FI110609B - Menetelmä kasvuhormonikiteiden valmistamiseksi - Google Patents

Description

Menetelmä kasvuhorraonikiteiden valmistamiseksi ^ ~ 110609 5 Esillä oleva keksintö kohdistuu menetelmään kasvuhormoni-(GH)kiteiden tai sen funktionaalisten johdannaisten kiteiden valmistamiseksi.

Kasvuhormoni voi olla ihmisen tai eläinten kasvuhormoni, kulo ten ihmisen kasvuhormoni (hGH), naudan kasvuhormoni (bGH), kalan ja sian kasvuhormoni (pGH).

hGH on proteiini, joka koostuu 191 aminohapon yksittäisestä ketjusta. Molekyyli on kahden disulfidisillan ristikytkemä 15 ja monomeerimuodon molekyylipaino on 22 kDa. Aivolisäkesyn-tyinen ihmisen kasvuhormoni ei ole kuitenkaan homogeeninen. Tunnetaan esimerkiksi myös samasta geenistä tuotettu pienempi 20 kDa:n hGH-variantti. "Emäksinen hGH"-variantti (hGH-V), jota istukka ilmentää raskauden aikana, on toinen 20 analogi, joka on erillisen geenin tuote. Kuten 22 kDa:n hGH, se koostuu 191 aminohaposta, mutta jotka ovat erilaisissa ’ ‘ asemissa molekyylissä 13:n niistä ollessa erilainen. Katso esim. Bewley TA et ai, Adv Enzymol, 42, 73-166, 1975 ja

Frankenne F et ai, J. Clin Endocrin and Metabol, 66, 25 1171-80, 1988.

• · * · · • · ·

Rekombinantti-hGH: ta on ollut kaupallisesti saatavissa usei-ta vuosia. Se on edullisin aivolisäkkeestä johdetuista tuotteista, koska ihmisen kudoksesta valmistettu tuote voi si-30 sältää tartuttavia aineita, kuten Creutzfeldt-Jacobin sai- . . rauden tartuttavan aineen. Kahta tyyppiä terapeuttisesti käyttökelpoista rekombinantti-hGH-valmistetta on kaupan: au-'·;·, tenttinen, esim. Genotropih, Kabi Pharmacia AB, ja analogi, : : jossa on lisämetioniinitähde N-terminaalisessa päässä esim.

3 5 Somatonorni.

• · 2 110609 hGH:ta käytetään lineaarisen kasvun stimuloimiseen potilaissa, joilla on aivolisäkkeen vajaatoiminnan aiheuttama kääpiökasvu tai Turnerin syndrooma, mutta myös muita indikaatioita on ehdotettu.

5

Proteiinien stabiilius on yleinen ongelma lääketeollisuudessa .

Se on usein ratkaistu kuivaamalla proteiini erilaisissa 10 kuivausmenetelmissä, kuten pakastekuivaaminen. Sen jälkeen proteiini on välitetty ja varastoitu kuivatussa muodossa. Potilaan tarvitsee rekonstituoida kuivattu proteiini liuot-timeen ennen käyttöä, mikä on haitta ja tietenkin potilaalle epämukavaa.

1 5

Pakastekuivausmenetelmä on kallis ja aikaa vievä menetelmä-vaihe ja olisi suuri etu, jos tämä vaihe voitaisiin välttää valmistettaessa kaupallista proteiinituotetta.

20 Potilaalle, joka tarvitsee päivittäisiä kasvuhormoni-injektioita, esim. hGH-injektioita, ja erityisesti jos potilas ·;·*: on lapsi, on tärkeää, että tuotetta on helppo käsitellä, : annostella ja injektoida. Pakastekuivatun hGH:n rekonstitu- .···, oiminen vaatii varovaisuutta ja huolellisuutta ja sitä tu- • ; 25 lisi edullisesti välttää mutta se on nykyisin ainoa saata- vissa oleva menetelmä.

Lukuisia tämän ongelman ratkaisuja on selostettu mutta tähän mennessä yhtään tuotetta ei ole tullut myyntiin.

30 WO 89/09614:ssä, Genentech, selostetaan stabiloitu hGH-for-| : ‘ mulointi, joka käsittää glysiiniä, mannitolia ja puskuria ja edullisessa suoritusmuodossa lisätään ei-ionista pinta--aktiivista ainetta, kuten polysorbaatti 80:ä. Natriumfos-35 faattia ehdotetaan puskurisubstanssiksi. Formuloinnin sta-·;·. biilius on parantunut lyofilisessa formuloinnissa ja rekon- stituution jälkeen.

3 110609

Toinen mahdollisuus kasvuhormonin antamiseksi liuoksena on lisätä lohkokopolymeeri, joka sisältää polyoksietyleeni-po-lyoksipropyleeniä EP 211 601:n, International Minerals and Chemical Corporation, mukaisesti.

5 Tämä liuos vapautuu pitkitetysti annettaessa eläimelle.

Tässä patenttihakemuksessa on esitetty erilainen tapa GH:n stabiilius- ja tuotanto-ongelmien kiertämiseksi.

1 0

Kiteyttämällä voidaan saavuttaa uusi kasvuhormonin valmistustapa .

Kasvuhormonikiteitä voidaan käyttää myös erilaisiin uusiin 15 hormonitormulointeihin, kuten esim. erityyppiset injektoitavat suspensiot, implantaatit ja tooppiset formuloinnit.

Kasvuhormonin kiteyttämistä ei ole ollut aiemmin mahdollista suorittaa teollisesti. Clarkson et ai raportoivat J Mol 20 Biol (1989), 208, 719-721 kolmesta erilaisesta kiteytysme-netelmästä, jotka eroavat aiemmin kuvatuista. Käytettiin ·;··· seuraavia menetelmiä: ’ 1. Tiputtaen ja käyttäen etanolia tai metanolia puskurissa, .·*·, joissa saadaan nelikulmaisia kaksoispyramideja, joiden koko .·. : 25 on 10-3 mm^ ja solumitta 134 Ä (0, 0134 mikronia) vuoden : sisällä.

2. Tiputtaen, käyttäen asetonia puskurissa, jossa saadaan kolmikulmaisia prismoja, joiden koko on 2x10-^ mm^ 3-14 päivän kuluttua.

30 3 . Erätapa käyttäen paraldehydiä ja saaden ortorombisia suuntaissärmiöitä, joiden koko on 2x1O-^ mm^ useiden viik-;.· ’ ko j en kuluttua. Kirjoittajat kommentoivat, etteivät he on- : : nistuneet suurien yksittäisten kiteiden saamisessa.

35 WO 92/00998: ssa, Novo Nordiska A/S, selostetaan menetelmä kemiallisesti vakaiden ja biologisesti aktiivisten kasvu- '·· hormonikationikiteiden valmistamiseksi. Menetelmä käsittää : vaiheet: kationien lisääminen GH-liuokseen pH:ssa 5-8, ki teiden kasvattaminen lämpötilassa 0-30 °C ja kiteiden eris- ^ 110609 täminen. Saatu kide on kationi-GH-kide. Edullinen kationi on Zn2* ja orgaaninen liuotin lisätään edullisesti yhdessä kationin kanssa.

5 Saadut kiteet sisältävät aina kationin ja ovat pieniä. Sinkkiä sisältävien kiteiden pituus vaihtelee esimerkeissä välillä 3-12 mikronia.

B C Cunningham et ai:n artikkelissa, Science, Voi 253, 10 545-548, 1991, selostetaan hGH:n dimerointi sinkillä.

Markkinoilla on kysyntää paremmista hGH:n antotavoista. Joitakin keinoja tämän kysynnän tyydyttämiseksi on saada aikaan joko käyttövalmiita injektioliuoksia tai saada aikaan injek-15 toitava varastoformulointi, esim. suspendoituja hGH-kiteitä.

hGH-kiteitä voidaan käyttää suspensiona tai vesipitoisena injektoitavana liuoksena yhdessä puskureiden kanssa ja yhdessä säilöntäaineiden kanssa tai ilman niitä. Niitä voidaan myös 20 käyttää varastoformulointina, esim. öljy- tai vesisuspensiona tai implantaattina saaden siten aikaan lääkkeen hidas vapau- . . tuminen.

• · • · *;·· Jos kiteet ovat riittävän suuria, niitä voidaan käyttää jau- t · *· ‘ 25 heena ja ne voidaan levittää pinnalle, esim. haavalle. Liian * » • · · ( lii lii :.: : pienet partikkelit eivät ole sopivia, sillä ne muodostavat V ·' pölyä ja niitä ei voida käyttää suoraan.

Olemme suureksi yllätykseksi keksineet uuden menetelmän puh-30 taiden, aktiivisten GH-kiteiden valmistamiseksi lisäämättä : kationeja tai liuottimia, kuten metanolia, etanolia, asetonia ,·*· tai paraldehydiä, jotka eivät ole terapeuttiselta kannalta hyväksyttäviä. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty ·.’ oheisissa patenttivaatimuksissa, ti": 35 ;·. Tällä uudella menetelmällä voidaan kiteitä muodostaa hyvin lyhyessä ajassa. Käytettäessä jotakin nimetyistä yhdisteistä, katso esimerkki 22, kiteet muodostuvat silmänräpäyksessä ja korkeintaan tunnissa. Tätä voidaan verrata Carlsson s 110609 et al:n esittämään menetelmään, joka tuottaa kiteitä useiden viikkojen kuluttua. Lisäämällä yleisen rakenteen (I) mukaista kemiallista yhdistettä GH-liuokseen voidaan GH-ki-teitä muodostaa helposti ja nopeasti. Lisääminen voidaan 5 suorittaa edullisesti yhdistettä sisältävän liuoksen viimeisessä dialyysi- tai kromatografiapuhdistusvaiheessa.

Tällä menetelmällä on mahdollista vaihdella olosuhteista ja ajasta riippuen kiteiden kokoa, mikä on suuri etu valmis-10 tettaessa erilaisia hGH:n antamiseen tarkoitettuja formulointeja.

Saatu kiteinä oleva GH on materiaali, joka sisältää normaalisti yli 80 % monomeeristä GH:ta.

1 5 hGH:n valmistamisessa olisi suuri etu, että on olemassa nopea menetelmä kiteiden valmistamiseksi kationeja välttäen.

20 Tätä menetelmää voidaan myös käyttää teknisissä puhdistus-ja valmistusmenetelmissä.

.·. Uusi menetelmä kasvuhormoni(GH)kiteiden tai sen funktionaa- ··· listen johdannaisten kiteiden valmistamiseksi käsittää vai- 25 heet: . i) GH:n tai sen funktionaalisten johdannaisten sekoittami- sen vesiliuokseen, joka käsittää puskurin ja kemiallisen yhdisteen, jolla on yleinen kaava (I): 30 Ar - [ - CR-|R2 - ]n - [ - C R3R4 - ]m - C R5R6 - OH (I) : jossa

Ar on fenyyli, alkyylillä substituoitu fenyyli, naftyyli, alkyylillä substituoitu naftyyli, ··;· 35 R-| -Rg on H, OH tai alkyyli, "··· n ja m on 0 tai 1 , ·'·, ii) inkuboinnin, iii) kiteiden eristämisen tunnetuilla menetelmillä.

6 110609

Inkuboinnilla tarkoitetaan erilaisia alan ammattimiehen tuntemia kiteytysmenetelmien tyyppejä.

Laboratorioskaalassa tiputusmenetelmä on edullinen, mutta te-5 ollisuusskaalassa helpoin tie on antaa liuoksen seisoa. Yhdiste valitaan edullisesti bentsyylialkoholista, 2-metyy-libentsyylialkoholista, 1-(1-naftyyli)etanolista, fenyyli- etanolista, 1-fenyyli-l-propanolista, 2-fenyyli-2-propano-lista, 3-fenyyli-l-propanolista.

10

Keksintö kohdistuu myös yleisen kaavan (I) mukaisen kemiallisen yhdisteen käyttöön GH-kiteiden valmistamiseksi puskuri-liuoksesta.

15 Kun bentsyylialkoholia käytetään, edullinen määrä on vähintään 1 %. Puskuri voi olla esim. sitraatti konsentraatiossa 2-50 mM, edullisesti 5-20 mM ja erityisesti 5 mM tai 10 mM. Puskuri voi olla myös natriumsitraatin ja natriumfosfaattien seos. Vesiliuos voi käsittää glysiiniä, lysiiniä, mannitolia 20 ja/tai glyserolia.

iiri ‘ Aloitus-pH 5,8-6,3 ja edullisesti 6,2 antaa hyvät tulokset.

Kiteiden muodostuminen riippuu ajasta, pH: s ta ja lämpöti-•’>(i lasta. Lämpötilassa 20 °C - 30 °C kiteet muodostuvat nor- 25 maalisti nopeasti, toisinaan silmänräpäyksessä ja useimmiten • ,·’ tunnin sisällä.

* ♦ · » * • · • ·

Keksintöön kuuluvat myös neulamuodossa, kolmikulmiona, kuutioina tai suuntaissärmiöinä olevat kasvuhormonikiteet ja sen 30 funktionaalisen analogin kiteet, joiden pituus on vähintään . , 20 mikronia. Joissakin tapauksissa saadut kiteet ovat jopa •t] yli 1 mm. Pituus on edullisesti vähintään 50-2000 mikronia ja edullisemmin 100-300 mikronia. Keksinnön mukaiset kiteet ovat siten suurempia kuin aiemmin saadut kiteet.

t :*·* 35 * Keksinnön mukaisesti saadut kiteet ovat käyttökelpoisia käyt- * ’ täessä ihmis- ja eläinlääketieteessä erilaisissa antomuodois- sa, esim. tooppisessa, nasaalisessa, pulmonaalisessa, oraalisessa, rektaalisessa ja parenteraalisessa antomuodossa.

7 110609

Injektointisuspensiot, varastoformuloinnit ja kuivaformu-loinnit, jotka käsittävät keksinnön mukaisia kiteitä, kuuluvat keksintöön.

5 Keksintö kohdistuu myös menetelmään kasvuhormonin tai minkä tahansa sen funktionaalisen analogin tarpeessa olevan potilaan hoitamiseksi antamalla keksinnön mukaista formulointia sekä GH-kiteiden käyttöön kasvuhormonin tai minkä tahansa sen funktionaalisen analogin tarpeessa olevan potilaan hoitoon 10 tarkoitetun lääkkeen valmistuksessa.

Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää GH:n puhdistusmenetelmässä .

15 Keksinnön mukaisesti saadut kiteet ovat osoittautuneet biologisesti aktiivisiksi.

Kasvuhormoni voi olla sekä ihmisen että eläimen kasvuhormoni, kuten ihmisen kasvuhormoni (hGH), naudan kasvuhormoni (bGH), 20 kalan ja sian kasvuhormoni (pGH).

Kasvuhormonilla (GH) tarkoitetaan sekä luontaisesti esiin-.···. tyviä että rekombinantti-GH: itä (rGH) . Funktionaalisilla ana- .·, ; logeilla tarkoitetaan yhdisteitä, joilla on sama tera- . 25 peuttinen vaikutus kuin kasvuhormonilla eläimessä. Rekom- binantti-hGH (rhGH) on edullinen.

• · Käyttämällä GH-kiteitä formulointi ei ole riippuvainen käytettyyn kantaja/puskuriin liukenevuudestaan, joka rajoittaa 30 GH-määrää tilavuutta kohti. Tämä on selvä keksinnön mukaisten kiteiden etu.

Kuivassa koostumuksessa, suspensiossa tai varastokoostumus-kessa GH:n määrä lääkkeenvälitysjärjestelmässä tilavuutta "··* 35 kohti voi olla hyvin korkea.

·;·*: Muodostetut kiteet on esitetty kuviossa 1, joka on muodos tuneiden kiteiden mikroskopia.

8 110609

Esimerkit 1 -20

Formulointitutkimusten materiaali oli lääkesubstanssi tavallisessa GenotropinR-prosessissa. Puhdistusmenetelmän jälkeen saatu eluaatti sisältää suunnilleen 36 IU/ml.

5

Formulointi suoritettiin laboratorioskaalassa geelisuodat-tamalla, joka tehdään aiemmissa puhdistusvaiheissa käytettyjen suolojen poistamiseksi, ja lisäämällä lopullinen for-mulaation aineosat. Pylväs, Sephadex G-25 (Pharmacia), 10 tasapainotettiin formulointipuskurilla. Kromatografia suoritettiin +7 °C:ssa.

Haluttu proteiinikonsentraatio saavutettiin laimentamalla formulointipuskurilla. Liuos suodatettiin steriiliksi ja 15 laitettiin lasipatruunoihin. Neulasten muodostumista erilaisissa liuoksissa seurattiin esimerkeissä 1-20 ja 22. Saadut hGH-kiteet karakterisoitiin.

Menetelmät: 20 Eristäminen

Kiteet sentrifugoitiin ja supernatantti otettiin pois pipe-·;·· tiliä. Jäännös pestiin ja sentrifugoitiin 6 kertaa vedellä, .·. sen jälkeen 3 kertaa asetonitriilillä ja lopuksi kahdesti ,···. dietyylieetterillä. Kiteet kuivattiin.

25 . Polypeptidien kokojakauma (SDS-PAGE) • > • ·

Somatropiini (hGH) valmisteissa olevat proteiinit denaturoitiin natriumdodekyylisulfaatilla (SDS) SDS-proteiinin negatiivisesti varautuneiden kompleksien saamiseksi. Erottami-30 nen suoritettiin molekyylikoon mukaisesti elektroforeesilla polyakryyliamidigeeleillä (PAGE) SDS:n läsnäollessa. hGH:n j j suhteellinen polypeptidikokojakauma määritettiin hopealla värjättyjen polypeptidikaistoj en densitometrisellä skan-nauksella.

35

Ohutkerroskromatoqrafia (TLC)

Ohutkerroskromatograf ia suoritettiin pi idioks idigeel i-levyillä (Merck wt 5715) ja kehitettiin n-butanoli: etikka-happo: vesi:etyyliasetaatissa, 1:1:1:1. Evaluointi perustui 9 110609 kolmeen erilaiseen visualisointitekniikkaan, jotka käsittävät UV-valon 254 nm:ssä yleisseulontaan, ninhydriinireak-tion primäärisille aminoryhmille ja kaliumpermanganaatti-reagenssit.

5 ELISA, immunosorbenttitesti

Mikrotiitterilevyjä (Nunc a/s, Tanska), jotka on päällystetty immunosorbenttipuhdistetuilla kanin vasta-aineilla, jotka on suunnattu hGH:ta vastaan, inkuboitiin seeruminäyt-10 teillä, viitteet (standardit) ja verrokit. Pesemisen jälkeen lisättiin Fab'-anti-hGH-biotiinikonjugaattia ja annettiin sitoutua kiintofaasin antigeeneihin. Lisäpesuvaiheen jälkeen lisättiin Streptavidiini-HRP-konjugaattia ja annettiin sitoutua kiintofaasin biotiiniin. Kiintofaasissa ole-15 van HRP:n määrä määritettiin sitten käyttämällä substraatteja H2O2 ja 3,3',5,5'-tetra-metyylibentsidiini (TMBZ) ja perboraaatti. Lopullinen hapettunut tuote mitataan absor-bansiltaan 450 nm:ssä. Pienin havaittava konsentraatio on 0,4 mU/1. 0,72 mU/l:ssa variaation testin väliset ja testin 20 sisäiset kertoimet ovat 2,3 ja 9,0 % vastaavasti ja 4,07 mU/l:ssa variaatiot ovat 2,2 ja 11 % vastaavasti.

• M t

.·. · HPLC

,·*· AshaiPac-OD 550, käänteisfaasi / Tris (pH 8,5) t !" 25 n-propanoli, isokraattinen.

. Havainnointi: 21 ja 280 nm.

• · 1 · * * < *

Geelisuodatus

Superdex 75/0,05 M fosfaattipuskuri pH 7,4 30 Havainnointi: 280 nm.

; ; Visuaalinen tarkastus ; Liuosten ulkonäkö tutkittiin silmämääräisesti Ph. Eur., 2.

V painos, mukaisesti.

35 : pH mitattiin lasi- ja kalomelielektrodeilla.

Esimerkit 1 2 3 4 5 6 10 110609 hGH IU/ml 20 20 20 20 20 20

Na -sit- 5 raatti, 10 10 10 10 - 5 mM x citr.+fos* glysiini ,12 - 12 - - 12

mM

10 lysiini, - _____

mM

mannitoli, 150 150 - - - 130 mM - - 150 150 130 glyseroli 15 bentsyy- 1 111 1,25 1 lialk. % tilavuus,1 1 1 1 1 3,4 ml 20 Lähtöar- .... vot: 6,3 6,3 6,2 6,2 6,1 6,2-6,3

pH

i * * ,”· visuaal. kirkas kirkas kirkas kirkas kirkas kirkas 25 tarkastus « » » » » f » t * • ·

Tulokset 3 viikkoa 30 °C:ssa varastoinnin jälkeen pH 6,3 6,3 - - - 6,2 visuaal.

30 tarkastus kirkas kirkas kiteinen kiteinen kiteinen kiteinen

4 I

f * t f ( • I » 4 » t * » f ( » ,, 110609

Esimerkit 7 8 9 10 11 hGH IU/ml 20 20 20 20 20 35 Na-sit- raatti, ni 10 10 10 citr.+fos* - - - x x glysiini, mM 12 - - 12 40 mannitoli, mM 150 150 - 150 150 glyseroli - - 150 bentsyyli- alk. % λ 1 1 1 1 45 tilavuus, ml 1 1 1 1 1 lähtöarvot: 50 pH 6,2 6,2 6,2 6,2 6,2 vi suaal.

tarkastus kirkas kirkas kirkas kirkas kirkas . Tulokset 3 viikkoa 30 °C:ssa varastoinnin jälkeen ' 55 pH 6,3 6,3 6,3 6,4 6,3 ; vi suaal.

···' tarkastus kiteinen kiteinen kiteinen kiteinen kiteinen

Esimerkit 12 13 14 15 16 60 12 110609 hGH IU/ml 20 20 20 20 20

Na-sit- raatti, mM- - 10 10 10 citr.+fos* x x 65 glysiini, mM 12 - - 29 lysiini - - 12 - 29 mannitoli, mM - - 130 130 130 70 glyseroli 150 150 bentsyyli- alk. % 1 1 1,5 1,5 1,5 t ilavuus, 75 ml 1 1 1 1 1 Lähtöarvot: pH 6,2 6,2 6,2 6,2 6,1 vi suaal.

80 tarkastus kirkas kirkas op** op** op**

Tulokset 3 viikkoa 30 °C:ssa varastoinnin jälkeen ' / pH 6,3 6,3 ’··" visuaal.

' 1: 85 tarkastus kiteinen kiteinen · Tulokset 3 kuukautta 5 °C:ssa varastoinnin jälkeen pH 6,3 6,3 6,3 vi suaal.

90 tarkastus kiteinen kiteinen kiteinen ·;· * x tarkoittaa seosta, jossa on 1,7 mM Na-sitraattia ja 6,7 mM Na-fos- ’. . faattipuskurij ärj estelmää.

sl» * ,,,: tarkoittaa opalisoivaa ,3 110609 95 Esimerkit 17 18 19 20 hGH IU/ml 20 4 20 20

Na-sit- raatti, mM 10 5 100 citr.+fos* x - - x g lys iini, mM 12 12 12 12 mannitoli, mM 250 250 250 250 105 bentsyyli- alk. % - t ilavuus, ml 1 31 1 1 1 o Lähtöarvot: pH 6,3 6,3 6,1 6,3 v i s u a a 1 .

tarkastus kirkas kirkas kirkas kirkas 1 1 5

Tulokset 3 viikkoa 30 °C:ssa varastoinnin jälkeen pH 6,4 6,2 6,2 6,4 v i s u a a 1 .

tarkastus kirkas kirkas kirkas kirkas !!.** 120

Tulokset 3 kuukautta 5 °C:ssa varastoinnin jälkeen : ; pH 6,3 6,3 visuaal.

tarkastus kirkas kirkas 1 25 * x tarkoittaa seosta, jossa on 1,7 mM Na-sitraattia ja 6,7 , . mM Na-fosfaattipuskurijärjestelmää.

• · '[ Selostus \· 130 Bentsyylialkoholia sisältävät koostumuksemme tuottivat nor- maalisti kiteitä pH-alueella 6,1-6,3 ja liuokset, joissa · ei ollut bentsyylialkoholia, eivät tuottaneet kiteitä tällä : ’ pH-alueella. Formuloinnit 1 ja 2 olivat kirkkaita johtuen 14 110609 bentsyylialkoholin lisäämisestä pH:ssa 6,3, joka näyttää olevan kriittinen arvo kiteiden muodostumiselle bentsyyli-alkolissa.

5 Tulokset ja identifiointi

Mikroskopia

Kiteet olivat eripituisten neulasten muodossa. Suurin oli noin 0,3 x 0,03 mm. Katso kuvio 1.

10 Sulamispisteen määrittäminen

Sulamispiste suoritettiin Leitz-Wetzlar-mikroskoopissa. Mitään sulamispistettä ei voitu havaita. Kiteet olivat in-takteja 230 °C:een saakka, ja sen jälkeen alkoivat olla vääränvärisiä. Noin 290 °C:ssa kiteet olivat mustia muttei-15 vät vielä sulaneita (pyrolyysi).

Liukenevuus

Kiteet olivat orgaanisiin liuottimiin, kuten dikloorimetaa-ni, asetonitriili, etanoli, dimetyyliformamidi, dietyyli-20 eetteri, liukenemattomia. Niiden veteen liuottaminen oli vaikeaa mutta ne olivat liukenevia happoihin, kuten 1 % etikkahappo, 6 M HC1, sekä emäkseen, kuten 0,1 M fosfaattipuskuri, pH 8.

\ 25 Ohutkerroskromatografia (TLC)

Kiteet, jotka liuotettiin 10-%:iseen etikkahappoon ja pus-’•J kurikomponentteihin, so. sitruunahappoon, mannitoliin, gly- j ; siiniin ja bentsyylialkoholiin, tutkittiin.

30 Kiteet eivät migratoituneet tässä järjestelmässä, kun taas kaikki puskurikomponentit migratoituivat.

Kidenäyte absorboi UV-valoa ja se reagoi positiivisesti ninhydriinin ja permanganaattireagenssien kanssa, mikä 35 osoittaa aromaattisten ryhmien, aminoryhmien ja hapettuvien . ryhmien läsnäolon.

15 110609

Hydrolyysi

Kidenäytteen ja hGH-viite-esimerkin hydrolysointi 6 M HCl:ssa, 110 °C:ssa, 20 tuntia. Analysointi käyttäen TLC:tä osoitti identtiset kohdat.

5

HPLC, geelisuodatus, SDS-PAGE, IEF

Kidenäyte oli lähes identtinen hGH-viite-esimerkin kanssa. Aminohappoanalyysi 10 Kiteillä saadut koetulokset olivat hyvin yhtäpitäviä teoreettisen arvon kanssa sekä hGH-viite-esimerkin kanssa. Katso seuraava taulukko:

Komponentti Teoreettinen arvo Kiteitä 15 Asp 20 19,9

Thr 10 9,7

Ser 18 17,8

Glu 27 26,8

Pro 8 8,2 20 Gly 8 8,2

Ala 7 7,0

Puoli-Cys 4 3,2

Vai 7 7,2 ' ‘ Met 3 3,0 25 Ile 8 8,2 ... Leu 26 26,2

Tyr 8 8,2

Phe 13 13,0 : His 3 3,1 30 Lys 9 9,3

Trp 1 *

Arg 11 11,1 I, * ei määritetty 35 V Kidenäytteen proteiinipitoisuus oli laskettuna määrästä 0,22 mg 84 %. Viitemateriaalissa (0,45 mg) oleva pitoisuus ; * oli 91 %.

1« 110609

Esimerkki 21

Mitään kiteitä ei muodostunut liuokseen, joka sisältää 20 IU/ml hGH 5 mM Na-sitraattia 5 12 mM glysiiniä 250 mM mannitolia ja 1 % bentsyylialkoholia pH:ssa 6,4 10 Lisäämällä enemmän bentsyylialkoholia (so. > 1 %) kiteet muodostuivat kuitenkin nopeasti. Kiteitä muodostui myös alentamalla pH lähemmäksi 6:a tai alle 6:n.

Kiteiden morfologiaa voidaan vaihdella pH:11a ja kasvuno-15 peudella. Kun pH on lähempänä 6,3:a, kiteet ovat kuten neuloja ja suuntaissärmiöitä. 24 tunnissa muodostuu kiteitä, joiden pituus on 0,1-0,3 mm ja jotka ovat noin 0,001-0,005 mm paksuja. Siten muuttamalla pH:ta voidaan kiteiden koko muuttaa.

20

Pienempiä kiteitä muodostuu lyhyemmässä ajassa.

Esimerkki 22

Muista kemiallisista koostumuksista tutkittiin kasvuhormo-25 nikiteiden muodostumiskyky.

,’· Materiaali formulointitutkimuksia varten oli lääkesubstans- • si tavallisessa GenotropinR-menetelmässä. Puhdistusmenetel män jälkeen saatu eluaatti sisältää suunnilleen 36 IU/ml 30 ennen formulointia.

Formulointi suoritettiin laboratorioskaalassa dialysoimalla vasten käytettyä puskuria.

35 Menetelmää "tiputus" käytettiin kasvuhormonin kiteyttämi- i I; seen käyttökelpoisten aineiden tutkimiseen.

t « "Tiputus"menetelmän on kuvannut A Ducruix ja R Giege, Crys- 17 110609 tallisation of Nucleic Acids and Proteins, A practical approach, IRL Press at Oxford, 1991, sivut 82-86.

Tipan aloitustilavuus oli 5 μΐ + 5 μΐ ja kolon tilavuus 1 5 ml. Kokeiden aikana käytetty puskuri sisälsi seuraavia aineosia : Jäljempänä mainittua yhdistettä 200 mM Na-sitraattia 10 pH 6,2

Erilaisilla kiteytysaineilla kiteytysaineilla saatiin seuraavia tuloksia: 1 5 Yhdiste_Kiteet_ bentsyylialkoholi suuri yksittäinen ±1-(1-naftyyli)etanoli suuri yksittäinen (±)fenyylietanoli suuri yksittäinen +fenyylietanoli suuri yksittäinen 20 -fenyylietanoli suuri yksittäinen 1- fenyyli-1-propanoli suuri yksittäinen (±)1-fenyyli-propanoli suuri yksittäinen 2- fenyyli-2-propanoli suuri yksittäinen > « · 3- fenyyli-1-propanoli suuri yksittäinen . ‘ 25 2-metyylibentsyylialkoholi yksittäinen ,’· Joillakin käytetyistä kiteytysaineista kiteet muodostuivat ; hitaammin. Käytettäessä ±1-1-naftyyli)etanolia kiteet muo dostuivat parin viikon kuluttua ja koko oli 200-500 mikro-30 nia. Na-sitraattipuskurin asemasta käytettiin myös MES-pus-kuria. Tulokset olivat samat kuin Na-sitraattipuskuria käytettäessä. Kuitenkin kiteytysainetta tarvittiin suurempi . konsentraatio, kun mitään sitraattia ei ollut läsnä.

i f ► ' i » '( 35 Kun muita, yleisen kaavan (I) ulkopuolella olevia, kitey- tysaineita testattiin samalla tavalla kuin edellä, ei mitään kiteitä muodostunut.

» i i f 1 8 110609

Yhdiste_Kiteitä 3- metyyli-4-nitrobentsyylialkoholi ei yhtään 2-nitrobentsyylialkoholi ei yhtään 4- nitrobentsyylialkoholi ei yhtään 5 1-naftoli ei yhtään 2-naftoli ei yhtään fenoli ei yhtään bentsaldehydi ei yhtään bentsyyliamiini ei yhtään 10 (-)1-fenyyli-1-butanoli ei yhtään L-fenyyliglysinoli ei yhtään

Esimerkki 24

Kiteiden immunologinen analyysi suoritettiin. Kiteet muo-15 dostettiin esimerkkien 1-20 mukaisesti puskurissa, joka sisältää: 20 IU/ml kasvuhormonia 5 mmoolia Na-sitraattia 12 mmoolia glysiiniä 20 130 mmoolia mannitolia 1 % bentsyylialkoholia 0,17 mg muodostettuja kiteitä liuotettiin 0,340 ml:aan 0,05 : M fosfaattipuskuroitua suolaliuosta, pH 7,5, joka sisältää ; :25 0,05 % Tween 20. Liuos laimennettiin edelleen 1 0-kertaisis- ;* sa vaiheissa samaan puskuriin. Kaikki yksittäiset laimen-: .·. nusvaiheet analysoitiin 4 kertaa.

Entsyymikytkettyä immunosorbenttitestiä, ELISA, Immunosor-30 bent assay, käytettiin rhGH:n mittaamiseen liuotetuissa kiteissä.

: rhGH:n määrän todettiin olevan lasipullossa 0,15 mg.

.’.35 Esimerkki 24 .··*. Biotesti '·· Edellä olevan esimerkin mukaisesta liuoksesta kasvatettiin : ’* kiteitä ja ne laitettiin 0,5 ml:n näytteinä lasisäiliöihin.

Valmistuksen jälkeen liuosta varastoitiin 1 viikko, jotta 1 9 110609 kiteet kasvavat. Niitä varastoitiin edelleen 5 °C:ssa 3 kuukautta ennen kiteiden keräämistä. Kun kiteet kerättiin, kiteitä ympäröivä supernatantti imettiin pois. Kiteet huuhdeltiin kahdesti 0,25 ml:lla esimerkin 6 mukaista puskuria 5 (so. esimerkin 6 mukainen koostumus lukuunottamatta kasvuhormonia). Toinen huuhteluvaihe päätettiin sentrifugoimalla kiteet ennen huuhtelupuskurin poisheittämistä. Jäljelle jääneet kiteet liuotettiin 0,5 ml:aan puskuria, jossa on 5 mM natriumsitraattia, 12 mM glysiiniä ja 130 mM mannitolia, 10 pH 6,1. Useita näytteitä yhdistettiin biotestianalyysissä käytettäväksi.

Geelisuodatuskromatografia tehtiin edellä mainitun menetelmän mukaisesti valmistetulle näytteelle. Kasvuhormoni 15 osoittautui olevan 100-%:isesti monomeeristä kiteyttämisen ja sitä seuraavan liuottamisen jälkeen.

Liuenneiden kasvuhormoni(GH)kiteiden biotesti:

Sen tutkimiseksi olivatko saadut GH-kiteet biologisesti 20 aktiivisia, rotille, joilta on poistettu aivolisäke suoritettiin painonlisäystesti.

'·"· Rotat hankittiin Möllegaard A/S:stä, Tanska. Rotilta pois-tettiin aivolisäke viikko ennen saapumista ja siten endo-: :25 geenisen kasvuhormonin ja muiden aivolisäkehormonien puut- tuminen tuotti kitukasvuisuuden. Rotat punnittiin niiden * » • saapuessa laboratorioon ja ennen testiä. Rotat, joiden pai-no muuttui <10 %, hyväksyttiin tutkimukseen.

30 Sitten rotat jaettiin umpimähkäisesti 15:n ryhmiin. Niitä käsiteltiin kahdesti päivässä 4 päivää joko talon omalla ihmisen rekombinantti-GH-standardivalmisteella (kalibroitu · vasten WHO 80/505 siten, että sen biologinen teho on 4,5 ·.1 IU/lasipullo) tai liuoksella, joka on tehty GH-kiteestä, ·|·35 kahtena annoksena. Standardiannokset olivat 0,04 IU/päivä ,··. ja 0,16 IU/ml.

“ Ryhmät punnittiin ennen ensimmäistä injektiota (päivä 1) ·. ja suunnilleen 16 tuntia viimeisen injektion jälkeen (päivä 20 110609 5). Näiden painojen välinen ero lasketiin ja teho määritettiin vertaamalla kideliuoksella käsitellyistä eläimistä saatuja tuloksia standardilla käsiteltyjen ryhmien tuloksiin.

5

Tulokset on esitetty seuraavassa (painonlisäys, d SD):

Annos 0,04 IU/päivä 0,16 IU/päivä 10 Standardi 12,2 8,9 17,7 8,7 GH-kiteet 17,3 8,0 21,3 1,7

Liuenneiden GH-kiteiden biologisen tehon havaittiin olevan 7,1 IU/ml.

1 5 Täten olemme osoittaneet, että liuenneissa GH-kiteissä oleva ihmisen kasvuhormoni on biologisesti aktiivista in vivo.

» « * * * »

Claims (5)

21 Patenttivaatimukset 110609

1. Menetelmä kasvuhormoni(GH)kiteiden tai niiden funktionaalisten johdannaisten valmistamiseksi, tunnettu siitä, et-5 tä se käsittää vaiheet: i) GH:n tai sen funktionaalisten johdannaisten sekoittamisen vesipitoisen liuoksen kanssa, jossa on puskuria ja kemiallista yhdistettä, jolla on yleinen kaava (I):

10 Ar- [-CR.R,-]n - [-C - C R5R.-OH (I) jossa Ar on fenyyli, alkyylillä substituoitu fenyyli, naf tyyli, alkyylillä substituoitu naftyyli,

15 R. R- on H, OH tai alkyyli, n ja m on 0 tai 1, ii) inkuboinnin, iii) kiteiden eristämisen tunnetuilla menetelmillä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että GH on ihmisen GH.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu sii-tä, että GH on rekombinanttinen ihmisen GH(rhGH). ‘ 25

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, • tunnettu siitä, että yhdiste on valittu bentsyylialkoho- • · » » lista, 2-metyylibentsyylialkoholista, 1-(1-naftyyli) etanolista, fenyylietanolista, 1-fenyyli-l-propanolista, 2-fenyy-30 li-2-propanolista, 3-fenyyli-l-propanolista.

. , 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu sii- *;] tä, että yhdiste on bentsyylialkoholi. 22 Patent kr av *] 10609