TWI825046B

TWI825046B - Epha2特用之雙環胜肽配位基

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Publication number: TWI825046B
Application number: TW107144453A
Authority: TW
Inventors: 劉宏陳; 飛利浦戶克斯利; 瑟薇亞帕分; 麗特斯考特恩凱特琳范
Original assignee: 英商拜西可泰克斯有限公司
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2018-12-11
Publication date: 2023-12-11
Also published as: KR102791088B1; WO2019122860A1; CN118909043A; FI3727461T3; HRP20220871T1; CN111787955B; DK3727460T3; PT3727461T; AU2018387417C9; BR112020012246A2; KR102890185B1; ES2987839T3; CA3086257A1; US11696956B2; JP7503689B2; RS67248B1; SG11202005494QA; SG11202005495UA; US11484602B2; JP2021506936A

Abstract

本發明係關於一種多肽，該多肽共價連接非芳香性分子支架，使二或多胜肽環於支架連接點彼此相對。特定而言，本發明揭示具有Eph受體酪胺酸激酶A2(EphA2)之高親和性之胜肽。本發明另包括藥物接合物，包括接合至一或多效應物和/或官能基之該胜肽、包括該胜肽配體和藥物接合物之醫藥組合物、以及該胜肽配體和藥物接合物用於預防、抑制、或治療罹病組織(如腫瘤)過度表現EphA2之疾病或病症。

Description

EPHA2特用之雙環胜肽配位基

環肽可具有高親和性結合力，並特異地結合標的蛋白，因此於醫療發展上為具吸引力的分子類別。事實上數種環肽已成功用於臨床，例如抗菌胜肽萬古黴素、免疫抑制藥物環孢素、或抗癌藥物體抑素胜肽(Driggers et al.(2008),Nat Rev Drug Discov 7(7),608-24)。其良好結合特性係源自形成於胜肽和標的之間相對大的交互作用面以及降低構形可撓性。大環通常結合至數百平方埃(angstrom)之表面，例如環肽CXCR4拮抗劑CVX15(400Å²；Wu et al.(2007),Science 330,1066-71)、具有Arg-Gly-Asp模體之環肽結合至αVb3(355Å²)(Xiong et al.(2002),Science 296(5565),151-5)、或環肽抑制劑upain-1結合至尿激酶型血漿蛋白原活化因子(603Å²；Zhao et al.(2007),J Struct Biol 160(1),1-10)。

由於其環狀結構，大環胜肽相較於線狀胜肽具有較低可撓性，導致結合至標的時熵降低較小，並造成較高親和力之結合。降低可撓性亦導致鎖定標的特異性結構，相較於可增加結合特異性。前述功效可以基質金屬蛋白酶8(MMP8)之有效和選擇性抑制劑為例，若環狀結構被打開，其喪失對於其他MMP之選擇性(Cherney et al.(1998),J Med Chem 41(11),1749-51)。藉由大環化所達成之較佳結合特性於多環胜肽中更加顯著，其具有多於一之環肽，例如萬古黴素、乳酸鏈球菌素、和放線菌素。

多個研究團隊先前已將具有半胱胺酸殘基之多肽連接至合成分子結構(Kemp and McNamara(1985),J.Org.Chem；Timmerman et al.(2005),ChemBioChem)。Meloen及其同事使用參(溴甲基)苯以及相關分子用於多肽環之快速大量環化形成仿似蛋白表面結構之合成架構(Timmerman et al.(2005),ChemBioChem)。製造候選藥物化合物之方法，其中該化合物藉由連接具有多肽之半胱胺酸以及分子架構產生，例如TATA(1,1',1"-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮，Heinis et al.Angew Chem,Int Ed.2014；53：1602-1606)。

基於噬菌體顯示之組合方法已發展用於生產和篩選大量標靶目標的雙環胜肽庫(Heinis et al.(2009),Nat Chem Biol 5(7),502-7 and WO 2009/098450)。簡而言之，包括三半胱胺酸殘基以及二區域之6隨機胺基酸(Cys-(Xaa)₆-Cys-(Xaa)₆-Cys)的線狀胜肽的組合庫展示於噬菌體上，並藉由共價鍵連接半胱胺酸側鏈和小分子架構而環化。

本發明之第一實施態樣提供一種EphA2特用之胜肽配體，包括：一多肽，包括至少三半胱胺酸殘基，以至少二環狀序列分離；以及一非芳香性分子支架，與該多肽之半胱胺酸殘基形成共價鍵，使該至少二多肽環形成於該分子支架上；其中該胜肽配體包括胺基酸序列：C_i(HyP)LVNPLC_iiLHP(D-Asp)W(HArg)C_iii(SEQ ID NO：1)；其中HyP係羥補胺酸，HArg係高精胺酸，以及C_i、C_ii、和C_iii分別表示第一、第二、和第三半胱胺酸殘基，或其藥學上可接受之鹽類。

本發明另一實施態樣提供一種藥物接合物，包括接合至一或多效應物和/或官能基之本說明書定義之胜肽配體。

本發明另一實施態樣提供一種醫藥組合物，包括本說明書定義之胜肽配體或藥物接合物以及一或多藥學上可接受之賦形劑。

本發明另一實施態樣提供一種本說明書定義之胜肽配體或藥物接合物用於預防、抑制、或治療罹病組織(如腫瘤)過度表現EphA2之疾病或病症。

圖1 製備雙環藥物接合物(BDC)之概念之一般架構。

圖2 HT1080異體移植小鼠給予BCY6136之平均腫瘤體積對應時間圖。於第0和7日給予不同劑量(2、3、和5毫克/公斤(mg/kg))。

圖3 NCI-H1975異體移植小鼠給予BCY6136之平均腫瘤體積對應時間圖。於第0、7、14、21、28、和35日給予不同劑量(1、2、和3mg/kg)。

圖4 MDA-MB-231異體移植小鼠給予BCY6136之平均腫瘤體積對應時間圖。於第0、7、14、21、28、35、和45日給予不同劑量(1、2、和3mg/kg)。

圖5和圖6 給予具有PC-3異體移植之BALB/c母裸鼠BCY6136(圖5)和ADC(圖6)後體重改變和腫瘤體積紀錄。數據點表示群組平均體重。

圖7 給予具有PC-3異體移植之BALB/c公裸鼠BCY6136、EphA2-ADC、或歐洲紫杉醇(Docetaxel)後體重改變和腫瘤體積紀錄。數據點表示群組平均體重。

圖8 給予具有NCI-H1975異體移植之BALB/c母裸鼠BCY6136後體重改變和腫瘤體積紀錄。數據點表示群組平均體重。

圖9和圖10 給予具有LU-01-0251異體移植之BALB/c母裸鼠BCY6136和ADC後體重改變和腫瘤體積紀錄。數據點表示群組平均體重。

圖11 給予具有LU-01-0046異體移植之BALB/c母裸鼠BCY6136後體重改變和腫瘤體積紀錄。數據點表示群組平均體重。

圖12 給予具有LU-01-0046 NSCLC PDX模式異體移植之BALB/c母裸鼠BCY6136或ADC後體重改變和腫瘤體積紀錄。數據點表示群組平均體重。

圖13至圖15 給予具有LU-01-0046異體移植之BALB/c母裸鼠BCY6136(圖13)、BCY6173(圖14)、和BCY6175(圖15)後體重改變和腫瘤體積紀錄。數據點表示群組平均體重。

圖16 給予具有LU-01-00412異體移植之BALB/c母裸鼠BCY6136(圖16中以BT5528表示)、BCY8245、或BCY8781後體重改變和腫瘤體積紀錄。數據點表示群組平均腫瘤體積(左)和平均體重(右)。

圖17 給予具有LU-01-0486異體移植之BALB/c母裸鼠BCY6136後體重改變和腫瘤體積紀錄。數據點表示群組平均體重。

圖18 給予具有MDA-MB-231-luc異體移植之BALB/c母裸鼠BCY6136後體重改變和腫瘤體積紀錄。數據點表示群組平均體重。

圖19 給予具有同源EMT-6異體移植之BALB/c母裸鼠BCY6136後體重改變和腫瘤體積紀錄。數據點表示群組平均體重。第3組和第4組織劑量自第14日改變為5毫克/公斤(milligrams per kilogram，mpk)和3mpk。

圖20 給予具有NCI-N87異體移植之BALB/c母裸鼠BCY6136後體重改變和腫瘤體積紀錄。數據點表示群組平均體重。

圖21 給予具有SK-OV-3異體移植之BALB/c母裸鼠BCY6136後體重改變和腫瘤體積紀錄。數據點表示群組平均體重。

圖22 給予具有OE21異體移植之BALB/c母裸鼠BCY6136後體重改變和腫瘤體積紀錄。數據點表示群組平均體重。

圖23 給予具有MOLP-8異體移植之CB17-SCID母鼠BCY6136後體重改變和腫瘤體積紀錄。數據點表示群組平均體重。

圖24至圖29 給予具有HT1080異體移植之BALB/c母鼠BCY6173(圖24)、BCY6135(圖25)、BCY6136(圖26)、BCY6174(圖27)、BCY6175(圖28)、和ADC(圖29)後體重改變和腫瘤體積紀錄。數據點表示群組平均體重。

上述圖式均包括誤差槓，代表平均標準差(SEM)。

於一實施例，該胜肽配體包括胺基酸序列：(β-Ala)-Sar₁₀-A(HArg)D-C_i(HyP)LVNPLC_iiLHP(D-Asp)W(HArg)C_iii(SEQ ID NO：2)(BCY6099)；其中Sar係肌胺酸，HArg係高精胺酸，以及HyP係羥補胺酸。

於一實施例，該分子支架係1,1',1"-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(1,1',1"-(1,3,5-triazinane-1,3,5-triyl)triprop-2-en-1-one，TATA)。

於另一實施例，該分子支架係1,1',1"-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)以及該胜肽配體包括胺基酸序列：(β-Ala)-Sar₁₀-A(HArg)D-C_i(HyP)LVNPLC_iiLHP(D-Asp)W(HArg)C_iii(SEQ ID NO：2)(BCY6099)；以及其中Sar係肌胺酸，HArg係高精胺酸，以及HyP係羥補胺酸。

除非另有定義，本說明書全部技術和科學用語具有習知技術者通常所理解之意義，例如於胜肽化學、細胞培養、噬菌體顯示、核酸化學及生物化學等領域。分子生物學、遺傳學、和生物化學方法則使用標準技術(Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,3rd ed.,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology(1999)4^th ed.,John Wiley & Sons,Inc.)，包含於說明書作為參照。

命名

編號

指稱本發明之胜肽之胺基酸殘基時，由於半胱胺酸殘基(C_i、C_ii、和C_iii)並無不同故將其編號省略，因此指稱本發明之胜肽中的胺基酸殘基之編號如下：-C_i-HyP₁-L₂-V₃-N₄-P₅-L₆-C_ii-L₇-H₈-P₉-(D-Asp)₁₀-W₁₁-(HArg)₁₂-C_iii-(SEQ ID NO：1)。

為說明起見，假定全部雙環胜肽均藉由1,1',1"-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)環化，獲得具有三取代之1,1',1"-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-1-酮的結構。由TATA形成的環化發生於C_i、C_ii、和C_iii。

分子格式

延伸至雙環核心序列之N或C端增加至該序列之左側或右側，以連號區隔。例如，N端之(β-Ala)-Sar₁₀-Ala尾將指稱為：(β-Ala)-Sar₁₀-A-(SEQ ID NO：X)。

反胜肽序列

由於Nair et al(2003)J Immunol 170(3)),1362-1373的揭露，可知本說明書之胜肽序列於反逆(retro-inverso)形式亦有功能。例如，序列反轉(即，N端變為C端，以此類推)，其立體化學亦如是反轉(即，D型胺基酸變為L型胺基酸，以此類推)。

胜肽配體

本說明書所述之胜肽配體指涉胜肽、胜肽類(peptidic)、或擬肽(peptidomimetic)，共價鍵結分子支架。該些胜肽、胜肽類、或擬肽包括具有自然或非自然胺基酸之胜肽，二或多反應基團(即，半胱胺酸殘基)可與該支架形成共價鍵，由於在胜肽、胜肽類、或擬肽連結該支架時形成一環，一序列於該些基團之間彼此相對，稱之為環狀序列。於本發明，該些胜肽、胜肽類、或擬肽包括至少三半胱胺酸殘基(本說明書稱之為C_i、C_ii、和C_iii)，並於該支架上形成至少二環。

胜肽配體之優勢

本發明之雙環胜肽具有多項優勢，可使其作為類似藥物分子，用於注射、吸入、鼻腔、眼、口、或外部給藥。該些優勢包括：-物種交叉反應：臨床前之藥物動力學和藥效學評估之一般需求；-蛋白酶穩定性：雙環胜肽配體於多數情況下對於血漿蛋白酶、上皮(膜錨定(membrane-anchored))蛋白酶、胃和腸道蛋白酶、肺表面蛋白酶、胞內蛋白酶等具有穩定性。蛋白酶穩定性可於不同物種之間維持，使雙環胜肽候選物可於動物模式中發展，亦信賴將其給予人類；-預期之可溶性：帶電和親水性相對於疏水和分子內/分子間氫鍵，對於調劑和吸收具有重要性；-於循環中具有適當的血漿半衰期：依據臨床用途和治療療程，可能須發展具有短或長之體內暴露時間的雙環胜肽，用於慢性或急性疾病型態之治療。適當暴露時間將藉由延長暴露(達成最大療效)相對於短暴露時間(最小化由於持續暴露藥物所引發的毒性)而管理；-選擇性：本發明之胜肽配體對於其他Eph受體酪胺酸激酶具有良好選擇性，例如EphA1、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphB1、XIIA因子、碳酸酐酶9、和CD38(本發明之胜肽配體的選擇性數據可見於表11和12)。另應注意，經選擇的本發明之胜肽配體可與其他物種(例如小鼠或大鼠) 展現交叉反應，使藥物試驗可於模式動物中進行(表3、7-8、10、和12)；以及-安全性：有報導指出EphA2抗體藥物接合物於臨床前體內模型和臨床試驗造成出血。例如，6名患者其中5人在第1期之MEDI-547的公開標記研究(open-label study)由於出血和凝血反應而中止(Annunziata et al,Invest New Drugs(2013)31：77-84)。觀察患者之出血與臨床前試驗於大鼠和猴子中觀察的凝血系統反應一致：增加活化部分凝血酶時間以及增加纖維蛋白原/血纖維蛋白降解產物(Annunziata et al IBID)。猴子的毒性試驗中報導明顯出血(Annunziata et al,IBID)。綜合上述結果，MEDI-547造成臨床前物種和患者的散播性血管內凝血(DIC)。該些報導中的BDC具有體內短半衰期(<30分鐘)，並且較不可能造成患者的DIC。本發明揭示的結果(第5和6部分的生物數據和表15)顯示經選擇的本發明之雙環藥物接合物對於凝血參數並不具有影響且不造成臨床前試驗的出血。

藥學上可接受之鹽類

習知技術者可知，本發明之範圍包含鹽類形式，指稱胜肽配體時包括該配體之鹽類。

本發明之鹽類可自包含鹼或酸部分之母化合物合成，藉由傳統化學方法，如Pharmaceutical Salts：Properties,Selection,and Use,P.Heinrich Stahl(Editor),Camille G.Wermuth(Editor),ISBN：3-90639-026-8,Hardcover,388 pages,August 2002所揭示。一般而言，該些鹽類可藉由將該些化合物之游離酸或鹼與適當的鹼或酸，於水或有機溶劑或二者混合中反應而得。

酸加成鹽(單或二鹽)可由多種酸所形成，無機或有機均可。酸加成鹽類的例子包括與一選自下列酸所構成群組之酸形成之鹽類，該群組係由乙酸(acetic)、2,2-二氯乙酸(2,2-dichloroacetic)、己二酸(adipic)、藻酸(alginic)、抗壞血酸(ascorbic)(例如，L-抗壞血酸(L-ascorbic))、L-天冬氨酸(L-aspartic)、苯磺酸(benzenesulphonic)、苯甲酸(benzoic)、4-乙醯氨基(4-acetamidobenzoic)、丁酸(butanoic)、(+)樟腦酸((+)camphoric)、樟腦磺酸(camphor-sulphonic)、(+)-(1S)-樟腦-10-磺酸((+)-(1S)-camphor-10-sulphonic)、癸酸(capric)、己酸(caproic)、辛酸(caprylic)、肉桂酸(cinnamic)、檸檬酸(citric)、環己烷氨基磺酸(cyclamic)、十二烷基硫酸(dodecylsulphuric)、乙烷-1,2-二磺酸(ethane-1,2-disulphonic)、乙磺酸(ethanesulphonic)、2-羥基乙磺酸(2-hydroxyethanesulphonic)、甲酸(formic)、富馬酸(fumaric)、半乳糖二酸(galactaric)、龍膽酸(gentisic)、葡庚糖酸(glucoheptonic)、D-葡糖酸(D-gluconic)、葡糖醛酸(glucuronic)(例如，D-葡糖醛酸(D-glucuronic))、谷氨酸(glutamic)(例如，L-谷氨酸(L-glutamic))、α-酮戊二酸(α-oxoglutaric)、乙醇酸(glycolic)、馬尿酸(hippuric)、氫鹵酸(例如，氫溴酸(hydrobromic)、鹽酸、氫碘酸(hydriodic))、羥乙磺酸(isethionic)、乳酸(lactic)(例如(+)-L-乳酸((+)-L-lactic)、(±)-DL-乳酸((±)-DL-lactic))、乳糖酸(lactobionic)、馬來酸(maleic)、蘋果酸(malic)、(-)-L-蘋果酸((-)-L-malic)、丙二酸(malonic)、(±)-DL-扁桃酸((±)-DL-mandelic)、甲磺酸(methanesulphonic)、萘-2-磺酸(naphthalene-2-sulphonic))、萘-1,5-二磺酸(naphthalene-1,5-disulphonic)、1-羥基-2-萘酸(1-hydroxy-2-naphthoic)、菸鹼酸(nicotinic)、硝酸(nitric)、油酸(oleic)、乳清酸(orotic)、草酸(oxalic)、棕櫚酸(palmitic)、雙羥萘酸(pamoic)、磷酸(phosphoric)、丙酸(propionic)、丙酮酸(pyruvic)、L-焦谷氨酸(L-pyroglutamic)、水楊酸(salicylic)、4-氨基水楊酸 (4-amino-salicylic)、癸二酸(sebacic)、硬脂酸(stearic)、琥珀酸(succinic)、硫酸(sulphuric)、單寧酸(tannic)、(+)-L-酒石酸((+)-L-tartaric)、硫氰酸(thiocyanic)、對甲苯磺酸(p-toluenesulphonic)、十一碳烯酸(undecylenic)和戊酸(valeric)，以及丙烯酸化胺基酸及陽離子交換樹脂。

特定鹽類群組由乙酸、鹽酸、氫碘酸(hydriodic)、磷酸(phosphoric)、硝酸(nitric)、硫酸(sulphuric)、檸檬酸(citric)、乳酸(lactic)、琥珀酸(succinic)、馬來酸(maleic)、蘋果酸(malic)、羥乙磺酸(isethionic)、富馬酸(fumaric)、苯磺酸(benzenesulphonic)、甲苯磺酸(toluenesulphonic)、硫酸、甲磺酸(methanesulphonic)(甲磺酸酯(mesylate))、乙磺酸(ethanesulphonic)、萘磺酸(naphthalenesulphonic)、戊酸(valeric)、丙酸(propanoic)、丁酸(butanoic)、丙二酸(malonic)、葡糖醛酸(glucuronic)和乳糖(lactobionic)之鹽類所組成。一特定鹽係鹽酸鹽。另一特定鹽係乙酸鹽。

若化合物為陰離子或具有陰離子官能基(例如-COOH可為-COO^-)，一有機或無機鹼可形成鹽類，產生一適當陽離子。適當無機陽離子之例示包括但不限於：鹼金屬離子，如Li⁺、Na⁺、和K⁺，鹼土金屬離子，如Ca²⁺和Mg²⁺，和其他陽離子，如Al³⁺或Zn⁺。適當有機陽離子之例示包括但不限於：胺離子(即NH₄ ⁺)和具取代基之胺離子(例如NH₃R⁺、NH₂R₂ ⁺、NHR₃ ⁺、NR₄ ⁺)。適當具取代基之胺離子之例示係源自：甲胺(methylamine)、乙胺(ethylamine)、二乙胺(diethylamine)、丙胺(propylamine)、二環己基胺(dicyclohexylamine)、三乙胺(triethylamine)、丁胺(butylamine)、乙二胺(ethylenediamine)、乙醇胺(ethanolamine)、二乙醇胺(diethanolamine)、哌嗪(piperazine)、芐胺(benzylamine)、苯基芐胺(phenylbenzylamine)、膽鹼(choline)、葡甲胺(meglumine)、氨基丁三醇 (tromethamine)、以及氨基酸，如離胺酸(lysine)和精胺酸(arginine)。習知四級銨離子之例示為N(CH₃)₄ ⁺。

若本發明之胜肽包括一胺官能基，可形成四級銨鹽，例如與一烷化劑藉由習知技術者所知的方法而反應。該些四級銨化合物包含於本發明之胜肽之範圍內。

同位素變體

本發明包括本發明之全部藥學上可接受之(放射)同位素標定胜肽配體，其中一或多原子由具有相同原子序、但不同於自然出現的原子量或質量數之原子取代，以及本發明之胜肽配體，其中連接金屬螯合物(即效應物)，可保有相關(放射)同位素，以及本發明之胜肽配體，其中特定官能基為相關(放射)同位素或同位素標定官能基藉由共價鍵取代。

可適當包含於本發明之胜肽配體之同位素的例示包括氫，例如²H(D)和³H(T)；碳，例如¹¹C、¹³C、和¹⁴C；氯，例如³⁶Cl；氟，例如¹⁸F；碘，例如¹²³I、¹²⁵I、和¹³¹I；氮，例如¹³N和¹⁵N；氧，例如¹⁵O、¹⁷O、和¹⁸O；磷，例如³²P；硫，例如³⁵S；銅，例如⁶⁴Cu；鎵，例如⁶⁷Ga或⁶⁸Ga；釔，例如⁹⁰Y；以及鎦，例如¹⁷⁷Lu；以及鉍，例如²¹³Bi。

本發明之特定同位素標定胜肽配體，例如具有放射同位素，可用於藥物和/或組織基質分布研究，並用於臨床評估罹病組織存在/不存在EphA2標的。本發明之胜肽配體另可用於診斷用途，其可用於偵測或辨認標定分子和其他分子、胜肽、蛋白質、酵素、或受體所形成的複合物。偵測或辨認之方法可使用具有標記之化合物，例如放射同位素、酵素、螢光物、發光物(例如發光醇(luminol)、發光醇衍生物、發光素(luciferin)、水母蛋白(aequorin)及螢光酵素 (luciferase))等。由於可簡單地包含以及容易用於偵測手段，放射同位素氚，即³H(T)，以及碳-14，即¹⁴C，特別可用於上述用途。

由於較佳的代謝穩定性，較重同位素之取代，例如刀，即²H(D)，可具有治療上的優勢，例如增加體內半衰期或降低需求劑量，因此較佳地可用於某些情況。

正子發射同位素之取代，例如¹¹C、¹⁸F、¹⁵O、和¹³N，可用於正子發射斷層掃描(PET)，檢查標的所佔體積。

本發明之同位素標定胜肽配體一般可以習知技術者所知的傳統方法製備，或藉由與實施例相似之製程，使用適當同位素標定反應物取代先前所使用之無標定反應物。

非芳香性分子支架

本說明書用語「非芳香性分子支架」指涉任何本說明書定義之分子支架，其不包含芳香(即非飽和)碳環或雜環系統。

非芳香性分子支架之適當例示揭露於Heinis et al(2014)Angewandte Chemie,International Edition 53(6)1602-1606。

如上述文件所述，該分子支架可為小分子，例如有機小分子。

於一實施例，該分子支架可為大分子。於一實施例，該分子支架可為胺基酸、核苷酸、或碳水化合物組成之大分子。

於一實施例，該分子支架包括可與多肽之官能基反應之反應基團，以形成共價鍵。

該分子支架可包括與胜肽形成連結之化學基團，例如胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯、炔、三氮化物(azides)、酸酐、琥珀醯亞胺(succinimides)、順丁烯二醯亞胺(maleimides)、烷基鹵化物、和醯基鹵化物。

包含α-不飽和羰基之化合物之例示為1,1',1"-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)(Angewandte Chemie,International Edition(2014),53(6),1602-1606)。

效應物和官能基

本發明另一實施態樣提供一藥物接合物，包括本說明書定義之胜肽配體接合至一或多效應物和/或官能基。

效應物和/或官能基可連接，例如，多肽之N端和/或C端、多肽中的胺基酸、或分子支架。

適當效應物基團包括抗體和其部分或片段。例如，效應物基團可包括抗體輕鏈恆定區(CL)、抗體CH1重鏈域、抗體CH2重鏈域、抗體CH3重鏈域、或其任意組合，以及一或多恆定區域。效應物基團亦可包括抗體鉸鍊區(hinge region)(該區通常位於IgG分子的CH1CH2域之間)。

於本發明實施態樣另一實施例，本發明之效應物基團為IgG分子的Fc區。較佳地，本發明之胜肽配體-效應物基團包括具有至少1日、至少2日、至少3日、至少4日、至少5日、至少6日、或至少7日之tβ半衰期之胜肽配體Fc融合，或由其組成。更佳地，本發明之胜肽配體包括具有至少1日之tβ半衰期之胜肽配體Fc融合，或由其組成。

一般而言，官能基團包括結合基團、藥物、接合其他單元之反應基團、協助細胞吸收大環胜肽之官能基團、或其近似。

胜肽透入細胞之能力可使胜肽有效地拮抗胞內標的。胜肽可穿透細胞抵達之標的包括轉錄因子、胞內訊息分子例如酪胺酸激酶、以及參與細胞凋亡路徑之分子。可穿透細胞之官能基團包括胜肽或連接胜肽或分子支架之化學基團。前述胜肽例如源自VP22、HIV-Tat、果蠅(Antennapedia)同源框(homeobox)蛋白，例如Chen and Harrison,Biochemical Society Transactions(2007)Volume 35,part 4,p821；Gupta et al.in Advanced Drug Discovery Reviews(2004)Volume 57 9637所揭示。可有效地穿透細胞膜的短胜肽之例示包括源自果蠅觸角足蛋白(Drosophila Antennapedia protein)的16胺基酸穿透肽(penetratin)(Derossi et al(1994)J Biol.Chem.Volume 269 p10444)、18胺基酸「模式兩性(amphipathic)胜肽」(Oehlke et al(1998)Biochim Biophys Acts Volume 1414 p127)、和HIV之TAT蛋白之富含精氨酸區域。非胜肽之方法包括：使用小分子模擬物或SMOC，可輕易連接至生物分子(Okuyama et al(2007)Nature Methods Volume 4 p153)。其他連接胍基團至分子的化學方法亦促進細胞穿透(Elson-Scwab et al(2007)J Biol Chem Volume 282 p13585)。小分子量之分子，例如類固醇，可連接至分子支架，以促進細胞吸收。

可連接至胜肽配體之官能基團之一類包括抗體和其結合片段，例如Fab、Fv、或單域片段。特定而言，使用連接可增加胜肽配體之半衰期之蛋白質之抗體。

於一實施例，本發明之胜肽配體-效應物基團具有tβ半衰期選自至少12小時、至少24小時、至少2日、至少3日、至少4日、至少5日、至少6日、至少7日、至少8日、至少9日、至少10日、至少11日、至少12日、至少13日、至少14日、至少15日、或至少20日所構成之群組。較佳地，本發明之胜肽配體-效應物基團或組合物具有之tβ介於12至60小時。於另一實施例，tβ係至少1日。於另一實施例，tβ係介於12至26小時。

於本發明一特定實施例，該官能基團係選自金屬螯合物，適用於複合醫療相關金屬放射同位素。

可能之效應物基團另包括酵素，例如羧肽酶G2，用於酵素/前驅藥物治療，其中胜肽配體取代ADEPT中的抗體。

於本發明一特定實施例，該官能基團係選自要亦，例如癌症療法之胞殺劑。適當之例示包括：烷化劑如順鉑和卡鉑以及奧沙利鉑(oxaliplatin)、甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、異環磷醯胺(ifosfamide)；抗代謝劑，包括嘌呤相似物硫唑嘌呤(azathioprine)和巰基嘌呤或嘧啶相似物；植物鹼類或萜類，包括長春花鹼(vinca alkaloids)如如長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)、和長春地辛(vindesine)；鬼臼毒素及其衍生物依託泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)；紫杉烷(taxane)，包括紫杉醇(原名Taxol)；拓樸酶抑制劑，包括喜樹鹼(camptothecin)：愛萊諾迪肯(irinotecan)和托普樂肯(Topotecan)，以及第二型抑制劑，包括安吖啶(amsacrine)、依託泊苷(etoposide)、依託泊苷磷酸鹽(etoposide phosphate)、和替尼泊苷(teniposide)。其他藥劑可包括：腫瘤抗生素，包括免疫抑制劑放線菌素(dactinomycin)(用於腎臟移植)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、博來黴素(bleomycin)、刺孢黴素(calicheamycin)、和其他。

於本發明另一特定實施例，胞殺劑係選自類美登素(Maytansinoids)(例如DM1)或單甲基奧里斯他汀(auristatin)(例如MMAE)。

DM1係一種胞殺劑，為包括硫之醇美登素(maytansine)衍生物並具有下列結構：

單甲基奧里斯他汀(Monomethyl auristatin E(MMAE))係一種合成抗腫瘤劑並具有下列結構：

於一實施例，該胞殺劑藉由一可裂解鍵結連接二環胜肽，例如雙硫鍵或蛋白酶易感鍵。於另一實施例，鄰接雙硫鍵之基團具有修飾，以控制雙硫鍵之阻礙，以及控制胞殺劑裂解和伴隨之釋放。

已有公開文獻建立修飾雙硫鍵的還原易感性的方法，係藉由將立體阻礙引入雙硫鍵任一側(Kellogg et al(2011)Bioconjugate Chemistry,22,717)。較大程度的立體阻礙可降低胞內麩胺基硫以及胞外(系統性)還原劑造成還原的速率，因此無論於胞內或胞外均可降低釋放毒素的容易度。因此，可藉由選擇適當程度的雙硫鍵任一側之阻礙，達成於循環中適當的雙硫鍵穩定性(最小化毒素的不必要副作用)以及胞內環境的釋放效率。

藉由將一或多甲基引入分子建構物之靶向物(此處為雙環胜肽)或毒素，可調整雙硫鍵任一側之阻礙。

於一實施例，該藥物接合物另包括一連接子，位於該胜肽配體和該胞殺劑之間。

於一實施例，該胞殺劑和連接子係選自WO 2016/067035所揭露之任意組合(其胞殺劑和連接子藉由引用涵蓋於本說明書)。

於一實施例，該胞殺劑係MMAE。

於一實施例，該雙環胜肽和該胞殺劑之間的連接子包括一或多胺基酸殘基。因此，於一實施例，該胞殺劑係MMAE以及該連接子係選自-Val-Cit-、-Trp-Cit-、-Val-Lys-、-D-Trp-Cit-、-Ala-Ala-Asn-、D-Ala-Phe-Lys-、或-Glu-Pro-Cit-Gly-hPhe-Tyr-Leu-(SEQ ID NO：3)。於另一實施例，該胞殺劑係MMAE以及該連接子係選自-Val-Cit-、-Trp-Cit-、-Val-Lys-、或-D-Trp-Cit-。於另一實施例，該胞殺劑係MMAE以及該連接子係-Val-Cit-或-Val-Lys-。於另一實施例，該胞殺劑係MMAE以及該連接子係-Val-Cit-。

於一替代實施例，該胞殺劑之間的連接子包括一雙硫鍵，例如可裂解雙硫鍵。因此，於另一實施例，該胞殺劑係DM1以及該連接子係選自-S-S-、 -SS(SO₃H)-、-SS-(Me)-、-(Me)-SS-(Me)-、-SS-(Me₂)-、或-SS-(Me)-SO₃H-。於另一實施例，該胞殺劑係MMAE以及該連接子包括-S-S-部分，例如(N-琥珀醯亞胺3-(2-吡啶基二硫基)丙酸(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate(SPDB))，或-SS(SO₃H)-部分，例如SO₃H-SPDB。於另一實施例，該胞殺劑係MMAE以及該連接子包括-S-S-部分，例如-S-S-或-S-S-(SO₃H)-。

於一實施例，該胞殺劑係DM1以及該藥物接合物包括式(A)化合物：

其中該雙環為BCY6099，如本說明書所定義。

於另一實施例，該胞殺劑係DM1以及該藥物接合物包括式(B)化合物：

其中該雙環係BCY6099，如本說明書所定義。

於另一實施例，該胞殺劑係DM1以及該藥物接合物包括式(A)化合物，其中該雙環為BCY6099，如本說明書所定義。於此，BDC為BCY6027。本說明書揭露的數據顯示，於EphA2競爭性結合實驗中，BCY6027具有優異的競爭性結合，如表4和表8所示。

於另一實施例，該胞殺劑係DM1以及該藥物接合物包括式(B)化合物，其中該雙環為BCY6099，如本說明書所定義。於此，BDC為BCY6028。本說明書揭露的數據顯示，於EphA2競爭性結合實驗中，BCY6028具有優異的競爭性結合，如表4和表8所示。

於另一實施例，該胞殺劑係MMAE或DM1，以及該藥物接合物係選自BCY6136和BCY6173。本說明書揭露的數據顯示，該二雙環藥物接合物對於下列蛋白不具有顯著結合：近人類同源物EphA1、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、和EphB4；小鼠EphA3和EphA4；和大鼠EphA3和EphB1，如表11和表12所示。

於另一實施例，該藥物接合物係選自BCY6135、BCY6136、BCY6173、BCY6174、和BCY6175其中任一者：

於另一實施例，該藥物接合物係BCY6136。本說明書實施例7和8揭示BCY6136對於PC-3前列腺癌異體移植模式具有顯著且有效之抗腫瘤活性，(圖5和6以及表16至19)。本說明書提供之數據揭示BCY6136對於NCI-H1975肺癌(NSCLC)異體移植模式具有有效之抗腫瘤活性(圖8以及表20至25)。本說明書實施例7和8之數據揭示BCY6136對於大型和小型腫瘤之LU-01-0251 PDX肺癌(NSCLC)異體移植模式具有有效之抗腫瘤活性(圖9和10以及表26至29)，其中可觀察到全部腫瘤縮小。本說明書實施例12揭示BCY6136對於LU-01-0046 PDX肺癌(NSCLC)異體移植模式具有顯著之抗腫瘤活性(圖11以及表30和31)，其中可觀察到BCY6136使全部腫瘤縮小。本說明書實施例13揭示BCY6136對於LU-01-0046 PDX肺癌(NSCLC)異體移植模式具有劑量依賴之抗腫瘤活性(圖12以及表32和33)。本說明書實施例14揭示BCY6136可根除LU-01-0046 PDX肺癌(NSCLC)模式(圖13至15以及表34至37)。本說明書實施例15和16揭示BCY6136對於使用低/可忽略EphA2表現細胞株(即Lu-01-0412和Lu-01-0486)之二模式的效果。圖23和24、表38至41之數據揭示BCY6136對於此二細胞株並不造成腫瘤減小之效果，但BCY8245和BCY8781可結合至Lu-01-0412細胞株高度表現之標的並可完全根除腫瘤。本說明書實施例17之數據揭示BCY6136對於MDA-MB-231乳癌異體移植模式具有有效之抗腫瘤活性(圖18以及表42至45)。本說明書實施例18之數據揭示BCY6136對於使用低/可忽略EphA2表現細胞株(即EMT6)之乳癌模式的效果。圖19、表46和47之數據揭示BCY6136對於此細胞株並不造成腫瘤減小之效果。實施例19之數據另揭示BCY6136對於NCI-N87胃癌異體移植模式具有顯著之抗腫瘤活性(圖20以及表48和49)。實施例20之數據另揭示BCY6136對於SK-OV-3卵巢癌異體移植模式具有顯著之抗腫瘤活性(圖21以及表50和51)，相較之下ADC MEDI-547僅具有中等抗腫瘤活性。實施例21之數據另揭示BCY6136對於OE-21食道癌異體移植模式具有顯著之抗腫瘤活性(圖22以及表52和53)。實施例22之數據另揭示BCY6136對於MOLP-8多發性骨髓瘤異體移植模式具有劑量依賴之抗腫瘤活性(圖23)。實施例23之數據另揭示BCY6136對於HT-1080纖維肉瘤異體移植模式具有有效之抗腫瘤活性(圖24至28以及表56和57)。

合成

本發明之胜肽可藉由標準技術而合成製備，而後與分子支架於體外反應。製備時可使用標準化學方法。其可快速大量製備可溶性材料，用於後續實驗或驗證。該些方法可使用傳統化學方法實施，例如文獻Timmerman et al(supra)所揭示。

因此，本發明另關於本說明書所述之多肽或接合物之製備，其中該製備包括選擇性之其他步驟，如下文所述。於一實施例，該些步驟係用於化學合成所製造之多肽/接合物之終產物。

製備接合物或複合物時，目標多肽中的胺基酸殘基可選擇性地被取代。

可將胜肽延長以包括，例如，另一環，因此可引入多重特異性。

可使用標準固相或液相化學方法，簡單地延伸N端或C端、或使用正交保護(Orthogonally protected)離胺酸(和類似物)於環內延伸，以延伸該胜肽。標準(生物)接合技術可用於引入活化或可活化之C或N端。可替代地，可藉由片段縮合(condensation)或自然化學連接(ligation)實施加成反應，例如文獻Dawson et al.1994.Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation.Science 266：776-779所揭示，或藉由酵素實施，例如使用肽連接酶，如文獻Chang et al Proc Natl Acad Sci U S A.1994 Dec 20；91(26)：12544-8或Hikari et al Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters Volume 18,Issue 22,15 November 2008,Pages 6000-6003所述。

可替代地，可另藉由雙硫鍵接合以延伸或修飾胜肽。其具有之優勢在於，當位於細胞的還原環境中，可使第一和第二胜肽彼此分離。若是如此，可於合成第一胜肽時加入分子支架，使其與三半胱胺酸基團反應；另一半胱胺酸基團或硫醇可接著附加於該第一胜肽之N或C端，因此該半胱胺酸或硫醇僅與第二胜肽之自由半胱胺酸或硫醇反應，形成雙硫鍵連結之雙環胜肽-胜肽接合物。

相似技術可應用於合成/耦合二雙環和雙特異性大環，具製造四特異性分子的潛力。

再者，可以相同方法加成其他官能基或效應物，使用適當化學方法，於N或C端或藉側鏈耦合。於一實施例，該耦合之實施不阻礙各反應物之活性。

醫藥組合物

本發明另一實施態樣係提供一種醫藥組合物，包括本說明書定義之胜肽配體或藥物接合物，組合一或多藥學上可接受之賦形劑。

一般而言，本發明之胜肽配體可以純化形式與藥理學上適當之賦形劑或載劑一併使用。該些賦形劑或載劑通常包括水性或醇類/水性溶液、乳化劑、或懸浮劑，包括鹽水和/或緩衝介質。腸道外載劑包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉和乳酸化林格氏溶液。若有必要將多肽複合物保持於懸浮劑，可自增厚劑選擇適當生理可接受之佐劑，例如羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、和藻酸鹽。

靜脈內載劑包括流體和營養補充液和電解質補充液，例如基於林格氏葡萄糖調製。亦可存在防腐劑和其他添加物，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體(Mack(1982)Remington's Pharmaceutical Sciences,16th Edition)。

本發明之胜肽配體可用於分別給藥之組合物或與其他藥劑一併使用。該些藥劑可包括抗體、抗體片段、和多種免疫治療藥物，例如環孢素(cylcosporine)、胺甲喋呤(methotrexate)、阿德力黴素(adriamycin)、或順鉑以及免疫毒素。醫藥組合物可包括多種胞殺劑或其他藥劑與本發明之胜肽配體合併使用之「雞尾酒療法」，或經選擇之本發明之多肽組合，其具有不同特異性，例如使用不同標的配體選擇之多肽，於給藥前可混合或不必混合之。

本發明之醫藥組合物之給藥途徑可為任何習知技術者所知的途徑。用於治療時，本發明之胜肽配體可依據標準技術給予任何患者。可藉由任何適當模式給藥，包括腸道內、盡妹、肌內、腹腔內、透皮、肺途徑、或適當地藉由導管輸液。較佳地，本發明之醫藥組合物可藉由吸入給藥。給藥之劑量和頻率係由醫師依據年齡、性別、患者條件、同時服用其他藥物、用藥禁忌、和其他參數而考量。

本發明之胜肽配體可凍乾用於保存，並於使用前以適當載劑重構。此技術顯示為有效，並可使用習知的凍乾和重構技術。習知技術者可知，凍乾和重構可造成不同程度的活性喪失，而劑量可能必須上調作為補償。

包括本發明之胜肽配體或其雞尾酒之組合物之給藥可用於預防或治療。於特定治療用途，用於經選擇之細胞族群之至少部分地抑制、抑止、調節、消滅、或其他可測量參數的適當量係定義為「治療有效劑量」。達成此劑量之量將依據疾病嚴重度和患者自身免疫系統之一般狀態而定，但經選擇之胜肽配體一般介於每公斤體重0.005至5.0毫克(mg)，更常使用0.05至2.0mg/kg/劑之劑量。於預防用途，包括本發明之胜肽配體或其雞尾酒之組合物可以相似或較低劑量給藥。

包括本發明之胜肽配體之組合物可用於預防或治療，協助改變、去活化、消滅、或移除哺乳類動物中經選擇之標的細胞族群。此外，本說明書所述之胜肽配體可用於體外或胞外選擇性地自異質細胞群之中消滅、消耗、或其他有效地移除標的細胞族群。依據標準技術，哺乳類的血液可於體外結合經選擇之胜肽配體，不需要的細胞可自血液中被消滅或移除，並返回哺乳類動物。

治療用途

本發明之雙環胜肽具有作為EphA2結合劑之特定用途。

Eph受體酪胺酸激酶(Ephs)屬於受體酪胺酸激酶(RTKs)之一大群組，可磷酸化蛋白質的酪胺酸殘基。Eph及其膜結合ephrin配體控制細胞定位以及組織結構(Poliakov et al.(2004)Dev Cell 7,465-80)。Eph於功能以及生物化學上的反應發生於較高的配體低聚合狀態(Stein et al.(1998)Genes Dev 12,667-678)。

於其他模式功能中，多種Eph和ephrin已被揭露具有血管發展的功能。剔除EphB4和ephrin-B2造成將微血管床重塑微血管之功能之缺乏(Poliakov et al.,supra)，以及胚胎致死性。新生的成人微血管亦可觀察到持續表現某些Eph受體和ephrins(Brantley-Sieders et al.(2004)Curr Pharm Des 10,3431-42；Adams(2003)J Anat 202,105-12)。

成人的某些ephrins及其受體之去控制再現亦觀察到可造成腫瘤侵襲、轉移、以及血管新生(Nakamoto et al.(2002)Microsc Res Tech 59,58-67；Brantley-Sieders et al.,supra)。此外，某些Eph家族之成員於多種人類腫瘤細胞中被發現為過度表現(Brantley-Sieders et al.,supra；Marme(2002)Ann Hematol 81 Suppl 2,S66；Booth et al.(2002)Nat Med 8,1360-1)。

EPH受體A2(ephrin type-A receptor 2)係人類由EPHA2基因編碼之蛋白質。

EphA2於人類的多種癌症中上調，多與病勢發展、癌症轉移、和預後不良相關，例如：乳房(Zelinski et al(2001)Cancer Res.61,2301-2306；Zhuang et al(2010)Cancer Res.70,299-308；Brantley-Sieders et al(2011)PLoS One 6,e24426)、肺(Brannan et al(2009)Cancer Prev Res(Phila)2,1039-1049；Kinch et al(2003)Clin Cancer Res.9,613-618；Guo et al(2013)J Thorac Oncol.8,301-308)、胃(Nakamura et al(2005)Cancer Sci.96,42-47；Yuan et al(2009)Dig Dis Sci 54,2410-2417)、胰臟(Mudali et al(2006)Clin Exp Metastasis 23,357-365)、前列腺(Walker-Daniels et al(1999)Prostate 41,275-280)、肝(Yang et al(2009)Hepatol Res.39,1169-1177)、和神經膠母細胞瘤(Wykosky et al(2005)Mol Cancer Res.3,541-551；Li et al(2010)Tumour Biol.31,477-488)。

目前未知EphA2於癌症發展中的全部角色，但有證據顯示癌症發展的多個階段中均有交互作用，包括腫瘤細胞生長、存活、侵襲、和血管新生。EphA2表現量下調則抑制腫瘤細胞發展(Binda et al(2012)Cancer Cell 22,765-780)，而阻斷EphA2可抑制VEGF造成的細胞遷移(Hess et al(2001)Cancer Res.61,3250-3255)、出芽和血管新生(Cheng et al(2002)Mol Cancer Res.1,2-11；Lin et al(2007)Cancer 109,332-40)、以及癌症轉移(Brantley-Sieders et al(2005)FASEB J.19,1884-1886)。

接合EphA2之抗體藥物可於大鼠和小鼠異體移植模式中，顯著地削減腫瘤生長(Jackson et al(2008)Cancer Research 68,9367-9374)，相似方法曾於人體試用但由於相關副作用而停止(Annunziata et al(2013)Invest New drugs 31,77-84)。

本發明之方法所選擇之胜肽配體可用於體內治療和預防之應用、體內或體外診斷之應用、體外試驗或反應之應用等。具有經選擇的特異性程度之配體可用於測試非人類動物，其中需交互反應，或診斷用途，其中需仔細控制同源物或同種同源物。於某些應用，例如用於疫苗，可開發誘發對於預定範圍之抗原的免疫反應之能力，以定製對於疾病和病原具特異性之疫苗。

至少90-95%同質之實質純胜肽配體較佳地用於哺乳類給藥，以及至少98-99%同質之胜肽配體更佳地可用於藥物用途，特別是用於人類。若已純化，部分地或已為所需之同質，經選擇之多肽可用於診斷或治療(包括體外治療)或研發以及實施試驗程序，或免疫螢光染色等用途(Lefkovite and Pernis,(1979 and 1981)Immunological Methods,Volumes I and II,Academic Press,NY)。

本發明另一實施態樣提供本說明書定義之胜肽配體或藥物接合物，可用於預防、抑制、或治療罹病組織(例如腫瘤)中EphA2過度表現造成之疾病或失調。

本發明另一實施態樣提供預防、抑制、或治療罹病組織(例如腫瘤)中EphA2過度表現造成之疾病或失調之方法，包括給予患者本說明書定義之胜肽配體之效應物群組或藥物接合物。

於一實施例，該EphA2係哺乳類EphA2。於另一實施例，該哺乳類EphA2係人類EphA2。

於一實施例，罹病組織中EphA2過度表現造成之疾病或失調係選自癌症。

可治療(或抑制)之癌症(及其良性之對應)包括但不限於：上皮源腫瘤(不同類型之腺瘤和癌，包括腺癌、鱗狀細胞癌、移行細胞癌、和其他癌症)例如膀胱和尿道、乳房、腸胃道(包括食道、胃、小腸、結腸、直腸、和肛門)、肝(肝細胞癌)、膽囊和膽系統、外泌胰臟、腎臟、肺(例如腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、支氣管肺泡癌、和中皮瘤)、頭頸(例如舌、口腔、喉腔、咽、鼻咽、扁桃腺、唾腺、鼻腔、和鼻竇等癌症)、卵巢、輸卵管、腹膜、陰道、外陰、陰莖、子宮頸、子宮肌層、子宮內膜、甲狀腺(例如甲狀腺濾泡癌)、腎上腺、前列腺、皮膚和附件(例如黑色素瘤、基細胞、鱗狀細胞癌、角質棘皮瘤、發育不良母斑)等癌症；血液癌症(即白血病、淋巴瘤)、和癌前的血液失調以及邊界癌化，包括血液癌和相關淋巴系統病症(例如急性淋巴性白血病[ALL]、慢性淋巴細胞白血病[CLL]、B細胞淋巴癌例如瀰漫大B細胞淋巴瘤[DLBCL]、濾泡淋巴癌、巴氏淋巴瘤、外膜細胞淋巴癌、T細胞淋巴癌和白血病、自然殺手[NK]細胞淋巴癌、霍奇金氏淋巴瘤、毛細胞白血病、不確定意義單株球蛋白症、漿細胞瘤、多發性骨髓瘤、移植後淋巴增生失調)、以及血液癌症和相關之骨髓系統病症(例如急性骨髓性白血病[AML]、慢性骨髓性白血病[CML]、慢性骨髓單核球性白血病[CMML]、嗜伊紅性白血球增多症候群、骨髓增生失調例如真性紅血球增多症、原發性血小板血症和初級骨髓纖維化、骨髓增生症候群、骨髓發育不良症候群、和早幼骨髓性白血病)；間葉源腫瘤，例如軟組織肉瘤、骨或軟骨之骨肉瘤、纖維肉瘤、軟骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、尤英氏肉瘤、滑膜肉瘤、上皮樣細胞肉瘤、腸胃道間質肉瘤、良性和惡性組織細胞瘤、以及隆凸性皮膚纖維肉瘤；中樞或周邊神經系統腫瘤(例如星狀細胞瘤、神經膠瘤和神經膠母細胞瘤、腦脊髓膜瘤、室管膜瘤、鬆果腺瘤、和神經鞘瘤)；內分泌腺瘤(例如腦下垂體瘤、腎上腺瘤、胰島細胞瘤、副甲狀腺瘤、類癌瘤、和甲狀腺髓瘤)；眼和附件瘤(例如視網膜瘤)；生殖細胞或滋養細胞瘤(例如畸胎瘤、精原細胞瘤、惡性胚細胞瘤、水囊狀胎塊和絨毛膜癌)；和小兒及胚胎腫瘤(例如神經管胚細胞瘤、神經胚細胞瘤、威爾姆氏癌、和原始神經外胚層腫瘤)；或症候群、先天疾病、或其他，可使患者對於惡性癌症易感(例如著色性乾皮病)。

於另一實施例，該癌症係選自：乳癌、肺癌、胃癌、胰臟癌、前列腺癌、肝癌、神經膠母細胞瘤、和血管新生。

於另一實施例，該癌症係選自：前列腺癌、肺癌(例如非小細胞肺癌(NSCLC))、乳癌(例如三陰性乳癌)、胃癌、卵巢癌、食道癌、多發性骨髓瘤、和纖維肉瘤。

於另一實施例，該癌症係前列腺癌。本說明書實施例7和8揭示BCY6136對於PC-3前列腺癌異體移植模式具有顯著且有效之抗腫瘤活性，(圖5和6以及表16至19)。

於另一實施例，該藥物接合物係用於預防、抑制、或治療實性瘤，例如纖維肉瘤、乳癌、和非小細胞肺癌。

於另一實施例，該癌症係選自肺癌，例如非小細胞肺癌(NSCLC)。實施例9之數據揭示BCY6136對於NCI-H1975肺癌(NSCLC)異體移植模式具有有效之抗腫瘤活性(圖8以及表20至25)。實施例10和11之數據揭示BCY6136對於大型和小型腫瘤之LU-01-0251 PDX肺癌(NSCLC)模式具有有效之抗腫瘤活性(圖9和10以及表26至29)，其中可觀察到全部腫瘤縮小。本說明書實施例12揭示BCY6136對於LU-01-0046 PDX肺癌(NSCLC)異體移植模式具有顯著之抗腫瘤活性(圖11以及表30和31)，其中可觀察到BCY6136使全部腫瘤縮小。本說明書實施例13揭示BCY6136對於LU-01-0046 PDX肺癌(NSCLC)異體移植模式具有劑量依賴之抗腫瘤活性(圖12以及表32和33)。本說明書實施例14揭示BCY6136和BCY6175可根除LU-01-0046 PDX肺癌(NSCLC)模式(圖13至15以及表34至37)。本說明書實施例15和16揭示BCY6136對於使用低/可忽略EphA2表現細胞株(即Lu-01-0412和Lu-01-0486)之二模式的效果。圖23和24、表38至41之數據揭示BCY6136對於此二細胞株並不造成腫瘤減小之效果，但BCY8245和BCY8781可結合至Lu-01-0412細胞株高度表現之標的並可完全根除腫瘤。於另一實施例，該癌症係乳癌。於另一實施例，該乳癌係三陰性乳癌。本說明書實施例17之數據揭示BCY6136對於MDA-MB-231乳癌異體移植模式具有有效之抗腫瘤活性(圖18以及表42至45)。本說明書實施例18之數據揭示BCY6136對於使用低/可忽略EphA2表現細胞株(即EMT6)之乳癌模式的效果。圖19、表46和47之數據揭示BCY6136對於此細胞株並不造成腫瘤減小之效果。於一替代實施例，該乳癌係具有賀癌平抗性之乳癌。不受限於理論，EphA2應與賀癌平抗性相關，故EphA2靶向物可有效地用於對於賀癌平無反應之患者。

於另一實施例，該癌症係胃癌。實施例19之數據另揭示BCY6136對於NCI-N87胃癌異體移植模式具有顯著之抗腫瘤活性(圖20以及表48和49)。

於另一實施例，該癌症係卵巢癌。實施例20之數據另揭示BCY6136對於SK-OV-3卵巢癌異體移植模式具有顯著之抗腫瘤活性(圖21以及表50和51)，相較之下ADC MEDI-547僅具有中等抗腫瘤活性。

於另一實施例，該癌症係食道癌。實施例21之數據揭示BCY6136對於OE-21食道癌異體移植模式具有顯著之抗腫瘤活性(圖22以及表52和53)。

於另一實施例，該癌症係多發性骨髓瘤。實施例22之數據揭示BCY6136對於MOLP-8多發性骨髓瘤異體移植模式(參見圖23)具有劑量依賴之抗腫瘤活性，以及BCY6082具有顯著之抗腫瘤活性。

於另一實施例，該癌症係纖維肉瘤。實施例23之數據揭示BCY6173、BCY6135、BCY6174、和BCY6175對於HT-1080纖維肉瘤異體移植模式具有劑量依賴之抗腫瘤活性，以及BCY6136對於HT-1080纖維肉瘤異體移植模式具有有效之抗腫瘤活性(圖24至28以及表56和57)。

本說明書用語「預防」包括於疾病誘發前給予保護性組合物。「抑制」指涉於誘發事件後、疾病於臨床出現前給予該組合物。「治療」包括於疾病病徵出現後給予保護性組合物。

可使用用於篩選胜肽配體預防或治療疾病之動物模式。本發明可利用動物模式系統，使人類和動物標的均可發展胜肽配體，並允許使用動物模式。

再者，實施例3的數據揭露多種腫瘤類型中複製數變異(copy number variation(CNV))和EphA2基因表現量之間的關聯。故，本發明另一實施態樣提供預防、抑制、或治療癌症之方法，包括給予患者本說明書定義之胜肽配體之效應物群組和藥物接合物，其中該患者被辨識具有增加之EphA2之複製數變異(CNV)。

於一實施例，該癌症係選自本說明書辨識具有增加之EphA2之CNV。於另一實施例，該癌症係乳癌。

本發明進一步參照實施例說明於下文。

實施例

材料和方法

胜肽合成

以固相合成方法合成胜肽。使用Rink Amide MBHA樹脂。混合Rink Amide MBHA(0.4-0.45微莫耳(mmol)/g)和Fmoc-Cys(Trt)-OH(3.0當量(eq))並加入DMF，再加入DIC(3eq)和HOAt(3eq)混合1小時。使用20%的哌啶之DMF溶液去保護基(deblocking)。各接續胺基酸與3eq使用活化反應物、DIC(3.0eq)、和HOAT(3.0eq)的DMF溶液形成耦合。使用茚三酮呈色反應或四氯(tetrachlor)呈色反應監測反應。合成完成後，使用DMF x 3和MeOH x 3洗滌胜肽樹脂，再於N₂起泡之下隔夜乾燥。再將胜肽樹脂和92.5% TFA/2.5% TIS/2.5% EDT/2.5% H₂O反應3小時。使用冰涼異丙醚和離心方法(3000rpm，3分鐘)沉澱胜肽。使用異丙醚清洗沉澱物2次，粗粹胜肽於真空乾燥2小時並凍乾。凍乾之粉末溶解於ACN/H₂O(50：50)，並加入100mM TATA之CAN溶液，再加入1M的碳酸氫銨水溶液混合1小時。環化完成後，使用1M的半胱胺酸鹽酸溶液(10eq相對於TATA)終止反應，再混合並放置1小時。將溶液凍乾並獲得粗粹產物。使用製備型HPLC純化粗粹胜肽，並凍乾以獲得產物。

除非另有說明，全部胺基酸均為L型結構。

序列：(β-Ala)-Sar ₁₀ -(SEQ ID NO：2)-CONH ₂

使用8.0g樹脂，產生2.1g的白色固態BCY6099(純度99.2%；產率16.3%)。

製備雙環胜肽藥物接合物

製備雙環藥物接合物(BDC)之一般架構揭示於圖1，表A說明各BDC中的靶相雙環和連接子/毒素之組成。

BCY6135

BCY6099(114.1mg、35.84μmol)係做為雙環反應物。獲得白色固體之22.4mg化合物BCY6135(5.30μmol、產率17.74%、純度95.14%)。

BCY6136

BCY6099(71.5mg、22.48μmol)係做為雙環反應物。獲得白色固體之化合物BCY6136(40.9mg、9.05μmol、產率40.27%、純度97.42%)。

BCY6173

BCY6099(200.15mg、62.89μmol)係做為雙環反應物。獲得白色固體之57.1mg化合物BCY6173(3.40μmol、產率22.79%、純度95.80%)。

BCY6174

BCY6099(389.77mg、122.47μmol、1.2eq)係做為雙環反應物。獲得白色固體之Dde-BCY6174(0.250g、55.10μmol、產率53.99%)。

依據一般方法，使用聯胺將Dde-BCY6174(0.250g、55.10μmol、1.0eq)去保護，獲得白色固體之BCY6174(0.1206g、27.45μmol、產率49.82%)。

BCY6175

製備化合物10A之一般方法

於BCY6099(195.15mg、61.32μmol、1.1eq)之DMA溶液(3mL)加入DIEA(21.61mg、167.23μmol、29.13μL、3eq)和化合物9(0.085g、55.74μmol、1.0eq)。於25℃攪拌混合物16小時。LC-MS結果揭露化合物9完全消耗，以及偵測到具有預期之m/z之一主波峰。將反應混合物減壓濃縮，去除溶劑後獲得殘餘物(淡黃色油狀)。直接使用製備型HPLC純化反應物(中性條件)。獲得白色固體之化合物10A(0.160g、34.84μmol、產率62.50%d)。

製備化合物BCY6175之一般方法

於化合物10A之DCM溶液(4.5mL)中加入TFA(4.5mL)。於0℃下混合30分鐘。LC-MS結果揭露化合物10A完全消耗，以及偵測到具有預期之m/z之一主波峰。將反應混合物減壓濃縮，去除溶劑後獲得殘餘物，並使用製備型HPLC純化(TFA條件)。獲得白色固體之化合物BCY6175(61.40mg、13.56μmol、產率31.13%)。

生物數據

實施例1：螢光極化測量

(a)直接結合試驗

具有螢光標記(螢光素(SIGMA)或Alexa Fluor488^TM(Fisher Scientific))之胜肽以2.5nM稀釋於含有0.01% tween 20之PBS或含有100mM NaCl和0.01% tween的50mM HEPES(pH 7.4)(均稱之為試驗緩衝液)。將其混合溶於相同試驗緩衝液之蛋白滴定，於黑色壁底低結合低體積384孔盤中獲得總體積25μL的1nM胜肽，通常為5μL試驗緩衝液，10μL蛋白(表1)以及10μL螢光胜肽。二序列稀釋其中之一用於獲得12不同濃度，高濃度範圍自500nM作為高親和力結合物至10μM作為低親和力結合物和選擇性試驗。使用備有「FP 485 520 520」光學模組的BMG PHERAstar FS測量，其發出485nm光波，以及於520nm偵測平行和垂直發光。PHERAstar FS設定於25℃並每孔洞200次發光，以及定位延遲0.1秒，各孔洞以5至10分鐘間隔測量60分鐘。60分鐘結束後，以用於分析的獲得物判斷各追蹤物，其中孔洞內不含蛋白質。使用Systat Sigmaplot(12.0版)分析數據。mP值帶入使用者定義之二次方程式，產生Kd值：f=ymin+(ymax-ymin)/Lig*((x+Lig+Kd)/2-sqrt((((x+Lig+Kd)/2)^2)-(Lig*x)))。「Lig」為使用追蹤物之濃度之定義值。

(b)競爭結合試驗

不具有螢光標示之胜肽與具有螢光標記和已知Kd之胜肽(表2)進行競爭試驗。比較化合物A之序列為Fl-G-Sar₅-ACPWGPAWCPVNRPGCA(Fl-G-Sar₅-(SEQ ID NO：4))。比較化合物B5之序列為Fl-G-Sar₅-ACPWGPFWCPVNRPGCA(Fl-G-Sar₅-(SEQ ID NO：5))。比較化合物C之序列為Fl-G-Sar₅-ADVTCPWGPFWCPVNRPGCA(Fl-G-Sar₅-(SEQ ID NO：6)。各比較化合物A、B、和C包含TBMB分子支架。將胜肽適當稀釋於如直接結合試驗所述的試驗緩衝液並含有5%DMSO，再序列稀釋1/2倍。將5μL稀釋後的胜肽加入培養盤中再加入10μL人類或小鼠EphA2(表1)，其濃度依據使用的螢光胜肽(表2)而固定，再加入10μL螢光胜肽。使用與直接結合試驗相同方法測量，但獲得物於第一次測量之前判斷。使用Systat Sigmaplot(12.0版)分析數據，其中mP值帶入使用者定義之三次方程式，產生Ki值：f=ymin+(ymax-ymin)/Lig*((Lig*((2*((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2-3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))^0.5*COS(AR CCOS((-2*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^3+9*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp)-27*(-1*Klig*Kcomp*Prot*c))/(2*((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2-3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))^3)^0.5)))/3))-(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)))/((3*Klig)+((2*((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2-3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))^0.5*COS(ARCCOS((-2*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^3+9*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp)-27*(-1*Klig*Kcomp*Prot*c))/(2*((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2-3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))^3)^0.5)))/3))-(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c))))。

「Lig」、「KLig」、和「Prot」全部為定義值，係分別關於：螢光胜肽濃度、螢光胜肽Kd值、和EphA2濃度。

本發明之特定胜肽配體以上述試驗測試，結果揭示於表3和4。

實施例2：螢光極化測量(替代方法)

(a)競爭結合

不具有螢光標示之胜肽與具有螢光標記和已知Kd之胜肽(表9)進行競爭試驗。將5μL的增加(2倍)濃度之測試化合物加入培養盤，再加入10μL的EphA2蛋白(表8)，其濃度依據使用的螢光胜肽(表9)而固定，再加入10μL螢光胜肽。使用如上所述的試驗緩衝液，包含DMSO<1%。使用配備FP 485 520 520光學模組的BMG PHERAstar FS測量，其發出485nm光波，以及於520nm偵測平行和垂直發光。PHERAstar FS設定於25℃並每孔洞200次發光，以及定位延遲0.1秒，各孔洞以5至10分鐘間隔測量60分鐘。可替代地，於配備FITC FP Dual Mirror以相似時間間隔進行測量，FITC FP 480激發過濾器和FITC FP P-pol 535和30次閃光的FITC FP S-pol激發過濾器和G-Factor of 1.2。使用Systat Sigmaplot version(12.0或13.0版)分析數據，其中60分鐘時的mP值帶入使用者定義之三次方程式，產生Ki值：f=ymin+(ymax-ymin)/Lig*((Lig*((2*((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2-3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))^0.5*COS(AR CCOS((-2*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^3+9*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp)-27*(-1*Klig*Kcomp*Prot*c))/(2*((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2-3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))^3)^0.5)))/3))-(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)))/((3*Klig)+((2*((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2-3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))^0.5*COS(ARCCOS((-2*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^3+9*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp)-27*(-1*Klig*Kcomp*Prot*c))/(2*((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2-3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))^3)^0.5)))/3))-(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)))).

本發明之特定胜肽配體和雙環藥物接合物以上述競爭試驗測試，結果揭示於表7。

表7：經選擇之雙環化合物之競爭結合

表7所示之競爭結合試驗結果揭示，靶向人類EphA2之雙環胜肽(BCY6099)對於小鼠和大鼠EphA2具有高度親和力。該結果顯示本發明之胜肽可用於大鼠和小鼠體內用途和毒理學模型。

表8揭露本發明之特定雙環藥物結合物於人類、小鼠、和囓齒類EphA2之間具有優異之交叉反應。因此本發明之胜肽可用於大鼠和小鼠用途和體內毒理學模型。

(b)SPR測量

非F融合蛋白使用EZ-Link^TM Sulfo-NHS-LC-Biotin於4mM乙酸鈉、100mM NaCl、pH 5.4、以及生物素莫耳量3倍多於蛋白質之下生物素化1小時。將反應混合物透析進入PBS後，以Fluorescence Biotin Quantification Kit(Thermo)確定標記之程度。為分析胜肽之結合，使用Biacore T200分析儀和 XanTec CMD500D晶片。使用標準胺耦合化學方法，於電泳緩衝液HBS-N(10mM HEPES、0.15M NaCl、pH 7.4)將鏈親和素固定於晶片上。簡而言之，羧甲基右旋糖酐表面之活化係使用注射7分鐘的1：1比例之0.4M 1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)/0.1M的N-羥琥珀醯亞胺(NHS)，流速為10μl/min。為捕捉鏈親和素，蛋白質稀釋於為0.2mg/ml之10mM乙酸鈉溶液(pH 4.5)，以及注射120μl於活化晶片表面並捕捉。殘留活化基團以7分鐘注射之1M乙醇胺(pH 8.5)：HBS-N(1：1)阻斷。再改用PBS/0.05% Tween 20，使用緩衝液中的0.2μM蛋白質稀釋，將生物素化之EphA2捕捉於500-1500 RU之量。於此緩衝液中製備胜肽之序列稀釋，包含最終濃度為0.5%之DMSO，胜肽濃度最大值為50或100nM，以及再進行6次2倍稀釋。SPR分析執行於25℃，流速90μl/min，包括60秒連接和900-1200分離。數據以DMSO排除體積效應校正。全部數據雙重參照空白注射，以及對比表面使用標準程序方法，並且數據處理和動態帶入執行於Scrubber軟體(2.0c版)(BioLogic Software).數據帶入樣本1：1結合模組，適當時用於大量傳輸效應。

使用Biacore 3000儀器，用於雙環藥物接合物結合。生物素化蛋白質之固定量為1500 RU，以及最大濃度為100nM。其他方法與上述相同，使用CMD500D或CM5晶片(GE Healthcare)。針對Fc標記蛋白質，CM5晶片如上述方法活化，而後羊類的人類IgG抗體(Thermo-Fisher H10500)稀釋為20μg/ml之10mM乙酸鈉溶液(pH5.0)，以及捕捉約3000 RU。而後，以上述方法將表面阻斷。執行後續Fc標記蛋白之捕捉，獲得約200-400 RU之標的蛋白。使用之蛋白揭示如下。以各廠商建議的緩衝液和濃度重構全部蛋白，並使用5-10μg/ml蛋白質的PBS/0.05% Tween 20溶液捕捉。

本發明之特定胜肽配體和雙環藥物接合物以上述試驗測試，結果揭示於表10至12。

表10：本發明之經選擇之雙環胜肽和雙環藥物接合物之SPR結合分析

表10揭示使用SPR試驗，經選擇之雙環藥物接合物和人類EphA2之間結合親和力和動力參數(Koff and Kon)。

表11揭露四個雙環藥物接合物(BCY6136 and BCY6173)與近似人類Ephrin同源物之間的SPR試驗之結合結果。該結果揭示本發明之化合物對於下列近似人類同源物不具有顯著結合力：EphA1、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、和EphB4。

表12之結果揭示本發明之特定雙環藥物接合物(BCY6136和BCY6173)對於小鼠和大鼠EphA2具有選擇性，以及對於下列相近同源物不具有顯著結合：小鼠EphA3和EphA4；及大鼠EphA3和EphB1。

實施例3和7-23

實施例3和7-23均採用下列方法。

(a)材料

(i)動物和飼養條件

動物

物種：Mus Musculus

品系：Balb/c裸鼠或CB17-SCID

年齡：6-8周

體重：18-22g

動物數量：9-90小鼠

動物供應商：Shanghai Lingchang Biotechnology Experimental Animal Co.Limited

飼養條件

小鼠保留於各自之通氣籠內，每籠3-5隻，恆溫以及恆濕。

˙溫度：20~26℃

˙濕度：40-70%

鼠籠：聚碳酸酯製造。尺寸為300mm x 180mm x 150mm。墊料為玉米芯，每周更換2次。

食物：研究期間動物可自由取得輻射消毒之乾燥顆粒食物。

飲水：動物可自由取得消毒過的水。

鼠籠辨識：各籠的辨識辨識包括下列資訊：動物數、性別、品系、收貨日、治療、研究編號、組別編號、和治療始日。

動物辨識：動物均標記耳碼。

(ii)測試和正控制組名稱

¹ MEDI-547(完全人類單株抗體1C1(可辨識人類和老鼠EphA2)藉由mc連接子接合MMAF)之全部細節揭示於文獻Jackson et al(2008)Cancer Res 68,9367-74。

(b)實驗方法和流程

(i)觀察

實施例中處理、飼養、和治療動物之全部流程依據WuXi AppTec的機構動物飼養和使用委員會(IACUC)所公布的準則進行，以及按照實驗動物飼養評估和認證協會(AAALAC)的指導。於日常監測中，每日檢查動物腫瘤生長和治療對於一般行為之影響，例如行動力、飲食(僅目視)、體重增減、眼/毛光澤、和其他不正常影響，如實驗方法所述。依據各組動物數紀錄死亡和臨床徵兆。

(ii)腫瘤測量及終點

主要終點係觀察腫瘤是否生長延遲或小鼠是否被治癒。每周3次使用卡尺測量腫瘤二維體積，該體積以mm³使用下列方程式表示：V=0.5 a x b ²，其中a和b分別係腫瘤之長和短直徑。而後腫瘤體積用於計算T/C值。該T/C值(百分比)係抗腫瘤功效之指標；T和C分別係給定日期之治療組和控制組織平均體積。以下列方程式計算各組TGI：TGI(%)=[1-(T_i-T₀)/(V_i-V₀)]×100；T_i係給定日期之治療組之平均腫瘤體積，T₀係治療始日之治療組之平均腫瘤體積，V_i係與T_i同日之載劑控制組之平均腫瘤體積，以及V₀係治療始日之載劑控制組之平均腫瘤體積。

(iii)樣本收集

實驗終了後，收集全部組別之腫瘤用於FFPE。

(iv)統計分析

提供各時間點之腫瘤體積的統計摘要，包括平均值和平均值標準差(SEM)。

以最後給藥後最佳療效時點所獲得的數據進行各組之間腫瘤差異之統計分析。

執行單因子獨立變異數分析(one-way ANOVA)比較各組腫瘤，以及當取得顯著F檢驗統計(治療變異和誤差變異之比例)時，各組之間的比較以Games-Howell檢定執行。全部數據使用GraphPad Prism 5.0分析。P<0.05為具有顯著差異。

實施例3：研究複製數變異之間的關聯以及多種腫瘤EphA2基因表現量

方法

1. 選擇cBioPortal(http：//www.cbioportal.org/)中所有研究並搜尋EPHA2。

(a)移除暫時研究

(b)不選擇重疊樣本的研究，防止樣本偏差(基於cBioPortal上的警告)-保持泛癌症研究，如果是一種選項

(c)選擇分析用之研究(表13)

2. cBioPortal輸出CNV和RNA表現量數據

3. 檢測CNV是否與EphA2 mRNA表現量具有統計學上顯著相關(不應用log₂)

(a)於GraphPad Prism(7.04)以及R/R studio執行非參數Kruskal-Wallis檢定(顯著性臨界值：p<0.01)

(i)GraphPad Prism：設定表格，執行無配對之非參數檢定，不預設高斯分佈

(ii)R使用的包裹

1. XLConnect

2. Dplyr

3. Kruskal-Wallis秩和檢定：Kruskal.test.

4. 於R/Rstudio使用鄧恩檢定調整多重比較(包括全部可能比較，即使組別n=1)(顯著性臨界值：p<0.025)

(a)鄧恩多重比較法=“bonferonni”

結果

結果揭示於表14。cBioPortal彙編41個公開資料組，報導複製數變異(CAN)和EphA2 mRNA表現量，多種癌症類型曾被報導具有EphA2淺度刪除(shallow-deletions)(<2複製數)。同癌症類型中，腫瘤次群另具有深度刪除(>1複製數喪失或雙對偶基因喪失)、EphA2獲得(2-3複製數)、或EphA2擴增(>3複製數)，但較不常見。

>33%之腫瘤具有EphA2淺度刪除或深度刪除的適應症包括：腎臟難染腺瘤、膽管癌、嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤、肺鱗狀細胞癌、乳癌、直腸癌、腦低級別膠質瘤、肝癌、腎上腺皮質癌、中皮瘤、食道腺癌、和結腸癌。相對地，並無研究顯示>33%之樣本具有EphA2的獲得或擴增。總結上述結果顯示多種適應症具有EphA2 DNA的刪除。

41個研究中約三分之一的樣本經分析具有EphA2 CNV。依據上述研究中高比例CNV，以及特定癌症類型中高比例的淺度刪除，實行統計檢定以辨識複製數改變和RNA表現量之間的可能關聯。各適應症之腫瘤分類為下列類別其中之一：a)深度刪除；b)淺度刪除；c)二倍體；d)獲得；或e)擴增。

而後執行Kruskall-Wallis檢定，偵測各組mRNA表現量分布是否具有差異(P<0.01)。針對P<0.01的TCGA數據組別以及辨識哪一組與其他不同，藉由計算Z統計以及調整計算P值(Bonferroni)而執行事後檢定(post-hoc testing)。為簡單解釋，檢閱配對比較和各適應症二倍體。19/41的實驗具有<0.01的Kruskall-Wallis p值，顯示複製數與RNA表現量具有統計顯著相關。該19實驗中，17實驗具有調整P<0.025的Bonferroni，作為二倍體相對於淺度刪除，顯示減少的EphA2 mRNA表現量和減少的EphA2複製數之間的相關。19實驗中僅有2個具有調整P<0.025的Bonferroni，作為二倍體相對於獲得，二者均為乳癌。此外，乳癌實驗其中之一(侵襲性乳癌(TCGA,PanCancer Atlas))具有調整P<0.025的Bonferroni，作為二倍體相對於獲得以及二倍體相對於獲得，顯示複製數改變可能對於乳癌的EphA2 mRNA表現量具有強烈影響。

遺傳學中心法則指出EphA2複製數降低導致RNA和蛋白質表現量降低。因此，多種腫瘤類型中觀察到EphA2複製數喪失和mRNA表現量降低之間的關聯，顯示EphA2蛋白質表現量亦可能降低。相似地，乳癌中EphA2複製數增加與mRNA表現量增加相關，亦表示EphA2蛋白質表現量增加。再者，於臨床前體內模型中，EphA2蛋白質高表現量(FACS測量)與本發明之特定EphA2雙環藥物接合物之功效增加相關。綜上所述，若複製數改變與mRNA表現量改變相關可預測蛋白質表現量，則具有EphA2複製數刪除之腫瘤患者對於本發明之EphA2雙環藥物接合物較無反應。相似地，若患者的腫瘤中EphA2複製數增加(如乳癌)，該患者較可能對於本發明之EphA2雙環藥物接合物具有反應。因此，若以EphA2複製數將患者分類，此項資訊可用於排除和篩選患者，使本發明之EphA2雙環藥物接合物可更有效地治療。

實施例4：CDX異體移植模式中BCY6136之體內功效

本實施例評估BCY6136對於三癌症細胞株來源(CDX)模型的治療功效：HT1080纖維肉瘤、MDA-MB-231三陰性乳癌、和NCI-H1975非小細胞肺癌(NSCLC)。

(a)實驗方法

將癌細胞植入Balb/c小鼠右側腹部皮下，當平均腫瘤體積介於150至200mm³時開始藥物治療。腫瘤測量和統計分析依前述方法實施。帶有腫瘤的動物每周一次給予BCY6136或載劑。

(b)討論

圖4-6揭示每周一次給予BCY6136對於乳癌、肺癌、和纖維肉瘤異體移植模式具有療效。

HT1080纖維肉瘤模式：

HT1080模式中，每周第0日和第7日給予BCY6136(3和5mg/kg)，於第14日腫瘤生長完全減縮(圖2)。每周第0日和第7日給予BCY6136(2mg/kg)則使腫瘤停止生長(部分減縮)(圖2)。BCY6136治療並無造成體重顯著減少，以及整個研究中並無觀察到藥物治療的小鼠具有臨床副作用。

NCI-H1975非小細胞肺癌模式：

NCI-H1975模式中，每周一次給予BCY6136(2和3mg/kg)，於第28日腫瘤生長完全減縮(圖3)。第35日停止給藥後，於第35至72日期間，當3mg/kg手臂測量停止時，給予3mg/kg藥物治療的動物並無觀察到腫瘤再生(圖3)。給予2mg/kg的BCY6136使此模型於約第28日時腫瘤完全縮減。第35日停止給藥後，至第51日時給予2mg/kg藥物治療者均無腫瘤生長。對於此給藥量，約自第51日至第77日研究終止時，觀察到中等腫瘤生長。給予1mg/kg的BCY6136使腫瘤停止生長(部分縮減)(圖3)。BCY6136治療並無造成體重顯著減少，以及整個研究中並無觀察到藥物治療的小鼠具有臨床副作用。

MDA-MB-231乳癌模式：

MDA-MB231模式中，自第0日至第45日每周一次給藥(2和3mg/kg)，可觀察到腫瘤生長停止(部分縮減)(圖4)。另觀察到部分給予2mg/kg藥物治療的動物體重下降(由於腫瘤負擔)。

上述結果顯示BCY6136每日一次給藥可顯著地抑制異體移植纖維肉瘤、肺癌、和乳癌CDX的小鼠的腫瘤生長。

實施例5：大鼠安全試驗

6母鼠隨機分配為3組，每組2隻大鼠，用於測試BCY6136的毒性，再於第1日和第8日靜脈注射5、7.5、和10mg/kg的藥物。研究於第15日終止。

第2、12、和15日觀察，對於凝血參數(凝血酶原時間(秒)、活化部分凝血酶時間(秒)、或纖維蛋白原濃度(g/L))無顯著影響(數據未揭示)。無日常出血紀錄，以及病理檢驗並無偵測到體內出血。

實施例6：食蟹獼猴(cynomologous monkeys)安全試驗

本實施例執行28日的BCY6136食蟹獼猴毒理學試驗。於第1、8、15、和22日給予1.0和2.0mg/kg的BCY6136。於第29日(最後給藥之7日後)將動物安樂死並解剖。

於第18、22、和25日(數據未揭示)以及第29日(表15)的觀察，凝血參數相較於原始數值並無顯著改變。無日常出血紀錄，以及病理檢驗並無偵測到體內出血。

實施例7：PC-3異體移植Balb/c裸鼠給予BCY6136和ADC之體內治療功效

(a)研究目的

本實驗評估BCY6136對於PC-3異體移植的體內抗腫瘤功效。

(b)實驗設計

(c)實驗方法和步驟

(i)細胞培養

腫瘤細胞PC-3於37℃以及5% CO₂環境下培養於包含10%熱不活化小牛血清的F12K培養基。腫瘤細胞每周2次進行繼代培養。收取指數成長期的細胞，並用於腫瘤接種之計算。

(ii)腫瘤接種

各小鼠於右腹皮下接種PC-3(10*10⁶)腫瘤細胞並待其發展。隨機分類該些動物，當平均腫瘤體積約為150mm³時開始治療。各組中試驗藥物之給藥和動物數量揭示於下列實驗設計表。

(iii)製備試驗藥物配方

(d)結果

(i)體重改變和腫瘤生長曲線

圖5和圖6揭示體重和腫瘤生長曲線。

(ii)腫瘤體積紀錄

表16揭示帶有PC-3異體移植之Balb/c母裸鼠的腫瘤體積相對於時間。

(iii)腫瘤生長抑制之分析

治療起始後第16日測量腫瘤體積，計算測試藥物對於PC-3異體移植模式的腫瘤生長之抑制。

a. 平均值±SEM

b. 將治療組的組平均腫瘤體積除以控制組的組平均腫瘤體積，計算腫瘤生長抑制(T/C)

(e)結果和討論

本實施例評估測試藥物對於PC-3異體移植模式之治療功效。全部組別於多個時間點測量之體重和腫瘤體積揭示於圖5和6以及表16和17。

給予載劑治療之小鼠之平均腫瘤體積於第16日達到2070mm³。BCY6136於1mg/kg qw(TV=107mm³,TGI=102.2%,p<0.001)，BCY6136於2mg/kg qw(TV=79mm³,TGI=103.6%,p<0.001)，以及BCY6136於3mg/kg qw(TV=70mm³,TGI=104.1%,p<0.001)揭示有效的抗腫瘤功效。於本實施例，定期地監測動物體重。全部小鼠良好地維持體重。

實施例8：BCY6136治療PC-3異體移植Balb/c裸鼠之功效

(a)研究目的

本研究之目的係評估BCY6136治療PC-3異體移植Balb/c裸鼠之抗腫瘤功效

(b)實驗設計

N：各組動物數量。

實驗設計表揭示於4周治療後，於監測日程中第3、5、和6組的小鼠自第52日起以BCY6136 1.5mg/kg qw治療。

第1次給藥後由於Docetaxel治療之小鼠體重嚴重下降，治療中止2周，再於第28日給予較低劑量(Docetaxel,10mg/kg)。而後，自第42日至第70日給予小鼠BCY6136 1.5mg/kg qw。

(c)實驗方法和流程

(i)細胞培養

將腫瘤細胞在37℃和5%CO₂環境培養於含有10%熱不活化小牛血清的F-12K培養基。腫瘤細胞每周2次進行繼代培養。收取指數成長期的細胞，並用於腫瘤接種之計算。

(ii)接種腫瘤

各小鼠於右腹皮下接種懸浮於0.2ml的PBS的PC-3腫瘤細胞(10 x 10⁶)並待其發展。當平均腫瘤體積約為454mm³時，隨機分類52隻動物。各組中試驗藥物之給藥和動物數量揭示於下列實驗設計表。

(iii)製備測試藥物配方

(c)結果

(i)體重改變和腫瘤生長曲線

圖7揭示體重和腫瘤生長曲線。

(ii)腫瘤體積紀錄

表18揭示帶有PC-3異體移植之公裸鼠之腫瘤體積對應時間。

(iii)腫瘤生長抑制分析

依據治療起始後第20日的腫瘤體積測量，計算測試藥物對於PC-3異體移植模式的腫瘤生長抑制率。

a. 平均值±SEM

(d)結果和討論

本實施例評估測試藥物對於PC-3異體移植模式之治療功效。圖7以及表18和19揭示全部治療組別於多個時間點之測量體重和腫瘤體積。

給予載劑之小鼠之平均腫瘤體積於第20日到達2364mm³。BCY6136於0.167mg/kg qw(TV=1188mm³，TGI=61.4%,p<0.001)，0.5mg/kg q2w(TV=530mm³,TGI=96.0%,p<0.001)，0.5mg/kg qw(TV=234mm³,TGI=111.4%,p<0.001)，和1.5mg/kg qw(TV=131mm³,TGI=117.2%,p<0.001)在第20日可產生顯著的劑量或劑量頻率依賴之抗腫瘤活性。BCY6136於1.5mg/kg q2w(TV=128mm³,TGI=117.0%,p<0.001)可產生相當於BCY6136 1.5mg/kg qw之抗腫瘤活性。上述劑量之中，以BCY6136 0.5mg/kg qw或BCY6136 0.5mg/kg q2w治療的小鼠於停止治療後顯示顯著的腫瘤復發，而後再以BCY6136 1.5mg/kg qw自第52日開始治療，則可有效地使腫瘤縮減。以BCY6136 1.5mg/kg q2w治療的小鼠亦於停止治療後顯示腫瘤復發，但進一步給藥無法使腫瘤完全縮減。以BCY6136 1.5mpk qw治療的小鼠至第48日為止無任何腫瘤復發。

EphA2-ADC於0.33mg/kg qw(TV=1637mm³,TGI=38.1%,p<0.001)，1mg/kg qw(TV=981mm³,TGI=72.2%,p<0.001)，和3mg/kg qw(TV=184mm³,TGI=114.0%,p<0.001)於第20日可產生顯著的劑量依賴抗腫瘤活性。以EphA2-ADC 3mg/kg qw治療的小鼠至第59日為止並無顯示任何腫瘤復發。

Docetaxel 15mg/kg qw(TV=419mm³,TGI=101.8%,p<0.001)可產生顯著抗腫瘤活性，但造成嚴重的動物體重下降。停止治療後，小鼠顯示顯著的腫瘤復發。以BCY6136 1.5mg/kg qw自第42日起治療小鼠可有效地使腫瘤縮減。

實施例9：BCY6136治療NCI-H1975異體移植Balb/c裸鼠之體內功效

(a)研究目的

本研究之目的係評估BCY6136治療NCI-H1975異體移植Balb/c裸鼠之體內功效。

(b)實驗設計

(c)實驗方法和流程

(i)細胞培養

收取指數成長期的細胞並用於計算腫瘤接種。

(ii)腫瘤接種

各小鼠於右腹皮下接種懸浮於0.2ml的PBS的NCI-H1975腫瘤細胞(10×10^6)，待腫瘤生長。平均腫瘤體積到達149mm³時，將36隻動物隨機分組。測試藥物之給藥和各組動物數量揭示於實驗設計表。

(iii)製備測試藥物配方

(iv)樣本收集

於PG-D44，以FFPE固定第2組腫瘤。

於實驗結束時，以FFPE固定第3組腫瘤。

(d)結果

(i)體種改變和腫瘤生長曲線

圖8揭示體重和腫瘤生長。

(ii)腫瘤體積紀錄

表20至24揭示帶有NCI-H1975異體移植之Balb/c母裸鼠的平均腫瘤體積相對於時間。

(iii)腫瘤生長抑制分析

依據治療起始後第21日之腫瘤體積測量，計算BCY6136對於NCI-H1975異體移植模式的腫瘤生長抑制率。

a. 平均值±SEM

(e)結果和討論

本實施例評估BCY6136對於NCI-H1975異體移植模式的治療功效。圖8和表20至25揭示全部治療組別於多個時間點之測量體重和腫瘤體積。

給予載劑之小鼠之平均腫瘤體積於第21日到達2371mm³。BCY6136於1mg/kg(TV=205mm³,TGI=97.5%,p<0.001)、2mg/kg(TV=99mm³,TGI=102.3%,p<0.001)、和3mg/kg(TV=94mm³,TGI=102.4%,p<0.001)可產生有效之抗腫瘤活性。BCY6136於2mg/kg和3mg/kg可根除腫瘤或縮減腫瘤。於第35日停止治療，給予3mg/kg藥物治療之群組於後續5-6周並無顯示顯著之腫瘤再生長，但給予2mg/kg藥物治療之群組顯示明顯之再生長且再次給藥後並無顯示顯著之腫瘤抑制。於本實施例，小鼠良好地維持體重。

實施例10 BCY6136於LU-01-0251 PDX模式之Balb/c裸鼠之體內治療功效

(a)研究目的

本研究之目的係評估BCY6136於LU-01-0251 PDX模式之Balb/c裸鼠之體內治療功效。

(b)實驗設計

(c)實驗方法和流程

(i)腫瘤接種

各小鼠於右腹皮下接種LU-01-0251腫瘤片段，(~30mm³)並待其發展。當平均腫瘤體積約為174mm³時開始治療。各組中試驗藥物之給藥和動物數量揭示於下列實驗設計表。

(ii)製備測試藥物配方

(d)結果

(i)體重改變和腫瘤生長曲線

圖9揭示體重和腫瘤生長曲線。

(ii)腫瘤體積紀錄

表26揭示帶有LU-01-0251異體移植之母裸鼠於開始治療後第28日之腫瘤體積。

(iii)腫瘤生長抑制分析

依據治療起始後第28日的腫瘤體積測量，計算測試藥物BCY6136和ADC對於LU-01-0251 PDX異體移植模式的腫瘤生長抑制率。

a. 平均值±SEM

(e)結果和討論

本實施例評估測試藥物BCY6136和ADC對於LU-01-0251 PDX異體移植模式之治療功效。圖9以及表26和27揭示全部治療組別於多個時間點之測量體重和腫瘤體積。

於本實施例，給予載劑之小鼠之平均腫瘤體積於治療起始後第28日到達2208mm³。BCY6136於1mg/kg,qw(TV=499mm³,TGI=84.0%,p<0.001)、2mg/kg,qw(TV=32mm³,TGI=107.0%,p<0.001)、和3mg/kg,qw(TV=0mm³, TGI=108.6%,p<0.001)可產生劑量依賴之抗腫瘤活性。ADC於3mg/kg,qw(TV=39mm³,TGI=106.6%,p<0.001)顯示顯著之抗腫瘤活性。

實施例11 BCY6136於LU-01-0251 PDX模式之Balb/c裸鼠之體內治療功效

(a)研究目的

(b)實驗設計

a. 自第0日至第70日維持全部小鼠組別的給藥日程，而後小鼠3-2和小鼠3-4自第77日進一步給予BCY6136 3mg/kg qw，但其他3小鼠停止治療。自第0日至第56日維持全部小鼠組別的給藥日程。

b. 自第0日至第70日維持全部小鼠組別的給藥日程。

(c)實驗方法和流程

(i)腫瘤接種

各小鼠於右腹皮下接種LU-01-0251腫瘤片段(~30mm³)，並待其發展。當平均腫瘤體積約為960mm³時開始治療。各組中試驗藥物之給藥和動物數量揭示於下列實驗設計表。

(ii)製備測試藥物配方

(iii)樣本收集

小鼠#3-2之腫瘤於第94日收集於FFPE。小鼠#5-2和5-3之腫瘤於第140日收集並包埋於1個FFPE塊。

(d)結果

(i)體重改變和腫瘤生長曲線

圖10揭示體重和腫瘤生長曲線。

(ii)腫瘤體積紀錄

表28揭示帶有LU-01-0251異體移植之母裸鼠於開始治療後第0日至第28日之腫瘤體積。

(iii)腫瘤生長抑制分析

依據治療起始後第17日的腫瘤體積測量，計算測試藥物BCY6136和ADC對於LU-01-0251 PDX異體移植模式的腫瘤生長抑制率。

a. 平均值±SEM

(e)結果和討論

本實施例評估測試藥物BCY6136和ADC對於LU-01-0251 PDX異體移植模式之治療功效。圖10以及表28和29揭示全部治療組別於多個時間點之測量體重和腫瘤體積。

於本實施例，當平均腫瘤體積到達960mm³時開始治療。給予載劑之小鼠之平均腫瘤體積於治療起始後第17日到達2301mm³。BCY6136於1 mg/kg qw(TV=1672mm³,TGI=47.0%,p>0.05)並無顯示明顯之抗腫瘤活性：BCY6136於2mg/kg qw(TV=398mm³,TGI=142.1%,p<0.001)和3mg/kg qw(TV=216mm³,TGI=155.6%,p<0.001)於第17日可產生劑量依賴之抗腫瘤活性。

於治療後70日，給予BCY6136 2mg/kg qw治療的5小鼠中，其中3隻顯示完全的腫瘤縮減，其他2隻於第42日至第77日顯示明顯的腫瘤復發。於第7日進一步給予腫瘤復發的2小鼠BCY6136 3mg/kg qw之治療，其中之一的腫瘤顯示明顯之減縮，但另一隻則顯示治療抗性。

於治療後56日，給予BCY6136 3mg/kg qw治療的全部小鼠組別均顯示腫瘤完全縮減。

ADC於3mg/kg qw(TV=1143mm³,TGI=86.3%,p<0.01)於第17日顯示明顯之抗腫瘤活性，再治療53日後，該些小鼠顯示進一步、但非完全的腫瘤縮減。

於本實施例，某些小鼠突然顯示體重減輕，可能與長期餵食免疫缺陷小鼠有關。

實施例12 BCY6136於LU-01-0046 NSCLC PDX模式之Balb/c裸鼠之體內治療功效

(a)研究目的

本研究之目的係評估BCY6136於大型LU-01-0046 PDX模式之Balb/c裸鼠之體內治療功效。

(b)實驗設計

(c)實驗方法和流程

(i)腫瘤接種

各小鼠於右腹皮下接種LU-01-0046腫瘤片段(~30mm³)，並待其發展。當平均腫瘤體積約為1039mm³時開始治療。各組中試驗藥物之給藥和動物數量揭示於下列實驗設計表。

(ii)製備測試藥物配方

(d)結果

(i)體重改變和腫瘤生長曲線

圖11揭示體重和腫瘤生長曲線。

(ii)腫瘤體積紀錄

表30揭示帶有LU-01-0046之母裸鼠之平均腫瘤體積對應時間。

應注意腫瘤體積紀錄並無揭示組別2和4於第22日之後的結果。

(iii)腫瘤生長抑制分析

針對二部份之研究，分別依據治療起始後第22日、第28日的腫瘤體積測量，計算測試藥物對於LU-01-0046 PDX模式的腫瘤生長抑制率。

a. 平均值±SEM

*某些組別於第22日前中止，以及腫瘤體積係依據指數生長公式計算如下：載劑組別：Y=995.4×exp(0.1134×X)

BCY6136,1mpk組別：Y=855.0×exp(0.0974×X)

ADC,3mpk組別：Y=757.4×exp(0.1312×X)

(e)結果和討論

本實施例評估測試藥物對於大型LU-01-0046腫瘤之治療功效。圖11以及表30和31揭示全部治療組別於多個時間點之測量體重和腫瘤體積。

於本實施例，給予載劑的小鼠之平均腫瘤體積於第22日為6186mm³。腫瘤體積到達1000mm³時開始治療，BCY6136於1mg/kg和ADC於3mg/kg並無顯示明顯之抗腫瘤活性。

BCY6136(TV=233mm³,TGI=115.6%,p<0.001)於3mg/kg可產生顯著之抗腫瘤活性。特定而言，BCY6136可完全根除2/5和4/5之腫瘤。

實施例13 BCY6136於LU-01-0046 NSCLC PDX模式之Balb/c裸鼠之體內治療功效

(a)研究目的

當平均腫瘤體積到達2000mm³時中止，收取腫瘤用於FFPE之組別：組別1於PG-D14，組別5於PG-D18，組別2&6於PG-D21，和組別3&4於PG-D31。

(c)實驗方法和流程

(i)腫瘤接種

各小鼠於右腹皮下接種特定種類之腫瘤片段(~30mm³)，並待其發展。當平均腫瘤體積約為198mm³時開始治療。各組中試驗藥物之給藥和動物數量揭示於下列實驗設計表。

(ii)製備測試藥物配方

給藥配方適時地重新配製。

(iii)收集樣本

當平均腫瘤體積到達2000mm³時中止，最後測量後收取腫瘤用於FFPE之組別：組別1於PG-D14，組別5於PG-D18，組別2&6於PG-D21，和組別3&4於PG-D31。

(d)結果

(i)體重改變和腫瘤生長曲線

圖12揭示體重和腫瘤生長曲線。

(ii)腫瘤體積紀錄

表32揭示帶有LU-01-0046 NSCLC PDX模式之母裸鼠之平均腫瘤體積對應時間。

(iii)腫瘤生長抑制分析

依據PG-D14的腫瘤體積測量，計算測試藥物對於LU-01-0046 PDX模式之Balb/c裸鼠的腫瘤生長抑制率。

a. 平均值±SEM

c. 各組別計算TGI之公式：TGI(%)=[1-(T_i-T₀)/(V_i-V₀)]×100

(e)結果和討論

本實施例評估測試藥物對於LU-01-0251 PDX模式之治療功效。圖12以及表32和33揭示全部治療組別於多個時間點之測量體重和腫瘤體積。

給予載劑之小鼠之平均腫瘤體積於PG-D14達到2307mm³。BCY6136於1mg/kg(TV=1058mm³,TGI=59.1%,p<0.05)、2mg/kg(TV=264mm³,TGI=97.0%,p<0.001)、和3mg/kg(TV=26mm³,TGI=108.3%,p<0.001)可產生劑量依賴之抗腫瘤活性。ADC於3mg/kg和5mg/kg並無顯示明顯之抗腫瘤活性(p>0.05)。

於本實施例，全部組別之動物良好地維持體重。

實施例14 BCY6136、BCY6173、和BCY6175對於LU-01-0046 NSCLC PDX模式之Balb/c裸鼠之體內治療功效

(a)研究目的

本研究之目的係評估測試藥物於LU-01-0046 PDX模式之Balb/c裸鼠之體內抗腫瘤功效。

(b)實驗設計

(c)實驗方法和流程

(i)腫瘤接種

各小鼠於右腹皮下接種LU-01-0046腫瘤片段(~30mm³)，並待其發展。當平均腫瘤體積約為200mm³時開始第一部分研究，當平均腫瘤體積約為192mm³時開始第二部分研究。各組中試驗藥物之給藥和動物數量揭示於下列實驗設計表。

(ii)製備測試藥物配方

(d)結果

(i)體重改變和腫瘤生長曲線

圖13至15揭示體重和腫瘤生長曲線。

(ii)腫瘤體積紀錄

表34和35揭示帶有LU-01-0046之母裸鼠於治療起始後第21日之平均腫瘤體積。

(iii)腫瘤生長抑制分析

依據治療起始後第21日的腫瘤體積測量，計算測試藥物對於LU-01-0046 PDX模式的腫瘤生長抑制率。

a. 平均值±SEM

a. 平均值±SEM

(e)結果和討論

本實施例評估測試藥物對於LU-01-0046 PDX模式之治療功效。圖13至15以及表34至37揭示全部治療組別於多個時間點之測量體重和腫瘤體積。

於第一部分研究，給予載劑之小鼠於治療起始後第21日平均腫瘤體積達到2551mm³。

BCY6136於1/2mg/kg,qw(TV=1285mm³,TGI=53.9%,p<0.001)可產生顯著之抗腫瘤活性，但並無顯示任何腫瘤縮減。BCY6136於3mg/kg,qw(TV=0mm³,TGI=108.5%,p<0.001)可完全根除腫瘤，BCY6136 3mg/kg組別中5腫瘤其中之一顯示停止藥後再生長以及再次給藥後對於BICY6136之抗性。BCY6136組別其餘之腫瘤(各組之4/5)於給藥停止後第80日無顯示再生長。

於第二部分研究，給予載劑之小鼠於治療起始後第21日平均腫瘤體積達到2342mm³。BCY6173於1mg/kg,qw(TV=2151mm³,TGI=8.9%,p>0.05)並無顯示抗腫瘤活性。BCY6173於3mg/kg,qw(TV=890mm³,TGI=67.5%,p<0.05)可產生明顯之抗腫瘤活性。

BCY6175於3mg/kg,qw(TV=0mm³,TGI=108.9%,p<0.001)於第14日可完全根除4/5腫瘤。

實施例15 BCY6136於LU-01-0412 NSCLC PDX模式之Balb/c裸鼠之體內治療功效

(a)研究目的

本研究之目的係評估BCY6136於LU-01-0412 NSCLC PDX模式之Balb/c裸鼠之體內治療功效。

(b)實驗設計

(c)實驗方法和流程

(i)腫瘤接種

各小鼠於右腹皮下接種LU-01-0412之腫瘤片段(~30mm³)，並待其發展。當平均腫瘤體積約為159mm³時開始治療。各組中試驗藥物之給藥和動物數量揭示於下列實驗設計表。

(ii)製備測試藥物配方

(iii)樣本收集

給藥後30分和24小時，收集給予載劑的小鼠和給予BCY6136、BCY8245、和BCY8781的3隻小鼠之血漿。於給藥後24小時，收集給予載劑的小鼠和給予BCY6136、BCY8245、和BCY8781的3隻小鼠之腫瘤。

(d)結果

(i)體重改變和腫瘤生長曲線

圖16揭示體重和腫瘤生長曲線。

(ii)腫瘤體積紀錄

表38揭示帶有LU-01-0412異體移植之母裸鼠之平均腫瘤體積對應時間。

(iii)腫瘤生長抑制分析

依據治療起始後第32日的腫瘤體積測量，計算BCY6136、BCY8245、和BCY8781對於LU-01-0412異體移植模式的腫瘤生長抑制率。

a. 平均值±SEM

(e)結果和討論

本實施例評估BCY6136、BCY8245、和BCY8781對於LU-01-0412異體移植模式之治療功效。圖16以及表38和39揭示全部治療組別於多個時間點之測量體重和腫瘤體積。

給予載劑之小鼠之平均腫瘤體積於治療起始後第32日達到1104mm³。BCY6136於1mg/kg,qw *4(TV=758mm³,TGI=36.7%,p<0.05)和3mg/kg,qw*4(TV=416mm³,TGI=72.9%,p<0.001)可產生劑量依賴之抗腫瘤活性，但並不顯示任何腫瘤縮減。BCY8245於3mg/kg,qw*4(TV=1mm³,TGI=116.8%,p<0.001)和BCY8781於3mg/kg,qw*4(TV=12mm³,TGI=115.6%,p<0.001)可明顯減縮腫瘤。給予BCY8245 3mg/kg的6腫瘤其中5組和給予BCY8781 3mg/kg的6腫瘤其中2組於第32日完全根除。

於本實施例，全部組別之動物良好地維持體重。

實施例16 BCY6136對於LU-01-0486 PDX模式之Balb/c裸鼠之體內治療功效

(a)研究目的

本研究之目的係評估BCY6136於LU-01-0486 PDX模式之Balb/c裸鼠之體內抗腫瘤功效。

(b)實驗設計

(c)實驗方法和流程

(i)腫瘤接種

各小鼠於右腹皮下接種LU-01-0486腫瘤片段(~30mm³)，並待其發展。當平均腫瘤體積約為180mm³時開始治療。各組中試驗藥物之給藥和動物數量揭示於下列實驗設計表。

(ii)製備測試藥物配方

(d)結果

(i)體重改變和腫瘤生長曲線

圖17揭示體重和腫瘤生長曲線。

(ii)腫瘤體積紀錄

表40揭示帶有LU-01-0486異體移植之母裸鼠於治療起始後第14日之平均腫瘤體積。

(iii)腫瘤生長抑制分析

依據治療起始後第14日的腫瘤體積測量，計算BCY6136對於LU-01-0486 PDX模式的腫瘤生長抑制率。

a. 平均值±SEM

(e)結果和討論

本實施例評估BCY6136對於LU-01-0486 PDX模式之治療功效。圖17及表40和41揭示全部治療組別於多個時間點之測量體重和腫瘤體積。

於本實施例，給予載劑之小鼠之平均腫瘤體積於治療起始後第14日達到651mm³。BCY6136於1mg/kg,qw(TV=638mm³,TGI=3.0%,p>0.05)和2mg/kg,qw(TV=645mm³,TGI=1.2%,p>0.05)並無顯示任何抗腫瘤活性。BCY6136於3mg/kg,qw(TV=449mm³,TGI=43.1%,p>0.05)可產生些微抗腫瘤活性，但無統計顯著性。

實施例17 BCY6136對於MDA-MB-231-luc異體移植模式之Balb/c裸鼠之體內抗腫瘤功效

(a)研究目的

本研究之目的係評估BCY6136於MDA-MB-231-luc異體移植模式之Balb/c裸鼠之體內抗腫瘤功效。

(b)實驗設計

(c)實驗方法和流程

(i)細胞培養

收取指數生長期之細胞，並計算用於腫瘤接種。

(ii)腫瘤接種

各小鼠於右腹皮下接種懸浮於含有胞外基質Matrigel之0.1ml PBS之MDA-MB-231-luc腫瘤細胞，並待其發展。當平均腫瘤體積達到159mm³時將36動物隨機分組。各組中試驗藥物之給藥和動物數量揭示於下列實驗設計表。

(iii)製備測試藥物配方

(iv)樣本收集

於PG-D33收集並固定組別2之腫瘤，用於FFPE。

於研究結束後，收集並固定組別3和4之腫瘤，用於FFPE。

(d)結果

(i)體重改變和腫瘤生長曲線

圖18揭示體重和腫瘤生長曲線。

(ii)腫瘤體積紀錄

表42至44揭示帶有MDA-MB-231-luc異體移植之母裸鼠於治療起始後第14日之平均腫瘤體積。

(iii)腫瘤生長抑制分析

依據治療起始後第21日的腫瘤體積測量，計算BCY6136對於MDA-MB-231-luc異體移植模式的腫瘤生長抑制率。

a. 平均值±SEM

(e)結果和討論

本實施例評估BCY6136對於MDA-MB-231-luc異體移植模式之治療功效。圖18及表42至45揭示全部治療組別於多個時間點之測量體重和腫瘤體積。

給予載劑之小鼠之平均腫瘤體積於治療起始後第21日達到1661mm³。BCY6136於1mg/kg(TV=994mm³,TGI=44.4%,p<0.01)顯示中等抗腫瘤活性，BCY6136於2mg/kg(TV=33mm³,TGI=108.4%,p<0.001)和3mg/kg(TV=132mm³,TGI=101.1%,p<0.001)可產生有效的抗腫瘤活性，但腫瘤自第28日顯示明顯的再生長。於本實施例，給予BCY6136 2mg/kg治療的1隻小鼠於治療期間降低15%體重，其他小鼠良好地維持體重。

實施例18 BCY6136對於同源EMT-6模式之BALB/c小鼠之體內治療功效

(a)治療目的

本研究之目的係評估BCY6136於同源EMT-6模式之BALB/c小鼠之體內抗腫瘤功效。

(b)實驗設計

a. 各小鼠注射量為10ml/kg。

b. 組別3和4隻給藥劑量自第14日更改為5mpk和3mpk。

(c)實驗方法和流程

(i)細胞培養

於含有10%熱不活化小牛血清之EMEM培養基、37℃和5%CO₂環境下培養EMT-6單層細胞。每周使用胰蛋白-EDTA處理，繼代培養腫瘤細胞2次。收取指數生長期之細胞，並記數用於腫瘤接種。

(ii)腫瘤接種

各小鼠於右腹皮下接種懸浮於0.1ml PBS之EMT-6腫瘤細胞(5 x 10⁶)，並待其發展。當平均腫瘤體積達到75mm³時將44動物隨機分組。各組中試驗藥物之給藥和動物數量揭示於下列實驗設計表。

(iii)製備測試藥物配方

(iv)樣本收集

於第11日收集備用小鼠之腫瘤用於FACS，數據由生物學團隊提供。

(d)結果

(i)體重改變和腫瘤生長曲線

圖19揭示體重和腫瘤生長曲線。

(ii)腫瘤體積紀錄

表46揭示帶有同源EMT-6之BALB/c母鼠之平均腫瘤體積對應時間。

組別3和組別4的劑量自第14日更改為5mpk和3mpk。

(iii)腫瘤生長抑制分析

依據治療起始後第21日的腫瘤體積測量，計算BCY6136對於同源EMT-6模式的腫瘤生長抑制率。

a. 平均值±SEM

c. 組別3和組別4的劑量自第14日更改為5mpk和3mpk

(e)結果和討論

本實施例評估BCY6136對於同源EMT-6模式之治療功效。圖19及表46和47揭示全部治療組別於多個時間點之測量體重和腫瘤體積。

給予載劑之小鼠之平均腫瘤體積於治療起始後第21日達到1499mm³。BCY6136於3mg/kg,qw(TV=561mm³,TGI=66.2%,p<0.05)顯示明顯之抗腫瘤活性。BCY6136於1/5mg/kg,qw(TV=1272mm³,TGI=16.1%,p>0.05)和 BCY6136於0.3/3mg/kg,qw(TV=1394mm³,TGI=7.4%,p>0.05)並無顯示任何抗腫瘤活性。

組別3和組別4的劑量自第14日更改為5mpk和3mpk。於第14日發現小鼠3-5的腫瘤潰瘍，並給予該小鼠抗生素。於本實施例，全部小鼠良好地維持體重。

實施例19 BCY6136對於NCI-N87異體移植模式之BALB/c裸鼠之體內治療功效

(a)研究目的

本研究之目的係評估BCY6136於NCI-N87異體移植模式之BALB/c裸鼠之體內抗腫瘤功效。

(b)實驗設計

(c)實驗方法和流程

(i)細胞培養

於含有10%熱不活化小牛血清之RPMI-1640培養基、37℃和5%CO₂環境下培養NCI-N87腫瘤細胞。每周繼代培養腫瘤細胞2次。收取指數生長期之細胞，並記數用於腫瘤接種。

(ii)腫瘤接種

各小鼠於右腹皮下接種懸浮於含有胞外基質Matrigel(1：1)的0.2ml PBS之NCI-N87腫瘤細胞(10 x 10⁶)，並待其發展。當平均腫瘤體積達到176 mm³時將動物隨機分組並開始治療。各組中試驗藥物之給藥和動物數量揭示於下列實驗設計表。

(iii)製備測試藥物配方

(d)結果

(i)體重改變和腫瘤生長曲線

圖20揭示體重和腫瘤生長曲線。

(ii)腫瘤體積紀錄

表48揭示帶有NCI-N87異體移植之BALB/c母裸鼠之平均腫瘤體積對應時間。

(iii)腫瘤生長抑制分析

依據治療起始後第30日的腫瘤體積測量，計算BCY6136對於NCI-N87異體移植模式的腫瘤生長抑制率。

a. 平均值±SEM

(e)結果和討論

本實施例評估BCY6136對於NCI-N87模式之治療功效。圖20及表48和49揭示全部治療組別於多個時間點之測量體重和腫瘤體積。

給予載劑之小鼠之平均腫瘤體積於治療起始後第30日達到1465mm³。BCY6136於1mg/kg,qw(TV=425mm³,TGI=80.7%,p<0.001)和2mg/kg,qw(TV=210mm³,TGI=97.4%,p<0.001)可產生顯著之劑量依賴抗腫瘤活性，BCY6136於3mg/kg,qw(TV=201mm³,TGI=98.1%,p<0.001)可產生相當於2mpk BCY6136的抗腫瘤活性。

於本實施例，並無發現全部組別於治療期間有明顯之體重減輕。

實施例20 BCY6136對於SK-OV-3異體移植模式之BALB/c裸鼠之體內抗腫瘤功效

(a)研究目的

本研究之目的係評估BCY6136對於SK-OV-3異體移植模式之BALB/c裸鼠之體內治療功效。

實驗設計

(c)實驗方法和流程

(i)細胞培養

於含有10%熱不活化小牛血清之McCoy^’s 5a培養基、37℃和5%CO₂環境下培養SK-OV-3腫瘤細胞。每周繼代培養腫瘤細胞2次。收取指數生長期之細胞，並記數用於腫瘤接種。

(ii)腫瘤接種

各小鼠於右腹皮下接種懸浮於含有胞外基質Matrigel(1：1)的0.2ml PBS之NCI-N87腫瘤細胞(10 x 10⁶)，並待其發展。當平均腫瘤體積達到186mm³時將動物隨機分組並開始治療。各組中試驗藥物之給藥和動物數量揭示於下列實驗設計表。

(iii)製備測試藥物配方

(d)結果

(i)體重改變和腫瘤生長曲線

圖21揭示體重和腫瘤生長曲線。

(ii)腫瘤體積紀錄

表50揭示帶有SK-OV-3異體移植之BALB/c母裸鼠之平均腫瘤體積對應時間。

(iii)腫瘤生長抑制分析

依據治療起始後第28日的腫瘤體積測量，計算BCY6136對於SK-OV-3異體移植模式的腫瘤生長抑制率。

表51：腫瘤生長抑制分析

a. 平均值±SEM

(e)結果和討論

本實施例評估BCY6136對於SK-OV-3模式之治療功效。圖21及表50和51揭示全部治療組別於多個時間點之測量體重和腫瘤體積。

給予載劑之小鼠之平均腫瘤體積於治療起始後第28日達到1560mm³。ADC於3mg/kg,qw(TV=684mm³,TGI=63.8%,p<0.01)顯示中等之抗腫瘤活性。BCY6136於1mg/kg,qw(TV=1035mm³,TGI=38.1%,p>0.05)並無顯示明顯之抗腫瘤活性。BCY6136於2mg/kg,qw(TV=277mm³,TGI=93.3%,p<0.001)和3mg/kg,qw(TV=254mm³,TGI=95.0%,p<0.001)可產生顯著之抗腫瘤活性。

實施例21 BCY6136對於OE21異體移植模式之BALB/c裸鼠之體內治療功效

(a)研究目的

本研究之目的係評估BCY6136對於OE21異體移植模式之BALB/c裸鼠之體內抗腫瘤功效。

(b)實驗設計

(c)實驗方法和流程

(i)細胞培養

於含有10%熱不活化小牛血清之RPMI-1640培養基、37℃和5%CO₂環境下培養OE21腫瘤細胞。每周繼代培養腫瘤細胞2次。收取指數生長期之細胞，並記數用於腫瘤接種。

(ii)腫瘤接種

各小鼠於右腹皮下接種懸浮於含有胞外基質Matrigel(1：1)的0.2ml PBS之OE21腫瘤細胞(5 x 10⁶)，並待其發展。當平均腫瘤體積達到157mm³時將動物隨機分組並開始治療。各組中試驗藥物之給藥和動物數量揭示於下列實驗設計表。

(iii)製備測試藥物配方

(d)結果

(i)體重改變和腫瘤生長曲線

圖22揭示體重和腫瘤生長曲線。

(ii)腫瘤體積紀錄

表52揭示帶有OE21異體移植之BALB/c母裸鼠之平均腫瘤體積對應時間。

(iii)腫瘤生長抑制分析

依據治療起始後第23日的腫瘤體積測量，計算BCY6136對於OE21異體移植模式的腫瘤生長抑制率。

a. 平均值±SEM

(e)結果和討論

本實施例評估BCY6136對於OE21模式之治療功效。圖22及表52和53揭示全部治療組別於多個時間點之測量體重和腫瘤體積。

給予載劑之小鼠之平均腫瘤體積於治療起始後第23日達到1586mm³。BCY6136於1mg/kg,qw(TV=1155mm³,TGI=30.4% p<0.05)顯示些微之抗腫瘤活性。BCY6136於2mg/kg,qw(TV=537mm³,TGI=73.4%,p<0.001)和3mg/kg,qw(TV=489mm³,TGI=76.7%,p<0.001)可產生顯著之抗腫瘤活性。

實施例22 BCY6136對於MOLP-8異體移植模式之CB17-SCID小鼠之體內治療功效

(a)研究目的

本研究之目的係評估BCY6136對於MOLP-8異體移植模式之CB17-SCID小鼠之體內抗腫瘤功效

(b)實驗設計

(c)實驗方法和流程

(i)細胞培養

於含有20%熱不活化小牛血清之RPMI-1640培養基、37℃和5%CO₂環境下培養單層MOLP-8腫瘤細胞。每周使用胰蛋白-EDTA處理，繼代培養腫瘤細胞2次。收取指數生長期之細胞，並記數用於腫瘤接種。

(ii)腫瘤接種

各小鼠於右腹皮下接種懸浮於含有50%胞外基質Matrigel的0.2ml PBS之MOLP-8腫瘤細胞(10 x 10⁶)，並待其發展。當平均腫瘤體積達到141mm³時將36動物隨機分組。各組中試驗藥物之給藥和動物數量揭示於下列實驗設計表。

(iii)製備測試藥物配方

(d)結果

(i)體重改變和腫瘤生長曲線

圖23揭示體重和腫瘤生長曲線。

(ii)腫瘤體積紀錄

表54揭示帶有MOLP-8異體移植之CB17-SCID母鼠之平均腫瘤體積對應時間。

(iii)腫瘤生長抑制分析

依據治療起始後第14日的腫瘤體積測量，計算BCY6136對於MOLP-8異體移植模式的腫瘤生長抑制率。

a. 平均值±SEM

(e)結果和討論

本實施例評估BCY6136對於MOLP-8異體移植模式之治療功效。圖23及表54和55揭示全部治療組別於多個時間點之測量體重和腫瘤體積。

給予載劑之小鼠之平均腫瘤體積於治療起始後第14日達到2528mm³。BCY6136於1mg/kg(TV=1146mm³,TGI=45.5%,p>0.05)、2mg/kg(TV=1218mm³,TGI=54.9%,p<0.05)、和3mg/kg(TV=938mm³,TGI=66.7%,p<0.01)可產生劑量依賴之抗腫瘤活性，但全部給藥劑量對於MOLP-8異體移植並不產生縮減腫瘤的功效。於本實施例，全部小鼠良好地維持體重。

實施例23 多種BCY對於HT1080異體移植模式之BALB/c裸鼠之體內治療功效

(a)研究目的

本研究之目的係評估多種BCY對於HT1080異體移植模式之BALB/c裸鼠之體內治療功效

(b)實驗設計

n：動物數量；給藥體積：依據體重10μl/g調整之給藥體積

(c)實驗方法和流程

(i)細胞培養

於含有10%熱不活化小牛血清之培養基、37℃和5%CO₂環境下培養HT1080腫瘤細胞。每周繼代培養腫瘤細胞2次。收取指數生長期之細胞，並記數用於腫瘤接種。

(ii)腫瘤接種

各小鼠於右腹皮下接種HT1080腫瘤細胞(5 x 10⁶)，並待其發展。當平均腫瘤體積達到150-200mm³時將動物隨機分組並開始治療。各組中試驗藥物之給藥和動物數量揭示於下列實驗設計表。

(iii)製備測試藥物配方

(d)結果

(i)體重改變和腫瘤生長曲線

圖24至29揭示體重和腫瘤生長曲線。

(ii)腫瘤體積紀錄

表56揭示帶有HT1080異體移植之Balb/c母裸鼠之平均腫瘤體積對應時間。

(iii)腫瘤生長抑制分析

依據治療起始後第14日的腫瘤體積測量，計算多種BCY對於HT1080異體移植模式的腫瘤生長抑制率。

a. 平均值±SEM

(e)結果和討論

本實施例評估多種BCY對於HT1080異體移植模式之治療功效。圖24至29及表56和57揭示全部治療組別於多個時間點之測量體重和腫瘤體積。

給予載劑之小鼠之平均腫瘤體積於治療起始後第14日達到1737mm³。

BCY6173於1mg/kg,qw(TV=1074mm³,TGI=42.5%,p>0.05)、2mg/kg,qw(TV=480mm³,TGI=80.6%,p<0.05)、和3mg/kg,qw(TV=7mm³,TGI=108.4%,p<0.01)可產生劑量依賴之抗腫瘤活性。

BCY6135於1mg/kg,qw(TV=871mm³,TGI=55.5%,p<0.01)、2mg/kg,qw(TV=62mm³,TGI=107.5%,p<0.001)、和3mg/kg,qw(TV=44mm³,TGI=108.6%,p<0.001)可產生劑量依賴之抗腫瘤活性。

BCY6136於2mg/kg,qw(TV=345mm³,TGI=95.7%,p<0.001)、3mg/kg,qw(TV=3mm³,TGI=111.2%,p<0.001)、和5mg/kg,qw(TV=2mm³,TGI=111.3%,p<0.001)顯示有效之抗腫瘤活性。

BCY6174於1mg/kg,qw(TV=1066mm³,TGI=43.1%,p<0.05)、2mg/kg,qw(TV=532mm³,TGI=77.3%,p<0.01)、和3mg/kg,qw(TV=11mm³,TGI=110.7%,p<0.001)可產生劑量依賴之抗腫瘤活性。

BCY6175於1mg/kg,qw(TV=769mm³,TGI=62.1%,p<0.01)、2mg/kg,qw(TV=295mm³,TGI=92.5%,p<0.001)、和3mg/kg,qw(TV=11mm³,TGI=110.8%,p<0.001)可產生劑量依賴之抗腫瘤活性。

ADC於3mg/kg,qw(TV=0mm³,TGI=111.5%)於第14日可完全根除腫瘤。

<110> 英商拜西可泰克斯有限公司BICYCLETX LIMITED

<120> EPHA2特用之雙環胜肽配位基

<140> 107144453

<141> 2018/12/11

<150> GB1721259.8

<151> 2017-12-19

<150> GB1804102.0

<151> 2018-03-14

<150> GB1818603.1

<151> 2018-11-14

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成胜肽

<220>

<221> Xaa

<222> (2)..(2)

<223> X表示HyP

<220>

<221> Xaa

<222> (12)..(12)

<223> Xaa表示D-Asp

<220>

<221> Xaa

<222> (14)..(14)

<223> Xaa表示HArg

<400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成胜肽

<220>

<221> Xaa

<222> (1)..(1)

<223> Xaa表示Beta-Ala

<220>

<221> Xaa

<222> (2)..(2)

<223> Xaa表示Sar10

<220>

<221> Xaa

<222> (4)..(4)

<223> Xaa表示HArg

<220>

<221> Xaa

<222> (7)..(7)

<223> Xaa表示HyP

<220>

<221> Xaa

<222> (17)..(17)

<223> Xaa表示D-Asp

<220>

<221> Xaa

<222> (19)..(19)

<223> Xaa表示HArg

<400> 2

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工連接子

<220>

<221> Xaa

<222> (3)..(3)

<223> Xaa表示Cit

<220>

<221> Xaa

<222> (5)..(5)

<223> Xaa表示hPhe

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成胜肽

<220>

<221> Xaa

<222> (1)..(1)

<223> Xaa表示FI

<220>

<221> Xaa

<222> (3)..(3)

<223> Xaa表示Sar5

<400> 4

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成胜肽

<220>

<221> Xaa

<222> (1)..(1)

<223> Xaa表示FI

<220>

<221> Xaa

<222> (3)..(3)

<223> Xaa表示Sar5

<400> 5

<210> 6

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成胜肽

<220>

<221> Xaa

<222> (1)..(1)

<223> Xaa表示FI

<220>

<221> Xaa

<222> (3)..(3)

<223> Xaa表示Sar5

<400> 6

Claims

一種EphA2特用之胜肽配體，包括：一多肽，包括至少三半胱胺酸殘基，以至少二環狀序列分離；以及一非芳香性分子支架，與該多肽之半胱胺酸殘基形成共價鍵，使該至少二多肽環形成於該分子支架上，其中該分子支架係1,1',1"-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)；其中該胜肽配體包括胺基酸序列：C_i(HyP)LVNPLC_iiLHP(D-Asp)W(HArg)C_iii(SEQ ID NO：1)；其中HyP係羥補胺酸，HArg係高精胺酸，以及C_i、C_ii、和C_iii分別表示第一、第二、和第三半胱胺酸殘基，或其藥學上可接受之鹽類。
如請求項1所述之胜肽配體或其藥學上可接受之鹽類，其中該胜肽配體包括胺基酸序列：(β-Ala)-Sar₁₀-A(HArg)D-C_i(HyP)LVNPLC_iiLHP(D-Asp)W(HArg)C_iii(SEQ ID NO：2)；其中Sar係肌胺酸，HArg係高精胺酸，以及HyP係羥補胺酸。
如請求項1所述之胜肽配體或其藥學上可接受之鹽類，其中該藥學上可接受之鹽類係選自游離酸或鈉、鉀、鈣、胺鹽。
如請求項1所述之胜肽配體或其藥學上可接受之鹽類，其中該EphA2係人類EphA2。
一種包括請求項1至4其中之一所述之胜肽配體或其藥學上可接受之鹽類之藥物接合物，接合一或多效應物和/或官能基團。
如請求項5所述之藥物接合物，其中該一或多官能基團為一胞殺劑。
如請求項6所述之藥物接合物，其中該胞殺劑係DM1或MMAE。
如請求項7所述之藥物接合物，其中該胞殺劑係MMAE。
如請求項5至8其中任一項所述之藥物接合物，其中另包括一連接子，位於該胜肽配體或其藥學上可接受之鹽類和該胞殺劑之間。
如請求項9所述之藥物接合物，其中該胞殺劑係MMAE，以及該連接子係選自-Val-Cit-、-Trp-Cit-、-Val-Lys-、-D-Trp-Cit-、-Ala-Ala-Asn-、D-Ala-Phe-Lys-、或-Glu-Pro-Cit-Gly-hPhe-Tyr-Leu-(SEQ ID NO：3)。
如請求項10所述之藥物接合物，其中該胞殺劑係MMAE，以及該連接子係-Val-Cit-。
如請求項9所述之藥物接合物，其中該胞殺劑係DM1，以及該連接子係選自-S-S-、-SS(SO₃H)-、-SS-(Me)-、-(Me)-SS-(Me)-、-SS-(Me₂)-、或-SS-(Me)-SO₃H-。
如請求項12所述之藥物接合物，其中該胞殺劑係DM1，以及該連接子係選自-S-S-和-SS(SO₃H)-。
如請求項5所述之藥物接合物，係選自BCY6027、BCY6028、BCY6135、BCY6136、BCY6173、BCY6174、和BCY6175其中任一者，其中，BCY6027為：
其中，雙環為BCY6099，BCY6028為：
其中，雙環為BCY6099，BCY6135為：
BCY6136為：
BCY6173為：
BCY6174為：
BCY6175為：
其中，BCY6099為(β-Ala)-Sar₁₀-A(HArg)D-C_i(HyP)LVNPLC_iiLHP(D-Asp)W(HArg)C_iii(SEQ ID NO：2)。
如請求項14所述之藥物接合物，係選自BCY6135、BCY6136、BCY6173、BCY6174、和BCY6175其中任一者。
如請求項14或15所述之藥物接合物，係BCY6136。
一種醫藥組合物，包括：請求項1至4其中任一項所述之胜肽配體或其藥學上可接受之鹽類，或請求項5至16其中任一項所述之藥物接合物，以及一或多藥學上可接受之賦形劑。
一種如請求項5至16其中任一項所述之藥物接合物在製備用於預防、抑制、或治療罹病組織過度表現EphA2之疾病或病症的藥物之用途。
一種如請求項5至16其中任一項所述之藥物接合物在製備用於預防、抑制、或治療癌症的藥物之用途。
如請求項19所述之用途，其中該癌症係選自前列腺癌、肺癌、乳癌、胃癌、卵巢癌、食道癌、多發性骨髓瘤、和纖維肉瘤。
如請求項20所述之用途，其中該肺癌為非小細胞肺癌(NSCLC)。
如請求項20所述之用途，其中該乳癌為三陰性乳癌。