ES2988600T3

ES2988600T3 - Proceso para elaborar una composición de liposoma que comprende una saponina

Info

Publication number: ES2988600T3
Application number: ES17828665T
Authority: ES
Inventors: Philippe Cara; Veronique Monique Roberte Henderickx; Cupere Vinciane Martha De; Kesel Carine Berthe Ghislaine De
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2016-12-07
Filing date: 2017-12-05
Publication date: 2024-11-21
Anticipated expiration: 2037-12-05
Also published as: CA3045952A1; US10695424B2; MX2019006728A; EP3551222B1; BR112019011286A2; CN110035770A; JP7136777B2; CN110035770B; EP3551222A1; JP2020500891A; WO2018104313A1; BE1025160A1; US20200061186A1; BE1025160B1

Abstract

La presente invención proporciona composiciones, métodos y procesos para la maduración de composiciones de liposomas submicrónicos que comprenden un lípido, un esterol y una saponina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proceso para elaborar una composición de liposoma que comprende una saponina

Campo técnico

La presente invención se refiere a procesos mejorados para la producción de composiciones de liposoma que contienen saponina, en particular, la filtración de tales composiciones.

Antecedentes de la invención

Durante las últimas décadas, los liposomas (también conocidos como vesículas lipídicas bicapa) se utilizan cada vez más para encapsular y administrar compuestos farmacéuticos. Los liposomas comprenden una o más bicapas de lípidos (tales como fosfolípidos), y pueden contener otras moléculas, tales como proteínas o hidratos de carbono, en su estructura. La capa lipídica del liposoma confina y protege el compuesto farmacéutico encerrado hasta que el liposoma llega a su destino y se adhiere a la membrana externa de las células diana. Mediante este proceso, se minimiza la toxicidad del fármaco para las células sanas y se puede aumentar la eficacia terapéutica. Debido a la presencia de fases lipídicas y acuosas en su estructura, los liposomas se pueden utilizar en la encapsulación o captura de material hidrosoluble y lípidos, además de compuestos anfifílicos.

Los liposomas se pueden utilizar en vacunas/composiciones inmunogénicas en la formulación de composiciones adyuvantes. Como estas composiciones adyuvantes a menudo se administran por vía parenteral a los seres humanos, es deseable que sean estériles. Los liposomas utilizados como adyuvantes son generalmente liposomas submicrónicos y son lo suficientemente pequeños como para ser filtrados de manera estéril a través de filtros de 0,2 pm. Se divulgan ejemplos de métodos para producir composiciones de liposoma que comprenden una saponina, p. ej., en los documentos WO 2010/142686, WO 2013/041572, WO 1998/15287 o Brunneret al.,2017 ("QS-21 Adjuvant: Laboratory-Scale Purification Method and Formulation Into Liposomes", Vaccine Adjuvants, Vol. 1494: páginas 73-86) Un objeto de la presente invención es proporcionar un proceso para mejorar la filtración de liposomas submicrónicos.

Sumario de la invención

Los presentes inventores mejoraron la filtración de liposomas submicrónicos que contienen saponina utilizando métodos que implican la maduración de las formulaciones liposomales submicrónicas. Por ello, en un aspecto, la presente invención proporciona un método como se define en la reivindicación 1.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método como se define en la reivindicación 13.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método como se define en la reivindicación 15.

Descripción de las figuras

Figura 1: Diagrama de flujo que ilustra la formulación de la formulación liposomal que contiene saponina del Ejemplo 2 y 3.

Figura 2: Ilustración de Vmáx en función del tiempo antes de la filtración utilizando diferentes filtros: ♦ Sartopore2 0,45/0,2; ■ Sartopore20,35/0,2; ▲ Sartopore20,8/0,2; X pa|| EKV; pa|| EDF.

Figura 3: Ilustración de la evolución del tamaño de partícula (nm) de la formulación liposomal que contiene saponina lote 1 (A) y lote 2 (B) en diferentes tiempos de maduración para el Ejemplo 3.

Figura 4: Ilustración de la evolución del PDI de la formulación liposomal que contiene saponina lote 1 (A) y lote 2 (B) en diferentes tiempos de maduración para el Ejemplo 3.

Figura 5: Ilustración de Vmáx en tres lotes diferentes de filtro de formulación liposomal que contiene saponina lote 1 (A) y lote 2 (B) en diferentes tiempos de maduración para el Ejemplo 3.

Figura 6: Ilustración del contenido de colesterol (pg/ml) antes y después de la filtración en tres lotes diferentes de filtro de formulación liposomal que contiene saponina lote 1 (A) y lote 2 (B) en diferentes tiempos de maduración para el Ejemplo 3.

Descripción detallada de la invención

Los liposomas, en particular, los liposomas submicrónicos se pueden utilizar en la formulación de adyuvantes inmunitarios. Las composiciones de vacunas que comprenden dichos liposomas en combinación con uno o más antígenos, por lo general se administran por vía parenteral y, por lo tanto, es deseable que las composiciones de liposoma sean estériles. Los presentes inventores han demostrado sorprendentemente que una etapa de maduración (tal como se define en la siguiente sección) resuelve/evita problemas en la filtración de los liposomas, tal como la obstrucción del filtro.

Maduración

Por "maduración" o "madurado" se entiende que la composición liposomal submicrónica que contiene saponina se almacena durante al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o al menos 16 horas después de la adición de la saponina a la primera composición liposomal submicrónica. Por ejemplo, la maduración dura al menos 4 horas, al menos 6 horas o al menos 8 horas. Por ejemplo, la maduración se aplicará o realizará durante un tiempo no superior a 36 horas, no superior a 48 horas, o, no superior a 24 horas, tal como entre 4 y 24 horas. En una realización, la maduración se aplica o realiza durante 16 a 24 horas. La maduración se puede realizar en cualquier recipiente adecuado. La maduración se puede realizar sin agitar la formulación. Después de que una formulación haya pasado por una o más etapas de maduración o madurado, ésta podría describirse como "madurada".

La maduración se realiza a cualquier temperatura adecuada. Normalmente, la maduración se lleva a cabo a temperatura ambiente, a una temperatura entre 15 y 30 °C, o a una temperatura entre 15 y 25 °C. Como alternativa, la maduración se realiza a aproximadamente 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26 o 27 °C.

Por ejemplo, la maduración puede realizarse a una temperatura entre 15 y 25 °C durante un período de 8 a 24 horas.

Esterilización

Por "filtro de calidad estéril" se entiende un filtro que produce un efluente estéril después de ser expuesto a microorganismos a un nivel de exposición superior o igual a 1x107/cm2 de área de filtración efectiva. Los filtros de calidad estéril son bien conocidos por los expertos en la materia de la invención y normalmente tienen un tamaño de poro de aproximadamente 0,2 pm y por lo tanto incluyen filtros con un tamaño de poro de aproximadamente 0,22 pm. Para el fin de la presente invención, los filtros de calidad estéril tienen un tamaño de poro entre 0,1 y 0,25 pm, tal como entre 0,18 y 0,22 pm.

Las membranas del filtro de calidad estéril pueden estar hechas de cualquier material adecuado conocido por el experto en la materia, por ejemplo, pero sin limitarse a acetato de celulosa, polietersulfona (PES), fluoruro de polivinilideno (PVDF), politetrafluoroetileno (PTFE) y similares. Por ejemplo, una o más o todas las membranas de filtro que se pueden utilizar en los métodos de la presente invención comprenden polietersulfona (PES), en particular polietersulfona hidrófila. Los filtros utilizados en los procesos descritos en el presente documento pueden ser un filtro de doble capa, en particular, un filtro estéril con prefiltro incorporado que tiene un tamaño de poro mayor que el tamaño de poro del filtro final. Por ejemplo, el filtro esterilizante es un filtro de doble capa en donde la capa de membrana de prefiltro tiene un tamaño de poro entre 0,3 y 0,5 pm, tal como 0,35 o 0,45 pm. Los filtros pueden comprender membrana(s) de filtro asimétricas, tales como membrana(s) de filtro de PES hidrófila asimétrica. Como alternativa, la capa de filtro esterilizante puede estar hecha de PVDF, p. ej., en combinación con una capa de membrana de prefiltro de PES hidrófila asimétrica.

Liposomas

El término "liposoma" es bien conocido en la técnica y define una categoría general de vesículas que comprenden una o más bicapas lipídicas que rodean un espacio acuoso. Los liposomas están constituidos por una o más bicapas de lípidos, tales como los fosfolípidos, y pueden contener otras moléculas, tales como proteínas o hidratos de carbono, en su estructura. Debido a que están presentes tanto la fase lipídica como la acuosa, los liposomas pueden encapsular o atrapar material hidrosoluble, material liposoluble y/o compuestos anfifílicos. Los liposomas previstos para la presente invención contienen una cantidad sustancial de lípidos (formadores de liposomas). Los lípidos formadores de liposomas están disponibles en la técnica y pueden ser lípidos aniónicos, catiónicos o neutros. Por ejemplo, la porción lipídica formadora de liposomas consiste esencialmente en lípidos neutros. Por "lípido neutro" se entiende que la carga neta global del lípido es (aproximadamente) cero. Por lo tanto, el lípido puede ser no iónico globalmente o puede ser dipolar. Los liposomas pueden comprender un lípido zwitteriónico. Algunos ejemplos de lípidos adecuados son fosfolípidos tales como especies de fosfatidilcolina. Los liposomas pueden contener fosfatidilcolina como lípido formador de liposomas que es convenientemente no cristalino a temperatura ambiente. Algunos ejemplos de estos lípidos de fosfatidilcolina no cristalinos incluyen la fosfatidilcolina de yema de huevo, la dioleil fosfatidilcolina (DOPC) o la dilauril fosfatidilcolina (DLPC). En una realización particular, los liposomas de la presente invención contienen DOPC, o, consisten esencialmente en DOPC.

Los liposomas también pueden contener una cantidad limitada de un lípido con carga que aumenta la estabilidad de la estructura liposoma-saponina para los liposomas compuestos por lípidos saturados, p. ej., los liposomas compuestos de DLPC. En estos casos, la cantidad de lípidos cargados es adecuada entre 1 y 20 % p/p, preferentemente del 5-10 % p/p de la composición de liposoma. Ejemplos adecuados de dichos lípidos cargados incluyen ácidos grasos, tales como el ácido láurico o, como alternativa, fosfatidilglicerol y fosfatidilserina. Convenientemente, los liposomas neutros contendrán menos del 5 % p/p de lípidos cargados, tal como menos del 3 % p/p o menos del 1 % p/p. Por ejemplo, los liposomas pueden estar compuestos de DLPC y ácido láurico, p. ej., en una proporción DLPC:ácido láurico entre 3,5:1 y 4,5:1, tal como de aproximadamente 4:1.

Los liposomas previstos para la presente invención comprenden además un esterol. Algunos esteróles adecuados incluyen p-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol. En una realización particular, los liposomas contienen colesterol en forma de esterol. Estos esteroles son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el colesterol se divulga en el Índice Merck, 11a ed., página 341, como un esterol natural que se encuentra en la grasa animal. La relación entre esteroles y lípidos es normalmente de 1:100 a 1:2 (mol/mol), convenientemente de 1:5 a 1:4, o aproximadamente 1:4.

Los liposomas de la presente invención pueden comprender DOPC y colesterol en una proporción de 1:4 (colesterol: DOPC)

El diámetro promedio Z (ZAD) y el índice de polidispersidad (PDI) se determinan basándose en los datos obtenidos mediante dispersión de luz dinámica (DLS). Un haz de luz láser monocromático y coherente ilumina una muestra representativa para el análisis del tamaño de partículas, dispersado en un líquido en una concentración adecuada. La luz dispersada por las partículas en un ángulo determinado es registrada por un detector (un fotodiodo de avalancha) cuya salida se alimenta a un correlador. Dado que las partículas dispersas están en movimiento browniano continuo, la intensidad dispersada observada fluctúa a lo largo del eje del tiempo. Por consiguiente, el análisis en función del tiempo de estas fluctuaciones de intensidad proporciona información sobre el movimiento de las partículas dispersadas. En un experimento de DLS, el análisis temporal se realiza con un correlador que construye la función de autocorrelación temporal de la intensidad dispersada. La tasa de descomposición está asociada al coeficiente de difusión traslacional D de las partículas. Esta descomposición se interpreta en términos de tamaño medio de partícula e índice de polidispersidad mediante el llamado método de cumulantes.

Para partículas esféricas no interactuantes dispersadas en un medio de viscosidad n, el coeficiente de difusión D está relacionado con el diámetro hidrodinámico de la partícula dH mediante la ecuación de Stokes-Einstein:

donde

k la constante de Boltzmann,

T es la temperatura absoluta

n la viscosidad del medio.

El método de cumulantes es un método simple para analizar la función de autocorrelación generada por un experimento de DLS. El cálculo está definido en las normas ISO 13321 e ISO 22412. En la práctica se utilizan los dos primeros términos de esta expansión de momentos, un valor medio para el tamaño (tamaño promedio z o media promedio z o diámetro promedio z) y un parámetro de anchura conocido como índice de polidispersidad (PDI).

Tamaño promedio Z

El tamaño promedio z es un valor calculado basado en la intensidad y no debe confundirse ni compararse directamente con un valor medio de masa o número producido por otros métodos. El cálculo está definido en las normas ISO, por lo tanto, todos los sistemas que utilizan este cálculo como se recomienda deberían dar resultados comparables si se utiliza el mismo ángulo de dispersión.

El tamaño promedio z o la media promedio z o el diámetro promedio z utilizado en la dispersión de luz dinámica es un parámetro también conocido como media de los cumulantes. Es el parámetro primario y más estable producido por la técnica. La media del promedio z se utiliza comúnmente en un entorno de control de calidad, tal como se define en la norma ISO 13321 y, más recientemente, en la norma ISO 22412, que define esta media como el "diámetro de partícula promedio de intensidad armónica".

El tamaño promedio z solo será comparable con el tamaño medido por otras técnicas si la muestra es monomodal (es decir, sólo un pico), de forma esférica o casi esférica, monodispersa (es decir, anchura de distribución muy estrecha), y la muestra se prepara en un dispersante adecuado, ya que el tamaño medio del promedio z puede ser sensible incluso a pequeños cambios en la muestra, p. ej., la presencia de una pequeña proporción de agregados. Cabe señalar que el promedio z es un parámetro hidrodinámico y, por lo tanto, solo es aplicable a partículas en dispersión o moléculas en solución.

Los liposomas submicrónicos tienen un diámetro promedio de menos de 1 gm. Los métodos de medición del diámetro de los liposomas son bien conocidos por el experto, p. ej., la dispersión de luz dinámica. Para el fin de la descripción de la presente invención, el diámetro promedio de los liposomas se expresa como diámetro promedio Z (ZAD).

Los liposomas de la invención pueden tener un diámetro promedio comprendido entre aproximadamente 30 y 300 nm, entre 50 y 225 nm, entre 50 y 200nm, entre 80 y 200 nm, entre 80 y 150 nm, o entre 80 y 120 nm. Como alternativa, el diámetro promedio de los liposomas puede ser aproximadamente 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 y 300 nm. Por ejemplo, los liposomas producidos mediante los métodos de la invención pueden tener un diámetro promedio entre 50 y 150 nm. El diámetro promedio de los liposomas puede verse afectado, por ejemplo, por extrusión de la composición liposomal a través de tamices o mallas con un tamaño de poro conocido. Este y otros métodos para controlar el tamaño de los liposomas son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Mayhew et al (1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169-174 u Olson et al (1979) Biochim. Biophys. Acta 557:9-23. Los liposomas pueden tener un diámetro promedio (ZAD) de menos de aproximadamente 220 nm, menos de 200 nm, en particular entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 150 nm. En una realización, los liposomas producidos mediante el método de la invención tienen un ZAD entre aproximadamente 80 nm y 120 nm.

Índice de polidispersidad

Este índice es un número calculado a partir de un ajuste simple de 2 parámetros a los datos de correlación (el análisis de cumulantes). El índice de polidispersidad es adimensional y se escala de 0 a 1. Los valores muy pequeños (p. ej., 0,05) corresponden a estándares altamente monodispersos. Cuanto más cercanos sean los valores a 1, más amplia será la distribución del tamaño de las partículas.

El índice de polidispersidad (PDI) de una formulación liposomal es una medida de la heterogeneidad de las partículas de liposoma en la formulación. En una realización, el PDI de la formulación liposomal después de la maduración de la etapa c. es inferior a 0,225. En una realización adicional, el PDI es inferior a 0,200.

Saponinas

En el método de la invención, se proporciona la etapa de agregar una saponina a la formulación liposomal después de la preparación de los liposomas submicrónicos y antes de la etapa de maduración.

Una saponina particularmente adecuada para usar en la presente invención es Quil A y sus derivados. La Quil A es una preparación de saponina aislada a partir del árbol sudamericano Quillaja saponaria Molina, y fue descrita por Dalsgaardet al.en 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlín, p243-254) como la primera en tener actividad adyuvante. Se han aislado fragmentos purificados de Quil A mediante HPLC que conservan la actividad adyuvante sin la toxicidad asociada con la Quil A (documento EP 0362279), por ejemplo, QS7 y QS21 (también conocidas como QA7 y QA21). La QS21 es una saponina natural derivada de la corteza de Quillaja saponaria Molina, que induce los linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+, los linfocitos Th1 y una respuesta de anticuerpos IgG2a predominante y es una saponina preferida en el contexto de la presente invención.

En particular, las saponinas para uso en la presente invención son fracciones inmunológicamente activas de Quil A, tales como QS-7 o QS21, convenientemente, QS21. En una realización específica, QS21 se proporciona en su composición menos reactógena, donde se inactiva con un esterol exógeno, tal como el colesterol, por ejemplo, un esterol tal como el colesterol que se incorpora en la formulación liposomal. La relación de QS21 :esterol será normalmente del orden de 1:100 a 1:1 (p/p), convenientemente de 1:10 a 1:1 (p:p) y preferentemente de 1:5 a 1:1 (p/p). Convenientemente, hay presente un exceso de esterol, siendo la relación de QS21 :esterol de al menos 1:2 (p/p). En una realización, la relación de QS21 :esterol es de 1:5 (p/p). El esterol es convenientemente colesterol.

Jampones

La formulación liposomal puede contener un tampón. Igualmente, el método de la invención puede comprender una etapa adicional de adición de tampón a la primera formulación liposomal. Los tampones utilizados en la presente invención pueden incluir: un tampón de fosfato (Na/Na2PO4, Na/K2PO4 o K/K<2>PO<4>); un tampón Tris; un tampón de borato; un tampón de succinato; un tampón de histidina; o un tampón de citrato. Los tampones normalmente se incluirán en una cantidad entre 5 y 20 mM. El tampón puede ser solución salina tamponada con fosfato (PBS). El pH de la mezcla líquida se ajusta en función de los componentes terapéuticos de la composición. Convenientemente, el pH de la mezcla líquida es al menos 4, al menos 5, al menos 5,5, al menos 5,8, al menos 6. Como alternativa a lo indicado, el pH de la mezcla líquida puede ser menos de 9, menos de 8, menos de 7,5 o menos de 7. El pH de la mezcla líquida puede estar entre 4 y 9, entre 5 y 8, entre 5,5 y 7,5, o, entre 5,8 y 6,4, o puede ser aproximadamente 6,1.

Jonicidad

Las soluciones deben tener una osmolalidad farmacéuticamente aceptable para evitar la distorsión o lisis celular. Una osmolalidad farmacéuticamente aceptable generalmente significará que las soluciones tendrán una osmolalidad aproximadamente isotónica o ligeramente hipertónica. Convenientemente, las composiciones inmunogénicas de la presente invención tendrán una osmolalidad en el intervalo de 250 a 750 mOsm/kg, por ejemplo, la osmolalidad puede estar en el intervalo de 250 a 550 mOsm/kg, tal como en el intervalo de 280 a 500 mOsm/kg. La osmolalidad se puede medir de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica, tal como mediante el uso de un osmómetro comercializado, por ejemplo el Advanced® Modelo 2020 comercializado por Advanced Instruments Inc. (EE. UU.).

La tonicidad de la composición se puede ajustar utilizando métodos conocidos por el experto en la materia, tal como proporcionando cantidades apropiadas de agentes isotonificantes. Un "agente de isotonicidad" o "agente isotonificante" es un compuesto que es fisiológicamente tolerado e imparte una tonicidad adecuada a una formulación (p. ej., composiciones inmunogénicas de la invención) para evitar el flujo neto de agua a través de las membranas celulares que están en contacto con la formulación. Se conocen composiciones adyuvantes acuosas que contienen cloruro de sodio 100 mM o más, por ejemplo, el sistema adyuvante A (ASA) en los documentos WO 2005/112991 y WO2008/142133 o los adyuvantes liposomales divulgados en el documento WO2007/068907.

El agente de isotonicidad utilizado para la composición puede ser una sal, tal como cloruro de sodio. No obstante, la composición puede comprender un agente de isotonicidad no iónico y la concentración de cloruro de sodio o la fuerza iónica en la composición es menos de 100 mM, tal como menos de 80 mM, p. ej., menos de 30 mM, tal como menos de 10 mM o menos de 5 mM. La composición puede comprender un agente de isotonicidad no iónico y la conductividad de la composición es menos de 5 mS/cm, tal como menos de 4 mS/cm. El agente de isotonicidad no iónico puede ser un poliol, tal como sorbitol. La concentración de sorbitol puede estar, p. ej., entre aproximadamente el 3 % y aproximadamente el 15 % (p/v), tal como entre aproximadamente 4 % y aproximadamente 10 % (p/v). En los documentos WO2012/080369 y WO2012/080370 se han descrito adyuvantes que comprenden una fracción de saponina inmunológicamente activa y un agonista de TLR4 en donde el agente de isotonicidad es una sal o un poliol.

Preparación de la composición de liposoma submicrónico

Los procesos para preparar la primera formulación liposomal submicrónica de la etapa a. se encuentran en el documento WO2013/041572 (también publicado como US20140234403), en particular los ejemplos 3 y 4, describen métodos para elaborar una preparación de liposomas de DOPC que además contienen colesterol y opcionalmente 3D-MPL. La preparación de liposomas tal como se describe allí se mezcla además con QS21.

Los liposomas obtenidos en la etapa a. pueden haber sido sometidos a una homogeneización, o como alternativa, la etapa a) puede comprender la homogeneización de la formulación liposomal, en particular homogeneización a alto cizallamiento y/o alta presión.

La etapa a. puede realizarse utilizando un método para formar una película lipídica que comprende las etapas (i) disolver una mezcla de lípidos en un disolvente para formar una mezcla homogénea; (ii) eliminar el disolvente para formar una película lipídica (p. ej., por evaporación); (iii) hidratar la película lipídica con una solución hidratante para formar una composición de liposoma; y (iv) reducir el tamaño del liposoma para formar una composición de liposoma submicrónico (en particular mediante el uso de homogeneización de alto cizallamiento y/o alta presión).

Homogeneización

Los liposomas pueden prehomogeneizarse primero con un mezclador de alto cizallamiento. Esta etapa tiene como objetivo reducir el tamaño de los liposomas gruesos. Un rotor o impulsor, junto con un componente estacionario conocido como estator, o un conjunto de rotores y estatores, se utiliza ya sea en un tanque que contiene la solución a mezclar, o en una tubería por donde pasa la solución, para crear cizallamiento. Se puede utilizar un mezclador de alto cizallamiento para crear emulsiones, suspensiones, liosoles (gas disperso en líquido) y productos granulares.

Los liposomas prehomogeneizados pueden homogeneizarse aún más con un homogeneizador de alta presión. Este proceso es bien conocido en la técnica y normalmente implica un homogeneizador estándar. La solución puede homogeneizarse en el primer recipiente de reacción o puede transferirse a un segundo recipiente de reacción antes de homogeneizarse. Los recipientes de reacción adecuados para su uso como segundo recipiente de reacción pueden contener un volumen de líquido e incluir, pero sin limitación, tanques, tales como tanques de acero inoxidable, matraces o vasos de precipitados. En una realización, la suspensión de liposomas se presuriza durante la homogeneización.

Por ejemplo, los liposomas pueden homogeneizarse utilizando un homogeneizador de alto cizallamiento en línea con un homogeneizador de alta presión. Esta tecnología es bien conocida en la técnica y la homogeneización generalmente ocurre en un intervalo de presión entre 3,5 x 107 y 2,1 x 108 Pa (entre 5000 y 30000 psi), es decir, 3,5 x 107 Pa (5000 psi), 4,1 x 107 Pa (6000 psi), 4,8 x 107 Pa (7000 psi), 5,5 x 107 Pa (8000 psi), 6,2 x 107 Pa (9000 psi), 6,9 x 107 Pa (10000 psi), 7,6 x 107 Pa (11000 psi), 8,2 x 107 Pa (12000 psi), 9 x 107 Pa (13000 psi), 9,7 x 107 Pa (14000 psi), 1 x 108 Pa (15000 psi), 1,10 x 108 Pa (16000 psi), 1,17 x 108 Pa (17000 psi), 1,24 x 108 Pa (18000 psi), 1,31 x 108 Pa (19000 psi), 1,37 x 108 Pa (20000 psi), 1,45 x 108 Pa (21000 psi), 1,52 x 108 Pa (22000 psi), 1,59 x 108 Pa (23000 psi), 1,65 x 108 Pa (24000 psi), 1,72 x 108 Pa (25000 psi), 1,79 x 108 Pa (26000 psi), 1,86 x 108 Pa (27000 psi), 1,93 x 108 Pa (28000 psi), 1,99 x 108 Pa (29000 psi) o 2,1 x 108 Pa (30000 psi).

Agonista de TLR-4

En una realización adicional, la formulación liposomal comprende además un agonista de TLR-4. Por ejemplo, este puede ser un lipopolisacárido detoxificado. El lipopolisacárido está destinado a funcionar como un inmunoestimulante en liposomas generados utilizando los métodos de las invenciones. En una realización, el lipopolisacárido es un derivado no tóxico del lípido A, tal como monofosforil lípido A o más particularmente monofosforil lípido A 3-desacilado (3D-MPL). El 3D-MPL se vende con el nombre de MPL por GlaxoSmithKline Biologicals N.A. y se menciona a lo largo de todo el documento como MPL o 3D-MPL. Véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos n.° 4.436.727, 4.877.611, 4.866.034 y 4.912.094. El 3D-MPL promueve principalmente las respuestas de los linfocitos T CD4+ con un fenotipo IFN-7 (Th1).

El 3D-MPL puede producirse de acuerdo con los métodos divulgados en el documento GB 2220211A. Químicamente es una mezcla de monofosforil lípido A 3-desacilado con 3, 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Se prefieren las mezclas que contienen más del 20 % de 6 cadenas aciladas. En las composiciones de la presente invención, se puede utilizar 3D-MPL de partícula pequeña. La partícula pequeña 3D-MPL tiene un tamaño de partícula tal que puede filtrarse de manera estéril a través de un filtro esterilizante tal como uno de los filtros esterilizantes descritos para el propósito de la invención. Dichas preparaciones se describen en el documento WO94/21292.

Otros agonistas de TLR-4 que pueden usarse son fosfatos de alquil glucosaminida (AGPs) tales como los divulgados en el documento WO 98/50399 o la patente de Estados Unidos n.° 6.303.347 (también se divulgan los procedimientos para la preparación de AGP), convenientemente RC527 o RC529 o sales farmacéuticamente aceptables de AGP como se divulga en la patente de Estados Unidos n.° 6.764.840. Algunos AGP son agonistas de TLR-4, y algunos son antagonistas de TLR-4. Se cree que ambos son útiles como adyuvantes.

Otros ligandos de TLR-4 adecuados se describen en los documentos WO 2003/011223 y WO 2003/099195, tal como el compuesto I, el compuesto II y el compuesto III descritos en las páginas 4-5 del documento WO2003/011223 o en las páginas 3-4 del documento WO2003/099195 y, en particular, aquellos compuestos descritos en el documento WO2003/011223 como ER803022, ER803058, ER803732, ER804053, ER804057m, ER804058, ER804059, ER804442, ER804680 y ER804764. Por ejemplo, un ligando de TLR-4 adecuado es ER804057.

Otros ligandos de TLR-4 que pueden ser de utilidad en la presente invención incluyen el adyuvante lipídico glucopiranosílico (GLA) tal como se describe en los documentos WO2008/153541 o WO2009/143457 o los artículos de la bibliografía Coler RNet al.(2011) Development and Characterization of Synthetic Glucopyranosyl Lipid Adjuvant System as a Vaccine Adjuvant. PLoS ONE 6(1): e16333. doi: 10.1371/journal.pone.0016333 y Arias MAet al.(2012) Glucopyranosyl Lipid Adjuvant (GLA), a Synthetic TLR4 Agonist, Promotes Potent Systemic and Mucosal Responses to Intranasal Immunization with HIVgp140. PLoS ONE 7(7): e41144. doi:10.1371/journal.pone.0041144. WO2008/153541 o WO2009/143457.

Un ligando del TLR-4, tal como un lipopolisacárido, tal como 3D-MPL, puede usarse en unas cantidades de entre 1 y 100 gg por dosis en seres humanos de la composición adyuvante. El 3D-MPL puede usarse a un nivel de aproximadamente 50 gg, tal como de al menos 40 gg, de al menos 45 gg o de al menos 49 gg, o, menos de 100 gg, menos de 80 gg, menos de 60 gg, menos de 55 gg o menos de 51 gg. Algunos ejemplos de intervalos adecuados son entre 40-60 gg, convenientemente entre 45-55 gg o entre 49 y 51 gg o 50 gg. La dosis humana de la composición adyuvante puede comprender 3D-MPL a un nivel de aproximadamente 25 gg, tal como de al menos 20 gg, de al menos 21 gg, de al menos 22 gg o de al menos 24 gg, o, menos de 30 gg, menos de 29 gg, menos de 28 gg, menos de 27 gg o menos de 26 gg. Algunos ejemplos de intervalos menores incluyen entre 20-30 gg, convenientemente entre 21 -29 gg o entre 22-28 gg o entre 28 y 27 gg o entre 24 y 26 gg, o 25 gg.

Envasado

Después de la filtración estéril, la composición de liposoma submicrónico estéril puede envasarse en recipientes adecuados. Las composiciones de liposoma submicrónico pueden envasarse en viales, en particular viales de vidrio monodosis. Como alternativa, las composiciones de liposoma submicrónico pueden envasarse en bolsas tales como bolsas de almacenamiento de polietileno de alta densidad.

Métodos de preparación de vacunas

La presente invención proporciona además métodos para preparar vacunas que comprenden preparar una composición de liposoma submicrónico mediante los procesos de la invención descritos en el presente documento y combinar la composiciones de liposoma con un antígeno.

El término "antígeno" es bien conocido por el experto en la materia. Un antígeno puede ser una proteína, un polisacárido, péptido, ácido nucleico, conjugados proteína-polisacárido, molécula o hapteno que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un ser humano o animal. Los antígenos se pueden derivar, ser homólogos o sintetizar para imitar moléculas, de virus, bacterias, parásitos, protozoos u hongos. El antígeno se puede derivar, ser homólogo o sintetizar para imitar moléculas, de una célula tumoral o neoplasia. El antígeno se puede derivar, ser homólogo o sintetizar para imitar moléculas, de una sustancia implicada en la alergia, enfermedad de Alzheimer, ateroesclerosis, obesidad y dependencia de la nicotina.

El antígeno puede derivarse dePlasmodiumspp, por ejemploP. falciparumoP. vivax.

El antígeno puede derivarse deMycobacterumspp, por ejemplo,M. tuberculosis.

Los posibles antígenos derivados dePlasmodium falciparumincluyen proteína del circumsporozoíto (proteína CS), RTS, PfEMP-1, antígeno Pfs 16, MSP-1, MSP-3, LSA-1, LSA-3, AMA-1 y TRAP. Otros antígenos deP. falciparumincluyen EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Secuestrina, Pf332, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs48/45, Pfs230 y sus análogos en otrasPlasmodiumspp. El antígeno puede ser una proteína entera o un fragmento inmunogénico de la misma.

Un antígeno derivado de la proteína CS dePlasmodium falciparumpuede tener la forma de una proteína de fusión híbrida. La proteína de fusión puede contener proteína derivada de la proteína CS deP. falciparumfusionada con otra proteína o fragmento de la misma. La proteína de fusión puede contener un fragmento N-terminal o C-terminal de la proteína CS deP. falciparum.Como alternativa, o además, la proteína de fusión puede comprender una o más unidades repetitivas (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más unidades repetitivas) de la región central de la proteína CS deP. falciparum.La proteína de fusión puede ser una proteína de fusión híbrida que comprende un antígeno derivado de la proteína CS junto con un antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) o un fragmento inmunogénico del mismo. Normalmente, el antígeno de superficie de la hepatitis B comprende la principal proteína de superficie conocida como antígeno S, por ejemplo, el antígeno S derivado de un serotipo adw.

En particular, la proteína de fusión puede comprender sustancialmente toda la porción C-terminal de la proteína CS deP. falciparum,cuatro o más repeticiones en tándem de la región inmunodominante de la proteína CS y el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). En un aspecto, la proteína de fusión comprende una secuencia que contiene al menos 160 aminoácidos que es sustancialmente homóloga a la porción C-terminal de la proteína CS. En particular, "sustancialmente toda" la porción C terminal de la proteína CS incluye el extremo C desprovisto de la secuencia de anclaje hidrófoba. La proteína CS puede carecer de los últimos 12 a 14 (tal como 12) aminoácidos del extremo C terminal.

La proteína de fusión para su uso en la invención puede ser una proteína que comprende una porción de la proteína CS deP. falciparumsustancialmente la correspondiente a los aminoácidos 207 a 395 del clon 3D7 deP. falciparum, derivada de la cepa NF54 (Casperset al, supra)fusionada en marco a través de un enlazador lineal al extremo N terminal de HBsAg. El enlazador puede comprender parte o la totalidad de la región preS2 de HBsAg.

Una proteína de fusión particular para su uso en la invención es la proteína de fusión conocida como RTS, como se describe en los documentos WO 93/10152 y WO 98/05355. La RTS puede estar en forma de partículas mixtas RTS,S (donde "S" representa un monómero no fusionado) o como RTS. Las partículas RTS,S comprenden dos polipéptidos RTS y S que pueden sintetizarse simultáneamente y formar espontáneamente estructuras particuladas compuestas (RTS,S) p. ej., durante la purificación. Estas partículas también pueden denominarse partículas similares a virus (VLP). Estas partículas se pueden preparar de varias maneras, por ejemplo, expresando la proteína de fusión en un hospedador adecuado como tal como una levadura o bacteria.

Se cree que la presencia del antígeno de superficie de la hepatitis B y la formación de partículas RTS,S aumentan la inmunogenicidad de la porción de proteína CS de la proteína híbrida, contribuye a la estabilidad y/o favorece la fabricación reproducible de la proteína.

Los antígenos CS pueden usarse junto con otro antígeno seleccionado de cualquier antígeno que se exprese en el esporozoíto o en la etapa preeritrocítica del ciclo de vida del parásito, tal como la etapa hepática, por ejemplo, el antígeno 1 del estadio hepático (LSA-1), el antígeno 3 del estadio hepático (LSA-3), la proteína anónima relacionada con la trombospondina (TRAP), la proteína de superficie del merozoíto-1 (MSP1), la principal proteína de superficie del merozoíto, y el antígeno apical del merozoíto-1 (AMA-1). Otros antígenos adecuados para usar junto con los antígenos CS incluyen PfEMP-1, antígeno Pfs 16, M<s>P-3, L<s>A-3, AMA-1, TRAP, GLURP, RAP1, RAP2, Secuestrina, Pf332, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs48/45, Pfs230.

Los fragmentos inmunogénicos de cualquiera de los antígenos como se describe en este documento contendrán al menos un epítopo del antígeno y mostrarán antigenicidad de la malaria y serán capaces de generar una respuesta inmunitaria cuando se presenten en una construcción adecuada, tal como por ejemplo cuando se fusionan con otros antígenos de la malaria u otros antígenos no relacionados con la malaria, o se presentan en un vehículo, dirigiéndose la respuesta inmunitaria frente al antígeno natural. Normalmente, los fragmentos inmunogénicos contienen al menos 20, o al menos 50, o al menos 100 aminoácidos contiguos del antígeno de la malaria.

Posibles antígenos deP. vivaxincluyen antígenos basados en la proteína del circumsporozoíto (proteína CS) y la proteína de unión al antígeno Duffy y fragmentos de los mismos, tal como PvRII (véase, p. ej., el documento WO02/12292).

Los posibles antígenos basados en la proteína CS pueden incluir una proteína de fusión que comprende secuencias derivadas de una proteína CS deP. vivax.La proteína de fusión puede ser una proteína de fusión híbrida. La proteína híbrida descrita en el presente documento puede contener proteína derivada deP. vivaxtipo I y tipo II. En particular, la proteína de fusión híbrida puede contener proteína derivada deP. vivaxtipo I y tipo II fusionada a otra proteína o fragmento de la misma.

En un aspecto, la proteína de fusión híbrida comprende una proteína híbrida derivada de las proteínas CS deP. vivax(CSV) y un antígeno de superficie de la hepatitis B, generalmente la principal proteína de superficie conocida como antígeno S, tal como el antígeno S derivado de un serotipo adw.

Preferentemente, la proteína de fusión es una proteína de fusión híbrida inmunogénica que comprende: a) al menos una unidad de repetición derivada de la sección de repetición central de una proteína del circumsporozoíto tipo I deP. vivax,b) al menos una unidad repetitiva derivada de la sección repetitiva central de una proteína del circumsporozoíto tipo II deP. vivax,y c. antígeno de superficie S derivado del virus de la hepatitis B.

El componente de antígeno derivado de CSV de la invención generalmente se fusiona al extremo amino terminal de la proteína S. Más específicamente, el extremo C-terminal del fragmento CSV se fusiona con el extremo N-terminal de dicho antígeno S. Por ejemplo, una proteína de fusión adecuada es CSV-S, como se describe en el documento WO2008/009652.

En células de levadura, una vez expresadas, la proteína de fusión híbrida (que comprende el antígeno S), es capaz de ensamblarse espontáneamente en una estructura/partícula de lipoproteína compuesta por numerosos monómeros de dichas proteínas (o VLP). Estas partículas se pueden preparar expresando la proteína de fusión en un hospedador adecuado, tal como una levadura o bacteria.

Cuando la cepa de levadura receptora elegida también lleva en su genoma una o más copias integradas de un casete de expresión S de la hepatitis B, la cepa resultante sintetiza proteínas híbridas como proteínas de fusión y también antígeno S no fusionado. Estos pueden ensamblarse espontáneamente en partículas de lipoproteína que comprenden monómeros de la proteína de fusión híbrida y monómeros del antígeno S.

También se proporciona, una VLP que comprende unidades CSV-S y/o RTS. La partícula puede consistir esencialmente en unidades CSV-S y RTS. Como alternativa, las partículas producidas comprenden o consisten esencialmente en unidades CSV-S, RTS y S. Tales partículas mixtas se describen, por ejemplo, en el documento WO2008/009650.

Los antígenos de interés en el campo de la tuberculosis incluyen Mtb72f y variantes del mismo, tal como se describe en el documento WO2006/117240. Un antígeno de particular interés es el M72, cuya secuencia polipeptídica se proporciona en la SEQ ID No: 4 y una secuencia de polinucleótidos que codifica dicho polipéptido que se proporciona en la SEQ ID No: 3 del documento WO2006/117240.

Otro antígeno de interés en el campo de la tuberculosis es el Rv1753 y sus variantes, tal como se divulga en el documento WO2010/010180, por ejemplo, una secuencia Rv1753 seleccionada de las SEQ ID No: 1 y 2-7 del documento WO2010/010180, en particular la SEQ ID No: 1. Otro antígeno de interés en el campo de la tuberculosis es el Rv2386 y variantes del mismo, tal como se divulga en el documento WO2010/010179, por ejemplo, una secuencia Rv2386 seleccionada de las SEQ ID No: 1 y 2-7 del documento WO2010/010179, en particular la SEQ ID No: 1. Otros antígenos de interés en el campo de la tuberculosis incluyen Rv3616 y variantes del mismo, tal como se divulga en el documento WO2011092253, por ejemplo, una secuencia natural Rv3616 seleccionada de las SEQ ID No: 1 y 2-7 del documento WO2011/092253 o una secuencia Rv3616 modificada como las seleccionadas de las SEQ ID No: 161 a 169, 179 y 180 del documento WO2011092253, en particular la SEQ ID No: 167. Un antígeno adicional de interés es HBHA, tal como se divulga en los documentos WO97/044463, WO03/044048 y WO2010/149657.

Los antígenos de la tuberculosis se utilizan convenientemente en forma de polipéptido, pero como alternativa puede proporcionarse en forma de un polinucleótido que codifica dicho polipéptido.

Los métodos de la invención pueden utilizar antígenos derivados del virus varicela zóster (VZV). El antígeno VZV para su uso en la invención puede ser cualquier antígeno VZV adecuado o derivado inmunogénico del mismo, siendo convenientemente un antígeno VZV purificado. La expresión "derivado inmunogénico" abarca cualquier molécula que conserva la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria frente al VZV después de su administración al hombre.

Los métodos adecuados para la generación de derivados son bien conocidos en la técnica e incluyen técnicas de biología molecular estándar como las descritas, por ejemplo, en Sambrook et al [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press], tales como técnicas para la adición, supresión, sustitución o reordenamiento de aminoácidos o modificaciones químicas de los mismos. En un aspecto, los derivados incluyen, por ejemplo, truncamientos u otros fragmentos.

En un aspecto, los derivados en el contexto de esta invención son secuencias de aminoácidos que comprenden epítopos, es decir, determinantes antigénicos sustancialmente responsables de las propiedades inmunogénicas de un polipéptido y capaces de provocar una respuesta inmunitaria, en un aspecto son epítopos de linfocitos T.

En un aspecto, el nivel de actividad inmunogénica del derivado inmunogénico es al menos aproximadamente el 50 %, en un aspecto al menos aproximadamente el 70 % y en un aspecto al menos o más de aproximadamente el 90 % de la inmunogenicidad para el polipéptido del que se deriva, convenientemente según se evaluó mediante las técnicas de inmunoensayo descritas anteriormente. En algunos aspectos de la invención se pueden identificar porciones inmunogénicas que tienen un nivel de actividad inmunogénica mayor que el del polipéptido de longitud completa correspondiente, p. ej., que tienen más de aproximadamente 100 % o 150 % o más de actividad inmunogénica. En un aspecto, el antígeno VZV es una glicoproteína, en un aspecto, el antígeno gE (también conocido como gp1), o un derivado inmunogénico del mismo.

El antígeno gE, los derivados sin anclaje del mismo (que también son derivados inmunogénicos) y su producción se describen en el documento EP0405867 y las referencias allí citadas [véase también Vafai A. Antibody binding sites on truncated forms of varicella-zoster virus gpI (gE) glycoprotein Vaccine 1994 12:1265-9]. El documento EP192902 también divulga gE y su producción.

En un aspecto, gE es un gE truncado que tiene la secuencia de SEQ ID No. 1 en el presente documento, y como se divulga en Virus Research, vol. 40, 1996 pág. 199 y sigs. La referencia a gE en lo sucesivo incluye la referencia a gE truncado, a menos que resulte evidente de otra forma a partir del contexto.

Kits

La presente invención proporciona además métodos para preparar un kit de vacuna que comprende preparar composiciones de liposoma submicrónico de la invención como se describe en este documento y envasar la composiciones de liposoma en un kit como un componente del kit además de un componente del kit de antígeno.

El antígeno y/o los liposomas pueden prepararse de forma extemporánea, en el momento de la administración. Por lo tanto, la invención proporciona métodos para preparar kits de vacunas que incluyen una composición de antígeno y liposoma lista para mezclar. Los kits permiten mantener la composición del antígeno y del liposoma por separado hasta el momento de su uso.

Los componentes están físicamente separados unos de otros dentro de un kit, y esta separación se puede lograr de varias maneras. Por ejemplo, los dos componentes pueden estar en dos recipientes separados, tal como viales. El contenido de los dos viales se puede mezclar a continuación p. ej., extrayendo el contenido de un vial y añadiéndolo al otro vial, o extrayendo el contenido de ambos viales y mezclándolos en un tercer recipiente (por ejemplo vial).

Uno de los componentes del kit puede estar en una jeringa y el otro puede estar en un recipiente tal como un vial. La jeringa se puede utilizar (p. ej., con una aguja) para insertar su contenido en el segundo recipiente para mezclar, y luego la mezcla se puede extraer hacia la jeringa. El contenido mezclado de la jeringa se puede administrar luego al paciente, normalmente mediante una aguja nueva y estéril. Al envasar un componente en una jeringa se elimina la necesidad de utilizar una jeringa aparte para la administración al paciente. En otra disposición preferida, los dos componentes del kit se mantienen juntos pero por separado en la misma jeringa, p. ej., una jeringa de doble cámara. Cuando se acciona la jeringa (p. ej., durante la administración a un paciente), se mezcla el contenido de las dos cámaras. Esta disposición evita la necesidad de una etapa de mezcla independiente en el momento de su uso.

Los componentes del kit pueden estar en forma acuosa. Un componente (tal como el antígeno) puede estar en forma seca (p. ej., en forma liofilizada), estando el otro componente (la composición de liposoma) en forma acuosa. Los dos componentes se pueden mezclar para reactivar el componente seco y dar una composición acuosa para administrar a un paciente. Un componente liofilizado normalmente se encontrará dentro de un vial en lugar de una jeringa.

Los componentes secos pueden incluir estabilizadores tales como lactosa, sacarosa o manitol, así como mezclas de los mismos, p. ej., mezclas de lactosa/sacarosa, mezclas de sacarosa/manitol,etc.Una disposición posible utiliza un componente adyuvante acuoso en una jeringa precargada y un componente antigénico liofilizado en un vial.

Las realizaciones del presente documento que se refieren a "composiciones de vacuna" de la invención también son aplicables a realizaciones que se refieren a "composiciones inmunogénicas" de la invención y viceversa.

Los términos en singular "un", "uno/a", y "el", "la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, se pretende que la palabra "o" incluya "y", a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El término "pluralidad" se refiere a dos o más. El término "comprende" significa "incluye". Por lo tanto, a menos que el contexto requiera lo contrario, el término "comprende", y las variaciones tales como "comprender" y "que comprende" se entenderá que implican la inclusión de un compuesto o composición establecida (p. ej., ácido nucleico, polipéptido, o antígeno) o etapa, o grupo de compuestos o etapas, pero no la exclusión de algún otro compuesto, composición, etapas o grupos de los mismos. La abreviatura, "e.g." (p. ej.) procede del Latínexempli gratisy se utiliza en el presente documento para indicar un ejemplo no limitante. Por lo tanto, la abreviatura "p. ej." es sinónimo de la expresión "por ejemplo". La expresión transicional abierta "que comprende", "comprender" y "comprende" en el presente documento los autores de la invención pretenden que sea opcionalmente sustituibles con expresión transicional cerrada "que consiste en", "consistir en" y "consiste en", respectivamente, en cada caso.

Aún más, las limitaciones numéricas dadas con respecto a las temperaturas, porcentajes de, concentraciones o niveles de una sustancia, tales como una composición, pretenden ser aproximadas. Por lo tanto, donde se indica una temperatura entre 15 °C y 25 °C, se pretende que la temperatura se entienda como aproximadamente (o "" o "~") 15 °C a aproximadamente (o "" o "~") 25 °C. Asimismo, cuando se indica que una concentración es de al menos (por ejemplo) 200 pg, se pretende que se entienda que la concentración es de al menos aproximadamente (o "" o "~") 200 pg. El término "aproximadamente" con respecto a un valor numéricoxsignificax± 5 % o x± 10 %.

Aunque pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento a la hora de poner en práctica o probar la presente divulgación, a continuación, se describen métodos y materiales adecuados. Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1. Preparación de la masa concentrada de liposomas - Ejemplo de los antecedentes

La masa de liposomas concentrada se preparó como se describe en el ejemplo 3 del documento WO2013/041572. En resumen, la masa de liposomas concentrada se ha preparado en 2 etapas. La primera etapa fue la preparación de la película lipídica. DOPC (dioleoil fosfatidilcolina), 3D-MPL y el colesterol se disolvieron secuencialmente en isopropanol. Luego se eliminó el isopropanol con agitación y gradiente de presión reducida en un baño de calentamiento a 55 °C para obtener un residuo de película. A continuación se redujo gradualmente la presión y se aplicó un secado final para obtener una película lipídica. La segunda etapa fue la preparación de la masa concentrada de liposomas. Con este fin, la película lipídica se rehidrató en PBS para formar una suspensión gruesa de liposomas. A continuación, la suspensión de liposomas se homogeneizó con un mezclador de alto cizallamiento en línea con un homogeneizador de alta presión para producir los liposomas de tamaño nanométrico deseado. La masa concentrada de liposomas resultante (que no contiene QS21) se filtra a través de una membrana PES de 0,22 gm. La masa concentrada de liposomas para su uso en los ejemplos contenía 40 mg/ml de DOPC, 10 mg/ml de colesterol, 2 mg/ml de MPL en tampón fosfato 10 mM (pH 6,1) y NaCl 150 mM.

Ejemplo 2. Preparación de liposomas que contienen saponina - Filtrabilidad

El propósito de la prueba fue evaluar la filtrabilidad de la formulación liposomal que contiene QS21 después de diferentes tiempos de maduración (0 horas, 1/2 hora, 4 horas y 24 horas) y en diferentes filtros (Sartopore20,45-0,2 gm, Sartopore 2 XLI 0,35-0,2 gm, Sartopore XLG 0,8-0,2 gm, Pall EKV y Pall EDF). La formulación liposomal se prepara siguiendo el protocolo ilustrado en el diagrama de flujo de la Figura 1. Resumiendo, la adición de QS21 a la masa concentrada de liposomas preparada en el Ejemplo 1, en el tampón apropiado, da como resultado la formulación liposomal que contiene QS21 para ser sometida a la evaluación de filtrabilidad, como se ha descrito anteriormente. Para la presente prueba, la formulación liposomal utilizada para la filtración tuvo la siguiente composición:

MPL 100 gg/ml

Colesterol 500 gg/ml

DOPC 2000 gg/ml

QS21 100 gg/ml

NaCl 150 mM

Na2HPO4 2,1 mM

KH2PO47,9 mM

La filtrabilidad se probó a una presión de 0,8 bar y se midió como Vmáx, es decir, el volumen máximo que puede pasar a través del filtro antes de que éste se bloquee. Los resultados obtenidos se enumeran en la Tabla 1 y se ilustran en la Figura 2.

Tabla 1

continuación

Resultados

Independientemente del tipo de filtro utilizado, la filtrabilidad de la composición liposomal que contiene QS21 aumenta con el tiempo de maduración, como lo demuestra el aumento de Vmáx de acuerdo con el tiempo de maduración. Los liposomas más largos maduran, cuanto mayor sea Vmáx.

Ejemplo 3. Preparación de los liposomas que contienen saponina - Tamaño de partícula, PDI, Vmáx, contenido de MPL/QS21/DOPC/colesterol

También se produjeron dos lotes de QS21 que contienen una formulación liposomal que tiene la composición detallada para el Ejemplo 2, siguiendo el diagrama de flujo de la Figura 1. Se probaron tres lotes de filtros Pall EKV (Pall 1, Pall 2 y Pall 3), sin maduración (T0) y después de 2 o 4 horas de maduración (T2H y T4H). Se midieron los siguientes parámetros:

- Tamaño promedio de partícula (nm) antes y después de la maduración (ZAD)

- PDI antes y después de la maduración

- Vmáx (ml/m2) en la filtración

- Contenido de MPL, QS21, DOPC y colesterol antes y después de la filtración

ZAD y PDI se midieron de acuerdo con las normas ISO 13321 e ISO 22412.

En la Tabla 2 se enumeran los contenidos indicados medidos en T0, T2H y T4H después de la filtración en los diferentes lotes de filtros Pall EKV. T ambién se recogió una muestra antes de la filtración para utilizarla como contenido de referencia.

Tabla 2

continuación

492

Resultados

Independientemente del lote del filtro, con ambos lotes de QS21 que contienen formulaciones liposomales, no hay variación sustancial en los contenidos medidos después de un tiempo de maduración de 2 h o 4 h (y después de la filtración), en comparación con el contenido medido antes de la filtración. Esto indica que no hay pérdida de contenido con respecto a MPL, QS21, DOPC y colesterol después de la maduración.

Los resultados con respecto al tamaño de partícula (Figura 3), PDI (Figura 4), Vmáx (Figura 5) y contenido de colesterol (Figura 6) se presentan en las Figuras 3 a 6. La Figura 3 (3A y 3B) muestra que el tamaño de los liposomas aumenta durante el tiempo de maduración. La Figura 4 (4A y 4B) muestra que, en paralelo, la polidispersidad (PDI) disminuye con el tiempo de maduración porque los liposomas de menor tamaño desaparecen. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se cree que la filtrabilidad mejora después de la maduración de los liposomas que contienen QS21 (como se muestra nuevamente en la Figura 5A y 5B, en donde la Vmáx aumenta con el tiempo de maduración) porque, en ausencia de la etapa de maduración, la presencia de liposomas más pequeños puede acumularse gradualmente en los poros del filtro y eventualmente provocar la obstrucción del filtro.

Seq ID No. 1

1 MGTVNKPWG VLMGFGIITG TLRITNPVRA SVLRYDDFHI DEDKLDTNSV YEPYYHSDHA 61 ESSWVNRGES SRKAYDHNSP YIWPRNDYDG FLENAHEHHGVYNQGRGIDS GERLMQPTQM

121 SAQEDLGDDT GIHVIPTLNG DDRHKIVNVD QRQYGDVFKG DLNPKPQGQR LIEVSVEENH

181 PFTLRAPIQR IYGVRYTETW SFLPSLTCTG DAAPAIQHIC LKHTTCFQDVWDVDCAENT

241 KEDQLAEISY RFQGKKEADQ PWIWNTSTL FDELELDPPE IEPGVLKVLR TEKQYLGVYI

301 WNMRGSDGTS TYATFLVTWK GDEKTRNPTP AVTPQPRGAE FHMWNYHSHV FSVGDTFSLA

361 MHLQYKIHEA PFDLLLEWLY VPIDPTCQPM RLYSTCLYHP NAPQCLSHMN SGCTFTSPHL

421 AQRVASTVYQ NCEHADNYTA YCLGISHMEP SFGLILHDGG TTLKFVDTPE SLSGLYVFW

481 YFNGHVEAVA YTWSTVDHF VNAIEERGFP PTAGQPPATT KPKEITPVNP GTSPLIRYAA

541 WTGGLA

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para elaborar una composición de liposoma que comprende una saponina en una formulación liposomal submicrónica en donde los liposomas contienen un lípido y un esterol, que comprende las etapas de:

a) preparar una primera formulación liposomal submicrónica en donde los liposomas contienen un lípido y un esterol,

b) añadir la saponina a la primera formulación liposomal submicrónica,

c) madurar la formulación liposomal submicrónica que contiene saponina durante al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o, 16 horas, y,

d) filtrar la formulación liposomal submicrónica que contiene saponina madura de la etapa c) a través de un filtro de calidad estéril.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la primera formulación liposomal submicrónica contiene además un agonista de TLR-4.

3. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el lípido es un lípido neutro seleccionado del grupo que consiste en: fosfatidilcolina de yema de huevo, dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) y dilauril fosfatidilcolina.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el lípido neutro es DOPC.

5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el esterol es colesterol.

6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la saponina es QS21.

7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agonista de TLR-4 es un lipopolisacárido.

8. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agonista de TLR-4 es el monofosforil lípido A 3-desacilado (3D-MPL).

9. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los liposomas después de la filtración de la etapa d) tienen un diámetro promedio Z entre 80 y 120 nm.

10. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la maduración de la etapa c) y el filtrado de la etapa d) se realizan a una temperatura entre 15 y 25 °C.

11. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la maduración se realiza durante 16 a 24 horas.

12. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el índice de polidispersidad (PDI) de la formulación liposomal submicrónica que contiene saponina después de la maduración en la etapa c) es inferior a 0,225, o, inferior a 0,200.

13. Un método para preparar una composición de vacuna que comprende el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y combinar la composición filtrada con un antígeno.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde, la vacuna se utiliza en la prevención, atenuación o tratamiento de la malaria, zóster, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), infección por CMV, infección por VRS en ancianos, infección por VHB, infección por VIH, tuberculosis (TB), infección por VHS, infección por<v>P<h>, estafilococosC Difficile,neumonía adquirida en la comunidad (NAC).

15. Un método para preparar un kit de vacuna que comprende preparar la composición de liposoma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y envasar la composición de liposoma en un kit como un componente del kit además de un componente del kit de antígeno.