ES2989358T3 - Inmunoterapia del cáncer por rotura de la membrana eléctrica por radiofrecuencia (RF-EMB) - Google Patents

Abstract

Un método de ablación no térmica de tejido no deseado en el cuerpo mediante la aplicación de campos eléctricos pulsados, bipolares, de inversión de carga instantánea de energía suficiente para causar la ruptura y destrucción completa e inmediata de la membrana celular. La energía se suministra a través de pulsos de radiofrecuencia de frecuencias particulares, características de onda, anchos de pulso y números de pulso, de modo que se ejercen tensiones físicas mejoradas sobre la membrana celular para causar su destrucción inmediata y completa, derramando así todo el contenido celular y los constituyentes de la membrana en el espacio extracelular sin desnaturalizar las proteínas, de modo de permitir una respuesta inmunológica para destruir y eliminar el tejido objetivo y el tejido marcado de manera similar en otras partes del sujeto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inmunoterapia del cáncer por rotura de la membrana eléctrica por radiofrecuencia (RF-EMB)

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de la ablación médica de tejido biológico para el tratamiento de enfermedades y, más particularmente, a la aplicación controlada de energía de radiofrecuencia a tejido blando y tejido canceroso en seres humanos y mamíferos para extirpar dicho tejido a través de la destrucción celular por Rotura de la Membrana Eléctrica.

2. Descripción de los antecedentes

El cáncer no es una enfermedad única sino más bien un grupo de enfermedades con características comunes que a menudo dan como resultado proliferación celular sostenida, mortalidad celular reducida o retardada, coopción de angiogénesis corporal y procesos metabólicos y evasión de respuesta inmunitaria corporal que da como resultado crecimientos de tejido blando no deseables denominados neoplasias o, más comúnmente, tumores. La eliminación o destrucción de este tejido aberrante es un objetivo de muchos métodos y modalidades de tratamiento del cáncer. La escisión quirúrgica de tumores es un método para conseguir este objetivo. La ablación de tejido es otro método, mínimamente invasivo para destruir tejido indeseable en el cuerpo, y se ha dividido generalmente en tecnologías de ablación térmica y no térmica. La ablación térmica abarca tanto la adición como la eliminación de calor para destruir células indeseables. La crio-ablación es una técnica bien establecida que destruye las células congelando el compartimento extracelular dando como resultado la deshidratación celular comenzando a -15 °C y mediante la formación de hielo intracelular que provoca la rotura de la membrana que se produce a temperaturas más frías. Debido a que las técnicas crio-ablativas pueden romper la membrana celular sin desnaturalizar las proteínas celulares en ciertas condiciones, tales técnicas tienen la capacidad adicional de estimular una respuesta inmune antitumoral en el paciente.

Las técnicas basadas en calor también están bien establecidas para la ablación de tejidos tanto cancerosos como no cancerosos e incluyen ablación por ultrasonidos focalizados de microondas y de alta intensidad, y térmica por radiofrecuencia (RF) que eleva temperaturas de tejido localizadas muy por encima de la temperatura normal del cuerpo de 37 °C. Estos métodos usan diversas técnicas para aplicar energía a las células diana para elevar la temperatura intersticial. Por ejemplo, la ablación térmica por RF usa un campo eléctrico de alta frecuencia para inducir vibraciones en la membrana celular que se convierten en calor por fricción. La muerte celular se produce en tan poco como 30 segundos una vez que la temperatura celular alcanza 50 °C y disminuye a medida que la temperatura aumenta. A 60°C la muerte celular es instantánea. Si la temperatura intracelular aumenta a entre aproximadamente 60 y 95 °C, los mecanismos implicados en la muerte celular incluyen la desecación celular y la coagulación de proteínas. Cuando la temperatura intracelular alcanza 100 °C, la vaporización celular se produce cuando el agua intracelular hierve a vapor. En el contexto de la ablación de tejido, las temperaturas celulares que no superan los 50 °C no se consideran clínicamente significativas. Debido a que las proteínas celulares se desnaturalizan por el calor de las técnicas de ablación térmica, no están disponibles para estimular una respuesta inmune específica como lo pueden ser con crioablación. Tanto las técnicas basadas en calor como las de crio-ablación tienen el inconveniente de que tienen poca o ninguna capacidad para ahorrar estructuras normales en la zona de tratamiento y, por lo tanto, pueden estar contraindicadas en base a la ubicación del tumor o conducir a complicaciones de lesiones colaterales.

Las técnicas de ablación no térmica incluyen electro-quimioterapia y electroporación irreversible que, aunque bastante distintas entre sí, cada una se basa en el fenómeno de electroporación. Con referencia a la FIG. 1, la electroporación se refiere al hecho de que la membrana plasmática de una célula expuesta a campos eléctricos pulsados de alta tensión dentro de ciertos parámetros, resulta temporalmente permeable debido a la desestabilización de la bicapa lipídica y la formación de poros P. La membrana plasmática celular consiste de una bicapa lipídica con un grosor t de aproximadamente 5 nm. Con referencia a la FIG. 2A, la membrana actúa como una barrera dieléctrica no concluyente que forma, en esencia, un condensador. Las condiciones fisiológicas producen una diferencia de potencial eléctrico natural debido a la separación de carga a través de la membrana entre el interior y el exterior de la célula incluso en ausencia de un campo eléctrico aplicado. Este potencial V’m transmembrana en reposo varía desde 40 mv para células adiposas a 85 mv para células de músculo esquelético y a 90 mv para células de músculo cardíaco y puede variar por el tamaño celular y concentración de iones entre otras cosas.

Con referencia continua a las FIGS. 2B-2D, la exposición de una célula a un campo eléctrico E aplicado externamente induce una tensión adicional V a través de la membrana siempre que el campo externo esté presente. La tensión transmembrana inducida es proporcional a la intensidad del campo eléctrico externo y al radio de la célula. La formación de poros P transmembrana en la membrana se produce si el potencial transmembrana en reposo y aplicado acumulativo excede la tensión umbral que puede estar típicamente entre 200 mV y 1 V. La poración de la membrana es reversible si el potencial transmembrana no excede el valor crítico de manera que el área de poros es pequeña en relación con la superficie total de la membrana. En tal electroporación reversible, la membrana celular se recupera después de que se retira el campo aplicado y la célula permanece viable. Por encima de un potencial transmembrana crítico y con tiempos de exposición, la poración resulta irreversible conduciendo a muerte celular eventual debido a un influjo de iones extracelulares que da como resultado pérdida de hemostasis y apoptosis posterior. La patología después de la electroporación irreversible de una célula no muestra cambios estructurales o celulares hasta 24 horas después de la exposición de campo excepto en ciertos tipos de tejidos muy limitados. Sin embargo, en todos los casos el mecanismo de destrucción celular y muerte por IRE es apoptótico, lo que requiere que transcurra un tiempo considerable y no es visible patológicamente en un intervalo de tiempo para ser clínicamente útil en la determinación de la eficacia del tratamiento con IRE, que es un importante inconveniente clínico del método.

Desarrollada a principios de la década de 1990, la electro-quimioterapia combina el efecto físico de la poración reversible de la membrana celular con la administración de fármacos quimioterapéuticos tales como cisplatino y bleomicina. Aumentando temporalmente la permeabilidad de la membrana celular, se potencia enormemente la captación de fármacos quimioterapéuticos no permeantes o poco permeantes. Después de interrumpir el campo eléctrico, los poros se cierran y las moléculas de fármaco son retenidas dentro de las células diana sin daño significativo a las células expuestas, Este enfoque, a la quimioterapia, se desarrolló fuera de la investigación anterior desarrollando electroporación como una técnica para la transfección de genes y moléculas de ADN para efecto terapéutico. En este contexto, la electroporación irreversible que conduce a la muerte celular se observó como un fallo en tanto que las células tratadas no sobrevivían para realizar la modificación como se pretendía.

La electroporación irreversible (IRE) como método de ablación creció fuera de la comprensión de que el "fallo" para lograr la electroporación reversible podría utilizarse para destruir selectivamente tejido no deseado, la IRE destruye eficazmente un área de tratamiento predecible sin los inconvenientes de los métodos de ablación térmica que destruyen estructuras vasculares y de colágeno adyacentes. Durante un tratamiento de IRE típico, se colocan de uno a tres pares de electrodos en o alrededor del tumor, Se administran pulsos eléctricos cuidadosamente elegidos para inducir una intensidad de campo eléctrico por encima del potencial transmembrana crítico en grupos de 10, normalmente durante nueve ciclos. Cada ciclo de 10 pulsos dura aproximadamente un segundo, y los electrodos pausan brevemente antes de iniciar el siguiente ciclo. Como se describe en la patente de EE. UU., 8,048,067 de Rubinsky, et. al y número de solicitud J 3/332,133 por Arena, et al., la intensidad de campo y las características de pulso se eligen para proporcionar la intensidad de campo necesaria para la IRE pero sin inducir efectos térmicos como con la ablación térmica por RF. Sin embargo, debido a que las células sometidas a ablación por métodos de IRE experimentan muerte apoptótica sin ruptura de membrana, su capacidad para inducir una respuesta inmunitaria suplementaria tal como se observa con crio-ablación resulta afectada. El documento US 2008/132885 A1 describe sistemas y métodos adicionales para tratar sitios tisulares de un paciente usando la IRE. Cuando se usa como la única herramienta ablativa en un protocolo de tratamiento, la incapacidad de la IRE para inducir una respuesta inmunitaria suplementaria es una limitación sustancial a su beneficio terapéutico para los pacientes. Por otro lado, la crio-ablación sufre de las desventajas clínicas significativas que surgen del frío extremo y su capacidad para destruir estructuras sanas críticas cercanas. Lo que se necesita es una tecnología de ablación de tejido mínimamente invasiva que pueda evitar dañar el tejido sano al exponer el contenido celular sin desnaturalizar dicho contenido celular de modo que pueda desencadenar una respuesta inmunitaria clínicamente útil.

Compendio de la invención

La invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Es un objeto de la presente descripción proporcionar un método de ablación de tejido que usa pulsos eléctricos que provoca la muerte celular inmediata a través del mecanismo de rotura completa de la membrana de la célula.

Otro objeto es proporcionar un método de ablación de tejido que provoque la muerte celular inmediata rompiendo eléctricamente la membrana celular de manera que pueda monitorizarse mediante examen patológico, químico o espectroscópico inmediato del tejido para evaluar la eficacia del tratamiento y ajustar el mismo según sea necesario.

Es otro objeto más proporcionar un método de ablación de tejido usando pulsos eléctricos que provoca la rotura inmediata de la membrana celular de manera no térmica de modo que se ahorran estructuras de tejido sensibles y las proteínas intracelulares y de membrana están en el espacio extracelular sin desnaturalizarse para ser expuestas al sistema inmunitario del cuerpo con el fin de provocar una respuesta inmunitaria tumoral específica.

Es otro objeto más proporcionar un método de ablación de tejido que expone proteínas intracelulares y de membrana no desnaturalizadas al sistema inmunitario para obtener una respuesta inmunitaria tumoral específica que puede modularse y mejorarse mediante una variedad de inmunomoduladores adicionales.

De acuerdo con la presente descripción, los objetos descritos anteriormente y otros se logran, aplicando a tejido indeseable en el cuerpo un campo eléctrico externo configurado específicamente para desintegrar directa y completamente la membrana celular. Denominada Rotura de Membrana Eléctrica (EMB), la aplicación de un campo eléctrico oscilante externo provoca vibración y flexión de la membrana celular, lo que da como resultado un desgarro o rotura mecánicos drásticos e inmediatos de la membrana celular. La EMB aplica niveles de energía significativamente mayores que los métodos de la técnica anterior para romper la membrana celular en lugar de electroporar la membrana celular. A diferencia de los métodos de la técnica anterior, la EMB expulsa el contenido completo de la célula al fluido extracelular y expone los componentes internos de la membrana celular lo que induce una respuesta inmunológica por el sujeto.

Un sistema para la generación del campo eléctrico necesario para inducir la EMB incluye un generador de pulsos bipolares acoplado operativamente a un controlador para controlar la generación y la administración de los pulsos eléctricos necesarios para generar un campo eléctrico apropiado. El campo se genera mediante sondas terapéuticas colocadas en proximidad al tejido blando o células cancerosas dentro del cuerpo del sujeto y los pulsos bipolares se conforman, diseñan y aplican para lograr ese resultado de una manera óptima. Se puede prever una sonda de temperatura para la retroalimentación de temperatura al controlador que está configurado para controlar las características de salida de señal del generador de señal. El protocolo de EMB exige una serie de pulsos bipolares cortos e intensos para generar un campo eléctrico oscilante entre los electrodos que induce una acumulación igualmente rápida y oscilante de potencial transmembrana a través de la membrana celular. La carga acumulada aplica una fuerza oscilante y flexible a la membrana celular que al alcanzar un valor crítico provoca una rotura extensa de la membrana y el derrame del contenido celular. Además de ser bipolares, los pulsos eléctricos trazan preferiblemente una forma de onda cuadrada y se caracterizan por una inversión de carga instantánea que no tiene sustancialmente tiempo de relajación entre las polaridades positiva y negativa del pulso bipolar. Los pulsos de inversión de carga instantánea son significativamente más eficaces en la destrucción de membranas de células dieléctricas.

Una característica importante del campo eléctrico aplicado incluye la intensidad del campo (Voltios/cm), frecuencia, polaridad, forma, duración, número y separación. La intensidad de campo (Voltios/cm) es una función tanto de la tensión aplicada como de la separación entre electrodos y está preferiblemente en el intervalo de 1.500 V/cm a 10.000 V/cm sin consideraciones térmicas. La ablación de RF-EMB se realiza preferiblemente mediante la aplicación de una serie de no menos de 100 pulsos eléctricos en un tren de pulsos para impartir la energía necesaria sobre el tejido diana sin desarrollar problemas térmicos de ninguna manera clínicamente significativa. La duración del pulso es preferiblemente de 100 a 1000 ps. La relación entre la duración y la frecuencia de cada pulso determina el número de inversiones instantáneas de carga experimentadas por la membrana celular durante cada pulso. La duración de cada intervalo de ráfaga entre pulsos es determinada por el controlador 14 en base a consideraciones térmicas. La retroalimentación de temperatura en tiempo real del sitio de tratamiento puede proporcionarse al controlador por lo que el controlador puede modular los parámetros de tratamiento para eliminar los efectos térmicos según se desee. El flujo de corriente en el sitio de tratamiento también puede monitorizarse para este fin.

El método de ablación de EMB se lleva a cabo identificando en primer lugar la ubicación del tejido blando dentro del sujeto que ha de extirparse mediante técnicas de formación de imágenes médicas tales como TC o MRI u otros medios. Se determina una posición y separación preferidas de los electrodos con respecto al tejido diana y se insertan de 1 a 6 electrodos de aguja conectados al controlador y al generador de señales en posición en y alrededor del sitio de tratamiento. La colocación y el posicionamiento de los electrodos se confirman mediante la formación de imágenes médicas y el generador de pulsos se activa para aplicar pulsos eléctricos a los electrodos para generar el campo de tratamiento, provocando así la rotura de la membrana eléctrica de las células en el tejido blando.

La rotura de la membrana eléctrica provoca el derrame inmediato de todos los componentes intracelulares de las células rotas a un espacio extracelular y expone las partes constituyentes internas de la célula y la membrana celular que incluyen antígenos que inducen una respuesta inmunológica para destruir y eliminar este material y otro similar en el cuerpo del sujeto. La respuesta puede mejorarse mediante la administración de agentes que aumentan el proceso de la respuesta inmunológica, incluyendo fármacos. La rotura de la membrana eléctrica provoca un cambio inmediato, observable visualmente, destrucción de la membrana celular y muerte celular, de manera que el método puede incluir la biopsia de una parte del tejido diana tratado para verificar la eficacia del tratamiento inmediatamente después de la finalización del tratamiento mientras el paciente está todavía en posición para un tratamiento adicional. En otras realizaciones, las sondas de aguja colocadas en ubicaciones críticas de tratamiento podrían monitorizar diversos parámetros mediante medios químicos o espectroscópicos relacionados con la destrucción inmediata y el derrame del contenido intracelular también para verificar el tratamiento En alguna situación, puede cambiarse de EMB a ablación térmica sin retirar o volver a colocar los electrodos reconfigurando la señal generada por el generador de pulsos para aumentar la temperatura del tejido en los electrodos según técnicas térmicas de RF conocidas.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama de un poro de membrana celular.

La Figura 2 es un diagrama de la formación de poros en la membrana celular mediante un método de la técnica anterior.

La Figura 3 es una comparación de una inversión de carga de la técnica anterior con una inversión de carga instantánea según la presente descripción.

La Figura 4 es una onda cuadrada del pulso de inversión de carga instantánea según la presente descripción.

La Figura 5 es un diagrama de las fuerzas impuestas sobre una membrana celular en función de la anchura de pulso de campo eléctrico según la presente descripción.

La Figura 6 es un diagrama de un fallo de la técnica anterior para administrar pulsos prescritos debido a un exceso de corriente.

La Figura 7 es un diagrama esquemático de un bucle de retroalimentación según la presente descripción mediante el cual un controlador reduce una tensión de señal aplicada para mantener el amperaje de corriente en o por debajo de un máximo.

La Figura 8 es un diagrama de una reducción en la tensión de señal aplicada al alcanzar un nivel de corriente máximo para permitir la administración de señal continuada según la presente descripción.

La Figura es un diagrama esquemático de un sistema de generación y administración de pulsos para la aplicación del método de la presente descripción.

La Figura 10 es un diagrama de los parámetros de un tren de pulsos parcial según la presente descripción.

La Figura 11 es un gráfico de parámetros de protocolo de tratamiento ejemplares según la presente descripción.

La Figura 12 es un diagrama de los parámetros del protocolo de tratamiento ejemplar número 1.

La Figura 13 es un diagrama de los parámetros del protocolo de tratamiento ejemplar número 2.

La Figura 14 es un diagrama de los parámetros del protocolo de tratamiento ejemplar número 3.

La Figura 15 es un diagrama de los parámetros del protocolo de tratamiento ejemplar número 4.

Descripción detallada

La electroporación irreversible como un método de ablación de tejidos está bien desarrollada con equipos fabricados comercialmente tales como NanoKnife de AngioDynamics (Latham, NY) disponibles en el mercado. Como se ha descrito, esta técnica de ablación utiliza elevadas intensidades de campo eléctrico, dentro de parámetros específicos, para inducir la electroporación irreversible de la membrana celular, dando como resultado la muerte celular final debida a la pérdida de homeostasis y apoptosis. La presente descripción también describe métodos para extirpar células dentro del cuerpo de un sujeto que utiliza campos eléctricos de alta frecuencia y alta intensidad, pero lo hace a través del proceso completamente diferente de rotura de membranas eléctricas (EMB) que usa características de energía muy diferentes. La Rotura de la Membrana Eléctrica es la aplicación de un campo eléctrico oscilante externo para provocar vibración y flexión de la membrana celular, lo que da como resultado un desgarro, desintegración o rotura mecánicos drásticos e inmediatos de la membrana celular. A diferencia de IRE, en el que se crean nanoporos en la membrana celular pero a través de los cuales se libera poco o ningún contenido de la célula, la EMB rompe completamente la membrana celular de manera que todo el contenido de la célula se expulsa al fluido extracelular, y se exponen los componentes internos de la propia membrana celular.

La presente descripción se basa en la interacción de un campo eléctrico aplicado con el potencial transmembrana pero su similitud con el IRE termina allí. La EMB aplica niveles de energía significativamente mayores mediante perfiles de campo eléctrico configurados específicamente para desintegrar directa y completamente la membrana celular en lugar de electroporar la membrana celular. Otros han demostrado que los niveles de energía requeridos para la EMB son 100 veces mayores que para la IRE usando las mismas configuraciones de pulso (número de pulsos y densidad de tensión) administradas por los equipos y protocolos de IRE disponibles actualmente. La incapacidad de los métodos de IRE actuales y los protocolos energéticos para administrar la energía necesaria para provocar EMB explica por qué el examen patológico de especímenes tratados con IRE nunca ha mostrado las características patológicas de la EMB y es una razón crítica por la que la EMB no se había reconocido hasta ahora como un método alternativo de destrucción celular.

La FIG. 9 es un diagrama esquemático de un sistema 10 para la generación del campo eléctrico necesario para inducir células 11 de EMB dentro de un paciente 12. El sistema 10 incluye un generador 16 de impulsos bipolares acoplado operativamente a un controlador 14 para controlar la generación y administración a la sonda o sondas terapéuticas 20 (se muestran dos) de los pulsos eléctricos necesarios para generar un campo eléctrico apropiado para lograr la EMB. Las sondas terapéuticas se colocan cerca del tejido blando o células cancerosas 11 que están destinadas a ser extirpadas a través del proceso de EMB y los pulsos bipolares se conforman, diseñan y aplican para lograr ese resultado de una manera óptima. Se puede prever una sonda 22 de temperatura para la medición percutánea de la temperatura y retroalimentación al controlador de la temperatura en o cerca de los electrodos. El controlador puede incluir preferiblemente un procesador digital a bordo y una memoria y puede ser un sistema informático de propósito general, un controlador lógico programable o un dispositivo de control lógico digital similar. El controlador está configurado preferiblemente para controlar las características de salida de señal de la generación de señal que incluyen la tensión, frecuencia, forma, polaridad y duración de los pulsos, así como el número total de pulsos administrados en un tren de pulsos y la duración del intervalo de ráfaga entre pulsos.

Con referencia a la FIG. 9, el protocolo EMB exige una serie de pulsos eléctricos bipolares cortos e intensos administrados desde el generador de pulsos a través de una o más sondas terapéuticas 20 (electrodos) insertadas directamente en, o colocadas alrededor del tejido diana 11. Los pulsos bipolares generan un campo eléctrico oscilante entre los electrodos que induce una acumulación igualmente rápida y oscilante de potencial transmembrana a través de la membrana celular. La carga acumulada aplica una oscilación y flexión contra la membrana celular que al alcanzar un valor crítico provoca la rotura de la membrana y el derrame del contenido celular. Los pulsos bipolares son más letales que los pulsos monopolares porque el campo eléctrico pulsado provoca el movimiento de moléculas cargadas en la membrana celular pulsada porque el campo eléctrico pulsado provoca el movimiento de las moléculas cargadas provoca un cambio correspondiente en la dirección del movimiento de las moléculas cargadas y de las fuerzas que actúan sobre la célula. Las tensiones añadidas que se colocan sobre la membrana celular alternando por cambios alternos en el movimiento de moléculas cargadas crean cambios internos y externos adicionales que causan muescas, grietas, aplastamientos y desgarros repentinos irregulares en la membrana celular causando daños y desintegración más extensos, diversos y aleatorios de la membrana celular.

Con referencia a la Fig. 4, además de ser bipolar, la realización preferida de pulsos eléctricos es una para la que la tensión con el tiempo traza una forma de onda cuadrada y se caracteriza por pulsos de inversión de carga instantánea (ICR). Una forma de onda de tensión cuadrada es una que mantiene una tensión sustancialmente constante de no menos del 80% de la tensión de pico durante la duración de la porción de polaridad única de la traza, excepto durante la transición de polaridad. Un pulso de inversión de carga instantánea es un pulso que está específicamente diseñado para asegurar que no se permite sustancialmente ningún tiempo de relajación entre las polaridades positiva y negativa del pulso bipolar. Es decir, la transición de polaridad se produce virtualmente de forma instantánea.

La destrucción de las membranas celulares dieléctricas a través del proceso de Rotura de Membrana Eléctrica es significativamente más eficaz si el pulso de tensión aplicado puede pasar de una polaridad positiva a una negativa sin retraso entre las mismas. La inversión instantánea de la carga evita la nueva disposición de las cargas superficiales inducidas, lo que da como resultado un estado corto de tensión y fuerzas mecánicas transitorias en las células, cuyos efectos son amplificados por inversiones grandes y abruptas de la fuerza. Se cree que la tensión alterna en la célula diana que causa fatiga estructural reduce la intensidad crítica del campo eléctrico requerida para la EMB. La fatiga estructural añadida dentro y a lo largo de la membrana de la celda da como resultado o contribuye a cambios físicos en la estructura de la celda. Estos cambios físicos y defectos aparecen en respuesta a la fuerza aplicada con el protocolo de EMB oscilante y se aproximan a la rotura de la membrana dieléctrica a medida que la posición de la membrana se desplaza en respuesta a la oscilación, hasta el punto de rotura total de la membrana y descarga catastrófica. Esto puede ser análogo a la fatiga o debilitamiento de un material causado por daños estructurales progresivos y localizados que se producen cuando un material se somete a carga cíclica, tal como por ejemplo una pinza metálica de papel que se somete a doblado repetido. Los valores de tensión máxima nominales que causan tal daño pueden ser mucho menores que la resistencia del material en condiciones ordinarias. La efectividad de esta forma de onda en comparación con otras formas de onda de pulso puede ahorrar hasta 1/5 o 1/6 del requisito de energía total.

Con referencia a la FIG. 10, otra característica importante del campo eléctrico aplicado es la intensidad de campo (Voltios/cm) que es una función tanto de la tensión 30 aplicada a los electrodos por el generador 16 de pulsos como de la separación entre electrodos. La separación típica de electrodos para una sonda bipolar de tipo aguja podría ser de 1 cm, mientras que la separación entre múltiples electrodos de sonda de aguja puede ser seleccionada por el cirujano y podría ser típicamente de 75 cm a 1,5 cm. Un generador de pulsos para la aplicación de la presente descripción es capaz de suministrar hasta un potencial de 10 kV. La intensidad de campo aplicada real variará a lo largo del curso de un tratamiento para controlar el amperaje del circuito que es el factor de control en la generación de calor, y la seguridad del paciente (evitando grandes flujos de corriente no prevista a medida que la impedancia del tejido cae durante un tratamiento). Cuando la tensión y, por tanto, la intensidad de campo están limitadas por cuestiones de calentamiento, la duración del ciclo de tratamiento puede extenderse para compensar la acumulación de carga disminuida. Sin consideraciones térmicas, una intensidad de campo preferida para EMB está en el intervalo de 1.500 V/cm a 10.000 V/cm.

Continuando con la referencia a la FIG. 10, la frecuencia 31 de la señal eléctrica suministrada a los electrodos 20 y, por lo tanto, de las oscilaciones de polaridad del campo del campo eléctrico resultante, influye en la energía total impartida sobre el tejido objeto y, por lo tanto, en la eficacia del tratamiento, pero son menos críticas que otras características. Una frecuencia de señal preferida es de 14,2 kHz a menos de 500 kHz. El límite de frecuencia más bajo imparte la energía máxima por ciclo por debajo de la cual no se logra una deposición de energía incremental adicional. Con referencia a la FIG. 5, el límite superior de frecuencia se establece basándose en la observación de que por encima de 500 kHz, las oscilaciones de polaridad son demasiado cortas para desarrollar suficiente fuerza motriz sobre la membrana de la celda para inducir la distorsión y el movimiento deseados de la membrana de la celda. Más específicamente, a 500 kHz la duración de un solo ciclo completo es de 2 gs cuya mitad es de polaridad positiva negativa. Cuando la duración de una polaridad única se aproxima a 1 gs, hay tiempo insuficiente para que se acumule carga y se desarrolle fuerza motriz sobre la membrana. En consecuencia, el movimiento de la membrana se reduce o elimina y no se produce la EMB. En una realización más preferida, la frecuencia de señal es de 100 kHz a 450 kHz. En este caso, el límite inferior se determina por el deseo de evitar la necesidad de anestesia o fármacos de bloqueo neuromuscular para limitar o evitar los efectos estimulantes de la contracción muscular de señales eléctricas aplicadas al cuerpo. El límite superior en esta realización más preferida se sugiere por la frecuencia de equipo de ablación térmica por radiofrecuencia ya aprobado por la PDA, que se ha considerado seguro para uso terapéutico en pacientes médicos

Además de controlar la amplitud 30 de pulso, la frecuencia 31, la polaridad y la forma proporcionadas por el generador 16 de pulsos, el controlador lógico 14 controla el número de pulsos 32 que se han de aplicar en la serie de tratamiento o tren de pulsos, la duración de cada pulso 32 y el retardo 33 de ráfaga entre pulsos. Aunque en la FIG. 10 sólo se representan dos debido a limitaciones de espacio, la ablación por RF-EMB se realiza preferiblemente mediante la aplicación de una serie de no menos de 100 pulsos eléctricos 32 en un tren de pulsos para impartir la energía necesaria en el tejido objetivo 11 sin desarrollar problemas térmicos de ninguna manera clínica. La anchura de cada pulso individual 32 es preferiblemente de 100 a 1000 gs con un intervalo 33 de ráfaga entre pulsos durante el cual no se aplica tensión con el fin de facilitar la disipación de calor y evitar efectos térmicos. La relación entre la duración de cada pulso 32 y la frecuencia 31 (periodo) determina el número de inversiones instantáneas de carga experimentadas por la membrana de la célula durante cada pulso 32. La duración de cada intervalo 33 de ráfaga entre pulsos determinada por el controlador 14 se basa en consideraciones térmicas. En una realización alternativa, el sistema 10 está provisto además de una sonda 22 de temperatura insertada próxima al tejido diana 11 para proporcionar una lectura de temperatura localizada en el sitio de tratamiento al controlador 14. La sonda 22 de temperatura puede ser una sonda de tipo aguja separada que tiene una punta de termopar, o puede formarse integralmente con o desplegarse desde uno o más de los electrodos de aguja. Con la retroalimentación de temperatura en tiempo real, el controlador puede modular los parámetros de tratamiento para eliminar los efectos térmicos según se desee comparando la temperatura observada con varios puntos de ajuste de temperatura almacenados en la memoria. Más específicamente, el controlador puede acortar o aumentar la duración de cada pulso 32 para mantener una temperatura establecida en el sitio de tratamiento para, por ejemplo, crear un calentamiento (temperatura alta) para el tracto de la aguja para evitar el sangrado o para limitar el calentamiento (temperatura baja) para evitar cualquier necrosis coagulativa. La duración del intervalo entre ráfagas puede modularse de la misma manera con el fin de eliminar la necesidad de detener el tratamiento y maximizar la deposición de energía para compensar la EMB-RF. La amplitud 30 de pulso y el número total de pulsos en el tren de pulsos también pueden modularse con el mismo propósito y resultado.

En otra realización más, el controlador puede monitorizar o determinar el flujo de corriente a través del tejido durante el tratamiento con el fin de evitar el sobrecalentamiento al tiempo que permite que el tratamiento continúe reduciendo la tensión aplicada. La reducción en la impedancia del tejido durante el tratamiento debido a la acumulación de carga y la rotura de la membrana puede provocar un flujo de corriente aumentado que genera un calentamiento adicional en el sitio de tratamiento. Con referencia a la FIG. 6, los métodos de tratamiento anteriores han sufrido la necesidad de detener el tratamiento cuando la corriente supera un máximo permisible de manera que no se cumplen los objetivos del tratamiento. Al igual que con la monitorización directa de la temperatura, la presente descripción puede evitar la necesidad de detener el tratamiento reduciendo la tensión aplicada y, por lo tanto, la corriente a través del tejido para controlar e impedir efectos térmicos clínicamente significativos no deseados. La modulación de la duración del pulso y la duración del intervalo de ráfaga de pulsos también puede ser empleada por el controlador 11 para este propósito como se describe.

Con referencia a la FIG. 11, se detallan cuatro protocolos de tratamiento de RF-EMB ejemplares. Con referencia adicional a la FIG. 12, en el protocolo 1, se aplica un tren de pulsos de 83 pulsos 32 cada uno de una duración de 10 ms a 600 voltios a electrodos separados en 1 cm dando como resultado una intensidad de campo de 600 V/cm entre los electrodos. En este ejemplo, los pulsos aplicados son bipolares con una frecuencia de 125 kHz con un ancho de pulso de 10 ms, de manera que la energía total aplicada durante los 83 segundos de duración del tren de pulsos fue de 10,38 mJ. Estos modelos de tratamiento y la energía total suministrada se referenciaron a partir del trabajo que describe parámetros energéticos usados para la rotura de la membrana de algas por , Foltz, G., Algae Lysis With Pulsed Electric Fields. Universidad Politécnica del Estado de California, San Luis Obispo 2012- descargado de http://digitalcommons-calpoly.edu/thets/732. Foltz demostró este requisito de energía usando pulsos unipolares, sin la ventaja de los pulsos de inversión de carga instantánea, haciendo de este el peor escenario de casos para los requisitos de energía para producir EMB.

Con referencia a la FIG. 13, en el protocolo 2 la EMB se logra mediante un ancho de pulso disminuido a 200 gs y un tren de pulsos extendido a 2490 pulsos en un campo de 10 kV/cm durante un tiempo de tratamiento total de 49 segundos. La energía aplicada total es de nuevo de 10,38 mJ. Con referencia a la FIG. 14, en el protocolo 3 pulsos adicionales por encima de los 2490 pretendidos inicialmente son añadidos por el controlador 11 para compensar la reducción en la tensión/intensidad de campo durante el tratamiento en base a la retroalimentación del sitio de tratamiento. Con referencia a la FIG. 15, en el protocolo 4 el pulso adicional por encima de los 2490 pretendidos inicialmente se añade para compensar la pérdida de recuperación de eficiencia de la señal de 250 kHz en comparación con la frecuencia de señal de 125 kHz en los protocolos ejemplares anteriores.

El método de ablación de tejido blando indeseable de la presente descripción se lleva a cabo identificando en primer lugar la ubicación del tejido blando dentro del sujeto que ha de ser extirpado. La identificación de tejido puede realizarse mediante técnicas de formación de imágenes médicas conocidas tales como ultrasonidos, TC o MRI. El tejido blando diana puede ser o no una neoplasia maligna, pero más bien solo necesita ser tejido que no es deseable en su ubicación actual por alguna razón. Después de la identificación del tejido diana, la posición y separación preferidas de los electrodos con respecto al tejido blando diana se determina basándose en la ubicación y la forma del tejido que ha de ser extirpado, la forma y ubicación de estructuras adyacentes, la constante dieléctrica y la conductividad del tejido blando diana y circundante, Normalmente se usan de 1 a 6 electrodos de sonda de tipo aguja. Los electrodos se introducen en posición en y alrededor del tratamiento y se conectan a un controlador para la administración controlada de los pulsos eléctricos para la generación y el tratamiento de campo. Los electrodos de sonda pueden incluir un sensor de temperatura tal como un termopar para leer y señalizar al controlador la temperatura local en o cerca del electrodo. La colocación y el posicionamiento de los electrodos pueden confirmarse preferiblemente mediante formación de imágenes médicas. El generador de impulsos es activado por el controlador para aplicar pulsos eléctricos a los electrodos para generar el campo de tratamiento como se ha descrito anteriormente, causando de esta manera la rotura de la membrana eléctrica de algunas o todas las células de dicho tejido blando.

La rotura de la membrana eléctrica, a diferencia de las técnicas de IRE o ablación térmica, provoca el derrame inmediato de todos los componentes intracelulares de las células de rotura en un derrame inmediato extracelular de todos los componentes intracelulares de las células rotas en un espacio extracelular y expone la parte constituyente de la membrana celular al espacio extracelular. Los componentes intracelulares incluyen antígenos celulares y las partes constituyentes internas de la membrana celular incluyen antígenos específicos de la membrana celular que inducen una respuesta inmunológica para destruir y eliminar este material y material similar en el cuerpo del sujeto. Un material similar puede ser otro material en el cuerpo del sujeto que tiene los mismos antígenos celulares o antígenos específicos de la membrana celular en ubicaciones remotas del sitio de tratamiento, incluido el tejido metastásico. Sin embargo, el cuerpo humano también tiene sistemas de defensa naturales para tumores que impiden la destrucción y/o eliminación del tumor en algunos casos. Uno de estos funciona a través de una señal inhibidora, que se presenta por sí misma a los linfocitos T citotóxicos (CTL) del cuerpo, las células en el cuerpo que reconocen y destruyen células cancerosas, y se une al receptor del antígeno 4 asociado a linfocitos T citototóxicos (CTLA-4), desconectando la reacción citotóxica que de otro modo puede destruir la célula cancerosa.

Por tanto, según otra realización de la presente descripción, la respuesta inmunológica de RF-EMB se potencia mediante la administración de fármacos que aumentan el proceso de respuesta inmunológica, incluyendo fármacos que bloquean la inhibición de la señal inhibidora de CTLA-4 de linfocitos citotóxicos, o que se unen a la proteína S100-A9, que está implicada en la inoculación de funciones celulares mieloides reguladoras. Un ejemplo del tipo anterior de fármaco es lpilimumab (comercializado como Yervoy®).). Un ejemplo de este último es Tasquinimod. Tales fármacos pueden administrarse por cualquier medio, incluyendo sin limitación, por vía intravenosa, oral o intramuscular y pueden inyectarse adicionalmente directamente en o junto al tejido blando diana inmediatamente antes o después de aplicar el campo eléctrico de EMB o un número establecido de días antes o después de un tratamiento de EMB-RF, como se describe en los protocolos de tratamiento de muestras a continuación. Dicho fármaco potenciador de la respuesta inmunológica puede estar comprendido también de células dendríticas autólogas. Por ejemplo, la terapia con Sipuleucel-T (comercializado como Probempe®) usa células dendríticas autólogas de pacientes activadas con fosfatasa ácida prostática (PAP) y se infunden de nuevo en el sistema del paciente. Otro fármaco inmunológico relevante es pembrolizumab, que funciona bloqueando una proteína conocida como receptor de Muerte Programada (PD-1), o una proteína relacionada conocida como PD-L1, ambas utilizadas por tumores como defensa para las células que luchan contra tumores. Otro fármaco inmunológico relevante más es la ciclofosfamida, que reduce las células T reguladoras e interfiere con la replicación del ADN. Muchas pruebas inmunológicas, tales como las descritas en la presente memoria, son eficaces contra uno o un pequeño número de tipos de cáncer, pero no son eficaces, de forma aislada, contra todos los tipos de cáncer para los que se diseñó esta clase de fármacos para su uso.

La combinación del tratamiento con RF-EMB con la administración de un fármaco inmunológico tal como los descritos anteriormente deja los antígenos de las células diana intactos y expuestos al entorno externo, permitiendo que reaccionen con el sistema inmunológico del paciente, todo lo cual ayuda al funcionamiento del fármaco inmunológico. El tratamiento combinado puede ayudar en el tratamiento de pacientes con una de dos patologías de enfermedad distintas. En una primera realización, que comprende un método para tratar a un paciente con un tumor canceroso primario y una alta probabilidad de enfermedad micrometastática, la EMB-RF puede aplicarse para provocar la destrucción directa del tumor primario precedida o seguida por la administración de un régimen farmacológico inmunológico diseñado para tumor precedida o seguida por la administración de un régimen farmacológico inmunológico diseñado para interaccionar de manera cooperativa con los antígenos intactos que se han expuesto como resultado del tratamiento de EMB-RF. El fármaco inmunológico elegido puede ser uno que bloquee la respuesta inhibidora que de otro modo podría evitar que el cuerpo del paciente reconozca y destruya las células diana de RF-EMB y otros que tengan los mismos antígenos celulares (es decir, crecimientos micrometastásicos) como resultado del tratamiento de RF-EMB. En una segunda realización, que comprende un método para tratar a un paciente que tiene enfermedad metastásica avanzada, el tratamiento de EMB-RF puede administrarse en los puntos medios de un plan de tratamiento en curso utilizando un fármaco inmunológico como se describió anteriormente. En esta realización, los tratamientos de RF-EMB potencian la eficacia del fármaco inmunológico exponiendo antígenos celulares únicos al sistema inmunitario del paciente.

Se describen ahora tres protocolos de tratamiento de muestras para el uso de RF-EMB junto con la administración de un fármaco inmunológico, en el Ejemplo 1, se administran 300 mg/m2 de ciclofosfamida por vía intravenosa al paciente el Día 1 del tratamiento. El Día 3, el paciente recibe tratamiento de EMB-RF según uno de los cuatro protocolos descritos anteriormente con referencia a la Fig. 11, comenzando dos semanas después del tratamiento de EMB-RF y prolongando hasta la semana 26 después del tratamiento de EMB-RF, se administran 25 mg de ciclofosfamida al paciente por vía oral durante seis ciclos, comprendiendo cada ciclo cuatro semanas, en donde el paciente recibe una dosis oral de ciclofosfamida dos veces al día en ciclos de siete días si (en el que se administra el fármaco), siete días no (en el que no se administra fármaco). En el Ejemplo 2, el paciente se trata el Día 1 con tratamiento de EMB-RF según uno de los cuatro protocolos descritos anteriormente con referencia a la Fig. 11. También el Día 1, se administran al paciente 3 mg/kg de ipilimumab por vía intravenosa durante el transcurso de 90 minutos. El paciente recibe entonces tres dosis adicionales de ipilimumab, 3 mg/kg por vía intravenosa, cada dosis separada por un período de tres semanas. En el Ejemplo 3, se administran 300 mg/m2 de ciclofosfamida por vía intravenosa del paciente el Día 1 de tratamiento. El Día 3 de tratamiento, el paciente recibe tratamiento de RF-EMB según uno de los cuatro protocolos descritos anteriormente con referencia a la Fig. 11, con la adición de la inyección de células dendríticas autólogas directamente en el tumor diana. Comenzando dos semanas después del tratamiento con EMB-RF y prolongándolo hasta la semana 26 después del tratamiento con EMB-RF, se administran 25 mg de ciclofosfamida al paciente por vía oral durante seis ciclos, comprendiendo cada ciclo cuatro semanas, en el que el paciente recibe una dosis oral de ciclofosfamida dos veces al día en ciclos de: siete días si (en el que se administra el fármaco); siete días no (en el que no se administra fármaco).

La rotura de la membrana eléctrica provoca un cambio inmediato del tejido, observable visualmente, destrucción de la membrana celular y muerte celular. Como resultado, el método puede incluir la biopsia de una porción del tejido diana tratado para verificar la eficacia del tratamiento inmediatamente después de la finalización del tratamiento mientras el paciente aún está en posición para un tratamiento adicional. Puede administrarse inmediatamente tratamiento adicional basándose en el resultado de la biopsia y en la determinación visual de la eficacia del tratamiento.

Alternativamente, debido a que el entorno intracelular comprende una composición química única, tal como altas concentraciones de potasio y ácido úrico, el derrame del contenido celular puede detectarse ahora mediante métodos tales como colocar una o más sondas de aguja en ubicaciones críticas del tratamiento para medir los niveles químicos usando reactivos, mediciones de impedancia o resistencia eléctrica, mediciones de pH, espectroscopía o similares. Además, un dispositivo tal como un sensor de microagujas, que comprende uno o más sensores capaces de medir las cualidades anteriores integrados en o insertados a través del núcleo hueco de una microaguja, puede insertarse en una o más ubicaciones predeterminadas en el área de tratamiento durante un procedimiento de RF-EMB para medir el derrame celular mediante la composición química extracelular en tiempo real.

Según este método, en una realización preferida, una aguja hueca que tiene al menos una dimensión de menos de 1 milímetro (conocida como microaguja) se equipa con uno o más sensores insertando el sensor o sensores a través del centro hueco de la aguja. El sensor o sensores puede ser uno o más de los tipos descritos anteriormente, incluyendo, pero sin limitación, un sensor de pH, un sensor de lactato, un sensor de glucosa, un sensor de impedancia eléctrica, un sensor de potasio y/o un sensor de ácido úrico. Múltiples de tales sensores pueden estar agrupados juntos o podría usarse un único sensor que mida una o más de las propiedades relevantes. En una realización alternativa, el sensor puede ser un espectrómetro. Más preferiblemente, una o más microagujas que contienen sensores se insertan en el área de tratamiento seleccionada inmediatamente antes de la aplicación del tratamiento con FR-EMB y permanecen insertadas en el tejido tratado durante toda la duración de la sesión de tratamiento. Las lecturas de los sensores pueden medirse por cualquier medio conocido en el campo. Dicho método tiene el beneficio añadido de permitir que el proveedor de tratamiento observe y cuantifique el nivel de destrucción de células diana, y por tanto la eficacia del tratamiento, en tiempo real e in vivo. Por el contrario, en la técnica anterior, los métodos de ablación térmica o los métodos de ablación no térmica tales como IRE carecen de esta capacidad porque no provocan que una cantidad mensurable del contenido celular se derrame inmediatamente en el área extracelular, dando como resultado en su lugar necrosis térmica o muerte celular apoptótica pretendida que destruye la célula y su contenido antes de que cualquiera de los contenidos celulares se exponga para la medición. Por lo tanto, los métodos de ablación de la técnica anterior a menudo requerían una biopsia del área tratada para determinar la eficacia del tratamiento, que no se puede completar hasta la terminación del tratamiento.

Según esta realización preferida, los parámetros de tratamiento y/o ubicación o ubicaciones pueden monitorizarse y/o ajustarse en tiempo real basándose en los niveles de derrame medidos en tiempo real durante el proceso de tratamiento. Además, o alternativamente, las mediciones del contenido celular como se describe en la presente memoria se pueden tomar antes, después o entre fases de tratamiento sin la necesidad de someter al paciente a una biopsia u otro procedimiento invasivo para medir la eficacia del tratamiento. Las técnicas de medición para contenidos celulares no se limitan a las descritas en la presente memoria, sino que pueden llevarse a cabo por cualquier medio conocido en la técnica de medición de composiciones químicas de un área de tratamiento objetivo in vivo y/o en tiempo real.

En otra realización alternativa más de la presente descripción con o sin biopsia intermedia y observación visual de la eficacia, el modo de tratamiento según la presente descripción puede cambiarse de EMB a ablación térmica sin retirada o nueva colocación de los electrodos. Puede ser deseable un cambio a la ablación térmica para controlar el sangrado en el sitio del tejido o para la destrucción directa de tejido no deseable junto con la RF-EMB. El cambio puede producirse dentro de un único tren de pulsos mediante el funcionamiento del controlador, o puede lograrse mediante un segundo tren de pulsos o tren de pulsos adicional dirigido solo a ablación térmica de RF. El cambio se consigue reconfigurando la señal generada por el generador de pulsos para aumentar la temperatura del tejido en los electrodos según técnicas térmicas de RF conocidas.

Aplicabilidad industrial

Los estudios estiman que el cáncer mata aproximadamente 20.000 personas en todo el mundo al día. Se podrían evitar muchos accidentes y podría mejorarse la calidad de vida para muchos pacientes con métodos más eficaces, mínimamente invasivos, para el tratamiento de tumores cancerosos y otras afecciones que dan como resultado tejido blando no deseado.. Los tratamientos mínimamente invasivos capaces de ayudar al propio sistema inmunitario de un paciente para atacar y eliminar el tejido canceroso no deseado dentro del cuerpo del paciente ayudarían aún más a salvar vidas y mejorar la calidad de vida del paciente. Lo que se necesita es un método mínimamente invasivo de eliminación de tejido blando no deseado, tal como tumores cancerosos. La presente descripción es un método innovador de ablación de tejido blando no deseado dentro del cuerpo de un paciente que tiene aplicabilidad para muchos tipos de tejido canceroso así como no canceroso, que mejora significativamente la eficacia de realización de dicho procedimiento, y que proporciona además un medio para medir directamente la eficacia de dichos procedimientos in vivo y simultáneamente con el tratamiento.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un sistema para la ablación de tejido blando indeseable usando rotura de membrana eléctrica por radiofrecuencia, RFEMB, que comprende;

un generador de pulsos eléctricos bipolares configurado para producir pulsos bipolares, en el que

los pulsos bipolares se caracterizan por una inversión instantánea de carga entre una polaridad positiva y una polaridad negativa,

al menos una sonda terapéutica, siendo dicha sonda un electrodo conectado operativamente a dicho generador de pulsos bipolares, estando dicha sonda y dicho generador de pulsos bipolares configurados para aplicar a dicho tejido blando los pulsos bipolares para generar un campo eléctrico oscilante que comprende una intensidad de campo en el intervalo de 1500 V/cm a 10.000 V/cm, en el que el campo eléctrico oscilante es suficiente para provocar la RFEMB de una membrana celular de una pluralidad de células de dicho tejido blando en donde la RFEMB provoca la destrucción de la membrana celular, el derrame inmediato de todos los componentes intracelulares a un espacio extracelular y la exposición de una parte constituyente interna de dicha membrana celular a dicho espacio extracelular;

una sonda de temperatura; y

un controlador conectado operativamente a dicho generador de pulsos bipolares eléctricos, dicha sonda terapéutica y dicha sonda de temperatura.

2. El sistema de la reivindicación 1, en donde una tensión de dichos pulsos eléctricos bipolares es de desde 0,5 kV a 10 kV y una frecuencia de dicho campo eléctrico oscilante generado por los pulsos eléctricos bipolares es de 14,2 kHz a menos de 500 kHz.

3. El sistema de la reivindicación 1, en donde dichos pulsos eléctricos bipolares trazan una forma de onda cuadrada caracterizado por que - inversión de carga instantánea no tiene sustancialmente tiempo de relajación entre las polaridades positiva y negativa del pulso bipolar.

4. El sistema de la reivindicación 1, en donde la duración de dichos pulsos eléctricos bipolares es de desde 100-1000 ps.

5. El sistema de la reivindicación 1, en donde dicho al menos un pulso bipolar eléctrico es una serie de no menos de 100 pulsos bipolares.