DE69322654T2

DE69322654T2 - Verfahren zur herstellung von kristallen des wachstumshormones und die so erhaltenen kristalle

Info

Publication number: DE69322654T2
Application number: DE69322654T
Authority: DE
Inventors: Ebba S-113 27 Stockholm Florin-Robertsson; Elvy S-122 32 Enskede Hoekby; Ronny S-178 32 Ekeroe Lundin; Tomas S-11255 Stockholm Lundqvist; Sirkka S-115 36 Stockholm Thome; Gertrud S-152 57 Soedertaelje Westin-Sjoedahl
Original assignee: Pharmacia and Upjohn AB
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1992-10-28
Filing date: 1993-10-27
Publication date: 1999-06-17
Anticipated expiration: 2013-10-28
Also published as: NO320171B1; NO951547L; DK0669934T3; ES2126660T3; ATE174602T1; CA2147482A1; US5734026A; CA2147482C; DE69322654D1; EP0669934A1; AU679012B2; FI110609B; FI952021A0; FI952021L; HK1013299A1; AU5401194A; JP3470135B2; WO1994010192A1; NO951547D0; SE9302278D0

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Kristallen von Wachstumshormon (GH) oder funktionellen Derivaten davon. Sie betrifft auch Kristalle von Wachstumshormon und Zusammensetzungen, die diese enthalten.
Wachstumshormon kann sowohl menschlich als auch tierisch sein, wie beispielsweise menschliches Wachstumshormon (hGH), Wachstumshormon vom Rind (bGH), von Fisch und vom Schwein (pGH).
hGH ist ein aus einer einzelnen Kette von 191 Aminosäuren bestehendes Protein. Das Molekül ist durch zwei Disulfidbrücken quervernetzt, und die monomere Form hat ein Molekulargewicht von 22 kDa. Jedoch ist menschliches Wachstumshormon aus der Hypophyse nicht homogen. Beispielsweise ist ebenfalls eine von demselben Gen produzierte kleinere hGH- Variante von 20 kDa bekannt. Die "basische hGH" ("basic hGH")-Variante (hGH-V), die durch die Plazenta während der Schwangerschaft exprimiert wird, ist ein weiteres Analog, das ein Produkt eines separaten Gens darstellt. Wie das hGH von 22 kDa besteht sie aus 191 Aminosäuren, jedoch sind in verschiedenen Positionen innerhalb des Moleküls 13 von diesen unterschiedlich. Siehe z. B. Bewley TA et al.; Adv Enzymol; 42, 73-166, 1975, und Frankenne F et al.; J. Clin. Endocrin and Metabol; 66, 1171-80, 1988.
Seit mehreren Jahren ist rekombinantes hGH (22 kDa) kommerziell erhältlich. Es ist gegenüber von der Hypophyse abgeleiteten Produkten bevorzugt, da das aus menschlichem Gewebe hergestellte Produkt infektiöse Mittel, wie jenes für die Creutzfeld-Jacob-Erkrankung, enthalten könnte. Es gibt zwei Typen therapeutisch nützlicher rekombinanter hGH- Präparationen auf dem Markt: das authentische, z. B. Genotropin®, Kabi Pharmacia AB, und ein Analog mit einem zusätzlichen Methioninrest am N-terminalen Ende, z. B. Somatonorm®.
hGH wird verwendet, um Längenwachstum in Patienten mit Zwergwüchsigkeit aufgrund von Hypophysenvorderlappeninsuffizienz oder Ullrich-Turner-Syndrom zu stimulieren, jedoch sind ebenfalls andere Indikationen vorgeschlagen worden.
Die Stabilität von Proteinen ist in der pharmazeutischen Industrie allgemein ein Problem.
Es ist oftmals durch Trocknen des Proteins in verschiedenen Trocknungsprozessen, wie Gefriertrocknung, gelöst worden. Das Protein ist danach verteilt und in getrockneter Form gelagert worden. Der Patient muß notwendigerweise das getrocknete Protein vor einer Ver wendung in einem Lösemittel rekonstituieren, was einen Nachteil und selbstverständlich eine Unbequemlichkeit für den Patienten darstellt.
Der Gefriertrocknungsprozeß ist eine kostspielige und zeitaufwendige Verfahrensstufe und es wäre von großem Vorteil, wenn dieser Schritt bei der Herstellung eines kommerziellen Produkts eines Proteins vermieden werden könnte.
Für einen Patienten, der tägliche Injektionen eines Wachstumshormons, z. B. von hGH, benötigt und insbesondere, wenn der Patient ein Kind ist, ist es wichtig, daß das Produkt leicht handzuhaben, zu dosieren und zu injizieren ist. Die Rekonstitution von gefriergetrocknetem hGH erfordert Umsicht und Sorgfalt und sollte vorzugsweise vermieden werden, stellt jedoch das einzige gegenwärtig verfügbare Verfahren dar.
Verschiedene Lösungen dieses Problems sind offenbart worden, aber bis jetzt ist kein Produkt auf dem Markt erschienen.
In WO 89/09614, Genentech, wird eine stabilisierte Formulierung von hGH, umfassend Glycin, Mannitol und einen Puffer, offenbart und in einer bevorzugten Ausführungsform wird ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel, wie Polysorbat 80, zugesetzt. Als Puffersubstanz wird Natriumphosphat vorgeschlagen. Die Formulierung weist in einer lyophilisierten Formulierung und nach Rekonstitution erhöhte Stabilität auf.
Eine andere Möglichkeit zur Verabreichung von Wachstumshormon in einer Lösung besteht darin, ein Polyoxyethylen/Polyoxypropylen enthaltendes Blockcopolymer gemäß EP 211 601, International Minerals and Chemical Corporation, zuzusetzen. Diese Lösung gewährleistet eine verlängerte Freisetzung nach Verabreichung an ein Tier.
Ein anderer Weg, um die Stabilitäts- und Produktionsprobleme von GH zu umgehen, wird in dieser Patentanmeldung aufgezeigt.
Durch Kristallisation kann ein neuer Weg zum Herstellen von Wachstumshormon erreicht werden.
Kristalle von Wachstumshormon können auch für verschiedene neue Formulierungen des Hormons, wie z. B. injizierbare Suspensionen, Implantate und topische Formulierungen verschiedener Typen, verwendet werden.
Es ist bislang nicht möglich gewesen, die Kristallisation von Wachstumshormon auf industrielle Weise auszuführen.
Clarkson et al. berichten in J. Mol. Biol. (1989), 208, 719-721 über drei unterschiedliche Kristallisationsmethoden, die sich von den früher beschriebenen unterscheiden.
Es wurden die folgenden Methoden verwendet:
1. Schwebetropfentechnik und Verwendung von Ethanol oder Methanol in dem Puffer, in dem tetragonale Bipyramiden mit einer Größe von 2 · 10&supmin;³ mm³ und einer Zelldimension von 134 Å (0,0134 um) nach bis zu einem Jahr erhalten werden.
2. Schwebetropfentechnik unter Verwendung von Aceton in dem Puffer, in dem trigonale Prismen mit einer Größe von 2 · 10&supmin;³ mm³ nach 3 bis 14 Tagen erhalten werden.
3. Chargenweises Verfahren unter Verwendung von Paraldehyd und Gewinnung von orthorhombischen Parallelepipeden mit einer Größe von 2 · 10&supmin;³ mm³ nach mehreren Wochen. Die Autoren kommentierten, daß sie hinsichtlich der Gewinnung großer einzelner Kristalle nicht erfolgreich waren.
In WO 92/00998, Novo Nordiska A/S, wird ein Verfahren zur Herstellung von chemisch stabilen und biologisch aktiven kationischen Wachstumshormon-Kristallen offenbart. Das Verfahren umfaßt die Schritte: Zugabe von Kationen zu einer Lösung von GH bei einem pH zwischen 5 und 8, Züchten von Kristallen bei einer Temperatur von 0-30ºC und Isolierung der Kristalle. Die erhaltenen Kristalle sind kationische GH-Kristalle. Das bevorzugte Kation ist Zn²&spplus; und vorzugsweise wird ein organisches Lösemittel zusammen mit dem Kation zugesetzt.
Die erhaltenen Kristalle umfassen stets ein Kation und sind klein. In den Beispielen variiert die Länge der Zink enthaltenden Kristalle zwischen 3 und 12 um.
In einer Veröffentlichung von B. C. Cunningham et al. in Science, Vol. 253, 545-548, 1991, wird eine Dimerisierung von hGH durch Zink offenbart.
Es besteht auf dem Markt ein Bedarf nach besseren Wegen zur Verabreichung von hGH. Eirüge Wege, um diesen Bedarf zu erfüllen, bestehen darin, entweder gebrauchsfertige Injektionslösungen bereitzustellen oder eine injizierbare Depotformulierung, z. B. als suspendierte hGH-Kristalle, bereitzustellen.
Kristalle von hGH können in einer Suspension oder in einer wäßrigen, injizierbaren Lösung zusammen mit Puffern und mit oder ohne Konservierungsmittel verwendet werden. Sie können auch in einer Depotformulierung, als z. B. eine ölige oder wäßrige Suspension oder als Implantat, verwendet werden und bewirken so eine langsame Freisetzung des Arzneimittels.
Wenn die Kristalle groß genug sind, können sie als Pulver verwendet und auf einer Oberfläche, z. B. auf einer Wunde, verteilt werden. Zu kleine Teilchen sind nicht geeignet, da sie Staub bilden und für eine direkte Verwendung nicht eingesetzt werden können.
Zu unserer großen Überraschung haben wir ein neues Verfahren zum Herstellen von reinen, aktiven GH-Kristallen ohne die Zugabe von Kationen oder Lösemitteln, wie Methanol, Ethanol, Aceton oder Paraldehyd, die aus therapeutischer Sicht nicht annehmbar sind, gefunden.
Durch dieses neue Verfahren konnten die Kristalle innerhalb sehr kurzer Zeit gebildet werden. Wenn einige der namentlich angegebenen Verbindungen, siehe Beispiel 22, verwendet wurden, wurden unverzüglich Kristalle gebildet und bei einigen anderen innerhalb von einer Stunde. Dies kann mit dem von Carlsson et al. präsentierten Verfahren, das Kristalle erst nach mehreren Wochen produziert, verglichen werden. Durch die Zugabe einer chemischen Verbindung mit der allgemeinen Struktur (I) zu einer wäßrigen Lösung von GH können leicht und schnell GH-Kristalle gebildet werden. Die Zugabe kann vorzugsweise in dem letzten Reinigungsschritt durch Dialyse oder Chromatographie mit der die Verbindung enthaltenden Lösung erfolgen.
Mit diesem Verfahren ist es möglich, die Größe der Kristalle abhängig von den Bedingungen und der Zeit zu variieren, was einen großen Vorteil darstellt, wenn verschiedene Formulierungen für eine Verabreichung von hGH hergestellt werden.
Das erhaltene GH in Kristallen ist ein Material, das normalerweise über 80% monomeres GH enthält.
Es könnte einen großen Vorteil bei der Herstellung von hGH darstellen, daß es ein schnelles Verfahren zum Herstellen von Kristallen und unter Vermeidung von Kationen gibt.
Dieses Verfahren kann auch in dem technischen Verfahren für die Reinigung und Herstellung eingesetzt werden.
Das neue Verfahren zum Herstellen von Kristallen von Wachstumshormon (GH) oder funktionellen Derivaten davon umfaßt folglich die Schritte:
i) Mischen von GH oder funktionellen Derivaten davon mit einer wäßrigen Lösung, umfassend einen Puffer und eine chemische Verbindung mit der allgemeinen Formel (I):
Ar-[-CR&sub1;R&sub2;-]n-[-CR&sub3;R&sub4;-]m-CR&sub5;R&sub6;-OH (I),
in der
Ar Phenyl, alkylsubstituiertes Phenyl, Naphthyl, alkylsubstituiertes Naphthyl ist,
R&sub1; bis R&sub6; H, OH oder Alkyl ist,
n und m 0 oder 1 ist,
ii) Inkubieren,
iii) Isolieren der Kristalle durch bekannte Verfahren.
Mit Inkubation sind alle unterschiedlichen Typen von Kristallisationsverfahren, die einem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, gemeint. Im Labormaßstab ist die Schwebetropfentechnik bevorzugt, jedoch besteht in industriellem Maßstab der leichteste Weg darin, die Lösung stehen zu lassen. Die Verbindung wird vorzugsweise aus Benzylalkohol, 2-Methylbenzylalkohol, 1-(1-Naphthyl)ethanol, Phenylethanol, 1-Phenyl-1-propanol, 2-Phenyl-2-propanol, 3-Phenyl-1-propanol ausgewählt.
Die Erfindung betritt auch die Verwendung einer chemischen Verbindung mit der allgemeinen Formel (I) für die Herstellung von Kristallen von GH aus einer gepufferten Lösung.
Wenn Benzylalkohol verwendet wird, beträgt die bevorzugte Menge mindestens 1%. Der Puffer könnte z. B. Citrat in einer Konzentration von 2 bis 50 mM, vorzugsweise 5 bis 20 mM und insbesondere 5 mM oder 10 mM sein. Der Puffer kann auch eine Mischung von Natriumcitrat und Natriumphosphaten sein. Die wäßrige Lösung könnte Glycin, Lysin, Mannitol und/oder Glycerol umfassen.
Ein anfänglicher pH-Wert von 5,8 bis 6,3 und vorzugsweise von 6,2 lieferte gute Ergebnisse. Die Bildung von Kristallen ist abhängig von Zeit, pH und Temperatur. Bei einer Temperatur zwischen 20ºC und 30ºC werden die Kristalle normalerweise rasch gebildet, manchmal unverzüglich und überwiegend innerhalb von einer Stunde.
Es werden auch Kristalle von Wachstumshormon oder einem beliebigen funktionellen Analog davon in Form von Nadeln, trigonalen Formen, Kuben oder Parallelepipeden mit einer Länge von mindestens 20 um, die durch das beanspruchte Verfahren erhalten worden sind, beansprucht. In einigen Fällen waren die erhaltenen Kristalle sogar mehr als 1 mm. Vorzugsweise beträgt die Länge mindestens 50 bis 2000 um und noch bevorzugter 100 bis 300 um. Die beanspruchten Kristalle sind folglich größer als die früher erhaltenen Kristalle.
Die beanspruchten Kristalle können bei einer Verwendung am Menschen oder einer tierärztlichen Verwendung für verschiedene Verabreichungsformen, z. B. topisch, nasal, pulmonal, oral, rektal und parenteral, nützlich sein.
Es werden eine Suspension für die Injektion, Depotformulierung und trockene Formulierung, umfassend erfindungsgemäße Kristalle, beansprucht.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von GH-Kristallen für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung eines Patienten, der Wachstumshormon oder ein beliebiges funktionelles Analog davon benötigt.
Das beanspruchte Verfahren kann in einem Reinigungsverfahren für GH eingesetzt werden.
Unsere beanspruchten Kristalle haben sich als biologisch aktiv erwiesen.
Wachstumshormon kann sowohl vom Menschen als auch vom Tier abstammen, wie menschliches Wachstumshormon (hGH), Wachstumshormon vom Rind (bGH), von Fisch und vom Schwein (pGH).
Mit Wachstumshormon (GH) ist sowohl natürlich vorkommendes als auch rekombinantes GH (rGH) gemeint. Mit funktionellen Analogen sind Verbindungen mit dem gleichen therapeutischen Effekt wie das Wachstumshormon in dem Tier gemeint. Bevorzugt ist das rekombinante hGH (rhGH).
Durch Verwendung von GH-Kristallen ist die Formulierung nicht von ihrer Löslichkeit in dem verwendeten Träger/Puffer, die eine Beschränkung hinsichtlich der Menge von GH pro Volumen bewirkt, abhängig. Dies ist ein klarer Vorteil der beanspruchten Kristalle.
In einer trockenen Zusammensetzung, einer Suspension oder einer Depotformulierung könnte die GH-Menge pro Volumen in dem Arzneimittelabgabesystem sehr hoch sein.
Gebildete Kristalle sind gezeigt in
Fig. 1: Mikroskopie gebildeter Kristalle

Beispiele 1-20

Material für Formulierungsstudien war die Arzneimittelsubstanz in dem gewöhnlichen Genotropin®-Verfahren. Das nach dem Reinigungsverfahren erhaltene Eluat enthält ungefähr 36 I. E./ml.
Eine Formulierung wurde im Laboratoriumsmaßstab durch Gelfiltration ausgeführt, die den Zwecken einer Entfernung von in den vorangegangenen Reinigungsschritten verwendeten Salzen und einer Zugabe der Bestandteile der endgültigen Formulierung dient. Die Säule Sephadex G-25 (Pharmacia) wurde mit dem Formulierungspuffer äquilibriert. Die Chromatographie wurde bei +7ºC ausgeführt.
Die gewünschte Proteinkonzentration wurde durch Verdünnung mit dem Formulierungspuffer eingestellt. Die Lösung wurde sterilfiltriert und in Glaskartuschen verteilt.
Die Bildung von Nadeln in verschiedenen Lösungen wurde in den Beispielen 1-20 und 22 untersucht. Die erhaltenen hGH-Kristalle wurden charakterisiert.

Methoden

Isolierung

Die Kristalle wurden zentrifugiert und der Überstand mit einer Pipette abgenommen. Der Rückstand wurde sechsmal mit Wasser, danach dreimal mit Acetonitril und schließlich zweimal mit Diethylether gewaschen und zentrifugiert. Die Kristalle wurden getrocknet.

Polypeptidgrößenverteilung (SDS-PAGE)

Proteine in Präparationen von Somatropin, hGH, wurden durch Natriumdodecylsulfat (SDS) denaturiert, um negativ geladene Molekülkomplexe von SDS-Protein zu erzeugen. Eine Auftrennung gemäß der Molekulargröße wurde dann durch Elektrophorese in Polyacrylamidgelen (PAGE) in Gegenwart von SDS erhalten. Die relative Polypeptidgrößenverteilung von hGH wurde durch densitometrisches Abtasten der mit Silber angefärbten Polypeptidbanden quantifiziert.

Dünnschichtchromatographie (TLC)

Dünnschichtchromatographie wurde auf Kieselgelplatten (Merck wt 5715) ausgeführt und in n-Butanol : Essigsäure : Wasser : Ethylacetat, 1 : 1 : 1 : 1, entwickelt.
Die Auswertung beruhte auf drei verschiedenen Sichtbarmachungstechniken, umfassend UV-Licht bei 254 nm für ein allgemeines Screening, Ninhydrin-Reaktion für primäre Aminogruppen und Kaliumpermanganat-Reagentien.

ELISA, Immunadsorbens-Assay

Mikrotiterplatten (Nung a/s, Dänemark), die mit Immunadsorbens-gereinigten, gegen hGH gerichteten Kaninchen-Antikörpern beschichtet waren, wurden mit Serumproben, Referenzen (Standards) und Kontrolle inkubiert. Nach Waschen wird Fab'-anti-hGH-Biotin-Konjugat zugesetzt und man läßt dieses sich an die Antigene in fester Phase binden. Nach einem weiteren Waschschritt wird ein Streptavidin-HRP-Konjugat zugesetzt und man läßt dieses sich an das in fester Phase gebundene Biotin binden. Die Menge an HRP an der festen Phase wird dann unter Verwendung der Substrate H&sub2;O&sub2; und 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMBZ) und Perborat bestimmt. Das endgültige oxidierte Produkt wird durch seine Extinktion bei 450 nm gemessen. Die minimale nachweisbare Konzentration beträgt 0,4 mE/l. Bei 0,72 mE/l betragen die Intra-Assay- und Inter-Assay-Variationskoeffizienten 2,3 bzw. 9,0%, und bei 4,07 mE/l betragen die Variationen 2,2 bzw. 11%.

HPLC

AshaiPac-OD 550, reverse Phase/TRIS (pH 8,5)-n-Propanol, isokratisch.
Detektion: 210 und 280 nm.
Gelfiltration
Superdex 75/0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,4.
Detektion: 280 nm.

Sichtprüfung

Das Erscheinungsbild der Lösungen wurde gemäß Ph. Eur., 2. Auflage, mit dem Auge überprüft.

pH

Der pH-Wert wurde mit Glas- und Kalomel-Elektroden gemessen. Ausgangswerte: Die Ergebnisse nach 3-wöchiger Lagerung bei 30ºC: Ausgangswerte: Die Ergebnisse nach 3-wöchiger Lagerung bei 30ºC: Ausgangswerte: Die Ergebnisse nach 3-wöchiger Lagerung bei 30ºC: Das Ergebnis nach 3-monatiger Lagerung bei 5ºC
* x bedeutet ein Puffersystem aus einer Mischung von 1,7 mM Natriumcitrat und 6,7 mM Natriumphosphat.
** bedeutet opaleszierend. Ausgangswerte: Die Ergebnisse nach 3-wöchiger Lagerung bei 30ºC: Das Ergebnis nach 3-monatiger Lagerung bei 5ºC
* x bedeutet ein Puffersystem aus einer Mischung von 1,7 mM Natriumcitrat und 6,7 mM Natriumphosphat.

DISKUSSION

Normalerweise lieferten unsere Benzylalkohol umfassenden Formulierungen Kristalle im pH-Bereich von 6,1 bis 6,3 und die Lösungen ohne Benzylalkohol lieferten keine Kristalle innerhalb dieses pH-Bereichs.
Die Formulierungen 1 und 2 waren klar trotz der Zugabe von Benzylalkohol bei pH 6,3, was ein kritischer Wert für die Bildung von Kristallen in Benzylalkohol zu sein scheint.

ERGEBNISSE UND IDENTIFIZIERUNG

Mikroskopie

Die Kristalle lagen in Form von Nadeln unterschiedliche Länge vor. Die größten waren ungefähr 0,3 · 0,03 mm. Siehe Fig. 1.

Schmelzpunktbestimmung

Der Schmelzpunkt wurde an einem Leitz-Wetzlar-Mikroskop ermittelt. Es konnte kein Schmelzpunkt beobachtet werden. Die Kristalle waren bis zu 230ºC intakt, dann begann eine Verfärbung der Kristalle. Bei ungefähr 290ºC waren die Kristalle schwarz, jedoch nicht geschmolzen (Pyrolyse).

Löslichkeit

Die Kristalle waren in organischen Lösemitteln, wie Dichlormethan, Acetonitril, Ethanol, Dimethylformamid, Diethylether, unlöslich. Sie waren in Wasser und 70%-igem Ethanol in Wasser schwierig aufzulösen, jedoch löslich in Säuren, wie 1%-iger Essigsäure, 6 M HCl, und in einer Base, wie 0,1 M Phosphatpuffer, pH 8.

Dünnschichtchromatographie (TLC)

Die in 10%-iger Essigsäure und den Pufferbestandteilen, d. h. Citronensäure, Mannitol, Glycin und Benzylalkohol, gelösten Kristalle wurden untersucht. Die Kristallprobe wanderte in diesem System nicht, wohingegen dies sämtliche Pufferbestandteile taten. Die Kristallprobe absorbierte UV-Licht und zeigte eine positive Reaktion mit Ninhydrin und Permanganat-Reagentien, was die Anwesenheit von aromatischen Gruppen, Aminogruppen und oxidierbaren Gruppen anzeigt.

Hydrolyse

Hydrolyse der Kristallprobe und einer hGH-Referenz in 6 M HCl, 110ºC, 20 h. Eine Analyse unter Verwendung von Dünnschichtchromatographie zeigte identische Flecken. HPLC, Gelfiltration, SDS-Page, IEF
Die Kristallprobe war nahezu identisch mit der hGH-Referenz.

Aminosäureanalyse

Von den Kristallen erhaltene experimentelle Daten stimmten gut mit dem theoretischen Wert wie auch mit der hGH-Referenzprobe überein. Siehe nachfolgende Tabelle:
* Nicht bestimmt.
Der Proteingehalt der Kristallprobe, basierend auf einer Menge von 0,22 mg, betrug 84%. Der Gehalt in dem Referenzmaterial (0,45 mg) betrug 91%.

BEISPIEL 21

Keine Kristalle wurden in einer Lösung gebildet, enthaltend:
20 i. E./ml hGH
5 mM Natriumcitrat
12 mM Glycin
250 mM Mannitol und
1% Benzylalkohol
bei einem pH von 6,4.
Bei der Zugabe von mehr Benzylalkohol (d. h. > 1%) wurden jedoch die Kristalle rasch gebildet.
Kristalle wurden auch durch Erniedrigen des pH-Werts näher zu 6 oder unter 6 produziert.
Die Morphologie der Kristalle konnte durch pH-Wert und Wachstumsrate variiert werden. Wenn der pH-Wert näher bei 6,3 liegt, ähneln die Kristalle Nadeln und Parallelepipeden. Innerhalb von 24 h werden Kristalle mit einer Länge von 0,1 bis 0,3 mm und einer Dicke von ungefähr 0,001 bis 0,005 mm gebildet. Durch Variieren des pH-Werts konnte folglich die Größe der Kristalle verändert werden.
Kleinere Kristalle werden innerhalb kürzerer Zeit gebildet.

BEISPIEL 22

Andere chemische Verbindungen wurden hinsichtlich der Möglichkeit, Kristalle von Wachstumshormon zu bilden, untersucht.
Material für Formulierungsstudien war die Arzneimittelsubstanz in dem gewöhnlichen Genotropin®-Verfahren. Das nach dem Reinigungsverfahren erhaltene Eluat enthält ungefähr 36 i. E./ml vor einer Formulierung.
Eine Formulierung wurde im Laboratoriumsmaßstab durch Dialyse gegen den verwendeten Puffer ausgeführt.
Die "Schwebetropfen"-Methode ("hanging drop") wurde für eine Untersuchung von nützlichen Mitteln für die Kristallisation von Wachstumshormon verwendet. Die "hanging drop"-Methode wird in Crystallisation of Nucleic Acids and Proteins, A practical approach, von A. Ducruix und R. Giegé, IRL Press at Oxford, 1991, Seiten 82-86, beschrieben. Das anfängliche Volumen des Tropfens betrug 5 ul + 5 ul und das Volumen der Vertiefung 1 ml. Der während der Experimente verwendete Puffer umfaßt die folgenden Bestandteile:
Verbindung, wie nachfolgend angegeben
200 mM Natriumcitrat
pH 6,2
Die Ergebnisse mit den unterschiedlichen Kristallisationsmitteln waren, wie folgt:
Verbindung Kristalle
Benzylalkohol groß, einzeln
±1-(1-Naphthyl)ethanol groß, einzeln
(±)-Phenylethanol groß, einzeln
+Phenylethanol groß, einzeln
-Phenylethanol groß, einzeln
1-Phenyl-1-propanol groß, einzeln
Verbindung Kristalle
(±)-1-Phenyl- -propanol groß, einzeln
2-Phenyl-2-propanol groß, einzeln
3-Phenyl-1-propanol groß, einzeln
2-Methylbenzylalkohol einzeln
Bei einigen der verwendeten Kristallisationsmitteln wurden die Kristalle langsamer gebildet. Bei einer Verwendung von ±1-(1-Naphthyl)ethanol wurden die Kristalle nach einigen Wochen gebildet und die Größe betrug 200 bis 500 um. Anstelle einer Verwendung von Natriumcitrat wurde auch MES-Puffer verwendet. Die Ergebnisse waren die gleichen wie bei der Verwendung von Natriumcitrat. Eine höhe Konzentration des Kristallisationsmittels wurde jedoch benötigt, wenn kein Citrat anwesend war.
Wenn andere Kristallisationsmittel auf die gleiche Weise wie vorstehend erläutert untersucht wurden, die nicht unter die allgemeine Formel (I) fallen, wurden keine Kristalle gebildet:
Verbindung Kristalle
3-Methyl-4-nitrobenzylalkohol keine
2-Nitrobenzylalkohol keine
4-Nitrobenzylalkohol keine
1-Naphthol keine
2-Naphthol keine
Phenol keine
Benzaldehyd keine
Benzylamin keine
(-)1-Phenyl-1-butanol keine
L-Phenylglycinol keine

BEISPIEL 23

Es wurde eine immunologische Analyse der Kristalle ausgeführt. Die Kristalle wurden gemäß den Beispielen 1-20 in einem Puffer gebildet, enthaltend:
20 i. E./ml Wachstumshormon
5 mmol Natriumcitrat
12 mmol Glycin
130 mmol Mannitol
1% Benzylalkohol.
0,17 mg der gebildeten Kristalle wurden in 0,340 ml 0,05 M Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,5, enthaltend 0,05% Tween 20, gelöst. Die Lösung wurde weiter in 10- fachen Schritten in dem gleichen Puffer verdünnt. Alle individuellen Verdünnungsschritte wurden mittels 4-facher Proben analysiert.
Ein Enzymimmuntest, ELISA, Immunadsorbens-Assay, wurde verwendet, um rhGH in den gelösten Kristallen zu messen.
Die rhGH-Menge in der Ampulle wurde zu 0,15 mg ermittelt.

BEISPIEL 24: Bioassay

Es wurden Kristalle aus einer Lösung gemäß dem vorstehend erläuterten Beispiel 6 gezüchtet und als 0,5 ml-Proben in Glasbehälter verteilt. Nach der Herstellung wurde die Lösung bei 25ºC eine Woche gelagert, damit die Kristalle wachsen konnten. Sie wurden weiter bei 5ºC 3 Monate vor der Ernte der Kristalle gelagert. Wenn die Kristalle geerntet wurden, wurde der die Kristalle umgebende Überstand abgesaugt. Die Kristalle wurden zweimal mit 0,25 ml Puffer gemäß Beispiel 6 (d. h. der Zusammensetzung gemäß Beispiel 6 mit Ausnahme des Wachstumshormons) gespült. Der zweite Spülschritt wurde durch Zentrifugation der Kristalle vor dem Verwerfen des Spülpuffers beendet. Die verbleibenden Kristalle wurden in 0,5 ml Puffer aus 5 mM Natriumcitrat, 12 mM Glycin und 130 mM Mannitol, pH 6,1l, gelöst. Mehrere Proben wurden vereinigt, um sie in der Bioassay-Analyse zu verwenden.
Gelfiltrationschromatographie wurde an einer gemäß der vorstehend erläuterten Vorgehensweise hergestellten Probe ausgeführt. Das Wachstumshormon erwies sich zu 100% monomer nach Kristallisation und nachfolgender Lösung.

Bioassay von gelösten Wachstumshormon (GH)-Kristallen:

Um zu untersuchen, ob die erhaltenen GH-Kristalle biologisch aktiv waren, wurde ein Gewichtszunahme-Assay in Ratten, denen die Hypophyse entfernt worden war, ausgeführt.
Ratten wurden von Möllegaard A/S. Dänemark, erworben. Den Ratten wurde die Hypophyse in der Woche vor Ankunft entfernt und diesen fehlte dementsprechend endogenes Wachstumshormon und andere Hypophysenhormone, was zu verkümmertem Wachstum führte. Die Ratten wurden bei Ankunft in dem Laboratorium und vor dem Assay gewogen. Ratten, deren Gewicht sich < 10% veränderte, wurden hinsichtlich einer Aufnahme in die Studie akzeptiert.
Die Ratten wurden dann zufallsbedingt in Gruppen von 15 eingeteilt. Sie wurden 4 Tage lang zweimal täglich entweder mit einer firmeninternen Standardpräparation von menschlichem rekombinantem GH (kalibriert gegen WHO 80/505, dementsprechend diese eine biologi sche Wirksamkeit von 4,5 i. E./Ampulle aufwies) oder der aus GH-Kristallen hergestellten Lösung in zwei Dosen behandelt. Standard-Dosen waren 0,04 i. E./Tag und 0,16 i. E./ml.
Die Gruppen wurden vor der ersten Injektion (Tag 1) und ungefähr 16 h nach der letzten Injektion (Tag 5) gewogen. Die Differenz zwischen diesen Gewichten wurde berechnet und die Wirksamkeit bestimmt, indem die Ergebnisse der mit der Kristall-Lösung behandelten Tiere mit jenen der mit der Standardpräparation behandelten Gruppen verglichen wurden.
Die Ergebnisse sind nachfolgend gezeigt (Gewichtszunahme, g Standardabweichung):
Die biologische Wirksamkeit der gelösten GH-Kristalle wurde zu 7,1 i. E./ml ermittelt.
Folglich haben wir gezeigt, daß das menschliche Wachstumshormon in gelösten GH- Kristallen in vivo biologisch aktiv ist.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Kristallen von Wachstumshormon (GH) oder funktionellen Derivaten davon, gekennzeichnet durch die Schritte:

i) Mischen von GH oder funktionellen Derivaten davon mit einer wäßrigen Lösung, umfassend einen Puffer und eine chemische Verbindung mit der allgemeinen Formel (I):

Ar-[-CR&sub1;R&sub2;-]n-[-CR&sub3;R&sub4;-]m-CR&sub5;R&sub6;-OH (I),

in der

Ar Phenyl, alkylsubstituiertes Phenyl, Naphthyl, alkylsubstituiertes Naphthyl ist, R&sub1; bis R&sub6; H, OH oder Alkyl ist,

n und m 0 oder 1 ist,

ii) Inkubieren,

iii) Isolieren der Kristalle durch bekannte Verfahren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei GH menschliches GH ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei GH rekombinantes menschliches GH (rhGH) ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Verbindung aus Benzylalkohol, 2-Methylbenzylalkohol, 1-(1-Naphthyl)ethanol, Phenylethanol, 1-Phenyl-1-propanol, 2-Phenyl-2-propanol, 3-Phenyl-1- propanol ausgewählt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Verbindung Benzylalkohol ist.

6. Kristalle von Wachstumshormon oder einem beliebigen funktionellen Analog davon in Form von Nadeln, trigonalen Formen, Kuben oder Parallelepipeden mit einer Länge von mindestens 20 um, die durch das in einem der Ansprüche 1-5 beanspruchte Verfahren erhalten worden sind.

7. Kristalle nach Anspruch 6, wobei GH menschliches GH ist.

8. Kristalle nach Anspruch 7, wobei GH rekombinantes menschliches GH (rhGH) ist.

9. Kristalle nach Anspruch 5, wobei die Nadeln eine Länge von mindestens 50, vorzugsweise von 50 bis 2000 und noch bevorzugter von 100 bis 300 um aufweisen.

10. Verwendung einer chemischen Verbindung mit der allgemeinen Formel (I):

Ar-[-CR&sub1;R&sub2;-]n-[CR&sub3;R&sub4;-]CR&sub5;R&sub6;-OH (I),

in der

n und m 0 oder 1 ist,

bei der Herstellung von Kristallen von GH gemäß einem der Ansprüche 6-9 aus einer gepufferten Lösung.

11. Suspension für die Injektion, umfassend Kristalle nach einem der Ansprüche 6-9.

12. Depotformulierung, umfassend Kristalle nach einem der Ansprüche 1-6.

13. Trockene Formulierung, umfassend Kristalle nach einem der Ansprüche 6-9.

14. Verwendung von GH-Kristallen nach einem der Ansprüche 6-9 für die Herstellung eines Arzneimittels für eine Behandlung eines Patienten, der Wachstumshormon oder ein beliebiges funktionelles Analog davon benötigt.

15. Verfahren für die Reinigung von GH, gekennzeichnet durch das Kristallisierungsverfahren nach Anspruch 1.