ES2989940T3 - Materiales y métodos para el tratamiento de la ataxia de Friedreich y otros trastornos relacionados - Google Patents

Abstract

La presente solicitud proporciona materiales y métodos para tratar a un paciente con una o más afecciones asociadas con FXN, ya sea ex vivo o in vivo. Además, la presente solicitud proporciona materiales y métodos para editar y/o modular la expresión del gen FXN en una célula mediante edición genómica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Materiales y métodos para el tratamiento de la ataxia de Friedreich y otros trastornos relacionados

Campo

La presente divulgación se refiere al campo de la reescritura genómica y específicamente a la alteración del gen Frataxina (FXN) con ARN guía de una sola molécula como se define en las reivindicaciones.

Solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE. UU. n.° 62/355.930 presentada el 29 de junio de 2016 y la solicitud provisional de EE. UU. n.° 62/461.821 presentada el 22 de febrero de 2017.

Antecedentes

La ingeniería genómica se refiere a las estrategias y técnicas para la modificación específica y dirigida de la información genética (genoma) de los organismos vivos. La ingeniería genómica es un campo de investigación muy activo debido a la amplia gama de posibles aplicaciones, particularmente en las áreas de salud humana. Por ejemplo, la ingeniería genómica se puede utilizar para alterar (p. ej., corregir o desactivar) un gen que porta una mutación dañina o para explorar la función de un gen. Las primeras tecnologías desarrolladas para insertar un transgén en una célula viva solían estar limitadas por la naturaleza aleatoria de la inserción de la nueva secuencia en el genoma. Las inserciones aleatorias en el genoma pueden provocar la interrupción de la regulación normal de genes vecinos, dando lugar a graves efectos no deseados. Además, las tecnologías de integración aleatoria ofrecen poca reproducibilidad, ya que no hay garantía de que la secuencia se inserte en el mismo lugar en dos células diferentes. Las estrategias recientes de ingeniería genómica, tales como las nucleasas con dedos de zinc (ZFN,Zinc Finger Nucleases),las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN,Transcription Activator-Like Effector Nucleases),las endonucleasas de asentamiento (HE,Homing Endonucleases)y MegaTAL, permiten que se modifique un área específica del ADN, aumentando así la precisión de la alteración en comparación con las primeras tecnologías. Estas plataformas más novedosas ofrecen un grado mucho mayor de reproducibilidad, pero todavía tienen sus limitaciones.

A pesar de los esfuerzos de investigadores y profesionales médicos de todo el mundo que han estado tratando de abordar los trastornos genéticos, y a pesar de la promesa de los enfoques de ingeniería genómica, todavía existe una necesidad esencial de desarrollar tratamientos seguros y efectivos que incluyan indicaciones relacionadas con FXN.

Al utilizar herramientas de ingeniería genómica para crear cambios permanentes en el genoma que puedan abordar los trastornos o afecciones relacionados con<f>X<n>con tan solo un tratamiento, la terapia resultante puede remediar por completo ciertas indicaciones y/o enfermedades relacionadas con FXN.

Sumario

La presente invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas. Específicamente, la presente invención se refiere a un ARN guía de una sola molécula que comprende al menos una secuencia espaciadora que es una secuencia de ARN correspondiente a cualquiera de las SEQ ID NO: 16178, 16295, 9521, 16177, 9373, 9257, 16201, 16094, 9210, 9232, 16187, 9194, 16084, 16133, 16253, 16278, 9364, 16141, 9359, 16315, 9294, 16271, 16164, 16311, 9203, 9258, 16224, 16163, 16159, 9327, 9264, 16274, 9237, 9282, 16161, 16091, 16260, 16293, 16294, 16450, 16100, 16138, 9387, 9249, 16131, 9214, 37549, 16123, 16126, 9271, 16176, 9260, 16128, 9388, 16096, 16259, 9212, 9516, 9224, 9369, 9206, 9333, 9293, 16252, 9211, 16275, 9234, 16129, 16254, 9174, 9363, 9251, 16144, 9372, 16263, 16290, 16143, 16273 o 16245. La presente invención también se refiere a un ADN que codifica un ARN guía de una sola molécula de la presente invención. De acuerdo con la presente invención, el ARN guía de una sola molécula de la presente invención se puede utilizar en el tratamiento de un trastorno relacionado con la frataxina (FXN), que comprende la reescritura del gen FXN en una célula de un paciente. La presente invención se refiere además a un métodoex vivooin vitropara reescribir un gen de Frataxina (FXN) en una célula mediante reescritura genómica que comprende introducir en la célula: una o más endonucleasas Cas9 de S.pyogeneso uno o más polinucleótidos que codifican la una o más endonucleasas Cas9 de S.pyogenes;y uno o más ARN guía de una sola molécula (ARNgu) de la presente invención o uno o más ADN de la presente invención; para efectuar una o más roturas monocatenarias (RMC) o roturas bicatenarias (RBC) dentro o cerca del gen FXN o de los elementos reguladores de FXN que dan lugar a una o más inserciones, deleciones o mutaciones permanentes de al menos un nucleótido dentro o cerca del gen FXN, reduciendo o eliminando así la expresión o función de productos anómalos del gen FXN.

En el presente documento, se describen métodos celulares,ex vivoein vivopara crear cambios permanentes en el genoma delecionando y/o corrigiendo la ampliación de la repetición trinucleotídica, o sustituyendo una o más bases nucleotídicas, o uno o más exones y/o intrones dentro o cerca del gen de la Frataxina (FXN), o introduciendo de otro modo inserciones, deleciones o mutaciones de al menos un nucleótido dentro o cerca del gen FXN u otras secuencias de ADN que codifican elementos reguladores del gen FXN mediante reescritura genómica. Dichos métodos pueden reducir o eliminar la expresión o función de productos anómalos del gen FXN y/o restablecer la actividad de la proteína FXN de tipo natural, que puede utilizarse para tratar una afección o un trastorno relacionado con el FXN, como la ataxia de Friedreich. También se proporcionan en el presente documento componentes y composiciones, y vectores para realizar dichos métodos.

En el presente documento se describe un método para reescribir un gen de Frataxina (FXN) en una célula mediante reescritura genómica que comprende la etapa de introducir en la célula una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) para efectuar una o más roturas monocatenarias (RMC) o roturas bicatenarias (RBC) dentro o cerca del gen FXN que den lugar a la deleción permanente de la repetición trinucleotídica ampliada o el reemplazo de una o más bases de nucleótidos, o uno o más exones y/o intrones dentro o cerca del gen FXN, restableciendo así la función del gen FXN.

También se describe en el presente documento un método para reescribir un gen de Frataxina (FXN) en una célula mediante reescritura genómica que comprende la etapa de introducir en la célula una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) para efectuar una o más roturas monocatenarias (RMC) o roturas bicatenarias (RBC) dentro o cerca del gen FXN o elementos reguladores de FXN que den lugar a una o más inserciones, deleciones o mutaciones permanentes de al menos un nucleótido dentro o cerca del gen FXN, reduciendo o eliminando así la expresión o función de productos anómalos del gen FXN.

También se describe en el presente documento un métodoex vivopara tratar a un paciente que tenga una afección o un trastorno relacionado con FXN que comprende las etapas de: crear una célula madre pluripotente inducida (iPSC,induced Pluripotent Stem Cell)específica del paciente; reescribir dentro o cerca de un gen Frataxina (FXN) u otras secuencias de ADN que codifican elementos reguladores del gen FXN de las iPSC; diferenciar las iPSC reescritas genómicamente en una neurona o neurogliocito del sistema nervioso central (SNC); e implantar la neurona o el neurogliocito del sistema nervioso central (SNC) en el paciente.

En algunos aspectos, la etapa de reescritura comprende: introducir en las iPSC una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) para efectuar una o más roturas monocatenarias (RMC) o roturas bicatenarias (RBC) dentro o cerca del gen FXN que den lugar a la deleción permanente de la repetición trinucleotídica ampliada o el reemplazo de una o más bases de nucleótidos, o uno o más exones y/o intrones dentro o cerca del gen FXN, restableciendo así la función del gen FXN.

En algunos aspectos, la etapa de reescritura comprende: introducir en las iPSC una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) para efectuar una o más roturas monocatenarias (RMC) o roturas bicatenarias (RBC) dentro o cerca del gen FXN o elementos reguladores de FXN que den lugar a una o más inserciones, deleciones o mutaciones permanentes de al menos un nucleótido dentro o cerca del gen FXN, reduciendo o eliminando así la expresión o función de productos anómalos del gen FXN.

También se describe en el presente documento un métodoex vivopara tratar a un paciente que tiene una afección o un trastorno relacionado con FXN que comprende: aislar una célula madre mesenquimatosa del paciente; reescribir dentro o cerca de un gen Frataxina (FXN) u otras secuencias de ADN que codifican elementos reguladores del gen FXN de la célula madre mesenquimatosa; diferenciar la célula madre mesenquimatosa reescrita genómicamente en una neurona o un neurogliocito del sistema nervioso central (SNC); e implantar la neurona o el neurogliocito del sistema nervioso central (SNC) en el paciente.

En algunos aspectos, la etapa de reescritura comprende: introducir en la célula madre mesenquimatosa una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) para efectuar una o más roturas monocatenarias (RMC) o roturas bicatenarias (RBC) dentro o cerca del gen FXN que den lugar a la deleción permanente de la repetición trinucleotídica ampliada o el reemplazo de una o más bases de nucleótidos, o uno o más exones y/o intrones dentro o cerca del gen FXN, restableciendo así la función del gen FXN.

En algunos aspectos, la etapa de reescritura comprende: introducir en la célula madre mesenquimatosa una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) para efectuar una o más roturas monocatenarias (RMC) o roturas bicatenarias (RBC) dentro o cerca del gen FXN o elementos reguladores de FXN que den lugar a una o más inserciones, deleciones o mutaciones permanentes de al menos un nucleótido dentro o cerca del gen FXN, reduciendo o eliminando así la expresión o función de productos anómalos del gen FXN.

También se describe en el presente documento un métodoin vivopara tratar a un paciente con un trastorno relacionado con FXN que comprende: reescribir el gen Frataxina (FXN) en una célula del paciente.

En algunos aspectos, la etapa de reescritura comprende: introducir en la célula una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) para efectuar una o más roturas monocatenarias (RMC) o roturas bicatenarias (RBC) dentro o cerca del gen FXN que den lugar a la deleción permanente de la repetición trinucleotídica ampliada o el reemplazo de una o más bases de nucleótidos, o uno o más exones y/o intrones dentro o cerca del gen FXN, restableciendo así la función del gen FXN.

En algunos aspectos, la etapa de reescritura comprende: introducir en la célula una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) para efectuar una o más roturas monocatenarias (RMC) o roturas bicatenarias (RBC) dentro o cerca del gen FXN o elementos reguladores de FXN que den lugar a una o más inserciones, deleciones o mutaciones permanentes de al menos un nucleótido dentro o cerca del gen FXN, reduciendo o eliminando así la expresión o función de productos anómalos del gen FXN.

En algunos aspectos, la célula es una célula del sistema nervioso central (SNC). En algunos aspectos, la célula del sistema nervioso central (SNC) es una neurona. En algunos aspectos, la célula del sistema nervioso central (SNC) es un neurogliocito. En algunos aspectos, la una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) se administran a la célula del sistema nervioso central (SNC) a través de vías intraparenquimatosa, intravenosa, intraarterial, intracerebroventricular, intracisternal, intratecal, intracraneal o intraperitoneal.

También se describe en el presente documento un método para alterar la secuencia genómica contigua de un gen FXN en una célula que comprende: poner en contacto la célula con una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) para efectuar una o más roturas monocatenarias (RMC) o roturas bicatenarias (RBC). En algunos aspectos, la alteración de la secuencia genómica contigua ocurre en el primer intrón del gen FXN. En algunos aspectos, la alteración de la secuencia genómica contigua ocurre en uno o más exones del gen FXN.

En algunos aspectos, la una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) se seleccionan de cualquiera de esas secuencias de SEQ ID NO: 1-620 y variantes que tienen al menos un 90 % de homología con cualquiera de las secuencias enumeradas en SEQ ID NO: 1-620.

En algunos aspectos, la una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) son una o más proteínas o polipéptidos. En algunos aspectos, la una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) son uno o más polinucleótidos que codifican una o más endonucleasas de ADN. En algunos aspectos, la una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) son uno o más ácidos ribonucleicos (ARN) que codifican una o más endonucleasas de ADN. En algunos aspectos, el uno o más ácidos ribonucleicos (ARN) son uno o más ARN modificados químicamente. En algunos aspectos, el uno o más ácidos ribonucleicos (ARN) están modificados químicamente en la región codificante. En algunos aspectos, el uno o más polinucleótidos o uno o más ácidos ribonucleicos (ARN) tienen optimización de los codones.

En algunos aspectos, los métodos comprenden además la introducción de uno o más ARNg o uno o más ARNgu. En algunos aspectos, el uno o más ARNg o uno o más ARNgu comprenden una secuencia espaciadora que es complementaria a una secuencia dentro o cerca de la repetición trinucleotídica ampliada en el gen FXN. En algunos aspectos, el uno o más ARNg o uno o más ARNgu comprenden una secuencia espaciadora que es complementaria a una secuencia de ADN dentro o cerca del gen FXN. En algunos aspectos, el uno o más ARNg o uno o más ARNgu comprenden una secuencia espaciadora que es complementaria a una secuencia que flanquea el gen FXN u otra secuencia que codifica un elemento regulador del gen FXN. En algunos aspectos, el uno o más ARNg o uno o más ARNgu están modificados químicamente.

En algunos aspectos, el uno o más ARNg o uno o más ARNgu están precomplejados con la una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN). En algunos aspectos, la precomplejación implica una unión covalente del uno o más ARNg o uno o más ARNgu a una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN).

En algunos aspectos, la una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) se formulan en un liposoma o una nanopartícula lipídica. En algunos aspectos, la una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) se formulan en un liposoma o una nanopartícula lipídica, que también comprende el uno o más ARNg o uno o más ARNgu.

En algunos aspectos, la una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) están codificadas en una partícula de vector de AAV. En algunos aspectos, el uno o más ARNg o uno o más ARNgu están codificados en una partícula de vector de AAV. En algunos aspectos, la una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) están codificadas en una partícula de vector de AAV, que también codifica el uno o más ARNg o uno o más ARNgu. En algunos aspectos, la partícula del vector de AAV se selecciona del grupo que consiste en cualquiera de las divulgadas en las SEQ ID NO: 4734-5302 y la Tabla 2.

En algunos aspectos, los métodos comprenden además introducir en la célula una plantilla donante que comprende al menos una parte del gen FXN de tipo natural. En algunos aspectos, al menos una parte del gen FXN de tipo natural comprende una o más secuencias seleccionadas entre un exón de FXN, un intrón de FXN y una secuencia que comprende una unión entre exón e intrón de FXN. En algunos aspectos, la plantilla donante comprende brazos homólogos al locus genómico del gen FXN. En algunos aspectos, la plantilla donante es un polinucleótido monocatenario o bicatenario.

En algunos aspectos, la plantilla donante está codificada en una partícula de vector de AAV, donde el serotipo del vector de AAV se selecciona entre cualquiera de los enumerados en SEQ ID NO: 4734-5302 y la Tabla 2. En algunos aspectos, el uno o más polinucleótidos que codifican una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) se formulan en una nanopartícula lipídica, y el uno o más ARNg o uno o más ARNgu se administran a la célulaex vivopor electroporación, y la plantilla donante se administra a la célula mediante un vector de dependoparvovirus (AAV). En algunos aspectos, el uno o más polinucleótidos que codifican una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) se formulan en un liposoma o una nanopartícula lipídica, que también comprende el uno o más ARNg o uno o más ARNgu y la plantilla donante.

También se describe en el presente documento un ARN guía de una sola molécula que comprende: al menos una secuencia espaciadora que es una secuencia de ARN correspondiente a cualquiera de las SEQ ID NO: 5305-37514 y 37549. En algunos aspectos, el polinucleótido guía de una sola molécula comprende además una región de ampliación espaciadora. En algunos aspectos, el ARN guía de una sola molécula comprende además una región de ampliación de ARNtracr. En algunos aspectos, el ARN guía de una sola molécula está modificado químicamente.

En algunos aspectos, el ARN guía de una sola molécula se precompleja con una endonucleasa de ADN. En algunos aspectos, la endonucleasa del ADN es una endonucleasa Cas9 o CPf1. En algunos aspectos, la endonucleasa Cas9 o Cpf1 se selecciona del grupo que consiste en: Cas9 de S.pyogenes,Cas9 de S.aureus,Cas9 deN. meningitis,Cas9 de CRISPR1 de S.thermophilus,Cas9 de CRISPR 3 de S.thermophilus,Cas9 deT. denticola,Cpf1 ND2006 deL. bacteriumy Cpf1 BV3L6 deAcidaminococcus sp.y variantes que tienen al menos un 90 % de homología con estas endonucleasas. En algunos aspectos, la endonucleasa Cas9 o Cpf1 comprende una o más señales de localización nuclear (NLS,Nuclear Localization Signals).En algunos aspectos, al menos una NLS está en o dentro de los 50 aminoácidos del extremo aminoterminal de la endonucleasa Cas9 o Cpf1 y/o al menos una NLS está en o dentro de los 50 aminoácidos del extremo carboxiterminal de la endonucleasa Cas9 o Cpf1.

También se describe en el presente documento un sistema CRISPR/Cas de origen no natural que comprende un polinucleótido que codifica una enzima Cas9 o Cpf1 y al menos un ARN guía de una sola molécula descrito en el presente documento. En algunos aspectos, el polinucleótido que codifica una enzima Cas9 o Cpf1 se selecciona del grupo que consiste en: Cas9 de S.pyogenes,Cas9 de S.aureus,Cas9 deN. meningitis,Cas9 de CRISPR1 de S.thermophilus,Cas9 de CRISPR 3 de S.thermophilus,Cas9 deT. denticola,Cpf1 ND2006 deL. bacteriumy Cpf1 BV3L6 deAcidaminococcus sp.y variantes que tienen al menos un 90 % de homología con estas endonucleasas. En algunos aspectos, el polinucleótido que codifica una endonucleasa Cas9 o Cpf1 comprende una o más señales de localización nuclear (NLS). En algunos aspectos, al menos una NLS está en o dentro de los 50 aminoácidos del extremo aminoterminal del polinucleótido que codifica una endonucleasa Cas9 o Cpf1 y/o al menos una NLS está en o dentro de los 50 aminoácidos del extremo carboxiterminal del polinucleótido que codifica una endonucleasa Cas9 o Cpf1. En algunos aspectos, el polinucleótido que codifica una endonucleasa Cas9 o Cpf1 tiene optimización de codones para su expresión en una célula eucariota.

También se describe en el presente documento ARN que codifica el ARN guía de una sola molécula descrito en el presente documento.

También se describe en el presente documento ARN que codifica el sistema CRISPR/Cas descrito en el presente documento.

También se proporciona en el presente documento un ADN que codifica el ARN guía de una sola molécula descrito en el presente documento como se define en las reivindicaciones.

También se describe en el presente documento un ADN que codifica el sistema CRISPR/Cas descrito en el presente documento.

También se describe en el presente documento un vector que comprende un ADN que codifica el ARN guía de una sola molécula y el sistema CRISPR/Cas. En algunos aspectos, el vector es un plásmido. En algunos aspectos, el vector es una partícula de vector de VAA, en donde la partícula del vector de AAV se selecciona entre las enumeradas en las SEQ ID NO: 4734-5302 o la Tabla 2.

Breve descripción de los dibujos

Diversos aspectos de los materiales y métodos divulgados y descritos en esta memoria descriptiva se pueden entender mejor haciendo referencia a las figuras adjuntas, en las que:

las figuras 1A-B representan el sistema CRISPR/Cas de tipo II;

la figura 1A es una representación del sistema CRISPR/Cas de tipo II que incluye ARNg;

la figura 1B es otra representación del sistema CRISPR/Cas de tipo II que incluye ARNgu;

las figuras 2A-E describen las eficiencias de corte de ARNg de S.pyogenesseleccionados a través de un cribado de ARNg transcritoin vitro(IVT, in vitrotranscribed)en células HEK293T;

la figura 2A describe las eficiencias de corte en el intervalo de 81,2-97,6 % de ARNg de S.pyogenesseleccionados a través de un cribado de ARNg transcritoin vitro(IVT) en células HEK293T;

la figura 2B describe las eficiencias de corte en el intervalo de 72,6-81,2 % de ARNg de S.pyogenesseleccionados a través de un cribado de ARNg transcritoin vitro(IVT) en células HEK293T;

la figura 2C describe las eficiencias de corte en el intervalo de 59,2-72,3%de ARNg de S.pyogenesseleccionados a través de un cribado de ARNg transcritoin vitro(IVT) en células HEK293T;

la figura 2D describe las eficiencias de corte en el intervalo de 32,3-59,0 % de ARNg de S.pyogenesseleccionados a través de un cribado de ARNg transcritoin vitro(IVT) en células HEK293T;

la figura 2E describe las eficiencias de corte en el intervalo de 0-32,1 % de ARNg de S.pyogenesseleccionados a través de un cribado de ARNg transcritoin vitro(IVT) en células HEK293T;

las figuras 3 A-C describen la eficiencia de corte de ARNg de S.pyogenesen células HEK293T;

la figura 3 A describe la eficiencia de corte en el intervalo de 74,3-97,6 % de ARNg de S.pyogenesen células HEK293T;

la figura 3B describe la eficiencia de corte en el intervalo de 53,9-74,1 % de ARNg de S.pyogenesen células HEK293T;

la figura 3C describe la eficiencia de corte en el intervalo de 0-53,4 % de ARNg de S.pyogenesen células HEK293T;

las figuras 4A-C describen las eficiencias de corte de ARNg de S.aureusseleccionados a través de un cribado de ARNg transcritoin vitro(IVT) en células HEK293T;

la figura 4A describe las eficiencias de corte en el intervalo de 26,4-50,5 % de ARNg de S.aureusseleccionados a través de un cribado de ARNg transcritoin vitro(IVT) en células HEK293T;

la figura 4B describe las eficiencias de corte en el intervalo de 3,6-25,8 % de ARNg de S.aureusseleccionados a través de un cribado de ARNg transcritoin vitro(IVT) en células HEK293T;

la figura 4C describe las eficiencias de corte en el intervalo de 0-3,3 % de ARNg de S.aureusseleccionados a través de un cribado de ARNg transcritoin vitro(IVT) en células HEK293T; y

la figura 5 describe la eficiencia de corte en el intervalo de 0-50,5 % de ARNg de S.aureusen células HEK293T.

Breve descripción del listado de secuencias

Las SEQ ID NO: 1-620 son secuencias ortólogas de la endonucleasa Cas.

Las SEQ ID NO: 621-631 no incluyen secuencias.

Las SEQ ID NO: 632-4715 son secuencias de microARN.

Las SEQ ID NO: 4716-4733 no incluyen secuencias.

Las SEQ ID NO: 4734-5302 son secuencias de serotipo AAV.

La SEQ ID NO: 5303 es una secuencia de nucleótidos de FXN.

La SEQ ID NO: 5304 es una secuencia genética que incluye entre 1 y 5 pares de kilobases en dirección 5' y/o en dirección 3' del gen FXN.

Las SEQ ID NO: 5305-5474 son secuencias espaciadoras de 20 pb para dirigirse hacia dentro o cerca de un gen FXN u otra secuencia de ADN que codifique un elemento regulador del gen FXN con una endonucleasa Cas9 deT. denticola.

Las SEQ ID NO: 5475-5827 son secuencias espaciadoras de 20 pb para dirigirse hacia dentro o cerca de un gen FXN u otra secuencia de ADN que codifique un elemento regulador del gen FXN con una endonucleasa Cas9 de S.thermophilus.

Las SEQ ID NO: 5828--7262 son secuencias espaciadoras de 20 pb para dirigirse hacia dentro o cerca de un gen FXN u otra secuencia de ADN que codifique un elemento regulador del gen FXN con una endonucleasa Cas9 deS. aureus.

Las SEQ ID NO: 7263-8441 son secuencias espaciadoras de 20 pb para dirigirse hacia dentro o cerca de un gen FXN u otra secuencia de ADN que codifique un elemento regulador del gen FXN con una endonucleasa Cas9 deN. meningitides.

Las SEQ ID NO: 8442-22079 son secuencias espaciadoras de 20 pb para dirigirse hacia dentro o cerca de un gen FXN u otra secuencia de ADN que codifique un elemento regulador del gen FXN con una endonucleasa Cas9 deS. pyogenes.

Las SEQ ID NO: 22080-37514 son secuencias espaciadoras de 20 pb para dirigirse hacia dentro o cerca de un gen FXN u otra secuencia de ADN que codifique un elemento regulador del gen FXN con una endonucleasa Cpf1 deAcidaminococcus, LachnospiraceaeyFranciscella Novicida.

Las SEQ ID NO: 37515-37544 no incluyen secuencias.

La SEQ ID NO: 37545 es un ARN guía (ARNg) de muestra para una endonucleasa Cas9 de S.pyogenes.

Las SEQ ID NO: 37546-37548 muestran secuencias de ARNgu de muestra.

La SEQ ID NO: 37549 es una secuencia espaciadora de 20 pb para dirigirse hacia dentro o cerca de un gen FXN u otra secuencia de ADN que codifique un elemento regulador del gen FXN con una endonucleasa Cas9 de S.pyogenes.

Descripción detallada

I. INTRODUCCIÓN

La reescritura genómica

La presente divulgación proporciona estrategias y técnicas para la alteración dirigida y específica de la información genética (genoma) de organismos vivos. Como se usa en el presente documento, el término "alteración" o la expresión "alteración de la información genética" se refiere a cualquier cambio en el genoma de una célula. En el contexto del tratamiento de trastornos genéticos, las alteraciones pueden incluir, pero sin limitación, la inserción, deleción y corrección. Como se usa en el presente documento, el término "inserción" se refiere a la adición de uno o más nucleótidos en una secuencia de ADN. Las inserciones pueden variar desde pequeñas inserciones de unos pocos nucleótidos hasta inserciones de segmentos grandes como un ADNc o un gen. El término "deleción" se refiere a una pérdida o eliminación de uno o más nucleótidos en una secuencia de ADN, o una pérdida o eliminación de la función de un gen. En algunos casos, una deleción puede incluir, por ejemplo, una pérdida de unos cuantos nucleótidos, un exón, un intrón, un segmento de un gen, o la secuencia completa de un gen. En algunos casos, la deleción de un gen se refiere a la eliminación o reducción de la función o expresión de un gen o de su producto génico. Esto no solo puede deberse a una deleción de secuencias dentro o cerca del gen, sino también a otros eventos (p. ej., inserción, mutación sin sentido) que interrumpan la expresión del gen. El término "corrección", como se usa en el presente documento, se refiere a un cambio de uno o más nucleótidos de un genoma en una célula, ya sea por inserción, deleción o sustitución. Tal corrección puede producir un resultado genotípico o fenotípico más favorable, ya sea en estructura o función, en el sitio genómico que fue corregido. Un ejemplo no limitativo de una "corrección" incluye la corrección de una secuencia mutada o defectuosa a una secuencia de tipo natural que restablece la estructura o función de un gen o de sus productos génicos. Dependiendo de la naturaleza de la mutación, la corrección puede lograrse a través de diferentes estrategias divulgadas en el presente documento. En un ejemplo no limitativo, una mutación de aminoácido se puede corregir reemplazando la región que contiene la mutación con su homóloga de tipo natural. Como otro ejemplo, las mutaciones de duplicación (p. ej., ampliaciones repetidas) en un gen pueden corregirse eliminando las secuencias adicionales.

En algunos aspectos, las alteraciones también pueden incluir la inserción, inactivación o atenuación génica. Como se usa en el presente documento, la expresión "inserción génica" se refiere a la adición de una secuencia de ADN, o un fragmento de la misma, a un genoma. Las secuencias de ADN que se van a insertar pueden incluir un gen o genes completos, pueden incluir secuencias reguladoras asociadas con un gen o cualquier parte o fragmento del mismo. Por ejemplo, un ADNc que codifica la proteína de tipo natural puede insertarse en el genoma de una célula portadora de un gen mutado. Las estrategias de inserción génica no necesitan reemplazar el gen defectuoso, en su totalidad o en parte. En algunos casos, una estrategia de inserción génica puede implicar además la sustitución de una secuencia existente por la secuencia proporcionada, p. ej., la sustitución de un alelo mutado por una copia de tipo natural. Por otra parte, la expresión "inactivación génica" se refiere a la eliminación de un gen o a la expresión de un gen. Por ejemplo, un gen puede ser inactivado mediante una deleción o una adición de una secuencia de nucleótidos que conduzca a una interrupción del marco de lectura. Como otro ejemplo, un gen puede ser inactivado reemplazando una parte del gen con una secuencia irrelevante. Finalmente, la expresión "atenuación génica" como se utiliza en el presente documento se refiere a la reducción en la expresión de un gen o de sus productos génicos. Como resultado de una atenuación genética, la actividad o función de la proteína puede atenuarse o los niveles de proteína pueden reducirse o eliminarse.

La reescritura genómica generalmente se refiere al proceso de modificar la secuencia de nucleótidos de un genoma, preferentemente de una manera exacta o predeterminada. Como ejemplos de métodos de reescritura genómica descritos en el presente documento se incluyen métodos de uso de nucleasas dirigidas al sitio para cortar ácido desoxirribonucleico (ADN) en ubicaciones diana exactas del genoma, creando así roturas monocatenarias o bicatenarias de ADN en ubicaciones particulares dentro del genoma. Estas roturas pueden repararse y se reparan regularmente mediante tratamientos naturales, procesos celulares endógenos, tales como la reparación dirigida por homología (HDR,homology-directed repair)y la unión de extremos no homólogos (NHEJ,non-homologous end joining),como se analiza en Coxet al.,Nature Medicine 21(2), 121-31 (2015). Estos dos procesos principales de reparación del ADN consisten en una familia de rutas alternativas. La NHEJ une directamente los extremos del ADN resultantes de una rotura bicatenaria, a veces con la pérdida o adición de una secuencia de nucleótidos, que pueden alterar o mejorar la expresión genética. La HDR utiliza una secuencia homóloga, o secuencia donadora, como molde para insertar una secuencia de ADN definida en el punto de rotura. La secuencia homóloga puede estar en el genoma endógeno, como una cromátida hermana. Como alternativa, el donante puede ser un ácido nucleico exógeno, tal como un plásmido, un oligonucleótido monocatenario, un oligonucleótido bicatenario, un oligonucleótido dúplex o un virus, que tiene regiones de alta homología con el locus escindido por nucleasa, pero que también puede contener una secuencia adicional o cambios de secuencia que incluyan deleciones que puedan incorporarse en el locus diana escindido. Un tercer mecanismo de reparación puede ser la unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ,microhomology-mediated end joining),también conocida como "NHEJ alternativa", en donde el resultado genético es similar al NHEJ en el sentido de que pueden producirse pequeñas deleciones e inserciones en el sitio de escisión. La MMEJ puede utilizar secuencias homólogas de algunos pares de bases que flanquean el sitio de rotura del ADN para dirigir un resultado de reparación de unión de extremos de ADN más favorable, e informes recientes han aclarado aún más el mecanismo molecular de este proceso; véase, p. ej., Cho y Greenberg, Nature 518, 174-76 (2015); Kentet al.,Nature Structural and Molecular Biology, Adv. Online doi: 10.1038/nsmb.2961(2015); Mateos-Gomezet al.,Nature 518, 254-57 (2015); Ceccaldiet al.,Nature 528, 258-62 (2015). En algunos casos, puede ser posible predecir los probables resultados de la reparación basándose en el análisis de posibles microhomologías en el sitio de la rotura del ADN.

Cada uno de estos mecanismos de reescritura genómica puede utilizarse para crear las alteraciones genómicas deseadas. Una etapa del proceso de reescritura genómica puede ser crear una o dos roturas del ADN, estas últimos como roturas bicatenarias o como dos roturas monocatenarias, en el locus diana tan cerca del sitio de la mutación prevista. Esto se puede lograr mediante el uso de polipéptidos dirigidos al sitio, como se describe e ilustra en el presente documento.

Sistema de endonucleasa CRISPR

Se puede encontrar un locus genómico CRISPR (grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares) en los genomas de muchos procariotas (p. ej., bacterias y arqueas). En los procariotas, el locus CRISPR codifica productos que funcionan como un tipo de sistema inmunitario para ayudar a defender a los procariotas contra invasores extraños, tales como virus y fagos. Hay tres etapas de la función del locus CRISPR: integración de nuevas secuencias en el locus CRISPR, expresión de ARN CRISPR (ARNcr) y silenciamiento del ácido nucleico invasor extraño. Se han identificado cinco tipos de sistemas CRISPR (p. ej., Tipo I, Tipo II, Tipo III, Tipo U y Tipo V).

Un locus CRISPR incluye una serie de secuencias cortas y repetidas denominadas "repeticiones". Cuando se expresan, las repeticiones pueden formar estructuras secundarias (p. ej., horquillas) y/o comprender secuencias monocatenarias no estructuradas. Las repeticiones suelen aparecer en grupos y con frecuencia divergen entre especies. Las repeticiones se intercalan regularmente con secuencias intermedias únicas denominadas secuencias "espadadoras", dando lugar a una arquitectura de locus repetición-espaciadora-repetición. Las secuencias espaciadoras son idénticas o tienen alta homología con secuencias invasoras extrañas conocidas. Una unidad de espaciadora-repetición codifica un ARNcrispr (ARNcr), que se procesa en una forma madura de la unidad espaciadorarepetición. Un ARNcr comprende una secuencia "semilla" o espaciadora que participa en el direccionamiento hacia un ácido nucleico diana (en la forma natural que se encuentra en los procariotas, la secuencia espaciadora se dirige al ácido nucleico invasor extraño). Una secuencia espaciadora se encuentra en el extremo 5' o 3' del ARNcr.

Un locus CRISPR también comprende secuencias de polinucleótidos que codifican genes asociados a CRISPR (Cas). Los genes Cas codifican endonucleasas que participan en la biogénesis y las etapas de interferencia de la función del ARNcr en procariotas. Algunos genes Cas comprenden estructuras secundarias y/o terciarias homólogas.

Sistemas CRISPR de tipo II

La biogénesis del ARNcr en un sistema CRISPR de tipo II en la naturaleza requiere un ARN CRISPR transactivador (ARNtracr). En las figuras 1A y 1B se muestran ejemplos no limitativos de sistemas CRISPR de tipo II. El ARNtracr puede ser modificado por la ribonucleasa III endógena y luego se hibrida con una repetición de ARNcr en la matriz de pre-ARNcr. Se puede reclutar ribonucleasa III endógena para escindir el pre-ARNcr. Los ARNcr escindidos se pueden someter a un recorte de exorribonucleasa para producir la forma ARNcr madura (p. ej., recorte en 5'). El ARNtracr puede permanecer hibridado con el ARNcr, y el ARNtracr y el ARNcr se asocian con un polipéptido dirigido al sitio (p. ej., Cas9). El ARNcr del complejo ARNcr-ARNtracr-Cas9 puede guiar el complejo hacia un ácido nucleico diana con el cual el ARNcr puede hibridar. La hibridación del ARNcr con el ácido nucleico diana puede activar Cas9 para la escisión dirigida del ácido nucleico. El ácido nucleico diana en un sistema CRISPR de tipo II se denomina motivo adyacente al protoespaciador (PAM,Protospacer Adjacent Motif).En la naturaleza, el PAM es esencial para facilitar la unión de un polipéptido dirigido al sitio (p. ej., Cas9) al ácido nucleico diana. Los sistemas de tipo II (también denominados Nmeni o CASS4) se subdividen en tipo II-A (CASS4) y II-B (CASS4a). Jineket al., Science,337(6096):816-821 (2012) demostró que el sistema CRISPR/Cas9 es útil para la reescritura genómica programable de ARN, y la publicación de solicitud de patente internacional número WO2013/176772 proporciona numerosos ejemplos y aplicaciones del sistema de endonucleasa CRISPR/Cas para la reescritura genómica de sitios específicos.

Sistemas CRISPR de tipo V

Los sistemas CRISPR de tipo V tienen varias diferencias importantes con respecto a los sistemas de tipo II. Por ejemplo, Cpf1 es una endonucleasa guiada por ARN único que, a diferencia de los sistemas de tipo II, carece de ARNtracr. De hecho, las matrices CRISPR asociadas a Cpf1 se pueden procesar para obtener ARNcr maduros sin necesidad de un ARNtracr transactivador adicional. La matriz CRISPR de tipo V se puede procesar en ARNcr maduros cortos de 42 a 44 nucleótidos de longitud, comenzando cada ARNcr maduro con 19 nucleótidos de repetición directa seguidos de 23-25 nucleótidos de secuencia espaciadora. En cambio, los ARNcr maduros en los sistemas de tipo II pueden comenzar con 20-24 nucleótidos de secuencia espaciadora seguidos de aproximadamente 22 nucleótidos de repetición directa. Igualmente, Cpf1 puede utilizar un motivo adyacente al protoespaciador rico en T de modo que los complejos Cpf1-ARNcr escindan eficazmente el ADN diana precedido por un PAM corto rico en T, lo que contrasta con el PAM rico en G que sigue al ADN diana para los sistemas de tipo II. Por tanto, los sistemas de tipo V se escinden en un punto que está distante del PAM, mientras que los sistemas de tipo II se escinden en un punto adyacente al PAM. Además, a diferencia de los sistemas de tipo II, Cpf1 escinde el ADN a través de una rotura bicatenaria escalonada de ADN con un saliente 5' de 4 o 5 nucleótidos. Los sistemas de tipo II se escinden mediante una rotura bicatenaria roma. De manera similar a los sistemas de tipo II, Cpf1 contiene un dominio de endonucleasa similar a RuvC previsto, pero carece de un segundo dominio de endonucleasa HNH, lo que contrasta con los sistemas de tipo II.

Genes Cas/polipéptidos y motivos adyacentes al protoespaciador

Como polipéptidos CRISPR/Cas ilustrativos se incluyen los polipéptidos de Cas9 publicados en Fonfaraet al., Nucleic Acids Research, 42:2577-2590 (2014). El sistema de nomenclatura de los genes CRISPR/Cas se ha modificado en gran medida desde que se descubrieron los genes Cas. Fonfaraet al.,también proporciona secuencias PAM para los polipéptidos Cas9 de varias especies (véase también SEQ ID NO: 1-37).

II. COMPOSICIONES Y MÉTODOS DE LA DIVULGACIÓN

En el presente documento se describen células, métodosex vivoein vivopara utilizar herramientas de ingeniería genómica para crear cambios permanentes en el genoma mediante: 1) la deleción de la ampliación de repeticiones anormales dentro del gen FXN, mediante la inducción de dos roturas de ADN bicatenario en ambos lados de la región ampliada y el reemplazo con una secuencia corregida; 2) la deleción de la ampliación de repeticiones anormales dentro del gen FXN, mediante la inducción de una rotura de ADN bicatenario proximal a la región ampliada y el reemplazo con una secuencia corregida; 3) la deleción o mutación del gen FXN mediante la inducción de una o más inserciones o deleciones dentro o cerca del gen FXN u otras secuencias de ADN que codifican elementos reguladores del gen FXN; o 4) la deleción del gen FXN mutado y la inserción de un gen FXN de tipo natural, un ADNc o un minigén (compuesto por uno o más exones e intrones, o intrones naturales o sintéticos) en el locus del gen FXN o en un locus de puerto seguro. Estos métodos utilizan endonucleasas, tales como las nucleasas asociadas a CRISPR (Cas9, Cpf1 y similares), para reescribir permanentemente dentro o cerca del locus genómico del gen FXN u otras secuencias de ADN que codifican elementos reguladores del gen FXN. De esta forma, los ejemplos expuestos en la presente divulgación pueden ayudar a restablecer la secuencia intrónica de FXN de tipo natural o similar, o a reducir o eliminar la expresión de, el gen FXN con tan solo un tratamiento (en lugar de ofrecer varias posibles terapias durante toda la vida del paciente).

Polipéptidos dirigidos al sitio (endonucleasas, enzimas)

Un polipéptido dirigido al sitio es una nucleasa utilizada en la reescritura genómica para escindir el ADN. El polipéptido dirigido al sitio se puede administrar a una célula o a un paciente como: uno o más polipéptidos, o uno o más ARNm que codifican el polipéptido. Cualquiera de las enzimas u ortólogos enumerados en las SEQ ID NO: 1-620, o divulgados en el presente documento, pueden utilizarse en los métodos descritos en el presente documento.

En el contexto de un sistema CRISPR/Cas9 o CRISPR/Cpf1, el polipéptido dirigido al sitio puede unirse a un ARN guía que, a su vez, especifica el sitio en el ADN diana al que se dirige el polipéptido. En los sistemas CRISPR/Cas9 o CRISPR/Cpf1 divulgados en el presente documento, el polipéptido dirigido al sitio puede ser una endonucleasa, tal como una endonucleasa de ADN.

Un polipéptido dirigido al sitio puede comprender una pluralidad de dominios de escisión de ácidos nucleicos (es decir, nucleasas). Dos o más dominios de escisión de ácidos nucleicos se pueden unir entre sí a través de un conector. Por ejemplo, el conector puede comprender un conector flexible. Los conectores pueden comprender 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40 o más aminoácidos de longitud.

Las enzimas Cas9 de tipo natural que se encuentran de forma natural comprenden dos dominios de nucleasa, un dominio de nucleasa<h>N<h>y un dominio RuvC. En el presente documento, el término "Cas9" se refiere tanto a una Cas9 natural como a una recombinante. Las enzimas Cas9 contempladas en el presente documento pueden comprender un dominio de nucleasa HNH o similar a HNH, y/o un dominio de nucleasa RuvC o similar a RuvC.

Los dominios HNH o similares a HNH comprenden un pliegue similar a McrA. Los dominios HNH o similares a HNH comprenden dos cadenas p antiparalelas y una hélice a. Los dominios HNH o similares a HNH comprenden un sitio de unión de metal (p. ej., un sitio de unión de catión divalente). Los dominios HNH o similares a HNH pueden escindir una cadena de un ácido nucleico diana (p. ej., la cadena complementaria de la cadena de ARNcr diana).

Los dominios RuvC o similares a RuvC comprenden un pliegue de ribonucleasa H o similar a ribonucleasa H. Los dominios RuvC/ribonucleasa H participan en un conjunto diverso de funciones basadas en ácidos nucleicos, incluida la acción sobre ARN y ADN. El dominio ribonucleasa H comprende 5 cadenas p rodeadas por una pluralidad de hélices a. Los dominios RuvC/ribonucleasa H o similares a RuvC/ribonucleasa H comprenden un sitio de unión de metal (p. ej., un sitio de unión de catión divalente). Los dominios RuvC/ribonucleasa H o similares a RuvC/ribonucleasa H pueden escindir una cadena de un ácido nucleico diana (p. ej., la cadena no complementaria de un ADN bicatenario diana).

Los polipéptidos dirigidos al sitio pueden introducir roturas bicatenarias o monocatenarias en los ácidos nucleicos, p. ej., ADN genómico. La rotura bicatenaria puede estimular las vías de reparación del ADN endógeno de una célula (p. ej., reparación dependiente de homología (HDR), unión de extremos no homólogos alternativos (A-NHEJ) o unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ)). La NHEJ puede reparar el ácido nucleico diana escindido sin la necesidad de una plantilla homóloga. A veces, esto puede dar lugar a pequeñas deleciones o inserciones (indels) en el ácido nucleico diana en el sitio de escisión, y puede provocar la interrupción o alteración de la expresión genética. La HDR puede ocurrir cuando una plantilla de reparación homóloga, o donante, esté disponible. La plantilla donante homóloga puede comprender secuencias que son homólogas a las secuencias que flanquean el sitio de escisión del ácido nucleico diana. La cromátida hermana puede ser utilizada por la célula como plantilla de reparación. Sin embargo, a los efectos de la reescritura genómica, la plantilla de reparación se puede suministrar como un ácido nucleico exógeno, tal como un plásmido, oligonucleótido dúplex, oligonucleótido monocatenario o ácido nucleico vírico. Con plantillas donantes exógenas, se puede introducir una secuencia de ácido nucleico adicional (tal como un transgén) o una modificación (como un cambio de base simple o múltiple o una deleción) entre las regiones flanqueantes de homología, de modo que la secuencia de ácido nucleico adicional o alterada también se incorpore al locus diana. La MMEJ puede producir un resultado genético similar a la NHEJ en el que pueden producirse pequeñas deleciones e inserciones en el sitio de escisión. La MMEJ puede hacer uso de secuencias homólogas de unos cuantos pares de bases que flanquean el sitio de escisión para impulsar un resultado de reparación del ADN por unión de extremos favorecido. En algunos casos, es posible predecir los posibles resultados de la reparación basándose en el análisis de posibles microhomologías en las regiones diana de la nucleasa.

Por tanto, en algunos casos, se puede utilizar la recombinación homóloga para insertar una secuencia de polinucleótidos exógena en el sitio de escisión del ácido nucleico diana. En el presente documento, una secuencia de polinucleótidos exógena se denomina "polinucleótido donante" (o donante o secuencia donante). Se puede insertar el polinucleótido donante, una parte del polinucleótido donante, una copia del polinucleótido donante o una parte de una copia del polinucleótido donante en el sitio de escisión del ácido nucleico diana. El polinucleótido donante puede ser una secuencia de polinucleótidos exógena, es decir, una secuencia que no se encuentra de forma natural en el sitio de escisión del ácido nucleico diana.

Las modificaciones del ADN diana debidas a NHEJ y/o HDR pueden conducir a, por ejemplo, mutaciones, deleciones, alteraciones, integraciones, corrección de genes, reemplazo de genes, etiquetado genético, inserción de transgenes, deleción de nucleótidos, alteración genética, translocaciones y/o mutaciones genéticas. Los procesos de deleción de ADN genómico e integración de ácido nucleico no nativo en el ADN genómico son ejemplos de reescritura genómica.

El polipéptido dirigido al sitio puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 99 % o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un polipéptido dirigido al sitio ilustrativo de tipo natural [p. ej., Cas9 de S.pyogenes,documento US2014/0068797 ID de Secuencia N.° 8 o Sapranauskaset al., Nucleic Acids Res,39(21): 9275-9282 (2011)] y otros polipéptidos diferentes dirigidos al sitio. El polipéptido dirigido al sitio puede comprender al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 o 100 % de identidad con un polipéptido dirigido al sitio natural (p. ej., Cas9 de S.pyogenes,citada anteriormente) sobre 10 aminoácidos contiguos. El polipéptido dirigido al sitio puede comprender como máximo: un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 o 100 % de identidad con un polipéptido dirigido al sitio natural (p. ej., Cas9 de S. pyogenes, citada anteriormente) sobre 10 aminoácidos contiguos. El polipéptido dirigido al sitio puede comprender al menos: un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 o 100 % de identidad con un polipéptido dirigido al sitio natural (p. ej., Cas9 de S. pyogenes, citada anteriormente) sobre 10 aminoácidos contiguos en un dominio de nucleasa HNH del polipéptido dirigido al sitio. El polipéptido dirigido al sitio puede comprender como máximo: un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 o 100 % de identidad con un polipéptido dirigido al sitio natural (p. ej., Cas9 de S. pyogenes, citada anteriormente) sobre 10 aminoácidos contiguos en un dominio de nucleasa HNH del polipéptido dirigido al sitio. El polipéptido dirigido al sitio puede comprender al menos: un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 o 100 % de identidad con un polipéptido dirigido al sitio natural (p. ej., Cas9 de S. pyogenes, citada anteriormente) sobre 10 aminoácidos contiguos en un dominio de nucleasa RuvC del polipéptido dirigido al sitio. El polipéptido dirigido al sitio puede comprender como máximo: un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 o 100 % de identidad con un polipéptido dirigido al sitio natural (p. ej., Cas9 de S. pyogenes, citada anteriormente) sobre 10 aminoácidos contiguos en un dominio de nucleasa RuvC del polipéptido dirigido al sitio.

El polipéptido dirigido al sitio puede comprender una forma modificada de un polipéptido dirigido al sitio ilustrativo de tipo natural. La forma modificada del polipéptido dirigido al sitio ilustrativo de tipo natural puede comprender una mutación que reduzca la actividad de escisión de ácidos nucleicos del polipéptido dirigido al sitio. La forma modificada del polipéptido dirigido al sitio ilustrativo de tipo natural puede tener menos de un 90 %, menos de un 80 %, menos de un 70 %, menos de un 60 %, menos de un 50 %, menos de un 40 %, menos de un 30 %, menos de un 20 %, menos de un 10 %, menos de un 5 % o menos de un 1 % de la actividad de escisión de ácidos nucleicos del polipéptido dirigido al sitio ilustrativo de tipo natural (p. ej., Cas9 de S.pyogenescitado anteriormente). La forma modificada del polipéptido dirigido al sitio puede no tener actividad sustancial de escisión de ácidos nucleicos. Cuando un polipéptido dirigido al sitio es una forma modificada que no tiene una actividad sustancial de escisión de ácidos nucleicos, recibe el nombre de "enzimáticamente inactiva", en el presente documento.

La forma modificada del polipéptido dirigido al sitio puede comprender una mutación que pueda inducir una rotura monocatenaria (RMC) en un ácido nucleico diana (p. ej., cortando solo una de las cadenas principales de azúcarfosfato de un ácido nucleico diana bicatenario). En algunos aspectos, la mutación puede dar como resultado menos de un 90 %, menos de un 80 %, menos de un 70 %, menos de un 60 %, menos de un 50 %, menos de un 40 %, menos de un 30 %, menos de un 20 %, menos de un 10 %, menos de un 5 % o menos de un 1 % de la actividad de escisión de ácidos nucleicos en uno o más de la pluralidad de dominios de escisión de ácidos nucleicos del polipéptido dirigido al sitio de tipo natural (p. ej., Cas9 de S.pyogenes,citado anteriormente). En algunos aspectos, la mutación puede dar lugar a que uno o más de la pluralidad de dominios de corte de ácido nucleico conserven la capacidad de escindir la cadena complementaria del ácido nucleico diana, pero reduciendo su capacidad para escindir la cadena no complementaria del ácido nucleico diana. La mutación puede dar lugar a que uno o más de la pluralidad de dominios de corte del ácido nucleico conserven la capacidad de escindir la cadena no complementaria del ácido nucleico diana, pero reduciendo su capacidad para escindir la cadena complementaria del ácido nucleico diana. Por ejemplo, los restos del polipéptido Cas9 de S.pyogenesilustrativo de tipo natural, tales como Asp10, His840, Asn854 y Asn856, se mutan para inactivar uno o más de la pluralidad de dominios de escisión de ácidos nucleicos (p. ej., dominios de nucleasa). Los residuos que se van a mutar pueden corresponder a los restos Asp10, His840, Asn854 y Asn856 del polipéptido Cas9 de S.pyogenesilustrativo de tipo natural (p. ej., según lo determinado por la secuencia y/o alineación estructural). Los ejemplos no limitativos de mutaciones incluyen D10A, H840A, N854A o N856A. Un experto en la materia reconocerá que pueden ser adecuadas mutaciones distintas de las sustituciones de alanina.

En algunos aspectos, una mutación D10A se puede combinar con una o más mutaciones H840A, N854A o N856A para producir un polipéptido dirigido al sitio que carezca sustancialmente de actividad de escisión del ADN. Una mutación H840A se puede combinar con una o más mutaciones D10A, N854A o N856A para producir un polipéptido dirigido al sitio que carezca sustancialmente de actividad de escisión del ADN. Una mutación N854A se puede combinar con una o más mutaciones H840A, D10A o N856A para producir un polipéptido dirigido al sitio que carezca sustancialmente de actividad de escisión del ADN. Una mutación N856A se puede combinar con una o más mutaciones H840A, N854A o D10A para producir un polipéptido dirigido al sitio que carezca sustancialmente de actividad de escisión del ADN. Los polipéptidos dirigidos al sitio que comprenden un dominio de nucleasa sustancialmente inactivo se denominan "nicasas".

Las variantes de nicasas de endonucleasas guiadas por ARN, por ejemplo, Cas9, se pueden utilizar para aumentar la especificidad de la reescritura genómica mediada por CRISPR. El Cas9 de tipo natural normalmente está guiado por un único ARN guía diseñado para hibridarse con una secuencia específica de ~20 nucleótidos en la secuencia diana (como un locus genómico endógeno). Sin embargo, se pueden tolerar varios desajustes entre el ARN guía y el locus diana, reduciendo eficazmente la longitud de homología requerida en el sitio diana, por ejemplo, tan solo 13 nt de homología, y por lo tanto resulta en un potencial elevado de unión y escisión de ácido nucleico bicatenario, por el complejo, CRISPR/Cas9 en otras partes del genoma diana, también conocido como escisión inespecífica. Debido a que las variantes de nicasa de Cas9 solo cortan una cadena cada una, para crear una rotura bicatenaria es necesario que un par de nicasas se unan en estrecha proximidad y en cadenas opuestas del ácido nucleico diana, creando así un par de muescas, lo que equivale a una rotura bicatenaria. Esto requiere que dos ARN guía separados (uno para cada nicasa) se unan en estrecha proximidad y en cadenas opuestas del ácido nucleico diana. Este requisito esencialmente duplica la longitud mínima de homología necesaria para que se produzca la rotura bicatenaria, reduciendo así la probabilidad de que ocurra un evento de escisión bicatenaria en otra parte del genoma, donde es poco probable que los dos sitios guía del ARN (si existen) estén lo suficientemente cerca entre sí para permitir que se forme la rotura bicatenaria. Como se describe en la técnica, las nicasas también se pueden utilizar para potenciar la HDR frente a la NHEJ. La HDR se puede utilizar para introducir cambios seleccionados en sitios diana del genoma mediante el uso de secuencias donantes específicas que median eficazmente los cambios deseados.

Las mutaciones contempladas pueden incluir sustituciones, adiciones y deleciones, o cualquier combinación de las mismas. La mutación convierte el aminoácido mutado en alanina. La mutación convierte el aminoácido mutado en otro aminoácido (p. ej., glicina, serina, treonina, cisteína, valina, leucina, isoleucina, metionina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptófano, ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina, histidina, lisina o arginina). La mutación convierte el aminoácido mutado en un aminoácido no natural (p. ej., selenometionina). La mutación convierte el aminoácido mutado en miméticos de aminoácidos (p. ej., fosfomiméticos). La mutación puede ser una mutación conservadora. Por ejemplo, la mutación convierte el aminoácido mutado en aminoácidos que se asemejan al tamaño, la forma, carga, polaridad, conformación y/o rotámeros de los aminoácidos mutados (p. ej., mutación cisteína/serina, mutación lisina/asparagina, mutación histidina/fenilalanina). La mutación puede provocar un cambio en el marco de lectura y/o la creación de un codón de parada prematuro. Las mutaciones pueden provocar cambios en las regiones reguladoras de genes o locus que influyen en la expresión de uno o más genes.

El polipéptido dirigido al sitio (p. ej., variante, polipéptido mutado, enzimáticamente inactivo y/o condicionalmente enzimáticamente inactivo dirigido al sitio) puede dirigirse al ácido nucleico. El polipéptido dirigido al sitio (p. ej., variante, endorribonucleasa mutada, enzimáticamente inactiva y/o condicionalmente inactiva) puede dirigirse al ADN. El polipéptido dirigido al sitio (p. ej., variante, endorribonucleasa mutada, enzimáticamente inactiva y/o condicionalmente inactiva) puede dirigirse al A<r>N.

El polipéptido dirigido al sitio puede comprender una o más secuencias no nativas (p. ej., el polipéptido dirigido al sitio es una proteína de fusión).

El polipéptido dirigido al sitio puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprenda al menos un 15 % de identidad de aminoácidos con una Cas9 de una bacteria (por ejemplo, S.pyogenes),un dominio de unión de ácido nucleico y dos dominios de escisión de ácido nucleico (es decir, un dominio HNH y un dominio RuvC).

El polipéptido dirigido al sitio puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprenda al menos un 15 % de identidad de aminoácidos con una Cas9 de una bacteria (p. ej., S.pyogenes),y dos dominios de escisión de ácidos nucleicos (es decir, un dominio HNH y un dominio RuvC).

El polipéptido dirigido al sitio puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprenda al menos un 15 % de identidad de aminoácidos con una Cas9 de una bacteria (p. ej., S.pyogenes),y dos dominios de escisión de ácidos nucleicos, en donde uno o ambos dominios de escisión de ácidos nucleicos comprenden al menos un 50 % de identidad de aminoácidos con un dominio de nucleasa de Cas9 de una bacteria (p. ej., S.pyogenes).

El polipéptido dirigido al sitio puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprenda al menos un 15 % de identidad de aminoácidos con una Cas9 de una bacteria (p. ej., S.pyogenes),dos dominios de escisión de ácidos nucleicos (es decir, un dominio HNH y un dominio RuvC) y una secuencia no nativa (por ejemplo, una señal de localización nuclear) o un conector que une el polipéptido dirigido al sitio a una secuencia no nativa.

El polipéptido dirigido al sitio puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprenda al menos un 15 % de identidad de aminoácidos con una Cas9 de una bacteria (p. ej., S.pyogenes),dos dominios de escisión de ácidos nucleicos (es decir, un dominio HNH y un dominio RuvC), en donde el polipéptido dirigido al sitio comprende una mutación en uno o ambos dominios de escisión de ácidos nucleicos que reduce la actividad de escisión de los dominios de nucleasa en al menos un 50 %.

El polipéptido dirigido al sitio puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 15 % de identidad de aminoácidos con una Cas9 de una bacteria (p. ej., S.pyogenes),y dos dominios de escisión de ácidos nucleicos (es decir, un dominio HNH y un dominio RuvC), en donde uno de los dominios de nucleasa comprende una mutación del ácido aspártico 10, y/o en donde uno de los dominios de nucleasa puede comprender una mutación de histidina 840, y en donde la mutación reduce la actividad de escisión del o los dominios de nucleasa en al menos un 50 %.

El uno o más polipéptidos dirigidos al sitio, p. ej., endonucleasas de ADN, pueden comprender dos nicasas que efectúan conjuntamente una rotura bicatenaria en un locus específico del genoma, o cuatro nicasas que efectúan o causan conjuntamente dos roturas bicatenarias en locus específicos del genoma. Como alternativa, un polipéptido dirigido al sitio, p. ej., la endonucleasa del ADN, puede efectuar o causar una rotura bicatenaria en un locus específico del genoma.

Los ejemplos no limitativos de ortólogos de Cas9 de otras cepas bacterianas incluyen, sin limitación, proteínas Cas identificadas enAcaryochloris marinaMBIC11017;Acetohalobium arabaticumDSM 5501;Addithiobadllus caldits; Addithiobadllus ferrooxidansATCC 23270;Alicydobacillus acidocaldariusLAA1;Alicydobacillus acidocaldarius subsp. acidocaldariusDSM 446;Allochromatium vinosumDSM 180;Ammonifex degensiiKC4;Anabaena variabilisATCC 29413;Arthrospira maximaCS-328;Arthrospira platensiscepaParaca; Arthrospira sp.PCC 8005;Bacillus pseudomycoidesDSM 12442;Bacillus selenitireducensMLS10;Burkholderiales bacterium1147;Caldicelulosiruptor becsciiDSM 6725;Candidatus Desulforudis audaxviatorMP104C;Caldicellulosiruptor hydrothermalis_108; Clostridium phagec-st;Clostridium botulinum A3cepaLoch Maree; Clostridium botulinumBa4 cepa 657;Clostridium difficileQCD-63q42;Crocosphaera watsoniiWH 8501;Cyanothece sp.ATCC 51142;Cyanothece sp.CCY0110;Cyanothece sp.PCC 7424;Cyanothece sp.PCC 7822;Exiguobacterium sibiricum255-15;Finegoldia magnaATCC 29328;Ktedonobacter racemiferDSM 44963;Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusPB2003/044-T3-4;Lactobacillus salivariusATCC 11741;Listeria innocua, Lyngbya sp.PCC 8106;Marinobacter sp.ELB17;Methanohalobium evestigatumZ-7303;Microcystis phageMa-LMMOl;Microcystis aeruginosaNIES-843;Microscilla marinaATCC 23134;Microcoleus chthonoplastesPCC 7420;Neisseria meningitidis; Nitrosococcus halophilusNc4;Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvilleiDSM 43111;Nodularia spumigenaCCY9414;Nostoc sp.PCC 7120;Oscilatoria sp.PCC 6506;Pelotomaculum_thermopropionicum_SI; Petrotoga mobilisSJ95;Polaromonas naphthalenivoransCJ2;Polaromonas sp.JS666;Pseudoalteromonas haloplanktisTAC125;Streptomyces pristinaespiralisATCC 25486;Streptomyces pristinaespiralisATCC 25486;Streptococcus thermophilus; Streptomyces viridochromogenesDSM 40736;Streptosporangium roseumDSM 43021;Synechococcus sp.PCC 7335; yThermosipho africanusTCF52B (Chylinskiet al., RNA Biol.,2013; 10(5): 726-737).

Además de los ortólogos de Cas9, otras variantes de Cas9, tales como las proteínas de fusión de dCas9 inactiva y los dominios efectores con diferentes funciones, pueden servir como plataforma para la modulación genética. Cualquiera de las enzimas anteriores puede ser útil en la presente divulgación.

Se proporcionan más ejemplos de endonucleasas que pueden utilizarse en la presente divulgación en las SEQ ID NO: 1-620. Estas proteínas pueden modificarse antes de su uso o pueden codificarse en una secuencia de ácido nucleico tal como un ADN, ARN o ARNm o dentro de una construcción vectorial tal como los plásmidos o vectores de AAV que se enseñan en el presente documento. Además, pueden tener optimización de codones.

Las SEQ ID NO: 1-620 divulgan una lista no exhaustiva de secuencias de endonucleasas.

Ácido nucleico dirigido al genoma

La presente divulgación proporciona un ácido nucleico dirigido al genoma que puede dirigir las actividades de un polipéptido asociado (p. ej., un polipéptido dirigido al sitio) a una secuencia específica de la diana dentro de un ácido nucleico diana. El ácido nucleico diana puede ser un ARN. En el presente documento, un ARN dirigido al genoma se denomina "ARN guía" o "ARNg". Un ARN guía puede comprender al menos una secuencia espaciadora que se hibrida con una secuencia de ácido nucleico diana de interés y una secuencia repetida CRISPR. En los sistemas de tipo II, el ARNg también comprende un segundo ARN denominado secuencia de ARNtracr. En el ARN guía (ARNg) de tipo II, la secuencia repetida CRISPR y la secuencia de ARNtracr se hibridan entre sí para formar un dúplex. En el ARN guía (ARNg) de tipo V, el ARNcr forma un dúplex. En ambos sistemas, el dúplex puede unirse a un polipéptido dirigido al sitio, de manera que el ARN guía y el polipéptido dirigido al sitio forman un complejo. El ácido nucleico dirigido al genoma puede proporcionar especificidad hacia el complejo en virtud de su asociación con el polipéptido dirigido al sitio. De esta forma, el ácido nucleico dirigido al genoma puede dirigir la actividad del polipéptido dirigido al sitio.

Los ARN guía ilustrativos incluyen las secuencias espaciadoras de las SEQ ID NO: 5305-37514 y 37549 del listado de secuencias. Como saben los expertos familiarizados con la materia, cada ARN guía puede diseñarse para incluir una secuencia espaciadora complementaria a su secuencia genómica diana. Por ejemplo, cada una de las secuencias espaciadoras de SEQ ID NO: 5305-37514 y 37549 del listado de secuencias se pueden colocar en una única quimera de ARN o en un ARNcr (junto con un ARNtracr correspondiente). Véase Jineket al.,Science, 337, 816-821 (2012) y Deltchevaet al.,Nature 471 602-607 (2011) Los ARN guía de la invención son aquellos definidos en las reivindicaciones.

El ácido nucleico dirigido al genoma puede ser un ARN guía de doble molécula. El ácido nucleico dirigido al genoma puede ser un ARN guía de una sola molécula.

Un ARN guía de doble molécula puede comprender dos cadenas de ARN. La primera cadena comprende, en la dirección 5' a 3', una secuencia de ampliación espaciadora opcional, una secuencia espaciadora y una secuencia mínima de repetición CRISPR. La segunda cadena puede comprender una secuencia mínima de ARNtracr (complementaria a la secuencia mínima de repetición CRISPR), una secuencia de ARNtracr 3' y una secuencia de ampliación de ARNtracr opcional.

Un ARN guía de una sola molécula (ARNgu) en un sistema de tipo II puede comprender, en la dirección 5' a 3', una secuencia de ampliación espaciadora opcional, una secuencia espaciadora, una secuencia mínima de repetición CRISPR, un conector guía de una sola molécula, una secuencia mínima de ARNtracr, una secuencia de ARNtracr 3' y una secuencia de ampliación de ARNtracr opcional. La ampliación de ARNtracr opcional puede comprender elementos que aporten funcionalidad adicional (p. ej., estabilidad) al ARN guía. El conector guía de una sola molécula puede unir la repetición CRISPR mínima y la secuencia mínima de ARNtracr para formar una estructura en horquilla. La ampliación de ARNtracr opcional puede comprender una o más horquillas.

El ARNgu puede comprender una secuencia espaciadora de 20 nucleótidos en el extremo 5' de la secuencia de ARNgu. El ARNgu puede comprender una secuencia espaciadora de menos de 20 nucleótidos en el extremo 5' de la secuencia de ARNgu. El ARNgu puede comprender una secuencia espaciadora de más de 20 nucleótidos en el extremo 5' de la secuencia de ARNgu. El ARNgu puede comprender una secuencia espaciadora de longitud variable con 17-30 nucleótidos en el extremo 5' de la secuencia del ARNgu (véase la Tabla 1).

El ARNgu puede no contener uracilo en el extremo 3' de la secuencia del ARNgu, tal como en SEQ ID NO: 37547 de la Tabla 1. El ARNgu puede comprender uno o más uracilos en el extremo 3' de la secuencia del ARNgu, tal como en SEQ ID NO: 37548 en la Tabla 1. Por ejemplo, el ARNgu puede comprender 1 uracilo (U) en el extremo 3' de la secuencia del ARNgu. El ARNgu puede comprender 2 uracilos (UU) en el extremo 3' de la secuencia del ARNgu. El ARNgu puede comprender 3 uracilos (UUU) en el extremo 3' de la secuencia del ARNgu. El ARNgu puede comprender 4 uracilos (UUUU) en el extremo 3' de la secuencia del ARNgu. El ARNgu puede comprender 5 uracilos (UUUUU) en el extremo 3' de la secuencia del ARNgu. El ARNgu puede comprender 6 uracilos (UUUUUU) en el extremo 3' de la secuencia del ARNgu. El ARNgu puede comprender 7 uracilos (UUUUUU) en el extremo 3' de la secuencia de ARNgu. El ARNgu puede comprender 8 uracilos (UUUUUUUU) en el extremo 3' de la secuencia de ARNgu.

El ARNgu puede no estar modificado o estar modificado. Por ejemplo, los ARNgu modificados pueden comprender uno o más nucleótidos de 2'-O-metil-fosforotioato.

Tabla 1

Un ARN guía de una sola molécula (ARNgu) en un sistema de tipo V puede comprender, en la dirección 5' a 3', una secuencia mínima de repetición CRISPR y una secuencia espadadora.

A modo ilustrativo, los ARN guía utilizados en el sistema CRISPR/Cas9 o CRISPR/Cpf1, u otros ARN más pequeños, se pueden sintetizar fácilmente por medios químicos, como se ilustra a continuación y se describe en la técnica. Si bien los procedimientos de síntesis química se encuentran en continua expansión, la purificación de dichos ARN mediante procedimientos tales como la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC, que evita el uso de geles tales como PAGE) tiende a volverse más complicada a medida que las longitudes de los polinucleótidos aumentan significativamente más allá de un centenar de nucleótidos. Un enfoque utilizado para generar ARN de mayor longitud es producir dos o más moléculas ligadas entre sí. Los ARN mucho más largos, tales como los que codifican una endonucleasa Cas9 o Cpf1, se generan más fácilmente enzimáticamente. Se pueden introducir varios tipos de modificaciones del ARN durante o después de la síntesis química y/o la generación enzimática de ARN, p. ej., modificaciones que mejoran la estabilidad, reducen la probabilidad o el grado de respuesta inmunitaria innata y/o mejoran otros atributos, como se describe en la técnica.

Secuencia de ampliación espadadora

En algunos ejemplos de ácidos nucleicos dirigidos al genoma, una secuencia de ampliación espaciadora puede modificar la actividad, proporcionar estabilidad y/o proporcionar una ubicación para modificaciones de un ácido nucleico dirigido al genoma. Una secuencia de ampliación espaciadora puede modificar la actividad o especificidad tanto específica como inespecífica. En algunos ejemplos, se puede proporcionar una secuencia de ampliación espaciadora. La secuencia de ampliación espaciadora puede tener una longitud de más de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000 o 7000, o más nucleótidos. La secuencia de ampliación espaciadora puede tener una longitud de menos de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000 o más nucleótidos. La secuencia de ampliación espaciadora puede ser de menos de 10 nucleótidos de longitud. La secuencia de ampliación espaciadora puede tener una longitud de entre 10 y 30 nucleótidos. La secuencia de ampliación espaciadora puede tener una longitud de entre 30 y 70 nucleótidos.

La secuencia de ampliación espaciadora puede comprender otra fracción (p. ej., una secuencia de control de estabilidad, una secuencia de unión a endoribonucleasa, o una ribozima). La fracción puede disminuir o aumentar la estabilidad de un ácido nucleico dirigido a un ácido nucleico. La fracción puede ser un segmento terminador de la transcripción (es decir, una secuencia de terminación de la transcripción). La fracción puede actuar en una célula eucariota. La fracción puede actuar en una célula procariota. La fracción puede actuar en células tanto eucariotas como procariotas. Entre los ejemplos no limitativos de fracciones adecuadas se incluye: una caperuza 5' (p. ej., una caperuza de 7-metilguanilato (m7 G)), una secuencia de ribointerruptor (p. ej., para permitir la estabilidad regulada y/o la accesibilidad regulada por proteínas y complejos de proteínas), una secuencia que forma un dúplex de ARNbc (es decir, una horquilla), una secuencia que dirige el ARN a una ubicación subcelular (p. ej., al núcleo, a las mitocondrias, a los cloroplastos y similar), una modificación o secuencia que proporciona seguimiento (p. ej., conjugación directa con una molécula fluorescente, conjugación con una fracción que facilita la detección fluorescente, una secuencia que permite la detección fluorescente, etc.) y/o una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas (p. ej., proteínas que actúan sobre el ADN, incluyendo activadores transcripcionales, represores transcripcionales, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona desacetilasas y similares).

Secuencia espaciadora

La secuencia espadadora se híbrida con una secuencia en un ácido nucleico diana de interés. El espaciador de un ácido nucleico dirigido al genoma puede interactuar con un ácido nucleico diana de una forma específica para la secuencia mediante hibridación (es decir, emparejamiento de bases). La secuencia de nucleótidos del espaciador puede variar dependiendo de la secuencia del ácido nucleico diana de interés.

En el sistema CRISPR/Cas que se describe en el presente documento, la secuencia espaciadora puede diseñarse para hibridarse con un ácido nucleico diana situado a 5' de una PAM de la enzima Cas9 utilizada en el sistema. El espaciador puede coincidir perfectamente con la secuencia diana o puede tener emparejamientos erróneos. Cada enzima Cas9 tiene una secuencia PAM particular que realiza el reconocimiento en un ADN diana. Por ejemplo, S.pyogenesrealiza el reconocimiento en un ácido nucleico diana de un PAM que comprende la secuencia 5'-NRG-3', donde R comprende A o G, donde N es cualquier nucleótido y N está inmediatamente 3' de la secuencia de un ácido nucleico diana dirigida por la secuencia espaciadora.

La secuencia de ácido nucleico diana puede comprender 20 nucleótidos. El ácido nucleico diana puede comprender menos de 20 nucleótidos. El ácido nucleico diana puede comprender más de 20 nucleótidos. El ácido nucleico diana puede comprender al menos: 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 30 o más nucleótidos. El ácido nucleico diana puede comprender como máximo: 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 o más nucleótidos. La secuencia de ácido nucleico diana puede comprender 20 bases inmediatamente 5' del primer nucleótido del PAM. Por ejemplo, en una secuencia que comprende 5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3' (SEQ ID NO: 37545), el ácido nucleico diana puede comprender la secuencia que corresponde a los N, donde N es cualquier nucleótido y la secuencia NRG subrayada es la PAM deS. pyogenes. Esta secuencia de ácido nucleico diana suele denominarse cadena PAM, y la secuencia de ácido nucleico complementaria suele denominarse cadena no PAM. Un experto en la materia reconocería que la secuencia espaciadora se hibrida con la cadena no PAM del ácido nucleico diana (figuras 1A y 1B).

La secuencia espaciadora que se hibrida con el ácido nucleico diana puede tener una longitud de al menos unos 6 nucleótidos (nt). La secuencia espaciadora puede tener al menos aproximadamente 6 nt, al menos aproximadamente 10 nt, al menos aproximadamente 15 nt, al menos aproximadamente 18 nt, al menos aproximadamente 19 nt, al menos aproximadamente 20 nt, al menos aproximadamente 25 nt, al menos aproximadamente 30 nt, al menos aproximadamente 35 nt o al menos aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 19 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 19 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 50 nt o de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 60 nt. En algunos ejemplos, la secuencia espaciadora puede comprender 20 nucleótidos. En algunos ejemplos, el espaciador puede comprender 19 nucleótidos. En algunos ejemplos, el espaciador puede comprender 18 nucleótidos. En algunos ejemplos, el espaciador puede comprender 22 nucleótidos.

En algunos ejemplos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia espaciadora y el ácido nucleico diana es de al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente 99% o 100%. En algunos ejemplos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia espaciadora y el ácido nucleico diana es como máximo de aproximadamente 30 %, como máximo de aproximadamente 40 %, como máximo de aproximadamente 50 %, como máximo de aproximadamente 60 %, como máximo de aproximadamente 65 %, como máximo de aproximadamente 70 %, como máximo de aproximadamente 75 %, como máximo de aproximadamente 80 %, como máximo de aproximadamente 85 %, como máximo de aproximadamente 90 %, como máximo de aproximadamente 95 %, como máximo de aproximadamente 97 %, como máximo de aproximadamente 98 %, como máximo de aproximadamente 99 % o 100 %. En algunos ejemplos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia espaciadora y el ácido nucleico diana es del 100 % sobre los seis nucleótidos más contiguos 5' de la secuencia diana de la cadena complementaria del ácido nucleico diana. El porcentaje de complementariedad entre la secuencia espaciadora y el ácido nucleico diana puede ser al menos del 60 % sobre aproximadamente 20 nucleótidos contiguos. La longitud de la secuencia espaciadora y del ácido nucleico diana puede diferir ente 1 y 6 nucleótidos, lo que puede considerarse como una protuberancia o protuberancias.

La secuencia espadadora se puede diseñar o elegir mediante un programa informático. El programa informático puede utilizar variables, tales como la temperatura de fusión prevista, formación de estructura secundaria, temperatura de hibridación prevista, identidad de secuencia, contexto genómico, accesibilidad a la cromatina, % de GC, frecuencia de aparición genómica (p. ej., de secuencias que son idénticas o similares pero que varían en uno o más puntos como resultado de un emparejamiento incorrecto, inserción o deleción), estado de metilación, presencia de SNP y similares.

Secuencia mínima de repetición CRISPR

En algunos aspectos, una secuencia mínima de repetición CRISPR es una secuencia con al menos aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 95% o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de repetición CRISPR de referencia (p. ej., ARNcr de S.pyogenes).

En algunos aspectos, una secuencia mínima de repetición CRISPR comprende nucleótidos que pueden hibridarse con una secuencia mínima de ARNtracr en una célula. La secuencia mínima de repetición CRISPR y una secuencia mínima de ARNtracr pueden formar un dúplex, es decir, una estructura bicatenaria con emparejamiento de bases. Conjuntamente, la secuencia mínima de repetición CRISPR y la secuencia mínima de ARNtracr pueden unirse al polipéptido dirigido al sitio. Al menos una parte de la secuencia mínima de repetición CRISPR puede hibridarse con la secuencia mínima de ARNtracr. Al menos una parte de la secuencia mínima de repetición CRISPR puede comprender al menos aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o 100 % de complementariedad con la secuencia mínima de ARNtracr. En algunos aspectos, al menos una parte de la secuencia mínima de repetición CRISPR comprende como máximo aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o 100 % de complementariedad con la secuencia mínima de ARNtracr.

La secuencia mínima de repetición CRISPR puede tener una longitud de unos 7 nucleótidos a unos 100 nucleótidos. Por ejemplo, la longitud de la secuencia mínima de repetición CRISPR es de aproximadamente 7 nucleótidos (nt) a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 100 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 30 nt o de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 25 nt. En algunos aspectos, la secuencia mínima de repetición CRISPR tiene aproximadamente 9 nucleótidos de longitud. En algunos aspectos, la secuencia mínima de repetición CRISPR tiene aproximadamente 12 nucleótidos de longitud.

La secuencia mínima de repetición CRISPR puede ser al menos aproximadamente un 60 % idéntica a una secuencia mínima de repetición CRISPR de referencia (p. ej., ARNcr de tipo natural de S.pyogenes)en un tramo de al menos 6, 7 u 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, la secuencia mínima de repetición CRISPR puede ser al menos un 65 % idéntica, al menos aproximadamente un 70 % idéntica, al menos aproximadamente un 75 % idéntica, al menos aproximadamente un 80 % idéntica, al menos aproximadamente un 85 % idéntica, al menos aproximadamente un 90 % idéntica, al menos aproximadamente un 95 % idéntica, al menos aproximadamente un 98 % idéntica, al menos aproximadamente un 99 % idéntica o 100 % idéntica a una secuencia mínima de repetición CRISPR de referencia sobre un tramo de al menos 6, 7 u 8 nucleótidos contiguos.

Secuencia mínima de ARNtracr

Una secuencia mínima de ARNtracr puede ser una secuencia con al menos aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 95% o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de ARNtracr de referencia (p. ej., ARNtracr de tipo natural de S.pyogenes).

Una secuencia mínima de ARNtracr puede comprender nucleótidos que se hibriden con una secuencia de repetición de CRISPR mínima en una célula. Una secuencia mínima de ARNtracr y una secuencia de repetición de CRISPR mínima forman un dúplex, es decir, una estructura bicatenaria con emparejamiento de bases. Conjuntamente, la secuencia mínima de ARNtracr y la repetición mínima de CRISPR pueden unirse a un polipéptido dirigido al sitio. Al menos una parte de la secuencia mínima de ARNtracr puede hibridarse con la secuencia de repetición de CRISPR mínima. La secuencia mínima de ARNtracr puede ser al menos aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o 100 % complementaria a la secuencia de repetición de CRISPR mínima.

La secuencia mínima de ARNtracr puede tener una longitud de aproximadamente 7 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos. Por ejemplo, la secuencia mínima de ARNtracr puede tener una longitud de aproximadamente 7 nucleótidos (nt) a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 100 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 30 nt o de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 25 nt de longitud. La secuencia mínima de ARNtracr puede tener una longitud de aproximadamente 9 nucleótidos. La secuencia mínima de ARNtracr puede tener una longitud de aproximadamente 12 nucleótidos. La secuencia mínima de ARNtracr puede consistir en la ARNtracr de 23-48 nt descrita en Jineket al.,citado anteriormente.

La secuencia mínima de ARNtracr puede ser al menos aproximadamente un 60 % idéntica a una secuencia mínima de ARNtracr de referencia (p. ej., la secuencia de ARNtracr natural de S.pyogenes)sobre un tramo de al menos 6, 7 u 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, la secuencia mínima de ARNtracr puede ser al menos aproximadamente un 65 % idéntica, aproximadamente un 70 % idéntica, aproximadamente un 75 % idéntica, aproximadamente un 80 % idéntica, aproximadamente un 85 % idéntica, aproximadamente un 90 % idéntica, aproximadamente un 95 % idéntica, aproximadamente un 98 % idéntica, aproximadamente un 99 % idéntica o 100 % idéntica a una secuencia mínima de ARNtracr de referencia sobre un tramo de al menos 6, 7 u 8 nucleótidos contiguos.

El dúplex entre el ARN de CRISPR mínimo y el ARNtracr mínimo puede comprender una doble hélice. El dúplex entre el ARN de CRISPR mínimo y el ARNtracr mínimo puede comprender al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, o más nucleótidos. El dúplex entre el ARN de CRISPR mínimo y el ARNtracr mínimo puede comprender como máximo aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, o más nucleótidos.

El dúplex puede comprender un emparejamiento incorrecto (es decir, que las dos hebras del dúplex no sean 100 % complementarias). El dúplex puede comprender al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5, o emparejamientos erróneos. El dúplex puede comprender como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5, o emparejamientos erróneos. El dúplex no puede comprender más de 2 emparejamientos erróneos.

Protuberancias

En algunos casos, puede haber una "protuberancia" en el dúplex entre el ARN de CRISPR mínimo y el ARN de tracr mínimo. Una protuberancia es una región desapareada de nucleótidos dentro del dúplex. Una protuberancia puede contribuir a la unión del dúplex con el polipéptido dirigido al sitio. La protuberancia puede comprender, en un lado del dúplex, un 5-XXXY-3' no emparejado donde X es cualquier purina e Y comprende un nucleótido que puede formar un par oscilante con un nucleótido en la cadena opuesta y una región de nucleótidos no apareado en el otro lado del dúplex. El número de nucleótidos no emparejados en los dos lados del dúplex puede ser diferente.

En un ejemplo, la protuberancia puede comprender una purina no emparejada (p. ej., adenina) en la cadena mínima de repetición de CRISPR de la protuberancia. En algunos ejemplos, la protuberancia puede comprender un 5-AAGY-3' no emparejado de la cadena de secuencia mínima de ARNtracr de la protuberancia, donde Y comprende un nucleótido que puede formar un emparejamiento oscilante con un nucleótido en la cadena de repetición mínima de CRISPR.

Una protuberancia en el lado de repetición mínima de CRISPR del dúplex puede comprender al menos 1, 2, 3, 4 o 5, o más nucleótidos no emparejados. Una protuberancia en el lado de repetición mínima de CRISPR del dúplex puede comprender como máximo 1,2, 3, 4 o 5, o más nucleótidos no emparejados. Una protuberancia en el lado de repetición mínima de CRISPR del dúplex puede comprender 1 nucleótido no emparejado.

Una protuberancia en el lado de la secuencia mínima de ARNtracr del dúplex puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, o más nucleótidos no emparejados. Una protuberancia en el lado de la secuencia mínima de ARNtracr del dúplex puede comprender como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, o más nucleótidos no emparejados. Una protuberancia en un segundo lado del dúplex (p. ej., el lado de la secuencia mínima de ARNtracr del dúplex) puede comprender 4 nucleótidos no emparejados.

Una protuberancia puede comprender al menos un emparejamiento oscilante. En algunos ejemplos, una protuberancia puede comprender como máximo un emparejamiento oscilante. Una protuberancia puede comprender al menos un nucleótido de purina. Una protuberancia puede comprender al menos 3 nucleótidos de purina. Una secuencia de protuberancia puede comprender al menos 5 nucleótidos de purina. Una secuencia de protuberancia puede comprender al menos un nucleótido de guanina. En algunos ejemplos, una secuencia de protuberancia puede comprender al menos un nucleótido de adenina.

Horquillas

En diferentes ejemplos, una o más horquillas se pueden ubicar en 3' con respecto al ARNtracr mínimo en la secuencia de ARNtracr 3'.

La horquilla puede comenzar al menos aproximadamente a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20, o más nucleótidos a 3' del último nucleótido emparejado en el dúplex de secuencia mínima de repetición de CRISPR y de secuencia mínima de ARNtracr. La horquilla puede comenzar como máximo a aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, o más nucleótidos a 3' del último nucleótido emparejado en el dúplex de secuencia mínima de repetición de CRISPR y de secuencia mínima de ARNtracr.

La horquilla puede comprender como mínimo aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20, o más, nucleótidos consecutivos. La horquilla puede comprender como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o más nucleótidos consecutivos.

La horquilla puede comprender un dinucleótido CC (es decir, dos nucleótidos de citosina consecutivos).

La horquilla puede comprender nucleótidos en dúplex (p. ej., nucleótidos en una horquilla, hibridados entre sí). Por ejemplo, una horquilla puede comprender un dinucleótido CC que está hibridado con un dinucleótido GG en un dúplex de horquilla de la secuencia de ARNtracr en 3'.

Una o más de las horquillas pueden interactuar con regiones de interacción con el ARN guía de un polipéptido dirigido al sitio.

En algunos ejemplos, hay dos o más horquillas, y en otros ejemplos hay tres o más horquillas.

Secuencia de ARNtracr 3'

Una secuencia de ARNtracr 3' puede comprender una secuencia con al menos aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 95% o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de ARNtracr de referencia (p. ej., un ARNtracr de S.pyogenes).

La secuencia de ARNtracr en 3' puede tener una longitud de aproximadamente 6 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos. Por ejemplo, la secuencia de ARNtracr en 3' puede tener una longitud de aproximadamente 6 nucleótidos (nt) a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 100 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 30 nt o de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 25 nt. La secuencia ARNtracr 3' puede tener una longitud de aproximadamente 14 nucleótidos.

La secuencia de ARNtracr en 3' puede ser al menos aproximadamente un 60 % idéntica a una secuencia de ARNtracr en 3' de referencia (p. ej., secuencia de ARNtracr en 3' de tipo natural de S.pyogenes)en un tramo de al menos 6, 7 u 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, la secuencia de ARNtracr en 3' puede ser al menos aproximadamente un 60 % idéntica, aproximadamente un 65 % idéntica, aproximadamente un 70 % idéntica, aproximadamente un 75 % idéntica, aproximadamente un 80 % idéntica, aproximadamente un 85 % idéntica, aproximadamente un 90 % idéntica, aproximadamente un 95 % idéntica, aproximadamente un 98 % idéntica, aproximadamente un 99 % idéntica o un 100 % idéntica, a una secuencia de ARNtracr 3' de referencia (p. ej., secuencia de ARNtracr 3' de tipo natural de S.pyogenes)en un tramo de al menos 6, 7 u 8 nucleótidos contiguos.

La secuencia de ARNtracr 3' puede comprender más de una región dúplex (p. ej., horquilla, región hibridada). La secuencia de ARNtracr 3' puede comprender dos regiones dúplex.

La secuencia de ARNtracr 3' puede comprender una estructura de tallo y bucle. La estructura de tallo y bucle en el ARNtracr 3' puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20, o más nucleótidos. La estructura de tallo y bucle en el ARNtracr 3' puede comprender como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, o más nucleótidos. La estructura de tallo y bucle puede comprender una fracción funcional. Por ejemplo, la estructura del tallo y el bucle puede comprender un aptámero, una ribozima, una horquilla que interactúa con proteínas, una matriz de CRISPR, un intrón o un exón. La estructura de tallo y bucle puede comprender al menos aproximadamente 1,2, 3, 4 o 5, o más fracciones funcionales. La estructura de tallo y bucle puede comprender como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5, o más fracciones funcionales.

La horquilla en la secuencia de ARNtracr 3' puede comprender un dominio P. En algunos ejemplos, el dominio P puede comprender una región bicatenaria en la horquilla.

Secuencia de ampliación de ARNtracr

Se puede proporcionar una secuencia de ampliación de ARNtracr independientemente de que el ARNtracr esté en el contexto de guías de una sola molécula o de guías de molécula doble. La secuencia de ampliación de ARNtracr puede tener una longitud de aproximadamente 1 nucleótido a aproximadamente 400 nucleótidos. La secuencia de ampliación de ARNtracr puede tener una longitud de más de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380 o 400 nucleótidos. La secuencia de ampliación de ARNtracr puede tener una longitud de aproximadamente 20 a aproximadamente 5000 o más nucleótidos. La secuencia de ampliación de ARNtracr puede tener una longitud de más de 1000 nucleótidos. La secuencia de ampliación de ARNtracr puede tener una longitud de menos de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400 o más nucleótidos. La secuencia de ampliación de ARNtracr puede tener una longitud de menos de 1000 nucleótidos. La secuencia de ampliación de ARNtracr puede comprender menos de 10 nucleótidos de longitud. La secuencia de ampliación de ARNtracr puede tener una longitud de 10 a 30 nucleótidos. La secuencia de ampliación de ARNtracr puede tener una longitud de 30 a 70 nucleótidos.

La secuencia de ampliación de ARNtracr puede comprender una fracción funcional (p. ej., una secuencia de control de estabilidad, ribozima, una secuencia de unión de endoribonucleasa). La fracción funcional puede comprender un segmento terminador de la transcripción (es decir, una secuencia de terminación de la transcripción). La fracción funcional puede tener una longitud total de aproximadamente 10 nucleótidos (nt) a aproximadamente 100 nucleótidos, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 30 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 40 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 50 nt a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 60 nt a aproximadamente 70 nt, de aproximadamente 70 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 80 nt a aproximadamente 90 nt o de aproximadamente 90 nt a aproximadamente 100 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 30 nt o de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 25 nt. La fracción funcional puede actuar en una célula eucariota. La fracción funcional puede actuar en una célula procariota. La fracción funcional puede actuar en células tanto eucariotas como procariotas.

Los ejemplos no limitativos de fracciones funcionales de ampliación de ARNtracr adecuadas incluyen una cola poliadenilada 3', una secuencia de ribointerruptor (p. ej., para permitir la estabilidad regulada y/o la accesibilidad regulada por proteínas y complejos de proteínas), una secuencia que forma un dúplex de ARNbc (es decir, una horquilla), una secuencia que dirige el ARN a una ubicación subcelular (p. ej., al núcleo, a las mitocondrias, a los cloroplastos y similar), una modificación o secuencia que proporciona seguimiento (p. ej., conjugación directa con una molécula fluorescente, conjugación con una fracción que facilita la detección fluorescente, una secuencia que permite la detección fluorescente, etc.) y/o una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas (p. ej., proteínas que actúan sobre el ADN, incluyendo activadores transcripcionales, represores transcripcionales, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona desacetilasas y similares). La secuencia de ampliación de ARNtracr puede comprender un sitio de unión de cebador o un índice molecular (p. ej., secuencia de código de barras). La secuencia de ampliación de ARNtracr puede comprender uno o más marcadores de afinidad.

Secuencia conectora guía de una sola molécula

La secuencia conectora de un ácido nucleico guía de una sola molécula puede tener una longitud de aproximadamente 3 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos. En Jineket al.,citado anteriormente, por ejemplo, se utilizó una estructura simple de "tetrabucle" de 4 nucleótidos (-GAAA-), Science, 337(6096):816-821 (2012). Un conector ilustrativo tiene una longitud de aproximadamente 3 nucleótidos (nt) a aproximadamente 90 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 70 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 10 nt. Por ejemplo, el conector puede tener una longitud de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 5 nt, de aproximadamente 5 nt a aproximadamente 10 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 25 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 30 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 35 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 40 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 50 nt a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 60 nt a aproximadamente 70 nt, de aproximadamente 70 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 80 nt a aproximadamente 90 nt o de aproximadamente 90 nt a aproximadamente 100 nt. El conector de un ácido nucleico guía de una sola molécula puede tener entre 4 y 40 nucleótidos. El conector puede tener al menos aproximadamente 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500 o 7000, o más nucleótidos. El conector puede tener como máximo aproximadamente 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500 o 7000, o más nucleótidos.

Los conectores pueden comprender cualquiera de una variedad de secuencias, aunque en algunos ejemplos el conector no comprenderá secuencias que tengan regiones amplias de homología con otras porciones del ARN guía, lo que podría causar unión intramolecular que podría interferir con otras regiones funcionales de la guía. En Jineket al.,citado anteriormente, se utilizó una secuencia simple de 4 nucleótidos -GAAA-, Science, 337(6096):816-821 (2012), pero también se pueden utilizar otras numerosas secuencias, incluidas secuencias más largas.

La secuencia enlazadora puede comprender una fracción funcional. Por ejemplo, la secuencia enlazadora puede comprender una o más características, incluyendo un aptámero, una ribozima, una horquilla que interactúa con proteínas, un sitio de unión a proteínas, una matriz de CRISPR, un intrón o un exón. La secuencia enlazadora puede comprender al menos aproximadamente 1,2, 3, 4 o 5, o más fracciones funcionales. En algunos ejemplos, la secuencia enlazadora puede comprender como máximo 1,2, 3, 4 o 5, o más fracciones funcionales.

Modificaciones de ácidos nucleicos (modificaciones químicas y estructurales)

En algunos aspectos, los polinucleótidos introducidos en las células pueden comprender una o más modificaciones que pueden utilizarse individualmente o combinadas, por ejemplo, para mejorar la actividad, estabilidad o especificidad, modificar la administración, reducir las respuestas inmunitarias innatas en las células hospedadoras, o para otras mejoras, como se describe en más detalle en el presente documento y se conoce en la técnica.

En ciertos ejemplos, los polinucleótidos modificados se pueden utilizar en el sistema CRISPR/Cas9 o CRISPR/Cpf1, en cuyo caso los ARN guía (ya sean guías de una sola molécula o guías de molécula doble) y/o un ADN o un ARN que codifica una endonucleasa Cas9 o Cpf1 introducida en una célula pueden modificarse, como se describe e ilustra a continuación. Estos polinucleótidos modificados se pueden utilizar en el sistema CRISPR/Cas9 o CRISPR/Cpf1 para reescribir uno o más locus genómicos.

Utilizando el sistema CRISPR/Cas9 o CRISPR/Cpf1 con fines ilustrativos no limitativos de dichos usos, se pueden utilizar modificaciones de los ARN guía para mejorar la formación o estabilidad del complejo de reescritura genómica CRISPR/Cas9 o CRISPR/Cpf1 que comprende los ARN guía, que pueden ser guías de una sola molécula o de doble molécula, y una endonucleasa Cas9 o Cpf1. También se pueden utilizar modificaciones de los ARN guía, o como alternativa, para mejorar la iniciación, estabilidad o cinética de las interacciones entre el complejo de reescritura genómica con la secuencia diana en el genoma, que se puede utilizar, por ejemplo, para mejorar la actividad específica. También se pueden utilizar modificaciones de los ARN guía o de forma alternativa para mejorar la especificidad, p. ej., las tasas relativas de reescritura genómica en el sitio diana en comparación con los efectos en otros sitios (inespecíficos).

También se pueden utilizar modificaciones, o como alternativa, para aumentar la estabilidad de un ARN guía, p. ej., al aumentar su resistencia a la degradación por las ribonucleasas presentes en una célula, haciendo así que su semivida en la célula aumente. Las modificaciones que mejoran la semivida del ARN guía pueden ser particularmente útiles en aspectos en los que se introduce una endonucleasa Cas9 o Cpf1 en la célula para ser reescrita a través de un ARN que necesita ser traducido para generar la endonucleasa, porque el aumento de la semivida de los ARN guía introducidos al mismo tiempo que el ARN que codifica la endonucleasa se puede utilizar para aumentar el tiempo durante el cual los ARN guía y la endonucleasa Cas9 o Cpf1 codificada coexisten en la célula.

También se pueden utilizar modificaciones, o como alternativa, para disminuir la probabilidad o el grado en que los ARN introducidos en las células provocan respuestas inmunitarias innatas. Tales respuestas, que han sido bien caracterizadas en el contexto del ARN interferente (ARNi), incluidos los ARN interferentes pequeños (ARNip), como se describe más adelante en el presente documento y en la técnica, tienden a estar asociadas con una semivida reducida del ARN y/o la provocación de citocinas u otros factores asociados con las respuestas inmunitarias.

También se pueden realizar uno o más tipos de modificaciones en los ARN que codifican una endonucleasa que se introducen en una célula, incluyendo, sin limitación, modificaciones que mejoran la estabilidad del ARN (tal como aumentando su degradación por las ribonucleasas presentes en la célula), modificaciones que mejoran la traducción del producto resultante (es decir, la endonucleasa) y/o modificaciones que disminuyen la probabilidad o el grado en que los ARN introducidos en las células provocan respuestas inmunitarias innatas.

También pueden utilizarse combinaciones de modificaciones, como las anteriores y otras. En el caso de CRISPR/Cas9 o CRISPR/Cpf1, por ejemplo, se pueden realizar uno o más tipos de modificaciones para guiar los ARN (incluidos los ilustrados anteriormente), y/o se pueden realizar uno o más tipos de modificaciones en los ARN que codifican la endonucleasa Cas (incluidos los ilustrados anteriormente).

A modo ilustrativo, los ARN guía utilizados en el sistema CRISPR/Cas9 o CRISPR/Cpfl, u otros ARN más pequeños, se pueden sintetizar fácilmente por medios químicos, permitiendo que se incorporen fácilmente una serie de modificaciones, como se ilustra a continuación y se describe en la técnica. Si bien los procedimientos de síntesis química se encuentran en continua expansión, la purificación de dichos ARN mediante procedimientos tales como la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC, que evita el uso de geles tales como PAGE) tiende a volverse más complicada a medida que las longitudes de los polinucleótidos aumentan significativamente más allá de un centenar de nucleótidos. Un enfoque que puede utilizarse para generar ARN modificados químicamente de mayor longitud es producir dos o más moléculas ligadas entre sí. Los ARN mucho más largos, como los que codifican una endonucleasa Cas9, se generan más fácilmente enzimáticamente. Si bien hay menos tipos de modificaciones disponibles para su uso en los ARN producidos enzimáticamente, todavía hay modificaciones que se pueden utilizar para, p. ej., potenciar la estabilidad, reducir la probabilidad o el grado de respuesta inmunitaria innata y/o mejorar otros atributos, como se describe más adelante y en la técnica; y periódicamente se desarrollan nuevos tipos de modificaciones.

A modo de ilustración de diversos tipos de modificaciones, especialmente aquellas que se utilizan frecuentemente con ARN sintetizados químicamente más pequeños, las modificaciones pueden comprender uno o más nucleótidos modificados en la posición 2' del azúcar, en algunos aspectos, un nucleótido 2'-O-alquilo, 2'-O-alquil-O-alquilo o modificado con 2'-fluoro. En algunos ejemplos, las modificaciones del ARN incluyen modificaciones 2'-fluoro, 2'-amino o 2'-O-metil en la ribosa de las pirimidinas, restos abásicos o una base invertida en el extremo 3' del ARN. Estas modificaciones se incorporan rutinariamente a los oligonucleótidos y se ha demostrado que estos oligonucleótidos tienen una Tm más alta (es decir, una mayor afinidad de unión al objetivo) que los 2'-desoxioligonucleótidos contra una diana determinada.

Se ha demostrado que una serie de modificaciones de nucleótidos y nucleósidos hacen que el oligonucleótido en el que se incorporan sea más resistente a la digestión por nucleasas que el oligonucleótido nativo; estos oligos modificados sobreviven intactos durante un periodo de tiempo más largo que los oligonucleótidos no modificados. Los ejemplos específicos de oligonucleótidos modificados incluyen aquellos que comprenden cadenas principales modificadas, por ejemplo, fosforotioatos, fosfotriésteres, metil fosfonatos, enlaces entre los azucares de alquilo o cicloalquilo de cadena corta o enlaces entre los azúcares heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Algunos oligonucleótidos son oligonucleótidos con cadenas principales de fosforotioato y aquellos con cadenas principales de heteroátomos, en particular, cadenas principales de CH2-NH-O-CH2, CH,~N(CH<3>)~O~CH<2>(conocida como cadena principal de metilen(metilimino) o MMI), CH<2>-O-N (CHa)-CH<2>, CH<2>-N (CH<3>)-N (CHa)-CH y O-N (CHa)-CH -CH<2>, en las que el armazón fosfodiéster nativo está representado como O-P-O-CH,); cadenas principales de amida (véase De Mesmaekeret al.,Ace. Chem. Res., 28:366-374 [1995]); estructuras de cadena principal de morfolino (véase Summerton y Weller, patente de EE. UU. n.° 5.034.506); cadena principal de ácido peptidonucleico (APN) (en la que la cadena principal de fosfodiéster del oligonucleótido se reemplaza por una cadena principal de poliamina, uniéndose los nucleótidos directamente o indirectamente a los átomos de nitrógeno aza de la cadena principal de poliamina, véase Nielsenet al.,Science 1991, 254, 1497). Los enlaces que contienen fósforo incluyen, pero sin limitación, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metilo y otros alquilos que comprenden fosfonatos de 3'alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que comprenden 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos con enlace 2'-5' de estos y aquellos que tienen una polaridad invertida, en os que los pares de nucleósidos adyacentes están enlazados en 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'; véanse las patentes de EE. UU. n.° 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; y 5.625.050.

Los compuestos oligoméricos basados en morfolino se describen en Braasch y David Corey, Biochemistry, 41(14): 4503-4510 (2002); Genesis, Volumen 30, Número 3, (2001); Heasman, Dev. Biol., 243: 209-214 (2002); Naseviciuset al.,Nat. Genet., 26:216-220 (2000); Lacerraet al.,Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 9591-9596 (2000); y la patente de EE. UU. n.° 5.034.506, publicada el 23 de julio de 1991.

Los miméticos de oligonucleótidos de ácido nucleico ciclohexenilo se describen en Wanget al.,J. Am. Chem. Soc., 122: 8595-8602 (2000).

Las cadenas principales de oligonucleótidos modificados que no incluyen un átomo de fósforo entre ellas tienen cadenas principales que se forman mediante enlaces internucleósido alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosídicos de heteroátomos mixtos y de alquilo o cicloalquilo o uno o más enlaces internucleosídicos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos comprenden aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la parte de azúcar de un nucleósido); cadenas principales de siloxano; sulfuro, cadenas principales de sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metilen formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales que contienen alqueno; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas principales de amida; y otros con componentes mixtos de N, O, S y CH<2>; véanse las patentes de EE. UU. n.° 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; y 5.677.439.

También pueden incluirse uno o más restos de azúcar sustituidos, p. ej., una de las siguientes en la posición 2': OH, SH, SCH<3>, F, OCN, OCH<3>OCH<3>, OCH<3>O(CH<2>)n CH<3>, O(CH<2>)n NH<2>u O(CH<2>)n CH3, donde n es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10; alquilo inferior de C1 a C10, alcoxialcoxi, alquilo inferior sustituido, alcarilo o aralquilo; Cl; Br; CN; CF<3>; OCF<3>; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; SOCH<3>; SO<2>CH<3>; ONO<2>; NO<2>; N<3>; NH<2>; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino; sililo sustituido; un grupo que escinde ARN; un grupo indicador; un intercalante; un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido; o un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En algunos aspectos, una modificación incluye 2'-metoxietoxi (<2>-O-CH<2>CH<2>OCH<3>, también conocida como 2'-O-(2-metoxietilo)) (Martinet al.,Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486). Otras modificaciones incluyen 2'-metoxi (2'-O-CH3), 2'-propoxi (<2>-OCH<2>CH<2>CH<3>) y 2'-fluoro (2'-F). También pueden producirse modificaciones similares en otras posiciones sobre el oligonucleótido, en particular en la posición 3' del azúcar en el nucleótido 3' terminal y en la posición 5' del nucleótido 5' terminal. Los oligonucleótidos también pueden tener miméticos de azúcar, tales como ciclobutilos en lugar del grupo pentofuranosilo.

En algunos ejemplos, tanto un azúcar como un enlace internucleósido, es decir, la cadena principal, de las unidades de nucleótidos pueden ser reemplazadas por grupos nuevos. Las unidades de bases pueden mantenerse para hibridación con un compuesto diana de ácido nucleico adecuado. Un compuesto oligomérico de este tipo, un mimético de oligonucleótido que se ha demostrado que tiene excelentes propiedades de hibridación, se cita como un ácido peptidonucleico (APN). En los compuestos de ANP, la cadena principal de azúcares de un oligonucleótido se puede reemplazar con una cadena principal que contiene amida, por ejemplo, un armazón de aminoetilglicina. Las nucleobases se pueden conservar y se unen directa o indirectamente a átomos de aza nitrógeno de la parte de amida de la cadena principal. Las patentes de los EE. UU. representativas que enseñan la preparación de dichos compuestos de ANP comprenden, pero sin limitación, patentes de EE. UU. n.° 5.539.082, 5.714.331; y 5.719.262. Pueden hallarse enseñanzas adicionales acerca de los compuestos de APN en Nielsenet al.,Science, 254: 1497-1500 (1991).

Los ARN guía también pueden incluir, de manera adicional o como alternativa, modificaciones o sustituciones de nucleobases (a menudo citadas en la técnica simplemente como "bases"). Como se usa en el presente documento, las nucleobases "no modificadas" o "naturales" incluyen adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen nucleobases encontradas solo de manera infrecuente o transitoria en los ácidos nucleicos naturales, p. ej., hipoxantina, 6-metiladenina, 5-Me pirimidinas, en particular 5-metilcitosina (también citada como 5-metil-2' desoxicitosina y con frecuencia citada en la técnica como 5-Me-C), 5-hidroximetilcitosina (HMC), glucosil HMC y gentobiosil HMC, así como nucleobases sintéticas, p. ej., 2-aminoadenina, 2-(metilamino)adenina, 2-(imidazoalquil)adenina, 2-(aminoalquilamino)adenina u otras alquiladeninas heterosustituidas, 2-tiouracilo, 2-tiotimina, 5-bromouracilo, 5-hidroximetiluracilo, 8-azaguanina, 7-desazaguanina, N6 (6-aminohexil)adenina y 2,6-diaminopurina. Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, págs. 75-77 (1980); Gebeyehuet al.,Nucl. Acids Res. 15:4513 (1997). Una base "universal" conocida en la técnica, p. ej., inosina, también se pueden incluir. Se ha mostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2 °C (Sanghvi, Y. S., en Crooke, S. T. y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón, 1993, págs. 276-278) y son aspectos de sustituciones de bases.

Las nucleobases modificadas pueden comprender otras nucleobases sintéticas y naturales, tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil-citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (seudo-uracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, particularmente, 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina.

Además, las nucleobases pueden comprender aquellas divulgadas en la Patente de los Estados Unidos n.° 3.687.808, las divulgadas en "The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering", páginas 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquellas divulgadas por Englischet al.,Angewandle Chemie, Edición internacional, 1991, 30, página 613 y aquellas divulgadas por Sanghvi, Y. S., capítulo 15, "Antisense Research and Applications", páginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993. Algunas de estas nucleobases son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos de la presente divulgación. Estas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, purinas sustituidas N-6 y 0-6, que comprenden 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha mostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad de la doble cadena de ácido nucleico en 0,6-1,2 °C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. y Lebleu, B., eds, "Antisense Research and Applications", CRC Press, Boca Ratón, 1993, págs. 276-278) y son aspectos de sustituciones de bases, aún más particularmente cuando se combinan con modificaciones de azúcar de 2'-O-metoxietilo. Las nucleobases modificadas se describen en las patentes de EE. UU. n.° 3.687.808, así como 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.596.091; 5.614.617; 5.681.941; 5.750.692; 5.763.588; 5.830.653; 6.005.096; y en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2003/0158403.

Por tanto, el término "modificado" se refiere a un azúcar no natural, fosfato, o base que se incorpora a un ARN guía, una endonucleasa, o tanto un ARN guía como una endonucleasa. No es necesario que todas las posiciones de un oligonucleótido dado estén modificadas de manera uniforme y, de hecho, se puede incorporar más de una de las modificaciones mencionadas en un solo oligonucleótido, o incluso en un solo nucleósido dentro de un oligonucleótido.

Los ARN guía y/o ARNm (o ADN) que codifican una endonucleasa se pueden unir químicamente a una o más fracciones o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular o la captación celular del oligonucleótido. Tales fracciones comprenden, pero sin limitación, fracciones lipídicas tales como fracciones de colesterol (Letsingeret al.,Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 86: 6553-6556 [1989]); ácido cólico [Manoharanet al.,Bioorg. Med. Chem. Let., 4: 1053-1060 (1994)]; un tioéter, p. ej., hexil-S-tritiltiol [Manoharanet al,Ann. N. Y. Acad. Sci., 660: 306-309 (1992) y Manoharanet al.,Bioorg. Med. Chem. Let., 3: 2765-2770 (1993)]; a thiocholesterol [Oberhauseret al.,Nucl. Acids Res., 20: 533-538 (1992)]; una cadena alifática, p. ej., restos de dodecandiol o undecilo [Kabanovet al.,FEBS Lett., 259: 327-330 (1990) y Svinarchuket al.,Biochimie, 75: 49-54 (1993)]; un fosfolípido, p. ej., di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de tri-etilamonio [Manoharanet al.,Tetrahedron Lett., 36: 3651-3654 (1995) y Sheaet al.,Nucl. Acids Res., 18: 3777-3783 (1990)]; una poliamina o una cadena de polietilenglicol [Mancharanet al.,Nucleosides & Nucleotides, 14: 969-973 (1995)]; ácido adamantano-acético [Manoharanet al.,Tetrahedron Lett., 36: 3651-3654 (1995)]; fracción de apalmitilo [(Mishraet al.,Bioquímica. Biophys. Acta, 1264: 229 237 (1995)]; o una fracción de octadecilamina o hexilamino-carbonil-t-oxicolesterol [Crookeet al.,J. Pharmacol. Exp Ther., 277: 923-937 (1996)]. Véanse también las patentes de EE. UU. n.° 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717, 5.580.731 5.580.731 5.591.584 5.109.124 5.118.802 5.138.045 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046 4.587.044 4.605.735 4.667.025 4.762.779 4.789.737 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013 5.082.830 5.112.963 5.214.136 5.082.830 5.112.963 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536 5.272.250 5.292.873 5.317.098 5.371.241 5.391.723 5.416.203, 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785 5.565.552 5.567.810 5.574.142 5.585.481 5.587.371 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941.

Los azúcares y otras fracciones se pueden utilizar para dirigir proteínas y complejos que comprendan nucleótidos, tales como los polisomas y liposomas catiónicos, a determinados sitios. Por ejemplo, la transferencia dirigida a células hepáticas puede mediarse a través de los receptores de asialoglicoproteína (ASGPR); véase, p. ej., Hu,et al.,Protein Pept Lett. 21(10): 1025-30 (2014). Se pueden utilizar otros sistemas conocidos en la técnica y desarrollados regularmente para dirigir biomoléculas de utilidad en el presente caso y/o complejos de las mismas a determinadas células diana de interés.

Estas fracciones o conjugados de direccionamiento pueden incluir grupos conjugados unidos covalentemente a grupos funcionales, tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Los grupos conjugados de la presente divulgación incluyen intercaladores, moléculas indicadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, poliéteres, grupos que potencian las propiedades farmacodinámicas de los oligómeros y grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas de los oligómeros. Los grupos conjugados típicos incluyen colesteroles, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, coumarinas y colorantes. Los grupos que potencian las propiedades farmacodinámicas, en el contexto de la presente divulgación, incluyen grupos que mejoran la captación, potencian la resistencia a la degradación y/o fortalecen la hibridación específica de secuencia con el ácido nucleico diana. Los grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas, en el contexto de la presente divulgación, incluyen grupos que mejoran la captación, la distribución, el metabolismo o la excreción de los compuestos de la presente divulgación. Los grupos conjugados representativos se divulgan en la solicitud internacional de patente n.°<p>C<t>/US92/09196, presentada el 23 de octubre de 1992 (publicada como el documento WO1993007883) y la patente de EE. UU. n.° 6.287.860. Las fracciones conjugadas incluyen, pero sin limitación, fracciones lipídicas tales como fracciones de colesterol, ácido cólico, un tioéter, p. ej., hexil-5-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifática, p. ej., dodecandiol o restos undecilo, un fosfolípido, p. ej., di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio 1,2-di-O-hexadecil-racglicero-3-H-fosfonato, una poliamina o una cadena de polietilenglicol o ácido adamantanoacético, un resto de palmitilo o un resto de octadecilamina o de hexilamino-carbonil-oxi colesterol. Véase, p. ej., las patentes de EE. UU. n.° 4.828.979 4.948.882 5.218.105 5.525.465 5.541.313 5.545.730 5.552.538 5.578.717 5.580.731 5.580.731 5.591.584 5.109.124 5.118.802 5.138.045 5.414.077 5.486.603 5.512.439 5.578.718 5.608.046 4.587.044 4.605.735 4.667.025 4.762.779 4.789.737 4.824.941 4.835.263 4.876.335 4.904.582 4.958.013 5.082.830 5.112.963 5.214.136 5.082.830 5.112.963 5.214.136 5.245.022 5.254.469 5.258.506 5.262.536 5.272.250 5.292.873 5.317.098 5.371.241 5.391.723 5.416.203 5.451.463 5.510.475 5.512.667 5.514.785 5.565.552 5.567.810 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941.

Los polinucleótidos más largos, que son menos susceptibles a la síntesis química y que normalmente se producen mediante síntesis enzimática, también pueden modificarse mediante diferentes medios. Dichas modificaciones pueden incluir, por ejemplo, la introducción de ciertos análogos de nucleótidos, la incorporación de determinadas secuencias u otras fracciones en los extremos 5' o 3' de las moléculas y otras modificaciones. A modo ilustrativo, el ARNm que codifica Cas9 tiene una longitud de aproximadamente 4 kb y se puede sintetizar mediante transcripciónin vitro.Las modificaciones en el ARNm se pueden aplicar a, p. ej., el aumento de su traducción o estabilidad (por ejemplo, aumentando su resistencia a la degradación en una célula) o la reducción de la tendencia del ARN a provocar una respuesta inmunitaria innata que a menudo se observa en las células después de la introducción de ARN exógenos, particularmente ARN más largos como los que codifican Cas9.

Se han descrito numerosas modificaciones de este tipo en la técnica, tales como colas de poliA, análogos de caperuza 5' (p. ej., análogos anti-caperuza inversos (ARCA) o m7G(5')ppp(5')G (mCAP)), regiones no traducidas (UTR) 5' o 3' modificadas, uso de bases modificadas (tales como Pseudo-UTP, 2-Tio-UTP, 5-metilcitidina-5'-trifosfato (5-netil-CTP) o N6-metil-ATP) o tratamiento con fosfatasa para eliminar los fosfatos del extremo 5'. Estas y otras modificaciones son conocidas en la técnica y periódicamente se desarrollan nuevas modificaciones de ARN.

Existen numerosos proveedores comerciales de ARN modificados, entre los que se incluyen, por ejemplo, TriLink Biotech, AxoLabs, Bio-Synthesis Inc., Dharmacon y muchos otros. Según lo descrito por TriLink, por ejemplo, se puede utilizar 5-metil-CTP para impartir características deseables, tal como una mayor estabilidad de la nucleasa, un aumento de la traducción o una reducción de la interacción de los receptores inmunitarios innatos con ARN transcritoin vitro.También se ha demostrado que el 5-metilcitidin-5'-trifosfato (5-metil-CTP), el N6-metil-ATP, así como el pseudo-UTP y el 2-tio-UTP, reducen la estimulación inmunitaria innata en cultivo ein vivoal tiempo que potencian la traducción, como se ilustra en las publicaciones de Kormannet al.y Warrenet al.a las que se hace referencia a continuación.

Se ha demostrado que el ARNm modificado químicamente y administradoin vivopuede utilizarse para conseguir mejores efectos terapéuticos; véase, p. ej., Kormannet al.,Nature Biotechnology 29, 154— 157 (2011). Se pueden utilizar tales modificaciones, por ejemplo, para aumentar la estabilidad de la molécula de ARN y/o reducir su inmunogenicidad. Por medio de modificaciones químicas tales como pseudo-U, N6-Metil-A, 2-Tio-U y 5-Metil-C, se encontró que sustituir solo una cuarta parte de los restos de uridina y citidina con 2-tio-U y 5-metil-C produjo respectivamente una disminución significativa en el reconocimiento del ARNm mediado por el receptor de tipo Toll (TLR) en ratones. Al reducir la activación del sistema inmunitario innato, estas modificaciones se pueden utilizar para aumentar eficazmente la estabilidad y la longevidad del ARNmin vivo;véase, p. ej., Kormannet al.,citado anteriormente.

También se ha demostrado que la administración repetida de ARN mensajeros sintéticos que tienen modificaciones diseñadas para eludir las respuestas antivíricas innatas puede reprogramar células humanas diferenciadas para la pluripotencia. Véase, p. ej., Warren,et al.,Cell Stem Cell, 7(5):618-30 (2010). Estos ARNm modificados que actúan como proteínas de reprogramación primaria pueden ser un medio eficaz para reprogramar múltiples tipos de células humanas. Tales células se denominan células madre de pluripotencia inducida (iPSC) y se descubrió que el ARN sintetizado enzimáticamente que tiene 5-metil-CTP, pseudo-UTP y un análogo anti-caperuza inverso (ARCA) se podrían utilizar para evadir eficazmente la respuesta antivírica de la célula; véase, p. ej., Warrenet al.,citado anteriormente.

Otras modificaciones de polinucleótidos descritas en la técnica incluyen, por ejemplo, el uso de colas de poliA, la adición de análogos de caperuza 5' (tales como m7G(5')ppp(5')G (mCAP)), modificaciones de las regiones no traducidas (UTR) 5' o 3', o tratamiento con fosfatasa para eliminar los fosfatos del extremo 5', y periódicamente se desarrollan nuevos enfoques.

Se han desarrollado varias composiciones y técnicas aplicables a la generación de ARN modificados para su uso en el presente documento en relación con la modificación de la interferencia de ARN (ARNi), incluidos los ARN interferentes pequeños (ARNip). Los ARNip presentan problemas particularesin vivoporque sus efectos sobre el silenciamiento genético a través de la interferencia del ARNm son generalmente transitorios, que puede requerir la administración repetida. Además, los ARNip son ARN bicatenarios (ARNbc) y las células de mamíferos tienen respuestas inmunitarias que han evolucionado para detectar y neutralizar el ARNbc, que a menudo es un subproducto de una infección vírica. Por tanto, existen enzimas de mamífero tales como la PKR (cinasa sensible a ARNbc) y, potencialmente, el gen I inducible por ácido retinoico (RIG-I), que pueden mediar las respuestas celulares hacia el ARNbc, así como los receptores de tipo Toll (tales como TLR3, TLR7 y TLR8) que pueden desencadenar la inducción de citocinas en respuesta a dichas moléculas; véase, p. ej., las reseñas de Angartet al.,Pharmaceuticals (Basel) 6(4): 440-468 (2013); Kanastyet al.,Molecular Therapy 20(3): 513-524 (2012); Burnettet al.,Biotechnol J. 6(9): 1130-46 (2011); Judge y MacLachlan, Hum Gene Ther 19(2): 111-24 (2008); y las referencias citadas en los mismos.

Se han desarrollado y aplicado una gran variedad de modificaciones para mejorar la estabilidad del ARN, reducir las respuestas inmunitarias innatas y/o lograr otros beneficios que puedan ser útiles en relación con la introducción de polinucleótidos en células humanas, tal como se describe en el presente documento; véase, p. ej., las revisiones de Whitehead K. A.et al.,Annual Review of Chemical y Biomolecular Engineering, 2: 77-96 (2011); Gaglione y Messere, Mini Rev Med Chem, 10(7):578-95 (2010); Chernolovskayaet al,Curr Opin Mol Ther., 12(2): 158-67 (2010); Deleaveyet al.,Curr Protoc Nucleic Acid Chem, capítulo 16:Unidad 16.3 (2009); Behlke, Oligonucleotides 18(4):305-19 (2008); Fuciniet al.,Nucleic Acid Ther 22(3): 205-210 (2012); Bremsenet al.,Front Genet 3:154 (2012).

Como se ha indicado anteriormente, hay varios proveedores comerciales de ARN modificados, muchos de los cuales se han especializado en modificaciones diseñadas para mejorar la eficacia de los ARNi. Se ofrecen diversos enfoques basados en diversos hallazgos reportados en la bibliografía. Por ejemplo, Dharmacon señala que el reemplazo de un oxígeno no puente con azufre (fosforotioato, PS) se ha utilizado ampliamente para mejorar la resistencia a las nucleasas de los ARNi, según lo informado por Kole, Nature Reviews Drug Discovery 11:125-140 (2012). Se ha informado que las modificaciones de la posición 2' de la ribosa mejoran la resistencia a la nucleasa del enlace de fosfato entre nucleótidos al tiempo que aumentan la estabilidad del dúplex (Tm), que también se ha demostrado que proporciona protección contra la activación inmunitaria. Se ha asociado una combinación de modificaciones moderadas de la cadena principal del PS con sustituciones en 2' pequeñas y bien toleradas (2'-O-metil, 2'-fluoro, 2'-hidro) con ARNip altamente estables para aplicacionesin vivo,según lo informado por Soutscheket al.Nature 432:173-178 (2004); y se ha informado que las modificaciones de 2'-O-metilo son efectivas para mejorar la estabilidad, según lo informado por Volkov, Oligonucleotides 19:191-202 (2009). Con respecto a la disminución de la inducción de respuestas inmunitarias innatas, se ha informado que la modificación de secuencias específicas con 2'-O-Metil, 2'-Fluoro, 2'-Hidro reduce la interacción de TLR7/TLR8 mientras que generalmente preserva la actividad silenciadora; véase, p. ej., Judgeet al.,Mol. Ther. 13:494-505 (2006); y Cekaiteet al.,J. Mol. Biol. 365:90-108 (2007). También se ha demostrado que las modificaciones adicionales, como el 2-tiouracilo, el pseudouracilo, la 5-metilcitosina, el 5-metiluracilo y la N6-metiladenosina minimizan los efectos inmunitarios mediados por el TLR3, TLR7 y TLR8; véase, p. ej., Kariko, K.et al.,Immunity 23:165-175 (2005).

Como también es conocido en la técnica y está disponible en el mercado, se pueden aplicar varios conjugados a los polinucleótidos, tales como los ARN, para su uso en el presente documento que pueden mejorar su administración y/o captación por las células, entre los que se incluyen, por ejemplo, colesterol, tocoferol y ácido fólico, lípidos, péptidos, polímeros, conectores y aptámeros; véase, p. ej., la reseña de Winkler, Ther. Deliv. 4:791-809 (2013) y las referencias citadas en ese documento.

Optimización de codones

Un polinucleótido que codifica un polipéptido dirigido al sitio se puede optimizar en codones según métodos convencionales en la técnica para su expresión en la célula que contiene el ADN diana de interés. Por ejemplo, si el ácido nucleico diana previsto está en una célula humana, se contempla un polinucleótido humano con optimización de codones que codifica Cas9 para su uso en la producción del polipéptido Cas9.

Complejos de un ácido nucleico dirigido al genoma y un polipéptido dirigido al sitio

Un ácido nucleico dirigido al genoma interactúa con un polipéptido dirigido al sitio (p. ej., una nucleasa guiada por ácido nucleico tal como Cas9), formando así un complejo. El ácido nucleico dirigido al genoma guía al polipéptido dirigido al sitio hacia un ácido nucleico diana.

Complejos de ribonucleoproteínas (RNP)

El polipéptido dirigido al sitio y el ácido nucleico dirigido al genoma se pueden administrar por separado a una célula o a un paciente. Por otra parte, el polipéptido dirigido al sitio se puede complejar previamente con uno o más ARN guía, o uno o más ARNcr junto con un ARNtracr. El material formando complejos previos puede administrarse después a una célula o a un paciente. Este material formando complejos previos se conoce como partícula de ribonucleoproteína (RNP,ribonucleoprotein particle).El polipéptido dirigido al sitio en el RNP puede ser, por ejemplo, una endonucleasa Cas9 o una endonucleasa Cpf1. El polipéptido dirigido al sitio puede estar flanqueado en el extremo N, en el extremo C, o tanto en el extremo N como en el extremo C, por una o más señales de localización nuclear (NLS,nuclear localization signals).Por ejemplo, una endonucleasa Cas9 puede estar flanqueada por dos NLS, estando una NLS ubicada en el extremo N y la otra en el extremo C. La NLS puede ser cualquier NLS conocida en la técnica, tal como una NLS de SV40. La proporción en peso entre el ácido nucleico dirigido al genoma y el polipéptido dirigido al sitio en el RNP puede ser de 1:1. Por ejemplo, en la RNP, la proporción en peso del ARNgu y de la endonucleasa Cas9 puede ser de 1:1.

Componentes del sistema de codificación de ácidos nucleicos

La presente divulgación proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ácido nucleico de la divulgación dirigido al genoma, un polipéptido dirigido al sitio de la divulgación y/o cualquier ácido nucleico o molécula proteica, necesarios para llevar a cabo los aspectos de los métodos de la divulgación.

El ácido nucleico que codifica un ácido nucleico de la divulgación dirigido al genoma, un polipéptido dirigido al sitio de la divulgación y/o cualquier ácido nucleico o molécula proteica, necesarios para llevar a cabo los aspectos de los métodos de la divulgación, pueden comprender un vector (p. ej., un vector de expresión recombinante).

El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN bicatenario en donde se pueden ligar segmentos adicionales de ácido nucleico. Otro tipo de vector es un vector vírico, en donde se pueden ligar segmentos de ácido nucleico adicionales al genoma vírico. Determinados vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la cual se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (p. ej., vectores no episómicos de mamífero) se integran en el genoma de una célula hospedadora tras su introducción en la célula hospedadora y, de este modo, se replican junto con el genoma del hospedador.

En algunos ejemplos, los vectores pueden dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se citan en el presente documento como "vectores de expresión recombinantes" o más simplemente "vectores de expresión", que tienen funciones equivalentes.

La expresión "unida operativamente" significa que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a la(s) secuencia(s) reguladora(s) de manera que se permite la expresión de la secuencia de nucleótidos. La expresión "secuencia reguladora" pretende incluir, por ejemplo, promotores, potenciadores y otros elementos de control de expresión (p. ej., señales de poliadenilación). En la técnica se conocen bien dichas secuencias reguladoras y se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedadoras y las que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solamente en determinadas células hospedadoras (p. ej., secuencias reguladoras específicas de tejido). Los expertos en la materia apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula diana, del nivel de expresión deseado, y similares.

Los vectores de expresión contemplados incluyen, pero sin limitación, vectores víricos basados en virus variolovacunal, poliovirus, adenovirus, dependoparvovirus, S V40, virus del herpes simple, virus de la inmunodeficiencia humana, retrovirus (p. ej., virus de la leucemia murina, virus de la necrosis del bazo y vectores procedentes de retrovirus, tales como el virus del sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, un lentivirus, virus de la inmunodeficiencia humana, virus del sarcoma mieloproliferativo y virus del tumor mamario) y otros vectores recombinantes. Otros vectores contemplados para células diana eucariotas incluyen, pero sin limitación, los vectores pXT1, pSG5, pSVK3, pBPV, pMSG y pSVLSV40 (Pharmacia). Pueden utilizarse otros vectores siempre que sean compatibles con la célula hospedadora.

En algunos ejemplos, un vector puede comprender uno o más elementos de control de la transcripción y/o traducción. Dependiendo del sistema hospedador/vector utilizado, se puede usar cualquier número de elementos de control de la transcripción y de traducción adecuados, incluidos los promotores constitutivos e inducibles, elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc., en el vector de expresión. El vector puede ser un vector autoinactivante que inactive las secuencias víricas o los componentes de la maquinaria CRISPR u otros elementos.

Como ejemplos no limitativos de promotores eucariotas adecuados (es decir, promotores funcionales en una célula eucariota) pueden incluirse los del promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), timidina cinasa del virus del herpes simple (HSV), de SV40 temprano y tardío, repeticiones terminales largas (LTR,long terminal repeats)de retrovirus, promotor del factor 1 de elongación humano (EF1), una construcción híbrida que comprende el potenciador del citomegalovirus (CMV) fusionado con el promotor de la beta-actina de pollo (CAG), promotor del virus de células madre murinas (MSCV), promotor del locus de fosfoglicerato cinasa 1 (PGK,phosphoglycerate kinase)y metalotioneína-I de ratón.

Para expresar ARN pequeños, incluidos los ARN guía utilizados en relación con la endonucleasa Cas, varios promotores como los promotores de la ARN polimerasa III, incluyendo, por ejemplo, U6 y H1, pueden ser ventajosos. Se conocen en la técnica descripciones y parámetros para mejorar el uso de dichos promotores, y periódicamente se describen información y enfoques adicionales; véase, p. ej., Ma, H.et al., Molecular Therapy - Nucleic Acids 3,e161 (2014) doi:10.1038/mtna.2014.12.

El vector de expresión también puede contener un sitio de unión a ribosomas para el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector de expresión también puede comprender secuencias adecuadas para amplificar la expresión. El vector de expresión también puede incluir secuencias de nucleótidos que codifican etiquetas no nativas (p. ej., etiqueta de histidina, etiqueta de hemaglutinina, proteína fluorescente verde, etc.) que se fusionan al polipéptido dirigido al sitio, dando así como resultado una proteína de fusión.

Un promotor puede ser un promotor inducible (p. ej., un promotor de choque térmico, promotor regulado por tetraciclina, promotor regulado por esteroides, promotor regulado por metales, promotor regulado por el receptor de estrógeno, etc.). El promotor puede ser un promotor constitutivo (p. ej., promotor de CMV, promotor de UBC). En algunos casos, el promotor puede ser un promotor restringido espacialmente y/o temporalmente (p. ej., un promotor específico de tejido, promotor específico del tipo de célula, etc.).

El ácido nucleico que codifica un ácido nucleico dirigido al genoma de la divulgación y/o un polipéptido dirigido al sitio se puede empaquetar en o sobre la superficie de vehículos de administración para su administración a las células. Los vehículos de administración contemplados incluyen, pero sin limitación, nanoesferas, liposomas, puntos cuánticos, nanopartículas, partículas de polietilenglicol, hidrogeles y micelas. Como se describe en la técnica, se pueden utilizar diversas fracciones de direccionamiento para mejorar la interacción preferencial de dichos vehículos con los tipos o ubicaciones de células deseados.

La introducción de los complejos, de los polipéptidos y de los ácidos nucleicos de la divulgación, en las células, pueden producirse mediante infección de virus o bacteriófagos, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, lipofección, electroporación, nucleofección, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polietilenimina (PEI), transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposomas, tecnología de pistola de partículas, precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa, suministro de ácidos nucleicos mediado por nanopartículas y similares.

Enfoque terapéutico

Se describen en el presente documento usos para el tratamiento de un paciente con ataxia de Friedreich. La ataxia de Friedreich es causada por la ampliación anormal de una repetición trinucleotídica GAA en el primer intrón del gen FXN. En la mayoría de las personas, el segmento GAA se repite menos de 12 veces. En los pacientes con ataxia de Friedreich, el número de repeticiones de GAA puede variar entre 66 y 1000 repeticiones. Este número puede ser diferente de un paciente a otro.

La expresión "ampliación de la repetición trinucleotídica" significa una serie de tres bases (por ejemplo, GAA) repetidas al menos dos veces. En ciertos ejemplos, la ampliación de la repetición trinucleotídica puede estar ubicada en el intrón 1 de un ácido nucleico FXN. En ciertos ejemplos, una ampliación de la repetición trinucleotídica patógena incluye al menos 66 repeticiones de GAA en un ácido nucleico FXN y está asociada con la enfermedad. En otros ejemplos, una ampliación de la repetición trinucleotídica patógena incluye al menos 67, 68, 69, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 800, 1000 o más repeticiones. En ciertos ejemplos, las repeticiones son consecutivas. En ciertos ejemplos, las repeticiones están interrumpidas por una o más nucleobases. En ciertos ejemplos, una ampliación de la repetición trinucleotídica de tipo natural incluye 12 o menos repeticiones de GAA en un ácido nucleico FXN. En otros ejemplos, una ampliación de la repetición trinucleotídica de tipo natural incluye 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 repetición. En ciertos ejemplos, se elimina toda la ampliación de la repetición trinucleotídica. En otros ejemplos, se elimina una parte de la ampliación de la repetición trinucleotídica.

Un aspecto de dicho uso es una terapia a base de célulasex vivo.Por ejemplo, se puede crear una célula madre pluripotente inducida (iPSC) específica del paciente. Después, el ADN cromosómico de estas células iPSC se puede reescribir utilizando los materiales y métodos descritos en el presente documento. Seguidamente, las iPSC reescritas del genoma se pueden diferenciar en células que luego pueden implantarse en el paciente. En determinados aspectos, las iPSC pueden diferenciarse en células del sistema nervioso central (p. ej., neuronas, neurogliocitos o retinianas), células del sistema nervioso periférico u otros tipos de células periféricas, incluidas las células del sistema cardiovascular (p. ej.: miocitos cardíacos).

Otro aspecto de dicho uso es una terapia a base de célulasex vivo.Por ejemplo, se puede aislar una célula madre mesenquimatosa del paciente, que puede aislarse de la médula ósea o de la sangre periférica del paciente. Seguidamente, el ADN cromosómico de estas células madre mesenquimatosas se puede reescribir utilizando los materiales y métodos descritos en el presente documento. Seguidamente, las células madre mesenquimatosas reescritas genómicamente pueden diferenciarse en células del sistema nervioso central (p. ej., neuronas o neurogliocitos). Finalmente, las células diferenciadas, p. ej., células del sistema nervioso central (p. ej., neuronas o neurogliocitos) se pueden implantar en el paciente.

Una ventaja de un enfoque de la terapia celularex vivoes la capacidad de realizar un análisis exhaustivo del fármaco antes de su administración. Las terapias a base de nucleasas pueden tener cierto nivel de efectos no deseados. Realizar la reescritura genómicaex vivopermite caracterizar la población de células reescritas antes de la implantación. La presente divulgación incluye la secuenciación de todo el genoma de las células reescritas para garantizar que los efectos no deseados, en su caso, pueden estar en ubicaciones genómicas asociadas con un riesgo mínimo para el paciente. Además, poblaciones de células específicas, incluidas las poblaciones clonales, pueden aislarse antes de la implantación.

Otra ventaja de la terapia celularex vivose refiere a la modificación genética en las iPSC en comparación con otras fuentes de células primarias. Las iPSC son prolíficas, facilitando la obtención de la gran cantidad de células que se requerirán para una terapia a base de células. Además, las iPSC son un tipo de célula ideal para realizar aislamientos clonales. Esto permite detectar la modificación genómica correcta, sin correr el riesgo de una disminución de la viabilidad. En cambio, otras células primarias, tales como las neurogliocitos, son viables solo para unos pocos pases y son difíciles de ampliar clonalmente. Por tanto, la manipulación de iPSC para el tratamiento de la ataxia de Friedreich puede ser mucho más fácil y puede acortar el tiempo necesario para realizar la modificación genética deseada.

Los usos también pueden incluir una terapia basadain vivo.El ADN cromosómico de las células del paciente se puede reescribir utilizando los materiales y métodos descritos en el presente documento. En algunos aspectos, la célula diana en una terapia basadain vivoes una célula del sistema nervioso central (p. ej., una neurona o una neurogliocito).

Aunque ciertas células presentan una diana atractiva para el tratamiento y la terapiaex vivo,una mayor eficacia en la administración puede permitir la administración directain vivoa dichas células. Lo ideal sería que la segmentación y la reescritura se dirigieran a las células relevantes. La escisión en otras células también se puede prevenir mediante el uso de promotores activos solo en ciertas células y/o etapas de desarrollo. Los promotores adicionales son inducibles y, por lo tanto, pueden controlarse temporalmente si la nucleasa se administra como plásmido. La cantidad de tiempo que el ARN y la proteína administrados permanecen en la célula también se puede ajustar utilizando tratamientos o dominios agregados para cambiar la semivida. El tratamientoin vivoeliminaría una serie de etapas del tratamiento, pero una tasa de administración más baja puede requerir tasas de reescritura más altas. El tratamientoin vivopuede eliminar los problemas y las pérdidas del tratamientoex vivo,el injerto y la integración posterior al injerto de neuronas y neurogliocitos de manera adecuada en los circuitos cerebrales existentes.

Una ventaja de la terapia génicain vivopuede ser la facilidad de producción y administración terapéutica. El mismo enfoque terapéutico y terapia tendrán el potencial de ser utilizados para tratar a más de un paciente, por ejemplo, un número de pacientes que compartan el mismo genotipo o alelo, o uno similar. En cambio, la terapia celularex vivogeneralmente requiere el uso de células del propio paciente, que se aíslan, manipulan y devuelven al mismo paciente.

También se proporciona en el presente documento un método celular para reescribir el gen FXN en una célula mediante reescritura genómica como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, se puede aislar una célula de un paciente o animal. Después, se puede reescribir el ADN cromosómico de la célula utilizando los materiales y métodos descritos en el presente documento.

Los métodos descritos en el presente documento, independientemente de si se trata de un método celular, o un métodoex vivooin vivo,puede implicar uno o una combinación de los siguientes: 1) deleción de toda la repetición trinucleotídica ampliada o una parte de la misma en o cerca del gen FXN, mediante la inducción de roturas de ADN bicatenarias en ambos lados de la región ampliada; 2) deleción de toda la repetición trinucleotídica ampliada o una parte de la misma en o cerca del gen FXN, mediante la inducción de una rotura de ADN bicatenaria proximal a la región ampliada; 3) reemplazo de la secuencia de repetición trinucleotídica ampliada delecionada con una secuencia corregida; 4) inserción de un gen FXN de tipo natural, un ADNc o un minigén (que comprende uno o más exones e intrones, o intrones naturales o sintéticos) en el locus del gen FXN o en un locus de puerto seguro; o 5) corrección de una mutación puntual dentro o cerca del gen FXN.

Por ejemplo, la estrategia de deleción inducida por RBC doble puede implicar la escisión de toda la ampliación de la repetición anormal, o una parte de ella en el gen FXN, induciendo dos o más roturas bicatenarias en ambos lados de la región de repetición con una o más endonucleasas CRISPR y dos o más ARNgu. En determinados aspectos, se puede proporcionar un ADN donante que contenga la secuencia corregida para restablecer la secuencia de tipo natural. Este enfoque puede requerir el desarrollo y la optimización de ARNgu y moléculas de ADN donantes para el gen FXN.

Por ejemplo, la estrategia de deleción inducida por RBC única puede implicar la deleción de toda la ampliación de la repetición anormal o una parte de ella en el gen FXN induciendo una rotura bicatenaria en un sitio proximal a la región de repetición con una o más endonucleasas CRISPR y un ARNg (p. ej., ARNcr ARNtracr o ARNgu). En determinados aspectos, se puede proporcionar un ADN donante que contenga la secuencia corregida para restablecer la secuencia de tipo natural. Este enfoque puede requerir el desarrollo y la optimización de ARNg y moléculas de ADN donante para el gen FXN.

Por ejemplo, el reemplazo de la secuencia de repetición trinucleotídica ampliada delecionada por una secuencia corregida se puede lograr mediante la administración a la célula de una o más endonucleasas CRISPR, un par de ARNg (p. ej., ARNcr ARNtracr o ARNgu) que se dirigen en dirección 5' o en dirección 3' de la secuencia de repetición trinucleotídica ampliada, y un ADN donante que contiene la secuencia deseada y los brazos de homología con las regiones flanqueantes del locus diana. Este enfoque puede requerir el desarrollo y la optimización de los ARNgu para el gen FXN.

Por ejemplo, toda la estrategia de corrección genética puede implicar la inserción de un gen FXN de tipo natural, un ADNc o un minigén (que comprende uno o más exones e intrones, o intrones naturales o sintéticos) en el locus del gen FXN. Esto se puede lograr introduciendo en la célula una o más endonucleasas CRISPR, un par de ARNg (p. ej., ARNcr ARNtracr o ARNgu) que se dirigen en dirección 5' y en dirección 3' del primer y último exón y/o intrón del gen FXN, y un ADN donante que contiene la secuencia deseada y los brazos de homología con las regiones flanqueantes del locus diana. La ubicación citogenética del gen FXN es 9q21.11. Como alternativa, se puede insertar el gen FXN de tipo natural, un ADNc o un minigén (que comprende uno o más exones e intrones, o intrones naturales o sintéticos) en un locus de puerto seguro. Un "locus de puerto seguro" se refiere a una región del genoma donde el material integrado puede expresarse adecuadamente sin perturbar la estructura o función de los genes endógenos. Los locus de puerto seguro incluyen, entre otros, AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpinal, TF y/o TTR. Los sitios diana de dentro de los locus de puerto seguro se pueden seleccionar del grupo que consiste en: exón 1-2 de AAVS1 (PPP1R12C), exón 1-2 de ALB, exón 1-2 de Angptl3, exón 1-2 de ApoC3, exón 1-2 de ASGR2, exón 1-2 de CCR5, exón 1-2 de FIX (F9), exón 1-2 de Gys2, exón 1-2 de HGD, exón 1-2 de Lp(a), exón 1-2 de Pcsk9, exón 1-2 de Serpinal, exón 1-2 de TF y/o exón 1-2 de TTR.

La estrategia de corrección génica completa también puede implicar la deleción del gen FXN endógeno mutado junto con la inserción del gen FXN de tipo natural.

Toda la estrategia de corrección genética utiliza una plantilla de ADN donante en la reparación dirigida por homología (HDR). La HDR se puede lograr haciendo una o más roturas monocatenarias (RMC) o roturas bicatenarias (RBC) en sitios específicos del genoma mediante el uso de una o más endonucleasas. El ADN donante puede ser ADN monocatenario o bicatenario. La plantilla donante puede tener brazos homólogos a la región 9q21.11. La plantilla donante puede tener brazos homólogos a un locus de puerto seguro. Por ejemplo, la plantilla donante puede tener brazos homólogos a un locus de puerto seguro AAVS1, tal como, intrón 1 del gen PPP1R12C. Como otro ejemplo, la plantilla donante puede tener brazos homólogos a un locus de puerto seguro CCR5.

Por ejemplo, la corrección de una mutación puntual puede implicar el reemplazo de una o más bases de nucleótidos, o uno o más exones y/o intrones dentro o cerca del gen FXN. La corrección de una mutación puntual puede implicar la deleción de la secuencia que contiene la mutación induciendo una rotura bicatenaria en un sitio proximal y un sitio distal a la mutación puntual con una o más endonucleasas CRISPR y un ARNg (p. ej., ARNcr ARNtracr o ARNgu). En determinados aspectos, se puede proporcionar un ADN donante que contenga la secuencia corregida para restablecer la secuencia de tipo natural. Este enfoque puede requerir el desarrollo y la optimización de ARNg y moléculas de ADN donante para el gen FXN.

Las ventajas de las estrategias anteriores son similares, incluyendo, en principio, efectos beneficiosos clínicos y de laboratorio tanto a corto como a largo plazo.

Además de las estrategias de reescritura genómica mencionadas anteriormente, otra estrategia implica modular la expresión, función o actividad de FXN mediante la reescritura en la secuencia reguladora.

Además de las opciones de reescritura enumeradas anteriormente, se pueden usar proteínas Cas9 o similares para dirigir los dominios efectores a los mismos sitios diana que se pueden identificar para la reescritura, o a sitios diana adicionales dentro del alcance del dominio efector. Pueden utilizarse diversas enzimas modificadoras de la cromatina, metilasas o desmetilasas para alterar la expresión del gen diana. Una posibilidad es disminuir la expresión de la proteína FXN si la mutación conduce a una actividad no deseada. Estos tipos de regulación epigenética tienen algunas ventajas, especialmente porque están limitadas en cuanto a posibles efectos inespecíficos.

Además de la ampliación de repeticiones trinucleotídicas en la secuencia intrónica del gen FXN, pueden estar presentes varios tipos de sitios diana genómicos.

La regulación de la transcripción y la traducción implica varias clases diferentes de sitios que interactúan con proteínas o nucleótidos celulares. A menudo, los sitios de unión del ADN de los factores de transcripción u otras proteínas pueden ser objeto de mutación o deleción para estudiar la función del sitio, aunque también pueden utilizarse para cambiar la expresión genética. Se pueden agregar sitios a través de la unión de extremos no homólogos (NHEJ) o mediante la reescritura directa del genoma mediante reparación dirigida por homología (HDR). El aumento del uso de la secuenciación del genoma, la expresión de ARN y los estudios de todo el genoma sobre la unión de factores de transcripción han aumentado nuestra capacidad para identificar cómo los sitios conducen a la regulación genética temporal o del desarrollo. Estos sistemas de control pueden ser directos o implicar una amplia regulación cooperativa que puede requerir la integración de actividades de múltiples potenciadores. Los factores de transcripción normalmente se unen a secuencias de ADN degeneradas de entre 6 y 12 pb de longitud. El bajo nivel de especificidad proporcionado por los sitios individuales indica que existen interacciones y reglas complejas involucradas en la unión y el resultado funcional. Los sitios de unión con menos degeneración pueden proporcionar medios de regulación más simples. Se pueden diseñar factores de transcripción artificiales para especificar secuencias más largas que tengan secuencias menos similares en el genoma y tengan un menor potencial de escisión inespecífica. Cualquiera de estos tipos de sitios de unión puede sufrir mutaciones, delecionarse o incluso crearse para permitir cambios en la regulación o expresión genética (Canver, M. C.et al., Nature(2015)).

Otra clase de regiones reguladoras de genes que tienen estas características son los sitios de unión de microARN (miARN). Los miARN son ARN no codificantes que desempeñan papeles clave en la regulación genética postranscripcional. Los miARN pueden regular la expresión del 30 % de todos los genes codificantes de proteínas de mamíferos. Se descubrió un silenciamiento genético específico y potente mediante ARN bicatenario (ARNi), más ARN pequeño no codificante adicional (Canver, M. C.et al., Nature(2015)). La clase más grande de ARN no codificantes importantes para el silenciamiento genético son los miARN. En los mamíferos, los miARN se transcriben primero como una transcripción de ARN larga, que pueden ser unidades transcripcionales separadas, parte de intrones de proteínas u otras transcripciones. Las transcripciones largas se denominan miARN primarios (miARN pri) e incluyen estructuras de horquilla con bases emparejadas de manera imperfecta. Estos miARN se pueden escindir en uno o más miARN precursores más cortos (miARN pre) mediante un microprocesador, un complejo proteico en el núcleo, que implica Drosha.

Los miARN pre son bucles de tallo cortos de aproximadamente 70 nucleótidos de longitud con un saliente 3' de 2 nucleótidos que se exportan, en los dúplex de miARN:miARN* maduros de 19-25 nucleótidos. La cadena de miARN con menor estabilidad de emparejamiento de bases (la cadena guía) se puede cargar en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). La cadena pasajera (marcada con *), puede ser funcional, pero generalmente se degrada. El miARN maduro une RISC a motivos de secuencia parcialmente complementarios en los ARNm diana que se encuentran predominantemente dentro de las regiones no traducidas (UTR) 3' e induce el silenciamiento génico postranscripcional (Bartel, D. P.Cell136, 215-233 (2009); Saj, A. y Lai, E.C.Curr Opin Genet Dev21, 504-510 (2011)).

Los miARN pueden ser importantes en el desarrollo, la diferenciación, control del ciclo celular y del crecimiento, y en prácticamente todas las vías biológicas de los mamíferos y otros organismos pluricelulares. Los miARN también pueden participar en el control del ciclo celular, apoptosis y diferenciación de células madre, hematopoyesis, hipoxia, desarrollo muscular, la neurogénesis, secreción de insulina, metabolismo del colesterol, envejecimiento, replicación vírica y respuestas inmunitarias.

Un solo miARN puede dirigirse a cientos de transcripciones de ARNm diferentes, mientras que una transcripción de miARN individual puede ser el objetivo de muchos miARN diferentes. Se han anotado más de 28645 microARN en la última versión de miRBase (v.21). Algunos miARN pueden estar codificados por múltiples locus, algunos de los cuales pueden expresarse a partir de grupos transcritos conjuntamente en tándem. Las características permiten redes reguladoras complejas con múltiples vías y controles de retroalimentación. Los miARN pueden ser partes integrales de estos circuitos de retroalimentación y regulación, y pueden ayudar a regular la expresión genética al mantener la producción de proteínas dentro de los límites (Herranz, H. y Cohen, S. M.Genes Dev24, 1339-1344 (2010); Posadas, D. M. y Carthew, R. W.Curr Opin Genet Dev27, 1-6 (2014)).

El miARN también puede ser importante en un gran número de enfermedades humanas que están asociadas con la expresión anormal de miARN. Esta asociación subraya la importancia de la vía reguladora de miARN. Estudios recientes de deleción de miARN han vinculado el miARN con la regulación de las respuestas inmunitarias (Stem-Ginossar, N.et al., Science317, 376-381 (2007)).

El miARN también tiene un fuerte vínculo con el cáncer y puede desempeñar un papel en diferentes tipos de cáncer. Se ha descubierto que los miARN están regulados a la baja en varios tumores. El miARN puede ser importante en la regulación de vías clave relacionadas con el cáncer, tales como el control del ciclo celular y la respuesta al daño del ADN, y por lo tanto se pueden utilizar en el diagnóstico y pueden ser dirigidas clínicamente. Los microARN pueden regular delicadamente el equilibrio de la angiogénesis, de tal manera que los experimentos que agotan todos los microARN suprimen la angiogénesis tumoral (Chen, S.et al., Genes Dev28, 1054-1067 (2014)).

Como se ha demostrado para los genes codificantes de proteínas, los genes de miARN también pueden estar sujetos a cambios epigenéticos que ocurren con el cáncer. Muchos locus de miARN pueden asociarse con islas CpG aumentando su oportunidad de regulación por metilación del ADN (Weber, B., Stresemann, C., Brueckner, B. y Lyko, F.Cell Cycle6, 1001-1005 (2007)). La mayoría de los estudios han utilizado el tratamiento con fármacos remodeladores de la cromatina para revelar miARN silenciados epigenéticamente.

Además de su papel en el silenciamiento del ARN, los miARN también pueden activar la traducción (Posadas, D. M. y Carthew, R. W.Curr Opin Genet Dev27, 1-6 (2014)). La desactivación de sitios de miARN puede provocar una disminución de la expresión del gen diana, mientras que la introducción de estos sitios puede aumentar la expresión.

Los miARN individuales se pueden desactivar de forma más efectiva mutando la secuencia semilla (bases 2 a 8 del microARN), lo que puede ser importante para la especificidad de la unión. La escisión en esta región, seguida de una reparación incorrecta por NHEJ puede abolir eficazmente la función de miARN al bloquear la unión a los sitios diana. miARN también podría inhibirse mediante la orientación específica de la región de bucle especial adyacente a la secuencia palindrómica. La Cas9 catalíticamente inactiva también se puede utilizar para inhibir la expresión de ARNhc (Zhao, Y.et al., Sci Rep4, 3943 (2014)). Además de dirigirse al miARN, los sitios de unión también pueden ser seleccionados y mutados para evitar el silenciamiento por miARN.

De acuerdo con la presente divulgación, cualquiera de los microARN (miARN) o sus sitios de unión pueden incorporarse a las composiciones descritas en el presente documento.

Las composiciones pueden tener una región tal como, pero sin limitación, una región que comprenda la secuencia de cualquiera de los microARN enumerados en las SEQ ID NO: 632-4715, el complemento inverso de los microARN enumerados en las SEQ ID NO: 632-4715, o la región anti-semilla de microARN de cualquiera de los microARN enumerados en las SEQ ID NO: 632-4715.

Las composiciones de la presente divulgación pueden comprender una o más secuencias diana de microARN, secuencias de microARN o semillas de microARN. Dichas secuencias pueden corresponder a cualquier microARN conocido, como los que se enseñan en la publicación de EE. UU. US2005/0261218 y la publicación de EE. UU. US2005/0059005. Como un ejemplo no limitativo, los microARN conocidos, sus secuencias y las secuencias de sus sitios de unión en el genoma humano se enumeran en las SEQ ID NO: 632-4715.

Una secuencia de microARN comprende una secuencia "semilla", es decir, una secuencia en la región de las posiciones 2-8 del microARN maduro, secuencia que tiene una complementariedad Watson-Crick perfecta con la secuencia diana del miARN. Una semilla de microARN puede comprender las posiciones 2-8 o 2-7 del microARN maduro. En algunos aspectos, una semilla de microARN puede comprender 7 nucleótidos (p. ej., los nucleótidos 2-8 del microARN maduro), en donde el sitio complementario de la semilla en el miARN diana correspondiente está flanqueado por una adenina (A) opuesta a la posición 1 del microARN. En algunos aspectos, una semilla de microARN puede comprender 6 nucleótidos (p. ej., los nucleótidos 2-7 del microARN maduro), en donde el sitio complementario de la semilla en el miARN diana correspondiente está flanqueado por una adenina (A) opuesta a la posición 1 del microARN. Véase, por ejemplo, Grimson A., Farh K. K., Johnston WK, Garrett-Engele P., Lim L. P., Bartel D. P.; Mol Cell. 6 de jul de 2007;27(1):91-105. Las bases de la semilla de microARN tienen completa complementariedad con la secuencia diana.

Se han identificado microARN, regiones diana de microARN, así como sus patrones de expresión y su papel en la biología (Bonaueret al.,Curr Drug Targets 2010 11:943-949; Anand y Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176; Contreras y Rao Leukemia 201226:404-413 (2011 Dec 20. doi: 10.1038/leu.2011.356); Bartel Cell 2009 136:215-233; Landgrafet al.,Cell, 2007 129:1401-1414; Gentner y Naldini, Tissue Antigens. 201280:393-403).

Por ejemplo, si la composición no está destinada a ser administrada al hígado sino que termina allí, entonces miR-122, un microARN abundante en el hígado, puede inhibir la expresión de la secuencia administrada si uno o varios sitios diana de miR-122 se diseñan en el polinucleótido que codifica esa secuencia diana. La introducción de uno o varios sitios de unión para diferentes microARN se puede diseñar para disminuir aún más la longevidad, estabilidad y traducción de proteínas, proporcionando así una capa adicional de durabilidad.

Como se usa en el presente documento, la expresión "sitio de microARN" se refiere a un sitio diana de microARN o un sitio de reconocimiento de microARN, o cualquier secuencia de nucleótidos a la que se une o asocia un microARN. Debe entenderse que la "unión" puede seguir las reglas tradicionales de hibridación de Watson-Crick o puede reflejar cualquier asociación estable del microARN con la secuencia diana en el sitio del microARN o adyacente a él.

Por el contrario, a los efectos de las composiciones de la presente divulgación, los sitios de unión de microARN se pueden diseñar (es decir, eliminar) de secuencias en las que se encuentran naturalmente para aumentar la expresión de proteínas en tejidos específicos. Por ejemplo, los sitios de unión de miR-137 podrían eliminarse para mejorar la expresión de proteínas en el cerebro.

Específicamente, se sabe que los microARN se expresan de forma diferencial en las células inmunitarias (también llamadas células hematopoyéticas), tales como las células presentadoras de antígenos (CPA) (p. ej., células dendríticas y macrófagos), macrófagos, monocitos, linfocitos B, linfocitos T, granulocitos, linfocitos citolíticos naturales, etc. Los microARN específicos de las células inmunitarias participan en la inmunogenicidad, en la autoinmunidad, la respuesta inmunitaria a la infección, la inflamación, así como una respuesta inmunitaria no deseada después de la terapia genética y el trasplante de tejidos/órganos. Los microARN específicos de las células inmunitarias también regulan muchos aspectos del desarrollo, la proliferación, la diferenciación y la apoptosis de células hematopoyéticas (células inmunitarias). Por ejemplo, miR-142 y miR-146 se expresan exclusivamente en las células inmunitarias, particularmente abundantes en células dendríticas mieloides. La introducción del sitio de unión de miR-142 en la UTR 3' de un polipéptido de la presente divulgación puede suprimir selectivamente la expresión génica en las células presentadoras de antígeno a través de la degradación del ARNm mediada por miR-142, limitando la presentación de antígenos en las APC profesionales (p. ej., células dendríticas) y, por lo tanto, previniendo la respuesta inmunitaria mediada por antígenos después de la administración del gen (véase, Annoni Aet al.,blood, 2009, 114, 5152-5161).

En un ejemplo, los sitios de unión de microARN que se sabe que se expresan en células inmunitarias, en particular, las células presentadoras de antígeno, se pueden introducir en los polinucleótidos para suprimir la expresión del polinucleótido en las APC a través de la degradación del ARN mediada por microARN, suprimiendo la respuesta inmunitaria mediada por antígenos, mientras que la expresión del polinucleótido se mantiene en células no inmunitarias donde los microARN específicos de las células inmunitarias no se expresan.

Se han realizado muchos estudios de expresión de microARN y se describen en la técnica, para perfilar la expresión diferencial de microARN en diversas células/tejidos cancerosos y otras enfermedades. Algunos microARN están anormalmente sobreexpresados en ciertas células cancerosas y otros están subexpresados. Por ejemplo, los microARN se expresan de forma diferencial en las células cancerosas (documentos WO2008/154098, US2013/0059015, US2013/0042333, WO2011/157294); las células madre cancerosas (documento US2012/0053224); los cánceres y enfermedades del páncreas (documentos US2009/0131348, US2011/0171646, US2010/0286232, US8389210); el asma y la inflamación (documento US8415096); el cáncer de próstata (documento US2013/0053264); el carcinoma hepatocelular (documentos WO2012/151212, US2012/0329672, WO2008/054828, US8252538); las células de cáncer de pulmón (documentos WO2011/076143, WO2013/033640, WO2009/070653, US2010/0323357); el linfoma cutáneo de linfocitos T (documento WO2013/011378); las células de cáncer colorrectal (documentos WO2011/0281756, WO2011/076142); los ganglios linfáticos cancerosos (documentos WO2009/100430, US2009/0263803); el carcinoma nasofaríngeo (documento EP2112235); la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (documentos US2012/0264626, US2013/0053263); el cáncer de tiroides (documento WO2013/066678); las células de cáncer de ovario (documentos US2012/0309645, WO2011/095623); las células de cáncer de mama (documentos WO2008/154098, WO 2007/081740, US2012/0214699), la leucemia y el linfoma (documentos WO2008/073915, US2009/0092974, US2012/0316081, US2012/0283310, WO2010/018563).

Algunos ejemplos no limitativos de secuencias de microARN y los tejidos y/o células diana se describen en las SEQ ID NO: 632-4715.

Estrategias de ingeniería genómica

Los métodos de la presente divulgación pueden implicar la reescritura de uno o ambos alelos mutados. La reescritura genómica para modificar o corregir el gen FXN tiene la ventaja de restablecer los niveles de expresión correctos o eliminar productos genéticos anómalos y el control temporal.

Una etapa de los usosex vivode la presente divulgación puede comprender la reescritura/corrección de células del sistema nervioso central (p. ej., neuronas o neurogliocitos) que se aislarán de un paciente con ataxia de Friedreich utilizando ingeniería genómica. Como alternativa, una etapa de los usosex vivode la presente divulgación puede comprender las iPSC específicas del paciente o las células madre mesenquimatosas que se van a reescribir/corregir. De manera análoga, una etapa de los usosin vivode la presente divulgación implica las células de un paciente con ataxia de Friedreich que se editarán/corregirán mediante ingeniería genómica. De manera similar, una etapa en los métodos celulares de la presente divulgación puede comprender la reescritura/corrección del gen FXN en una célula humana mediante ingeniería genómica.

Los pacientes con ataxia de Friedreich presentan repeticiones trinucleotídicas ampliadas en el gen FXN. Por lo tanto, diferentes pacientes pueden utilizar estrategias de reescritura similares. Se puede utilizar cualquier endonucleasa CRISPR en los métodos de la presente divulgación, cada endonucleasa CRISPR tiene su propio PAM asociado, que puede ser o no específico de una enfermedad.

En un aspecto, la ampliación de la repetición trinucleotídica se puede escindir induciendo dos roturas bicatenarias (RBC) en dirección 5' y en dirección 3' de la región de repetición. Se han utilizado pares de ARNg para este tipo de deleciones. Las endonucleasas CRISPR, configuradas con los dos ARNg, inducen dos RBC en las ubicaciones deseadas. Después de la escisión, los dos extremos, bien romos o sobresalientes, pueden unirse a NHEJ, lo que conduce a la deleción del segmento intermedio. En determinados aspectos, la secuencia de tipo natural se puede restablecer insertando una secuencia repetida correcta a través de HDR.

En otro aspecto, la ampliación de la repetición trinucleotídica puede eliminarse después de inducir una sola RBC cerca o dentro de la región de repetición. Se ha informado de una pérdida de repetición inducida por RBC única en varios estudios, incluidas repeticiones CAG/CTG cortas escindidas con TALEN diseñadas en levadura, repeticiones CAG escindidas por ZFN diseñadas en células humanas y repeticiones CTG/CAG escindidas por CRISPR/Cas9 diseñadas en células humanas (Richardet al., PLoS ONE(2014), 9(4): e95611; Mittelman et al.,Proc Natl Acad Sci EE. UU.(2009), 106(24):9607-12; van Agtmaal et al.,Mol Ther(2016), http://dx.doi.Org/10.1016/j.ymthe.2016.10.014). Una RBC cerca de la región de repetición desestabiliza los tramos de repetición, desencadenando una contracción (p. ej., una deleción parcial) o, en algunos casos, una deleción completa de las repeticiones. Adicionalmente, el trabajo de Mittelmanet al.sugirió que la pérdida de repetición inducida por RBC única es más efectiva en repeticiones más largas. En determinados aspectos, la secuencia de tipo natural se puede restablecer insertando una secuencia repetida correcta a través de HDR.

Como alternativa, la expresión del gen FXN mutado puede verse alterada o eliminada mediante la introducción de inserciones o deleciones aleatorias (indels) que surgen debido a la vía de reparación de NHEJ imprecisa. Las regiones diana pueden ser la secuencia codificante del gen FXN (es decir, exones).

La inserción o deleción de nucleótidos en la secuencia codificante de un gen puede provocar un "cambio de marco" en el que se altere el patrón normal de codones de 3 letras. De esta forma, la expresión genética y, por lo tanto, la producción de proteínas mutadas pueden reducirse o eliminarse. Este enfoque también se puede utilizar para dirigir cualquier intrón, unión intromexona o elemento regulador del ADN del gen FXN, donde la alteración de la secuencia puede interferir con la expresión del gen FXN. Este enfoque puede requerir el desarrollo y la optimización de los ARNgu para el gen FXN.

Como alternativa adicional, se puede delecionar todo el gen mutado y un gen de tipo natural, un ADNc o un minigén (que comprenda uno o más exones e intrones, o intrones naturales o sintéticos) se pueden introducir en el locus del gen o en una ubicación heteróloga del genoma, tal como un locus de puerto seguro. Se pueden utilizar pares de nucleasas para eliminar regiones genéticas mutadas y se proporciona un donante para restablecer la función. En este caso se suministrarían dos ARNg y una secuencia donante. Un ADNc de longitud completa puede introducirse en cualquier "puerto seguro", pero debe utilizar un promotor suministrado o endógeno. Si esta construcción se introduce en el locus del gen FXN, tendrá control fisiológico, similar al gen normal.

Algunas estrategias de ingeniería genómica implican corregir la ampliación de repeticiones o insertar un gen FXN de tipo natural o un ADNc o un minigén (que comprenda uno o más exones e intrones, o intrones naturales o sintéticos) en el locus del gen correspondiente o un locus de puerto seguro mediante reparación dirigida por homología (HDR), que también se conoce como recombinación homóloga (HR). La reparación dirigida por homología puede ser una estrategia para tratar a pacientes que tengan trinucleótidos ampliados en el gen fXn . Estas estrategias pueden restablecer el gen FXN y revertir, tratar y/o mitigar el estado de la enfermedad.

La reparación dirigida por homología es un mecanismo celular para reparar roturas bicatenarias (RBC). La forma más común es la recombinación homóloga. Existen vías adicionales para la HDR, que incluyen la hibridación monocatenaria y la HDR alternativa. Las herramientas de ingeniería genómica permiten a los investigadores manipular las vías de recombinación homóloga celular para crear modificaciones específicas del sitio del genoma. Se ha descubierto que las células pueden reparar una rotura bicatenaria utilizando una molécula donante sintética proporcionada en trans. Por lo tanto, introduciendo una rotura bicatenaria cerca de una mutación específica y proporcionando un donante adecuado, se pueden realizar cambios específicos en el genoma. La escisión específica aumenta la tasa de HDR más de 1000 veces por encima de la tasa de 1 en 106 células que reciben un donante homólogo únicamente. La tasa de reparación dirigida por homología (HDR) en un nucleótido particular depende de la distancia al sitio de corte, por lo que es importante elegir sitios diana superpuestos o más cercanos. La reescritura genómica ofrece la ventaja sobre la adición de genes, como la correcciónin situdeja el resto del genoma intacto.

Los donantes suministrados para la reescritura por HDR varían notablemente, pero pueden contener la secuencia deseada con brazos de homología flanqueantes pequeños o grandes para permitir la unión con el ADN genómico. Las regiones de homología que flanquean los cambios genéticos introducidos pueden ser de 30 pb o más pequeñas, o tan grandes como un casete de varios kilobases que puede contener promotores, ADNc, etc. Se han utilizado donantes de oligonucleótidos tanto monocatenarios como bicatenarios. Estos oligonucleótidos varían en tamaño desde menos de 100 nt hasta muchos kb, aunque también se pueden generar y utilizar ADNmc más largos. Se pueden utilizar donantes bicatenarios, incluidos amplicones de PCR, plásmidos y minicírculos. En general, se ha descubierto que un vector de AAV puede ser un medio muy eficaz de administración de una plantilla donante, aunque el límite de empaquetado para donantes individuales es <5 kb. La transcripción activa del donante aumentó la HDR tres veces, lo que indica que la inclusión del promotor puede aumentar la conversión. Por el contrario, la metilación de CpG del donante disminuyó la expresión genética y la HDR.

Además de las endonucleasas de tipo natural, tales como Cas9, existen variantes de nicasa que tienen uno u otro dominio de nucleasa inactivado, lo que produce el corte de solo una cadena de ADN. La HDR se puede dirigir desde nicasas Cas individuales o utilizando pares de nicasas que flanqueen el área diana. Los donantes pueden ser monocatenarios, mellados o ADNbc.

El ADN donante se puede suministrar con la nucleasa o de forma independiente mediante una variedad de métodos diferentes, por ejemplo, por transfección, nanopartícula, microinyección o transducción vírica. Se ha propuesto una variedad de opciones de vinculación para aumentar la disponibilidad de los donantes para la HDR. Los ejemplos incluyen unir el donante a la nucleasa, adhiriéndose a proteínas de unión al ADN que se unen cerca, o adhiriéndose a proteínas que participan en la unión o reparación de los extremos del ADN.

La elección de la vía de reparación puede estar guiada por una serie de condiciones de cultivo, tales como aquellos que influyen en el ciclo celular o dirigidas a la reparación del ADN y las proteínas asociadas. Por ejemplo, para aumentar la HDR, se pueden suprimir moléculas clave de NHEJ, tales como KU70, KU80 o ADN ligasa IV.

Sin un donante presente, los extremos de una rotura de ADN o los extremos de diferentes roturas se pueden unir utilizando varias vías de reparación no homólogas en las que los extremos del ADN se unen con poco o ningún emparejamiento de bases en la unión. Además de la NHEJ canónica, existen mecanismos de reparación similares, tales como alt-NHEJ. Si hay dos roturas, el segmento intermedio se puede delecionar o invertir. Las vías de reparación de NHEJ pueden conducir a inserciones, deleciones o mutaciones en las uniones.

Se utilizó la NHEJ para insertar un casete de expresión genética inducible de 15 kb en un locus definido en estirpes celulares humanas después de la escisión de la nucleasa. (Véase, p. ej., Maresca, M., Lin, V.G., Guo, N. y Yang, Y.,Genome Res23, 539-546 (2013); Cristeaet al.Biotechnology and Bioengineering, 110 (3):871-80 (2013); Suzukiet al. Nature,540, 144-149 (2016)).

Además de la reescritura genómica mediante NHEJ o HDR, se han realizado inserciones de genes en sitios específicos que utilizan tanto la vía NHEJ como HR. En determinados entornos puede ser aplicable un enfoque combinado, posiblemente incluyendo bordes de intrones/exones. La NHEJ puede resultar eficaz para la ligadura en el intrón, mientras que la HDR sin errores puede ser más adecuado en la región de codificación.

La mutación del gen FXN que causa la ataxia de Friedreich es una ampliación de la repetición trinucleotídica de la cadena de tres letras de nucleótidos GAA. En los individuos sanos, hay pocas repeticiones de este trinucleótido, en general, aproximadamente 12 o menos. En las personas con el fenotipo de enfermedades, la repetición puede ocurrir en el orden de las centenas. Se pueden eliminar o corregir una o más repeticiones trinucleotídicas para restablecer el gen a un tipo natural o a un número similar de repeticiones trinucleotídicas. En algunos aspectos, se pueden eliminar todas las repeticiones trinucleotídicas. Como alternativa, el gen mutado puede ser desactivado para eliminar productos genéticos tóxicos. Además de la ampliación repetida, también se han identificado mutaciones puntuales en pacientes con ataxia de Friedreich. Cualquiera o más de las mutaciones pueden repararse para restablecer el FXN inactivo. En algunos ejemplos, se pueden reemplazar una o más bases de nucleótidos para corregir la mutación puntual. En otros ejemplos, se pueden reemplazar uno o más exones y/o intrones dentro o cerca del gen FXN. Como alternativa adicional, se puede insertar un gen FXN o ADNc en el lugar del gen correspondiente para reemplazar el gen mutado o insertarlo en un sitio seguro, tal como AAVS1. En algunos ejemplos, los métodos pueden proporcionar un ARNg o un par de ARNg que pueden usarse para facilitar la incorporación de una nueva secuencia a partir de una plantilla donante de polinucleótidos para incorporar una parte o la totalidad del gen FXN o ADNc.

Algunas estrategias de ingeniería genómica implican la deleción de repeticiones. La deleción dirigida de repeticiones trinucleotídicas es una estrategia atractiva para tratar un gran subconjunto de pacientes con un único cóctel terapéutico. Las deleciones pueden ser deleciones de repeticiones de un solo trinucleótido o deleciones de repeticiones de múltiples trinucleótidos. Durante las deleciones de múltiples repeticiones, incluida la deleción completa de la repetición trinucleotídica ampliada, puede llegar a un mayor número de pacientes, para deleciones más grandes, la eficiencia de la deleción disminuye considerablemente al aumentar el tamaño. En algunos aspectos, las deleciones varían de tamaño entre 40 y 5.000 pares de bases (pb). Por ejemplo, las deleciones pueden variar de 40 a 100; de 100 a 300; de 300 a 500; de 500 a 1000; de 1000 a 2000; de 2000 a 3000; o de 3000 a 5000 pares de bases de tamaño.

Los métodos pueden proporcionar pares de ARNg que realizan una deleción cortando el gen dos veces, un ARNg cortando en el extremo 5' de las repeticiones trinucleotídicas y el otro ARNg cortando en el extremo 3' de las repeticiones trinucleotídicas. El corte puede lograrse mediante un par de endonucleasas de ADN cada una formando una RBC en el genoma, o mediante múltiples nicasas que juntas forman una RBC en el genoma.

Como alternativa, los métodos pueden proporcionar un ARNg para realizar un corte bicatenario alrededor de las repeticiones trinucleotídicas. El corte bicatenario puede ser realizado por una sola endonucleasa de ADN o por múltiples nicasas que juntas forman una RBC en el genoma.

Las modificaciones ilustrativas dentro del gen FXN incluyen deleciones dentro o cerca (proximales) de las repeticiones trinucleotídicas mencionadas anteriormente, tales como, por ejemplo, en la región de menos de 3 kb, menos de 2kb, menos de 1 kb, menos de 0,5 kb en dirección 5' o en dirección 3' de la mutación específica. Dadas las variaciones relativamente amplias de repeticiones trinucleotídicas en el gen FXN, se apreciará que existen numerosas variaciones de las deleciones a las que se hace referencia anteriormente (incluidas, entre otras, deleciones más grandes y más pequeñas), se esperaría que esto diera como resultado el restablecimiento de la expresión del gen FXN.

Tales variantes pueden incluir deleciones que son más grandes en la dirección 5' y/o 3' que la ampliación de la repetición específica en cuestión, o más pequeñas en cualquier dirección. Por consiguiente, por "cerca" o "proximal" con respecto a la ampliación de la repetición específica, se pretende que el locus de RMC o RBC asociado con un límite de deleción deseado (también denominado en el presente documento punto final) pueda estar dentro de una región que esté a menos de aproximadamente 3 kb del locus de referencia indicado. El locus de RMC o RBC puede ser más proximal y estar dentro de 2 kb, dentro de 1 kb, dentro de 0,5 kb o dentro de 0,1 kb. En caso de una pequeña deleción, el punto final deseado puede estar en el lugar de referencia o "adyacente a él", con lo que se pretende que el punto final pueda estar dentro de 100 pb, dentro de 50 pb, dentro de 25 pb, o menos de aproximadamente 10 pb a 5 pb del locus de referencia.

Para garantizar que el ARNm pre se procese correctamente después de la deleción, se pueden delecionar las señales de corte y empalme circundantes. Los donantes y aceptores de corte y empalme generalmente se encuentran a 100 pares de bases del intrón vecino. Por lo tanto, en algunos ejemplos, los métodos pueden proporcionar todos los ARNg que cortan aproximadamente /-100-3100 pb con respecto a cada unión exón/intrón de interés.

Para cualquiera de las estrategias de reescritura genómica, la reescritura genómica se puede confirmar mediante secuenciación o análisis de PCR.

Selección de secuencias diana

Los cambios en la ubicación del límite 5' y/o el límite 3' en relación con locus de referencia particulares se pueden utilizar para facilitar o mejorar aplicaciones particulares de reescritura genómica, que dependen en parte del sistema de endonucleasa seleccionado para la reescritura, como se describe e ilustra con más detalle en el presente documento.

En un primer ejemplo no limitativo de dicha selección de secuencia diana, muchos sistemas de endonucleasas tienen reglas o criterios que pueden guiar la selección inicial de posibles sitios diana para la escisión, tales como la necesidad de un motivo de secuencia PAM en una posición particular adyacente a los sitios de escisión del ADN en el caso de las endonucleasas CRISPR de tipo II o Tipo V.

En otro ejemplo no limitativo de selección u optimización de secuencia diana, la frecuencia de actividad inespecífica para una combinación particular de secuencia diana y endonucleasa de reescritura genómica (es decir, la frecuencia de RBC que ocurren en sitios distintos de la secuencia diana seleccionada) se puede evaluar en relación con la frecuencia de actividad específica. En algunos casos, las células que han sido reescritas correctamente en el lugar deseado pueden tener una ventaja selectiva con respecto a otras células. A modo ilustrativo, pero no limitativo, los ejemplos de una ventaja selectiva incluyen la adquisición de atributos tales como tasas mejoradas de replicación, persistencia, resistencia a ciertas condiciones, tasas mejoradas de injerto exitoso o persistenciain vivodespués de la introducción en un paciente y otros atributos asociados con el mantenimiento o el aumento del número o la viabilidad de dichas células. En otros casos, las células que han sido reescritas correctamente en el locus deseado pueden seleccionarse positivamente mediante uno o más métodos de detección utilizados para identificar, ordenar o seleccionar de otro modo las células que se han reescrito correctamente. Tanto los métodos de ventaja selectiva como los de selección dirigida pueden aprovechar el fenotipo asociado con la corrección. En algunos casos, las células se pueden reescribir dos o más veces para crear una segunda modificación que genere un nuevo fenotipo que se utilice para seleccionar o purificar la población de células deseada. Se podría crear una segunda modificación de este tipo añadiendo un segundo ARNg que permita la expresión de un marcador seleccionable o detectable. En algunos casos, las células se pueden reescribir correctamente en el locus deseado utilizando un fragmento de ADN que contenga el ADNc y también un marcador seleccionable.

Si en un caso particular se aplica alguna ventaja selectiva o se debe aplicar alguna selección dirigida, la selección de la secuencia diana también puede guiarse por la consideración de frecuencias inespecíficas con el fin de mejorar la eficacia de la aplicación y/o reducir el potencial de alteraciones no deseadas en sitios distintos del objetivo deseado. Como se describe e ilustra con más detalle en el presente documento y en la técnica, la ocurrencia de una actividad inespecífica puede verse influenciada por una serie de factores, incluidas las similitudes y diferencias entre el sitio diana y varios sitios inespecíficos, así como la endonucleasa utilizada en particular. Existen herramientas bioinformáticas que ayudan a predecir la actividad inespecífica y, con frecuencia, dichas herramientas también se pueden utilizar para identificar los sitios más probables de actividad inespecífica, que luego se pueden evaluar en entornos experimentales para evaluar las frecuencias relativas de actividad inespecífica y específica, permitiendo así la selección de secuencias que tienen actividades relativas más altas en la diana. Se proporcionan en el presente documento ejemplos ilustrativos de dichas técnicas y se conocen otras en la técnica.

Otro aspecto de la selección de la secuencia diana se relaciona con los eventos de recombinación homóloga. Las secuencias que comparten regiones de homología pueden servir como puntos focales para eventos de recombinación homóloga que resultan en la deleción de secuencias intermedias. Estos eventos de recombinación ocurren durante el curso normal de la replicación de los cromosomas y otras secuencias de ADN, y también en otros momentos cuando se sintetizan secuencias de ADN, tal como en el caso de reparaciones de roturas bicatenarias (RBC), que ocurren regularmente durante el ciclo normal de replicación celular, pero que también pueden verse potenciadas por la ocurrencia de varios eventos (tales como la luz UV y otros inductores de rotura del ADN) o la presencia de ciertos agentes (como varios inductores químicos). Muchos de estos inductores hacen que se produzcan RBC indiscriminadamente en el genoma, y estos pueden inducirse y repararse regularmente en células normales. Durante la reparación, la secuencia original se puede reconstruir con total fidelidad, sin embargo, en algunos casos, se introducen pequeñas inserciones o deleciones (denominadas "indels") en el sitio de la RBC.

Las RBC también pueden inducirse específicamente en ubicaciones particulares, como en el caso de los sistemas de endonucleasas descritos en el presente documento, lo que puede utilizarse para provocar eventos de modificación genética dirigidos o preferenciales en ubicaciones cromosómicas seleccionadas. La tendencia de las secuencias homólogas a estar sujetas a recombinación en el contexto de la reparación del ADN (así como de la replicación) se puede aprovechar en diversas circunstancias y es la base para una aplicación de los sistemas de reescritura genómica, tales como CRISPR, en los que se utiliza la reparación dirigida por homología para insertar una secuencia de interés, proporcionado mediante el uso de un polinucleótido "donante", en una ubicación cromosómica deseada.

Las regiones de homología entre secuencias particulares, que pueden ser pequeñas regiones de "microhomología" que pueden comprender tan solo diez pares de bases o menos, también se puede utilizar para provocar deleciones deseadas. Por ejemplo, se puede introducir una sola RBC en un sitio que presente microhomología con una secuencia cercana. Durante el curso normal de la reparación de dicha RBC, un resultado que ocurre con alta frecuencia es la deleción de la secuencia intermedia como resultado de la recombinación facilitada por la RBC y el proceso de reparación celular concomitante.

En algunas circunstancias, sin embargo, la selección de secuencias diana dentro de regiones de homología también puede dar lugar a deleciones mucho mayores, incluidas las fusiones de genes (cuando las deleciones se encuentran en regiones codificantes), lo cual puede o no ser deseado dadas las circunstancias particulares.

Los ejemplos proporcionados en el presente documento ilustran además la selección de varias regiones diana para la creación de RBC diseñadas para inducir deleciones o reemplazos que den lugar a la restauración de niveles de tipo natural o similares de repeticiones trinucleotídicas en el gen FXN, así como la selección de secuencias diana específicas dentro de dichas regiones que están diseñadas para minimizar los eventos inespecíficos en relación con los eventos específicos.

Células humanas

Para mejorar la ataxia de Friedreich o cualquier trastorno asociado con FXN, como se describe e ilustra en el presente documento, las principales dianas de la reescritura genómica son las células humanas. Por ejemplo, en los métodosex vivo,las células humanas pueden ser células somáticas, que después de ser modificadas mediante las técnicas descritas, pueden dar lugar a células diferenciadas, p. ej., neuronas o células progenitoras. Por ejemplo, en los métodosin vivo,las células humanas pueden ser células del sistema nervioso central o células de otros órganos afectados.

Mediante la reescritura genética de células autólogas derivadas del paciente y, por tanto, totalmente compatibles con él, es posible generar células que puedan reintroducirse de forma segura en el paciente y dar lugar de manera eficaz a una población de células que sea eficaz para mejorar una o más condiciones clínicas asociadas con la enfermedad del paciente.

Las células madre pueden proliferar y dar lugar a más células progenitoras, a su vez, éstas tienen la capacidad de generar una gran cantidad de células madre que a su vez pueden dar lugar a células hijas diferenciadas o diferenciables. Las propias células hijas pueden inducirse para proliferar y producir una progenie que posteriormente se diferenciará en uno o más tipos de células maduras, conservando al mismo tiempo también una o más células un posible desarrollo progenitor. La expresión "célula madre" se refiere entonces, a una célula con capacidad o posibilidad, en circunstancias particulares, para diferenciarse a un fenotipo más especializado o diferenciado, y que conserva la capacidad, en determinadas circunstancias, de proliferar sin diferenciarse sustancialmente. En un aspecto, la expresión célula progenitora o madre se refiere a una célula original generalizada cuyos descendientes (progenie) se especializan, a menudo en diferentes direcciones, mediante diferenciación, p. ej., mediante la adquisición de caracteres completamente individuales, como sucede en la diversificación progresiva de células y tejidos embrionarios. La diferenciación celular es un proceso complejo que normalmente se produce a través de muchas divisiones celulares. Una célula diferenciada puede proceder de una célula multipotente que a su vez procede de una célula multipotente, y así sucesivamente. Aunque cada una de estas células multipotentes puede considerarse una célula madre, la gama de tipos de células que cada una puede originar puede variar considerablemente. Algunas células diferenciadas también tienen la capacidad de dar lugar a células de mayor potencial de desarrollo. Tal capacidad puede ser natural o puede inducirse artificialmente tras el tratamiento con varios factores. En muchos casos biológicos, las células madre también pueden ser "multipotentes" porque pueden producir progenie de más de un tipo celular distinto, pero esto no es necesario para la "pluripontencialidad".

La autorrenovación puede ser otro aspecto importante de la célula madre. En teoría, la autorrenovación puede ocurrir por cualquiera de dos mecanismos principales. Las células madre pueden dividirse asimétricamente, con una hija conservando el estado de madre y la otra hija expresando alguna otra función específica y fenotipo distintos. Como alternativa, algunas de las células madre de una población pueden dividirse simétricamente en dos madres, manteniendo así algunas células madre en la población en su conjunto, mientras que otras células de la población dan lugar únicamente a una progenie diferenciada. En general, las "células progenitoras" tienen un fenotipo celular que es más primitivo (es decir, se encuentra en una etapa anterior a lo largo de una ruta de desarrollo o progresión que una célula completamente diferenciada). Con frecuencia, las células progenitoras también tienen un potencial proliferativo significativo o muy alto. Las células progenitoras pueden dar lugar a múltiples tipos de células diferenciadas distintas o a un solo tipo de célula diferenciada, dependiendo de la ruta de desarrollo y del entorno en el que las células se desarrollan y se diferencian.

En el contexto de la ontogenia celular, el adjetivo "diferenciada", o "diferenciar" es un término relativo. Una "célula diferenciada" es una célula que ha avanzado más en la vía del desarrollo que la célula con la que se compara. Por tanto, las células madre pueden diferenciarse en células precursoras de linaje restringido (tal como una célula progenitora de miocitos), que a su vez, pueden diferenciarse en otros tipos de células precursoras en estadios posteriores de la vía (tal como un precursor de miocito), y después, en una célula diferenciada en estadio final, tal como un miocito, que desempeña un papel característico en un determinado tipo de tejido y que puede conservar o no la capacidad de seguir proliferando.

Células madre pluripotentes inducidas

Las células humanas modificadas genéticamente descritas en el presente documento pueden ser células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Una ventaja de usar iPSC es que las células pueden proceder del mismo sujeto al que se van a administrar las células progenitoras. Es decir, se puede obtener una célula somática de un sujeto, reprogramarla a una célula madre pluripotente inducida, y luego volver a diferenciarla en una célula progenitora para ser administrada al sujeto (p. ej., células autólogas). Dado que las progenitoras proceden esencialmente de una fuente autóloga, el riesgo de rechazo del injerto o de respuestas alérgicas puede reducirse en comparación con el uso de células de otro sujeto o grupo de sujetos. Además, el uso de iPSC niega la necesidad de células obtenidas de una fuente embrionaria. Por tanto, en un aspecto, las células madre utilizadas en los métodos divulgados no son células madre embrionarias.

Aunque la diferenciación es generalmente irreversible en contextos fisiológicos, recientemente se han desarrollado varios métodos para reprogramar células somáticas en iPSC. Los expertos en la materia conocen métodos ilustrativos y se describen brevemente a continuación en el presente documento.

El término "reprogramación" se refiere a un proceso que altera o invierte el estado de diferenciación de una célula diferenciada (p. ej., una célula somática). Dicho de otra manera, la reprogramación se refiere a un proceso de conducir la diferenciación de una célula hacia atrás a un tipo de célula más indiferenciada o más primitiva. Cabe señalar que la colocación de muchas células primarias en cultivo puede conducir a cierta pérdida de características completamente diferenciadas. Por tanto, simplemente cultivar dichas células incluidas en el término células diferenciadas no convierte estas células en células no diferenciadas (p. ej., células indiferenciadas) o células pluripotentes. La transición de una célula diferenciada a la pluripotencia requiere un estímulo de reprogramación más allá de los estímulos que conducen a la pérdida parcial del carácter diferenciado en cultivo. Las células reprogramadas también tienen la característica de la capacidad de realizar pases prolongados sin pérdida de potencial de crecimiento, en relación con las células progenitoras primarias, que generalmente tienen capacidad para un número limitado de divisiones en cultivo.

La célula que se va a reprogramar puede diferenciarse parcial o terminalmente antes de la reprogramación. La reprogramación puede abarcar la inversión completa del estado de diferenciación de una célula diferenciada (p. ej., una célula somática) a un estado pluripotente o multipotente. La reprogramación puede abarcar inversión completa o parcial del estado de diferenciación de una célula diferenciada (p. ej., una célula somática) a una célula indiferenciada (p. ej., una célula de tipo embrionario). La reprogramación puede dar como resultado la expresión de genes particulares por parte de las células, cuya expresión contribuye aún más a la reprogramación. En determinados ejemplos descritos en el presente documento, la reprogramación de una célula diferenciada (p. ej., una célula somática) puede hacer que la célula diferenciada asuma un estado indiferenciado (p. ej., es una célula indiferenciada). Las células resultantes se denominan "células reprogramadas", o "células madre pluripotentes inducidas (iPSC o células iPS)".

La reprogramación puede implicar alteraciones, p. ej., inversión, de al menos algunos de los patrones hereditarios de modificación de ácidos nucleicos (p. ej., metilación), condensación de cromatina, cambios epigenéticos, huella genética, etc., que ocurren durante la diferenciación celular. La reprogramación es diferente de simplemente mantener el estado indiferenciado existente de una célula que ya es pluripotente o mantener el estado existente menos que completamente diferenciado de una célula que ya es una célula multipotente (p. ej., una célula madre miogénica). La reprogramación también es distinta de promover la autorrenovación o la proliferación de células que ya son pluripotentes o multipotentes, aunque las composiciones y métodos descritos en el presente documento también pueden ser útiles para dichos fines, en algunos ejemplos.

Se conocen muchos métodos en la técnica que pueden utilizarse para generar células madre pluripotentes a partir de células somáticas. Cualquier método que reprograme una célula somática al fenotipo pluripotente sería apropiado para usar en los métodos descritos en el presente documento.

Se han descrito metodologías de reprogramación para generar células pluripotentes utilizando combinaciones definidas de factores de transcripción. Las células somáticas del ratón se pueden convertir en células similares a las células ES con un potencial de desarrollo ampliado mediante la transducción directa de Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc; véase, p. ej., Takahashi y Yamanaka, Cell 126(4): 663-76 (2006). Las iPSC se parecen a las células ES, a medida que restablecen el circuito transcripcional asociado a la pluripotencia y gran parte del paisaje epigenético. Además, las iPSC de ratón satisfacen todos los ensayos estándar de pluripotencia: específicamente, la diferenciaciónin vitroen tipos celulares de las tres capas germinales, formación de teratoma, contribución a las quimeras, transmisión de línea germinal [véase, p. ej., Maherali y Hochedlinger, Cell Stem Cell. 3(6):595-605 (2008)] y complementación tetraploide.

Las iPSC humanas se pueden obtener utilizando métodos de transducción similares y el trío de factores de transcripción, OCT4, SOX2 y NANOG, se ha establecido como el conjunto central de factores de transcripción que rigen la pluripotencia; véase, p. ej., Budniatzky y Gepstein, Stem Cells Transl Med. 3(4):448-57 (2014); Barrettet al.,Stem Cells Trans Med 3:1-6 sctm.2014-0121 (2014); Focosiet al.,Blood Cancer Journal 4: e211 (2014); y las referencias citadas en los mismos. La producción de células iPSC se puede lograr mediante la introducción de secuencias de ácido nucleico que codifican genes asociados a células madre en una célula somática adulta, históricamente utilizando vectores víricos.

Las células iPSC se pueden generar o proceder de células somáticas terminalmente diferenciadas, así como de células madre adultas o células madre somáticas. Es decir, una célula progenitora no pluripotente puede volverse pluripotente o multipotente mediante reprogramación. En dichos casos, puede que no sea necesario incluir tantos factores de reprogramación como se requiere para reprogramar una célula terminalmente diferenciada. Además, la reprogramación se puede inducir mediante la introducción no vírica de factores de reprogramación, p. ej., mediante la introducción de las proteínas mismas, mediante la introducción de ácidos nucleicos que codifican los factores de reprogramación, o mediante la introducción de ARN mensajeros que, tras la traducción, producen los factores de reprogramación (véase, p. ej., Warrenet al.,Cell Stem Cell, 7(5):618-30 (2010). La reprogramación se puede lograr mediante la introducción de una combinación de ácidos nucleicos que codifican genes asociados con células madre, incluyendo, por ejemplo, Oct-4 (también conocido como Oct-3/4 or Pouf51), Sox1, Sox2, Sox3, Sox 15, Sox 18, NANOG, Klfl, Klf2, Klf4, Klf5, NR5A2, c-Myc, 1-Myc, n-Myc, Rem2,Terty LIN28. La reprogramación usando los métodos y composiciones descritos en el presente documento puede comprender además la introducción de uno o más de Oct-3/4, un miembro de la familia Sox, un miembro de la familia Klf y un miembro de la familia Myc a una célula somática. Los métodos y composiciones descritos en el presente documento pueden comprender además la introducción de uno o más de cada Oct-4, Sox2, Nanog, c-MYC y Klf4 para reprogramación. Como se ha indicado anteriormente, el método exacto utilizado para la reprogramación no es necesariamente esencial para los métodos y composiciones descritos en el presente documento. Sin embargo, donde se utilizarán células diferenciadas de las células reprogramadas, p. ej., terapia humana, en un aspecto, la reprogramación no se efectúa mediante un método que altere el genoma. Por tanto, en dichos ejemplos, la reprogramación se puede lograr, p. ej., sin el uso de vectores víricos o plásmidos.

La eficacia de la reprogramación (es decir, el número de células reprogramadas) procedente de una población de células iniciales se puede mejorar mediante la adición de diferentes agentes, p. ej., moléculas pequeñas, según lo demostrado por Shiet al.,Cell-Stem Cell 2:525-528 (2008); Huangfuet al.,Nature Biotechnology 26(7):795-797 (2008) y Marsonet al.,Cell-Stem Cell 3: 132-135 (2008). Por tanto, se puede usar un agente o combinación de agentes que mejoran la eficacia o velocidad de producción de células madre pluripotentes inducidas en la producción de iPSC específicas del paciente o de la enfermedad. Algunos ejemplos no limitativos de agentes que mejoran la eficacia de la reprogramación incluyen Wnt soluble, medios condicionados con Wnt, BIX-01294 (una histona metiltransferasa G9a), PD0325901 (un inhibidor de MEK), inhibidores de ADN metiltransferasa, inhibidores de la histona desacetilasa (HDAC), ácido valproico, 5'-azacitidina, dexametasona, suberoilanilida, ácido hidroxámico (SAHA), vitamina C y tricostatina (TSA), entre otros.

Otros ejemplos no limitativos de agentes potenciadores de la reprogramación incluyen: ácido hidroxámico de suberoilanilida (SAHA (p. ej., MK0683, vorinostat) y otros ácidos hidroxámicos), BML-210, depudecina (p. ej., (-)-depudecina), toxina HC, Nullscript (4-(1,3-Dioxo-1H,3H-benzo[de]isoquinolin-2-il)-N-hidroxibutanamida), fenilbutirato (p. ej., fenilbutirato de sodio) y ácido valproico ((VP A) y otros ácidos grasos de cadena corta), Scriptaid, Suramina sódica, tricostatina A (TSA), compuesto APHA 8, apicidina, butirato de sodio, butirato de pivaloiloximetilo (Pivanex, AN-9), Trapoxina B, clamidocina, depsipéptido (también conocido como FR901228 o FK228), benzamidas (p. ej., CI-994 (p. ej., N-acetil dinalina) y MS-27-275), MGCD0103, NVP-LAQ-824, CBHA (ácido bishidroxámico de ácido mcarboxicinamínico), JNJ16241199, tubacina, A-161906, proxamida, oxamflatina, 3-C1-UCHA (p. ej., ácido 6-(3-clorofenilureido)caproico hidroxámico), AOE (ácido 2-amino-8-oxo-9,10-epoxidecanoico), CHAP31 y CHAP 50. Otros agentes potenciadores de la reprogramación incluyen, por ejemplo, formas negativas dominantes de las HDAC (p. ej., formas catalíticamente inactivas), inhibidores de ARNip de las HDAC y anticuerpos que se unen específicamente a las HDAC. Dichos inhibidores están disponibles, p. ej., de BIOMOL International, Fukasawa, Merck Biosciences, Novartis, Gloucester Pharmaceuticals, Titan Pharmaceuticals, MethylGene y Sigma Aldrich.

Para confirmar la inducción de células madre pluripotentes para usar con los métodos descritos en el presente documento, los clones aislados pueden probarse para la expresión de un marcador de células madre. Dicha expresión en una célula procedente de una célula somática identifica las células como células madre pluripotentes inducidas. Los marcadores de células madre se pueden seleccionar del grupo no limitativo que incluye SSEA3, SSEA4, CD9, Nanog, Fbxl5, Ecatl, Esgl, Eras, Gdf3, Fgf4, Cripto, Daxl, Zpf296, Slc2a3, Rexl, Utfl y Natl. En un caso, por ejemplo, una célula que expresa Oct4 o Nanog se identifica como pluripotente. Los métodos para detectar la expresión de dichos marcadores pueden incluir, por ejemplo, RT-PCR y métodos inmunológicos que detectan la presencia de los polipéptidos codificados, tales como transferencias Western o análisis de citometría de flujo. La detección puede implicar no solo RT-PCR, sino que también puede incluir la detección de marcadores proteicos. Los marcadores intracelulares se pueden identificar mejor mediante RT-PCR o métodos de detección de proteínas como la inmunocitoquímica, mientras que los marcadores de la superficie celular se identifican fácilmente, p. ej., mediante inmunocitoquímica.

El carácter de células madre pluripotentes de células aisladas se puede confirmar mediante pruebas que evalúan la capacidad de las iPSC para diferenciarse en células de cada una de las tres capas germinales. Como ejemplo, la formación de teratomas en ratones desnudos puede usarse para evaluar el carácter pluripotente de los clones aislados. Las células pueden introducirse en ratones desnudos y se puede realizar examen histológico y/o inmunohistoquímico en un tumor que surge de las células. El crecimiento de un tumor que comprende células de las tres capas germinales, por ejemplo, indica además que las células son células madre pluripotentes.

Células del sistema nervioso central

En algunos aspectos, las células humanas modificadas genéticamente descritas en el presente documento son células del sistema nervioso central. Las neuronas, que procesan la información, y los neurogliocitos (o neuroglia), que proporcionan soporte mecánico y metabólico al sistema nervioso y modulan la información procesada por las neuronas, son las dos clases principales de células del sistema nervioso central. Los ejemplos no limitativos de neuronas incluyen las neuronas sensoriales (también denominadas neuronas aferentes), que transfieren información del entorno externo al sistema nervioso central, las neuronas motoras (también denominadas neuronas eferentes), que transfieren información del sistema nervioso central al entorno externo, y las interneuronas (también denominadas neuronas de asociación), que procesan información en el sistema nervioso central y transfieren la información de una neurona a otra dentro del sistema nervioso central. Los ejemplos no limitativos de neurogliocitos incluyen astrocitos, oligodendrocitos, microgliocitos y células de Schwann. Las células progenitoras del SNC pueden ser células progenitoras neurales o neurogliocitos progenitores.

La neurona típica transmite señales eléctricas de una célula a otra. Las neuronas contienen un cuerpo celular, dendritas, cono axónico, axón, terminaciones nerviosas, sinapsis neuronales y uniones neuromusculares. Las neuronas pueden nombrarse según la forma o la naturaleza del árbol dendrítico.

Los neurogliocitos se diferencian de las neuronas en varios aspectos generales: no forman sinapsis, tienen esencialmente solo un tipo de proceso, conservan la capacidad de dividirse y son menos excitables eléctricamente que las neuronas. Los neurogliocitos se clasifican según el tamaño y la forma de su núcleo y se distinguen de las neuronas, a nivel de microscopio óptico. Los neurogliocitos se dividen en dos categorías principales según el tamaño, los macrogliocitos y los microgliocitos. Los macrogliocitos son de origen ectodérmico y consisten en astrocitos, oligodendrocitos y células ependimarias. Los microgliocitos son probablemente de origen mesodérmico.

Creación de células iPSC específicas para cada paciente

Una etapa de los métodosex vivode la presente divulgación puede implicar la creación de una célula iPS específica del paciente, células iPS específicas del paciente o una estirpe de células iPS específicas del paciente. Existen muchos métodos establecidos en la técnica para crear células iPS específicas del paciente, como se describe en Takahashi y Yamanaka 2006; Takahashi, Tanabeet al.2007. Por ejemplo, la etapa de creación puede comprender: a) aislar una célula somática, tal como una célula de la piel o un fibroblasto, del paciente; y b) introducir un conjunto de genes asociados a la pluripotencia en la célula somática para inducir que la célula se convierta en una célula madre pluripotente. El conjunto de genes asociados a la pluripotencia puede ser uno o más de los genes seleccionados del grupo que consiste en OCT4, SOX1, SOX2, SOX3, SOX15, SOX18, NANOG, KLF1, KLF2, KLF4, KLF5, c-MYC, n-MYC, REM2,TERTy LIN28.

Aislamiento de una célula madre mesenquimatosa

Las células madre mesenquimatosas se pueden aislar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, de la médula ósea o de la sangre periférica de un paciente. Por ejemplo, el aspirado de médula ósea se puede recoger en una jeringa con heparina. Las células se pueden lavar y centrifugar en un Percoll. Las células se pueden cultivar en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (bajo contenido de glucosa) que contiene 10 % de suero bovino fetal (FBS) (Pittinger MF, Mackay AM, Beck SCet al.,Science 1999; 284:143-147).

Células modificadas genéticamente

La expresión "célula genéticamente modificada" se refiere a una célula que comprende al menos una modificación genética introducida mediante reescritura genómica (p. ej., utilizando el sistema CRISPR/Cas9 o CRISPR/Cpf1). En algunos ejemplosex vivodel presente documento, la célula genéticamente modificada puede ser una célula progenitora neuronal genéticamente modificada. En algunos ejemplosin vivodel presente documento, la célula genéticamente modificada puede ser una célula genéticamente modificada del sistema nervioso central (p. ej., una neurona o una neurogliocito). Se contempla en el presente documento una célula genéticamente modificada que comprende un ácido nucleico dirigido al genoma exógeno y/o un ácido nucleico exógeno que codifica un ácido nucleico dirigido al genoma.

La expresión "población de control tratada" describe una población de células que se ha tratado con idénticos medios, inducción vírica, secuencias de ácido nucleico, temperatura, confluencia, tamaño del matraz, pH, etc., a excepción de la adición de los componentes de reescritura genómica. Se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica para medir el restablecimiento de la expresión o actividad del gen o proteína FXN, por ejemplo, el análisis de transferencia Western de la proteína FXN o la cuantificación del ARNm de FXN.

La expresión "célula aislada" se refiere a una célula que se ha eliminado de un organismo en el que se encontraba originalmente, o un descendiente de dicha célula. Opcionalmente, la célula puede cultivarsein vitro,p. ej., en condiciones definidas o en presencia de otras células. Opcionalmente, la célula puede introducirse posteriormente en un segundo organismo o se reintroduce en el organismo del que se aisló (o la célula de la que desciende).

La expresión "población aislada" con respecto a una población aislada de células se refiere a una población de células que se ha eliminado y separado de una población mixta o heterogénea de células. En algunos casos, la población aislada puede ser una población de células sustancialmente pura, en comparación con la población heterogénea de la que se aislaron o enriquecieron las células. En algunos casos, la población aislada puede ser una población aislada de células progenitoras humanas, p. ej., una población sustancialmente pura de células progenitoras humanas, en comparación con una población heterogénea de células que comprende células progenitoras humanas y células de las que se obtuvieron las células progenitoras humanas.

La expresión "sustancialmente mejorada" con respecto a una población celular particular, se refiere a una población de células en la que la aparición de un tipo particular de célula aumenta en relación con los niveles preexistentes o de referencia, en al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 400 veces, al menos 1000 veces, al menos 5000 veces, al menos 20.000 veces, al menos 100.000 o más veces dependiendo, p. ej., de los niveles deseados de dichas células para mejorar la ataxia de Friedreich.

La expresión "sustancialmente enriquecida" con respecto a una población celular particular, se refiere a una población de células que es al menos aproximadamente un 10%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 % o más con respecto a las células que componen una población celular total.

La expresión "sustancialmente puro" con respecto a una población celular particular, se refiere a una población de células que es al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 % o al menos aproximadamente el 95 % pura, con respecto a las células que componen una población celular total. Es decir, las expresiones "sustancialmente pura" o "esencialmente purificada", con respecto a una población de células progenitoras, se refiere a una población de células que contiene menos de aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 15%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 9%, aproximadamente un 8%, aproximadamente un 7 %, aproximadamente un 6 %, aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 4 %, aproximadamente un 3 %, aproximadamente un 2 %, aproximadamente un 1 % o menos del 1 %, de células que no son células progenitoras como se definen en los términos en el presente documento.

Diferenciación de células iPSC reescritas genómicamente en células del sistema nervioso central (SNC)

Otra etapa de los métodosex vivode la presente divulgación puede comprender la diferenciación de las iPSC reescritas genómicamente en células del sistema nervioso central (SNC) (p. ej., neuronas o neurogliocitos). La etapa de diferenciación puede realizarse de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica.

Diferenciación de células madre mesenquimatosas reescritas genómicamente en células del sistema nervioso central (SNC)

Otra etapa de los métodosex vivode la presente divulgación puede comprender la diferenciación de las células madre mesenquimatosas reescritas genómicamente en células del sistema nervioso central (SNC). La etapa de diferenciación puede realizarse de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica.

Implantación de células en pacientes

Otra etapa de los usosex vivode la presente divulgación implica las células del sistema nervioso central que se implantarán (p. ej., neuronas o neurogliocitos) en pacientes. Esta etapa de implantación puede llevarse a cabo utilizando cualquier método de implantación conocido en la técnica. Por ejemplo, las neuronas modificadas genéticamente pueden administrarse al paciente por vía intraparenquimatosa, vascular (p. ej., intravenosa, intraarterial) o ventricular (p. ej., intracerebroventricular, intracisternal, intratecal) u otras vías como la inyección intracraneal o intraperitoneal.

III. FORMULACIONES Y ADMINISTRACIÓN

Vehículos farmacéuticamente aceptables

Los usosex vivode células progenitoras que se van a administrar a un sujeto contemplados en el presente documento implican el uso de composiciones terapéuticas que comprenden células progenitoras.

Las composiciones terapéuticas pueden contener un vehículo fisiológicamente tolerable junto con la composición celular y, opcionalmente, al menos un agente bioactivo adicional como se describe en el presente documento, disuelto o dispersado en los mismos como principio activo. En algunos casos, la composición terapéutica no es sustancialmente inmunogénica cuando se administra a un mamífero o paciente humano con fines terapéuticos, a menos que se desee.

En general, las células progenitoras descritas en el presente documento se pueden administrar como una suspensión con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un experto en la materia reconocerá que un vehículo farmacéuticamente aceptable para usar en una composición celular no incluirá tampones, compuestos, agentes de crioconservación, conservantes u otros agentes en cantidades que interfieran sustancialmente con la viabilidad de las células que se van a administrar al sujeto. Una formulación que comprende células puede incluir, p. ej., tampones osmóticos que permiten mantener la integridad de la membrana celular y, opcionalmente, nutrientes para mantener la viabilidad celular o mejorar el injerto tras la administración. Los expertos en la materia conocen dichas formulaciones y suspensiones y/o pueden adaptarse para su uso con las células progenitoras, como se describe en el presente documento, usando experimentación de rutina.

Una composición celular también se puede emulsionar o presentar como una composición de liposomas, siempre que el procedimiento de emulsificación no afecte negativamente a la viabilidad celular. Las células, y cualquier otro principio activo, pueden mezclarse con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo y en cantidades adecuadas para su uso en los métodos terapéuticos descritos en el presente documento.

Los agentes adicionales incluidos en una composición celular pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables de los componentes de la misma. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del polipéptido) que se forman con ácidos inorgánicos, tal como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico o dichos ácidos orgánicos tales como acético, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también proceder de bases inorgánicas, tal como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino-etanol, histidina, procaína y similares.

En la técnica se conocen bien portadores fisiológicamente tolerables. Son ejemplos de portadores líquidos las soluciones acuosas estériles que no contienen materiales además de los principios activos y agua, o contienen un tampón tal como fosfato de sodio a un valor de pH fisiológico, solución salina fisiológica o ambos, tal como solución salina tamponada con fosfato. Más aún, los portadores acuosos pueden contener más de una sal tampón, así como sales tales como cloruro de sodio y de potasio, dextrosa, polietilenglicol y otros solutos. Las composiciones líquidas también pueden contener fases líquidas además de y excluyendo el agua. Son ejemplos de dichas fases líquidas adicionales glicerina, aceites vegetales tales como aceite de semilla de algodón y emulsiones de agua y aceite. La cantidad de un compuesto activo usado en las composiciones celulares descritas en el presente documento, que es eficaz en el tratamiento de un trastorno o afección particular, puede depender de la naturaleza del trastorno o afección, y puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar.

Formulación de ARN guía

Los ARN guía de la presente divulgación se pueden formular con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como portadores, disolventes, estabilizantes, adyuvantes, diluyentes, etc., dependiendo del modo de administración y de la forma farmacéutica particular. Las composiciones de ARN guía pueden formularse para lograr un pH fisiológicamente compatible, y varían de un pH de aproximadamente 3 a un pH de aproximadamente 11, de un pH de aproximadamente 3 a un pH de aproximadamente 7, dependiendo de la formulación y vía de administración. En algunos casos, el pH puede ajustarse a un intervalo de un pH de aproximadamente 5,0 a un pH de aproximadamente 8. En algunos casos, las composiciones pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un compuesto descrito en el presente documento, junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Opcionalmente, las composiciones pueden comprender una combinación de los compuestos descritos en el presente documento, o pueden incluir un segundo principio activo útil en el tratamiento o la prevención del crecimiento bacteriano (por ejemplo y sin limitación, agentes antibacterianos o antimicrobianos), o pueden incluir una combinación de reactivos de la presente divulgación.

Los excipientes adecuados incluyen, por ejemplo, moléculas portadoras que incluyen macromoléculas grandes de metabolización lenta, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros aminoacídicos y partículas víricas inactivas. Otros excipientes ilustrativos pueden incluir antioxidantes (por ejemplo y sin limitación, ácido ascórbico), agentes quelantes (por ejemplo y sin limitación, EDTA), hidratos de carbono (por ejemplo y sin limitación, dextrina, hidroxialquilcelulosa e hidroxialquilmetilcelulosa), ácido esteárico, líquidos (por ejemplo y sin limitación, aceites, agua, solución salina, glicerol y etanol), agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH y similares.

Administración

Los polinucleótidos de ARN guía y/o el /los polinucleótido(s) de endonucleasa pueden suministrarse mediante vehículos de suministro vírico o no vírico conocidos en la técnica. Como alternativa, el /los polinucleótido(s) de endonucleasa puede(n) suministrarse mediante vehículos de suministro vírico o no vírico conocidos en la técnica, tales como mediante electroporación o nanopartículas lipídicas. En otros aspectos alternativos, la endonucleasa de ADN puede suministrarse como uno o más polipéptidos, ya sea solo o formando complejos previos con uno o más ARN guía, o uno o más ARNcr junto con un ARNtracr.

Los polinucleótidos pueden suministrarse mediante vehículos de suministro no vírico, entre los que se incluyen, pero sin limitación, nanopartículas, liposomas, ribonucleoproteínas, péptidos con carga positiva, conjugados de ARN de molécula pequeña, quimeras de aptámero-ARN y complejos de proteínas de fusión y ARN. Algunos ejemplos de vehículos de suministro no vírico se describen en Peer y Lieberman, Gene Therapy, 18: 1127-1133 (2011) (que se centra en vehículos de suministro no vírico de ARNip que también son útiles para el suministro de otros polinucleótidos).

Para los polinucleótidos de la presente divulgación, la formulación puede seleccionarse de cualquiera de las enseñadas, por ejemplo, de la solicitud internacional PCT/US2012/069610.

Los polinucleótidos, tales como ARN guía, ARNgu y ARNm, que codifican una endonucleasa, pueden suministrarse a una célula o a un paciente a través de una nanopartícula lipídica (LNP,lipid nanoparticle).

Una LNP se refiere a cualquier partícula que tenga un diámetro inferior a 1000 nm, 500 nm, 250 nm, 200 nm, 150 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm o 25 nm. Como alternativa, el tamaño de una nanopartícula puede variar de 1-1000 nm, 1 500 nm, 1-250 nm, 25-200 nm, 25-100 nm, 35-75 nm o 25-60 nm.

Las LNP pueden estar hechas de lípidos catiónicos, aniónicos o neutros. Los lípidos neutros, tales como el fosfolípido fusogénico DOPE o el componente de membrana colesterol, pueden incluirse en las LNP como 'lípidos auxiliares' para mejorar la actividad de la transfección y la estabilidad de las nanopartículas. Las limitaciones de los lípidos catiónicos incluyen una baja eficacia debido a su escasa estabilidad y rápida deleción, así como la generación de respuestas inflamatorias o antiinflamatorias.

Las LNP también pueden comprender lípidos hidrófobos, lípidos hidrófilos, o lípidos tanto hidrófobos como hidrófilos.

Para producir una LNP puede utilizarse cualquier lípido o combinación de lípidos conocido en la técnica. Son ejemplos de lípidos utilizados para producir las LNP: DOTMA, DOSPA, DOTAP, DMRIE, DC-colesterol, DOTAP-colesterol, GAP-DMORIE-DPyPE y GL67A-DOPE-DMPE-polietilenglicol (PEG). Son ejemplos de lípidos catiónicos: 98N12-5, C12-200, DLin-KC2-DMA (KC2), DLin-MC3-DMA (MC3), XTC, MD1 y 7C1. Son ejemplos de lípidos neutros: DPSC, DPPC, POPC, DOPE y SM. Son ejemplos de lípidos modificados con PEG: PEG-DMG, PEG-CerC14 y PEG-CerC20.

Los lípidos pueden combinarse en cualquier cantidad de relaciones molares para producir una LNP. Además, el/los polinucleótido(s) puede(n) combinarse con uno o más lípidos en un amplio intervalo de relaciones molares para producir una LNP.

Como se indica previamente, el polipéptido dirigido al sitio y el ácido nucleico dirigido al genoma se pueden administrar por separado a una célula o a un paciente. Por otra parte, el polipéptido dirigido al sitio se puede complejar previamente con uno o más ARN guía, o uno o más ARNcr junto con un ARNtracr. El material formando complejos previos puede administrarse después a una célula o a un paciente. Este material formando complejos previos se conoce como partícula de ribonucleoproteína (RNP,ribonucleoprotein particle).

El ARN es capaz de formar interacciones específicas con el ARN o el ADN. Si bien esta propiedad se aprovecha en muchos procesos biológicos, también conlleva el riesgo de interacciones promiscuas en un entorno celular rico en ácidos nucleicos. Una solución a este problema es la formación de partículas de ribonucleoproteína (RNP), en donde el ARN se precompleja con una endonucleasa. Otro beneficio de la RNP es la protección del ARN contra la degradación.

La endonucleasa en la RNP puede ser modificada o no modificada. De manera análoga, el ARNg, ARNcr, ARNtracr o ARNgu puede ser modificado o no modificado. Se conocen numerosas modificaciones en la técnica y pueden utilizarse.

La endonucleasa y el ARNgu generalmente se pueden combinar en una proporción molar de 1:1. Como alternativa, la endonucleasa, el ARNcr y el ARNtracr se pueden combinar generalmente en una proporción molar de 1:1:1. Sin embargo, se puede utilizar una amplia gama de relaciones molares para producir un RNP.

AAV (dependoparvovirus)

Para la administración, puede utilizarse un vector de dependoparvovirus (AAV,adeno-associated virus)recombinante. Las técnicas para producir partículas rAAV, en las que el genoma AAV que se va a empaquetar que incluye el polinucleótido que se va a administrar, los genes rep y cap, y las funciones del virus ayudante se proporcionan a una célula son convencionales en la técnica. La producción de rAAV normalmente requiere que dentro de una célula individual (denominada en el presente documento célula empaquetadora) estén presentes los siguientes componentes: un genoma de rAAV, los genes rep y cap de AAV separados (es decir, no dentro) del genoma de rAAV y las funciones del virus auxiliar. Los genes rep y cap de AAV pueden ser de cualquier serotipo de AAV del cual se puedan obtener virus recombinantes, y pueden ser de un serotipo de AAV distinto de las ITR(inverted terminal repeats,repeticiones terminales invertidas) del genoma de rAAV, incluyendo, pero sin limitación, los serotipos de AAV descritos en el presente documento. La producción de rAAV pseudotipado se describe en, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 01/83692.

Serotipos de AAV

Partículas de AAV que empaquetan polinucleótidos que codifican composiciones de la presente divulgación, p. ej., endonucleasas, secuencias donantes, o moléculas de ARN guía, de la presente divulgación puede comprender o derivarse de cualquier serotipo de AAV natural o recombinante. De acuerdo con la presente divulgación, las partículas de AAV pueden utilizar o basarse en un serotipo seleccionado de cualquiera de los siguientes serotipos y variantes de los mismos, incluidos, aunque no de forma limitativa, AAV1, AAV10, AAV106.1/hu.37, AAV11, AAV114.3/hu.40, AAV12, AAV127.2/hu.41, AAV127.5/hu.42, AAV128.1/hu.43, AAV128.3/hu.44, AAV130.4/hu.48, AAV145.1/hu.53, AAV145.5/hu.54, AAV145.6/hu.55, AAV16.12/hu.11, AAV16.3, AAV16.8/hu.10, AAV161.10/hu.6O, AAV161.6/hu.61, AAVl-7/rh.48, AAVl-8/rh.49, AAV2, AAV2.5T, AAV2-15/rh.62, AAV223.1, AAV223.2, AAV223.4, AAV223.5, AAV223.6, AAV223.7, AAV2- 3/rh.61, AAV24.1, AAV2-4/rh.50, AAV2-5/rh.51, AAV27.3, AAV29.3/bb.1, AAV29.5/bb.2, AAV2G9, AAV-2-miARN pre-101, AAV3, AAV3.1/hu.6, AAV3.1/hu.9, AAV3-11/rh.53, AAV3-3, AAV33.12/hu.17, AAV33.4/hu.15, AAV33.8/hu.16, AAV3-9/rh.52, AAV3a, AAV3b, AAV4, AAV4-19/rh.55, AAV42.12, AAV42-10, AAV42-11, AAV42-12, AAV42-13, AAV42-15, AAV42-lb, AAV42-2, AAV42-3a, AAV42-3b, AAV42-4, AAV42-5a, AAV42-5b, AAV42-6b, AAV42-8, AAV42-aa, AAV43-1, AAV43-12, AAV43-20, AAV43-21, AAV43-23, AAV43-25, AAV43-5, AAV4-4, AAV44.1, AAV44.2, AAV44.5, AAV46.2/hu.28, AAV46.6/hu.29, AAV4-8/r11.64, AAV4-8/rh.64, AAV4-9/rh.54, AAV5, AAV52.1/hu.20, AAV52/hu.19, AAV5-22/rh.58, AAV5-3/rh.57, AAV54.1/hu.21, AAV54.2/hu.22, AAV54.4R/hu.27, AAV54.5/hu.23, AAV54.7/hu.24, AAV58.2/hu.25, AAV6, AAV6.1, AAV6.1.2, AAV6.2, AAV7, AAV7.2, AAV7.3/hu.7, AAV8, AAV-8b, AAV-8h, AAV9, AAV9.11, AAV9.13, AAV9.16, AAV9.24, AAV9.45, AAV9.47, AAV9.61, AAV9.68, AAV9.84, AAV9.9, AAVA3.3, AAVA3.4, AAVA3.5, AAVA3.7, AAV-b, AAVC1, AAVC2, AAVC5, AAVCh.5, AAVCh.5Rl, AAVcy.2, AAVcy.3, AAVcy.4, AAVcy.5, AAVCy.5Rl, AAVCy.5R2, AAVCy.5R3, AAVCy.5R4, AAVcy.6, AAV-DJ, AAV-DJ8, AAVF3, AAVF5, AAV-h, AAVH-l/hu.l, AAVH2, AAVH-5/hu.3, AAVH6, AAVhEl.l, AAVhER1.14, AAVhEr1.16, AAVhEr1.18, AAVhER1.23, AAVhEr1.35, AAVhEr1.36, AAVhEr1.5, AAVhEr1.7, AAVhEr1.8, AAVhEr2.16, AAVhEr2.29, AAVhEr2.30, AAVhEr2.31, AAVhEr2.36, AAVhEr2.4, AAVhEr3.1, AAVhu.1, AAVhu.10, AAVhu.11, AAVhu.11, AAVhu.12, AAVhu.13, AAVhu.14/9, AAVhu.15, AAVhu.16, AAVhu.l7, AAVhu.18, AAVhu.19, AAVhu.2, AAVhu.20, AAVhu.21, AAVhu.22, AAVhu.23.2, AAVhu.24, AAVhu.25, AAVhu.27, AAVhu.28, AAVhu.29, AAVhu.29R, AAVhu.3, AAVhu.31, AAVhu.32, AAVhu.34, AAVhu.35, AAVhu.37, AAVhu.39, AAVhu.4, AAVhu.40, AAVhu.41, AAVhu.42, AAVhu.43, AAVhu.44, AAVhu.44Rl, AAVhu.44R2, AAVhu.44R3, AAVhu.45, AAVhu.46, AAVhu.47, AAVhu.48, AAVhu.48Rl, AAVhu.48R2, AAVhu.48R3, AAVhu.49, AAVhu.5, AAVhu.51, AAVhu.52, AAVhu.53, AAVhu.54, AAVhu.55, AAVhu.56, AAVhu.57, AAVhu.58, AAVhu.6, AAVhu.60, AAVhu.61, AAVhu.63, AAVhu.64, AAVhu.66, AAVhu.67, AAVhu.7, AAVhu.8, AAVhu.9, AAVhu.t 19, AAVLG-10/rh.40, AAVLG-4/rh.38, AAVLG-9/hu.39, AAVLG-9/hu.39, AAV-LK01, AAV-LK02, AAVLK03, AAV-LK03, AAV-LK04, AAV-LK05, AAV-LK06, AAV-LK07, AAV-LK08, AAV-LK09, AAV-LK10, AAV-LK11, AAV-LK12, AAV-LK13, AAV-LK14, AAV-LK15, AAV-LK17, AAV-LK18, AAV-LK19, AAVN721-8/rh.43, AAV-PAEC, AAV-PAEC11, AAV-PAEC12, AAV-PAEC2, AAV-PAEC4, AAV-PAEC6, AAV-PAEC7, AAV-PAEC8, AAVpi.l, AAVpi.2, AAVpi.3, AAVrh.10, AAVrh.12, AAVrh.13, AAVrh.13R, AAVrh.14, AAVrh.17, AAVrh.18, AAVrh.19, AAVrh.2, AAVrh.20, AAVrh.21, AAVrh.22, AAVrh.23, AAVrh.24, AAVrh.25, AAVrh.2R, AAVrh.31, AAVrh.32, AAVrh.33, AAVrh.34, AAVrh.35, AAVrh.36, AAVrh.37, AAVrh.37R2, AAVrh.38, AAVrh.39, AAVrh.40, AAVrh.43, AAVrh.44, AAVrh.45, AAVrh.46, AAVrh.47, AAVrh.48, AAVrh.48, AAVrh.48.1, AAVrh.48.1.2, AAVrh.48.2, AAVrh.49, AAVrh.50, AAVrh.51, AAVrh.52, AAVrh.53, AAVrh.54, AAVrh.55, AAVrh.56, AAVrh.57, AAVrh.58, AAVrh.59, AAVrh.60, AAVrh.61, AAVrh.62, AAVrh.64, AAVrh.64Rl, AAVrh.64R2, AAVrh.65, AAVrh.67, AAVrh.68, AAVrh.69, AAVrh.70, AAVrh.72, AAVrh.73, AAVrh.74, AAVrh.8, AAVrh.8R, AAVrh8R, mutante A586R de AAVrh8R, mutante R533A de AAVrh8R, BAAV, AAV BNP61, AAV BNP62, AAV BNP63, AAV bovino, AAV caprino, AAV 10 japonés, AAV de tipo verdadero (ttAAV), UPENN AAV 10, AAV-LK16, AAAV, AAV aleatorio 100-1, AAV aleatorio 100 2, AAV aleatorio 100-3, AAV aleatorio 100-7, AAV aleatorio 10-2, AAV aleatorio 10-6, AAV aleatorio 10-8, AAV SM 100-10, AAV SM 100-3, AAV SM 10-1, AAV SM 10-2 y/o AAV SM 10-8.

En algunos aspectos, el serotipo AAV puede ser, o tener, una mutación en la secuencia de AAV9 como se describe em N Pulicherlaet al.(Molecular Therapy 19(6): 1070-1078 (2011)), tales como, pero sin limitación, AAV9.9, AAV9.11, AAV9.13, AAV9.16, AAV9.24, AAV9.45, AAV9.47, AAV9.61, AAV9.68, AAV9.84.

En algunos aspectos, el serotipo AAV puede ser, o tener, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 6156303, tal como, pero sin limitación, AAV3B (S<e>Q ID NO: 1 y 10 del documento U.S. 6156303), AAV6 (SEQ ID NO: 2, 7 y 11 del documento U.S. 6156303), AAV2 (SEQ ID NO: 3 y 8 del documento U.S. 6156303), AAV3A (SEQ ID NO: 4 y 9, del documento U.S. 6156303) o derivados de los mismos.

En algunos aspectos, el serotipo puede ser AAVDJ o una variante del mismo, tal como AAVDJ8 (o AAV-DJ8), como lo describen Grimmet al.(Journal of Virology 82(12): 5887-5911 (2008)). La secuencia de aminoácidos de AAVDJ8 puede comprender dos o más mutaciones para eliminar el dominio de unión de heparina (HBD). Como un ejemplo no limitativo, la secuencia AAV-DJ descrita como SEQ ID NO: 1 en la patente de EE. UU. n.° 7.588.772, puede comprender dos mutaciones: (1) R587Q donde la arginina (R; Arg) en el aminoácido 587 se cambia a glutamina (Q; Gln) y (2) R590T donde la arginina (R; Arg) en el aminoácido 590 se cambia a treonina (T; Thr). Como otro ejemplo no limitativo, puede comprender tres mutaciones: (1) K406R donde la lisina (K; Lys) en el aminoácido 406 se cambia a arginina (R; Arg), (2) R587Q donde la arginina (R; Arg) en el aminoácido 587 se cambia a glutamina (Q; Gln) y (3) R590T donde la arginina (R; Arg) en el aminoácido 590 se cambia a treonina (T; Thr).

En algunos aspectos, el serotipo AAV puede ser, o tener, una secuencia como se describe en la publicación Internacional n.° WO2015121501, tal como, pero sin limitación, AAV de tipo verdadero (ttAAV) (SEQ ID NO: 2 del documento WO2015121501), "UPenn AAV10" (SEQ ID NO: 8 del documento WO2015121501), "AAV10 japonés" (SEQ ID NO: 9 del documento WO2015121501) o variantes del mismo.

De acuerdo con la presente divulgación, la selección o el uso del serotipo de la cápside de AAV puede realizarse a partir de una variedad de especies. En un ejemplo, el AAV puede ser un AAV aviar (AAAV). El serotipo AAAV puede ser, o tener, como se describe en la patente de Ee . UU. n.° 9238800, tal como, pero sin limitación, AAAV (SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14 del documento U.S. 9.238.800) o variaciones del mismo.

En un ejemplo, el AAV puede ser un AAV bovino (BAAV). El serotipo BAAV puede ser, o tener, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 9193769, tal como, pero sin limitación, BAAV (Se Q ID NO: 1 y 6 del documento U.S.

9193769) o variantes del mismo. El serotipo BAAV puede ser o tener una secuencia como la descrita en la patente de EE. UU. N.° U.S.7427396, tal como, pero sin limitación, BAAV (SEQ ID NO: 5 y 6 del documento U.S.7427396) o variantes del mismo.

En un ejemplo, el AAV puede ser un AAV caprino. El serotipo AAV caprino puede ser, o tener, una secuencia como la descrita en la patente de EE. UU. n.° 7427396, tal como, pero sin limitación, AAV caprino (SEQ ID NO: 3 del documento U.S.7427396) o variantes del mismo.

En otros ejemplos, el AAV puede diseñarse como un AAV híbrido a partir de dos o más serotipos parentales. En un ejemplo, el AAV puede ser AAV2G9, que comprende secuencias de AAV2 y AAV9. El serotipo AAV2G9 AAV puede ser, o tener, una secuencia como se describe en la publicación de patente de EE. UU. n.° 20160017005.

En un ejemplo, el AAV puede ser un serotipo generado por la biblioteca de la cápside AAV9 con mutaciones en los aminoácidos 390-627 (numeración VP1) como lo describen Pulicherlaet al.(Molecular Therapy 19(6): 1070-1078 (2011). El serotipo y las sustituciones de nucleótidos y aminoácidos correspondientes pueden ser, aunque no de forma limitativa, AAV9.1 (G1594C; D532H), AAV6.2 (T1418A y T1436X; V473D y I479K), AAV9.3 (T1238A; F413Y), AAV9.4 (T1250C y A1617T; F417S), AAV9.5 (A1235G, A1314T, A1642G, C1760T; Q412R, T548A, A587V), AAV9.6 (T1231A; F411I), AAV9.9 (G1203A, G1785T; W595C), AAV9.10 (A1500G, T1676C; M559T), AAV9.11 (A1425T, A1702C, A1769T; T568P, Q590L), AAV9.13 (A1369C, A1720T; N457H, T574S), AAV9.14 (T1340A, T1362C, T1560C, G1713A; L447H), AAV9.16 (A1775T; Q592L), AAV9.24 (T1507C, T1521G; W503R), AAV9.26 (A1337G, A1769C; Y446C, Q590P), AAV9.33 (A1667C; D556A), AAV9.34 (A1534G, C1794T; N512D), AAV9.35 (A1289T, T1450A, C1494T, A1515T, C1794A, G1816A; Q430L, Y484N, N98K, V606I), AAV9.40 (A1694T, E565V), AAV9.41 (A1348T, T1362C; T450S), AAV9.44 (A1684C, A1701T, A1737G; N562H, K567N), AAV9.45 (A1492T, C1804T; N498Y, L602F), AAV9.46 (G1441C, T1525C, T1549G; G481R, W509R, L517V), 9,47 (G1241A, G1358A, A1669G, C1745T; S414N, G453D, K557E, T582I), AAV9.48 (C1445T, A1736T; P482L, Q579L), AAV9.50 (A1638T, C1683T, T1805A; Q546H, L602H), AAV9.53 (G1301A, A1405C, C1664T, G1811T; R134Q, S469R, A555V, G604V), AAV9.54 (C1531A, T1609A; L511I, L537M), AAV9.55 (T1605A; F535L), AAV9.58 (C1475T, C1579A; T492I, H527N), AAV.59 (T1336C; Y446H), AAV9.61 (A1493T; N498I), AAV9.64 (0531A, A1617T; L511I), AAV9.65 (C1335T, T1530C, C1568A; A523D), AAV9.68 (C1510A; P504T), AAV9.80 (G1441A,;G481R), AAV9.83 (C1402A, A1500T; P468T, E500D), AAV9.87 (T1464C, T1468C; S490P), AAV9.90 (A1196T; Y399F), AAV9.91 (T1316G, A1583T, C1782G, T1806C; L439R, K528I), AAV9.93 (A1273G, A1421G, A1638C, C1712T, G1732A, A1744T, A1832T; S425G, Q474R, Q546H, P571L, G578R, T582S, D611V), AAV9.94 (A1675T; M559L) y AAV9.95 (T1605A; F535L).

En un ejemplo, el AAV puede ser un serotipo que comprende al menos un epítopo de linfocito T CD8+ de la cápside del AAV. Como un ejemplo no limitativo, el serotipo puede ser AAV1, AAV2 o AAV8.

En un ejemplo, el AAV puede ser una variante, tal como PHP.A o PHP.B como se describe en Deverman. 2016. Nature Biotechnology. 34(2): 204-209.

En un ejemplo, el AAV puede ser un serotipo seleccionado de cualquiera de los que se encuentran en las SEQ ID NO: 4734-5302 y la Tabla 2.

En un ejemplo, el AAV puede estar codificado por una secuencia, fragmento o variante como se describe en SEQ ID NO: 4734-5302 y la Tabla 2.

Los principios generales de la producción de rAAV se revisan en, por ejemplo, Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; y Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129). Se describen diferntes enfoques en Ratschinet al.,Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonatet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 81:6466 (1984); Tratschinet al.,Mol. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlinet al.,J. Virol., 62:1963 (1988); y Lebkowskiet al.,1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulskiet al.(1989, J. Virol., 63:3822-3828); la patente de EE.UU. n.° 5.173.414; Documento WO 95/13365 y la patente de EE. UU. n.° 5,658,776 correspondiente; documentos WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrinet al.(1995) Vaccine 13:1244-1250; Paulet al.(1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clarket al.(1996) Gene Therapy 3:1124-1132; patente de EE. UU. n.° 5.786.211; la patente de EE. UU. n.° 5.871.982; y patente de EE. UU. n. 6.258.595.

Los serotipos del vector de AAV pueden coincidir con los tipos de células diana. Por ejemplo, los siguientes tipos de células ilustrativas pueden ser transducidos por los serotipos de AAV indicados, entre otros.

T l 2. Ti i l l r i

continuación

Además de los vectores de dependoparvovirus, se pueden utilizar otros vectores víricos. Estos vectores víricos incluyen, pero sin limitación, lentivirus, alfavirus, enterovirus, pestivirus, baculovirus, herpesvirus, virus de Epstein Barr, papovavirus, poxvirus, virus variolovacunal y virus del herpes simple.

En algunos aspectos, el ARNm de Cas9, el ARNgu dirigido a uno o dos sitios en el gen FXN y el ADN donante pueden formularse por separado en nanopartículas lipídicas, o pueden coformularse todos en una nanopartícula lipídica.

En algunos aspectos, el ARNm de Cas9 se puede formular en una nanopartícula lipídica, mientras que el ARNgu y el ADN donante se pueden administrar en un vector de AAV.

Hay opciones disponibles para administrar la nucleasa Cas9 como un plásmido de ADN, como ARNm o como proteína. El ARN guía puede expresarse a partir del mismo ADN o también puede administrarse como ARN. El ARN se puede modificar químicamente para alterar o mejorar su semivida o disminuir la probabilidad o el grado de respuesta inmunitaria. La proteína endonucleasa se puede combinar con el ARNg antes de su administración. Los vectores víricos permiten una distribución eficaz; versiones divididas de Cas9 y ortólogos más pequeños de Cas9 se pueden empaquetar en AAV, al igual que los donantes para el HDR. También existe una variedad de métodos de administración no víricos que pueden administrar cada uno de estos componentes, o se pueden emplear métodos víricos y no víricos en conjunto. Por ejemplo, se pueden utilizar nanopartículas para administrar la proteína y guiar el ARN, mientras que el AAV se puede utilizar para suministrar ADN de un donante.

IV. DOSIFICACIÓN Y ADMINISTRACIÓN

Los términos "administrar", "introducción" y "trasplante" se usan indistintamente en el contexto de la colocación de células, p. ej., células progenitoras, en un sujeto, mediante un método o una vía que suponga la ubicación, al menos parcial, de las células introducidas en un lugar deseado, tal como un lugar de lesión o reparación, de manera que se produzcan los efectos deseados. Las células, p. ej., las células progenitoras, o su progenie diferenciada, pueden administrarse mediante cualquier vía apropiada que suponga un suministro a una ubicación deseada en el sujeto donde al menos una parte de las células o componentes de las células implantadas permanecen viables. El período de viabilidad de las células después de su administración a un sujeto, puede ser tan corto como de algunas horas, p. ej., veinticuatro horas, a algunos días, hasta varios años, o incluso toda la vida del paciente, es decir, un injerto de larga duración. Por ejemplo, en algunos aspectos descritos en el presente documento, se debe administrar una cantidad eficaz de células progenitoras neuronales mediante una vía de administración sistémica, tal como una vía intraperitoneal o intravenosa.

Los términos "individuo", "sujeto", "anfitrión" y "paciente" se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a cualquier sujeto para quien se desea un diagnóstico, tratamiento o terapia. En algunos aspectos, el sujeto es un mamífero. En algunos aspectos, el sujeto es un ser humano.

Cuando se proporcionan de manera profiláctica, las células progenitoras descritas en el presente documento se pueden administrar a un sujeto antes de que aparezca cualquier síntoma de ataxia de Friedreich. Por consiguiente, la administración profiláctica de una población de células progenitoras sirve para prevenir la ataxia de Friedreich.

Una población de células progenitoras puede comprender células progenitoras alogénicas obtenidas de uno o más donantes. Dichos progenitores pueden ser de cualquier origen celular o tisular, p. ej., hígado, músculo, cardíaca, cerebro, etc. "alogénico" se refiere a una célula progenitora o muestras biológicas que comprenden células progenitoras obtenidas de uno o más donantes diferentes de la misma especie, donde los genes en uno o más loci no son idénticos. Por ejemplo, una población de células progenitoras del hígado que se administra a un sujeto puede derivar de uno o más sujetos donantes no relacionados, o de uno o más hermanos no idénticos. En algunos casos, se pueden utilizar poblaciones de células progenitoras singénicas, tales como las obtenidas de animales genéticamente idénticos o de gemelos idénticos. Las células progenitoras pueden ser células autólogas; es decir, las células progenitoras se obtienen o se aíslan de un sujeto y se administran al mismo sujeto, es decir, el donante y el receptor son el mismo.

La expresión "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad de una población de células progenitoras o su progenie necesaria para prevenir o aliviar al menos uno o más signos o síntomas de la ataxia de Friedreich, y se relaciona con una cantidad suficiente de una composición para proporcionar el efecto deseado, p. ej., para tratar a un paciente con ataxia de Friedreich. Por lo tanto, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de células progenitoras o una composición que comprende células progenitoras que es suficiente para promover un efecto particular cuando se administra a un sujeto típico, tal como alguien que padece o está en riesgo de padecer ataxia de Friedreich. Una cantidad eficaz también incluiría una cantidad suficiente para prevenir o retrasar el desarrollo de un síntoma de la enfermedad, alterar el curso de un síntoma de la enfermedad (por ejemplo, pero sin limitación, ralentizar la progresión de un síntoma de la enfermedad) o invertir un síntoma de la enfermedad. Se entiende que para cualquier caso dado, puede determinarse una "cantidad eficaz" adecuada por un experto habitual en la materia usando experimentación rutinaria.

Para usar en los diversos aspectos descritos en el presente documento, una cantidad eficaz de células progenitoras comprende al menos 102 células progenitoras, al menos 5 x 102 células progenitoras, al menos 103 células progenitoras, al menos 5 x 103 células progenitoras, al menos 104 células progenitoras, al menos 5 x 104 células progenitoras, al menos 105 células progenitoras, al menos 2 x 105 células progenitoras, al menos 3 x 105 células progenitoras, al menos 4 x 105 células progenitoras, al menos 5 x 105 células progenitoras, al menos 6 x 105 células progenitoras, al menos 7 x 105 células progenitoras, al menos 8 x 105 células progenitoras, al menos 9 x 105 células progenitoras, al menos 1 x 106 células progenitoras, al menos 2 x 106 células progenitoras, al menos 3 x 106 células progenitoras, al menos 4 x 106 células progenitoras, al menos 5 x 106 células progenitoras, al menos 6 x 106 células progenitoras, al menos 7 x 106 células progenitoras, al menos 8 x 106 células progenitoras, al menos 9 x 106 células o múltiplos de las mismas. Las células progenitoras pueden derivar de uno o más donantes o pueden obtenerse de una fuente autóloga. En algunos ejemplos descritos en el presente documento, las células progenitoras pueden ampliarse en cultivo antes de su administración a un sujeto que lo necesite.

En algunos aspectos, la reducción de las repeticiones trinucleotídicas ampliadas en el gen FXN en células de pacientes con ataxia de Friedreich puede ser beneficiosa para mejorar uno o más síntomas de la enfermedad, para aumentar la supervivencia a largo plazo y/o para reducir los efectos secundarios asociados con otros tratamientos. Tras la administración de dichas células a pacientes humanos, la presencia de progenitores que tienen niveles de repetición trinucleotídica de tipo natural o similares en el gen FXN es beneficiosa. En algunos casos, el tratamiento eficaz de un sujeto da lugar a al menos aproximadamente un 3 %, 5 % o 7 % de transcripciones que tienen niveles de repetición trinucleotídica de tipo natural o similares en relación con las transcripciones de FXN totales en el sujeto tratado. En algunos ejemplos, las transcripciones que tienen niveles de repetición trinucleotídica de tipo natural o similares representarán al menos aproximadamente el 10% del total de transcripciones de FXN. En algunos ejemplos, las transcripciones que tienen niveles de repetición trinucleotídica de tipo natural o similares representarán al menos entre el 20 % y el 30 % del total de transcripciones de FXN. De manera similar, la introducción de subpoblaciones incluso relativamente limitadas de células que tengan niveles de repetición trinucleotídica de tipo natural en el gen FXN puede ser beneficiosa en varios pacientes porque en algunas situaciones las células normalizadas tendrán una ventaja selectiva en relación con las células enfermas. Sin embargo, incluso niveles moderados de progenitores con niveles de repetición trinucleotídica de tipo natural o similares en el gen FXN pueden ser beneficiosos para mejorar uno o más aspectos de la ataxia de Friedreich en pacientes. En algunos ejemplos, aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 % o más de los progenitores neuronales en pacientes a quienes se les administrarán dichas células tienen niveles de repetición trinucleotídica de tipo natural o similares en el gen FXN.

El término "administrado" se refiere a la administración de una composición de células progenitoras a un sujeto mediante un método o vía que dé lugar a la localización, al menos parcial, de la composición celular en un lugar deseado. Una composición celular puede administrarse por cualquier vía adecuada que dé lugar a un tratamiento eficaz en el sujeto, es decir, la administración da como resultado la administración a una ubicación deseada en el sujeto donde se administra al menos una parte de la composición, es decir, al menos 1 x 104 células se administran al sitio deseado durante un período de tiempo.

En un aspecto, la composición farmacéutica puede administrarse a través de una vía tal como, pero sin limitación, enteral (en el intestino), gastroenteritis, epidural (en la duramadre), oral (por vía oral), transdérmica, peridural, intracerebral (dentro del cerebro), intracerebroventricular (hacia los ventrículos cerebrales), epicutánea (aplicación sobre la piel), intradérmica, (en la propia piel), subcutánea (debajo de la piel), administración nasal (a través de la nariz), intravenosa (en una vena), bolo intravenoso, goteo intravenoso, intraarterial (dentro de una arteria), intramuscular (en un músculo), intracardíaca (dentro del corazón), infusión intraósea (en la médula ósea), intratecal (en el canal espinal), intraperitoneal, (infusión o inyección en el peritoneo), infusión intravesical, intravítrea, (a través del ojo), inyección intracavernosa (en una cavidad patológica) intracavitaria (en la base del pene), administración intravaginal, intrauterina, administración extraamniótica, transdérmica (difusión a través de la piel intacta para distribución sistémica), transmucosa (difusión a través de una membrana mucosa), transvaginal, insuflación (resoplar), sublingual, sublabial, enema, gotas para los ojos (sobre la conjuntiva), en gotas óticas, auricular (en o a través del oído), bucal (dirigida hacia la mejilla), conjuntiva, cutánea, dental (a un diente o dientes), electroósmosis, endocervicouterina, endosinusal, endotraqueal, extracorpórea, por hemodiálisis, infiltración, intersticial, intraabdominal, intraamniótica, intraarticular, intrabiliar, intrabronquial, intrabursal, intracartilaginosa (dentro de un cartílago), intracaudal (dentro de la cola de caballo), intracisternal (dentro del cistema magnacerebelomedular), intracorneal (dentro de la córnea), intracomal dental, intracoronaria (dentro de las arterias coronarias), intracorporus cavernoso (dentro de los espacios dilatables de los cuerpos cavernosos del pene), intradiscal (dentro de un disco), intraductal (dentro de un conducto de una glándula), intraduodenal (dentro del duodeno), intradural (dentro o debajo de la duramadre), intraepidérmica (a la epidermis), intraesofágica (en el esófago), intragástrica (dentro del estómago), intragingival (dentro de la encía), intraileal (dentro de la parte distal del intestino delgado), intralesional (dentro o introducida directamente en una lesión localizada), intraluminal (dentro de una luz de un tubo), intralinfática (dentro de la linfa), intramedular (dentro de la cavidad medular de un hueso), intrameníngea (dentro de las meninges), intramiocárdica (dentro del miocardio), intraocular (dentro del ojo), intraovárica (dentro del ovario), intrapericárdica (dentro del pericardio), intrapleural (dentro de la pleura), intraprostática (dentro de la glándula prostática), intrapulmonar (dentro de los pulmones o sus bronquios), intrasinal (dentro de los senos nasales o periorbitales), intraespinal (dentro de la columna vertebral), intrasinovial (dentro de la cavidad sinovial de una articulación), intratendinosa (dentro de un tendón), intratesticular (dentro del testículo), intratecal (dentro del líquido cefalorraquídeo a cualquier nivel del eje cefalorraquídeo), intratorácica (dentro del tórax), intratubular (dentro de los túbulos de un órgano), intratumoral (dentro de un tumor), intratimpánica (dentro del auro medio), intravascular (dentro de uno o varios vasos), intraventricular (dentro de un ventrículo), ionoforesis (mediante corriente eléctrica donde los iones de sales solubles migran a los tejidos del cuerpo), irrigación (para bañar o enjuagar heridas abiertas o cavidades corporales), laríngea (directamente sobre la laringe), nasogástrica (a través de la nariz hasta el estómago), técnica de vendaje oclusivo (administración por vía tópica, que luego se cubre con un vendaje que ocluye la zona), oftálmica (en el ojo externo), orofaríngea (directamente en la boca y la faringe), parenteral, percutánea, periarticular, peridural, perineural, periodontal, rectal, respiratoria (dentro del tubo respiratorio por inhalación oral o nasal para efecto local o sistémico), retrobulbar (detrás del puente o detrás del globo ocular), intramiocárdica (que entra en el miocardio), tejido blando, subaracnoidea, subconjuntival, submucosa, tópica, transplacentaria (a través de la placenta), transtraqueal (a través de la pared de la tráquea), transtimpánica (a través de la cavidad timpánica), ureteral (al uréter), uretral (a la uretra), vaginal, bloqueo caudal, diagnóstica, bloqueo nervioso, perfusión biliar, perfusión cardíaca, fotoféresis y raquídea.

Los modos de administración pueden incluir inyección, infusión, instilación y/o ingestión. "Inyección" incluye, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, intracerebroespinal e inyección e infusión intraesternal. En algunos ejemplos, la vía es intravenosa. Para la administración de células, la administración puede realizarse mediante inyección o infusión.

Las células pueden administrarse por vía sistémica. Las expresiones "administración sistémica", "administrado/a por vía sistémica", "administración periférica" y "administrado periféricamente" se refieren a la administración de una población de células progenitoras de forma distinta a la directa en un sitio diana, un tejido o un órgano, tal que entra, en cambio, al sistema circulatorio del sujeto y, por tanto, se somete al metabolismo y otros procesos similares.

La eficacia de un tratamiento que comprende una composición para el tratamiento de la ataxia de Friedreich puede ser determinada por el médico experto. Sin embargo, un tratamiento se considera "tratamiento eficaz", si alguno o todos los signos o síntomas de, como un solo ejemplo, los niveles de repetición trinucleotídica en el gen FXN se alteran de manera beneficiosa (p. ej., se reducen al menos en un 10 %), o se mejoran o mejoran otros síntomas o marcadores de enfermedad clínicamente aceptados. La eficacia también puede medirse mediante la incapacidad de un individuo para empeorar según la evaluación de la hospitalización o la necesidad de intervenciones médicas (p. ej., la progresión de la enfermedad se detiene o al menos se ralentiza). Los expertos en la materia conocen métodos para medir estos indicadores y/o se describen en el presente documento. El tratamiento incluye cualquier tratamiento de una enfermedad en un individuo o un animal (algunos ejemplos no limitativos incluyen un ser humano o un mamífero) e incluye: (1) inhibir la enfermedad, p. ej., detener o ralentizar la progresión de los síntomas; o (2) aliviar la enfermedad, p. ej., provocando regresión de los síntomas; y (3) prevenir o reducir la probabilidad de desarrollo de los síntomas.

El tratamiento de acuerdo con la presente divulgación puede mejorar uno o más síntomas asociados con la ataxia de Friedreich al reducir el número de repeticiones trinucleotídicas en el gen FXN en el individuo.

V. CARACTERÍSTICAS Y PROPIEDADES DEL GEN DE FRATAXINA (FXN)

El FXN se ha asociado con enfermedades y trastornos tales como, pero sin limitación, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, apraxias, ataxia, telangiectasia ataxia, ataxias hereditarias, síndrome de Bloom, neoplasias cerebrales, tumor maligno del colon, miocardiopatía dilatada, miocardiopatía hipertrófica, ataxia cerebelosa, fibrosis quística, Diabetes, diabetes mellitus, diabetes mellitus no insulinodependiente, disartria, distonía, síndrome del cromosoma X frágil, ataxia de Friedreich, cardiopatías, cardiomegalia, hemocromatosis, infecciones por herpes simple, enfermedad de Huntington, heoplasias hepáticas, enfermedad de Machado-Joseph, enfermedades metabólicas, infarto de miocardio, distrofia miotónica, trastorno del sistema nervioso, neuroblastoma, enfermedades neuromusculares, palor, enfermedad de Parkinson, neuropatía periférica, deficiencia de proteínas, síndrome de las piernas inquietas, esquizofrenia, escoliosis no especificada, paraplejia espástica hereditaria, ataxia espinocerebelosa, hipertrofia ventricular izquierda, neuropatía sensorial, progresión del tumor, síntomas neurológicos, fibrilación auricular paroxística, hipoalbuminemia, tolerancia alterada a la glucosa, sobrecarga de hierro, adenocarcinoma de colon, agotamiento del ADN mitocondrial, hipertrofia del tabique ventricular, neoplasia maligna de próstata, hemocromatosis hereditaria, trastornos de distonía, distrofia miotónica congénita, espasticidad, trastornos neurodegenerativos, escoliosis congénita, carcinoma de colon, neuroblastoma central, escoliosis adquirida, síntoma cardíaco, ataxia apendicular, enfermedades mitocondriales, trastornos del sistema nervioso heredodegenerativo, ataxia espinocerebelosa de tipo 1, miocardiopatías, deficiencia de ceruloplasmina, miocardiopatía hipertrófica familiar, trastorno degenerativo, titubeo de cabeza, trastorno no neoplásico, atrofia bulboespinal ligada al cromosoma X, síndrome de temblor/ataxia del cromosoma X frágil, ataxia de Friedreich con reflejos retenidos, ataxia con deficiencia de Vitamina E, ataxia espinocerebelosa autosómica recesiva 1, ataxia de Friedreich 1, trastorno neurodegenerativo hereditario y paraplejía espástica de tipo 7. La reescritura del gen FXN como se define en las reivindicaciones utilizando cualquiera de los métodos descritos en el presente documento se puede utilizar para tratar, prevenir y/o mitigar los síntomas de las enfermedades y trastornos descritos en el presente documento.

La frataxina es una chaperona de hierro mitocondrial que se considera importante para el procesamiento del hierro y el azufre. Esta proteína se encuentra en todo el cuerpo humano, pero está enriquecida en el corazón, médula espinal, hígado, páncreas y músculos. Las ampliaciones de una región de repetición trinucleotídica GAA en el gen FXN y la posterior deficiencia de proteína frataxina, provoca la ataxia de Friedreich. La región de repetición GAA está ubicada en el medio de un elemento Alu en el primer intrón del gen FXN. En la mayoría de las personas, el número de repeticiones GAA en el gen FXN es inferior a 12. Se dice que los individuos con 12-33 repeticiones GAA ininterrumpidas son asintomáticos. Sin embargo, como estas repeticiones son inestables y es muy probable que se amplíen durante la meiosis, estas personas corren el riesgo de tener hijos afectados. En las personas con ataxia de Friedreich, el segmento GAA se repite anormalmente entre 66 y más de 1000 veces. El número de repeticiones en el gen se correlaciona con la edad de aparición y la gravedad de la enfermedad. Las personas con repeticiones de GAA menores de 300 copias tienden a tener una aparición más tardía de los síntomas (después de los 25 años) que aquellos con repeticiones trinucleotídicas GAA mayores. La ampliación anormal de repeticiones provoca un defecto en el procesamiento del ARN, lo que conduce a una desregulación de la traducción y a una reducción de la cantidad de la proteína FXN en las células.

La ataxia de Friedreich generalmente se diagnostica en la primera o segunda década y afecta a 1 de cada 50.000 personas en los Estados Unidos. La ataxia de Friedreich es un trastorno progresivo del movimiento que se caracteriza por la pérdida de fuerza y sensibilidad, rigidez muscular y alteración del habla. Las personas con ataxia de Friedreich también pueden tener miocardiopatía, diabetes, pérdida de visión o audición y/o escoliosis. Actualmente no existe tratamiento para la ataxia de Friedreich, solo el control de los síntomas.

El gen FXN también está asociado con una serie de otros trastornos, incluida la ataxia hereditaria, anemia sideroblástica ligada al cromosoma X con ataxia, tabes dorsal, degeneración espinocerebelosa, neurosífilis terciaria, una transferrinemia, ataxia espinocerebelosa, escoliosis, hemocromatosis, síndrome del cromosoma X frágil, trastornos mitocondriales y miocardiopatía.

En un ejemplo, el tejido diana para las composiciones y los métodos descritos en el presente documento es el tejido del sistema nervioso central.

En un ejemplo, el gen es Frataxina (FXN), que también puede denominarse proteína de ataxia de Friedreich, FRDA, X25, CE 1.16.3.1, CyaY, FARR o FA. FXN tiene una ubicación citogenética de 9q21.11 y las coordenadas genómicas están en el cromosoma 9 en la cadena directa en la posición 69.035.259-69.100.178. La secuencia de nucleótidos de FXN se muestra como la SEQ ID NO: 5303. PIP5K1B es el gen que se encuentra en dirección 5' de FXN en la cadena directa y TJP2 es el gen que se encuentra en dirección 3' de FXN en la cadena directa. FXN tiene un ID de gen NCBI de 2395, ID de Uniprot de Q16595 e ID de gen Ensembl de ENSG00000165060. FXN tiene 3516 SNP, 14 intrones y 15 exones. El identificador de exón de Ensembl y los sitios de inicio/finalización de los intrones y exones se muestran en la Tabla 3.

T l . Inr n x n r FXN

La Tabla 4 proporciona información sobre todas las transcripciones del gen FXN según la base de datos Ensembl. En la Tabla 4 se proporcionan el ID de transcripción de Ensembl y el ID de RefSeq de NCBI correspondiente para la transcripción, el ID de traducción de Ensembl y el ID de RefSeq de NCBI correspondiente para la proteína, el biotipo de la secuencia de transcripción según la clasificación de Ensembl y los exones e intrones de la transcripción según la información de la Tabla 3.

T 4. Inf rm i n r n ri i n r FXN

continuación

FXN tiene 3516 SNP y el numero rs de NCBI y/o el numero VAR de UniProt para los SNP del gen FXN son rs1089z, rs944348, rs953588, rs1045632, rs1052186, rs1052187, rs1052188, rs1052189, rs1052194, rs1052195, rs1052201, rs1330843, rs1411675, rs1411676, rs1544306, rs1800651, rs1800652, rs1815427, rs1888334, rs1971625, rs1984002, rs1984003, rs1984004, rs1984005, rs2309393, rs2309394, rs2481598, rs2481599, rs2481600, rs2481601, rs2498419, rs2498425, rs2498426, rs2498427, rs2498428, rs2498429, rs2498430, rs2498431, rs2498432, rs2498433, rs2498434, rs2871218, rs2871219, rs2871220, rs3066311, rs3066313, rs3793451, rs3793452, rs3793453, rs3793454, rs3793455, rs3793456, rs3793457, rs3793458, rs3793459, rs3793460, rs3793461, rs3793464, rs3793465, rs3793466, rs3793467, rs3829062, rs3829063, rs3829064, rs3838715, rs4069737, rs4304388, rs4596713, rs4744786, rs4744787, rs4744795, rs4744806, rs4744807, rs4744808, rs4744810, rs4744811, rs4745543, rs4745553, rs4745581, rs4745582, rs4745583, rs4745585, rs6560541, rs6560545, rs6560546, rs6560547, rs6560550, rs6560551, rs7020927, rs7022681, rs7868040, rs7868752, rs7870295, rs7870727, rs7871596, rs7874105, rs7874989, rs7875272, rs7875564, rs7875659, rs7875693, rs7875924, rs9314854, rs9314858, rs9314859, rs9333291, rs9410778, rs9411170, rs9411171, rs9411179, rs9411181, rs9411182, rs9411184, rs9411186, rs9645006, rs9695990, rs9775387, rs10114266, rs10116434, rs10117212, rs10120686, rs10121021, rs7866878, rs7866579, rs7866067, rs7865854, rs7865353, rs7861997, rs7860403, rs7860265, rs7859021, rs7858657, rs7858407, rs7858249, rs7857635, rs7856250, rs7855905, rs7851458, rs7849347, rs7848466, rs7847872, rs7047274, rs7043526, rs7041324, rs7039631, rs7038541, rs7035156, rs7033409, rs7030480, rs7028965, rs7028835, rs7027499, rs7027359, rs7026584, rs7026473, rs7025834, rs7024295, rs4745580, rs4745578, rs4745577, rs10123512, rs10125005, s10126006, rs10521429, rs10684421, rs10710603, rs10719473, rs10747003, rs10781379, rs10781392, rs10781393, 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rs148956974 , rs148993247 , rs149043736, rs149112976, rs149166088 rs149201840 rs149220567 rs149229839 rs149284013 , rs149305063 , rs149335881, rs149382769, rs149400821 rs149432558 rs149474553 rs149518334 rs149527902 , rs149569204 , rs149664725, rs149724959, rs149786645 rs149875882 rs149882637 rs149929356 rs150039316 , rs150049106 , rs150103002, rs150146352, rs150169295 rs150186989 rs150333955 rs150387486 rs150401273 , rs150402805 , rs150449980, rs150461963, rs150667446 rs150676454 rs150704179 rs150714901 rs150912297 , rs150966024 , rs150986302, rs151027782, rs151081910 rs151137592 rs151145334 rs151193551 rs151198663 , rs151206121 , rs151240103, rs151293277, rs180718803 rs180724537 rs180725897 rs180840842 rs180842670 , rs180854508 , rs180917352, rs181114629, rs181177908 rs181234532 rs181253726 rs181273151 rs181275925 , rs181344343 , rs181365432, rs181420522, rs181501338 rs181532286 rs181554923 rs181609161 rs181610742 , rs181618593 , rs181661669, rs181729571, rs181742829 rs181843028 rs181855141 rs181918026 rs182016974 , rs182023188 , rs182028985, rs182094804, rs182219423 rs182225193 rs182247587 rs182341656 rs182344078 , rs182354080 , rs182374273, rs182528688, rs182547745 rs182647940 rs182650767 rs182656665 rs182659089 , rs182778625 , rs182780435, rs182784546, rs182802845 rs182809280 rs182929891 rs182933637 rs182945884 , rs182946167 , rs183073915, rs183092959, rs183145381 rs183200802 rs183211798 rs183373904 rs183391753 , rs183393884 , rs183406807, rs183445860, rs183497619 rs183533465 rs183580514

rs765104278, rs765250715, rs765254518, rs765292167, rs765326819, rs765327959 rs765385467 rs765428828, rs765443063, rs765535884, rs765565268, rs765591364 rs765595341 rs765624130 rs765627835 rs765798124, rs765949363, rs765980325, rs766013384, rs766086086, rs766098970 rs766108031 rs766182110 rs766185043, rs766205564, rs766248658, rs766282859, rs766351329 rs766429135, rs766449339 rs766472272 rs766494247, rs766594368, rs766667087, rs766673048, rs766696067, rs766709547 rs766735156 rs766753015 rs766807869, rs766811051, rs766868487, rs766907810, rs766911652 rs766913579, rs766917058 rs767019606 rs767074416, rs767098170, rs767110855, rs767135118, rs767209869, rs767221228, rs767282028 rs767311143 rs767337081, rs767408126, rs767444075, rs767594211, rs767684144, rs767688998, rs767712381 rs767747274 rs767763971, rs767805270, rs767821167, rs767895442, rs767921269 rs767936812, rs767955696 rs768007005 rs768141633, rs768211884, rs768234696, rs768236204, rs768249441 rs768258705, rs768276171 rs768302281 rs768308746, rs768315920, rs768383346, rs768453636, rs768521098 rs768528021, rs768545612 rs768567679 rs768682148, rs768698102, rs768767571, rs768774261, rs768798165, rs768854337, rs768870216 rs768922208 rs769111363, rs769221893, rs769263357, rs769332608, rs769369486, rs769374256, rs769377072 rs769419324 rs769495410, rs769506907, rs769666460, rs769791923, rs769814681, rs769842953, rs769916554 rs769951615 rs769983356, rs770065256, rs770136809, rs770174890, rs770297831 rs770301407, rs770331392 rs770461831 rs770469110, rs770484040, rs770547062, rs770552483, rs770615540 rs770621146, rs770662527 rs770717563 rs770749218, rs770797393, rs770814725, rs770820187, rs772851285, rs772862580, rs772944947 rs772969571 rs773140020, rs773141179, rs773224517, rs773248460, rs773334153 rs773335291, rs773384438 rs773395588 rs773400184, rs773448415, rs773491164, rs773504655, rs773510858 rs773591108, rs773622110 rs773672471 rs773674426, rs773726261, rs773740446, rs773777893, rs773784116 rs773789443, rs773811006 rs773870140 rs773937838, rs774009421, rs774061606, rs774063213, rs774161001 rs774247851, rs774294743 rs774296834 rs774334226, rs774352947, rs774470069, rs774482038, rs774552998, rs774575889, rs774586012 rs774642391 rs774643033, rs774709233, rs774762045, rs774793728, rs774818917 rs774839688, rs774965614 rs775037912 rs775084721, rs775093187, rs775108471, rs775109062, rs775124025, rs775125985, rs775175487 rs775198773 rs775207232, rs775245346, rs775247170, rs775362003, rs775411092 rs774197299, rs774126196 rs773387329 rs772838646, rs772811260, rs772792033, rs772778611, rs772657240, rs772534557, rs772459922 rs772399509 rs772385458, rs772324471, rs772274838, rs772225763, rs772220865, rs772192693, rs772158520 rs772115386 rs772114366, rs772109541, rs771989365, rs771977006, rs771963647 rs771917961, rs771845909 rs771841331 rs771772248, rs771587107, rs771582496, rs771549096, rs771521962 rs771376781, rs771334233 rs771309291 rs771300774, rs771198338, rs771189323, rs770852732, rs770833066, rs770013261, rs769684401 rs769496727 rs769403578, rs775422930, rs775491351, rs775570821, rs775586060, rs775627319, rs775651157 rs775700480 rs775805998, rs775811038, rs775909929, rs776068810, rs776069419 rs776162050, rs776182760 rs776258801 rs776293634, rs776327698, rs776349476, rs776381343, rs776411838 rs776486323, rs776547476 rs776670422 rs776675663, rs776742257, rs776783015, rs776791338, rs776815324 rs776819110, rs776860998 rs776911647 rs776912990, rs776953881, rs776958080, rs777010211, rs777139953 rs777189440, rs777195182 rs777197335 rs777206398, rs777268224, rs777309330, rs777329360, rs777354411 rs777356002, rs777420129 rs777437973 rs777575699, rs777584849, rs777612392, rs777641173, rs777742220, rs777802297, rs777808073 rs777828114 rs777926714, rs777951879, rs778046313, rs778049381, rs778131313 rs778190061, rs778271999 rs778294133 rs778328348, rs778329662, rs778330269, rs778386401, rs778421871 rs778452780, rs778471518 rs778475864 rs778553167, rs778569361, rs778620538, rs778674959, rs778713583 rs778747720, rs778844235 rs778855294 rs778936475, rs778998517, rs779117235, rs779118774, rs779235355, rs779407412, rs779433953 rs779438703 rs779523762, rs779535518, rs779587953, rs779796383, rs779832932 rs779869090, rs779939985 rs779973443 rs779997028, rs780002761, rs780057588, rs780099351, rs780103828 rs780165577, rs780197298 rs780347607 rs780362055, rs780387020, rs780443975, rs780445803, rs780465562 rs780537650, rs780563284 rs780647613 rs780650361, rs780653185, rs780679409, rs780718943, rs780720645 rs780732530, rs780745566 rs780779362 rs780817833, rs780938645, rs780954419, rs781074030, rs781122008 rs781124063, rs781145998 rs781147870 rs781204747, rs781349561, rs781375252, rs781434584, rs781475090 rs781500913, rs781513478 rs781519769 rs781556528, rs781583462, rs781606112, rs781693019, VAR_002428 VAR_002429, VAR_002430, VAR 002431 VAR_008139, VAR_008140, VAR_016065 / VARO16066.

En un ejemplo, el ARN guía utilizado en la presente divulgación puede comprender al menos una secuencia de ácido nucleico diana de 20 nucleótidos (nt) enumerada en la Tabla 5. En la Tabla 5 se proporcionan el símbolo del gen y el identificador de secuencia del gen (Gene SEQ ID NO), la secuencia genética que incluye 1-5 pares de kilobases en dirección 5' y/o en dirección 3' del gen diana (SEQ ID NO del gen ampliado) y la secuencia de ácido nucleico diana de 20 nt (SEQ ID NO de la secuencia diana de 20 nt). En la lista de secuencias del gen diana respectivo, la hebra a la que se dirige el gen (indicada por una hebra (+) o una hebra (-) en la lista de secuencias), se describen el tipo de PAM asociado y la secuencia de PAM para cada una de las secuencias de ácidos nucleicos diana de 20 nt (SEQ ID NO: 5305-37514 y 37549). Se entiende en la técnica que la secuencia espaciadora, donde "T" es "U", puede ser una secuencia de ARN correspondiente a las secuencias de 20 nt enumeradas en la Tabla 5.

Tabla 5. Secuencias de ácido nucleico

En un ejemplo, el ARN guía utilizado en la presente divulgación puede comprender al menos una secuencia espadadora que, donde "T" es "U", puede ser una secuencia de ARN correspondiente a una secuencia diana de 20 nucleótidos (nt) tal como, pero sin limitación, cualquiera de las SEQ ID NO: 5305-37514 y 37549.

En un ejemplo, el ARN guía utilizado en la presente divulgación puede comprender al menos una secuencia espaciadora que, donde "T" es "U", es una secuencia de ARN correspondiente a las secuencias de 20 nt tal como, pero sin limitación, cualquiera de las SEQ ID NO: 5305-37514 y 37549.

En un ejemplo, un ARN guía puede comprender una secuencia de ácido nucleico diana de 20 nucleótidos (nt) asociada con el tipo PAM tal como, pero sin limitación, NAAAAC, NNAGAAW, NNGRRT, NNNNGHTT, NRG o YTN. Como un ejemplo no limitativo, la secuencia de ácido nucleico diana de 20 nt para un gen diana específico y un tipo de PAM específico puede ser, donde "T" es "U", la secuencia de ARN correspondiente a cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de 20 nt de la Tabla 6.

T l . n i i n l i r i PAM

En un ejemplo, un ARN guía puede comprender una secuencia de ácido nucleico diana de 22 nucleótidos (nt) asociada con el tipo PAM de YTN. Como un ejemplo no limitativo, la secuencia de ácido nucleico diana de 22 nt para un gen diana específico puede comprender una secuencia central de 20 nt donde la secuencia central de 20 nt, donde "T" es "U", puede ser la secuencia de ARN correspondiente a las SEQ ID NO: 22080-37514 y 37549. Como otro ejemplo no limitativo, la secuencia de ácido nucleico diana de 22 nt para un gen diana específico puede comprender una secuencia central donde la secuencia central, donde "T" es "U", puede ser un fragmento, segmento o región de la secuencia de ARN correspondiente a cualquiera de los SEQ ID NO: 22080-37514 y 37549.

VI. OTROS ENFOQUES TERAPÉUTICOS

La reescritura genómica se puede realizar utilizando nucleasas diseñadas para apuntar a secuencias específicas. Hasta la fecha existen cuatro tipos principales de nucleasas: meganucleasas y sus derivados, las nucleasas de dedo de zinc (ZFN), las nucleasas efectoras similares al activador de la transcripción (TALEN) y los sistemas de nucleasa CRISPR/Cas9. Las plataformas de nucleasas varían en dificultad de diseño, densidad de focalización y modo de acción, particularmente porque la especificidad de las ZFN y TALEN se debe a interacciones entre la proteína y el ADN, mientras que las interacciones entre el ARN y el ADN guían principalmente a Cas9.

Las endonucleasas CRISPR, tales como Cas9, pueden utilizarse en los métodos de la presente divulgación. Sin embargo, las enseñanzas descritas en el presente documento, tal como los sitios diana terapéuticos, podrían aplicarse a otras formas de endonucleasas, tales como las ZFN, TALEN, HE o MegaTAL, o utilizando combinaciones de nucleasas. Sin embargo, con el fin de aplicar las enseñanzas de la presente divulgación a dichas endonucleasas, habría que, entre otras cosas, diseñar proteínas dirigidas a sitios diana específicos.

Se pueden fusionar dominios de unión adicionales a la proteína Cas9 para aumentar la especificidad. Los sitios diana de estas construcciones se asignarían al sitio específico de ARNg identificado, pero requeriría motivos de unión adicionales, tales como, por ejemplo, un dominio de dedo de zinc. En el caso de Mega-TAL, se puede fusionar una meganucleasa a un dominio de unión al ADN de TALE. El dominio meganucleasa puede aumentar la especificidad y proporcionar la escisión. De manera similar, se puede fusionar la Cas9 inactivada o muerta (dCas9) a un dominio de escisión y requerir el sitio diana ARNgu/Cas9 y el sitio de unión adyacente para el dominio de unión al ADN fusionado. Probablemente esto requeriría alguna ingeniería de proteínas de la dCas9, además de la inactivación catalítica, para disminuir la unión sin el sitio de unión adicional.

Nucleasas con dedos de zinc

Las nucleasas con dedos de zinc (ZFN) son proteínas modulares compuestas por un dominio de unión al ADN con dedos de zinc diseñados unido al dominio catalítico de la endonucleasa de tipo II FokI. Dado que FokI actúa sólo como un dímero, debe diseñarse un par de ZFN para que se unan a secuencias de "semisitio" diana, afines en cadenas de ADN opuestas y con un espacio exacto entre ellas para permitir que se forme el dímero FokI catalíticamente activo. Tras la dimerización del dominio Fokl, que en sí mismo no tiene especificidad de secuencia de por sí, se genera una rotura bicatenaria de ADN entre los semisitios de ZFN como etapa inicial en la reescritura genómica.

El dominio de unión al ADN de cada ZFN suele estar compuesto por 3-6 dedos de zinc de la abundante arquitectura Cys2-His2, reconociendo cada dedo principalmente un triplete de nucleótidos en una cadena de la secuencia de ADN diana, aunque la interacción entre cadenas con un cuarto nucleótido también puede ser importante. La alteración de los aminoácidos de un dedo en posiciones que establecen contactos clave con el ADN, altera la especificidad de secuencia de un dedo determinado. Por tanto, una proteína de dedos de zinc de cuatro dedos reconocerá selectivamente una secuencia diana de 12 pb, donde la secuencia diana es un compuesto de las preferencias del triplete aportadas por cada dedo, aunque la preferencia del triplete puede verse influenciada en diversos grados por dedos adyacentes. Un aspecto importante de las ZFN es que pueden redirigirse fácilmente a casi cualquier dirección genómica simplemente modificando los dedos individuales, aunque se requiere una experiencia considerable para hacerlo bien. En la mayoría de las aplicaciones de las ZFN, se utilizan proteínas de 4-6 dedos, que reconocen 12-18 pb respectivamente. En consecuencia, un par de ZFN normalmente reconocerá una secuencia diana combinada de 24-36 pb, sin incluir el clásico espaciador de 5-7 pb entre semisitios. Los sitios de unión pueden separase además con espaciadores más grandes, que incluyen 15-17 pb. Es probable que una secuencia diana de esta longitud sea única en el genoma humano, suponiendo que las secuencias repetitivas u homólogos de genes están excluidos durante el proceso de diseño. No obstante, las interacciones entre el ADN y la proteína de ZFN no son absolutas en su especificidad, por lo que se producen acontecimientos de unión y escisión inespecíficos, ya sea como un heterodímero entre las dos ZFN, o como un homodímero de una u otra de las ZFN. Esta última posibilidad se ha eliminado eficazmente al diseñar la interfaz de dimerización del dominio FokI para crear variantes "más" y "menos", también conocidas como variantes de heterodímero obligado, que sólo pueden dimerizarse entre sí, y no consigo mismas. Forzar el heterodímero obligado impide la formación del homodímero. Esto ha mejorado enormemente la especificidad de las ZFN, así como cualquier otra nucleasa que adopte estas variantes de FokI.

En la técnica se ha descrito una variedad de sistemas basados en ZFN, se informa periódicamente sobre sus modificaciones y numerosas referencias describen reglas y parámetros que se utilizan para guiar el diseño de las ZFN; véase, p. ej., Segalet al.,Proc Natl Acad Sci EE. UU. 96(6):2758-63 (1999); Dreier Bet al.,J Mol Biol. 303(4):489-502 (2000); Liu Qet al.,J Biol Chem. 277(6):3850-6 (2002); Dreieret al.,J Biol Chem 280(42):35588-97 (2005); y Dreieret al.,J Biol Chem. 276(31):29466-78 (2001).

Nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN)

Las TALEN representan otro formato de nucleasas modulares mediante el cual, al igual que con las ZFN, un dominio de unión al ADN diseñado está unido al dominio de nucleasa FokI y un par de TALEN funcionan en tándem para lograr la escisión del ADN diana. La principal diferencia con las ZFN es la naturaleza del dominio de unión al ADN y las propiedades de reconocimiento de la secuencia de ADN diana asociadas. El dominio de unión al ADN de TALEN deriva de las proteínas TALE, que se describieron originalmente en el fitopatógeno bacterianoXanthomonassp. Las TALE se componen de matrices en tándem de repeticiones de 33 a 35 aminoácidos, reconociendo cada repetición un único par de bases en la secuencia de ADN diana que normalmente tiene hasta 20 pb de longitud, dando una longitud total de secuencia diana de hasta 40 pb. La especificidad de nucleótidos de cada repetición la determina el resto doble variable de repetición (RVD,repeat variable diresidue),que incluye solo dos aminoácidos en las posiciones 12 y 13. Las bases guanina, adenina, citosina y timina son reconocidas predominantemente por los cuatro RVD: Asn-Asn, Asn-Ile, His-Asp y Asn-Gly, respectivamente. Esto constituye un código de reconocimiento mucho más sencillo que el de los dedos de zinc y, por tanto, representa una ventaja sobre estos últimos para el diseño de nucleasas. No obstante, al igual que con las ZFN, las interacciones proteína-ADN de las TALEN no son absolutas en cuanto a su especificidad, y las TALEN también se han beneficiado del uso de variantes de heterodímeros obligados del dominio FokI para reducir la actividad inespecífica.

Se han creado variantes adicionales del dominio FokI que tienen desactivada su función catalítica. Si la mitad de un par TALEN o ZFN contiene un dominio FokI inactivo, entonces sólo se producirá la escisión (mellado) del ADN monocatenario en el sitio diana, en lugar de una RBC. El resultado es comparable al uso de CRISPR/Cas9 o CRISPR/Cpf1 mutadas con "nicasa" en los que uno de los dominios de escisión de Cas9 se ha desactivado. Las mellas de ADN pueden utilizarse para dirigir la reescritura genómica mediante HDR, pero con menor eficacia que con una RBC. El principal beneficio es que las mellas inespecíficas se reparan de forma rápida y exacta, a diferencia de la RBC, que es propensa a fallos de reparación mediados por NHEJ.

En la técnica se ha descrito una variedad de sistemas basados en TALEN y periódicamente se informa sobre sus modificaciones; véase, p. ej., Boch, Science 326(5959): 1509-12 (2009); Maket al.,Science 335(6069):716-9 (2012); y Moscouet al.,Science 326(5959): 1501 (2009). El uso de TALEN basados en la plataforma "Golden Gate", o esquema de clonación, ha sido descrito por múltiples grupos; véase, p. ej., Cermaket al.,Nucleic Acids Res.

39(12):e82 (2011); Liet al.,Nucleic Acids Res. 39(14): 6315-25(2011); Weberet al.,PLoS One. 6(2):el6765 (2011); Wanget al.,J Genet Genomics 41(6):339-47, Epub de 17 de mayo de 2014 (2014); y Cermak T.et al.,Methods Mol Biol. 1239:133-59 (2015).

Endonucleasas de asentamiento

Las endonucleasas de asentamiento (HE) son endonucleasas específicas de secuencia que tienen largas secuencias de reconocimiento (14-44 pares de bases) y escinden el ADN con alta especificidad - a menudo en sitios únicos del genoma. Hay al menos seis familias conocidas de HE clasificadas por su estructura, entre las que se incluyen, GIY-YIG, la caja His-Cis, H-N-H, PD-(D/E)xK y de tipo Vsr, que derivan de una amplia gama de hospedadores, incluyendo eucariotas, protistas, bacterias, arqueas, cianobacterias y fagos. Al igual que con las ZFN y las TALEN, Las HE pueden utilizarse para crear una RBC en un locus diana como etapa inicial en la reescritura genómica. Además, algunas HE naturales y artificiales cortan solo una cadena de ADN, actuando así como nicasas específicas de sitio. La gran secuencia diana de las HE y la especificidad que ofrecen los han convertido en candidatos atractivos para crear RBC específicas de sitio.

En la técnica se ha descrito una variedad de sistemas basados en HE y periódicamente se informa sobre sus modificaciones; véase, p. ej., las revisiones de Steentoftet al.,Glycobiology 24(8):663-80 (2014); Belfort y Bonocora, Methods Mol Biol. 1123:1-26 (2014); Hafez y Hausner, Genome 55(8):553-69 (2012); y las referencias citadas en los mismos.

MegaTAL/Tev-mTALEN/MegaTev

Como ejemplos adicionales de nucleasas híbridas, la plataforma MegaTAL y la plataforma Tev-mTALEN utilizan una fusión de dominios de unión al ADN de TALE y HE catalíticamente activos, aprovechando tanto la unión del ADN ajustable como la especificidad del TALE, así como la especificidad de la secuencia de escisión de la HE; véase, p. ej., Boissel et al., Na R 42: 2591-2601 (2014); Kleinstiveret al.,G34:1155-65 (2014); y Boissel y Scharenberg, Methods Mol. Biol. 1239: 171-96 (2015).

En una variación adicional, la arquitectura MegaTev es la fusión de una meganucleasa (Mega) con el dominio de nucleasa derivado de la endonucleasa de asentamiento GIY-YIG, I-TevI (Tev). Los dos sitios activos están ubicados a ~ 30 pb de distancia en un sustrato de ADN y generan dos RBC con extremos cohesivos no compatibles; véase, p. ej., Wolfs et al., NAR 42, 8816-29 (2014). Se contempla que otras combinaciones de enfoques basados en nucleasas existentes evolucionarán y serán útiles para lograr las modificaciones genómicas específicas descritas en el presente documento.

dCas9-FokI o dCpf1-Fok1 y otras nucleasas

La combinación de las propiedades estructurales y funcionales de las plataformas de nucleasa descritas anteriormente ofrece un enfoque adicional para la reescritura genómica que posiblemente puede superar algunas de las deficiencias intrínsecas. Como ejemplo, el sistema de reescritura genómica CRISPR normalmente utiliza una única endonucleasa Cas9 para crear una RBC. La especificidad del direccionamiento está dirigida por una secuencia de 20 o 24 nucleótidos en el ARN guía que se somete a un emparejamiento de bases de Watson y Crick con el ADN diana (más 2 bases adicionales en la secuencia de PAM adyacente NAG o NGG en el caso de Cas9 de S.pyogenes),Dicha secuencia es suficientemente larga como para ser única en el genoma humano, sin embargo, la especificidad de la interacción ARN/ADN no es absoluta, tolerando a veces una promiscuidad significativa, particularmente en la mitad 5' de la secuencia diana, reduciendo eficazmente el número de bases que dirigen la especificidad. Una solución a esto ha sido desactivar completamente la función catalítica de Cas9 o Cpf1 - conservando solo la función de unión al ADN guiada por ARN - y en su lugar fusionar un dominio Fokl con la Cas9 desactivada; véase, p. ej., Tsaiet al.,Nature Biotech 32: 569-76 (2014); y Guilingeret al.,Nature Biotech. 32: 577-82 (2014). Dado que FokI debe dimerizarse para volverse catalíticamente activa, se requieren dos ARN guía para unir dos fusiones FokI muy cerca para formar el dímero y escindir el ADN. Básicamente, esto duplica el número de bases en los sitios diana combinados, aumentando así la rigurosidad del direccionamiento por parte de los sistemas basados en CRISPR.

Como ejemplo adicional, la fusión del dominio de unión al ADN de TALE con una HE catalíticamente activa, tal como I-TevI, aprovecha tanto la unión del ADN ajustable como la especificidad del TALE, así como la especificidad de la secuencia de escisión de I-TevI, con la esperanza de reducir aún más la escisión inespecífica.

VII. KITS

La presente divulgación describe kits para llevar a cabo los métodos descritos en el presente documento. Un kit puede incluir uno o más ácidos nucleicos dirigidos al genoma, un polinucleótido que codifica un ácido nucleico dirigido al genoma, un polipéptido dirigido al sitio, un polinucleótido que codifica un polipéptido dirigido al sitio y/o cualquier ácido nucleico o molécula proteica necesaria para llevar a cabo los aspectos de los métodos descritos en el presente documento, o cualquier combinación de los mismos.

Un kit puede incluir: (1) un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ácido nucleico dirigido al genoma, (2) el polipéptido dirigido al sitio o un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido dirigido al sitio y (3) un reactivo para la reconstitución y/o dilución del (de los) vector(es) y/o polipéptido.

Un kit puede incluir: (1) un vector que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un ácido nucleico dirigido al genoma y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido dirigido al sitio; y (2) un reactivo para la reconstitución y/o dilución del vector.

En cualquiera de los kits anteriores, el kit puede incluir un ácido nucleico guía de una sola molécula dirigido al genoma. En cualquiera de los kits anteriores, el kit puede incluir un genoma de molécula doble que tiene como diana el ácido nucleico. En cualquiera de los kits anteriores, el kit puede comprender dos o más guías de doble molécula o guías monocatenarias. Los kits pueden comprender un vector que codifique el ácido nucleico diana.

En cualquiera de los kits anteriores, el kit puede incluir además un polinucleótido que se insertará para efectuar la modificación genética deseada.

Los componentes de un kit pueden estar en recipientes separados o combinados en un solo recipiente.

Cualquier kit descrito anteriormente puede comprender además uno o más reactivos adicionales, donde dichos reactivos adicionales se seleccionan entre un tampón, un tampón para introducir un polipéptido o polinucleótido en una célula, un tampón de lavado, un reactivo de control, un vector de control, un polinucleótido de ARN de control, un reactivo para la producciónin vitrodel polipéptido a partir del ADN, adaptadores para la secuenciación y similares. Un tampón puede ser un tampón de estabilización, un tampón reconstituyente, un tampón diluyente o similares. Un kit también puede comprender uno o más componentes que pueden usarse para facilitar o mejorar la unión a la diana o la escisión del ADN por la endonucleasa, o mejorar la especificidad del direccionamiento.

Además de los componentes mencionados anteriormente, un kit puede comprender además instrucciones para utilizar los componentes del kit para poner en práctica los métodos. Las instrucciones para poner en práctica los métodos pueden grabarse en un soporte de grabación adecuado. Por ejemplo, las instrucciones pueden imprimirse en un sustrato, tal como papel o plástico, etc. Las instrucciones pueden estar presentes en los kits como un prospecto, en el etiquetado del envase del kit o de sus componentes (es decir, asociado al envase o subenvase), etc. Las instrucciones pueden estar presentes como un archivo de datos de almacenamiento electrónico presente en un medio de almacenamiento legible por ordenador adecuado, p. ej., CD-ROM, disquete, unidad flash, etc. En algunos casos, las instrucciones propiamente dichas no están presentes en el kit, pero pueden proporcionarse medios para obtener las instrucciones de una fuente remota (por ejemplo, a través de Internet). Un ejemplo de este caso es un kit que incluye una dirección web en la que se pueden ver las instrucciones y/o desde la que se pueden descargar. Como ocurre con las instrucciones, este medio para obtener las instrucciones puede grabarse en un sustrato adecuado.

IX. DEFINICIONES

La expresión "que comprende" o el término "comprende" se utiliza en referencia a las composiciones, los métodos y el(los) respectivo(s) componente(s) de los mismos, que son esenciales para la presente divulgación, pero abiertos a la inclusión de elementos no especificados, ya sean esenciales o no.

La expresión "que consiste esencialmente en" se refiere a los elementos necesarios para un aspecto determinado. El término permite la presencia de elementos adicionales que no afecten materialmente a la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s) o funcional(es) de ese aspecto de la presente divulgación.

La expresión "que consiste en" se refiere a composiciones, métodos y componentes correspondientes de los mismos como se describe en el presente documento, que son exclusivos de cualquier elemento no mencionado en esa descripción del aspecto.

Las formas en singular "uno", "una" y "el/la" incluyen los referentes en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Cualquier intervalo numérico mencionado en esta memoria descriptiva describe todos los subintervalos de la misma precisión numérica (es decir, que tienen el mismo número de dígitos especificados) incluidos dentro del intervalo mencionado. Por ejemplo, un intervalo citado de "1,0 a 10,0" describe todos los subintervalos entre (y que incluyen) el valor mínimo citado de 1,0 y el valor máximo citado de 10,0, tal como, por ejemplo, "de 2,4 a 7,6" aun cuando el intervalo de "2,4 a 7,6" no esté expresamente mencionado en el texto de la memoria descriptiva. Por consiguiente, el solicitante se reserva el derecho de modificar la presente memoria descriptiva, que incluye las reivindicaciones, citar expresamente cualquier subintervalo de la misma precisión numérica subsumido dentro de los intervalos expresamente citados en esta memoria descriptiva. Todos estos intervalos se describen inherentemente en esta memoria descriptiva, de modo que la modificación para citar expresamente cualquiera de dichos subintervalos cumplirá con la descripción escrita, suficiencia de la descripción y requisitos de materia añadida, incluidos los requisitos establecidos en 35 U.S.C. § 112(a) y el artículo 123(2) EPC. Igualmente, a menos que se especifique expresamente o el contexto lo requiera, todos los parámetros numéricos descritos en esta memoria descriptiva (tales como los que expresan valores, intervalos, cantidades, porcentajes y similares) pueden leerse como si estuvieran precedidos por la palabra "aproximadamente", incluso aunque el término "aproximadamente" no aparezca expresamente antes de un número. Adicionalmente, los parámetros numéricos descritos en esta memoria descriptiva deben interpretarse a la luz del número de dígitos significativos informados, precisión numérica y aplicando técnicas de redondeo habituales. También se entiende que los parámetros numéricos descritos en esta memoria descriptiva poseerán necesariamente la característica de variabilidad inherente de las técnicas de medición subyacentes utilizadas para determinar el valor numérico del parámetro.

Los detalles de uno o más aspectos de la presente divulgación se exponen en la descripción que se acompaña a continuación. Aunque cualquier material y método similar o equivalente a los descritos en el presente documento puede ser utilizado en la práctica o ensayo de la presente divulgación, a continuación se describen los materiales y métodos preferentes. Otras características, objetos y ventajas de la divulgación se desprenderán de la descripción. En la descripción, las formas en singular también incluyen las referencias en plural, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta divulgación. En caso de conflicto, prevalecerá la presente descripción.

La divulgación se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

X. EJEMPLOS

La presente divulgación se entenderá más completamente con referencia a los siguientes ejemplos, que proporcionan aspectos ilustrativos no limitativos de la invención.

Los ejemplos describen el uso del sistema CRISPR como técnica ilustrativa de edición del genoma para crear deleciones, inserciones o sustituciones genómicas terapéuticas definidas, denominadas en el presente documento "modificaciones genómicas", en el gen FXN que conducen a la deleción permanente o corrección de repeticiones trinucleotídicas ampliadas en el gen FXN, desactivación del gen FXN o corrección de todo el gen, o corrección de mutaciones dentro del gen, que restablecen los niveles de tipo natural o similares de repeticiones trinucleotídicas en el gen FXN y/o eliminan los productos anómalos del gen FXN.

Todos los ARNg probados se pueden utilizar para un enfoque de reescritura basado en la corrección/HDR. Se pueden utilizar ARNg individuales dirigidos a los aceptores de corte y empalme para inducir la omisión de exones y restablecer el marco de lectura del gen FXN. Se pueden utilizar pares seleccionados de ARNg para realizar deleciones en el gen FXN que restablezcan el marco de lectura. Se pueden utilizar pares seleccionados de ARNg para realizar deleciones que simulen mutaciones del paciente y se pueden utilizar para generar estirpes mutadas de FXN modelo.

Se evalúan varios ortólogos de Cas para el corte. Los ARNg se administran como ARN y se expresan desde el promotor U6 en plásmidos. La proteína Cas correspondiente se introduce en la estirpe celular de interés y se expresa de forma constitutiva, administrada como ARNm o administrada como proteína. La actividad de ARNg en todos los formatos se evalúa mediante análisis TIDE en células HEK293T.

La introducción de las modificaciones terapéuticas definidas descritas anteriormente representa una nueva estrategia terapéutica para la posible mejora de la ataxia de Friedreich y trastornos relacionados, como se describe e ilustra en el presente documento.

Ejemplo 1: Sitios diana de CRISPR/SpCas9 para el gen FXN

Se exploraron regiones del gen FXN en busca de sitios diana. Cada área fue explorada en busca de un motivo protoespaciador adyacente (PAM) que tuviera la secuencia NRG. Luego se identificaron las secuencias espaciadoras de ARNg de 20 pb correspondientes al PAM, como se muestra en las SEQ ID NO: 8442-22079 y 37549 del listado de secuencias.

Ejemplo 2: Sitios diana de CRISPR/SaCas9 para el gen FXN

Se exploraron regiones del gen FXN en busca de sitios diana. Cada área fue explorada en busca de un motivo protoespaciador adyacente (PAM) que tuviera la secuencia NNGRRT. Luego se identificaron las secuencias espaciadoras de ARNg de 20 pb correspondientes al PAM, como se muestra en las SEQ ID NO: 5828-7262 del listado de secuencias.

Ejemplo 3: Sitios diana de CRISPR/StCas9 para el gen FXN

Se exploraron regiones del gen FXN en busca de sitios diana. Cada área fue explorada en busca de un motivo protoespaciador adyacente (PAM) que tuviera la secuencia NNAGAAW. Luego se identificaron las secuencias espaciadoras de ARNg de 20 pb correspondientes al PAM, como se muestra en las SEQ ID NO: 5475-5827 del listado de secuencias.

Ejemplo 4: Sitios diana de CRISPR/TdCas9 para el gen FXN

Se exploraron regiones del gen FXN en busca de sitios diana. Cada área fue explorada en busca de un motivo protoespaciador adyacente (PAM) que tuviera la secuencia NAAAAC. Luego se identificaron las secuencias espaciadoras de ARNg de 20 pb correspondientes al PAM, como se muestra en las SEQ ID NO: 5305-5474 del listado de secuencias.

Ejemplo 5: S itios diana de CRISPR/NmCas9 para el gen FXN

Se exploraron regiones del gen FXN en busca de sitios diana. Cada área fue explorada en busca de un motivo protoespaciador adyacente (PAM) que tuviera la secuencia NNNNGHTT. Luego se identificaron las secuencias espadadoras de ARNg de 20 pb correspondientes al PAM, como se muestra en las SEQ ID NO: 7263-8441 del listado de secuencias.

Ejemplo 6: Sitios diana de CRISPR/Cpf1 para el gen FXN

Se exploraron regiones del gen FXN en busca de sitios diana. Cada área fue explorada en busca de un motivo protoespaciador adyacente (PAM) que tuviera la secuencia YTN. Luego se identificaron las secuencias espaciadoras de ARNg de 22 pb correspondientes al PAM, como se muestra en las SEQ ID NO: 22080-37514 del listado de secuencias.

Ejemplo 7 - Análisis b ioinformático de las cadenas guía

A continuación, se examinarán y seleccionarán las cadenas guía candidatas en un proceso de una o varias etapas que implica tanto la unión teórica como la actividad evaluada experimentalmente en sitios tanto específicos o como inespecíficos. A modo ilustrativo, las cadenas guía candidatas que tienen secuencias que coinciden con un sitio diana en particular, tal como un sitio dentro del gen FXN, con PAM adyacentes se pueden evaluar para determinar su potencial para escindirse en sitios inespecíficos que tengan secuencias similares, utilizando una o más de una variedad de herramientas bioinformáticas disponibles para evaluar la unión inespecífica, como se describe e ilustra con más detalle a continuación, con el fin de evaluar la probabilidad de efectos en posiciones cromosómicas distintas de las previstas.

Después se pueden evaluar experimentalmente los candidatos que se predice que tienen un potencial relativamente menor de actividad inespecífica para medir su actividad específica y luego sus actividades inespecíficas en varios sitios. Las cadenas guía preferidas tienen una actividad específica suficientemente alta para lograr los niveles deseados de reescritura genómica en el locus seleccionado, y una actividad inespecífica relativamente menor para reducir la probabilidad de alteraciones en otros locus cromosómicos. La relación entre la actividad específica y la actividad inespecífica a menudo se denomina "especificidad" de una cadena guía.

Para la detección inicial de actividades previstas inespecíficas, hay una serie de herramientas bioinformáticas conocidas y disponibles públicamente que pueden utilizarse para predecir los sitios más probables inespecíficos; y dado que la unión a los sitios diana en el sistema de nucleasa CRISPR/Cas9 o CRISPR/Cpf1 está impulsada por el emparejamiento de bases Watson-Crick entre secuencias complementarias, el grado de disimilitud (y, por lo tanto, el potencial reducido de unión inespecífica) está relacionado esencialmente con las diferencias en la secuencia primaria: emparejamientos incorrectos y protuberancias, es decir, bases que se cambian a una base no complementaria, e inserciones o deleciones de bases en el sitio potencial inespecífico en relación con el sitio diana. Una herramienta bioinformática ilustrativa llamada COSMID(CRISPR Off-target Sites with Mismatches, Insertions and Deletions,sitios CRISPR inespecíficos con emparejamientos incorrectos, inserciones y deleciones) recopila dichas similitudes. Otras herramientas bioinformáticas incluyen, pero no se limitan a autoCOSMID y CCTop.

Se utilizó la bioinformática para minimizar la escisión inespecífica con el fin de reducir los efectos perjudiciales de las mutaciones y los reordenamientos cromosómicos. Los estudios sobre los sistemas CRISPR/Cas9 indicaron la posibilidad de una actividad inespecífica debido a una hibridación no específica de la cadena guía con secuencias de ADN con emparejamientos incorrectos de pares de bases y/o protuberancias, particularmente en posiciones distales de la región PAM. Por lo tanto, es importante contar con una herramienta bioinformática que pueda identificar posibles sitios inespecíficos que tengan inserciones y/o deleciones entre la cadena guía de ARN y las secuencias genómicas, además de los emparejamientos incorrectos de pares de bases. Se utilizaron herramientas bioinformáticas basadas en el algoritmo de predicción de sitios inespecíficos CCTop para buscar genomas de posibles sitios inespecíficos de CRISPR (CCTop está disponible en la web en crispr.cos.uni-heidelberg.de/). Las listas de salida clasificadas de los sitios potencialmente no diana se basan en la cantidad y la ubicación de las discrepancias, permitiendo una elección más informada de los sitios diana y evitando el uso de sitios con mayor probabilidad de escisión inespecífica.

Se emplearon procesos bioinformáticos adicionales que ponderan la actividad estimada tanto específica como inespecífica de los sitios de direccionamiento de ARNg en una región. Otras características que pueden utilizarse para predecir la actividad incluyen información sobre el tipo de célula en cuestión, accesibilidad del ADN, estado de la cromatina, sitios de unión de factores de transcripción, datos de unión de factores de transcripción y otros datos de CHIP-seq. Se ponderan factores adicionales que predicen la eficiencia de la reescritura, tal como posiciones relativas y direcciones de pares de ARNg, características de secuencia local y microhomologías.

La evaluación inicial y la selección de los sitios diana de CRISPR/Cas9 se centraron en la región de dirección 5' de 500 pb de FXN, Exón 1 e Intrón 1. Los ARNg dirigidos a la secuencia de dirección 5' y al Exón 1 se pueden utilizar para insertar ADNc de FXN de longitud completa para reemplazar el gen FXN endógeno mutado y restablecer la expresión de la proteína. Los ARN guía dirigidos al intrón 1 se pueden utilizar para dirigirse a las repeticiones ampliadas. Se pueden utilizar pares de ARNg a cada lado de la secuencia de repetición ampliada para extirpar las repeticiones ampliadas. Los ARNg superpuestos con la secuencia de repetición ampliada se pueden utilizar para inducir la contracción parcial o total de las repeticiones. Además, se pueden utilizar ARNg cuidadosamente seleccionados junto con dCas9 fusionadas a proteínas modificadoras de cromatina para aliviar los cambios epigenéticos que ocurren en el alelo FXN con repeticiones ampliadas y restablecer la expresión de FXN. Estos ARNg también se pueden utilizar para reescribir uno o más nucleótidos, secuencias exónicas y/o secuencias intrónicas.

El análisis bioinformático inicial identificó 146 ARNg dirigidos a la región en dirección 5' y el exón 1, y 1432 guías dirigidas al intrón 1. Un análisis adicional de los sitios inespecíficos previstos y la evaluación del sitio diana del ARNg dentro del gen FXN produjeron 192 ARNg seleccionados para la detección. La lista priorizada de 192 ARNg individuales dirigidos al gen FXN se evaluó para determinar la eficacia del corte utilizando spCas9 (Tabla 7).

Tabla 7

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Cabe señalar que las SEQ ID NO representan la secuencia de ADN de la diana genómica, mientras que la secuencia espadadora ARNg o ARNgu será la versión de ARN de la secuencia de ADN.

Se seleccionaron ARNg individuales que abarcaban diferentes regiones del gen FXN y se probaron sus eficacias de corte utilizando saCas9. Un análisis adicional de los sitios fuera de la diana previstos y la evaluación del sitio diana del ARNg dentro del gen FXN produjeron 74 ARNg seleccionados para la detección. La lista priorizada de 74 ARNg individuales dirigidos al gen FXN se evaluó para determinar la eficacia del corte utilizando spCas9 (Tabla 8).

Tabla 8

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Cabe señalar que las SEQ ID NO representan la secuencia de ADN de la diana genómica, mientras que la secuencia espadadora ARNg o ARNgu será la versión de ARN de la secuencia de ADN.

Ejemplo 8: Prueba de cadenas guía preferidas en el cribado de ARNg transcritoin vitro(IVT)

Para identificar un amplio espectro de pares de ARNg capaces de reescribir la región diana del ADN afín, se realizó cribado de ARNg transcritoin vitro.La secuencia genómica relevante se envió para análisis utilizando unsoftwarede diseño de ARNg. La lista resultante de los ARNg se redujo a una lista seleccionada de ARNg como se ha descrito anteriormente en función de la singularidad de la secuencia (solo se exploraron los ARNg sin una coincidencia perfecta en algún otro lugar del genoma) y de los efectos inespecíficos mínimos previstos. Este conjunto de ARNg se transcribióin vitroy se transfectó con Lipofectamine MessengerMAX en células HEK293T que expresan Cas9 de forma constitutiva. Las células se recogieron 48 horas después de la transfección, se aisló el ADN genómico y la eficacia del corte se evaluó utilizando el análisis TIDE. (figuras 2A-E; figuras 3A-C; figuras 4A-C; y la figura 5).

Los resultados también demuestran que las secuencias guía cortan eficazmente la secuencia genómica que contiene polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). Por ejemplo, ARNg que contiene el espaciador de secuencia guía, "Fxn en dirección 5' y Exón1_T73" (SEQ ID NO: 9214) cortaron eficazmente (78,2 %, Figura 2B) la secuencia de dianas genómicas que contiene un SNP en la posición 5. Por tanto, los ARNg que contienen secuencias guía espaciadoras: "Fxn en dirección 5' y Exón1_T73" o "Fxn en dirección 5' y Exón1_T73_V2" se pueden usar para reescribir FXN eficazmente.

Luego se puede hacer un seguimiento del ARNg o pares de ARNg con actividad significativa en células cultivadas para medir la corrección de la mutación de FXN. Los eventos inespecíficos se pueden volver a rastrear. Se puede transfectar una variedad de células y medir el nivel de corrección genética y de posibles eventos inespecíficos. Estos experimentos permiten optimizar el diseño y la administración de nucleasas y donantes.

Ejemplo 9: Prueba de cadenas guía preferidas en células para detectar actividad inespecífica

Los ARNg que tienen la mejor actividad específica de la prueba de IVT en el ejemplo anterior se prueban para detectar la actividad inespecífica mediante ensayos de captura híbrida, GUIDE Seq. y secuenciación del genoma completo además de otros métodos.

Ejemplo 10: Prueba de diferentes enfoques para la reescritura genómica de HDR

Después de probar los ARNg tanto para la actividad específica como para la actividad inespecífica, se probará la corrección de la ampliación repetida y la estrategia de reescritura genómica completa para la reescritura de genes de HDR.

Para todo el enfoque de corrección genética, un ADN monocatenario o bicatenario que tenga brazos homólogos a la región cromosómica de FXN puede incluir más de 40 nt del primer exón (el primer exón codificante o secuencia en dirección 5') del gen FXN, la CDS completa del gen FXN y la UTR 3' del gen FXN, y al menos 40 nt del siguiente intrón. El ADN monocatenario o bicatenario que tiene brazos homólogos a la región cromosómica de FXN puede incluir más de 80 nt del primer exón del gen FXN, la CDS completa del gen FXN y la UTR 3' del gen FXN, y al menos 80 nt del siguiente intrón. El ADN monocatenario o bicatenario que tiene brazos homólogos a la región cromosómica de FXN puede incluir más de 100 nt del primer exón del gen<f>X<n>, la CDS completa del gen FXN y la UTR 3' del gen FXN, y al menos 100 nt del siguiente intrón. El ADN monocatenario o bicatenario que tiene brazos homólogos a la región cromosómica de FXN puede incluir más de 150 nt del primer exón del gen FXN, la CDS completa del gen FXN y la UTR 3' del gen FXN, y al menos 150 nt del siguiente intrón. El ADN monocatenario o bicatenario que tiene brazos homólogos a la región cromosómica de FXN puede incluir más de 300 nt del primer exón del gen FXN, la CDS completa del gen FXN y la UTR 3' del gen FXN, y al menos 300 nt del siguiente intrón. El ADN monocatenario o bicatenario que tiene brazos homólogos a la región cromosómica de FXN puede incluir más de 400 nt del primer exón del gen FXN, la CDS completa del gen FXN y la UTR 3' del gen FXN, y al menos 400 nt del siguiente intrón.

Como alternativa, la plantilla de ADN será administrada por una partícula AAV recombinante como las que se enseñan en el presente documento.

Se puede realizar una inserción de ADNc de FXN en cualquier ubicación cromosómica seleccionada, incluido el locus del gen FXN o en un locus de "puerto seguro", es decir, a Av S1 (PPP1R12C), ALB, Angpt13, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpinal, TF y/o TTR. La evaluación de la eficacia de la inserción mediada por HDR del ADNc en el primer exón puede utilizar la inserción del ADNc en sitios de "puerto seguro" tales como: ADN monocatenario o bicatenario que tiene brazos homólogos a una de las siguientes regiones, por ejemplo: exón 1-2 de AAVS1 (PPP1R12C), exón 1-2 de ALB, exón 1-2 de Angptl3, exón 1-2 de ApoC3, exón 1-2 de ASGR2, exón 1-2 de CCR5, exón 1-2 de F<i>X (F9), exón 1-2 de Gys2, exón 1-2 de HGD, exón 1-2 de Lp(a), exón 1-2 de Pcsk9, exón 1-2 de Serpinal, exón 1-2 de TF o exón 1-2 de TTR; UTR 5' correspondiente a FXN o<u>T<r>5' alternativo, la CDS completa de FXN y UTR 3' de FXN o UTR 3' modificada y al menos 80 nt del primer intrón, como alternativa, la misma secuencia de plantilla de ADN será suministrada por AAV.

Ejemplo 11: Reevaluación de las principales combinaciones de donantes de ADN/CRISPR-Cas9

Después de probar las diferentes estrategias de reescritura genómica, las principales combinaciones de donantes CRISPR-Cas9/ADN se volverán a evaluar en células para comprobar la eficacia de la deleción, recombinación y especificidad inespecífica. El ARNm o RNP de Cas9 se formulará en nanopartículas lipídicas para su administración, los ARNgu se formularán en nanopartículas o se administrarán como partículas AAV recombinantes, y el ADN donante se formulará en nanopartículas o se administrará como partículas AAV recombinantes.

Ejemplo 12: Pruebasin vivoen modelos animales relevantes

Después de que se hayan reevaluado las combinaciones de donantes de CRISPR-Cas9/ADN, las formulaciones principales se probaránin vivoen un modelo animal.

El cultivo en células humanas permite realizar pruebas directas en la diana humana y en el acervo genómico humano, como se ha descrito anteriormente.

Las evaluaciones preclínicas de eficacia y seguridad se pueden observar mediante el injerto de neuronas modificadas de ratón o humanas en un modelo de ratón. Las células modificadas se pueden observar en los meses posteriores al injerto.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un ARN guía de una sola molécula que comprende al menos una secuencia espadadora que es una secuencia de ARN correspondiente a cualquiera de las SEQ ID NO: 16178, 16295, 9521, 16177, 9373, 9257, 16201, 16094, 9210, 9232, 16187, 9194, 16084, 16133, 16253, 16278, 9364, 16141, 9359, 16315, 9294, 16271, 16164, 16311, 9203, 9258, 16224, 16163, 16159, 9327, 9264, 16274, 9237, 9282, 16161, 16091, 16260, 16293, 16294, 16450, 16100, 16138, 9387, 9249, 16131, 9214, 37549, 16123, 16126, 9271, 16176, 9260, 16128, 9388, 16096, 16259, 9212, 9516, 9224, 9369, 9206, 9333, 9293, 16252, 9211, 16275, 9234, 16129, 16254, 9174, 9363, 9251, 16144, 9372, 16263, 16290, 16143,16273 o 16245.

2. El ARN guía de una sola molécula de la reivindicación 1, en donde el ARN guía de una sola molécula comprende además una región de ampliación espaciadora, una región de ampliación de ARNtracr o una combinación de las mismas y/o en donde el ARN guía de una sola molécula está modificado químicamente.

3. El ARN guía de una sola molécula de la reivindicación 1 o 2, en donde el ARN guía de una sola molécula está precomplejado con una endonucleasa Cas9 de S.pyogenes.

4. El ARN guía de una sola molécula de la reivindicación 3, en donde la endonucleasa Cas9 de S.pyogenescomprende una o más señales de localización nuclear (NLS) en o dentro de los 50 aminoácidos del extremo aminoterminal y/o carboxiterminal de la endonucleasa Cas9 de S.pyogenes.

5. Un ADN que codifica el ARN guía de una sola molécula de la reivindicación 1 o 2.

6. El ARN guía de una sola molécula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el ADN de la reivindicación 5 para su uso en el tratamiento de un trastorno relacionado con la frataxina (FXN) que comprende la reescritura del gen FXN en una célula de un paciente.

7. Un métodoex vivooin vitropara reescribir un gen de Frataxina (FXN) en una célula mediante reescritura genómica que comprende introducir en la célula:

una o más endonucleasas Cas9 de S.pyogeneso uno o más polinucleótidos que codifican la una o más endonucleasas Cas9 de S.pyogenes; y

uno o más ARN guía de una sola molécula (ARNgu) de la reivindicación 1 o 2, o uno o más ADN de la reivindicación 6;

para efectuar una o más roturas monocatenarias (RMC) o roturas bicatenarias (RBC) dentro o cerca del gen FXN o elementos reguladores de FXN que den lugar a una o más inserciones, deleciones o mutaciones permanentes de al menos un nucleótido dentro o cerca del gen FXN, reduciendo o eliminando así la expresión o función de productos anómalos del gen FXN.

8. El método de la reivindicación 7, en donde la célula es una célula del sistema nervioso central (SNC).

9. El método de la reivindicación 8, en donde la célula del SNC es una neurona o un neurogliocito.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde el uno o más polinucleótidos que codifican la una o más endonucleasas Cas9 de S.pyogenesson uno o más ADN o ARN que codifican la una o más endonucleasas Cas9 deS. pyogenes.

11. El método de 10, en donde el uno o más ARN que codifican la una o más endonucleasas Cas9 de S.pyogenesestán modificados químicamente, opcionalmente en donde la modificación química está en la región codificante.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en donde el uno o más polinucleótidos que codifican la una o más endonucleasas Cas9 deS. pyogenestienen optimización de codones.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en donde la una o más endonucleasas Cas9 de S.pyogenesestán formuladas en un liposoma o una nanopartícula lipídica, que opcionalmente comprende además el uno o más ARNgu.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en donde la una o más endonucleasas Cas9 de S.pyogenesestán codificadas en una partícula de vector de AAV, que opcionalmente codifica además el uno o más ARNgu.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en donde el uno o más ARNgu están codificados en una partícula de vector de AAV.