ES2966890T3 - Nuevos anticuerpos anti-PD-L1 - Google Patents

Abstract

La presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales contra el ligando 1 de muerte celular programada de la proteína (PD-L1), que puede bloquear la unión de PD-L1 a PD-1 y, por lo tanto, bloquear la función inhibidora de PD-L1 en células T que expresan PD-1. . Los anticuerpos de la divulgación proporcionan agentes muy potentes para el tratamiento de múltiples cánceres mediante la modulación de la función inmune humana. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevos anticuerpos anti-PD-LI

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente divulgación se refiere de manera general a nuevos anticuerpos anti-PD-L1.

ANTECEDENTES

Evidencias crecientes de resultados preclínicos y clínicos han demostrado que el dirigirse a los puntos de control inmunitarios se está convirtiendo en el enfoque más prometedor para tratar a los pacientes con cáncer. La muerte celular programada 1, una de las proteínas de los puntos de control inmunitarios, desempeña un papel fundamental en la limitación de la actividad de células T, que proporcionan un importante mecanismo de resistencia inmunitaria mediante el cual las células tumorales escapan a la vigilancia inmunitaria. La interacción entre PD-1, expresada en las células T activadas, y PD-L1, expresada en las células tumorales, regula negativamente la respuesta inmunitaria y amortigua la inmunidad antitumoral. La expresión de PD-L1 en los tumores se correlaciona con una supervivencia reducida en cánceres de esófago, páncreas y otros tipos de cáncer, destacando esta vía como un nuevo objetivo prometedor para la inmunoterapia tumoral. Las empresas farmacéuticas, como Bristol-Myers Squibb (BMS), Merck, Roche y GlaxoSmithKline (GSK), han desarrollado múltiples agentes dirigidos contra la vía PD-1. Los datos de los ensayos clínicos han demostrado evidencias tempranas de una actividad clínica duradera y un perfil de seguridad alentador en pacientes con varios tipos de tumores. El nivolumab, un fármaco de PD-1 desarrollado por BMS, se está situando en la etapa central del campo de la nueva generación. Actualmente en 6 estudios de fase avanzada, el tratamiento estimuló la contracción tumoral en tres de los 5 grupos de cáncer estudiados, incluyendo el 18% de 72 pacientes con cáncer de pulmón, cerca de un tercio de 98 pacientes con melanoma y el 27% de 33 pacientes con cáncer de riñón. Desarrollado por Merck, el lambrolizumab es un anticuerpo monoclonal de IgG4 completamente humano que actúa contra PD-1, que obtuvo la designación de nuevo avance de la FDA tras la presentación de impresionantes datos IB para el cáncer de piel. Los resultados de un estudio de fase IB han mostrado una respuesta antitumoral objetiva en el 51% de 85 pacientes con cáncer, y una respuesta completa en el 9% de los pacientes. El MPDL3280A experimental de Roche demostró su capacidad para reducir el tamaño de los tumores en 29 de 140 (21%) pacientes con cáncer avanzado y tumores de varios tamaños. La WO2007005874 A2, entre otras cosas, divulga anticuerpos monoclonales aislados, en particular anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente a PD-Ll. La divulgación también proporciona métodos para detectar PD-L1, así como métodos para tratar varias enfermedades, incluyendo cáncer y enfermedades infecciosas, usando anticuerpos anti-PD-Ll.

Sin embargo, es posible que las terapias existentes no sean del todo satisfactorias, por lo que se siguen necesitando nuevos anticuerpos anti-PD-L1.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente divulgación proporciona nuevos anticuerpos monoclonales anti-PD-L1 (en particular anticuerpos completamente humanos), polinucleótidos que codifican los mismos y métodos de uso de los mismos. Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos 21-23, 25, 156 y 160-161 de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

En un aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que son capaces de unirse específicamente a PD-L1 humana a un valor de Kd no mayor de 10-9 M (por ejemplo, no mayor de <9x10-10 M, <8x10-10 M, <7x10-10 M, <6x10-10 M, <5x10-10 M, <4x10-10 M, <3x10-10 M, <2x10-10 M, o <10-10 M) medido mediante ensayo de unión por resonancia de plasmón.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se unen a PD-L1 de mono a una EC50 de no más de 10 nM (por ejemplo no más de 1 nM, 0,9nM, 0,8nM, 0,7nM, 0,6nM, 0,5nM, 0,4nM, 0,3nM, 0,2nM, 0,1nM, 0,09nM, 0,08nM, 0,07nM, 0,06nM, 0,05nM, 0,04nM, 0,03nM, 0,02nM, o 0,01nM. En ciertas realizaciones, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos no se unen a PD-L1 de ratón pero se unen a PD-L1 de mono con una afinidad de unión similar a la de PD-L1 humana. En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos inhiben potentemente la unión de PD-L1 humana o de mono a su receptor (por ejemplo, PD-1), a una IC50 de no más de 100 nM (por ejemplo, no más de 50 nM).Por ejemplo, no más de 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,9 nM, 0,8 nM, 0,7 nM, 0,6 nM, 0,5 nM, 0,4 nM, 0,3 nM, 0,2 nM o 0,1 nM). En ciertas realizaciones, la EC50 o IC50 se mide mediante análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).

En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos tienen una función efectora sustancialmente reducida. En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos no median ADCC o CDC o ambas.

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en la presente comprenden:

a) una región variable de cadena pesada que comprende la CDR1 de la SEQ ID NO: 13, la CDR2 de la SEQ ID NO: 15, y la CDR3 de la SEQ ID NO: 17; y una región variable de cadena ligera que comprende la CDR1 de la SEQ ID NO: 19, la CDR2 de la SEQ ID NO: 21, y la CDR3 de la SEQ ID NO: 23;

b) o

c) una región variable de cadena pesada que comprende la CDR1 de la SEQ ID NO: 37, la CDR2 de la SEQ ID NO: 39, y la CDR3 de la SEQ ID NO: 41 y una región variable de cadena ligera que comprende la CDR1 de la SEQ ID NO: 19, la CDR2 de la SEQ ID NO: 21, y la CDR3 de la SEQ ID NO: 23. Los anticuerpos así especificados se unen específicamente a PD-L1.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en la presente comprenden:

a) una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 47; y una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 49;

b) una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 55; y una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 49.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente incluyen, por ejemplo, 1.14.4 y 1.46.11.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en la presente compiten por el mismo epítopo con los anticuerpos 1.4.1, 1.14.4, 1.20.15 y 1.46.11. En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en la presente se unen al epítopo que comprende por lo menos uno de los siguientes residuos de aminoácidos de PD-L1: E58, E60, D61, K62, N63 y R113.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos son capaces de bloquear la unión de PD-L1 humana a su receptor y proporcionar de este modo por lo menos una de las siguientes actividades:

a) inducir la producción de IL-2 en las células T CD4+;

b) inducir la producción de IFN<y>en las células T CD4+;

c) inducir la proliferación de células T CD4+T y

d) invertir la función supresora de T reg.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente son anticuerpos monoclonales, anticuerpos completamente humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos recombinantes, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos marcados, anticuerpos bivalentes o anticuerpos antiidiotípicos.

En ciertas realizaciones, los fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en la presente son un anticuerpo de dominio único camelizado, un diacuerpo, un scFv, un dímero scFv, un BsFv, un dsFv, un (dsFv)2, un dsFv-dsFv', un fragmento Fv, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un diacuerpo ds, un nanocuerpo, un anticuerpo de dominio o un anticuerpo de dominio bivalente.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en la presente comprenden además una región constante de inmunoglobulina.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en la presente, comprenden además un conjugado.

En ciertas realizaciones, el conjugado puede ser un marcador detectable, una fracción modificadora farmacocinética o una fracción de purificación.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona polinucleótidos aislados que codifican los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en la presente. En ciertas realizaciones, se proporcionan polinucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno divulgados en la presente. En ciertas otras realizaciones, se proporcionan vectores que comprenden estos polinucleótidos, y en ciertas otras realizaciones, se proporcionan células huésped que comprenden estos vectores. En ciertas realizaciones, se proporcionan métodos para expresar uno o más de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno divulgados en la presente mediante el cultivo de estas células huésped en condiciones en las que los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno codificados por los polinucleótidos se expresan desde un vector. En ciertas realizaciones, los polinucleótidos proporcionados en la presente se asocian operativamente con un promotor como un promotor SV40 en un vector. En ciertas realizaciones, las células huésped que comprenden los vectores proporcionados en la presente son células de ovario de hámster chino o células 293F.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona kits que comprenden el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

En otro aspecto, los anticuerpos de PD-L1 proporcionados en la presente, como el 1.14.4 y el 1.46.11 tienen buena tolerabilidad y alta actividad antitumoralin vivoen un animal. En ciertas realizaciones, un animal que tiene células tumorales administradas con los anticuerpos de PD-L1 proporcionados en la presente tiene una reducción del volumen tumoral de por lo menos el 20%, por lo menos el 30%, por lo menos el 40%, por lo menos el 50%, por lo menos el 60%, por lo menos el 70%, por lo menos el 80%, por lo menos el 90% o por lo menos el 95% en comparación con el animal de control que tiene un volumen tumoral de referencia similar pero administrado sólo con vehículo.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para detectar la presencia o el nivel de PD-L1 (por ejemplo, humano o de mono) en una muestra biológica, que comprenden exponer la muestra biológica al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en la presente, y determinar la presencia o el nivel de PD-L1 en la muestra.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para identificar a un individuo que tiene un trastorno o afección con probabilidad de responder a un antagonista de PD-L1, que comprenden: determinar la presencia o el nivel de PD-L1 (por ejemplo, humano o de mono) en una muestra biológica de prueba del individuo con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en la presente, en donde la presencia o el nivel regulado por incremento de PD-L1 en la muestra biológica de prueba indica probabilidad de respuesta. En ciertas realizaciones, los métodos comprenden además administrar una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en la presente al individuo que se ha identificado como que tiene un trastorno o afección que probablemente responda a un antagonista de PD-L1.

La presente divulgación proporciona además métodos para monitorizar la respuesta terapéutica o la progresión de la enfermedad en un sujeto tratado con un antagonista de PD-L1, que comprenden determinar la presencia o el nivel de PD-L1 (por ejemplo, humano o de mono) en una muestra biológica de prueba del individuo con el anticuerpo anti-PD-L1 o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en la presente.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en la presente y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. En ciertas de estas realizaciones, los portadores farmacéuticos pueden ser, por ejemplo, diluyentes, antioxidantes, adyuvantes, excipientes o sustancias auxiliares no tóxicas.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para tratar una afección en un sujeto que se beneficiaría de la regulación por incremento de la respuesta inmunitaria, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en la presente. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene una expresión regulada por incremento de PD-L1.

El uso del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en la presente en la fabricación de un medicamento para tratar una afección que se beneficiaría de la regulación por incremento de la respuesta inmunitaria. En ciertas realizaciones, la afección es cáncer o infección vírica crónica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 presenta la unión de anticuerpos de PD-L1 completamente humanos a células CHO que expresan PD-1, medida mediante análisis FACS.

La Figura 2 presenta que los anticuerpos de PD-L1 completamente humanos bloquearon la unión de PD-1 a las células CHO transfectadas con PD-L1, medida mediante análisis FACS.

La Figura 3 muestra que los anticuerpos de PD-L1 completamente humanos se unieron específicamente a PD-L1, pero no se unieron a PD-L2, según se midió mediante análisis FACS.

La Figura 4 muestra que los anticuerpos de PD-L1 completamente humanos se unieron a PD-L1 humano y de mono cynomolgus.

La Figura 5 muestra la cinética completa de la afinidad de unión de los anticuerpos de PD-L1 al PD-L1 humano, que varía entre 2,26E-10 y 4,78E-10 mol/l, determinada por resonancia de plasmón superficial.

La Figura 6 ilustra el efecto de los anticuerpos anti-PD-L1 completamente humanos sobre la producción de IFN<y>en la respuesta específica de células T.

La Figura 7 muestra que los anticuerpos anti-PD-LI completamente humanos potenciaron la proliferación específica de células T.

La Figura 8 muestra que los anticuerpos de PD-L1 completamente humanos aumentaron la producción de IFNy en la reacción linfocitaria mixta (MLR).

La Figura 9 ilustra el efecto de los anticuerpos anti-PD-L1 completamente humanos sobre la producción de IL-2 en MLR.

La Figura 10 muestra que los anticuerpos anti-PD-L1 promovieron la proliferación de células T en la MLR.

La Figura 11 muestra que los anticuerpos anti-PD-L1 revirtieron la función supresora de las T reg.

La Figura 12 muestra que los anticuerpos anti-PD-L1 carecían de ADCC en células T activadas.

La Figura 13 muestra que los anticuerpos anti-PD-L1 carecían de CDC en células T activadas.

La Figuras 14A y la 14B muestran la reactividad cruzada de los anticuerpos anti-PD-L1 con PD-1 humana/de ratón. Se recubrieron 2 pg/ml de anticuerpo 1.14.4 en una placa de 96 pocillos durante la noche y se incubaron con proteína hPD-L1-His (Figura 14A) y proteína mPD-L1-His (Figura 14B), después se añadió anticuerpo HRP-anti-His para la detección.

La Figura 15 muestra los residuos de puntos calientes mapeados en la estructura de hPD-L1. Sitio de unión del anticuerpo 1.14.4. Los datos proceden de la tabla 3. Los colores de las imágenes ayudan a distinguir las diferencias entre epítopos.

La Figura 16 muestra la buena tolerabilidadin vivodel anticuerpo 1.14.4 contra hPD-L1. Se administraron tres dosis del anticuerpo 1.14.4 (3mg/kg, 10mg/kg y 30mg/kg) mediante inyecciones intraperitoneales múltiples al ratón B-hPD-1 humanizado. No se observaron cambios significativos en el peso corporal durante el experimento.

La Figura 17 muestra la inhibición significativain vivodel anticuerpo 1.14.4 contra hPD-L1 en el crecimiento de células tumorales. Después de 19 días de administración del anticuerpo, las tres dosis del anticuerpo 1.14.4 (3mg/kg, 10mg/kg y30mg/kg) mostraron efectos antitumorales significativos indicados por inhibiciones del crecimiento tumoral (IGT) de >40%.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Se pretende que la siguiente descripción de la divulgación meramente ilustre varias realizaciones de la divulgación. Como tales, las modificaciones específicas analizadas no deben interpretarse como limitaciones en el alcance de la divulgación.

Definiciones

El término "anticuerpo", como se usa en la presente, incluye cualquier inmunoglobulina, anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal, anticuerpo multiespecífico o anticuerpo biespecífico (bivalente) que se une a un antígeno específico. Un anticuerpo nativo intacto consta de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada cadena pesada consiste en una región variable y una primera, segunda y tercera región constante, mientras que cada cadena ligera consiste en una región variable y una región constante. Las cadenas pesadas de mamíferos se clasifican como a, 5, £,<y>y p, y las cadenas ligeras de mamíferos se clasifican como A o<k>. El anticuerpo tiene forma de "Y", con el tallo de la Y formado por la segunda y la tercera regiones constantes de dos cadenas pesadas unidas mediante enlace disulfuro. Cada brazo de la Y incluye la región variable y la primera región constante de una única cadena pesada unida a las regiones variable y constante de una única cadena ligera. Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada son responsables de la unión al antígeno. La región variable de ambas cadenas generalmente contiene tres giros altamente variables denominados regiones determinantes de la complementariedad (CDR) (las CDR de la cadena ligera (L) incluyen LCDR1, LCDR2 y LCDR3, las CDR de la cadena pesada (H) incluyen HCDR1, HCDR2 y HCDR3). Los límites de CDR para los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno divulgados en la presente pueden definirse o identificarse mediante las convenciones de Kabat, Chothia o Al-Lazikani (Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M., J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997); Chothia, C. et al., J Mol Biol. Dic 5;186(3):651 -63 (1985); Chothia, C. and Lesk, A.M., J.Mol.Biol., 196,901 (1987); Chothia, C. et al., Nature. Dic 21-28;342(6252):877-83 (1989); Kabat E.A.et al.,National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Las tres CDR se interponen entre tramos de flanqueo conocidos como regiones marco (FR), que están más conservadas que las CDR y forman un andamiaje para sostener los giros hipervariables. Las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera no intervienen en la unión al antígeno, pero presentan varias funciones efectoras. Los anticuerpos se asignan a clases sobre la base de la secuencia de aminoácidos de la región constante de su cadena pesada. Las cinco clases o isotipos principales de anticuerpos son IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que se caracterizan por la presencia de cadenas pesadas a, 5, £,<y>y p, respectivamente.

Varias de las principales clases de anticuerpos se dividen en subclases, como IgG1 (cadena pesada y1 ), IgG2 (cadena pesada<y>2), IgG3 (cadena pesada<y>3), IgG4 (cadena pesada<y>4), IgA1 (cadena pesada a1) o IgA2 (cadena pesada a2).

El término "fragmento de unión a antígeno", como se usa en la presente, se refiere a un fragmento de anticuerpo formado a partir de una porción de un anticuerpo que comprende una o más CDR, o cualquier otro fragmento de anticuerpo que se una a un antígeno pero que no comprende una estructura nativa intacta de anticuerpo. Los ejemplos de fragmento de unión a antígeno incluyen, sin limitación, un diacuerpo, un Fab, un Fab', un F(ab')<2>, un fragmento Fv, un fragmento Fv estabilizado por disulfuro (dsFv), un (dsFv)<2>, un dsFv biespecífico (dsFv-dsFv'), un diacuerpo estabilizado por disulfuro (diacuerpo ds), una molécula de anticuerpo de cadena sencilla (scFv), un dímero scFv (diacuerpo bivalente), un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo de dominio único camelizado, un nanocuerpo, un anticuerpo de dominio y un anticuerpo de dominio bivalente. Un fragmento de unión a antígeno es capaz de unirse al mismo antígeno al que se une el anticuerpo original. En ciertas realizaciones, un fragmento de unión a antígeno puede comprender una o más CDR de un anticuerpo humano particular injertadas en una región marco de uno o más anticuerpos humanos diferentes.

"Fab" con respecto a un anticuerpo se refiere a la porción del anticuerpo que consiste en una única cadena ligera (ambas regiones variable y constante) unida a la región variable y a la primera región constante de una única cadena pesada mediante un enlace disulfuro.

"Fab" se refiere a un fragmento Fab que incluye una parte de la región bisagra.

"F(ab<')2>"se refiere a un dímero de Fab'.

La "Fc" de un anticuerpo se refiere a la porción del anticuerpo que consiste en la segunda y la tercera regiones constantes de una primera cadena pesada unidas a la segunda y la tercera regiones constantes de una segunda cadena pesada mediante enlace disulfuro. La porción Fc del anticuerpo es responsable de varias funciones efectoras, como la ADCC y la CDC, pero no de la unión al antígeno.

"Fv" con respecto a un anticuerpo se refiere al fragmento más pequeño del anticuerpo que lleva el sitio de unión al antígeno completo. Un fragmento Fv consiste en la región variable de una única cadena ligera unida a la región variable de una única cadena pesada.

Por "anticuerpo Fv de cadena sencilla" o "scFv" se entiende un anticuerpo manipulado que consiste en una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada conectadas entre sí directamente o mediante una secuencia conectora peptídica (Huston JS et al. Proc Natl Acad Sci USA, 85:5879(1988)).

"Anticuerpo Fv-Fc de cadena sencilla" o "scFv-Fc" se refiere a un anticuerpo manipuladoque consiste en un scFv conectado a la región Fc de un anticuerpo.

"Anticuerpo de dominio único camelizado", "anticuerpo de cadena pesada" o "HCAb" se refiere a un anticuerpo que contiene dos dominios V<h>y ninguna cadena ligera (Riechmann L. y Muyldermans S., J Immunol Methods.); Muyldermans S., J Biotechnol. Jun;74(4):277-302 (2001); WO94/04678; WO94/25591; US6005079 A. Los anticuerpos de cadena pesada procedían originalmente deOamelidae(camellos, dromedarios y llamas). Aunque carecen de cadenas ligeras, los anticuerpos camelizados tienen un auténtico repertorio de unión a antígenos (Hamers-Casterman C. et al., Nature.); Nguyen VK. et al. "Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation", Immunogenetics. Abr;54(1):39-47 (2002); Nguyen VK. et al.Immunology. Mayo;109(1):93-101 (2003)). El dominio variable de un anticuerpo de cadena pesada (dominio VHH) representa la unidad de unión a antígeno más pequeña conocida generada por las respuestas inmunitarias adaptativas (Koch-Nolte F. et al., FASEB J. Nov;21 (13):3490-8. Epub 15 junio 2007 (2007)).

Un "nanocuerpo" se refiere a un fragmento de anticuerpo formado por un dominio VHH de un anticuerpo de cadena pesada y dos dominios constantes, CH2 y CH3.

Los "diacuerpos" incluyen pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, en donde los fragmentos comprenden un dominio V<h>conectado a un dominio V<l>en la misma cadena polipeptídica (V<h>-V<l>o V<h>-V<l>) (consultar, por ejemplo, Holliger P. et al., Proc Natl Acad Sci USA. Julio 15;90(14):6444-8 (1993); EP404097; WO93/11161). Al usar un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se ven forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena, creando de este modo dos sitios de unión a antígeno. Los sitios de unión al antígeno pueden dirigirse al mismo antígeno o a antígenos diferentes (o epítopos).

Un "anticuerpo de dominio" se refiere a un fragmento de anticuerpo que contiene únicamente la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En ciertos casos, dos o más dominios V<h>se unen covalentemente con un conector peptídico para crear un anticuerpo de dominio bivalente o multivalente. Los dos<dominios>V<h de un anticuerpo de dominio bivalente pueden dirigirse al mismo antígeno o a antígenos diferentes.>

<En ciertas realizaciones, un "(dsFv)2 " comprende tres cadenas peptídicas: dos moléculas>V<h enlazadas por un conector peptídico y unidas por puentes disulfuro a dos fracciones>V<l>.

<En ciertas realizaciones, un "diacuerpo ds biespecífico" comprende>V<h1>-V<l2 (enlazados por un conector peptídico) unidos a>V<l1>-V<h2 (también enlazados por un conector peptídico) a través de un puente disulfuro entre>V<h1 y>V<l1>.

En ciertas realizaciones, un "dsFv biespecífico" o dsFv-dsFv'" comprende tres cadenas peptídicas: una<fracción>V<h1>-V<h2 en la que las cadenas pesadas están enlazadas por un conector peptídico (por ejemplo, un conector flexible largo) y unidas a las fracciones>V<l1 y>V<l2>,<respectivamente, a través de puentes disulfuro, en donde cada>cadena pesada y ligera emparejada por disulfuro tiene una especificidad antigénica diferente.

En ciertas realizaciones, un "dímero scFv" es un diacuerpo bivalente o ScFv bivalente (BsFv) que comprende V<h>-V<l (enlazados por un conector peptídico) dimerizado con otra fracción>V<h>-V<l de tal manera que los Vn de una fracción se coordinan con los>V<l de la otra fracción y forman dos sitios de unión que pueden dirigirse a los mismos>antígenos (o epítopos) o a antígenos (o epítopos) diferentes. En otras realizaciones, un "dímero scFv" es un diacuerpo<biespecífico que comprende>V<h1>-V<l2 (enlazados por un conector peptídico) asociados con>V<l1>-V<h2 (también enlazados por un conector peptídico) de tal manera que>V<h1 y>V<l1 se coordinan y>V<h2 y>V<l2 se coordinan y cada par coordinado>tiene una especificidad de antígeno diferente.

El término "completamente humano", como se usa en la presente, con referencia al anticuerpo o al fragmento de unión a antígeno, significa que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno tiene o consiste en secuencia o secuencias de aminoácidos correspondientes a la de un anticuerpo producido por un humano o una célula inmunitaria humana, o derivado de una fuente no humana como un animal no humano transgénico que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias codificantes de anticuerpos humanos. En ciertas realizaciones, un anticuerpo completamente humano no comprende residuos de aminoácidos (en particular residuos de unión a antígeno) derivados de un anticuerpo no humano.

El término "humanizado", como se usa en la presente, con referencia al anticuerpo o al fragmento de unión a antígeno, significa que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno comprende CDR derivadas de animales no humanos, regiones FR derivadas de humanos y, cuando proceda, las regiones constantes derivadas de humanos. Un anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno es útil como agente terapéutico humano en ciertas realizaciones porque tiene inmunogenicidad reducida en humanos. En algunas realizaciones, el animal no humano es un mamífero, por ejemplo, un ratón, una rata, un conejo, una cabra, una oveja, una cobaya o un hámster. En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno se compone de secuencias sustancialmente humanas excepto las secuencias CDR que no son humanas. En algunas realizaciones, las regiones FR derivadas de humano pueden comprender la misma secuencia de aminoácidos que el anticuerpo humano del que se derivan, o pueden comprender algunos cambios de aminoácidos, por ejemplo, no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 cambios de aminoácidos. En algunas realizaciones, dicho cambio de aminoácidos podría estar presente sólo en las regiones FR de cadena pesada, sólo en las regiones FR de cadena ligera, o en ambas cadenas. En algunas realizaciones<preferibles, los anticuerpos humanizados comprenden FR1 -3 humanos y JH y>J<k humanos.>

El término "quimérico", como se usa en la presente, significa un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, que tiene una parte de la cadena pesada y/o ligera derivada de una especie, y el resto de la cadena pesada y/o ligera derivada de una especie diferente. En un ejemplo ilustrativo, un anticuerpo quimérico puede comprender una región constante derivada del ser humano y una región variable de una especie no humana, como de ratón.

"PD-L1", como se usa en la presente, se refiere al ligando de muerte celular programada 1 (PD-L1, consultar, por ejemplo, Freeman et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027). La secuencia de aminoácidos representativa del PD-L1 humano se divulga con el número de registro NCBI NP_054862.1, y la secuencia representativa de ácido nucleico que codifica la PD-L1 humana se muestra bajo el número de registro NCBI: NM_014143.3. PD-L1 se expresa en la placenta, el bazo, los ganglios linfáticos, el timo, el corazón, el hígado fetal, y también se encuentra en muchas células tumorales o cancerosas. PD-L1 se une a su receptor PD-1 o B7-1, que se expresa en células T activadas, células B y células mieloides. La unión de PD-L1 y su receptor induce la transducción de señales para suprimir la activación de la producción de citoquinas y la proliferación de células T mediada por TCR. Por consiguiente, PD-L1 desempeña un papel importante en la supresión del sistema inmunitario durante acontecimientos particulares como el embarazo, las enfermedades autoinmunes, los aloinjertos de tejidos, y se cree que permite a las células tumorales o cancerosas eludir el punto de control inmunológico y evadir la respuesta inmunitaria.

"Anticuerpo anti-PD-L1", como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse específicamente a PD-L1 (por ejemplo, PD-L1 humana o de mono) con una afinidad que es suficiente para proporcionar un uso diagnóstico y/o terapéutico.

El término "unión específica" o "se une específicamente" como se usa en la presente se refiere a una reacción de unión no aleatoria entre dos moléculas, como por ejemplo entre un anticuerpo y un antígeno. En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno proporcionados en la presente se unen específicamente a PD-L1 humana y/o de mono con una afinidad de unión (Kd) de <10-6 M (por ejemplo, <5x10-7 M, <2x10-7 M, <10-7 M, <5x10-8 M, <2x10-8 M, <10-8 M, <5x10-9 M, <2x10-9 M, <10-9 M, aproximadamente 10-10 M, de 10-10 M a 10-9 M, de 10-10 M a 10-85 M, o de 10-10 M a 10-8 M). K<d>, como se usa en la presente, se refiere a la relación entre la velocidad de disociación y la velocidad de asociación (koff/kon), puede determinarse usando métodos de resonancia de plasmón superficial, por ejemplo usando un instrumento como Biacore.

La capacidad de "bloquear la unión" o "competir por el mismo epítopo", como se usa en la presente, se refiere a la capacidad de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de inhibir la interacción de unión entre dos moléculas (por ejemplo, PD-L1 humana y un anticuerpo anti-PD-L1) en cualquier grado detectable. En ciertas realizaciones, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que bloquea la unión entre dos moléculas inhibe la interacción de unión entre las dos moléculas en por lo menos un 50%. En ciertas realizaciones, esta inhibición puede ser mayor del 60%, mayor del 70%, mayor del 80% o mayor del 90%.

El término "epítopo", como se usa en la presente, se refiere al grupo específico de átomos o aminoácidos de un antígeno al que se une un anticuerpo. Dos anticuerpos pueden unirse al mismo epítopo dentro de un antígeno si muestran una unión competitiva por el antígeno. Por ejemplo, si un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se divulga en la presente bloquea la unión de los anticuerpos ejemplares tales como 1.14.4 o 1.46.11 a PD-L1 humana, entonces puede considerarse que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une al mismo epítopo que dichos anticuerpos ejemplares.

Puede mutarse un residuo de aminoácido particular dentro del epítopo, por ejemplo mediante mutagénesis de barrido de alanina, y se identifican las mutaciones que reducen o impiden la unión a la proteína. La "mutagénesis de barrido de alanina" es un método que puede realizarse para identificar determinados residuos o regiones de una proteína que afectan a la interacción del epítopo con otro compuesto o proteína que se une a ella. Un residuo o grupo de residuos objetivo dentro de la proteína se sustituye por un aminoácido neutro o cargado negativamente (más preferiblemente alanina o polialanina, o una sustitución conservadora de aminoácidos). Cualquier mutación de los residuos de aminoácidos o codones que codifican los mismos que reduce la unión de la proteína más de un umbral o reduce la unión de la proteína al grado máximo que otras mutaciones es probable que se encuentre dentro del epítopo unido por la proteína. En ciertas realizaciones de la presente divulgación, el epítopo que es crítico para el anticuerpo de PD-L1 comprende por lo menos uno de los residuos de aminoácidos de E58, E60, D61, K62, N63 y R113.

"1.4.1", como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo monoclonal completamente humano que tiene una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 43, una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 45, y una región constante humana de isotipo IgG4.

"1.14.4", como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo monoclonal completamente humano que tiene una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 47, una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 49, y una región constante humana de isotipo IgG4.

"1.20.15", como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo monoclonal completamente humano que tiene una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 51, una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 53, y una región constante humana de isotipo IgG4.

"1.46.11", como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo monoclonal completamente humano que tiene una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 55, una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 49, y una región constante humana de isotipo IgG4.

Una "sustitución conservadora" con referencia a la secuencia de aminoácidos se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido diferente que tenga una cadena lateral con propiedades fisicoquímicas similares. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones conservadoras entre residuos de aminoácidos con cadenas laterales hidrófobas (por ejemplo Met, Ala, Val, Leu e Ile), entre residuos con cadenas laterales hidrófilas neutras (por ejemplo Cys, Ser, Thr, Asn y Gln), entre residuos con cadenas laterales ácidas (por ejemplo Asp, Glu), entre aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo His, Lys y Arg), o entre residuos con cadenas laterales aromáticas (por ejemplo Trp, Tyr y Phe). Como se sabe en la técnica, la sustitución conservadora habitualmente no provoca cambios significativos en la estructura conformacional de la proteína y, por lo tanto, podría conservar la actividad biológica de una proteína.

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia" con respecto a la secuencia de aminoácidos (o secuencia de ácidos nucleicos) se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) en una secuencia de referencia, después de alinear las secuencias y, si es necesario, introducir huecos, para lograr el máximo número de aminoácidos (o ácidos nucleicos) idénticos. La sustitución conservadora de los residuos de aminoácidos puede o no considerarse como residuos idénticos. La alineación con propósito de determinar el porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos (o ácidos nucleicos) puede lograrse, por ejemplo, usando herramientas de acceso público como BLASTN, BLASTp (disponibles en el sitio web del U.S. National Center for Biotechnology Information (NCBI), consultar también, Altschul S.F. et al, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990); Stephen F. et al, Nucleic Acids Res, 25:3389-3402 (1997)), ClustalW2 (disponible en el sitio web del Instituto Europeo de Bioinformática, consultar también, Higgins D.G. et al, Methods in Enzymology, 266:383-402 (1996); Larkin M.A. et al, Bioinformatics (Oxford, Inglaterra), 23(21): 2947-8 (2007)), y el software ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden usar los parámetros por defecto proporcionados por la herramienta, o pueden personalizar los parámetros según sea apropiado para la alineación, como por ejemplo, seleccionando un algoritmo adecuado.

"Célula T", como se usa en la presente, incluye células T CD4+, células T CD8+, células T auxiliares de tipo 1, células T auxiliares de tipo 2, células T auxiliares de tipo 17 y células T inhibidoras.

"Funciones efectoras", como se usa en la presente, se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la unión de la región Fc de un anticuerpo a sus efectores, como el complejo C1 y el receptor Fc. Las funciones efectoras ejemplares incluyen: citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) inducida por la interacción de anticuerpos y C1q en el complejo C1; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) inducida por la unión de la región Fc de un anticuerpo al receptor Fc en una célula efectora; y fagocitosis.

"Cáncer" o "afección cancerosa", como se usa en la presente, se refiere a cualquier afección médica provocada por el crecimiento, la proliferación o la metástasis de células neoplásicas o malignas, e incluye tanto cánceres sólidos como no sólidos, como la leucemia. "Tumor", como se usa en la presente, se refiere a una masa sólida de células neoplásicas y/o malignas.

"T ratar" o "tratamiento" de una afección, como se usa en la presente, incluye prevenir o aliviar una afección, ralentizar la aparición o la tasa de desarrollo de una afección, reducir el riesgo de desarrollar una afección, prevenir o retrasar el desarrollo de los síntomas asociados a una afección, reducir o poner fin a los síntomas asociados a una afección, generar una regresión completa o parcial de una afección, curar una afección, o alguna combinación de los mismos. Con respecto al cáncer, "tratar" o "tratamiento" puede referirse a inhibir o ralentizar el crecimiento, proliferación o metástasis de células neoplásicas o malignas, prevenir o retrasar el desarrollo de crecimiento, proliferación o metástasis de células neoplásicas o malignas, o alguna combinación de los mismos. Con respecto a un tumor, "tratar" o "tratamiento" incluye erradicar todo o parte de un tumor, inhibir o ralentizar el crecimiento tumoral y la metástasis, prevenir o retrasar el desarrollo de un tumor, o alguna combinación de los mismos.

Una sustancia "aislada" ha sido alterada por la mano del hombre respecto a su estado natural. Si una composición o sustancia "aislada" es de origen natural, ha sido modificada o apartada de su entorno original, o ambas cosas. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente de manera natural en un animal vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido está "aislado" si se ha separado lo suficiente de los materiales coexistentes de su estado natural como para existir en un estado sustancialmente puro. En ciertas realizaciones, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno tienen una pureza de por lo menos el 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, determinada por métodos electroforéticos (como SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico, electroforesis capilar), o métodos cromatográficos (como cromatografía de intercambio iónico o HPLC de fase inversa).

El término "vector", como se usa en la presente, se refiere a un vehículo en el que puede insertarse operativamente un polinucleótido que codifica una proteína para provocar la expresión de dicha proteína. Un vector puede usarse para transformar, transducir o transfectar una célula huésped para provocar la expresión del elemento genético que porta dentro de la célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen plásmidos, fagémidos, cósmidos, cromosomas artificiales como el cromosoma artificial de levadura (YAC), el cromosoma artificial bacteriano (BAC) o el cromosoma artificial derivado de P1 (PAC), bacteriófagos como el fago lambda o el fago M13, y virus animales. Las categorías de virus animales usados como vectores incluyen retrovirus (incluyendo lentivirus), adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus (por ejemplo, virus del herpes simple), poxvirus, baculovirus, papilomavirus y papovavirus (por ejemplo, SV40). Un vector puede contener una variedad de elementos para controlar la expresión, incluyendo secuencias promotoras, secuencias de inicio de la transcripción, secuencias potenciadoras, elementos seleccionables y genes informadores. Además, el vector puede contener un origen de replicación. Un vector también puede incluir materiales que faciliten su entrada en la célula, incluyendo pero no limitados a, una partícula vírica, un liposoma o un recubrimiento proteico, entre otros.

La frase "célula huésped", como se usa en la presente, se refiere a una célula en la que se ha introducido un polinucleótido exógeno y/o un vector.

Una "enfermedad asociada con o relacionada con PD-L1", como se usa en la presente, se refiere a cualquier afección provocada por, exacerbada por, o vinculada de otro modo a un aumento o disminución de la expresión o actividades de PD-L1 (por ejemplo, una PD-L1 humana).

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" o "dosificación eficaz", como se usa en la presente, se refiere a la dosificación o concentración de un fármaco eficaz para tratar una enfermedad o afección asociada con PD-L1 humana. Por ejemplo, con respecto al uso de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno divulgados en la presente para tratar el cáncer, una cantidad terapéuticamente eficaz es la dosificación o concentración del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno capaz de erradicar la totalidad o parte de un tumor, inhibir o ralentizar el crecimiento tumoral, inhibir el crecimiento o la proliferación de células mediadoras de una afección cancerosa, inhibir la metástasis de células tumorales, mejorar cualquier síntoma o marcador asociado con un tumor o afección cancerosa, prevenir o retrasar el desarrollo de un tumor o afección cancerosa, o alguna combinación de los mismos.

El término "farmacéuticamente aceptable" indica que el portador, vehículo, diluyente, excipiente o excipientes y/o sal designados son generalmente compatibles química y/o físicamente con los demás ingredientes que componen la formulación, y fisiológicamente compatibles con el receptor de la misma.

Anticuerpo anti-PD-L1

En un aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos anti-PD-L1 y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos. PD-1, también denominado CD279, se conoce como un receptor de punto de control inmunitario clave expresado por células T activadas, que media en la inmunosupresión. El ligando 1 de PD-1 (PD-L1) es una proteína transmembrana de 40 kDa expresada en varias células tumorales, células estromales o ambas, y se une a PD-1. La inhibición de la interacción entre PD-1 y PD-L1 puede potenciar la respuesta de las células T y, por tanto, mediar en la actividad anticancerígena.

La presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales completamente humanos ejemplares 1.4.1, 1.14.4, 1.20.15, y 1.46.11, cuyas secuencias CDR se muestran en la Tabla 1 siguiente, y las secuencias de región variable de cadena pesada o ligera que también se muestran a continuación.

Tabla 1

continuación

1.4.1-VH(30511):(SEQ ID NO:43 para aminoácidos y SEQ ID NO:44 para ácidos nucleicos) con las CDR de cadena pesada 1-3: SEQ ID NO: 1, 3, 5 son secuencias de aminoácidos y SEQ ID NO:2, 4, 6 son secuencias de ácidos nucleicos, respectivamente:

Segmento V: IGHV4-39*01

Segmento D: IGHD1-26*01

Segmento J: IGHJ4*02

1.4.1-VL(30027):(SEQ ID NO:45 para aminoácidos y SEQ ID NO:46 para ácidos nucleicos) con las CDR de cadena ligera 1-3: SEQ ID NO: 7, 9, 11 son secuencias de aminoácidos y SEQ ID NO:8, 10, 12 son secuencias de ácidos nucleicos, respectivamente:

Segmento V: IGLV3-1* 01

Segmento J: IGLJ2* 01

S Y E L T Q P P S V S V 8 P G

I TCC T A T Í<t>AA r:TG AC T CAG CCA CCC TCA GT'G T C C G T Q T C f: CCA QGA

C D IS

D S (i T V I P (i G G T K I. T V

<¿>i ) 'oAC AGC Lr1. ? C AG I L J ir A I A I I C ir'oL L'uA tióíi ACC A Air L I L Al-C ir 1L

L (SliQ 10 N O : -15)

31ñ CTA (SFQ TD NO:46)

1.14.4-VH(29812):(SEQ ID NO:47 para aminoácidos y SEQ ID NO:48 para ácidos nucleicos) con las CDR 1-3 de cadena pesada: SEQ ID NO: 13, 15, 17 son secuencias de aminoácidos y SEQ ID NO:14, 16, 18 son secuencias de ácidos nucleicos, respectivamente:

Segmento V: IGHV3-23*01

Segmento D: IGHD5-5*01

Segmento J: IGHJ4*02

F V q 1. [. F S G G G J, V Q P G

1 GAG GTG CAA CTG TU! GAG TCT GGG GGA GGC 1TG GTA CAG GGT GGG

G S 1. R 1.nC Al3 G F T F Sm.CCC ICC CTC ACA CTC ICC TGT CCA CCC TCT CCA TTC ACC GTT ACC

ÜDS!

1.14.4-VL y 1.46.11-VL (29841):(SEQ ID NO:49 para aminoácidos y SEQ ID NO:50 para ácidos nucleicos)<con las CDR 1-3 de cadena ligera: SEQ ID NO: 19, 21,23 son secuencias de aminoácidos y>S<e>Q<ID NO: 20, 22, 24>son secuencias de ácidos nucleicos, respectivamente:

Segmento V: IGLV3-21*02

Segmento J: IGLJ2*01

1.20.15-VH(30712): (SEQ ID NO: 51 para aminoácidos y SEQ ID NO:52 para ácidos nucleicos)con las CDR 1 -3 de cadena pesada: SEQ ID NO: 25, 27, 29 son secuencias de aminoácidos y SEQ ID NO:26, 28, 30 son secuencias de ácidos nucleicos, respectivamente:

Segmento V: IGHV4-39*01

Segmento D: indeterminado

Segmento J: IGHJ4*02

Q í. Q I. Q R S G P G 1. V K P S

i<c a o>e re<c a g>ere<c>.<ac c a c>roe m :<o c a c c a>ere erre<a a c>e c r roe

<r>x i, s<l>r c r<y>s e<g s i>.<s>m<c a c a c c>ere xcc e re<a c c>-ice<a c t>e re r e í<c c t c g c>'reo<a t o a c c>

C D JÍ1

CDR2

c<l>ir w r c s r<y>x s c s r<r>re o e c e e r e<c a g t c g>A r r<g c c>¿<t a i c t á i t a i a g í c g c a c c a c c a a c>

Y W G Q G M [. V T V S S (SRQID\ í > : 5 i )

Zlül’Á C TGG GGC CAG GGA ATG CRG GTC ACC GTC TCC TCA ( S l i Q [[! \(>;5G)

1.20.15-VL(29907):(SEQ ID NO:53 para aminoácidos y SEQ ID NO:54 para ácidos nucleicos) con las CDR 1-3 de cadena ligera: SEQ ID NO: 31,33, 35 son secuencias de aminoácidos y SEQ ID NO:32, 34, 36 son secuencias de ácidos nucleicos, respectivamente:

Segmento V: IGLV3-1 *01

Segmento J: IGLJ2 *01

s y o i .<t>g p<p>s v 8 v 8 p<g>

1 ICC TAT GAC Ü't’G AC'I CAG GGA GCC TCA GTG TGÜ bTG TGC GGA G'GA

G D R 1

CDR J

i A 0 f YqQ K P GqS P L L

91 T A T G C T T G C TGG T A T CAG CAG AAG CCA GGC CAG T C C C C T T T G GTG

GDR 3

C I)R 3

C T Q A M 1) ü A DYP C Q T &'

22 ñ G (:G A C f: CAG G C T A T G G AT GAG G C T GAC T A T T T C T G T CAG ACG TGG

CURA

'X .X . X""X .X . .X. .X. X ■■■•. .X . X - 'X .X. X -'X .X.

T¡ 8 8 t V V 1- C G C T K L T V

2 t 1 C<j>A.C.. AbC AcC ACA ílTb G 1A PTC- bíjC- GGA Gtíííj ACC AAG CTG<a>C<l>bTC

P ( 8 E Q TD K i V F t f )

316 CTA (SEQ ID NO:54)

1.46.11-VH(30626):(SEQ ID NO:55 para aminoácidos y SEQ ID NO:56 para ácidos nucleicos) con las CDR 1 -3 de cadena pesada: SEQ ID NO: 37, 39, 41 son secuencias de aminoácidos y SEQ ID NO:38, 40, 42 son secuencias de ácidos nucleicos, respectivamente:

Segmento V: IGHV3-23*01

Segmento D: IGHD5-5*01

Segmento J: IGHJ4*02

ÜP [ ' D Y W G Q G 1 [. Y T V O

310 CCC CCT f l T CAC TAC TCC CCC CAO COA ACO CTC (.PTC ACO CIO TCC

B(SEQ ID .NO; 00)

301 TOA (SEO ID NO: 150)

1.46.11-VL(29841):(SEQ ID NO:49 para aminoácidos y SEQ ID NO:50 para ácidos nucleicos) con las CDR 1-3 de cadena ligera: SEQ ID NO: 19, 21,23 son secuencias de aminoácidos y SEQ ID NO:20, 22, 24 son secuencias de ácidos nucleicos, respectivamente:

Segmento V: IGLV3-21*02

Segmento J: IGLJ2*01

1 A

CI)R 1

Q T A R T T f: G G \ N T G 8 Tí

4 ti<l>.'<l>O ;\C<v>> >,,Lt Aiííi A ! L AGC [vil n'i.jE<u>Í<j>A Ay\C A.A<l>y\l I utiA Atil y\AA

CDJÜ

Si V N *V Y Q O K P GQA P V !,

91 AÍT CIA CACmTAC CAC CAC AAu OCA CCC CAC CCC (XX CTC CTC

CIJUÍT

a m

R V E A G D E A D Y YCQ V W

226 AGG G’l G GA,Á GLv GGG GAP GAG GGC GAG TAI TAC IGT CAG CTG 1GG

CDR3

D S 3 S i) II V V l 1' C C (i T K L

111 G Al AG T .Aij T AÍ<j>T!<í>¡ A1 LA L t i 7$ i i T A T TC (ídc L<j>L>A\-AG L A^ís G T G

T V I- (SPQ ID NÜ:49)

316 ACC GTC CTA (SEQ ID .NO: 50)

Los anticuerpos anti-PD-LI y los fragmentos de unión a antígeno de la invención comprenden: a) una región variable de cadena pesada que comprende la CDR1 de la SEQ ID NO: 13, la CDR2 de la SEQ ID NO: 15, y la CDR3 de la SEQ ID NO: 17; y una región variable de cadena ligera que comprende la CDR1 de la SEQ ID NO: 19, la CDR2 de la SEQ ID NO: 21, y la CDR3 de la SEQ ID NO: 23 o b) una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 37, la SEQ ID NO: 39, y/o la SEQ ID NO: 41 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 19, la SEQ ID NO: 21, y/o la SEQ ID NO: 23.

Un experto en la técnica entenderá que las secuencias de CDR proporcionadas en la Tabla 1 pueden modificarse para que contengan una o más sustituciones de aminoácidos, para proporcionar una actividad biológica mejorada como una afinidad de unión mejorada a PD-L1 humana. Por ejemplo, puede generarse una biblioteca de variantes de anticuerpos (como variantes Fab o scFv) y expresarse con tecnología de presentación en fagos, y a continuación examinarse la afinidad de unión a PD-L1 humana. En otro ejemplo, puede usarse un programa informático para simular virtualmente la unión de los anticuerpos a PD-L1 humana e identificar los residuos de aminoácidos de los anticuerpos que forman la interfaz de unión. Tales residuos pueden evitarse en la sustitución para evitar la reducción de la afinidad de unión, o pueden sustituirse para conseguir una unión más fuerte. En ciertas realizaciones, por lo menos una (o todas) las sustituciones en las secuencias de CDR es una sustitución conservadora.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-PD-L1 y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos son completamente humanos. Los anticuerpos completamente humanos no presentan los problemas de inmunogenicidad en humanos y/o afinidad de unión reducida que se observan a menudo con los anticuerpos humanizados.

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-PD-L1 completamente humanos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden: a) una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 47; y una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 49 o b) una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 55; y una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 49.

También se contemplan en la presente anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno que compiten por el mismo epítopo con los anticuerpos anti-PD-L1 y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en la presente. Los anticuerpos bloquean la unión de 1.14.4 o 1.46.11 a PD-L1 humana o de mono, por ejemplo, a un valor de IC<50>(es decir, concentración de inhibición del 50%) de menos de 10-6 M, de menos de 10-7 M, de menos de 10-75 M, de menos de 10-8 M, de menos de 10-85 M, de menos de 10-9 M o de menos de 10-10 M. Los valores de IC<50>se determinan a partir de un ensayo de competencia, como los ensayos ELISA, los ensayos de unión por competencia de radioligandos y los análisis FACS.

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-PD-L1 y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en la presente son capaces de unirse específicamente a PD-L1 humana con una afinidad de unión (Kd) de <10-6 M (por ejemplo, <5x10-7 M, <2x10-7 M, <10-7 M, <5x10-8 M, <2x10-8 M, <10-8 M, <5x10-9 M, <2x10-9 M, <10-9 M, aproximadamente 10-10 M, 10-10 M a 10-85 M, o 10-10 M a 10-8 M) medida mediante ensayo de unión por resonancia de plasmón. La afinidad de unión puede representarse mediante el valor KD, que se calcula como la relación entre la tasa de disociación y la tasa de asociación (koff/kon) cuando la unión entre el antígeno y la molécula de unión al antígeno alcanza el equilibrio. La afinidad de unión al antígeno (por ejemplo, K<d>) puede determinarse adecuadamente usando métodos adecuados conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, el ensayo de unión por resonancia de plasmón usando instrumentos como Biacore (consultar, por ejemplo, Murphy, M. et al, Current protocols in protein science, Capítulo 19, unidad 19.14, 2006).

En ciertas realizaciones, los anticuerpos y los fragmentos de los mismos proporcionados en la presente se unen a PD-L1 humana con una EC<50>(es decir, concentración de unión del 50%) de 0,1 nM-100nM (por ejemplo, 0,1 nM-50nM, 0,1nM-30nM, 0,1nM-20nM, 0,1nM-10nM, o 0,1nM-1nM. La unión de los anticuerpos a<p>D-L1 humano puede medirse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, ensayo de sándwich como ELISA, transferencia Western, FACS u otro ensayo de unión. En un ejemplo ilustrativo, se permite que el anticuerpo de prueba (es decir, el primer anticuerpo) se una a PD-L1 humana inmovilizada o a células que expresan PD-L1 humana, después de lavar el anticuerpo no unido, se introduce un anticuerpo secundario marcado que puede unirse al primer anticuerpo unido y permitir por tanto su detección. La detección puede realizarse con un lector de microplacas cuando se usa PD-L1 inmovilizada, o mediante análisis FACS cuando se usan células que expresan PD-L1 humana. En ciertas realizaciones, los anticuerpos y los fragmentos de los mismos proporcionados en la presente se unen a PD-L1 humana con una EC<50>(es decir, 50% de concentración efectiva) de 1nM a 10nM, o de 1nM a 5nM según se mide mediante análisis FACS.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos y los fragmentos de los mismos proporcionados en la presente inhiben la unión de PD-L1 humana a su receptor en un IC<50>de 0,2nM-100nM (por ejemplo, 0,2nM-50nM, 0,2nM-30nM, 0,2nM-20nM, 0,2nM-10nM o 1 nM-10nM), medido en un ensayo de competición.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos y los fragmentos de los mismos proporcionados en la presente bloquean la unión de PD-L1 humana a su receptor y, de este modo, proporcionan actividad biológica que incluye, por ejemplo, inducir la producción de citoquinas de las células T activadas (como células T CD4+ y células T CD8+), inducir la proliferación de células T activadas (como células T CD4+ y células T CD8+) y revertir la función supresora de T reg. Las citoquinas ejemplares incluyen la IL-2 e IFN<y>. El término "IL-2'' se refiere a la interleucina 2, un tipo de molécula de señalización de citoquinas del sistema inmunitario que regula las actividades de los glóbulos blancos (por ejemplo, los leucocitos). El término "interferón gamma (IFN<y>)" es una citoquina producida por las células asesinas naturales (NK), las células T NK, las células T CD4+ y CD8+, que es un activador crítico de los macrófagos e inductor de la expresión de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). La producción de citoquinas puede determinarse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante ELISA. También pueden usarse métodos para detectar la proliferación de células T, incluido el ensayo de incorporación de timidina [3H].

Los anticuerpos anti-PD-L1 y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos son específicos para PD-L1 humana. En ciertas realizaciones, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos no se unen a PD-L2 (por ejemplo, PD-L2 humana). Por ejemplo, la afinidad de unión con PD-L2 es menor del 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1% de la afinidad con PD-L1 humana.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos se unen a PD-L1 de mono a una EC50 de no más de 100nM, por ejemplo, no más de o aproximadamente 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.9nM, 0,8nM, 0,7nM, 0,6nM, 0,5nM, 0,4nM, 0,3nM, 0,2nM, 0,1nM, 0,09nM, 0,08nM, 0,07nM, 0,06nM, 0,05nM, 0,04nM, 0,03nM, 0,02nM, o 0,01nM, según se mide por ELiSa . En ciertas realizaciones, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos se unen a PD-L1 de mono a una EC50 de aproximadamente 1 nM - 10nM.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos no se unen a PD-L1 de ratón pero se unen a PD-L1 de mono con una afinidad de unión similar a la de PD-L1 humana. Por ejemplo, la unión de los anticuerpos ejemplares 1.4.1, 1.14.4, 1.20.15, y 1.46.11 a PD-L1 de ratón no es detectable en ensayos de unión convencionales como ELISA, o análisis FACS, mientras que la unión de estos anticuerpos a PD-L1 de mono tiene una afinidad o valor de EC50 similar a la de PD-L1 humana medida por ELISA o FACS.

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-PD-L1 y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos tienen una función efectora reducida o agotada. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-PD-L1 y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos tienen una región constante de isotipo IgG4, que tiene una función efectora reducida o agotada. Las funciones efectoras como ADCC y CDC pueden llevar a la citotoxicidad de las células que expresan PD-L1. Muchas células, incluyendo las normales, pueden expresar PD-L1. Para evitar la toxicidad potencial no deseada para esas células normales, ciertas realizaciones de los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno proporcionados en la presente pueden poseer funciones efectoras reducidas o incluso agotadas. Se conocen varios ensayos para evaluar las actividades ADCC o CDC, por ejemplo, el ensayo de unión al receptor Fc, el ensayo de unión a C1q y el ensayo de lisis celular, y pueden seleccionarse fácilmente por expertos en la técnica. Sin querer estar limitados por la teoría, se cree que los anticuerpos con funciones efectoras reducidas o agotadas, como ADCC o CDC, no provocarían citotoxicidad o provocarían una citotoxicidad mínima a las células que expresan PD-L1, por ejemplo las células normales, y por lo tanto las librarían de efectos secundarios no deseados, mientras tanto, las células tumorales que expresan PD-L1 estarían unidas por los anticuerpos anti-PD-L1 y por lo tanto no podrían escapar del punto de control inmunitario y por lo tanto podrían ser reconocidas y eliminadas por el sistema inmunitario.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-PD-L1 y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en la presente tienen efectos secundarios reducidos. Por ejemplo, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en la presente pueden tener una secuencia de IgG totalmente humana y, por lo tanto, una inmunogenicidad menor que un anticuerpo humanizado. Por ejemplo, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en la presente pueden estar en formato IgG4 para eliminar la ADCC y la CDC.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-PD-L1 y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en la presente son ventajosos porque pueden usarse en combinación con agentes inmunogénicos, como células tumorales, antígeno tumoral purificado y células transfectadas con genes que codifican citoquinas inmunoestimuladoras, vacunas tumorales. Además, los anticuerpos anti-PD-L1 y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden incluirse en terapias combinadas, incluyendo quimio y radioterapias estándar, terapias de moléculas pequeñas basadas en dianas, otras terapias emergentes de moduladores de puntos de control inmunitarios. En ciertas realizaciones, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden usarse como base de conjugados anticuerpo-fármaco, anticuerpos biespecíficos o multivalentes.

Los anticuerpos anti-PD-L1 o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en la presente pueden ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo marcado, un anticuerpo bivalente o un anticuerpo antiidiotípico. Un anticuerpo recombinante es un anticuerpo preparado in vitro usando métodos recombinantes en lugar de en animales. Un anticuerpo biespecífico o bivalente es un anticuerpo artificial que tiene fragmentos de dos anticuerpos monoclonales diferentes y puede unirse a dos antígenos diferentes. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que es "bivalente" comprende dos sitios de unión a antígeno. Los dos sitios de unión a antígeno pueden unirse al mismo antígeno, o cada uno puede unirse a un antígeno diferente, en cuyo caso el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se caracteriza como "biespecífico".

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-PD-L1 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en la presente son anticuerpos completamente humanos. En ciertas realizaciones, los anticuerpos completamente humanos se preparan usando métodos recombinantes. Por ejemplo, puede hacerse que un animal transgénico como un ratón lleve transgenes o transcromosomas de genes de inmunoglobulina humana, y por tanto sea capaz de producir anticuerpos completamente humanos tras la inmunización con un antígeno adecuado como PD-L1 humana. Los anticuerpos completamente humanos pueden aislarse de dicho animal transgénico o, alternativamente, pueden elaborarse mediante tecnología de hibridoma fusionando las células del bazo del animal transgénico con una línea celular inmortal para generar células de hibridoma que segreguen los anticuerpos completamente humanos. Los animales transgénicos ejemplares incluyen, sin limitación, OmniRat, cuya expresión endógena de genes de inmunoglobulina de rata están inactivados y al mismo tiempo manipulados para contener loci de inmunoglobulina humana recombinante funcional; OmniMouse, cuya expresión endógena de genes de inmunoglobulina de ratón están inactivados y al mismo tiempo manipulados para contener loci de inmunoglobulina humana recombinante con deleción del locus J y una mutación C-kappa; OmniFlic, que es una rata transgénica cuya expresión endógena de genes de inmunoglobulina de rata están inactivados y al mismo tiempo manipulados para contener loci de inmunoglobulina humana recombinante con una única cadena ligera VkJk común reordenada y una cadena pesada funcional. Información más detallada puede encontrarse además en: Osborn M. et al, Journal of Immunology, 2013, 190: 1481-90; Ma B. et al, Journal of Immunological Methods 400 - 401 (2013) 78-86; Geurts A. et al, Science, 2009, 325:433; US8907157 B2; patente EP 2152880B1; patente EP 2336329B1. También pueden usarse otros animales transgénicos adecuados, por ejemplo, ratones HuMab (consultar, para más detalles, Lonberg, N. et al. Nature 368(6474): 856859 (1994)), Xeno-Mouse (Mendez et al. Nat Genet, 1997, 15:146-156), TransChromo Mouse (Ishida et al. Cloning Stem Cells, 2002, 4:91-102) y VelocImmune Mouse (Murphy et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111:5153-5158), Kymouse (Lee et al. Nat Biotechnol, 2014, 32:356-363), y conejo transgénico (Flisikowska et al. PLoS One, 2011,6:e21045).

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-PD-L1 y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos son un anticuerpo de dominio único camelizado, un diacuerpo, un scFv, un dímero scFv, un BsFv, un dsFv, un (dsFv)2, un dsFv-dsFv', un fragmento Fv, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un diacuerpo ds, un nanocuerpo, un anticuerpo de dominio o un anticuerpo de dominio bivalente.

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-PD-L1 y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden además una región constante de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, una región constante de inmunoglobulina comprende una región constante de cadena pesada y/o de cadena ligera. La región constante de cadena pesada comprende regiones CH1, CH1-CH2, o CH1-CH3. En algunas realizaciones, la región constante puede comprender además una o más modificaciones para conferir propiedades deseables. Por ejemplo, la región constante puede modificarse para reducir o agotar una o más funciones efectoras, para mejorar la unión al receptor FcRn, o para introducir uno o más residuos de cisteína.

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-PD-L1 y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden además un conjugado. Se contempla que una variedad de conjugados puedan enlazarse a los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno proporcionados en la presente (consultar, por ejemplo, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J.M. Cruse y R.E. Lewis, Jr. (eds.), Carger Press, Nueva York, (1989)). Estos conjugados pueden enlazarse a los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno mediante unión covalente, unión por afinidad, intercalación, unión coordinada, formación de complejos, asociación, mezclado o adición, entre otros métodos. En ciertas realizaciones, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno descritos en la presente pueden manipularse para que contengan sitios específicos fuera de la porción de unión al epítopo que pueden usarse para la unión a uno o más conjugados. Por ejemplo, dicho sitio puede incluir uno o más residuos de aminoácidos reactivos, como por ejemplo residuos de cisteína o histidina, para facilitar el enlace covalente a un conjugado. En ciertas realizaciones, los anticuerpos pueden enlazarse a un conjugado indirectamente, o a través de otro conjugado. Por ejemplo, el anticuerpo o los fragmentos de unión a antígeno pueden conjugarse con biotina, y luego conjugarse indirectamente con un segundo conjugado que se conjuga con avidina. El conjugado puede ser un marcador detectable, una fracción modificadora farmacocinética, una fracción de purificación o una fracción citotóxica. Los ejemplos de marcadores detectables pueden incluir marcadores fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rodamina, dansilo, ficoeritrina o Texas Red), marcadores de sustrato enzimático (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, luceríferasas, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas o p-D-galactosidasa), radioisótopos (por ejemplo 123I, 124I, 125I, 131I, 35S, 3H, 111In, 112In, 14C, 64Cu, 67Cu, 86Y, 88Y, 90Y, 177Lu, 211At, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, y 3P, otros lantánidos, marcadores luminiscentes), fracción cromofórica, digoxigenina, biotina/avidina, una molécula de ADN u oro para detección. En ciertas realizaciones, el conjugado puede ser una fracción modificadora farmacocinética, como PEG, que ayuda a aumentar la semivida del anticuerpo. Otros polímeros adecuados incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol y similares. En ciertas realizaciones, el conjugado puede ser una fracción de purificación, como una perla magnética. Una "fracción citotóxica" puede ser cualquier agente que sea perjudicial para las células o que pueda dañarlas o matarlas. Ejemplos de fracción citotóxica incluyen, sin limitación, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina y análogos de los mismos, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).

Polinucleótidos y métodos recombinantes

La presente divulgación proporciona polinucleótidos aislados que codifican los anticuerpos anti-PD-L1 y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

Los polinucleótidos aislados pueden codificar una región variable de cadena pesada y comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 56. También se divulgan secuencias homólogas de los mismos que tienen por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) de identidad de secuencia. En algunas realizaciones, los polinucleótidos aislados codifican una región variable de cadena ligera y comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 50. También se divulgan secuencias homólogas que tienen por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) de identidad de secuencia. En ciertas realizaciones, el porcentaje de identidad se debe a la degeneración del código genético, mientras que la secuencia de proteína codificada permanece inalterada.

El polinucleótido aislado que codifica los anticuerpos anti-PD-L1 y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, incluyendo las secuencias de la Tabla 1) puede insertarse en un vector para su posterior clonación (amplificación del ADN) o para su expresión, usando técnicas recombinantes conocidas en la técnica. En otra realización, el anticuerpo puede producirse mediante recombinación homóloga conocida en la técnica. El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal se aísla y secuencia fácilmente mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Hay muchos vectores disponibles. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor (por ejemplo, SV40, CMV, EF-1 a) y una secuencia de terminación de la transcripción.

En algunas realizaciones, el sistema de vector incluye sistemas de mamíferos, bacterias, levaduras, etc., y comprende plásmidos como, pero no limitados a, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pCMV, pEGFP, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO,pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS420, pLexA, pACT2.2, etc., y otros vectores de laboratorio y comerciales. Los vectores adecuados pueden incluir, plásmidos o vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados).

Los vectores que comprenden la secuencia polinucleotídica que codifica el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno pueden introducirse en una célula huésped para su clonación o expresión génica. Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores de la presente son las células procariotas, de levadura o eucariotas superiores descritas anteriormente. Las procariotas adecuadas para este propósito incluyen eubacterias, como organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli como B. subtilis y B. licheniformis, Pseudomonas como P. aeruginosa, y Streptomyces.

Además de las procariotas, los microbios eucariotas, como los hongos filamentosos o las levaduras, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para los vectores que codifican anticuerpos anti-PD-L1. El Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadería común, es el más comúnmente usado entre los microorganismos huésped eucariotas inferiores. Sin embargo, hay una serie de géneros, especies y cepas comúnmente disponibles y útiles en la presente, como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes Kluyveromyces como, por ejemplo, K. lactis, K.<fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus>(AT<c>C<16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii>(<at>C<c 56,500), K.>drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y Aspergillus hospedadores como A. nidulans y A. niger.

Las células huésped adecuadas para la expresión de los anticuerpos glicosilados o de los fragmentos de antígenos que se proporcionan en la presente se derivan de organismos pluricelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovirales y las correspondientes células huésped de insectos permisivas de huéspedes como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Se dispone públicamente de una variedad de cepas virales para transfección, por ejemplo, la variante L-1 del NPV de Autographa californica y la cepa Bm-5 del NPV de Bombyx mori, y tales virus pueden usarse como el virus de la presente de acuerdo con la presente invención, en particular para transfección de células de Spodoptera frugiperda. También pueden utilizarse como huéspedes cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco.

Sin embargo, el mayor interés se ha centrado en las células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón<(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1>A<t>CC<CCL 70); células de riñón de>mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2);<células de riñón canino (MDCK,>A<t>CC<CCL 34); células de hígado de rata búfala (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células>de pulmón humano (W 138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Anales N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2). En algunas realizaciones preferibles, la célula huésped es la célula 293F.

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción de anticuerpos anti-PD-L1 y se cultivan en medios nutritivos convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

Las células huésped usadas para producir los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno proporcionados en la presente pueden cultivarse en una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente, como F10 de Ham (Sigma), Medio mínimo esencial (MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, pueden usarse cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), US4767704 A; US4657866 A; US4927762 A; US4560655 A; o US5122469 A; WO 90/03430; WO 87/00195; o Re. Pat. de Estados Unidos 30.985 como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (como HEPES), nucleótidos (como adenosina y timidina), antibióticos (como el fármaco GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos generalmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También puede incluirse cualquier otro suplemento necesario en las concentraciones adecuadas que conozcan los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, como temperatura, pH y similares, son las usadas anteriormente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto en la técnica.

Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primer paso se eliminan los restos particulados, ya sean células huésped o fragmentos lisados, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan en el espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, la pasta celular se descongela en presencia de acetato sódico (pH 3,5), EDTA y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los restos celulares pueden eliminarse por centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión generalmente se concentran primero usando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Puede incluirse un inhibidor de la proteasa, como el PMSF, en cualquiera de los pasos anteriores para inhibir la proteólisis y pueden incluirse antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios.

El anticuerpo preparado a partir de las células puede purificarse usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía de intercambio iónico DEAE-celulosa, precipitación con sulfato de amonio, salado y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y del isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A puede usarse para purificar anticuerpos basados en cadenas pesadas humanas .gamma.1, .gamma.2 o .gamma.4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para la .gamma.3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:1567 1575 (1986)). La matriz a la que se une el ligando de afinidad suele ser agarosa, pero hay disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables, como el vidrio de poro controlado o el poli(estirenodivinil)benceno, permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden conseguir con la agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, para la purificación es útil la resina Bakerbond ABX.TM. (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.). También hay disponibles otras técnicas para la purificación de proteínas, como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, la precipitación con etanol, la HPLC de fase inversa, la cromatografía en sílice, la cromatografía en heparina SEPHAROSE™, la cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (como una columna de ácido poliaspártico), el cromatoenfoque, SDS-PAGE y la precipitación con sulfato de amonio, dependiendo del anticuerpo que se desee recuperar.

Después de cualquier paso o pasos preliminares de purificación, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes puede someterse a cromatografía de interacción hidrófoba de bajo pH usando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5-4,5, preferentemente realizado a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, de aproximadamente 0-0,25M de sal).

Kits

La presente divulgación proporciona kits que comprenden los anticuerpos anti-PD-LI o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunas realizaciones, los kits son útiles para detectar la presencia o el nivel de PD-L1 en una muestra biológica. La muestra biológica puede comprender una célula o un tejido.

En algunas realizaciones, el kit comprende un anticuerpo anti-PD-L1 o el fragmento de unión a antígeno del mismo que está conjugado con un marcador detectable. En otras realizaciones, el kit comprende un anticuerpo anti-PD-L1 no marcado o un fragmento de unión a antígeno, y comprende además un anticuerpo secundario marcado que es capaz de unirse al anticuerpo anti-PD-L1 no marcado. El kit puede comprender además unas instrucciones de uso, y un envase que separa cada uno de los componentes del kit.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 o el fragmento de unión a antígeno del mismo se asocian con un sustrato o un dispositivo útil en un ensayo sándwich como ELISA, o en un ensayo inmunográfico. El sustrato o dispositivo útil puede ser, por ejemplo, una placa de microtitulación y una tira reactiva.

Composición farmacéutica y método de tratamiento

La presente divulgación proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anti-PD-L1 o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables.

Los portadores farmacéuticamente aceptables para su uso en las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente pueden incluir, por ejemplo, portadores farmacéuticamente aceptables líquidos, geles o sólidos, vehículos acuosos, vehículos no acuosos, agentes antimicrobianos, agentes isotónicos, tampones, antioxidantes, anestésicos, agentes de suspensión/disolución, agentes secuestrantes o quelantes, diluyentes, adyuvantes, excipientes o sustancias auxiliares no tóxicas, otros componentes conocidos en la técnica, o varias combinaciones de los mismos.

Los componentes adecuados pueden incluir, por ejemplo, antioxidantes, cargas, aglutinantes, disgregantes, tampones, conservantes, lubricantes, aromatizantes, espesantes, colorantes, emulgentes o estabilizantes como azúcares y ciclodextrinas. Los antioxidantes adecuados pueden incluir, por ejemplo, metionina, ácido ascórbico, EDTA, tiosulfato sódico, platino, catalasa, ácido cítrico, cisteína, tioglicerol, ácido tioglicólico, tiosorbitol, butilhidroxanisol, butilhidroxitolueno y/o galato de propilo. Como se divulga en la presente, la inclusión de uno o más antioxidantes como metionina en una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y conjugados como se proporciona en la presente disminuye la oxidación del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno. Esta reducción de la oxidación previene o reduce la pérdida de afinidad de unión, mejorando de este modo la estabilidad del anticuerpo y maximizando su vida útil. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones que comprenden uno o más anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos como los divulgados en la presente y uno o más antioxidantes como la metionina. Además, se proporcionan métodos para prevenir la oxidación, prolongar la vida útil y/o mejorar la eficacia de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se proporciona en la presente, mezclando el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno con uno o más antioxidantes como la metionina.

Para ilustrar aún más, los portadores farmacéuticos aceptables pueden incluir, por ejemplo, vehículos acuosos como inyección de cloruro sódico, inyección de Ringer, inyección de dextrosa isotónica, inyección de agua estéril, o inyección de dextrosa y Ringer lactada, vehículos no acuosos como aceites fijos de origen vegetal, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de sésamo o aceite de cacahuete, agentes antimicrobianos a concentraciones bacteriostáticas o fungistáticas, agentes isotónicos como cloruro sódico o dextrosa, tampones como tampones de fosfato o citrato, antioxidantes como el bisulfato sódico, anestésicos locales como el clorhidrato de procaína, agentes de suspensión y dispersión como la carboximetilcelulosa sódica, la hidroxipropilmetilcelulosa o la polivinilpirrolidona, agentes emulsionantes como el polisorbato 80 (TWEEN-80) agentes secuestrantes o quelantes como EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) o EGTA (ácido etilenglicol tetraacético), alcohol etílico, polietilenglicol, propilenglicol, hidróxido sódico, ácido clorhídrico, ácido cítrico o ácido láctico. Los agentes antimicrobianos utilizados como portadores pueden añadirse a las composiciones farmacéuticas en envases de múltiples dosis que incluyen fenoles o cresoles, mercuriales, alcohol bencílico, clorobutanol, ésteres metílicos y propílicos del ácido phidroxibenzoico, timerosal, cloruro de benzalconio y cloruro de bencetonio. Los excipientes adecuados pueden incluir, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol o etanol. Las sustancias auxiliares no tóxicas adecuadas pueden incluir, por ejemplo, agentes humectantes o emulsionantes, agentes de tamponamiento del pH, estabilizadores, potenciadores de la solubilidad o agentes como acetato de sodio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina o ciclodextrina.

Las composiciones farmacéuticas pueden ser una solución líquida, suspensión, emulsión, píldora, cápsula, comprimido, formulación de liberación sostenida o polvo. Las formulaciones orales pueden incluir portadores estándar como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, polivinil pirollidona, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se formulan en una composición inyectable. Las composiciones farmacéuticas inyectables pueden prepararse en cualquier forma convencional, como por ejemplo solución líquida, suspensión, emulsión, o formas sólidas adecuadas para generar solución líquida, suspensión o emulsión. Las preparaciones para inyección pueden incluir soluciones estériles y/o no piréticas listas para inyección, productos secos solubles estériles, como polvos liofilizados, listos para combinarse con un solvente justo antes de su uso, incluyendo comprimidos hipodérmicos, suspensiones estériles listas para inyección, productos secos insolubles estériles listos para combinarlos con un vehículo justo antes de su uso, y emulsiones estériles y/o no piréticas. Las soluciones pueden ser acuosas o no acuosas.

En ciertas realizaciones, los preparados parenterales de dosis unitaria se envasan en una ampolla, un vial o una jeringuilla con aguja. Todas las preparaciones para administración parenteral deben ser estériles y no piréticas, como es conocido y se practica en la técnica.

En ciertas realizaciones, se prepara un polvo liofilizado estéril disolviendo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se divulga en la presente en un solvente adecuado. El solvente puede contener un excipiente que mejore la estabilidad u otros componentes farmacológicos del polvo o de la solución reconstituida, preparada a partir del polvo. Los excipientes que pueden usarse incluyen, entre otros, agua, dextrosa, sorbital, fructosa, jarabe de maíz, xilitol, glicerina, glucosa, sacarosa u otro agente adecuado. El solvente puede contener un tampón, como citrato, fosfato sódico o potásico u otro tampón conocido por los expertos en la técnica, con un pH aproximadamente neutro.

La filtración estéril posterior de la solución seguido por la liofilización bajo condiciones estándares conocidas por los expertos en la técnica proporciona una formulación deseable. En una realización, la solución resultante se repartirá en viales para la liofilización. Cada vial puede contener una dosis única o múltiples dosis del anticuerpo anti-PD-L1 o fragmento de unión a antígeno del mismo o composición del mismo. Es aceptable sobrellenar los viales con una pequeña cantidad por encima de la necesaria para una dosis o conjunto de dosis (por ejemplo, aproximadamente el

10%) para facilitar la extracción precisa de la muestra y la dosificación precisa. El polvo liofilizado puede almacenarse en condiciones adecuadas, por ejemplo, entre 4° C y temperatura ambiente.

La reconstitución de un polvo liofilizado con agua para inyección proporciona una formulación para su uso en administración parenteral. En una realización, para la reconstitución se añade al polvo liofilizado agua estéril y/o no pirética u otro portador líquido adecuado. La cantidad precisa depende de la terapia seleccionada que se administre, y puede determinarse empíricamente.

También se proporcionan métodos terapéuticos, que comprenden: administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según se proporciona en la presente a un sujeto con necesidad de ello, tratando o previniendo de este modo una afección o un trastorno asociado o relacionado con PD-L1. En otro aspecto, se proporcionan métodos para tratar una afección en un sujeto que se beneficiaría de la regulación por incremento de la respuesta inmunitaria, que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según se proporciona en la presente a un sujeto con necesidad de ello.

La cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, tal como se proporciona en la presente, dependerá de varios factores conocidos en la técnica, como por ejemplo el peso corporal, la edad, el historial médico, la medicación actual, el estado de salud del sujeto y la posibilidad de reacciones cruzadas, alergias, sensibilidades y efectos secundarios adversos, así como la vía de administración y el grado de desarrollo tumoral. Un experto en la técnica (por ejemplo, un médico o veterinario) puede reducir o aumentar proporcionalmente las dosis según lo indiquen estas y otras circunstancias o requisitos.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se proporciona en la presente puede administrarse a una dosificación terapéuticamente eficaz de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente

100 mg/kg (por ejemplo, aproximadamente 0,01 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg, aproximadamente 40 mg aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 55 mg/kg, aproximadamente 60 mg aproximadamente 65 mg/kg, aproximadamente 70 mg/kg, aproximadamente 75 mg/kg, aproximadamente 80 mg aproximadamente 85 mg/kg, aproximadamente 90 mg/kg, aproximadamente 95 mg/kg o aproximadamente 100 mg/kg). En ciertas de estas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se administra a una dosificación de aproximadamente 50 mg/kg o menos, y en algunas de estas realizaciones la dosificación es de 10 mg/kg o menos, 5 mg/kg o menos, 1 mg/kg o menos, 0,5 mg/kg o menos, o 0,1 mg/kg o menos. En ciertas realizaciones, la dosificación de administración puede cambiar a lo largo del tratamiento. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la dosificación de administración inicial puede ser mayor que las dosificaciones de administración posteriores. En ciertas realizaciones, la dosificación de administración puede variar a lo largo del tratamiento dependiendo de la reacción del sujeto.

Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse una dosis individual o varias dosis divididas a lo largo

del tiempo.

Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno divulgados en la presente pueden administrarse por cualquier vía conocida en la técnica, como por ejemplo vías parenterales (por ejemplo, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, incluyendo la infusión intravenosa, intramuscular o inyección intradérmica) o no parenterales (por ejemplo, oral, intranasal, intraocular, sublingual, rectal o tópica).

Las afecciones y trastornos asociados a PD-L1 pueden ser enfermedades o trastornos relacionados con el sistema inmunitario. En ciertas realizaciones, las afecciones y trastornos asociados con PD-L1 incluyen, tumores y cánceres, por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de células renales, cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de páncreas, carcinoma gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de esófago, mesotelioma, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de tiroides, sarcoma, cáncer de próstata, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, carcinoma tímico, leucemia, linfomas, mielomas, micosis fungoide, cáncer de células de Merkel, y otras enfermedades malignas hematológicas, como el linfoma de Hodgkin clásico (CHL), el linfoma mediastínico primario de células B grandes, el linfoma de células B ricas en células T/histiocitos, el linfoma de células B grandes difuso (DLBCL) positivo para EBV y negativo para PTLD, y asociado a EBV, linfoma plasmablástico, linfoma extraganglionar de células NK/T, carcinoma nasofaríngeo y linfoma de efusión primaria asociado a HHV8, linfoma de Hodgkin, neoplasia del sistema nervioso central (SNC), como linfoma primario del SNC, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico. En ciertas realizaciones, los tumores y cánceres son metastásicos, especialmente los tumores metastásicos que expresan PD-L1. En ciertas realizaciones, las afecciones y trastornos asociados a PD-L1 incluyen enfermedades autoinmunes, como lupus eritematoso sistémico (SLE), psoriasis, esclerodermia sistémica, diabetes autoinmune y similares, En ciertas realizaciones, las afecciones y trastornos asociados a PD-L1 incluyen enfermedades infecciosas, como infección vírica crónica, por ejemplo, infección vírica de hepatitis B, hepatitis C, virus del herpes, virus de Epstein-Barr, VIH, citomegalovirus, virus del herpes simple tipo I, virus del herpes simple tipo 2, virus del papiloma humano, adenovirus, epidemias de virus del herpes asociadas al sarcoma de Kaposi West, virus del anillo fino (Torquetenovirus), virus JC o virus BK.

Métodos de uso

La presente divulgación proporciona además métodos de uso de los anticuerpos anti-PD-L1 o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos para tratar una afección o un trastorno asociado o relacionado con PD-L1 en un individuo, que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-PD-L1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En ciertas realizaciones, se ha identificado que el individuo tiene un trastorno o afección que es probable que responda a un antagonista de PD-L1.

La presencia o el nivel de PD-L1 en una muestra biológica de interés puede ser indicativa de si el individuo del que procede la muestra biológica es probable que responda a un antagonista de PD-L1. Pueden usarse varios métodos para determinar la presencia o el nivel de PD-L1 en una muestra biológica de prueba del individuo. Por ejemplo, la muestra biológica de prueba puede exponerse a un anticuerpo anti-PD-L1 o a un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une y detecta a la proteína de PD-L1 expresada. Alternativamente, PD-L1 también puede detectarse a nivel de expresión de ácido nucleico, usando métodos como qPCR, PCR de transcriptasa inversa, micromatriz, SAGE, FISH, y similares. En algunas realizaciones, la muestra de prueba se deriva de una célula o tejido canceroso, o de células inmunitarias infiltrantes de tumores. En ciertas realizaciones, la presencia o el nivel regulado por incremento de PD-L1 en la muestra biológica de ensayo indica la probabilidad de respuesta. El término "regulado por incremento", como se usa en la presente, se refiere a un aumento global de no menos del 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% o mayor, en el nivel de proteína de PD-L1 en la muestra de prueba, tal como se detecta usando los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno proporcionados en la presente, en comparación con el nivel de proteína de PD-L1 en una muestra de referencia como se detecta usando el mismo anticuerpo. La muestra de referencia puede ser una muestra de control obtenida de un individuo sano o no enfermo, o una muestra sana o no enferma obtenida del mismo individuo del que se obtiene la muestra de prueba. Por ejemplo, la muestra de referencia puede ser una muestra no enferma adyacente o próxima a la muestra de prueba (por ejemplo, un tumor).

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno divulgados en la presente pueden administrarse solos o en combinación con uno o más medios o agentes terapéuticos adicionales. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno divulgados en la presente pueden administrarse en combinación con quimioterapia, radioterapia, cirugía para el tratamiento del cáncer (por ejemplo, tumorectomía), uno o más antieméticos u otros tratamientos para complicaciones derivadas de la quimioterapia, o cualquier otro agente terapéutico para su uso en el tratamiento del cáncer o cualquier trastorno médico mediado por PD-L1. En algunas de estas realizaciones, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se divulga en la presente que se administra en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales puede administrarse simultáneamente con uno o más agentes terapéuticos adicionales, y en algunas de estas realizaciones el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y el agente o agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse como parte de la misma composición farmacéutica. Sin embargo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno administrado "en combinación" con otro agente terapéutico no tiene que administrarse simultáneamente o en la misma composición que el agente. Se considera que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno administrado antes o después de otro agente se administra "en combinación" con dicho agente, como se usa esta frase en la presente, incluso si el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y el segundo agente se administran por vías diferentes. Cuando sea posible, los agentes terapéuticos adicionales administrados en combinación con los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno divulgados en la presente se administran de acuerdo con la pauta indicada en la hoja de información del producto del agente terapéutico adicional, o de acuerdo con el Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 57a Ed; Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 57a edición (noviembre de 2002)) o protocolos bien conocidos en la técnica.

En ciertas realizaciones, los agentes terapéuticos pueden inducir o potenciar la respuesta inmunitaria contra el cáncer. Por ejemplo, puede usarse una vacuna tumoral para inducir la respuesta inmunitaria frente a un determinado tumor o cáncer. También puede usarse terapia con citoquinas para mejorar la presentación del antígeno tumoral al sistema inmunitario. Ejemplos de terapia de citoquinas incluyen, sin limitación, interferones como interferón-a, -p y -y, factores estimulantes de colonias como macrófago-CSF, granulocitos macrófagos CSF y granulocitos-CSF, interleucinas como IL-1, IL-1 a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 e IL-12, factores de necrosis tumoral como TNF-a y TNF-p. También pueden usarse agentes que inactiven dianas inmunosupresoras, por ejemplo, inhibidores de TGF-beta, inihibidores de IL-10 e inhibidores del ligando Fas. Otro grupo de agentes incluye los que activan la capacidad de respuesta inmunitaria a las células tumorales o cancerosas, por ejemplo, los que potencian la activación de las células T (por ejemplo, agonistas de moléculas coestimuladoras de células T como CTLA-4, ICOS y OX-40), y los que potencian la función de las células dendríticas y la presentación de antígenos.

La presente divulgación proporciona además métodos para monitorizar la respuesta terapéutica o la progresión de la enfermedad en un sujeto tratado con un antagonista de PD-L1, que comprenden determinar la presencia o el nivel de PD-L1 en una muestra biológica de prueba del individuo con el anticuerpo anti-PD-L1 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En ciertas realizaciones, los métodos comprenden además comparar el nivel de PD-L1 en la muestra biológica de prueba con el nivel de PD-L1 en una muestra comparable obtenida previamente del mismo individuo, en donde la reducción o el aumento ralentizado o detenido del nivel de PD-L1 en la muestra biológica de prueba indica una respuesta terapéutica positiva o una progresión controlada de la enfermedad. La muestra comparable puede ser del mismo tipo que la muestra de prueba, pero que se ha obtenido del mismo individuo antes del tratamiento o durante una fase anterior del tratamiento.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar mejor la invención reivindicada y no debe interpretarse que limitan el alcance de la invención. Todas las composiciones, materiales y métodos específicos descritos a continuación, en su totalidad o en parte, entran dentro del alcance de la presente invención. No se pretende que estas composiciones, materiales y métodos específicos limiten la invención, sino que simplemente ilustren realizaciones específicas que entran dentro del alcance de la invención.

EJEMPLO 1: Generación de hibridomas de anticuerpos

1.1 Inmunización: Se cebaron ratas hembra OMT (obtenidas de Open Monoclonal Technology, Inc., Palo Alto, US, 8-10 semanas de edad), con 10gg de proteína PD-L1 ECD humana en TiterMax mediante inyección en la almohadilla plantar, y luego se reforzaron cada 3 días con proteína PD-L1 ECD en adyuvante de gel de fosfato de aluminio mediante inyección en la almohadilla plantar, hasta que estuvieron listas para la fusión. Los títulos séricos de anticuerpos anti-PD-L1 se examinaron mediante ELISA o FACS cada dos semanas.

1.2 Fusión celular: T res días antes de la fusión, los animales recibieron un refuerzo final con 10gg de proteína PD-L1 ECD humana en PBS mediante inyección intraperitoneal. El día de la fusión, se recogieron los ganglios linfáticos y se prepararon para obtener una suspensión de células individuales. Los linfocitos obtenidos se mezclaron con células de mieloma (P3) en la proporción adecuada. La mezcla celular se lavó y se volvió a suspender a 2,0 x 106 células/ml en solución ECF. La fusión se realizó usando el instrumento eléctrico bTX 2000.

1.3 Selección primaria y secundaria de sobrenadantes de hibridoma: después de cultivar durante 7-14 días a 37° C, se examinó una parte del sobrenadante de hibridoma usando el análisis Mirrorball. Brevemente, el sobrenadante de hibridoma se diluyó 5 veces en 1X PBS. Las células CHO-K1 que expresan PD-L1 se mezclaron con el anticuerpo secundario marcado con fluorocromo y DraQ5. En cada pocillo de la placa de 384 pocillos, se añadieron 20 gl de la mezcla de células y 20 gl de la muestra de sobrenadante de hibridoma diluido y se incubaron durante por lo menos 2 horas a temperatura ambiente en la oscuridad, hasta que estuvieron listos para el análisis en un citómetro de microplacas de alta sensibilidad Mirrorball®. Los resultados positivos se confirmaron mediante FACS usando las células CHO-K1 que expresan PD-L1. Las células se tiñeron con las muestras sobrenadantes del hibridoma, seguido de una segunda tinción con anticuerpos IgG de cabra antirratón Fc conjugados con FITC. Las líneas celulares parentales correspondientes se usaron como controles negativos. Las células teñidas se analizaron usando un BD Biosciences FACSCanto II y el software FlowJo Version.

1.4 Subclonación: las líneas celulares de hibridoma con unión positiva confirmada a las células que expresan PD-L1 se usaron para la subclonación. Brevemente, para cada línea celular de hibridoma, se contaron las células y se diluyeron para obtener 5 o 1 células por 200 pl en medio de clonación. Se colocaron 200 pl/pocillo en las placas de 96 pocillos. Las placas se incubaron a 37° C, 5% de CO2hasta que estuvieron listas para el análisis siguiente.

1.5 Prueba de isotipo: las placas ELISA se recubrieron con 50 pl/pocillo de anticuerpos IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA e IgM de cabra a 1 pg/ml, respectivamente. Después del bloqueo, se añadieron 50 pl de muestras de sobrenadantes de hibridoma en cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Como anticuerpo de detección se usó cadena ligera kappa de cabraantirrata-HRP. La reacción de color se desarrolló usando sustrato TMB durante 10 minutos, y se detuvo con HCl 2M. A continuación, las placas se leyeron a 450 nm en un lector de microplacas ELISA.

1.6 Ensayo de unión celular: Para examinar la actividad de unión de los anticuerpos completamente humanos a la diana, se tiñeron células CHO-K1 que expresan PD-L1 humana o células dendríticas maduras (mDC) con los anticuerpos completamente humanos, seguido de una tinción de 2° anticuerpos con Fc de IgG antihumana de cabra conjugada con FITC. Las líneas celulares parentales correspondientes se usaron como controles negativos. Las células teñidas se analizaron usando un FACSCanto II de BD Biosciences y el software FlowJo Version.

Las células CHO transfectadas con PD-L1 humana de longitud completa se tiñeron con anticuerpos contra PD-L1 humana de hibridoma de rata, seguidos de 2a tinción de anticuerpos con Fc de IgG antirrata de cabra conjugado con FITC y se analizaron por FACS. Como se muestra en la Figura 1, los anticuerpos 1.4.1, 1.14.4, 1.20.15 y 1.46.11 se unieron específicamente a PD-L1 expresada en células CHO con valores de EC50 de aproximadamente 1 nM.

EJEMPLO 2: Cambio de la porción Fc y purificación

A continuación, los anticuerpos presentes en el sobrenadante del cultivo de células 293F se purificaron mediante cromatografía de afinidad con proteína A.

EJEMPLO 3: Caracterización de anticuerpos completamente humanos

3.1 Ensayo de competición por FACS: para examinar si los anticuerpos completamente humanos pueden bloquear la unión de PD-L1 a PD-1, las células CHO-K1 que expresan PD-L1 humana se incubaron con varias concentraciones de los anticuerpos completamente humanos a 4° C durante 1 hora. Se lavaron los anticuerpos no unidos y, a continuación, se añadió a las células la PD-1 humana marcada con Fc de ratón. La unión de PD-1 humana a la célula que expresa PD-L1 se detectó usando IgG antirratón de cabra conjugado con FITC, seguido del análisis usando un FACSCanto II de BD Biosciences y el software FlowJo Version.

Se incubaron células CHO que expresaban PD-L1 humana con diferentes concentraciones de los anticuerpos completamente humanos (1.4.1, 1.14.4, 1.20.15 y 1.46.11). A continuación, se añadió a las células la PD-1 humana marcada con Fc de ratón. La unión de la PD-1 humana a la célula que expresaba PD-L1 se detectó usando IgG antirratón de cabra conjugado con FITC, seguido del análisis FACS. Como se muestra en la Figura 2, todos los anticuerpos de PD-L1 completamente humanos probados bloquearon la unión de PD-1 a PD-L1 expresada en células CHO transfectadas, y 1.14.4, 1.20.15 y 1.46.11 mostraron un valor de IC50 de aproximadamente 10nM.

3.2 Ensayo de afinidad mediante resonancia de plasmón superficial (SPR): Los anticuerpos se caracterizaron por afinidad y cinética de unión a PD-L1 mediante ensayo SPR usando ProteOn XPR36 (Bio-Rad). La proteína A (Sigma) se inmovilizó en un chip sensor GLM (Bio-Rad) mediante acoplamiento amínico. Los anticuerpos purificados se hicieron fluir sobre el chip sensor y fueron capturados por la proteína A. El chip se rotó 90° y se lavó con tampón de ejecución (1 XPBS/0,01% de Tween20, Bio-Rad) hasta que el valor de referencia fue estable. Se hicieron fluir cinco concentraciones de PD-L1 humana y tampón de ejecución contra la célula de flujo de anticuerpos a un caudal de 100 pl/min para una fase de asociación de 240s, seguido de una disociación de 600s. El chip se regeneró con pH 1,7 H<3>PO<4>después de cada ciclo. La curva de asociación y disociación se ajustó a un modelo de unión Langmiur 1:1 usando el software ProteOn.

Como se muestra en la Figura 5, las afinidades de los anticuerpos de PD-L1 completamente humanos por el PD-L1 humano recombinante fueron de 4,78E-10 a 2,26E-10 mol/l, medidas por resonancia de plasmón superficial.

3.3 Prueba de afinidad por FACS: la afinidad de unión del anticuerpo a la superficie celular PD-L1 se realizó mediante análisis FACS usando células CHO-K1 que expresaban PD-L1 humana. Los anticuerpos probados se diluyeron en serie 1 en 2 en tampón de lavado (1XPBS/ 1% de BSA) y se incubaron con las células a 4° C durante 1 h. Se añadió el anticuerpo secundario FITC Fc de IgG antihumano de cabra (Jackson Immunoresearch Lab) y se incubó a 4° C en la oscuridad durante 1 h. Luego, las células se lavaron una vez y se volvieron a suspender en 1XPBS/1% de BSA, y se analizaron mediante citometría de flujo (BD). La intensidad de la fluorescencia se convertirá en moléculas unidas/célula sobre la base de las perlas cuantitativas QuantumTM MESF Kits (Bangs Laboratories, Inc.). KD se calculó usando Graphpad Prism5.

3.4 Ensayo funcional in vitro: para evaluar la capacidad de los anticuerpos completamente humanos de modular la capacidad de respuesta de las células T, incluyendo la producción de citoquinas y la proliferación celular, se realizaron los tres ensayos siguientes.

3.4.1 MLR alogénica: se aislaron monocitos de donantes sanos usando el kit de enriquecimiento de monocitos humanos siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se cultivaron durante 5 - 7 días para que se diferenciaran en células dendríticas (DC). Entre 18 y 24 horas antes de su uso, se añadió 1 pg/ml de LPS al cultivo celular para inducir la maduración de las DC.

Las células T CD4+ se aislaron usando el kit de enriquecimiento de células T CD4+ humanas de acuerdo con el protocolo del fabricante y, a continuación, se estimularon con las DC alogénicas maduras o inmaduras en presencia o ausencia de anticuerpos completamente humanos o Ab de control. Los niveles de IL-2 e IFNy en el sobrenadante del cultivo se midieron mediante ELISA el día 3 y el día 5, respectivamente. La proliferación de células T CD4+ se evaluó mediante la incorporación de timidina [3H].

Como se muestra en la Figura 9, todos los anticuerpos de PD-L1 completamente humanos probados (1.4.1, 1.14.4, 1.20.15 y 1.46.11) aumentaron la secreción de IL-2 de manera dosificada. Como se muestra en la Figura 8, todos los anticuerpos de PD-L1 completamente humanos probados (1.4.1, 1.14.4, 1.20.15 y 1.46.11) aumentaron la secreción de IFNy de manera dosificada. Como se muestra en la Figura 10, todos los anticuerpos de PD-L1 completamente humanos probados (1.4.1, 1.14.4, 1.20.15 y 1.46.11) aumentaron la proliferación de células T dependiente de la concentración.

3.4.2 Respuesta inmunitaria autóloga específica de Ag: Se aislaron PBMC y monocitos del mismo donante. Las PBMC se cultivaron en presencia del péptido pp65 del CMV y una dosis baja de IL2 (20U/ml). Mientras tanto, se generaron DC cultivando monocitos como se ha mencionado anteriormente. Después de 5 días, las DC fueron pulsadas con el péptido pp65 y luego añadidas a las células T CD4+ en presencia o ausencia de los anticuerpos completamente humanos o Ab de control. Los niveles de IL-2 e IFN<y>en el sobrenadante del cultivo se midieron mediante ELISA el día 3 y el día 5, respectivamente. La proliferación de células T CD4+ específicas de CMVpp65 se evaluó mediante la incorporación de timidina [3H].

Como se muestra en la Figura 6, la producción de IFNy en la respuesta específica de células T se vio potenciada por los anticuerpos de PD-L1 completamente humanos (1.4.1, 1.14.4, 1.20.15 y 1.46.11). La Figura 7 muestra que los anticuerpos de PD-L1 completamente humanos mejoraron la proliferación de células T CMV+ - CD4+ dependiente de la concentración estimulada con DC autólogas cargadas con el péptido pp65 de CMV.

3.4.3 Ensayo de supresión de Treg: las células T reguladoras (Treg) son un modulador inmunitario clave y desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la autotolerancia. Las Tregs CD4+ CD25+ se asocian a tumores porque se ha encontrado un mayor número de Tregs en pacientes con múltiples cánceres y se asocian a un peor pronóstico. Para evaluar directamente el efecto de los anticuerpos anti PD-L1 completamente humanos sobre la función inhibidora de las Tregs, comparamos la función de las Tregs en presencia o ausencia de anticuerpos completamente humanos o Ab de control. Brevemente, las Tregs de CD4+ CD25+ y las células T CD4+ CD25- se separaron por MACS. Las células Treg CD4+ CD25+ y las células T CD4+ CD25- (relación Treg:Teff 1:1) se cocultivaron con mDC alogénicas en presencia o ausencia de anticuerpos completamente humanos o Ab de control a diferentes concentraciones. Como control negativo se usó la ausencia de anticuerpos o anticuerpos isotípicos. La producción de citoquinas y la proliferación de células T se midieron como se ha mencionado anteriormente.

Como se muestra en la Figura 11, el anticuerpo PD-L1 1.20.15 anuló la función supresora de las Treg y restauró la proliferación de células T respondedoras y la secreción de IFNy.

3.5 Ensayo de citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) y de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC): como la PD-L1 humana se expresa en una variedad de tipos de células, y tanto en células sanas como tumorales, para minimizar la toxicidad no deseada en las células PD-L1+ sanas, se confirmó que los anticuerpos anti-PD-L1 completamente humanos seleccionados no tenían función ADCC y CDC.

3.5.1 ADCC: se preincubaron las células diana (mDC) y varias concentraciones de anticuerpos completamente humanos en placas de 96 pocillos durante 30 minutos, después se añadieron PBMC activadas por IL-2 (efectoras) en una proporción efector/objetivo de 50:1. Se incubaron las placas durante 6 horas a 37° C en un incubador con un 5% de CO2. La lisis de las células diana se determinó mediante un kit de detección de citotoxicidad (Roche). La densidad óptica se midió con el lector de placas Molecular Devices SpectraMax M5e. Se usaron hAb de control (IgG1) y hAb de control (IgG4) como controles positivo y negativo, respectivamente.

Usando PBMC activadas con IL-2 como fuente de células asesinas naturales (NK) y mDC que expresan altos niveles de PD-L1 en la superficie celular como células diana, los anticuerpos de PD-L1 completamente humanos (1.4.1, 1.14.4, 1.20.15 y 1.46.11) no mediaron ADCC (Figura 12).

3.5.2 CDC: en una placa de 96 pocilios se mezclaron células diana (mDC), complemento sérico humano diluido (Quidel-A112) y varias concentraciones de anticuerpos completamente humanos. La placa se incubó durante 4 h a 37° C en un incubador con 5% de CO2. La lisis de las células diana se determinó mediante CellTiter glo (Promega-G7573). Como control positivo se usaron Rituxan (Roche) y la línea celular de linfoma B humano Raji (CD20 positiva). Como se muestra en la Figura 13, los anticuerpos de PD-L1 completamente humanos no mediaron la CDC.

3.6 Prueba de agrupamiento mediante FACS: Para examinar si los anticuerpos completamente humanos se encontraban en el mismo grupo epitópico que el anticuerpo de referencia, las células CHO-K1 que expresaban PD-L1 humana se incubaron con diferentes concentraciones de los anticuerpos completamente humanos a 4° C durante 1 hora. Se lavaron los anticuerpos no unidos y, a continuación, se añadió a las células el anticuerpo de control marcado con biotina. La unión del anticuerpo de control marcado con biotina a las células que expresan PD-L1 se detectó usando estreptavidina conjugada con PE, seguido del análisis usando un FACSCanto II de BD Biosciences y el software FlowJo Version.

Los resultados de la prueba de agrupación mostraron que el epítopo de PD-L1 humana unido por los anticuerpos de PD-L1 completamente humanos (es decir, 1.4.1, 1.14.4, 1.20.15 y 1.46.11) era diferente de los anticuerpos de PD-L1 existentes (es decir, el anticuerpo de referencia).

3.7 Ensayo de unión cruzada entre especies: la reactividad cruzada del Ac frente a PD-L1 de cynomolgus y murino se midió mediante ELISA. Se recubrieron placas ELISA con PD-L1 humana, cino y murina, respectivamente. Después del bloqueo, se añadieron anticuerpos completamente humanos en la placa y se incubaron a temperatura ambiente durante por lo menos 2 horas. La unión de los anticuerpos a los antígenos recubiertos se detectó usando IgG antihumana de cabra Fc-HRP. La reacción de color se desarrolló con sustrato TMB y se detuvo con HCl 2M. Las placas ELISA se analizaron a 450 nm usando un lector de microplacas Molecular Device M5e.

Como se muestra en la Figura 4, el resultado del experimento ELISA demostró que la PD-L1 completamente humana probada se unió al PD-L1 de mono cynomolgus de manera dependiente de la dosis. Sin embargo, ninguno de los anticuerpos probados (1.4.1, 1.14.4, 1.20.15 y 1.46.11) se unió a PD-L1 murina.

3.8 Ensayo de unión cruzada entre familias mediante FACS: para examinar la actividad de unión entre familias de los anticuerpos completamente humanos, las líneas celulares que expresan PD-L2 se tiñeron con los anticuerpos completamente humanos, seguido de una tinción de 2° anticuerpos con Fc IgG antihumana de cabra conjugada con FITC. Las células que expresan PD-L1 se usaron como control positivo. Las líneas celulares parentales correspondientes se usaron como controles negativos. Las células teñidas se analizaron usando un BD Biosciences FACSCanto II y el software FlowJo Version.

Las células CHO transfectadas con PD-L1 o PD-L2 se tiñeron con anticuerpos de PD-L1 completamente humanos y se analizaron mediante FACS. Como se muestra en la Figura 3, los anticuerpos de PD-L1 completamente humanos se unieron específicamente a PD-L1, pero no a PD-L2 de la familia de ligandos PD-1.

Ejemplo 4: Mapeo de epítopos del anticuerpo completamente humano

Para determinar los epítopos el presente anticuerpo 1.14.4 proporcionado en la presente, se realizaron experimentos de barrido de alanina en hPD-1 y la evaluación del efecto a la unión del anticuerpo usando 1.14.4.

Se realizaron experimentos de barrido de alanina en hPD-L1 y se evaluó su efecto sobre la unión de anticuerpos. Los residuos de alanina en hPD-L1 se mutaron a codones de glicina, y todos los demás residuos se mutaron a codones de alanina. Para cada residuo del dominio extracelular (ECD) de hPD-L1, se realizaron sustituciones puntuales de aminoácidos mediante dos pasos secuenciales de PCR. Se usó como plantilla un plásmido pcDNA3.3-hPD-L1_ECD.His que codifica ECD de PD-L1 humana y una etiqueta His C-terminal, y se usó un conjunto de cebadores mutagénicos para la PCR de primer paso usando el kit de mutagénesis dirigida a múltiples sitios QuikChange lightning (Agilent technologies, Palo Alto, CA). Se usó la endonucleasa Dpn I para digerir la plantilla parental tras la reacción de síntesis de la cadena mutante. En el segundo paso de la PCR, se amplificó y expresó transitoriamente en células HEK293F (Life Technologies, Gaithersburg, MD) un casete de expresión de ADN lineal compuesto por un promotor CMV, un dominio extracelular (ECD) de PD-L1, una etiqueta His y una poliadenilación de timidina quinasa (TK) del virus del herpes simple.

El anticuerpo monoclonal 1.14.4 se recubrió en placas para el ensayo de unión ELISA. Tras interactuar con el sobrenadante que contenía el mutante de PD-L1 cuantificado o la proteína PD-L1_ECD.His humana/ratón (Sino Biological, China), se añadió anticuerpo anti-His conjugado con HRP (1:5000; Rockland Immunochemicals, Pottstown, PA) como anticuerpo de detección. La absorbancia se normalizó de acuerdo con la media de los mutantes de control. Tras establecer un límite adicional para el cambio de veces de unión (<0,55), se identificaron los residuos epitópicos finales determinados.

Se realizaron las actividades de unión de los anticuerpos 1.14.4 tanto para PD-L1 humana como murina (Figura 14). Nuestro 1.14.4 principal se unió a PD-L1 humana (Figura 14A), pero no se unió a PD-L1 murina (Figura 14B).

En la Tabla 2 se muestra el efecto de 131 mutaciones puntuales de PD-L1 sobre la unión a anticuerpos. La comprobación de las posiciones de todos estos residuos en las estructuras cristalinas de hPD-L1 (código PDB 3BIK y 4ZQK) reveló que era improbable que algunos aminoácidos (por ejemplo, Gly159, Tyr160, Pro161) contactaran directamente con ningún anticuerpo. Las reducciones de unión observadas se debían muy probablemente a la inestabilidad o incluso al colapso de la estructura de hPD-L1 tras las sustituciones de alanina. Después de establecer un límite adicional para el cambio de veces de unión (<0,55), los residuos del epítopo finalmente determinados se enumeran en la Tabla 3. Hay 6 posiciones para 1.14.4.

Por lo tanto, todos los datos de la Tabla 3 se mapearon en la estructura cristalina de hPD-L1 para realizar una mejor visualización y comparación. (Figura 15).

Tabla 2. El efecto de las mutaciones puntuales de PD-L1 sobre la unión de anticuerpo

1.14.4

PQ-Ll

N° de residuo veces de cambio0SD

p216 0.563 0.017

i37 0.5690.004

K120n.w>0.011

G70 0.002 0.019

D49 0.603 0.002

L50 0.614 0.O05

A52 0.622 0.010

G110 0.632 0.000

p 133 0.664 0.007 G 95 fl.GSfc 0.010 N 131 0.680 0.000 Y 81 0,(392 0007 Y 11X 0.701 0.005 V 12$ 0.701 0.012 V 68 0.707 0.012 J 64 0,710 0 009 V m 0.723 0.003 I, 0.732 0.00 S L? 21$ 0.732 0.000T127 0.735 0 021 E 72 0.748 0.025 V 225 0.749 0.048 A 232 0.756 0.010 K. 1X9 0,759 0 021 V 76 0.760 0.010 I, 48 0.770 0.006 Li 71 0.772 0.012 F 19 0.780 0045 T 701 0.781m nN 33 0.788 0.003 Q 10? 0.792 0.001 A 1.09 0.797 0.004U205 0.801 0 010 V 21 0,80.3 0 011 R 186 0.805 0 008 C 33 0.807 0.000 D 215 0.811 0.015a3 0.813 0 000 K 105 0.816 0 004 II 78 0.821 0.000 E 217 0.823 0.136 G 119 0.825 0 010 E 39 0.831 0 002 E 188 0.833 0.000 P 3 0.834 0.010 V 44 0.837 0 001 L 231 0.838 0 003 Y 56 0.840 0.002 Y 28 0.842 0.015 1. 175 0.842 0.009 N 23(3 0.848 0.019 J 199 0.848 0 011 K 1X5 0.853 0.003 K 25 0.857 0.0 SO D 90 0.858 0.003 D 103 0.863 0 007 T 203 0.870 0.015 R 212 0.870 0.006 rJ 22 0.875 0.004T2060.3760.002 V 29 0.XX20.001T1020.337 0.001T 154 0 XXX 0.004 T 179 0.X93 0.050 Ü 1200.305 0.007[< m0.3070.021 T i% 0 X9X 0.049Q01 0.0060.01(5P 240.007 0.009i: 5.10.003 0.033K X9 0 915 0.009 I ¿40.0IX 0.045 K 06 0.0240.007R320.0340.003V 52 0 9550.009£ 117 0.035 0.010 £1# 0.030 0.018 F 45 0.042 0.002 N1830.044 0.021 T13 L0.9470.033V 2.5 0 94X 0.019 L ■i" 0 9490.001E 237 0.0560.0011. 2140.053 0.013K 125 0 959 0.009 £ 79 0.962 0.007 D 26 0.063 0.010 T 20 0.0740.017£ XO 0 974 0.015 0 06 0 979 0.016 A IX 0.0700.011q 33 0.032 0.003 Y 174 0 9X5 0.009 ü73 0.0330.014 K 102 0 990 0.008 T 1X0 1.000 0.025R36 1.001 0.003AOS1.0000.002 Q 77 1011 0.002 Mi 59 1012 0.006 q 100 1.012 0.002 X 75 1.015 0.021 Vi115 1.0160.040 Y 145 1016 0.031 V 147 1.017 0.005 1. 74 1.021 0.018 K135 1.026 0.130 A51 1055 0.037 M 36 1.036 0.005t142 1.047 0.072Q47 1.051 0.030

K124 1.056 0 ,004

H691.056 0.00?

K.41 1.071 0.036

k4 61.085 0 ,029

L88 1.102 0.017

V123 1.108 0 ,005

I38 1.132 0.026

s 931.145 0 ,024

A121 1.147 0.018

L941.189 0.021

D122 1.215 0 ,026

lLas veces de cambio en la unión es con respecto a la unión de varias sustituciones de alanina silenciosas

Tabla 3. Identificación de e íto os otenciales

Como se muestra en la Figura 15, los residuos de los puntos calientes encargados de la unión de hPD-L1 se concentran en la cadena C, el giro CC' y las cadenas F (Figura 15). La com probación^ las posiciones de los residuos en las estructuras cristalinas del complejo hPD-1/hPD-L1 (código PDB 4ZQK, 4Á) reveló que estos residuos se localizaban principalmente en las cadenas A, C, F y G. A los epítopos de 1.14.4 contribuyeron principalmente los residuos de la cadena C, que se solapan directamente con el sitio de interacción de hPD-1 y hPD-L1, lo que indica los mecanismos de unión de hPD-L1 y de bloqueo de hPD-1.

Ejemplo 5: Inhibición in vivo del crecimiento tumoral por el anticuerpo completamente humano hPD-L1

Para evaluar la inhibición del crecimiento tumoral por el anticuerpo hPD-L1, se inocularon 5x105 células/0,1 ml de células tumorales MC38-B7H1 por vía subcutánea en la costilla anterior derecha de 42 ratones machos humanizados B-hPD-1. Cuando el tamaño del tumor alcanzó aproximadamente 100 mm3, se agrupó a los ratones (5 grupos, 7 por grupo) y se les administraron los agentes siguientes: Grupo 1: vehículo, Grupo 2: anticuerpo de control BMK6 (consultar la descripción detallada en la WO2011066389A1), Grupo 3: 1.14.4, 3mg/kg, Grupo 4: 1.14.4, 10mg/kg y Grupo 5: 1.14.4, 30mg/kg. A todos los grupos se les administró mediante inyección intraperitoneal una vez cada dos días con seis administraciones consecutivas. Los animales fueron observados continuamente durante otras dos semanas tras finalizar la administración. El volumen tumoral y el peso corporal se midieron dos veces por semana, y se registraron las relaciones entre el cambio del peso corporal de los ratones y el período de administración, y el cambio del volumen tumoral y el período de administración. Al final del experimento, se calcularon y analizaron estadísticamente la relación entre los volúmenes tumorales de los grupos terapéuticos y el grupo del vehículo (T/C) y la inhibición del crecimiento tumoral (TGI). Se realizó una prueba T con Graphpad Prism 5 y se analizó estadísticamente el volumen tumoral. Se consideró que P<0,05 era una diferencia significativa.

El volumen tumoral se midió dos veces por semana usando un calibre de vernier para el diámetro largo y el diámetro corto, y la fórmula para calcular el volumen es: Volumen tumoral = 0,5 x diámetro largo x diámetro corto2. La tasa de crecimiento tumoral se calculó basándose en los resultados de las mediciones: T/C (%) = volumen tumoral del grupo terapéutico/volumen tumoral del grupo de control negativo x 100%. Inhibición del crecimiento tumoral TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)] x 100, donde Ti es el volumen tumoral medio del grupo terapéutico en el día i, T0 es el volumen tumoral medio del grupo terapéutico en el día 0, Vi es el volumen tumoral medio del grupo de control en el día i, y V0 es el volumen tumoral medio del grupo de control en el día 0.

Tabla 4. Efectos antitumorales del anticuerpo de PD-L1 completamente humano 1.14.4en el xenoinjerto MC38-B7H1 de cáncer de colon murino hPD-1 en ratones humanizados.

Durante el experimento, el peso corporal de los animales de cada grupo no mostró una disminución significativa (Tabla 4 y Figura 16), lo que indica que los agentes de prueba tienen una buena tolerabilidad. Después de los 19 días de administración (es decir, 25 días después de la inoculación de las células tumorales), el volumen tumoral en el grupo vehículo alcanzó los 2359 mm3, y en comparación con el grupo de vehículo, los volúmenes tumorales en los grupos de dosis alta, media y baja del anticuerpo 1.14.4 mostraron una disminución significativa (el volumen tumoral medio fue de 949 mm3, 1416 mm3 y 1115 mm3, respectivamente). Las tres dosis de anticuerpo mostraron efectos antitumorales significativos indicados por el TGI del 62,8%, 42,0% y 55,4%, respectivamente (Tabla 4 y Figura 17). El anticuerpo de control BMK6 también mostró un efecto antitumoral significativo (el volumen tumoral medio es de 1241 mm3, y el TGI es del 49,7%). Por lo tanto, los resultados mostraron que el anticuerpo 1.14.4 mostró un efecto antitumoral significativo, y las inhibiciones para todos los grupos de dosis altas, medias y bajas estaban por encima del 40%.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende

a) una región variable de cadena pesada que comprende la CDR1 de la SEQ ID NO: 13, la CDR2 de la SEQ ID NO: 15, y la CDR3 de la SEQ ID NO: 17; y una región variable de cadena ligera que comprende la CDR1 de la SEQ ID NO: 19, la CDR2 de la SEQ ID NO: 21, y la CDR3 de la SEQ ID NO: 23; o

b) una región variable de cadena pesada que comprende la CDR1 de la SEQ ID NO: 37, la CDR2 de la SEQ ID NO: 39, y la CDR3 de la SEQ ID NO: 41 y una región variable de cadena ligera que comprende la CDR1 de la SEQ ID NO: 19, la CDR2 de la SEQ ID NO: 21, y la CDR3 de la SEQ ID NO: 23;

en donde los anticuerpos se unen específicamente a PD-L1.

2. El anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende:

a) una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 47; y una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 49; o

b) una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 55; y una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 49.

3. El anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, capaz de unirse específicamente a PD-L1 humana a un valor Kd de no más de 10-8 M medido mediante ensayo de unión por resonancia de plasmón;

que se une a PD-L1 de mono a una EC50 de no más de 10 nM, o no más de 1 nM, y no se une a PD-L1 de ratón; capaz de inhibir la unión de PD-L1 humana o de mono a su receptor a una IC50 de no más de 100 nM; que no se une a PD-L2.

que no media ADCC o CDC o ambas;

que es un anticuerpo monoclonal completamente humano, preferiblemente en donde el anticuerpo monoclonal completamente humano es producido por una rata transgénica;

y se une al epítopo que comprende los siguientes residuos de aminoácidos de PD-L1: E58, E60, D61, K62, N63 y R113.

4. Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, capaz de bloquear la unión de PD-L1 humana a su receptor y proporcionar de este modo por lo menos una de las siguientes actividades:

a) inducción de la producción de IL-2 en las células T CD4+;

b) inducción de la producción de IFNy en las células T CD4+;

c) inducción de la proliferación de células T CD4+; y

d) reversión de la función supresora de las Treg.

preferentemente que es un diacuerpo, un scFv, un dímero scFv, un BsFv, un dsFv, un (dsFv)<2>, un dsFv-dsFv', un fragmento Fv, un Fab, un Fab', un F(ab')<2>, un diacuerpo ds,

preferiblemente que comprende además una región constante de inmunoglobulina.

5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un conjugado.

6. Un polinucleótido aislado que codifica el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de las reivindicaciones 1-5.

7. Un vector que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 6.

8. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 7.

9. Un método para expresar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 10 en la condición en la que se expresa el polinucleótido de la reivindicación 7.

10. Un kit que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

11. Un método de

detectar la presencia o el nivel de PD-L1 humano o de mono en una muestra biológica, que comprende exponer la muestra biológica al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y determinar la presencia o el nivel de PD-L1 humano o de mono en la muestra; o

identificar a un individuo que tiene un cáncer o un tumor, que comprende: determinar la presencia o el nivel de PD-L1 en una muestra biológica de prueba del individuo con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en donde la presencia o el nivel regulado por incremento de PD-L1 en la muestra biológica de prueba indica la probabilidad de respuesta, comprendiendo preferiblemente además administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 al individuo; o

monitorizar la respuesta terapéutica o la progresión de la enfermedad en un sujeto tratado con un antagonista de PD-L1, que comprende determinar la presencia o el nivel de PD-L1 en una muestra biológica de prueba del individuo con el anticuerpo anti-PD-L1 o fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

12. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 -5 y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables.

13. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en el tratamiento del cáncer o de una infección vírica crónica.