FI113769B - Neurosuojaavia kromaaniyhdisteitä - Google Patents

Description

113769

Neuro suo j aavi a kromaaniyhdis tei tä

Tekniikan taso

Keksintö koskee neurosuojaavaa (anti-iskeemistä ja 5 eksitatorisen aminohapon reseptoria salpaavaa) (3R*,4S*)- 3-[4-(4-fluorifenyyli)-4-hydroksi-piperidin-l-yyli]kro-man-4,7-diolia; sen enantiomeerejä; sen farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja. Näitä yhdisteitä voidaan käyttää pään vaurion, halvauksen tai CNS-degeneratiivisten sai-10 rauksien, kuten Alzheimerin taudin, Huntingtonin taudin, Parkinsonin taudin sekä muiden, N-metyyli-D-aspara-giinihappo (NMDA) -reseptorin salpaamisella lieventyvien tilojen hoitoon.

Eksitatoriset aminohapot ovat eräs tärkeä neurovä-15 littäjäaineiden ryhmä, joka välittää eksitatorista neurotransmissiota keskushermostojärjestelmässä. Glutamiini-; happo ja asparagiinihappo ovat kaksi endogeenista ligan- dia, jotka aktivoivat eksitatorisia aminohappo (EAA, excitatory amino acid) -reseptoreja. On kahdenlaisia EAA-20 reseptoreja, ionotrooppisia ja metabotrooppisia, jotka poikkeavat toisistaan niiden signaalitransduktiotavan osalta. Edelleen on vähintään kolme erilaista ionotroop-pista EAA-reseptoria, joille on tunnusomaista, että se-

• · I

•lektiivinen agonisti aktivoi kutakin tyyppiä: NMDA-, (N- : ; 25 metyyli-D-asparagiinihappo-), AMPA-, (2-amino-3-(5-metyy- *·> li-3-hydroksi-isoksatsol-4-yyli)propaanihappo)- ja ka- .··, iniinihapporeseptoria. Ionotrooppiset EAA-reseptorit liittyvät ionikanaviin, jotka läpäisevät natriumia ja, • · · ”·/ NMDA-reseptorien tapauksessa, kalsiumia. Metabotrooppiset * 30 reseptorit, jotka liittyvät membraaniin yhteydessä olevan G-proteiinin fosfoinositidi-hydrolyysiin, aktivoituvat kviskuaalihapolla (quisqualic acid), iboteenihapolla ja (IS,3R)-1-aminosyklopentaani-1,3-dikarboksyylihapolla.

* NMDA-reseptori on makromolekyylinen kompleksi, 35 jossa on lukuisia erilaisia sitoutumiskohtia, jotka * aikaansaavat natrium- ja kalsiumioneja läpäisevän ioni- 2 113769 kanavan. Hansen ja Krogsgaard-Larsen, Med. Res. Rev., 10, 55 - 94 (1990). Sitoutumiskohtia on glutamiinihapolle, glysiinille ja polyamiineille ja eräs kohta ionikanavan sisällä, jossa sellaiset yhdisteet, kuten fensyklidiini 5 (PCP), aikaansaavat antagonistiset vaikutuksensa.

Kompetitiiviset NMDÄ-antagonistit ovat yhdisteitä, jotka salpaavat NMDA-reseptoria olemalla vuorovaikutuksessa glutamaatin sitoutumiskohdan kanssa. Tietyn yhdisteen kyky sitoa kompetitiivisesti NMDA-glutamaattiresep-10 toria voidaan määrittää käyttäen radioligandin sitomis-määritystä. Ks. julkaisu, Murphy et ai. British J. Pharmacol. 95, 932 - 938 (1988). Antagonistit voidaan erottaa agonisteista käyttämällä rotan aivokuorikiilamäa-ritystä. Ks. julkaisu, Harrison ja Simmonds, British J. 15 Pharmacol., 84, 381-391 (1984). Esimerkkeihin kompetitii-visistä NMDA-antagonisteista kuuluu D-2-amino-5-fosfono-pentaanihappo (D-AP5) ja D-2-amino-7-fosfonoheptaanihap-po, Schoepp et ai. , J. Neur, Transm., 85, 131 - 143 (1991) .

20 NMDA-reseptorien neurotransmission antagonistit ovat hyödyllisiä terapeuttisia aineita hoidettaessa neurologisia häiriöitä. US-patenttijulkaisu nro 4 902 695 on kohdistettu kompetitiivisten NMDA-antagonistien erääseen sarjaan, joka on käyttökelpoinen hoidettaessa 25 neurologisia häiriöitä, mukaan lukien epilepsia, halvaus, '·· levottomuus, aivojen iskemia, lihasspasmit ja neurodege- ratiiviset häiriöt, kuten Alzheimerin tauti ja Hunting- . tönin tauti. US-patenttijulkaisu nro 4 968 878 on • * » * * *, * kohdistettu kompetitiivisten NMDA-reseptoriantagonistien ’·* * 30 erääseen toiseen sarjaan, joka on käyttökelpoinen samojen neurologisten häiriöiden ja neurodegeneratiivisten häi-riöiden hoitoon. US-patenttijulkaisu nro 5 192 751 tuo esiin menetelmän nisäkkäiden virtsanpidätyskyvyttömyyden hoitamiseksi, jolloin menetelmässä annetaan tehokas määrä ** 35 kompetitiivista NMDA-antagonistia.

; .♦ i » « I

3 113769 NMDA-antagonistit ovat myös hyödyllisiä terapeuttisina aineina, joilla on antikonvulsiivista, anksiolyyttistä, lihasta relaksoivaa ja antipsykoottista aktiivisuutta, julkaisu, J. Lehmann, The NMDA Receptor, 5 Drugs of the Future 14, nro 11, s. 1059 (1989). NMDA-antagonistien on esitetty olevan tehokkaita myös migreenin (Can. J. Neurol. Sei. 19 (4), s. 487, 1992); lääkeriippuvuuden (Science, 251, s. 85, 1991); ja

AIDS:iin liittyvien neuropsykiatristen häiriöiden (PIPS

10 11, s. 1, 1990), hoitoon.

US-patentti 5 356 905 (EP-hakemusjulkaisu 0 441 506 A3, julkaistu 24. tammikuuta 1991) tuo esiin neurosuojaavia yhdisteitä, joilla on kaava: ZT^Ax^<CH8)n 1 15

jossa A ja B ovat yhdistyneet ja ovat -CH2CH2- tai A ja B

ovat erillään ja ovat kumpikin H; *..! X on CH2 tai 0; • 20 X1 on H tai OH; Z on H, F, Cl, Br tai OH; *...* Z1 on H, F, Cl, Br tai (Ci-3) alkyyli; » · j n on 0 tai 1; ja > m on 0 tai kokonaisluku 1-6; 25 ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja.

·· Ifenprodiili on raseeminen, ns. dl-erytro-yhdiste, jonka suhteellinen stereokemiallinen kaava on i OH i/xrCHi'0

i joV

» · » · 4 113769 ja jota markkinoidaan hypotensiivisena aineena, ja lukuisilla läheisillä analogeilla on tämä sama käyttötarkoitus; Carron et ai., US-patenttijulkaisu 3 509 164; Carron et ai., Drug Res., voi 21, s. 1992 - 1999 (1971). Ifen- 5 prodiilin on vähän aikaa sitten osoitettu omaavan anti-iskeemistä ja eksitatorista aminohapporeseptoria salpaa-vaa aktiivisuutta; Gotti et ai , J. Pharm. Exp. Therap., voi. 247, s. 1211 - 21 (1988); Carter et ai, loc. cit., s. 1222 - 32 (1988) . Ks. myös julkaistua ΕΡ ΙΟ hakemusjulkaisua nro 322 361 ja FR-patenttijulkaisua nro 2 546 166. Tavoitteena, joka on saavutettu esillä olevalla keksinnöllä, on ollut löytää yhdisteitä, joilla on merkittävissä määrin tällaista neurosuojaavaa vaikutusta, samalla kun niillä on alentunut tai ei-merkittävä | 15 hypotensiivinen vaikutus.

Eräiden rakenteellisesti läheisten 1-fenyyli-3-(4-aryyli-4-asyylioksipiperidino)-1-propanolien on myös raportoitu olevan käyttökelpoisia analgeettisina aineina, US-patentti julkaisu nro 3 294 804; ja 1-[4-(amino- ja 20 hydroksi-alkyyli)fenyyli]-2-(4-hydroksi-4- tolyylipiperatsino)-1-alkanolien ja -alkanonien on raportoitu omaavan analgeettista, antihypertensiivistä, psykotrooppista tai anti-inflammatorista aktiivisuutta, : JP-Kokaijulkaisut nro 53-02 474 (CA 89: 43498y; Derwent : 25 Abs. 14858A) ja nro 53-59 675 (CA 89: 146938w; Derwent ·· Abs. 48671A) .

.* *, Keksinnön yhteenveto

Esillä oleva keksintö koskee yhdistettä, joka on (3R*, 4S*)-3-[4-(4-f luorifenyyli)-4-hydroksi-piperidin-l-* 30 yyli)-kroman-4,7-dioli, sen optisia isomeerejä ja farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja.

:* Esillä oleva keksintö tuo esiin neurosuojaavia kromanoliyhdisteitä, joilla on kaava (I), » 5 113769

OH

joilla on poikkeuksellista oraalista aktiivisuutta. Esillä oleva keksintö käsittää lisäksi kaavan (I) mukaisen yhdisteen optiset isomeerit ja farmaseuttisesti 10 hyväksyttävät suolat.

Voidaan valmistaa farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät kaavan (I) mukaista yhdistettä ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa.

Kaavan I mukaista yhdistettä voidaan käyttää 15 menetelmässä NMDA-reseptoripaikkojen salpaamiseksi nisäk käissä, jotka tarvitsevat mainittua salpaamista, jolloin menetelmässä mainitulle nisäkkäälle annetaan tehokas määrä kaavan (I) mukaista yhdistettä.

Edelleen kaavan I mukaista yhdistettä voidaan 20 käyttää menetelmässä nisäkkään sairauden tai tilan hoitamiseksi, joka sairaus tai tila on herkkä NMDA-reseptorikohtien salpauskäsittelylle, jolloin menetelmässä mainitulle nisäkkäälle annetaan tehokas määrä kaavan • · • *' (I) mukaista yhdistettä.

·,,,· 25 Kaavan (I) mukaisella yhdisteellä käsittelylle ‘herkkiin sairauksiin tai tiloihin kuuluu pään vaurio, selkäytimen vaurio, halvaus ja moni-infarktinen dementia.

; ,·, Kaavan (I) mukaisella yhdisteellä käsittelylle » > f ‘‘ herkkiin muihin sairauksiin tai tiloihin kuuluu Alzheime- 30 rin tauti, Huntingtonin tauti, Parkinsonin tauti, epilepsia ja amytrooppinen lateraaliskleroosi.

Kaavan (I) mukaisella yhdisteellä käsittelylle ; herkkiin sairauksiin tai tiloihin kuuluu lisäksi kipu, AIDS-dementia, psykoottiset tilat, lääkeriippuvuus, mig- ! > 35 reeni, hypoglykemia ja anksiolyyttiset tilat.

I >

i I

6 113769

Kaavan (I) mukaisella yhdisteellä käsittelylle herkkiin sairauksiin tai tiloihin kuuluu edelleen virtsanpidätyskyvyttömyys.

Kaavan (I) mukaisella yhdisteellä käsittelylle 5 herkkiin sairauksiin tai tiloihin kuuluu edelleen iskeemiset tapahtumat, jotka aiheutuvat CNS:n kirurgiasta, avosydänkirurgiasta tai muusta toimenpiteestä, jonka yhteyteen liittyy sydänverisuonijärjestelmän toiminto.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 10 Kaavan (I) mukaisia neurosuojaavia kromanoleja voidaan valmistaa helposti EP-hakemusjulkaisussa 441 506 kuvatulla tavalla.

! Esillä olevan keksinnön mukaiset yhdisteet valmis tetaan edullisesti antamalla sopivasti suojatun 7-hydrok-15 sikromanonin, esim. 7-bentsyylioksikromanonin, reagoida bromin kanssa reaktiolle inertissä liuottimessa 7-bentsyylioksi-3,3-dibromikromanonin tuottamiseksi.

Dibromiyhdisteen annetaan sitten reagoida 4-(4-fluorifenyyli)-4-hydroksipiperidiinin kanssa, jota on 20 kaksi mooliekvivalenttia, 7-bentsyylioksi-3-[4-(4-fluori-fenyyli)-4-hydroksi-piperidin-l-yyli]kromenonin tuottamiseksi. Reaktio suoritetaan tavallisesti emäksen, yleensä tertiaarisen amiinin, läsnä ollessa reaktiolle inertissä t i > : liuottimessa, kuten etanolissa tai asetonitriilissä. Ha- !|it! 25 luttaessa reaktiota voidaan katalysoida j odidisuolalla, jota voi olla aina yhteen mooliekvivalenttiin saakka. Lämpötila ei ole kriittinen, mutta se ei saisi olla niin • · · | korkea, että se aiheuttaisi tarpeetonta hajoamista.

Lämpötila, joka on on vallitsevan lämpötilan ja 100 °C:n 1 * » 30 välillä, on tavallisesti riittävä.

, Edellä kuvatulla tavalla saatu kromenoni pelkiste- tään kromanoliksi käyttämällä konventionaalisia hydridi-pelkistimiä, esim. NaBH4:ää, reaktiolle inertissä liuot-timessa, kuten metanolissa tai etanolissa, tavallisesti ; 35 vallitsevassa tai hieman korkeammassa lämpötilassa.

• > i • · 7 113769

Viimeisessä vaiheessa poistetaan suojaryhmä, esim. bentsyylioksi, konventionaalisilla menetelmillä, esim. katalyyttisellä hydrauksella, kaavan (I) mukaisen yhdisteen saamiseksi.

5 Haluttaessa kaavan (I) mukainen yhdiste voidaan konvertoida farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

Edellä mainitulla "farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat" -viittauksella tarkoitetaan konventionaalisia happoadditiosuoloja ja kationisuoloja. Siten kaavan (I) 10 mukaiset yhdisteet sisältävät amiiniryhmän, joka on emäksinen, kyeten muodostamaan tällaisia suoloja. Mainittuihin suoloihin kuuluu, näihin rajoittumatta, suolat HCl:n, HBr: n, HN03:n, H2S04:n, H3P04:n, CH3S03H:n, 2-CH3C6H4S03H: n, CH3C02H:n, glukonihapon, viinihapon, maleiinihapon ja 15 meripihkahapon kanssa. Ne valmistetaan tavallisesti konventionaalisilla menetelmillä, esim. yhdistämällä kaavan (I) mukainen yhdiste hapon kanssa, jota on vähintään yksi mooliekvivalentti. Kaavan (I) mukaiset yhdisteet sisältävät fenolisen hydroksiryhmän ja kykenevät siten muo-i 20 dostamaan myös kationisia suoloja (esim. Na, K, ja vastaavia); "farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat" -ilmaisu on tarkoitettu käsittämään myös tällaiset suolat. Myös nämä suolat valmistetaan konventionaalisilla menetelmillä, esim. yhdistämällä kaavan (I) mukainen 25 fenolinen yhdiste yhden mooliekviValentin NaOHrta tai K0H:ta kanssa sopivassa liuottimessa.

Kaavan (I) mukaiset yhdisteet sisältävät kaksi 1’ asymmetrista hiiltä - vastaten kahta rasemaattia ja neljää optisesti aktiivista yhdistettä. Yksi näistä « » · : .·, 30 rasemaateista on edellä mainittu cis-isomeeri ja toinen « · » on trans-isomeeri. Esillä olevassa keksinnössä cis- • · » - • · · * isomeeri on vallitseva ja on edullisempi muoto. Jokainen näistä rasemaateista voidaan erottaa enantiomeeripariksi diasteromeeristen happoadditiosuolojen kautta käyttämällä * » > : ί 35 optisesti aktiivista happoa. Vaihtoehtoisesti raseeminen alkoholi konvertoidaan vastaaviksi diasteromeeriestereik- « » » » t · ( i » * i » « • · 8 113769 si tai -uretaaneiksi, jotka on muodostettu optisesti aktiivisesta haposta tai isosyanaatista. Tällaisiin kovalenttisesti sidottuihin johdannaisiin voidaan kohdistaa erilaisia erotusmenetelmiä (esim. kromatogra-5 fointi, uudelleenkiteytys jne.). Tällaiset diasteromeeri-esterit muodostetaan alkoholista ja optisesti aktiivisesta haposta käyttäen standardimenetelmiä, tavallisesti sellaisia menetelmiä, jotka käsittävät hapon aktivoimisen, esim. happokloridina, anhydridi seostettuna 10 alkyylikloroformaatin kanssa, tai käyttäen dehydraavaa kytkevää ainetta, kuten disykloheksyylikarbodi-imidiä. Sen jälkeen kun saadut diasteromeeriesterit on erotettu esim. kromatografisesti, ne hydrolysoidaan konventionaalisilla menetelmillä, esim. hapon vesiliuoksella 15 tai emäksen vesiliuoksella, enantiomeeristen, valinnaisesti aktiivisten kaavan (I) mukaisten alkoholiyhdisteiden saamiseksi. Edulliset keksinnön mukaiset yhdisteet ovat (±)-cis- ja (+)-cis-isomeereja. Eräs erityisen edullinen yhdiste on (+)-(3R,4S)-3-[4-(4-20 fluorifenyyli)-4-hydroksi-piperidin-l-yyli]kroman-4,7-diolitartraattietanolaattihydraatti.

Esillä olevan keksinnön mukaisten yhdisteiden synteesiin tarvittavat lähtömateriaalit ja reagenssit saadaan helposti joko kaupallisina tuotteina, ... 25 kirjallisuuden menetelmien mukaisesti tai alla, valmisteiden esimerkkiosassa kuvattujen menetelmien • e *··' mukaisesti.

Esillä olevilla kaavan (I) mukaisilla yhdisteillä *. on selektiivistä neurosuoj aavaa aktiivisuutta, joka | ;'j 30 perustuu niiden anti-iskeemiseen aktiivisuuteen ja kykyyn nt 1 ,·1.·. salvata eksitatorisia aminohapporeseptoreja, samalla kun

• · I

niillä on alentunut tai ei-merkittävä hypotensiivinen aktiivisuus. Esillä olevien yhdisteiden anti-iskeeminen ak-.! tiivisuus voidaan määrittää yhdellä tai useammalla mene- 35 telmällä, joka on selostettu aikaisemmin yksityiskohtai-V, sesti edellä viitattujen Gotti et ai. ja Carter et ai.

» 1 i I 1 t » 9 113769 toimesta, tai vastaavilla menetelmillä. Esillä olevan keksinnön mukaisten yhdisteiden kyky salvata eksitatorisia aminohapporeseptoreja voidaan osoittaa niiden kyvyllä salvata N-metyyli-D-asparagiinihappo-5 indusoitua cGMP:n lisääntymistä vastasyntyneen rotan pikkuaivoissa seuraavan menetelmän mukaisesti. Kymmeneltä 8-14 päivän ikäiseltä Wistar-rotalta poistetaan nopeasti pikkuaivot ja asetetaan 4 °C:iseen Krebs/bikarbonaattipuskuriin, jonka pH-arvo on 7,4, ja 10 sitten leikellään 0,5 mm x 0,5 mm:n palasiksi käyttäen Mcllvain-kudosleikkuria (The Nickle Laboratory Engineering Col, Gomshall, Surrey, Englanti). Saadut pikku-aivoleikepalat siirretään 100 ml:n Krebs/bikarbonaattipuskuriin 37 °C:seen, jota tasapainotetaan jatkuvatoimi-15 sesti 95:5 C>2/C02:lla. Pikkuaivon palasia inkuboidaan tällä tavoin 90 minuutin ajan vaihtaen puskuri kolme kertaa. Sitten puskuri dekantoidaan, kudos sentrifugoidaan (yksi minuutti, 3 200 rpm.) ja kudos uudelleensuspensoidaan 20 ml:n Krebs/bikar- ! 20 bonaattipuskuriin. Tämän jälkeen otetaan 250 μ1:η näyt teitä (n. 2 mg), jotka sijoitetaan 1,5 ml:n mikrofugiput-kiin. Näihin putkiin lisätään 10 μΐ tutkimuksen kohteena olevaa yhdistettä kantaliuoksesta, ja sitten, 10 minuutin inkubointijakson jälkeen, 10 μΐ 2,5 mM NMDA-liuosta reak-, 25 tion käynnistämiseksi. Lopullinen NMDA-pitoisuus on 100 | μΜ. Kontrollit eivät sisällä lisättyä NMDArta. Putkia in- kuboidaan yhden minuutin ajan 37 °C:ssa ravistelevassa ,·’ vesihauteessa ja sitten lisätään 750 μΐ 50 mM Tris-Cl, 5 : ; mM EDTA-liuosta reaktion pysäyttämiseksi. Putket asete- • 30 taan välittömästi kiehuvaan vesihauteeseen viiden • * · minuutin ajaksi. Jokaisen putken sisältöä sitten • i » sonikoidaan 15 sekunnin ajan käyttäen sonikaattorisondia, joka on asetettu tehotasolle kolme. Poistetaan 10 μΐ ja • i · proteiini määritetään julkaisussa Lowry, Anal. Biochem. ί(ιι: 35 100: 201 - 220 (1979) esitetyllä menetelmällä. Sitten putket sentrifugoidaan (5 minuuttia, 10 000 x g), otetaan • » • · iti » • · I » » 10 113769 100 μΐ supernatanttia ja syklisen GMP:n (cGMP) taso määritetään käyttäen New England Nuclear (Boston, Massachusetts) cGMP RIA -määritystä toimittajan menetelmän mukaisesti. Tulokset ilmoitetaan pmolreina 5 muodostunutta cGMP:ta mg:aa proteiinia kohti. Myös ei-toivottu hypotensiivinen aktiivisuus määritetään tunnettuja menetelmiä käyttäen, esim. Carron et ai. , johon on myös viitattu edellä, esittämien menetelmien mukaisesti .

10 Vaihtoehtoinen ja edullisempi menetelmä neurosuo- jaavan aktiivisuuden arvioimiseksi on Ismail A. Shalaby, et ai., julkaisussa J. Pharm. and Experimental Therapeutics, 260, 925 (1992), esittämä menetelmä, joka liitetään tähän hakemukseen viitteenä ja kuvataan alla.

15 Soluviljely. Seitsemäntoista päivän ikäisen rotan sikiön (CD, Charles River Breeding Laboratories, Inc., Wilmington, MA) hippokampaalisoluja kasvatettiin PRIMARIA-kasvatusalustoilla (Falcon Co., Lincoln Park, NJ) 2-3 viikon ajan seerumissa, joka sisälsi 20 kasvatusväliainetta (minimivälttämätön väliaine yhdessä

ei-välttämättömien aminohappojen kanssa sisältäen 2 mM

glutamiinia, 21 mM glukoosia, penisilliini/streptomysii- niä (5 000 U kutakin), 10 % naudansikiön seerumia (päivät 1-7) ja 10 % hevosen seerumia (päivät 1 - 21) (Choi et ,»t*t 25 ai., 1987) . Solut maljattiin joko 96 kuopan mikrotiitterilevyille tiheyden ollessa 80 000 solua ··’ kuoppaa kohti tai 24 kuopan kasvatuslevyille tiheyden ollessa 250 000 solua kuoppaa kohti. Viljelmiä kasva- tettiin 37 °C:ssa kosteutetussa CC>2-kudosviljel- : 30 mäinkubaattorissa, joka sisälsi 5 % CO2 - 95 % ilmaa. Ei- • < » * neuronaalisten solujen prolif eraatiota kontrolloitiin t » » lisäämällä 20 μΜ uridiinia ja 20 μΜ 5-fluori-2-deoksiuri-diinia (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) kasvatuksen ··’· päivinä 6-8 (Martin et ai. 1990). Kasvatusväliaine ·...* 35 vaihdettiin joka 2. - 3. päivä tuoreella varastoliuoksel- la.

1 » V » > · t * » » i 11 113769 !

Glutamaattitoksisuus. Viljelmistä määritettiin j glutamaattitoksisuus 2-3 viikon kuluttua alkumaljauksesta. Kasvatusväliaine poistettiin ja viljelmiä huuhdeltiin kahdesti CSS:llä (Choi et ai. , 5 1987) (millimooleissa) : NaCl, 120; KC1, 5,4; MgCla, 0,8;

CaCl2, 1,8; glukoosi, 15; ja 4-(2-hydroksietyyii)-1-j piperatsiinietaanisulfonihappo, 25 mM (pH 7,4). Viljelmät altistettiin sitten 15 minuutin ajaksi (37 °C) erilaisille glutamaattipitoisuuksille. Tämän inkuboinnin 10 jälkeen viljelmiä huuhdeltiin 3 kertaa glutamaatittomalla CSS:llä ja kahdesti tuoreella kasvatusväliaineella ilman seerumia. Sitten viljelmiä inkuboitiin 20 - 24 tuntia seerumittomassa kasvatusväliaineessa. Lääkeaineet lisättiin 2 minuuttia ennen glutamaattialtistusta ja 15 15 minuutin glutamaattialtistuksen aikana. Eräissä kokeissa lääkeaineita lisättiin eri aikoina glutamaattialtistuksen jäkeen ja seuraavien 20 - 24 tunnin ajan.

! Solun elinkyky määritettiin rutiininomaisesti 20 - 24 tuntia ärsytystoksiinialtistuksen jälkeen mittaamalla 20 sytosolisen entsyymi LDH:n aktiivisuus (Koh ja Choi, 1987; Wroblewski ja LaDue, 1955). LDH-aktiivisuus määritettiin mikrotiitterilevyjen jokaisen 96 kuopan kasvatusväliaineesta. 50 μΐ väliainenäytettä lisättiin

samaan tilavuuteen natriumfosfoaattipuskuria (0,1 M, pH 25 7,4), joka sisälsi 1,32 mM natriumpyruvaattia ja 2,9 mM

‘ NADH:ta. Koko reaktioseoksen 340 nm:n absorbanssi *. ‘ jokaisen 96 kuopan tapauksessa monitoroitiin aina 5 sekunnin välein 2 minuutin ajan automaattisella : : spektrofotometrimikrotiitterilevylukijalla (Molecular ‘ 30 Devices; Menlo Park, CA). Absorbanssiarvo laskettiin * · f automaattisesti käyttäen IBM SOFTmax -ohjelmaa (versio 1.01; Molecular Devices) ja sitä käytettiin LDH-ak-tiivisuusindeksinä.

Neuronaalisen elinkyvyn morfologinen arviointi 35 suoritettiin käyttäen faasikontrastimikroskopiaa. 96 kuopan kasvatuslevyillä ei saatu hyvää faasikontrasti- * » 12 113769 kuvaa, joten tähän tarkoitukseen käytettiin soluja, jotka oli kasvatettu 24 kuopan levyillä. Kvantitatiivisesti molemmat kasvatusmaljaukset olivat yhtä herkkiä glutamaattitoksisuudelle ja osoittivat 2 - 3-kertaista 5 LDH-aktiivisuuden lisäystä 24 tunnin kuluttua 0,1 - 1,0 mM:lle altistuksesta.

Reagenssit. DTG hankittiin Aldrich Chemical Companyltä (Milwaukee, WI) ja haloperidoli Research Biochemicals Inc.'iltä (Natick, MA). Spermiini hankittiin 10 Sigma Chemical Co.'lta (St. Louis, MO). Hevosen ja naudansikiön seerumi hankittiin Hycloneilta (Logan, UT) . Kasvatusväliaine, glutamiini ja penisilliini/streptomy-siini hankittiin Gibco Co.'lta (Grand Island, NY).

Tulosten analysointi. Neurotoksisuus määritettiin 15 kvantitatiivisesti mittaamalla 20 - 24 tuntia glutamaattialtistuksen jälkeen kasvatusväliaineessa läsnä oleva LDH-aktiivisuus. Alkukokeet vahvistivat julkaistut raportit ja osoittivat, että lisääntynyt LDH-aktiivisuus kasvatusväliaineessa korreloi neuronien tuhoutumisen ja 20 degeneroitumisen kanssa (Koh ja Choi, 1987). Koska LDH:n todelliset tasot vaihtelivat eri viljelmissä, tulokset ilmaistiin yleisen tavan mukaisesti suhteessa saman kasvatuslevyn puskurilla käsiteltyihin sisarkuoppiin nähden. LDH-aktiivisuusindeksin saamiseksi viljelmistä, . 25 jotka oli käsitelty glutamaatilla ja lääkeaineella, kont- ' ) rolliviljelmistä saadut LDH-arvot vähennettiin käsittely- ryhmien arvoista. Lääkekäsittelyn tulokset ilmoitettiin ,!!’ kunkin kokeen tapauksessa 1 mM glutamaatilla (tai NMDA:- : lla) indusoidun LDH:n prosentuaalisena lisäyksenä. NMDA- i i · .’j 30 antagonistien pitoisuudet, jotka tarvittiin kumoamaan • » ;·, ärsyketoksiineilla indusoitua LDH:n lisääntymistä 50- %:isesti (IC50) , laskettiin käyttäen log-koe (log-probit) -analyysiä kolmen itsenäisen kokeen yhdistetyille tuloksille. Eri käsittelyryhmiä verrattiin käyttäen ' 35 kaksihäntäistä t-koetta (two-tailed t test) .

* » t f · » > 13 113769 Tällaisen selektiivisen neurosuojaavan, anti-iskeemisen ja eksitatorista aminohappoa salpaavan aktiivisuuden perusteella esillä olevan keksinnön mukaiset yhdisteet ovat arvokkaita käytettäväksi degeneratiivisten 5 CNS:n (central nervous system, keskushermostojärjestelmä) häiriöiden, kuten halvauksen; ja Alzheimerin taudin, Parkinsonin taudin ja Huntingtonin taudin; hoitoon ilman merkittävää mahdollisuutta, että tapahtuu samanaikaista tarpeetonta laskua verenpaineessa. Hoidettaessa systeemi-10 sesti tällaisia sairauksia neurosuojäävällä määrällä kaavan (I) mukaisia yhdisteitä annos on tyypillisesti n. 0,02 - 10 mg/kg/päivä (1 - 500 mg/päivä tyypillisellä, 50 kg painavalla ihmisellä) yhtenä tai jaettuna annoksena antoreitistä riippumatta. Luonnollisesti erityisestä 15 yhdisteestä ja yksittäisen sairauden erityisestä luonteesta riippuen hoitava lääkäri voi määrätä annoksia, jotka ovat näiden rajojen ulkopuolella. Oraalinen anto-reitti on tavallisesti edullisin. Kuitenkin, mikäli potilas ei kykene nielemään tai oraalinen absorptio on 20 muutoin huonontunut, niin parenteraalinen (i.m., i.v.) tai topikaalinen antoreitti on edullisin.

Esillä olevan keksinnön mukaisia yhdisteitä annetaan tavallisesti farmaseuttisten koostumusten muodossa, jotka koostumukset sisältävät vähintään yhtä kaavan (I) 25 mukaista yhdistettä yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttä- | vän kantajan tai laimennusaineen kanssa. Tällaiset ·’ koostumukset formuloidaan tavallisesti konventionaaliseen *' tapaan hyödyntäen kiinteitä tai nestemäisiä kantajia tai t laimennusaineita halutun antomuodon mukaan: oraalista * 30 antoa varten tablettien, kovien tai pehmeiden gela- tiinikapseleiden, suspensioiden, rakeiden, jauheiden ja • · · vastaavien muotoon; parenteraalista antoa varten injektoitavien liuosten tai suspensioiden ja vastaavien

< i I

···· muotoon; ja topikaalista antoa varten liuosten, 35 lotioneiden, voiteiden, salvojen ja vastaavien muotoon.

I » I · • » 14 113769

Oraalinen anto on edullisin ja oraalinen hyötyosuus on tärkeä parametri valittaessa sellaisia yhdisteitä, jotka ovat erityisen käyttökelpoisia NMDA-antagonisteina. Oraalista hyötyosuutta voidaan arvioida 5 menetelmällä, jonka ovat suunnitelleet Schmidt ja Bubser (Pharmacol. Biochem. Behavior, 1989, 32, 621) ja joka mittaa testiyhdisteen oraalisen annoksen kykyä kumota haloperidolilla indusoitua katalepsiaa.

Sprague-Dawley-urosrotat (Interfauna, Tutlingen, 10 F.R.G.) saivat intraperitoneaalisena (IP) injektiona 0,5 mg/kg haloperidolia (injektoitava liuos ampulleista, Jansen, Neuss, (F.R.G) kohtalaisen asteisen katalepsian indusoimiseksi. Samanaikaisesti annettiin oraalisesti joko kaavan (I) mukaista yhdistettä inertissä kantajassa 15 tai inerttia kantajaa. Oraaliseen antoon tarkoitettu | liuos valmistettiin liuottamalla yhdiste 0,3-%:iseen | viinihapon vesiliuokseen. Kiinteää viinihappohappoa lisättiin pH:n saamiseksi arvoon 3,5. 30 minuutin kuluttua käsittelystä mitattiin jokaiselta rotalta 20 katalepsian aste. Voidaan suorittaa kolme vakiintunutta koetta seuraavassa järjestyksessä: (1) Asetetaan molemmat etujalat vaakatasonsuuntai-selle tangolle, joka on 9 cm pinnan yläpuolella.

(2) Asetetaan yksi etujalka korokkeelle (3 cm kor- . . 25 kea) .

’ | (3) Ripustetaan pystysuoransuuntaiselle lankaver kolle.

Aikajakso käpälien asettamisesta yhden käpälän ensimmäiseen liikahdukseen (laskeutumisen viive) mitattiin t 30 (enintään 180 sekunnin ajan).

Ryhmien väliset erot analysoitiin käyttäen kaksihäntäistä Mann-Whitneyn U-testiä (two-tailed Mann-Whitney U-test). p-arvoa < 0,05 pidettiin osoituksena > · · ..d merkittävästä erosta ryhmien välillä.

35 i t » 4 · • * · t · « · » » 15 113769

On yllättäen havaittu, että kaavan (I) mukainen yhdiste on merkittävästi tehokkaampi oraalisessa annoksessa kuin toiset yhdisteet, jotka on kuvattu EP-hakemusjulkaisussa 441 506.

5 Esillä olevaa keksintöä on havainnollistettu seu- raavien esimerkkien avulla.

Välituotteet ja esimerkit

Kaikki vedettömät reaktiot suoritettiin mukavuussyistä ja yleensä saantojen maksimoimiseksi typen alla. 10 Kaikki liuottimet/laimennusaineet kuivattiin julkaistujen standardimenetelmien mukaisesti tai ne hankittiin esikui-vatussa muodossa. Kaikkia reaktioita sekoitettiin joko magneettisesti tai mekaanisesti. NMR-spektrit rekisteröitiin 250 - 300 MHz:ssä ja ilmoitettiin ppm:inä. NMR:n 15 liuottimena oli CDC13 ellei toisin mainita. IR-spektrit raportoitiin ctrfSinä, yleensä spesifioitiin ainoastaan voimakkaat signaalit. Käytetään seuraavia lyhenteitä: DMF on dimetyyliformamidi, THF on tetrahydrofuraani, HRMS on suurierotuskykyinen massaspektri (high resolution mass 20 spectrum).

Välituote 1 7-bentsyylioksikromanoni

Seosta, jossa oli 7-hydroksikromanonia (10,0 g, ' 61 mmol) , bentsyylibromidia (7,6 ml, 64 mmol) ja kalium- *: 25 karbonaattia (16,5 g, 120 mmol) asetonissa (250 ml), ref- k luksoitiin lievästi 24 tunnin ajan. Seos jäähdytettiin ja suodatettiin celiten läpi. Suodos konsentroitiin ja jään-; nös otettiin etyyliasetaattiin. Orgaanista liuosta i ‘ ’ pestiin vedellä ja suolavedellä, se kuivattiin I i 1 ' 30 kalsiumsulfaatilla ja konsentroitiin keltaisenruskeaksi kiintoaineeksi. Uudelleenkiteytys etanolista tuotti 12,63 g (81 %) 7-bentsyylioksikromanonia keltaisenruskeina kiteinä, joiden sp. oli 99 - 102 °C; NMR δ 7,85 (d, J = 9 : k Hz, 1H) , 7,44 - 7,32 (m, 5H) , 6,66 (dd, J = 2,4, 9 Hz, , ·. 35 1H) , 6,49 (d, J = 2,4 Hz, 1H) , 5,09 (s, 2H) , 4,52 (t, J = > i ♦ • t 16 113769 6,5 Hz, 2H), 2,76 (t, J = 6,5 Hz, 2H). Analyysi laskettuna Ci6Hi403 : lie: C, 75,58; H, 5,55. Havaittu: C, 75,44; H, 5,58.

Välituote 2 5 7-bentsyylioksi-3,3-dibromikromanoni

Lietteeseen, jossa oli 7-bentsyylioksikromanonia (12,63 g, 49,7 mmol) hiilitetrakloridissa (200 ml) ja etyyliasetaatissa (100 ml), lisättiin bromin (5,38 ml, 104,4 mmol) liuosta hiilitetrakloridissa (100 ml) 20 mi-10 nuutin kuluessa. Kirkasta punaista liuosta sekoitettiin vielä 10 minuuttia, sitten vetybromidi poistettiin reak-tioseoksesta typpivirralla (15 min) . Orgaanista liuosta pestiin natriumbisulfiitin vesiliuoksella, natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja suolavedellä; sitten se 15 kuivattiin kalsiumsulfaatilla ja konsentroitiin öljyksi, joka jähmettyi hitaasti. Uudelleenkiteytys etanolista tuotti 15,73 g (76 %) 7-bentsyylioksi-3,3-dibromikroma-nonia vaalaenpunaisina kiteinä, joiden sp. oli 89 90 °C; NMR δ 7,96 (d, J = 9 Hz, 1H) , 7,43 - 7,36 (m, 5H) , 20 6,79 (dd, J = 2,4, 9 Hz, 1H) , 6,57 (d, J = 2,4 Hz, 1H) , 5,12 (s, 2H) , 4,71 (s, 2H) . Analyysi laskettuna

CisHi2Br203: lie: C, 46,64; H, 2,94. Havaittu: C, 46,62; H, 2,96.

< Esimerkki 1 25 (3R*,4S*)-3-[4-(4-fluorifenyyli)-4-hydroksi- * piperidin-l-yyli]kroman-4,7-dioli . Seosta, jossa oli 7-bentsyylioksi-3,3-dibromi- kromanonia (54,7 g, 133 mmol), 4-(4-fluorifenyyli)-4- hydroksipiperidiiniä (52,0 g, 266 mmol) ja trietyyli-30 amiina (38 ml, 270 mmol) asetonitriilissä (2,5 1), sekoitettiin 16 tunnin ajan vallitsevassa lämpötilassa. Muodostui keltaista sakkaa, joka kerättiin, pestiin hyvin vedellä ja eetterillä ja ilmakuivattiin. 7-bentsyylioksi- 3- [4- (4-fluorifenyyli) -4-hydroksi-piperi-din-l-yyli] kro-35 menonin saanto oli 55,4 g (93 %) ja se oli i i käyttökelpoista ilman enempää puhdistamista. Näytteen, * 17 113769 joka oli uudelleenkiteytetty etanoli/tetrahydrofuraanista, sp. oli 220 - 221 °C; NMR DMS0d6 δ 7,99 (d, J = 9 Hz, 2H), 7,56 - 7,40 (m, 8H), 7,18 - 7,08 (m, 4H), 5,25 (s, 2H) , 5,06 (s, 1H) , 3,60 (leveä s, 1H) , 3, 55 - 3, 35 (m, 5 1H, osittain peittynyt NMR-liuottimesta peräisin olevalla vedellä), 3,10 - 2,95 (m, 2H), 2,15 - 2,00 (m, 2H), 1,71 (leveä t, J = 13,7 Hz, 2H) . Analyysi laskettuna C27H24FNO4: lie: C, 72,80; H, 5,43; N, 3,14. Havaittu: C, 72,83; H, 5,82; N, 2,82.

10 Lietteeseen, jossa oli 7-bentsyylioksi-3-[4-(4- fluorifenyyli)-4-hydroksi-piperidin-l-yyli]kromenonia (8,24 g, 18,5 mmol) etanolissa (400 ml) ja tetrahydrofu-raanissa (600 ml), lisättiin natriumboorihydridiä (7,0 g, 185 mmol). Seosta sekoitettiin yön yli. Joukkoon 15 lisättiin vielä natriumboorihydridiä ((7,0 g) ja reaktioseosta sekoitettiin 3 päivän ajan. Lisättiin vettä ja liuotin poistettiin alipaineessa 45 °C:ssa. Muodostunut kiintoaine kerättiin ja sitä pestiin hyvin vedellä ja sitten eetterillä. Kiintoainetta kuivattiin 20 vielä vakuumissa yön yli, jolloin saatiin 5,01 g, 60 %, (3R*,4S*)-7-bentsyylioksi-3-[4-(4-fluorifenyyli)-4-hydr-oksi-piperidin-l-yyli]kroman-4-olia, joka oli käyttökelpoista ilman enempää puhdistamista. Etyyliasetaatti/klo-roformista uudelleenkiteytetyn näytteen sp. oli 194 25 195 °C; NMR δ 7,56 - 7,30 (m, 8H) , 7,06 (pitkällä välillä | kytkeytynyt t, J = 8,7 Hz, 2H) 6,63 (dd, J = 2,4, 8,5 Hz, J 1H), 6,47 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,04 (s, 2H), 4,77 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 4,36 (dd, J = 3,5, 10,4 Hz, 1H) , 4,13 (t, J ’ = 10,4 Hz, 1H) , 3,82 (leveä s, 1H) , 3,11 (leveä d, J = ; 30 11,2 Hz, 1H) , 2,92 - 2,71 (m, 4H) , 2,21 - 2,06 (m, 2H) , 1,87 - 1,73 (m, 2H) , 1,54 (s, 1H) . Analyysi laskettuna C27H28FNO4: lie: C, 72,14; H, 6,28; N, 3,12. Havaittu C, 72,15; H, 6,21; N, 3,12.

.... Seos, jossa oli (3R*, 4S*) -7-bentsyylioksi-3-[4-(4- : 35 fluorifenyyli)-4-hydroksi-piperidin-l-yyli]kroman-4-olia ;V. (0,80 g, 1,78 mmol), 10-%:ista palladium-hiiltä (0,16 g), * > * · » ψ « t » » I I · 18 113769 metanolia (40 ml) ja etikkahappoa (0,8 ml), hydrattiin 8 tunnin ajan lähtöpaineella 48,5 psi. Reaktioseos suodatettiin celiten läpi ja suodos konsentroitiin. Jäännöstä sekoitettiin voimakkaasti eetterin ja nat-5 riumbikarbonaatin kyllästetyn vesiliuoksen kanssa 1 tunnin ajan. Kiintoainetuote suodatettiin, sitä pestiin vedellä ja eetterillä ja kuivattiin vakuumissa.

Uudelleenkiteytys etanolista tuotti 0,35 g (54 %) (3R*,4S*)-3-[4-(4-fluorifenyyli)-4-hydroksi-piperidin-Ι-ΙΟ yyli]kroman-4,7-diolia valkoisena kiintoaineena, jonka sp. oli 159 - 160 °C; NMR DMSOd6 δ 7,55 - 7,47 (m, 2H) , 7,11 (t, J = 9 Hz, 2H), 7,02 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,32 (dd, J = 2,3, 8,3 Hz, 1H), 6,15 (d, J = 2,3 Hz, 1H) , 5,10 - 4,50 (leveä m sekä s 4,63:n kohdalla, 3H), 4,23 (dd, J ! 15 = 2,8, 10,3 Hz, 1H) , 4,04 (t, J = 10,5 Hz, 1H) , 2,99 I (leveä d, J = 10,8 Hz, 1H), 2,86 (leveä d, J = 10,7 Hz, 1H) , 2,73 - 2,50 (m, 3H) , 2,08 - 1, 90 (m, 2H) , 1,58 (leveä d, J = 13 Hz, 2H) . Analyysi laskettuna C20H22FNO4· 0,25 H20:lle; C, 66,01; H, 6,23; N, 3,85. Havaittu: C, 20 66,22; H, 6,58; N, 3,46.

Esimerkki 2 (3R,4S)-3-[4-(4-fluorifenyyli)-4-hydroksi-piperi-din-l-yyli]kroman-4,7-diolin (+)-enantiomeeri

Seosta, jossa oli (3R*,4S*)-7-bentsyylioksi-3-[4- ,, , 25 (4-fluorifenyyli)-4-hydroksi-piperidin-l-yyli]kroman-4- *it| olia (15,22 g, 33,86 mmol) , N-tert-butoksikarbonyyli-L- « proliinia (14,65 g, 68,06 mmol), 4-dimetyyliaminopyridii-,,** niä (4,18 g, 34,21 mmol) ja l-etyyli-3-(3-dimetyyliamino- ; ' : propyyli)karbodi-imidihydrokloridia (13,10 g, 68,3 mmol) j 30 metyleenikloridissa, refluksoitiin lievästi 3 tunnin ,·; . ajan. Seos konsentroitiin alipaineessa ja jäännös jaettiin etyyliasetaatin ja veden kesken. Faasit erotettiin ja orgaanista kerrosta pestiin vedellä ja suolavedellä; sitten se kuivattiin kalsiumsulfaatilla ja ! 35 konsentroitiin keltaiseksi vaahdoksi. Lisättiin isopro- pyylieetteriä (200 ml) ja seos kuumennettiin nopeasti > » > 19 113769 kiehumispisteeseen. Seoksen annettiin palata vallitsevaan lämpötilaan ja sitä sekoitettiin yön yli. Liukenematon materiaali kerättiin ja sitä huuhdeltiin isoproyylieette-rillä ja punnittiin, jolloin painoksi saatiin 9,62 g. 5 Tämä materiaali uudelleenkiteytettiin etyyliasetaatista, jolloin saatiin 6,43 g (29 %) (3R,4S)-7-bentsyylioksi-3- [4-(4-fluorifenyyli)-4-hydroksi-piperidin-l-yyli]kroman- 4-olin N-tert-butoksikarbonyyli-L-proliiniesterin ( + )- enantiomeeriä, jonka sp. oli 200 - 200,5 °C; [cx]d = 10 +100,0° c = 0, 345 (metanoli). Analyysi laskettuna C37H43F- N2O7:lie: C, 68,71; H, 6,70; N, 4,33. Havaittu: C, 68,36; H, 6,78; N, 4,57. Huomattakoon, että isopropyylieette-risuodos sisälsi diasteromeerista N-tert-butoksikarbonyy- 1 li-L-proliiniesterituotetta, jota voitiin käyttää otsikon 15 mukaisen vastaavan (-)-tuotteen valmistamiseen.

Edellisen reaktion tuote (0,262 g, 0,405 mmol) lisättiin 0 °C:iseen litiumalumiinihydridin (0,020 g, 0,527 mmol) lietteeseen tetrahydrofuraanissa (10 ml). Seoksen annettiin lämmetä huoneenlämpötilaan ja sitä sekoitettiin 20 10 minuutin ajan. Reaktio sammutettiin natriumsulfaattidekahydraatilla, kuivattiin natriumsul-faatilla ja suodatettiin celiten läpi. Suodos konsentroitiin, jolloin jäljelle jäi valkoista kiintoainetta, jota trituroitiin eetteri/ heksaanin kanssa, jolloin saatiin ; h 25 0,154 g (85 %) (+)-enantiomeeristä (3R,4S)-7- titi! bentsyylioksi-3- [4- (4-f luorifenyyli) -4-hydroksi-piperidn-

** 1-yyli] kroman-4-olia, jonka sp. oli 178 - 178,5 °C; [a]D

= +75,4° c = 0,305 (metanoli); NMR δ 7,51 - 7,30 (m, 8H) , 7,06 (t, J = 8,7 Hz, 2H) , 6,63 (dd, J = 2,4, 8,5 Hz, 1H) , 30 6,47 (d, J = 2,3 Hz, 1H) , 5,04 (s, 2H) , 4,77 (d, J = 3 V ‘ HZ, 1H), 4,36 (dd, J = 3,3, 10,5 Hz, 1H) , 4,13 (t, J = 10,4 Hz, 1H) , 3,83 (s, 1H) , 3,11 (leveä d, J = 11,1 Hz, :· 1H), 2,91 - 2,72 (m, 4H) , 2,20 - 2,05 (m, 2H) , 1,86 - I. 79 (m, 2H), 1,56 (s, 1H) ; 13C-NMR δ 163, 59, 160, 05, | 35 154,95, 143,73, 136,84, 131,84, 128,58, 127,96, 127,42, 126,33, 126, 22, 115, 33, 115, 26, 115, 05, 108,91, 101,97, » 20 113769 77,22, 70,68, 70,03, 62,46, 61,76, 60,71, 47,05, 45,09, 38, 63. Analyysi laskettuna C27H28FNO4: lie: C, 72,14; H, 6,28; N, 3,12. Havaittu: C, 71,75; H, 6,45; N, 3,12.

Seosta, jossa oli edellisen reaktion tuotetta 5 (1,29 g, 2,87 mmol) ja 10-%:ista palladium-hiiltä (0,27 g) metanolissa (65 ml) ja etikkahapossa (1,3 ml), hydrattiin 50 psirssa (lähtöpaine) 7,25 tunnin ajan. Seos suodatettiin celiten läpi ja konsentroitiin öljyksi. Öljyyn lisättiin natriumbikarbonaatin kyllästettyä 10 vesiliuosta (150 ml) ja eetteriä (50 ml) ja tätä seosta sekoitettiin voimakkaasti 15 minuutin ajan. Muodostunut valkoinen kiintoaine kerättiin ja ilmakuivattiin, jolloin saatiin 0,83 g (81 %) (3R,4S)-3-[4(4-fluorifenyyli)-4- hydroksi-piperidin-l-yyli]kroman-4,7-diolin (+)- 15 enantiomeeriä, jonka sp. oli 165 - 166 °C; [a]o = +85,6° c I = 0,430 (metanoli); NMR DMSOd6 δ 9,38 (leveä s, 1H), 7,54 ! - 7,50 (m, 2H), 7,12 (t, J = 9 Hz, 2H), 7,02 (d, J = 8,4

Hz, 1H), 6,32 (dd, J = 2,4, 8,3 Hz, 1H), 6,16 (d, J = 2,3 Hz, 1H) , 4,88 (s, 1H) , 4,77 (s, 1H) , 4,65 (s, 1H) , 4,23 20 (dd, J = 2,5, 10,1 Hz, 1H) , 4,05 (t, J = 10,6 Hz, 1H) , 3,00 (leveä d, J = 10,3 Hz, 1H), 2,87 (leveä d, J = 10,3 Hz, 1H), 2,67 (q, J = 11,2 Hz, 2H), 2,54 - 2,49 (m, 1H) , 1,94 (leveä t, J = 11,0 Hz, 2H) , 1,59 (leveä d, J = 13

Hz, 2H) ; 13C-NMR DMSOde δ 162,41, 159,21, 158,17, 154,58, H · • V 25 146,42, 131,79, 126,88, 126,78, 115,92, 114,52, 114,24, 108, 12, 101, 83, 69, 47, 62,74, 61, 95, 61,45, 46,21, 45, 82, ... 38,37, 38,28. Analyysi laskettuna C20H22FNO4 · 0,2 5 H2Ö:lle: ,···, C, 66,01; H, 6,23; N, 3,85. Havaittu C, 66, 05; H, 6,39; N, 3,84.

; · 30 Esimerkki 3 • » (4R, 3S)-3-[4-(4-fluorifenyyli)-4-hydroksi-piperi-din-l-yyli]kroman-4,7-diolin (-)-enantiomeeri ;* Otsikon mukainen tuote valmistettiin esimerkissä 2 esitetyn menetelmän mukaisesti käyttäen N-tert-butoksi-35 karbonyyli-D-proliinia erotusaineena. Näin saaduilla 21 113769 välituotteilla ja otsikon mukaisella tuotteella oli seuraavat fysikaaliset tunnusmerkit: (4R,3S)-7-bentsyylioksi-3-[4-(4-fluorifenyyli) -4-hydroksi-piperidin-l-yyli]kroman-4-olin N-tert-butoksi- 5 karbonyyli-D-proliiniesterin (-)-enantiomeeri: sp. 199 - 199,5 °C; [cx]d = -92,5° c = 0,320 (metanoli). Analyysi laskettuna C37H43N2O7: lie: C, 68,71; H, 6,70; N, 4,33.

Havaittu: C, 68,37; H, 6,84; N, 4,34.

(4R,3S)-7-bentsyylioksi-3-[4-(4-fluorifenyyli)-4-10 hydroksi-piperidin-l-yyli]kroman-4-olin (-)-enantiomeeri: sp. 177 - 178 °C; [a]D = -73,0° c = 0,330 (metanoli). Analyysi laskettuna C27H28FNO4 · 1,25 H20:lle: C, 68,70; H, 6,51; N, 2,96. Havaittu: C, 68,76; H, 6,42; N, 3,01.

(4 R,3S)-3-[4-(4-fluorifenyyli)-4-hydroksi-piperi-! 15 din-l-yyli]kroman-4,7-diolin (-)-enantiomeeri: sp. 166,5 - 167 °C; [oOd = -84,1° c = 0,290 (metanoli) . Analyysi laskettuna C20H22FNO4 0,25 H20:lle: C, 66,01; H, 6,23; N, 3,85. Havaittu: C, 66,22; H, 6,27; N, 3,96.

Vaihtoehtoisesti esimerkistä 2 saatu liukoinen 20 L-proliiniesteri hydrolysoitiin litiumalumiinihydridillä oleellisesti edellä kuvatun mukaisissa olosuhteissa esimerkin 2 lähtömateriaalin palauttamiseksi, joka rikastuu (-)-enantiomeerissä. Tätä materiaalia käsiteltiin N-tert-butoksikarbonyyli-D-proliinilla esimerkissä 2 esitetyn • · · • 25 menetelmän mukaisesti tämän esimerkin otsikon mukaisen : : tuotteen tuottamiseksi.

·** Esimerkki 4 .***, (+) - (3R,4S) -3- [4- (4-fluorifenyyli) -4-hydroksi- . piperidin-l-yyli] kroman-4,7- ‘ 30 diolitartraattietanolaattihydraatti ’ Seos, jossa oli ( + )-(3R, 4S)-3-[4-(4-fluorifenyy li) -4-hydroksi-piperidin-l-yyli]kroman-4,7-diolia (2,11 ;· g, 5,87 mmol) ja viinihappoa (0,885 g, 5,90 mmol, Mallin- ckrodt, oikealle kiertävä ja levo-konfiguraatiossa) 35 etanolissa (20 ml, lämmittäen), konsentroitiin amorfisek- » .* si, vaaleankeltaiseksi kiintoaineeksi, jota kuivattiin » > 22 113769 vakuumissa yön yli, jolloin saatiin 2,995 g (100 %) (+)- (3R,4S)— 3 — [ 4 — ( 4-fluorifenyyli)-4-hydroksi-piperidin-1-yy-li]kroman-4,7-diolitartraattietanolaattihydraattia, jolla oli: sulamispisteväli 85 - 95 °C; [a]D = + 55,6°, c = 5 1,140 (metanoli) ; 1H-NMR DMSOd6 δ 7,53 (dd, J = 5,6, 8,7

Hz, 2H) , 7,15 (t, J = 8,9 Hz, 2H) , 7,08 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,81 (leveä s, 7H), 6,40 (dd, J = 2,2, 8,3 Hz, 1H) , 6,22 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 4,85 (s, 1H), 4,45 (d, J = -8,4

Hz, 1H) , 4,21 - 4,13 (m, 3H) , 3,44 (q, J = 7,0 Hz, 2H) 10 3,34 - 3,08 (m, 5H) , 2,19 (leveä q, J = 12,9 Hz, 2H) , 1,72 (leveä t, J = 11,8 Hz, 2H), 1,06 (t, J = 7,0 Hz, 3H) 13C-NMR DMSOd6 δ 174,02, 162,62, 159,41, 158,56, 154,24, 145,10, 131,80, 126,87, 126,77, 114,72, 114,45, 108,80, 1 101,94, 72,11, 68,55, 61,50, 61,08, 60,35, 56,08, 46,57, 15 46,09, 36,39, 36,24, 18,57. Analyysi laskettuna C2oH22FN04-C4H606-C2H60· H20:lle; C, 54,45; H, 6,33; N, 2,44. Havaittu: C, 54,51; H, 6,33; N, 2,49.

i ! i • · • v *

• I

« • > t * *

Claims (5)

113769

1. Yhdiste, tunnettu siitä, että se on (3R1,4S1)-3- [4-(4-fluorifenyyli)-4-hydroksi-piperidin-1- 5 yyli]kroman-4,7-dioli, sen optiset isomeerit ja farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että yhdiste on raseeminen (3R1,4S1)-3-[4-(4-fluorifenyyli)-4-hydroksi-piperidin-l-yyli]kroman- 10 4,7-dioli.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että yhdiste on (+)-(3R,4S)-3-[4-(4- ! fluorifenyyli)-4-hydroksi-piperidin-l-yyli]kroman-4,7-di oli.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että yhdiste on ( —) — (4R,3S)—3— [4— (4 — fluorifenyyli)-4-hydroksi-piperidin-l-yyli]kroman-4,7-dioli .

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, t u n-; 20 n e t t u siitä, että yhdiste on ( + ) - (3R, 4S)-3- [4-(4- j fluorifenyyli)-4-hydroksi-piperidin-l-yyli]kroman-4,7-di- olitartraattietanolaattihydraatti. » * t I 1 1 » 1 1 I t f t II» » » • I » t I I 1 • i I 113769