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ES2973425T3 - Anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (sars-cov-2) - Google Patents

Anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (sars-cov-2) Download PDF

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ES2973425T3
ES2973425T3 ES21719462T ES21719462T ES2973425T3 ES 2973425 T3 ES2973425 T3 ES 2973425T3 ES 21719462 T ES21719462 T ES 21719462T ES 21719462 T ES21719462 T ES 21719462T ES 2973425 T3 ES2973425 T3 ES 2973425T3
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James E Crowe
Seth Zost
Robert Carnahan
Pavlo Gilchuk
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Vanderbilt University
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Abstract

La presente divulgación está dirigida a anticuerpos que se unen y neutralizan el coronavirus denominado SARS-CoV-2 y métodos para su uso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2)ANTECEDENTES
1. Campo de la divulgación
La presente divulgación se refiere, en general, a los campos de la medicina, las enfermedades infecciosas y la inmunología. Más particularmente, la divulgación se refiere a anticuerpos humanos que se unen a un nuevo coronavirus denominado SARS-CoV-2 y a métodos de uso de los mismos.
2. Antecedentes
Una epidemia por un nuevo coronavirus (SARS-CoV-2) ha afectado a la China continental, junto con casos en otros 179 países y territorios. Se identificó en Wuhan, la capital de la provincia de Hubei en China, después de que 41 personas desarrollasen neumonía sin una causa evidente. El virus, que provoca la enfermedad de dificultad respiratoria aguda denominada enfermedad por coronavirus de 2019 (COVID-19), es capaz de pasar de una persona a otra. El periodo de incubación (tiempo desde la exposición hasta la aparición de síntomas) varía de 0 a 24 días, con una media de 3-5 días, pero puede ser contagioso durante este periodo y tras la recuperación. Los síntomas incluyen fiebre, tos y dificultades para respirar. En febrero de 2020 se estimó que la tasa de mortalidad era del 2 % de los casos confirmados y mayor entre los que requieren ingreso hospitalario.
A fecha de 10 de febrero de 2020, se habían confirmado 40,627 casos (6,495 graves), incluyendo todas las divisiones a nivel de provincia de China. Puede haberse infectado un mayor número de personas, pero no detectado (especialmente los casos leves). A fecha de 10 de febrero de 2020, se han atribuido al virus 910 muertes desde la primera muerte confirmada el 9 de enero, con 3,323 pacientes recuperados. La primera transmisión local fuera de China se produjo en Vietnam entre miembros de una familia, mientras que la primera transmisión internacional entre no familiares se produjo en Alemania el 22 de enero. La primera muerte fuera de china se produjo en Filipinas, donde falleció un varón procedente de Wuhan el 1 de febrero. A fecha de 10 de febrero de 2020, el número de muertes a causa de este virus ha superado al del brote epidémico mundial de SARS en 2003.
A fecha de febrero de 2020, no hay vacunas autorizadas ni tratamientos específicos, aunque se están investigando varias estrategias de vacunación y antivíricos. El brote epidémico se ha declarado una emergencia de salud pública de importancia internacional (PHEIC, por sus siglas en inglés) por la Organización Mundial de la Salud (OMS), basándose en los posibles efectos que pueda tener el virus si se expande a países con sistemas sanitarios más débiles. Por tanto, existe la urgente necesidad de explorar la biología y la patología del SARS-CoV-2, así como de la respuesta inmunitaria humana frente a este virus.
Wang et al, Nat Commun 11, 2251 (2020) divulga un anticuerpo monoclonal humano que neutraliza el SARS-CoV-2 (y el SARS-CoV) en cultivo celular.
Ng O-W et al., PLoS ONE 9(7): e102415, divulga que los anticuerpos monoclonales (mAbs) murinos dirigidos a la subunidad S2 de la proteína S son capaces de neutralizar la infección por SARS-CoV in vitro.
SUMARIO
La presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a una proteína espícula de superficie de SARS-CoV-2, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:59, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:61, una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:89, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:90, una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:91.
La presente invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a una proteína espícula de superficie de SARS-CoV-2, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:70, una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:98, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:99, una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100.
La presente invención también proporciona una composición farmacéuticamente aceptable que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención, opcionalmente en la que la composición está formulada para administración intravenosa.
La presente invención también proporciona una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención y un segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención.
Por este motivo, de acuerdo con la presente divulgación, pero no parte de la invención, se proporciona un método para detectar la infección de COVID-19 por el SARS-CoV-2 en un sujeto que comprende (a) poner en contacto una muestra de dicho sujeto con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene secuencias de CDR de cadena pesada y ligera emparejadas por clones de las tablas 3 y 4, respectivamente; y (b) detectar el SARS-CoV-2 en dicha muestra mediante la unión de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo a un antígeno del SARS-CoV-2 en dicha muestra. La muestra puede ser un fluido corporal, tal como sangre, esputo, lágrimas, saliva, moco o suero, semen, secreciones de cuello de útero o vaginales, líquido amniótico, tejidos placentarios, orina, exudado, transudado, frotis de tejidos o heces. La detección puede comprender ELISA, RIA, ensayo de flujo lateral o transferencia de Western. El método puede comprender además llevar a cabo las etapas (a) y (b) una segunda vez y determinar un cambio en las concentraciones de antígeno del SARS-CoV-2 en comparación con el primer ensayo. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede estar codificado por secuencias variables emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede estar codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad respecto de secuencias variables emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1 o por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen un 100 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede comprender secuencias variables de cadena ligera y pesada de acuerdo con las secuencias emparejadas por clones de la tabla 2 o secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede unirse a una proteína espícula de la superficie del SARS-CoV-2. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo scFv (fragmento variable monocatenario) recombinante, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv.
En otra realización de la divulgación pero no parte de la invención, se divulga un método para tratar a un sujeto infectado por SARS-CoV-2 o reducir la probabilidad de infección de un sujeto en riesgo de contraer el SARS-CoV-2, que comprende administrar a dicho sujeto un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene secuencias de CDR de cadena pesada y ligera emparejadas por clones de las tablas 3 y 4, respectivamente. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede estar codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad respecto de secuencias variables emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1 o por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen un 100 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede comprender secuencias variables de cadena ligera y pesada de acuerdo con las secuencias emparejadas por clones de la tabla 2 o secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo scFv (fragmento variable monocatenario) recombinante, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv. El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico o un anticuerpo biespecífico. El anticuerpo puede ser una IgG, o un anticuerpo IgG recombinante o un fragmento de anticuerpo que comprende una porción Fc mutada para alterar (eliminar o potenciar) las interacciones con FcR, para aumentar la semivida y/o aumentar la eficacia terapéutica, tal como una mutación LALA, LALA PG, N297, GASD/ALIE, DHS, YTE o LS o glicanos modificados para alterar (eliminar o potenciar) las interacciones con FcR, tales como la adición enzimática o química o la eliminación de glicanos o la expresión en una línea celular diseñada por ingeniería genética con un patrón de glucosilación definido. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede unirse a un antígeno del SARS-CoV-2, tal como una proteína espícula de la superficie. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede administrarse antes de la infección o después de la infección. El sujeto puede tener más de 60 años, puede estar inmunodeprimido o puede padecer un trastorno respiratorio y/o cardiovascular. La administración puede comprender la administración de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o administración genética con una secuencia de ARN o ADN o un vector que codifica el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo.
En otra realización más de la divulgación pero no parte de la invención, se proporciona un anticuerpo monoclonal, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se caracteriza por secuencias de CDR de cadena pesada y ligera emparejadas por clones de las tablas 3 y 4, respectivamente. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede estar codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad respecto de secuencias variables emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1 o por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen un 100 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede comprender secuencias variables de cadena ligera y pesada de acuerdo con las secuencias emparejadas por clones de la tabla 2 o secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo scFv (fragmento variable monocatenario) recombinante, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv. El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo biespecífico o es un intracuerpo. El anticuerpo puede ser una IgG, o un anticuerpo IgG recombinante o un fragmento de anticuerpo que comprende una porción Fc mutada para alterar (eliminar o potenciar) las interacciones con FcR, para aumentar la semivida y/o aumentar la eficacia terapéutica, tal como una mutación LALA, LALA PG, N297, GASD/ALIE, DHS, YTE o LS o glicanos modificados para alterar (eliminar o potenciar) las interacciones con FcR, tales como la adición enzimática o química o la eliminación de glicanos o la expresión en una línea celular diseñada por ingeniería genética con un patrón de glucosilación definido. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede unirse a una proteína espícula de la superficie del SARS-CoV-2.
Un hibridoma o una célula modificada por ingeniería genética que codifica un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se caracteriza por secuencias de CDR de cadena pesada y ligera emparejadas por clones de las tablas 3 y 4, respectivamente. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede estar codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad respecto de secuencias variables emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1 o por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen un 100 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede comprender secuencias variables de cadena ligera y pesada de acuerdo con las secuencias emparejadas por clones de la tabla 2 o secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo scFv (fragmento variable monocatenario) recombinante, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv. El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo biespecífico o un intracuerpo. El anticuerpo puede ser una IgG, o un anticuerpo IgG recombinante o un fragmento de anticuerpo que comprende una porción Fc mutada para alterar (eliminar o potenciar) las interacciones con FcR, para aumentar la semivida y/o aumentar la eficacia terapéutica, tal como una mutación LALA, LALA PG, N297, GASD/ALIE, DHS, YTE o LS o glicanos modificados para alterar (eliminar o potenciar) las interacciones con FcR, tales como la adición enzimática o química o la eliminación de glicanos o la expresión en una línea celular diseñada por ingeniería genética con un patrón de glucosilación definido. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede unirse a una proteína espícula de la superficie del SARS-CoV-2.
En otra realización más de la divulgación pero no parte de la invención, se proporciona una formulación de vacuna que comprende uno o más anticuerpos o fragmentos de anticuerpo caracterizados por secuencias de CDR de cadena pesada y ligera emparejadas por clones de las tablas 3 y 4, respectivamente. El al menos uno de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo puede estar codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada de acuerdo con las secuencias emparejadas por clones de la tabla 1, por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 %, o 90 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 1, o por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 1. El al menos uno de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo puede comprender secuencias variables de cadena ligera y pesada de acuerdo con las secuencias emparejadas por clones de la tabla 2 o puede comprender secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. El al menos uno de dichos fragmentos de anticuerpo puede ser un anticuerpo scFv (fragmento variable monocatenario) recombinante, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv. El al menos uno de dichos anticuerpos puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo biespecífico o un intracuerpo. El anticuerpo puede ser una IgG, o un anticuerpo IgG recombinante o un fragmento de anticuerpo que comprende una porción Fc mutada para alterar (eliminar o potenciar) las interacciones con FcR, para aumentar la semivida y/o aumentar la eficacia terapéutica, tal como una mutación LALA, LALA PG, N297, GASD/ALIE, DHS, YTE o LS o glicanos modificados para alterar (eliminar o potenciar) las interacciones con FcR, tales como la adición enzimática o química o la eliminación de glicanos o la expresión en una línea celular diseñada por ingeniería genética con un patrón de glucosilación definido. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede unirse a un antígeno de la proteína espícula de la superficie del SARS-CoV-2.
En una realización adicional de la divulgación pero no parte de la invención, se proporciona una formulación de vacuna que comprende uno o más vectores de expresión que codifican un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se describe en el presente documento. Los uno o más vectores de expresión pueden ser uno o más vectores de virus Sindbis o VEE. La vacuna puede formularse para su inyección con aguja, inyección por chorro o electroporación. La formulación de vacuna puede comprender además uno o más vectores de expresión que codifican un segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo, tal como un anticuerpo o fragmento distinto de las reivindicaciones 26-34.
En otra realización adicional de la divulgación pero no parte de la invención, se proporciona un método para proteger la salud de un sujeto mayor de 60 años, un sujeto inmunodeprimido o un sujeto que padece un trastorno respiratorio y/o cardiovascular que está infectado o en riesgo de infectarse con SARS-CoV-2 que comprende administrar a dicho sujeto un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene secuencias de CDR de cadena pesada y ligera emparejadas por clones de las tablas 3 y 4, respectivamente. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede estar codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad respecto de secuencias variables emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1 o por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen un 100 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede comprender secuencias variables de cadena ligera y pesada de acuerdo con las secuencias emparejadas por clones de la tabla 2 o secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo scFv (fragmento variable monocatenario) recombinante, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv. El anticuerpo puede ser una IgG, o un anticuerpo IgG recombinante o un fragmento de anticuerpo que comprende una porción Fc mutada para alterar (eliminar o potenciar) las interacciones con FcR, para aumentar la semivida y/o aumentar la eficacia terapéutica, tal como una mutación LALA, LALA PG, N297, GASD/ALIE, DHS, YTE o LS o glicanos modificados para alterar (eliminar o potenciar) las interacciones con FcR, tales como la adición enzimática o química o la eliminación de glicanos o la expresión en una línea celular diseñada por ingeniería genética con un patrón de glucosilación definido. El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico o un anticuerpo biespecífico. Dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede administrarse antes de la infección o después de la infección. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede unirse a un antígeno del SARS-CoV-2, tal como una proteína espícula de la superficie. La administración puede comprender la administración de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o administración genética con una secuencia de ARN o ADN o un vector que codifica el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede mejorar la respiración del sujeto, en comparación con un control no tratado y/o puede reducir la carga vírica, en comparación con un control no tratado.
En una realización adicional más de la divulgación pero no parte de la invención, se proporciona un método para determinar la integridad antigénica, la conformación correcta y/o la secuencia correcta de una proteína espícula de la superficie del SARS-CoV-2 que comprende (a) poner en contacto una muestra que comprende dicho antígeno con un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene secuencias de CDR de cadena pesada y ligera emparejadas por clones de las tablas 3 y 4, respectivamente; y (b) determinar la integridad antigénica, la conformación correcta y/o la secuencia correcta de dicho antígeno mediante la unión detectable de dicho primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo a dicho antígeno. La muestra puede comprender antígeno producido de manera recombinante o una formulación de vacuna o un lote de producción de vacuna. La detección puede comprender ELISA, RIA, transferencia de Western, un biosensor que emplea resonancia de plasmones superficiales o interferometría de biocapas o tinción por citometría de flujo. El primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede estar codificado por secuencias variables emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1, por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 % o 90 % de identidad respecto de secuencias variables emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1 o por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1. El primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede comprender secuencias variables de cadena ligera y pesada de acuerdo con las secuencias emparejadas por clones de la tabla 2, puede comprender secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 % o 90 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 2 o puede comprender secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. El primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo scFv (fragmento variable monocatenario) recombinante, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv. El método puede comprender además llevar a cabo las etapas (a) y (b) una segunda vez para determinar la estabilidad antigénica del antígeno con el paso del tiempo.
El método puede comprender además (c) poner en contacto una muestra que comprende dicho antígeno con un segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene secuencias de CDR de cadena pesada y ligera emparejadas por clones de las tablas 3 y 4, respectivamente; y (d) determinar la integridad antigénica de dicho antígeno mediante la unión detectable de dicho segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo a dicho antígeno. El segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede estar codificado por secuencias variables emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1, por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 % o 90 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1 o por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1. El segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede comprender secuencias variables de cadena ligera y pesada de acuerdo con las secuencias emparejadas por clones de la tabla 2, puede comprender secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 % o 90 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 2 o puede comprender secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. El segundo primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo scFv (fragmento variable monocatenario) recombinante, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv. El método puede comprender además llevar a cabo las etapas (c) y (d) una segunda vez para determinar la estabilidad antigénica del antígeno con el paso del tiempo.
También se divulga pero no es parte de la invención un anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo humano aislado o un hibridoma o una célula modificada por ingeniería genética que produce el mismo, en donde dicho anticuerpo se une a un antígeno de la proteína espícula de la superficie del SARS-CoV-2.
En un aspecto (A1) de la divulgación pero no parte de la invención proporcionado en el presente documento, un método para detectar la infección de COVID-19 por el SARS-CoV-2 en un sujeto comprende: (a) poner en contacto una muestra de dicho sujeto con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene secuencias de CDR de cadena pesada y ligera emparejadas por clones de las tablas 3 y 4, respectivamente; y (b) detectar el SARS-CoV-2 en dicha muestra mediante la unión de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo a un antígeno del SARS-CoV-2 en dicha muestra. En un aspecto (A2) de A1, dicha muestra es un fluido corporal. En un aspecto (A3) de A1 o A2, dicha muestra es de sangre, esputo, lágrimas, saliva, moco o suero, semen, secreciones de cuello de útero o vaginales, líquido amniótico, tejidos placentarios, orina, exudado, transudado, frotis de tejidos o heces. En un aspecto (A4) de uno cualquiera de A1-A3, la detección comprende un ELISA, RIA, ensayo de flujo lateral o transferencia de Western. En un aspecto (A5) de uno cualquiera de A1-A4, el método comprende además llevar a cabo las etapas (a) y (b) una segunda vez y determinar un cambio en las concentraciones de antígeno del SARS-CoV-2 en comparación con el primer ensayo. En un aspecto (A6) de uno cualquiera de A1-A5, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo está codificado por secuencias variables emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1. En un aspecto (A7) de uno cualquiera de A1-A5, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo está codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad respecto de secuencias variables emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1. En un aspecto (A8) de uno cualquiera de A1-A5, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo está codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen un 100 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1. En un aspecto (A9) de uno cualquiera de A1-A5, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende secuencias variables de cadena ligera y pesada de acuerdo con las secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. En un aspecto (A10) de uno cualquiera de A1-A5, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. En un aspecto (A11) de uno cualquiera de A1-A10, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a una proteína espícula de la superficie del SARS-CoV-2. En un aspecto (A12) de uno cualquiera de A1, el fragmento de anticuerpo es un anticuerpo scFv (fragmento variable monocatenario) recombinante, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv.
En un aspecto (A13) de la divulgación pero no parte de la invención proporcionado en el presente documento, un método para tratar a un sujeto infectado por SARS-CoV-2 o reducir la probabilidad de infección de un sujeto en riesgo de contraer el SARS-CoV-2, comprende administrar a dicho sujeto un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene secuencias de CDR de cadena pesada y ligera emparejadas por clones de las tablas 3 y 4, respectivamente. En un aspecto (A14) de A13, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo está codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1. En un aspecto (A15) de A13 o A14, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo está codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 1. En un aspecto (A16) de A13, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende secuencias variables de cadena ligera y pesada de acuerdo con las secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. En un aspecto (A17) de A13, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 % o 90 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. En un aspecto (A18) de A13, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. En un aspecto (A19) de uno cualquiera de A13-A18, el fragmento de anticuerpo es un anticuerpo scFv (fragmento variable monocatenario) recombinante, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv. En un aspecto (A20) de uno cualquiera de A13-A19, dicho anticuerpo es una IgG, o un anticuerpo IgG recombinante o un fragmento de anticuerpo que comprende una porción Fc mutada para alterar (eliminar o potenciar) las interacciones con FcR, para aumentar la semivida y/o aumentar la eficacia terapéutica, tal como una mutación LAlA, LALA PG, N297, GASD/ALIE, DHS, YTE o LS o glicanos modificados para alterar (eliminar o potenciar) las interacciones con FcR, tales como la adición enzimática o química o la eliminación de glicanos o la expresión en una línea celular diseñada por ingeniería genética con un patrón de glucosilación definido. En un aspecto (A21) de uno cualquiera de A13-A18, dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo biespecífico. En un aspecto (A22) de uno cualquiera de A13-A21 dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a una proteína espícula de la superficie del SARS-CoV-2. En un aspecto (A23) de uno cualquiera de A13-A22, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se administra antes de la infección o después de la infección. En un aspecto (A24) de uno cualquiera de A13-A23, dicho sujeto tiene 60 o más años, está inmunodeprimido o padece un trastorno respiratorio y/o cardiovascular. En un aspecto (A25) de uno cualquiera de A13-A24, la administración comprende la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo o la administración genética con una secuencia de ARN o ADN o un vector que codifica el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo.
En un aspecto (A26) de la divulgación pero no parte de la invención en el presente documento se proporciona un anticuerpo monoclonal, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se caracteriza por secuencias de CDR de cadena pesada y ligera emparejadas por clones de las tablas 3 y 4, respectivamente. En un aspecto (A27) de A26, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo está codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada de acuerdo con las secuencias emparejadas por clones de la tabla 1. En un aspecto (A28) de A26, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo está codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 1. En un aspecto (A29) de A26, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende secuencias variables de cadena ligera y pesada de acuerdo con las secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. En un aspecto (A30) de A26, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. En un aspecto (A31) de uno cualquiera de A26-A30, el fragmento de anticuerpo es un anticuerpo scFv (fragmento variable monocatenario) recombinante, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv. En un aspecto (A32) de uno cualquiera de A26-A30, dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico o es un anticuerpo biespecífico. En un aspecto (A33) de uno cualquiera de A26-A32, dicho anticuerpo es una IgG, o un anticuerpo IgG recombinante o un fragmento de anticuerpo que comprende una porción Fc mutada para alterar (eliminar o potenciar) las interacciones con FcR, para aumentar la semivida y/o aumentar la eficacia terapéutica, tal como una mutación LA<l>A, LALA PG, N297, GASD/ALIE, DHS, YTE o LS o glicanos modificados para alterar (eliminar o potenciar) las interacciones con FcR, tales como la adición enzimática o química o la eliminación de glicanos o la expresión en una línea celular diseñada por ingeniería genética con un patrón de glucosilación definido. En un aspecto (A34) de uno cualquiera de A26-A33, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a un antígeno del SARS-CoV-2, tal como una proteína espícula de la superficie. En un aspecto (A35) de uno cualquiera de A26-A34, dicho anticuerpo es un intracuerpo.
En un aspecto (A36) de la divulgación pero no parte de la invención proporcionado en el presente documento, un hibridoma o una célula modificada por ingeniería genética codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se caracteriza por secuencias de CDR de cadena pesada y ligera emparejadas por clones de las tablas 3 y 4, respectivamente. En un aspecto (A37) de A36, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo está codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada de acuerdo con las secuencias emparejadas por clones de la tabla 1. En un aspecto (A38) de A36, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo está codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80%o 90%de identidad respecto de secuencias variables emparejadas por clones de la tabla 1. En un aspecto (A39) de A36, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo está codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 95 % de identidad respecto de secuencias variables emparejadas por clones de la tabla 1. En un aspecto (A40) de A36, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende secuencias variables de cadena ligera y pesada de acuerdo con las secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. En un aspecto (A41) de A36, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo está codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 % o 90 % de identidad respecto de secuencias variables emparejadas por clones de la tabla 2. En un aspecto (A42) de A36, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. En un aspecto (A43) de uno cualquiera de A36-A42, el fragmento de anticuerpo es un anticuerpo scFv (fragmento variable monocatenario) recombinante, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv. En un aspecto (A44) de uno cualquiera de A36-A43, dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo biespecífico o un intracuerpo. En un aspecto (A45) de uno cualquiera de A36-A43, dicho anticuerpo es una IgG, o un anticuerpo IgG recombinante o un fragmento de anticuerpo que comprende una porción Fc mutada para alterar (eliminar o potenciar) las interacciones con FcR, para aumentar la semivida y/o aumentar la eficacia terapéutica, tal como una mutación LAlA, LALA PG, N297, GASD/ALIE, DHS, YTE o LS o glicanos modificados para alterar (eliminar o potenciar) las interacciones con FcR, tales como la adición enzimática o química o la eliminación de glicanos o la expresión en una línea celular diseñada por ingeniería genética con un patrón de glucosilación definido. En un aspecto (A46) de uno cualquiera de A36-A45, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a una proteína espícula de la superficie del SARS-CoV-2.
En un aspecto (A47) de la divulgación pero no parte de la invención proporcionado en el presente documento, una formulación de vacuna comprende uno o más anticuerpos o fragmentos de anticuerpo caracterizados por secuencias de CDR de cadena pesada y ligera emparejadas por clones de las tablas 3 y 4, respectivamente. En un aspecto (A48) de A47, al menos uno de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo está codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada de acuerdo con las secuencias emparejadas por clones de la tabla 1. En un aspecto (A49) de A47, al menos uno de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo está codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 % o 90 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 1. En un aspecto (A50) de A47, al menos uno de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo está codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 1. En un aspecto (A51) de A47, al menos uno de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo comprende secuencias variables de cadena ligera y pesada de acuerdo con las secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. En un aspecto (A52) de A47, al menos uno de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo comprende secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. En un aspecto (A53) de uno cualquiera de A47-A52, al menos uno de dichos fragmentos de anticuerpo es un anticuerpo scFv (fragmento variable monocatenario) recombinante, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv. En un aspecto (A54) de uno cualquiera de A47-A52, al menos uno de dichos anticuerpos es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo biespecífico o un intracuerpo. En un aspecto (A55) de uno cualquiera de A47-A54, dicho anticuerpo es una IgG, o un anticuerpo IgG recombinante o un fragmento de anticuerpo que comprende una porción Fc mutada para alterar (eliminar o potenciar) las interacciones con FcR, para aumentar la semivida y/o aumentar la eficacia terapéutica, tal como una mutación LALA, LALA PG, N297, GASD/ALIE, DHS, YTE o LS o glicanos modificados para alterar (eliminar o potenciar) las interacciones con FcR, tales como la adición enzimática o química o la eliminación de glicanos o la expresión en una línea celular diseñada por ingeniería genética con un patrón de glucosilación definido. En un aspecto (A56) de uno cualquiera de A47-A55, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a una proteína espícula de la superficie del SARS-CoV-2.
En un aspecto (A57) de la divulgación pero no parte de la invención proporcionado en el presente documento, una formulación de vacuna comprende uno o más vectores que codifican un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de A26-A34. En un aspecto (A58) de A57, dicho(s) vector(es) de expresión es/son vectores de virus Sindbis o VEE. En un aspecto (A59) de<a>57 o A58, la formulación de vacuna se formula para su administración mediante inyección por aguja, inyección por chorro o electroporación. En un aspecto (A60) de A57, la formulación de vacuna comprende además uno o más vectores de expresión que codifican un segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo distinto de uno cualquiera de A26-A34.
En un aspecto (A61) de la divulgación pero no parte de la invención proporcionado en el presente documento, un método para proteger la salud de un sujeto mayor de 60 años, un sujeto inmunodeprimido o un sujeto que padece un trastorno respiratorio y/o cardiovascular que está infectado o en riesgo de infectarse con SARS-CoV-2 comprende administrar a dicho sujeto un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene secuencias de CDR de cadena pesada y ligera emparejadas por clones de las tablas 3 y 4, respectivamente. En un aspecto (A62) de A61, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo está codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1. En un aspecto (A63) de A61 o A62, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo está codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada emparejadas por clones que tienen al menos un 95 % de identidad respecto de las expuestas en la tabla 1. En un aspecto (A64) de A61 o A62, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo está codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 % o 90 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 1. En un aspecto (A65) de A61, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende secuencias variables de cadena ligera y pesada de acuerdo con las secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. En un aspecto (A66) de A61, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 % o 90 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. En un aspecto (A67) de A61, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. En un aspecto (A68) de uno cualquiera de A61-A67, el fragmento de anticuerpo es un anticuerpo scFv (fragmento variable monocatenario) recombinante, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv. En un aspecto (A69) de uno cualquiera de A61-A68, dicho anticuerpo es una IgG, o un anticuerpo IgG recombinante o un fragmento de anticuerpo que comprende una porción Fc mutada para alterar (eliminar o potenciar) las interacciones con FcR, para aumentar la semivida y/o aumentar la eficacia terapéutica, tal como una mutación LALA, LALA PG, N297, GASD/ALIE, DHS, YTE o LS o glicanos modificados para alterar (eliminar o potenciar) las interacciones con FcR, tales como la adición enzimática o química o la eliminación de glicanos o la expresión en una línea celular diseñada por ingeniería genética con un patrón de glucosilación definido. En un aspecto (A70) de uno cualquiera de A61-A67, dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo biespecífico. En un aspecto (A71) de uno cualquiera de A61-A70, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se administra antes de la infección o después de la infección. En un aspecto (A72) de uno cualquiera de A61-A71, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a una proteína espícula de la superficie del SARS-CoV-2. En un aspecto (A73) de uno cualquiera de A61-A72, la administración comprende la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo o la administración genética con una secuencia de ARN o ADN o un vector que codifica el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo. En un aspecto (A74) de A61, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo mejora la respiración del sujeto, en comparación con un control no tratado. En un aspecto (A75) de A61, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo reduce la carga vírica en comparación con un control no tratado.
En un aspecto (A76) de la divulgación pero no parte de la invención proporcionado en el presente documento, un método para determinar la integridad antigénica, la conformación correcta y/o la secuencia correcta de una proteína espícula de la superficie del SARS-CoV-2 comprende: (a) poner en contacto una muestra que comprende dicho antígeno con un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene secuencias de CDR de cadena pesada y ligera emparejadas por clones de las tablas 3 y 4, respectivamente; y (b) determinar la integridad antigénica, la conformación correcta y/o la secuencia correcta de dicho antígeno mediante la unión detectable de dicho primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo a dicho antígeno. En un aspecto (A77) de A76, dicha muestra comprende antígeno producido de manera recombinante. En un aspecto (A78) de A76, dicha muestra comprende una formulación de vacuna o un lote de producción de vacuna. En un aspecto (A79) de A76-A78, la detección comprende ELISA, RIA, transferencia de Western, un biosensor que emplea resonancia de plasmones superficiales o interferometría de biocapas o tinción por citometría de flujo. En un aspecto (A80) de A76-A79, el primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo está codificado por secuencias variables emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1. En un aspecto (A81) de A76-A79, dicho primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo está codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 % o 90 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1. En un aspecto (A82) de uno cualquiera de A76-A79, dicho primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo está codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1. En un aspecto (A83) de uno cualquiera de A76-A79, dicho primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende secuencias variables de cadena ligera y pesada de acuerdo con las secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. En un aspecto (A84) de uno cualquiera de A76-A79, dicho primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 % o 90 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. En un aspecto (A85) de uno cualquiera de A76-A79, dicho primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. En un aspecto (A86) de uno cualquiera de A76-A85, el primer fragmento de anticuerpo es un anticuerpo scFv (fragmento variable monocatenario) recombinante, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv. En un aspecto (A87) de uno cualquiera de A76-A86, el método comprende además llevar a cabo las etapas (a) y (b) una segunda vez para determinar la estabilidad antigénica del antígeno con el paso del tiempo. En un aspecto (A88) de uno cualquiera de A76-A87, el método comprende además (c) poner en contacto una muestra que comprende dicho antígeno con un segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene secuencias de CDR de cadena pesada y ligera emparejadas por clones de las tablas 3 y 4, respectivamente; y (d) determinar la integridad antigénica de dicho antígeno mediante la unión detectable de dicho segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo a dicho antígeno. En un aspecto (A89) de A88, el segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo está codificado por secuencias variables emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1. En un aspecto (A90) de A89, dicho segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo está codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 % o 90 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1. En un aspecto (A91) de A89, dicho segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo está codificado por secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones como se exponen en la tabla 1. En un aspecto (A92) de A89, dicho segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende secuencias variables de cadena ligera y pesada de acuerdo con las secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. En un aspecto (A93) de A89, dicho segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 70 %, 80 % o 90 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. En un aspecto (A94) de A89, dicho segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende secuencias variables de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 95 % de identidad respecto de secuencias emparejadas por clones de la tabla 2. En un aspecto (A95) de A89, el segundo fragmento de anticuerpo es un anticuerpo scFv (fragmento variable monocatenario) recombinante, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv. En un aspecto (A96) de A89, el método comprende además llevar a cabo las etapas (c) y (d) una segunda vez para determinar la estabilidad antigénica del antígeno con el paso del tiempo.
En un aspecto (A97) de la divulgación pero no parte de la invención en el presente documento se proporciona un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo humano o un hibridoma o una célula modificada por ingeniería genética que produce el mismo, en donde dicho anticuerpo se une a una proteína espícula de la superficie del SARS-CoV-2.
El uso de la palabra "un" o "una", cuando se usa con el término "comprende" en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva, puede significar "uno", pero también concuerda con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno". La palabra "aproximadamente" significa más o menos un 5 % del número indicado.
Se contempla que pueda implementarse cualquier método o composición descrito en el presente documento con respecto a cualquier otro método o composición descrito en el presente documento. Otros objetos, características y ventajas de la presente divulgación resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, ha de entenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones específicas de la divulgación, se proporcionan únicamente a modo ilustrativo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
El archivo de la patente o solicitud contiene al menos un dibujo en color. Las copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con dibujo(s) en color las proporcionará la oficina tras la petición y el pago de la tasa necesaria.
Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente divulgación. La divulgación puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos, en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en el presente documento.
FIG. 1. Matriz de dosis-respuesta para evaluar la actividad de neutralización sinérgica mediante el cóctel de COV2-2196 COV2-2130 usando virus SARS-CoV-2 BSL3 vivo.Desde el punto de vista cualitativo, hubo una pequeña fracción de virus no neutralizado a las mayores concentraciones analizadas (250 ng/ml) de los mAb individuales (recuadros a 0 ng/ml de COV2-2196 250 ng/ml de COV2-2130 y 250 ng/ml COV2-2196 0 ng/ml COV2-2130) pero neutralización completa (100 %) al intervalo de menores concentraciones de Ab mediante el combo. El recuadro a 15.6 ng/ml de COV2-2196 63 ng/ml COV2-2130 indica el área con sinergia máxima con 15.6 ng/ml de mAb COV2-2196 y 63 ng/ml de mAb COV2-2130 en una combinación que neutralizó un 96 % del virus, mientras que los Ab individuales mostraron únicamente un 6 o 0 % de neutralización, respectivamente (óvalos a 0 ng/ml de COV2-2196 63 ng/ml de COV2-2130 y 15.6 ng/ml de COV2-2196 0 ng/ml de c Ov 2-2130). Se muestran los valores promedio para replicados técnicos por triplicado.
FIG. 2A-B. Matriz de dosis-respuesta para evaluar la actividad neutralizante sinérgica por el cóctel de mAb COV2-2196 mAb COV2-2130 usando virus SARS-CoV-2 BSL3 vivo.Se muestra la media de valores por triplicado para los replicados técnicos. Los datos se visualizaron y se evaluó la sinergia usando el programa informático SynergyFinder.
FIG. 3. Matriz de dosis-respuesta para evaluar la actividad neutralizante sinérgica por el cóctel de mAb COV2-2196 mAb COV2-2130 usando virus SARS-CoV-2 BSL3 vivo.Interpretación de la puntuación de sinergia:_<-10: es probable que la interacción sea antagonista; de -10 a 10: es probable que la interacción sea aditiva; >10: es probable que la interacción sea sinérgica.
FIG. 4A-C.Eficacia de los mAb humanos neutralizantes frente a la infección establecida por SARS-CoV-2.(FIG.
4A) Se inocularon ratones por vía intranasal con 105 UFP de MA-SARS-CoV-2 y 12 h después se les administraron los tratamientos con anticuerpos indicados mediante inyección intraperitoneal. La carga vírica en los pulmones se midió a los 2 días después de la exposición al virus usando el ensayo de placas. Se muestran las mediciones de ratones individuales y la mediana del título y cada grupo se comparó con el control de isotipo usando ANOVA de Kruskal-Wallis con prueba posterior de Dunn (* p <0.05). Los datos representan un experimento. (FIG. 4B) Se trataron ratones BALB/c de diez a once semanas de edad (un experimento de 3 a 9 ratones por grupo) con mAb anti-Ifnar1 y se transdujeron con AdV-hACE2 por vía intranasal un día después. Después de cuatro días, se inoculó a los ratones por vía intranasal con 105 FFU de SARS-CoV-2 auténtico y 12 h después se les administró los tratamientos con los mAb indicados mediante inyección intraperitoneal. La carga vírica en los pulmones se midió a los 2 ddi después de la exposición al virus usando el ensayo de placas. Dos controles para el ensayo de neutralización de placas incluyeron homogeneizados de pulmón de ratones individuales tratados con isotipo que se mezclaron a 1:1 (volumen:volumen) con homogeneizados de pulmón de ratones individuales no infectados o tratados con el cóctel de mAb de COV2-2196 COV2-2130. Se muestran las mediciones de ratones individuales y la mediana del título y cada grupo se comparó con el control de isotipo usando ANOVA de Kruskal-Wallis con prueba posterior de Dunn (** p <0.01). Los datos representan un experimento. (FIG. 4C) Se midió la expresión génica de citocinas y quimiocinas mediante análisis qPCR de los pulmones extraídos como en la FIG. 4B. Se muestran las mediciones de ratones individuales y los valores de la mediana. Los grupos se compararon usando la prueba de la U de Mann-Whitney (* p <0.05; ** p <0.01).
FIG. 5. Farmacocinética del anticuerpo después de la infusión del mAb humano en macacos.
FIG.6. Carga vírica del SARS-CoV-2 (medida como ARN subgenómico recién producido) en lavado broncoalveolar de macacos después de la exposición intranasal e intratraqueal con el virus SARS-CoV-2 de tipo silvestre.
FIG. 7. Carga vírica del SARS-CoV-2 (medida como ARN subgenómico recién producido) en especímenes de exudado nasal de macacos después de la exposición intranasal e intratraqueal con el virus SARS-CoV-2 de tipo silvestre.
FIG.8A-E. Estructura cristalina del RBD de proteína S en complejo con el Fab COV2-2196.(FIG. 8A) Representación esquemática de COV2-2196 en complejo con RBD. La cadena pesada de COV2-2196 se muestra en azul cian, la cadena ligera en magenta y la RBD en verde. El color es visible en la figura 8A del documento U.S. 63/161,890. (FIG. 8B) La estructura del complejo COV2-2196-RBD se superpone sobre la estructura del complejo RBD-ACE2 humana (PDB ID: 6M0J), usando la estructura del RBD como referencia. El esquema de colores del complejo COV2-2196-RBD es el mismo que en la FIG. 8A. El RBD en el complejo RBD-ACE2 está coloreado en azul claro, el dominio peptidasa de ACE2 humana en gris. El color es visible en la figura 8B del documento U.S. 63/161,890. (FIG. 8C) La estructura del complejo COV2-2196-RBD está superpuesta sobre la estructura de la espícula con un solo RBD en la conformación "arriba" (PDB ID: 6XM4), usando la RBD en la conformación "arriba" como referencia. El esquema de colores del complejo COV2-2196-RBD es el mismo que en la FIG. 8A. Las tres subunidades de la espícula están coloreadas en gris, amarillo o azul claro, respectivamente (la subunidad con su RBD en la conformación "arriba" se muestra en amarillo). El color es visible en la figura 8C del documento U.S. 63/161,890. (FIG. 8D) Representación de superficie del epítopo de RBD reconocido por COV2-2196. Los restos del epítopo están coloreados en distintas tonalidades de verde y se marcan en negro. El color es visible en la figura 8D del documento U.S. 63/161,890. (FIG. 8E) Interacciones de anticuerpo-antígeno entre COV2-2196 y RBD. RBD se muestra en la misma representación y orientación superficial que en la FIG. 8D. Los restos del parátopo de COV2-2196 se muestran en una representación de varillas. La cadena pesada se muestra en color azul cian y la cadena ligera está coloreada en magenta. El color es visible en la figura 8E del documento U.S. 63/161,890.
FIG.9A-F. Estructura cristalina del RBD de proteína S en complejo con ambos Fab, COV2-2196 y COV2-2130.(FIG.
9A) Representación esquemática de la estructura cristalina del RBD de proteína S en complejo con los Fab COV2-2196 y COV2-2130. El RBD se muestra en verde, la cadena pesada de COV2-2196 en azul cian, la cadena ligera de COV2-2196 en magenta, la cadena pesada de COV2-2130 en amarillo y la cadena ligera de COV2-2130 en naranja. Se marcan las CDR de COV2-2130. El color es visible en la figura 9A del documento U.S. 63/161,890. (FIG. 9B) La estructura del complejo COV2-2130-RBD se superpone sobre la estructura del complejo RBD-ACE2 (PDB ID: 6M0J), usando la estructura del RBD como referencia. El esquema de colores del complejo COV2-2130-RBD es el mismo que el de la FIG.
9A. El RBD en el complejo RBD-ACE2 está coloreado en azul claro, el dominio peptidasa de ACE2 humana en gris. El color es visible en la figura 9B del documento U.S. 63/161,890. (FIG. 9C) La estructura del complejo COV2-2130-RBD se superpone sobre la estructura de la espícula con toda la RBD en la conformación "abajo" (PDB ID: 6ZOY), usando la RBD en un protomero como referencia. El esquema de colores del complejo COV2-2130-RBD es el mismo que en la FIG. 9A. Los tres protomeros de la espícula se colorean en gris, azul claro o púrpura, respectivamente. El color es visible en la figura 9C del documento U.S. 63/161,890. (FIG. 9D) La estructura del complejo<c>O<v>2-2196-2130-RBD está superpuesta sobre la estructura de la espícula con un RBD en la conformación "arriba" (PDB ID: 7CAK), usando la RBD en la conformación "arriba" como referencia. El esquema de colores del complejo COV2-2130-RBD es el mismo que en la FIG.
9A. Los tres protomeros de la espícula se colorean en gris, azul claro o púrpura, respectivamente. El color es visible en la figura 9D del documento U.S. 63/161,890. (FIG. 9E) Representación de superficie del epítopo de RBD reconocido por COV2-2130. Los restos del epítopo están indicados en diferentes colores y se marcan en negro. El color es visible en la figura 9E del documento U.S. 63/161,890. (FIG. 9F) Interacciones de los restos del parátopo de COV2-2130 con el epítopo. RBD se muestra en la misma representación y orientación superficial que los de la FIG. 9E. Los restos del parátopo se muestran en una representación de varillas. La cadena pesada se muestra en color amarillo y la cadena ligera en color naranja. El color es visible en la figura 9F del documento U.S. 63/161,890.
FIG. 10A-B.(FIG. 10A) Resultados de IMGT/DomainGapAlign de las cadenas pesada y ligera de COV2-2196. Los restos que interactúan clave y sus restos correspondientes en los genes de línea germinal se muestran en recuadros. Las SEQ ID NO para las secuencias en la FIG. 10A son las siguientes:
(FIG. 10B) Curvas de unión de los mutantes puntuales de COV2-2196. Se identificaron los ADNc que codifican los mutantes puntuales para la cadena pesada, recuadrados anteriormente, se sintetizaron como ADN para producir proteínas IgG recombinantes y se analizó su actividad de unión a la proteína espícula. Los mutantes en el resto D108 se muestran en la gráfica superior izquierda, la mutación revirtiente de las mutaciones somáticas inferidas a la secuencia de línea germinal se muestran en la gráfica superior derecha, los mutantes de P99 se muestran en la gráfica inferior izquierda y un mutante de eliminación del enlace disulfuro en la HCDR3 se muestra en la gráfica inferior derecha.
FIG. 11A-H. Identificación de restos críticos para COV2-2196 y COV2-2130 mediante barrido mutacional profundo, acoplado con selección de variantes resistentes.(FIG. 11A) Gráficas logo de las fracciones de escape de mutaciones de todos los sitios de RBD con fuerte escape para COV2-2196 (izquierda) o COV2-2130 (derecha). Las letras más altas indican un mayor escape de la unión. Las mutaciones se colorean basándose en el grado de reducción de la unión de RBD a ACE2 humana. Los datos mostrados son la media de dos experimentos de selección de escape independientes usando dos bibliotecas de levadura independientes; las correlaciones se muestran en las FIG. 18B-C. Pueden encontrarse versiones ampliables interactivas de estas gráficas logo en jbloomlab.github.io/SARS-CoV-2-RBD_MAP_AZ_Abs/. Los inventores determinaron fracciones de escape, como se describen en los métodos, que representan la fracción estimada de células que expresan dicha variante específica que se encuentra dentro del grupo de escape de anticuerpo, de tal forma que un valor de 0 significa que la variante siempre se une al anticuerpo y un valor de 1 significa que siempre escapa de la unión al anticuerpo. (FIG. 11B) Gráficas logo de las fracciones de escape de mutación para COV2-2196 y COV2-2130 que son accesibles mediante sustituciones de un solo nucleótido de la cepa de referencia Wuhan-Hu-1 usada en las selecciones de escape (FIG. 11E-F). El efecto de cada sustitución en la unión a ACE2 se representa como en la FIG.
11A. (FIG. 11C) Panel izquierdo: mapeo de mutaciones de escape de barrido mutacional profundo para COV2-2196 sobre la superficie del RBD en la estructura de RBD-COV2-2196. Las mutaciones que suprimen la unión de COV2-2196 se muestran sobre la estructura del RBD usando una matriz cromática, donde el color azul representa el sitio del RBD con el mayor escape acumulado de anticuerpo y el color blanco representa que no se ha detectado escape. El color gris indica restos donde los efectos perjudiciales en la expresión del<r>B<d>impidieron la evaluación del efecto de la mutación en la unión al anticuerpo. Panel derecho: despiece del panel izquierdo que muestra los restos que interactúan alrededor de los sitios de escape más fuertes del RBD. La cadena pesada de COV2-2196 se muestra en color azul cian y la cadena ligera en magenta. Se efectuaron dos análisis duplicados con bibliotecas independientes, como se describe en la FIG: 11A. El color es visible en la figura 11C del documento U.S. 63/161,890 (FIG. 11D). Panel derecho: mapeo de mutaciones de escape de barrido mutacional para COV2-2130 sobre la superficie del RBD en la estructura de RBD-COV2-2130. Las mutaciones que suprimen la unión de COV2-2130 se muestran sobre la estructura del RBD usando una matriz cromática como en la FIG. 11C. Panel izquierdo: despiece del panel izquierdo que muestra los restos que interactúan alrededor de los sitios de escape más fuertes del RBD. La cadena pesada de COV2-2130 se muestra en color amarillo y la cadena ligera en color salmón. El color es visible en la figura 11D del documento U.S. 63/161,890. (FIG. 11E) Tabla que muestra los resultados de los experimentos de selección de escape del VSV-SARS-CoV-2 con COV2-2196, COV2-2130 y su combinación. Se indica el número de mutantes de escape seleccionados y el número total de replicados de la selección de escape, así como los restos identificados mediante secuenciación de los virus mutantes de escape. (FIG. 11F) Tabla que muestra los resultados del pase del SARS-CoV-2 en presencia de concentraciones subneutralizantes de AZD8895 (basado en COV2-2196), AZD1061 (basado en COV2-2130) y AZD7442 (AZD8895 AZD1061). Se destacan las mutaciones víricas asociadas con resistencia identificadas mediante secuenciación de placas resistentes a la neutralización. (FIG. 11G) Gráfica de dispersión que muestra los datos de DMS de la FIG. 11A, con la fracción de escape de mutación en el eje x y el efecto en la unión a ACE2 en el eje y. Las cruces indican mutaciones accesibles únicamente mediante sustituciones de múltiples nucleótidos, mientras que los círculos indican mutaciones accesibles mediante sustitución de un solo nucleótido. Se indican las sustituciones de aminoácidos seleccionadas mediante COV2-2130 en VSV-SARS-CoV-2 (K444R, K444E) o el SARS-CoV-2 auténtico (R346I). (FIG. 11H) Neutralización por anticuerpos medida mediante FRNT contra cepas de referencia y variantes del SARS-CoV-2 preocupantes. Se llevaron a cabo ensayos de neutralización por duplicado y se repitieron dos veces, mostrándose los resultados de un replicado experimental. Las barras de error indican el rango para cada punto. Se indican las mutaciones en comparación con la cepa de referencia WA-1. B.1.1.7-OXF contiene las eliminaciones 69-70 y 144-145 y las siguientes sustituciones: N501Y, A570D, D614G, P681H y T716I.
FIG. 12. Superposición de la subestructura de RBD-COV2-2196 en el complejo RBD-COV2-2196-2130 y estructura cristalina de RBD-COV2-2196.
FIG. 13A-F. Apilamiento de aromáticos similares y patrones de interacción hidrófoba en el sitio del RBD F486 compartidos entre los complejos de RBD-COV2-2196 y de espícula-S2E12.(FIGS. 13A y B) Mismo patrón de enlaces de hidrógeno que rodean el resto F486 en las estructuras de los dos complejos. (FIG. 13C) Interacciones detalladas entre COV2-2196 y RBD. La cadena pesada de COV2-2196 se muestra en color azul cian, la cadena ligera se muestra en color magenta y la RBD se muestra en color verde. Los restos importantes para la interacción se muestran en una representación de varillas. Las moléculas de agua implicadas en la interacción de Ab-Ag se representan como esferas de color rosa. Los enlaces de hidrógeno directos se muestran como líneas discontinuas de color naranja y los enlaces de hidrógeno mediados por agua como líneas discontinuas de color amarillo. El color es visible en la figura 2C de datos ampliados del documento U.S. 63/161,890. (FIG. 13D) Superposición de la estructura mediante crio-EM de S2E12/RBD sobre la estructura cristalina de COV2-2196/RBD, con los dominios variables de los anticuerpos como referencia. La cadena pesada de COV2-2196 se muestra en color azul cian y su cadena ligera en magenta; la cadena pesada de S2E12 se muestra en color azul cian pálido y su cadena ligera en color rosa claro. Las dos estructuras correspondientes del RBD se muestran en color verde o amarillo, respectivamente. El color es visible en la figura 2D de datos ampliados del documento U.S. 63/161,890. (FIG. 13E) Interacciones detalladas entre la cadena pesada de COV2-2130 y RBD. Los restos del parátopo se muestran en representación de varillas y en color amarillo, los restos del epítopo en varillas de color verde. Los enlaces de hidrógeno o las interacciones polares fuertes se representan como líneas discontinuas en color magenta. El color es visible en la figura 2E de datos ampliados del documento U.S. 63/161,890. (FIG. 13F) Interacciones detalladas entre la cadena ligera de COV2-2130 y RBD. Los restos del parátopo se muestran en representación de varillas y en color naranja, los restos del epítopo en varillas de color verde. Los enlaces de hidrógeno se representan como líneas discontinuas en color naranja. El color es visible en la figura 2F de datos ampliados del documento U.S. 63/161,890.
FIG. 14A-E. Un clonotipo común de los anticuerpos anti-RBD con el mismo mecanismo de unión(FIG. 14A) Estructura cristalina de COV2-2196/RBD. (FIG. 14B) Estructura de crio-EM de S2E12/RBD. (FIG. 14C) Modelo de homología de COV2-2381/RBD. COV2-2072 codifica una secuencia de glucosilación unida a N en la HCDR3, indicada mediante esferas de color gris. El color es visible en la figura 3D de datos ampliados del documento U.S. 63/161,890. (FIG. 14D) Modelo de homología de COV2-2072/RBD. (FIG. 14E) Superposición de la estructura cristalina de COV2-2196/RBD (FIG. 14A) y la estructura de crio-EM de S2E12/RBD (FIG. 14B).
FIG. 15A-B. Identificación de posibles miembros del clonotipo público genéticamente similares a COV2-2196 en los repertorios génicos variables del anticuerpo de individuos no expuestos previamente al virus.Se alinean las secuencias génicas variables del anticuerpo de individuos sanos con las mismas características de secuencia que la cadena pesada (FIG. 15A) y la cadena ligera (FIG. 15A y 15B) de COV2-2196. Secuencias de tres donantes diferentes, así como secuencias incluidas en sangre de cordón umbilical con las características del clonotipo público. Las características de secuencia y los restos de contacto usados en COV2-2196 se destacan con recuadros por debajo de cada alineamiento de múltiples secuencias (los recuadros se colorean en rojo en la figura 4A de datos ampliados del documento U.S. 63/161,890). Las SEQ ID NO para las secuencias de cadena pesada en la FIG. 15A son las siguientes: HIP1: SEQ ID NO: 166, HIP2: SEQ ID NO: 167, HIP3: SEQ ID NO: 168, y CORD: SEQ ID NO: 169. Las SEQ ID NO para las secuencias de cadena ligera en la FIG. 15A son las siguientes: HIP1: S<e>Q ID NO: 170, HIP2: SEQ ID NO: 171, y HIP3: SEQ ID NO: 172. Las SEQ ID NO para las secuencias de cadena ligera de HIP1 en la FIG. 15B son las siguientes: SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176 y SEQ ID NO: 177 (de arriba a abajo). Las SEQ ID NO para las secuencias de cadena ligera de HIP2 en la FIG. 15B son las siguientes: SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ Id NO: 180, SEQ ID NO: 181 y SEQ ID NO: 182 (de arriba a abajo). Las SEQ ID NO para las secuencias de cadena ligera de HIP3 en la FIG. 15B son las siguientes: SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186 y SEQ ID NO: 187 (de arriba a abajo).
FIG. 16A-D.(FIG. 16A) Estructura detallada del bucle de HCDR3 de COV2-2130. Los enlaces de hidrógeno de corto alcance, que estabilizan la conformación del bucle, se muestran como líneas discontinuas (las líneas discontinuas se muestran en color magenta en la figura 5A de datos ampliados del documento U.S. 63/161,890). (FIG. 16B) Los restos de la cadena ligera de COV2-2130 forman interacciones de apilamiento aromático y enlaces de hidrógeno con HCDR3 para estabilizar adicionalmente el bucle de HCDR3. (FIG. 16C) LCDR1, HCDR2 y HCDR3 largas forman una superficie de unión complementaria con el epítopo del RBD. El RBD se muestra como una representación de superficie en color gris. La cadena pesada de COV2-2130 se muestra en color amarillo con la HCDR3 en color naranja, y la cadena ligera en color salmón con la LCDR1 en magenta. El color es visible en la figura 3D de datos ampliados del documento U.S.
63/161,890. (FIG. 16D) Vista en rotación de 180° de la FIG. 16C.
FIG. 17. Interfaz entre COV2-2196 y COV2-2130 en la estructura cristalina del RBD en complejo con COV2-2196 y COV2-2130.La cadena pesada o ligera de COV2-2196 se muestran como una representación esquemática en color azul cian o magenta, respectivamente y la cadena pesada o ligera de COV2-2130 en color amarillo o salmón, respectivamente. El RBD se muestra en color verde. El color es visible en la figura 6 de datos ampliados del documento U.S. 63/161,890. Los restos de la interfaz se muestran en una representación de varillas.
FIG. 18A-I. Identificación mediante barrido mutacional profundo de mutaciones que afectan a la unión del anticuerpo y método de selección de mutantes resistentes al anticuerpo con el virus VSV-SARS-CoV-2.(FIG. 18A) Parte superior: gráficas de citometría de flujo que muestran la estrategia de selección representativa para la selección de células de levadura individuales usando la dispersión frontal y lateral (primeros tres paneles) y la selección de células de levadura que expresan la RBD (panel derecho). Cada gráfica procede de la selección anterior. Parte inferior: Gráficas de citometría de flujo que muestran la selección para células de levadura RBD+, anticuerpo- (es decir, células que expresan la RBD pero donde una mutación impide la unión del anticuerpo). Se muestran experimentos de selección para COV2-2196 o COV2-2130, mostrándose dos bibliotecas independientes para cada uno. (FIG. 18B) Correlación de los sitios observados de escape de la unión del anticuerpo entre experimentos de selección de la biblioteca de levadura usando COV2-2196, COV2-2130 o una mezcla 1:1 de COV2-2196 y COV2-2130. Los ejes x muestran la fracción de escape acumulada para cada sitio de la biblioteca 1 y los ejes y muestran la fracción de escape acumulada para cada sitio de la biblioteca 2. Se indican para cada gráfica el coeficiente de correlación y n. (FIG. 18C) Correlación de las mutaciones observadas que escapan de la unión del anticuerpo entre experimentos de selección de la biblioteca de levadura usando COV2-2196, COV2-2130 o una mezcla 1:1 de COV2-2196 y COV2-2130. Los ejes x muestran la fracción de escape de cada mutación de aminoácido para la biblioteca 1 y los ejes y muestran la fracción de cada mutación de aminoácido para la biblioteca 2. Se indican para cada gráfica el coeficiente de correlación y n. (FIGS. 18D-F) Resultados de DMS para COV2-2196 (FIG. 18D), COV2-2130 (FIG. 18E) o una mezcla 1:1 de COV2-2196 y COV22130 (FIG. 18F). Paneles a la izquierda: los sitios de escape a lo largo de toda la RBD se indican mediante picos que corresponden a las gráficas logo en el panel intermedio y derecho. Panel intermedio: como en la FIG. 11A, la gráfica de las fracciones de mutación de escape acumulativas de todos los sitios del RBD con fuertes mutaciones de escape para COV2-2196 o COV2-2130 o COV2-2196+COV2-2130. Las mutaciones se colorean basándose en el grado de supresión de la unión de RBD a ACE2 humana. Panel derecho: nuevamente, las gráficas muestran las fracciones de escape acumuladas, pero coloreadas basándose en el grado en que las mutaciones afectan a la expresión de RBD en el sistema de presentación en levadura. Las versiones interactivas ampliables de estas gráficas se encuentran en jbloomlab.github.io/SARS-CoV-2-RBD_MAP_AZ_Abs/. El color es visible en la figura 7F de datos ampliados del documento U.S. 63/161,890. (FIG. 18G) Sensogramas de RTCA representativos que muestran el virus que escapó a la neutralización por anticuerpos. Se monitorizó el efecto citopático (CPE) cinéticamente en células Vero E6 inoculadas con el virus en presencia de una concentración saturante (5 |jg/ml) del anticuerpo COV2-2130. Se muestran los casos representativos de escape (magenta) o ausencia de escape detectable (azul). Las células no infectadas (en verde) o las células inoculadas con virus sin anticuerpo (en rojo) sirven como controles. Las curvas de color magenta y azul representan un solo pocillo representativo; los controles de color rojo y verde son la media de replicados técnicos. El color es visible en la figura 7G de datos ampliados del documento U.S. 63/161,890. (FIG. 18H) Sensogramas de RTCA representativos que validan que un virus variante seleccionado mediante COV2-2130 en la FIG. 18G de hecho escaparon a COV2-2130 (magenta) pero se neutralizó por COV2-2196 (azul claro). El color es visible en la figura 7H de datos ampliados del documento U.S.
63/161,890. (FIG. 18I) Sensogramas ilustrativos de pocillos individuales de un análisis en placa E de 96 pocillos para los experimentos de selección de escape con COV2-2196, COV2-2130 o una mezcla 1:1 de COV2-2196 y COV2-2130. Se indican los casos de escape de COV2-2130, mientras que no se detectó escape en presencia de COV2-2196 o COV2-2196+COV2-2130. Los controles positivos y negativos se indican en la primera placa.
FIG. 19. Método de selección de mutantes resistentes al anticuerpo con virus SARS-CoV-2 auténtico.
FIG. 20(A-I). Características funcionales de los mAb neutralizantes del SARS-CoV-2.(FIG. 20A) Matriz cromática de la actividad de neutralización del mAb, la actividad de bloqueo de hACE2 y la unión a proteína S2Pecto trimérica o a SRBD monomérica. Los mAb se ordenan según su potencia de neutralización (máxima en la parte superior, mínima en la parte inferior). Las líneas discontinuas indican los 13 anticuerpos con un valor de CI50 de neutralización inferior a 150 ng/ml para el virus ts. Los valores de CI50 se visualizan para la neutralización vírica y el bloqueo de hACE2, mientras que los valores de CE50 se visualizan para la unión. Se muestra una forma recombinante del mAb con reactividad cruzada con SRB del SARS-CoV, CR3022, como control positivo, mientras que el mAb contra el dengue 2D22 se muestra como un control negativo. Los datos son representativos de al menos 2 experimentos independientes, cada uno realizado en un duplicado técnico. La ausencia de inhibición indica un valor de CI50 de >10,000 ng/ml, mientras que la ausencia de unión indica un valor de CE50 de >10,000 ng/ml. (FIGS. 20B-E) Correlación del bloqueo de hACE2, la unión al trímero S2Pecto o la unión a SRBD de los mAb con su actividad de neutralización. Se muestran los valores de R2 para el análisis por regresión lineal de los valores transformados logarítmicamente. Los círculos de color oscuro (mostrados en púrpura en las FIG. 1B-E del ejemplo 5 del documento U.S. 63/161,890) indican mAb con un valor de CI50 de neutralización inferior a 150 ng/ml. (FIG. 20E) Correlación del bloqueo de hACE2 y la unión al trímero S2Pecto. Se muestran los valores de R2 para el análisis por regresión lineal de los valores transformados logarítmicamente. (FIG. 20F) Curvas de neutralización para COV2-2196 y COV2-2130 en un ensayo de neutralización frente al auténtico virus SARS-CoV-2. Los valores de CI50 calculados se indican en la gráfica. Las barradas de error indican la desviación estándar de cada punto. Los datos son representativos de al menos 2 experimentos independientes, cada uno realizado en un duplicado técnico. (FIG 20G) Curvas de neutralización para COV2-2196 y COV2-2130 en un ensayo de neutralización de pseudovirus. Las barradas de error indican la desviación estándar de cada punto. Los valores mostrados son duplicados técnicos de un solo experimento. En la gráfica se indican los valores de CI50 calculados de un mínimo de 6 experimentos. (FIG 20H) Curvas de bloqueo de hACE2 para COV2-2196, COV2-2130 y el mAb para SARS-CoV no bloqueante, rCR3022 en el ELISA de bloqueo de hACE2. Los valores de CI50 calculados se indican en la gráfica. Las barradas de error indican la desviación estándar de cada punto. Los valores mostrados son triplicados técnicos de un experimento representativo repetido dos veces. (FIG 20I) ELISA de unión de COV2-2196, COV2-2130 y rCR3022 a S2Pecto trimérico. Los valores de CE50 calculados se indican en la gráfica. Las barradas de error indican la desviación estándar de cada punto. Los valores mostrados son triplicados técnicos de un experimento representativo repetido dos veces.
FIG. 21 (A-D). Mapeo de epítopos de los mAb mediante análisis de unión competitiva y neutralización sinérgica mediante un par de mAb.(FIG. 21A) A la izquierda: ensayo de unión de competición basado en interferometría de biocapas que mide la capacidad de los mAb para impedir la unión de los mAb de referencia COV2-2196 y rCR3022 a RBD fusionado a Fc de ratón (RBD-mFc) cargado sobre biosensores de anti-Fc de ratón. Los valores en los cuadrados son el % de unión del mAb de referencia en presencia de mAb competidor, en relación con un control de competición simulada. Los cuadrados de color negro indican competición completa (<33 % de unión en relación con el control sin competición), mientras que los cuadrados de color blanco indican la ausencia de competición (>67 % de la unión en relación con el control sin competición). A la derecha: ensayo de unión de competición de interferometría de biocapas que mide la capacidad de los mAb para impedir la unión de hACE2. Los valores indican el % de unión de hACE2, normalizado a la unión de hACE2 en ausencia de competición. El sombreado indica la competición del mAb con hACE2. (El sombreado mostrado en color rojo en la FIG. 2A del ejemplo 5 del documento U.S. 63/161,890.) (FIG. 21B) Competición del panel de mAb neutralizantes con mAb los mAb de referencia COV2-2130, COV2-2196 o rCR3022. Los mAb de referencia se biotinilaron y se midió la unión de los mAb de referencia a S2Pecto trimérica en presencia de cantidades saturantes de cada mAb en un ELISA de competición. Se normalizó la señal del ELISA para cada mAb de referencia a la señal en presencia del mAb sin unión contra el dengue, 2D22. El color negro indica una competición completa (<25 % de unión del mAb de referencia), el color gris indica una competición parcial (25-60 % de unión del mAb de referencia) y el color blanco indica ausencia de competición (>60 % de unión del mAb de referencia). (FIG. 21C) Neutralización sinérgica del SARS-CoV-2 de tipo silvestre mediante COV2-2196 y COV2-2130. Parte superior: matriz de neutralización con diluciones seriadas de cada mAb. El experimento se realizó en un triplicado técnico. Se muestra un experimento representativo de la cantidad que se efectuó en el triplicado técnico. En cada cuadrado se muestra el % de neutralización para cada combinación de mAb. Una matriz cromática de blanco a negro indica de un 0 % de neutralización a un 100 % de neutralización, respectivamente. (La matriz cromática mostrada de blanco a rojo en la FIG. 2C del ejemplo 5 del documento U.S. 63/161,890). (FIG. 21D) Matriz de sinérgica calculada basándose en la neutralización del SARS-CoV-2 en la FIG. 21C. Un color más oscuro (mostrado en color rojo en la FIG. 2D del ejemplo 5 del documento U.S. 63/161,890) indica áreas donde se observó neutralización sinérgica y un recuadro en negro indica el área de máxima sinergia entre los dos mAb.
FIG. 22 (A-F). Identificación de epítopos y caracterización estructural de los mAb.(FIG. 22A) Identificación de restos de contacto críticos mediante mutagénesis de alanina y arginina. Parte superior: unión de COV2-2130 (dorado), COV2-2165 (marrón) o COV2-2196 (violeta oscuro) a construcciones de SRBD de tipo silvestre (ts) o mutante medida mediante interferometría de biocapas. En el eje y se muestra la respuesta normalizada a la señal observada para la unión a SRBD ts. Parte inferior: curvas de unión representativas para COV2-2196 a construcciones de SRBD ts o con restos de contacto críticos mutados. El coloreado es visible en la FIG. 3A del ejemplo 5 del documento U.S. 63/161,890. (FIG. 22B) Estructura cristalina del SARS-CoV-2 (en azul) y de hACE2 (en verde) (PDB (6M0J)). El motivo de reconocimiento de hACE2 se muestra en color naranja. Los residuos de contacto críticos para COV2-2130 se muestran como esferas doradas, mientras que los restos de contacto críticos para COV2-2196 se muestran como esferas de color púrpura. El coloreado es visible en la FIG. 3B del ejemplo 5 del documento U.S. 63/161,890. (FIG. 22C) Unión mediante ELISA de los mAb al motivo de reconocimiento de hACE2 de 60 aminoácidos. r2D22, un mAb contra el dengue, se muestra como control negativo. Parte inferior: la estructura del motivo de reconocimiento de hACE2 en color naranja, con los restos de contacto críticos de COV2-2196 mostrados en color púrpura. El coloreado es visible en la FIG. 3C del ejemplo 5 del documento U.S.
63/161,890. (FIG. 22D) Complejos de Fab único:trímero de S2Pecto visualizados mediante microscopía electrónica de tinción negativa para COV2-2130 (dorado), COV2-2165 (marrón) o COV2-2196 (violeta oscuro). El RBD se muestra en color azul y el dominio N-terminal (NTD) de S se muestra en color rojo. La densidad de electrones se muestra en color gris. Se indica el estado trimérico (abierto o cerrado) para cada complejo. Las medias de clase 2D representativas para cada complejo se muestran en la parte inferior (tamaño del recuadro de 128 píxeles). El coloreado es visible en la FIG.
3D del ejemplo 5 del documento U.S. 63/161,890. (FIG. 22E) Fab COV2-2130 y COV2-2196 en complejo con el trímero S2Pecto. Unión simultánea de los Fab COV2-2130 (dorado) y COV2-2196 (púrpura) al trímero S2Pecto. La densidad de electrones se muestra en color gris. Se indica el estado trimérico (abierto o cerrado). Las medias de clase 2D representativas para los complejos se muestran en la parte inferior (tamaño del recuadro de 128 píxeles). Todas las imágenes se obtuvieron con Chimera. El coloreado es visible en la FIG. 3E del ejemplo 5 del documento U.S. 63/161,890. (FIG. 22F) Análisis de unión de competición visualizado en el trímero S2Pecto. La estructura cristalina de CR3022 se acopló con la estructura de doble Fab:trímero de S2Pecto. CR3022 se muestra en color azul cian. El coloreado es visible en la FIG. 3F del ejemplo 5 del documento U.S. 63/161,890. Parte inferior: un diagrama de Venn cuantitativo indica el número de mAb en cada grupo de competición y el solape entre grupos.
FIG. 23 (A-F). Eficacia protectora de los mAb humanos neutralizantes frente a la infección por SARS-CoV-2.(FIG.
23A) Modelo de exposición al SARS-CoV-2. Se trataron ratones BALB/c de diez a once semanas de edad (dos experimentos de 4-5 ratones por grupo) con mAb anti-Ifnar1 y se transdujeron con AdV-hACE2 por vía i.n. un día después. Después de cuatro días, se trató a los ratones por vía i.p. con 200 |jg de los mAb CoV2-2196, -2130 o una combinación (proporción 1:1) o mAb de control de isotipo. Un día después, se inoculó el SARS-CoV-2 por vía i.n. Se extrajeron tejidos a los 7 ddi para su análisis (FIG. 23C y 23D). (FIG. 23B) Cambio en el peso corporal de los ratones en el panel a. (ANOVA convencional unilateral con prueba posterior de Tukey: **** P <0.0001). (FIG. 2C) La carga vírica en el pulmón, bazo y corazón se midió mediante RT-qPcR: ANOVA de Kruskal-Wallis con prueba posterior de Dunn (*, P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001, **** P <0.0001). La línea discontinua indica el límite de detección del ensayo. (FIG. 23D) Se midió la expresión génica de citocinas y quimiocinas mediante análisis qPCR. ANOVA de Kruskal-Wallis con prueba posterior de Dunn (*, P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001). (FIG. 23E) Modelo de exposición al MA-SARS-CoV-2. Se inocularon ratones BALB/c de doce semanas de edad (n=10) con 105 UFP de MA-SARS-CoV-2 por la vía i.n. Se muestra el cambio en el peso corporal de los ratones. (FIG. 23F) La carga vírica en el pulmón se midió a los 2 ddi mediante RT-qPCR (a la izquierda) o un ensayo de placa (a la derecha) a partir de (FIG. 23E): A n OVA de Kruskal-Wallis con prueba posterior de Dunn (*** P <0.001, **** P <0.0001).
FIG. 24. Curvas de neutralización del SARS-CoV-2 para un panel de mAb.Neutralización del SARS-CoV-2 auténtico mediante mAb humanos. Se muestra la media ± DE de los duplicados técnicos. Los datos representan uno de dos o más experimentos independientes.
FIG. 25A-B. Curvas de inhibición para la inhibición mediante mAb de la unión de S2Pecto a hACE2.Bloqueo de la unión de hACE2 a S2Pecto mediante mAb humanos neutralizantes dirigidos contra el SARS-CoV-2. Se muestra la media ± DE de los triplicados de un experimento. Los anticuerpos CR3022 y 2D22 sirvieron como controles.
FIG. 26A-B. ELISA de unión de mAb humanos neutralizantes anti-SARS-CoV-2 a SRBD trimérico, S2Pecto o el antígeno S2Pecto del SARS-CoV.Se muestran la media ± DE de los triplicados y representantes de dos experimentos. Los anticuerpos CR3022 y 2D22 sirvieron como controles.
FIG. 27A-B. Mapeo de los restos de contacto críticos del mAb mediante mutagénesis de alanina y arginina e interferometría de biocapas.(FIG. 27A) A la izquierda: valores de respuesta de la unión del mAb a construcciones de SRBD de ts o mutantes normalizada al ts. Los asteriscos indican restos donde se observó un aumento de la disociación del mAb, que probablemente indican que el resto se encuentra próximo al epítopo del mAb. A la derecha: curvas de respuesta completa para la asociación y disociación del mAb con construcciones de SRBD de ts o mutante. (FIG. 27B) Estructura del RBD que resalta los restos de contacto críticos para varios mAb y su ubicación en la estructura.
DESCRIPCIÓN DE REALIZACIONES ILUSTRATIVAS
Como se ha analizado anteriormente, el SARS-CoV-2 es un problema de salud importante, con casos activos que aumentan a diario. Por tanto, es extremadamente importante comprender la biología de este virus y la naturaleza y el alcance de la respuesta inmunitaria humana al virus. Los inventores han identificado las secuencias de los anticuerpos humanos contra el SARS-CoV-2. En el presente documento se muestran estas secuencias y los usos para dichos anticuerpos.
Además, mediante el estudio en detalle de la interacción del anticuerpo (COV2-2196) con la RBD, los inventores identifican la base molecular para la selección de un clonotipo público para el SARS-CoV-2 que está impulsado por una configuración estructural compleja que implica cadenas tanto pesadas como ligeras. Las características estructurales compartidas de este clonotipo contribuyen a la formación de un parátopo que comprende restos en las cadenas tanto pesadas como ligeras, pero que notablemente son independientes de la HCDR3 que normalmente es dominante en las interacciones antígeno-anticuerpo. Los inventores demuestran que este clonotipo público es uno de los tipos más frecuentemente compartidos de los anticuerpos neutralizantes potentes producidos por seres humanos contra la proteína RBD del SARS-CoV-2. Se reveló en estudios estructurales detallados que el parátopo del anticuerpo normalmente formado contribuye a una "jaula aromática" formada por cinco restos aromáticos en el parátopo que rodea a la interfaz de las cadenas pesada y ligera. Esta estructura de jaula se coordina con un resto aromático en la proteína S del SARS-CoV-2, que causa la alta especificidad y afinidad de estos anticuerpos. De manera destacable, aunque se necesitan las cadenas tanto pesada como ligera para formar este clonotipo público (definiendo de este modo los genes canónicos IGHV, IGHJ, IGLV e IGLJ en el clonotipo), la HCDR3 afecta de manera mínima a la interacción. Dado que estas recombinaciones de cadena pesada IGHV1-58-IGHJ3 y de cadena ligera IGKV3-20-IGKJ1 son comunes en el repertorio de linfocitos B preinmunes, muchos individuos posiblemente producen dichos clones durante la respuesta a la infección por o la vacunación contra el SARS-CoV-2. El sitio antigénico reconocido por la compleja estructura preconfigurada de este clonotipo público es probablemente un importante componente de una vacuna protectora contra la COVID-19, debido a la frecuencia del clon de linfocitos B en la población humana y a la potencia de neutralización y protectora de los anticuerpos codificados por los segmentos génicos variables.
Estos y otros aspectos de la divulgación se describen con detalle a continuación.
I. Coronavirus de 2019 (SARS-CoV-2)
El SARS-CoV-2 es un virus contagioso que provoca la enfermedad respiratoria aguda denominada enfermedad por coronavirus de 2019 (COVID-19), una infección respiratoria. Es la causa del actual brote epidémico por coronavirus de 2019-20, una emergencia de salud global. La secuenciación genómica ha demostrado que es un coronavirus de ARN monocatenario de sentido positivo.
Durante el actual brote epidémico, el virus se ha denominado por los no expertos como "el coronavirus", "el nuevo coronavirus", "el coronavirus de Wuhan", aunque la OMS recomienda denominarlo "SARS-CoV-2". El comité internacional de taxonomía de virus (ICTV) anunció que el nombre oficial para el virus es SARS-CoV-2.
Muchos de los primeros casos estaban vinculados con un gran mercado de mariscos y animales en la ciudad china de Wuhan y se cree que el virus tiene un origen zoonótico. La comparación de las secuencias genéticas de este virus y otras muestras de virus han mostrado similares con el SARS-CoV (79.5 %) y con coronavirus de murciélago (96 %). Esta observación hace que sea probable que proceda de murciélagos, aunque no puede descartarse un hospedador intermedio, por ejemplo un pangolín. El virus puede ser un virus recombinante formado a partir de dos o más coronavirus.
Se ha confirmado la transmisión del virus entre humanos. Los coronavirus se propagan principalmente mediante contacto cercano, en particular, mediante aerosoles respiratorios procedentes de toses y estornudos a una distancia de aproximadamente 6 pies (1.8 m). También se ha encontrado ARN vírico en muestras de heces de pacientes infectados. Es posible que el virus sea infeccioso incluso durante el periodo de incubación.
Inicialmente se sospechó que los animales vendidos para consumo eran el reservorio o los hospedadores intermedios del SARS-CoV-2, debido a que muchos de los primeros individuos que se infectaron por el virus trabajaban en el Mercado de mariscos de Huanan. También se culpó a un mercado de animales vivos por el brote epidémico del SARS en 2003; se considera que dichos mercados son incubadoras de nuevos patógenos. El brote epidémico ha forzado a una prohibición temporal del comercio y consumo de animales silvestres en China. Sin embargo, algunos investigadores han sugerido que es posible que el Mercado de mariscos de Huanan puede no ser la fuente original de la transmisión del virus a seres humanos.
Con un número suficiente de genomas secuenciados, es posible reconstruir un árbol filogenético del historial de mutaciones de una familia de virus. La investigación acerca del origen del brote epidémico del SARS de 2003 dio como resultado el descubrimiento de muchos coronavirus de murciélago similares al SARS, muchos de ellos originados en el géneroRhinolophusde murciélagos de herradura. El SARS-CoV-2 se encuentra en esta categoría de coronavirus relacionados con el SARS. Dos secuencias genómicas deRhinolophus sinicuspublicadas en 2015 y 2017 muestran una similitud del 80 % respecto del SARS-CoV-2. Un tercer genoma vírico deRhinolophus affinis,"RaTG13" recogido en la provincia de Yunnan, tiene un 96 % de semejanza con el SARS-CoV-2.[28][29] Por comparación, esta cantidad de variación entre distintos virus es similar a la cantidad de mutación observada en un espacio de tiempo de diez años en la cepa H3N2 del virus de la gripe humana.
El SARS-CoV-2 pertenece a la amplia familia de virus conocidos como coronavirus; "nCoV" es el término habitual usado para denominar los nuevos coronavirus, hasta que se elija una denominación más específica. Es un virus de ARN monocatenario de sentido positivo (ARNss+). Otros coronavirus tienen la capacidad de provocar enfermedades que abarcan desde el resfriado común hasta enfermedades más graves, tales como el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) y el síndrome respiratorio agudo grave (SARS). Es el séptimo coronavirus conocido que infecta a seres humanos, tras el 229E, NL63, OC43, HKU1, MERS-CoV y SARS-CoV.
Al igual que el SARS-CoV, el SARS-CoV-2 es un miembro del subgéneroSarbecovirus(Beta-CoV linaje B). Su secuencia de ARN tiene aproximadamente 30,000 bases de longitud. Hasta el 12 de enero, se habían aislado cinco genomas del SARS-CoV-2 en Wuhan y notificado por el Centro para el Control y Prevención de Enfermedades chino (CCDC) y otras instituciones; el número de genomas aumentó hasta 28 a fecha de 26 de enero. Salvo por el primer genoma en GenBank, los genomas se encuentran embargados en el GISAID. Puede encontrarse un análisis filogenético de las muestras en Nextrain.
La publicación del genoma del SARS-CoV-2 originó varios experimentos de modelaje de proteínas en la proteína de unión a receptor (RBD) de la proteína espícula (S) del virus. Los resultados sugieren que la proteína S conserva una afinidad suficiente por el receptor de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) como para usarlo como mecanismo de entrada a la célula. El 22 de enero, un grupo en China que trabajaba con el virus completo y un grupo en los EE. UU. que trabajaba mediante genética inversa demostraron de manera independiente y experimental que ACE2 humana es el receptor para el SARS-CoV-2.
A fin de buscar posibles inhibidores de proteasa, también se ha modelado la proteasa similar a 3C M(pro) de la poliproteína del ORF1a para experimentos de acoplamiento a fármacos. Innophore ha producido dos modelos computacionales basándose en la proteasa del SARS y la Academia China de Ciencias ha producido una estructura experimental no publicada de una proteasa del SARS-CoV-2 recombinante. Además, investigadores en la Universidad de Michigan han modelado las estructuras de todos los péptidos maduros en el genoma del SARS-CoV-2 usando I-TASSER.
La primera infección en humanos conocida se produjo a primeros de diciembre de 2019. Inicialmente se detectó un brote epidémico de SARS-CoV-2 en Wuhan, China, a mediados de diciembre de 2019, posiblemente causado por un solo animal infectado. Posteriormente, el virus se expandió a todas las provincias de China y a más de dos docenas de países en Asia, Europa, América del Norte y Oceanía. Se ha confirmado la transmisión del virus entre humanos en todas estas regiones. El 30 de enero de 2020, la OMS declaró que el SARS-CoV-2 es una emergencia sanitaria global.
Hasta el 10 de febrero de 2020 (17:15 UTC), había 40,645 casos de infección confirmada, de los cuales 40,196 se encontraban en la China continental. Inicialmente, prácticamente todos los casos fuera de China se produjeron en personas que o bien habían viajado a Wuhan o que estuvieron en contacto directo con alguien que había viajado a esa zona. Posteriormente, la dispersión viajeros a otros países causó la transmisión en muchos países de todo el mundo. Aunque sigue sin estar clara la proporción de infecciones que desembocan en infección confirmada o una enfermedad respiratoria aguda causada por SARS-CoV-2 diagnosticable, el número total de muertes atribuidas al virus era mayor de 19,000 a fecha de 25 de marzo de 2020.
Se ha estimado que el número reproductivo básico (R-cero) del virus es de entre 1.4 y 3.9. Esto significa que, cuando no se detecta, el virus provoca de 1.4 a 3.9 nuevos casos por cada infección establecida. Se ha determinado que el virus es capaz de transmitirse a lo largo de una cadena de al menos cuatro personas.
En enero de 2020, diversas organizaciones e instituciones comenzaron a trabajar en la creación de vacunas para el SARS-CoV-2 basándose en el genoma publicado. En China, el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades chino está desarrollando una vacuna contra el nuevo coronavirus. La Universidad de Hong Kong también ha anunciado que está desarrollando una vacuna. El Hospital de Shanghái Este también está desarrollando una vacuna en colaboración con la compañía biotecnológica Stermirna Therapeutics.
En otras partes, hay tres proyectos de vacuna respaldados por la Coalición para las Innovaciones en Preparación para Epidemias (CEPI), que incluye los proyectos de las compañías biotecnológicas Moderna e Inovio Pharmaceuticals y otro de la Universidad de Queensland. Los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de los Estados Unidos cooperan con Moderna para crear una vacuna de ARN que imite a la espícula de la superficie del coronavirus; los ensayos clínicos de fase I comenzaron en marzo de 2020. Inovio Pharmaceuticals está desarrollando una vacunación a base de ADN y colabora con una firma china a fin de acelerar su aceptación por las autoridades reguladoras de China, con la intención de llevar a cabo ensayos con seres humanos de la vacuna en verano de 2020. En Australia, la Universidad de Queensland está investigando el potencial de una vacuna de pinza molecular que podría modificar genéticamente las proteínas víricas para hacer que imiten al coronavirus y estimular una reacción inmunitaria.
En un proyecto independiente, la Agencia de Salud Pública de Canadá ha autorizado al Centro de Vacunas Internacional (VIDO-InterVac) en la Universidad de Saskatchewan para comenzar a trabajar en una vacuna. VIDO-InterVac tiene previsto comenzar la producción y ensayos en animales en marzo de 2020 y los ensayos en humanos en 2021. La Facultad de Medicina del Imperial College de Londres se encuentra en fase de experimentación con animales de una vacuna.
La enfermedad respiratoria aguda COVID-19 es una enfermedad respiratoria vírica causada por el SARS-CoV-2. Se detectó inicialmente durante el brote epidémico por coronavirus en Wuhan de 2019-20. Los síntomas pueden incluir fiebre, tos seca y dificultad para respirar. No hay un tratamiento autorizado específico disponible a fecha de marzo de 2020, y los esfuerzos se centran en el alivio sintomático y el soporte funcional.
Los pacientes infectados pueden ser o bien asintomáticos o tener síntomas de leves a intensos, tales como fiebre, tos y dificultad para respirar. Son menos frecuentes la diarrea o síntomas respiratorios superiores (por ejemplo, estornudo, rinorrea, dolor de garganta). Los casos de infección grave pueden evolucionar en neumonía grave, fallo multiorgánico y muerte. La Organización Mundial de la Salud ha estimado que el tiempo desde la exposición hasta la aparición de los síntomas es de 2 a 10 días y según los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos, es de 2 a 14 días.
Las organizaciones sanitarias mundiales han publicado las medidas preventivas que puede adoptar la población para reducir la probabilidad de infectarse por el SARS-CoV-2. Las recomendaciones son similares a las publicadas anteriormente para otros coronavirus e incluyen: lavado frecuente de manos con agua y jabón; no tocarse los ojos, nariz o boca sin haberse lavado las manos; y práctica de buena higiene respiratoria.
La OMS ha publicado varios protocolos de pruebas para el SARS-CoV-2. La prueba emplea reacción en cadena de la polimerasa de retrotranscripción en tiempo real (rRT-PCR). La prueba puede efectuarse en muestras respiratorias o de sangre. Generalmente se dispone de los resultados en un plazo de unas pocas horas hasta días.
En enero de 2020 se iniciaron las investigaciones de posibles tratamientos para la enfermedad. A finales de enero, el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades chino comenzó a probar los tratamientos existentes para la neumonía en los casos de neumonía causada por coronavirus. También se ha examinado el inhibidor de la ARN polimerasa remdesivir y del interferón beta. A finales de enero de 2020, investigadores médicos chinos manifestaron su intención de comenzar ensayos clínicos con remdesivir, cloroquina y lopinavir/ritonavir, que parecían tener "efectos inhibidores posiblemente buenos" contra el SARS-CoV-2 a nivel celular en la investigación exploratoria. El 5 de febrero de 2020, China comenzó a patentar el uso de remdesivir contra la enfermedad.
Se desconocen las tasas de mortalidad y morbilidad generales causadas por la infección por SARS-CoV-2, debido a que la tasa de letalidad puede cambiar con el paso del tiempo en el actual brote epidémico y a que sigue sin esclarecerse la proporción de infecciones que evolucionan a enfermedad diagnosticable. Sin embargo, las investigaciones preliminares acerca de la enfermedad respiratoria aguda por SARS-CoV-2 han arrojado una tasa de letalidad de entre el 2 % y el 3 % y en enero de 2020, la OMS sugirió que la tasa de letalidad era aproximadamente del 3 %. Un estudio no revisado antes de imprenta del Imperial College entre 55 casos de muerte observó que las estimaciones de mortalidad iniciales podrían ser demasiado elevadas, ya que no se detectaban las infecciones asintomáticas. Estimaron una tasa de mortalidad media a causa de la infección (la mortalidad entre los infectados) en el intervalo del 0.8 % cuando se incluye a los portadores asintomáticos hasta el 18 % cuando se incluyen únicamente los casos sintomáticos de la provincia de Hubei.
Los datos iniciales indican que entre los primeros 41 casos confirmados ingresados en los hospitales de Wuhan, 13 (32 %) necesitaron cuidados intensivos y 6 (15 %) individuos fallecieron. Entre los que fallecieron, muchos no gozaban de buena salud, con afecciones como hipertensión, diabetes o enfermedad cardiovascular que comprometían sus sistemas inmunitarios. En los primeros casos de enfermedad respiratoria aguda por SARS-CoV-2 que desembocaron en muerte, se observó que la mediana de tiempo de la enfermedad era de 14 días, con un rango total de seis a 41 días.
II. Anticuerpos monoclonales y producción de los mismos
Un "anticuerpo aislado" es uno que se ha separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones particulares, el anticuerpo se purifica: (1) hasta más de un 95 % en peso del anticuerpo, determinado mediante el método de Lowry y más particularmente hasta más de un 99 % en peso; (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria; o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpoin situentre células recombinantes, ya que no estará presente al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
La unidad básica de cuatro cadenas del anticuerpo es una glucoproteína heterotetramérica formada por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Un anticuerpo IgM consta de 5 unidades heterotetraméricas básicas, junto con un polipéptido adicional denominado cadena J y por tanto, contiene 10 sitios de unión a antígeno, mientras que los anticuerpos IgA secretados pueden polimerizarse para formar conjuntos polivalentes que comprenden 2-5 de las unidades básicas de 4 cadenas, junto con la cadena J. En el caso de las IgG, la unidad de 4 cadenas es generalmente de aproximadamente 150,000 Dalton. Cada cadena L está unida a una cadena H por medio de un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están unidas entre sí mediante uno o más enlaces disulfuro, dependiendo del isotipo de la cadena H. Cada cadena H y L también tiene puentes disulfuro intracadena regularmente espaciados. Cada cadena H en el extremo N-terminal tiene una región variable (Vh) seguida de tres dominios constantes (C<h>) para cada una de las cadenas alfa y gamma y cuatro dominios C<h>para los isotipos mu. Cada cadena L tiene, en el extremo N-terminal, una región variable (Vl) seguida de un dominio constante (Cl) en su otro extremo. El Vl se alinea con el V<h>y el C<l>se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada (Cm). Se cree que hay restos de aminoácidos particulares que forman una interfaz entre las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada. El emparejamiento de una V<h>y V<l>entre si forma un solo sitio de unión a antígeno. Para la estructura y las propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, véase, por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8.a edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, página 71 y Capítulo 6.
La cadena L de cualquier especie de vertebrado puede asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes (C<l>). Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (Ch), las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases o isotipos. Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que tienen cadenas denominadas alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las clases gamma y alfa se dividen adicionalmente en subclases basándose en diferencias relativamente menores en la secuencia y función de C<h>, los seres humanos expresan las siguientes subclases: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.
El término "variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios V difieren en gran medida en secuencia entre anticuerpos. El dominio V media la unión al antígeno y define la especificidad de un anticuerpo por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está uniformemente distribuida a lo largo del tramo de 110 aminoácidos de las regiones variables. En lugar, las regiones V consisten en tramos relativamente invariantes denominados regiones marco (FR) de 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas de extrema variabilidad denominadas "regiones hipervariables" que tienen cada una 9-12 aminoácidos de longitud. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada una cuatro FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina beta, conectada por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan y en algunos casos forman parte de la estructura de la lámina beta. Las regiones hipervariables en cada cadena pesada se mantienen muy próximas mediante las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Los dominios constantes no están directamente implicados en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), la fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP), la fagocitosis de neutrófilos dependiente de anticuerpos (ADNP) y la deposición de complemento dependiente de anticuerpo (ADCD).
La expresión "región hipervariable", cuando se usa en el presente documento, se refiere a los restos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende generalmente restos de aminoácido de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, alrededor de aproximadamente los restos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la Vl, y alrededor de aproximadamente 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en la Vh cuando se numeran de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat; Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)); y/o aquellos restos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, los restos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la V<l>y 26-32 (<h>1), 52 56 (H2) y 95-101 (H3) en la Vh cuando se numeran de acuerdo con el sistema de numeración de Chothia; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); y/o aquellos restos de un "bucle hipervariable"/CDR (por ejemplo, los restos 27-38 (L1), 56-65 (L2) y 105-120 (L3) en la V<l>y 27-38 (H1), 56-65 (H2) y 105-120 (H3) en la V<h>cuando se numeran de acuerdo con el sistema de numeración IMGT; Lefranc, M. P.et al.Nucl. Acids Res. 27:209-212 (1999), Ruiz, M.et al.Nucl. Acids Res.
28:219-221 (2000)). Opcionalmente, el anticuerpo tiene inserciones simétricas en uno o más de los siguientes puntos 28, 36 (L1), 63, 74-75 (L2) y 123 (L3) en la Vl, y 28, 36 (H1), 63, 74-75 (H2) y 123 (H3) en la VsubH cuando se numeran de acuerdo con AHo; Honneger, A. y Plunkthun, A. J. Mol. Biol. 309:657-670 (2001)).
Por "resto de ácido nucleico de línea germinal" se entiende el resto de ácido nucleico que se produce de manera natural en un gen de línea germinal que codifica una región constante o variable. "Gen de línea germinal" es el ADN observado en una célula germinal (es decir, una célula destinada a convertirse en un óvulo o espermatozoide). Una "mutación de línea germinal" se refiere a un cambio heredable en un ADN particular que se ha producido en una célula germinal o el cigoto en el estadio de una sola célula y cuando se transmite a la descendencia, dicha mutación se incorpora en cada célula del organismo. Una mutación somática se diferencia de una mutación de línea germinal en que se adquiere en una sola célula del organismo. En algunos casos, los nucleótidos en una secuencia de ADN de línea germinal que codifican una región variable se mutan (es decir, una mutación somática) y reemplazan por un nucleótido diferente.
La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por las posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son sumamente específicos, ya que se dirigen contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales ofrecen ventajas porque pueden sintetizarse sin contaminación por parte de otros anticuerpos. No debe interpretarse por el modificador "monoclonal" que se requiera cualquier método particular para la producción del anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales útiles en la presente divulgación pueden prepararse mediante la metodología de hibridoma, descrita inicialmente por Kohleret al.,Nature, 256:495 (1975), o puede producirse usando métodos de ADN recombinante en células bacterianas, animales o vegetales eucariotas (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 4,816,567) después de la clasificación de un linfocito B específico para el antígeno, un plasmablasto específico para el antígeno que responde a una infección o inmunización o la captura de cadenas pesadas y ligeras a partir de células individuales en una colección específica de antígenos clasificados en bruto. Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpos en fagos usando, por ejemplo, las técnicas descritas en Clacksonet al.,Nature, 352:624-628 (1991) y Markset al.,J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).
A. Métodos generales
Se entenderá que los anticuerpos monoclonales que se unen al SARS-CoV-2 tendrán varias aplicaciones. Estas incluyen la producción de kits de diagnóstico para su uso en la detección y el diagnóstico de la infección por SARS-CoV-2, así como para tratar la misma. En estos contextos, se pueden relacionar dichos anticuerpos con agentes de diagnóstico o terapéuticos, usarlos como agentes de captura o competidores en ensayos competitivos o usarlos individualmente sin unir a los mismos agentes adicionales. Los anticuerpos pueden mutarse o modificarse, como se analiza con más detalle más adelante. Los métodos para preparar y caracterizar anticuerpos se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Patente de los Estados Unidos 4,196,265).
Los métodos para generar anticuerpos monoclonales (mAb) comienzan generalmente de manera similar a aquellos para preparar anticuerpos policlonales. La primera etapa para ambos métodos es la inmunización de un hospedador adecuado o la identificación de sujetos que son inmunes debido a una infección natural o vacunación anterior con una vacuna autorizada o experimental. Como es bien sabido en la técnica, puede variar la inmunogenicidad de una composición determinada para la inmunización. Por tanto, normalmente es necesario reforzar el sistema inmunitario del hospedador, lo que puede lograrse acoplando un inmunógeno peptídico o polipeptídico a un portador. Los portadores ilustrativos y preferidos son la hemocianina de lapa californiana (KLH) y la seroalbúmina bovina (BSA). También pueden usarse como portadores otras albúminas, tales como ovoalbúmina, seroalbúmina de ratón o seroalbúmina de conejo. Se conocen bien en la técnica medios para conjugar un polipéptido a una proteína portadora e incluyen glutaraldehído, éster de mmaleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, carbodiimida y bencidina bis-biazotizada. Como también se conoce bien en la técnica, puede potenciarse la inmunogenicidad de una composición inmunógena particular mediante el uso de estimuladores no específicos de la respuesta inmunitaria, conocidos como adyuvantes. Los adyuvantes ilustrativos y preferidos en animales incluyen el adyuvante completo de Freund (un estimulador no específico de la respuesta inmunitaria que contieneMycobacterium tuberculosismuerta), adyuvantes incompletos de Freund y adyuvante de hidróxido de aluminio y en seres humanos incluyen alumbre, CpG, MFP59 y combinaciones de moléculas inmunoestimulantes ("Sistemas adyuvantes", tales como AS01 o AS03). Son posibles formas experimentales adicionales de inoculación para inducir linfocitos B específicos para el SARS-CoV-2, que incluyen vacunas de nanopartículas o antígenos codificados genéticamente administrados como genes de ADN o ARN en un sistema de suministro físico (tal como nanopartículas lipídicas o sobre perlas de oro biolísitcas) y se administran con una aguja, cañón de genes, o un dispositivo de electroporación transcutáneo. El gen del antígeno también puede estar portado como se codifica por un vector vírico competente o defectuoso para la replicación, tal como adenovirus, virus adenoasociado, poxvirus, herpesvirus o replicón de alfavirus o como alternativa, una partícula similar a un virus.
En el caso de anticuerpos humanos contra patógenos naturales, una estrategia adecuada es identificar sujetos que han estado expuestos a los patógenos, tales como aquellos a los que se ha diagnosticado que han contraído la enfermedad o aquellos que han sido vacunados para generar inmunidad protectora contra el patógeno o para evaluar la seguridad o eficacia de una vacuna experimental. Pueden detectarse anticuerpos circulantes contra el patógeno y posteriormente pueden obtenerse linfocitos B que codifican o producen el anticuerpo del sujeto positivo al anticuerpo.
La cantidad de composición de inmunógeno usada en la producción de anticuerpos policlonales varía según la naturaleza del inmunógeno, así como el animal usado para la inmunización. Pueden usarse diversas rutas para administrar el inmunógeno (subcutánea, intramuscular, intradérmica, intravenosa e intraperitoneal). La producción de anticuerpos policlonales puede controlarse tomando muestras de sangre del animal inmunizado en diversos puntos después de la inmunización. También puede administrarse una segunda inyección de refuerzo. El proceso de refuerzo y valoración se repite hasta que se logra un título adecuado. Cuando se obtiene un nivel deseado de inmunogenicidad, puede extraerse sangre del animal inmunizado y se aísla y conserva el suero y/o puede usarse el animal para generar mAb.
Después de la inmunización, se seleccionan células somáticas con el potencial de producir anticuerpos, específicamente linfocitos B, para su uso en el protocolo de generación del mAb. Estas células pueden obtenerse de biopsias de bazo, ganglios linfáticos, amígdalas o adenoides, aspirados o biopsias de médula ósea, biopsias de tejido de órganos mucosos, tales como pulmón o el tracto GI o de la sangre circulante. Los linfocitos B productores de anticuerpos del animal inmunizado o del ser humano inmune se fusionan posteriormente con células de una célula de mieloma inmortal, generalmente una de la misma especie que el animal que se inmunizó o de ser humano o células quiméricas de humano/ratón. Las líneas celulares de mieloma adecuadas para su uso en procedimientos de fusión productores de hibridomas son preferentemente no productoras de anticuerpos, tienen una elevada eficacia de fusión y deficiencias enzimáticas que hacen que sean incapaces de crecer en ciertos medios selectivos, que soportan el crecimiento únicamente de las células fusionadas deseadas (hibridomas). Puede usarse una cualquiera de una serie de células de mieloma, como es sabido por los expertos en la materia (Goding, pp. 65-66, 1986; Campbell, págs. 75-83, 1984). Las células HMMA2.5 o las células MFP-2 son ejemplos particularmente útiles de dichas células.
Los métodos para generar híbridos de células de bazo o ganglio linfático productoras de anticuerpos y células de mieloma normalmente comprenden mezclar células somáticas con células de mieloma a una proporción 2:1, aunque la proporción puede variar de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 1:1, respectivamente, en presencia de uno o más agentes (químicos o eléctricos) que promueven la fusión de las membranas celulares. En algunos casos, la transformación de los linfocitos B humanos con el virus de Epstein Barr (EBV) como etapa inicial aumenta el tamaño de los linfocitos B, lo que potencia la fusión con las células de mieloma de tamaño relativamente grande. La eficiencia de transformación mediante el EBV se potencia usando CpG y un fármaco inhibidor de Chk2 en el medio de transformación. Como alternativa, pueden activarse linfocitos B humanos mediante cocultivo con líneas celulares transfectadas que expresan ligando de CD40 (CD154) en medio que contiene factores solubles adicionales, tales como IL-21 y factor activante de linfocitos B humanos (BAFF), un miembro de tipo II de la superfamilia de TNF. Se han descrito métodos de fusión que emplean virus de Sendai por Kohler y Milstein (1975; 1976), y aquellos que usan polietilenglicol (PEG), tal como PEG al 37 % (v/v), por Gefteret al.(1977). También es adecuado el uso de métodos de fusión inducida eléctricamente (Goding, págs. 71-74, 1986) y existen procesos para obtener una mayor eficiencia (Yuet al.,2008). Los procedimientos de fusión normalmente producen híbridos viables a bajas frecuencias, de aproximadamente 1 x 10-6 a 1 x 10-8, pero con procedimientos optimizados, pueden obtenerse eficiencias de fusión próximas a 1 de cada 200 (Yuet al.,2008). Sin embargo, una relativamente baja eficiencia de fusión no representa un problema, ya que los híbridos viables fusionados se diferencian de las células precursoras infundidas (en particular, las células de mieloma infundidas que normalmente continuarían dividiéndose indefinidamente) mediante cultivo en un medio selectivo. El medio selectivo es generalmente uno que contiene un agente que bloquea la síntesisde novode nucleótidos en el medio de cultivo tisular. Los agentes ilustrativos y preferidos son aminopterina, metotrexato y azaserina. La aminopterina y el metotrexato bloquean la síntesisde novotanto de purinas como de pirimidinas, mientras que la azaserina bloquea únicamente la síntesis de purinas. Cuando se usa aminopterina o metotrexato, el medio se suplementa con hipoxantina y timidina como fuente de nucleótidos (medio HAT). Cuando se usa azaserina, el medio se suplementa con hipoxantina. Se añade ouabaína si la fuente de linfocitos B es una línea de linfocitos B humana transformada con EBV, a fin de eliminar líneas transformadas con EBV que no se han fusionado al mieloma.
El medio de selección preferido es HAT o HAT sin ouabaína. Solo las células de emplear vías de ahorro de nucleótidos tienen la capacidad de sobrevivir en medio HAT. Las células de mieloma son defectuosa para enzimas clave de la vía de ahorro, por ejemplo, hipoxantina fosforibosil transferasa (HPRT) y no pueden sobrevivir. Los linfocitos B pueden emplear esta vía, pero tienen un tiempo de vida limitado en cultivo y en general, mueren en aproximadamente dos semanas. Por tanto, las únicas células que pueden sobrevivir en el medio selectivo son aquellos híbridos formados a partir de mieloma y linfocitos B. Cuando la fuente de linfocitos B usados para la infusión es una línea de linfocitos B transformados con EBV, como en este caso, también puede usarse ouabaína para la selección farmacológica de híbridos, ya que los linfocitos B transformados con EBV son susceptibles a la eliminación con fármacos, mientras que el compañero de mieloma usado se selecciona para que sea resistente a la ouabaína.
El cultivo proporciona una población de hibridomas a partir de los que se seleccionan hibridomas específicos. Normalmente, la selección de hibridomas se efectúa cultivando las células mediante dilución de clones individuales en placas de microtitulación, seguido del análisis de los sobrenadantes de clones individuales (después de aproximadamente dos a tres semanas) para detectar la reactividad deseada. El ensayo debe ser sensible, sencillo y rápido, tales como radioinmunoensayos, inmunoensayos enzimáticos, ensayos de citotoxicidad, ensayos en placas, ensayos de unión inmunológica puntual y similares. Los hibridomas seleccionados se diluyen en serie posteriormente o se clasifican en células individuales mediante clasificación por citometría de flujo y se clonan en líneas celulares productoras de anticuerpos individuales, cuyos clones pueden propagarse después indefinidamente para obtener mAb. Las líneas celulares pueden aprovecharse para la producción de mAb de dos maneras básicas. Puede inyectarse una muestra del hibridoma (normalmente en la cavidad peritoneal) en un animal (por ejemplo, un ratón). Opcionalmente, se ceba a los animales con un carbohidrato, especialmente aceites, tales como pristano (tetrametilpentadecano) antes de la inyección. Cuando se usan hibridomas humanos de este modo, resulta óptimo inyectar a ratones inmunodeprimidos, tales como ratones SCID, para impedir el rechazo de tumores. El animal inyectado desarrolla tumores que secretan el anticuerpo monoclonal específico producido por el híbrido celular fusionado. Posteriormente pueden canalizarse los fluidos corporales del animal, tales como suero o fluido de ascitis, para obtener mAb con una alta concentración. También pueden cultivarse las líneas celulares individualesin vitro,donde os mAb se secretan de manera natural al medio de cultivo, del que pueden obtenerse fácilmente a altas concentraciones. Como alternativa, pueden usarse líneas celulares de hibridoma humanasin vitropara producir inmunoglobulinas en el sobrenadante celular. Las líneas celulares pueden adaptarse para el crecimiento en medio asérico para optimizar la capacidad de recuperar inmunoglobulinas monoclonales humanas de alta pureza.
Los mAb producidos por cualquiera de los medios pueden purificarse adicionalmente, si se desea, usando filtración, centrifugación y diversos métodos cromatográficos, tales como FPLC o cromatografía de afinidad. Pueden obtenerse fragmentos de los anticuerpos monoclonales de la divulgación a partir de los anticuerpos monoclonales purificados mediante métodos que incluyen digestión con enzimas, tales como pepsina o papaína y/o mediante escisión de los enlaces disulfuro mediante reducción química. Como alternativa, pueden sintetizarse fragmentos de anticuerpos monoclonales abarcados por la presente divulgación usando un sintetizador de péptidos automatizado.
También se contempla que pueda usarse una estrategia de clonación molecular para generar anticuerpos monoclonales. Los linfocitos B individuales identificados como sensibles a la infección o vacunación debido a plasmablastos o marcadores de linfocitos B activados, o los linfocitos B de memoria marcados con el antígeno de interés, pueden clasificarse físicamente usando selección con perlas paramagnéticas o clasificación por citometría de flujo y después puede aislarse el ARN de las células individuales y los genes de anticuerpo se amplifican mediante la RT-PCR. Se dispone de diversos métodos de ARN-sec de células individuales para obtener genes variables de anticuerpos a partir de células individuales. Como alternativa, pueden segregarse poblaciones de células clasificadas en bruto específicas para el antígeno en microvesículas y los genes variables de cadena pesada y ligera emparejados se recuperan de las células individuales usando enlace físico de amplicones de cadena pesada y ligera o marcaje con código de barras convencional de los genes de cadena pesada y ligera de una vesícula. Los genes de cadena pesada y ligera emparejados procedentes de células individuales también pueden obtenerse a partir de poblaciones de linfocitos B específicos para un antígeno, mediante el tratamiento de células con nanopartículas penetrantes en células que portan cebadores de RT-PCR y códigos de barras para marcar transcritos con un código de barras por célula. Los genes variables de anticuerpos también pueden aislarse mediante extracción de ARN de una línea de hibridoma y los genes de anticuerpo se obtienen mediante RT-PCR y se clonan en un vector de expresión de inmunoglobulina. Como alternativa, se preparan bibliotecas de fagémido de inmunoglobulina combinatorias a partir de ARN aislado de las líneas celulares y los fagémidos que expresan anticuerpos adecuados se seleccionan mediante paneo usando antígenos víricos. Las ventajas de esta estrategia frente a las técnicas de hibridoma convencionales son que pueden producirse y secretarse aproximadamente 104 veces más anticuerpos en una sola ronda y que se generan nuevas especificidades mediante la combinación de cadenas H y L, con aumentos adicionales en las probabilidades de hallar anticuerpos adecuados.
Otras patentes de los Estados Unidos, incorporadas al presente documento por referencia, que enseñan la producción de anticuerpos usados en la presente divulgación incluyen la Patente de los Estados Unidos 5,565,332, que describe la producción de anticuerpos quiméricos usando una estrategia combinatoria; la Patente de los Estados Unidos 4,816,567, que describe preparaciones de inmunoglobulina recombinantes; y la Patente de los Estados Unidos 4,867,973, que describe conjugados de anticuerpo-agente terapéutico.
B. Anticuerpos de la presente divulgación
Los anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación pueden definirse, en primera instancia, por su especificidad de unión. Los expertos en la materia, al evaluar la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo dado usando técnicas de sobra conocidas por los expertos en la materia, pueden determinar si dichos anticuerpos se encuentran dentro del alcance de las presentes reivindicaciones. Por ejemplo, el epítopo al que se une un anticuerpo dado puede constar de una única secuencia de contigua de 3 o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20) aminoácidos ubicados dentro de la molécula de antígeno (por ejemplo, un epítopo lineal en un dominio). Como alternativa, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos no contiguos (o secuencias de aminoácido) ubicados dentro de la molécula del antígeno (por ejemplo, un epítopo conformacional).
Dos categorías principales de antígenos del SARS-CoV-2 son la proteína espícula (S) de la superficie y las proteínas internas, especialmente la proteína nucleocápside (N). Los anticuerpos dirigidos a la proteína S serán útiles para la profilaxis o el tratamiento o el diagnóstico o para caracterizar vacunas. Los anticuerpos para la proteína S tendrán una especificidad de unión adicional con dicha proteína, con anticuerpos particulares que se unen al ectodominio de longitud completa de la proteína S del SARS-CoV-2 (presentado como un monómero u oligómero, tal como un trímero, con o sin mutaciones estabilizantes de la conformación, tal como la introducción de prolinas en sitios críticos ("mutación 2P")) y (a) anticuerpos contra la proteína S que se unen al dominio de unión a receptor (RBD), (b) anticuerpos contra la proteína S que se unen a dominios distintos del RBD. Algunos de los subconjuntos que se unen a dominios distintos del RBD se unen al dominio N-terminal (NTD), mientras que otros se unen a un epítopo distinto del NTD o RBD) y (c) puede observarse además que los anticuerpos contra la proteína S neutralizan al SARS-CoV-2 bloqueando la unión de la proteína S del SARS-CoV-2 a su receptor, la enzima convertidora de angiotensina 2 humana (hACE2), con otros que neutralizan pero no bloquean la unión al receptor. Finalmente, los anticuerpos pueden reaccionar de manera cruzada tanto con la proteína S del SARS-CoV-2 como con la proteína S de otros coronavirus, tales como el SARS-CoV, el MERS-CoV, el HCoV-229E, el HCoV-OC43, el HCoV-NL63 y/o el HCoV-HKU1, así como neutralizar de manera cruzada tanto el SARS-CoV-2 como estos otros coronavirus.
Otra especificidad será anticuerpos que se unen a N anticuerpos (u otras dianas internas) que tendrán principalmente usos diagnósticos. Por ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra N u otras proteínas internas del SARS-CoV-2 que reconocen específicamente al SARS-CoV-2 o que reconocen mediante reactividad cruzada al SARS-CoV-2 y a otros coronavirus, tales como el SARS-CoV, el MERS-CoV, el HCoV-229E, el HCoV-OC43, el HCoV-NL63 y/o el HCoV-HKU1.
Pueden usarse diversas técnicas conocidas por expertos habituales en la materia para determinar si un anticuerpo "interacciona con uno o más aminoácidos" en un polipéptido o proteína. Las técnicas ilustrativas incluyen, por ejemplo, ensayos de bloqueo cruzado rutinarios, tales como los descritos en Antibodies, Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Puede medirse el bloqueo cruzado en diversos ensayos de unión, tales como ELISA, interferometría de biocapas o resonancia de plasmones superficiales. Otros métodos incluyen análisis mutacional mediante barrido de alanina, análisis de transferencia de péptidos (Reineke, Methods Mol. Biol. 248: 443-63, 2004), análisis de escisión peptídica, técnicas de microscopía electrónica de alta resolución usando reconstrucción de partículas individuales, crioEM o tomografía, estudios cristalográficos y análisis por RMN. Además, pueden emplearse métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer Prot. Sci. 9: 487-496, 2000). Otro método que puede usarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interacciona un anticuerpo es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio de hidrógeno/deuterio implica el marcaje con deuterio de la proteína de interés, seguido de la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. A continuación, se transfiere el complejo de proteína/anticuerpo a agua y los protones intercambiables en los aminoácidos que están protegidos por el complejo de anticuerpo sufren intercambio de deuterio a hidrógeno a una menor velocidad que los protones intercambiables dentro de los aminoácidos que no forman parte de la interfaz. Como resultado, los aminoácidos que forman parte de la interfaz de proteína/anticuerpo pueden conservar el deuterio y de este modo, mostrar una masa relativamente mayor en comparación con aminoácidos no incluidos en la interfaz. Tras la disociación del anticuerpo, la proteína diana se somete a escisión con proteasas y análisis de espectrometría de masas, revelando de ese modo los restos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interacciona el anticuerpo. Véase, por ejemplo, Ehring, Analytical Biochemistry 267: 252-259 (1999); Engen Y Smith, Anal. Chem. 73: 256A-265A (2001). Cuando el anticuerpo neutraliza al SARS-CoV-2, pueden aislarse organismos variantes mutantes de escape para el anticuerpo propagando el SARS-CoV-2in vitroo en modelos animales en presencia de altas concentraciones del anticuerpo. El análisis de secuencia del gen del SARS-CoV-2 que codifica el antígeno diana del anticuerpo revela las una o más mutaciones que confieren escape del anticuerpo, lo que indica los restos en el epítopo o que afectan alostéricamente a la estructura del epítopo.
El término "epítopo" se refiere a un sitio en un antígeno frente al que responden los linfocitos B y/o T. Pueden formarse epítopos para linfocitos B tanto a partir de aminoácidos contiguos como a partir de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos son retenidos normalmente en la exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario se pierden normalmente en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo normalmente incluye al menos 3 y más frecuentemente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.
La elaboración de perfiles asistida por modificación (MAP, por sus siglas en inglés), también conocida como elaboración de perfiles de anticuerpos basada en la estructura del antígeno (ASAP, por sus siglas en inglés), es un método que clasifica grandes cantidades de anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos contra el mismo antígeno de acuerdo con las similitudes del perfil de unión de cada anticuerpo a superficies antigénicas modificadas química o enzimáticamente (véase la Publicación de Patente de los Estados Unidos 2004/0101920). Cada categoría puede reflejar un epítopo único o bien distintivamente diferente o parcialmente solapante con un epítopo representado por otra categoría. Esta tecnología permite el rápido filtrado de anticuerpos genéticamente idénticos, de tal forma que la caracterización puede enfocarse en anticuerpos genéticamente distintos. Cuando se aplica a la exploración de hibridomas, MAP puede facilitar la identificación de clones de hibridoma escasos que producen mAb que tienen las características deseadas. Puede usarse MAP para clasificar los anticuerpos de la divulgación en grupos de anticuerpos que se unen a diferentes epítopos.
La presente divulgación incluye anticuerpos que pueden unirse al mismo epítopo o a una porción del epítopo. Igualmente, la presente divulgación también incluye anticuerpos que compiten por la unión a una diana o un fragmento de la misma con cualquiera de los anticuerpos ilustrativos descritos en el presente documento. Se puede determinar fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo o compite por la unión con un anticuerpo de referencia usando métodos rutinarios conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo que uno de referencia, se deja que el anticuerpo de referencia se una a una diana en condiciones de saturación. A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo para unirse a la molécula diana. En caso de que el anticuerpo de ensayo sea capaz de unirse a la molécula diana después de la unión por saturación con el anticuerpo de referencia, puede deducirse que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente al del anticuerpo de referencia. Por otra parte, en caso de que el anticuerpo de ensayo no sea capaz de unirse a la molécula diana después de la unión de saturación con el anticuerpo de referencia, el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo que el epítopo al que se une el anticuerpo de referencia.
Para determinar si un anticuerpo compite por la unión con un anticuerpo anti-SARS-CoV-2 de referencia, se lleva a cabo la metodología anteriormente descrita en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una al antígeno del SARS-CoV-2 en condiciones de saturación, seguido de la evaluación de la unión del anticuerpo de ensayo a la molécula del SARS-CoV-2. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se une a la molécula del antígeno del SARS-CoV-2 en condiciones de saturación, seguido de la evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la molécula del SARS-CoV-2. Si, en ambas orientaciones, solo el primer anticuerpo (saturación) es capaz de unirse al SARS-CoV-2, se deduce que el anticuerpo de ensayo y el anticuerpo de referencia compiten por la unión al SARS-CoV-2. Como apreciará un experto habitual en la materia, un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia puede no unirse necesariamente al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, pero puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante unión a un epítopo solapante o adyacente.
Dos anticuerpos se unen al mismo epítopo o a uno solapante si cada uno inhibe de manera competitiva (bloquea) la unión del otro al antígeno. Es decir, un exceso de 1, 5, 10, 20 o 100 veces de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos un 50 %, pero preferentemente un 75 %, un 90 % o incluso un 99 %, medida en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghansetal.,Cancer Res. 199050:1495-1502). Como alternativa, dos anticuerpos tienen el mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo, reducen o eliminan la unión del otro. Dos anticuerpos tienen epítopos solapantes en caso de que algunas mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reduzcan o eliminen la unión del otro. En algunos aspectos, se usa un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo o uno solapante, como COV2-2196, en combinación con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo o uno solapante, como COV2-2130.
Posteriormente puede llevarse a cabo experimentación rutinaria adicional (por ejemplo, análisis de mutación peptídica y de unión) para confirmar si la ausencia de unión observada del anticuerpo de ensayo se debe de hecho a la unión del mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la ausencia de unión observada. Pueden llevarse a cabo experimentos de este tipo usando ELISA, RIA, resonancia de plasmones superficiales, citometría de flujo o cualquier otro ensayo de unión a anticuerpos cuantitativa o cualitativa disponible en la técnica. Los estudios estructurales con EM o cristalografía también pueden demostrar si dos anticuerpos que compiten por la unión reconocen o no al mismo epítopo.
En otro aspecto, se proporcionan anticuerpos monoclonales que tienen CDR emparejadas por clones de las cadenas pesadas y ligeras, como se ilustran en las tablas 3 y 4, respectivamente. Dichos anticuerpos pueden producirse mediante los clones analizados más adelante en la sección de ejemplos usando métodos descritos en el presente documento.
En otro aspecto, los anticuerpos pueden definirse por su secuencia variable, que incluye regiones "marco" adicionales. Además, las secuencias de anticuerpo pueden variar con respecto a estas secuencias, opcionalmente usando métodos analizados con más detalle más adelante. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico pueden variar con respecto a las expuestas anteriormente en que (a) las regiones variables pueden segregarse de los dominios constantes de las cadenas ligeras y pesadas, (b) los ácidos nucleicos pueden variar respecto de los expuestos anteriormente, mientras que no afectan a los restos codificados por los mismos, (c) los ácidos nucleicos pueden variar con respecto a los expuestos anteriormente en un porcentaje determinado, por ejemplo, una homología del 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, (d) los ácidos nucleicos pueden variar con respecto a los expuestos anteriormente debido a su capacidad para hibridar en condiciones de alta rigurosidad, ilustradas por condiciones de baja salinidad y/o alta temperatura, tales como las proporcionadas por NaCl de aproximadamente 0.02 M a aproximadamente 0.15 M a temperaturas de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C, (e) los aminoácidos pueden variar con respecto a los expuestos anteriormente en un porcentaje determinado, por ejemplo, un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología o (f) los aminoácidos pueden variar respecto de los expuestos anteriormente al permitir sustituciones conservativas (analizadas anteriormente). Todo lo anterior se aplica a secuencias de ácido nucleico y a las secuencias de aminoácidos.
Cuando se comparan secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas, se dice que dos secuencias son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinea para máxima correspondencia, como se ha descrito anteriormente. Normalmente se efectúan comparaciones entre dos secuencias comparando las secuencias a lo largo de una ventana de comparación para identificar y comparar las regiones locales de similitud de secuencia. Como se usa en el presente documento, una "ventana de comparación" se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, normalmente de 30 a aproximadamente 75, de 40 a aproximadamente 50, en la que puede compararse una secuencia con una secuencia de referencia con el mismo número de posiciones contiguas después de que se alineen de manera óptima las dos secuencias.
El alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede efectuarse usando el programa Megalign en la suite de programas de bioinformática Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, Wis.) usando parámetros por defecto. Este programa incorpora varios esquemas de alineamiento descritos en las siguientes referencias: Dayhoff, M. O. (1978) A model of evolutionary change in proteins--Matrices for detecting distant relationships. En Dayhoff, M. O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington D.C. Vol. 5, Supl. 3, págs. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogeny págs. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Higgins, D. G. y Sharp, P. M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E. W. y Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E. D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P. H. A. y Sokal, R. R. (1973) Numerical Taxonomy--the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, Calif.; Wilbur, W. J. y Lipman, D. J. (1983) Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726-730.
Como alternativa, puede llevarse a cabo un alineamiento óptimo de secuencias para comparación mediante el algoritmo de identidad local de Smith y Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482, mediante el algoritmo de alineamiento de identidad de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol.48:443, mediante los métodos de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el paquete informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.) o mediante inspección.
Un ejemplo particular de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschulet al.(1977) Nucl. Acids Res.
25:3389-3402 y Altschulet al.(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. BLAST y BLAST 2.0 pueden usarse, por ejemplo, con los parámetros descritos en el presente documento, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia para los polinucleótidos y polipéptidos de la divulgación. El programa informático para llevar a cabo los análisis BLAST se encuentra disponible de manera pública a través del National Center for Biotechnology Information. La naturaleza reorganizada de una secuencia de anticuerpo y la longitud variable de cada gen requiere múltiples tandas de búsquedas BLAST para una sola secuencia de anticuerpo. Asimismo, el ensamblaje manual de diferentes genes es difícil y propenso a errores. La herramienta de análisis de secuencias IgBLAST (en Internet en ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) identifica coincidencias con los genes V, D y J de línea germinal, detalles en uniones de reordenamiento, la delineación de las regiones marco del dominio V de las Ig y las regiones determinantes de la complementariedad. IgBLAST puede analizar secuencias de nucleótidos o proteínas y puede procesar secuencias en lotes y permite búsquedas frente a las bases de datos de genes de línea germinal y otras bases de datos de secuencias simultáneamente para minimizar la probabilidad de posiblemente no encontrar el gen V de línea germinal con mejor coincidencia.
En un ejemplo ilustrativo, pueden calcularse las puntuaciones acumulativas usando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos emparejados; siempre >0) y N (puntuación de penalización para restos no emparejados; siempre <0). La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulativa recae por debajo de la cantidad X con respecto a su valor máximo logrado; la puntuación acumulativa alcanza un valor de cero o inferior debido a la acumulación de uno o más alineamientos de secuencia con puntuación negativa; o se alcanza el fin de cualquiera de las dos secuencias. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa valores por defecto de longitud de palabra (W) de 11 y una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915), alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras.
Para secuencias de aminoácidos, puede usarse una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulativa recae por debajo de la cantidad X con respecto a su valor máximo logrado; la puntuación acumulativa alcanza un valor de cero o inferior debido a la acumulación de uno o más alineamientos de secuencia con puntuación negativa; o se alcanza el fin de cualquiera de las dos secuencias. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento.
En una estrategia, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos o polipéptido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) de un 20 por ciento o menos, normalmente de un 5 a un 15 por ciento o de un 10 a un 12 por ciento, en comparación con las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones o eliminaciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparecen las bases de ácidos nucleicos o los restos de aminoácidos idénticos en ambas secuencias, a fin de obtener el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas entre el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando los resultados por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.
Otra manera más de definir un anticuerpo es como un "derivado" de cualquiera de los anticuerpos descritos más adelante y sus fragmentos de unión a antígeno. El término "derivado" se refiere a un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une de manera inmunoespecífica a un antígeno, pero que comprende una, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones, adiciones, eliminaciones o modificaciones de aminoácidos en relación con una molécula "precursora" (o de tipo silvestre). Este tipo de sustituciones o adiciones de aminoácidos podrán introducir restos de aminoácidos de origen natural (es decir, codificados por el ADN) o de origen no natural. El término "derivado" abarca, por ejemplo, variantes que tienen regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 o CH4 alteradas, a fin de formar, por ejemplo, anticuerpos, etc., que tienen regiones Fc variantes que muestran características efectoras o de unión mejoradas o deterioradas. El término "derivado" abarca además modificaciones con no aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos que pueden estar glucosilados (por ejemplo, tienen un contenido alterado de manosa, 2-N-acetilglucosamina, galactosa, fucosa, glucosa, ácido siálico, ácido 5-N-acetilneuramínico, ácido 5-glicolilneuramínico, etc.), acetilados, pegilados, fosforilados, amidados, derivatizados mediante grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica, unidos a un ligando celular u otra proteína, etc. En algunas realizaciones, las modificaciones con carbohidratos alterados modulan uno o más de los siguientes: la solubilización del anticuerpo, el facilitamiento del transporte subcelular y la secreción del anticuerpo, la promoción del ensamblaje del anticuerpo, la integridad conformacional y la función efectora mediada por anticuerpos. En una realización específica, las modificaciones con carbohidratos alterados potencian la función efectora mediada por anticuerpos en relación con el anticuerpo que carece de la modificación de carbohidratos. Se conocen bien en la técnica modificaciones de carbohidratos que dan lugar a una función efectora mediada por anticuerpos alterada (véase, por ejemplo, Shields, R. L.et al.(2002)"Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity,"J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740; Davies J.et al.(2001)"Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 c Ho Production Cell Line: Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In ADCC Through Higher Affinity For FC Gamma RIII," Biotechnology & Bioengineering 74(4): 288-294). Los expertos en la materia conocen métodos para alterar el contenido de carbohidratos, véase, por ejemplo, Wallick, S. C.et al.(1988)"Glycosylation Of A VH Residue Of A Monoclonal Antibody Against Alpha(1-—6)Dextran Increases Its Affinity For Antigen,"J. Exp. Med. 168(3): 1099-1109; Tao, M. H.et al.(1989)"Studies Of Aglycosylated Chimeric Mouse-Human IgG. Role of Carbohydrate in The Structure And Effector Functions Mediated By The Human IgG Constant Region"J. Immunol. 143(8): 2595-2601; Routledge, E. G.et al.(1995)"The Effect of Aglycosylation on The Immunogenicity of A Humanized Therapeutic CD3 Monoclonal Antibody,"Transplantation 60(8):847-53; Elliott, S.et al.(2003)"Enhancement Of Therapeutic Protein In Vivo Activities Through Glycoengineering"Nature Biotechnol. 21:414-21; Shields, R. L.et al.(2002)"Lack of Fucose on Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding to Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity"J. Biol. Chem. 277(30): 26733 26740).
Puede generarse un anticuerpo derivado o un fragmento de anticuerpo con una secuencia o estado de glucosilación modificado para conferir niveles de actividad preferidos en las funciones de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP), fagocitosis de neutrófilos dependiente de anticuerpo (ADNP) o deposición de complemento dependiente de anticuerpo (ADCD), medidas mediante ensayos basados en perlas o basados en células o estudiosin vivoen modelos animales.
Puede modificarse un derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo mediante modificaciones químicas conocidas por los expertos en la materia que incluyen, pero sin limitación, escisión química específica, acetilación, formulación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. En una realización, un derivado de anticuerpo poseerá una función similar o idéntica a la del anticuerpo precursor. En otra realización, un derivado de un anticuerpo mostrará una actividad alterada respecto al anticuerpo precursor. Por ejemplo, un derivado de un anticuerpo (o un fragmento de este) se puede unir a su epítopo más fuertemente o ser más resistente a la proteolisis que el anticuerpo precursor.
C. Modificación por ingeniería genética de secuencias de anticuerpo
En diversas realizaciones, se puede optar por modificar por ingeniería genética secuencias de los anticuerpos identificados por diversos motivos, tales como la expresión mejorada, la reactividad cruzada mejorada o la unión fuera de la diana reducida. Pueden producirse anticuerpos modificados mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la materia, incluida la expresión mediante técnicas de biología molecular convencionales o la síntesis química de los polipéptidos. Se abordan métodos para la expresión recombinante en otras partes del presente documento. A continuación se analiza de manera general los objetivos relevantes para la modificación por ingeniería genética del anticuerpo.
Los hibridomas pueden cultivarse, después se lisan las células y se extrae el ARN total. Pueden usarse hexámeros aleatorios con RT para generar copias en ADNc del ARN y después, la PCR se lleva a cabo usando una mezcla multiplexada de cebadores para la PCR que se espera que amplifiquen todas las secuencias génicas variables humanas. El producto de la PCR puede clonarse en el vector pGEM-T Easy y posteriormente secuenciarse mediante secuenciación de ADN automatizada usando cebadores para el vector convencionales. El ensayo de unión y neutralización puede llevarse a cabo usando anticuerpos recogidos de sobrenadantes de hibridoma y purificarse mediante FPLC, usando columnas de proteína G.
Pueden generarse anticuerpos IgG de longitud completa recombinantes mediante subclonación de los ADN de Fc de cadena pesada y ligera a partir del vector de clonación en un vector plasmídico de IgG, transfectarse en células 293 (por ejemplo, Freestyle) o células CHO y los anticuerpos pueden recogerse y purificarse del sobrenadante de las células 293 o CHO. Otros sistemas de células hospedadoras adecuadas incluyen bacterias, tales comoE. coli,células de insecto (S2, Sf9, Sf29, High Five), células vegetales (por ejemplo, de tabaco, con o sin modificación para producir glicanos similares a los humanos), algas o en diversos contextos transgénicos no humanos, tales como ratones, ratas, cabras o vacas.
También se contempla la expresión de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos, tanto con el objetivo de purificar el anticuerpo posteriormente como para la inmunización de un hospedador. Las secuencias codificantes del anticuerpo pueden ser de ARN, tal como de ARN nativo o de ARN modificado. El ARN modificado contempla ciertas modificaciones químicas que confieren estabilidad aumentada y baja inmunogenicidad a los ARNm, facilitando de este modo la expresión de proteínas terapéuticamente importantes. Por ejemplo, la Nl-metil-pseudouridina (N1m^) supera a varias modificaciones de nucleósidos diferentes y a sus combinaciones en cuanto a su capacidad de traducción. Además de inactivar la inhibición de la traducción inmunitaria/de eIF2a dependiente de fosforilación, los nucleótidos de N1m^ incorporados alteran drásticamente la dinámica del proceso de traducción al aumentar la pausa ribosómica y la densidad del ARNm. Una mayor carga ribosómica de ARNm modificados hace que sean más permisivos para el inicio al favorecer el reciclado ribosómica en el mismo ARNm o al reclutamiento de un nuevo ribosoma. Dichas modificaciones pueden usarse para potenciar la expresión de anticuerposin vivodespués de la inoculación con el ARN. El ARN, ya sea nativo o modificado, puede administrarse como un ARN desnudo o en un vehículo de administración, tal como una nanopartícula lipídica.
Como alternativa, el ADN que codifica el anticuerpo puede emplearse con el mismo fin. El ADN se incluye en un casete de expresión que comprende un promotor activo en la célula hospedadora para la que se diseña. El casete de expresión se incluye ventajosamente en un vector replicable, tal como un plásmido o minivector convencional. Se contemplan vectores que incluyen vectores víricos, tales como poxvirus, adenovirus, herpesvirus, virus adenoasociados y lentivirus. También se contemplan replicones que codifican genes de anticuerpos, tales como replicones de alfavirus o virus VEE o virus Sindbis. La administración de dichos vectores puede efectuarse mediante una aguja por vía intramuscular, subcutánea o intradérmica o mediante electroporación transcutánea cuando se desea la expresiónin vivo.
La rápida disponibilidad del anticuerpo producido en la misma célula hospedadora y el mismo proceso de cultivo celular que el proceso de fabricación conforme a las BPF actuales tiene el potencial de reducir la duración de los programas de desarrollo de procesos. Lonza ha desarrollado un método genérico que emplea transfectantes agrupados cultivados en medio CDACF para la rápida producción de pequeñas cantidades (hasta 50 g) de anticuerpos en células CHO. Aunque es ligeramente más lento que un sistema transitorio auténtico, las ventajas incluyen una mayor concentración de producto y el uso del mismo hospedador y proceso al de la línea celular de producción. Ejemplo de cultivo y productividad de mezclas de GS-CHO, que expresan un anticuerpo modelo, en un biorreactor de un solo uso: en un biorreactor de cultivo de bolsa desechable (volumen de trabajo de 5 l) utilizado en modo discontinuo con alimentación, se logró una concentración de anticuerpo recolectado de 2 g/l a las 9 semanas de la transfección.
Las moléculas de anticuerpo comprenderán fragmentos (tales como F(ab'), F(ab')2) que se producen, por ejemplo, mediante la escisión proteolítica de los mAb o las inmunoglobulinas producibles, por ejemplo, por medios recombinantes. Los derivados de anticuerpo F(ab') son monovalentes, mientras que los derivados de anticuerpo F(ab')2 son bivalentes. En una realización, dichos fragmentos puede combinarse entre sí o con otros fragmentos de anticuerpo o ligandos de receptor para formar moléculas de unión "quiméricas". De manera significativa, dichas moléculas quiméricas pueden contener sustituyentes capaces de unirse a diferentes epítopos de la misma molécula.
En realizaciones relacionadas, el anticuerpo es un derivado de los anticuerpos divulgados, por ejemplo, un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR idénticas a aquellas en los anticuerpos divulgados (por ejemplo, un anticuerpo quimérico o con injerto de CDR). Como alternativa, puede ser deseable efectuar modificaciones, tales como la introducción de cambios conservativos en una molécula de anticuerpo. Al efectuar dichos cambios, puede valorarse el índice hidropático de los aminoácidos. Se entiende de manera general en la técnica la importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir una función biológica interactiva (Kyte y Doolittle, 1982). Se acepta que el carácter hidropático de los aminoácidos contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, lo que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares.
También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede efectuarse de manera eficaz basándose en la hidrofilia. La Patente de los Estados Unidos 4,554,101, incorporada al presente documento por referencia, expone que la mayor hidrofilia media local de una proteína, regida por la hidrofilia de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con las propiedades biológicas de la proteína. Como se detalla en la Patente de los Estados Unidos 4,554,101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilia a los restos de aminoácidos: aminoácidos básicos: arginina (+3.0), lisina (+3.0) e histidina (-0.5); aminoácidos ácidos: aspartato (+3.0 ± 1), glutamato (+3.0 ± 1), asparagina (+0.2) y glutamina (+0.2); aminoácidos hidrófilos no iónicos: serina (+0.3), asparagina (+0.2), glutamina (+0.2) y treonina (-0.4), aminoácidos que contienen azufre: cisteína (-1.0) y metionina (-1.3); aminoácidos hidrófobos no aromáticos: valina (-1.5), leucina (-1.8), isoleucina (-1.8), prolina (-0.5 ± 1), alanina (-0.5) y glicina (0); aminoácidos hidrófobos aromáticos: triptófano (-3.4), fenilalanina (-2.5) y tirosina (-2.3).
Se entiende que puede sustituirse un aminoácido por otro que tenga una hidrofilia similar y producir una proteína biológica o inmunológicamente modificada. En dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilia se encuentran a ±2, se prefieren particularmente aquellos que se encuentran a ±1 y se prefieren aún más aquellos que se encuentran a ±0.5.
Como se ha indicado anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral del aminoácido, por ejemplo, su hidrofobia, hidrofilia, carga, tamaño y similares. Las sustituciones ilustrativas que tienen en cuenta las diversas características anteriores son de sobra conocidas por los expertos en la materia e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.
La presente divulgación también contempla la modificación de isotipo. Al modificar la región Fc para que tenga un isotipo diferente, pueden lograrse diferentes funcionalidades. Por ejemplo, el cambio a IgG1 puede aumentar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, el cambio a la clase A puede mejorar la distribución en tejidos y el cambio a la clase M puede mejorar la valencia.
Como alternativa o además, puede ser útil combinar modificaciones de aminoácidos con una o más modificaciones de aminoácidos adicionales que alteran la unión a C1q y/o a la función de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) de la región Fc de una molécula de unión a IL-23p19. El polipéptido de unión de particular interés puede ser uno que se une a C1q y muestra citotoxicidad dependiente de complemento. Los polipéptidos con actividad de unión a C1q preexistente, que opcionalmente tienen la capacidad de mediar la CDC, pueden modificarse de tal forma que se potencia una o ambas de estas actividades. Las modificaciones de aminoácidos que alteran C1q y/o modifican su función de citotoxicidad dependiente de complemento se describen, por ejemplo, en el documento WO/0042072, que se incorpora al presente documento por referencia.
Se puede diseñar una región Fc de un anticuerpo con función efectora alterada, por ejemplo, modificando la unión a C1q y/o la unión a F<cy>R y de este modo, se cambia la actividad de CDC y/o la actividad de ADCC. Las "funcione efectoras" son responsables de la activación o reducción de la actividad biológica (por ejemplo, en un sujeto). Los ejemplos de funciones efectoras incluyen, pero sin limitación: unión a C1q; citotoxicidad dependiente de complemento (CDC); unión a receptor de Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación negativa de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B; BCR), etc. Dichas funciones efectoras pueden requerir combinar la región Fc con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y pueden evaluarse usando diversos ensayos (por ejemplo, ensayos de unión a Fc, ensayos de ADCC, ensayos de CDC, etc.).
Por ejemplo, se puede generar una región Fc variante de un anticuerpo con unión a C1q mejorada y unión a F<cy>RIII mejorada (por ejemplo, que tiene tanto actividad ADCC mejorada como actividad CDC mejorada). Como alternativa, si se desea reducir o suprimir la función efectora, puede modificarse por ingeniería genética una región Fc variante con actividad CDC reducida y/o actividad ADCC reducida. En otras realizaciones, solo puede aumentarse una de estas actividades y opcionalmente, reducirse también la otra actividad (por ejemplo, para generar una región Fc variante con actividad ADCC mejorada, pero actividad CDC reducida y viceversa).
Unión a FcRn.También pueden introducirse y crearse por ingeniería genética mutaciones de Fc para alterar su interacción con el receptor de Fc neonatal (FcRn) y mejorar sus propiedades farmacocinéticas. Se ha descrito una colección de variantes de Fc humanas con unión mejorada al FcRn (Shieldset al.,(2001). High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for F<cy>RI, F<cy>RII, F<cy>RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the FcyR, (J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Se conocen diversos métodos que pueden dar como resultado una semivida aumentada (Kuo y Aveson, (2011)), lo que incluye que pueden generarse modificaciones de aminoácidos mediante técnicas que incluyen mutagénesis de barrido de alanina, mutagénesis aleatoria y exploración para evaluar la unión al receptor de Fc neonatal (FcRN) y/o el comportamientoin vivo.También pueden usarse estrategias computacionales seguidas de mutagénesis para seleccionar una de las mutaciones de aminoácidos para efectuar la mutación.
La presente divulgación proporciona por tanto una variante de una proteína de unión a antígeno con unión optimizada a FcRn. En una realización particular, dicha variante de una proteína de unión a antígeno comprende al menos una modificación de aminoácidos en la región Fc de dicha proteína de unión a antígeno, en donde dicha modificación se selecciona entre el grupo que consiste en 226, 227, 228, 230, 231,233, 234, 239, 241,243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 y 447 de la región Fc, en comparación con dicho polipéptido precursor, en donde la numeración de los aminoácidos en la región Fc es la del índice de EU en Kabat. En un aspecto adicional de la divulgación, las modificaciones son M252Y/S254T/T256E.
Además, diversas publicaciones describen métodos para obtener moléculas fisiológicamente activas, cuyas semividas se modifican; véase, por ejemplo, Kontermann (2009) o bien introduciendo un polipéptido de unión a FcRn en las moléculas o fusionando las moléculas con anticuerpos cuyas afinidades de unión a FcRn se conservan, pero se han reducido en gran medida las afinidades por otros receptores de Fc o fusionando con dominios de unión a FcRn de anticuerpos.
Pueden usarse anticuerpos derivados para alterar las semividas (por ejemplo, semividas séricas) de anticuerpos precursores en un mamífero, en particular un ser humano. Dichas alteraciones pueden dar como resultado una semivida de más de 15 días, preferentemente más de 20 días, más de 25 días, más de 30 días, más de 35 días, más de 40 días, más de 45 días, más de 2 meses, más de 3 meses, más de 4 meses o más de 5 meses. Las semividas aumentadas de los anticuerpos de la presente divulgación o los fragmentos de los mismos en un mamífero, preferentemente un ser humano, dan como resultado una mayor concentración sérica de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo en el mamífero y por tanto, reduce la frecuencia de la administración de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo y/o reduce la concentración de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se van a administrar. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos que tienen un aumento en las semividasin vivose pueden generar mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden generar anticuerpos o fragmentos de estos con un aumento en las semividasin vivomodificando (por ejemplo, sustituyendo, eliminando o añadiendo) restos de aminoácidos identificados por participar en la interacción entre el dominio de Fc y el receptor FcRn.
Beltramelloet al.(2010) comunicaron con anterioridad la modificación de mAb neutralizantes, debido a su tendencia a potenciar la infección por el virus del dengue, generando anticuerpos en los que los restos de leucina en las posiciones 1.3 y 1.2 del dominio CH2 (de acuerdo con la numeración única de IMGT para el dominio C) se sustituyeron por restos de alanina. Esta modificación, también conocida como la mutación "LALA", suprime la unión del anticuerpo a FcyRI, FcyRII y FcYRIIIa, como se describe por Hessellet al.(2007). Los mAb variantes y no modificados recombinantes se compararon por su capacidad para neutralizar y potenciar la infección por los cuatro serotipos del virus del dengue. Las variantes LALA conservaron la misma actividad neutralizante que el mAb no modificado, pero estaban completamente desprovistas de actividad de potenciación. Las mutaciones LALA de este anticuerpo maduro se contemplan por tanto en el contexto de los anticuerpos divulgados en el presente documento.
Glucosilación alterada.Una realización particular de la presente divulgación es un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que contiene un glicano sustancialmente homogéneo sin ácido siálico, galactosa o fucosa. El anticuerpo monoclonal comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, unidas ambas a regiones constantes de cadena pesada o de cadena ligera, respectivamente. El glicano anteriormente mencionado sustancialmente homogéneo puede unirse covalentemente a la región constante de cadena pesada.
Otra realización de la presente divulgación comprende un mAb con un nuevo patrón de glucosilación de Fc. El anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo, está presente en una composición sustancialmente homogénea representada por la glucoforma GNGN o G1/G2. La glucosilación de Fc desempeña un papel significativo en las propiedades antivíricas y anticancerosas de los mAb terapéuticos. La divulgación concuerda con un estudio reciente que demuestra una inhibición vírica mediada por células contra lentivirus de un mAb sin fucosa anti-VIHin vitro.Esta realización de la presente divulgación con glicanos homogéneos que carecen de una fucosa central, mostró una protección aumentada contra virus específicos con un factor mayor del doble. La eliminación de la fucosa central mejora drásticamente la actividad ADCC de los mAb mediada por los linfocitos citolíticos naturales (NK), pero parece tener el efecto opuesto en la actividad ADCC de las células polimorfonucleares (PMN).
El anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una composición sustancialmente homogénea representada por la glucoforma GNGN o G1/G2, muestra una afinidad de unión aumentada por Fc gamma RI y Fc gamma RIII, en comparación con el mismo anticuerpo sin la glucoforma GNGN sustancialmente homogénea y con glucoformas que contienen G0, G1F, G2F, GNF, GNGNF o GNGNFX. En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo se disocia de Fc gamma RI con una Kd de 1 x 10-8 M o menos y de Fc gamma RIII con una Kd de 1 x 10-7 M o menos.
La glicosilación de una región Fc normalmente está o bien unida a N o unida a O. Unida a N se refiere a la unión del resto de carbohidrato a la cadena lateral de un resto de asparagina. La glucosilación unida a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. Las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de carbohidrato a las secuencias peptídicas de cadena lateral de asparagina son asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido, excepto prolina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias peptídicas en un polipéptido crea un posible sitio de glucosilación.
El patrón de glucosilación puede alterarse, por ejemplo, eliminando uno o más sitios de glucosilación hallados en el polipéptido y/o añadiendo uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en el polipéptido. La adición de sitios de glucosilación en la región Fc de un anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos, de tal forma que contiene una o más de las secuencias de tripéptido anteriormente descritas (para los sitios de glucosilación unidos a N). Una variante de glucosilación ilustrativa tiene una sustitución de aminoácidos del resto Asn 297 de la cadena pesada. La alteración también puede efectuarse mediante la adición de o la sustitución por uno o más restos de serina o treonina por la secuencia del polipéptido original (para los sitios de glucosilación unidos a O). Además, un cambio de Asn 297 a Ala puede eliminar uno de los sitios de glucosilación.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo se expresa en células que expresan beta (1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnT III), de tal forma que GnT III añade GlcNAc al anticuerpo IL-23p19. Se proporcionan métodos para producir anticuerpos de este modo en los documentos WO/9954342, WO/03011878, la publicación de patente 20030003097A1, y en Umanaet al.,Nature Biotechnology, 17:176-180, febrero de 1999. Las líneas celulares pueden alterarse para potenciar o reducir o eliminar ciertas modificaciones postraduccionales, tales como la glucosilación, usando tecnología de edición genómica, tal como grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares (CRISPR). Por ejemplo, puede usarse la tecnología CRISPR para eliminar genes que codifican enzimas glucosilantes en células 293 o CHO usadas para expresar anticuerpos monoclonales recombinantes.
Problemas con la eliminación de secuencias de proteína de anticuerpos monoclonales.Es posible modificar las secuencias génicas variables del anticuerpo obtenidas de linfocitos B humanos para potenciar su posibilidad de fabricación y seguridad. Pueden identificarse posibles problemas en la secuencia de proteína buscando motivos de secuencia asociados con sitios que contienen:
1) restos de Cys no emparejados,
2) glucosilación unida a N,
3) desamidación de Asn,
4) isomerización de Asp,
5) truncamiento de SYE,
6) oxidación de Met,
7) oxidación de Trp,
8) glutamato N-terminal,
9) unión a integrinas,
10) unión a CD11c/CD18 o
11) fragmentación
Dichos motivos pueden eliminarse alterando el gen sintético para el ADNc que codifica los anticuerpos recombinantes.
Los trabajos en ingeniería de proteínas en el campo del desarrollo de anticuerpos terapéuticos evidencian que ciertas secuencias o restos se asocian con diferencias de la solubilidad (Fernandez-Escamillaet al., Nature Biotech.,22 (10), 1302-1306, 2004; Chennamsettyet al., PNAS,106 (29), 11937-11942, 2009; Voynovet a l, Biocon. Chem,21 (2), 385 392, 2010) Las pruebas procedentes de mutaciones que alteran la solubilidad en la bibliografía indican que algunos restos hidrófilos, tales como ácido aspártico, ácido glutámico y serina contribuyen de manera significativamente más favorable a la solubilidad de las proteínas que otros restos hidrófilos, tales como asparagina, glutamina, treonina, lisina y arginina.
Estabilidad.Los anticuerpos pueden modificarse para obtener propiedades biofísicas mejoradas. Se puede usar temperatura elevada para desplegar los anticuerpos para determinar la estabilidad relativa, usando las temperaturas de fusión aparentes medias. La calorimetría de barrido diferencial (DSC) mide la capacidad térmica, Cp, de una molécula (el calor necesario para elevar un grado su temperatura) en función de la temperatura. Se puede usar DSC para estudiar la estabilidad térmica de los anticuerpos. Los datos de DSC para los mAb es particularmente interesante, dado que en algunos casos resuelve el desplegamiento de dominios individuales dentro de la estructura del mAb, produciendo hasta tres picos en el termograma (del desplegamiento de los dominios Fab, Ch2 y Ch3). Normalmente, el desplegamiento del dominio Fab produce el pico más fuerte. Los perfiles de DSC y la estabilidad relativa de la porción Fc muestran diferencias características para las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas (Garber y Demarest,Biochem. Biophys. Res. Commun.355, 751-757, 2007). También se puede determinar la temperatura de fusión aparente usando dicroísmo circular (CD), efectuado con un espectrómetro de CD. Los espectros de CD del UV lejano se medirán para anticuerpos en el intervalo de 200 a 260 nm a incrementos de 0.5 nm. Los espectros finales pueden determinarse como las medias de 20 acumulaciones. Los valores de elipticidad del resto pueden calcularse después de restar el valor basal. El desplegamiento térmico de los anticuerpos (0.1 mg/ml) puede monitorizarse a 235 nm a 25-95 °C y una velocidad de calentamiento de 1 °C/min. Se puede usar dispersión de luz dinámica (DLS) para evaluar la propensión a la agregación. La DLS se usa para caracterizar el tamaño de diversas partículas, incluidas proteínas. En caso de que el tamaño no sea disperso, puede determinarse el diámetro medio eficaz de las partículas. Esta medida depende del tamaño del núcleo de la partícula, el tamaño de las estructuras superficiales y la concentración de partículas. Dado que la DLS mide esencialmente las fluctuaciones en la intensidad de la luz dispersada a causa de las partículas, puede determinarse el coeficiente de difusión de las partículas. El programa informático de DLS en los instrumentos de DLA comerciales presenta la población de partículas a diferentes diámetros. Los estudios de estabilidad pueden efectuarse convenientemente usando DLS. Las mediciones por DLS de una muestra pueden demostrar si las partículas se agregan con el paso del tiempo o con la variación de la temperatura determinando si aumenta el radio hidrodinámico de la partícula. En caso de que las partículas se agreguen, se puede observar una mayor población de partículas con un radio mayor. La estabilidad dependiente de la temperatura puede analizarse controlando la temperaturain situ.Las técnicas de electroforesis capilar (CE) incluyen metodologías probadas para determinar características de estabilidad de anticuerpos. Se puede usar una estrategia de iCE para resolver las variantes de carga de proteína del anticuerpo debido a la desamidación, las lisinas C-terminales, la sialilación, la oxidación, la glucosilación y cualquier otro cambio en la proteína que pueda dar como resultado un cambio en el pI de la proteína. Puede evaluarse cada una de las proteínas de anticuerpo expresadas mediante alto rendimiento, isoelectroenfoque (IEF) de solución libre en una columna capilar (cIEF), usando un instrumento Maurice simple para proteínas. La detección de la absorción UV de toda la columna puede efectuarse cada 30 segundos para el control en tiempo real de las moléculas que se enfocan en los puntos isoeléctricos (pI). Esta estrategia combina la alta resolución de la IEF en gel tradicional con las ventajas de la cuantificación y la automatización lograda en las separaciones basadas en columna, a la vez que se elimina la necesidad de una etapa de movilización. La técnica proporciona un análisis cuantitativo y reproducible de la identidad, la pureza y los perfiles de heterogeneidad de los anticuerpos expresados. Los resultados identifican la heterogeneidad de carga y la separación por tamaño molecular de los anticuerpos, con modos de detección tanto de la absorbancia como de la fluorescencia nativa y con una sensibilidad de detección inferior a 0.7 |jg/ml.
Solubilidad.Se puede determinar la puntuación de solubilidad intrínseca de las secuencias de anticuerpo. Las puntuaciones de solubilidad intrínseca pueden calcularse usando CamSol Intrinsic (Sormanniet al., J Mol B io l427, 478 490, 2015). Pueden evaluarse las secuencias de aminoácidos para los restos 95-102 (numeración de Kabat) en la HCDR3 de cada fragmento de anticuerpo, tal como un scFv, mediante el programa en línea para calcular las puntuaciones de solubilidad. También se puede determinar la solubilidad usando técnicas analíticas. Existen diversas técnicas, que incluyen la adición de proteínas liofilizadas a una solución hasta que se sature la solución y se alcance el límite de solubilidad, o concentración mediante ultrafiltración en un microconcentrador con un corte de peso molecular adecuado. El método más directo es la inducción de la precipitación amorfa, que mide la solubilidad de la proteína usando un método que implica la precipitación de proteínas usando sulfato de amonio (Trevinoet al., J Mol Biol,366: 449-460, 2007). La precipitación con sulfato de amonio proporciona información rápida y precisa acerca de los valores de solubilidad relativa. La precipitación con sulfato de amonio produce soluciones precipitadas con fases acuosas y sólidas bien definidas y requiere cantidades relativamente pequeñas de proteína. Las mediciones de solubilidad efectuadas usando la inducción de la precipitación amorfa con sulfato de amonio también pueden efectuarse fácilmente a diversos valores de pH. La solubilidad de las proteínas depende en gran medida del pH y se considera que el pH es el factor extrínseco más importante que afecta a la solubilidad.
Autorreactividad.En general, se considera que deben eliminarse los clones autorreactivos durante la ontogenia mediante selección negativo, aunque se ha evidenciado que muchos anticuerpos humanos de origen natural con propiedades autorreactivas persisten en los repertorios maduros adultos y la autorreactividad puede potenciar la función antivírica de muchos patógenos contra patógenos. Se ha demostrado que los bucles de HCDR3 en los anticuerpos durante el desarrollo temprano de linfocitos B normalmente son ricos en cargas positivas y muestran patrones de autorreactividad (Wardemannet al., Science301, 1374-1377, 2003). Se puede analizar la autorreactividad de un anticuerpo dado evaluando el nivel de unión a las células de origen humano mediante microscopía (usando células epiteliales HeLa o Hep-2 adherentes) y tinción de la superficie celular mediante citometría de flujo (usando linfocitos T Jurkat en suspensión y células de riñón embrionario humano 293S). También puede analizarse la autorreactividad usando la evaluación de la unión a tejidos en matrices de tejidos.
Restos preferidos ("similitud con humanos").La secuenciación profunda del repertorio de linfocitos B humanos procedentes de donantes de sangre se está realizando a gran escala en muchos estudios recientes. La información de secuencia acerca de una porción significativa del repertorio de anticuerpos humanos facilita la evaluación estadística de las características de secuencia de anticuerpo comunes en los humanos sanos. Con el conocimiento acerca de las características de secuencia en una base de datos de referencia de genes variables de anticuerpos recombinados, puede estimarse el grado específico de "similitud con humanos" (HL) de la posición específica de una secuencia de anticuerpo. Se ha demostrado que el HL es útil para el desarrollo de anticuerpos de uso clínico, como anticuerpos terapéuticos o anticuerpos como vacunas. El objetivo es aumentar la similitud con humanos de los anticuerpos para reducir los posibles efectos adversos y las respuestas inmunitarias anti-anticuerpos que darán lugar a una eficacia significativamente reducida del fármaco de anticuerpo o pueden inducir implicaciones graves para la salud. Se pueden evaluar las características del anticuerpo del repertorio de anticuerpos combinados de tres donantes de sangre humanos sanos, con un total de aproximadamente 400 millones de secuencias, y crear una nueva puntuación de "similitud con humanos relativa" (rHL) que se centra en la región hipervariable del anticuerpo. La puntuación de rHL permite distinguir fácilmente entre secuencias humanas (puntuación positiva) y no humanas (puntuación negativa). Los anticuerpos pueden modificarse por ingeniería genética para eliminar restos que no son comunes en los repertorios humanos.
D. Anticuerpos monocatenarios
Un fragmento variable monocatenario (scFv) es una fusión de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas, unidas entre sí mediante un enlazador corto (normalmente de serina y glicina). Esta molécula quimérica conserva la especificidad de la inmunoglobulina original, a pesar de la eliminación de las regiones constantes y la introducción de un péptido enlazador. Esta modificación normalmente deja la especificidad inalterada. Estas moléculas se han creado históricamente para facilitar la presentación en fagos y es altamente conveniente para expresar el dominio de unión a antígeno como un solo péptido. Como alternativa, pueden crearse scFv directamente a partir de cadenas pesadas y ligeras obtenidas a partir de un hibridoma o un linfocito B. Los fragmentos variables monocatenarios carecen de la región constante de Fc observada en las moléculas de anticuerpo completas y por tanto, de los sitios de unión comunes (por ejemplo, proteína A/G) usados para purificar anticuerpos. Normalmente, estos fragmentos pueden purificarse/inmovilizarse usando proteína L, ya que la proteína L interactúa con la región variable de las cadenas ligeras kappa.
En general, los enlazadores flexibles están formados por restos de aminoácido que favorecen la formación de hélices y giros, tales como alanina, serina y glicina. Sin embargo, también pueden funcionar otros restos. Tanget al.(1996) usaron presentación en fagos como medio para seleccionar rápidamente enlazadores a medida para anticuerpos monocatenarios (scFv) a partir de bibliotecas de proteínas enlazadoras. Se construyó una biblioteca aleatoria en la que se enlazaron los genes para los dominios variables de cadena pesada y ligera mediante un segmento que codifica un polipéptido de 18 aminoácidos de composición variable. El repertorio de scFv (aproximadamente 5 * 106 miembros diferentes) se presentó sobre fagos filamentosos y se sometió a selección de afinidad con hapteno. La población de variantes seleccionadas mostró aumentos significativos en la actividad de unión, pero conservó una diversidad de secuencia considerable. La detección sistemática de 1054 variantes individuales proporcionó posteriormente un scFv catalíticamente activo que se produjo eficazmente en forma soluble. Los análisis de secuencia revelaron una prolina conservada en el enlazador dos restos después del extremo de la VhC y una abundancia de argininas y prolinas en otras posiciones como las únicas características comunes de los anclajes seleccionados.
Los anticuerpos recombinantes de la presente divulgación también pueden implicar secuencias o restos que permiten la dimerización o la multimerización de los receptores. Dichas secuencias incluyen las procedentes de IgA, que permiten la formación de multímeros junto con la cadena J. Otro dominio de multimerización es el dominio de dimerización Gal4. En otras realizaciones, las cadenas pueden modificarse con agentes, tales como biotina/avidina, que permiten la combinación de dos anticuerpos.
En una realización independiente, puede crearse un anticuerpo monocatenario uniendo cadenas ligeras y pesadas usando un enlazador o unidad química no peptídica. En general, las cadenas ligeras y pesadas se producirán en células diferentes, se purificarán y posteriormente se unirán de una manera adecuada (es decir, el extremo N-terminal de la cadena pesada se une al extremo C-terminal de la cadena ligera por medio de un puente químico adecuado).
Se usan reactivos de reticulación para formar puentes moleculares que unen a los grupos funcionales de dos moléculas diferentes, por ejemplo, un agente estabilizante y uno coagulante. Sin embargo, se contempla que puedan crearse dímeros o multímeros del mismo análogo o complejos heteroméricos formados por diferentes análogos. Para unir dos compuestos diferentes de una manera escalonada, pueden usarse reticulantes heterobifuncionales que eliminan la formación de homopolímeros no deseados.
Un reticulante heterobifuncional ilustrativo contiene dos grupos reactivos: uno que reacciona con el grupo amina primario (por ejemplo, N-hidroxi succinimida) y el otro reacciona con un grupo tiol (por ejemplo, disulfuro de piridilo, maleimidas, halógenos, etc.). A través del grupo reactivo de amina primaria, el reticulante puede reaccionar con el o los restos de lisina de una proteína (por ejemplo, en anticuerpo o fragmento seleccionado) y mediante el grupo reactivo tiol, el reticulante ya unido a la primera proteína reacciona con el resto de cisteína (grupo sulfhidrilo libre) de la otra proteína (por ejemplo, el agente selectivo).
Se prefiere emplear un reticulante que tenga una estabilidad razonable en la sangre. Se conocen numerosos tipos de enlazadores que contienen enlaces disulfuro que pueden emplearse con éxito para conjugar agentes de direccionamiento y terapéuticos/preventivos. Los enlazadores que contienen un enlace disulfuro que está estéricamente impedido pueden demostrar que proporcionan más estabilidadin vivo,previniendo la liberación del péptido de direccionamiento antes de alcanzar el sitio de acción. Por tanto, estos enlazadores son un grupo de agentes de enlace.
Otro reactivo reticulante es SMPT, que es un reticulante bifuncional que contiene un enlace disulfuro que está "impedido estéricamente" por medio de un anillo bencénico y grupos metilo adyacentes. Se cree que el impedimento estérico del enlace disulfuro sirve como una función para proteger al enlace frente al ataque por aniones tiolato, tales como glutatión, que pueden estar presentes en tejidos y sangre y de este modo, ayudan a prevenir el desacoplamiento del conjugado antes de la administración del agente unido al sitio diana.
El reactivo reticulante de SMTP, al igual que con muchos otros reactivos reticulantes conocidos, proporciona la capacidad de reticular grupos funcionales, tales como el SH de la cisteína o las aminas primarias (por ejemplo, el grupo amino épsilon de la lisina). Otro posible tipo de reticulante incluye las fenilazidas fotorreactivas heterobifuncionales que contienen un enlace disulfuro escindible, tal como sulfosuccinimidil-2-(p-azido-salicilamido)etil-1,3-'-ditiopropionato. El grupo N-hidroxisuccinimidilo reacciona con los grupos amino primarios y la fenilazida (tras la fotólisis) reacciona de manera no selectiva con cualquier resto de aminoácido.
Además de los reticulantes impedidos, también pueden emplearse reticulantes no impedidos de acuerdo con el presente documento. Otros reticulantes útiles, que no se considera que contengan o generen un disulfuro protegido, incluyen SATA, SPDP y 2-iminotiolano (Wawrzynczak y Thorpe, 1987). Se comprende bien en la técnica el uso de dichos reticulantes. Otra realización implica el uso de enlazadores flexibles.
La Patente de los Estados Unidos 4,680,338 describe enlazadores bifuncionales útiles para producir conjugados de ligandos con polímeros y/o proteínas que contienen amina, especialmente para formar conjugados de anticuerpo con quelantes, fármacos, enzimas, marcadores detectables y similares. Las Patentes de los Estados Unidos 5,141,648 y 5,563,250 divulgan conjugados escindibles que contienen un enlace lábil que puede escindirse en diversas condiciones leves. Este enlazador es particularmente útil en tanto que el agente de interés puede unirse directamente al enlazador, en donde la escisión da como resultado la liberación del agente activo. Los usos particulares incluyen añadir un grupo amino libre o sulfhidrilo libre a una proteína, tal como un anticuerpo o un fármaco.
La Patente de los Estados Unidos 5,856,456 proporciona enlazadores peptídicos para su uso en la conexión de constituyentes polipeptídicos para producir proteínas de fusión, por ejemplo, anticuerpos monocatenarios. El enlazador tiene hasta aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, contiene al menos una aparición de un aminoácido cargado (preferentemente arginina o lisina) seguido de una prolina y se caracteriza por una mayor estabilidad y agregación reducida. La Patente de los Estados Unidos 5,880,270 divulga enlazadores que contienen aminooxi útiles en diversas técnicas de inmunodiagnóstico y separativas.
E. Anticuerpos multiespecíficos
En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la presente divulgación son biespecíficos o multiespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos ilustrativos pueden unirse a dos epítopos diferentes de un solo antígeno. Otros anticuerpos de este tipo pueden combinar un primer sitio de unión a antígeno con un sitio de unión para un segundo antígeno. Como alternativa, puede combinarse un brazo antipatógeno con un brazo que se une a una molécula activadora en un leucocito, tal como una molécula receptoras de linfocitos T (por ejemplo, CD3) o receptores Fc para IgG (FcyR), tales como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y Fc gamma RIII (CD16), a fin de enfocar y localizar los mecanismos de defensa celulares a la célula infectada. Los anticuerpos biespecíficos también pueden usarse para localizar agentes citotóxicos a células infectadas. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a patógenos y un brazo que se une al agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferón-a, alcaloides de la vinca, cadena A de ricina, metotrexato o un hapteno de isótopo radiactivo). Pueden prepararse anticuerpos biespecíficos en forma de anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2). El documento WO 96/16673 describe un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-Fc gamma RIII y la Patente de los Estados Unidos 5,837,234 divulga un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-Fc gamma RI. En el documento WO98/02463 se muestra un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/Fc alfa. La Patente de los Estados Unidos 5,821,337 enseña un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-CD3.
Se conocen en la técnica métodos para producir anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millsteinet al.,Nature, 305:537-539 (1983)). Debido al ordenamiento aleatorio de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de las que solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que normalmente se efectúa mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante laboriosa y el rendimiento de producto es bajo. Se divulgan procedimientos similares en el documento WO 93/08829 y en Trauneckeret al.,EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
De acuerdo con una estrategia diferente, se fusionan regiones variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. Preferentemente, la fusión es con un dominio constante de cadena pesada de Ig, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, Ch2 y Ch3. Se prefiere que la primera región constante de cadena pesada (Cm) contenga el sitio necesario para la unión a la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en una célula hospedadora adecuada. Esto aporta mayor flexibilidad a la hora de ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en las realizaciones cuando las relaciones no equitativas de las tres cadenas de polipéptido usadas en la construcción proporcionan el rendimiento óptimo del anticuerpo biespecífico deseado. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un solo vector de expresión, cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas a proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las relaciones no tienen un efecto significativo en el rendimiento de la combinación de cadena deseada.
En una realización particular de esta estrategia, los anticuerpos biespecíficos están formados por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrido (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se observó que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina solo en una mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma fácil de separación. Esta estrategia se divulga en el documento WO 94/04690. Para más detalles acerca de la generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Sureshet al.,Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
De acuerdo con otra estrategia descrita en la Patente de los Estados Unidos 5,731,168, puede modificarse por ingeniería genética la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan de un cultivo de células recombinantes. La interfaz preferida comprende al menos una parte del dominio Ch3. En este método, se reemplazan una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo por cadenas más largas (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias del mismo tamaño o uno similar al de las grandes cadenas laterales en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando las cadenas laterales de aminoácidos grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero frente a otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.
Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina y el otro a biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir las células diana del sistema inmunitario a células no deseadas (Patente de los Estados Unidos 4,676,980) y para el tratamiento de la infección por VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089). Pueden producirse anticuerpos heteroconjugados usando cualquier método de reticulación conveniente. Los agentes reticulantes adecuados son bien conocidos en la técnica y se divulgan en la Patente de los Estados Unidos 4,676,980, junto con diversas técnicas de reticulación.
Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la bibliografía. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos usando enlace químico. Brennane t a l.,Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en donde se escinden proteolíticamente anticuerpos intactos para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente de complejación de ditiol, arsenito de sodio, para estabilizar los ditioles próximos e impedir la formación de disulfuros intermoleculares. Posteriormente, los fragmentos Fab' generados se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB se vuelve a convertir en el Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
Existen técnicas que facilitan la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH deE. c o li,que puede acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalabye t a l.,J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo F(ab')2 biespecífico humanizado. Cada fragmento Fab' se secretó por separado enE. c o liy se sometió a acoplamiento químico dirigidoin v itropara formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de este modo fue capaz de unirse a células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y a linfocitos T humanos normales, así como desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumor de mama humano.
También se han descrito diversas técnicas para producir y aislar directamente fragmentos de anticuerpo biespecíficos a partir de cultivos de células recombinantes (Merchante t a l., Nat. B io te c h n o l.16, 677-681 (1998). doi:10.1038/nbt0798-677pmid:9661204). Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina (Kostelnye t a l.,J. Immunol., 148(5):1547-1553, 1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después se volvieron a oxidar para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollingere t a l.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para producir fragmentos de anticuerpo biespecíficos. Los fragmentos comprenden una Vh conectada a una Vl por medio de un enlazador que es demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, se fuerza el emparejamiento de los dominios V<h>y V<l>de un fragmento con los dominios V<l>y V<h>complementarios de otro fragmento, formando de este modo dos sitios de unión a antígeno. También se ha notificado otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpo biespecíficos mediante el uso de dímeros de Fv monocatenarios (sFv). Véase Grubere t a l.,J. Immunol., 152:5368 (1994).
En una realización particular, puede formarse un anticuerpo biespecífico o multiespecífico en forma de un complejo DOCK-AND-LOCK™ (DNL™) (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos 7,521,056; 7,527,787; 7,534,866; 7,550,143 y 7,666,400). En general, la técnica aprovecha las interacciones específicas y de alta afinidad que se producen entre una secuencia de dominio de dimerización y acoplamiento (DDD) de las subunidades reguladoras (R) de proteína cinasa dependiente de AMPc (PKA) y una secuencia de dominio de anclaje (AD) procedente de cualquiera de diversas proteínas AKAP(Bailliee t a l., F E B S Le tte rs .2005; 579: 3264; Wong y Scott,Nat. Rev. M ol. C e ll B iol.2004; 5: 959). Los péptidos DDD y AD pueden unirse a cualquier proteína, péptido o a otra molécula. Debido a que las secuencias de DDD se dimerizan espontáneamente y se unen a la secuencia de AD, la técnica permite la formación de complejos entre cualquiera de las moléculas seleccionadas que pueden unirse a las secuencias de DDD o AD.
Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos (T uttet a l.,J. Immunol. 147: 60, 1991; Xue t a l., S c ie n c e ,358(6359):85-90, 2017). Puede internalizarse (y/o catabolizarse) un anticuerpo multivalente más rápido que un anticuerpo bivalente mediante una célula que expresa un antígeno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente divulgación pueden ser anticuerpos multivalentes con tres o más sitios de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos tretravalentes), que pueden producirse fácilmente mediante expresión recombinante de ácidos nucleicos que codifican las cadenas de polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más dominios de unión a antígeno. El dominio de dimerización preferido comprende (o consiste en) una región Fc o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fc y tres o más sitios de unión a antígeno aminoterminales respecto de la región Fc. El anticuerpo multivalente preferido del presente documento comprende (o consiste en) de tres a aproximadamente ocho, pero preferentemente cuatro, sitios de unión a antígeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena polipeptídica (y preferentemente dos cadenas polipeptídicas), en donde las cadenas de polipéptido comprenden dos o más regiones variables. Por ejemplo, las cadenas de polipéptido pueden comprender VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, en donde VD1 es una primera región variable, VD2 es una segunda región variable, Fc es una cadena polipeptídica de una región Fc, X1 y X2 representan un aminoácido o polipéptido y n es 0 o 1. Por ejemplo, las cadenas de polipéptido pueden comprender: VH-CH1-enlazador flexible-VH-CH1-cadena de la región Fc; o VH-CH1-VH-CH1-cadena de la región Fc. El anticuerpo multivalente del presente documento preferentemente comprende además al menos dos (y preferentemente cuatro) polipéptidos de región variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente del presente documento puede comprender, por ejemplo, de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de región variable de cadena ligera. Los polipéptidos de región variable de cadena ligera contemplados en este caso comprenden una región variable de cadena ligera y opcionalmente, comprenden además un dominio C<l>.
Las modificaciones de carga son particularmente útiles en el contexto de un anticuerpo multiespecífico, donde las sustituciones de aminoácidos en las moléculas de Fab dan como una reducción en el emparejamiento erróneo de las cadenas ligeras con cadenas pesadas no emparejadas (productos secundarios de tipo Bence-Jones), que pueden producirse durante la producción de las moléculas de unión a antígeno bi o multiespecíficas basadas en Fab con un intercambio de VH/VL en uno (o más, en el caso de moléculas que comprenden más de dos moléculas de Fab de unión a antígeno) de sus brazos de unión (véase también la Publicación PCT n.° WO 2015/150447, en particular los ejemplos en la misma).
Por consiguiente, en realizaciones particulares de la divulgación pero no parte de la invención, un anticuerpo comprendido en el agente terapéutico comprende
(a) una primera molécula de Fab que se une específicamente a un primer antígeno
(b) una segunda molécula de Fab que se une específicamente a un segundo antígeno y en donde los dominios variables VL y VH de la cadena ligera del Fab y la cadena pesada del Fab están reemplazados entre sí,
en donde el primer antígeno es un antígeno de linfocitos T activante y el segundo antígeno es un antígeno de la célula diana o el primer antígeno es un antígeno de célula diana y el segundo antígeno es un antígeno de linfocitos T activante; y
en donde
i) en el dominio constante CL de la primera molécula de Fab de a), el aminoácido en la posición 124 está sustituido por un aminoácido con carga positiva (numeración de acuerdo con Kabat) y en donde en el dominio constante CH1 de la primera molécula de Fab de a), el aminoácido en la posición 147 del aminoácido en la posición 213 se sustituye por un aminoácido con carga negativa (numeración de acuerdo con el índice de EU de Kabat); o
ii) en el dominio constante CL de la segunda molécula de Fab de b), el aminoácido en la posición 124 está sustituido por un aminoácido con carga positiva (numeración de acuerdo con Kabat) y en donde en el dominio constante CH1 de la segunda molécula de Fab de b), el aminoácido en la posición 147 del aminoácido en la posición 213 se sustituye por un aminoácido con carga negativa (numeración de acuerdo con el índice de EU de Kabat).
El anticuerpo puede no comprender ambas modificaciones mencionadas en i) y ii). Los dominios constantes CL y CH1 de la segunda molécula de Fab no se reemplazan entre sí (es decir, se mantienen sin cambios).
En otras realizaciones de la divulgación pero no parte de la invención, el anticuerpo, en el dominio constante CL de la primera molécula de Fab de a), el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) (en una realización preferida, independientemente por lisina (K) o arginina (R)) y en el dominio constante CH1 de la primera molécula de Fab de a), el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice de EU de Kabat).
En una realización adicional de la divulgación pero no parte de la invención, en el dominio constante CL de la primera molécula de Fab de a), el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat), y en el dominio constante CH1 de la primera molécula de Fab de a), el aminoácido en la posición 147 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice de EU de Kabat).
En una realización particular de la divulgación pero no parte de la invención, en el dominio constante CL de la primera molécula de Fab de a), el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) (en una realización preferida, independientemente por lisina (K) o arginina (R)) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) (en una realización preferida, independientemente por lisina (K) o arginina (R)), y en el dominio constante CH1 de la primera molécula de Fab de a), el aminoácido en la posición 147 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice de EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice de EU de Kabat).
En una realización más particular de la divulgación pero no parte de la invención, en el dominio constante CL de la primera molécula de Fab de a), el aminoácido en la posición 124 se sustituye por lisina (K) (numeración de acuerdo con Kabat) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye por lisina (K) o arginina (R) (numeración de acuerdo con Kabat) y en el dominio constante CH1 de la primera molécula de Fab de a), el aminoácido en la posición 147 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice de EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice de EU de Kabat).
En una realización aún más preferida de la divulgación pero no parte de la invención, en el dominio constante CL de la primera molécula de Fab de a), el aminoácido en la posición 124 se sustituye por lisina (K) (numeración de acuerdo con Kabat) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye por arginina (R) (numeración de acuerdo con Kabat) y en el dominio constante CH1 de la primera molécula de Fab de a), el aminoácido en la posición 147 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice de EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice de EU de Kabat).
F. Receptores de antígeno quiméricos
Los receptores de linfocitos T artificiales (también conocidos como receptores de linfocitos T quiméricos, inmunorreceptores quiméricos, receptores de antígeno quiméricos (CAR)) son receptores modificados por ingeniería genética, que injertan una especificidad arbitraria sobre una célula efectora inmunitaria. Normalmente, estos receptores se usan para injertar la especificidad de un anticuerpo monoclonal en un linfocito T, facilitándose la transferencia de su secuencia codificante por medio de vectores retrovíricos. De este modo, puede generarse un gran número de linfocitos T específicos para la diana para la transferencia de células adoptivas. Los estudios clínicos de fase I de esta estrategia muestran eficacia.
La forma más habitual de estas moléculas son fusiones de fragmentos variables monocatenarios (scFv) procedentes de anticuerpos monoclonales, fusionados al dominio transmembrana y al endodominio de CD3-zeta. Dichas moléculas dan como resultado la transmisión de una señal zeta en respuesta al reconocimiento de la diana por el scFv. Un ejemplo de dicha construcción es 14g2a-Zeta, que es una fusión de un scFv procedente del hibridoma 14g2a (que reconoce al disialogangliósido GD2). Cuando los linfocitos T expresan esta molécula (lo que normalmente se logra mediante transducción de vectores oncorretrovíricos), reconocen y eliminan a las células diana que expresan GD2 (por ejemplo, células de neuroblastoma). Para dirigirse a linfocitos B malignos, los investigadores han redirigido la especificidad de los linfocitos T usando un inmunorreceptor quimérico específico para la molécula del linaje B, CD19.
Las porciones variables de una cadena pesada y ligera de inmunoglobulina se fusionan mediante un enlazador flexible para formar un scFv. Este scFv va precedido de un péptido de señal para dirigir la proteína naciente al retículo endoplasmático y la posterior expresión en la superficie (este se escinde). Un enlazador flexible permite que el scFv se oriente en diferentes direcciones para posibilitar la unión al antígeno. El dominio transmembrana es normalmente una alfa hélice hidrófoba que normalmente procede de la molécula original del endodominio de señalización, que sobresale de la célula y transmite la señal deseada.
Las proteínas de tipo I, de hecho, son dos dominios de proteína unidos por medio de una alfa hélice intermedia. La bicapa lipídica de la membrana celular, a través de la que pasa el dominio transmembrana, actúa aislando la porción interna (endodominio) de la porción externa (ectodominio). No resulta sorprendente que la unión de un ectodominio de una proteína a un endodominio de otra proteína de como resultado una molécula que combina el conocimiento de la primera a la señal de la segunda.
Ectodominio. Un péptido de señal dirige la proteína naciente al retículo endoplasmático. Esto es esencial en caso de que el receptor se vaya a glucosilar y a anclar en la membrana celular. Normalmente funciona bien cualquier secuencia de péptido de señal eucariota. En general, se usa el péptido de señal unido de manera nativa al componente más próximo al extremo amino (por ejemplo, en un scFv con la orientación de cadena ligera - enlazador - cadena pesada, se usa la señal nativa de la cadena ligera).
El dominio de reconocimiento de antígenos es normalmente un scFv. Sin embargo, hay varias alternativas. Se han descrito las cadenas individuales alfa y beta de un dominio de reconocimiento de antígeno de un receptor de linfocitos T nativo (TCR), ya que tienen ectodominios simples (por ejemplo, ectodominio de CD4 para reconocer a células infectadas por el VIH) y componentes de reconocimiento más exóticos, tales como una citocina unida (que da lugar al reconocimiento de células que portan el receptor de citocinas). De hecho, puede usarse prácticamente cualquier cosa que se una a una diana dada con alta afinidad como región de reconocimiento de antígeno.
Una región espaciadora une el dominio de unión a antígeno al dominio transmembrana. Debe ser lo suficientemente flexible como para permitir que el dominio de unión a antígeno se oriente en diferentes direcciones para facilitar el reconocimiento del antígeno. La forma más sencilla es la región bisagra de IgG1. Las alternativas incluyen la región CH2CH3 de la inmunoglobulina y porciones de CD3. Para la mayoría de construcciones basadas en scFv, resulta suficiente la bisagra de IgG1. Sin embargo, normalmente se tiene que determinar empírica el mejor espaciador.
Dominio transmembrana. El dominio transmembrana es una alfa hélice hidrófoba que atraviesa la membrana. En general, se usa el dominio transmembrana del componente más próximo a la membrana del endodominio. De manera interesante, el uso del dominio transmembrana de CD3-zeta puede dar como resultado la incorporación del TCR artificial en el TCR nativo, un factor que es dependiente de la presencia del resto de ácido aspártico cargado transmembrana de CD3-zeta nativo. Los diferentes dominios transmembrana dan como resultado diferentes estabilidades del receptor. El dominio transmembrana de CD28 da como resultado un receptor estable brillantemente expresado.
Endodominio. Este es el "extremo trabajador" del receptor. Tras el reconocimiento del antígeno, los receptores se agrupan y se transmite una señal a la célula. El componente del endodominio más comúnmente usado es CD3-zeta, que contiene 3 ITAM. Este transmite una señal de activación al linfocito T tras la unión del antígeno. CD3-zeta puede no proporcionar una señal de activación totalmente competente y se necesita señalización coestimuladora adicional.
Los CAR de "primera generación" tenían normalmente el dominio intracelular de la cadena ^de CD3, que es el principal transmisor de señales a partir de los TCR endógenos. Los CAR de "segunda generación" añaden dominios de señalización de diversos receptores de proteínas coestimuladores (por ejemplo, CD28, 41BB, ICOS) a la cola citoplasmática del CAR a fin de proporcionar señales adicionales al linfocito T. Se ha demostrado en estudios preclínicos que la segunda generación de CAR mejora la actividad antitumoral de los linfocitos T. Los CAR más recientes de "tercera generación" combinan múltiples dominios de señalización, tales como CD3z-CD28-41BB o CD3z-CD28-OX40, para aumentar más la potencia.
G. ADC
Los conjugados de anticuerpo-fármaco o ADC son una nueva clase de fármacos biofarmacéuticos altamente potentes diseñados como una terapia dirigida para el tratamiento de pacientes con enfermedades infecciosas. Los ADC son moléculas complejas formadas por un anticuerpo (un mAb completo o un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento variable monocatenario) unido, a través de un enlazador químico estable con enlaces lábiles, a una carga o fármaco citotóxico o antivírico biológicamente activo. Los conjugados de anticuerpo-fármaco son ejemplos de bioconjugados e inmunoconjugados.
Al combinar las capacidades únicas de direccionamiento de los anticuerpos monoclonales con la capacidad de eliminación del cáncer de los fármacos citotóxicos, los conjugados de anticuerpo-fármaco permiten la diferenciación sensible entre el tejido sano y enfermo. Esto significa que, a diferencia de las estrategias sistémicas tradicionales, los conjugados de anticuerpo-fármaco se dirigen y atacan a la célula infectada, de tal forma que las células sanas se ven afectadas de manera menos intensa.
En el desarrollo de los tratamientos antitumorales basados en ADC, se acopla un fármaco anticanceroso (por ejemplo, una toxina o citotoxina celular) a un anticuerpo que se dirige específicamente a un cierto marcador celular (por ejemplo, una proteína que, idealmente, solo se encuentra dentro o sobre células infectadas). Los anticuerpos rastrean a estas proteínas en el organismo y se unen a la superficie de las células cancerosas. La reacción bioquímica entre el anticuerpo y la proteína diana (antígeno) desencadena una señal en la célula tumoral, que posteriormente absorbe o internaliza al anticuerpo junto con la citotoxina. Después de internalizar el ADC, se libera el fármaco citotóxico y este elimina a la célula o impide la replicación vírica. Debido a su direccionamiento, el fármaco tiene idealmente menos efectos secundarios y proporciona una ventana terapéutica más amplia que otros agentes.
Un enlace estable entre el anticuerpo y el agente citotóxico o antivírico es un aspecto crucial de un ADC. Los enlazadores se basan en motivos químicos que incluyen disulfuros, hidrazonas o péptidos (escindibles) o tioéteres (no escindibles) y controlan la distribución y el suministro del agente citotóxico a la célula diana. Se ha demostrado que los enlazadores de tipo escindible y no escindible son seguros en ensayos preclínicos y clínicos. Brentuximab vedotina incluye un enlazador escindible sensible a enzimas que suministra un potente agente antimicrotúbulos potente y altamente tóxico, monometil auristatina E o MMAE, un agente antineoplásico sintético, dirigido contra células malignas específicas positivas a CD30 humano. Debido a su alta toxicidad, la m Ma E, que inhibe la división celular bloqueando la polimerización de la tubulina, no puede usarse como fármaco quimioterapéutico en monoterapia. Sin embargo, la combinación de MMAE unido a un anticuerpo monoclonal anti-CD30 (cAC10, una proteína de la membrana celular del factor de necrosis tumoral o el receptor de TNF) ha demostrado ser estable en el fluido extracelular, escindible por catepsina y seguro en terapia. Trastuzumab emtansina, el otro ADC aprobado, es una combinación del inhibidor de la formación de microtúbulos, la mertansina (DM-1), un derivado de la maitansina y el anticuerpo trastuzumab (Herceptin®/Genentech/Roche) unidos mediante un enlazador estable no escindible.
La disponibilidad de enlazadores mejores y más estables ha cambiado la función del enlace químico. El tipo de enlazador, escindible o no escindible, proporciona propiedades específicas al fármaco citotóxico (anticanceroso). Por ejemplo, un enlazador no escindible mantiene el fármaco dentro de la célula. Como resultado, el anticuerpo completo, el enlazador y el agente citotóxico entran en la célula de cáncer diana, donde se degrada el anticuerpo a nivel de aminoácidos. El complejo resultante, aminoácidos, enlazador y agente citotóxico, se convierte en el fármaco activo. Por el contrario, los enlazadores escindibles se catalizan por las enzimas en la célula hospedadora, donde libera al agente citotóxico.
Otro tipo de enlazador escindible, actualmente en desarrollo, añade una molécula adicional entre el fármaco citotóxico o antivírico y el sitio de escisión. Esta tecnología de enlazadores permite a los investigadores crear ADC con más flexibilidad sin preocuparse acerca de cambiar la cinética de escisión. Los investigadores también están desarrollando un nuevo método de escisión peptídica basándose en la degradación de Edman, un método de secuenciación de aminoácidos en un péptido. El desarrollo de ADC en el futuro apunta a que también incluirá el desarrollo de conjugación de sitio específico (TDC) para mejorar adicionalmente la estabilidad y el índice terapéutico y los inmunconjugados emisores de partículas a y nanopartículas conjugadas con anticuerpos.
H. BiTE
Las moléculas de acoplamiento a linfocitos T biespecíficas (BiTE) son una clase de anticuerpos monoclonales biespecíficos que se están investigando para su uso como fármacos contra el cáncer. Dirigen el sistema inmunitario del hospedador, más específicamente la actividad citotóxica de los linfocitos T, contra células infectadas.BiTEes una marca registrada de Micromet AG.
Los BiTE son proteínas de fusión que consisten en dos fragmentos variables monocatenarios (scFv) de diferentes anticuerpos o secuencias de aminoácidos de cuatro genes diferentes en una sola cadena peptídica de aproximadamente 55 kilodalton. Uno de los scFv se une a los linfocitos T a través del receptor CD3 y el otro a una célula infectada a través de una molécula específica.
Al igual que otros anticuerpos biespecíficos, y a diferencia de los anticuerpos monoclonales convencionales, los BiTE forman un enlace entre los linfocitos T y las células diana. Esto hace que los linfocitos T ejerzan su actividad citotóxica/antivírica en las células infectadas mediante la producción de proteínas, tales como perforina y granzimas, de manera independiente de la presencia de moléculas del MHC I o coestimuladoras. Estas proteínas entran en las células infectadas e inician la apoptosis de las células. Esta acción imita procesos fisiológicos observados durante el ataque de los linfocitos T contra células infectadas.
I. Intracuerpos
En una realización particular, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante que es adecuado para actuar dentro de una célula; dichos anticuerpos se conocen como "intracuerpos". Estos anticuerpos pueden interferir con la función de la diana mediante diversos mecanismos, tales como alterando el tráfico de proteínas intracelulares, interfiriendo con la función enzimática y bloqueando las interacciones entre proteínas o entre proteínas y ADN. En muchos sentidos, sus estructuras imitan o establecen paralelismos con las de los anticuerpos monocatenarios y de un solo dominio analizados anteriormente. De hecho, una característica importante es un solo transcrito/una sola cadena, que permite la expresión intracelular en una célula diana y también hace que sea más factible el tránsito de la proteína a través de las membranas celulares. Sin embargo, se necesitan características adicionales.
Los dos principales problemas que afectan a la implementación del agente terapéutico del intracuerpo son el suministro, incluido el direccionamiento a células/tejidos, y la estabilidad. Con respecto a la administración, se han empleado diversas estrategias, tales como la administración dirigida a tejido, el uso de promotores específicos de tipo celular, el suministro basado en virus y el uso de péptidos de permeabilidad de membrana/translocación de membrana. Con respecto a la estabilidad, la estrategia es generalmente o bien detectar sistemáticamente mediante fuerza bruta, incluidos métodos que implican la presentación en fagos y que pueden incluir la maduración de la secuencia o el desarrollo de secuencias consenso, o modificaciones más dirigidas, tales como la inserción de secuencias estabilizantes (por ejemplo, regiones Fc, secuencias de proteínas chaperonas, cremalleras de leucina) y reemplazo/modificación de disulfuro.
Una característica adicional que pueden requerir los intracuerpos es una señal de direccionamiento intracelular. Se han diseñado y se encuentran disponibles comercialmente vectores que pueden dirigir los intracuerpos (u otras proteínas) a las regiones subcelulares, tales como el citoplasma, el núcleo, las mitocondrias y el RE (Invitrogen Corp.; Persicet al.,1997).
Debido a su capacidad para entrar en las células, los intracuerpos tienen usos adicionales que pueden no lograrse con otros tipos de anticuerpos. En el caso de los presentes anticuerpos, la capacidad para interactuar con el dominio citoplasmático de MUC1 en una célula viva puede interferir con las funciones asociadas con el CD de MUC1, tales como las funciones de señalización (unión a otras moléculas) o la formación de oligómeros. En particular, se contempla que dichos anticuerpos puedan usarse para inhibir la formación de dímeros de MUC1.
J. Purificación
En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la presente divulgación pueden purificarse. El término "purificado", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a una composición, aislable de otros componentes, en donde la proteína se purifica hasta cualquier grado en relación con su estado obtenible en la naturaleza. Por tanto, una proteína purificada también se refiere a una proteína, libre del ambiente en el que puede producirse de manera natural. Cuando se usa la expresión "sustancialmente purificado", esta denominación hará referencia a una composición en la que la proteína o el péptido forma el principal componente de la composición, de tal forma que constituye aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o más de las proteínas en la composición.
Los expertos en la materia conocen bien las técnicas de purificación de proteínas. Estas técnicas implican, a un nivel, el fraccionamiento en bruto del medio celular en fracciones polipeptídicas y no polipeptídicas. Al haber separado el polipéptido de otras proteínas, el polipéptido de interés puede purificarse adicionalmente usando técnicas cromatográficas y electroforéticas para lograr la purificación parcial o completa (o la purificación hasta la homogeneidad). Los métodos analíticos particularmente adecuados para la preparación de un péptido puro son la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de exclusión, la electroforesis en gel de poliacrilamida y el isoelectroenfoque. Otros métodos para la purificación de proteínas incluyen precipitación con sulfato de amonio, PEG, anticuerpos y similares o mediante desnaturalización térmica, seguida de centrifugación; filtración en gel, fase inversa, hidroxilapatita y cromatografía de afinidad; y combinaciones de estas y otras técnicas.
Al purificar un anticuerpo de la presente divulgación, puede ser deseable expresar el polipéptido en un sistema de expresión procariota o eucariota y extraer la proteína usando condiciones desnaturalizantes. El polipéptido puede purificarse a partir de otros componentes celulares usando una columna de afinidad, que se une a una porción marcada del polipéptido. Como es generalmente bien sabido en la técnica, se cree que el orden de ejecución de las diversas etapas de purificación puede cambiarse o que pueden omitirse ciertas etapas y seguir obteniendo como resultado un método adecuado para la preparación de una proteína o un péptido sustancialmente purificado.
Comúnmente, los anticuerpos completos se fraccionan utilizando agentes (es decir, proteína A) que se unen a la porción Fc del anticuerpo. Como alternativa, pueden usarse antígenos para purificar y seleccionar simultáneamente anticuerpos adecuados. Dichos métodos normalmente utilizan el agente de selección unido a un soporte, tal como una columna, filtro o perla. Los anticuerpos se unen a un soporte, se eliminan los contaminantes (por ejemplo, por lavado) y se liberan los anticuerpos aplicando condiciones (sal, calor, etc.).
Los expertos en la técnica conocerán, a la vista de la presente divulgación, diversos métodos para cuantificar el grado de purificación de la proteína o el péptido. Estos incluyen, por ejemplo, determinar la actividad específica de una fracción activa o evaluar la cantidad de polipéptidos en una fracción mediante análisis de SDS/PAGE. Otro método para evaluar la pureza de una fracción es calcular la actividad específica de la fracción, compararla con la actividad específica del extracto inicial y de este modo, calcular el grado de pureza. Las unidades reales usadas para representar la cantidad de actividad dependerá, obviamente, de la técnica de ensayo particular elegida para seguir la purificación y de si la proteína o el péptido expresado muestra o no una actividad detectable.
Se sabe que la migración de un polipéptido puede variar, en ocasiones de manera significativa, con las diferentes condiciones de la SDS/PAGE (Capaldiet al.,1977). Por tanto, será evidente que en diferentes condiciones de electroforesis, pueden variar los pesos moleculares aparentes de los productos de expresión purificados o parcialmente purificados.
111. Inmunización activa/pasiva y tratamiento/prevención de la infección por SARS-CoV-2
A. Formulación y administración
La presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprende anticuerpos dirigidos contra el virus SARS-CoV-2 y antígenos para generar los mismos. Dichas composiciones comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento del mismo o un inmunógeno peptídico y un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o listado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y más particularmente, en seres humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, excipiente o vehículo con el que se administra el agente terapéutico. Dichos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los de derivados de petróleo o de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un portador particular, cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También se pueden emplear soluciones salinas y soluciones de glicerol y dextrosa acuosa como portadores líquidos, particularmente para las soluciones inyectables. Otros excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares.
Si se desea, la composición también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes o agentes tamponantes del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación prolongada y similares. Otras formulaciones pueden incluir portadores estándar, tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Los ejemplos de agentes farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences". Dichas composiciones contendrán una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz del anticuerpo o el fragmento del mismo, preferentemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador, a fin de proporcionar la forma para la administración adecuada al paciente. La formulación debe ser adecuada para el modo de administración, que puede ser oral, intravenoso, intraarterial, intrabucal, intranasal, nebulizada, inhalación bronquial, intrarrectal, vaginal, tópica o administrarse mediante ventilación mecánica.
También se prevén vacunas activas, donde los anticuerpos como los divulgados se producenin vivoen un sujeto en riesgo de contraer infección por el SARS-CoV-2. Dichas vacunas pueden formularse para administración parenteral, por ejemplo, formularse para inyección por vía intradérmica, intravenosa, intramuscular, subcutánea o incluso peritoneal. Se contempla la administración por vía intradérmica e intramuscular. Como alternativa, la vacuna puede administrarse por una vía tópica directamente a la mucosa, por ejemplo, mediante gotas nasales, inhalación, mediante nebulizador o mediante administración intrarrectal o vaginal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de ácidos y aquellas que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos, tales como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con grupos carboxilo libres también pueden proceder de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico y bases orgánicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína y similares.
La transferencia pasiva de anticuerpos, conocida como inmunidad pasiva adquirida artificialmente, normalmente no implicará el uso de inyecciones intravenosas o intramusculares. Las formas del anticuerpo pueden ser plasma sanguíneo o suero animal o humano, en forma de inmunoglobulina humana mezclada para uso intravenoso (IVIG) o intramuscular (IG), como IVIG o IG humana de alta concentración de pacientes inmunizados o de donantes que se recuperan de la enfermedad y en forma de anticuerpos monoclonales (mAb). Dicha inmunidad normalmente dura un breve periodo de tiempo y también existe el riesgo de posibles reacciones de hipersensibilidad y enfermedad del suero, especialmente causada por gamma globulinas de origen no humano. Sin embargo, la inmunidad pasiva proporciona protección inmediata. Los anticuerpos se formularán en un portador adecuado para inyección, es decir, estéril e inyectable con una jeringa.
En general, los ingredientes de las composiciones de la divulgación se suministran o bien por separado o se mezclan en una forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, en forma de un polvo liofilizado seco o de un concentrado sin agua en un recipiente cerrado herméticamente, tal como una ampolla o bolsita que indica la cantidad del agente activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, se puede dispensar con una botella de infusión que contenga solución salina o agua de calidad farmacéutica estéril. Cuando la composición se va a administrar por inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o de solución salina de modo que se puedan mezclar los ingredientes antes de la administración.
Las composiciones de la divulgación pueden formularse como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones, tales como los procedentes de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellas formadas con cationes, tales como los derivados de los hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio y férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.
2. ADCC
La citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) es un mecanismo inmunitario que da lugar a la lisis de las células diana recubiertas de anticuerpo por células efectoras inmunitarias. Las células diana son células a las que se unen específicamente anticuerpos o fragmentos de los mismos que comprenden una región Fc, generalmente por la parte de la proteína que se encuentra en N-terminal en la región Fc. Por "anticuerpo que tiene citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) aumentada/reducida" se entiende un anticuerpo que tiene ADCC aumentada/reducida, según se determina mediante cualquier método adecuado conocido por los expertos habituales en la materia.
Como se usa en el presente documento, la expresión "ADCC aumentada/reducida" se define como un aumento o reducción en el número de células diana que se lisan en un momento determinado, a una concentración determinada del anticuerpo en el medio que rodea a las células diana, mediante el mecanismo de ADCC definido anteriormente y/o una reducción o aumento en la concentración del anticuerpo, en el medio que rodea a las células diana, necesaria para lograr la lisis de un número determinado de células diana en un tiempo determinado, mediante el mecanismo de ADCC. El aumento/reducción en la ADCC es en relación con la ADCC mediada por el mismo anticuerpo producido por el mismo tipo de células hospedadoras, usando los mismos métodos de producción, purificación, formulación y conservación estándar (que son métodos conocidos por los expertos en la materia), pero que no se han modificado por ingeniería genética. Por ejemplo, el aumento en la ADCC mediada por un anticuerpo producido por células hospedadoras modificadas por ingeniería genética para que tengan un patrón de glucosilación alterado (por ejemplo, para que exprese la glicosiltransferasa GnTIII u otras glicosiltransferasas) mediante los métodos descritos en el presente documento, es en relación con la ADCC mediada por el mismo anticuerpo producido por el mismo tipo de células hospedadoras no modificadas por ingeniería genética.
3. CDC
La citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) es una función del sistema de complemento. Es el proceso en el sistema inmunitario que elimina a los patógenos dañando sus membranas sin la implicación de anticuerpos o células del sistema inmunitario. Existen tres procesos principales. Los tres insertan uno o más complejos de ataque a la membrana (MAC) en el patógeno, lo que provoca un hinchamiento osmótico por coloides letal, es decir, la CDC. Es uno de los mecanismos mediante los que los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo tienen un efecto antivírico.
IV. Conjugados de anticuerpo
Los anticuerpos de la presente divulgación pueden unirse a al menos un agente para formar un conjugado de anticuerpo. A fin de aumentar la eficacia de las moléculas de anticuerpo como agentes de diagnóstico o terapéuticos, es convencional enlazar o unir covalentemente o complejar al menos una molécula o resto deseado. Dicha molécula o resto puede ser, pero sin limitación, al menos una molécula efectora o indicadora. Las moléculas efectoras comprenden moléculas que tienen una actividad deseada, por ejemplo, actividad citotóxica. Los ejemplos no limitantes de moléculas efectoras que se han unido a anticuerpos incluyen toxinas, agentes antitumorales, enzimas terapéuticas, radionúclidos, agentes antivíricos, agentes quelantes, citocinas, factores de crecimiento y oligo o polinucleótidos. Por el contrario, una molécula indicadora se define como cualquier esto que pueda detectarse usando un ensayo. Los ejemplos no limitantes de moléculas indicadoras que se han conjugado a anticuerpos incluyen enzimas, radiomarcadores, haptenos, marcadores fluorescentes, moléculas fosforescentes, moléculas quimioluminiscentes, cromóforos, moléculas de fotoafinidad, partículas o ligandos coloreados, tales como biotina.
En general se prefieren conjugados de anticuerpo para su uso como agentes de diagnóstico. Los diagnósticos con anticuerpos se asocian a dos clases, aquellas para su uso en los diagnósticosin vitro,tal como en diversos inmunoensayos y aquellos para su uso en protocolos de diagnósticoin vivo,lo que generalmente se conoce como "formación de imágenes dirigida por anticuerpos". Se conocen en la técnica diversos agentes de formación de imágenes adecuados, así como métodos para su unión a anticuerpos (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos 5,021,236, 4,938,948 y 4,472,509). Los restos de formación de imágenes pueden ser iones paramagnéticos, isótopos radiactivos, fluorocromos, sustancias detectables por RMN y agentes de formación de imágenes por rayos X.
En el caso de los iones paramagnéticos, se pueden mencionar a título enunciativo iones tales como cromo(III), manganeso(II), hierro(III), hierro(II), cobalto(II), níquel(II), cobre(II), neodimio(III), samario(III), iterbio(III), gadolinio(lII), vanadio(II), terbio(III), disprosio(III), holmio(III) y/o erbio(lII), prefiriéndose particularmente el gadolinio. Los iones útiles en otros contextos, tales como formación de imágenes por rayos X, incluyen, pero sin limitación, lantano(III), oro(III), plomo(II) y especialmente, bismuto(III).
En el caso de isótopos radiactivos para aplicaciones terapéuticas y/o de diagnóstico, se podrían mencionar astato211, 14carbono, 51cromo, 36cloro, 57cobalto, 58cobalto, cobre67, 152Eu, galio67, 3hidrógeno, yodo123, yodo125, yodo131, indio111, 59hierro, 32fósforo, renio186, renio188, 75selenio, 35azufre, tecnecio99m y/o itrio90. Normalmente se prefiere 125I para su uso en ciertas realizaciones y normalmente también se prefiere tecnecio99m y/o indio111 debido a su baja energía e idoneidad para detección a larga distancia. Los anticuerpos monoclonales marcados radiactivamente de la presente divulgación pueden producirse de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden yodarse poniéndolos en contacto con yoduro de sodio y/o potasio y un agente oxidante químico, tal como hipoclorito de sodio o un agente oxidante enzimático, tal como lactoperoxidasa. Los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la divulgación pueden marcarse con tecnecio99m mediante un proceso de intercambio de ligandos, por ejemplo, reduciendo el pertecnato con solución estannosa, quelando el tecnecio reducido en una columna Sephadex y aplicando el anticuerpo a esta columna. Como alternativa, pueden usarse técnicas de marcaje directo, por ejemplo, incubando pertecnato, un agente reductor, tal como SNCh, una solución tampón, tal como solución de ftalato de sodio-potasio y el anticuerpo. Los grupos funcionales intermedios que normalmente se usan para unir radioisótopos que existen en forma de iones metálicos a anticuerpos, son el ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
Entre los marcadores fluorescentes contemplados para su uso como conjugados se incluyen Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascade Blue, Cy3, Cy5,6-FAM, isotiocianato de fluoresceína, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, verde de rodamina, rojo de rodamina, renografina, ROX, TAMRA, TET, tetrametilrodamina y/o rojo Texas.
Los tipos adicionales de anticuerpos contemplados en la presente divulgación son los previstos principalmente para su usoin vitro,donde el anticuerpo se une a un ligando de unión secundario y/o a una enzima (un marcador enzimático) que generará un producto coloreado tras entrar en contacto con un sustrato cromogénico. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen ureasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa de hidrógeno (de rábano picante) o glucosa oxidasa. Los ligandos de unión secundarios preferidos son biotina y avidina y compuestos de estreptavidina. El uso de dichos marcadores se conoce bien por los expertos en la materia y se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos 3,817,837, 3,850,752, 3,939,350, 3,996,345, 4,277,437, 4,275,149 y 4,366,241.
Otro método conocido más de unión de sitio específico de las moléculas a anticuerpos comprende la reacción de los anticuerpos con marcadores de afinidad a base de hapteno. Esencialmente, los marcadores de afinidad a base de hapteno reaccionan con aminoácidos en el sitio de unión a antígeno, destruyendo de este modo este sitio y bloqueando la reacción específica de antígeno. Sin embargo, esto puede no ser ventajoso debido a que da como resultado la pérdida de unión al antígeno por el conjugado de anticuerpo.
Las moléculas que contienen grupos azido también pueden usarse para formar enlaces covalentes en proteínas mediante intermedios de nitreno reactivos que se generan mediante luz ultravioleta de baja intensidad (Potter y Haley, 1983). En particular, se han usado análogos de 2 y 8-azido nucleótidos de purina como fotosondas de sitio dirigido para identificar proteínas de unión a nucleótidos en extractos celulares en bruto (Owens y Haley, 1987; Athertonet al.,1985). Los 2 y 8-azido nucleótidos también se han usado para cartografiar dominios de unión a nucleótidos de proteínas purificadas (Khatoonet al.,1989; Kinget al.,1989; Dholakiaet al.,1989) y pueden usarse como agentes de unión a anticuerpos.
Se conocen en la técnica varios métodos para la unión o conjugación de un anticuerpo a su resto conjugado. Algunos métodos de acoplamiento incluyen el uso de un complejo de quelato de metal que emplea, por ejemplo, un agente quelante orgánico, tal como anhídrido del ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA); ácido etilentriaminotetraacético; N-cloro-p-toluenosulfonamida; y/o tetracloro-3a-6a-difenilglucouril-3 unido al anticuerpo (Patentes de los Estados Unidos 4,472,509 y 4,938,948). También pueden hacerse reaccionar los anticuerpos monoclonales con una enzima en presencia de un agente de acoplamiento, tal como glutaraldehído o peryodato. Los conjugados de marcadores de fluoresceína se preparan en presencia de estos agentes de acoplamiento o mediante reacción con un isotiocianato. En la Patente de los Estados Unidos 4,938,948, se logra la formación de imágenes de tumores mamarios usando anticuerpos monoclonales y los restos de formación de imágenes detectables se unen al anticuerpo usando enlazadores, tales como metil-phidroxibencimidato o N-succinimidil-3-(4-hidroxifenil)propionato.
En otras realizaciones, se contempla la derivatización de inmunoglobulinas introduciendo de manera selectiva grupos sulfhidrilo en la región Fc de una inmunoglobulina, usando condiciones de reacción que no alteran el sitio de combinación con el anticuerpo. Se divulgan conjugados de anticuerpo producidos de acuerdo con esta metodología para mostrar longevidad, especificidad y sensibilidad mejoradas (Patente de los Estados Unidos 5,196,066, incorporada al presente documento por referencia). La unión de sitio específico de moléculas efectoras o indicadoras, en donde la molécula indicadora o efectora se conjuga a un resto de carbohidrato en la región Fc, también se ha divulgado en la bibliografía (O'Shannessyet al.,1987). Se ha comunicado que esta estrategia proporciona anticuerpos prometedores desde el punto de vista diagnóstico y terapéutico que en la actualidad se encuentran en evaluación clínica.
V. Métodos de inmunodetección
En otras realizaciones adicionales de la divulgación pero no parte de la invención, la presente divulgación se refiere a métodos de inmunodetección para unir, purificar, eliminar, cuantificar y de otro modo generalmente detectar el SARS-CoV-2 y sus antígenos asociados. Aunque dichos métodos pueden aplicarse en un sentido tradicional, otro uso será en el control de cantidad y la monitorización de soluciones madre de vacuna y otros virus, donde los anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación pueden usarse para evaluar el grado de integridad (es decir, la estabilidad a largo plazo) de los antígenos en los virus. Como alternativa, los métodos pueden usarse para detectar sistemáticamente diversos anticuerpos por sus perfiles de reactividad adecuada/deseada.
Otros métodos de inmunodetección incluyen ensayos específicos para determinar la presencia del SARS-CoV-2 en un sujeto. Se contempla una gran variedad de formatos de ensayo, pero específicamente aquellos que podrían usarse para detectar el SARS-CoV-2 en un fluido obtenido de un sujeto, tal como saliva, sangre, plasma, esputo, semen u orina. En particular, se ha demostrado que el semen es una muestra viable para detectar el SARS-CoV-2 (Purpuraet al.,2016; Mansuyet al.,2016; Barzonet al.,2016; Gornetet al.,2016; Duffyet al.,2009; CDC, 2016; Halfonet al.,2010; Elderet al.2005). Los ensayos pueden formatearse ventajosamente para uso no hospitalario (a domicilio), incluidos ensayos de flujo lateral (véase más adelante) similares a las pruebas de embarazo domésticas. Estos ensayos pueden envasarse en forma de un kit con reactivos adecuados e instrucciones para permitir el uso por el sujeto o un familiar.
Algunos métodos de inmunodetección incluyen ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), ensayo inmunorradiométrico, fluoroinmunoensayo, ensayo quimioluminiscente, ensayo bioluminiscente y transferencia de Western, solo por mencionar algunos. En particular, también se proporciona un ensayo competitivo para la detección y cuantificación de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 dirigidos contra epítopos parasitarios específicos en las muestras. Se han descrito las etapas de diversos métodos de inmunodetección útiles en la bibliografía científica, tal como, por ejemplo, Doolittle y Ben-Zeev (1999), Gulbis y Galand (1993), De Jageret al.(1993) y Nakamuraet al.(1987). En general, los métodos de inmunotransferencia incluyen obtener una muestra que se sospecha que contiene SARS-CoV-2 y poner en contacto la muestra con un primer anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación, según sea el caso, en condiciones eficaces para permitir la formación de inmunocomplejos.
Estos métodos incluyen métodos para purificar el SARS-CoV-2 o antígenos relacionados de una muestra. El anticuerpo se unirá preferentemente a un soporte sólido, tal como en forma de una matriz de columna y se aplicará la muestra que se sospecha que contiene el SARS-CoV-2 o un componente antigénico al anticuerpo inmovilizado. Los componentes no deseados se lavarán de la columna, dejando el antígeno del SARS-CoV-2 en inmunocomplejo con el anticuerpo inmovilizado, que después se recoge retirando el organismo o antígeno de la columna.
Los métodos de unión inmunológica también incluyen métodos para detectar y cuantificar la cantidad de SARS-CoV-2 o componentes relacionados en una muestra y la detección y cuantificación de cualquier complejo inmunitario formado durante el proceso de unión. En este caso, se podría obtener una muestra que se sospecha que contiene SARS-CoV-2 o sus antígenos y poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se une al SARS-CoV-2 o a componentes del mismo, seguido de la detección y cuantificación de la cantidad de complejos inmunitarios formados en las condiciones específicas. En términos de detección del antígeno, la muestra biológica analizada puede ser cualquier muestra que se sospeche que contiene SARS-CoV-2 o antígeno del SARS-CoV-2, tal como una sección o espécimen de tejido, un extracto de tejido homogeneizado, un fluido biológico, que incluye sangre y suero o una secreción, tal como heces u orina.
La puesta en contacto de la muestra biológica seleccionada con el anticuerpo en condiciones eficaces y durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de complejos inmunitarios (complejos inmunitarios primarios) es generalmente cuestión de simplemente añadir la composición de anticuerpo a la muestra e incubar la mezcla durante un periodo de tiempo lo suficientemente largo como para que los anticuerpos formen complejos inmunitarios, es decir, se unan, al SARS-CoV-2 o a los antígenos presentes. Transcurrido este tiempo, la composición de muestra-anticuerpo, tal como una sección de tejido, placa de ELISA, transferencia por puntos o transferencia de Western, se lavará generalmente para eliminar cualquier especie de anticuerpo no unida de manera específica, permitiendo la detección de únicamente aquellos anticuerpos unidos específicamente en los complejos inmunitarios primarios.
En general, la detección de la formación de inmunocomplejos se conoce bien en la técnica y puede lograrse mediante la aplicación de numerosas estrategias. En general, estos métodos se basan en la detección de una etiqueta o marcador, tal como cualquiera de las etiquetas radiactivas, fluorescentes, biológicas y enzimáticas. Las patentes relacionadas con el uso de dichas etiquetas incluyen las Patentes de los Estados Unidos 3,817,837, 3,850,752, 3,939,350, 3,996,345, 4,277,437, 4,275,149 y 4,366,241. Obviamente, se pueden encontrar ventajas adicionales mediante el uso de un ligando de unión secundario, tal como un segundo anticuerpo y/o un conjunto de unión de ligando de biotina/avidina, como es sabido en la técnica.
El anticuerpo empleado en la detección puede ligarse en sí a un marcador detectable, en donde se detectaría simplemente esta etiqueta, permitiendo de este modo determinar la cantidad de los complejos inmunitarios primarios en la composición. Como alternativa, el primer anticuerpo que se une a los complejos inmunitarios primarios pueden detectarse mediante un segundo ligando de unión, que tiene afinidad de unión por el anticuerpo. En estos casos, el segundo ligando de unión puede unirse a un marcador detectable. El segundo ligando de unión es normalmente en sí mismo un anticuerpo, que puede denominarse de este modo un anticuerpo "secundario". Los complejos inmunitarios primarios se ponen en contacto con el ligando de unión o el anticuerpo marcado, en condiciones eficaces y durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de complejos inmunitarios secundarios. Posteriormente, se lavan los complejos inmunitarios secundarios para eliminar cualquier anticuerpo o ligando secundario marcado no unido específicamente y después se detecta el marcador restante en los complejos inmunitarios secundarios.
Los métodos adicionales incluyen la detección de los complejos inmunitarios primarios mediante una estrategia en dos pasos. Un segundo ligando de unión, tal como un anticuerpo que tiene afinidad de unión por el anticuerpo, se usa para formar complejos inmunitarios secundarios, como se ha descrito anteriormente. Después del lavado, los complejos inmunitarios secundarios se ponen en contacto con un tercer ligando o anticuerpo de unión que tiene afinidad de unión por el segundo anticuerpo, nuevamente en condiciones eficaces y durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de complejos inmunitarios (complejos inmunitarios terciarios). El tercer ligando o anticuerpo se une a un marcador detectable, permitiendo la detección de los complejos inmunitarios terciarios formados de este modo. Este sistema puede posibilitar la amplificación de la señal, si se desea.
Un método de inmunodetección emplea dos anticuerpos diferentes. Se usa un primer anticuerpo biotinilado para detectar el antígeno diana y después, se usa un anticuerpo secundario para detectar la biotina unida a la biotina complejada. En dicho método, la muestra que se va a analizar se incuba en primer lugar en una solución que contiene el anticuerpo de la primera etapa. En caso de que el antígeno diana esté presente, parte del anticuerpo se une al antígeno para formar un complejo de anticuerpo biotinilado/antígeno. El complejo de anticuerpo/antígeno se amplifica posteriormente mediante incubación en soluciones sucesivas de estreptavidina (o avidina), ADN biotinilado y/o ADN biotinilado complementario, en donde cada etapa adicional añade sitios de biotina adicionales al complejo de anticuerpo/antígeno. Las etapas de amplificación se repiten hasta que se logra un nivel adecuado de amplificación, y una vez alcanzado este punto, se incuba la muestra en una solución que contiene el anticuerpo de la segunda etapa dirigido contra biotina. Este anticuerpo de la segunda etapa se marca, por ejemplo, con una enzima que puede usarse para detectar la presencia del complejo de anticuerpo/antígeno mediante histoenzimología usando un sustrato de cromógeno. Con una amplificación adecuada, puede producirse un conjugado que sea macroscópicamente visible.
Otro método de inmunodetección conocido aprovecha la metodología de la inmuno-PCR (reacción en cadena de la polimerasa). El método de la PCR es similar al método Cantor hasta la incubación con ADN biotinilado, aunque en lugar de usar múltiples rondas de incubación con estreptavidina y ADN biotinilado, el complejo de ADN/biotina/estreptavidina/anticuerpo se elimina por lavado con un tampón a pH bajo o alta salinidad que libera el anticuerpo. La solución de lavado resultante se usa posteriormente para llevar a cabo una reacción PCR con cebadores adecuados con controles adecuados. Al menos en teoría, puede utilizarse la enorme capacidad de amplificación y la especificidad de la PCR para detectar una sola molécula de antígeno.
A. ELISA
Los inmunoensayos, en su sentido más simple y directo, son ensayos de unión. Determinados inmunoensayos preferidos son los diversos tipos de ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA) y los radioinmunoensayos (RIA) conocidos en la técnica. La detección inmunohistoquímica que usa secciones de tejido también es particularmente útil. Sin embargo, se apreciará fácilmente que la detección no se limita a dichas tecnologías y también pueden usarse transferencia de Western, transferencia por puntos, análisis FACS y similares.
En un ELISA ilustrativo, los anticuerpos de la divulgación se inmovilizan sobre una superficie seleccionada que muestra afinidad por la proteína, tal como un pocillo en una placa de microtitulación de poliestireno. Posteriormente, se añade a los pocillos una composición de ensayo que se sospecha que contiene el SARS-CoV-2 o un antígeno del SARS-CoV-2. Después de la unión y el lavado para eliminar los complejos inmunitarios no unidos específicamente, puede detectarse el antígeno unido. La detección puede lograrse mediante la adición de otro anticuerpo anti-SARS-CoV-2 que está unido a un marcador detectable. Este tipo de EILISA es un "ELISA sándwich" simple. También puede lograrse la detección mediante la adición de un segundo anticuerpo anti-SARS-CoV-2, seguido de la adición de un tercer anticuerpo que tiene afinidad de unión por el segundo anticuerpo, uniéndose el tercer anticuerpo a un marcador detectable.
En otro ELISA detectable, se inmovilizan las muestras sospechosas de contener el SARS-CoV-2 o el antígeno del SARS-CoV-2 sobre la superficie del pocillo y después se ponen en contacto con los anticuerpos anti-SARS-CoV-2 de la divulgación. Después de la unión y el lavado para eliminar los complejos inmunitarios no unidos específicamente, se detectan los anticuerpos anti-SARS-CoV-2 unidos. Cuando los anticuerpos anti-SARS-CoV-2 iniciales se unen a un marcador detectable, los complejos inmunitarios pueden detectarse directamente. Nuevamente, los complejos inmunitarios pueden detectarse usando un segundo anticuerpo que tiene afinidad de unión por el primer anticuerpo anti-SARS-CoV-2, estando el segundo anticuerpo unido a un marcador detectable.
Independientemente del formato empleado, los ELISA tienen determinadas características en común, tales como recubrimiento, incubación y unión, lavado para eliminar las especies no unidas específicamente y detectar los complejos inmunitarios unidos. Estas se describen más adelante.
Al recubrir una placa con antígeno o anticuerpo, generalmente se incubarán los pocillos de la placa con una solución del antígeno o el anticuerpo, o bien durante una noche o durante un periodo especificado de horas. Posteriormente se lavarán los pocillos de la placa para eliminar el material adsorbido de manera incompleta. Posteriormente, se "recubren" las superficies restantes disponibles de los pocillos con una proteína no específica, que es antigénicamente neutra con respecto a los antisueros de ensayo. Estas incluyen seroalbúmina bovina (BSA), caseína o soluciones de leche en polvo. El recubrimiento permite el bloqueo de los sitios de adsorción no específicos sobre la superficie inmovilizada y de este modo, reduce el fondo producido por la unión no específica de los antisueros a la superficie.
En los ELISA, es probablemente más habitual usar un medio de detección secundario o terciario, en lugar de un procedimiento directo. Por tanto, tras la unión de una proteína o anticuerpo al pocillo, el recubrimiento con un material no reactivo para reducir el fondo y el lavado para eliminar el material no unido, la superficie inmovilizada se pone en contacto con la muestra biológica que se va a analizar en condiciones eficaces para permitir la formación del complejo inmunitario (antígeno/anticuerpo). La detección del complejo inmunitario requiere posteriormente un ligando o anticuerpo de unión secundario marcado y un ligando o anticuerpo de unión secundario junto con un anticuerpo terciario marcado o un tercer ligando de unión.
"En condiciones eficaces para permitir la formación de complejos inmunitarios (antígeno/anticuerpo)" significa que las condiciones incluyen preferentemente diluir los antígenos y/o anticuerpos con soluciones, tales como BSA, gamma globulina bovina (BGG) o solución salina tamponada con fosfato (PBS)/Tween. Estos agentes añadidos también tienden a ayudar en la reducción del fondo no específico.
Las condiciones "adecuadas" también significan que la incubación es a una temperatura o durante un periodo de tiempo suficientes para permitir la unión efectiva. Las etapas de incubación son normalmente de aproximadamente 1 a 2 a 4 horas o similares, a temperaturas preferentemente en el intervalo de 25 °C a 27 °C, o pueden ser durante una noche a 4 °C o similares.
Después de todas las etapas de incubación en un ELISA, la superficie contactada se lava para eliminar el material no complejado. Un procedimiento de lavado preferido incluye lavado con una solución, tal como PBS/Tween o tampón borato. Después de la formulación de complejos inmunitarios específicos entre la muestra de ensayo y el material unido originalmente y el posterior lavado, puede determinarse la aparición de cantidades incluso insignificantes de complejos inmunitarios.
A fin de proporcionar medios de detección, el segundo o el tercer anticuerpo tendrá un marcador asociado para permitir la detección. Preferentemente, este será una enzima que generará un revelado de color tras la incubación con un sustrato cromogénico adecuado. Por tanto, por ejemplo, se puede desear poner en contacto o incubar el primer o el segundo complejo inmunitario con un anticuerpo conjugado a ureasa, glucosa oxidasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa de hidrógeno durante un periodo de tiempo y en condiciones que favorecen el desarrollo de formación de complejos inmunes adicionales (por ejemplo, incubación durante 2 horas a temperatura ambiente en una solución que contiene PBS, tal como PBS-Tween).
Tras la incubación con el anticuerpo marcado y después del lavado para eliminar el material no unido, se cuantifica la cantidad de marcador, por ejemplo, mediante incubación con un sustrato cromogénico, tal como urea o púrpura de bromocresol o ácido 2,2'-azino-di-(3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS) o H2O2, en el caso de usar peroxidasa como marcador enzimático. Posteriormente se logra la cuantificación midiendo el grado de color generado, por ejemplo, usando un espectrofotómetro de espectros visibles.
En otra realización de la divulgación pero no parte de la invención, la presente divulgación contempla el uso de formatos competitivos. Esto es particularmente útil para la detección de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 en la muestra. En los ensayos basados en competición, se determina una cantidad desconocida de analito o anticuerpo por su capacidad para desplazar una cantidad conocida de anticuerpo o analito marcado. Por tanto, la pérdida cuantificable de una señal es una indicación de la cantidad de anticuerpo o analito desconocido en una muestra.
En este caso, los inventores proponen el uso de anticuerpos monoclonales marcados dirigidos contra el SARS-CoV-2 para determinar la cantidad de anticuerpos dirigidos contra el SARS-CoV-2 en una muestra. El formato básico podría incluir poner en contacto una cantidad conocida del anticuerpo monoclonal contra el SARS-CoV-2 (unido a un marcador detectable) con antígenos o partículas de SARS-CoV-2. El antígeno u organismo del SARS-CoV-2 está unido preferentemente a un soporte. Después de la unión del anticuerpo monoclonal marcado al soporte, se añade la muestra y se incuba en condiciones que permiten que cualquier anticuerpo no marcado en la muestra compita con, y de este modo desplace, al anticuerpo monoclonal marcado. Al medir o bien el marcador perdido o el marcador restante (y restando esto de la cantidad original de marcador unido), se puede determinar la cantidad de anticuerpo no marcado que se une al soporte y de este modo, la cantidad de anticuerpo que estaba presente en la muestra.
B. T ransferencia de Western
La transferencia de Western (como alternativa, inmunotransferencia de proteínas) es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada o en un homogeneizado o extracto de tejido. Emplea electroforesis en gel para separar las proteínas naturales o desnaturalizadas según la longitud del polipéptido (condiciones desnaturalizantes) o según la estructura en 3-D de la proteína (condiciones nativas/no desnaturalizantes). Posteriormente, se transfieren las proteínas a una membrana (normalmente nitrocelulosa o PVDF), donde se sondan (detectan) usando anticuerpos específicos para la proteína diana.
Pueden tomarse muestras de tejidos completos o de cultivo celular. En la mayoría de casos, en primer lugar se rompen los tejidos sólidos por medios mecánicos usando una trituradora (para los volúmenes de muestra de mayor tamaño), usando un homogeneizador (volúmenes más pequeños) o mediante ultrasonidos. También pueden romperse las células mediante uno de los métodos mecánicos anteriores. Sin embargo, cabe destacar que las muestras de bacterias, virus o ambientales pueden ser la fuente de proteínas y por tanto, la transferencia de Western no se restringe únicamente a estudios celulares. Pueden emplearse detergentes, sales y tampones seleccionados para favorecer la lisis de células y para solubilizar proteínas. Los inhibidores de proteasa y fosfatasa normalmente se añaden para prevenir la digestión de la muestra por sus propias enzimas. La preparación de tejidos normalmente se efectúa a temperaturas frías para evitar la desnaturalización de las proteínas.
Las proteínas de la muestra se separan usando electroforesis en gel. La separación de proteínas puede ser mediante el punto isoeléctrico (pI), el peso molecular, la carga eléctrica o una combinación de estos factores. La naturaleza de la separación depende del tratamiento de la muestra y la naturaleza del gel. Esta es una manera muy útil para determinar una proteína. También es posible usar un gel en dos dimensiones (2-D), que dispersa las proteínas de una sola muestra en dos dimensiones. Las proteínas se separan de acuerdo con su punto isoeléctrico (pH al que tienen una carga neta neutra) en la primera dimensión y según su peso molecular en la segunda dimensión.
A fin de hacer que las proteínas sean accesibles a la detección por anticuerpos, se mueven del gel a una membrana de nitrocelulosa o difluoruro de polivinilideno (PVDF). La membrana se coloca sobre el gel y sobre esto se coloca una pila de papeles de filtro. La pila completa se coloca en una solución tampón que se mueve en dirección ascendente por el papel por acción capilar, arrastrando con ello las proteínas. Otro método para transferir las proteínas se denomina electrotransferencia y emplea una corriente eléctrica para arrastrar las proteínas del gel a la membrana de PVDF o de nitrocelulosa. Las proteínas se mueven del gel a la membrana, mientras que mantienen la organización que tenían en el gel. Como resultado de este proceso de transferencia, las proteínas se exponen sobre una fina capa superficial para la detección (véase más adelante). Ambas variedades de membrana se seleccionan por sus propiedades de unión a proteínas no específicas (es decir, se une igualmente bien a todas las proteínas). La unión a proteínas se basa en las interacciones hidrófobas, así como en las interacciones cargadas entre la membrana y la proteína. Las membranas de nitrocelulosa son más baratas que las de PVDF, pero son mucho más frágiles y no soportan bien los sondados repetidos. La uniformidad y eficacia general de la transferencia de proteína del gel a la membrana puede comprobarse mediante la tinción de la membrana con los colorantes azul brillante de Coomassie o Ponceau S. Una vez se han transferido, las proteínas se detectan usando anticuerpos primarios marcados o anticuerpos primarios no marcados, seguido de detección indirecta usando proteína A marcada o anticuerpos secundarios marcados que se unen a la región Fc de los anticuerpos primarios.
C. Ensayos de flujo lateral
Los ensayos de flujo lateral, también conocidos como ensayos inmunocromatográficos de flujo lateral, son dispositivos sencillos pensados para detectar la presencia (o ausencia) de un analito diana en una muestra (matriz) sin necesidad de equipos especializados y costosos, aunque existen muchas aplicaciones de laboratorio que están soportadas por equipos de lectura. Normalmente, estas pruebas se usan como diagnósticos médicos con recursos limitados, o bien para pruebas a domicilio, análisis en el punto de atención o uso en laboratorios. Una aplicación ampliamente difundida y bien conocida es la prueba de embarazo domiciliaria.
La tecnología se basa en una serie de lechos capilares, tales como trozos de papel poroso o polímero sinterizado. Cada uno de estos elementos tiene la capacidad de transportar fluido (por ejemplo, orina) de manera espontánea. El primer elemento (el receptáculo de la muestra) actúa como esponja y retiene el exceso de fluido de la muestra. Una vez que se ha empapado, el fluido migra al segundo elemento (receptáculo conjugado), en el que el fabricante ha almacenado el denominado conjugado, un formato seco de partículas bioactivas (véase más adelante) en una matriz de sal-azúcar que contiene todo lo necesario para garantizar una reacción química optimizada entre la molécula diana (por ejemplo, un antígeno) y su compañero químico (por ejemplo, anticuerpo), que se ha inmovilizado sobre la superficie de la partícula. Aunque el fluido de la muestra disuelve la matriz de sal-azúcar, también disuelve las partículas y en una acción de transporte combinado, la muestra y la mezcla de conjugado mientras fluye a través de la estructura porosa. De este modo, el analito se une a las partículas, mientras migra adicionalmente a través del tercer lecho capilar. Este material tiene una o más áreas (normalmente denominadas tiras) donde el fabricante ha inmovilizado una tercera molécula. En el momento en que la mezcla de muestra-conjugado alcanza estas tiras, el analito se ha unido a la partícula y la tercera molécula "de captura" se une al complejo. Transcurrido un tiempo, cuando ha pasado más fluido por las tiras, se acumulan las partículas y el área de la tira cambia de color. Normalmente hay al menos dos tiras: una (el control) que captura cualquier partícula y de este modo muestra las condiciones de reacción y que la tecnología ha funcionado de manera adecuada, la segunda contiene una molécula de captura específica y captura únicamente aquellas partículas sobre las que se ha inmovilizado una molécula de analito. Después de atravesar estas zonas de reacción, el fluido entra en el material poroso final, la mecha, que actúa simplemente como un depósito de desechos. Las pruebas de flujo lateral pueden funcionar como ensayos competitivos o en sándwich. Se divulgan ensayos de flujo lateral en la Patente de los Estados Unidos 6,485,982.
D. Inmunohistoquímica
Los anticuerpos de la presente divulgación también pueden usarse junto con bloques de tejidos frescos congelados y/o fijados en formalina e incluidos en parafina preparados para el estudio mediante inmunohistoquímica (IHC). El método para preparar los bloques de tejido a partir de estos especímenes en partículas se ha usado con éxito en estudios de IHC anteriores de diversos factores pronósticos y es bien conocido por los expertos en la materia (Brownet al.,1990; Abbondanzoet al.,1990; Allredet al.,1990).
Brevemente, pueden prepararse secciones congeladas rehidratando 50 ng de tejido congelado "pulverizado" a temperatura ambiente en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en pequeñas cápsulas de plástico; sedimentar las partículas mediante centrifugación; resuspenderlas en un medio de inclusión viscoso (OCT); invertir la cápsula y/o sedimentar nuevamente mediante centrifugación; congelar inmediatamente en isopentano a -70 °C; cortar la cápsula de plástico y/o eliminar el cilindro de tejido congelado; fijar el cilindro de tejido sobre un micrótomo con criostato; y/o cortar 25-50 secciones seriadas de la cápsula. Como alternativa, pueden usarse muestras de tejido completo congelado para cortes de sección seriados.
Pueden prepararse secciones permanentes mediante un método similar que implica rehidratar los 50 mg de muestra en un tubo de microcentrifugación de plástico; resuspender en formalina al 10 % durante 4 horas de fijación; lavar/sedimentar; resuspender en agar templado al 2.5 %; sedimentar; enfriar en hielo para endurecer el agar; eliminar el bloque de tejido/agar del tubo; infiltrar y/o incluir el bloque en parafina; y/o cortar hasta 50 secciones permanentes seriadas. Nuevamente, pueden sustituirse muestras de tejido completas.
E. Kits de inmunodetección
En otras realizaciones adicionales de la divulgación pero no parte de la invención, la presente divulgación se refiere a kits de inmunodetección para su uso con los métodos de inmunodetección descritos anteriormente. Ya que los anticuerpos pueden usarse para detectar el SARS-CoV-2 o antígenos del SARS-CoV-2, los anticuerpos pueden incluirse en el kit. Los kits de inmunodetección comprenderán, por tanto, en medios recipientes adecuados, un primer anticuerpo que se une al SARS-CoV-2 o a un antígeno del SARS-CoV-2 y opcionalmente, un reactivo de inmunodetección.
En ciertas realizaciones de la divulgación pero no parte de la invención, el anticuerpo contra el SARS-CoV-2 puede estar previamente unido a un soporte sólido, tal como una matriz de columna y/o un pocillo de una placa de microtitulación. Los reactivos de inmunodetección del kit pueden adoptar una de diversas formas, incluidas las de marcadores detectables que están asociados o unidos al anticuerpo concreto. También se contemplan marcadores detectables que se asocian o están unidos a un ligando de unión secundario. Los ligandos secundarios ilustrativos son aquellos anticuerpos secundarios que tienen afinidad de unión por el primer anticuerpo.
Los reactivos de inmunodetección adecuados para su uso en los presentes kits incluyen el reactivo en dos componentes que comprende un anticuerpo secundario que tiene afinidad de unión por el primer anticuerpo, junto con un tercer anticuerpo que tiene afinidad de unión por el segundo anticuerpo, en donde el tercer anticuerpo está unido a un marcador detectable. Como se ha indicado anteriormente, se conocen en la técnica diversos marcadores ilustrativos y todos estos marcadores pueden emplearse en relación con la presente divulgación.
Los kits pueden comprender además una composición separada de manera adecuada en partes alícuotas del SARS-CoV-2 o de antígenos del SARS-CoV-2, ya esté marcado o no marcado, que pueden usarse para preparar una curva patrón para un ensayo de detección. Los kits pueden contener conjugados de anticuerpo-marcador ya se encuentren en forma completamente conjugada, en forma de intermedios o como restos separados que se conjugan por el usuario del kit. Los componentes de los kits pueden envasarse o bien en medios acuosos o en forma liofilizada.
Los medios contenedores de los kits incluirán generalmente al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringa u otro medio contenedor, en el que puede ponerse el anticuerpo o preferentemente, separarse en partes alícuotas adecuadas. Los kits de la presente divulgación también incluirán normalmente un medio para contener el anticuerpo, el antígeno y cualquier otro contenedor de reactivo en confinamiento cerrado para su comercialización. Dichos contenedores pueden incluir contenedores de plástico moldeados por inyección o soplado en los que se conservan los viales deseados.
F. Ensayos de control de calidad de la vacuna y el antígeno
La presente divulgación también contempla el uso de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo como se describen en el presente documento para su uso en la evaluación de la integridad antigénica de un antígeno vírico en una muestra. Los productos medicinales biológicos, como las vacunas, difieren de los fármacos químicos en que normalmente no pueden caracterizarse molecularmente; los anticuerpos son moléculas de gran tamaño significativamente complejas y tienen la capacidad de variar ampliamente de una preparación a otra. También se administran a individuos sanos, incluidos niños al poco de nacer y por tanto, debe hacerse gran énfasis en su calidad para garantizar, en el mayor grado posible, que son eficaces para prevenir o tratar enfermedades potencialmente mortales, sin que por sí mismos causen daño.
La globalización creciente en la producción y distribución de vacunas ha abierto nuevas posibilidades para gestionar mejor los problemas de salud pública, pero también ha suscitado cuestiones acerca de la equivalencia y el uso indistinto de vacunas producidas de diversas fuentes. La estandarización internacional de las materias primas, de la producción y de los análisis de control de calidad y el establecimiento de elevadas expectativas para el control regulatorio acerca de cómo se fabrican y usan estos productos, ha sido la piedra angular para un éxito continuo. Sin embargo, sigue siendo un campo de cambios constantes y los constantes avances técnicos en el campo ofrecen la promesa de desarrollar armas nuevas y potentes contra las amenazas de salud pública más antiguas, así como contra las nuevas, la malaria, las pandemias de gripe y el VIH, por nombrar solo algunas, pero también imponen mucha presión en los fabricantes, las agencias reguladoras y la comunidad médica en general para garantizar que los productos siguen cumpliendo los máximos estándares de calidad obtenibles.
Por tanto, se puede obtener un antígeno o vacuna de cualquier fuente o en cualquier momento durante un proceso de fabricación. Los procesos de control de calidad pueden comenzar, por tanto, preparando una muestra para in inmunoensayo que identifica la unión de un anticuerpo o fragmento divulgado en el presente documento a un antígeno vírico. Dichos inmunoensayos se divulgan en otras partes del presente documento y puede usarse cualquiera de estos para evaluar la integridad estructural/antigénica del antígeno. Las agencias reguladoras pueden establecer estándares para observar que la muestra contiene cantidades aceptables de antígenos antigénica correctos e intactos.
Otra realización importante de la divulgación pero no parte de la invención donde se evalúa la integridad antigénica es para determinar el periodo de validez y la estabilidad durante la conservación. La mayoría de medicinas, incluidas las vacunas, pueden deteriorarse con el paso del tiempo. Por lo tanto, resulta crítico determinar si, con el paso del tiempo, un antígeno, tal como en una vacuna, se degrada o desestabiliza, de tal forma que deja de ser antigénico y/o capaz de generar una respuesta inmunitaria cuando se administra a un sujeto. Nuevamente, las agencias reguladoras pueden establecer estándares para observar que la muestra contiene cantidades aceptables de antígenos antigénicamente intactos.
En ciertas realizaciones de la divulgación pero no parte de la invención, los antígenos víricos pueden contener más de un epítopo protector. En estos casos, puede resultar útil emplear ensayos que observan la unión de más de un anticuerpo, tal como 2, 3, 4, 5 o incluso más anticuerpos. Estos anticuerpos se unen a epítopos estrechamente relacionados, de tal forma que se encuentran adyacentes o incluso se solapan entre sí. Por otra parte, pueden representar epítopos distintos de partes distintas del antígeno. Al examinar la integridad de múltiples epítopos, puede lograrse una visión de conjunto más completa acerca de la integridad general del antígeno y por tanto, de la capacidad para generar una respuesta inmunitaria protectora.
Los anticuerpos y fragmentos de los mismos como se describen en la presente divulgación también pueden usarse en un kit para controlar la eficacia de los procedimientos de vacunación detectando la presencia de anticuerpos protectores contra el SARS-CoV-2. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o variantes y derivados de los mismos, como se describen en la presente divulgación, también pueden usarse en un kit para controlar la fabricación de una vacuna con la inmunogenicidad deseada.
G. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se incluyen a fin de demostrar realizaciones preferidas. Los expertos en la materia apreciarán que las técnicas divulgadas en los ejemplos a continuación representan técnicas descubiertas por los inventores que funcionan bien en la práctica de las realizaciones y por tanto, puede considerarse que representan modos de ponerla en práctica preferidos. Sin embargo, los expertos en la materia, a la vista de la presente divulgación, apreciarán que pueden efectuarse diversos cambios en las realizaciones específicas que se divulgan y se sigue obteniendo un resultado igual o similar.
Ejemplo 1 - Sinergia de anticuerpos
En el presente documento, la sinergia se define como una mayor actividad neutralizante mediada por un cóctel de dos mAb cuando se compara con la mediada por mAb individuales a la misma concentración total(in vitro)o dosis(in vivo)de los anticuerpos. Para evaluar si dos mAb son sinérgicos en un cóctel para neutralizar el SARS-CoV-2, los inventores usaron una estrategia anteriormente notificada para cuantificar la sinergia (Ianevski A, He L, Aittokallio T, Tang J.Bioinformatics.33, 2413-2415, 2017). Para evaluar la significación del efecto beneficioso de combinar los mAb, las respuestas de combinación observadas (matriz de dosis-respuesta) se compararon con las respuestas esperadas calculadas mediante modelos de puntuación de sinergia (Ianevski A, He L, Aittokallio T, Tang J.Bioinformatics.33, 2413 2415, 2017). La neutralización del virus se midió en una prueba de neutralización de reducción de focos (FRNT) convencional que usa SARS-CoV-2 de tipo silvestre y monocapas de cultivo de células Vero-E2. Los mAb individuales COV2-2196 y COV2-2130 se mezclaron a diferentes concentraciones para evaluar la actividad neutralizante de diferentes relaciones de los mAb en el cóctel. Específicamente, se mezclaron diluciones de factor siete del mAb COV2-2130 (comenzando a 500 ng/ml) con cada una de nueve diluciones del mAb COV2-2196 (comenzando a 500 ng/ml) en un volumen total de 50 |jl por cada condición y después se incubaron con 50 |jl de SARS-CoV-2 activo en medio de cultivo celular (medio RPMI-1640 suplementado con FBS al 2 %) antes de su aplicación a células Vero-E2 confluentes cultivadas en placas de 96 pocillos. Los valores de control incluyeron aquellos de la dosis-respuesta de la actividad neutralizante medida por separado para los mAb COV2-2196 y COV2-2130 individuales que se evaluaron a las mismas dosis que en cóctel (véanse las FIG. 1-3). Cada medición se efectuó por duplicado. Los inventores calcularon a continuación el porcentaje de neutralización del virus para cada condición y después calcularon el valor de la puntuación de sinergia, lo que definió la interacción entre estos dos mAb en el cóctel como sinérgica (puntuación de sinergia = 17.4). Nota: una puntuación de sinergia menor de -10 indica antagonismo, una puntuación de -10 a 10 indica un efecto aditivo y una puntuación mayor de 10 indica un efecto sinérgico. El ejemplo en las FIG. 1-3 muestra la matriz de dosis-respuesta y demuestra que una dosis combinada del mAb de 79 ng/ml en el cóctel (16 ng/ml de COV2-2196 y 63 ng/ml de COV2-2130) tenía la misma actividad que 250 ng/ml de cada mAb individual. Esta observación demuestra que el cóctel, puede reducirse la dosis más de 3 veces para lograr la misma potencia en la neutralización del virus.
Para evaluar la eficacia terapéutica del tratamiento, los inventores probaron en primer lugar el mAb COV2-2196 o COV2-2130 o su combinación 1:1 usando el modelo de exposición a MA-SARS-CoV-2. Todos los tratamientos redujeron el virus infeccioso en los pulmones, como se midió mediante el título de placas del tejido pulmonar a los 2 días después de la inoculación del virus. El tratamiento con el cóctel administrado a una dosis de 400 jg/ratón (~20 mg/kg) fue el más eficaz, ya que redujo significativamente la carga pulmonar hasta 3 x 104 veces; 4 de los 5 animales de este grupo de tratamiento dejaron de tener virus infeccioso en el pulmón (FIG. 4A). De manera similar, el tratamiento de los ratones con pulmones transducidos con un adenovirus recombinantes para expresar el receptor ACE2 humano del SARS-CoV-2 (AdV-hACE2) con 400 jg/ratón del cóctel de mAb 12 h después de la exposición a SARS-CoV-2 auténtico reveló la neutralización completa del virus en los pulmonesin vivo(FIG. 4B). La expresión de los genes de citocinas y quimiocinas INF-<y>, IL-6, CXCL10 y CCL2, que son indicadores de la inflamación, también se redujeron en los pulmones de los ratones tratados con el cóctel de mAb cuando se comparó con los pulmones de ratones tratados con el control de isotipo (FIG. 4C). En conjunto, estos resultados sugirieron una eficacia del tratamiento después de la exposición mediada por el cóctel de COV2-2196 COV2-2130 en los modelos de exposición al SARS-CoV-2 en ratones.
Ejemplo 2 - Estudios de exposición de primates no humanos
Producción y purificación del mAb.Las secuencias de los mAb que se habían sintetizado (Twist Bioscience) y clonado en un vector de expresión monocistrónico de IgG1 (denominado pTwist-mCis_G1) se usaron para la secreción de mAb en cultivos de células de mamífero. Este vector contiene una secuencia 2A mejorada y un enlazador GSG que permite la expresión simultánea de los genes de cadena pesada y ligera del mAb a partir de una sola construcción tras la transfección1. Los inventores describieron con anterioridad la expresión a microescala de mAb en 1 ml de cultivos de ExpiCHO en placas de 96 pocillos2. Para la expresión del mAb a mayor escala, los inventores llevaron a cabo la transfección (de 1 a 300 ml por anticuerpo) de los cultivos de células CHO usando el sistema de expresión y el protocolo de Gibco™ ExpiCHO™ para tubos mini biorreactores de 50 ml (Corning) como se describe por el proveedor. Se purificaron sobrenadantes de cultivo usando HiTrap MabSelect Sure (Cytiva, anteriormente GE Healthcare Life Sciences) en un sistema de cromatografía de proteínas de 24 columnas paralelas (Protein BioSolutions). Se intercambió el tampón de los mAb purificados a PBS, se concentraron usando unidades de filtro para centrifugación Amicon® Ultra-450KDa (Millipore Sigma) y se conservaron a 4 °C hasta su uso. Los mAb purificados se analizaron rutinariamente para determinar las concentraciones de endotoxina, que se observó que eran de <1 UE/mg de IgG para los estudios de NHP. Las pruebas de endotoxinas se efectuaron usando el cartucho PTS201F (Charles River), con un intervalo de sensibilidad de 10 a 0.1 UE/ml, y un instrumento Endosafe Nexgen-MCS (Charles River).
Los inventores evaluaron la eficacia protectora de los mAb usando un modelo de exposición de primates no humanos (NHP) al SARS-CoV-2 recientemente descrito34. Para este modelo, los inventores analizaron como monoterapia COV2-2196, un mAb neutralizante codificado por los mismos segmentos génicos variables que COV2-2196, pero que emplea un número notable de diferencias de aminoácidos en la HCDR3 y la LCDR3. Los animales recibieron una dosis de 50 mg/kg del mAb COV2-2196 o del mAb de control de isotipo por vía intravenosa en el día -3 y después se les expuso por vía intranasal e intratraqueal en el día 0 a una dosis de 1.1 * 104 UFP de SARS-CoV-2. Después de la exposición, los inventores evaluaron el ARN vírico mediante RT-qPCR en lavados broncoalveolares (BAL) y exudados nasofaríngeos. Se observaron altas concentraciones de ARN vírico subgenómico en los NHP tratados con mAb de control de isotipo, con una mediana de pico de 7.53 (rango de 5.37 a 8.23) log-m copias de ARN/hisopo en el exudado nasofaríngeo y una mediana de pico de 4.97 (rango de 3.81 a 5.24) logio copias de ARN/ml en el BAL. El ARN vírico subgenómico no se detectó en muestras del grupo de tratamiento con mAb (LOD = 50 [1.7 logio] copias de ARN/hisopo o por ml), lo que muestra protección. Un análisis farmacocinético reveló concentraciones estables de los mAb humanos en circulación en los NHP.
Estudio de exposición en NHP.Los estudios de investigación en NHP siguieron los principios indicados en la octava edición de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. La instalación donde se llevó a cabo esta investigación (Bioqual Inc., Rockville, MD) está completamente acreditada por la Asociación internacional para la evaluación y acreditación del cuidado de animales de laboratorio (AAALAC, por sus siglas en inglés) y tiene una Oficina del bienestar de animales de laboratorio aprobada. Los estudios en NHP se efectuaron de conformidad con todas las regulaciones locales, estatales y federales y fueron aprobadas por la Junta institucional de cuidado y uso de animales (IACUC, por sus siglas en inglés) pertinente.
Se estudiaron ocho macacos cangrejeros adultos sanos(Macaca mulatta)de origen indio (de 5 a 15 kg de peso corporal). Los animales fueron asignados aleatoriamente al grupo de tratamiento con mAb anti-SARS-CoV-2 (n = 4 por grupo) y un grupo de control (tratado con isotipo) (n = 4 por grupo). Los animales recibieron una dosis de 50 mg/kg del mAb COV2-2196 o de mAb de control de isotipo por vía intravenosa en el día -3 y después se les expuso a los tres días a 1.1 * 104 UFP de SARS-CoV-2, administradas en 1 ml por vía i.n. y 1 ml por vía intratraqueal. Después de la exposición, se evaluó el ARN vírico mediante RT-qPCR en el lavado broncoalveolar y los exudados nasofaríngeos en múltiples puntos de tiempo como se describe56. Se efectuaron exámenes físicos en todos los animales. Además, se controló a diario a los animales con un protocolo de puntuación interno aprobado por la Junta institucional de cuidado y uso de animales. Estos estudios no estaban enmascarados.
Detección de los mAb humanos en circulación en suero de NHP.Se recubrieron placas de ELISA durante una noche a 4 °C con 1 |jg/ml de anticuerpo secundario de cabra anti-IgG humana (H+L) (preadsorbido en mono) (Novus Biological) y después se bloqueó durante 2 h. Las muestras de suero se analizaron en diluciones de factor 3 comenzando a una dilución 1:3 en diluyente Blocker Casein en PBS (ThermoFisher). Las muestras se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente y después se retiraron y se lavaron las placas. Después, se incubaron los pocillos durante 1 h con anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado a HRP (preadsorbido en mono) (Southern Biotech) a una dilución 1:4,000. Después, se lavaron los pocillos y se incubaron con sustrato de peroxidasa para micropocillos SureBlue Reserve TMB (Seracare) (100 jl/pocillo) durante 3 min, seguido de soluciones de paro de<t>M<b>(Seracare) para detener la reacción (100 jl/pocillo). Las microplacas se leyeron a 450 nm. Las concentraciones de los mAb humanos se interpolaron a partir del intervalo lineal de las curvas patrón de IgG humana (Sigma) purificada usando el programa informático Prism, versión 8.0 (GraphPad).
Ejemplo 3 - Materiales y métodos para el ejemplo 4
Expresión y purificación de dominio de unión a receptor recombinante (RBD) de la proteína espícula del SARS-CoV-2.Se optimizaron para su expresión los segmentos de ADN correspondientes al RBD de la proteína S (restos 319 -528), se sintetizaron y se clonaron en el plásmido de ADN de expresión pTwist-CMV cadena abajo del péptido de señal de IL-2 (MYRMQLLSClALSLALVTNS) (Twist Bioscience). Se incorporaron un enlazador de tres aminoácidos (GSG) y un marcador His en el extremo C-terminal de las construcciones de expresión para facilitar la producción de proteínas. Las células Expi293F se transfectaron transitoriamente con el plásmido que codificaba el RBD y se cosecharon los sobrenadantes de cultivo después de 5 días. El RBD se purificó a partir de los sobrenadantes mediante cromatografía de afinidad de níquel con columnas HisTrap Excel (GE Healthcare Life Sciences). Para la producción de proteína usada en los ensayos de cristalización, se incluyó kifunensina 5 jM en el medio de cultivo para producir RBD rico en glicanos de manosa. Las glicoproteínas ricas en manosas se trataron posteriormente con endoglicosidasa F1 (Millipore) para obtener RBD homogéneamente desglucosilado.
Expresión y purificación de los Fab COV2-2196 y COV2-2130 recombinantes.Se sintetizaron los fragmentos de ADN correspondientes a los dominios variables de cadena pesada de COV2-2196 y COV2-2130 con el dominio CH1 de IgG1 humana y los dominios variables de cadena ligera con el dominio constante de cadena kappa y se clonaron en el vector pTwist (Twist Bioscience). Este vector incluye la cadena pesada de cada Fab, seguida de un enlazador GGGGS, un sitio de escisión de furina, un sitio de escisión ribosómica t 2a y la cadena ligera de cada Fab. La expresión de la cadena pesada y la cadena ligera está impulsada por el mismo promotor de CMV. Los Fab COV2-2196 y COV2-2130 se expresaron en células ExpiCHO mediante transfección transitoria con el plásmido de expresión. El Fab recombinante se purificó del sobrenadante de cultivo usando una columna CaptureSelect anti-CH1 (Thermo Fisher Scientific). Para el complejo de RBD/COV2-2196, se usó la secuencia detsde COV2-2196 para la expresión. Para el complejo RBD/COV2-2196/COV2-2130 se usó una versión modificada del Fab COV2-2196 en el que se mutaron los primeros dos aminoácidos de la región variable de QM a EV.
Cristalización y determinación estructural de los complejos de anticuerpo-antígeno.El Fab COV2-2196 purificado se mezcló con RBD desglucosilado a una relación molar de 1:1.5 y la mezcla se purificó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaños con una columna Superdex-200 Increase (GE Healthcare Life Sciences) para obtener el complejo de anticuerpo-antígeno. Para obtener el complejo triple de RBD/COV2-2196/COV2-2130, se mezcló el RBD purificado y desglucosilado con los Fab COV2-2196 y COV2-2130 a una relación molar de 1:15:1.5 y el complejo triple se purificó con una columna Superdex-200 Increase. Los complejos se concentraron a aproximadamente 10 mg/ml y se sometieron a ensayos de cristalización. El complejo RBD/COV2-2196 se cristalizó en PEG 3350 al 16 % - 18 %, Tris-<H>a<0.2 a pH 8.0 - 8.5, y el complejo RBD/COV2-2196/COV2-2130 se cristalizó en PEG 1000 al 5 % (p/v), fosfato de>sodio dibásico 100 mM/ácido cítrico a pH 4.2, reactivo de alcohol al 40 % (v/v). La solución de crioprotección se preparó mezclando la solución de cristalización con glicerol al 100 % a una relación de volumen de 20:7 para los cristales de ambos complejos. Los cristales de proteína se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido después de sumergirlos rápidamente en solución crioprotectora. Se recogieron los datos de difracción en el haz 21-ID-F para el complejo r Bd /COV2-2196 y 21-ID-G para el complejo RBD/COV2-2196/COV2-2130 en el Advanced Photon Source. Los datos de difracción se procesaron con XDS58 y la suite CCP459 Las estructuras cristalinas se resolvieron mediante reemplazo molecular usando la estructura de RBD en complejo con el Fab CC12.1 (PDB ID 6XC2) y la estructura del Fab de MR78 (PDB ID 5JRP) con el programa Phaser60. Las estructuras se refinaron y reconstruyeron manualmente con Phenix61 o Coot62, respectivamente. Los modelos se han depositado en el Protein Data Bank. Se usó el programa informático PyMOL63 para producir todas las figuras estructurales.
Experimentos de espectrometría de masas de hidrógeno y deuterio (HDX-MS).Los experimentos de HDX-MS se llevaron a cabo usando un robot de manejo de muestras automatizado (LEAp technologies, Fort Lauderdale, FL, EE.UU.) acoplado a un sistema de LC Acquity de clase M y el gestor HDX (Waters Ltd., Wilmslow, R. U.). Se añadieron 7.6 |jl de trímero de espícula S2P del SARS-CoV-24.3 jM o bien solo o con una relación molar 1:1.12 de AZD1061 o AZD8895 a 52.4 j l de tampón de marcaje (fosfato de potasio 50 mM, pD 6.2) y se incubó durante 1 min a 20 °C. Después de la incubación, se añadieron 50 j l de esta muestra a 50 j l de solución de inactivación (fosfato de potasio 50 mM, TCEP 200 mM, Gdn-HCl 2 M, pH 2.3) a 1 °C. Se hicieron pasar 50 j l de muestra inactivada a través de una columna de BEH pepsina inmovilizada (Waters Ltd., Wilmslow, R. U.) a 20 °C a 100 j l min'1 (~4,000 psi) durante 4 min antes de atrapar los péptidos resultantes usando una columna previa Vanguard, columna de atrapamiento Acquity UPLC BEH C18 (1.7 jm , 2.1 mm x 5 mm, Waters Ltd., Wilmslow, R. U.). Después de girar la válvula, se separaron los péptidos a 1 °C mediante elución de gradiente del 0 al 35 % de MeCN (ácido fórmico al 0.2 %v/v)en H2O (ácido fórmico al 0.2 %v/v)a lo largo de 6 minutos a 40 j l min_1 usando una columna analítica Acquity UPLC BEH C18 (1.7 jm , 1 mm x 100 mm). Los péptidos se analizaron un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion (Thermo Fisher, Bremen, Alemania) que funcionaba en el modo de detección orbitrap a una resolución de 120K (muestras deuteradas) o el modo orbitrap-iontrap DDA (t = 0 muestras). Los datos de EM/e M del péptido usados para identificar péptidos se analizaron usando BioPharma Finder v3.0 (Thermo Fisher, Bremen, Alemania) y la captación de deuterio se cuantificó usando HDExaminer v2.0 (Sierra Analytitcs). Los resultados de la mezcla de péptido y la tabla resumen de la captación exportada en csv del programa HDExaminer se reformatearon usando un script propio en R para generar las figuras de las gráficas de captación y las matrices cromáticas estructurales usando PAVED (Universidad de Leeds)64.
ELISA de unión de mutantes de COV2-2196.Se recubrieron los pocillos de placas de microtitulación de 384 pocillos con proteína S 6P del SARS-CoV-2 recombinante a 4 °C durante una noche. Las placas se bloquearon con leche desnatada al 2 % y suero de cabra normal al 2 % en DPBS que contenía Tween-20 al 0.05 % (DPBS-T) durante 1 h. Los anticuerpos se diluyeron a 10 jg/m l y se valoraron por partida doble 23 veces en DPBS-T y se añadieron a los pocillos, seguido de una incubación durante 1 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos unidos se detectaron usando anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con peroxidasa de rábano picante (Southern Biotech) y sustrato TMB (Thermo Fisher Scientific). Las reacciones se inactivaron con ácido clorhídrico 1 N y se midió la absorbancia a 450 nm usando un espectrofotómetro (Biotek).
Mapeo de todas las mutaciones que escapan a la unión del anticuerpo.Todas las mutaciones que escapan a la mutación de anticuerpos se mapearon mediante una estrategia de DMS41. Los inventores emplearon bibliotecas mutantes de RBD de presentación en levadura previamente descritas4142. Brevemente, se construyeron bibliotecas duplicadas mutantes en el dominio de unión a receptor (RBD) de la proteína espícula del SARS-CoV-2 (aislado Wuhan-Hu-1, número de referencia de GenBank MN908947. restos N331-T531) y contienen 3,804 de las 3,819 posibles mutaciones de aminoácidos, con >95 % presente como mutantes individuales. Cada variante de RBD se unió a una secuencia de código de barras única de 16 nucleótidos para facilitar la secuenciación posterior. Como se ha descrito anteriormente, las bibliotecas se seleccionaron para la expresión de RBD y la unión a ACE2 para eliminar las variantes de RBD que están completamente mal plegadas o no funcionales (es decir, que carecen de una afinidad de unión modesta a ACE241).
Se llevaron a cabo experimentos de mapeo de escape de anticuerpos en replicados biológicos usando dos bibliotecas de RBD mutante independientes, como se ha descrito anteriormente41, con modificaciones menores. En resumen, se lavaron bibliotecas de levadura mutantes en las que se indujo la expresión de RBD y se incubaron con anticuerpo a 400 ng/ml durante 1 h a temperatura ambiente con agitación suave. Después de las incubaciones con anticuerpos, las bibliotecas se marcaron secundariamente con anticuerpo anti-MYC conjugado a FITC a 1:100 (Immunology Consultants Lab, CYMC-45F) para marcar la expresión del RBD y con anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado a PE a 1:200 (Jackson ImmunoResearch 109-115-098) para marcar el anticuerpo unido. Se usó clasificación por citometría de flujo para enriquecer las células que expresan variantes de RBD con unión de anticuerpo reducida mediante una ventana de selección establecida para capturar las células de SARS-CoV-2 no mutado marcadas al 1 % de la concentración de anticuerpo de las muestras de la biblioteca. Para cada muestra, se procesaron en el citómetro aproximadamente 10 millones de células RBD+. Las células que habían escapado al anticuerpo se cultivaron durante una noche en SD-CAA (6.7 g/l de base de nitrógeno de levadura, 5.0 g/l de casaminoácidos, 1.065 g/l de MES ácido, y dextrosa al 2%p/v) para expandir las células antes de la extracción del plásmido.
Las muestras de plásmido se prepararon mediante preselección y cultivos durante una noche de células que habían escapado al anticuerpo (Plásmido de levadura Zymoprep MiniprepII) como se ha descrito anteriormente41. Las secuencias de código de barras de 16 nucleótidos que identifican cada RBD variante se amplificaron mediante la PCR y se secuenciaron en un dispositivo Illumina HiSeq 2500 con lecturas de un solo extremo de 50 pb como se ha descrito4142.
Las fracciones de escape se calcularon como se ha descrito41, con modificaciones menores como se indican a continuación. Los inventores usaron el paquete dms_variants (jbloomlab.github.io/dms_variants/, versión 0.8.2) para procesar las secuencias de Illumina en los recuentos de cada variante de RBD con código de barras en cada clasificación previa y población de escape de anticuerpo usando la tabla de consulta /RBD anteriormente descrita65.
Para cada selección de anticuerpo, los inventores calcularon la "fracción de escape" para cada variante marcada con código de barras usando los recuentos de secuenciación profunda para cada variante en las poblaciones originales y de escape de anticuerpo y la fracción total de la biblioteca que escapó a la unión del anticuerpo mediante una fórmula descrita anteriormente41. Estas fracciones de escape representan la fracción estimada de células que expresan dicha variante específica que se encuentra dentro del grupo de escape de anticuerpo, de tal forma que un valor de 0 significa que la variante siempre se une suero y un valor de 1 significa que siempre escapa de la unión al anticuerpo. Posteriormente, los inventores aplicaron un filtro computacional para eliminar las variantes con bajos recuentos de secuenciación o mutaciones altamente perjudiciales que podrían provocar el escape de anticuerpo simplemente dando lugar a una escasa expresión de RBD adecuadamente plegado en la superficie de las células de levadura4142. Específicamente, eliminaron variantes que tenían (o contenían mutaciones con) puntuaciones de unión a ACE2 < -2.35 o puntuaciones de expresión < -1, usando puntuaciones de barrido mutacional profundo a nivel de variante y de mutación, como se ha descrito anteriormente42. Obsérvese que estos criterios de filtrado son ligeramente más rigurosos que los anteriormente usados para cartografiar un panel de anticuerpos humanos41 pero son idénticos a los usados en estudios recientes que definen los restos de RBD que afectan a la unión de los mAbs65 y del suero policlonal54.
A continuación, los inventores desconvolucionaron las puntuaciones de escape a nivel de variante en estimaciones de la fracción de escape para mutaciones individuales usando modelos de epistasis global66 implementados en el paquete dms_variants, como se detalla en (jbloomlab.github.io/dms_variants/dms_variants.globalepistasis.html) como se ha descrito41. Las fracciones de escape notificadas a lo largo del artículo son la media entre las bibliotecas (las correlaciones mostradas en las FIG. 18A-B); estas puntuaciones también se encuentran en la tabla B.Los sitios de fuerte escape de cada anticuerpo para su representación en gráficas se determinaron heurísticamente como sitios cuyas puntuaciones de escape mutacional sumadas eran al menos 10 veces la mediana de la suma por sitios de la selección y dentro de 10 veces la suma por sitios del sitio más fuertemente seleccionado. La documentación completa del análisis computacional se encuentra en github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_AZ_Abs. Estos resultados también se encuentran disponibles en forma interactiva en https://jbloomlab.github.io/SARS-CoV-2-RBD_MAP_AZ_Abs/.
Experimentos de selección de escape de anticuerpo con VSV-SARS-CoV-2.Para los experimentos de selección de escape con COV2-2196 y COV2-2130, los inventores usaron un virus VSV recombinante competente para replicación que codifica la proteína espícula del SARS-CoV-2, con una eliminación C-terminal de 21 aminoácidos43. El virus VSV que expresa la espícula se propagó en células MA104 (mono verde africano, ATCC CRL-2378.1) como se ha descrito anteriormente43, y las reservas de virus se titularon en cultivos de monocapas de células Vero E6. Las placas se visualizaron usando tinción de rojo neutro. Para detectar sistemáticamente las mutaciones de escape seleccionadas en presencia de COV2-2196, COV2-2130 o un cóctel compuesto por una mezcla 1:1 de COV2-2196 y COV2-2130, los inventores usaron un ensayo de análisis celular en tiempo real (RTCA) y el analizador xCELLigence RTCA MP (ACEA Biosciences Inc.) y un esquema de selección de escape anteriormente descrito41. Brevemente, se añadieron 50 pl de medio de cultivo celular (DMEM suplementado con FBS al 2 %) a cada pocillo de una placa E de 96 pocillos para obtener una lectura de fondo. Se sembraron dieciocho mil (18,000) células Vero E6 en 50 pl de medio de cultivo celular por pocillo y las placas se colocaron sobre el analizador. Las mediciones se tomaron automáticamente cada 15 min y los sensogramas se visualizaron usando el programa informático RTCA, versión 2.1.0 (ACEA Biosciences Inc). Se mezcló virus VSV-SARS-CoV-2 (5e3 unidades formadoras de placas (UFP) por pocillo, ~0.3 MOI) con una concentración neutralizante saturante de COV2-2196, COV2-2130 o una mezcla 1:1 de anticuerpo c Ov 2-2196 y COV2-2130 (concentración total de anticuerpos de 5 pg/ml) en un volumen total de 100 pl y se incubó durante 1 h a 37 °C. A las 16 20 h después de sembrar las células, se añadieron las mezclas de virus-anticuerpo a las monocapas de células. Se incluyeron pocillos que solo contenían virus en ausencia de anticuerpo y pocillos que solo contenían células Vero E6 en medio en cada placa como controles. Las placas se midieron de manera continua (cada 15 min) durante 72 h. Las mutaciones de escape se identificaron monitorizando el índice celular para una caída en la viabilidad celular. Para verificar el escape de la selección con anticuerpo, se evaluaron los pocillos donde se observó el efecto citopático en presencia de COV2-2130 en un experimento RTCA posterior en presencia de 10 pg/ml de COV2-2130 o de COV2-2196. Tras confirmar la resistencia de los virus seleccionados a la neutralización por COV2-2130, se expandieron los aislados víricos en células Vero E6 en presencia de 10 pg/ml de COV2-2130. El ARN vírico se aisló usando un kit de extracción de ARN vírico de QiAmp (QIAGEN) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se retrotranscribió el gen de la espícula del SARS-CoV-2 y se amplificó con un kit de RT-PCR SupreScript IV One-Step (ThermoFisher Scientific) usando cebadores que flanquean al gen S. El producto de la PCR amplificado se purificó usando perlas magnéticas SPRI (Beckman Coulter) a una relación1:1y se secuenció mediante el método de Sanger, usando cebadores que proporcionaban lecturas directas e inversas del RBD.
Pase en serie y análisis del SARS-CoV-2 para seleccionar mutaciones resistentes al mAb.Se pasó en serie la cepa del SARS-CoV-2 USA-WA1/2020 en cultivos de monocapas de células Vero con AZD8895, AZD1061 o AZD7442, a concentraciones que comenzaban a sus valores de CI50 respectivos y aumentaron escalonadamente hasta su valor de CI90 con cada pase. Como control, el virus se pasó en ausencia de anticuerpo. Después del pase final, se evaluó la susceptibilidad de los virus frente al anticuerpo recíproco a una concentración final 10 veces la concentración CI90 mediante un ensayo de placa. Las placas (n = 6) se seleccionaron aleatoriamente para los cultivos de AZD1061 y se secuenció el gen que codifica la espícula del virus.
Aislamiento o generación de auténticos virus SARS-CoV-2, incluidos virus con restos variantes.El aislado UK B.1.1.7-OXF se obtuvo de un exudado nasofaríngeo de un individuo infectado en Kent, Inglaterra. Los estudios clínicos para obtener especímenes tras obtener el consentimiento informado fueron aprobados por el John Radcliffe Hospital en Oxford, R. U. La muestra se diluyó en DMEM con FBS al 2 % y se pasó a través de un filtro de 0.45 |jm antes de añadir las monocapas de células Vero-hACE2-TMPRSS2 (donadas por A. Creanga y B. Graham). Dos días después, se cosechó el sobrenadante para establecer una reserva de pase cero (p0). Se obtuvo el aislado 2019n-CoV/USA_WA1/2019 del SARS-CoV-2 de los Centros para el Control de Enfermedades de los Estados Unidos (CDC) y se pasaron en células Vero E6. Se introdujeron mutaciones puntuales individuales en el gen de la espícula (D614G y E484K/D614G) en un clon de ADNc infeccioso de la cepa 2019n-CoV/USA_WA1/2019 como se ha descrito anteriormente67. Las sustituciones de nucleótidos se introdujeron en un subclon puc57-CoV-2-F6 que contenía el gen de la espícula del clon infeccioso de tipo silvestre del SARS-CoV-268. Los clones de ADNc infecciosos de longitud completa de los virus SARS-CoV-2 variantes se ensamblaron mediante ligamientoin vitrode siete fragmentos de ADNc contiguos siguiendo el protocolo anteriormente descrito68. Posteriormente se llevó a cabo la transcripciónin vitropara sintetizar el ARN genómico de longitud completa. Para recuperar los virus mutantes, se electroporaron los transcritos de ARN en células Vero E6. Se recogieron los virus del sobrenadante de las células 40 h después y sirvieron como reservas de p0. Todas las reservas de virus se confirmaron mediante secuenciación.
Prueba de neutralización de reducción de focos.Se incubaron diluciones seriadas de los mAb con 102 unidades formadoras de focos (UFF) de diferentes cepas o variantes del SARS-CoV-2 durante 1 h a 37 °C. Los complejos de anticuerpo-virus se añadieron a los cultivos de monocapas de células Vero-hACE2-TMPRSS2 en placas de 96 pocillos y se incubaron a 37 °C durante 1 h. Posteriormente, se superpusieron las células con metilcelulosa al 1 % (p/v) en MEM suplementado con FBS al 2 %. Las placas se recolectaron 20 h después eliminando las superposiciones y se fijaron con PFA al 4 % en PBS durante 20 min a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y se incubaron en serie con una mezcla oligoclonal de mAb anti-S y anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado a HRP en PBS suplementado con saponina al 0.1 % y seroalbúmina bovina al 0.1 %. Los focos de células infectadas por SARS-CoV-2 se visualizaron usando sustrato de peroxidasa TrueBlue (KPL) y se cuantificaron en un microanalizador ImmunoSpot (Cellular Technologies).
Alineamientos de múltiples secuencias.Los inventores buscaron secuencias génicas variables de anticuerpo que daban lugar a las mismas características que codifican COV2-2196 y recuperaron las secuencias emparejadas de los repertorios de cada individuo examinado. Buscaron secuencias similares en los repertorios disponibles al público de secuencia de anticuerpo a gran escala para tres individuos sanos y repertorios de sangre de cordón umbilical (depositados en SRP174305). Los parámetros de búsqueda para la cadena pesada eran secuencias conIGHV1-58eIGHJ3con los restos P99, D108 y F110. Además, los parámetros de búsqueda para la cadena ligera eran secuencias con los restos Y92 y W98. Las secuencias de un clonotipo emparejado que pertenecían a cada uno de los individuos se alinearon o bien con ClustalO (cadenas pesadas) o con MUSCLE (cadenas ligeras). Posteriormente, se generaron las gráficas LOGO usando WebLogo.
Disponibilidad de datos y materiales:Las estructuras cristalinas comunicadas en este artículo se han depositado en el Protein Data Bank con los números de registro 7L7D y 7L7E. El depósito del archivo de lectura de secuencias para el repertorio de genes de anticuerpo se ha depositado en el NCBI: PRJNA511481. Todos los demás datos se encuentran disponibles en el texto principal o en los materiales complementarios.
Disponibilidad de programas informáticos.El proceso computacional para el análisis de exploración mutacional profunda de las mutaciones de escape de los anticuerpos está disponible en GitHub: github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_AZ_Abs. Los archivos FASTQ se encuentran en el archivo de lectura de secuencias del NCBI con el registro BioSample SAMN17532001 como parte de BioProject PRJNA639956. Las fracciones de escape por mutación se encuentran disponibles en GitHub (github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_AZ_Abs/blob/main/results/supp_data/AZ_cocktail_raw_data.csv) y en la tabla B.
Ejemplo 4 - Resultados y análisis
Se está investigando un anticuerpo basado en COV2-2196 para la profilaxis o la terapia en combinación con un anticuerpo basado en el anticuerpo específico ara RBD no competidor COV2-2130. Para comprender los detalles moleculares del reconocimiento del RBD mediante COV2-2196 y COV2-2130 y los posibles mecanismos subyacentes a la sinergia mostrada en la protección profiláctica de los dos mAb no competidores en modelos animales1, los inventores determinaron las estructuras cristalinas de la proteína S RBD en complejo con COV2-2196 a 2.50 A(FIG. 8A-E, tabla B) y en complejo con COV2-2196 y COV2-2130 a 3.00 A (FIG. 9A-F, tabla B). La estructura de RBD-COV2-2196 en el complejo RBD-COV2-2196-2130 puede superponerse con la estructura del complejo RBD-COV2-2196 (FIG. 12). El área superficial enterrada en la interfaz entre COV2-2196 y el RBD es de aproximadamente 650 A2 en ambas estructuras cristalinas y la de la interfaz entre COV2-2130 y RBD es de aproximadamente 740 A2. COV2-2196 se une al surco de unión a receptor de RBD, y COV2-2130 se une a un lado del borde de RBD alrededor del resto K444 y la región en silla del motivo de unión a receptor (RBM), que solapa al sitio de unión a ACE2 (FIG. 8A-B, FIG. 9A-B). Estas características explican la competición entre los anticuerpos y ACE2 para la unión a RBD a partir del estudio anterior de los mismos inventores, por ejemplo, tanto COV2-2196 como COV2-2130 neutralizan al virus bloqueando el acceso de RBD al receptor humano ACE21. Los restos aromáticos de las cadenas pesada y ligera de COV2-2196 forman un bolsillo hidrófobo que rodea al resto F486 de RBD y a restos adyacentes (G485, N487) (FIG. 8A, 8D y 8E; FIG. 13A-C). Este modo de interacción de Ab-Ag es infrecuente, en tanto que la formación del bolsillo de anticuerpo está provocada por una amplia separación espacial de la HCDR3 y la LCDR3. Además, aunque el sitio antigénico reconocido por COV2-2196 no se encuentra enterrado en la interfaz entre los protomeros del trímero de Sper se,COV2-2196 no tiene la capacidad de unirse a RBD en la conformación "abajo" debido a los choques estéricos con RBD en un protomero S adyacente. Por tanto, COV2-2196 solo se une a RBD en la conformación "arriba" (FIG. 8C). Las superposiciones de la subestructura de RBD en complejo con COV2-2130 (FIG. 9C) y la estructura de RBD en complejo tanto con COV2-2196 como con COV2-2130 (FIG. 9D) indican que COV2-2130 es capaz de unirse a RBD en las conformaciones "arriba" y "abajo" del trímero de S. Estos hallazgos estructurales concuerdan con los resultados a menor resolución anteriores para el complejo usando microscopía electrónica de tinción negativa1.
El análisis estructural de COV2-2196 en complejo con RBD revela cómo COV2-2196 reconoce al surco de unión al receptor en el RBD. Uno de los principales restos de contacto, F486, sitúa en el centro del sitio de unión, interactúa extensamente con el bolsillo hidrófobo (resto P99 de la cadena pesada y una "jaula aromática" formada por 5 cadenas laterales aromáticas) entre las cadenas pesadas/ligeras de COV2-2196 mediante un efecto hidrófobo e interacciones de Van der Waals (FIG. 8D-E, FIG. 13A-B). Una red de enlaces de hidrógeno (enlace H), construida con 4 enlaces H directos entre Ab-Ag y 16 enlaces H mediados por agua, rodean al resto F486 y fortalecen la interacción Ab-Ag (FIG. 13C). De manera importante, para todos los restos excepto uno (resto P99 de la cadena pesada) que interactúan extensamente con el epítopo, estos están codificados por secuencias de línea germinal(IGHV1-58*01yIGHJ3*02para la cadena pesada,IGKV3-20*01yIGKJ1*01para la cadena ligera) (FIG. 10A) o solo están implicados sus átomos de la cadena principal en las interacciones Ab-Ag, tales como N107 y G99 en la cadena pesada y S94 en la cadena ligera. Los inventores observaron otro anticuerpo en la bibliografía, S2E12, que está codificado por las mismas recombinacionesIGHV/IGHJeIGKV/IGKJ,con genesIGHDsimilares pero muy probablemente diferentes a los de COV2-2196(IGHD2-15frente a IGHD2-2)38. Una comparación de la estructura de crio-EM de S2E12 en complejo con la proteína S (PDB 7K4N) sugiere que el mAb S2E12 posiblemente usa interacciones Ab-Ag prácticamente idénticas a aquellas de COV2-2196, aunque pueden observarse variaciones en las conformaciones de las cadenas laterales de restos de la interfaz (FIG.
13D). Por ejemplo, para el resto Y92 de la cadena ligera, el anillo de fenilo en la estructura cristalina es perpendicular a dicho anillo en la estructura de EM como se ha ajustado.
Los inventores efectuaron búsquedas en bases de datos genéticas para determinar si estas características estructurales estaban presentes en mAb adicionales contra el SARS-CoV-2 aislados por otros y descubrieron miembros adicionales del clonotipo (FIG. 10A). Otros dos estudios notificaron el mismo clonotipo o uno similar de anticuerpos aislados de múltiples pacientes convalecientes por COVID-19438, y un estudio halló tres anticuerpos con el mismo emparejamiento deIGHV1-58y deIGKV3-20,sin proporcionar información acerca del uso de los genes D o J39. Se ha notificado que todos estos anticuerpos se unen con avidez a RBD del SARS-CoV-2 y que neutralizan el virus con alta potencia143839. Hasta ahora, solo hay dos estructuras a resolución atómica de los anticuerpos codificados por estas recombinaciones de V<h>(D<h>)J<h>y Vk-Jk, la estructura de COV2-2196 presentada en este ejemplo y la de S2E1238 Los inventores llevaron a cabo el modelado por homología de dos anticuerpos adicionales de este clonotipo a partir de su propio panel de anticuerpos anti-SARS-CoV-2, denominados COV2-2072 y COV2-2381. Como se esperaba, dado que estos anticuerpos son miembros de un clonotipo genético compartido, las estructuras modeladas de los complejos COV2-2072/RBD y COV2-2381/RBD son prácticamente superponibles con las de COV2-2196/RBD y S2E12/RBD en las interfaces Ab-Ag (FIG. 14A-E). Además, COV2-2072 codifica una secuencia de glucosilación unida a N en la HCDR3 (FIG. 14D), una característica infrecuente para los anticuerpos, dado que la glucosilación de las CDR podría afectar negativamente al reconocimiento del antígeno. Sin embargo, la estructura de COV2-2196 demuestra que la HCDR3 unida por disulfuro en este clonotipo tiene un ángulo que la aparta del sitio de unión, lo que explica cómo puede tolerarse esta glucosilación infrecuente de HCDR3 en COV2-2072 sin comprometer la unión (FIG. 14E).
A continuación, los inventores determinaron si podrían identificar potenciales precursores de este clonotipo público en los repertorios génicos variables del anticuerpo de los linfocitos B en circulación de individuos no expuestos previamente al SARS-CoV-2. Los inventores buscaron los genes V(D)J y VJ en conjuntos de datos exhaustivos anteriormente descritos procedentes de 3 donantes humanos sanos, sin antecedentes de infección por SARS-CoV-2 y en conjuntos de datos de sangre de cordón umbilical extraída antes de la pandemia de COVID-1940. Se observó un total de 386, 193, 47 o 7 secuencias de cadena pesada para este clonotipo público reactivo de SARS-CoV-2 en cada donante o repertorio de sangre de cordón umbilical, respectivamente (FIG. 15A). Además, los inventores observaron 516,738 secuencias de anticuerpo humanas con la misma recombinación de V-J de cadena ligera(IGKV3-20-IGKJ1*01).Se observó un total de 103,534, 191,039 o 222,165 secuencias de cadena ligera para este clonotipo público en cada donante, respectivamente. Debido al gran número de secuencias, se alinearon las cinco secuencias más abundantes de cada donante. Los alineamientos de múltiples secuencias se generaron para cada una de las secuencias donantes usando ClustalOmega y se generaron las gráficas logo. Las principales 5 secuencias con el mismo evento de recombinación en cada donante eran idénticas, obteniéndose las mismas gráficas logo (FIG. 15A-B).
Los inventores observaron que 8 de los 9 restos comunes importantes para la unión en el anticuerpo estaban codificados por secuencias génicas de línea germinal y todos estaban presentes en los 14 miembros del clonotipo público aquí mostrado a partir de cuatro equipos de descubrimiento de anticuerpos diferentes (FIG. 10A). Para validar la importancia de estas características, expresaron anticuerpos variantes con mutaciones puntuales en el paratopo para determinar el efecto de la variación en restos conservados (FIG. 10B). La alteración del resto D108 a A, N o E apenas tuvo efecto, pero la eliminación del enlace disulfuro en la HCDR3 que rigidifica ese bucle redujo la unión. El resto P99 que orienta el bucle de HCDR3 fuera del sitio de interacción con el antígeno también era importante, ya que un mutante P99G mostró unión reducida y la forma revirtiente de COV2-2196 con P99 se unió al antígeno, pero P99G en el fondo genético revirtiente a la línea germinal no (FIG. 10B).
El anticuerpo basado en la región variable de COV2-2196 se está analizando en combinación con un anticuerpo basado en la región variable de COV2-2130 en los ensayos clínicos. La HCDR3 de COV2-2130, con 22 restos de aminoácido, es relativamente larga para anticuerpos humanos, y está altamente mutada a partir del genIGHD3de línea germinal inferido. La HCDR3 forma un largo bucle estructurado formado por pequeños bucles, se estabiliza por medio de enlaces de hidrógeno de corto alcance e interacciones hidrófobas/apilamientos aromáticos en la HCDR3 y se fortalece adicionalmente por sus interacciones (enlaces de hidrógeno y apilamientos aromáticos) con los restos de la cadena ligera (FIG. 16A-B). Las cadenas pesada y ligera de COV2-2130 están codificadas por los genes de línea germinalIGHV3-15yIGKV4-1,respectivamente, y los dos genes más largos codifican los bucles de HCDR2 (10 aa) y de LCDR1 (12 aa) que se usan en COV2-2130. La recombinación V(D)J de cadena pesada, las mutaciones de HCDR3 y el emparejamiento de las cadenas pesada y ligera dan como resultado un surco de unión entre las cadenas pesada y ligera, que coincide con la forma de la región RBD centrada en el bucle S443 - Y449 (FIG. 9A, FIG. 16C). Estrechamente relacionadas con estas características estructurales, solo HCDR3, LCDR1, HCDR2 y LCDR2 están implicadas en la formación del parátopo (FIG. 9E-F, FIG.
13E-F). La inspección de la interfaz Ab-Ag revela una región que posiblemente impulsa gran parte de la energía de interacción. La cadena lateral del resto K444 del RBD está rodeada por un sub-bucle Y104 - V l09 del bucle de HCDR3 y la carga positiva en el átomo NZ de la cadena lateral se neutraliza por la cadena lateral del resto D107 de la HCDR3, tres átomos de oxígeno del carbonilo de la cadena principal de Y105, D107 y V109, y la cara rica en electrones del anillo de fenilo Y104 (interacción de catión-n) (FIG. 13E). Dado que los átomos que interactúan están completamente protegidos frente al disolvente, las interacciones altamente concentradas en dicho espacio restringido son energéticamente favorables. Además, este "punto" de la interfaz Ab-Ab está rodeado por o protegido frente al disolvente por las interacciones Ab-Ag con menos aumentos de energía libre, incluido el puente salino entre el resto del RBD R346 y D56 de la HCDR2, la interacción electrostática entre R346 del RBD y el oxígeno de la cadena principal de Y106 de la HCDR3, un enlace de hidrógeno entre N450 del RBD y el oxígeno de cadena principal de Y105 de la HCDR3, un enlace de hidrógeno entre el oxígeno de cadena principal de V445 del RBD y la cadena lateral de Y104 de la HCDR3, una interacción hidrófoba entre la cadena lateral de V445 y las cadenas laterales de L113 y F118 de la HCDR3 (FIG. 13E). Además, el apilamiento aromático entre el resto Y105 de la HCDR3 y el resto W56 de la LCDR2 participa en la protección del "punto" frente al disolvente (FIG. 13E). Además, la LCDR1 y la LCDR2 de la cadena ligera de<c>O<v>2-2130 producen contactos extensos con el RBD. Entre ellos, la cadena lateral de S32, el oxígeno de cadena principal de S33, la cadena lateral de N34 de la LCDR1 y la cadena lateral de Y55 de la LCDR2 forman enlaces de hidrógeno con la cadena lateral de E484, el nitrógeno de cadena principal de S494, el oxígeno de cadena principal de Y449 y el nitrógeno de cadena principal de G446 del RBD (FIG. 13F). Los restos K36, Y38 de la LCDR1 y W56 de la LCDR2 interactúan con Y449 del RBD mediante apilamientos aromáticos e interacciones de catión-n, formando un "cúmulo de interacción" (FIG. 13F), aunque estas interacciones probablemente no son tan fuertes desde el punto de vista energético como en el caso de K444 del RBD.
En la estructura cristalina del RBD en complejo tanto con COV2-2196 como con COV2-2130, los inventores observaron una interacción entre los Fab COV2-2196 y COV2-2130 próximos en el espacio (FIG. 17). Es posible que las interacciones entre los dos Fab en el estado unido al RBD puedan contribuir a la neutralización sinérgica del SARS-CoV-2 observada anteriormente1. Sin embargo, no está claro hasta qué punto el efecto sinérgico puede atribuirse a esta interacción Fab-Fab.
Para comprender mejor los sitios del RBD que son críticos para la unión de COV2-2196 y COV2-2130, los inventores utilizaron una metodología de escaneo mutacional profundo (DMS,deep mutational scanning)para mapear todas las mutaciones en el RBD que escapan de la unión del anticuerpo41; (FIG. 18). Para ambos anticuerpos, identificaron varios sitios clave, todos en la huella estructural del anticuerpo, en donde las mutaciones en RBD alteraban con fuerza la unión (FIGS. 11A-D). Los inventores aprovecharon nuestro trabajo anterior en el que se cuantificaban los efectos de las mutaciones de RBD sobre la unión de ACE242 para superponer el efecto sobre la unión de ACE2 de las mutaciones que anulaban la unión del anticuerpo a RBD (FIg S. 11A-B). Para COV2-2196, muchas mutaciones en F486 y N487 tenían fracciones de escape que se acercaban a 1 (es decir, esas variantes de RBD escapaban por completo a la unión del anticuerpo en las condiciones probadas), lo que refuerza la importancia de las contribuciones de estos dos restos con respecto a la unión del anticuerpo. Del mismo modo, para COV2-2130, la mutación en el sitio K444 a cualquiera de los otros 19 aminoácidos anuló la unión del anticuerpo, lo que indica que la lisina en esta posición es crítica para la interacción Ab-Ag (anticuerpo-antígeno).
No obstante, no se identificaron todos los restos de contacto como sitios en los que las mutaciones reducían en gran medida la unión. Hay varias explicaciones posibles: 1) es posible que algunos restos del sitio de unión no sean críticos para la unión, 2) algunos restos pueden utilizar sus átomos estructurales para interaccionar con su cadena lateral apuntando lejos de la interfaz de unión o 3) en algunos sitios no pueden tolerarse mutaciones42. Por ejemplo, los restos L455, F456 y Q493 forman parte del sitio de unión estructuralmente definido para COV2-2196 (FIG. 8D), pero en estos sitios, las mutaciones no tuvieron un impacto detectable en la unión del anticuerpo (FIGS. 11A y 11C), lo que sugiere que estos restos no contribuyen de forma crítica en la unión. La superposición de la estructura COV2-2196/RBD sobre la estructura S2E12/RBD demuestra claramente una región bisagra flexible entre el borde del RBD y el resto del RBD que se conserva cuando se une al anticuerpo (FIG. 13D). Este hallazgo indica que en estas tres posiciones podrían tolerarse bien las mutaciones para la unión Ab-Ag y respalda la naturaleza no esencial de estos restos particulares para la unión de COV2-2196 o S2E12.
Es importante destacar que COV2-2196 y COV2-2130 no compiten por la unión al RBD1, lo que sugiere que podrían constituir un cóctel resiste al escape para uso profiláctico o terapéutico. De hecho, los mapas de variantes de escape y de sitios de unión estructurales de estos dos anticuerpos no se solapan. Para comprobar si había mutaciones individuales que pudieran escapar de la unión de ambos anticuerpos, los inventores realizaron experimentos de mapeo de variantes con una mezcla 1:1 de los anticuerpos COV2-2196 y COV2-2130, pero no detectaron ninguna mutación que tuviera una fracción de escape superior a 0.2, mientras que las mutaciones con mayores efectos de cada uno de los anticuerpos individuales era de aproximadamente 1 (FIG. 18D).
Aunque en estos experimentos se mapean todas las mutaciones que escapan a la unión del anticuerpo al RBD, los inventares también intentaron determinar qué mutaciones tenían el potencial de surgir durante el crecimiento vírico. Para abordar esta cuestión, primero intentaron seleccionar mutaciones de escape utilizando un VSV recombinante que expresaba la glucoproteína S del SARS-CoV-2 (VSV-SARS-CoV-2)43; (FIG. 11E). Los inventoras esperaban que las únicas mutaciones de aminoácidos que se seleccionasen durante el crecimiento vírico fuesen las que 1) surgieran por cambios del ARN mononucleotídico, 2) causaran un efecto nocivo mínimo sobre la unión y expresión de ACE2 y 3) impactaran sustancialmente en la unión con el anticuerpo4142. De hecho, los inventores no detectaron ninguna mutación inducida por COV2-2196 que fuera accesible por un solo nucleótido y se tolerase relativamente bien con respecto a los efectos sobre la unión de ACE2 (FIG. 11B), lo que puede explicar por qué no se seleccionaron mutantes de escape en ninguna de las 88 copias independientes del crecimiento del VSV recombinante en presencia del anticuerpo (FIG. 11E, FIG. 18G). En el caso de COV2-2130, la mutaciones en el sitio K444, un sitio que es relativamente tolerante a las mutaciones42, demostraron el escape más frecuente de la unión de anticuerpos en la selección de escape de anticuerpos de alto rendimiento con el virus VSV quimérico. En el 40 % de los experimentos de selección de anticuerpos, dos de las mutaciones de un solo nucleótido con los mayores efectos sobre la unión de anticuerpos, K444R (seleccionada en 6 de 20 copias) y K444E (seleccionada en 2 de 20 copias) surgieron durante el crecimiento vírico (FIG. 11E, FIG. 18G).
Para explorar la resistencia con virus infeccioso auténtico, se pasó la cepa del SARS-CoV-2 USA-WA1/2020 en serie en cultivos de monocapas de células Vero con los anticuerpos clínicos basados en COV2-2196 (AZD8895), COV2-2130 (AZD1061) o sus combinaciones 1:1 (AZD7442), a concentraciones a partir de sus valores de CI50 respectivos y aumentaron gradualmente hasta su valor de CI90 con cada pase (FIG. 19). Como control, el virus se pasó en ausencia de anticuerpo. Después del pase final, se evaluó la susceptibilidad de los virus frente al anticuerpo recíproco a una concentración final 10 veces la concentración CI90 mediante un ensayo de placa. Los inventores no detectaron placas resistentes a la neutralización por AZD8895 (basado en COV2-2196) o el cóctel de AZD7442. El virus que se pasó en serie en AZD1061 formó placas con un título de 1.2 x 107 ufp/ml en presencia de una concentración de 10 veces el valor de CI90 de AZD1061, pero no se formaron placas con AZD7442. Las placas (n = 6) se seleccionaron aleatoriamente y se secuenció el gen codificante de la espícula del virus, revelando los mismos 3 cambios de aminoácidos en las 6 placas seleccionadas y secuenciadas independientemente: N74K, R346I y S686G (FIG. 11F). Se ha notificado anteriormente que la carga de S686G está asociada con el pase en serie del SARS-CoV-2 en células Vero44, aisladas de estudios de exposición en hurones45 o NHPs46 y se predice que reduce la actividad de furina44 El resto N74K está ubicado en el dominio N-terminal fuera del sitio de unión de AZD1061 y da como resultado la pérdida de un glicano47 El residuo R346I está ubicado en el sitio de unión de AZD1061 y puede estar asociado con la resistencia a AZD1061. El impacto de los cambios R346I en la unión de AZD1061 (COV2-2130) a la proteína S se muestra en la FIG. 11G. Las sustituciones K444R y K444E seleccionadas en el sistema de VSV-SARS-CoV-2 y la sustitución R346I seleccionada mediante el pase con SARS-CoV-2 auténtico son accesibles mediante la sustitución de un solo nucleótido y mantienen la actividad de unión a ACE2 (FIG. 11G), lo que indica que este análisis por DMS predijo las mutaciones seleccionadas en presencia del anticuerpo COV2-2130. En conjunto, estos resultados cartografían exhaustivamente los efectos de todas las sustituciones de aminoácidos a la unión de COV2-2196 y COV2-2130 e identifican sitios de posible preocupación para la evolución vírica. Dicho esto, las variantes que contienen mutaciones en los restos K444 y R346, se encuentran entre todos los virus secuenciados presente en las bases de datos del GISAID (todos < 0.01 % cuando se consultaron el 23/12/20).
Recientemente, se han notificado variantes víricas con transmisibilidad aumentada y posibles mutaciones antigénicas en aislados clínicos48'51. Los inventores evaluaron si algunos de los restos variantes en estas cepas rápidamente emergentes podrían suprimir la actividad de estos anticuerpos potentemente neutralizantes. Evaluaron un aislado vírico de una muestra nasal obtenida en Oxford en Reino Unido (un virus B.1.1.7 denominado UK B.1.1.7-OXF), que contiene cambios en el gen de la espícula que definen el linaje B.1.1.7 que incluyen las eliminaciones 69-70 y 144-145 en el NTD y sustituciones en n 501Y, A570D, D614G y P681H49 Los inventores también analizaron variantes D614G y E484K isogénicas en el fondo genético de la cepa WA-1 (2019n-CoV/USA_WA1/2019, [WA-1]), todas preparadas como virus SARS-CoV-2 auténticos y usados en pruebas de neutralización de reducción de focos43. La mutación E484K era especialmente interesante, dado que este resto se encuentra a 4.5 A de cada uno de los mAb en el complejo de los Fab y el RBD, aunque en la misma periferia de las huellas del Fab, está presente en los linajes emergentes B.1.351 (501Y.V2)50 y P.1 (501Y.V3)51, y se ha demostrado que altera la unión de algunos anticuerpos monoclonales5253 así como anticuerpos de suero policlonal humano54. También se ha demostrado que las variantes que contienen E484K se neutralizan menos eficazmente por el suero de convalecientes y el plasma de supervivientes al SARS-CoV-25556 Para COV2-2196, COV2-2130 y COV2-2050 (un tercer anticuerpo que los inventores incluyeron por comparación, ya que interactúa con el resto E484), observaron la práctica ausencia de impacto de la mutación D614G o el conjunto de mutaciones presente en la cepa UK B.1.1.7-OXF; como mucho, los inventores observaron una tendencia hacia una ligera mejora (reducción de 2 a 3 veces en los valores de CI50) frente a este último virus circulante (FIG. 11H). Sin embargo, observaron efectos en la neutralización con el virus D614G/E484K. COV2-2050 perdió por completo la actividad de neutralización, lo que concuerda con el estudio anterior que define E484K como una mutación que suprime la unión de COV2-205041. Por el contrario, COV2-2196, COV2-2130 y COV2-2196 COV2-2130 mostraron una capacidad inhibidora ligeramente menor (aumentos de 2 a 5 veces en los valores de CI50).
Análisis. Los análisis estructurales definen la base molecular para la selección frecuente de un clonotipo público de anticuerpos humanos que comparten recombinaciones de V-D-J de cadena pesada y de V-J de cadena ligera que se dirigen a la misma región del r Bd del SARS-CoV-2. Los restos codificados por el gen de anticuerpo de línea germinal en las cadenas pesada y ligera desempeñan un papel crucial en el reconocimiento del antígeno, lo que sugiere que son necesarias algunas mutaciones somáticas para la maduración del anticuerpo de este clonotipo. Un enlace disulfuro codificado por el genIGHD2proporciona una restricción adicional para la HCDR3 para que adopte una conformación con complementariedad de forma y química respecto del sitio antigénico en el RBD. Al parecer, tres genesIGHD2diferentes(IGHD2-2, IGHD2-8,andIGHD2-15)codifican porciones de la HCDR3 que pueden funcionar en el contexto de este clonotipo. Los inventores han sugerido que esta aparición de anticuerpos codificados por genes de línea germinal comunes con características estructurales preconfiguradas que permiten una alta especificidad y potente actividad neutralizante es una característica no prevista y beneficiosa de la respuesta inmunitaria humana primaria frente al SARS-CoV-2. La selección de linfocitos B de este clonotipo público permitió el rápido aislamiento de anticuerpos extremadamente potentes que resisten al escape y que posiblemente pueden ser responsables de la notable eficacia de las vacunas basadas en proteína S que se está observando en la práctica clínica. Se podría prever una oportunidad para producir títulos de anticuerpo neutralizantes en suero con una potencia de neutralización aún mayor usando diseños de vacuna basados en dominios o motivos para este sitio antigénico para cebar las respuestas inmunitarias humanas para generar este clonotipo.
El análisis estructural de los complejos RBD-COV2-2196 y RBD-COV2-2130 presentados en este caso sugieren que dos anticuerpos se unen al antígeno<r>B<d>formando interacciones "similares a remaches" con una alta densidad de energía por unidad de área superficial de la interfaz, y este hallazgo explica cómo estos anticuerpos tan potentes pueden tener un área superficial enterrada tan relativamente pequeña (<750 A2) en las interfaces de Ab-Ag. La cartografía de las mutaciones de escape para los dos anticuerpos estudiados en este caso indicó que los loci de las mutaciones de escape coinciden con el sitio de unión determinado mediante las presentes estructuras cristalinas de Ag-Ag, que confirman además la precisión de la metodología de DMS. Los inventores han sugerido que los datos de la fracción de escape pueden usarse en el futuro como restricciones para el acoplamiento computacional de anticuerpos sobre antígenos o, de manera más general, para proteínas sobre proteínas, ya que, por ejemplo, los restos K444 o F486 con las máximas fracciones de escape para COV2-2130 o COV2-2196, respectivamente, muestran las interacciones más intensas con los anticuerpos en la estructura del complejo de antígeno-anticuerpo.
La reciente aparición de linajes de virus variantes con una capacidad de transmisión aumentada y secuencias alteradas en muchos sitios de neutralización conocidos es preocupante debido a la capacidad del SARS-CoV-2 de escapar a las actuales contramedidas de anticuerpos en desarrollo y evaluación. Los inventores analizaron la actividad de los anticuerpos y el cóctel de ambos y observaron actividad sostenida contra diversas variantes diferentes, que incluyen un virus que contiene la mutación E484K y un virus B.1.1.7 con múltiples variaciones en el gen S. La base genética y estructural para esta amplia actividad se revela en las estructuras cristalinas y los estudios de DMS que aquí presentan los inventores. El reconocimiento crucial del resto F486 relativamente invariante por un dominio de "jaula aromática" en COV2-2196 es beneficioso, ya que la variación de este resto se asocia con una aptitud vírica reducida. El uso como diana de este sitio de unión parece ser especialmente eficaz en el contexto de la neutralización sinérgica en una combinación con el mAb COV2-2130, que reconoce los trímeros de S tanto "abiertos" como "cerrados". Por tanto, esta combinación parece ofrecer un mecanismo amplio y potente de inhibición que resiste al escape.
Tabla de datos extendidos 1. Recogida de datos y estadística de refinamiento para los
cristales de RBD-COV2-2196 y complejos de RBD-COV2-2130
Recogida de datos
Cristal RBD-COV2-2196 RBD-COV2-2196-2130
ID de PDB 7L7D 7L7E
Longitud de onda<(A )>0.97872 0.97857
Grupo espacial P2i P2i
Dimensiones de celdas
unitarias
a, b, c (Á) 44.1,81.6, 101.2 97.2, 1525, 199.2
a, P, Y 90.0, 96.6, 90.0 90.0, 94.7, 90.0
Resolución (A) 43.98 -2.50 35.21 - 3.00
Reflejos únicos 24896 (13417) 115751 (16908)
Redundancia 3.7 (3.7) 7.7 (7.7)
Compleción (%) 99.9 (99.6) 99.9 (100)
Rfusión (% )4.6 (24.5) 23.1 (81.0)
1/0ÍO 19.2(4.8) 6.4 (2.3)
Estadística de refinamiento
Rfactor (% )18.5 21.5
Rlibre (% )23.1 27.3
R. m. s. d. (enlace) (A) 0.0030 0.0023
R. m. s. d. (ángulo) (°) 0.563 0.598
Gráfico de Ramachandran
Favorecido (%) 95.82 95.34
Permitido (%) 4.18 4.37
Valores atípicos (%) 0.00 0.09
Rfusión = 1 1 1Ihki - lhki(j)|/X Ihki, donde Ihki® es la intensidad observada y Ihki es la intensidad
promedio final.
<Rtrabajo = X>||Fobs| - |Fcalc|/X |Fobs| y<Rlibr© =>x ||Fobs| - |Fcalc|/X |Fobs|, donde<R»bre>y<R eba jo>
se calculan usando un conjunto de prueba seleccionado aleatoriamente del 5 % de los datos y
todos los reflejos excluyendo el conjunto de prueba del 5 %, respectivamente. Los números
entre paréntesis son para el grupo de mayor resolución.
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Ejemplo 5: Anticuerpos humanos potentemente neutralizantes que bloquean la unión del SARS-CoV-2 al receptor y que protegen a animales
AUTORES:Seth J. Zostl*, Pavlo Gilchukl*, James Brett Case3, Elad Binshteinl, Rita E. Chen2,3, Joseph X. Reidyl, Andrew Trivettel, Rachel S. Nargil, Rachel E. Suttonl, Naveenchandra Suryadevaral, Lauren E. WiNiamson4, Elaine C. Chen4, Taylor Jones1, Samuel Day1, Luke Myers1, Ahmed O. Hassan3, Natasha M. Kafai2,3, Emma S. Winkler2,3, Julie M. Fox3, James J. Steinhardt6, Kuishu Ren7, Yueh-Ming Loo7, Nicole L. Kallewaard7, David R. Martinez5, Alexandra Schafer5, Lisa E. Gralinski5, Ralph S. Baric5, Larissa B. Thackray3, Michael S. Diamond2,3,8,9, Robert H. Carnahan1,10**, James E. Crowe, Jr.1,4,10**
Afiliaciones:
IVanderbilt Vaccine Center, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN, 37232, EE. UU.
2Department of Pathology & Immunology, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, 63110, EE. UU. 3Department of Medicine, Washington University School of Medicine, St. Louis, 63110, MO, EE. UU. 4Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN, 37232, EE. UU.
5Department of Epidemiology, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC, 27599, EE. UU.
6Antibody Discovery and Protein Engineering, BioPharmaceuticals R&D, AstraZeneca, Gaithersburg, Maryland, 20878, EE. UU.
7Microbial Sciences, BioPharmaceuticals R&D, AstraZeneca, Gaithersburg, Maryland, 20878, EE. UU.
8Department of Molecular Microbiology, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, 63110, EE. UU. 9Andrew M. and Jane M. Bursky Center for Human Immunology and Immunotherapy Programs, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, 63110, EE. UU.
10Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN, 37232, EE. UU.
Información de contacto:
James E. Crowe, Jr., M.D.[C O N T A C T O P R IN C IP A L ]
Departments of Pediatrics, Pathology, Microbiology, and Immunology, and the Vanderbilt Vaccine CenterCorreo postal:
Vanderbilt Vaccine Center
11475 Medical Research Building IV
2213 Garland Avenue
Nashville, TN 37232-0417, EE. UU.
Teléfono(615) 343-8064
Correo electrónicojames.crowe@vumc.org
Notas al pie de la página de título
* Estos autores contribuyeron en la misma medida
**Autores de correspondencia
Palabras clave: Coronavirus; SARS-CoV-2; SARS-CoV; COVID-19; Anticuerpos, Monoclonal; Humano; Inmunidad adaptativa.
La pandemia de COVID-19 es una importante amenaza para la salud global para la que en la actualidad no se dispone de contramedidas médicas y se carece de una comprensión exhaustiva de los mecanismos de inmunidad hummoral1,2. A partir de un panel de anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos a la glucoproteína espícula (S) (S) aislada de linfocitos B de sujetos infectados, se identificaron varios mAb que muestran una potente actividad de neutralización, con valores de CI50 tan bajos como de 0.9 o 15 ng/ml en pruebas de neutralización de pseudovirus o en SARS-CoV-2 de tipo silvestre(ts),respectivamente. Los mAb más potentes bloquean por completo la interacción del dominio de unión a receptor de S (SRBD) con ACE2 humana. Los estudios de unión de competición, estructurales y funcionales permitieron agrupar los mAb en clases definidas que reconocendiferentes epítopos dentro de los sitios antigénicos principales en el SRBD. Se reveló mediante estudios de microscopía electrónica que estos mAb reconocen diferentes estados conformacionales de la proteína S trimérica. Los potentes mAb neutralizantes que reconocen sitios únicos, COV2-2196 y COV2-2130, se unieron simultáneamente a S y neutralizaron sinérgicamente el virus SARS-CoV-2 auténtico. En dos modelos murinos de infección por SARS-CoV-2, la transferencia pasiva de solo COV2-2916 o COV2-2130 o de una combinación de ambos mAb protegió a los ratones frente a la pérdida de peso grave y redujo la carga vírica y la inflamación en el pulmón. Estos resultados identifican epítopos protectores en el SRBD y proporcionan un marco basado en estructura para el diseño racional de vacunas y la selección de cócteles inmunoterapéuticos robustos.
La proteína S del SARS-CoV-2 es el determinante molecular de la unión, fusión y entrada vírica en las células hospedadoras3. La estructura mediante crio-EM del ectodominio de la proteína S trimérica estabilizada antes de la fusión (S2Pecto) para el SARS-CoV-2 revela características similares a las de la proteína S del SARS-CoV4. Esta proteína integral de membrana de tipo I y proteína de fusión de clase I posee una subunidad N-terminal (S1) que media la unión al receptor y una subunidad C-terminal (S2) que media la fusión del virus a la membrana celular. La subunidad S1 contiene un dominio N-terminal (SNTD) y un dominio de unión a receptor (SRBD). SARS-CoV-2 y el SARS-CoV, que comparten aproximadamente un 78 % de identidad de secuencia en sus genomas1 emplean en ambos casos la enzima convertidora de angiotensina 2 humana (hACE2) como receptor de entrada5-7. Los estudios anteriores de inmunidad humana con otros betacoronavirus zoonóticos altamente patógenos, incluido el SARS-CoV8-12 y el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS)13-22 demostraron que los Ab dirigidos contra la glucoproteína espícula (S) de la superficie vírica median la inmunidad protectora. Los mAb más potentes específicos para la proteína S parecen neutralizar los betacoronavirus mediante el bloqueo de la unión del virus a células hospedadoras mediante la unión a la región en el SRBD que media directamente el acoplamiento al receptor. Es probable que los Ab humanos sean prometedores para su uso en la modificación de la enfermedad durante la infección por SARS-CoV-2, cuando se usan para profilaxis, para profilaxis postexposición o para el tratamiento de la infección por SARS-CoV-223. Se encuentran en desarrollo muchos estudios, incluidos ensayos controlados aleatorizados que evalúan el plasma de convalecientes y un ensayo que evalúa las inmunoglobulinas hiperinmunes, pero aún no está claro si dichos tratamientos pueden reducir la morbilidad o la mortalidad24.
Los presentes autores aislaron un gran panel de mAb reactivos con la proteína S del SARS-CoV-2 a partir de linfocitos B de dos individuos que se habían infectado previamente por el SARS-CoV-2 en Wuhan, China25. Un subconjunto de estos anticuerpos se unión al dominio de unión a receptor de S (SRBD) y mostró actividad neutralizante en un ensayo de exploración rápida con auténtico SARS-CoV-225. En este caso, los presentes autores definieron el paisaje antigénico del SARS-CoV-2 y determinaron qué sitios del SRBD son la diana de los mAb protectores. Los presentes autores analizaron un panel de 40 mAb humanos anti-S que habían preseleccionado mediante un ensayo rápido de detección de neutralización en una prueba de neutralización de reducción de focos (FRNT) cuantitativa con la cepa del SARS-CoV-2 WA1/2020. Estos ensayos revelaron que el panel mostró un intervalo de valores de concentración inhibidora semimáxima (CI50) de 15 a más de 4,000 ng/ml (visualizado como una matriz cromática en la FIG. 20a, los valores se muestran en la tabla B y las curvas completas se muestran en la FIG. 24). Los presentes autores barajaron la hipótesis de que muchos de estos mAb que reaccionan con el SRBD neutralizan la infección vírica bloqueando la unión del SRBD a hACE2. De hecho, la mayoría de mAb neutralizantes que se analizaron inhibieron la interacción de hACE2 directamente con la proteína S trimérica (FIG. 20a, FIG. 25). De manera coherente con estos resultados, estos mAb también se unieron fuertemente a una proteína de ectodominio de S trimérico (S2Pecto) o a SRBD monomérico (FIG. 20a, FIG. 26). Los presentes autores evaluaron si la unión a S2Pecto o a SRBD o la potencia de bloqueo de hACE2 predicen de manera independiente la potencia de neutralización de la unión, pero ninguna de estas medidas se correlaciona con la potencia de neutralización (FIG. 20b-d). Sin embargo, cada uno de los mAb en el rango de potencia neutralizante más elevado (CI50 <150 ng/ml) también reveló una actividad de bloqueo más fuerte frente a hACE2 (CI50 <150 ng/ml) y una excepcional actividad de unión (EC50 <2 ng/ml) al trímero de S2Pecto y a SRBD (FIG. 20e). Se muestran en la (FIG. 20f) las curvas de neutralización representativas para dos mAb potentemente neutralizantes denominados COV2-2196 y COV2-2130. Se confirmó una potente neutralización usando ensayos de neutralización de pseudovirus, que revelaron fenotipos de neutralización mucho más sensibles que el virus detsy demostraron la necesidad de uso de ensayos con virus activo para evaluar la potencia del mAb (FIG. 20g). Estos dos mAb se unieron fuertemente al trímero de S2Pecto y bloquearon por completo la unión a hACE2 (FIG. 20h-i).
A continuación, se definieron los sitios antigénicos principales en el SRBD para los mAb neutralizantes mediante análisis de unión de competición. En primer lugar, los presentes autores usaron un ensayo de competición basado en interferometría de biocapas con un dominio SRBD mínimo para detectar mAb que competían por la unión con el mAb potentemente neutralizante COV2-2196 o una versión recombinante del mAb contra el SARS-CoV anteriormente descrito, CR3022, que reconoce un epítopo críptico conservado10,26. Los presentes autores identificaron tres grupos principales de mAb competidores (FIG. 21a). El grupo más abundante de mAb bloqueó a COV2-2196 pero no a rCR3022, mientras que algunos mAb se bloquearon mediante rCR3022, pero no por COV2-2196. Dos mAb, incluidos COV2-2130, no se bloquearon por cualquiera de los mAb de referencia. La mayoría de los mAb compitieron por la unión a hACE2, lo que sugiere que se unen cerca del sitio de unión de hACE2 al SRBD. Los presentes inventores usaron COV2-2196, COV2-2130 y rCR3022 en un ensayo de unión de competición basado en ELISA con proteína S2Pecto trimérica y se observó que SRBD contenía tres sitios antigénicos principales, y algunos de los mAb probablemente producían contactos en más de un sitio (FIG. 21b). La mayoría de los mAb potentemente neutralizantes competían por la unión con COV2-2196.
Dado que COV2-2196 y COV2-2130 no competían por la unión a SRBD, los presentes autores evaluaron si estos mAb actuaban de manera sinérgica para neutralizar el virus, un fenómeno previamente observado para los mAb contra el SARS-CoV10. Los presentes inventores analizaron las respuestas combinadas (véase la matriz de neutralización de dosis-respuesta, FIG. 21c) en el FRNT usando SARS-CoV-2 y compararon estos valores experimentales con las respuestas esperadas calculadas mediante los modelos de puntuación de sinergia27. La comparación reveló que la combinación de COV2-2196 COV2-2130 era sinérgica (con una puntuación de sinergia de 17.4, donde cualquier puntuación >10 indica sinergia). Los datos en la FIG. 21c muestran la matriz de sinergia de dosis-respuesta y demuestra que una dosis combinada del mAb de 79 ng/ml en el cóctel (16 ng/ml de COV2-2196 y 63 ng/ml de COV2-2130) tenía la misma actividad que 250 ng/ml de cada mAb individual (véase la FIG. 21c). Este hallazgo demuestra que usando un cóctel, puede reducirse la dosis de cada mAb más de tres veces para lograr la misma potencia de neutralización del virusin vitro.
A continuación se definieron los epítopos reconocidos por los mAb representativos en los dos grupos de unión de competición principales que sinergizan para la neutralización. Los presentes autores llevaron a cabo estudios de mutagénesis del SRBD usando sustitución de alanina o arginina para determinar los restos críticos para la unión de los mAb neutralizantes (FIG. 27). Los estudios de pérdida de unión revelaron que F486A o N487A son restos críticos para COV2-2196 y N487A es un resto crítico para COV2-2165, que compiten entre sí por la unión e igualmente, en estudios de mutagénesis para COV2-2130 usando mutantes de K444a y G447R, se definieron estos restos como críticos para el reconocimiento (FIG. 22a). En estudios estructurales anteriores se ha definido la interacción entre el SRBD y hACE2 (FIG.
22b)28. La mayoría de restos que interactúan en el SRBD están contenidos en un péptido lineal de 60 aminoácidos que define el motivo de reconocimiento de hACE2 (FIG. 22c). A continuación, se evaluó la unión de los mAb humanos a este péptido mínimo y se observó que los miembros neutralizantes potentes del mayor grupo de unión de competición, que incluye COV2-2196, COV2-2165 y COV2-2832 reconoció este péptido (FIG. 22c), lo que sugiere que estos mAb efectúan contactos críticos con el motivo de reconocimiento de hACE2.
Los presentes autores usaron microscopía electrónica de tinción negativa de complejos de trímero S2Pecto/Fab para determinar estructuralmente los epítopos para estos mAb. Los anticuerpos potentemente neutralizantes COV2-2196 y COV2-2165 se unieron al motivo de reconocimiento de hACE2 del SRBD y reconocieron el estado conformacional "abierto" del trímero S2Pecto (FIG. 22d). El modo de acoplamiento de estos dos anticuerpos difirió, aunque la posición y el ángulo de unión en relación con el "cuerpo" de la espícula para uno de ellos era diferente al del otro. COV2-2130, que representa el segundo grupo de unión de competición, se unió al RBD en el trímero de S2Pecto en la posición "cerrada" (FIG. 22d). Dado que COV2-2196 y COV2-2130 no competían por la unión, los presentes autores trataron de producir complejos de ambos Fab unidos al mismo tiempo que al trímero de S2Pecto. Los presentes autores observaron que ambos Fab se unieron simultáneamente cuando el trímero S2Pecto se encontraba en la posición abierta, lo que indica que COV2-2130 puede reconocer el SRBD en ambas conformaciones (FIG. 22e). Al superponer los dos complejos de Fab con la estructura del complejo de RBD:CR302226, los presentes autores observaron que estos anticuerpos se unían a tres sitios distintos en el SRBD, como se había predicho basándose en estos estudios de unión de competición (FIG.
22f).
A continuación, los presentes autores evaluaron la eficacia profiláctica de COV2-2196 o COV2-2130 en monoterapia o una combinación de COV2-2196 COV2-2130 en un nuevo modelo de infección por SARS-CoV-2 en ratones BALB/c en los que se expresa hACE2 en el pulmón después de la transducción por vía intranasal con adenovirus (AdV-hACE2). En este modelo de enfermedad relativamente riguroso, también se administró una sola dosis de anticuerpo anti-Ifnar1 para aumentar la infección vírica y la patogénesis, lo que da como resultado una neumonía intersticial diseminada (A. Hassan y M. Diamond, enviado para publicación). Se transfirió de manera pasiva una sola dosis de mAb COV2-2196 (10 mg/kg), COV2-2130 (10 mg/kg), una combinación de COV2-2196 COV2-2130 (5 mg/kg cada uno) o un mAb de control de isotipo (10 mg/kg) a ratones transducidos con AdV-hACE2 un día después de la exposición intranasal con 4 x 105 UFP de SARS-CoV-2. La profilaxis con COV2-2196 o COV2-2130 o su combinación impidió la pérdida de peso inducida por el SARS-CoV-2 grave a lo largo de la primera semana de la infección (FIG. 23a). Las concentraciones de ARN vírico se redujeron significativamente a los 7 ddi en el pulmón y los sitios distante que incluyen el corazón y el bazo (FIG. 23b). La expresión de los genes de citocinas y quimiocinas interferón gamma (INF-g), IL-6, CXCL10 y CCL2, que son indicadores de la inflamación, también se redujo en el pulmón de ratones tratados a los 7 ddi, el pico de la enfermedad (FIG. 23c).
Los presentes autores también analizaron la eficacia profiláctica de COV2-2196 o COV2-2130 o su combinación en un modelo inmunocompetente que emplea un virus SARS-CoV-2 adaptado a ratón (MA)29 (FIG. 23d). Los análisisin vitrodemostraron que los valores de CI50 para la neutralización eran comparables para los virus SARS-CoV-2tsy MA para estos mAb (datos no mostrados). Cada uno de los tratamientos con mAb se administraron a una dosis de 200 |jg/ratón (~ 8 mg/kg) redujeron las concentraciones de ARN hasta 105-veces a los 2 ddi en el pulmón, cuando se comparó con el grupo de control de isotipo (FIG. 23e, a la izquierda). De manera concordante, todos los animales del grupo de tratamiento con COV2-2196 y COV2-2196 COV2-2130 y 8 de los 10 animales del tratamiento con COV2-2130 dejaron de estar infectados por el virus a los 2 ddi en el pulmón, como se midió mediante una titulación en placa del tejido pulmonar (FIG.
23e, a la derecha). De manera colectiva, estos resultados en ratones sugirieron que COV2-2196 o COV2-2130 solos o en combinación son candidatos prometedores para el tratamiento o la prevención de la COVID-19.
En este caso, los presentes autores definieron el panorama antigénico para un gran panel de mAb altamente potentes contra el SARS-CoV-2. Estos estudios detallados y los estudios de detección que identificaron este panel de mAb procedentes de un panel de cientos25 demuestran que aunque se generan diversos anticuerpos neutralizantes humanos mediante la infección natural por el SARS-CoV-2, solo un pequeño subconjunto de estos mAb son altamente potentes (CI50 <50 ng/ml contra el virus SARS-CoV-2 activo) y por tanto, son adecuados para su desarrollo terapéutico. El análisis bioquímico y estructural de estos potentes mAb definen tres sitios antigénicos principales de vulnerabilidad a la neutralización por mAb humanos generados por la infección natural por SARS-CoV en el SRBD. Se mostró que los mAb representativos de los dos sitios antigénicos más potentes sinergizanin vitroy protegen como un cóctelin vivo.Este hallazgo revela características críticas de la inmunidad humoral efectiva contra el SARS-CoV-2 y sugiere que debe seguirse explorando el papel de la actividad de neutralización sinérgica en las respuestas policlonales. Además, continúa circulando un SARS-CoV-2, la inmunidad poblacional generada por la infección natural puede empezar a seleccionar variantes antigénicas que se escapan de la presión selectiva de los anticuerpos neutralizantes, lo que refuerza la necesidad de dirigirse a múltiples epítopos de la proteína S en las vacunas o agentes inmunoterapéuticos.
Las variantes comunes del gen S por todo el mundo notificadas hasta la fecha se ubican en las posiciones D614G, V483A, L5F, Q675H, H655Y y S939F30, alejadas de las variantes de aminoácidos en los restos 486 o 487 identificados en los presentes estudios de mutación para los principales mAb estudiados en este documento. Los cócteles terapéuticos seleccionados racionalmente como el descrito en este documento ofrecen aún más resistencia al escape del SARS-CoV-2. Estos estudios plantean el escenario para la evaluación preclínica y el desarrollo de los mAb identificados como candidatos para su uso como agentes inmunoterapéuticos contra la COVID-19 en seres humanos.
Disponibilidad de datos.Los mapas de EM se han depositado en el Electron Microscopy Data Bank con los códigos de referencia del EMBD 21965 (S2Pecto apo), EMD-21974 (S2Pecto Fab COVs-2165), EMD-21975 (S2Pecto Fab COVs-2196), EMD-21976 (S2Pecto Fab COVs-2130) y EMD-21977 (S2Pecto Fab COV2-2196 Fab COV2-2130). Los materiales que aparecen en este estudio se pondrán a disposición de los interesados, pero puede necesitarse la firma de un Contrato de transferencia de materiales.
Agradecimientos.Mostramos nuestro agradecimiento a Angela Jones y al personal del laboratorio central de Vanderbilt VANTAGE por la rápida secuenciación, a Ross Trosseth por su ayuda con la gestión y el análisis de datos, a Robin Bombardi y a Cinque Soto de VUMC por su labor de asesoría técnica acerca de las estrategias genómicas, a Arthur Kim, Adam Bailey, Laura VanBlargan, James Earnest, Broc McCune y Swathi Shrihari de WUSTL por su ayuda con los experimentos y reactivos clave y a Kevin M. Tuffy, Seme Diallo, Patrick M. McTamney, y Lori Clarke de AstraZeneca por la generación de reactivos de proteína y pseudovirus y los datos relacionados. Este estudio ha sido promovido por las concesiones de la Agencia de proyectos de investigación avanzados de defensa (DARPA, por sus siglas en inglés) HR0011-18-2-0001 y HR0011-18-3-0001, los contratos con los NIH 75N93019C00074 y 75N93019C00062 y por el Fondo de investigación de la COVID-19 de Dolly Parton en Vanderbilt. Este trabajo está respaldado por la concesión de los NIH 1S10RR028106-01A1 para el Secuenciador de ácidos nucleicos de última generación, instalado en Vanderbilt Technologies for Advanced Genomics (VANTAGE) y el Vanderbilt Institute for Clinical and Translational Research con el soporte de la concesión UL1TR002243 de NCAt S/NIH. S.J.Z. cuenta con el respaldo de los NIH T32 AI095202. J.B.C. cuenta con el soporte de investigación posdoctoral de la Helen Hay Whitney Foundation. D.R.M. cuenta con el respaldo de los NIH T32 AI007151 y la beca del Burroughs Wellcome Fund Postdoctoral Enrichment Program. J.E.C. ha recibido el premio Future Insight de 2019 de Merck KGaA, Darmstadt Alemania, que respaldó esta investigación con una beca de investigación. El contenido es exclusivamente responsabilidad de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista del Gobierno de los Estados Unidos o de los demás promotores.
Contribuciones de autores.Concibieron el proyecto: S.J.Z., P.G., R.H.C., L.B.T., M.S.D., J.E.C.; Obtuvieron la financiación: J.E.C. y M.S.D. Llevaron a cabo los experimentos de laboratorio: S.J.Z., P.G., J.B.C., E.B., R.E.C., J.X.R., A.T., R.S.N., R.E.S., N.S., L.E.W., A.O.H., N.M.K., E.W., J.M.F., L.B.T.,
J. J.S., K.R., Y.-M.L., A.S., L.E.G., D.R.M.; Llevaron a cabo el trabajo computacional: E.C.C., T.J., S.D., L.M.; Supervisaron la investigación: N.L.K, M.S.D., L.B.T., R.S.B., R.H.C., J.E.C. Redactaron el primer borrador del artículo: S.J.Z., P.G., R.H.C., J.E.C.; Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito final.
Conflictos de intereses.R.S.B. ha prestado servicios como consultor de Takeda y Sanofi Pasteur en cuestiones relacionadas con vacunas. M.S.D. es un consultor de Inbios, Vir Biotechnology, NGM Biopharmaceuticals, Eli Lilly, y es vocal de la Junta de Asesoría Científica de Moderna, receptor en el pasado de una beca de investigación de Moderna no relacionada y el receptor actual de una beca de investigación no relacionada de Emergent BioSolutions. J.E.C. ha prestado servicios como consultor para Sanofi y es un vocal de la Junta de Asesoría Científica de CompuVax y Meissa Vaccines, ha sido receptor de becas de investigación no relacionadas de Moderna y Sanofi y es el fundador de IDBiologics, Inc. La Vanderbilt University ha solicitado patentes relacionadas con anticuerpos contra el SARS-CoV-2 que están relacionados con este trabajo. AstraZeneca ha presentado patentes para materiales/hallazgos relacionados con este trabajo. J.J.S., K. R., Y.-M.L. y N.L.K. son empleados de AstraZeneca y en la actualidad son titulares de acciones o de opciones sobre acciones de AstraZeneca. Todos los demás autores no declararon conflictos de intereses.
Información adicional
Se dispone deinformación complementariasobre este artículo.
La correspondencia y las solicitudes de materialesdeben remitirse a J.E.C.
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*Anteriormente notificado, Zostet al., 2020(referencia 25).
Métodos
Anticuerpos.Los anticuerpos humanos estudiados en este artículo se aislaron de muestras de sangre de dos sujetos de América del Norte con infección previa sintomática confirmada por laboratorio por el SARS-CoV-2 contraída en china. Se han descrito con anterioridad los estudios clínicos originales para obtener especímenes después de otorgar el consentimiento informado1 y han sido aprobados por la Junta de Revisión Institucional del Vanderbilt University Medical Center y la Junta de Revisión Ética de la Universidad de Toronto. Los sujetos (un varón de 56 años y una mujer de 56 años) son una pareja casada y residente en Wuhan, China que viajaron a Toronto, Canadá, donde se obtuvieron las PBMC mediante leucaféresis 50 días después de la aparición de los síntomas. Los anticuerpos se aislaron usando diversas herramientas para el aislamiento y clonación de linfocitos B específicos para un solo antígeno y de los genes variables de anticuerpo que codifican anticuerpos monoclonales1.
Cultivo celular.Se mantuvieron células Vero E6 (CRL-1586, Colección Americana de Cultivos Tipo (Colección Americana de Cultivos Tipo, ATCC), Vero CCL81 (ATCC), HEK293 (ATCC) y HEK293T (ATCC)
a 37°C en CO2 al 5 % en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) que contenía suero fetal bovino (FBS) al 10 % (vol/vol) inactivado por calor, HEPES 10 mM a pH 7.3, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales 1* y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina. Las células Vero-furina se obtuvieron de T. Pierson (NIH) y se han descrito con aterioridad2. Las células Expi293F (ThermoFisher Scientific, A1452) se mantuvieron a 37 °C en CO2 al 8 % en medio de expresión Expi293F (ThermoFisher Scientific, A1435102). Las células ExpiCHO (ThermoFisher Scientific, A29127) se mantuvieron a 37 °C en CO2 al 8 % en medio de expresión ExpiCHO (ThermoFisher Scientific, A2910002). El análisis de microplasmas de los cultivos de Expi293F y ExpiCHO se llevó a cabo mensualmente usando un kit de detección de micoplasmas basado en la PCR (ATCC, 30-1012K).
Virus.La cepa del SARS-CoV-22019 n-CoV/USA_WA1/2020 se obtuvo de los Centros para el control y la prevención de enfermedades (cedidas gratuitamente por Natalie Thornburg). El virus se pasó en células Vero CCL81 y se titularon mediante un ensayo en placa en células Vero E6. Todos los estudios con SARS-CoV-2 infeccioso habían recibido la autorización por parte de la Washington University School of Medicine o la Junta de bioseguridad institucional de UNC-Chapel Hill y se llevaron a cabo en instalaciones aprobadas de BSL3 usando respiradores purificadores del aire debidamente alimentados y equipos de protección personal.
Antígenos y proteínas recombinantes.Se sintetizó un gen que codifica el ectodominio de una proteína espícula del SARS-CoV-2 estabilizada en conformación antes de la fusión (S2Pecto) y se clonó en un vector de expresión de ADN plasmídico para células de mamífero. Se ha notificado con anterioridad un antígeno de proteína S diseñado de un modo similar con dos prolinas y la eliminación del sitio de escisión de furina para la estabilidad de la forma previa a la fusión de S3. En resumen, este gen incluye el ectodominio del SARS-CoV-2 (hasta el resto 1,208), un dominio de trimerización de fibritina T4, una secuencia de biotinilación específica para el sitio de AviTag y un marcador 8x-His C-terminal. Para estabilizar la construcción en la conformación antes de la fusión, los presentes autores incluyeron las sustituciones K986P y V987P y mutaron el sitio de escisión de furina en los restos 682-685 de RRAR a ASVG. Esta proteína espícula 2P estabilizada recombinante (denominada en el presente documento como S2Pecto) se aisló mediante cromatografía de afinidad de metales en columnas HisTrap Excel (GE Healthcare) y las preparaciones de proteína se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaños en una columna Superose 6 Increase 10/300 (GE Healthcare). La presencia de proteína S trimérica en la conformación antes de la fusión se verificó mediante microscopía electrónica de tinción negativa! Para la microscopía electrónica con S y Fab, se expresó una variante de S2Pecto que carece de AviTag, pero que contiene un marcador C-terminal de Twin-Strep, de manera similar a lo descrito anteriormente3. La proteína expresada se aisló mediante cromatografía de afinidad de metales en columnas HisTrap Excel (GE Healthcare), seguido de purificación adicional en una columna StrepTrap HP (GE Healthcare) y cromatografía de exclusión por tamaños TSKgel G4000SW XL (TOSOH). Para expresar el subdominio del SRBD de la proteína S del SARS-CoV-2, se clonaron los restos 319-541 en un vector de expresión en mamíferos cadena abajo de un péptido de señal de IL-2 y cadena arriba de un sitio de escisión de trombina, un AviTag y un marcador de 6x-His. La proteína RBD fusionada al domino Fc de IgG1 de ratón (denominada RBD-mFc), se adquirió de Sino Biological (40592-V05H). Para el mapeo de epítopos mediante barrido de alanina, se clonaron el RBD del SARS-CoV-2 (restos 334-526) o variantes de RBD con una sola mutación con una secuencia líder de CD33 N-terminal y un enlazador GSSG C-terminal, AviTag, enlazador GSSG y un marcador 8xHis. Las proteínas espícula se expresaron en células FreeStyle 293 (Thermo Fisher) y se aislaron mediante cromatografía de afinidad usando una columna HisTrap (GE Healthcare), seguido de cromatografía de exclusión por tamaños con una columna Superdex200 (GE Healthcare). Las proteínas purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE para garantizar la pureza y los pesos moleculares adecuados.
Preparación de la rejilla de tinción para microscopía electrónica (EM), formación de imágenes y procesamiento de la proteína S2Pecto del SARS-CoV-2 o de complejos de S2Pecto/Fab.Para tomar imágenes por EM, los Fab se produjeron digiriendo IgG recombinantes purificadas por cromatografía usando enzima cisteína proteasa inmovilizada en resina (FabALACTICA, Genovis). La digestión se produjo en fosfato de sodio 100 mM, NaCl 150 mM a pH 7.2 durante ~16 h a TA. Para eliminar el Fc escindido y las IgG intactas, se incubó la mezcla de digestión con resina para Fc CaptureSelect (Genovis) durante 30 min a t A en tampón de PBS. En caso necesario, se cambió el tampón del Fab por tampón Tris mediante centrifugación con una columna de centrifugación Zeba (Thermo Scientific).
Para detectar y obtener imágenes de la proteína S2Pecto del SARS-CoV-2 teñida negativamente (NS) en complejo con Fab humanos, se incubaron las proteínas durante ~1 h y se aplicaron aproximadamente 3 |jl de la muestra a concentraciones de aproximadamente 10 a 15 jg/m l sobre una rejilla descargada de brillo con una película de carbono continua sobre rejillas para EM de malla de cobre de 400 cuadrículas (Electron Microscopy Sciences). Las rejillas se tiñeron con formiato de uranilo (UF)4 al 0.75 %. Las imágenes se tomaron con una cámara Gatan US40004k * 4k CCD usando un microscopio electrónico de transmisión FEI TF20 (TFS) a 200 keV y controlado con SerialEM5. Todas las imágenes se tomaron a una ampliación de 50,000x con un tamaño de píxel de 2.18 Á/píxel en modo de baja dosis con un desenfoque de 1.5 a 1.8 |jm. La dosis total de las micrografías fue de ~25 a 38 e-/Á2. El procesamiento de imágenes se llevó a cabo usando el paquete informático cryoSPARC6. Se importaron las imágenes y las partículas se estimaron mediante CTF. Posteriormente, se eliminó el ruido de las imágenes y se seleccionaron con Topaz7. Las partículas se extrajeron con un tamaño de recuadro de 256 píxeles y se agruparon a 128 píxeles. Se realizaron las medias en la clase 2D y se seleccionaron las clases buenas para un modeloab-initioy refinado sin simetría. Para el modelo de EM de acoplamiento de la proteína S2Pecto del SARS-CoV-2, el modelo seleccionado (PDB: 6VXX) se usó en Chimera8 para acoplar el mapa de EM (véase también la tabla C para más detalles). Para los complejos SARS-CoV-2 S2Pecto/Fab COV2-2165 y SARS- CoV-2 S2Pecto/Fab COV2-2165, el modelo abierto del SARS-CoV-2 (PDB: 6VYB) y del Fab (Fab: 12E8) se usaron en Chimera para acoplar los mapas de EM (véase también la tabla C para más detalles). Para el complejo SARS-Cov-2 S2Pecto/Fab COV2-2130, el modelo cerrado y el Fab (PDB: 12E8) se usaron en Chimera para acoplar el mapa de EM (véase también la tabla C para más detalles). Todas las imágenes se obtuvieron con Chimera.
Producción y purificación del mAb.Las secuencias de los mAb que se habían sintetizado (Twist Bioscience) y clonado en un vector de expresión monocistrónico de IgG1 (denominado pTwist-mCis_G1) se usaron para la secreción de mAb en cultivos de células de mamífero. Este vector contiene una secuencia 2A mejorada y un enlazador GSG que permite la expresión simultánea de los genes de cadena pesada y ligera del mAb a partir de una sola construcción tras la transfección9. Los inventores describieron con anterioridad la expresión a microescala de mAb en 1 ml de cultivos de ExpiCHO en placas de 96 pocillos1. Para la expresión del mAb a mayor escala, los inventores llevaron a cabo la transfección (de 1 a 300 ml por anticuerpo) de los cultivos de células CHO usando el sistema de expresión y el protocolo de Gibco™ ExpiCHO™ para tubos mini biorreactores de 50 ml (Corning) como se describe por el proveedor. Se purificaron sobrenadantes de cultivo usando HiTrap MabSelect Sure (Cytiva, anteriormente GE Healthcare Life Sciences) en un sistema de cromatografía de proteínas de 24 columnas paralelas (Protein BioSolutions). Se intercambió el tampón de los mAb purificados a PBS, se concentraron usando unidades de filtro para centrifugación Amicon® Ultra-450KDa (Millipore Sigma) y se conservaron a 4 °C hasta su uso.
Ensayos de unión ELISA.Se recubrieron los pocillos de placas de microtitulación de 96 pocillos con proteína S del SARS-CoV-2 o proteína SRBD del SARS-CoV-2 recombinante a 4 °C durante una noche. Las placas se bloquearon con leche desnatada deshidratada al 2 % y suero de cabra normal al 2 % en DPBS que contenía Tween-20 al 0.05 % (DPBS-T) durante 1 h. Los anticuerpos unidos se detectaron usando anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con HRP (peroxidasa de rábano picante) (Southern Biotech) y sustrato t Mb (3,3',5,5'-tetrametilbencidina) (Thermo Fisher Scientific). Se monitorizó el revelado del color, se añadió ácido clorhídrico 1 N para detener la reacción y se midió la absorbancia a 450 nm usando un espectrofotómetro (Biotek). Para los ensayos de respuesta a la dosis, se aplicaron diluciones seriadas de mAb purificados a los pocillos por triplicado y se detectó la unión del mAb como se ha detallado anteriormente. Se determinaron los valores de concentración eficaz semimáxima (CE50) para la unión usando el programa informático Prism v8.0 (GraphPad) después de la transformación log de la concentración del mAb usando análisis de regresión no lineal de dosis-respuesta sigmoidal.
ELISA de unión a péptido de motivo mínimo de unión a ACE2 del RBD.Se recubrieron los pocillos de una placa de microtitulación de 384 pocillos con 1 jg/m l de estreptavidina a 4 °C durante una noche. Las placas se bloquearon con BSA al 0.5 % en DPBS que contenía Tween-20 al 0.05 % (DPBS-T) durante 1 h. Las placas se lavaron 4x con 1x PBST y se añadieron 2 jg/m l de péptido de motivo de unión a ACE2 biotinilado (n.° de cat. LT5578, de LifeTein, LLC) para que se uniese a la estreptavidina durante 1 h a TA. Los mAb purificados se diluyeron en tampón de bloqueo, se añadieron a los pocillos y se incubaron durante 1 h a TA. Los anticuerpos unidos se detectaron usando anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado a HRP (peroxidasa de rábano picante) (n.° de cat. 2014-05, Southern Biotech) y sustrato de TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina) (Thermo Fisher Scientific). Se monitorizó el revelado del color, se añadió ácido clorhídrico 1 N para detener la reacción y se midió la absorbancia a 450 nm usando un espectrofotómetro (Biotek). Para los ensayos de respuesta a la dosis, se aplicaron diluciones seriadas de factor 3, comenzando a una concentración de 10 jg/ml, de mAb purificados a los pocillos por triplicado y se detectó la unión del mAb como se ha detallado anteriormente.
Análisis de la unión de anticuerpos a proteínas RBD variantes con alanina o mutaciones puntuales de alanina.Se llevó a cabo la interferometría de luz de biocapas (BLI) usando un instrumento Octet RED96 (ForteBio; Pall Life Sciences) y proteína RBD de tipo silvestre o una proteína RBD mutante con un solo cambio de aminoácidos en posiciones definidas a alanina o arginina. La unión de las proteínas RBD se confirmó capturando en primer lugar con proteína RBD de tipo silvestre o mutada marcada con octa-His a partir de una solución a 10 jg/m l (=200 nM) sobre biosensores de Penta-His durante 300 s. Posteriormente, se sumergieron las puntas de los biosensores en tampón de unión (PBS/Tween-20 al 0.2 %) durante un lavado de 60 s, seguido de inmersión en una solución que contiene mAb 150 nM durante 180 s (asociación), seguido de una inmersión en tampón de unión durante 180 s (disociación). La respuesta para cada proteína RBD mutante se normalizó con la de la proteína RBD de tipo silvestre.
Prueba de neutralización de reducción de focos (FRNT).Se incubaron diluciones seriadas de los mAb con 102 FFU de SARS-CoV-2 durante 1 h a 37 °C. Los complejos de mAb-virus se añadieron a monocapas de cultivos de células Vero E6 en placas de 96 pocilios durante 1 h a 37 °C. Posteriormente, se superpusieron las células con metilcelulosa al 1%(p/v) en medio esencial mínimo (MEM) suplementado para que contuviese FBS inactivado por calor al 2 %. Las placas se fijaron durante 30 h después eliminando las superposiciones y se fijaron con PFA al 4 % en PBS durante 20 min a temperatura ambiente. Las placas se incubaron secuencialmente con 1 |jg/ml de anticuerpo anti-S10 rCR3022 y anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP) en PBS suplementado con saponina al 0.1 % (p/v) (Sigma) y seroalbúmina bovina (BSA) al 0.1 %. Los focos de células infectadas por SARS-CoV-2 se visualizaron usando sustrato de peroxidasa TrueBlue (KPL) y se cuantificaron en un analizador ImmunoSpot 5.0.37 Macro (Cellular Technologies). Los datos se procesaron usando el programa informático Prism, versión 8.0 (GraphPad).
Generación de lentivirus seudotipado con proteína S.Se sembraron células 293 en suspensión y se transfectaron con un vector lentivírico basado en el VIH de tercera generación que expresa luciferasa, junto con plásmidos de empaquetamiento que codifican lo siguiente: proteína espícula del SARS-CoV-2 con una eliminación de 19 aminoácidos C-terminal, Rev y Gag-pol. El medio se cambió de 16 a 20 h después de la transfección y se recogió el sobrenadante que contenía el virus 24 h después. Los residuos celulares se retiraron mediante centrifugación a baja velocidad y el sobrenadante se hizo pasar a través de una unidad de filtro de 0.45 jm . El pseudovirus se sedimentó mediante ultracentrifugación y se resuspendió en PBS hasta obtener una solución madre concentrada 100 veces.
Ensayo de neutralización de pseudovirus.Se prepararon diluciones seriadas de los mAb en una placa de microtitulación de 384 pocillos y se preincubaron con pseudovirus durante 30 minutos a 37 °C, a las que se añadieron células 293 que expresan de manera estable ACE2 humana. La placa se retornó a la estufa de incubación a 37 °C y 48 h después, se midió la actividad de luciferasa en un lector de placas multimodal EnVision 2105 (Perkin Elmer) usando el sistema de ensayo de luciferasa Bright-Glo™ (Promega), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se calculó el porcentaje de inhibición en relación con el control de sol pseudovirus. Los valores de CI50 se determinaron mediante regresión no lineal usando el programa informático Prism, versión 8.1.0 (GraphPad). Se determinó el valor medio de CI50 de cada anticuerpo a partir de un mínimo de 3 experimentos independientes.
Medición de la neutralización sinérgica mediante una combinación de anticuerpos.La sinergia se definió como una mayor actividad neutralizante mediada por un cóctel de dos mAb, cuando se compara con la mediada por mAb individuales, a la vez que la concentración total de anticuerposin vitro.Para evaluar si dos mAb son sinérgicos en un cóctel para neutralizar el SARS-CoV-2, los inventores usaron una estrategia anteriormente notificada para cuantificar la sinergia11. Para evaluar la significación del efecto beneficioso de combinar los mAb, las respuestas de combinación observadas (matriz de dosis-respuesta) se compararon con las respuestas esperadas calculadas mediante modelos de puntuación de sinergia11. La neutralización del virus se midió en una prueba de neutralización de reducción de focos (FRNT) convencional que usa SARS-CoV-2 de tipo silvestre y monocapas de cultivo de células Vero-E6. Los mAb individuales COV2-2196 y COV2-2130 se mezclaron a diferentes concentraciones para evaluar la actividad neutralizante de diferentes relaciones de los mAb en el cóctel. Específicamente, se mezclaron diluciones de factor siete del mAb COV2-2130 (comenzando a 500 ng/ml) con cada una de las nueve diluciones del mAb COV2-2196 (comenzando a 500 ng/ml) en un volumen total de 50 j l por cada condición y después se incubaron con 50 j l de SARS-CoV-2 activo en medio de cultivo celular (medio RPMI-1640 suplementado con FBS al 2 %) antes de su aplicación a células Vero-E6 confluentes cultivadas en placas de 96 pocillos. Los valores de control incluyeron aquellos para determinar la dosis-respuesta de la actividad neutralizante medida por separado para el mAb COV2-2196 o COV2-2130 individual, que se evaluaron a las mismas dosis que en el cóctel. Cada medición se efectuó por duplicado. Los inventores calcularon a continuación el porcentaje de neutralización del virus para cada condición y después calcularon el valor de la puntuación de sinergia, lo que definió la interacción entre estos dos mAb en el cóctel. Una puntuación de sinergia menor de - 10 indica antagonismo, una puntuación de -10 a 10 indica un efecto aditivo y una puntuación mayor de 10 indica un efecto sinérgico11.
Cuantificación de mAb.La cuantificación de los mAb purificados se llevó a cabo mediante espectrofotometría UV usando un espectrofotómetro NanoDrop y teniendo en cuenta el coeficiente de extinción de IgG humana.
Análisis de unión de competición mediante interferometría de biocapas.Se sumergieron biosensores de captura anti-Fc de IgG de ratón (ForteBio 18-5089) en un instrumento de interferometría de biocapas Octet HTX (ForteBio) durante 10 minutos en tampón de cinética 1x (Molecular Devices 18-1105), seguido de una medición de la señal basal durante 60 segundos. Se inmovilizó RBD del SARS-CoV-2 recombinante fusionado a IgG1 de ratón (RBD-mFc, Sino Blological, 40592-V05H) sobre las puntas de biosensor durante 180 segundos. Después de una etapa de lavado en tampón de cinética 1x durante 30 segundos, se incubó el anticuerpo de referencia (5 jg/m l) con el biosensor que contiene el antígeno durante 600 segundos. Los anticuerpos de referencia incluyeron el mAb humano contra el SARS-CoV CR3022 y COV2-2196. Después de una etapa de lavado en tampón de cinética 1x durante 30 segundos, se sumergieron las puntas del biosensor en el segundo anticuerpo (5 jg/m l) durante 300 segundos. La unión máxima de cada anticuerpo se normalizó a un control de solo tampón. Se restó el bloqueo entre similares. La comparación entre la señal máxima de cada anticuerpo se usó para determinar el porcentaje de unión de cada anticuerpo. Una reducción en la señal máxima hasta <33 % de la señal sin competencia se consideró competición completa de la unión al segundo anticuerpo, en presencia del anticuerpo de referencia. Una reducción en la señal máxima de hasta entre un 33 y un 67 % de la señal sin competencia se consideró competición intermedia de la unión al segundo anticuerpo en presencia del anticuerpo de referencia. Un porcentaje de unión de la señal máxima >67 % se consideró ausencia de competición de la unión por el segundo anticuerpo, en presencia del anticuerpo de referencia.
Análisis de inhibición de la unión a ACE-2 de alto rendimiento.Se recubrieron los pocillos de placas de microtitulaciónde 384 pocilios con proteína S2Pecto del SARS-CoV-2 recombinante a 4 °C durante una noche. Las placas se bloquearon con leche desnatada deshidratada al 2 % y suero de cabra normal al 2 % en DPBS-T durante 1 h. Los mAb purificados de la expresión a microescala se diluyeron dos veces en tampón de bloqueo, comenzando a 10 |jg/ml por triplicado, se añadieron a los pocillos (20 jl/pocillo), y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Se añadió ACE2 humana recombinante con proteína marcadora FLAG C-terminal a los pocillos a 2 jg/ml en un volumen de 5 jl/pocillo (concentración final de 0.4 jg/ml de ACE2) sin lavado del anticuerpo y después, se incubó durante 40 min a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y se detectó ACE2 unida usando anticuerpo anti-FLAG conjugado a HRP (Signa) y sustrato de TMB. La unión a ACE2 sin anticuerpo sirvió como control. La señal obtenida para la unión de ACE2 en presencia de cada dilución de anticuerpo analizado se expresó como un porcentaje de la unión de ACE2 sin anticuerpo después de restar la señal de fondo. Se determinaron los valores de concentración inhibidora semimáxima (CI50) para la inhibición mediante mAb de la unión de proteína S2Pecto a ACE2 tras la transformación logarítmica de la concentración de anticuerpo usando análisis de regresión no lineal de dosis-respuesta sigmoidal (Programa informático Prism, GraphPad Prism, versión 8.0).
Ensayo de bloqueo de ACE2 usando biosensor de interferometría de biocapas. Se sumergieron biosensores anti-IgG de ratón en un instrumento de interferometría de biocapas Octet HTX (ForteBio) durante 10 minutos en tampón de cinética 1x, seguido de una medición de la señal basal durante 60 segundos. Se inmovilizó RBD del SARS-CoV-2 recombinante fusionado a IgG1 de ratón (RBD-mFc, Sino Blological, 40592-V05H) sobre las puntas de biosensor durante 180 segundos. Después de una etapa de lavado en tampón de cinética 1x durante 30 segundos, se incubó el anticuerpo de (5 |jg/ml) con el biosensor que recubierto con el antígeno durante 600 segundos. Después de una etapa de lavado en tampón de cinética 1x durante 30 segundos, se sumergieron las puntas del biosensor en el receptor de ACE2 (20 jg/ml) (Sigma-Aldrich, SAE0064) durante 300 segundos. La unión máxima de ACE2 se normalizó a un control de solo tampón. El porcentaje de unión de ACE2 en presencia de anticuerpo se comparó con la unión máxima a ACE2. Se consideró que una reducción en la señal máxima hasta <30 % representaba bloqueo de ACE2.
Análisis de unión competitiva de alto rendimiento. Se recubrieron los pocillos de placas de microtitulación de 384 pocillos con proteína S del SARS-CoV-2 recombinante a 4 °C durante una noche. Las placas se bloquearon con BSA al 2 % en DPBS que contenía Tween-20 al 0.05 % (DPBS-T) durante 1 h. Los mAb no marcados purificados a escala micro se diluyeron diez veces en tampón de bloqueo, se añadieron a los pocillos (20 jl/pocillo) por cuadruplicado y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Se añadió una preparación biotinilada de un mAb recombinante basándose en la secuencia génica variable del mAb CR302212 anteriormente descrito y también los mAb recién identificados, COV2-2096, -2130 y -2196, que reconocen diferentes regiones antigénicas de la proteína S del SARS-CoV-2 a cada uno de cuatro pocillos con el mAb respectivo a 2.5 jg/ml en un volumen de 5 jl/pocillo (concentración final de 0.5 jg/ml de mAb biotinlado), sin lavar el anticuerpo no marcado y después se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y los anticuerpos unidos se detectaron usando avidina conjugada a HRP (Sigma) y sustrato de TMB. La señal obtenida para la unión del anticuerpo de referencia marcado con biotina en presencia del anticuerpo de ensayo no marcado se expresó como un porcentaje de la unión del anticuerpo de referencia solo después de restar la señal de fondo. Se consideró que los mAb analizados competían si su presencia reducía la unión del anticuerpo de referencia a menos del 41 % de su unión máxima y que no competían si la señal era mayor del 71 %. Se consideró que un nivel del 40-70 % era competición intermedia.
Análisis de unión de los mAb a mutantes de RBD de alanina o arginina. Se llevó a cabo una interferometría de luz de biocapas usando un instrumento Octet RED96 (ForteBio; Pall Life Sciences). La unión se confirmó capturando en primer lugar los mutantes de RBD marcados con Octa-His a 10 jg/ml (=200 nM) sobre biosensores de Penta-His durante 300 s. Después se sumergieron los biosensores en tampón de unión (PBS/TWEEN 20 al 0.2 %) para un lavado durante 60 s seguido de inmersión en una solución que contenía mAb 150 nM durante 180 s (asociación), seguido de una inmersión posterior en tampón de unión durante 180 s (disociación). La respuesta para cada RBD mutante se normalizó con la de RBD de tipo silvestre.
Experimentos en ratones usando ratones transducidos conh A C E 2.Los estudios en animales se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones en la Guía de cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Los protocolos fueron aprobados por la Junta institucional de cuidado y uso de animales en la Washington University School of Medicine (número de garantía A3381-01). Las inoculaciones del virus se efectuaron bajo anestesia, que se indujo y mantuvo con ketamina clorhidrato y xilazina y se hizo todo lo posible para minimizar el sufrimiento de los animales.
Se adquirieron ratones BALB/c de Jackson Laboratories (estirpe 000651). Se administró a ratones hembra (10-11 semanas de edad) una sola inyección intraperitoneal de 2 mg de mAb anti-lfnar1 (MAR1-5A3 13, Leinco) un día antes de la administración intranasal de 2.5 x 108 u Fp de AdV-hACE2. Cinco días después de la transducción con AdV, se inoculó a los ratones con 4 x 105 UFP de SARS-CoV-2 por vía intranasal. Se administraron mAb humanos anti-SARS-CoV-2 o mAb de control de isotipo 24 horas después de la inoculación del SARS-CoV-2. Se controló el peso a diario y se sacrificó a los animales en el día 5 o 7 después de la infección y se extrajeron tejidos.
Medición de la carga vírica. Los tejidos se pesaron y homogeneizaron con bolas de circonia en un instrumento MagNA Lyser (Roche Life Sciences) en 1 ml de medio DMEM suplementado con FBS inactivado por calor al 2 %. Los homogeneizados de tejido se clarificaron por centrifugación a 10,000 rpm durante 5 min y se conservaron a -80°C. El ARN se extrajo usando el kit de aislamiento de ARN total MagMax mirVana (Thermo Scientific) y una máxima de extracciónde 96 pocilios Kingfisher Flex (Thermo Scientific). Se diseñaron cebadores TaqMan para dirigirse a una región conservada del gen N usando la secuencia del SARS-CoV-2 (MN908947) como guía (cebador L: ATGCTGCAATCGTGCTACAA; cebador R: GACTGCCGCCTCTGCTC; sonda: /56-FAM/TCAAGGAAC/ZEN/AACATTGCCAA/3IABkFQ/). Para determinar una curva patrón de ARN, los presentes inventores generaron segmentos concatenados del gen N en un fragmento de gBlocks (IDT) y clonaron esto en el vector PCR-II topo (Invitrogen). El vector se linealizo y se llevó a cabo la transcripción de ARN dependiente de T7-ADNin vitropara generar materiales para una curva patrón cuantitativa.
Mediciones de ARNm de citocinas y quimiocinas. Se aisló ARN de homogeneizados de pulmón a los 7 ddi como se ha descrito anteriormente. El ADNc se sintetizó a partir de ARN tratado con DNasa usando el kit de retrotranscripción en ADN de alta capacidad (Thermo Scientific) con la adición de inhibidor de RNasa, siguiendo el protocolo del fabricante. La expresión de citocinas y quimiocinas se determinó usando mezcla maestra para PCR TaqMan Fast Universal (Thermo Scientific) con conjuntos de cebadores/sondas específicos paraIFNy(IDT: Mm.PT.58.41769240),IL-6(Mm.PT.58.10005566),CXCL10(Mm.PT.58.43575827),CCL2(Mm.PT.58.42151692) y los resultados se normalizaron a las concentraciones deGAPDH(Mm.PT.39a.1). El factor de cambio se determinó usando el método de 2-AACt que compara a los ratones tratados con mAb específico contra el SARS-CoV-2 o de control de isotipo con los controles no expuestos previamente al virus.
Experimentos en ratones usando ratones de tipo silvestre.Los estudios en animales se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones en la Guía de cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Los protocolos fueron aprobados por la Junta institucional de cuidado y uso de animales en la UNC Chapel Hill School of Medicine of Medicine (número de garantía de bienestar animal de los NIH/PHS D16-00256 (A3410-01)). Las inoculaciones del virus se efectuaron bajo anestesia, que se indujo y mantuvo con ketamina clorhidrato y xilazina y se hizo todo lo posible para minimizar el sufrimiento de los animales.
Virus del SARS-CoV-2 adaptado a ratón (MA-SARS-CoV-2).El virus se generó como se ha descrito anteriormente14. El virus se propagó en células Vero E6 cultivadas en DMEM con clon II fetal al 10 % y Pen/Strep al 1 %. El título de virus se determinó mediante un ensayo en placas. En resumen, el virus se diluyó en serie y se inoculó en monocapas confluentes de células Vero E6, seguido de superposición en agarosa. Las placas se visualizaron en el día 2 después de la infección tras teñirlas con colorante rojo neutro.
Ratones de tipo silvestre. En los experimentos se usaron ratones BALB/c de 12 meses de edad procedentes de Envigo. Se aclimató a los ratones a las condiciones de BSL3 durante al menos 72 h antes de comenzar los experimentos. A las 6 horas antes de la infección, se trató profilácticamente a los ratones con 200 |jg de anticuerpos monoclonales humanos mediante inyección intraperitoneal. Al día siguiente, se anestesió a los ratones con una mezcla de ketamina y xilazina y se les inyectó por vía intranasal 105 UFP de MA-SARS-CoV-2 diluido en PBS. Se midió la pérdida de peso diaria y a los dos días después de la infección, se sacrificó a los ratones mediante sobredosis de isoflurano antes de la extracción de tejidos.
Ensayo en placa de homogeneizados de tejido pulmonar. Se homogeneizó el lóbulo inferior del pulmón derecho en 1 ml de PBS usando un MagnaLyser (Roche). Se titularon diluciones seriadas en monocapas de cultivos de células Vero E6 y las placas de virus se visualizaron mediante tinción de rojo neutro a los dos días de la inoculación. El límite de detección del ensayo es de 100 UFP por pulmón.
Cuantificación y análisis estadístico.Se determinaron las estadísticas descriptivas de media ± EEM o media ± DT para las variables continuas, como se ha indicado. Los replicados técnicos y biológicos se describen en las leyendas de las figuras. En los estudios en ratones, se determinaron los análisis del cambio de peso y la carga víricain vivomediante ANOVA bilateral y pruebas de Mann-Whitney, respectivamente. Los análisis estadísticos se realizaron usando Prism v8.0 (GraphPad).
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11 lanevski, A., He, L., Aittokallio, T. y Tang, J. SynergyFinder: a web application for analyzing drug combination dose-response matrix data.B io in fo rm a tics33, 2413-2415, doi:10.1093/bioinformatics/btx162 (2017).
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14 Dinnon KH,e t al.A mouse-adapted SARS-CoV-2 model for the evaluation of COVID-19 medical countermeasures.b io R x iv2020.05.06.081497; doi: https://doi.org/10.1101/2020.05.06.081497 (2020).
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TABLA 3 - SECUENCIAS DE CADENA PESADA
TABLA 4 - SECUENCIAS DE CADENA LIGERA
Todas las composiciones y métodos divulgados y reivindicados en el presente documento pueden producirse y efectuarse sin experimentación innecesaria a la vista de la presente divulgación. Aunque las composiciones y métodos de la presente divulgación se han descrito en términos de realizaciones preferidas, será evidente para los expertos en la materia que pueden aplicarse variaciones a las composiciones y métodos y en las etapas o en la secuencia de las etapas del método descrito en el presente documento. Más específicamente, resultará evidente que los agentes descritos en el presente documento pueden sustituirse por determinados agentes que están relacionados tanto química como fisiológicamente, obteniéndose resultados idénticos o similares.
VII. REFERENCIAS
Las siguientes referencias, en tanto que proporcionan detalles procedimentales o de otro tipo ilustrativos complementarios a los expuestos en el presente
Patente de los Estados Unidos
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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une a una proteína espícula de la superficie del SARS-CoV-2, en donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo comprende
una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:59, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:60, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:61, una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:89, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:90, una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:91.
2. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento comprende secuencias variables de cadena pesada y ligera que tienen al menos un 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad respecto de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34.
3. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33 y una secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34.
4. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a una proteína espícula de superficie de SARS-CoV-2, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:69, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:70, una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:98, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:99, una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de<s>E<q>ID NO:100.
5. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende secuencias variables de cadena pesada y ligera que tienen al menos 70%, 80%, 90% o 95% de identidad a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40.
6. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39 y una secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40.
7. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una mutación YTE.
8. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de IgG.
9. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 8, en donde el anticuerpo o fragmento de IgG es un anticuerpo de IgG1.
10. Una composición farmacéuticamente aceptable que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, opcionalmente en donde la composición se formula para administración intravenosa.
11. Una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 4-6.
12. La composición farmacéuticamente aceptable de la reivindicación 11, en donde el primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una mutación YTE y el segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una mutación YTE.
13. La composición farmacéuticamente aceptable de la reivindicación 11 o 12, en donde el primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo de IgG1 y el segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo de IgG1.
14. Una combinación de un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a una proteína espícula de superficie de SARS-CoV-2 y un segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a una proteína espícula de superficie de SARS-CoV-2 para uso en un método para tratar o prevenir la infección por SARS-CoV-2 en un sujeto, en donde
el primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:59, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:60, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:61, una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:89, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:90, una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:91; y
el segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:69, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:70, una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:98, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:99, una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100.
15. La combinación para uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33 y una secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34.
16. La combinación para uso de acuerdo con la reivindicación 14 o 15, en donde el segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39 y una secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40.
17. La combinación para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en donde el primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una mutación YTE y el segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una mutación YTE.
18. La combinación para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14-17, en donde el primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de IgG y el segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de IgG.
19. La combinación para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14-18, en donde el primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo de IgG1; y el segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo de IgG1.
20. La combinación para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14-19, en donde el primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo se formula para administración intravenosa y/o el segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo se formula para administración intravenosa.
21. La combinación para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14-20, en donde el primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo y el segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo están en la misma composición farmacéuticamente aceptable.
22. La combinación para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14-21, en donde el sujeto:
(i) tiene 60 años o más,
(ii) está inmunocomprometido, o
(iii) padece de un trastorno respiratorio y/o cardiovascular.
ES21719462T 2020-03-26 2021-03-25 Anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (sars-cov-2) Active ES2973425T3 (es)

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