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ES3033517T3 - Heterotandem bicyclic peptide complexes - Google Patents

Heterotandem bicyclic peptide complexes

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Publication number
ES3033517T3
ES3033517T3 ES24203287T ES24203287T ES3033517T3 ES 3033517 T3 ES3033517 T3 ES 3033517T3 ES 24203287 T ES24203287 T ES 24203287T ES 24203287 T ES24203287 T ES 24203287T ES 3033517 T3 ES3033517 T3 ES 3033517T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
peptide
compound
pmol
polypeptide
reaction mixture
Prior art date
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Active
Application number
ES24203287T
Other languages
English (en)
Inventor
Kevin Mcdonnell
Gemma Mudd
Punit Upadhyaya
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BicycleTx Ltd
Original Assignee
BicycleTx Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BicycleTx Ltd filed Critical BicycleTx Ltd
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Abstract

La presente invención se refiere a complejos peptídicos bicíclicos heterotándem que comprenden un primer ligando peptídico, que se une a un componente presente en una célula cancerosa, conjugado mediante un ligador a un segundo ligando peptídico, que se une a un componente presente en una célula inmunitaria. La invención también se refiere al uso de dichos complejos peptídicos bicíclicos heterotándem para la prevención, supresión o tratamiento del cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Complejos peptídicos bicíclicos en heterotándem
Campo de la invención
La presente invención se refiere a ligandos peptídicos que se unen a un componente presente en una célula cancerosa. La invención también se refiere a complejos peptídicos que comprenden el ligando peptídico de la invención conjugado mediante un enlazador con un segundo péptido.
Antecedentes de la invención
Los péptidos cíclicos son capaces de unirse con alta afinidad y especificidad a dianas proteicas y, por lo tanto, son una clase de moléculas atractiva para el desarrollo de opciones terapéuticas. De hecho, varios péptidos cíclicos ya se usan con éxito en la clínica, como, por ejemplo, el péptido antibacteriano vancomicina, el fármaco inmunosupresor ciclosporina o el fármaco antineoplásico octreótido (Driggerset al.(2008),Nat Rev Drug Discov7 (7), 608-24). Las buenas propiedades de unión son resultado de una superficie de interacción relativamente grande formada entre el péptido y la diana, así como de la flexibilidad conformacional reducida de las estructuras cíclicas. Normalmente, los macrociclos se unen a superficies de varios cientos de angstroms cuadrados, como, por ejemplo, el antagonista CXCR4 de péptido cíclico CVX15 (400 A2; Wuet al.(2007),Science330, 1066-71), un péptido cíclico con el motivo Arg-Gly-Asp que se une a la integrina aVb3 (355 A2) (Xionget al.(2002),Science296 (5565), 151-5) o el inhibidor del péptido cíclico upaína-1 que se une al activador del plasminógeno de tipo urocinasa (603 A2; Zhaoet al.(2007),J Struct Biol160 (1), 1-10).
Debido a su configuración cíclica, los macrociclos peptídicos son menos flexibles que los péptidos lineales, lo que conduce a una menor pérdida de entropía al unirse a las dianas y da como resultado una mayor afinidad de unión. La flexibilidad reducida también conduce al bloqueo de conformaciones específicas de la diana, lo que aumenta la especificidad de unión en comparación con los péptidos lineales. Este efecto se ha ejemplificado por un inhibidor potente y selectivo de la metaloproteinasa de matriz 8 (MMP-8) que perdió su selectividad sobre otras MMP cuando se abrió su anillo Cherneyet al.(1998),J Med Chem41 (11), 1749-51). Las propiedades de unión favorables logradas a través de la macrociclación son incluso más pronunciadas en péptidos multicíclicos que tienen más de un anillo peptídico como, por ejemplo, en vancomicina, nisina y actinomicina.
Diferentes equipos de investigación han unido previamente polipéptidos con restos cisteína a una estructura molecular sintética (Kemp y McNamara (1985), J. Org.Chem;Timmermanet al.(2005),ChemBioChem).Meloen y sus colaboradores habían utilizado tris(bromometil)benceno y moléculas relacionadas para la ciclación rápida y cuantitativa de múltiples bucles peptídicos sobre armazones sintéticos para la imitación estructural de superficies de proteínas (Timmermanet al.(2005),ChemBioChem).En los documentos WO 2004/077062 y WO 2006/078161 se describen métodos para la generación de compuestos candidatos a fármacos en donde dichos compuestos se generan uniendo polipéptidos que contienen cisteína a un armazón molecular como, por ejemplo, tris(bromometil)benceno.
Se han desarrollado enfoques combinatorios basados en la presentación en fagos para generar y cribar grandes bibliotecas de péptidos bicíclicos para dianas de interés (Heiniset al.(2009),Nat Chem Biol5 (7), 502-7 y el documento WO 2009/098450). En resumen, se presentaron en fago bibliotecas combinatorias de péptidos lineales que contenían tres restos cisteína y dos regiones de seis aminoácidos aleatorios (Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys) y se ciclaron uniendo covalentemente las cadenas laterales de cisteína a una molécula pequeña (tris(bromometil)benceno).
Se proporciona más divulgación acerca de los péptidos bicíclicos en: Punit Upadhyaya, "Activation of CD137 using multivalent and tumour targeted bicyclic peptides", 25 de abril de 2019, VI Congreso anual sobre péptidos (XP055669343); "Constrained peptides Unconstrained Thinking" 1 de agosto de 2019, páginas 1-30 (XP055719882); documento WO2019/162682; documento WO2010/089115; documento WO2019/025811; y en Paul Beswick, "Bicycles - An entirely new class of therapeutics", XXX Simposio sobre química médica, 2 de mayo de 2019 (XP055669342).
Sumario de la invención
La invención reivindicada en el presente documento proporciona un ligando peptídico que se une a la Nectina-4 presente en una célula cancerosa, que comprende un polipéptido que comprende al menos tres grupos reactivos, separados por al menos dos secuencias de bucle, y un armazón molecular que forma enlaces covalentes con los grupos reactivos del polipéptido de manera que se formen al menos dos bucles de polipéptido en el armazón molecular, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables; caracterizado por que dicho polipéptido es un derivado modificado de CP[1Nal][dD]CM[HArg]DWSTP[HyP]WC; en donde uno o más residuos de cisteína se sustituyen por un grupo reactivo seleccionado entre ácido 3-mercaptopropiónico, cisteamina y penicilamina; en donde 1 Nal representa 1-naftilalanina, HArg representa homoarginina y HyP representa hidroxiprolina. En una realización del ligando peptídico de la invención, el armazón molecular es 1,1',1"-(1,3,5-triazinano-1,3,5-triil)triprop-2-en-1-ona (TATA).
La invención reivindicada en el presente documento también proporciona un complejo peptídico, que comprende (a) un primer ligando peptídico que se une a la Nectina-4 presente en una célula cancerosa; conjugado mediante un enlazador con (b) un segundo péptido; en donde el primer péptido comprende un polipéptido que comprende al menos tres grupos reactivos, separados por al menos dos secuencias de bucle, y un armazón molecular que forma enlaces covalentes con los grupos reactivos del polipéptido de manera que se formen al menos dos bucles de polipéptido en el armazón molecular, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables; caracterizado por que dicho polipéptido de dicho primer ligando peptídico es un derivado modificado de CP[1Nal][dD]CM[HArg]DWSTP[HyP]WC; en donde uno o más residuos de cisteína se sustituyen por un grupo reactivo seleccionado entre ácido 3-mercaptopropiónico, cisteamina y penicilamina; en donde 1Nal representa 1-naptilalanina, HArg representa homoarginina y HyP representa hidroxiprolina. En una realización del complejo peptídico de la invención, el armazón molecular es 1,1',1"-(1,3,5-triazinano-1,3,5-triil)triprop-2-en-1-ona (TATA).
Para ayudar a una comprensión completa del contexto de la presente invención, la presente divulgación incluye además el análisis de materias objeto adicionales que no forman parte de la presente invención. Por ejemplo, de acuerdo con un primer aspecto de la presente divulgación (que no forma parte de la presente invención), se proporciona un complejo peptídico bicíclico en heterotándem que comprende:
(a) un primer ligando peptídico que se une a un componente presente en una célula cancerosa; conjugado mediante un enlazador con
(b) un segundo ligando peptídico que se une a un componente presente en una célula inmunitaria;
en donde cada uno de dichos ligandos peptídicos comprende un polipéptido que comprende al menos tres grupos reactivos, separados por al menos dos secuencias de bucle, y un armazón molecular que forma enlaces covalentes con los grupos reactivos del polipéptido de tal manera que se formen al menos dos bucles de polipéptido en el armazón molecular, caracterizado por que dicho complejo peptídico bicíclico en heterotándem comprende los siguientes ligandos peptídicos primero y segundo:
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
en donde 1Nal representa 1-naftilalanina, HArg representa homoarginina, HyP representa hidroxiprolina, B-Ala representa beta-alanina, PYA representa ácido 4-pentanoico, 3,3-DPA representa 3,3-difenilalanina, Cba representa p-ciclobutilalanina, hGlu representa ácido homoglutámico, Nle representa norleucina, NMeAla representa la N-metilalanina, tBuAla representa t-butil-alanina, Aad representa ácido alfa-L-aminoadípico, Ac representa un grupo acetilo, Dap representa ácido diaminopropiónico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
De acuerdo con un aspecto adicional de la divulgación (que, de nuevo, no forma parte de la presente invención), se proporciona una composición farmacéutica que comprende un complejo peptídico bicíclico en heterotándem como se define en el presente documento junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
De acuerdo con otro aspecto de la divulgación (que, de nuevo, no forma parte de la presente invención), se proporciona un complejo peptídico bicíclico en heterotándem como se define en el presente documento para usar en la prevención, la inhibición o el tratamiento del cáncer.
Descripción detallada de la invención
Primeros ligandos peptídicos
Las referencias en el presente documento a la expresión "célula cancerosa" incluyen cualquier célula que se sabe que participa en el cáncer. Las células cancerosas se crean cuando se dañan los genes responsables de regular la división celular. La carcinogénesis está provocada por la mutación y epimutación del material genético de las células normales, que altera el equilibrio normal entre proliferación y muerte celular. Esto da lugar a una división celular incontrolada y a la evolución de esas células por selección natural en el cuerpo. La proliferación incontrolada y a menudo rápida de las células puede dar lugar a tumores benignos o malignos (cáncer). Los tumores benignos no se extienden a otras partes del cuerpo ni invaden otros tejidos. Los tumores malignos pueden invadir otros órganos, extenderse a lugares distantes (metástasis) y convertirse en una amenaza para la vida.
En un caso, la célula cancerosa se selecciona entre una célula tumoral HT1080, A549, SC-OV-3, PC3, H1376, NCI-H292, LnCap, MC38, 4T1-D02 y RKO.
En un caso de la divulgación general, el componente presente en una célula cancerosa es la Nectina-4. Para evitar dudas, sin embargo, en el ligando peptídico y el complejo peptídico de la presente invención, el componente es Nectina-4.
La Nectina-4 es una molécula de superficie que pertenece a la familia de proteínas nectina, que comprende 4 miembros. Las nectinas son moléculas de adhesión celular que juegan un papel clave en diversos procesos biológicos tales como la polaridad, la proliferación, la diferenciación y la migración, para células epiteliales, endoteliales, inmunitarias y neuronales, durante el desarrollo y la vida adulta. Están implicadas en varios procesos patológicos en seres humanos. Son los principales receptores del poliovirus, virus del herpes simple y virus del sarampión. Las mutaciones en los genes que codifican la nectina-1 (PVRL1) o la Nectina-4 (PVRL4) provocan síndromes de displasia ectodérmica asociados con otras anomalías. La Nectina-4 se expresa durante el desarrollo fetal. En los tejidos adultos su expresión es más restringida que la de otros miembros de la familia. La Nectina-4 es un antígeno asociado a tumores en el 50 %, 49 % y 86 % de los carcinomas de mama, ovario y pulmón, respectivamente, en su mayoría en tumores de mal pronóstico. Su expresión no se detecta en los tejidos normales correspondientes.
En los tumores de mama, la Nectina-4 se expresa principalmente en carcinomas triple negativos y ERBB2+. En el suero de pacientes con estos cánceres, la detección de formas solubles de Nectina-4 se asocia con un mal pronóstico. Los niveles de Nectina-4 sérica aumentan durante la progresión metastásica y disminuyen después del tratamiento. Estos resultados sugieren que Nectina-4 podría ser una diana confiable para el tratamiento del cáncer. En consecuencia, se han descrito varios anticuerpos anti-Nectina-4 en la técnica anterior. En particular, Enfortumab Vedotina (ASG-22ME) es un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) dirigido a Nectina-4 y actualmente se investiga clínicamente para el tratamiento de pacientes que padecen tumores sólidos.
En un caso de la divulgación general, el primer ligando peptídico comprende un ligando peptídico bicíclico de unión a la Nectina-4. En el documento WO 2019/243832 se divulgan ejemplos adecuados de ligandos peptídicos bicíclicos de unión a la Nectina-4. En un caso, el péptido bicíclico de unión a la Nectina-4 se selecciona entre cualquiera de los péptidos de las SEQ ID NO: 52 a 66 descritos en el presente documento. Para disipar cualquier duda, sin embargo, se observa que el ligando peptídico de la presente invención, y el primer ligando peptídico del complejo peptídico de la presente invención, son ligandos específicos de unión a la Nectina-4, tal como se definen en las reivindicaciones adjuntas.
Como alternativa a la divulgación general, el componente presente en una célula cancerosa es EphA2 (pero esto no forma parte de la presente invención).
Las tirosina cinasas receptoras Eph (Ephs) pertenecen a un amplio grupo de tirosina cinasas receptoras (RTK), cinasas que fosforilan proteínas en residuos de tirosina. Los Eph y sus ligandos efrinas unidos a la membrana (efrinas) controlan el posicionamiento celular y la organización de los tejidos (Poliakovet al.(2004)Dev Cell7, 465-80). Las respuestas de Eph funcionales y bioquímicas se producen en estados de oligomerización del ligando superiores (Steinet al.(1998)Genes Dev12, 667-678).
Entre otras funciones de patrón, se ha demostrado que varios Eph y efrinas desempeñan un papel en el desarrollo vascular. La desactivación de EphB4 y efrina-B2 produce una falta de capacidad para remodelar los lechos capilares en vasos sanguíneos (Poliakovet al., supra)y letalidad embrionaria. También se ha observado la expresión persistente de algunos receptores de Eph y efrinas en microvasos adultos recién formados (Brantley-Siederset al.(2004)Curr Pharm Des10, 3431-42; Adams (2003)J Anat202, 105-12).
También se ha observado que la reaparición desregulada de algunas efrinas y sus receptores en adultos contribuye a la invasión, metástasis y neoangiogénesis tumorales (Nakamotoet al.(2002)Microsc Res Tech59, 58-67; Brantley-Siederset al., supra).Además, se ha descubierto que algunos miembros de la familia Eph se sobreexpresan en células tumorales de diferentes tumores humanos (Brantley-Siederset al., supra);Marme (2002)Ann Hematol81 Supl. 2, S66; Boothet al.(2002)Nat Med8, 1360-1).
El receptor de EPH A2 (receptor 2 de efrina de tipo A) es una proteína que, en seres humanos, está codificada por el genEPHA2.
EphA2 se regula al alza en múltiples tipos de cáncer en el ser humano, a menudo en correlación con la progresión, metástasis y mal pronóstico de la enfermedad, p. ej.: mama (Zelinskiet al.,(2001)Cancer Res.61,2301-2306; Zhuanget al.,(2010)Cancer Res.70, 299-308; Brantley-Siederset al.,(2011) PLoS One 6, e24426), pulmón (Brannanet al.,(2009)Cancer Prev Res(Phila) 2, 1039-1049; Kinchet al.,(2003)Clin Cancer Res.9, 613-618; Guoet al.,(2013)J Thorac Oncol.8, 301-308), gástrico (Nakamuraet al.,(2005)Cancer Sci.96, 42-47; Yuanet al.,(2009)Dig Dis Sci54, 2410-2417), páncreas (Mudaliet al.,(2006)Clin Exp Metastasis23, 357-365), próstata (Walker-Danielset al.,(1999)Prostate41,275-280), hígado (Yanget al.,(2009)Hepatol Res.39, 1169-1177) y glioblastoma (Wykoskyet al.,(2005)Mol Cancer Res.3, 541-551; Liet al.,(2010)Tumour Biol.31, 477-488).
El papel completo de EphA2 en la progresión del cáncer aún no está definido, aunque existen pruebas de su interacción en numerosas fases de la progresión del cáncer, incluido el crecimiento de las células tumorales, la supervivencia, la invasión y la angiogénesis. La regulación a la baja de la expresión de EphA2 inhibe la propagación de las células cancerosas tumorales (Bindaet al.,(2012)Cancer Cell22, 765-780), mientras que el bloqueo de EphA2 inhibe la migración celular inducida por VEGF (Hesset al.,(2001)Cancer Res.61, 3250-3255), germinación y angiogénesis (Chenget al.,(2002)Mol Cancer Res.1, 2-11; Linet al.,(2007)Cancer109, 332-40) y la progresión metastásica (Brantley-Siederset al.,(2005)FASEB J.19, 1884-1886).
Se ha demostrado que un conjugado de anticuerpo y fármaco contra EphA2 disminuye significativamente el crecimiento tumoral en modelos de xenoinjerto de rata y ratón (Jacksonet al.,(2008)Cancer Research68, 9367-9374) y se ha probado un enfoque similar en el ser humano, aunque el tratamiento tuvo que interrumpirse por acontecimientos adversos relacionados con el tratamiento (Annunziataet al.,(2013)Invest New drugs31, 77-84).
En un ejemplo de la divulgación general (que no forma parte de la presente invención), el primer ligando peptídico comprende un ligando peptídico bicíclico de unión a EphA2. En los documentos WO 2019/122860, WO 2019/122861 y WO 2019/122863, se divulgan ejemplos adecuados de ligandos peptídicos bicíclicos de unión a EphA2. En un caso, el péptido bicíclico de unión a EphA2 se selecciona desde cualquiera de los péptidos de las SEQ ID NO: 10 a 51 descritos en el presente documento.
Como alternativa a la divulgación general, el componente presente en una célula cancerosa es PD-L1 (que, de nuevo, esto no forma parte de la presente invención).
El ligando 1 de la muerte celular programada 1 (PD-L1) es una proteína transmembrana de tipo I de 290 aminoácidos codificada por el gen CD274 del cromosoma 19 del ratón y el cromosoma 9 del ser humano. La expresión de PD-L1 participa en la evasión de las respuestas inmunitarias implicadas en la infección crónica, p. ej., infección vírica crónica (incluyendo, por ejemplo, VIH,<v>H<b>, VHC y HTLV, entre otros), infección bacteriana crónica (incluyendo, por ejemplo,Helicobacter pylori,entre otras) e infección parasitaria crónica (incluyendo, por ejemplo,Schistosoma mansoni).La expresión de PD-L1 se ha detectado en diversos tejidos y tipos celulares, incluidos los linfocitos T, linfocitos B, macrófagos, células dendríticas y células no hematopoyéticas, incluidas las células endoteliales, hepatocitos, células musculares y placenta.
La expresión de PD-L1 también está implicada en la supresión de la actividad inmunitaria antitumoral. Los tumores expresan antígenos que pueden ser reconocidos por los linfocitos T del huésped, pero la eliminación inmunitaria de los tumores es poco frecuente. Parte de este fracaso se debe a la inhibición inmunitaria por el microentorno tumoral. La expresión de PD-L1 en muchos tumores es un componente de este entorno supresor y actúa en conjunto con otras señales inmunosupresoras. Se ha demostrado la expresión de PD-L1in situen una amplia variedad de tumores sólidos, incluida los de mama, pulmón, colon, ovario, melanoma, vejiga, hígado, glándulas salivares, estómago, gliomas, tiroides, epitelial tímico, cabeza y cuello (Brown J. A.et al.2003Immunol.170:1257-66; Dong H.et al.2002Nat. Med.8:793-800; Hamanishi J.,et al.2007Proc. Natl. Acad. Sci.EE. UU. 104:3360-65; Strome S. E.et al.2003Cancer Res.63:6501-5; Inman B. A.et al.2007Cancer109:1499-505; Konishi J.et al.2004Clin. Cancer Res.10:5094-100; Nakanishi J.et al.2007Cancer Immunol. Immunother.56:1173-82; Nomi T.et al.2007Clin. Cancer Res.13:2151-57; Thompson R. H.et al.2004Proc. Natl. Acad. Sci.EE. UU. 101: 17174-79; Wu Cet al.2006Acta Histochem.
108:19-24). Adicionalmente, la expresión del receptor de PD-L1, proteína 1 de muerte celular programada (también conocida como PD-1 y CD279), está regulada al alza en los linfocitos infiltrantes tumorales, lo que también contribuye a la inmunosupresión tumoral (Blank Cet al.2003Immunol.171:4574-81). Más importante aún, los estudios que relacionan la expresión de PD-L1 en los tumores con la evolución de la enfermedad muestran que la expresión de PD-L1 se correlaciona fuertemente con un pronóstico desfavorable en el cáncer de riñón, ovario, vejiga, mama, gástrico y pancreático (Hamanishi J.et al.2007Proc. Natl. Acad. Sci.EE. UU. 104:3360-65; Inman B. A.et al.2007Cancer109:1499-505; Konishi J.et al.2004Clin. Cancer Res.10:5094-100; Nakanishi J.et al.2007Cancer Immunol. Immunother.56:1173-82; Nomi T.et al.2007Clin. Cancer Res.13:2151-57; Thompson R. H.et al.2004Proc. Natl. Acad. Sci.EE. UU. 101:17174-79; Wu Cet al.2006Acta Histochem.108:19-24). Adicionalmente, estos estudios indican que niveles más altos de expresión de PD-L1 en los tumores pueden facilitar el avance del estadio del tumor y la invasión a estructuras tisulares más profundas.
La vía PD-1 también puede desempeñar un papel en las neoplasias hematológicas. PD-L1 se expresa en células de mieloma múltiple pero no en células plasmáticas normales (Liu Jet al.2007Blood110:296-304). PD-L1 se expresa en algunos linfomas primarios de linfocitos T, en particular los linfomas T anaplásicos macrocíticos (Brown J. A.et al.,2003Immunol.170:1257-66). PD-1 se expresa en gran medida en los linfocitos T de los linfomas angioinmunoblásticos, y PD-L1 se expresa en la red de células dendríticas foliculares asociadas (Dorfman D. M.et al.
2006Am. J. Surg. Pathol.30:802-10). En el linfoma de Hodgkin con predominio linfocítico nodular, los linfocitos T asociados a células linfocíticas o histiocíticas (L&H) expresan PD-1. El análisis de micromatrices utilizando una lectura de genes inducidos por la ligadura de PD-1 indica que los linfocitos T asociadas al tumor responden a las señales de PD-1in situen el linfoma de Hodgkin (Chemnitz J. M.et al.2007Blood110:3226-33). PD-1 y PD-L1 se expresan en los linfocitos T CD4 en la leucemia y el linfoma de linfocitos T adultos mediado por HTLV-1 (Shimauchi T.et al.2007Int. J. Cancer121: 2585-90). Estas células tumorales son hipersensibles a las señales del TCR.
Los estudios en modelos animales demuestran que la presencia de PD-L1 en los tumores inhibe la activación de los linfocitos T y la lisis de las células tumorales y, en algunos casos, conduce a un aumento de la muerte de los linfocitos T específicos del tumor (Dong H.et al.2002Nat. Med.8:793-800; Hirano F.et al.2005Cancer Res.65:1089-96). Las APC asociadas a tumores también pueden utilizar la vía PD-1:PD-L1 para controlar las respuestas de los linfocitos T antitumorales. La expresión de PD-L1 en una población de DC mieloides asociadas a tumores está regulada al alza por factores ambientales tumorales (Curiel T. J.et al.2003Nat. Med.9:562-67). Las células dendríticas plasmocitoides (DC) del ganglio linfático de drenaje tumoral del melanoma B16 expresan IDO, que activa fuertemente la actividad supresora de los linfocitos T reguladores. La actividad supresora de los linfocitos T reguladores tratadas con IDO requería el contacto celular con DC que expresaran IDO (Sharma M. D.et al.2007Clin. Invest.117:2570-82).
En un ejemplo de la divulgación general (que no forma parte de la presente invención), el primer ligando peptídico comprende un ligando peptídico bicíclico de unión a PD-L1. En un caso, el péptido bicíclico de unión a PD-L1 se selecciona desde cualquiera de los péptidos de las SEQ ID NO: 1 a 9 descritos en el presente documento.
Como alternativa a la divulgación general, el componente presente en una célula cancerosa es el antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) (que, de nuevo, esto no forma parte de la presente invención).
El antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) (también conocido como Glutamato carboxipeptidasa II (GCPII), N-acetil-L-aspartil-L-glutamato peptidasa I (NAALADasa I) y NAAG peptidasa) es una enzima que, en los seres humanos, está codificada por el genFOLH1(folato hidrolasa 1). La GCPII humana contiene 750 aminoácidos y pesa aproximadamente 84 kDa.
El PSMA humano está altamente expresado en la próstata, aproximadamente cien veces más que en la mayoría de los demás tejidos. En algunos cánceres de próstata, el PSMA es el segundo producto génico más regulado al alza, con un aumento de 8 a 12 veces sobre los niveles en células de próstata no cancerosas. Debido a esta alta expresión, el PSMA se está desarrollando como posible biomarcador para la terapia y la obtención de imágenes de algunos tipos de cáncer. En el cáncer de próstata humano, los tumores con mayor expresión se asocian a un tiempo más rápido hasta la progresión y a un mayor porcentaje de pacientes que sufren una recaída.
En un ejemplo de la divulgación general (que no forma parte de la presente invención), el primer ligando peptídico comprende un ligando peptídico bicíclico de unión a PSMA.
Segundos ligandos peptídicos
Las referencias en el presente documento a la expresión "célula inmunitaria" incluyen cualquier célula dentro del sistema inmunitario. Entre los ejemplos adecuados se incluyen los glóbulos blancos, tales como los linfocitos (p. ej. linfocitos T, los linfocitos B o los linfocitos citolíticos naturales). En un caso, el linfocito T es CD8 o CD4. En un caso adicional, el linfocito T es CD8. Otros ejemplos de células inmunitarias incluyen las células dendríticas, células dendríticas foliculares y granulocitos.
En un caso, el componente presente en una célula inmunitaria es CD137.
CD137 es un miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF,Tumor Necrosis Factor).Sus nombres alternativos son receptor del factor de necrosis tumoral, miembro de la superfamilia 9 (TNFRSF9), 4-IBB e inducido por activación linfocitaria (ILA). CD137 se puede expresar en linfocitos T, pero en mayor medida en los linfocitos T CD8+ que en los linfocitos T CD4+. Adicionalmente, la expresión de CD137 se encuentra en las células dendríticas, células dendríticas foliculares, linfocitos citolíticos naturales, granulocitos y células de las paredes de los vasos sanguíneos en los focos de inflamación. Una actividad caracterizada de CD137 es su actividad coestimuladora de linfocitos T activados. El entrecruzamiento de CD137 potencia la proliferación de linfocitos T, la secreción de IL-2, la supervivencia y la actividad citolítica. Además, puede potenciar la actividad inmunitaria para eliminar tumores en ratones.
CD137 es un receptor coestimulante de linfocitos T inducido en la activación del TCR (Namet al., Curr. Cáncer Drug Targets,5:357-363 (2005); Waitset al., Annu. Rev, Immunol.,23:23-68 (2005)). Además de su expresión en linfocitos T CD4+ y CD8+ activados, CD137 también se expresa en los linfocitos T reguladores CD4+CD25+, citolíticos naturales (NK) y los linfocitos T-NK, monocitos, neutrófilos y células dendríticas. Su ligando natural, CD137L, se ha descrito en células presentadoras de antígenos, incluidos los linfocitos B, monocitos/macrófagos y células dendríticas (Wattset al. Annu. Rev. Immunol,23:23-68 (2005)). En interacción con su ligando, CD137 provoca un aumento de la proliferación de linfocitos T inducida por el TCR, la producción de citocinas, maduración funcional y supervivencia prolongada de los linfocitos T CD8+ (Namet al., Curr. Cancer Drug Targets,5:357-363 (2005), Wattset aI., Annu. Rev. Immunol,23:23-68 (2005)).
La señalización a través de CD137 mediante CD137L o anticuerpos monoclonales agonistas (mAb) contra CD137 conduce a un aumento de la proliferación de linfocitos T inducida por el TCR, la producción de citocinas y la maduración funcional, así como la supervivencia prolongada de los linfocitos T CD8+. Estos efectos son el resultado de: (1) la activación de las vías de señalización NF-<k>B, c-Jun NH2-terminal cinasa/proteína cinasa activada por estrés (JNK/SAPK) y p38 mitógeno-proteína cinasa activada (MAPK), y (2) el control de la expresión génica antiapoptótica y relacionada con el ciclo celular.
Los experimentos realizados tanto en ratones deficientes en CD137 como en CD137L han demostrado adicionalmente la importancia de la coestimulación por CD137 en la generación de una respuesta de linfocitos T totalmente competente.
Los linfocitos NK activados por IL-2 e IL-15 expresan CD137, y la ligadura de CD137 por mAb agonistas estimula la proliferación de linfocitos n K y la secreción de IFN-y, pero no su actividad citolítica.
Además, los linfocitos NK estimulados con CD137 promueven la expansión de linfocitos T activadosin vitro.
De acuerdo con su función coestimulante, se ha demostrado que los mAb agonistas contra CD137 promueven el rechazo de aloinjertos cardíacos y cutáneos, erradican tumores establecidos, amplían las respuestas antivíricas primarias de los linfocitos T CD8+ y aumentan el potencial citolítico de los linfocitos T. Estos estudios respaldan la opinión de que la señalización de CD137 promueve la función de los linfocitos T, lo que puede mejorar la inmunidad frente a tumores e infecciones.
En un caso, el segundo ligando peptídico comprende un ligando peptídico bicíclico de unión a CD137.
En el documento WO 2019/025811 se divulgan ejemplos adecuados de ligandos peptídicos bicíclicos de unión a CD137.
En un caso, el péptido bicíclico de unión a CD137 se selecciona desde cualquiera de los péptidos de las SEQ ID NO: 67 a 84 descritos en el presente documento.
Enlazadores
Se apreciará que el primer ligando peptídico puede conjugarse con el segundo ligando peptídico a través de cualquier enlazador adecuado. Normalmente, el diseño de dicho enlazador será tal que los dos péptidos bicíclicos se presenten de manera que puedan unirse sin trabas a sus respectivas dianas, ya sea solos o mientras se unen simultáneamente a ambos receptores diana. Adicionalmente, el enlazador debe permitir la unión a ambas dianas simultáneamente, manteniendo al mismo tiempo una distancia adecuada entre las células diana que conduzca al resultado funcional deseado. Las propiedades del enlazador pueden modularse para aumentar la longitud, rigidez o solubilidad a fin de optimizar el resultado funcional deseado. El enlazador también puede estar diseñado para permitir la unión de más de un biciclo a la misma diana. El aumento de la valencia de cualquiera de los péptidos de unión puede servir para aumentar la afinidad del heterotándem por las células diana o puede ayudar a inducir la oligomerización de uno o ambos receptores diana.
En un caso, el enlazador se selecciona entre las secuencias siguientes: -PEG5- y TCA-[PEG10]3.
A continuación, se detallan las representaciones estructurales de estos enlazadores:
Complejos en heterotándem
En un caso concreto de la divulgación general (pero que no forma parte de la presente invención), el primer ligando peptídico comprende un ligando peptídico bicíclico de unión a PD-L1 unido a un armazón TATA, el segundo ligando peptídico comprende un ligando peptídico bicíclico de unión a CD137 unido a un armazón TATA y dicho complejo en heterotándem se selecciona de entre los complejos enumerados en la Tabla A:
Tabla A (PD-L1: CD137; 1:1)
En uno de dichos casos, el complejo peptídico bicíclico en heterotándem se selecciona entre: BCY12375 y BCY12021. En un ejemplo concreto de la divulgación general (que, de nuevo, no forma parte de la presente invención), el primer ligando peptídico comprende un ligando peptídico bicíclico de unión a EphA2 unido a un armazón TATA, el segundo ligando peptídico comprende un ligando peptídico bicíclico de unión a CD137 unido a un armazón TATA y dicho complejo en heterotándem se selecciona de entre los complejos enumerados en la Tabla B:
T l B E hA2:^ D1 7 1:1
continuación
En uno de dichos casos, el complejo peptídico bicíclico en heterotándem se selecciona entre: BCY13035, BCY13040, BCY13253, BCY13254, BCY13340 y BCY13342.
En un ejemplo concreto de la divulgación general (que, de nuevo, no forma parte de la presente invención), el primer ligando peptídico comprende un ligando peptídico bicíclico de unión a la Nectina-4 unido a un armazón TATA, el segundo ligando peptídico comprende un ligando peptídico bicíclico de unión a CD137 unido a un armazón TATA y dicho complejo en heterotándem se selecciona de entre los complejos enumerados en la Tabla C:
T l N in -4: D1 7 1:1
continuación
En uno de dichos casos, el complejo peptídico bicíclico en heterotándem se selecciona entre: BCY11468, BCY11618, BCY11776, BCY11860, BCY12020, BCY12661 y BCY12969.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entienden normalmente los expertos habituales en la materia, tal como en las técnicas de la química de péptidos, cultivo celular y presentación en fagos, química de ácidos nucleicos y bioquímica. Se usan técnicas convencionales para biología molecular, métodos genéticos y bioquímicos (véase Sambrooket al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3a ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubelet al., Short Protocols in Molecular Biology(1999) 4.a ed., John Wiley & Sons, Inc.).
Nomenclatura
Formato molecular
Las extensiones en el extremo N o C de la secuencia central bicíclica se añaden al lado izquierdo o derecho de la secuencia, separadas por un guion. Por ejemplo, una cola pAla-Sar10-Ala N-terminal se denotaría como:
pAla-Sar10-A-(SEQ ID NO: X).
Secuencias peptídicas invertidas
A la luz de la divulgación en Nair et al (2003) J Immunol 170(3), 1362-1373, se prevé que las secuencias peptídicas divulgadas en el presente documento también encuentren utilidad en su forma retroinversa. Por ejemplo, la secuencia se invierte (es decir, el extremo N se convierte en el extremo C, y viceversa) y su estereoquímica también se invierte (es decir, los aminoácidos D se convierten en aminoácidos L, y viceversa). Para disipar cualquier duda, las referencias a los aminoácidos, ya sea con su nombre completo o con sus códigos de una o tres letras, se denominan en el presente documento L-aminoácidos, salvo que se especifique lo contrario. Si dicho aminoácido está previsto que se represente como un aminoácido D, a continuación, se antepondrá una d minúscula entre corchetes, por ejemplo [dA], [dD], [dE], [dK], [d1Nal], [dNle], etc.
Ligandos peptídicos
Un ligando peptídico, como se denomina en el presente documento, se refiere a un péptido unido covalentemente a un armazón molecular.
Grupos reactivos
El armazón molecular puede estar unido al polipéptido a través de grupos funcionales o reactivos del polipéptido. Normalmente se forman a partir de las cadenas laterales de aminoácidos particulares que se encuentran en el polímero polipeptídico. En general, tales grupos reactivos pueden ser una cadena lateral de cisteína, una cadena lateral de lisina o un grupo amina N-terminal o cualquier otro grupo reactivo adecuado, tal como penicilamina. En el documento WO 2009/098450 pueden encontrarse detalles sobre grupos reactivos adecuados. Debe observarse, sin embargo, que en el ligando peptídico y el complejo peptídico de la presente invención, el polipéptido es específicamente un derivado modificado de una secuencia específica que comprende tres residuos de cisteína, en donde uno o más de estos residuos de cisteína se sustituyen por un grupo reactivo seleccionado entre ácido 3-mercaptopropiónico, cisteamina y penicilamina.
Algunos ejemplos más generales de grupos reactivos de aminoácidos naturales son el grupo tiol de cisteína, el grupo amino de lisina, el grupo carboxilo de aspartato o glutamato, el grupo guanidinio de arginina, el grupo fenólico de tirosina o el grupo hidroxilo de serina. Los aminoácidos no naturales pueden proporcionar una amplia gama de grupos reactivos, incluidos un grupo azida, cetocarbonilo, alquino, vinilo o haluro de arilo. Los grupos amino y carboxilo de las terminaciones del polipéptido también pueden servir como grupos reactivos para formar enlaces covalentes a un armazón molecular/núcleo molecular.
Los polipéptidos de la divulgación contienen al menos tres grupos reactivos. Dichos polipéptidos pueden contener también cuatro o más grupos reactivos. Cuantos más grupos reactivos se usan, más bucles pueden formarse en el armazón molecular.
En un caso preferido, se generan polipéptidos con tres grupos reactivos. La reacción de dichos polipéptidos con un armazón molecular/núcleo molecular que tiene una simetría rotacional triple genera un único isómero del producto. La generación de un único isómero del producto es favorable por varias razones. Los ácidos nucleicos de las bibliotecas de compuestos solo codifican las secuencias primarias del polipéptido, pero no el estado isomérico de las moléculas que se forman tras la reacción del polipéptido con el núcleo molecular. Si solo puede formarse un isómero del producto, la asignación del ácido nucleico al isómero del producto está claramente definida. Si se forman múltiples isómeros del producto, el ácido nucleico no puede dar información sobre la naturaleza del isómero del producto que se aisló en un proceso de cribado o selección. La formación de un único isómero del producto también es ventajosa si se sintetiza un miembro específico de una biblioteca de la divulgación. En este caso, la reacción química del polipéptido con el armazón molecular da lugar a un único isómero del producto en lugar de una mezcla de isómeros.
En otro caso, se generan polipéptidos con cuatro grupos reactivos. La reacción de dichos polipéptidos con un armazón molecular/núcleo molecular que tiene una simetría tetraédrica genera dos isómeros del producto. Aunque los dos isómeros diferentes del producto están codificados por un mismo ácido nucleico, la naturaleza isomérica del isómero aislado puede determinarse sintetizando químicamente ambos isómeros, separando los dos isómeros y probando la unión de ambos isómeros a un ligando diana.
En un caso, al menos uno de los grupos reactivos de los polipéptidos es ortogonal a los restantes grupos reactivos. El uso de grupos reactivos ortogonales permite la dirección de dichos grupos reactivos ortogonales a sitios específicos del núcleo molecular. Las estrategias de enlace que implican grupos reactivos ortogonales pueden utilizarse para limitar el número de isómeros del producto formados. En otras palabras, al seleccionar grupos reactivos distintos o diferentes para uno o más de los al menos tres enlaces a los seleccionados para el resto de los al menos tres enlaces, puede ser útil un orden particular de unión o dirección de grupos reactivos específicos del polipéptido a posiciones específicas en el armazón molecular.
En otro caso, los grupos reactivos del polipéptido se hacen reaccionar con enlazadores moleculares en donde dichos enlazadores son capaces de reaccionar con un armazón molecular de manera que el enlazador intervendrá entre el armazón molecular y el polipéptido en el estado de enlace final.
En algunos casos, los aminoácidos de los miembros de las bibliotecas o conjuntos de polipéptidos pueden sustituirse por cualquier aminoácido natural o no natural. Quedan excluidos de estos aminoácidos intercambiables los que albergan grupos funcionales para la reticulación de los polipéptidos a un núcleo molecular, de modo que las secuencias de bucles por sí solas sean intercambiables. Las secuencias polipeptídicas intercambiables tienen secuencias aleatorias, secuencias constantes o secuencias con aminoácidos aleatorios y constantes. Los aminoácidos con grupos reactivos están situados en posiciones definidas dentro del polipéptido, ya que la posición de estos aminoácidos determina el tamaño del bucle.
En un caso, un polipéptido con tres grupos reactivos tiene la secuencia (X)<l>Y(X)<m>Y(X)<n>Y(X)<o>, en donde Y representa un aminoácido con un grupo reactivo, X representa un aminoácido aleatorio, m y n son números entre 3 y 6 que definen la longitud de los segmentos polipeptídicos intermedios, que pueden ser iguales o diferentes, e I y o son números entre 0 y 20 que definen la longitud de los segmentos polipeptídicos flanqueantes.
Pueden utilizarse alternativas a las conjugaciones mediadas por tioles para unir el armazón molecular al péptido mediante interacciones covalentes. Como alternativa, estas técnicas pueden utilizarse en la modificación o unión de otras moléculas (como pequeñas moléculas de interés distintas del armazón molecular) al polipéptido después de que se hayan seleccionado o aislado de acuerdo con la presente divulgación; en este caso, está claro que la unión no tiene por qué ser covalente y puede adoptar una unión no covalente. Estos métodos pueden usarse en lugar de (o junto con) los métodos mediados por tioles produciendo fagos que presenten proteínas y péptidos con aminoácidos no naturales con los grupos reactivos químicos necesarios, junto con pequeñas moléculas que llevan el grupo reactivo complementario, o incorporando los aminoácidos no naturales en un polipéptido sintetizado química o recombinantemente cuando la molécula se está fabricando después de la fase de selección/aislamiento. Pueden encontrarse más detalles en el documento WO 2009/098450 o Heiniset al., Nat Chem Biol2009, 5 (7), 502-7. En un caso, los grupos reactivos se seleccionan entre residuos de cisteína, ácido 3-mercaptopropiónico y/o cisteamina.
Si bien lo anterior ayuda a comprender el contexto de la presente invención, se observa de nuevo que, en la presente invención reivindicada, el polipéptido comprendido por el ligando peptídico, y por el primer ligando peptídico del complejo peptídico, es un derivado modificado de CP[1Nal][dD]cM[HArg]DWSTP[HyP]WC, en donde uno o más residuos de cisteína se sustituyen por un grupo reactivo seleccionado entre ácido 3-mercaptopropiónico, cisteamina y penicilamina.
Sales farmacéuticamente aceptables
Se apreciará que las formas salinas están dentro del alcance de esta invención y las referencias a ligandos peptídicos incluyen las formas salinas de dichos ligandos.
Las sales de la presente invención pueden sintetizarse a partir del compuesto precursor que contiene un resto básico o ácido mediante métodos químicos convencionales tales como los métodos descritos en "Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use", P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 páginas, agosto de 2002. Generalmente, dichas sales pueden prepararse haciendo reaccionar las formas ácidas o básicas libres de estos compuestos con la base o el ácido apropiados en agua o en un disolvente orgánico, o en una mezcla de los dos.
Las sales de adición de ácido (monosales o disales) pueden formarse con una amplia diversidad de ácidos, tanto inorgánicos como orgánicos. Los ejemplos de sales de adición de ácido incluyen mono o disales formadas con un ácido seleccionado del grupo que consiste en los ácidos acético, 2,2-dicloroacético, adípico, algínico, ascórbico (por ejemplo, L-ascórbico), L-aspártico, bencenosulfónico, benzoico, 4-acetamidobenzoico, butanoico, (+) alcanfórico, alcanfor-sulfónico, (+)-(1S)-alcanfor-10-sulfónico, cáprico, caproico, caprílico, cinámico, cítrico, ciclámico, dodecilsulfúrico, etano-1,2-disulfónico, etanosulfónico, 2-hidroxietanosulfónico, fórmico, fumárico, galactárico, gentísico, glucoheptónico, D-glucónico, glucurónico (por ejemplo, D-glucurónico), glutámico (por ejemplo, L-glutámico), a-oxoglutárico, glicólico, hipúrico, ácidos hidrohálicos (por ejemplo, bromhídrico, clorhídrico, yodhídrico), isetiónico, láctico (por ejemplo, (+)-L-láctico, (±)-DL-láctico), lactobiónico, maleico, málico, (-)-L-málico, malónico, (±)-DL-mandélico, metanosulfónico, naftaleno-2-sulfónico, naftaleno-1,5-disulfónico, 1-hidroxi-2-naftoico, nicotínico, nítrico, oleico, orótico, oxálico, palmítico, pamoico, fosfórico, propiónico, pirúvico, L-piroglutámico, salicílico, 4-aminosalicílico, sebácico, esteárico, succínico, sulfúrico, tánico, (+)-L-tartárico, tiociánico, p-toluenosulfónico, undecilénico y valérico, así como aminoácidos acilados y resinas de intercambio catiónico.
Un grupo particular de sales consiste en sales formadas a partir de los ácidos acético, clorhídrico, yodhídrico, fosfórico, nítrico, sulfúrico, cítrico, láctico, succínico, maleico, málico, isetiónico, fumárico, bencenosulfónico, toluenosulfónico, sulfúrico, metanosulfonato (mesilato), etanosulfónico, naftalenosulfónico, valérico, propanoico, butanoico, malónico, glucurónico y lactobiónico. Una sal particular es la sal de clorhidrato. Otra sal particular es la sal de acetato.
Si el compuesto es aniónico o tiene un grupo funcional que puede ser aniónico (por ejemplo, -COOH puede ser -COO<'>), entonces puede formarse una sal con una base orgánica o inorgánica, generando un catión adecuado. Los ejemplos de cationes inorgánicos adecuados incluyen, pero sin limitación, iones de metales alcalinos tales como Li<+>, Na<+>y K<+>, cationes de metales alcalinotérreos tales como Ca<2+>y Mg<2+>, y otros cationes tales como Al<3+>o Zn<+>. Los ejemplos de cationes orgánicos adecuados incluyen, pero sin limitación, ion amonio (es decir NH<4+>) e iones amonio sustituidos (por ejemplo, NH<3>R<+>, NH<2>R<2+>, NHR<3+>, NR<4+>). Algunos ejemplos de algunos iones amonio sustituidos adecuados son aquellos derivados de: metilamina, etilamina, dietilamina, propilamina, diciclohexilamina, trietilamina, butilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, bencilamina, fenilbencilamina, colina, meglumina y trometamina, así como aminoácidos, tales como lisina y arginina. Un ejemplo de un ion amonio cuaternario común es N(CH<3>)<4+>.
Cuando los compuestos divulgados en el presente documento contienen una función amina, estos pueden formar sales de amonio cuaternario, por ejemplo, mediante reacción con un agente alquilante de acuerdo con métodos bien conocidos por el experto en la materia.
Derivados modificados
Algunos ejemplos de derivados modificados de los ligandos peptídicos como se definen en el presente documento incluyen una o más modificaciones seleccionadas entre: modificaciones N-terminales y/o C-terminales; reemplazo de uno o más restos de aminoácidos por uno o más restos de aminoácidos no naturales (tal como el reemplazo de uno o más restos de aminoácidos polares por uno o más aminoácidos isostéricos o isoelectrónicos; reemplazo de uno o más restos de aminoácidos no polares con otros aminoácidos isostéricos o isoelectrónicos no naturales); adición de un grupo espaciador; reemplazo de uno o más restos de aminoácidos sensibles a la oxidación por uno o más restos de aminoácidos resistentes a la oxidación; sustitución de uno o más restos de aminoácidos por una alanina, reemplazo de uno o más restos de aminoácidos L por uno o más restos de aminoácidos D; N-alquilación de uno o más enlaces amida dentro del ligando peptídico bicíclico; reemplazo de uno o más enlaces peptídicos por un enlace sustituto; modificación de la longitud de la cadena principal del péptido; sustitución del hidrógeno en el carbono alfa de uno o más restos de aminoácidos con otro grupo químico, modificación de aminoácidos tales como cisteína, lisina, glutamato/aspartato y tirosina con la amina adecuada, tiol, ácido carboxílico y reactivos fenólicos para funcionalizar dichos aminoácidos, e introducción o sustitución de aminoácidos que introduzcan reactividades ortogonales adecuadas para la funcionalización, por ejemplo, aminoácidos que portan grupos azida o alquino que permiten la funcionalización con restos fracciones que portan alquino o azida, respectivamente. Los derivados modificados fuera del ámbito de las reivindicaciones anexas no forman parte de la presente invención.
En un caso, el derivado modificado comprende una modificación N-terminal y/o C-terminal. En un caso adicional, en donde el derivado modificado comprende una modificación N-terminal usando una química amino-reactiva adecuada, y/o una modificación C-terminal usando una química carboxi-reactiva adecuada. En un caso adicional, dicha modificación N-terminal o C-terminal comprende la adición de un grupo efector, incluyendo, pero sin limitación, un agente citotóxico, un radioquelante o un cromóforo.
En un caso adicional, el derivado modificado comprende una modificación N-terminal. En un caso adicional, la modificación N-terminal comprende un grupo acetilo N-terminal. En este caso, el grupo cisteína N-terminal (el grupo denominado en el presente documento C<i>) se protege con caperuza con anhídrido acético u otros reactivos apropiados durante la síntesis de péptidos dando lugar a una molécula acetilada N-terminalmente. Este caso proporciona la ventaja de eliminar un punto de reconocimiento potencial para aminopeptidasas y evita el potencial de degradación del péptido bicíclico.
En un caso alternativo, la modificación N-terminal comprende la adición de un grupo espaciador molecular que facilita la conjugación de grupos efectores y la retención de la potencia del péptido bicíclico con su diana.
En un caso adicional, el derivado modificado comprende una modificación en el extremo C. En un caso adicional, la modificación en el extremo C comprende un grupo amida. En este caso, el grupo cisteína C-terminal (el grupo denominado en el presente documento C<iii>) se sintetiza como una amida durante la síntesis de péptidos dando lugar a una molécula amidada C-terminalmente. Este caso proporciona la ventaja de eliminar un punto de reconocimiento potencial para la carboxipeptidasa y reduce el potencial de degradación proteolítica del péptido bicíclico.
En un caso, el derivado modificado comprende el reemplazo de uno o más restos de aminoácidos por uno o más restos de aminoácidos no naturales. En este caso, pueden seleccionarse aminoácidos no naturales que tengan cadenas laterales isostéricas/isoelectrónicas que no sean reconocidas por proteasas degradativas ni tengan ningún efecto adverso sobre la potencia de la diana.
Como alternativa, pueden usarse aminoácidos no naturales que tengan cadenas laterales de aminoácidos restringidas, de tal manera que la hidrólisis proteolítica del enlace peptídico cercano se impida conformacional y estéricamente. En particular, estos se refieren a análogos de prolina, cadenas laterales voluminosas, derivados disustituidos en Ca (por ejemplo, ácido aminoisobutírico, Aib) y aminoácidos cíclicos, siendo un derivado simple el ácido aminociclopropilcarboxílico.
En un caso, el derivado modificado comprende la adición de un grupo espaciador. En un caso adicional, el derivado modificado comprende la adición de un grupo espaciador a la cisteína N-terminal (C<i>) y/o la cisteína C-terminal (C<iii>).
En un caso, el derivado modificado comprende el reemplazo de uno o más restos de aminoácidos sensibles a la oxidación por uno o más restos de aminoácidos resistentes a la oxidación. En un caso adicional, el derivado modificado comprende el reemplazo de un residuo de triptófano por un residuo de naftilalanina o alanina. Este caso proporciona la ventaja de mejorar el perfil de estabilidad farmacéutica del ligando peptídico bicíclico resultante.
En un caso, el derivado modificado comprende el reemplazo de uno o más restos de aminoácidos cargados por uno o más restos de aminoácidos hidrófobos. En un caso alternativo, el derivado modificado comprende el reemplazo de uno o más restos de aminoácidos hidrófobos por uno o más restos de aminoácidos cargados. El equilibrio correcto de restos de aminoácidos cargados frente a hidrófobos es una característica importante de los ligandos peptídicos bicíclicos. Por ejemplo, los restos de aminoácidos hidrófobos influyen en el grado de unión a proteínas plasmáticas y, por lo tanto, en la concentración de la fracción libre disponible en el plasma, mientras que los restos de aminoácidos cargados (en particular, arginina) pueden influir en la interacción del péptido con las membranas de fosfolípidos en las superficies celulares. Los dos en combinación pueden influir en la semivida, el volumen de distribución y la exposición del fármaco peptídico y pueden adaptarse de acuerdo con el criterio de valoración clínico. Adicionalmente, la combinación y el número correctos de restos de aminoácidos cargados frente a hidrófobos pueden reducir la irritación en el lugar de inyección (si el fármaco peptídico se ha administrado por vía subcutánea).
En un caso, el derivado modificado comprende el reemplazo de uno o más restos de aminoácidos L por uno o más restos de aminoácidos D. Se cree que este caso aumenta la estabilidad proteolítica por impedimento estérico y por una propensión de los D-aminoácidos a estabilizar las conformaciones de giro p (Tugyiet al.,(2005)PNAS,102(2), 413-418).
En un caso, el derivado modificado comprende la eliminación de cualquier resto de aminoácido y la sustitución por alaninas. Este caso proporciona la ventaja de eliminar posibles sitio o sitios de ataque proteolítico.
Cabe señalar que cada una de las modificaciones mencionadas anteriormente sirve para mejorar deliberadamente la potencia o la estabilidad del péptido. Pueden lograrse mejoras de potencia adicionales basadas en modificaciones a través de los siguientes mecanismos:
- Incorporar restos hidrófobos que aprovechen el efecto hidrófobo y conduzcan a velocidades de desactivación más bajas, de tal manera que se logren afinidades más altas;
- Incorporar grupos cargados que aprovechen interacciones iónicas de largo alcance, lo que conduce a velocidades de activación más rápidas y a afinidades más altas (véase, por ejemplo, Schreiberet al.,"Rapid, electrostatically assisted association of proteins" (1996),Nature Struct. Biol.3, 427-31); y
- Incorporar restricciones adicionales en el péptido, por ejemplo, restringiendo las cadenas laterales de aminoácidos correctamente de tal manera que la pérdida de entropía sea mínima tras la unión a la diana, restringiendo los ángulos de torsión de la cadena principal de tal manera que la pérdida de entropía sea mínima tras la unión a la diana e introduciendo ciclaciones adicionales en la molécula por razones idénticas.
(para revisiones, véanse Gentilucci et al, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203 y Nestor et al, Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418).
Variaciones isotópicas
También se divulgan ligandos peptídicos marcados con (radio)isótopos farmacéuticamente aceptables de la divulgación, en donde uno o más átomos se reemplazan por átomos que tienen el mismo número atómico, pero una masa atómica o número másico diferente de la masa atómica o número másico que se encuentra habitualmente en la naturaleza, y ligandos peptídicos de la divulgación, en donde se unen grupos quelantes metálicos (denominados "efectores") que son capaces de contener (radio)isótopos relevantes, y ligandos peptídicos de la divulgación, en donde determinados grupos funcionales se reemplazan covalentemente por (radio)isótopos relevantes o grupos funcionales marcados isotópicamente.
Los ejemplos de isótopos adecuados para su inclusión en los ligandos peptídicos comprenden isótopos de hidrógeno, tales como 2H (D) y 3H (T), carbono, tales como 11C, 13C y 14C, cloro, tales como 36Cl, flúor, tal como 18F, yodo, tales como 123I, 125I y 131I, nitrógeno, tales como 13N y 15N, oxígeno, tales como 15O, 17O y 18O, fósforo, tal como 32P, azufre, tal como 35S, cobre, tal como 64Cu, galio, tales como 67Ga o 68Ga, itrio, tal como 90Y y lutecio, tal como 177Lu, y bismuto, tal como 213Bi.
Ciertos ligandos peptídicos marcados isotópicamente, por ejemplo, aquellos que incorporan un isótopo radiactivo, son útiles en estudios de distribución de fármacos y/o sustratos tisulares, y para evaluar clínicamente la presencia y/o ausencia de la diana Nectina-4 en tejidos enfermos. Los ligandos peptídicos pueden tener además valiosas propiedades diagnósticas ya que pueden usarse para detectar o identificar la formación de un complejo entre un compuesto marcado y otras moléculas, péptidos, proteínas, enzimas o receptores. Los métodos de detección o identificación pueden usar compuestos que están marcados con agentes de marcado tales como radioisótopos, enzimas, sustancias fluorescentes, sustancias luminosas (por ejemplo, luminol, derivados de luminol, luciferina, ecuorina y luciferasa), etc. Los isótopos radiactivos tritio, es decir, 3H (T), y carbono-14, es decir 14C, son particularmente útiles para este fin en vista de su facilidad de incorporación y medios de detección sencillos.
La sustitución con isótopos más pesados tales como deuterio, es decir, 2H (D), puede proporcionar determinadas ventajas terapéuticas resultantes de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, mayor semividain vivoo menores requisitos de dosificación y, por lo tanto, pueden preferirse en algunas circunstancias.
La sustitución con isótopos emisores de positrones, tales como 11C, 18F, 15O y 13N, puede ser útil en estudios de topografía por emisión de positrones (PET) para examinar la ocupación de la diana.
Los compuestos marcados isotópicamente de ligandos peptídicos de la divulgación pueden prepararse generalmente mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia o mediante procesos análogos a los descritos en los Ejemplos adjuntos usando un reactivo marcado isotópicamente apropiado en lugar del reactivo no marcado empleado previamente.
Armazón molecular
Se describen armazones moleculares en, por ejemplo, el documento WO 2009/098450, y las referencias citadas en el mismo, en particular los documentos WO 2004/077062 y WO 2006/078161.
Como se ha indicado en los documentos anteriores, el armazón molecular puede ser una molécula pequeña, tal como una molécula orgánica pequeña.
En un caso, el armazón molecular puede ser una macromolécula. En un caso, el armazón molecular es una macromolécula que comprende aminoácidos, nucleótidos o carbohidratos.
En un caso, el armazón molecular comprende grupos reactivos que son capaces de reaccionar con uno o más grupos funcionales del polipéptido para formar enlaces covalentes.
El armazón molecular puede comprender grupos químicos que forman el enlace con un péptido, tales como aminas, tioles, alcoholes, cetonas, aldehídos, nitrilos, ácidos carboxílicos, ésteres, alquenos, alquinos, azidas, anhídridos, succinimidas, maleimidas, haluros de alquilo y haluros de acilo.
En un caso, el armazón molecular puede comprender o consistir en hexahidro-1,3,5-triazina, en especial, 1,3,5-triacrilohexahidro-1,3,5-triazina ("TATA") o un derivado de los mismos.
El armazón molecular de la divulgación contiene grupos químicos que permiten a los grupos funcionales del polipéptido de la biblioteca codificada de la divulgación formar enlaces covalentes con el armazón molecular. Dichos grupos químicos se seleccionan de una amplia gama de grupos funcionales, incluyendo aminas, tioles, alcoholes, cetonas, aldehídos, nitrilos, ácidos carboxílicos, ésteres, alquenos, alquinos, anhídridos, succinimidas, maleimidas, azidas, haluros de alquilo y haluros de acilo.
Los grupos reactivos del armazón que podrían usarse en el armazón molecular para reaccionar con los grupos tiol de las cisteínas son haluros de alquilo (o también denominados halogenoalcanos o haloalcanos).
Algunos ejemplos incluyen bromometilbenceno o yodoacetamida. Otros grupos reactivos de armazón que se usan para acoplar selectivamente compuestos a las cisteínas de las proteínas son las maleimidas, compuestos que contienen ap-carbonilo insaturado y compuestos que contienen a-halometilcarbonilo. Los ejemplos de maleimidas que pueden usarse como armazones moleculares de la divulgación incluyen: tris-(2-maleimidoetil)amina, tris-(2-maleimidoetil)benceno, tris-(maleimido)benceno. Un ejemplo de un compuesto que contiene carbonilo ap insaturado es 1,1',1"-(1,3,5-triazinano-1,3,5-triil)triprop-2-en-1-ona (TATA) (Angewandte chemie, Edición Internacional (2014), 53(6), 1602-1606). Un ejemplo de compuesto que contiene a-halometilcarbonilo es N,N',N"-(benceno-1,3,5-triil)tris(2-bromoacetamida). La selenocisteína también es un aminoácido natural que tiene una reactividad similar a la de la cisteína y puede usarse para las mismas reacciones. Por tanto, siempre que se mencione la cisteína, normalmente es aceptable sustituirla por selenocisteína, a menos que el contexto sugiera otra cosa.
Síntesis
Los péptidos de la presente divulgación pueden fabricarse sintéticamente mediante técnicas convencionales seguidas de una reacción con un armazón molecularin vitro.Cuando esto se realiza, puede usarse la química convencional. Esto permite la preparación rápida a gran escala de material soluble para experimentos posteriores adicionales o validación. Dichos métodos podrían llevarse a cabo usando química convencional tal como aquella descrita en Timmermanet al(anteriormente).
Por tanto, la divulgación también se refiere a la fabricación de polipéptidos o conjugados seleccionados como se expone en el presente documento, en donde la fabricación comprende etapas adicionales opcionales como se explica a continuación. En un caso, estas etapas se realizan en el polipéptido/conjugado del producto final elaborado mediante síntesis química.
Opcionalmente, los restos de aminoácidos en el polipéptido de interés pueden sustituirse cuando se elabora un conjugado o complejo.
Los péptidos también pueden extenderse, para incorporar, por ejemplo, otro bucle y, por lo tanto, introducir múltiples especificidades.
Para extender el péptido, simplemente puede extenderse químicamente en su extremo N o el extremo C o dentro de los bucles usando lisinas protegidas ortogonalmente (y análogos) usando química convencional en fase sólida o fase de solución. Pueden usarse técnicas de (bio)conjugación convencionales para introducir un extremo N o C activado o activable. Como alternativa pueden realizarse adiciones mediante condensación de fragmentos o ligadura química natural, por ejemplo, como se describe en (Dawsonet al.1994. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266:776-779) o mediante enzimas, por ejemplo, usando subtiligasa como se describe en (Changet al., ProcNatl Acad SciEE. UU. 20 de diciembre de 1994; 91(26):12544-8 o en Hikariet al. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,Volumen 18, número 22, 15 de noviembre de 2O08, páginas 6000-6003).
Como alternativa, los péptidos pueden extenderse o modificarse mediante una conjugación adicional a través de enlaces disulfuro. Esto tiene la ventaja adicional de permitir que el primer y el segundo péptido se disocien entre sí una vez dentro del entorno reductor de la célula. En este caso, el armazón molecular (por ejemplo, TATA) podría añadirse durante la síntesis química del primer péptido para que reaccione con los tres grupos de cisteína; después podría añadirse una cisteína o tiol adicional al extremo N o C del primer péptido, de manera que esta cisteína o tiol solo reaccionara con una cisteína o tiol libre de los segundos péptidos, formando un conjugado péptido bicíclico ligado a disulfuro-péptido.
Las técnicas similares se aplican igualmente a la síntesis/acoplamiento de dos macrociclos bicíclicos y biespecíficos, creando potencialmente una molécula tetraespecífica.
Además, la adición de otros grupos funcionales o grupos efectores puede lograrse de la misma manera, usando la química apropiada, acoplándose en los extremos N o C o a través de cadenas laterales. En un caso de la divulgación, el acoplamiento se realiza de tal manera que no bloquee la actividad de ninguna de las entidades.
Composiciones farmacéuticas
De acuerdo con un aspecto adicional de la divulgación, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un ligando peptídico como se define en el presente documento junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
Generalmente, los presentes ligandos peptídicos se usarán en forma purificada junto con excipientes o portadores farmacológicamente apropiados. Normalmente, estos excipientes o portadores incluyen soluciones acuosas o alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo medios salinos y/o tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico y Ringer lactato. Los adyuvantes fisiológicamente aceptables adecuados, si son necesarios para mantener un complejo polipeptídico en suspensión, pueden elegirse de espesantes tales como carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, gelatina y alginatos.
Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de líquidos y nutrientes y reponedores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer. Los conservantes y otros aditivos, tales como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes, también puede estar presentes (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Edición).
Los ligandos peptídicos de la presente divulgación pueden usarse como composiciones administradas por separado o junto con otros agentes. Estos pueden incluir anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y diversos fármacos inmunoterápicos, tales como ciclosporina, metotrexato, adriamicina o cisplatino e inmunotoxinas. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir "cócteles" de diversos agentes citotóxicos u otros agentes junto con los ligandos proteicos de la presente divulgación, o incluso combinaciones de polipéptidos seleccionados de acuerdo con la presente divulgación que tienen diferentes especificidades, tales como polipéptidos seleccionados usando diferentes ligandos diana, ya sea que se agrupen o no antes de la administración.
La vía de administración deseada de las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la divulgación puede ser cualquiera de aquellas conocidas comúnmente por los expertos en la materia. Para la terapia, los ligandos peptídicos pueden administrarse a cualquier paciente de acuerdo con técnicas convencionales. La administración puede ser por cualquier modo apropiado, incluyendo por vía parenteral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, a través de la vía pulmonar o también, apropiadamente, por infusión directa con un catéter. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas se administrarán por inhalación. La dosis y frecuencia de administración dependerán de la edad, el sexo y la condición del paciente, la administración simultánea de otros fármacos, contraindicaciones y otros parámetros que el médico debe tener en cuenta.
Los ligandos peptídicos de esta divulgación pueden liofilizarse para su almacenamiento y reconstituirse en un portador adecuado antes de su uso. Se ha demostrado que esta técnica es eficaz y pueden emplearse técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica. Los expertos en la materia apreciarán que la liofilización y la reconstitución pueden conducir a diversos grados de pérdida de actividad y que los niveles pueden tener que ajustarse hacia arriba para compensar.
Las composiciones que contienen los presentes ligandos peptídicos o un cóctel de los mismos pueden ser para administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En determinadas aplicaciones terapéuticas, una cantidad adecuada para lograr al menos una inhibición parcial, supresión, modulación, destrucción, o algún otro parámetro medible, de una población de células seleccionadas se define como una "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades necesarias para alcanzar esta dosis dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general del sistema inmunológico del propio paciente, pero generalmente varían de 0,005 a 5,0 mg de ligando peptídico seleccionado por kilogramo de peso corporal, usándose más comúnmente dosis de 0,05 a 2,0 mg/kg/dosis. Para aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los presentes ligandos peptídicos o cócteles de los mismos también pueden ser para administrarse en dosis similares o ligeramente inferiores.
Una composición que contiene un ligando peptídico de acuerdo con la presente divulgación puede ser para usarse en entornos profilácticos y terapéuticos para facilitar la alteración, inactivación, destrucción o eliminación de una población de células diana seleccionada en un mamífero. Adicionalmente, los ligandos peptídicos descritos en el presente documento pueden ser para usarse de manera extracorpórea o selectivain vitropara destruir, agotar o eliminar de otro modo de manera eficaz una población de células diana de una colección heterogénea de células. La sangre de un mamífero puede combinarse de manera extracorpórea con los ligandos peptídicos seleccionados, por lo que las células no deseadas se destruyen o se eliminan de otro modo de la sangre para devolverlas al mamífero de acuerdo con técnicas convencionales.
Usos terapéuticos
De acuerdo con otro aspecto de la divulgación general (pero no de la presente invención), se proporciona un complejo peptídico bicíclico en heterotándem como se define en el presente documento para usar en la prevención, la inhibición o el tratamiento del cáncer.
Los ejemplos de cánceres (y sus equivalentes benignos) que pueden tratarse (o inhibirse) incluyen, pero no se limitan a tumores de origen epitelial (adenomas y carcinomas de diversos tipos incluyendo adenocarcinomas, carcinomas escamosos, carcinomas de células transicionales y otros carcinomas) tales como carcinomas de vejiga y tracto urinario, mama, tracto gastrointestinal (incluyendo el esófago, estómago (gástrico), intestino delgado, colon, recto y ano), hígado (carcinoma hepatocelular), vesícula biliar y sistema biliar, páncreas exocrino, riñón, pulmón (por ejemplo, adenocarcinomas, carcinomas pulmonares microcíticos, carcinomas pulmonares no microcíticos, carcinomas bronquioalveolares y mesoteliomas), cabeza y cuello (por ejemplo, cánceres de lengua, cavidad bucal, laringe, faringe, nasofaringe, amígdala, glándulas salivales, cavidad nasal y senos paranasales), ovario, trompas de Falopio, peritoneo, vagina, vulva, pene, cuello uterino, miometrio, endometrio, tiroides (por ejemplo, carcinoma folicular de tiroides), suprarrenal, próstata, piel y anexos (por ejemplo, melanoma, carcinoma basocelular, carcinoma escamocelular, queratoacantoma, nevo displásico); neoplasias hematológicas (es decir, linfomas) y trastornos hematológicos preneoplásicos y trastornos de bajo potencial neoplásico, incluyendo neoplasias hematológicas y afecciones relacionadas del linaje linfoide (por ejemplo, leucemia linfocítica aguda [ALL], leucemia linfocítica crónica [CLL], linfomas de linfocitos B, tales como linfoma difuso de linfocitos B grandes [DLBCL], linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de células del manto, linfomas y leucemias de linfocitos T, linfomas de linfocitos citolíticos naturales [NK], linfomas de Hodgkin, leucemia de células pilosas, gamopatía monoclonal de significado incierto, plasmacitoma, mieloma múltiple y trastornos linfoproliferativos postrasplante), y neoplasias hematológicas y afecciones relacionadas de linaje mieloide (por ejemplo, leucemia mieloide aguda [AML], leucemia mieloide crónica [CML], leucemia mielomonocítica crónica [Cm Ml], síndrome hipereosinofílico, trastornos mieloproliferativos tales como policitemia vera, trombocitemia esencial y mielofibrosis primaria, síndrome mieloproliferativo, síndrome mielodisplásico y leucemia promielocítica); tumores de origen mesenquimal, por ejemplo, sarcomas de tejido blando, hueso o cartílago, tales como osteosarcomas, fibrosarcomas, condrosarcomas, rabdomiosarcomas, leiomiosarcomas, liposarcomas, angiosarcomas, sarcoma de Kaposi, sarcoma de Ewing, sarcomas sinoviales, sarcomas epitelioides, tumores del estroma gastrointestinal, histiocitomas benignos y malignos y dermatofibrosarcoma protuberans; tumores del sistema nervioso central o periférico (por ejemplo, astrocitomas, gliomas y glioblastomas, meningiomas, ependimomas, tumores pineales y schwannomas); tumores endocrinos (por ejemplo, tumores pituitarios, tumores suprarrenales, tumores de células de los islotes, tumores paratiroideos, tumores carcinoides y carcinoma medular de la tiroides); tumores oculares y anexiales (por ejemplo, retinoblastoma); tumores de células germinales y trofoblásticos (por ejemplo, teratomas, seminomas, disgerminomas, molas hidatiformes y coriocarcinomas); y tumores pediátricos y embrionarios (por ejemplo, meduloblastoma, neuroblastoma, tumor de Wilms y tumores neuroectodérmicos primitivos); o síndromes, congénitos o de otro tipo, que dejan al paciente susceptible a la malignidad (por ejemplo, xeroderma pigmentoso).
En un caso adicional, el cáncer se selecciona de una neoplasia maligna hematopoyética tal como seleccionada de: linfoma no hodgkiniano (NHL), linfoma de Burkitt (BL), mieloma múltiple (MM), leucemia linfocítica crónica de linfocitos B (B-CLL), leucemia linfocítica aguda (ALL) B y T, linfoma de linfocitos T (TCL), leucemia mieloide aguda (AML), tricoleucemia (HCL), linfoma de Hodgkin (HL) y leucemia mieloide crónica (CML).
Las referencias en el presente documento al término "prevención" implican la administración de la composición protectora antes de la inducción de la enfermedad. "Supresión" se refiere a la administración de la composición después de un acontecimiento inductivo, pero antes de la aparición clínica de la enfermedad. "Tratamiento" implica la administración de la composición protectora después de que se manifiesten los síntomas de la enfermedad.
Están disponibles sistemas de modelos animales que pueden usarse para evaluar la eficacia de los ligandos peptídicos en la protección contra la enfermedad o en el tratamiento de la misma. La presente divulgación facilita el uso de sistemas de modelos animales, que permite el desarrollo de ligandos polipeptídicos que pueden reaccionar de forma cruzada con dianas humanas y animales, para permitir el uso de modelos animales.
Ejemplos (de referencia)
En general, los complejos peptídicos bicíclicos en heterotándem pueden prepararse de acuerdo con el siguiente método general:
Una mezcla deBiciclo 1(1,0 eq.) yNHS-PEG5-N3(1,6 eq.) se disuelve en MeCN/H<2>O (1:1), y el pH de la solución se ajusta a 8 mediante adición gota a gota de NaHCO<3>(0,1 M). La mezcla de reacción se agita a 30 °C durante 2 h y, a continuación, se concentra a presión reducida para eliminar el disolvente. El residuo se purifica a continuación por HPLC prep., dando el producto intermedio 2.
Se disuelven una mezcla deproducto intermedio 2(1,0 eq) yBiciclo2(1,0 eq) en t-BuOH/H<2>O (1:1) y, a continuación, se añaden CuSO<4>(1,0 eq), VcNa (2,3 eq) y THPTA (1,0 eq). Por último, se añade NH<4>HCO<3>0,2 M para ajustar el pH a 8. La mezcla de reacción se agita a 40 °C durante 16 hora en una atmósfera de N<2>. La mezcla de reacción se purificó directamente por HPLC preparativa.
A continuación, se presentan experimentos más detallados de complejos peptídicos bicíclicos en heterotándem seleccionados:
E m l 1: ín i B Y12 7
Procedimiento para la preparación de ácido palmítico--PEG10-N3
Ácido palmítico NHS-PEGIO-N3 Acido palmítico-PEGIO-N3
1 2 3
Se disolvió una mezcla deácido palmítico(100,0 mg, 282,89 pmol, 1,0 eq.), elcompuesto 2(150,0 mg, 284,84 pmol, 1,0 eq.) y DIEA (74,5 mg, 574,11 pmol, 100,0 pl, 2,0 eq.) en DMF (2 ml). La mezcla de reacción se agitó a 30 °C durante 2 h. La LC-MS mostró que el compuesto1se consumió por completo y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM: 765,03,m/zobservada: 765,22). La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para eliminar el disolvente y se obtuvo un residuo. A continuación, el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condiciones neutras). Se obtuvoácido palmítico--PEG10-N3 (79,0 mg, 99,41 pmol, rendimiento del 35,14 %, pureza del 96,27 %) en forma de un sólido blanco.
Procedimiento de preparación del ácido palmítico-PEG10-BCY12023
CuSO/i VcNaTHPTA
Acido palmítico-PEGIO-N<3>BCY00012023 ■ Acido palmítico -PEG10-BCY00012023 t-Bu0H/H<2>0(1:1)
3 4 5
Se disolvió una mezcla del compuesto 3 (50,0 mg, 22,07 |jmol, 1,0 eq.), compuesto2(17,0 mg, 22,22 |jmol, 1,0 eq.), y THPTA (10,0 mg, 23,02 jmol, 1,0 eq.) en t-BuOH/H<2>O (1:1, 1 ml, previamente desgasificado y purgado con N<2>durante 3 veces) y, a continuación, se añadieron CuSO<4>(0,4 M, 56,0 jl, 1,0 eq.) y VcNa (10,0 mg, 50,48 jmol, 2,3 eq.) bajo N<2>. El pH de esta solución se ajustó a 8 mediante la adición gota a gota de NH<4>HCO<3>0,2 M (en 1:1 de t-BuOH/H<2>O), y la solución se volvió de color amarillo claro. La mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante 2 hora en una atmósfera de N<2>. La LC-MS mostró que elácido palmítico--PEG10-N3 era remanente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 3030,60,m/zobservada: 1010,35 ([M/3+H]<+>)). La mezcla de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para dar un residuo. El producto bruto se purificó mediante HPLC preparativa (en condiciones de T<f>A) y se obtuvoácido palmítico--PEG10-BCY12023(43,0 mg, 13,97 jmol, rendimiento del 63,30 %, pureza del 98,46 %) en forma de sólido blanco.
Procedimiento para la preparación de ácido palmítico--PEG10-BCY12023-PEG5-N3
NaHCCh
Acido palm¡tico I--PEG10-BCY00012023 N3-PEG5-NHS ---------------- =--------*Acido palmítico- PEG10-BCY00012023-PEG5-N3
MeCN/H20(1:1)
5 6 7
Se disolvió una mezcla delcompuesto 5(43,0 mg, 14,19 jmol, 1,0 eq.),compuesto 6(10,0 mg, 23,13 jmol, 1,6 eq.) en MeCN/H2O (1:1, 1 ml) y, a continuación, se ajustó el pH de esta solución a 8 mediante la adición gota a gota de NaHCO3 (0,1 M). La mezcla de reacción se agitó a 30 °C durante 2 h. La LC-MS mostró que elcompuesto 5se consumió por completo y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM: 3347,94,m/zobservada: 1673,7 ([(M/2+H+]), 1115,9 ([(M/3+H+)]). La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para eliminar el disolvente y se obtuvo un residuo. A continuación, el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condiciones neutras). Se obtuvoácido palmítico--PEG10-BCY12023-PEG5-N3(16,0 mg, 4,43 jmol, rendimiento del 31,25 %, pureza del 92,78 %) en forma de un sólido blanco.
Procedimiento para la preparación de BCY12375
CuS04 VcNa THPTA
Ácido palmítico -PEG10-BCY00012023 BCY00010861 ------------------------------------► BCY00012375
t-BtiOH/H20(1:1)
7 8 9
Se disolvió una mezcla del compuesto7(8,0 mg, 2,39 jmol, 1,0 eq.), compuesto8(6,5 mg, 2,39 jmol, 1,0 eq.), y THPTA (1,1 mg, 2,53 jmol, 1,0 eq.) en t-BuOH/H<2>O (1:1, 1 ml, previamente desgasificado y purgado con N<2>durante 3 veces) y, a continuación, se añadieron CuSO<4>(0,4 M, 6,0 j l, 1,0 eq.) y VcNa (1,0 mg, 5,05 jmol, 2,1 eq.) bajo N<2>. El pH de esta solución se ajustó a 8 mediante la adición gota a gota de NH<4>HCO<3>0,2 M (en 1:1 de t-BuOH/H<2>O), y la solución se volvió de color amarillo claro. La mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante 16 hora en una atmósfera de N<2>. La LC-MS mostró que el compuesto7era remanente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 6064.08,m/zobservada: 1516,4 ([M/4+H]<+>), 1212.8 ([M/5+H]<+>)). La mezcla de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para dar un residuo. El producto en bruto se purificó mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA) y se obtuvoBCY12375(6,2 mg, 0,99 jmol, 41,62 % de rendimiento, 97,27 % de pureza) en forma de un sólido de color blanco.
Ejemplo 2: Síntesis de BCY12021
Procedimiento de preparación de! ácido paimítico--PEG10-BCY11144
C uS 04 VcNa THPTA
Acido palmít¡CO-PEG10-N3 BCY00011144 ------------------------------------------► Ácidopalmítico-PEG10-BCY00011144
t-B u0H /H 20(1:1)
3 4 5
Se disolvió una mezcla del compuesto3(160,0 mg, 69,45 pmol, 1,0 eq.), compuesto4(56,0 mg, 72,20 pmol, 1,0 eq.), y THPTA (35,0 mg, 80,55 pmol, 1,1 eq.) en t-BuOH/H<2>O (1:1, 2 ml, previamente desgasificado y purgado con N<2>durante 3 veces) y, a continuación, se añadieron CuSO<4>(0,4 M, 56,0 pl, 1,0 eq.) y VcNa (30,0 mg, 151,43 pmol, 2,2 eq.) bajo N<2>. El pH de esta solución se ajustó a 8 mediante la adición gota a gota de NH<4>HCO<3>0,2 M (en 1:1 de t-BuOH/H<2>O), y la solución se volvió de color amarillo claro. La mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante 16 hora en una atmósfera de N<2>. La LC-MS mostró un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 3068,70,m/zobservada: 1533,81 ([M/2+H]<+>), 1023,43 ([M/3+H]<+>)) detectado. La mezcla de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para dar un residuo. El producto bruto se purificó mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA) y se obtuvoácido palmítico--PEG10-BCY11144(150,0 mg, 46,83 pmol, rendimiento del 67,42 %, pureza del 95,80 %) en forma de sólido blanco.
Procedimiento para la preparación de ácido paimítico--PEG10-BCY11144-PEG5-N3
Ácido palmítico —PEG10-BCY00011144 N3-PEG5-NHS ------------- ► Ácido palmítico -PEG 10-BC Y00011144-PEG5-N3
DMF
5 6 7
Se disolvió una mezcla de compuesto5(47,0 mg, 15,32 pmol, 1,0 eq.), compuesto6(7,0 mg, 16,19 pmol, 1,0 eq.) y DIEA (3,0 mg, 22,97 pmol, 4,0 pl, 1,5 eq.) en DMF (1 ml). La mezcla de reacción se agitó a 30 °C durante 2 h. La LC-MS mostró que el compuesto5se había consumido completamente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM: 3386,03,m/zobservada: 1693,21 ([M/2+H]+), 1129,13 ([M/3+H]+)). La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para eliminar el disolvente y se obtuvo un residuo. A continuación, el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condiciones neutras). Se obtuvoácido palmítico--PEG10-BCY11144-PEG5-N3 (20,0 mg, 5,72 pmol, rendimiento del 37,33 %, pureza del 96,79 %) en forma de un sólido blanco.
Procedimiento para la preparación de BCY12021
C uS 04 VcNaTHPTA
Ácido palmítico-PEG10-BCY0G011144-PEG5-N3 BCY0G010861 ---------------------------------------- ► BCY0C012021
t-BuOH/HaO(1:1)
7 8 9
Se disolvió una mezcla del compuesto7(10,0 mg, 2,95 ^mol, 1,0 eq.), compuesto8(8,2 mg, 3,02 ^mol, 1,0 eq.), y THPTA (1,5 mg, 3,45 ^mol, 1,1 eq.) en t-BuOH/H<2>O (1:1, 1 ml, previamente desgasificado y purgado con N<2>durante 3 veces) y, a continuación, se añadieron CuSO<4>(0,4 M, 8,0 ^l, 1,0 eq.) y VcNa (1,5 mg, 7,57 ^mol, 2,5 eq.) bajo N<2>. El pH de esta solución se ajustó a 8 mediante la adición gota a gota de NH<4>HCO<3>0,2 M (en 1:1 de t-BuOH/H<2>O), y la solución se volvió de color amarillo claro. La mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante 16 hora en una atmósfera de N<2>. La LC-MS mostró un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 6102,17,m/zobservada: 1525,17 ([M/4+H]<+>), 1221,3 ([M/5+H]<+>)). La mezcla de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para dar un residuo. El producto en bruto se purificó mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA) y se obtuvoBCY12021(6,6 mg, 1,02 Mmol, 34,62%de rendimiento, 94,54%de pureza) en forma de un sólido de color blanco.
Ejemplo 3: Síntesis de BCY11468
Procedimiento para la preparación de COM113
Se disolvió una mezcla del compuesto1(50,0 mg, 124,4 ^mol, 1,0 eq.), EDCI (95,4 g, 497,7 ^mol, 4,0 eq.), HOBt (55,5 mg, 410,6 ^mol, 3,3 eq) y DMAP (l5 ,2 mg, 124,4 ^mol, 1,0 eq) en 2 ml de DMF y, a continuación, se añadió DIEA (134,9 mg, 1,04 mmol, 181,8 ^l, 8,4 eq.) para generar una solución homogénea. A continuación, a esta solución, se añadió gota a gota el compuesto2(200,0 mg, 379,8 ^mol, 3,05 eq.) disuelto en DMF (2 ml). La mezcla de reacción se agitó a 30 °C durante 16 h. La LC-MS mostró que el compuesto1se había consumido completamente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM: 1891,19,m/zobservada: 945,8600 ([M/2+H<+>]) y 612,4400 ([(M-3H<2>O)/3+H<+>])). La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC prep(en condiciones de TFA), produciendo COM113(161 mg, 85,67 ^mol, 68%de rendimiento) en forma de un aceite amarillo tras la liofilización.
Procedimiento para la preparación de COM113-BCY8928
1 2
Primero se disolvieronCOM113(50,0 mg, 26,44 ^mol, 1,0 eq) yBCY8928(53,0 mg, 23,9 ^mol, 0.9 eq) en 2 ml de t-BuOH/H<2>O (1 :1) y, a continuación, se añadieron CuSO<4>(0,4 M, 66,1 ^l, 1,0 eq.), VcNa (10,5 mg, 53,0 ^mol, 2,0 eq) y THPTA (23,0 mg, 52,93 ^mol, 2,0 eq.). Por último, se añadió NH<4>HCO<3>1 M para ajustar el pH a 8. Todos los disolventes se desgasificaron y purgaron con N<2>3 veces. La mezcla de reacción se agitó a 30 °C durante 16 hora en una atmósfera de N<2>. La LC-MS mostró un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 4108,77m/zobservada: 1369,97 ([M/3+H]<+>)). La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA) y se obtuvo elCompuesto 2(14,0 mg, 3,21 ^mol, rendimiento del 12,14 %, pureza del 94,16 %) en forma de un sólido blanco.
Procedimiento de preparación del éster NHS del ácido palmítico
A una solución de ácido palmítico (500 mg, 1,95 mmol, 586,85 ^l, 1,0eq),ee añadió 1-hidroxipirrolidin-2,5-diona (250 mg, 2,17 mmol, 1,11 eq) en DCM (5 ml) con EDCI (747,60 mg, 3,90 mmol, 2,0 eq). La mezcla se agitó a 30 °C durante 16 h. La TLC indicó que el reactante 1 se había consumido por completo y que se había formado una nueva mancha. La reacción fue limpia según TLC. La mezcla de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (SiO2, DCM: MeOH = 0 a 100:1). El producto deseado se secó, obteniéndoseÉster NHS del ácido palmítico(0,68 g, 1,92 mmol, 98,65 % de rendimiento) en forma de un sólido blanco.
Procedimiento de preparación del ácido palmítico-Propargilalanina
A una solución del compuesto3(120 mg, 339,47 |jmol, 1,0 eq) y el compuesto4(57,60 mg, 509,20 |jmol, 1,5 eq) en DMF (6 ml), se añadieron DIEA (131,62 mg, 1,02 mmol, 177,39 j l, 3,0eq)y DMAP (41,47 mg, 339,47 jmol, 1,0eq).La mezcla se agitó a 40 °C durante 16 h. El análisis por LC-MS mostró que el reactante 3 se había consumido por completo, y se detectó un máximo principal con lam/zdeseada o la masa deseada. La mezcla de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante HPLC preparatoria (TFA). Se obtuvoácido palmítico-propargilalanina(90 mg, 256,03 jmol, 75,42 % de rendimiento) en forma de un sólido blanco.
Procedimiento para la preparación de COM113-BCY8928-Ácido palmítico
CuS04
VcNa
TCA-PEG10-N3-BCY00008928 Ácido palmítico- ------- THPTA— _ TCA-PEG10-«,-BCY00008928- Ácido palmítico
3Propargilalanma „ „ J
t-BuOH/H20
2 3 4
Primero se disolvieron el compuesto2(14,0 mg, 3,41 jmol, 1,0 eq) y el compuesto 3 (1,1 mg, 3,13 jmol, 0,9 eq) en 2 ml de t-BuOH/H<2>O (1:1) y, a continuación, se añadieron CuSO<4>(0,4 M, 10,0 jl, 1,1 eq.), VcNa (2,0 mg, 10,1 jmol, 2,9 eq) y THPTA (2,0 mg, 4,6 jmol, 1,3 eq). Finalmente se añadió NH<4>HCO<3>0,2 M para ajustar el pH a 8. Aquí, todos los disolventes se desgasificaron y purgaron con N<2>3 veces. La mezcla de reacción se agitó a 35 °C durante 16 hora en una atmósfera de N<2>. La LC-MS mostró un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 4460,29,m/zobservada: 1486,92 ([M/3+H]<+>), 1115,58 ([M/4+H]<+>), 895,83 ([M/5+H]<+>)). La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA) y se obtuvo el Compuesto4(5,9 mg, 1,28 jmol, rendimiento del 37,66 %, pureza del 97,0 %) en forma de un sólido blanco.
Procedimiento para la preparación de BCY11468
C uS04
VcNa
TCA-PEG10-N3-BCY00008928-Ácido palmíticoBCY00011016 ------ THPTA— »- BCY00011468
t-BuOH/H20
4
Primero se disolvieron elCompuesto 4(5,9 mg, 1,32 jmol, 1,0 eq) yBCY11016(3,0 mg, 1.29 jmol, 1 eq) en 2 ml de t-BuOH/H<2>O (1:1) y, a continuación, se añadieron CuS0<4>(0,4 M, 8,0 jl, 2,4 eq.), VcNa 2,0 mg, 7,6 eq) y T<h>PTA (2,0 mg, 3,5 eq). Por último, se añadió NH<4>HCO<3>1 M para ajustar el pH a 8. Todos los disolventes se desgasificaron y purgaron con N<2>3 veces. La mezcla de reacción se agitó a 30 °C durante 16 hora en una atmósfera de N<2>. La LC-MS mostró un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 6783,93,m/z/zobservada: 1131,7 ([M/6+H]<+>)). La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA) y se obtuvo elBCY11468(2,2 mg, 0,312 jmol, rendimiento del 23,57 %, pureza del 96,16 %) en forma de un sólido blanco.
Ejemplo 4: Síntesis de BCY11618
Procedimiento para la preparación de BCY8920-PEG5-N3
Se disolvió una mezcla del compuestoBCY8920(50,0 mg, 23,39 pmol, 1,0 eq.), el compuesto2(10,2 mg, 23,51 pmol, 1,01 eq.) y NaHCO3 (2,0 mg, 24,8 pmol, 1,0 eq.) en MeCN/H2O (1:1, 2 ml). La mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante 2 h, hasta que la LC-MS mostró queBCY8920se había consumido completamente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 2454,83,m/zobservada: 1227,67 ([M/2+H]+) y 818,74 ([M/3+H]+)). A continuación, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida para eliminar el disolvente y se obtuvo un residuo, seguido de la purificación mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA).BCY8920-PEG5-N3(25 mg, 9,70 pmol, rendimiento del 41,47 %, pureza del 95,26 %) se obtuvo en forma de un sólido blanco.
Procedimiento de preparación de BCY11143-dK(ácido palmítico)
BCY00011143-dK (ácido palmítico) 6
Se disolvió una mezcla deBCY11143(30,0 mg, 12,84 pmol, 1,0 eq.), Compuesto 5 (5,0 mg, 14,12 pmol, 1,1 eq.), DIEA (1,7 mg, 12,84 pmol, 2,2 pl, 1,0 eq.) y DMAP (1,6 mg, 12,84 pmol, 1,0 eq.) en DMF. La mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante 2 hora en una atmósfera de N2. La LC-MS mostró un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 2575,14,m/zobservada: 1287,68 ([M/2+H+])) se detectó. La mezcla de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para dar un residuo, que, a continuación, se purificó mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA). Se obtuvoBCY11143-dK(ácido palmítico)(18,3 mg, 6,95 pmol, 54,17 % de rendimiento, 97,86 % de pureza) en forma de un sólido blanco.
Procedimiento para la preparación de BCY11618
Se disolvió una mezcla del compuesto 3 (5 mg, 2,04 pmol, 1,0 eq.), compuesto 6 (5,8 mg, 2,3 pmol, 1,1 eq.) y THPTA (0,9 mg, 2,07 pmol, 1,0 eq.) en t-BuOH/H2O (1:1, 1 ml, previamente desgasificado y purgado con N2 durante 3 veces) y, a continuación, se añadieron CuSO4 (0,4 M, 5,1 pl, 1,0 eq.) y VcNa (0,4 M, 5,1 pl, 1,0 eq.) bajo N2. El pH de esta solución se ajustó a 8 mediante la adición gota a gota de NH<4>HCO<3>0,2 M (en 1:1 de t-BuOH/H<2>O), y la solución se volvió de color amarillo claro. La mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante 6 hora en una atmósfera de N<2>. La LC-MS mostró que el compuesto3se había consumido completamente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 5029.97,m/zobservada: 1257,8 ([M/4+H]<+>) y 1006,6 ([M/5+H]<+>)). La mezcla de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para dar un residuo. El producto en bruto se purificó mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA) y se obtuvoBCY11618(5,3 mg, 1,0 pmol, 49,15 % de rendimiento, 95 % de pureza) en forma de un sólido de color blanco.
Ejemplo 5: Síntesis de BCY11776
Procedimiento para la preparación de BCY8116-Peg5-N3
BCY00008116 NHS-Peg5-N3 -----__Nd ^ ° 3 »»■ BCY00008116-Peg5-N3
MeCN/H20
2 3
Se disolvió una mezcla del compuestoBCY8116(50,0 mg, 23,39 pmol, 1,0 eq.), el compuesto 2 (10,2 mg, 23,51 pmol, 1,01 eq.) y NaHCO3 (2,0 mg, 24,8 pmol, 1,0 eq.) en MeCN/H2O (1:1, 2 ml). La mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 1 h hasta que la LC-MS mostró que elBCY8116se había consumido por completo y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 2454,83,m/zobservada: 1227,67 ([M/2+H+]), 818,74 ([M/3+H+])). A continuación, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida para eliminar el disolvente y se obtuvo un residuo, seguido de la purificación mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA). El compuesto 3 (25,0 mg, 9,70 pmol, rendimiento del 41,47 %, pureza del 95,26 %) se obtuvo en forma de un sólido blanco.
Procedimiento de preparación del compuesto BCY11144-dK(ácido palmítico)
BCY00011144-dK (ácido palmítico)
6
Se disolvió una mezcla deBCY11144(50,0 mg, 21,7 pmol, 1,0 eq.), Compuesto 5 (8,5 mg, 23,87 pmol, 1,1 eq.), DIEA (2,81 mg, 21,7 pmol, 4,0 pl, 1,0 eq.) y DMAP (2,7 mg, 21,7 pmol, 1,0 eq.) en DMF. La mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 2 hora en una atmósfera de N2. La LC-MS mostró que el compuesto 3 se había consumido completamente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 2542,08,m/zobservada: 1271,7 ([M/2+H+])). La mezcla de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para dar un residuo, que, a continuación, se purificó mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA). Elcompuesto 6(18,3 mg, 6,95 pmol, rendimiento del 54,17 %, pureza del 96,68 %) se obtuvo en forma de un sólido blanco.
Procedimiento para la preparación de BCY11776
Se disolvió una mezcla del compuesto 3 (10 mg, 4,0 pmol, 1,0 eq.), compuesto 6 (11,2 mg, 4,4 pmol, 1,1 eq.) y THPTA (1,8 mg, 1,0 eq.) en t-BuOH/H2O (1:1, 1 ml, previamente desgasificado y purgado con N2 durante 3 veces) y, a continuación, se añadieron CuSO<4>(0,4 M, 5,1 pl, 1 eq.) y VcNa (0,4 M, 5,1 pl, 1 eq.) bajo N<2>. El pH de esta solución se ajustó a 8 mediante la adición gota a gota de NH<4>HCO<3>0,2 M (en 1:1 de t-BuOH/H<2>O), y la solución se volvió de color amarillo claro. La mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante 6 hora en una atmósfera de N<2>. La LC-MS mostró que el compuesto3se había consumido completamente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 5031,9,m/zobservada: 1258,52 ([M/4+H<+>]), 1006,7 ([M/5+H<+>])). La mezcla de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para dar un residuo. El producto en bruto se purificó mediante HPLC (en condiciones de TFA) preparativa y se obtuvo BCY11776 (12,5 mg, 2,4 pmol, 60,11%de rendimiento, 96,6%de pureza) en forma de un sólido de color blanco.
Ejemplo 6: Síntesis de BCY11860
CuS04 THPTA VcNa
BCY00008920-Peg5-N3 BCY00011143 ----------------------------------- ► BCY00008920-Peg5-BCY00011143 t-Bu0H/H20 „
1 2 2 3
Se disolvió una mezcla deBCY8920-PEG5-N3 (20,0 mg, 8,15 pmol, 1,0 eq.), compuesto 2 (21,0 mg, 8,96 pmol, 1,1 eq.) y THPTA (0,4 mg, 21,0 pmol, 1,0 eq.) en t-BuOH/H<2>O (1:1, 1 ml, previamente desgasificado y purgado con N<2>durante 3 veces) y, a continuación, se añadieron CuSO<4>(0,4 M, 21,0 pl, 1,0 eq.) y VcNa (0,4 M, 21,0 pl, 1,0 eq.) bajo N<2>. El pH de esta solución se ajustó a 8 mediante la adición gota a gota de NH<4>HCO<3>0,2 M (en 1:1 de t-BuOH/H<2>O), y la solución se volvió de color amarillo claro. La mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante 4 hora en una atmósfera de N<2>. La LC-MS mostró que el compuesto1se había consumido completamente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 4791,56,m/zobservada: 1597,28 ([M/3+H]<+>), 1198,18 ([M/4+H]<+>)). La mezcla de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para dar un residuo. El producto en bruto se purificó mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA) y se obtuvoBCY8920-Peg5-BCY11143(22,5 mg, 4,25 pmol, 52,13 % de rendimiento, 90,44 % de pureza) en forma de un sólido de color blanco.
Procedimiento para la preparación de BCY11860
DIEA, DMAP
BCY00008920-Peg5-BCY00011143 Biotin-Peg12-NHS -----------------► BCY00011860 DMF
Se disolvió una mezcla del compuesto3(5,0 mg, 1,04 pmol, 1,0 eq.), compuesto4(1,08 mg, 1,15 pmol, 1,1 eq.) y DIEA (0,4 M, 1,04 pmol, 3,0 pl, 1,0 eq.) y DMAP (0,2 mg, 1,04 pmol, 1,0 eq.) en DMF (1,0 ml). La mezcla de reacción se agitó a 30 °C durante 2 h. La LC-MS mostró que el compuesto 3 se había consumido completamente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM: 5617,56,m/zobservada: 1404,56 ([(M/4+H+])). La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para eliminar el disolvente y se obtuvo un residuo. A continuación, el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condiciones neutras).BCY11860(2,9 mg, 0,48 pmol, rendimiento del 45,86%,pureza del 92,70 %) se obtuvo en forma de un sólido blanco.
Ejemplo 7: Síntesis de BCY12020
Procedimiento para la preparación de ácido palmítico-PEG10-N3
Ácido palmítico-NHS NH2-PEG10-N3 Qjyjp* *Ácido palmítico-PEG10-N3
1 2 3
Se disolvió una mezcla deácido palmítico-NHS(100,0 mg, 282,89 pmol, 1,0 eq.), el compuesto 2 (150,0 mg, 284,84 pmol, 1,0 eq.) y DIEA (74,5 mg, 574,11 pmol, 100,0 pl, 2,0 eq.) en DMF (2 ml). La mezcla de reacción se agitó a 30 °C durante 2 h. La LC-MS mostró que el compuesto 1 se consumió por completo y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM: 765,03,m/zobservada: 765,22). La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para eliminar el disolvente y se obtuvo un residuo. A continuación, el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condiciones neutras).Ácido palmítico-PEG10-N3 (79,0 mg, 99,41 pmol, 35,14 % de rendimiento, 96,27 % de pureza) se obtuvo en forma de un sólido blanco.
Procedimiento de preparación del ácido palmítico-PEG10-BCY11144
CuS04 VcNaTHPTA
Ácido palmítico-PEGIO-N3 BCY00011144 ------------------------------------- ► Ácido palmítico-PEG10-t-BuOH/H20(1 :1) BCY00011144
3 4 5
Se disolvió una mezcla del compuesto 3 (160,0 mg, 69,45 pmol, 1,0 eq.), compuesto 2 (56,0 mg, 72,20 pmol, 1,0 eq.), y THPTA (35,0 mg, 80,55 pmol, 1,1 eq.) en t-BuOH/H<2>O (1:1, 2 ml, previamente desgasificado y purgado con N<2>durante 3 veces) y, a continuación, se añadieron CuSO<4>(0,4 M, 56,0 pl, 1,0 eq.) y VcNa (30,0 mg, 151,43 pmol, 2,2 eq.) bajo N<2>. El pH de esta solución se ajustó a 8 mediante la adición gota a gota de NH<4>HCO<3>0,2 M (en 1:1 de t-BuOH/H<2>O), y la solución se volvió de color amarillo claro. La mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante 16 hora en una atmósfera de N<2>. La LC-MS mostró un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 3068,70,m/zobservada: 1533,81 ([M/2+H]<+>), 1023,43 ([M/3+H]<+>)). La mezcla de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para dar un residuo. El producto bruto se purificó mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA) y se obtuvoácido palmítico-PEG10-BCY11144(150,0 mg, 46,83 pmol, rendimiento del 67,42 %, pureza del 95,80 %) en forma de sólido blanco.
Procedimiento para la preparación de ácido palmítico-PEG10-BCY11144-PEG5-N3
Ácido palmítico-PEG10-BCY00011144 N3-PEG5-NHS DIEA »Ácido palmítico-PEG10-BCY00011144-PEG5-N3
DMF
5 6 7
Se disolvió una mezcla de compuesto 5 (47,0 mg, 15,32 pmol, 1,0 eq.), compuesto 6 (7,0 mg, 16,19 pmol, 1,1 eq.) y DIEA (3,0 mg, 22,97 pmol, 4,0 pl, 1,5 eq.) en DMF (1 ml). La mezcla de reacción se agitó a 30 °C durante 2 h. La LC-MS mostró que el compuesto5se había consumido completamente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM: 3386,03,mizobservada: 1693,21 ([M/2+H]+), 1129,13 ([M/3+H]+)). La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para eliminar el disolvente y se obtuvo un residuo. A continuación, el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condiciones neutras). Se obtuvoácido palmítico-PEG10-BCY11144-PEG5-N3 (20,0 mg, 5,72 pmol, rendimiento del 37,33 %, pureza del 96,79 %) en forma de un sólido blanco.
Procedimiento para la preparación de BCY12020
CuS04 VcNa THPTA
Ácido palmítico -PEG10-BCY00011144-PEG5-N3 BCY00011016 ------------------------------------- ► BCY00012020 t-BuOH/H20(1:1)
7 8 9 Se disolvió una mezcla del compuesto7(50,0 mg, 14,77 pmol, 1,0 eq.), compuesto8(35,0 mg, 15,06 pmol, 1,0 eq.), y THPTA (10,0 mg, 23,02 pmol, 1,5 eq.) en t-BuOH/H<2>O (1:1, 2 ml, previamente desgasificado y purgado con N<2>durante 3 veces) y, a continuación, se añadieron CuSO<4>(0,4 M, 38,0 pl, 1,0 eq.) y VcNa (6,5 mg, 32,81 pmol, 2,2 eq.) bajo N<2>. El pH de esta solución se ajustó a 8 mediante la adición gota a gota de NH<4>HCO<3>0,2 M (en 1:1 de t-BuOH/H<2>O), y la solución se volvió de color amarillo claro. La mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante 16 hora en una atmósfera de N<2>. La LC-MS mostró un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 5709,68,m/zobservada: 1902,80 ([M/3+H]<+>), 1427,56 ([M/4+H]<+>)). La mezcla de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para dar un residuo. El producto en bruto se purificó mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA) y se obtuvoBCY12020(54,8 mg, 9,49 pmol, 64,24 % de rendimiento, 98,83 % de pureza) en forma de un sólido de color blanco.
Ejemplo 8: Síntesis de BCY12661
Procedimiento de preparación del compuesto 2
El péptido se sintetizó usando la química Fmoc convencional. Se añadió DCM a un recipiente de reacción que contenía resina de clorotritilo (1 mmol, 0,91 g, 1,10 mmol/g) y Fmoc-Lys(N3)-OH (1 eq, 395,4 mg, 1 mmol) con burbujeo de N<2>. Se añadió DIEA (4,0 eq) gota a gota y se mezcló durante 2 horas. A continuación, se añadió MeOH (2 ml) y se mezcló durante 30 min. Se escurrió la resina y se lavó con DMF 5 veces. La desprotección por Fmoc se realizó añadiendo un 20 % de piperidina/DMF y mezclando durante 30 min. La resina se escurrió y se lavó con DMF 5 veces. Para el alargamiento de la cadena, se añadió la solución de aminoácido Fmoc y se mezcló primero durante 30 segundos, a continuación, se añadió tampón de activación (que contenía HBTU y DIEA en DMF) y se agitó durante 1 h con burbujeo
N.° Materiales Reactivos de acoplamiento
1 Fmoc-Lys(N3)-OH ( DIEA (4,0 eq)
2 Fmoc-yGlu(OtBu)-OH (3 eq) HBTU (2,85 eq) y DIEA (6,0 eq) 3 Ácido palmítico (3 eq) HBTU (2,85 eq) y DIEA (6,0 eq)
Tras el último acoplamiento de aminoácidos, la resina se lavó con MeOH 3 veces y, a continuación, se secó al vacío. Se añadieron 10 ml de cóctel de escisión (95 % de TFA/2,5 % de TIS/2,5 % de H2O) al matraz que contenía el péptido protegido de la cadena lateral a temperatura ambiente y se agitó durante 1 hora. La resina se filtró y el filtrado se concentró para eliminar el disolvente. El péptido en bruto se liofilizó, dando el producto finalCompuesto 2 (azida de ácido palmítico)(200 mg, 97,78 % de pureza, 37,06 % de rendimiento). PM calculado: 539,72,m/zobservada:540,4([M+H]+).
Procedimiento para la preparación de BCY12023-azida de ácido palmítico
Se disolvió una mezcla del compuesto 1 (40,0 mg, 17,66 pmol, 1,0 eq.), compuesto 2 (9,5 mg, 17,66 pmol, 1,0 eq.), y THPTA (8,0 mg, 17,66 pmol, 1,0 eq.) en t-BuOH/H<2>O (1:1, 1 ml, previamente desgasificado y purgado con N<2>durante 3 veces) y, a continuación, se añadieron CuSO<4>(0,4 M, 45,0 pl, 1,0 eq.) y VcNa (8,0 mg, 35,33 pmol, 2,0 eq.) bajo N<2>. El pH de esta solución se ajustó a 8 mediante la adición gota a gota de NH<4>HCO<3>0,2 M (en 1:1 de t-BuOH/H<2>O), y la solución se volvió de color amarillo claro. La mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante 4 hora en una atmósfera de N<2>. La LC-MS mostró que el compuesto 1 se había consumido completamente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 2804,30,m/zobservada: 1402,8 ([M/2+H]<+>), 935,9 ([M/3+H]<+>)). La mezcla de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para dar un residuo. El producto en bruto se purificó mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA), y se obtuvoBCY12023-azida de ácido palmítico(35,0 mg, 12,11 pmol, 68,54 % de rendimiento, 97,00 % de pureza) en forma de un sólido blanco.
Procedimiento para la preparación de BCY12023-ácido palmítico-PEG5-N3
NaHC03 BCY00012023-ácido BCY00012023-azida de ácido palmítico N3-PEG5-NHS ---------------------------► palmítico-PEG5-N3
MeCN/H20(1:1)
3 4 5
Se disolvió una mezcla del compuesto3(35,0 mg, 12,48 pmol, 1,0 eq.), compuesto4(5,4 mg, 12,48 pmol, 1,0 eq.) en MeCN/H2O (1:1, 1 ml) y, a continuación, se ajustó el pH de esta solución a 8 mediante la adición gota a gota de NaHCO3 (0,1 M). La mezcla de reacción se agitó a 30 °C durante 2 h. La LC-MS mostró que el compuesto 3 se había consumido completamente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM: 3121,63,m/zobservada: 1561,2 ([(M/2+H+])). La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para eliminar el disolvente y se obtuvo un residuo. A continuación, el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condiciones neutras). Se obtuvoBCY12023-ácido palmítico-PEG5-N3(11,4 mg, 3,46 pmol, 27,71 % de rendimiento, 94,70 % de pureza) en forma de un sólido blanco.
Procedimiento para la preparación de BCY12661
Se disolvió una mezcla del compuesto5(11,4 mg, 3,65 pmol, 1,0 eq.), compuesto6(8,3 mg, 3,65 pmol, 1,0 eq.) y THPTA (1,6 mg, 3,65 pmol, 1,0 eq.) en t-BuOH/H<2>O (1:1, 1 ml, previamente desgasificado y purgado con N<2>durante 3 veces) y, a continuación, se añadieron CuSO<4>(0,4 M, 10,0 pl, 1,1 eq.) y VcNa (1,5 mg, 7,30 pmol, 2,0 eq.) bajo N<2>. El pH de esta solución se ajustó a 8 mediante la adición gota a gota de NH<4>HCO<3>0,2 M (en 1:1 de t-BuOH/H<2>O), y la solución se volvió de color amarillo claro. La mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante 4 hora en una atmósfera de N<2>. La LC-MS mostró que el compuesto3se había consumido completamente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 5374,21,m/zobservada: 1344,5 ([M/4+H]<+>)). La mezcla de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para dar un residuo. El producto en bruto se purificó mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA) y se obtuvoBCY12661(9,8 mg, 19,63 pmol, 48,73 % de rendimiento, 97,60 % de pureza) en forma de un sólido de color blanco.
Ejemplo 9: Síntesis de BCY12969
El péptido se sintetizó usando la química Fmoc convencional. Se añadió DCM a un recipiente de reacción que contenía resina de clorotritilo (1 mmol, 0,91 g, 1,1 mmol/g) y Fmoc-yGlu(OtBu)-OH (0,425 mg, 1 mmol, 1 eq) y se agitó la mezcla con burbujeo de N<2>. Se añadió DIEA (4,0 eq) gota a gota y la mezcla se agitó durante 2 horas. A continuación, se añadió MeOH (4,6 ml) y se mezcló durante 30 min. Se escurrió la resina y se lavó con DMF 5 veces. Se añadió a la resina un 20 % de piperidina/DMF y se mezcló durante 30 minutos. La resina se escurrió y se lavó con DMF 5 veces. Se añadió a la resina una solución de Fmoc-aminoácido y se mezcló durante 30 segundos, a continuación, se añadió agente activador y DIPEA, y se burbujeó N<2>a través de la mezcla durante 1 hora. Las etapas de desprotección y acoplamiento se repitieron con los siguientes reactivos:
Nota:
Tras el acoplamiento del ácido palmítico, la resina se lavó 3 veces con MeOH y, a continuación, se secó al vacío. El péptido se separó de la resina añadiendo un 20 % de HFIP/80 % de DCM a temperatura ambiente y agitando la mezcla durante 1 hora. Este procedimiento se repitió una vez más, a continuación, se filtró la resina y se concentró el filtrado para eliminar el disolvente. El péptido en bruto se liofilizó, dando el producto final (280 mg, pureza del 84,80 %, rendimiento del 44,67%). PM calculado: 626,8,m/zobservada: 627,4 ([M+H]+)
Procedimiento general para la preparación del compuesto 3
A una solución del compuesto 2 (15,8 mg, 25,1 jmol, 1,1 eq) en DMF (0,5 ml) se añadió EDCI (4,4 mg, 22,8 jmol, 1,0 eq) y se agitó durante 10 min. A continuación, se añadieron a la mezcla HOSu (2,9 mg, 25,1 jmol, 1,1 eq) y DIEA (8,8 mg, 68,5 jmol, 11,9 |jl, 3 eq). La mezcla se agitó durante 16 h a 25 °C. A continuación, se añadió a la mezclaBCY12358(50,0 mg, 22,8 jmol, 1,0 eq) en DMF (0,5 ml) y se agitó a 25 °C durante otras 4 h. La LC-MS mostró queBCY12358se había consumido completamente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada fPM calculado: 2798,42,m/zobservada: 1399,6 [M/2+H]+). La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC preparativa (A: 0,075 % de TFA en H2O, B: ACN), dando el compuesto 3 (21,9 mg, 7,83 jmol, 34,3 % de rendimiento) en forma de un sólido blanco.
Procedimiento general para la preparación del compuesto 5
5
Una mezcla del compuesto4(20,0 mg, 8,03 jmol, 1,0 eq), compuesto 3 (22,5 mg, 8,03 jmol, 1,0 eq) y THPTA (4,0 mg, 9,21 jmol, 1,15 eq) en t-BuOH (0.5 ml) y H<2>O (0,5 ml)sedesgasificó y purgó con N<2>3 veces y, a continuación, se añadieron CuSO<4>(0,4 M, 20,1 jl, 1,0 eq.), VcNa (0,4 M, 40,2 jl, 2,0 eq) y NH<4>HCO<3>(0,2 M, 80,4 jl, 2,0 eq) a la mezcla. La mezcla se agitó a 30 °C durante 2 h en una atmósfera de N<2>. La LC-MS mostró que el compuesto4se había consumido completamente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada fPM calculado: 5288,25,m/zobservada: 1322,3 [M/4+H]<+>, 1763,8 [M/3+H]<+>). Se añadió EDTA (0,5 M, 20,0 jl) a la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida, dando un producto en bruto compuesto5(42,0 mg, en bruto) en forma de un sólido gris y se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Procedimiento general para la preparación de BCY12969
ml, 458,6 eq) gota a gota. La mezcla se agitó a 30 °C durante 1 h. La LC-MS mostró que el compuesto5se había consumido completamente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 5176,04,m/zobservada: 1035,7 [M/5+H]<+>, 1294,9 [M/4+H]<+>, 1726,8 [M/3+H]<+>). La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa (A: 0,075 % de TFA en H<2>O, B: ACN), dando BCY12969 (2,6 mg, 0,48 jmol, 5,85 % de rendimiento, 92,4 % de pureza) en forma de un sólido blanco.
Ejemplo 10: Síntesis de BCY13035
Se disolvió una mezcla de BCY12860 (40,0 mg, 19,40 pmol, 1,0 eq.), compuesto 2 (10,0 mg, 21,34 pmol, 1,1 eq.) en MeCN/H2O (1:1, 1 ml) y, a continuación, se ajustó el pH de esta solución a 8 mediante la adición gota a gota de NaHCO3 (0,1 M). La mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 1 h. La LC-MS mostró un pico con lam/zdeseada. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para eliminar el disolvente y se obtuvo un residuo. A continuación, el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condiciones neutras). Se obtuvo BCY12860-PEG5-N3 (39,7 mg, 15,02 pmol, rendimiento del 77,41 %, pureza del 90,0 %) se obtuvo en forma de un sólido blanco. PM: 2378,78,m/zobservada: 1190,1 ([(M/2+H+]), 793,5 ([(M/3+H+]).
Procedim iento para la preparación de BCY13035
Se disolvió una mezcla de compuesto 3 (39,7 mg, 16,69 pmol, 1,0 eq.), BCY8928 (41,0 mg, 18,36 pmol, 1,1 eq.) y THPTA (0,4 mg, 55 pmol, 1,3 eq.) en t-BuOH/H2O (1:1, 1 ml, previamente desgasificado y purgado con N2 durante 3 veces) y, a continuación, se añadieron CuSO4 (0,4 M, 55 pl, 1,3 eq.) y VcNa (0,4 M,109 pl, 2,6 eq.) bajo N2. El pH de esta solución se ajustó a 8 mediante la adición gota a gota de NH4HCO30,2 M (en 1:1 de t-BuOH/H2O), y la solución se volvió de color amarillo claro. La mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante 2 hora en una atmósfera de N2. La LC-MS mostró que el compuesto 3 se había consumido por completo, y se detectó un máximo principal con lam/zdeseada. La mezcla de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para dar un residuo. El producto en bruto se purificó mediante HPLC (en condiciones de TFA) preparativa y se obtuvo BCY13035 (42,0 mg, 8,85 ^mol, 53,04 % de rendimiento, 96,41 % de pureza) en forma de un sólido de color blanco. PM calculado: 4596,37,m/zobservada: 1532,9 ([M/3+H]+), 1149,9 ([M/4+H]+).
Ejemplo 11: Síntesis de BCY13040
Procedimiento para la preparación de BCY12865-PEG5-N3
Se disolvieronBCY12865(30,0 mg, 13,99 pmol, 1,0 eq) ycompuesto 1(6,1 mg, 14,11 pmol, 1.01 eq), en 1 ml de MeCN/H2O (1:1) y, a continuación, se añadió NaHCO31 M para ajustar el pH a 8. La mezcla se agitó a 25 °C durante 2 h. La LC-MS mostró queBCY12865se había consumido por completo, y se detectó un máximo principal con lam/zdeseada. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA) y se obtuvo elcompuesto 2(15,6 mg, 6,32 pmol, 45,19 % de rendimiento, 99,76 % de pureza) en forma de un sólido blanco. PM calculado: 2461,87,m/zobservada: 1231,5 ([M/2+H]+) y 821,3 ([M/3+H]+).
Procedimiento para la preparación de BCY13040
CuS04
VcNa
BCY00012865-PEG5-N3 BCY00008928THPTABCY00013040
t-Bu0H/H20
2
Primero se disolvieron elCompuesto 2(15,6 mg, 6,34 pmol, 1,0 eq) yBCY8928(14,5 mg, 6,54 pmol, 1.03 eq) en 2 ml de t-BuOH/H<2>O (1:1) y, a continuación, se añadieron CuSO<4>(0,4 M, 16 pl, 1,01 eq), VcNa (3,0 mg, 15,14 pmol, 2,39 eq) y THPTA (3 mg, 6,90 pmol, 1,09 eq). Por último, se añadió NH<4>HCO<3>1 M para ajustar el pH a 8. Todos los disolventes se desgasificaron y purgaron con N<2>3 veces. La mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante 16 hora en una atmósfera de N<2>. El análisis por LC-MS mostró que elCompuesto 2se había consumido por completo, y se detectó un máximo principal con lam/zdeseada. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA) y se obtuvo elBCY13040(15,8 mg, 3,31 pmol, rendimiento del 52,27 %, pureza del 98,1 %) en forma de un sólido blanco. PM calculado: 4679,45,m/zobservada: 1560,8 ([M/3+H]<+>), 1170,9 ([M/4+H]<+>), 936,6 ([M/5+H]<+>).
Ejemplo 12: Síntesis de BCY13253
1 2 3
Se disolvió una mezcla de BCY13119 (35,0 mg, 17,20 pmol, 1,0 eq.), compuesto 2 (7,8 mg, 18,06 pmol, 1,05 eq.) en MeCN/H<2>O (1:1, 1 ml) y, a continuación, se ajustó el pH de esta solución a 8 mediante la adición gota a gota de NaHCO<3>(0,1 M). La mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 1 h. La LC-MS mostró la detección de un pico principal con lam/zdeseada (PM: 2352,74,m/zobservada: 1177,4 ([(M/2+H<+>])). La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para eliminar el disolvente y se obtuvo un residuo. A continuación, el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condiciones neutras). Se obtuvo BCY13119-PEG5-N<3>(25,7 mg, 9,97 pmol, rendimiento del 58,0 %, pureza del 91,3 %) se obtuvo en forma de un sólido blanco.
Procedimiento para la preparación de BCY13253
CuS04 VcNa THPTA
BCY00013119-PEG5-N3 BCY00008928 --------------------------------► BCY00013253
Se disolvió una mezcla del compuesto3(25,7 mg, 10,92 jmol, 1,0 eq.), compuesto2(26,6 mg, 12,02 jmol, 1,1 eq.), y THPTA (5,7 mg, 13,11 |jmol, 1,2 eq.) en t-BuOH/H<2>O (1:1, 1 ml, previamente desgasificado y purgado con N<2>durante 3 veces) y, a continuación, se añadieron CuSO<4>(0,4 M, 33,0 j l , 1,2 eq.) y VcNa (5,2 mg, 26,21 jmol, 2,4 eq.) bajo N<2>. El pH de esta solución se ajustó a 8 mediante la adición gota a gota de NH<4>HCO<3>0,2 M (en 1:1 de t-BuOH/H<2>O), y la solución se volvió de color amarillo claro. La mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 2 hora en una atmósfera de N<2>. La LC-MS mostró que el compuesto3se había consumido completamente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 4570,32,m/zobservada: 1143,4 ([M/4+H]<+>), 914,9 ([M/5+H]<+>)). La mezcla de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para dar un residuo. El producto en bruto se purificó mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA) y se obtuvoBCY13253(17,5 mg, 3,67 jmol, 33,58%de rendimiento, 95,8%de pureza) en forma de un sólido de color blanco.
Ejemplo 13: Síntesis de BCY13254
Se disolvió una mezcla deBCY13120(40,0 mg, 17,92 jmol, 1,0 eq.), compuesto2(8,5 mg, 19,72 jmol, 1,1 eq.) en MeCN/H2O (1:1, 1 ml) y, a continuación, se ajustó el pH de esta solución a 8 mediante la adición gota a gota de NaHCO3 (0,1 M). La mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 1 h. La LC-MS mostró queBCY13120se había consumido completamente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM: 2548,99,m/zobservada: 1275,3 ([(M/2+H+])). La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para eliminar el disolvente y se obtuvo un residuo. A continuación, el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condiciones neutras). Se obtuvoBCY13120-PEG5-N3 (27,3 mg, 10,46 jmol, rendimiento del 58,38 %, pureza del 97,7 %) se obtuvo en forma de un sólido blanco.
Procedimiento para la preparación de BCY13254
Se disolvió una mezcla del compuesto 3 (27,3 mg, 10,71 jmol, 1,0 eq.), compuesto2(26,1 mg, 11,78 jmol, 1,1 eq.), y THPTA (5,6 mg, 12,85 |jmol, 1,2 eq.) en t-BuOH/H<2>O (1:1, 1 ml, previamente desgasificado y purgado con N<2>durante 3 veces) y se añadieron CuSO<4>(0,4 M, 33,0 jl, 1,2 eq.) y VcNa (5,2 mg, 26,24 jmol, 2,4 eq.) bajo N<2>. El pH de esta solución se ajustó a 8 mediante la adición gota a gota de NH<4>HCO<3>0,2 M (en 1:1 de t-BuOH/H<2>O), y la solución se volvió de color amarillo claro. La mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 2 hora en una atmósfera de N<2>. La LC-MS mostró que el compuesto3se había consumido completamente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 4766,58,m/zobservada: 1192,5 ([M/4+H]<+>), 954,1 ([M/5+H]<+>)). La mezcla de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para dar un residuo. El producto en bruto se purificó mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA) y se obtuvoBCY13254(36,5 mg, 7,49 jmol, 69,92 % de rendimiento, 97,8 % de pureza) en forma de un sólido de color blanco.
Ejemplo 14: Síntesis de BCY13340
A«0 m dtoM * *551.»
Procedimiento para la preparación de BCY12865-PEG5-N3
BCY00012865 NHS-PEG5-N3 NaHC° 3— ► BCY00012865-PEG5-N3
MeCN H20
1 2
Se disolvieronBCY12865(50 mg, 23,32 jmol, 1,0 eq) ycompuesto1 (10,5 mg, 24,28 jmol, 1,04 eq) en 2 ml de MeCN/H2O (1:1), Se añadió NaHCO31 M para ajustar el pH a 8. Y se agitó la mezcla a 25 °C durante 2 h. La LC-MS mostró que BCY12865 se había consumido completamente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 2461.87,m/zobservada: 1231,6 ([M/2+H]+) y 821,4 ([M/3+H]+)). La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA) y se obtuvo elcompuesto 2(31,5 mg, 12,62 jmol, 54,14 % de rendimiento, 98,66 % de pureza) en forma de un sólido blanco.
Procedimiento para la preparación de BCY13340
Se disolvió una mezcla del compuesto2(31,5 mg, 12,80 ^mol, 1,0 eq.), BCY12353 (27 mg, 12,92 ^mol, 1,0 eq.) y THPTA (5,7 mg, 13,12 ^mol, 1,0 eq.) en t-BuOH/H<2>O (1:1, 2 ml, previamente desgasificado y purgado con N<2>durante 3 veces) y, a continuación, se añadieron CuSO<4>(0,4 M, 32 ^l, 1,0 eq.) y VcNa (5,1 mg, 25,74 ^mol, 2,0 eq.) bajo N<2>. El pH de esta solución se ajustó a 8 mediante la adición gota a gota de NH<4>HCO<3>0,2 M (en 1:1 de t-BuOH/H<2>O), y la solución se volvió de color amarillo claro. La mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante 1 hora en una atmósfera de N<2>. La LC-MS mostró que el compuesto2se había consumido por completo y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 4551,32,m/zobservada: 1517,7 ([M/3+H]<+>) y 1138,6 ([M/4+H]<+>)). La mezcla de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para dar un residuo. El producto en bruto se purificó mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA) y se obtuvoBCY13340(34,7 mg, 7,62 ^mol, 59,59 % de rendimiento, 89,59 % de pureza) en forma de un sólido de color blanco.
Ejemplo 15: Síntesis de BCY13342
Procedimiento para la preparación de BCY12860-PEG5-N3
NaHCO-í
BCY00012860 N3-PEG5-NHS --------------- 5--------► BCY00012860-PEG5-N3
MeCN/H20(1:1)
1 2 3
Se disolvió una mezcla deBCY12860(28,0 mg, 13,58 ^mol, 1,0 eq.) ycompuesto2 (6,5 mg, 14,94 ^mol, 1,1 eq.) en MeCN/H<2>O (1:1, 1 ml) y, a continuación, se ajustó el pH de esta solución a 8 mediante la adición gota a gota de NaHCO<3>(0,1 M). La mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 1 h. La LC-MS mostró queBCY12860se había consumido completamente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM: 2378,78,m/zobservada: 1190,2 ([(M/2+H<+>])). La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para eliminar el disolvente y se obtuvo un residuo. A continuación, el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (condiciones neutras).BCY12860-PEG5-N<3>(20,7 mg, 8,41 ^mol, rendimiento del 61,95 %, pureza del 96,7 %) se obtuvo en forma de un sólido blanco.
Procedimiento para la preparación de BCY13342
Se disolvió una mezcla del compuesto 3 (20,7 mg, 8,70 |jmol, 1,0 eq.), compuesto4(19,0 mg, 9,14 |jmol, 1,05 eq.), y THPTA (5,0 mg, 11,31 jmol, 1,3 eq.) en t-BuOH/H<2>O (1:1, 1 ml, previamente desgasificado y purgado con N<2>durante 3 veces) y, a continuación, se añadieron CuSO4 (0,4 M, 28,3 jl, 1,3 eq.) y VcNa (4,5 mg, 22,62 jmol, 2,6 eq.) bajo N<2>. El pH de esta solución se ajustó a 8 mediante la adición gota a gota de NH<4>HCO<3>0,2 M (en 1:1 de t-BuOH/H<2>O), y la solución se volvió de color amarillo claro. La mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 2 hora en una atmósfera de N<2>. La LC-MS mostró que el compuesto3se había consumido completamente y se detectó un pico principal con lam/zdeseada (PM calculado: 4468,24,m/zobservada: 1118,6 ([M/4+H]<+>)). La mezcla de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para dar un residuo. El producto en bruto se purificó mediante HPLC preparativa (en condiciones de TFA) y se obtuvoBCY13342(21,7 mg, 4,60 jmol, 52,85 % de rendimiento, 94,7 % de pureza) en forma de un sólido de color blanco.
DATOS ANALÍTICOS
Los siguientes complejos peptídicos bicíclicos en heterotándem se analizaron mediante espectrometría de masas y HPLC. La configuración de la HPLC fue la siguiente:
Fase móvil: A: 0,1 % de TFA en H<2>O; B: 0,1 % de TFA en ACN
Flujo: 1,0 ml/min
Columna: Gemini-NX C185 um 110A 150*4,6 mm
Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE(1-614)
Los gradientes utilizados se describen en la tabla siguiente:
y los datos se generaron de la siguiente manera:
continuación
continuación
continuación
DATOS BIOLOGICOS
1. Cocultivo con células tumorales para el ensayo con marcador de CD137
El medio de cultivo, denominados medios R1, se prepara añadiendo un 1 % de FBS a RPMI-1640 (componente del kit CS196005 de Promega). Se preparan diluciones en serie de los artículos de ensayo en R1 en una placa estéril de 96 pocillos. Se añaden 25 pl por pocillo de artículos de prueba o R1 (como control de fondo) a los pocillos designados en una placa de cultivo de células blancas. Las células tumorales* se recogen y se resuspenden a una concentración de 400.000 células/ml en medio R1. Se añaden veinticinco (25) pl/pocillo de células tumorales a la placa de cultivo de células blancas. Las células Jurkat (kit Promega CS196005, 0,5 ml) se descongelan al baño maría y, a continuación, se añaden a 5 ml de medio R1 precalentado. A continuación, se añaden veinticinco (25) pl/pocillo de células Jurkat a la placa de cultivo de células blancas. Se incuban las células y los artículos de ensayo durante 6 h a 37 °C, CO2 al 5 %. Tras finalizar las 6 h, se añaden 75 pl/pocillo de reactivo Bio-Glo™ (Promega) y se incuban durante 10 min antes de leer la luminiscencia en un lector de placas (Clariostar, BMG). Se calcula el factor de cambio en relación con las células solas (células Jurkat estirpe celular utilizada en cocultivo) y se representa en GraphPad Prism como log (agonista) frente a la respuesta para determinar la CE50 (nM) y el incremento relativo expresado como múltiplo sobre el fondo (Máx).
El tipo de célula tumoral utilizado en el cocultivo es NCI-H292, que ha demostrado expresar la Nectina-4. El tipo de célula tumoral utilizado en cocultivo para EphA2 es PC3. El tipo de célula tumoral utilizado en cocultivo para PD-L1 es RKO.
En la Tabla 1 se muestra un sumario del incremento relativo expresado como múltiplo por los péptidos en heterotándem de Nectina-4/CD137 en el ensayo de cocultivo con marcador de CD137 con células NCI-H292. Todos los compuestos se comparan con el control en placa BCY10000, que tiene una CE50 promedio de 1,1 ± 0,5 nM y una Emáx de 28 ± 11 veces sobre el fondo.
Tabla 1: Incremento relativo expresado como múltiplo inducido por complejos péptidos bicíclicos en heterotándem de Nectina-4/CD137 en un ensa o con marcador de CD137
continuación
En la Tabla 2 se muestra un sumario del incremento relativo expresado como múltiplo por los péptidos en heterotándem de EphA2/CD137 en el ensayo de cocultivo con marcador de CD137 con células PC3. Todos los compuestos se comparan con el control en placa BCY9173, que tiene una CE50 media de 0,54 nM y una Emáx de 42 veces sobre el fondo.
Tabla 2: Incremento relativo expresado como múltiplo inducido por complejos de péptidos bicíclicos en heterotándem E hA2/CD137 en un ensa o con marcador de CD137
En la Tabla 3 se muestra un sumario del incremento relativo expresado como múltiplo por los péptidos en heterotándem de PD-L1/CD137 en el ensayo de cocultivo con marcador de CD137 con células RKO.
Tabla 3: Incremento relativo expresado como múltiplo inducido por complejos de péptidos bicíclicos en heterotándem PD-L1/CD137 en un ensa o con marcador de CD137
2. Farmacocinética de complejos peptídicos bicíclicos en heterotándem CD137 en ratas SD
Se administraron a ratas SD macho 2 mg/kg de cada complejo de péptidos bicíclicos en heterotándem formulado en HCl de histidina 25 mM, 10 % de sacarosa a pH 7. Se realizaron sangrías en serie (aproximadamente 80 pl de sangre/muestreo) a través de la vena submadibular o safena en cada muestreo. Todas las muestras de sangre se transfirieron inmediatamente a tubos de microcentrífuga previamente refrigerados que contenían 2 pl de K2-EDTA (0,5 M) como anticoagulante y se colocaron sobre hielo húmedo. Las muestras de sangre se procesaron inmediatamente para obtener plasma mediante centrifugación a aproximadamente 4 °C, 3000 g. El precipitante, incluido el patrón interno, se añadió inmediatamente al plasma, se mezcló bien y se centrifugó a 12.000 rpm, a 4 °C durante 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a tubos de microcentrífuga de polipropileno preetiquetados y, a continuación, se congeló rápidamente sobre hielo seco. Las muestras se almacenaron a 70 °C o menos según fuera necesario hasta su análisis. Se inyectaron directamente 7,5 pl de las muestras sobrenadantes para el análisis de LC-MS/MS utilizando un Orbitrap Q Exactive en modo de iones positivos para determinar las concentraciones de biciclo. Los datos de concentración plasmática frente al tiempo se analizaron mediante enfoques no compartimentales utilizando el programa informático Phoenix WinNonlin 6.3. Se presentaron C0, Cl, Vdss, T1^ , AUC(0-último), AUC(0-inf), MRT(0-último), MRT(0-inf) y los gráficos de concentración plasmática frente al perfil temporal. Los parámetros farmacocinéticos del experimento se muestran en la Tabla 4:
Tabla 4: Parámetros farmacocinéticos en ratas SD

Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Un ligando peptídico que se une a la Nectina-4 presente en una célula cancerosa, que comprende un polipéptido que comprende al menos tres grupos reactivos, separados por al menos dos secuencias de bucle, y un armazón molecular que forma enlaces covalentes con los grupos reactivos del polipéptido de manera que se formen al menos dos bucles de polipéptido en el armazón molecular, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables;
caracterizado por quedicho polipéptido es un derivado modificado de CP[1Nal][dD]CM[HArg]DWSTP[HyP]WC; en donde uno o más residuos de cisteína se sustituyen por un grupo reactivo seleccionado entre ácido 3-mercaptopropiónico, cisteamina y penicilamina;
en donde 1Nal representa 1-naftilalanina, HArg representa homoarginina y HyP representa hidroxiprolina.
2. El ligando peptídico de la reivindicación 1, en donde el armazón molecular es 1,1',1"-(1,3,5-triazinano-1,3,5-triil)triprop-2-en-1-ona (TATA).
3. Un complejo peptídico, que comprende
(a) un primer ligando peptídico que se une a la Nectina-4 presente en una célula cancerosa; conjugado mediante un enlazador con
(b) un segundo péptido;
en donde el primer péptido comprende un polipéptido que comprende al menos tres grupos reactivos, separados por al menos dos secuencias de bucle, y un armazón molecular que forma enlaces covalentes con los grupos reactivos del polipéptido de manera que se formen al menos dos bucles de polipéptido en el armazón molecular, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables;caracterizado por quedicho polipéptido de dicho primer ligando peptídico es un derivado modificado de CP[1Nal][dD]CM[HArg]DWSTP[HyP]WC;
en donde uno o más residuos de cisteína se sustituyen por un grupo reactivo seleccionado entre ácido 3-mercaptopropiónico, cisteamina y penicilamina;
en donde 1Nal representa 1-naptilalanina, HArg representa homoarginina y HyP representa hidroxiprolina.
4. El complejo peptídico de la reivindicación 3, en donde el armazón molecular es 1,1',1"-(1,3,5-triazinano-1,3,5-triil)triprop-2-en-1-ona (TATA).
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