ES3022264T3

ES3022264T3 - Prevention of disulfide bond reduction during recombinant production of polypeptides

Info

Publication number: ES3022264T3
Application number: ES24160370T
Authority: ES
Inventors: Yung-Hsiang Kao; Michael W Laird; Melody Trexler Schmidt; Rita L Wong; Daniel P Hewitt
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2007-07-09
Filing date: 2008-07-08
Publication date: 2025-05-28
Anticipated expiration: 2028-07-08
Also published as: ES2659829T3; US11987638B1; SI4365189T1; JP2020105180A; US11639395B2; EP4365189A2; US12173080B1; US20130017598A1; US20240301080A1; EP4245766A3; EP3597659B1; CA3113365A1; HRP20230461T3; KR101851580B1; US20230383004A1; KR20160105539A; EP4245766A9; US11987637B1; TW201713679A; AU2008275229B2

Abstract

La invención se refiere a métodos y medios para prevenir la reducción de enlaces disulfuro durante la producción recombinante de polipéptidos que contienen disulfuro. En particular, la invención se refiere a la prevención de la reducción de enlaces disulfuro durante la recolección de polipéptidos que contienen disulfuro, incluyendo anticuerpos, a partir de cultivos de células huésped recombinantes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Prevención de la reducción de enlaces disulfuro durante la producción recombinante de polipéptidos

Campo de la invención

La invención se refiere a procedimientos para prevenir la reducción de enlaces disulfuro durante la producción recombinante de polipéptidos que contienen disulfuro como se expone en las reivindicaciones.

Antecedentes de la invención

En la industria de la biotecnología, las aplicaciones farmacéuticas requieren una variedad de proteínas producidas usando técnicas de ADN recombinante. En general, se producen proteínas recombinantes por cultivo celular, usando células eucariotas, tales como células de mamífero, o bien células procariotas, tales como células bacterianas, genomanipuladas para producir la proteína de interés por inserción de un plásmido recombinante que contiene el ácido nucleico que codifica la proteína deseada. Para que una proteína permanezca biológicamente activa, la conformación de la proteína, incluyendo su estructura terciaria, se debe mantener durante su purificación y aislamiento, y los múltiples grupos funcionales de la proteína se deben proteger de la degradación.

Las células de mamífero se han convertido en el sistema dominante para la producción de proteínas de mamífero para aplicaciones clínicas, principalmente debido a su capacidad de producir proteínas heterólogas plegadas y ensambladas apropiadamente, y a su capacidad de modificaciones postraduccionales. Las células de ovario de hámster chino (CHO) y las líneas celulares obtenidas a partir de diversas otras fuentes de mamífero, tales como, por ejemplo, células de mieloma de ratón (NS0), de riñón de cría de hámster (BHK), de riñón embrionario humano (HEK-293) y de la retina humana, tales como la línea celular PER.C6® aislada de una célula de la retina humana, que proporciona características de glucosilación humana y puede producir de forma natural anticuerpos que coincidan con la fisiología humana, se han aprobado por las autoridades sanitarias para la producción de productos biofarmacéuticos.

Normalmente, para empezar el ciclo de producción, se deja que un pequeño número de células huésped recombinantes transformadas crezcan en cultivo durante varios días (véase, por ejemplo, la figura 23). Una vez que las células se han sometido a varias tandas de replicación, se transfieren a un recipiente más grande donde se preparan para someterse a fermentación. Los medios en los que se cultivan las células y los niveles de oxígeno, nitrógeno y dióxido de carbono que existen durante el ciclo de producción pueden tener un impacto significativo sobre el procedimiento de producción. Se determinan específicamente parámetros de crecimiento para cada línea celular y estos parámetros se miden con frecuencia para garantizar las condiciones óptimas de crecimiento y producción.

Cuando las células crecen en números suficientes, se transfieren a depósitos de producción a gran escala y se cultivan durante un periodo de tiempo más largo. En este punto en el procedimiento, se puede obtener la proteína recombinante. Típicamente, se genomanipulan las células para que secreten el polipéptido en los medios de cultivo celular, por lo que la primera etapa en el procedimiento de purificación es separar las células de los medios. Típicamente, la obtención incluye la centrifugación y filtración para producir un caldo de cultivo celular obtenido (HCCF). A continuación, se somete el medio a varias etapas de purificación adicionales que retiran cualquier resto celular, proteínas no deseadas, sales, minerales u otros elementos indeseables. Al final del procedimiento de purificación, la proteína recombinante es altamente pura y es adecuada para su uso terapéutico humano.

Aunque este procedimiento ha sido la materia de mucho estudio y mejoras durante las últimas décadas, la producción de proteínas recombinantes todavía no está exenta de dificultades. Por tanto, por ejemplo, durante la producción recombinante de polipéptidos que comprenden enlaces disulfuro, especialmente polipéptidos multicatenarios que comprenden enlaces disulfuro intercatenarios, tales como anticuerpos, es esencial proteger y retener los enlaces disulfuro en todo el procedimiento de fabricación, recuperación y purificación, para producir polipéptidos plegados apropiadamente con la actividad biológica requerida.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere, en general, a un procedimiento para prevenir la reducción de enlaces disulfuro en polipéptidos expresados en células huésped recombinantes, como se define en las reivindicaciones.

En un modo de realización, el inhibidor de tiorredoxina se añade al caldo de cultivo previo a la obtención.

En otro modo de realización, el inhibidor de tiorredoxina se añade al caldo de cultivo obtenido.

En otro modo de realización, el inhibidor de tiorredoxina es un inhibidor directo de tiorredoxina.

En todos los modos de realización, el inhibidor de tiorredoxina puede ser, por ejemplo, un disulfuro de alquil-2-imidazolilo o un derivado de naftoquinona-espirocetal.

En otro modo de realización, el inhibidor de tiorredoxina es un inhibidor específico de tiorredoxina reductasa.

Todavía en otro modo de realización, el inhibidor de tiorredoxina es un complejo de oro, donde el complejo de oro, por ejemplo, puede ser aurotioglucosa (ATG) o aurotiomalato (ATM). Aunque la concentración inhibidora eficaz puede variar, típicamente está entre aproximadamente 0,1 mM y 1 mM. De forma similar, la concentración inhibidora eficaz mínima varía dependiendo de la naturaleza del polipéptido y de las circunstancias globales, y típicamente se alcanza cuando la concentración de ATG o ATG sea al menos aproximadamente cuatro veces la concentración de tiorredoxina en el caldo de cultivo previo a la obtención u obtenido.

En otro modo de realización de este aspecto de la invención, el inhibidor de tiorredoxina es sulfato cúprico, añadido en una concentración de entre aproximadamente 5|jM y aproximadamente 100|jM, o de entre aproximadamente 10 j M y aproximadamente 80 j M, o de entre aproximadamente 15 j M y aproximadamente 50 j M.

En un modo de realización diferente, el inhibidor de tiorredoxina es un inhibidor de G6PD, que es piridoxal-5'-fosfato, 1-fluoro-2,4 dinitrobenceno, deshidroepiandrosterona (DHEA) o epiandrosterona (EA). Las típicas concentraciones de inhibidor eficaces de DHEA están entre aproximadamente 0,05 mM y aproximadamente 5 mM, o entre aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 2,5 mM.

En otro modo de realización, el inhibidor de tiorredoxina es un inhibidor de la actividad de hexocinasa, que es ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) añadido en una concentración de entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 20 mM y aproximadamente 40 mM.

En otros modos de realización preferentes, el inhibidor de la actividad de hexocinasa se selecciona del grupo que consiste en sorbosa-1-fosfato, polifosfatos, 6-desoxi-6-fluoroglucosa, 2-C-hidroxi-metilglucosa, xilosa y lixosa.

Todavía en otro modo de realización, el inhibidor de tiorredoxina es un anticuerpo que se une específicamente a una tiorredoxina reductasa.

En otro modo de realización, el inhibidor de tiorredoxina es una medida que da como resultado indirectamente la inhibición de la actividad de tiorredoxina. La invención incluye la inyección de aire en el caldo de cultivo obtenido de las células huésped recombinantes.

En diversos modos de realización, la inyección de aire se puede combinar con el uso de inhibidores directos de tiorredoxina, tales como los enumerados anteriormente.

En todos los modos de realización, los polipéptidos son anticuerpos monoclonales terapéuticos que se unen a HER2.

Los anticuerpos frente a HER2, por ejemplo, pueden comprender una secuencia de dominio variable de la cadena pesada y/o ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16, 17, 18 y 19.

En todos los modos de realización, las células huésped recombinantes son células huésped eucariotas, tales como células huésped de mamífero, incluyendo, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO).

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Experimento de diálisis:formación de imágenes similar a gel digital obtenida a partir del análisis con Bioanalyzer (representando cada carril un punto de tiempo) que demuestra que ocrelizumab (rhuMAb 2H7 -variante A) en el interior de la bolsa de diálisis permaneció intacto durante el periodo de incubación.

Figura 2. Experimento de diálisis:formación de imágenes similar a gel digital obtenida a partir del análisis con Bioanalyzer (representando cada carril un punto de tiempo) que muestra que ocrelizumab en el exterior de la bolsa de diálisis se redujo durante el periodo de incubación. Esto se evidencia por la pérdida de anticuerpo intacto (~ 150 kDa) y la formación de fragmentos de anticuerpo representados en la figura. En el punto de tiempo de 48 horas (carril 7), el anticuerpo reducido parecía estar reoxidado, supuestamente como resultado de la pérdida de actividad de reducción en el caldo de cultivo celular obtenido (HCCF). La banda que aparece justo por encima del marcador de 28 kDa surgió de la cadena ligera del anticuerpo. Existía una cantidad significativa de cadena libre ya presente en el HCCF antes de que comenzara la incubación. La presencia de cadena ligera libre en exceso y dímeros de cadena ligera en el HCCF es típica de la línea celular que produce ocrelizumab.

Figura 3. Niveles de tiol libre del experimento de diálisis:ocrelizumab purificado en solución salina tamponada con fosfato (PBS) estaba en el interior de la bolsa de diálisis y el HCCF que contenía ocrelizumab estaba en el exterior de la bolsa. Los tioles libres en el interior (recuadros) y en el exterior (rombos) de la bolsa de diálisis alcanzaron niveles comparables en unas pocas horas, lo que indica un buen intercambio de componentes de molécula pequeña en el HCCF entre el interior y el exterior de la bolsa de diálisis.

Figura 4. Sistema de tiorredoxina y otras reacciones implicados en la reducción de anticuerpos:el sistema de tiorredoxina, que comprende tiorredoxina (Trx), tiorredoxina reductasa (TrxR) y NADPH, funciona como un sistema donante de hidrógeno para la reducción de enlaces disulfuro en proteínas. Trx es una proteína monomérica pequeña con un motivo en sitio activo CXXC que cataliza muchas reacciones rédox a través del intercambio tiol-disulfuro. La Trx oxidada se puede reducir por NADPH por medio de la TrxR. La Trx reducida, a continuación, puede catalizar la reducción de disulfuros en proteínas. La NADPH requerida para el sistema de tiorredoxina se proporciona por medio de reacciones en la vía de la pentosa fosfato y glucólisis.

Figura 5. Actividadin v itrodel sistema de tiorredoxina:imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer (representando cada carril un punto de tiempo) que demuestra que la incubación de ocrelizumab intacto (1 mg/ml) con TrxR 0,1 mM (hígado de rata), Trx 5 mM (humana) y NADPH 1 mM en PBS dio como resultado la reducción completa de ocrelizumab; ocrelizumab se redujo completamente en menos de 21 horas.

Figura 6. Actividadin vitrodel sistema de tiorredoxina inhibida por aurotioglucosa:la adición de aurotioglucosa (ATG) a la misma mezcla de reacción como se describe en la leyenda de la figura 5, anteriormente, inhibió eficazmente la reducción de ocrelizumab. Esto se observa en la imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer (representando cada carril un punto de tiempo).

Figura 7. Actividadin vitrodel sistema de tiorredoxina inhibida por aurotiomalato:la adición de aurotiomalato (ATM) a una concentración de 1 mM a la misma mezcla de reacción como se describe en la leyenda de la figura 5, anteriormente, inhibió eficazmente la reducción de ocrelizumab. Esto se observa en la imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer (representando cada carril un punto de tiempo).

Figura 8. Actividadin v itrodel sistema de tiorredoxina:imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer (representando cada carril un punto de tiempo) que muestra que la incubación de ocrelizumab intacto (1 mg/ml) con TrxR 0,1 mM (hígado de rata), Trx 5 mM (humana) y NADPH 1 mM en tampón de sulfato de histidina 10 mM dio como resultado la reducción de ocrelizumab en menos de 1 hora.

Figura 9. Actividadin vitrodel sistema de tiorredoxina inhibida por CuSO4:la adición de CuSO4 a una concentración de 50 |<j>M a la misma mezcla de reacción como se describe en la leyenda de la figura 8 inhibió eficazmente la reducción de ocrelizumab como se muestra en la imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer (representando cada carril un punto de tiempo).

Figura 10. Reducción de ocrelizumab:imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer (representando cada carril un punto de tiempo) que muestra que ocrelizumab se redujo en un experimento de incubación usando HCCF de un CCF homogeneizado generado a partir de un fermentador de 3 l.

Figura 11. Inhibición de la reducción de ocrelizumab en HCCF por aurotioglucosa:imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer (representando cada carril un punto de tiempo) que muestra que la adición de aurotioglucosa 1 mM al mismo HCCF que se usa para el experimento de incubación como se muestra en la figura 10 inhibió la reducción de ocrelizumab.

Figura 12. Inhibición de la reducción de ocrelizumab en HCCF por aurotiomalato:imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer (representando cada carril un punto de tiempo) que indica que la adición de aurotiomalato 1 mM al mismo HCCF que se usa para el experimento de incubación mostrado en la figura 10 inhibió la reducción de ocrelizumab.

Figura 13. Pérdida de actividad de reducción en HCCF:el HCCF de una de las tandas de fabricación a gran escala para ocrelizumab (la tanda "beta") que se sometió a varios ciclos de congelación/descongelación no demostró ninguna reducción de ocrelizumab cuando al usarse en un experimento de incubación. Esto se mostró por el análisis con Bioanalyzer (representando cada carril un punto de tiempo), y se puede contrastar con la reducción de anticuerpos observada previamente en el HCCF recién descongelado del mismo lote de fermentación.

Figura 14. La actividad de reducción perdida en HCCF restablecida por adición de NADPH:la reducción de ocrelizumab se observó de nuevo en el ensayo con Bioanalyzer (representando cada carril un punto de tiempo) después de la adición de NADPH a una concentración de 5 mM en el HCCF donde la actividad de reducción se ha eliminado en las condiciones descritas anteriormente en la figura 13.

Figura 15. La actividad de reducción perdida en HCCF restablecida por adición de glucosa-6-fosfato:la reducción de ocrelizumab se observó de nuevo en el ensayo con Bioanalyzer (representando cada carril un punto de tiempo) después de la adición de G6P a una concentración de 10 mM en el HCCF donde la actividad de reducción se ha eliminado debido al tratamiento descrito anteriormente en la figura 13.

Figura 16. Reducción de ocrelizumab:una imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer que muestra que ocrelizumab se redujo en un experimento de incubación usando un HCCF de una tanda de fabricación a gran escala (la tanda "alfa").

Figura 17. EDTA inhibe la reducción de ocrelizumab:imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer (representando cada carril un punto de tiempo) que muestra que se inhibió la reducción de ocrelizumab en un experimento de incubación usando un HCCF de la tanda alfa con EDTA añadido a una concentración de 20 mM al HCCF, demostrándose su actividad reductora en la figura 16.

Figura 18. La actividad de reducción perdida en el HCCF de la "tanda beta" restablecida por adición de glucosa-6-fosfato, pero sin ninguna inhibición de la reducción por EDTA:la reducción de ocrelizumab se observó en el ensayo con Bioanalyzer (representando cada carril un punto de tiempo) después de la adición de G6P a una concentración de 5 mM y EDTA 20 mM en el HCCF, habiéndose perdido su actividad de reducción (véase la figura 13). A diferencia de los resultados mostrados en la figura 17, la presencia de EDTA no bloqueó la reducción de ocrelizumab.

Figura 19. Inhibición de la reducción de ocrelizumab: por (i) adición de EDTA, (ii) adición de CuSO4 o (iii) ajuste del pH a 5,5.Los tres procedimientos diferentes, (1) adición de EDTA, (2) adición de CuSO4 y (3) ajuste del pH a 5,5, usados independientemente, fueron eficaces en la inhibición de la reducción de ocrelizumab. Esto se demostró por los resultados del Bioanalyzer cuantitativos representados que mostraron que casi un 100 % del anticuerpo intacto (150 kDa) permanecía en los grupos de elución de proteína A. Por el contrario, ocrelizumab se redujo completamente en el HCCF de control después de 20 horas de tiempo de espera en HCCF.

Figura 20. Inhibición de la reducción de ocrelizumab por inyección de aire:la inyección de aire en el HCCF fue eficaz en la inhibición de la reducción de enlaces disulfuro de ocrelizumab. Esto se demostró por los resultados del Bioanalyzer cuantitativos que mostraron que casi un 100 % del anticuerpo intacto (150 kDa) permanecía en los grupos de elución de proteína A. Por el contrario, ocrelizumab se redujo casi completamente en el HCCF de control después de 5 horas de inyección de nitrógeno.

Lafigura 21muestra la secuencia de aminoácidos de V<l>(SEQ ID NO. 24) de un anticuerpo anti-Her2 (trastuzumab).

Lafigura 22muestra la secuencia de aminoácidos de V<h>(SEQ ID NO. 25) de un anticuerpo anti-Her2 (trastuzumab).

Lafigura 23es un esquema que muestra algunas etapas de un procedimiento de fabricación a gran escala típico.

Lafigura 24es una imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer: 2H7 (variante A) NADPH 1 mM tiorredoxina 5 |<j>M tiorredoxina reductasa 0,1 |<j>M (recombinante) en sulfato de histidi na 10 mM.

Lafigura 25es una imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer: 2H7 (variante A) NADPH 1 mM tiorredoxina 5<j>M tiorredoxina reductasa 0,1<j>M (recombinante) en sulfato de histidina 1 mM ATG 1 mM.

Lafigura 26es una imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer: 2H7 (variante A) NADPH 1 mM tiorredoxina 5 j M tiorredoxina reductasa 0,1 j M (recombinante) en sulfato de histidina 10 mM ATG 0,6 j M (6:1 ATG:TrxR).

Lafigura 27es una imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer: 2H7 (variante A) NADPH 1 mM tiorredoxina 5 j M tiorredoxina reductasa 0,1 j M (recombinante) en sulfato de histidina 10 mM ATG 0,4 j M (4:1 ATG:TrxR).

Lafigura 28es una imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer: 2H7 (variante A) NADPH 1 mM tiorredoxina 5<j>M tiorredoxina reductasa 0,1<j>M (recombinante) en sulfato de histidina 10 mM ATG 0,2 j M (2:1 ATG:TrxR).

Lafigura 29es una imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer: 2H7 (variante A) NADPH 1 mM tiorredoxina 5 j M tiorredoxina reductasa 0,1 j M (recombinante) en sulfato de histidina 10 mM aurotiomalato (ATM) 0,1 mM.

Lafigura 30es una imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer: 2H7 (variante A) NADPH 1 mM tiorredoxina 5 j M tiorredoxina reductasa 0,1 j M (recombinante) en sulfato de histidina 10 mM aurotiomalato (ATM) 0,01 mM.

Lafigura 31es una imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer: 2H7 (variante A) NADPH 1 mM tiorredoxina 5<j>M tiorredoxina reductasa 0,1<j>M (recombinante) en sulfato de histidina 10 mM CuSO4 20|jM(4:1 Cu2+:Trx).

Lafigura 32es una imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer: 2H7 (variante A) NADPH 1 mM tiorredoxina 5j M+ tiorredoxina reductasa 0,1j M(recombinante) en sulfato de histidina 10 mM CuSO410j M(2:1 Cu2+:Trx).

Lafigura 33es una imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer: 2H7 (variante A) NADPH 1 mM tiorredoxina 5j M+ tiorredoxina reductasa 0,1j M(recombinante) en sulfato de histidina 10 mM CuSO45j M(1:1 Cu2+:Trx).

Lafigura 34es una imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer: 2H7 (variante A) NADPH 1 mM tiorredoxina 5j M+ tiorredoxina reductasa 0,1j M(recombinante) en sulfato de histidina 10 mM cistamina 532j M(20:1 cistamina:disulfuro en 2H7).

Lafigura 35es una imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer: 2H7 (variante A) NADPH 1 mM tiorredoxina 5j M+ tiorredoxina reductasa 0,1j M(recombinante) en sulfato de histidina 10 mM cistamina 266j M(10:1 cistamina:disulfuro en 2H7).

Lafigura 36es una imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer: 2H7 (variante A) NADPH 1 mM tiorredoxina 5j M+ tiorredoxina reductasa 0,1j M(recombinante) en sulfato de histidina 10 mM cistamina 133j M(5:1 cistamina:disulfuro en 2H7).

Lafigura 37es una imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer: 2H7 (variante A) NADPH 1 mM tiorredoxina 5j M+ tiorredoxina reductasa 0,1j M(recombinante) en sulfato de histidina 10 mM cistamina 26,6j M(1:1 cistamina:disulfuro en 2H7).

Lafigura 38es una imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer: 2H7 (variante A) NADPH 1 mM tiorredoxina 5j M+ tiorredoxina reductasa 0,1j M(recombinante) en sulfato de histidina 10 mM (pH=7,6) cistina 2,6 mM.

Lafigura 39es una imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer: 2H7 (variante A) NADPH 1 mM tiorredoxina 5j M+ tiorredoxina reductasa 0,1j M(recombinante) en sulfato de histidina 10 mM GSSG 2,6 mM (glutatión oxidado).

Figura 40. Sistema de reducción enzimática reconstruido. 1 mg/ml de 2H7 (variante A) 10 jg/m l de hexocinasa, 50 jg/m l de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, tiorredoxina 5j M,tiorredoxina reductasa 0,1j M,glucosa 2 mM, ATP 0,6 mM, Mg2+2 mM y NADP 2 mM en tampón de sulfato de histidina 50 mM a pH=7,38.

Figura 41. El sistema de tiorredoxina requiere NADPH. 1 mg/ml de 2H7 (variante A) tiorredoxina 5j M,tiorredoxina reductasa 0,1j My NADP 2 mM en tampón de sulfato de histidina 50 mM a pH=7,38.

Descripción detallada de los modos de realización preferentes

I. Definiciones

En la presente invención, en el contexto de proteínas, incluyendo anticuerpos, en general, o con respecto a cualquier proteína o anticuerpo específico, el término "reducción" se usa para referirse a la reducción de uno o más enlaces disulfuro de la proteína o anticuerpo. Por tanto, por ejemplo, el término "reducción de ocrelizumab" se usa de manera intercambiable con el término "reducción de enlaces disulfuro de ocrelizumab" y el término "reducción de anticuerpo (Ab)" se usa de manera intercambiable con el término "reducción de enlaces disulfuro de anticuerpo (Ab)".

Los términos "reducción" o "reducción de enlaces disulfuro" se usan en el sentido más amplio e incluyen la reducción completa y parcial y la reducción de algunos o la totalidad de los enlaces disulfuro, intercatenarios o intracatenarios, presentes en una proteína, tal como un anticuerpo.

Por "proteína" se quiere decir una secuencia de aminoácidos para la que la longitud de cadena es suficiente para producir los mayores niveles de estructura terciaria y/o cuaternaria. Esto es para distinguirse de los "péptidos" u otros fármacos de pequeño peso molecular que no tienen dicha estructura. Típicamente, la proteína en el presente documento tendrá un peso molecular de al menos aproximadamente 15-20 kD, preferentemente de al menos aproximadamente 20 kD. Los ejemplos de proteínas englobadas dentro de la definición en el presente documento incluyen todas las proteínas de mamífero, en particular, proteínas terapéuticas y de diagnóstico, tales como anticuerpos terapéuticos y de diagnóstico, y, en general, proteínas que contienen uno o más enlaces disulfuro, incluyendo polipéptidos de múltiples cadenas que comprenden uno o más enlaces disulfuro inter- y/o intracatenarios.

El término "proteína terapéutica" o "polipéptido terapéutico" se refiere a una proteína que se usa en el tratamiento de una enfermedad, independientemente de su indicación o mecanismo de acción. Para que las proteínas terapéuticas sean útiles en la clínica, se deben fabricar en grandes cantidades. La producción a "escala de fabricación" de proteínas terapéuticas, u otras proteínas, utiliza cultivos celulares que varían de aproximadamente 400 l a aproximadamente 80.000 l, dependiendo de la proteína que se produce y la necesidad. Típicamente, dicha producción a escala de fabricación utiliza tamaños de cultivo celular de aproximadamente 400 l a aproximadamente 25.000 l. Dentro de este intervalo, se utilizan tamaños de cultivo celular específicos, tales como de 4000 l, de aproximadamente 6000 l, de aproximadamente 8000, de aproximadamente 10.000, de aproximadamente 12.000 l, de aproximadamente 14.000 l o de aproximadamente 16.000 l.

El término "anticuerpo terapéutico" se refiere a un anticuerpo que se usa en el tratamiento de una enfermedad. Un anticuerpo terapéutico puede tener diversos mecanismos de acción. Un anticuerpo terapéutico se puede unir y neutralizar la función normal de una diana asociada con un antígeno. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal que bloquea la actividad de la proteína necesaria para la supervivencia de una célula cancerosa provoca la muerte celular. Otro anticuerpo monoclonal terapéutico se puede unir y activar la función normal de una diana asociada con un antígeno. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal se puede unir a una proteína en una célula y desencadenar una señal de apoptosis. Aún otro anticuerpo monoclonal se puede unir a un antígeno diana expresado solo en un tejido enfermo; la conjugación de una carga útil tóxica (agente eficaz), tal como un agente quimioterápicos o radioactivo, con el anticuerpo monoclonal puede crear un agente para la administración específica de la carga útil tóxica al tejido patológico, lo que reduce el daño en el tejido sano. Un "fragmento biológicamente funcional" de un anticuerpo terapéutico presentará al menos una, sino algunas o la totalidad de las funciones biológicas atribuidas al anticuerpo intacto, comprendiendo la función al menos una unión específica al antígeno diana.

El término "proteína de diagnóstico" se refiere a una proteína que se usa en el diagnóstico de una enfermedad.

El término "anticuerpo de diagnóstico" se refiere a un anticuerpo que se usa como reactivo de diagnóstico para una enfermedad. El anticuerpo de diagnóstico se puede unir a un antígeno diana que se asocia específicamente con, o muestra expresión incrementada en, una enfermedad particular. El anticuerpo de diagnóstico se puede usar, por ejemplo, para detectar una diana en una muestra biológica de un paciente, o en formación de imágenes de diagnóstico de sitios patológicos, tales como tumores, en un paciente. Un "fragmento biológicamente funcional" de un anticuerpo de diagnóstico presentará al menos una, sino algunas o la totalidad de las funciones biológicas atribuidas al anticuerpo intacto, comprendiendo la función al menos una unión específica al antígeno diana.

"Purificada" quiere decir que una molécula está presente en una muestra a una concentración de al menos un 80-90 % en peso de la muestra en la que está contenida.

La proteína, incluyendo los anticuerpos, que se purifica es de forma preferente esencialmente pura y de forma deseable esencialmente homogénea (es decir, libre de proteínas contaminantes, etc.).

Una proteína "esencialmente pura" quiere decir una composición de proteína que comprende al menos aproximadamente un 90 % en peso de la proteína, en base al peso total de la composición, preferentemente al menos aproximadamente un 95 % en peso.

Una proteína "esencialmente homogénea" quiere decir una composición de proteína que comprende al menos aproximadamente un 99 % en peso de proteína, en base al peso total de la composición.

Como se señala anteriormente, en determinados modos de realización, la proteína es un anticuerpo. Los "anticuerpos" (Ab) y las "inmunoglobulinas" (Ig) son glucoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos presentan especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que, en general, están desprovistas de especificidad por el antígeno. Los polipéptidos de esta última clase se producen, por ejemplo, a bajos niveles por el sistema linfático y a niveles incrementados por mielomas.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos de longitud completa que tienen una región Fc de inmunoglobulina), composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitópica, anticuerpos biespecíficos, diacuerpos y moléculas monocatenarias, tales como moléculas de scFv, así como fragmentos de anticuerpo.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones naturales, que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que no es una mezcla de anticuerpos discretos. En determinados modos de realización, dicho anticuerpo monoclonal típicamente incluye un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une a una diana, en los que la secuencia polipeptídica de unión a diana se obtuvo por un procedimiento que incluye la selección de una única secuencia polipeptídica de unión a diana de una pluralidad de secuencias polipeptídicas. Por ejemplo, el procedimiento de selección puede ser la selección de un único clon de una pluralidad de clones, tal como un grupo de clones de hibridoma, clones de fago o clones de ADN recombinante. Se debe entender que una secuencia de unión a diana seleccionada se puede alterar adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar la secuencia de unión a diana, para mejorar su producción en el cultivo celular, para reducir su inmunogenicidadin vivo,para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de unión a diana alterada también es un anticuerpo monoclonal de la presente invención. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales son ventajosas en tanto que típicamente no están contaminadas por otras inmunoglobulinas.

El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar como que requiere la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo, por ejemplo, el procedimiento de hibridoma (por ejemplo, Kohleret al.,Nature, 256: 495 (1975); Harlowet al.,Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.a ed. 1988); Hammerlinget al.,en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.816.567), tecnologías de presentación en fagos (véase, por ejemplo, Clacksonet al.,Nature, 352: 624-628 (1991); Markset al.,J. Mol. Biol.222: 581-597 (1992); Sidhuet al.,J, Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Leeet al.,J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Leeet al.,J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004), y tecnologías para producir anticuerpos humanos o similares a humanos en animales que tienen partes o la totalidad de los locus de inmunoglobulina humana o genes que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, los documentos WO98/24893; WO96/34096; WO96/33735; WO91/10741; Jakobovitset al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovitset al.,Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemannet al.,Year in Immunol.7:33 (1993); las patentes de EE. UU. n.os 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; Markset al.,BioTechnology 10: 779-783 (1992); Lonberget al.,Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwildet al.,Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico a u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (patente de EE. UU. n.° 4.816.567; y Morrisonet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En un modo de realización, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la que los residuos de una región hipervariable del receptor se remplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentren ni en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se pueden preparar para refinar además el rendimiento del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables en los que todos o sustancialmente la totalidad de los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente comprenderá también al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para otros detalles, véanse Joneset al.,Nature 321:522-525 (1986); Riechmannet al.,Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol.

2:593-596 (1992). Véanse también los siguientes artículos de revisión y referencias citadas en los mismos: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994). El anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo Primatized™, en el que la región de unión a antígeno del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido inmunizando macacos con el antígeno de interés.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha preparado usando cualquiera de las técnicas para preparar anticuerpos humanos como se divulga en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.

Un anticuerpo "madurado en afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más CDR/HVR del mismo que dan como resultado una mejora de la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo original que no posea dicha(s) alteración/alteraciones. Los anticuerpos madurados en afinidad preferentes tienen afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno diana. Los anticuerpos madurados en afinidad se producen por procedimientos conocidos en la técnica. Markset al.,Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración en afinidad por barajado de los dominios V<h>y V<l>. La mutagénesis aleatoria de los residuos de CDR/HVR y/o de la región estructural se describe por: Barbaset al.,Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schieret al.,Gene 169:147-155 (1995); Yeltonet al.,J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jacksonet al.,J. Immunol. 154(7)3310-9 (1995); y Hawkinset al.,J. Mol. Biol.226:889-896 (1992).

La "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios aminoterminales de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada se puede denominar "V<h>". El dominio variable de la cadena ligera se puede denominar "V<l>". Estos dominios son, en general, las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de unión a antígeno.

El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente en todos los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o regiones hipervariables (HVR) tanto en los dominios variables de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se llaman regiones estructurales (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera naturales comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan, en gran medida, una configuración de lámina beta, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan, y, en algunos casos, forman parte de, la estructura de lámina beta. Las CDR en cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos.

Se pueden asignar las "cadenas ligeras" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa (<k>) y lambda (A), en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) se pueden asignar a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA<1>e IgA<2>. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, d, e, g, y m, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas y se describen, en general, por ejemplo, en Abbaset al.,Cellular and Mol. Immunology, 4.a ed. (2000). Un anticuerpo puede ser parte de una molécula de fusión más grande, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo con una o más de otras proteínas o péptidos.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, no a fragmentos de anticuerpo como se define a continuación. Los términos se refieren, en particular, a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen la región Fc.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden solo una porción de un anticuerpo intacto, en el que la porción retiene al menos una, y hasta tantas como la mayoría de o todas las funciones asociadas normalmente con esa porción cuando está presente en un anticuerpo intacto. En un modo de realización, un fragmento de anticuerpo comprende un sitio de unión a antígeno del anticuerpo intacto y, por tanto, retiene la capacidad de unirse al antígeno. En otro modo de realización, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, uno que comprende la región Fc, retiene al menos una de las funciones biológicas asociadas normalmente con la región Fc cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como la unión a FcRn, modulación de la semivida del anticuerpo, función ADCC y unión al complemento. En un modo de realización, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una semividain vivosustancialmente similar a un anticuerpo intacto. Por ejemplo, dicho fragmento de anticuerpo puede comprender un brazo de unión a antígeno enlazado a una secuencia de Fc que puede conferir estabilidadin vivoal fragmento.

La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento "Fc" residual, en el que su nombre refleja su capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina proporciona un fragmento F(ab')<2>que tiene dos sitios de combinación con antígeno y todavía puede reticular el antígeno.

El fragmento Fab contiene los dominios variables de la cadena pesada y ligera y también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxílico del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para un Fab' en el que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes porta(n) un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También son conocidos otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

"Fv" es el mínimo fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de unión a antígeno completo. En un modo de realización, una especie de Fv bicatenario consiste en un dímero de un dominio variable de la cadena pesada y uno de la ligera en asociación estrecha no covalente. En una especie de Fv monocatenario (scFv) se pueden enlazar de forma covalente un dominio variable de la cadena pesada y uno de la ligera por un conector peptídico flexible, de modo que las cadenas ligera y pesada se puedan asociar en una estructura "dimérica" análoga a la de una especie de Fv bicatenario. Es en esta configuración en la que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero V<h>-V<l>. Conjuntamente, las seis CDR confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque a una afinidad menor que todo el sitio de unión.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv monocatenario" o "scFv" comprenden los dominios V<h>y V<l>de un anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. En general, el polipéptido scFv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios V<h>y V<l>que posibilita que el scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una obtener una revisión de los scFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.

269-315 (1994).

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de la cadena pesada (V<h>) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (V<l>) en la misma cadena polipeptídica (V<h>-V<l>). Usando un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se fuerzan a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos. Los diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO93/1161; Hudsonet al.,(2003) Nat. Med. 9:129-134; y Hollingeret al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudsonet al.,(2003) Nat. Med.9:129-134.

Los anticuerpos se unen a HER2.

Un "fragmento biológicamente funcional" de un anticuerpo comprende solo una porción de un anticuerpo intacto, en el que la porción retiene al menos una, y hasta tantas como la mayoría de o todas las funciones asociadas normalmente con esa porción cuando está presente en un anticuerpo intacto. En un modo de realización, un fragmento biológicamente funcional de un anticuerpo comprende un sitio de unión a antígeno del anticuerpo intacto y, por tanto, retiene la capacidad de unirse al antígeno. Un fragmento biológicamente funcional de un anticuerpo, por ejemplo, uno que comprende la región Fc, puede retener al menos una de las funciones biológicas asociadas normalmente con la región Fc cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como la unión a FcRn, modulación de la semivida del anticuerpo, función ADC<c>y unión al complemento. Un fragmento biológicamente funcional de un anticuerpo puede ser un anticuerpo monovalente que tiene una semividain vivosustancialmente similar a un anticuerpo intacto. Por ejemplo, dicho fragmento biológicamente funcional de un anticuerpo puede comprender un brazo de unión a antígeno enlazado a una secuencia de Fc que puede conferir estabilidadin vivoal fragmento.

Los términos "inhibidor de tiorredoxina" e "inhibidor de Trx" se usan de manera intercambiable e incluyen todos los agentes y medidas eficaces en la inhibición de la actividad de tiorredoxina. Por tanto, los inhibidores de tiorredoxina (Trx) incluyen todos los agentes y medidas que bloquean cualquier componente de los sistemas enzimáticos de Trx, G6PD y/o hexocinasa. Los inhibidores de tiorredoxina usados en los procedimientos de la invención se definen en las reivindicaciones. En este contexto, la "inhibición" incluye la eliminación completa (bloqueo) y la reducción de la actividad de tiorredoxina y, en consecuencia, la eliminación completa o parcial de la reducción de enlaces disulfuro en una proteína, tal como un anticuerpo.

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían en los usos en la investigación, en el diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En algunos modos de realización, un anticuerpo se purifica (1) hasta más de un 95 % en peso de anticuerpo como se determina, por ejemplo, por el procedimiento de Lowry, y en algunos modos de realización, hasta más de un 99 % en peso; (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N terminal o interna por el uso, por ejemplo, de un secuenciador de vaso giratorio o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando, por ejemplo, tinción con azul de Coomassie o plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpoin situdentro de las células recombinantes, puesto que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no está presente. Habitualmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.

Los términos "proteína A" y "ProA" se usan de manera intercambiable en el presente documento y engloban proteína A recuperada de una fuente natural de la misma, proteína A producida sintéticamente (por ejemplo, por síntesis de péptidos o por técnicas recombinantes) y variantes de las mismas que retienen la capacidad de unirse a proteínas que tienen una región C<h>2/C<h>3, tal como una región Fc. La proteína A se puede adquirir comercialmente de Repligen, GE Healthcare y Fermatech. La proteína A se inmoviliza, en general, en un material de soporte en fase sólida. El término "ProA" también se refiere a una resina o columna de cromatografía de afinidad que contiene una matriz de soporte sólido cromatográfico a la que se une de forma covalente la proteína A.

El término "cromatografía" se refiere al procedimiento por el que un soluto de interés en una mezcla se separa de otros solutos en una mezcla como resultado de diferencias en las tasas a las que los solutos individuales de la mezcla migran a través de un medio estacionario bajo la influencia de una fase móvil, o en procedimientos de unión y elución.

El término "cromatografía de afinidad" y "cromatografía de afinidad para proteínas" se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a una técnica de separación de proteínas en la que una proteína de interés o anticuerpo de interés se une reversible y específicamente a un ligando bioespecífico. Preferentemente, el ligando bioespecífico se une de forma covalente a un material cromatográfico en fase sólida y es accesible a la proteína de interés en solución a medida que la solución entra en contacto con el material cromatográfico en fase sólida. La proteína de interés (por ejemplo, anticuerpo, enzima o proteína receptora) retiene su afinidad de unión específica por el ligando bioespecífico (antígeno, sustrato, cofactor u hormona, por ejemplo) durante las etapas cromatográficas, mientras que otros solutos y/o proteínas en la mezcla no se unen apreciable o específicamente al ligando. La unión de la proteína de interés al ligando inmovilizado permite que las proteínas contaminantes o impurezas proteicas se pasen a través del medio cromatográfico, mientras que la proteína de interés permanece específicamente unida al ligando inmovilizado en el material en fase sólida. A continuación, la proteína de interés específicamente unida se retira en forma activa del ligando inmovilizado con pH bajo, pH alto, alto contenido de sal, ligando competidor, y similares, y se hace pasar a través de la columna cromatográfica con el tampón de elución, libre de proteínas contaminantes o impurezas proteicas que anteriormente se permitía que pasaran a través de la columna. Se puede usar cualquier componente como ligando para purificar su respectiva proteína de unión específica, por ejemplo, el anticuerpo.

Los términos "cromatografía distinta de afinidad" y "purificación distinta de afinidad" se refieren a un procedimiento de purificación en el que no se utiliza cromatografía de afinidad. La cromatografía distinta de afinidad incluye técnicas cromatográficas que se basan en interacciones no específicas entre una molécula de interés (tal como una proteína, por ejemplo, un anticuerpo) y una matriz en fase sólida.

Una "resina de intercambio catiónico" se refiere a una fase sólida que está cargada negativamente y que, por tanto, tiene cationes libres para el intercambio con cationes en una solución acuosa que se hace pasar sobre o a través de la fase sólida. Un ligando cargado negativamente unido a la fase sólida para formar la resina de intercambio catiónico puede ser, por ejemplo, un carboxilato o sulfonato. Las resinas de intercambio catiónico disponibles comercialmente incluyen carboxi-metil-celulosa, sulfopropilo (SP) inmovilizado en agarosa (por ejemplo, SP-SEPHAROSE FAST FLOW™ o SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE™, de GE Healthcare) y sulfonilo inmovilizado en agarosa (por ejemplo, S-SEPHAROSE FAST FLOW™ de GE Healthcare). Una "resina de intercambio iónico en modo mixto" se refiere a una fase sólida que se modifica de forma covalente con restos catiónicos, aniónicos e hidrófobos. Una resina de intercambio iónico en modo mixto disponible comercialmente es BAKERBOND ABX™ (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ), que contiene grupos de intercambio catiónico débiles, una baja concentración de grupos de intercambio aniónico y ligandos hidrófobos unidos a una matriz de soporte en fase sólida de gel de sílice.

El término "resina de intercambio aniónico" se usa en el presente documento para hacer referencia a una fase sólida que está cargada positivamente, por ejemplo, que tiene uno o más ligandos cargados positivamente, tales como grupos amino cuaternarios, unidos a la misma. Las resinas de intercambio aniónico disponibles comercialmente incluyen celulosa DEAE, QAE SEPHADEX™ y FAST Q SEPHAROSE™ (GE Healthcare).

Un "tampón" es una solución que resiste los cambios en el pH por la acción de sus componentes conjugados ácido-base. Se describen diversos tampones que se pueden emplear dependiendo, por ejemplo, del pH deseado del tampón enBuffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems,Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975). En un modo de realización, el tampón tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 9, de forma alternativa de aproximadamente 3 a aproximadamente 8, de forma alternativa de aproximadamente 4 a aproximadamente 7, de forma alternativa de aproximadamente 5 a aproximadamente 7. Los ejemplos no limitantes de tampones que controlarán el pH en este intervalo incluyen los tampones MES, MOPS, MOPSO, Tris, HEPES, fosfato, acetato, citrato, succinato y amonio, así como combinaciones de estos.

El "tampón de carga" es el que se usa para cargar la composición que comprende la molécula de polipéptido de interés y una o más impurezas en la resina de intercambio iónico. El tampón de carga tiene una conductividad y/o pH de modo que la molécula de polipéptido de interés (y, en general, una o más impurezas) se una(n) a la resina de intercambio iónico o de modo que la proteína de interés fluya a través de la columna mientras las impurezas se unen a la resina.

El "tampón intermedio" se usa para eluir una o más impurezas de la resina de intercambio iónico, antes de eluir la molécula de polipéptido de interés. La conductividad y/o pH del tampón intermedio es/son tal(es) que una o más impurezas se eluyan de la resina de intercambio iónico, pero no cantidades significativas del polipéptido de interés.

El término "tampón de lavado" al usarse en el presente documento se refiere a un tampón usado para lavar o volver a equilibrar la resina de intercambio iónico antes de eluir la molécula de polipéptido de interés. Convenientemente, el tampón de lavado y el tampón de carga pueden ser iguales, pero esto no se requiere.

El "tampón de elución" se usa para eluir el polipéptido de interés de la fase sólida. La conductividad y/o pH del tampón de elución es/son tal(es) que el polipéptido de interés se eluya de la resina de intercambio iónico.

Se puede usar un "tampón de regeneración" para regenerar la resina de intercambio iónico de modo que se pueda volver a usar. El tampón de regeneración tiene una conductividad y/o pH según se requiera para retirar sustancialmente todas las impurezas y el polipéptido de interés de la resina de intercambio iónico.

La expresión "sustancialmente similar" o "sustancialmente igual", como se usa en el presente documento, indica un grado suficientemente alto de similitud entre dos valores numéricos (por ejemplo, uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/comparación), de modo que un experto en la técnica considerara que la diferencia entre los dos valores fuera de poca o ninguna significación biológica y/o estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd). La diferencia entre dichos dos valores, por ejemplo, es de menos de aproximadamente un 50 %, de menos de aproximadamente un 40 %, de menos de aproximadamente un 30 %, de menos de aproximadamente un 20 % y/o de menos de aproximadamente un 10 % como una función del valor de referencia/comparación.

La frase "sustancialmente reducido" o "sustancialmente diferente", como se usa en el presente documento con respecto a cantidades o valores numéricos (y no como referencia al procedimiento químico de reducción), indica un grado suficientemente alto de diferencia entre dos valores numéricos (en general, uno asociado con una molécula y el otro asociado con una molécula de referencia/comparación), de modo que un experto en la técnica considerara que la diferencia entre los dos valores fuera de significación estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd). La diferencia entre dichos dos valores, por ejemplo, es mayor que aproximadamente un 10 %, mayor que aproximadamente un 20 %, mayor que aproximadamente un 30 %, mayor que aproximadamente un 40 % y/o mayor que aproximadamente un 50 % como una función del valor para la molécula de referencia/comparación.

Se pretende que el término "vector", como se usa en el presente documento, haga referencia a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico a la que se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un ADN bicatenario circular en el que se pueden fijar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector de fago. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que se pueden fijar segmentos de ADN adicionales al genoma vírico. Determinados vectores se pueden replicar de forma autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos). Se pueden integrar otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) en el genoma de una célula huésped tras su introducción en la célula huésped, y, de este modo, se replican junto con el genoma del huésped. Además, determinados vectores pueden dirigir la expresión de los genes a los que se enlazan de forma funcional. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinantes", o, simplemente, "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están, a menudo, en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se pueden usar de manera intercambiable, ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada.

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin tener en consideración ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, se generan valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde se ha registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente en Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. Se debe compilar el programa ALIGN-2 para su uso en un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a, con o contra una secuencia de aminoácidos dada B (que se puede parafrasear de forma alternativa como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o contra una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos de aminoácido puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y

donde Y es el número total de residuos de aminoácido en B.

Se apreciará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se indique específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.

Se define "porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico" como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos en una secuencia que codifica el factor D de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la máxima alineación sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. A continuación, se calcula la identidad de secuencia en relación con la secuencia más larga, es decir, incluso si una secuencia más corta muestra un 100 % de identidad de secuencia con una porción de una secuencia más larga, la identidad de secuencia global será de menos de un 100 %.

"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen el trastorno, así como aquellos en los que se ha de prevenir el trastorno. "Tratamiento" en el presente documento engloba el alivio de la enfermedad y de los signos y síntomas de la enfermedad particular.

Un "trastorno" es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con la proteína. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas, incluyendo las afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de trastornos que se van a tratar en el presente documento incluyen carcinomas y alergias.

"Mamífero" para los propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo seres humanos, primates superiores no humanos, otros vertebrados, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, para la práctica de deportes o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferentemente, el mamífero es un ser humano.

Un "ARN interferente" o "ARN interferente pequeño (ARNip)" es una molécula de ARN bicatenario de menos de aproximadamente 30 nucleótidos de longitud que reduce la expresión de un gen diana. Los ARN interferentes se pueden identificar y sintetizar usando procedimientos conocidos (Shi Y., Trends in Genetics 19(1 ):9-12 (2003), documentos WO/2003056012 y WO2003064621), y las colecciones de ARNip están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Dharmacon, Lafayette, Colorado. Con frecuencia, los ARNip se pueden diseñar con éxito para dirigirse al extremo 5' de un gen.

II. Composiciones y procedimientos de la invención

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología molecular y similares, que están dentro de la habilidad de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Véanse, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrooket al.,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubelet al.,eds., 1987, actualizado); Essential Molecular Biology (T. Brown ed., IRL Press 1991); Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwellet al.,eds., Bartlett Publ. 1990); Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Methodology II (R. Wuet al.,eds., Academic Press 1995); PCR: A Practical Approach (M. McPhersonet al.,IRL Press at Oxford University Press 1991); Oligonucleotide Synthesis (M. Gait ed., 1984); Cell Culture for Biochemists (R. Adams ed., Elsevier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller & M. Calos eds., 1987); Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler ed., 1991); Animal Cell Culture (J. Pollardet al.,eds., Humana Press 1990); Culture of Animal Cells, 2.a ed. (R. Freshneyet al.,eds., Alan R. Liss 1987); Flow Cvtometrv and Sorting (M. Melamedet al.,eds., Wiley-Liss 1990); la serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Wirth M. y Hauser H. (1993); Immunochemistry in Practice, 3.a edición, A. Johnstone & R. Thorpe, Blackwell Science, Cambridge, MA, 1996; Techniques in Immunocytochemistry. (G. Bullock & P. Petrusz eds., Academic Press 1982, 1983, 1985, 1989); Handbook of Experimental Immunology, (d . Weir & C. Blackwell, eds.); Current Protocols in Immunology (J. Coliganet al.,eds. 1991); Immunoassay (E. P. Diamandis & T.K. Christopoulos, eds., Academic Press, Inc., 1996); Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2.a ed) Academic Press, New York; Ed Harlow y David Lane, Antibodies A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Antibody Engineering, 2.a edición (C. Borrebaeck, ed., Oxford University Press, 1995); y la serie Annual Review of Immunology; la serie Advances in Immunology.

1. Prevención de la reducción de enlaces disulfuro

La presente invención se refiere a procedimientos para la prevención de la reducción de enlaces disulfuro de proteínas durante la producción recombinante como se define en las reivindicaciones. La invención se refiere a procedimientos para prevenir la reducción de enlaces disulfuro de proteínas recombinantes durante el procesamiento tras la fermentación. Los procedimientos de la invención son, en particular, valiosos para la producción a gran escala de proteínas que contienen enlaces disulfuro, tal como a escala de fabricación. En un modo de realización, los procedimientos de la invención son útiles para la producción de proteínas a gran escala a una escala de más de 5000 l.

Se ha descubierto experimentalmente que la reducción de enlaces disulfuro se produce durante el procesamiento del caldo de cultivo celular obtenido (HCCF) producido durante la fabricación de proteínas recombinantes que contienen enlaces disulfuro. Típicamente, esta reducción se observa después de la lisis celular, especialmente la lisis celular mecánica durante las operaciones de obtención, cuando alcanza un determinado umbral, tal como, por ejemplo, de aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 70 %, o de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 60 %, o de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 60 % de lisis celular total. Este umbral variará, dependiendo de la naturaleza de la proteína (por ejemplo, el anticuerpo) producida, el huésped recombinante, el sistema de producción, los parámetros de producción usados y similares, y se puede determinar fácilmente de forma experimental.

Teóricamente, dicha reducción podría resultar de una variedad de factores y condiciones durante el procedimiento de fabricación, y se podría provocar por una variedad de agentes reductores. La presente invención se basa, al menos en parte, en el reconocimiento de que la causa raíz de esta reducción es una tiorredoxina (Trx) o sistema similar a tiorredoxina activo/a en el HCCF.

El sistema enzimático de Trx, compuesto por Trx, tiorredoxina reductasa (TrxR) y NADPH, es un sistema donante de hidrógeno para la reducción de enlaces disulfuro en proteínas. Trx es una proteína monomérica pequeña con un motivo en sitio activo CXXC que cataliza muchas reacciones rédox a través del intercambio tiol-disulfuro. La Trx oxidada se puede reducir por NADPH por medio de la TrxR. La Trx reducida, a continuación, puede catalizar la reducción de disulfuros en proteínas. La NADPH requerida para el sistema de tiorredoxina se proporciona por medio de reacciones en la vía de la pentosa fosfato y glucólisis. Los resultados presentados en el presente documento demuestran que la NADPH, que se requiere para la actividad del sistema de Trx, se proporciona por la actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), que genera NADPH a partir de glucosa y ATP por hexocinasa (véase la figura 4). Estas enzimas celulares (sistema de Trx, G6PD y hexocinasa), junto con sus sustratos, se liberan en el CCF tras la lisis celular, lo que permite que se produzca la reducción. En consecuencia, la reducción de disulfuros se puede prevenir por inhibidores del sistema enzimático de Trx o sistemas enzimáticos en dirección 5' que proporcionen componentes para un sistema de Trx activo, tales como actividad de G6PD y hexocinasa.

Para otros detalles de estos sistemas enzimáticos, o con respecto a otros detalles de producción de proteínas, véase, por ejemplo: Babson, A.L. y Babson, S.R. (1973) Kinetic Colorimetric Measurement of Serum Lactate Dehydrogenase Activity. Clin. Chem. 19: 766-769; Michael W. Lairdet al.,"Optimization of BLyS Production and Purification from Eschericia coli", Protein Expression and Purification 39:237-246 (2005); John C. Jolyet al.,"Overexpression of Eschericia coli Oxidoreductases Increases Recombinant Insulin-like Growth Factor-I Accumulation", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2773-2777 (March 1998); Dana C. Andersenet al.,"Production Technologies for Monoclonal Antibodies and Their Fragments", Current Opinion in Biotechnology 15:456-462 (2004); Yariv Mazoret al.,"Isolation of Engineered, Full-length Antibodies from Libraries Expressed inEscherichia coli',Nature Biotech. 25, 563 - 565 (01 Jun 2007); Laura C. Simmonset al.,"Expression of Full-length Immunoglobulins inEscherichia coli.Rapid and Efficient Production of Aglycosylated Antibodies", Journal of Immunological Methods 263:133-147 (2002); Paul H. Bessetteet al.,"Efficient Folding of Proteins with Multiple Disulfide Bonds in theEscherichia colicytoplasm", Proc. Natl. Acad. Sci. 96(24): 13703-08 (1999); Chaderjian, W.B., Chin, E.T., Harris, R.J., y Etcheverry, T.M., (2005) "Effect of copper sulfate on performance of a serum-free CHO cell culture process and the level of free thiol in the recombinant antibody expressed", Biotechnol. Prog.21: 550-553; Gordon G., Mackow M.C., y Levy H.R., (1995) "On the mechanism of interaction of steroids with human glucose 6-phosphate dehydrogenase", Arch. Biochem. Biophys. 318: 25-29; Gromer S., Urig S., y Becker K., (2004) "TheTrx System - From Science to Clinic", Medicinal Research Reviews, 24: 40-89; Hammes G.G. y Kochavi D., (1962a) "Studies of the Enzyme Hexokinase. I. Steady State Kinetics at pH 8", J. Am. Chem. Soc. 84:2069-2073; Hammes G.G. y Kochavi D., (1962b) "Studies of the Enzyme Hexokinase. III. The Role of the Metal Ion", J. Am. Chem. Soc. 84:2076-2079; Johansson C., Lillig C.H., y Holmgren A., (2004) "Human Mitochondrial Glutaredoxin Reduces S-Glutathionylated Proteins with High Affinity Accepting Electrons from Either Glutathione or Thioredoxin Reductase", J. Biol. Chem. 279:7537-7543; Legrand, C., Bour, J.M., Jacob, C., Capiaumont J., Martial, A., Marc, A., Wudtke, M., Kretzmer, G., Demangel, C., Duval, D., y Hache J., (1992) "Lactate Dehydrogenase (LDH) Activity of the Number of Dead Cells in the Medium of Cultured Eukaryotic Cells as Marker", J. Biotechnol., 25: 231-243; McDonald, M.R., (1955) "Yeast Hexokinase: ATP --> Hexose Hexose-6-phosphate ADP", Methods in Enzymology, 1: 269-276, Academic Press, NY; Sols, A., DelaFuente, G., Villar-Palasi, C., y Asensio, C., (1958) "Substrate Specificity and Some Other Properties of Bakers 'Yeast Hexokinase", Biochim Biophys Acta 30: 92-101; Kirkpatrick D.L., Kuperus M., Dowdeswell M., Potier N., Donald L.J., Kunkel M., Berggren M., Angulo M., y Powis G., (1998) "Mechanisms of inhibition of the Trx growth factor system by antitumor 2-imidazolyl disulfides", Biochem. Pharmacol. 55: 987-994; Kirkpatrick D.L., Watson S., Kunkel M., Fletcher S., Ulhaq S., y Powis G., (1999) "Parallel synthesis of disulfide inhibitors of the Trx redox system as potential antitumor agents", Anticancer Drug Des. 14: 421-432; Milhausen, M., y Levy, H.R., (1975) "Evidence for an Essential Lysine in G6PD from Leuconostoc mesenteroides", Eur. J. Biochem. 50: 453-461; Pleasants, J.C., Guo, W. y Rabenstein, D.L., (1989) "A comparative study of the kinetics of selenol/diselenide and thiol/disulfide exchange reactions", J. Am. Chem. Soc. 111: 6553-6558; Whitesides, G.M., Lilburn, J.E., y Szajewski, R.P., (1977) "Rates of thioldisulfide interchange reactions between mono- and dithiols and Ellman's reactive,"' J. Org. Chem. 42: 332-338; y Wipf P., Hopkins T.D., Jung J.K., Rodriguez S., Birmingham A., Southwick E.C., Lazo J.S., y Powis G, (2001) "New inhibitors of the Trx-TrxR system based on a naphthoquinone spiroketal natural product lead", Bioorg. Med. Chem. Lett.11:2637-2641.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la reducción de enlaces disulfuro se puede prevenir usando los inhibidores de tiorredoxina (Trx) definidos en las reivindicaciones.

Los inhibidores de Trx típicamente se añaden al caldo de cultivo celular (CCF), que contiene las células huésped recombinantes y el medio de cultivo, y/o al caldo de cultivo celular obtenido (HCCF), que se obtiene después de la obtención por centrifugación, filtración o procedimientos de separación similares. El HCCF está desprovisto de células huésped intactas, pero típicamente contiene proteínas de célula huésped y otros contaminantes, incluyendo<a>D<n>, que se retiran en etapas de purificación posteriores. Por tanto, los inhibidores de Trx se pueden añadir antes de la obtención y/o durante la obtención, preferentemente antes de la obtención.

De forma alternativa o además, la inyección de aire también se puede usar para prevenir la reducción de la reducción de enlaces disulfuro tras la fermentación durante la producción recombinante de proteínas recombinantes. Determinados procedimientos de inhibición de la reducción contemplados en el presente documento se enumeran en la siguiente tabla 1.

Tabla 1: procedimientos de inhibición de la reducción

1 Aplicado al CCF antes de la obtención o en el HCCF inmediatamente después de la obtención.

2 Actualmente no disponible comercialmente.

Los "inhibidores de Trx" para su uso en los procedimientos de la presente invención incluyen, (1) inhibidores directos de Trx, tales como disulfuros de alquil-2-imidazolilo y compuestos relacionados (por ejemplo, disulfuro de 1 -metilpropil-2-imidazolilo) (Kirkpatricket al.,1998 y 1999,supra)y derivados de naftoquinona-espirocetal (por ejemplo, palmarumicina CP<1>) (Wipfet al.,2001,supra);(2) inhibidores específicos de TrxR, incluyendo complejos de oro, tales como aurotioglucosa (ATG) y aurotiomalato (ATM) (véase, por ejemplo, la revisión por Gromeret al.,2004), que son ejemplos de inhibidores irreversibles de TrxR; (3) inhibidores de G6PD, seleccionados de piridoxal-5'-fosfato y 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (Milhausen y Levy 1975,supra),deshidroepiandrosterona (DHEA) y epiandrosterona (EA) (Gordonet al.,1995,supra);y (4) inhibidores de la actividad de hexocinasa (y, de este modo, la producción de G6P para la G6PD), que son EDTA y sorbosa-1-fosfato, polifosfatos, 6-desoxi-6-fluoroglucosa, 2-C-hidroxi-metilglucosa, xilosa y lixosa (Solset al.,1958,supra;McDonald, 1955,supra);se divulgan otros inhibidores de hexocinasa no reivindicados en la patente de EE. UU. n.° 5.854.067 titulada "Inhibidores de hexocinasa".

Los "inhibidores de Trx" para su uso en los procedimientos de la presente invención también incluyen el uso de anticuerpos dirigidos. Para diseñar ARNip o nucleótidos antisentido dirigidos para los genes como se encuentran en las células CHO, estas secuencias génicas están disponibles a partir de bases de datos públicas para seleccionar secuencias para dirigir enzimas en diferentes organismos. Véase el ejemplo 9 a continuación para ejemplos de los genes del sistema de Trx deE. coliy ratón.

Además de usar los inhibidores analizados anteriormente, también es posible, en determinados modos de realización de la presente invención, prevenir la reducción de proteínas recombinantes que se van a purificar inyectando aire en el HCCF para mantener un potencial rédox oxidante en el HCCF. Esta es una medida no dirigida que puede agotar la glucosa, G6P y NADPH al oxidar continuamente las formas reducidas de Trx y TrxR. La inyección de aire del depósito de HCCF se puede realizar, por ejemplo, con un flujo de aire de aproximadamente 100 litros a aproximadamente 200 litros, tal como, por ejemplo, 150 litros por minuto. La inyección de aire se puede realizar para alcanzar un porcentaje de punto final de saturación; por ejemplo, la inyección de aire se puede continuar hasta que el HCCf esté aproximadamente un 100 % saturado con aire, o se puede continuar hasta que el HCCR esté aproximadamente un 30 % saturado con aire, o hasta que esté entre aproximadamente un 100 % saturado y aproximadamente un 30 % saturado con aire. La cantidad mínima de oxígeno disuelto (dO<2>) requerida para el efecto inhibidor deseado también depende del anticuerpo u otra proteína recombinante producida. Por tanto, por ejemplo, aproximadamente un 10 % de dO<2>(o aproximadamente 10 sccm para una corriente continua) tendrá el efecto deseado durante la producción del anticuerpo 2H7 (variante A), mientras que Apomab podría requerir un mayor (aproximadamente un 30 %) dO<2>.

En otros aspectos no reivindicados explícitamente, otro procedimiento no dirigido utilizable para bloquear la reducción de la proteína recombinante es reducir el pH del HCCF. Esto aprovecha el intercambio tiol-disulfuro, en particular, lento a valores de menor pH (Whitesideset al.,1977,supra;Pleasantset al.,1989,supra).Por lo tanto, la actividad del sistema de Trx es significativamente menor a valores de pH por debajo de 6 y, por tanto, se puede inhibir la reducción de la proteína recombinante, tal como ocrelizumab.

Los enfoques no dirigidos también se pueden combinar entre sí y/o con el uso de uno o más inhibidores de Trx.

La reducción de enlaces disulfuro se puede inhibir (es decir, bloquear parcial o completamente) usando uno o más inhibidores de Trx y/o aplicando enfoques no dirigidos tras la finalización del procedimiento de cultivo celular, preferentemente a CCF antes de la obtención o en el HCCF inmediatamente después de la obtención. El tiempo y modo de aplicación óptimos y las cantidades eficaces dependen de la naturaleza de la proteína que se va a purificar, las células huésped recombinantes y el procedimiento de producción específico usado. La determinación de los parámetros óptimos está bien dentro de la experiencia del experto en la técnica.

Por ejemplo, en un procedimiento de cultivo de células de mamífero, tal como el procedimiento de producción de anticuerpos en CHO descrito en los ejemplos en el presente documento, si se usa sulfato cúprico (CuSO4 en forma de pentahidrato o forma anhidra) como inhibidor de Trx, se puede añadir para complementar el CCF o HCCF en el intervalo de concentraciones de aproximadamente 5|jM a aproximadamente 100|jM, tal como de aproximadamente 10<j>M a aproximadamente 80<j>M, preferentemente de aproximadamente 15<j>M a aproximadamente 50<j>M. Puesto que algunos cultivos celulares ya contienen cobre (por ejemplo, aproximadamente CuSO4 0,04 j M para los cultivos de células CHO usados en los ejemplos en el presente documento), esta cantidad es adicional al cobre, si lo hay, ya presente en el cultivo celular. Se puede usar cualquier sal de cobre (II) en lugar de CuSO4 siempre que la solubilidad no sea un problema. Por ejemplo, se pueden usar acetato de cobre y cloruro de cobre, que son ambos solubles en agua, en lugar de CuSO4. La concentración eficaz mínima también puede depender del anticuerpo producido y de la fase en la que se usa el inhibidor. Por tanto, por ejemplo, cuando se añade sulfato cúprico previamente a la lisis, para el anticuerpo 2H7 (variante A) la concentración eficaz mínima es de aproximadamente 30<j>M, para Apomab es de aproximadamente 75<j>M y para la variante C de anticuerpo (véase la tabla 2) es de aproximadamente 50<j>M. Cuando se añade sulfato cúprico en medio CC, para el anticuerpo 2H7 (variante A) la concentración eficaz mínima es de aproximadamente 15<j>M, para Apomab es de aproximadamente 25 j M y para la variante C de anticuerpo es de aproximadamente 20 j M. Una concentración de inhibidor de CuSO4 mínima típica de 2 x concentración de Trx (o equivalencia de Trx).

El EDTA se puede usar en un amplio intervalo de concentraciones, dependiendo del grado de lisis celular, la célula huésped recombinante usada y otros parámetros del procedimiento de producción. Por ejemplo, al usar CHO u otras células huésped de mamífero, típicamente se puede añadir EDTA en una concentración de entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 60 mM, tal como de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM, o de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 40 mM, dependiendo del grado de lisis celular. Para un menor grado de lisis celular, serán suficientes menores concentraciones de EDTA, mientras que para una lisis celular de aproximadamente un 75 % - 100 %, la concentración de EDTA requerida es mayor, tal como, por ejemplo, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 40 mM. La concentración eficaz mínima también puede depender del anticuerpo producido. Por tanto, por ejemplo, para el anticuerpo 2H7 (variante A), la concentración de EDTA eficaz mínima es de aproximadamente 10 mM.

La DHEA como inhibidor de Trx es típicamente eficaz a una menor concentración, tal como, por ejemplo, en el intervalo de concentraciones de aproximadamente 0,05 mM a aproximadamente 5 mM, preferentemente de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 2,5 mM.

Otros inhibidores de Trx, tales como aurotioglucosa (ATG) y aurotiomalato (ATM) inhiben la reducción de los enlaces disulfuro en el intervalo de concentraciones j M. Por tanto, por ejemplo, se puede añadir ATG o ATM en una concentración de entre aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 1 mM. Aunque la concentración inhibidora mínima varía dependiendo de las condiciones reales, para ATG y ATM típicamente es de alrededor de 4 x concentración de TrxR.

Cabe señalar que todos los inhibidores se pueden usar en una cantidad en exceso, por lo tanto, no siempre es necesario conocer la cantidad de Trx o TrxR en el sistema.

En un modo de realización preferente, las células huésped de mamífero usadas en el procedimiento de fabricación son células de ovario de hámster chino (CHO) (Urlaubet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA77:4216 (1980)). Otras células huésped de mamífero incluyen, sin limitación, la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para su cultivo en cultivo en suspensión), Grahamet al., J. Gen Virol.36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather,Biol. Reprod.23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, At CC CCL51); células TRI (Matheret al., Annals N.Y. Acad. Sci.383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; una línea de hepatoma humano (Hep G2); y células de mieloma o linfoma (por ejemplo, células Y0, J558L, P3 y NS0) (véase la patente de EE. UU. n.° 5.807.715).

Una célula huésped preferente para la producción de los polipéptidos en el presente documento es la línea de células CHO DP12 (CHO K1 dhfr-). Esta es una de las líneas de células CHO más conocidas, ampliamente usada en la práctica de laboratorio (véase, por ejemplo, el documento EP 0.307.247, publicado el 15 de marzo de 1989). Además, son conocidas otras líneas de células CHO-K1 (dhfr-) y se pueden usar en los procedimientos de la presente invención.

Las células huésped de mamífero usadas para producir péptidos, polipéptidos y proteínas se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente, tales como F10 de Ham (Sigma), medio mínimo esencial (MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio de Eagle modificado de Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, se puede usar cualquiera de los medios descritos en Ham y Wallace (1979), Meth. en Enz. 58:44, Barnes y Sato (1980), Anal. Biochem. 102:255, la pat. de EE. UU. n.° 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; o 4.560.655; los documentos WO 90/03430; WO 87/00195; la pat. de EE. UU. n.° Re. 30.985; o la pat. de EE. UU. n.° 5.122.469 como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de dichos medios se puede complementar según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco Gentamycin™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos presentes normalmente en concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También se puede incluir cualquier otro complemento necesario a concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las usadas previamente con la célula huésped seleccionada para su expresión, y serán evidentes para el experto en la técnica.

Un protocolo para la producción, recuperación y purificación de anticuerpos recombinantes en células de mamífero, tales como CHO, puede incluir las siguientes etapas:

Las células se pueden cultivar en un sistema de biorreactor de depósito agitado y se emplea un procedimiento de cultivo por lotes alimentados. En un cultivo por lotes alimentados preferente, las células huésped de mamífero y el medio de cultivo se suministran inicialmente a un recipiente de cultivo y se alimentan nutrientes de cultivo adicionales, de forma continua o en incrementos discretos, al cultivo durante el cultivo, con o sin recogida periódica de células y/o productos antes de la finalización del cultivo. El cultivo por lotes alimentados puede incluir, por ejemplo, un cultivo por lotes alimentados semicontinuo, en el que se retira periódicamente el cultivo completo (incluyendo las células y el medio) y se reemplaza por medio recién preparado. El cultivo por lotes alimentados se distingue del simple cultivo por lotes en que todos los componentes para cultivar células (incluyendo las células y todos los nutrientes de cultivo) se suministran al recipiente de cultivo al inicio del procedimiento de cultivo. El cultivo por lotes alimentados se puede distinguir además del cultivo por perfusión en la medida en que el sobrenadante no se retira del recipiente de cultivo durante el procedimiento (en el cultivo por perfusión, las células se retienen en el cultivo, por ejemplo, por filtración, encapsulación, sujeción a microportadores, etc. y el medio de cultivo se introduce de forma continua o intermitente y se retira del recipiente de cultivo).

Además, las células del cultivo se pueden propagar de acuerdo con cualquier esquema o rutina que pueda ser adecuada para la célula huésped particular y el plan de producción particular contemplado. Por lo tanto, se puede emplear un procedimiento de cultivo en una única etapa o múltiples etapas. En un cultivo en una única etapa, las células huésped se inoculan en un entorno de cultivo y se emplean los procedimientos durante una única fase de producción del cultivo celular. De forma alternativa, se puede usar un cultivo en múltiples fases. En el cultivo en múltiples fases, se pueden cultivar las células en una serie de etapas o fases. Por ejemplo, se pueden cultivar células en un cultivo en una primera etapa o fase de crecimiento, en el que las células, posiblemente retiradas del almacenamiento, se inoculen en un medio adecuado para promover el crecimiento y la alta viabilidad. Las células se pueden mantener en la fase de crecimiento durante un periodo de tiempo adecuado por adición de medio recién preparado al cultivo de células huésped.

En determinados modos de realización, se pueden concebir condiciones de cultivo celular por lotes alimentados o continuo para potenciar el crecimiento de las células de mamífero en la fase de crecimiento del cultivo celular. En la fase de crecimiento, se cultivan células en condiciones y durante un periodo de tiempo que se maximiza para su crecimiento. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH, oxígeno disuelto (dO<2>), y similares, son las usadas con el huésped particular y serán evidentes para el experto en la técnica. En general, el pH se ajusta a un nivel de entre aproximadamente 6,5 y 7,5 usando un ácido (por ejemplo, CO<2>) o bien una base (por ejemplo, Na2CO3 o NaOH). Un intervalo de temperaturas adecuado para cultivar células de mamífero, tales como células CHO, es de entre aproximadamente 30 °C y 38 °C, y un dO<2>adecuado es de entre un 5-90 % de saturación de aire.

En una fase particular, se pueden usar las células para inocular una fase o etapa de producción del cultivo celular. De forma alternativa, como se describe anteriormente, la fase o etapa de producción puede ser continua con la fase o etapa de inoculación o crecimiento.

Típicamente, se controla el entorno de cultivo celular durante la fase de producción del cultivo celular. Por tanto, si se produce una glucoproteína, los factores que afectan a la productividad específica celular de la célula huésped de mamífero se pueden manipular de modo que se logre el contenido de ácido siálico deseado en la glucoproteína resultante. En un aspecto preferente, la fase de producción del procedimiento de cultivo celular está precedida por una fase de transición del cultivo celular en que se integran los parámetros para la fase de producción del cultivo celular. Se encuentran otros detalles de este procedimiento en la patente de EE. UU. n.° 5.721.121 y Chaderjianet al.,Biotechnol. Prog. 21(2):550-3 (2005).

Tras la fermentación, las proteínas se purifican. Los procedimientos para la purificación de proteínas a partir de restos celulares dependen inicialmente del sitio de expresión de la proteína. Se puede provocar que algunas proteínas se secreten directamente desde la célula en los medios de crecimiento circundantes; otras se producen intracelularmente. Para estas últimas proteínas, la primera etapa de un procedimiento de purificación implica la lisis de la célula, que se puede realizar por una variedad de procedimientos, que incluyen cizallamiento mecánico, choque osmótico o tratamientos enzimáticos. Dicha ruptura libera todo el contenido de la célula en el homogeneizado, y además produce fragmentos subcelulares que son difíciles de retirar debido a su pequeño tamaño. En general, estos se retiran por centrifugación diferencial o por filtración. El mismo problema surge, aunque en una escala más pequeña, con proteínas secretadas directamente debido a la muerte natural de las células y la liberación de proteínas y componentes de célula huésped intracelulares en el transcurso de la tanda de producción de proteínas.

Una vez que se ha obtenido una solución aclarada que contiene la proteína de interés, normalmente se intenta su separación de las otras proteínas producidas por la célula usando una combinación de diferentes técnicas de cromatografía. Dichas técnicas separan las mezclas de proteínas en base a su carga, grado de hidrofobia o tamaño. Están disponibles varias resinas de cromatografía diferentes para cada una de estas técnicas, lo que permite una adaptación exacta del esquema de purificación a la proteína particular implicada. La esencia de cada uno de estos procedimientos de separación es que se puede provocar que las proteínas desciendan a diferentes tasas por una columna larga, logrando una separación física que se incrementa a medida que van bajando por la columna, o bien se adhieran selectivamente al medio de separación, eluyéndose, a continuación, diferencialmente por diferentes disolventes. En algunos casos, la proteína deseada se separa de las impurezas cuando las impurezas se adhieren específicamente a la columna y la proteína de interés no, es decir, la proteína de interés está presente en el "flujo directo". Por tanto, la purificación de proteínas recombinantes del cultivo celular de células huésped de mamífero puede incluir una o más etapas de afinidad (por ejemplo, proteína A) y/o de cromatografía de intercambio iónico.

La cromatografía de intercambio iónico es una técnica cromatográfica que se usa comúnmente para la purificación de proteínas. En la cromatografía de intercambio iónico, las irregularidades cargadas en la superficie del soluto se atraen por cargas opuestas unidas a una matriz de cromatografía, siempre que la fuerza iónica del tampón circundante sea baja. La elución se logra, en general, incrementando la fuerza iónica (es decir, la conductividad) del tampón para competir con el soluto por los sitios cargados de la matriz de intercambio iónico. Cambiar el pH y, de este modo, alterar la carga del soluto es otra manera de lograr la elución del soluto. El cambio de la conductividad o pH puede ser gradual (elución con gradiente) o escalonada (elución por etapas). En el pasado, estos cambios han sido progresivos; es decir, el pH o la conductividad se incrementan o disminuyen en una única dirección.

Para otros detalles de la purificación industrial de anticuerpos terapéuticos véase, por ejemplo, Fahrneret al.,Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 18:301-27 (2001).

Además de las células huésped de mamífero, se pueden usar otros organismos eucariotas como células huésped para la expresión de la proteína recombinante. Para la expresión en células huésped de levadura, tales como levadura de panadería común oSaccharomyces cerevisiae,los vectores adecuados incluyen vectores episómicamente replicantes basados en el plásmido de 2 micrómetros, vectores de integración y vectores de cromosomas artificiales de levadura (YAC). Otras levaduras adecuadas para la producción recombinante de proteínas heterólogas incluyenSchizosaccharomyces pombe(Beach y Nurse, Nature, 290: 140 (1981); documento EP 139.383 publicado el 2 de mayo de 1985); huéspedes deKluyveromyces(pat. de EE. UU. n.° 4.943.529; Fleeret al.,Bio/Technology, 2: 968 975 (1991)), tales como, por ejemplo,K. lactis(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourtet al.,J. Bacteriol., 737 (1983)),K. fragilis(ATCC 12.424),K. bulgaricus(ATCC 16.045),K. wickeramii(ATCC 24.178),K. waltii(ATCC 56.500),K. drosophilarum(ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8: 135 (1990)),K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia(documento EP 402.226);Pichia pastoris(EP 183.070; Sreekrishnaet al.,J. Basic Microbiol., 28: 265278 (1988));Candida; Trichoderma reesia(EP 244.234);Neurospora crassa(Caseet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259 5263 (1979));Schwanniomyces,tal comoSchwanniomyces occidentalis(documento EP 394.538 publicado el 31 de oct. de 1990); y hongos filamentosos, tales como, por ejemplo,Neurospora, Penicillium, Tolypocladium(documento WO 91/00357 publicado el 10 de enero de 1991), y huéspedes deAspergillus,tales comoA. nidulans(Ballanceet al.,Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284289 (1983); Tilburnet al.,Gene, 26: 205221 (1983); Yeltonet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470 1474 (1984)) yA. niger(Kelly y Hynes, EMBO J., 4: 475 479 (1985)). Las levaduras metilotrópicas son adecuadas en el presente documento e incluyen, pero no se limitan a, levaduras que pueden crecer en metanol, seleccionadas de los géneros que consisten enHansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, TorulopsisyRhodotorula.Una lista de especies específicas que son ejemplares de esta clase de levaduras se puede encontrar en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982). Los sistemas de expresión para las levaduras enumeradas y otras son bien conocidos en la técnica y/o están disponibles comercialmente.

Para la expresión en células huésped de insecto, tales como células Sf9, los vectores adecuados incluyen vectores baculovíricos. Para la expresión en células huésped vegetales, en particular, huéspedes de plantas dicotiledóneas, tales como tabaco, los vectores de expresión adecuados incluyen vectores derivados del plásmido Ti deAgrobacterium tumefaciens.

Los procedimientos para la producción, recuperación y purificación de proteínas recombinantes a partir de cultivos de células huésped distintas de mamífero también son bien conocidos en la técnica. Si los polipéptidos se producen en una célula distinta de mamífero, por ejemplo, un microorganismo, tal como hongos, los polipéptidos se recuperarán en el interior de la célula o en el espacio periplásmico (Kipriyanov y Little, Molecular Biotechnology, 12: 173201 (1999)). De ahí que sea necesario liberar la proteína de las células al medio extracelular por extracción, tal como lisis celular. Dicha ruptura libera todo el contenido de la célula en el homogeneizado, y además produce fragmentos subcelulares que son difíciles de retirar debido a su pequeño tamaño. En general, estos se retiran por centrifugación diferencial o por filtración.

La lisis celular típicamente se logra usando técnicas de ruptura mecánica, tales como homogeneización o molienda con cabezales. Aunque la proteína de interés se libera, en general, eficazmente, tales técnicas tienen varias desventajas (Engler, Protein Purification Process Engineering, Harrison eds., 3755 (1994)). Los incrementos de temperatura, que, a menudo, se producen durante el procesamiento, pueden dar como resultado la inactivación de la proteína. Además, la suspensión resultante contiene un amplio espectro de proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos contaminantes. Los ácidos nucleicos y los polisacáridos incrementan la viscosidad de la solución, lo que complica potencialmente el procesamiento posterior por centrifugación, filtración de flujo cruzado o cromatografía. Las asociaciones complejas de estos contaminantes con la proteína de interés pueden complicar el procedimiento de purificación y dar como resultado rendimientos inaceptablemente bajos. Se describen procedimientos mejorados para la purificación de polipéptidos heterólogos a partir de homogeneizado o caldo de fermentación microbiano, por ejemplo, en la patente de Ee . UU. n.° 7.169.908.

Se enfatiza que los procedimientos de fermentación, recuperación y purificación descritos en el presente documento son solo con propósitos ilustrativos. Los procedimientos de la presente invención se pueden combinar con cualquier procedimiento de fabricación desarrollado para la producción, recuperación y purificación de proteínas recombinantes.

2. Anticuerpos

Los procedimientos de la presente invención se usan para prevenir la reducción de enlaces disulfuro inter- y/o intracatenarios de anticuerpos terapéuticos. Los anticuerpos dentro del alcance de la presente invención incluyen, pero no se limitan a: trastuzumab (HERCEPTIN®) (Carteret al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 89:4285-4289 (1992), patente de EE. UU. n.° 5.725.856).

Muchos de estos anticuerpos se usan ampliamente en la práctica clínica para tratar diversas enfermedades, incluyendo cáncer.

En determinados modos de realización específicos, se usan los procedimientos de la presente invención para la producción de los siguientes anticuerpos.

Anticuerpos anti-HER2

Una versión humanizada recombinante del anticuerpo frente a HER2 murino 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, trastuzumab o HERCEPTIN®; patente de EE. UU. n.° 5.821.337) es clínicamente activa en pacientes con cánceres de mama metastásicos que sobreexpresan HER2 que han recibido extenso tratamiento antineoplásico anterior (Baselgaet al., J. Clin. Oncol.14:737-744(1996)). Trastuzumab recibió la autorización de comercialización de la Food and Drug Administration (FDA) el 25 de septiembre de 1998 para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico en los que sus tumores sobreexpresan la proteína HER2. En noviembre de 2006, la FDA autorizó Herceptin como parte de un régimen de tratamiento que contenía doxorrubicina, ciclofosfamida y paclitaxel, para el tratamiento complementario de pacientes con cáncer de mama con ganglios positivos y positivo para HER2.

En un modo de realización, los anticuerpos anti-HER2 comprenden las siguientes secuencias de dominio V<l>y V<h>:

V<l>de anticuerpo 2C4, versión 574, humanizado (SEQ ID NO:16)

D1QMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVS1GVAWYQQKPGKAPKLL1YSASY

RYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYY1YPYTFGQGTKVEIK.

y V<h>de anticuerpo 2C4, versión 574, humanizado (SEQ ID NO:17)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVAD

VNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYF

DYWGQGTLVTVSS.

En otro modo de realización, los anticuerpos anti-HER2 comprenden las secuencias de dominio V<l>(SEQ ID NO:18) y V<h>(SEQ ID NO:19) de trastuzumab como se muestra en la figura 21 y la figura 22, respectivamente.

Otros anticuerpos frente a HER2 con diversas propiedades se han descrito en Tagliabueet al.,Int. J. Cancer 47:933-937 (1991); McKenzieet al.,Oncogene 4:543-548 (1989); Maieret al.,Cancer Res.51:5361-5369 (1991); Bacuset al.,Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovskiet al.,PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacuset al.,Cancer Research 52:2580-2589 (1992); Xuet al.,Int. J. Cancer 53:401-408 (1993); documento WO94/00136; Kasprzyket al.,Cancer Research 52:2771-2776 (1992); Hancocket al.,Cancer Res. 51:4575-4580 (1991); Shawveret al.,Cancer Res. 54:1367-1373 (1994); Arteagaet al., Cancer Res.54:3758-3765 (1994); Harwerthet al.,J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992); patente de EE. UU. n.° 5.783.186; y Klapperet al.,Oncogene 14:2099-2109 (1997).

4. Procedimientos generales para la producción recombinante de anticuerpos

Los anticuerpos y otras proteínas recombinantes en el presente documento se pueden producir por técnicas bien conocidas de la tecnología de ADN recombinante. Por tanto, aparte de los anticuerpos específicamente identificados anteriormente, el profesional experto podría generar anticuerpos dirigidos contra un antígeno de interés, por ejemplo, usando las técnicas descritas a continuación.

Selección y preparación de antígenos

Los anticuerpos en el presente documento se dirigen contra un antígeno de interés, que es HER2.

Se pueden usar antígenos solubles o fragmentos de los mismos, conjugados opcionalmente a otras moléculas, como inmunógenos para generar anticuerpos. Para moléculas transmembranarias, tales como receptores, se pueden usar fragmentos de estos (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor) como inmunógeno. De forma alternativa, se pueden usar células que expresen la molécula transmembranaria como inmunógeno. Dichas células se pueden derivar de una fuente natural (por ejemplo, líneas de células de cáncer) o pueden ser células que se hayan transformado por técnicas recombinantes para expresar la molécula transmembranaria.

Otros antígenos y formas de los mismos útiles para preparar anticuerpos serán evidentes para los expertos en la técnica.

Anticuerpos policlonales (no forman parte de la presente invención, presentes con propósitos ilustrativos)

Se producen preferentemente anticuerpos policlonales en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (s.c.) o intraperitoneales (i.p.) del antígeno pertinente y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno a una proteína que sea inmunogénica en la especie que se va a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, seroalbúmina, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de la soja, usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoilsuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl<2>o R1N=C=NR, en la que R y R1 son grupos alquilo diferentes.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados combinando, por ejemplo, 100 |jg o 5 |jg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en sitios múltiples. Un mes más tarde, los animales se refuerzan con de 1/5 a 1/10 de la cantidad original de antígeno o conjugado en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días más tarde, se extrae sangre de los animales y el suero se somete a ensayo para determinar el valor de anticuerpos. Se administra una dosis de refuerzo a los animales hasta la meseta del valor. Preferentemente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. También se pueden preparar conjugados en cultivo de células recombinantes como fusiones de proteínas. También se usan adecuadamente agentes de agregación, tales como alumbre, para potenciar la respuesta inmunitaria.

Anticuerpos monoclonales

Se pueden preparar anticuerpos monoclonales usando el procedimiento de hibridoma descrito en primer lugar por Kohleret al., Nature,256:495 (1975), o se pueden preparar por procedimientos de ADN recombinante (patente de EE. UU. n.° 4.816.567).

En el procedimiento de hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster o un macaco, como se describe anteriormente en el presente documento, para inducir linfocitos que produzcan o puedan producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. De forma alternativa, los linfocitos se pueden inmunizarin vitro.

A continuación, se fusionan los linfocitos con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding,Monoclonal Antibodies: Principies and Practice,pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

Las células de hibridoma preparadas así se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado, por ejemplo, que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma originales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), previniendo dichas sustancias el crecimiento de células desprovistas de HGPRT.

Las células de mieloma preferentes son las que se fusionan eficazmente, soportan la producción estable a alto nivel de anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estas, las líneas de células de mieloma son líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de los tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California EE. UU., y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles del American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE. UU. También se han descrito líneas de células de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor,J. Immunol.,133:3001 (1984); Brodeuret al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma se somete a ensayo para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de uniónin vitro,tal como radioinmunoanálisis (RIA) o ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA).

Después de que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar por procedimientos de dilución limitante y cultivar por procedimientos estándar (Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma se pueden cultivarin vivocomo tumores ascíticos en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, líquido ascítico o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales, tales como, por ejemplo, cromatografía con proteína A-Sepharose, con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. Preferentemente, se usa el procedimiento de cromatografía con proteína A descrito en el presente documento.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que se puedan unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferente de dicho a Dn . Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que se transfecten, a continuación, en células huésped, tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma, que, de otro modo, no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes.

También se puede modificar el ADN, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes de la cadena pesada y ligera humana en lugar de las secuencias murinas homólogas (patente de EE. UU. n.° 4.816.567; Morrison,et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA,81:6851 (1984)), o uniendo de forma covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido distinto a inmunoglobulina.

Típicamente, dichos polipéptidos no inmunoglobulínicos se sustituyen con los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen con los dominios variables de un sitio de combinación con antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación con antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación con antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.

En otro modo de realización, se pueden aislar anticuerpos monoclonales de las colecciones de fagos con anticuerpos generadas usando las técnicas descritas en McCaffertyet al., Nature,348:552-554 (1990). Clacksonet al., Nature352:624-628 (1991) y Markset al., J. Mol. Biol.222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando colecciones de fagos. Las publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) por barajado de cadenas (Markset al., Bio/Technology,10:779-783 (1992)), así como la infección combinatoria y la recombinaciónin vivocomo una estrategia para construir colecciones de fagos muy grandes (Waterhouseet al., Nuc. Acids. Res.,21:2265-2266 (1993)). Por tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridoma tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

Anticuerpos humanizados y humanos

Un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en él de una fuente que no sea humana. Estos residuos de aminoácido no humanos a menudo se denominan residuos de "importación", que típicamente se toman de un dominio variable de "importación". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Joneset al., Nature,321:522-525 (1986); Riechmannet al., Nature,332:323-327 (1988); Verhoeyenet al., Science,239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las CDR o secuencias de CDR de roedor con las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de EE. UU. n.° 4.816.567) en los que se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto con la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen con residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se van a usar en la preparación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el llamado procedimiento de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba contra toda la colección de secuencias del dominio variable humanas conocidas. A continuación, la secuencia humana que sea la más cercana a la del roedor se acepta como la FR humana para el anticuerpo humanizado (Simset al., J. Immunol.,151:2296 (1993)). Otro procedimiento usa una región estructural particular derivada de la secuencia consenso de la totalidad de los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de las cadenas ligera o pesada. Se puede usar la misma región estructural para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carteret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89:4285 (1992); Prestaet al., J. Immnol,151:2623 (1993)).

Es importante además que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con un procedimiento preferente, los anticuerpos humanizados se preparan por un procedimiento de análisis de las secuencias originales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina están disponibles comúnmente y son consabidos por los expertos en la técnica. Están disponibles programas informáticos que ilustran y presentan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse a su antígeno. De esta manera, se pueden seleccionar y combinar residuos de FR de las secuencias receptoras y de importación de modo que se logre la característica de anticuerpo deseada, tal como afinidad incrementada por el/los antígeno(s) diana. En general, los residuos de CDR están directamente y lo más sustancialmente implicados en influir en la unión a antígeno.

De forma alternativa, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que, tras su inmunización, pueden producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión a la cadena pesada (J<h>) de anticuerpo en ratones mutantes quiméricos y de la estirpe germinal da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la micromatriz genética de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana en dichos ratones mutantes de la estirpe germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición a antígeno. Véanse, por ejemplo, Jakobovitset al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:2551 (1993); Jakobovitset al., Nature,362:255-258 (1993); Bruggermannet al., Year in Immuno.,7:33 (1993); y Duchosalet al., Nature355:258 (1992). También se pueden derivar anticuerpos humanos de colecciones de presentación en fagos (Hoogenboomet al., J. Mol. Biol.,227:381 (1991); Markset al., J. Mol. Biol.,222:581-597 (1991); Vaughanet al., Nature Biotech14:309 (1996)).

Fragmentos de anticuerpo

Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos derivaban por medio de digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véanse, por ejemplo, Morimotoet al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods24:107-117 (1992) y Brennanet al., Science,229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se pueden producir ahora directamente por células huésped recombinantes. Por ejemplo, se pueden aislar los fragmentos de anticuerpo de las colecciones de fagos con anticuerpos analizadas anteriormente. De forma alternativa, se pueden recuperar directamente los fragmentos Fab'-SH deE. coliy acoplar químicamente para formar fragmentos F(ab')<2>(Carteret al.,Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, se pueden aislar fragmentos F(ab')<2>directamente del cultivo de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el profesional experto.

Anticuerpos multiespecíficos

Los anticuerpos multiespecíficos tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes. Aunque dichas moléculas normalmente solo se unirán a dos antígenos (es decir, anticuerpos biespecíficos, BsAb), los anticuerpos con especificidades adicionales, tales como los anticuerpos triespecíficos, se engloban por esta expresión al usarse en el presente documento.

Son conocidos en la técnica procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millsteinet al., Nature,305:537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las que solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que normalmente se realiza por etapas de cromatografía de afinidad, es bastante engorrosa, y los rendimientos de producto son bajos. Se divulgan procedimientos similares en el documento WO 93/08829 y en Trauneckeret al., EMBO J.,10:3655-3659 (1991).

De acuerdo con otro enfoque descrito en el documento W096/27011, se puede genomanipular la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfase preferente comprende al menos una parte del dominio C<h>3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena(s) lateral(es) grande(s) en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando las cadenas laterales de aminoácidos grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero frente a otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, el otro a biotina. Por ejemplo, se han propuesto dichos anticuerpos para dirigir células del sistema inmunitario a células no deseadas (patente de EE. UU. n.° 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por el VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089). Se pueden preparar anticuerpos heteroconjugados usando cualquier procedimiento de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica y se divulgan en la patente de EE. UU. n.° 4.676.980, junto con una serie de técnicas de reticulación.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos usando un enlace químico. Brennanet al., Science,229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que se escinden proteolíticamente anticuerpos intactos para generar fragmentos F(ab')<2>. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente que forma complejos con ditiol arsenito de sodio para estabilizar los ditioles vecinos y prevenir la formación de disulfuro intermolecular. A continuación, los fragmentos Fab' generados se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). A continuación, uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte en Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

El reciente progreso ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH deE. coli,que se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalabyet al., J. Exp. Med.,175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de F(ab')<2>de anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se secretó por separado deE. coliy se sometió a acoplamiento químico dirigidoin vitropara formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado se pudo unir a células que sobreexpresaban el receptor ErbB2 y linfocitos T humanos normales, así como desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos frente a las dianas de tumores de mama humanos.

También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente del cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelnyet al., J. Immunol.,148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos de las cremalleras de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y, a continuación, se volvieron a oxidar para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este procedimiento también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollingeret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (V<h>) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (V<l>) por un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, los dominios V<h>y V<l>de un fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios V<l>y V<h>complementarios de otro fragmento, formando, de este modo, dos sitios de unión a antígeno. También se ha informado de otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico por el uso de dímeros de Fv monocatenario (sFv). Véase Gruberet al., J. Immunol.,152:5368 (1994). De forma alternativa, los anticuerpos pueden ser "anticuerpos lineales" como se describe en Zapataet al., Protein Eng.8(10): 1057-1062 (1995). En resumen, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (V<h>-C<h>1-V<h>-C<h>1) que forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tuttet al., J. Immunol.147: 60 (1991).

Inmunoadhesinas

El diseño de inmunoadhesina más simple y más directo combina el/los dominio(s) de unión de la adhesina (por ejemplo, el dominio extracelular (DEC) de un receptor) con las regiones bisagra y Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina. Habitualmente, cuando se preparan las inmunoadhesinas de la presente divulgación, el ácido nucleico que codifica el dominio de unión de la adhesina se fusionará de forma C terminal al ácido nucleico que codifica el extremo N de una secuencia del dominio constante de inmunoglobulina, sin embargo, también son posibles las fusiones N terminales.

Típicamente, en dichas fusiones, el polipéptido quimérico codificado retendrá al menos los dominios bisagra, Ch2 y Ch3 funcionalmente activos de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. También se realizan fusiones al extremo C de la porción Fc de un dominio constante, o inmediatamente N terminal con respecto al C<h>1 de la cadena pesada o la región correspondiente de la cadena ligera. El sitio preciso en el que se realiza la fusión no es crucial; los sitios particulares son bien conocidos y se pueden seleccionar para optimizar la actividad biológica, la secreción o las características de unión de la inmunoadhesina.

La secuencia de adhesina se puede fusionar al extremo N del dominio Fc de la inmunoglobulina G<1>(IgG<1>). Es posible fusionar toda la región constante de la cadena pesada a la secuencia de adhesina. Sin embargo, más preferentemente, se usa una secuencia que empieza en la región bisagra justo en dirección 5' del sitio de escisión por papaína que define químicamente Fc de IgG (es decir, el residuo 216, asumiendo que el primer residuo de la región constante de la cadena pesada es 114) o sitios análogos de otras inmunoglobulinas en la fusión. La secuencia de aminoácidos de adhesina se puede fusionar a (a) la región de bisagra y CH2 y CH3 o (b) los dominios Ch1, bisagra, Ch2 y Ch3 , de una cadena pesada de IgG.

Para las inmunoadhesinas biespecíficas, las inmunoadhesinas se ensamblan como multímeros, y, en particular, como heterodímeros o heterotetrámeros. En general, estas inmunoglobulinas ensambladas tendrán estructuras unitarias conocidas. Una unidad estructural básica de cuatro cadenas es la forma en la que existen IgG, IgD e IgE. Se repite una unidad de cuatro cadenas en las inmunoglobulinas de mayor peso molecular; la IgM existe, en general, como un pentámero de cuatro unidades básicas unidas entre sí por enlaces disulfuro. La globulina IgA, y ocasionalmente la globulina IgG, también pueden existir en forma multimérica en suero. En el caso del multímero, cada una de las cuatro unidades puede ser igual o diferente.

Se representan en diagrama esquemáticamente diversas inmunoadhesinas ensambladas ejemplares a continuación:

AC<l>-AC<l>;

ACh-(ACh, ACl-ACh, ACl-VhCh, o VlCl-ACh);

ACl-ACh-(ACl-ACh, ACl-VhCh, VlCl-ACh, o VlCl-VhCh)

ACl-VhCh-(ACh, o ACl-VhCh, o VlCl-ACh);

VlCl-ACh-(ACl-VhCh, o VlCl-ACh); y

(A-Y^-(VlCl-VhCh)2,

en las que cada A representa secuencias de aminoácidos de adhesina idénticas o diferentes;

Vl es un dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;

VH es un dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;

Cl es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;

CH es un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina;

n es un número entero mayor que 1;

Y designa el residuo de un agente de reticulación covalente.

Por motivos de brevedad, las estructuras anteriores solo muestran rasgos característicos clave; no indican unión (J) u otros dominios de las inmunoglobulinas, ni tampoco se muestran enlaces disulfuro. Sin embargo, si se requieren dichos dominios para la actividad de unión, se interpretará que están presentes en las localizaciones habituales que ocupan en las moléculas de inmunoglobulina.

De forma alternativa, las secuencias de adhesina se pueden insertar entre las secuencias de la cadena pesada y de la cadena ligera de inmunoglobulina, de modo que se obtiene una inmunoglobulina que comprende una cadena pesada quimérica. Las secuencias de adhesina se pueden fusionar al extremo 3' de una cadena pesada de inmunoglobulina en cada brazo de una inmunoglobulina, entre la bisagra y el dominio C<h>2, o bien entre los dominios C<h>2 y C<h>3. Se ha informado de construcciones similares por Hoogenboom,et al., Mol. Immunol.

28:1027-1037 (1991).

Aunque no se requiera la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en las inmunoadhesinas de la presente divulgación, una cadena ligera de inmunoglobulina puede estar presente asociada de forma covalente a un polipéptido de fusión cadena pesada de inmunoglobulina-adhesina o bien directamente fusionada a la adhesina. En el primer caso, el ADN que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina típicamente se coexpresa con el ADN que codifica la proteína de fusión cadena pesada de inmunoglobulina-adhesina. Tras la secreción, la cadena pesada híbrida y la cadena ligera se asociarán de forma covalente para proporcionar una estructura similar a inmunoglobulina que comprende dos pares cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina enlazadas por disulfuro. Los procedimientos adecuados para la preparación de dichas estructuras se divulgan, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567, presentada el 28 de marzo de 1989.

Las inmunoadhesinas se construyen lo más convenientemente fusionando la secuencia de ADNc que codifica la porción de adhesina sin cambio de pauta de lectura a una secuencia de ADNc de inmunoglobulina. Sin embargo, también se puede usar la fusión a fragmentos genómicos de inmunoglobulina (véase, por ejemplo, Aruffoet al., Cell61:1303-1313 (1990); y Stamenkovicet al.,Cell 66:1133-1144 (1991)). Este último tipo de fusión requiere la presencia de secuencias reguladoras de Ig para la expresión. Se pueden aislar ADNc que codifiquen regiones constantes de la cadena pesada de IgG en base a secuencias publicadas de colecciones de ADNc derivadas de bazo o linfocitos de sangre periférica, por hibridación o por técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los ADNc que codifican la "adhesina" y las partes de inmunoglobulina de la inmunoadhesina se insertan en tándem en un vector plasmídico que dirige la expresión eficaz en las células huésped elegidas.

Los siguientes ejemplos solo se ofrecen con propósitos ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención de ningún modo.

Ejemplos

Los reactivos disponibles comercialmente a los que se hace referencia en los ejemplos se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a menos que se indique de otro modo. La fuente de aquellas células identificadas en los siguientes ejemplos, y en toda la memoria descriptiva, por los números de acceso a ATCC es la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia.

Ejemplo 1

Descripción de los materiales y procedimientos

Los siguientes materiales y procedimientos se usaron en los ejemplos 2-8 a continuación.

Materiales

Los materiales y dispositivos usados en los experimentos descritos en los ejemplos experimentales incluyen: frascos de acero inoxidable (minidepósitos, Flow Components, Dublín, CA; cortos (50 cm3) y altos (55 cm3)); tubos de diálisis (Spectra/Por, 6-8000 MWCO, n.° de cat. 132645), filtro de 0,22 |jm (Millipore Millipak Gamma Gold, n.° de cat. MPGL04GH2); solución salina tamponada con fosfato (PBS, E<m>D, n.° de cat. 6506); ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, Sigma, n.° de cat. E4884); a-nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato (NADPH, Calbiochem, n.° de cat. 481973); deshidroepiandrosterona (DHEA, TCI, n.° de cat. D0044); sulfato cúprico (Sigma, n.° de cat. C8027), glucosa-6-fosfato (G6P, Calbiochem, n.° de cat. 346764); aurotioglucosa (ATG, USP, n.° de cat.

1045508); aurotiomalato (ATM, Alfa Aesar, n.° de cat. 39740); glutatión reducido (GSH, J.T. Baker, n.° de cat. M770-01); monobromobimano (mBB, Fluka, n.° de cat. 69898); histidina (J.T. Baker, n.° de cat. 2080-05); sulfato de sodio (J.T. Baker, n.° de cat. 3897-05); Trx (Sigma, n.° de cat. T8690); TrxR (Sigma, n.° de cat. T9698). Se usaron todos los productos químicos y reactivos como se recibieron sin purificación adicional. Se prepararon soluciones madre de EDTA (250 mM, pH 7,5), CuSO4 (10 mM), ATG (30 mM), ATM (30 mM), NADPH (75 mM), G6P (300 mM) para su uso en los estudios de evolución temporal en minidepósitos.

Generación de caldo de cultivo celular (CCF)

Para generar el CCF con ocrelizumab para los diversos estudios de reducción, se utilizó un procedimiento de fermentación a pequeña escala representativo similar a los procedimientos descritos previamente (Chaderjianet al.,2005). En resumen, se usaron biorreactores Applikon® de depósito agitado de vidrio de 3 litros equipados con impulsores de álabes inclinados para el cultivo para inoculación y los cultivos de producción con los componentes del medio de ocrelizumab. Los biorreactores estaban equipados con sondas calibradas de oxígeno disuelto (DO), pH y temperatura. El OD, el pH, la temperatura y la tasa de agitación se controlaron usando unidades de control digital para los parámetros definidos del procedimiento de fabricación de ocrelizumab. El volumen de trabajo tanto para el cultivo para inoculación como para los cultivos de producción fue de 1,5 l. Las muestras diarias se analizaron en un analizador de gases en sangre NOVA Bioprofile para garantizar la exactitud del valor en línea para el pH y el oxígeno disuelto, así como para supervisar las concentraciones de glucosa, lactato, amonio, glutamina, glutamato y sodio en los cultivos. También se tomaron muestras diarias para supervisar el crecimiento, la viabilidad y el valor celulares. El crecimiento celular se midió tanto por recuentos de células viables usando un ViCell, así como sobre una base de hematocrito (PCV). La viabilidad del cultivo se determinó por exclusión de azul tripano en un instrumento ViCell. Las muestras de sobrenadante se sometieron a ensayo por un procedimiento basado en HPLC para medir los valores de ocrelizumab.

Preparación del caldo de cultivo celular obtenido (HCCF)

La lisis completa del CCF se logró por homogeneización a alta presión usando un homogeneizador Microfluidics HC-8000. El regulador de presión del instrumento se estableció en 4000-8000 psi, y el CCF se introdujo a través del homogeneizador para obtener la lisis celular completa (rotura de membrana) después de una única pasada. El homogeneizado de CCF se recogió una vez que se purgó agua a través del sistema. El homogeneizado se transfirió a frasquitos de centrifugadora y se centrifugó en una centrifugadora de rotor Sorval RC-3B a 4500 rpm durante 30 minutos a 20 °C. El concentrado se decantó y, a continuación, se filtró en profundidad seguido de filtración estéril en 0,22 |jm usando una bomba peristáltica con tubo de silicio para generar el HCCF final a partir del CCF homogeneizado (100 % de lisis celular). De forma alternativa, el CCF se centrifugó directamente desde el fermentador sin ninguna homogeneización y, a continuación, el concentrado se filtró con un filtro de 0,22 jm estéril para generar el HCCF.

Manejo de minidepósitos

Se usó una campana de flujo laminar en el manejo de todos los minidepósitos y todos los materiales usados en los experimentos de incubación con HCCF se esterilizaron en autoclave o se enjuagaron usando isopropanol al 70 % para minimizar la contaminación bacteriana.

Ensayo con lactato deshidrogenasa

Para el ensayo con lactato deshidrogenasa, véase Babson & Babson (1973) y Legrandet al.,(1992).

Experimento de diálisis

Se llevó a cabo un experimento de diálisis para determinar si los componentes que provocan la reducción de ocrelizumab eran moléculas pequeñas o macromoléculas (es decir, enzimas).

Se dializó una muestra de 3 ml de ocrelizumab purificado y formulado (30,2 mg/ml) contra 1 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS, 10 mM, pH 7,2) durante 24 horas y se cambió la PBS después de 8 horas. La concentración de la muestra de ocrelizumab se ajustó, a continuación, a 1 mg/ml usando la absorbancia a 280 nm. Las alícuotas se almacenaron a -70 °C antes de su uso. El tubo de diálisis se hidrató durante la noche en una solución de acida al 0,05 % y se enjuagó con agua estéril antes de su uso. El HCCF obtenido de la homogeneización de CCF de un fermentador de 3 l se descongeló y se filtró a través de un filtro Millipak de 0,22 jm usando una bomba peristáltica. Se llenaron seis minidepósitos cortos con 30 ml de HCCF cada uno. A cada minidepósito, se añadieron 500 j l de muestra de ocrelizumab en un tubo de diálisis sellado. Los minidepósitos se sellaron y cargaron en un mezclador de sobremesa (Barnstead Lab-Line MAX Q 4000) que funcionaba a 35 rpm y a temperatura ambiente. Para cada punto de tiempo, se retiró un minidepósito del mezclador, y se tomaron alícuotas del HCCF (en el minidepósito) y muestra de ocrelizumab (en la bolsa de diálisis) y se almacenaron a -70 °C hasta que se analizaron con el ensayo de tiol libre y el ensayo con Bioanalyzer (descrito a continuación).

Inhibidores de prueba para la reducción en un sistema in vitro a pequeña escala

Se llenó un minidepósito alto con 27 ml de HCCF. Dependiendo del diseño del experimento, se añadieron diversos reactivos (NADPH, G6P, inhibidores de G6PD o TrxR) a la concentración deseada, y el volumen final en el minidepósito se llevó a 30 ml con PBS (10 mM, pH 7,2). Los minidepósitos se sellaron y cargaron en un mezclador de sobremesa que funcionaba a 35 rpm y a temperatura ambiente. En cada punto de tiempo para el muestreo, los exteriores de los minidepósitos se esterilizaron con IPA al 70 % y se abrieron en una campana de flujo laminar para la retirada de una alícuota. A continuación, los minidepósitos se volvieron a aumentar a escala y se cargaron, de nuevo, en el mezclador de sobremesa. Todas las alícuotas se almacenaron a -70 °C hasta que se analizaron con el ensayo de tiol libre y el ensayo con Bioanalyzer (descrito a continuación).

Estudios de Trx/Trx reductasa in vitro

Una solución de TrxR (hígado de rata) comercial (4|jM) se diluyó con agua para proporcionar una solución 2,86 j M. Se reconstituyó Trx liofilizada (humana) con PBS (10 mM, pH 7,2) proporcionando una solución 500 j M. Se prepararon una solución de NADPH 20 mM y soluciones de ATG y ATM 10 mM en agua.

En un tubo de microcentrifugadora de 1,5 ml de polipropileno negro, se mezclaron con cuidado 437 j l de PBS, 25 j l de NADPH, 16 j l de solución de ocrelizumab formulada (30,2 mg/ml) y 5 j l de Trx. La reacción se inició por adición de 17,5 j l de TrxR. Se incubó la reacción a temperatura ambiente durante 24 horas. Se tomaron alícuotas de 20 j l en cada punto de tiempo de muestreo y se almacenaron a -70 °C hasta que se analizaron por el ensayo con Bioanalyzer (véase a continuación). Se realizaron controles para determinar si la vía enzimática estaba activa cuando se omitía una enzima sustituyendo un volumen igual de PBS por Trx y/o bien TrxR en la mezcla de reacción.

Se demostró la inhibición del sistema de Trx usando las mismas condiciones de reacción descritas anteriormente con la adición de 5 j l de ATG o ATM. Para demostrar la inhibición del sistema de Trx por Cu2+, se añadieron 2,5 j l de CuSO4 (10 mM) a la mezcla de reacción usando las mismas enzimas, pero un tampón diferente (histidina 10 mM, Na2SO410 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,5 mM, pH 7,0) para prevenir la formación de Cu3(PO4)2 insoluble.

Ensayo de tiol libre

Se generó una curva de calibración usando GSH en PBS (10 mM, pH 6,0±0,05). A partir de una solución de GSH 110 mM, se prepararon patrones en concentraciones de 0, 5.5, 11,22, 44, 55, 110 y 550<j>M a través de dilución en serie. A partir de una solución madre de acetonitrilo de mBB (10 mM almacenada a -20 °C), se preparó una solución 100<j>M de mBB en PBS (10 mM, pH 10,0±0,05) y se almacenó lejos de la luz.

En una placa de 96 pocillos de fondo plano negra, se distribuyeron 100 j l de mBB en cada pocillo. Para la curva de calibración, se añadieron 10 j l de solución de GSH patrón, proporcionando un pH de trabajo de 8,0 ± 0,2. Para las muestras, se añadieron 10 j l de muestra a los pocillos. Todos los pocillos se prepararon por triplicado. Se incubó la placa a temperatura ambiente durante 1 hora en la oscuridad y, a continuación, se leyó usando un lector de placas de fluorescencia (Molecular Devices SpectraMax® Gemini XS) con una longitud de onda de excitación de 390 nm y una longitud de onda de emisión de 490 nm. Se generó una curva de calibración lineal usando el resultado promedio de los tres pocillos patrón representados frente a la concentración de GSH. Los niveles de tiol libre en las muestras se calcularon a partir de la ecuación lineal de la curva de calibración usando el valor promedio de los tres pocillos de muestra.

Ensayo con Bioanalyzer

Se adquirieron mediciones de electroforesis capilar usando el 2100 Bioanalyzer de Agilent. La preparación de la muestra se llevó a cabo como se describe en el Protein 230 Assay Protocol de Agilent (número de pieza manual G2938-90052) con cambios minoritarios. Las muestras de HCCF se diluyeron 1:4 y las muestras de proteína A se diluyeron a 1,0 g/l con agua antes de la preparación. Para las muestras de HCCF en la etapa de desnaturalización, se añadieron 24 j l de una solución de yodoacetamida (IAM) 50 mM, SDS al 0,5 %, además de los 2 j l de solución desnaturalizante proporcionada. Para las muestras de proteína A, se usaron SDS al 0,5 % sin IAM y 2 |jl de solución desnaturalizante. Se generaron imágenes similares a gel digitales usando el programa informático 2100 Expert de Agilent.

Soluciones madre para estudios de tiempo de espera en HCCF

Se usaron tres soluciones madre separadas en los estudios de tiempo de espera en HCCF a escala de laboratorio: (1) Solución madre 250 mM de EDTA (pH 7,4) preparada usando e Dt A, dihidrato disódico (Mallinckrodt, n.° de cat.

7727-06 o Sigma, n.° de cat. E-5134) y EDTA, dihidrato tetrasódico (Sigma, n.° de cat. E-6511), (2) solución madre 50 mM de sulfato cúprico pentahidratado (CuSO4, Sigma, n.° de cat. C-8027), y (3) solución de ácido acético 1 M (Mallinckrodt, n.° de cat. V193).

Adiciones de inhibidores y combinación de caldo de cultivo celular (CCF)

Se añadió una solución madre de EDTA 250 mM o bien CuSO450 mM al CCF antes de la homogeneización para evaluar un intervalo de concentraciones finales para prevenir la reducción de disulfuros de anticuerpo. Una vez que se generó el HCCF final a partir del CCF homogeneizado, a continuación, estas soluciones se mezclaron con el HCCF generado a partir del CCF no homogeneizado (que también contenía EDTA o CuSO4) para diluir y disminuir el nivel total de lisis celular a por debajo de un 100 % máximo. De forma alternativa, se añadió una solución madre de ácido acético 1 M a una solución de HCCF combinada final (CCF homogeneizado y CCF no homogeneizado) para disminuir el pH de la solución para prevenir la reducción de disulfuros de anticuerpo.

Se mantuvieron aproximadamente 30 - 50 ml de cada solución de HCCF (que contenía EDTA, CuSO4, ácido acético o ninguna adición para el control) en un frasco de acero inoxidable 316L de 50 ml. Se selló el frasco con una pinza y no se aireó ni agitó la solución. El frasco se almacenó a temperatura ambiente (18 - 22 °C). En puntos de tiempo predeterminados, se retiró la solución y se purificó sobre una resina de afinidad de proteína A a escala de laboratorio.

Se pueden obtener resultados similares con otros agentes oxidantes, tales como, por ejemplo, cistina y glutatión oxidado.

Inyección de aire

Para evaluar la inyección de aire del HCCF generado a partir del CCF homogeneizado para prevenir la reducción de disulfuros de anticuerpo, se utilizaron recipientes de vidrio de 3 l o de acero inoxidable de 15 l.

Aproximadamente 1-5 l de HCCF se filtró de forma estéril en 0,22 |jm en cada recipiente esterilizado. Las condiciones experimentales se mantuvieron a 18-22 °C y agitación a 50 (fermentador de 15 l) o 275 rpm (fermentador de 3 l) con o sin control de pH por adición de dióxido de carbono.

Se inyectó aire en las soluciones para incrementar el nivel de oxígeno disuelto hasta la saturación con aire o bien nitrógeno (control) para retirar cualquier oxígeno disuelto en la solución. El flujo de gas en cada recipiente fue variable dependiendo de si se usaba una tasa de aireación constante o se mantenía un nivel mínimo de oxígeno disuelto. En puntos de tiempo predeterminados, se retiraron muestras de 25-50 ml de ambos recipientes y se purificaron sobre una resina de afinidad de proteína A a escala de laboratorio antes del análisis.

Procesamiento con proteína A

El anticuerpo en las muestras de caldo de cultivo celular obtenido se puede capturar y purificar usando una resina de cromatografía de afinidad específica. Se seleccionó la resina de proteína A (Millipore, Prosep-vA High Capacity) como la resina de afinidad para la purificación de anticuerpos. Se rellenó la resina en una columna de vidrio de diámetro interior de 0,66 cm (Omnifit®) con una altura de lecho de 14 cm que dio como resultado un volumen de columna final de 4,8 ml. La cromatografía se realizó usando un sistema de cromatografía AKTA Explorer 100 (GE Healthcare).

Se expuso la resina a tampones y HCCF a un caudal lineal de entre 350-560 cm/h. La resina se equilibró con Tris 25 mM, NaCl 25 mM, EDT<a>5 mM, pH 7,1. Para cada purificación, la resina se cargó con entre 5 - 15 mg de anticuerpo por ml de resina. La concentración de anticuerpos en el HCCF se determinó usando una columna de HPLC con proteína A inmovilizada (Applied BIOSYSTEMS, POROS A). Después de cargarse, la resina se lavó con Tris 25 mM, NaCl 25 mM, EDTA 5 mM, TMAC 0,5 M, pH 7,1, y, a continuación, el anticuerpo se eluyó usando ácido acético 0,1 M, pH 2,9. El grupo de elución se basó en la absorbancia UV a 280 nm medida en línea después de la columna. Los grupos de elución purificados se ajustaron al pH usando HEPES sodio 1 M a pH 5,0-5,5. Después de la regeneración de la resina con ácido fosfórico 0,1 M, se usaron las mismas o similares resinas rellenadas para la purificación posterior de otras soluciones de HCCF.

La concentración de anticuerpos en el grupo de proteína A purificado se midió usando espectrometría UV a 280 nm. Los grupos de elución de proteína A purificados se analizaron por el ensayo con Bioanalyzer para cuantificar el porcentaje de anticuerpo intacto a un peso molecular de 150 kDa.

Ejemplo 2

Experimento de diálisis

Se diseñó y llevó a cabo un experimento de diálisis para determinar si la reducción de ocrelizumab estaba provocada por moléculas reductoras pequeñas o macromoléculas (por ejemplo, enzimas). En este experimento de diálisis, se colocó ocrelizumab intacto purificado en una bolsa de diálisis con un valor de corte de peso molecular (MWCO) de 7000 y se incubó la bolsa de diálisis en el HCCF que contenía ocrelizumab en un minidepósito de acero inoxidable. Como se muestra en las figuras 1 y 2, el ocrelizumab en el interior de la bolsa no se redujo después del periodo de incubación (figura 1), mientras que el ocrelizumab en el exterior de la bolsa en el HCCF se redujo significativamente poco después de que se iniciara la incubación. Esto se evidenció por la pérdida de ocrelizumab intacto (~150 kDa) y la formación de fragmentos de ocrelizumab (diversas combinaciones de cadenas pesadas y ligeras) (figura 2). El análisis por espectrometría de masas de ocrelizumab en los grupos de elución de proteína A de las tandas de fabricación reducidas indicó que los fragmentos observados se formaron por reducción de solo los enlaces disulfuro intercatenarios.

La medición de tiol libre mostró que no estaban presentes tioles libres en el interior de la bolsa de diálisis al inicio de la incubación; sin embargo, los niveles de tioles libres en el interior y en el exterior de la bolsa de diálisis se vuelven comparables en menos de cinco horas después de que se iniciara la incubación, lo que indica que los componentes de molécula pequeña en el HCCF están completamente equilibrados en el interior y en el exterior de la bolsa de diálisis (figura 3). Puesto que la reducción se observó solo en el exterior, pero no en el interior, de la bolsa de diálisis con un MWCO de 7000 Da, el peso molecular de la(s) molécula(s) reductora(s) debe de ser mayor de 7000 Da. Por tanto, una reacción enzimática es responsable de la reducción de ocrelizumab.

Ejemplo 3

Reducción de ocrelizumab (rhuMAb 2H7, variante A) por Trx/TrxR in vitro

El sistema de Trx se sometió a prueba para determinar su capacidad de reducir ocrelizumabin vitroincubando ocrelizumab intacto con Trx, TrxR y NADPH. Los resultados del Bioanalyzer indican que se redujo ocrelizumabin vitropor el sistema de Trx (figura 5). La tasa de reducción en este sistemain vitroparece ser más lenta que en el HCCF (por ejemplo, en comparación con la reducción mostrada en la figura 2). Esto se debe probablemente a menores concentraciones de las enzimas (Trx y Trx-R) y/o al sistema tampón usado en la reacciónin vitroporque la tasa de reacción del sistema de Trx es dependiente tanto de las concentraciones de enzima como de los sistemas tampón.

Ejemplo 4

Inhibidores del sistema de Trx

(i) Inhibición de la reducción de anticuerpo recombinante por sulfato cúprico

El sulfato cúprico es conocido por su capacidad de proporcionar un potencial rédox oxidante y se ha usado en los procedimientos de cultivo celular para minimizar los niveles de tiol libre (es decir, minimizar la cisteína no emparejada) en moléculas de anticuerpo recombinante (Chaderjianet al.,2005,supra).Se sometió a prueba el sulfato cúprico para determinar la eficacia en la inhibición del sistema de Trxin vitroy la posterior reducción de ocrelizumab. En este experimento de reducciónin vitro,el sistema tampón se cambió de PBS a sulfato de histidina para evitar la formación de Cu3(PO4)2 insoluble. La figura 8 muestra que ocrelizumab se redujo fácilmente por el sistema de Trx en el tampón de sulfato de histidina (incluso más rápido que en el tampón de PBS). La adición de CuSO4 a esta reacción inhibe claramente la reducción de ocrelizumab (figura 9).

(ii) Inhibición de la reducción de anticuerpo recombinante en HCCF por ATG y ATM

Se sometieron a prueba dos inhibidores específicos disponibles comercialmente de TrxR, aurotioglucosa (ATG) y aurotiomalato (ATM) para determinar su capacidad de inhibir el sistema de Trxin vitroy la reducción de ocrelizumab. Tanto ATG como ATM pueden inhibir eficazmente la reducción de ocrelizumab en el ensayo descrito anteriormente (véanse las figuras 6 y 7). La adición de aurotioglucosa o aurotiomalato, a una concentración de 1 mM a la misma mezcla de reacción como se describe en la leyenda de la figura 5, inhibió eficazmente la reducción de ocrelizumab como se muestra en la imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer.

Si el sistema de Trx estaba activo en el HCCF y reducía ocrelizumab como se observa en las tandas de fabricación que dieron como resultado moléculas de anticuerpo reducido o en los experimentos a escala de laboratorio, ambos compuestos de oro (ATG y ATM) deberían poder inhibir la reducción de ocrelizumab en el HCCF. La figura 10 muestra que ocrelizumab se redujo fácilmente en un HCCF de CCT homogeneizado generado a partir de un fermentador de 3 l después de un periodo de incubación. Sin embargo, el acontecimiento de reducción de ocrelizumab se inhibía completamente cuando se añadía ATG o bien ATM 1 mM al HCCF (figuras 11 y 12). Estos resultados demostraron que el sistema de Trx es activo en el HCCF y es directamente responsable de la reducción de ocrelizumab.

Ejemplo 5

La fuente de NADPH para la actividad del sistema de Trx y los papeles de G6P y glucosa en el mecanismo de reducción

La reducción de disulfuros por el sistema de Trx requiere los equivalentes reductores de NADPH (figura 4). La principal vía metabólica celular que proporciona NADPH para todas las reacciones de biosíntesis reductora es la vía de la pentosa fosfato. Para que se produzca el acontecimiento de reducción de anticuerpos, las enzimas en esta vía todavía deben estar activas en el HCCF para mantener el sistema de Trx activo. Como mínimo, la primera etapa en la vía de la pentosa fosfato (catalizada por G6PD) debe ser activa para reducir NADP+ a NADPH al convertir G6P en 6-fosfogluconolactona. Además, lo más probable es que G6P se produzca a partir de glucosa y 5'-trifosfato de adenosina (ATP) por la actividad de hexocinasa en HCCF. El mecanismo global de reducción de ocrelizumab se resume en la figura 4.

La actividad reductora en el HCCF parecía ser transitoria en algunos casos y se puede inhibir con el tiempo en determinadas condiciones de almacenamiento o después de múltiples ciclos de congelación/descongelación. El HCCF que ha perdido completamente la actividad reductora proporcionó una oportunidad de explorar el papel de NADPH y G6P en la reducción de ocrelizumab por el sistema de Trx.

Un HCCF de una tanda de fabricación a gran escala (la tanda "beta") se sometió a varios ciclos de congelación/descongelación y se usó en un experimento diseñado para medir la reducción; no se observó ninguna reducción de ocrelizumab (figura 13) a pesar de su capacidad de ocasionar la reducción de anticuerpos observada previamente en el HCCF recién descongelado de esta misma fermentación. Se añadió NADPH a este HCCF no reductor a una concentración de 5 mM y retornó el acontecimiento de reducción (figura 14). Por lo tanto, el sistema de Trx todavía está intacto y activo en el HCCF donde ya no se produce la reducción, y puede reducir la proteína y/o anticuerpo si se suministra con cofactores. Además, la actividad reductora se perdía con el tiempo a medida que se agotaba la fuente de NADPH (supuestamente debido a la oxidación de NADPH por la totalidad de las reacciones reductoras que compiten por NADPH), y no porque el sistema de Trx se degradara o inactivara.

Esto se verificó por otro experimento. Se añadió G6P 10 mM a un HCCF que se había congelado-descongelado repetidamente de la tanda beta. Esta adición de G6P reactivó el sistema de Trx que posteriormente redujo ocrelizumab en el experimento de incubación con HCCF (figura 15). Esto demostró que la reducción de ocrelizumab en el HCCF estaba provocada por las actividades tanto del sistema de Trx como de G6PD. Además, la G6PD todavía está activa en un HCCF congelado/descongelado repetidamente de la tanda beta; la pérdida de la actividad de reducción en esta tanda beta del HCCF congelado/descongelado repetidamente parece deberse al agotamiento de G6P, que eliminó, por tanto, la conversión de NADP+ en NADPH.

En nuestros estudios, hemos observado que el EDTA puede inhibir eficazmente la reducción de ocrelizumab en el experimento de incubación con HCCF. Como se muestra en la figura 16, ocrelizumab se redujo después de incubar el HCCF de una tanda de fabricación de ocrelizumab a escala de 12.000 l (no se congeló/descongeló repetidamente y no hubo pérdida de actividad reductora) a temperatura ambiente durante más de 19 horas. Sin embargo, la reducción se inhibió completamente cuando se añadió EDTA 20 mM al HCCF de 12 kl y se mantuvo en un minidepósito de acero inoxidable separado (figura 17). En la primera etapa de la glucólisis, la hexocinasa cataliza la transferencia del grupo fosfato de Mg2+-ATP a glucosa, una reacción que requiere la complejación de Mg2+ con ATP (Hammes & Kochavi, 1962a & 1962b,supra).Puesto que el EDTA es un quelante de iones metálicos, especialmente para Mg2+, puede ser un inhibidor eficaz de hexocinasa. La observación de que una cantidad en exceso de EDTA puede bloquear eficazmente la reducción indica la implicación de la hexocinasa (es decir, la proporción de G6P) en el mecanismo de reducción de ocrelizumab. Sin ceñirse a esta teoría, ni a ninguna otra, el EDTA bloquea la reducción de ocrelizumab al eliminar la actividad de hexocinasa y, de este modo, reducir el nivel de G6P disponible para G6PD y, posteriormente, el nivel de NADPH disponible para el sistema de Trx.

Aunque el EDTA sea muy eficaz en el bloqueo de la reducción de ocrelizumab en HCCF recién preparado, no pudo prevenir la reducción de ocrelizumab en el HCCF de la tanda beta en el que se perdió la actividad del sistema de Trx y, a continuación, se reactivó por adición de G6P. Por ejemplo, la reducción de ocrelizumab se observó en un experimento de incubación con HCCF en el que se añadieron G6P 5 mM y EDTA 20 mM (concentraciones finales) al HCCF de la tanda beta que había perdido completamente la actividad reductora (figura 18). Sin embargo, no se observó ninguna reducción en el experimento de incubación de control en el que no se añadieron G6P ni EDTA. Sin ceñirse a esta teoría, ni a ninguna otra, el EDTA usado de esta manera no puede inhibir, por lo tanto, ni el sistema de Trx ni la G6PD, y puede funcionar como un inhibidor de hexocinasa, que produce la G6P para la G6PD. Sin G6P, el sistema de Trx no se suministraría con la NADPH necesaria para la actividad.

Ejemplo 6

Inhibición de la reducción de anticuerpo recombinante por DHEA

La deshidroepiandrosterona (DHEA), así como otros inhibidores de G6PD similares, bloquea eficazmente la actividad de G6PD (Gordonet al.,1995,supra).Los inhibidores de G6PD también previenen la reducción de un anticuerpo en HCCF, por ejemplo, ocrelizumab, al bloquear la generación de NADPH. La capacidad de DHEA de inhibir la reducción de ocrelizumab se demuestra en un experimento de incubación con HCCF. La adición de DHEA a un HCCF previene la reducción de anticuerpos.

La DHEA típicamente se usa en el intervalo de concentraciones de aproximadamente 0,05 mM a aproximadamente 5 mM. La DHEA también típicamente se usa en el intervalo de concentraciones de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 2,5 mM.

Ejemplo 7

Inhibición de la reducción de anticuerpo recombinante por adiciones de (i) EDTA, (ii) sulfato cúprico y (iii) ácido acético

Se almacenaron cuatro HCCF diferentes y se mantuvieron en los frascos de acero inoxidable. Las soluciones fueron similares en la cantidad de lisis celular, que se generaron diluyendo HCCF a partir del CCF homogeneizado con HCCF a partir del CCF no homogeneizado. Por ejemplo, se mezclaron 150 ml de la primera solución lisada con 50 ml de la segunda solución, respectivamente. Las cuatro mezclas de HCCF evaluadas en este estudio contenían: (1) EDTA 20 mM, (2) CuSÜ430|jM, (3) ácido acético 15 mM (pH 5,5) y (4) no se añadió ningún inhibidor químico para la solución de control. El anticuerpo ocrelizumab de las cuatro mezclas se purificó inmediatamente (t = 0 h) usando cromatografía con proteína A y, a continuación, de nuevo después de 20 h y 40 h de almacenamiento en los frascos de acero inoxidable. Los grupos de elución de proteína A purificados se analizaron por el ensayo con Bioanalyzer para cuantificar el porcentaje de anticuerpo intacto (150 kDa). Los resultados mostraron que más de un 90 % del anticuerpo intacto estaba presente en las cuatro mezclas en el punto de tiempo inicial (figura 19). Sin embargo, en el punto de tiempo de 20 h, no se detectó ningún anticuerpo intacto en la mezcla de control (sin ninguna adición), lo que indica la reducción de los enlaces disulfuro de anticuerpo. En las otras tres mezclas, todavía se detectó más de un 90 % del anticuerpo intacto en los puntos de tiempo de 20 h y 40 h, lo que demuestra la prevención de la reducción de enlaces disulfuro por los tres inhibidores sometidos a prueba.

Ejemplo 8

Inhibición de la reducción de anticuerpo recombinante por inyección de aire en el HCCF

Se almacenó una mezcla de HCCF generada a partir del CCF homogeneizado y se mantuvo en dos fermentadores de acero inoxidable de 10 l separados. Se inyectó aire en un recipiente mientras que se inyectó gas nitrógeno en el otro recipiente. El anticuerpo ocrelizumab se purificó inmediatamente (t = 0 h) a partir de la mezcla inicial usando cromatografía con proteína A. En los puntos de tiempo seleccionados, se retiraron muestras de 50 ml de cada recipiente y el anticuerpo se purificó usando cromatografía con proteína A. A continuación, se analizaron los grupos de elución de proteína A purificados por el ensayo con Bioanalyzer para cuantificar el porcentaje de anticuerpo intacto a 150 kDa. Los resultados mostraron que aproximadamente un 85 % del anticuerpo intacto estaba presente en la solución inicial (figura 20), lo que indica cierta reducción incipiente de los enlaces disulfuro de anticuerpo antes de la exposición al oxígeno (es decir, aire inyectado en el fermentador). Una vez que se inyectó aire en la mezcla durante dos horas, se midió más de un 90 % del anticuerpo intacto durante el resto del estudio de 36 h. Por el contrario, cuando se inyecto gas nitrógeno en la mezcla, el acontecimiento de reducción de anticuerpos continuó como se mide a las 2 h (28 % de pico de 150 kDa) y a las 6 h (5 % de pico de 150 kDa). Estos resultados demostraron la prevención de la reducción de enlaces disulfuro en el anticuerpo cuando la mezcla de HCCF generada a partir del CCF homogeneizado se expuso a oxígeno.

Ejemplo 9

Diseño de inhibidores de Trx de ARNip o nucleótidos antisentido dirigidos

El diseño de ARNip o nucleótidos antisentido dirigidos para los genes como se encuentran en las células CHÜ se puede realizar usando secuencias disponibles públicamente, tales como las de tiorredoxina TrxA deE. co li(SEQ ID NO:30), tiorredoxina reductasa TrxB deE. coli(SEQ ID NO:31); tiorredoxina 1 de ratón (SEQ ID NO:32), tiorredoxina 2 de ratón (SEQ ID NO:33), tiorredoxina reductasa 1 de ratón (SEQ ID NO:34) y tiorredoxina reductasa 2 de ratón (SEQ ID NO:35). Un experto en la técnica puede usar estas secuencias para seleccionar secuencias para diseñar inhibidores de Trx para dirigirse a enzimas en diferentes organismos y/o células, tales como células CHÜ.

La secuencia de la tiorredoxina TrxA deE. colies:

ATG T ÍA CAC CAA CAA COA AAC CAA CAC GCC AGG CTT ATI' CCI GTG GAG

TTA TAI' ATG AGC GAT AAA ATT AT T CAC CTG ACT GAC GAC AGT ITT GAC

ACG GAT GTA CTC AAA GCG GAC GGG GCG ATC CTC GTC GAT TTC TGG GCA

GAG TGG TGC GGT CCG TGC AAA ATG ATC GCC CCG ATT' CTG GAT GAA ATC

GCT GAC GAA TAT C’AG GGC AAA CTG ACC GTT GCA AAA CTG AAC ATC GAT

CAA AAC CCT GGC ACT GCG CCG AAA TAT GGC ATC CGT GGT ATC CCG ACT’

CT G CTG CTG TTC AAA AAC GGT’ GAA GTG GCG GCA ACC AAA GTG GGT GCA CTG TCT AAA GGT CAG TTG AAA GAG TIC CTC GAC GCT AAC CTG GCG TAA (SEQ ID NO:30).

La secuencia de la tiorredoxina TrxB deE. colies:

ATO GGC ACG ACC AAA CAC AGT AAA CTG CTT ATC CTG GGT TCA GGC CCG GCG GGA TAC ACC GCT GCT GTC TAC GCG GCG CGC GCC AAC CTG CAA CCT GTG CIX<j>ATT ACC GGC ATG GAA AAA GGC GGC CAA CTG ACC ACC ACC ACG GAA GTG GAA AAC TGG CCT GGC GAT CCA AAC GAT CTG ACC GGT CCG T I A TTA ATG GAG CGC ATG CAC GAA CAT GCC ACC AAG ITT GAA ACT GAG ATC ATT TTT GAT CAT ATC AAC AAG GTG GAT' CT’G CAA AAC CGT CCG 1TC CGT CTG AAT GGC GAT AAC GGC GAA TAC ACT' TGC GAC GCG CTG ATT' ATT GCC ACC GGA GCT TCT GCA CGC TAT CTC GGC CTG CCC TCT GAA GAA GCC TTT AAA GGC CGT' GGG GT'T TCT GCT’ TGT GCA ACC TGC GAC GGT TTC TTC TA I' CGC AAC CAG AAA GT'T GCG GTC ATC GGC GGC GGC AAT ACC GCG GTT GAA GAG GCG TTG TAT CTG TCT AAC ATC GCT TCG GAA GTG C A Í CTG ATT' CAC CGC CGT GAC GGT' TTC CGC GCG GAA AAA ATC CTC ATT' AAG CGC CTG ATG GAT' AAA GTG CAG AAC GGC AAC ATC ATT CTG CAC ACC AAC CGT ACG CTG GAA GAA GTG ACC GGC GAP CAA ATG GGT GTC ACT GGC GTT CGT CTG CGC GAT ACG CAA AAC AGC GAT AAC ATC GAG TCA CTC GAC GTT GCC GGT CTG TTTGTTGCT ATC GG T CAC AGC CCG AAT ACT GCG ATT TTC GAA GGG CAG CTG GAA CTG GAA AAC GGC TAC ATC AAA GTA CAG TCG GGT ATT CAT GGT AAT GCC ACC CAG ACC AGC ATI’ CCT GGC GTC TTT GCC GCA GGC GAC GTG ATG GAT' CAC ATT T AI’ CGC CAG GCC ATT' ACT' TCG GCC GGT' ACA GGC T GC ATG GCA GCA CTT GA P GCG GAA CGC PAC CTC GAT GGT 'H A GCT GAC GCA AAA TAA (SEQ ÍDNO:31).

La secuencia de la tiorredoxina 1 de ratón es:

ATGGTGAAGCTGATCGAGAGCAAGGAAGCTTTTCAGGAGGCCCTGGCCGCCGCGG GAGACAAGCTTGTCGTGGTGGACTTCTCTGCTACGTGGTGTGGACCTTGCAAAATG ATCAAGCCCTTCT'T’CCATTCCCTCTGTGACAAGTATTCCAATGTGGTGTTCCT'T'GAA GTGGATGTGGATGACTGCCAGGA'TGTTGCTGCAGAC'TGTGAAGTCAAATGCATGC CGACCTTCCAGTTTTATAAAAAGGGTCAAAAGGTGGGGGAGTTCTCCGGTGCTAA CAAGGAAAAGCTTGAAGCCTCTATTACTGAATATGCCTAA (SEQ ID NO:32).

La secuencia de la tiorredoxina 2 de ratón es:

ATGGCTCAGCGGCTCCTCCTGGGGAGGTTCC TGACCTCAGTCATCTCCAGGAAGCC TCCTCAGGGTGTG IGGGC'J rCCCTCACCTCTAAGACCCTGCAGACCCCTCAGTACA ATGCTGG1GG J C1AACAG ÍAA rCJCCCAGCCCAGCCCGCACAG I ACACACCACCAGAG'l'C'J’G 'n ’TGACGACCTTTAACGTCCAGGATGGACCTGACnTCAAGACAGAG'ITGTCAACAGTGAGACACCAGTTGTTGTGGACTFTCATGCACAGTGGTGTGGCCCCTGC AAGATCCTAGGACCGCGGCTAGAGAAGATGGTCGCCAAGCAGCACGGGAAGGTG GTCATGGCCAAAGTGGACA JTGACGAl'CACACAGACCr IGCCAJ IGAAl Al GACXj TG rCAGCTGTGCCTACCGTGCTAGCCATCAAG AACGGGGACG I GGTGGACAAGTTrGTGGGGATCAAGGACGAGGACCAGCTAGAAGCClTCC'iGAAGAACiCTGATrGGCTGA (SRQ ID NO:33).

La secuencia de la tiorredoxina reductasa 1 de ratón es:

ATGAATGGCTCCAAAGATCCCCCTGGGTCCTATGACITCGACCTGATCATCATTGGAGGAGGCTCAGGAGGAC 1GGCAGCAGCTAAGGAGGCAGCCAAAI"HGACAAGAA AGICC Í GCI CITGGATIrTGTCACACCGAC'i'CCI’CiTGGGACCAGA rOGGG'lG’TCG GAGGAACG-1 GTGTGAATGTGGG'n GCA J'ACC J AAGAAGCTGATGCACCAGGCAGCÍT JGC 1CGGACAAGCTCTGAAAGACTCGCGCAACl'A IGGt.TGGAAAGTCGAAGAC AC'AGTGAAGCATGACTGGGAGAAAA 1GACGGAA1C FGTGCAGAGTCACA J CGGC F CGCTGAACTGGGGC rACCGCGTAGCTCTCCGGGAGAAAAAGGTCGTCTA 1GAGAA TGCTrACGGGAGGTTCATTGGTCCTCACAGGA TTGTGGCGACAAA FAACAAAGGT AAAGAAAAAA IC I A'1ICAGCAGAGCGG'rTCC l CA rCGCGACAGG l'GAGAGGCCCC GCTACC IGGGCA'l CCCJ'GGAGACAAAGAG IV\CTGCATCAGCAGTG A 1 GA'lCJ1TT C rCCTTGCCrrACTGCCCGGGGAAGACCCTAG 1AG1'rGGTÜCATCC I ATGTCGCCT TGGAATGTGCAGG ATTTCTGGCTGGTATCGGCTiAGACGTCACTGTAATGGTGCGGICCAFIC'ÍCCITAGAGGATI l GACCAAGy\CA I GCiCCAACAAAA'ICGG IGAACACA TGGAAGAACATGGTATCAAGTTTATAAGGCAGTFCGTCCCAACGAAAATTGAACA GA ! CGAAGCAGGAACACCAGGCCGACTCAGGG l'GAC TGCTCAATCCACAAACAG CGAGGAGACCAI AGAGGGCGAA I l l AACACAG'l'G 11GC rGGCGCri’AGGAAGAGA TTCITGTACG AGA ACTATTGGCTTAGAG ACCGTGGGCGTGAAGATAAACCAAA AAACCGGAAAGATACCCGTCACGGA7GAAGAGCAGACCAATGTGCCTTACATCTACGCCATCGGTGACATCCTGGAGGGGAAGCTAGAGCTGACTGCCGTAGCCATCCAGGCGGGGAGAFTGC'l'GGC I CAGAGGCl'GTA l üGAGGC i'CCAATG'i'CAAA l'G f GACTAT GACAA'FGICCCAAC'GAC'lXrrA F1TACTCCTFFGGAAIA FGGCTG F FGFGGCCTCIC TGAAGAAAAAGCCGTAGAGAAATTTGGGGAAGAAAATATTGAAGTTTACCATAGT FTCFT l TGGCCA'n GGAA'I GGACAG'FCCX’A'Fa'CGGGyVI'AACAACAAA 1G ITA'FGC: AAAAATAATCTGCAACCTTAAAGACGATGAACXIi G rCGTGGGCTTCCACGTGCTG CrGl CCAAACGC ] GGAGAGG PGACGCAGGGC I 1TGCGGCTGCGCTCAAG TGTGGGC TGACTAAGCAGCAGCTGGACAGCACCATCGGCATCCACCCGGTCTGTGCAGAGAT ATTCACAACGTTGTCAGTGACGAAGCGCTCTGGGGGAGACATCCTCCAGTCTGGC IGCTGA (SEQ ID NO:34)

La secuencia de la tiorredoxina reductasa 2 de ratón es:

ATGGCGGCGATGGTGGCGGCGATGGTGGCGGCGCTGCGTGGACCCAGCAGGCGCT TCCGGCCÜCGGACACGGGCTCTGACACGCGGGACAAGGGGCGCGGCGAGTGCAG CGGGAGGGC AGCAGAGCTTTGA'TCTCTTGG ITlATCGGTGGGGGATCCGGTGGCCT AGCTTGTGCCAAGGAAGCTGCTCAGCTGGGAAAGAAGGTGGCTGTGGCTGACTAT GTGGAACCTTCTCCCCGAGGC-ACCAAGTGGGGCCTTGGTGGCACCTGTGTCAACG TGGGTTGCATACCCAAGAAGCTGATGCATCAGGCTGCACTGCTGGGGGGCATGAT CAGAGATGCTCACCACTATGGCTGGGAGGTGGCCCAGCCTGTCCAACACAACTGG AAGACAATGGCAGAAGCCGTGCAAAACCATGTGAAATCCTTGAACTGGGGTCATC GCGTCCAACTGCAGGACAGGAAAG'rCAAGTAC'ITTAACATCAAAGCCAGCTTTGT GGATGAGCACACAGTTCGCGGTGTGGACAAAGGCGGGAAGGCGACTCTGCTTTCA GCTGAGCACATTGTCATTGCTACAGGAGGACGGCCAAGGTACCCCACACAAGTCA AAGGAGCCCTGGAATATGGAATCACAAGTGACGACATCTTCTGGCTGAAGGAGTC CCCTGGGAAAACGTTGGTGGTTGGAGCCAGCTATGTGGCCCTAGAGTGTGCTGGC TTCCTCACTGGAATTGGACTGGATACCACTGTCATGATGCGCAGCATCCCTCTCCG ACGCTTl GACCAGCAAATGTCATCT'n’GGTCACAGAGCACATGGAGTCTCATGGC ACCCAGTTCCrGAAAGGCTGTGTCCCCTCCCACA ÍCAAAAAACTCCCAACTAACC AGCTGCAGGTCACTTGGGAGGATCATGCTTCTGGCAAGGAAGACACAGGCACCTT TGACACTGTCCTGTGGGCCATAGGGCGAG'ITC’CAGAAACCAGGACTTTGAATCTG GAGAAGGCI GGCATCAGTACCAACCCT’AAGAATCAGAAGATTATI GTGGATGCCC AGGAGGCTACCTCTGn’CCCCACA PC I A 1 GCCAT1 GGAGA'IGTTC<j>CTGAGGGGCC] GCCTGAGCTGACGCCCACAGCTATCAAGGCAGGAAAGCTTCTGÜCTCAGCGGCTC TITGGGAAATCCTCAACCTTAATGGATTACAGCAATG'ITCCCACAACTGTCTTTAC ACCACTGGAGTATGGCTGTGTGGGGCTGTCTGAGGAGGAGGCTGTGGCTCTCCAT GGCCAGGAGCATGTAGAGGTTTACCATGCATATTATAAGCCCCTAGAGTTCACGü TGGCGGATAGGGATGCATCACAGTGCTACATAAAGATGGTATGCATGAGGGAGCC CCCACAACTGGTGCTGGGCCTGCACTTCCTTGGCCCCAACGCTGGAGAAGTCACC CAAGGA iTTGCTCTTGGGATCAAGTGTGGGGCTTCATATGCACAGGTGATGCAGA CAGTAGGGATCCATCCCACCTGCTCTGAGGAGGTGGTCAAGCTGCACATCTCCAA GCGCTCCGGCCTGGAGCCTAC TGTGACTGGTTGCTGA (SHQ IDNO:35).

Ejemplo 10

Estudios de Trx/Trx reductasa in vitro

Materiales y procedimientos

Una solución de TrxR (hígado de rata) comercial (4 |jM) se diluyó con agua para proporcionar una solución 2,86 j M. Se reconstituyó Trx liofilizada (humana) con PBS (10 mM, pH 7,2) proporcionando una solución 500 j M. Se prepararon una solución de NADPH 20 mM y soluciones de ATG y ATM 10 mM en agua.

En un tubo de microcentrifugadora de 1,5 ml de polipropileno negro, se mezclaron con cuidado 437 jl de tampón de reacción (histidina 10 mM, Na2SO4 10 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,5 mM, pH 7,0), 25 jl de NADPH, 16 jl de solución de ocrelizumab formulada (30,2 mg/ml) y 5 jl de Trx. La reacción se inició por adición de 17,5 jl de TrxR. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 24 horas. Se tomaron alícuotas de 20 jl en cada punto de tiempo de muestreo y se almacenaron a -70 °C hasta que se analizaron por el ensayo con Bioanalyzer.

Se demostró la inhibición del sistema de Trx usando las mismas condiciones de reacción descritas anteriormente con la adición de diversos inhibidores.

1. Actividad in vitro del sistema de tiorredoxina

La figura 24 muestra una imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer (representando cada carril un punto de tiempo) que muestra que la incubación de ocrelizumab intacto ("2H7", un anticuerpo anti-CD20 humanizado, denominado "variante A" anteriormente) (1 mg/ml) con TrxR 0,1 j M (hígado de rata), Trx 5 j M (humana) y NADPH 1 mM en tampón de sulfato de histidina 10 mM da como resultado la reducción de ocrelizumab en menos de una hora.

2. Actividad in vitro del sistema de tiorredoxina inhibida por aurotioglucosa

Se añadió aurotioglucosa (ATG) a la mezcla de ocrelizumab descrita anteriormente, a las siguientes concentraciones: 1 mM; 0,6 j M (6:1 ATG:TrxR); 0,4 j M (4:1 ATG:TrxR); y 0,2 j M (2:1 ATG:TrxR).

Como se atestigua por las imágenes similares a gel digitales a partir del análisis con Bioanalyzer mostradas en las figuras 25-27, la aurotioglucosa añadida a concentraciones de 1 mM, 0,6 j M y 0,4 j M inhibe eficazmente la reducción de ocrelizumab por el sistema de tiorredoxina. Sin embargo, como se muestra en la figura 28, en estas condiciones experimentales la aurotioglucosa añadida a una concentración de 0,2 j M no puede inhibir la reducción de ocrelizumab después de 24 horas.

3. Actividad in vitro del sistema de tiorredoxina inhibida por aurotiomalato

Se añadió aurotiomalato (ATM) a la mezcla de ocrelizumab descrita anteriormente, a concentraciones de 0,1 mM y 0,01 mM. Como se atestigua por las imágenes similares a gel digitales a partir del análisis con Bioanalyzer mostradas en las figuras 29 y 30, el ATM inhibe eficazmente la reducción de ocrelizumab por el sistema de tiorredoxina en ambas concentraciones sometidas a prueba.

4. Actividad in vitro del sistema de tiorredoxina inhibida por CuSO4

Se añadió CuSO4 a la mezcla de ocrelizumab descrita anteriormente, a concentraciones de 20 j M (4:1 Cu2+:Trx); 10 jm (2:1 Cu2+:Trx); y 5 j M (1:1 Cu2+:Trx). Como se muestra en las figuras 31-33, el CuSO4 inhibe eficazmente la reducción inducida por tiorredoxina de ocrelizumab a concentraciones de 20 j M y 10 j M (figuras 31 y 32), pero la concentración de 5 j M es insuficiente para dar como resultado una inhibición completa de la reducción (figura 33).

5. Actividad in vitro del sistema de tiorredoxina inhibida por cistamina

Se añadió cistamina a la mezcla de ocrelizumab descrita anteriormente a las siguientes concentraciones: 532 j M (20:1 cistamina:disulfuro en 2H7 (variante A)); 266 j M (10:1 cistamina:disulfuro en 2H7 (variante A)); 133 j M (5:1 cistamina:disulfuro en 2H7); y 26,6 j M (1:1 cistamina:disulfuro en 2H7 (variante A)). Como se muestra en lasfiguras 34-37, la cistamina inhibe eficazmente la reducción inducida por tiorredoxina de ocrelizumab a concentraciones de 532 |jM (20:1 cistamina:disulfuro en 2H7 (variante A)) y 266 |jM (10:1 cistamina:2H7 (variante A)) (figuras 34 y 35), pero las concentraciones de 133 j M (5:1 cistamina:disulfuro en 2H7 (variante A)) y 26,6 j M (1:1 cistamina:disulfuro en 2H7 (variante A)) son insuficientes para inhibir la reducción de ocrelizumab después de 24 horas (figuras 36 y 37).

6. Actividad in vitro del sistema de tiorredoxina inhibida por cistina

Se añadió cistina a la mezcla de ocrelizumab descrita anteriormente a una concentración de 2,6 mM. Como se muestra en la figura 38, a esta concentración la cistina inhibe eficazmente la reducción de ocrelizumab por el sistema de tiorredoxina. Cabe señalar que la concentración eficaz mínima de cistina (al igual que la concentración mínima eficaz de otros inhibidores) depende de las circunstancias reales, y podría ser diferente para diferentes proteínas, tales como anticuerpos, y podría variar dependiendo de la cronología de la adición. Por tanto, por ejemplo, si se añade cistina previamente a la lisis, la concentración eficaz mínima para el anticuerpo 2H7 (variante A) es de aproximadamente 1,3 mM, para Apomab de aproximadamente 1 mM y para la variante C de anticuerpo de aproximadamente 4,5 mM. Cuando se añade cistina en el medio de cultivo celular, la concentración eficaz mínima típicamente es un tanto mayor, y es de aproximadamente 5,2 mM para 2H7 (variante A), 6 mM para Apomab y 9 mM para la variante C de anticuerpo. Normalmente, para cistina, cistamina y glutatión oxidado (véase a continuación), la concentración inhibidora eficaz mínima es de aproximadamente 40x de la concentración de anticuerpos (en j M).

7. Actividad in vitro del sistema de tiorredoxina inhibida por glutatión oxidado (GSSG)

Se añadió GSSG a la mezcla de ocrelizumab descrita anteriormente a una concentración de 2,6 mM. Como se muestra en la figura 39, a esta concentración GSSG inhibe eficazmente la reducción de ocrelizumab por el sistema de tiorredoxina. Sin embargo, cabe señalar que la concentración eficaz mínima de glutatión oxidado (al igual que la de los otros inhibidores) depende de las circunstancias reales, tales como, por ejemplo, de la naturaleza de la proteína (por ejemplo, anticuerpo) producida y la cronología de la adición. Por ejemplo, para el anticuerpo 2H7 (variante A), la concentración eficaz mínima es de aproximadamente 1,3 mM para la adición antes de la lisis.

8. Actividad in vitro del sistema de reducción enzimática

La figura 40 muestra una imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer (representando cada carril un punto de tiempo) que muestra que la incubación de ocrelizumab intacto ("2H7", un anticuerpo anti-CD20 humanizado, variante A) (1 mg/ml) con 10 jg/ml de hexocinasa, 50 jg/ml de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, tiorredoxina 5 j M, tiorredoxina reductasa 0,1 j M, glucosa 2 mM, ATP 0,6 mM, Mg2+ 2 mM y NADP 2 mM en sulfato de histidina 50 mM tamponado a pH 7,38 da como resultado la reducción de ocrelizumab en aproximadamente una hora. La adición de HDEA 0,1 mM, un inhibidor de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa conocido, no inhibe la reducción.

9. La actividad in vitro del sistema de reducción enzimática requiere NADPH

Como se muestra en la imagen similar a gel digital a partir del análisis con Bioanalyzer de la figura 41, la incubación de ocrelizumab intacto (1 mg/ml) con tiorredoxina 5 j M, tiorredoxina reductasa 0,1 j M y NADP 2 mM en tampón de sulfato de histidina 50 mM a pH 7,38 no da como resultado la reducción del anticuerpo ocrelizumab. La reducción de ocrelizumab no se podría producir sin hexocinasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y sus sustratos para generar NADPH.

La invención descrita de forma ilustrativa en el presente documento se puede poner en práctica adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, que no se divulgue específicamente en el presente documento. Por tanto, por ejemplo, los términos "que comprende", "que incluye", "que contiene", etc., se leerán de forma expansiva y sin limitación.

Las invenciones se han descrito ampliamente y de forma genérica en el presente documento. Cada una de las especies y agrupaciones subgenéricas más estrechas que entran dentro de la divulgación genérica también forman parte de estas invenciones. Esto incluye dentro de la descripción genérica de cada una de las invenciones una salvedad o limitación negativa que permitirá retirar cualquier materia objeto del género, independientemente de si el material que se va a retirar se citó específicamente o no. Además, cuando los rasgos característicos o aspectos de una invención se describen en términos del grupo Markush, los expertos en la técnica reconocerán que la invención también se describe, de este modo, en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo Markush. Además, cuando una referencia a un aspecto de la invención enumera un intervalo de miembros individuales, como, por ejemplo, de "SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:100, inclusive", se pretende que sea equivalente a enumerar cada miembro de la lista individualmente, y adicionalmente se debe entender que cada miembro individual se puede excluir o incluir en la reivindicación individualmente.

Las etapas representadas y/o usadas en los procedimientos en el presente documento se pueden realizar en unorden diferente del que se representa o y/o indica. Las etapas son meramente ejemplares del orden en el que se producen estas etapas. Las etapas se pueden producir en cualquier orden que se desee, de modo que todavía alcance los objetivos de la invención reivindicada.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Genentech, Inc.

<120> PREVENCIÓN DE LA REDUCCIÓN DE ENLACES DISULFURO DURANTE LA PRODUCCIÓN RECOMBINANTE DE POLIPÉPTIDOS

<130> SJK/FP7505662

<140> Aún sin asignar

<141 > 08-07-2008

<150> 17196350.7

<151> 08-07-2008

<150> 12178200.7

<151 > 08-07-2008

<150> 08781481.0

<151 > 08-07-2008

<150> PCT/US2008/069395

<151 > 08-07-2008

<150> US 60/948.677

<151 > 09-07-2007

<160> 35

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> variable de la cadena ligera

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> variable de la cadena pesada

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<210> 3

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> variable de la cadena ligera

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<223> variable de la cadena pesada

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<223> cadena pesada de longitud completa

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��

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<223> cadena ligera de longitud completa

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<223> secuencia de cadena pesada de longitud completa

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Ser Pro Gly Lys

450

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<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de cadena pesada de longitud completa

<400> 12

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Ser Pro Gly Lys

450

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de cadena pesada de longitud completa

<400> 13

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Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60

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85 90 95

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165 170 175

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Ser Pro Gly Lys

450

<210> 14

<211> 452

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> cadena pesada de longitud completa

<400> 14

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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Ala Ala Leu Pro Ala Pro

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Ser Pro Gly Lys

450

<210> 15

<211> 452

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> cadena pesada de longitud completa

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

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165 170 175

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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

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His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr 290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Ala Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

lie Ala Ala Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val 370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

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<211 > 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> anticuerpo

<400> 16

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<213> Artificial

<220>

<223> anticuerpo

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

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<210> 18

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> cadena ligera

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

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<400> 19

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211 > 108

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> anticuerpo

<400> 20

Asp lie Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15

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<213> artificial

<220>

<223> anticuerpo

<400> 21

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> anticuerpo

<400> 22

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> anticuerpo

<400> 23

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> anticuerpo

<400> 24

Asp lie Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp lie Ser Asn Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu lie 35 40 45

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<211 > 123

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> anticuerpo

<400> 25

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr 20 25 30

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<211 > 108

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> anticuerpo

<400> 26

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Lys Thr lie Ser Lys Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Leu

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg

100 105

<210> 27

<211 > 121

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> anticuerpo

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His 20 25 30

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Gly Met lie His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr lie Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly lie Tyr Phe Tyr Gly Thr Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 28

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> anticuerpo

<400> 28

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125

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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

<210> 29

<211 > 451

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> anticuerpo

<400> 29

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Met lie His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr lie Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly lie Tyr Phe Tyr Gly Thr Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His 195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie

325 330 335

Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350

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<210> 30

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<213> Tiorredoxina TrxA de E. coli

<400> 30

atgttacacc aacaacgaaa ccaacacgcc aggcttattc ctgtggagtt atatatgagc 60 gataaaatta ttcacctgac tgacgacagt tttgacacgg atgtactcaa agcggacggg 120 gcgatcctcg tcgatttctg ggcagagtgg tgcggtccgt gcaaaatgat cgccccgatt 180 ctggatgaaa tcgctgacga atatcagggc aaactgaccg ttgcaaaact gaacatcgat 240 caaaaccctg gcactgcgcc gaaatatggc atccgtggta tcccgactct gctgctgttc 300 aaaaacggtg aagtggcggc aaccaaagtg ggtgcactgt ctaaaggtca gttgaaagag 360 ttcctcgacg ctaacctggc gtaa 384<210> 31

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<212> ADN

<213> Tiorredoxina reductasa TrxB de E. coli

<400> 31

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<210> 32

<211> 318

<212> ADN

<213> mus musculus

<400> 32

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<211> 501

<212> ADN

<213> mus musculus

<400> 33

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<210> 34

<211> 1494

<212> ADN

<213> mus musculus

<400> 34

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<210> 35

<211> 1578

<212> ADN

<213> mus musculus

<400> 35

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para la prevención de la reducción de enlaces disulfuro en anticuerpos expresados en células huésped recombinantes durante el procesamiento tras la fermentación, que comprende, tras la finalización del procedimiento de cultivo celular, añadir un inhibidor de tiorredoxina al caldo de cultivo celular previo a la obtención u obtenido de las células huésped recombinantes o inyectar aire en el caldo de cultivo celular previo a la obtención u obtenido de las células huésped recombinantes, en el que las células huésped recombinantes son células huésped eucariotas, en el que los anticuerpos expresados en las células huésped recombinantes son anticuerpos monoclonales terapéuticos que se unen a HER2, y en el que el inhibidor de tiorredoxina es:

(i) un inhibidor directo de tiorredoxina;

(ii) un inhibidor específico de tiorredoxina reductasa;

(iii) sulfato cúprico

(a) añadido en una concentración de entre aproximadamente 5 |j M y aproximadamente 100 |j M;

(b) añadido en una concentración de entre aproximadamente 10 j M y aproximadamente 80 j M; o

(c) añadido en una concentración de entre aproximadamente 15 j M y aproximadamente 50 j M;

(iv) un inhibidor de G6PD, seleccionado del grupo que consiste en piridoxal-5'-fosfato, 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno, deshidroepiandrosterona (DHEA) y epiandrosterona (EA);

(v) un inhibidor de la actividad de hexocinasa, siendo dicho inhibidor (a) EDTA añadido en una concentración de entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM; o (b) estando seleccionado del grupo que consiste en sorbosa-1-fosfato, polifosfatos, 6-desoxi-6-fluoroglucosa, 2-C-hidroxi-metilglucosa, xilosa y lixosa; o

(vi) un anticuerpo que se une específicamente a una tiorredoxina reductasa.

2. El procedimiento de la reivindicación 1(i), en el que el inhibidor de tiorredoxina es un disulfuro de alquil-2-imidazolilo o un derivado de naftoquinona-espirocetal.

3. El procedimiento de la reivindicación 1(ii), en el que el inhibidor de tiorredoxina es un complejo de oro.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el complejo de oro es aurotioglucosa (ATG) o aurotiomalato (ATM) y, opcionalmente, dicha ATG o dicho ATM se añade en una concentración de entre aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 1 mM.

5. El procedimiento de la reivindicación 1(iii), en el que el sulfato cúprico está en forma de pentrahidrato o en forma anhidra.

6. El procedimiento de la reivindicación 1 (iv), en el que el inhibidor es DHEA y en el que dicha DHEA se añade en una concentración (a) de entre aproximadamente 0,05 mM y aproximadamente 5 mM, o (b) de entre aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 2,5 mM.

7. El procedimiento de la reivindicación 1(v)(a), en el que el EDTA se añade en una concentración de entre aproximadamente 20 mM y aproximadamente 40 mM.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que:

a) el inhibidor de tiorredoxina se añade al caldo de cultivo celular antes de la obtención o en el caldo de cultivo celular obtenido inmediatamente después de la obtención; o

b) inyectar aire en el caldo de cultivo celular previo a la obtención u obtenido de las células huésped recombinantes comprende inyectar el caldo de cultivo celular antes de la obtención o inyectar el caldo de cultivo celular obtenido inmediatamente después de la obtención.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el procedimiento comprende, tras la finalización del procedimiento de cultivo celular, inyectar aire en el caldo de cultivo celular previo a la obtención.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el procedimiento comprende inyectar aire en el caldo de cultivo celular obtenido.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que inyectar aire se continúa hasta que el caldo de cultivoobtenido esté al menos aproximadamente un 30%saturado con aire, o esté entre aproximadamente un 100%saturado y aproximadamente un 30 % saturado con aire.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los anticuerpos monoclonales terapéuticos son anticuerpos IgG1.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los anticuerpos monoclonales terapéuticos comprenden un dominio variable de la cadena ligera (Vl) de SEQ ID NO: 16 y un dominio variable de la cadena pesada (Vh) de SEQ ID NO: 17.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células huésped eucariotas son células huésped de mamífero y, opcionalmente, son células de ovario de hámster chino (CHO).

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los anticuerpos expresados en las células huésped recombinantes se producen a una escala de más de 5000 l.

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células huésped recombinantes se cultivan en un sistema de biorreactor de depósito agitado con un procedimiento de cultivo por lotes alimentados.

17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además la etapa de recuperar los anticuerpos del caldo de cultivo celular obtenido (HCCF).

18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además la etapa de purificar los anticuerpos del caldo de cultivo celular obtenido (HCCF).