PL212317B1 - Sposób izolacji bialka zawierajacego wiazania disulfidowe w natywnej konformacji - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób izolacji białka zawierającego wiązania disulfidowe w natywnej konformacji.

Ludzki hormon peptydowy - insulina - kontroluje poziom glukozy we krwi podczas jedzenia i poszczenia i działa za pośrednictwem receptorów na powierzchni komórek wątroby i tkanki tłuszczowej. Poza kontrolowaniem pobierania, magazynowania i wytwarzania glukozy, insulina jest także m. in. zaangażowana w kontrolowanie wytwarzania i rozkładu lipidów.

Niedobory w dostarczaniu insuliny powodują wzrost stężenia glukozy we krwi (hiperglikemia), a w postaci przewlekłej ujawniają się klasycznymi objawami cukrzycy (DM). Pacjentom cierpiącym na DM insulina podawana jest codziennie.

Dojrzała ludzka insulina jest peptydem złożonym z łańcuchów A (alfa) i B (beta), połączonych dwoma międzyłańcuchowymi mostkami disulfidowymi. Trzeci mostek disulfidowy łączy dwie reszty w łańcuchu A. W proinsulinie, biosyntetycznym prekursorze, łańcuchy A i B są połączone ze sobą peptydem C, którego rola polega na wspomaganiu tworzenia odpowiednich mostków disulfidowych pomiędzy segmentami A i B oraz umożliwianiu prawidłowego fałdowania cząsteczki proinsuliny. W ostatnim etapie dojrzewania enzymy proteolityczne przecinają cząsteczkę pomiędzy określonymi resztami aminokwasowymi uwalniając peptyd C i tworząc tym samym dojrzałą insulinę.

Biosyntetyczna rekombinowana ludzka insulina jest obecnie m. in. wytwarzana w postaci polipeptydów podobnych do proinsuliny wyrażanych np. w E. coli lub drożdżach (patrz np. opis patentowy USA nr 5 593 860). W większości przypadków proinsuIina wytwarzana jest w postaci białka fuzyjnego lub zrekombinowanej hybrydy, gdzie proinsulina jest połączona przez reszty metioninowe z białkiem heterologicznym, takim jak przykładowo ludzka dysmutaza ponadtlenkowa zależna od miedzi/cynku (hSOD). Z reguły hybrydy te nagromadzają się w zrekombinowanych komórkach w postaci wewnątrzkomórkowych wytrąconych białek lub ciał inkluzyjnych.

Podczas wytwarzania zrekombinowanej proinsuliny ciała inkluzyjne, uzyskane przez wirowanie po lizie komórek, płucze się detergentem lub czynnikiem denaturującym w niskim stężeniu. Działanie takie powtarza się, aby zwiększyć czystość pożądanego białka. W celu zminimalizowania międzycząsteczkowych oddziaływań hydrofobowych i tworzenia nieprawidłowych wiązań disulfidowych, przepłukane ciała inkluzyjne są rozpuszczane w czynniku denaturującym, takim jak roztwór mocznika lub chlorowodorku guanidyny zawierającym czynnik redukujący, taki jak ditiotreitol (DTT) lub β-merkaptoetanol i odzyskiwane przez wytrącanie.

Hybrydę zwykle izoluje się i przecina bromocyjanem (CNBr) w celu uwolnienia polipeptydu proinsuliny od białka heterologicznego. Proinsulina jest w dalszym stopniu modyfikowana przez utleniającą siarczynolizę dając S-sulfonian proinsuliny (patrz np. EP nr 0 055 945 i EP nr 0 196 056). S-sulfonian proinsuliny jest następnie dalej oczyszczany i refałdowany do natywnej konformacji w warunkach redukujących przy zastosowaniu czynników redukujących takich, jak ditiotreitol (DTT), 2-merkaptoetanol, itp. lub układu redox, takiego jak glutation. Przemianę pronisuliny w insulinę, tzn. usunięcie peptydu C, osiąga się przez połączone działanie trypsyny i karboksypeptydazy B. Ostatecznie insulina oczyszczana jest przez np. wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconymi fazami (RP-HPLC) i ewentualnie krystalizowana.

Podczas pełnej procedury izolacji, od Iizy zrekombinowanych komórek do właściwego zwinięcia proinsuliny, wolne grupy tiolowe reszt cysteinowych zawartych w białku (fuzyjnym) mogą tworzyć nieprawidłowe lub niespecyficzne wewnątrz- lub międzycząsteczkowe mostki disulfidowe. Powoduje to powstanie peptydów o nieprawidłowych wiązaniach disulfidowych oraz nieaktywnych hormonów albo powstawanie „agregatów” pożądanych białek i białek zanieczyszczających (opis patentowy USA nr 6 150 134). Wolne grupy tiolowe powinny zatem albo być blokowane w celu zapobieżenia powstaniu nieprawidłowych mostków disulfidowych, albo procedury powinny obejmować wybiórcze przecinanie nieprawidłowych wiązań disulfidowych.

Przecięcie wiązań disulfidowych można m. in. osiągnąć przez:

a) modyfikację reszt cysteinowych do kwasu cysteinowego przez utlenianie kwasu cysteinowego albo działanie kwasem nadmrówkowym;

b) modyfikację cysteiny do S-sulfocysteiny przez siarczynolizę (R-S-S-R >2R-SO₃);

c) redukcję za pomocą niektórych czynników redukujących, takich jak fosfiny lub merkaptany (patrz np. EP nr 0 379 132).

PL 212 317 B1

Zapobieganie tworzeniu się nieprawidłowych wiązań disulfidowych jest jednak korzystniejsze niż stosowanie czynników „tasujących utlenienie” po izolacji białka, dla osiągnięcia czego stosuje się najczęściej kilka czynników redukujących, takich jak ditiotreitol (DTT), β-merkaptoetanol, cysteina, glutation, E-merkaptoetyloamina lub kwas tioglikolowy.

Zastosowanie wszystkich wymienionych powyżej czynników redukujących stwarza jednak problemy, ponieważ stanowią one zagrożenie toksyczne, są kosztowne, a zanieczyszczenie nimi produktu wymaga dodatkowego oczyszczania.

Dowodzi to zatem tego, że konwencjonalny proces wytwarzania zrekombinowanej proinsuliny jest mniej korzystny, gdyż obejmuje on skomplikowane etapy rozpuszczania i sulfonowania, oczyszczania, zatężania, gdzie ponowne fałdowanie proinsuliny postępuje z niską wydajnością, powodując niską wydajność uzyskania pożądanego białka.

Istnieje zatem potrzeba ulepszonego procesu izolacji białek zawierających wiązania disulfidowe w natywnej konformacji w sposób wydajny i wprowadzający mniej zanieczyszczeń.

Twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili, że zastosowania czynników redukujących w izolacji białek zawierających wiązania disulfidowe można uniknąć lub przynajmniej znacząco je zmniejszyć przez przeprowadzenie tej izolacji w atmosferze zasadniczo beztlenowej.

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu izolacji białka zawierającego wiązania disulfidowe w natywnej konformacji, który to sposób obejmuje izolację tego białka w warunkach zasadniczo beztlenowych, przy czym białko jest zrekombinowanym białkiem hybrydowym obecnym w postaci ciał inkluzyjnych zrekombinowanych komórek, a izolacja obejmuje zebranie i rozerwanie tych komórek, wyizolowanie ciał inkluzyjnych i stabilizację wyizolowanego produktu.

Korzystnie, zasadniczo beztlenowe warunki obejmują zasadniczo beztlenową atmosferę, korzystnie atmosferę azotu.

Korzystnie, sposób izolacji białek według wynalazku dotyczy insuliny jako białka.

Korzystnie, białkiem jest też białko prekursorowe, a zwłaszcza prekursor insuliny.

Korzystnie, sposób według wynalazku nadaje się do izolacji białek wytworzonych przez ekspresję w zrekombinowanych komórkach gospodarza, które są komórkami E. coli szczepu S733 niosącymi i wyrażającymi plazmid pDBAST-RAT-N-7-1.

Przy zastosowaniu sposobu według niniejszego wynalazku białka zawierające mostki disulfidowe mogą teraz być wyekstrahowane i wyizolowane z otoczenia bez konieczności zastosowania niepożądanych czynników redukujących. Jedną z korzyści sposobu według niniejszego wynalazku jest to, że nie jest już konieczna ekstrakcja takich czynników redukujących z wyizolowanego i oczyszczonego produktu białkowego, procedura izolacji jest zatem wydajniejsza. Ponadto, sposób według niniejszego wynalazku zapobiega tworzeniu się nieprawidłowych konformacji białek i daje w rezultacie wysoką wydajność uzyskiwania białek w ich stabilnej, natywnej konformacji.

Opis rysunków

Na figurze 1 jest przedstawiony schemat technologiczny głównych etapów procedury objętych sposobem według wynalazku.

Na figurze 2 przedstawiono skutek przedmuchiwania 40 ml porcji wyizolowanych zawiesin ciał inkluzyjnych, tak jak opisano to w przykładzie 2.

Termin „oczyszczanie” lub „izolacja” oraz „izolowanie” w użytym tu znaczeniu definiowany jest jako proces uwalniania i uzyskiwania pojedynczego składnika, takiego jak określone indywiduum makrocząsteczkowe, z mieszaniny składników, takich jak hodowla zrekombinowanych komórek. Opisana tu procedura izolacji obejmuje proces izolowania białka w stosunkowo czystej postaci, tzn. uwalniania go od dalszych zanieczyszczeń podczas izolacji.

„Wyizolowane” i „oczyszczone” odnosi się do dowolnych cząsteczek lub związków, które są wydzielone z naturalnego środowiska i są w około 60% do około 99% wolne, korzystnie 80% do 99% wolne od innych składników, z którymi są naturalnie związane.

Termin „zrekombinowane” w użytym tu znaczeniu odnosi się do konstruktu białka lub kwasu nukleinowego wytworzonego przez rekombinację DNA lub syntetycznie, np. w przypadku białka przez translację transkryptu RNA konkretnego wektora lub związanej z plazmidem serii konkretnych elementów kwasów nukleinowych lub kasety ekspresyjnej w komórce gospodarza. Termin „zrekombinowane” w użytym tu znaczeniu nie obejmuje zmiany komórki lub wektora przez zdarzenia zachodzące naturalnie (np. spontaniczną mutację, naturalną transformację/transdukcję/transpozycję), takie jak zachodzące bez zamierzonej interwencji człowieka.

PL 212 317 B1

Jako „komórkę gospodarza” rozumie się komórkę, która zawiera wektor lub kasetę ekspresyjną i podtrzymuje ich replikację i/lub ekspresję. Komórkami gospodarza mogą być komórki prokariotyczne, takie jak E. coli lub komórki eukariotyczne, takie jak komórki drożdży, owadów, płazów, roślin lub komórki ssaków. Korzystnie, komórkami gospodarza są komórki bakteryjne lub prokariotyczne. Szczególnie korzystną komórką gospodarza dla wytwarzania insuliny jest komórka gospodarza E. coli, korzystnie E. coli szczepu SΦ733.

W użytym tu znaczeniu termin „wektor” odnosi się do kwasu nukleinowego zastosowanego do transfekcji komórki gospodarza, do którego można wstawić polinukleotyd. Wektory często są replikonami.

Termin „białko” lub „białka” w użytym tu znaczeniu odnosi się do polipeptydu lub dowolnej jego części.

Termin „polipeptyd” odnosi się do polimeru aminokwasów i nie odnosi się do konkretnej długości produktu; peptydy, oligopeptydy i białka są zatem objęte definicją polipeptydu. Termin ten nie odnosi się ani nie obejmuje postekspresyjnych modyfikacji polipeptydu, przykładowo glikozylacji, acetylacji, fosforylacji i im podobnych. Definicją objęte są, przykładowo, polipeptydy zawierające jeden lub więcej analogów aminokwasów (w tym, przykładowo, aminokwasy nie występujące naturalnie, itp.), polipeptydy z podstawionymi wiązaniami, a także znane w technice modyfikacje, zarówno występujące, jak i nie występujące naturalnie.

Termin „zrekombinowane białko” w użytym tu znaczeniu odnosi się do (1) polipeptydu pochodzenia półsyntetycznego lub syntetycznego powstałego w wyniku wyrażania kombinacji cząsteczek DNA różnego pochodzenia, które połączono przy zastosowaniu technik rekombinacji DNA;

(2) polipeptydu pochodzenia półsyntetycznego lub syntetycznego, który ze względu na swe pochodzenie lub manipulację, nie jest związany z całością lub częścią białka, z którym związany jest naturalnie;

(3) polipeptydu pochodzenia półsyntetycznego lub syntetycznego, który jest połączony z polipeptydem innym, niż ten, z którym połączony jest w naturze; lub (4) polipeptydu pochodzenia półsyntetycznego lub syntetycznego, który nie występuje w naturze.

Terminy „ciało inkluzyjne” lub „ciało załamujące światło” odnoszą się do wewnątrzkomórkowych agregatów powstających w wyniku nieswoistego wytrącania się pojedynczych białek. Tworzenie się ciał inkluzyjnych i ciał załamujących światło jest częstą konsekwencją wytwarzania białek na wysokim poziomie w cytoplazmie. Tworzą się one przez akumulację pośrednich stadiów fałdowania, a nie z natywnego lub niesfałdowanego białka. Ciała inkluzyjne lub ciała załamujące światło mogą tworzyć się z dowolnego lub ze wszystkich wymienionych powodów: heterologicznego charakteru wyrażanych polipeptydów; wysokiego tempa wyrażania białek; stosunkowo dużej ilości białek hydrofobowych, które agregują międzycząsteczkowo w wyniku wiązań nie kowalencyjnych oraz nieobecności lub niedostatecznej dostępności białek opiekuńczych.

Termin „wiązanie disulfidowe” lub „wiązania disulfidowe” w użytym tu znaczeniu definiowany jest jako jedno lub odpowiednio więcej poprzecznych połączeń pomiędzy łańcuchami polipeptydowymi lub pomiędzy częściami łańcucha polipeptydowego, utworzonych przez utlenianie reszt cysteinowych. Wytworzony disulfid nazywany jest cystyną.

Termin „zasadniczo beztlenowe” w użytym tu znaczeniu definiowany jest jako w znacznym stopniu pozbawione tlenu i może oznaczać zakres od zmniejszenia poziomu tlenu normalnie spotykanego w powietrzu do warunków w pełni beztlenowych w np. atmosferze, środowisku ciekłym lub w tkance.

„Konformacja białka” odnosi się do charakterystycznego trójwymiarowego kształtu białka, w tym struktury łańcucńa białkowego drugorzędowej (helisy, kartki), ponaddrugorzędowej (motywy), trzeciorzędowej (domeny) i czwartorzędowej (białka multimeryczne).

Termin „natywna konformacja” w użytym tu znaczeniu odnosi się do charakterystycznego stanu, formacji, kształtu lub struktury białka w postaci aktywnej biologicznie w układzie żywym, w którym jest ono sfałdowane do globalnego minimum energii swobodnej Gibbsa zgodnie z definicją C. B. Anfinsena (wykład laureata Nagrody Nobla, 11 grudnia 1972).

„Refałdowanie” odnosi się do procesu przekształcenia in vitro białka przez wybiórcze przecinanie wiązań disulfidowych po pełnej denaturacji w białko o konformacji natywnej.

Białka z wiązaniami disulfidowymi nie są zasadniczo znajdowane w cytoplazmie, za wyjątkiem oksydoreduktaz tiolowych. Białka, które są eksportowane z cytoplazmy, takie jak przykładowo insulina

PL 212 317 B1 i alkaliczna fosfataza, zawierają jednak zwykle wiązania disulfidowe. Przypisuje się to często różnicy w potencjale redukującym pomiędzy cytoplazmą a środowiskiem zewnątrzkomórkowym, gdzie, jak się uważa, obecność reduktaz tioredoksyny w cytoplazmie stanowi istotny czynnik. W kilku badaniach wykazano, że zarówno aktywność komórkowa, jak i aktywność reduktazy tioredoksynowej jest wymagana do utrzymania w nieaktywnej i zredukowanej postaci w cytoplazmie białek zewnątrzkomórkowych, które zawierałyby utlenione wiązania disulfidowe w konformacji natywnej (Derman i wsp., 1993. Science 262: 1744-47; Derman i Beckwith. 1995. J. Bacteriol. 177: 3764-70).

Po lizie (lub śmierci komórki albo zatrzymaniu wzrostu na skutek wyczerpania się substratów) reduktazy tioredoksynowe nie są już w stanie utrzymać reszt cysteinowych białek w postaci zredukowanej i rozpoczyna się losowe fałdowanie białka, prowadzące do utlenienia reszt cysteinowych do wiązań disulfidowych. Proces ten często daje w rezultacie białka nieprawidłowo sfałdowane lub o nieprawidłowych wiązaniach disulfidowych.

W celu uzyskania ze zrekombinowanego materiału czystego ekstraktu białek w natywnej konformacji, obejmujących obecność wiązań disulfidowych, takich jak przykładowo insulina, kluczowym etapem jest tworzenie prawidłowych wiązań disulfidowych.

Konwencjonalne sposoby izolacji białka zawierającego wiązania disulfidowe w natywnej konformacji opierają się na obecności czynników redukujących. Stwierdzono teraz, że zastosowanie warunków beztlenowych od momentu, gdy zdolność redukcyjna reduktaz tioredoksynowych zaczyna maleć do momentu ustabilizowania białka lub zapewnienia warunków dla prawidłowego fałdowania, może skutecznie zapobiec tworzeniu się białek o nieprawidłowych wiązaniach disulfidowych.

Zastosowanie sposobu według niniejszego wynalazku daje w rezultacie wyizolowany produkt białkowy, który jest zasadniczo wolny od zanieczyszczeń środkami redukującymi, jak opisano powyżej, i w którym znaczna i istotna część białek jest aktywna i znajduje się w natywnym stanie konformacyjnym i jest biologicznie czynna.

Sposób według wynalazku jest bardzo odpowiedni do izolowania takich białek, jak przykładowo hormony peptydowe, takie jak insulina, wazopresyna, somatostatyna, oktreotyd, endoteIina I, białka typu węzła, enzymy, takie jak rybonukleaza, epitopy, takie jak epitopy toksyny skorpiona Cn2, konotoksyny i/lub moduły epitopów receptora LDL.

Na ogół, bogate w wiązania disulfidowe białka, peptydy lub ich fragmenty, z wirusów, bakterii, grzybów (w tym drożdży), roślin, zwierząt lub ludzi, są cenne dla badania związków struktury z aktywnością np. w projektowaniu leków. Możliwości skuteczniejszego osiągania natywnej konformacji tych białek dzięki zastosowaniu niniejszego wynalazku dają zatem istotne korzyści także i w tej dziedzinie nauki.

Sposób według wynalazku jest odpowiedni do izolowania białek zawierających wiązania disulfidowe w natywnej konformacji z dowolnego źródła, takich jak związane z wirusem lub prionem albo wytwarzane przez organizm prokariotyczny, taki jak bakteria lub wytwarzane przez organizm eukariotyczny, taki jak drożdże, grzyb, roślina, zwierzę lub komórka ludzka.

Korzystnie, białko to jest białkiem zewnątrzkomórkowym, które znajduje się w postaci lub stanie zredukowanym podczas ekspresji w cytozolu komórki wytwarzającego je organizmu i które osiąga natywną konformację w stanie utlenionym.

Specjalista jest w stanie stwierdzić, czy białko zawierające wiązania disulfidowe jest (re)fałdowane prawidłowo i znajduje się w konformacji natywnej. Takie oznaczenie może przykładowo obejmować pomiar prawidłowo sfałdowanego, utlenionego i strawionego produktu pośredniego, Lys-Arg-Insuliny, za pomocą analizy HPLC.

Sposób według niniejszego wynalazku jest stosowany korzystnie do izolowania wytworzonych drogą rekombinacji białek zawierających wiązania disulfidowe w natywnej konformacji. Białka wytwarzane drogą rekombinacji mogą być wyrażane bezpośrednio albo wyrażane w postaci białka fuzyjnego. Wykrywanie wyrażanego białka osiąga się sposobami znanymi w technice, takimi jak przykładowo oznaczenia radioimmunoenzymatyczne, techniki hybrydyzacji typu Western lub immunoprecypitacja.

Sposób wytwarzania lub (bio)syntezy (zrekombinowanego) białka nie jest istotny dla sposobu według niniejszego wynalazku. Zrekombinowane białka mogą zasadniczo być wytwarzane dowolnym znanym w technice sposobem, przykładowo takimi sposobami stosowanymi do wytwarzania zrekombinowanych białek, jak z użyciem zrekombinowanych drożdży, korzystniej zrekombinowanych bakterii, najkorzystniej zrekombinowanej komórki E. coli, takiej jak przykładowo opisana w opisie patentowym USA nr 5 593 860. W wielu, lecz niekoniecznie we wszystkich przypadkach, sposoby takie będą da6

PL 212 317 B1 wały w rezultacie powstawanie białek fuzyjnych lub hybryd. Sposób według niniejszego wynalazku jest zatem bardzo odpowiednio wykorzystywany do izolacji białek fuzyjnych.

W korzystnym wykonaniu sposób według wynalazku jest stosowany do izolowania białka prekursora insuliny zawartego w ciałach inkluzyjnych wytwarzanych przez zrekombinowany szczep E. coli

SΦ733 niosący i wyrażający plazmid pDBAST-RAT-N71 (Bio-Technology General Ltd., Rehovot, Izrael), będący pochodną wektora pDBAST-LAT (patrz opis patentowy USA nr 6 001 604 lub WO

96/20724).

Sposób według wynalazku obejmuje izolację białka w warunkach zasadniczo beztlenowych. Korzystnie, warunki beztlenowe osiąga się przez zapewnienie w środowisku atmosfery beztlenowej, takiej jak atmosfera azotu, atmosfera ditlenku węgla lub atmosfera helu albo innego gazu obojętnego. Najkorzystniej w sposobie według wynalazku do zapewnienia warunków beztlenowych podczas izolowania białek zawierających wiązania disulfidowe w natywnej konformacji stosowana jest atmosfera N2.

Korzystnie, warunki beztlenowe stosowane w sposobie według wynalazku są warunkami odpowiadającymi atmosferze zawierającej 0-1% obj., korzystniej 0-0,5% obj., jeszcze korzystniej 0-0,05% O2 lub cieczy w równowadze z tą atmosferą. W najkorzystniejszym wykonaniu warunki beztlenowe odpowiadają atmosferze zawierającej zasadniczo 0% obj. O2 lub cieczy w równowadze z tą atmosferą.

W skrócie, sposób według wynalazku izolowania białek zawierających wiązania disulfidowe w natywnej konformacji nie obejmuje hodowli komórek i/lub samego wytwarzania białek. Sposób według wynalazku przeprowadza się jednak na materiale wytwarzającym białka, takim jak wytwarzające komórki zawierające białko, zaczynając od zbierania komórek, przez płukanie komórek po zebraniu, aż do stabilizacji wyizolowanych białek przez zamrożenie, np. przez zamrożenie wyizolowanych ciał inkluzyjnych.

Konkretniej, gdy potencjał redukujący w cytozolu komórki maleje w wyniku zmniejszenia aktywności reduktaz tioredoksynowych, np., gdy komórki przestają rosnąć, np. podczas zbierania i płukania po zebraniu, komórki są korzystnie już umieszczone w warunkach beztlenowych. Warunki beztlenowe są korzystnie utrzymywane podczas całego procesu aż do rozpoczęcia refałdowania białka.

Sposób według wynalazku może odpowiednio obejmować takie etapy, jak Iiza komórek, przykładowo przez wstępne działanie enzymatyczne, po którym następuje rozbicie lub fragmentacja komórek, np. przez działanie ultradźwiękami, obróbka komórek w prasie French'a albo mieszanie z wysokim ścinaniem, takie jak obróbka w Ultra-Turrax™, pod warunkiem, że Iiza ta przeprowadzana jest w warunkach beztlenowych. Dalszy etap w sposobie według wynalazku może obejmować oddzielenie lub izolację ciał inkluzyjnych z cytozolu, w przypadku, gdy pożądane białko jest tam wytwarzane w warunkach beztlenowych. Po tym etapie możliwe jest przechowywanie wyizolowanych ciał inkluzyjnych i stabilizowanie zawartych tam białek, przykładowo przez zamrażanie, np. w -20°C lub schłodzenie, np. w 2-8°C. Dalsze etapy procesu izolowania i oczyszczania białka nie muszą być koniecznie przeprowadzane w warunkach beztlenowych.

Po odebraniu z przechowywania lub bezpośrednio po przeprowadzeniu powyższych etapów izolacji, wyizolowane i ewentualnie w dalszym stopniu oczyszczone białko może być refałdowane do konformacji natywnej. Ogólnie, w przypadku białek zawierających wiązania disulfidowe takie refałdowanie przeprowadzane jest w roztworze rozcieńczonym, w celu uniknięcia tworzenia się nienatywnych międzycząsteczkowych mostków disulfidowych. Bardzo odpowiedni sposób refałdowania insuliny obejmuje rozpuszczenie białka w buforze zawierającym NaHCO3 i EDTA w pH 12,0, zmniejszenie pH do 11,2, działanie węglem drzewnym i filtrowanie. Polipeptydy są następnie fałdowane przez podanie do roztworu powietrza w celu utlenienia disulfidów.

Dla produktów fuzyjnych można następnie przeprowadzić trawienie białka fuzyjnego odpowiednim enzymem proteolitycznym w celu uwolnienia pożądanego zrekombinowanego białka. Po wyizolowaniu białka sposobem według wynalazku można ponadto prowadzić oczyszczanie do stanu zasadniczo czystego przy zastosowaniu standardowych dobrze znanych w tej dziedzinie technik, w tym rozpuszczania w detergentach, wybiórczego wytrącania za pomocą substancji, takich jak siarczan amonu, chromatografii kolumnowej, metod immunooczyszczania, chromatografii powinowactwa i innych, patrz, przykładowo, R. Scopes, Protein Purification: Principies and Practicef Springer-Verlag: New York (1982); Deutscher, Guide to Protein Purification, Academic Press (1990).

Wynalazek zilustrowano poniżej następującymi, nieograniczającymi przykładami.

Przykłady

Po fermentacji płynną hodowlę doprowadza się do warunków beztlenowych przez odcięcie dopływu sprężonego powietrza, usunięcie nadciśnienia i przedmuchanie azotem fazy gazowej nad hoPL 212 317 B1 dowlą oraz płynów procesowych. Przedmuchiwanie fazy gazowej nad hodowlą azotem jest kontynuowane podczas wszystkich kolejnych etapów procesu, obejmujących zebranie i płukanie komórek, lizę komórek oraz dodatkowe działanie na ciała inkluzyjne. Przedmuchiwaniu azotem poddawana jest także aparatura procesowa, taka jak naczynia, zbiorniki i aparatura pomocnicza, taka jak wirówki, homogenizatory i jednostki do filtrowania. Przedmuchiwanie azotem przeprowadza się za pomocą nieruchomego przewodu rurowego.

P r z y k ł a d 1

Dwie identyczne hodowle w skali 450 1 szczepu SΦ733/pDBAST-RAT-N-7-1, produkującego zrekombinowanego prekursora ludzkiej insuliny, prowadzono wychodząc od zawartości identycznych ampułek z roboczego banku komórek. Przebieg fermentacji śledzono i analizowano próbki z obu hodowli za pomocą zgodnych z normą procedur analitycznych. Wyniki wykazują, że obie hodowle przebiegały w bardzo zbliżony sposób i że uzyskana absorbancja, sucha masa, końcowe stężenie białka i końcowe względne stężenie prekursora insuliny wykazywały różnice 8% lub mniejsze.

Po fermentacji obie hodowle poddano identycznym procedurom odzyskiwania ciał inkluzyjnych (IB), co schematycznie przedstawiono na schemacie technologicznym na fig. 1.

Podczas procedury odzyskiwania IB warstwę ochronną azotu zastosowano tylko w drugiej hodowli, a pierwszą hodowlę utrzymywano w warunkach tlenowych.

Po odzyskaniu IB uzyskane produkty w postaci ciał inkluzyjnych poddano refałdowaniu i oczyszczaniu na małą skalę w celu wyznaczenia ilości prawidłowo sfałdowanego białka prekursora insuliny przy zastosowaniu HPLC.

Analiza wykazała, że w litrze przetwarzanej w warunkach tlenowych hodowli wydajność uzyskania prawidłowo utlenionego, sfałdowanego i strawionego prekursora insuliny wynosiła zaledwie 8,1% w porównaniu z wydajnością z hodowli prowadzonej w warunkach beztlenowych.

P r z y k ł a d 2

Byliśmy w stanie wykazać wpływ różnych warunków atmosfery na izolację peptydu insuliny. Dokonano tego w doświadczeniach, w których odzyskana beztlenowo zawiesina ciał inkluzyjnych została rozdzielona na 3 porcje po 40 ml. Porcje te były przedmuchiwane przez 16 godzin tymi samymi ilościami odpowiednio gazowego azotu, sprężonego powietrza lub gazowego tlenu. Następnie, zawiesinę i materiał wyjściowy poddano refałdowaniu i oczyszczaniu na małą skalę w celu zmierzenia uzyskiwalnej ilości insuliny. Analizy wykazały, że przedmuchiwanie zawiesin ciał inkluzyjnych sprężonym powietrzem lub gazowym tlenem powodowało gwałtowne zmniejszenie wydajności prawidłowo sfałdowanego białka, podczas gdy przedmuchiwanie przez 16 godzin gazowym azotem nie miało takiego wpływu na wydajność. Wykazuje to, że zastosowanie sposobu według niniejszego wynalazku może znacząco zwiększyć wydajność prawidłowo sfałdowanego białka, gdy podczas obróbki usunie się tlen z ciał inkluzyjnych prekursora insuliny. Wyniki tego doświadczenia przedstawiono na fig. 2.

Claims (7)

1. Sposób izolacji białka zawierającego wiązania disulfidowe w natywnej konformacji, znamienny tym, że obejmuje izolowanie tego białka w warunkach zasadniczo beztlenowych, białko jest zrekombinowanym białkiem hybrydowym obecnym w postaci ciał inkluzyjnych zrekombinowanych komórek, a izolacja obejmuje zebranie i rozerwanie tych komórek, wyizolowanie ciał inkluzyjnych i stabilizację wyizolowanego produktu.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zasadniczo beztlenowe warunki obejmują zasadniczo beztlenową atmosferę.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że białko jest insuliną.

4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że białko jest białkiem prekursorowym.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że białkiem prekursorowym jest prekursor insuliny.

6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że zasadniczo beztlenowa atmosfera jest atmosferą azotu.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zrekombinowane komórki są komórkami E. coli szczepu SΦ733 niosącymi i wyrażającymi plazmid pDBAST-RAT-N-7-1.