TW202430210A - 用於治療癌症之btn3a活化抗體、bcl2抑制劑及去甲基化劑之組合 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種BTN3A活化抗體、Bcl-2家族抑制劑及去甲基化劑之治療組合，其尤其可用於治療癌症，尤其血液惡性病。本發明更特別於關於活化Vγ9Vδ2 T細胞之細胞溶解功能的BTN3A活化抗體、選擇性地抑制Bcl2受體之維納妥拉(Venetoclax)及去甲基化劑(諸如阿紮胞苷(Azacytidine))的組合用途，以協同且特異性地促進Vγ9Vδ2 T細胞抗癌活性。

Description

用於治療癌症之BTN3A活化抗體、BCL2抑制劑及去甲基化劑之組合

下文揭示一種BTN3A活化抗體、Bcl-2抑制劑及去甲基化劑之治療組合，其尤其可用於治療癌症，尤其血液惡性病。本發明更特別於關於活化Vγ9Vδ2 T細胞之細胞溶解功能的BTN3A活化抗體、選擇性地抑制Bcl2受體之維納妥拉(Venetoclax)及去甲基化劑(諸如阿紮胞苷(Azacytidine))的組合用途，以協同且特異性地促進Vγ9Vδ2 T細胞抗癌活性。

迄今為止，已提出了用於治療癌症之各種治療及疫苗策略，該等策略依賴於動員患者免疫反應，且更尤其為T淋巴球，以對抗惡性細胞。全世界多個管理機構已批准若干針對CTLA-4、PD-1及PD-L1之免疫調節抗體用於臨床用途。儘管此等藥物代表癌症療法之重大進展，但對當前可用之治療無反應的大部分癌症患者群體之醫療需求仍未得到滿足。

γδ (Gamma delta) T細胞為具有先天性及適應性免疫反應特徵之非習知T細胞子集，其在針對惡性病及感染之免疫監視中起重要作用(Holtmeier W等人, 編者. Chem Immunol Allergy [網際網路]. Basel: KARGER; 2005 [2022年8月19日引用]. 第151-183頁. 可自以下獲得: https://www.karger.com/Article/FullText/86659)。在健康成人之血液中，Vγ9Vδ2 T細胞構成循環γδ T細胞之大部分(50至90%) (Kabelitz D等人. Cell Mol Immunol. 2020年9月;17(9):925-939)且占總血液淋巴球之1至5% (Pauza CD等人. Gamma Delta T Cell Therapy for Cancer: It Is Good to be Local. Front Immunol [網際網路]. 2018 [2018年11月19日引用])。與代表循環T細胞中主要T細胞子集且識別MHC限制性抗原之習知αβ T細胞不同，γδ T細胞以非MHC限制性方式活化。更特定言之，Vγ9Vδ2 T細胞活化係由對於病毒及細菌感染、代謝壓力或癌發生期間之基因失調反應而過度產生的磷酸抗原(pAg)之細胞內積聚所觸發。在此等病理生理情形下之Vγ9Vδ2 T細胞活化誘發廣泛功能活性，該等活性包括細胞介素及趨化介素之產生、感染或轉型之標靶細胞之細胞溶解及與其他細胞(包括上皮細胞、單核球、樹突狀細胞(DC)、嗜中性白血球及B細胞)之相互作用(Blazquez JL, Benyamine A, Pasero C, Olive D. New Insights Into the Regulation of γδ T Cells by BTN3A and Other BTN/BTNL in Tumor Immunity. Front Immunol [網際網路]. 2018 [2018年8月6日引用])。由於其強效的抗腫瘤活性(Pauza CD等人, 參見上文)及其浸潤惡性組織與積極預後之間的關聯(Gentles AJ等人. Nat Med. 2015年8月;21(8):938-945；Tosolini M等人. OncoImmunology. 2017年3月4日;6(3):e1284723. PMID: 28405516)，Vγ9Vδ2 T細胞代表癌症免疫療法之有吸引力的標靶。

近年來，已在多種腫瘤中探究了多種基於Vγ9Vδ2 T細胞之免疫腫瘤學治療方法，使用胺基雙膦酸鹽(ABP) (諸如唑來膦酸鹽(Zoledronate)或合成磷酸抗原(亦即，BrHPP)與IL-2組合)活體內活化Vγ9Vδ2 T細胞，或在活體外/離體擴增後將自體或同種異體Vγ9Vδ2 T細胞過繼轉移給患者(Kabelitz D等人. 2020, 參見上文)。儘管此兩種基於Vγ9Vδ2 T細胞之療法似乎為安全的，但獲得的臨床反應在患者之間為可變的(Kabelitz D等人. 2020, 參見上文)。尤其在白血病中，在使用ABP活體內刺激Vγ9Vδ2 T細胞之臨床試驗中僅觀測到較低反應。相比之下，Vγ9Vδ2 T細胞之擴增及轉移具有超過50%反應率(Künkele KP等人. Cells. 2020年3月30日;9(4):829；Barros M de S等人. Front Immunol. 2021年9月22日;12:729085)，增強Vγ9Vδ2 T細胞尤其在AML療法中之效用，且其用途在大量臨床試驗中得到進一步研究(Saura-Esteller J等人. Front Immunol. 2022年6月16日;13:915837)。儘管表面上成功，但Vγ9Vδ2 T細胞之活體外/離體擴增及轉移係費力的，此表明需要新穎策略來使用活體內活化及擴增以增強Vγ9Vδ2 T細胞介導之抗腫瘤免疫的臨床益處。

專利公開案WO2012080351A1、WO2012080769A1、WO20200257031A1及WO2020136218提及能夠活化Vγ9Vδ2 T細胞之細胞介素產生、增殖及細胞溶解功能的針對BTN3A之各種抗體。

先前研究已展示維納妥拉及去甲基化劑5-阿紮胞苷具有直接抗白血病活性。另外，展示出5-阿紮胞苷可經由誘導應激配體表現來改善免疫效應細胞對癌細胞之識別(Gang AO等人. Blood Cancer J. 2014年3月;4(3):e197-e197；Lee JB等人. Blood. 2021年7月22日;138(3):234-245)，且描述維納妥拉可增強T細胞及NK細胞介導之針對AML芽細胞之細胞毒性(Lee等人. 2021, 見上文；Wu等人. Int Immunopharmacol. 2022年3月;104:108497)。然而，維納妥拉治療導致AML患者淋巴球減少，鑒於Vγ9Vδ2 T細胞通常占成人周邊血液中總T細胞之＜5%，此可能在臨床上係不利的。

本發明人已展示ICT01介導之Vγ9Vδ2 T細胞之活化部分地保護其免於維納妥拉誘導之細胞死亡，且ICT01與維納妥拉及5-阿紮胞苷之組合顯著改善AML細胞殺死。

本發明依賴於維納妥拉及去甲基化劑與ICT01之組合使用，與單一藥劑相比，該組合展示出優良的AML殺死。藉由觸發Vγ9Vδ2 T細胞抗癌活性，從而保護其免於細胞死亡及化學療法誘導之AML細胞之細胞凋亡。

   特定實施例E1.  一種BTN3A活化抗體，其係用於治療有需要之個體中之癌症，其中治療有效量之該BTN3A活化抗體係與治療有效量之Bcl2家族抑制劑化合物(例如Bcl2抑制劑)同時、依序或分開向該個體投與，視情況進一步與去甲基化劑組合。

E2.   如實施例E1所使用之BTN3A活化抗體，其中該Bcl2抑制劑為維納妥拉。

E3.  如實施例E1或E2所使用之BTN3A活化抗體，其中藉由表面電漿子共振所量測，該BTN3A活化抗體以10 nM或更低之K _D，較佳以5 nM或更低之K _D與人類BTN3A結合。

E4.  如實施例E1至E3中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該BTN3A活化抗體在與表現BTN3A之細胞共培養中誘導γδ T細胞，通常Vγ9Vδ2 T細胞之活化，其中以在脫粒檢定中所量測，EC ₅₀低於5 µg/ml，較佳為1 µg/ml或更低。

E5.如實施例E1至E4中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該BTN3A活化抗體： - 包含(a)可變重鏈(VH)多肽，其包含與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，及(b)可變輕鏈(VL)多肽，其包含與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列； - 包含SEQ ID NO: 12-14之HCDR1-3及SEQ ID NO: 15-17之LCDR1-3； - 包含SEQ ID NO: 18-20之HCDR1-3及SEQ ID NO: 21-23之LCDR1-3；或 - 與選自以下之抗體競爭結合：mAb 20.1，其由寄存於CNCM寄存號為I-4401之融合瘤產生；mAb 7.2，其由寄存於CNCM寄存號為I-4402之融合瘤產生；以及具有SEQ ID NO: 4之重鏈及SEQ ID NO: 6之輕鏈的抗體。

E6.如實施例E1至E5中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該BTN3A抗體包含突變或經化學修飾之IgG1恆定區，其中當與具有野生型IgG1同型恆定區之對應抗體相比時，該突變或經化學修飾之IgG1恆定區不賦予與Fcγ受體結合或減少與Fcγ受體結合。

E7.如實施例E1至E6中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該突變IgG1恆定區為IgG1三重突變體L247F、L248E及P350S。

E8.如實施例E1至E7中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該抗BTN3A抗體為包含SEQ ID NO: 4之重鏈及SEQ ID NO: 6之輕鏈的抗體。

E9.如實施例E1至E8中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該BTN3A活化抗體與維納妥拉同時、依序或分開組合投與，進一步與阿紮胞苷或地西他濱(Decitabine)組合投與。

E10.如實施例E1至E9中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該癌症為血液惡性病。

E11.如實施例E1至E10中任一項所使用之抗BTN3A活化抗體，其中該癌症為急性骨髓性白血病。

E12.如實施例E1至E11中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該癌症為急性骨髓性白血病，且其中該BTN3A活化抗體為包含SEQ ID NO: 4之重鏈及SEQ ID NO: 6之輕鏈的抗體，且該BTN3A活化抗體係與維納妥拉同時、依序或分開組合投與，進一步與阿紮胞苷或地西他濱組合投與。

E13.如實施例E1至E12中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該個體不適合於密集化學療法。

E14.如實施例E1至E13中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該個體之年齡大於75歲。

E15.如實施例E1至E14中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該BTN3A活化抗體係每三週一次或每四週一次投與。

E16.如實施例E1至E15中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該BTN3A活化抗體係靜脈內投與。

E17.如實施例E1至E16中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該BTN3A活化抗體係以約7至約200 mg，例如約75 mg之單位劑量投與，例如每21天投與一次持續1至22個週期。

E18.如實施例E1至E17中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中維納妥拉係每日一次經口投與。

E19.如實施例E1至E18中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中維納妥拉係以約50 mg至約500 mg之單位劑量經口投與。

E20.如實施例E1至E19中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中阿紮胞苷或地西他濱係作為去甲基化劑投與。

E21.如實施例E1至E20中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中阿紮胞苷係作為去甲基化劑投與。

E22.如實施例E1至E21中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中去甲基化劑係以約50 mg/m ²至約100 mg/m ²之劑量投與。

E23.如實施例E1至E22中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中去甲基化劑係以約75 mg/m ²之劑量投與。

E24.如實施例E1至E23中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中去甲基化劑係每日投與一次。

E25.如實施例E1至E24中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中投與去甲基化劑連續5至7日。

E26.如實施例E1至E25中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中投與去甲基化劑持續 (a)在28天週期之第1天至第7天連續七日， (b)在28天週期之第1天至第5天連續五日，隨後兩天中斷，接著在28天週期之第8天至第9天連續兩日，或 (c)在28天週期之第1天至第6天連續六日，隨後一天中斷，接著視情況在28天週期之第8天投與一次。

E27.如實施例E1至E26中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中去甲基化劑係皮下或靜脈內投與。

E28.如實施例E1至E27中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中首先投與維納妥拉至少一個週期，隨後係恢復期，且該BTN3A活化抗體例如在恢復期之至少10天至14天之後或與維納妥拉之投與的第2週期一起投與。

E29.如實施例E1至E27中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中維納妥拉之第一次投與發生在用BTN2A活化抗體治療之第一個週期之後，較佳在第一次投與BTN3A活化抗體後21天之後。

E30.一種治療有需要之個體中之癌症的方法，該方法包含向該個體同時、依序或分開投與治療有效量之BTN3A活化抗體與治療有效量之Bcl2家族抑制劑化合物(例如Bcle 2抑制劑)，視情況進一步與去甲基化劑組合。

E31.如實施例E30之方法，其中該Bcl2抑制劑為維納妥拉。

E32.如實施例E30或E31之方法，其中藉由表面電漿子共振所量測，該BTN3A活化抗體以10 nM或更低之K _D，較佳以5 nM或更低之K _D與人類BTN3A結合。

E33.如實施例E30至E32中任一項之方法，其中該BTN3A活化抗體在與表現BTN3A之細胞共培養中誘導γδ T細胞，通常Vγ9Vδ2 T細胞之活化，其中以在脫粒檢定中所量測，EC ₅₀低於5 µg/ml，較佳為1 µg/ml或更低。

E34.如實施例E30至E33中任一項之方法，其中該BTN3A活化抗體： - 包含(a)可變重鏈(VH)多肽，其包含與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，及(b)可變輕鏈(VL)多肽，其包含與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列； - 包含SEQ ID NO: 12-14之HCDR1-3及SEQ ID NO: 15-17之LCDR1-3； - 包含SEQ ID NO: 18-20之HCDR1-3及SEQ ID NO: 21-23之LCDR1-3；或 - 與選自以下之抗體競爭結合：mAb 20.1，其由寄存於CNCM寄存號為I-4401之融合瘤產生；mAb 7.2，其由寄存於CNCM寄存號為I-4402之融合瘤產生；以及具有SEQ ID NO: 4之重鏈及SEQ ID NO: 6之輕鏈的抗體。

E35.如實施例E30至E34中任一項之方法，其中該BTN3A抗體包含突變或經化學修飾之IgG1恆定區，其中當與具有野生型IgG1同型恆定區之對應抗體相比時，該突變或經化學修飾之IgG1恆定區不賦予與Fcγ受體結合或減少與Fcγ受體結合。

E36.如實施例E30至E35中任一項之方法，其中該突變IgG1恆定區為IgG1三重突變體L247F L248E及P350S。

E37.如實施例E30至E36中任一項之方法，其中該抗BTN3A抗體為包含SEQ ID NO: 4之重鏈及SEQ ID NO: 6之輕鏈的抗體。

E38.如實施例E30至E37中任一項之方法，其中該BTN3A活化抗體與維納妥拉同時、依序或分開組合投與，進一步與阿紮胞苷或地西他濱組合投與。

E39.如實施例E30至E38中任一項之方法，其中該癌症為血液惡性病。

E40.如實施例E30至E39中任一項之方法，其中該癌症為急性骨髓性白血病。

E41.如實施例E30至E40中任一項之方法，其中該癌症為急性骨髓性白血病，且其中該BTN3A活化抗體為包含SEQ ID NO: 4之重鏈及SEQ ID NO: 6之輕鏈的抗體，且該BTN3A活化抗體係與維納妥拉同時、依序或分開組合投與，進一步與阿紮胞苷或地西他濱組合投與。

E42.如實施例E30至E41中任一項之方法，其中該個體不適合於密集化學療法。

E43.如實施例E30至E42中任一項之方法，其中該個體之年齡大於75歲。

E44.如實施例E30至E43中任一項之方法，其中該BTN3A活化抗體係每三週一次或每四週一次投與。

E45.如實施例E30至E44中任一項之方法，其中該BTN3A活化抗體係靜脈內投與。

E46.如實施例E30至E45中任一項之方法，其中該BTN3A活化抗體係以約7至約200 mg，例如約75 mg之單位劑量投與，例如每21天投與一次持續1至22個週期。

E47.如實施例E30至E46中任一項之方法，其中維納妥拉係每日一次經口投與。

E48.如實施例E30至E47中任一項之方法，其中維納妥拉係以約50 mg至約500 mg之單位劑量經口投與。

E49.如實施例E30至E48中任一項之方法，其中阿紮胞苷或地西他濱係作為去甲基化劑投與。

E50.如實施例E30至E49中任一項之方法，其中阿紮胞苷係作為去甲基化劑投與。

E51.如實施例E30至E50中任一項之方法，其中去甲基化劑係以約50 mg/m ²至約100 mg/m ²之劑量投與。

E52.如實施例E30至E51中任一項之方法，其中去甲基化劑係以約75 mg/m ²之劑量投與。

E53.如實施例E30至E52中任一項之方法，其中去甲基化劑係每日一次投與。

E54.如實施例E30至E53中任一項之方法，其中投與去甲基化劑連續5至7日。

E55.如實施例E30至E54中任一項之方法，其中投與去甲基化劑持續 (a)在28天週期之第1天至第7天連續七日， (b)在28天週期之第1天至第5天連續五日，隨後兩天中斷，接著在28天週期之第8天至第9天連續兩日，或 (c)在28天週期之第1天至第6天連續六日，隨後一天中斷，接著視情況在28天週期之第8天投與一次。

E56.如實施例E30至E55中任一項之方法，其中去甲基化劑係皮下或靜脈內投與。

E57.如實施例E30至E56中任一項之方法，其中首先投與維納妥拉至少一個週期，隨後係恢復期，且該BTN3A活化抗體例如在恢復期之至少10天至14天之後或與維納妥拉之投與的第2週期一起投與。

E58.如實施例E30至E56中任一項之方法，其中維納妥拉之第一次投與發生在用BTN2A活化抗體治療之第一個週期之後，較佳在第一次投與BTN3A活化抗體後21天之後。

定義為了使本發明可更易於理解，首先定義某些術語。在整個詳細說明中，闡述額外的定義。

如本文所用，術語「多肽」、「蛋白」或「肽」係指胺基酸殘基之任何鏈，與其長度或轉譯後修飾(諸如醣基化)無關。

如本文所用，術語「BTN3A」具有其在此項技術中之一般含義。在特定實施例中，其係指人類BTN3A多肽，包括SEQ ID NO: 24之BTN3A1、SEQ ID NO: 25之BTN3A2或SEQ ID NO: 26之BTN3A3。

如本文所用，術語「抗體」係指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，亦即，含有免疫特異性結合抗原之抗原結合位點的分子。術語「抗體」或「免疫球蛋白」具有相同含義，且將同樣用於本發明中。如此，術語抗體不僅涵蓋完全抗體分子，且亦涵蓋抗體片段以及抗體之變異體(包括衍生物)。如本文所用，術語「抗體」亦包括雙特異性或多特異性分子。可將抗體衍生為或連接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白(例如受體之另一抗體或配體)，以產生與至少兩個不同結合位點或標靶分子結合之雙特異性分子。實際上可將抗體衍生為或連接至超過一種其他功能分子，以產生與超過兩個不同結合位點及/或標靶分子結合之多特異性分子；此類多特異性分子亦意欲由如本文所用之術語「雙特異性分子」涵蓋。為產生雙特異性分子，本發明之抗體可功能性連接(例如藉由化學偶合、基因融合、非共價結合或以其他方式)至一或多個其他結合分子(諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物)，從而產生雙特異性分子。另外，對於其中雙特異性分子為多特異性之實施例，除第一及第二標靶抗原決定基之外，分子亦可進一步包括第三結合特異性。

在嚙齒動物及靈長類動物之天然抗體中，兩條重鏈藉由二硫鍵彼此連接，且各重鏈藉由二硫鍵與輕鏈連接。存在兩種類型之輕鏈，λ (lambda)及κ (kappa)。決定抗體分子之功能活性的主要重鏈類別(或同型)有五種：IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。各鏈含有不同序列域。在典型IgG抗體中，輕鏈包括兩個域：可變域(VL)及恆定域(CL)。重鏈包括四個域：一個可變域(VH)及三個恆定域(CH1、CH2及CH3，統稱為CH)。輕鏈(VL)及重鏈(VH)二者之可變區決定對抗原之結合識別及特異性。輕鏈(CL)及重鏈(CH)之恆定區域賦予重要生物特性，諸如抗體鏈結合、分泌、經胎盤移動性、補體結合及與Fc受體(FcR)之結合。

Fv片段為免疫球蛋白之Fab片段的N端部分，且由一個輕鏈及一個重鏈之可變部分組成。抗體之特異性存在於抗體結合位點與抗原決定子之間的結構互補性。抗體結合位點由主要來自高變區或互補決定區(CDR)之殘基構成。間或地，來自非高變區或構架區(FR)之殘基可參與抗體結合位點或影響總體域結構，且因此影響結合位點。互補決定區或CDR係指一起限定天然免疫球蛋白結合位點之天然Fv區之結合親和力及特異性的胺基酸序列。免疫球蛋白之輕鏈及重鏈各自具有三個CDR，分別稱為L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3及H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。因此，抗原結合位點通常包括六個CDR，該六個CDR包含來自重鏈及輕鏈V區中之各者的CDR集合。構架區(FR)係指插入於CDR之間的胺基酸序列。相應地，輕鏈及重鏈之可變區通常包含以下序列之4個構架區及3個CDR：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

抗體可變域中之殘基習知地根據Kabat等人所設計的系統進行編號。此系統闡述於Kabat等人, 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (Kabat等人, 1992, 下文「Kabat等人」)中。此編號系統用於本說明書中。Kabat殘基名稱並不始終與SEQ ID序列中之胺基酸殘基的線性編號直接對應。對應於基本可變域結構之結構組分(無論是構架還是互補決定區(CDR))的縮短或插入，實際線性胺基酸序列可含有比嚴格的Kabat編號更少的胺基酸或含有其他胺基酸。對於給定抗體，可藉由將抗體序列中之同源殘基與「標準」Kabat編號序列進行比對來確定殘基之正確Kabat編號。根據Kabat編號系統，重鏈可變域之CDR位於殘基31至35 (H-CDR1)、殘基50至65 (H-CDR2)及殘基95至102 (H-CDR3)。根據Kabat編號系統，輕鏈可變域之CDR位於殘基24至34 (L-CDR1)、殘基50至56 (L-CDR2)及殘基89至97 (L-CDR3)。

目前在此項技術中公認，哺乳動物抗體之非CDR區可由同種特異性或異種特異性抗體之相似區置換同時保留原始抗體之抗原決定基特異性。此最清晰地體現於「人源化」抗體之開發及用途中，在人源化抗體中非人類CDR與人類FR及/或Fc/pFc'區共價接合以產生功能性抗體。

如本文所用，「人源化」描述其中CDR區外部之一些、大部分或全部胺基酸由衍生自人類免疫球蛋白分子之對應胺基酸置換的抗體。人源化之方法包括(但不限於)美國專利第4,816,567號、第5,225,539號、第5,585,089號、第5,693,761號、第5,693,762號及第5,859,205號中所描述的人源化之方法。以上美國專利第5,585,089號及第5,693,761號以及WO 90/07861亦提出四個可用於設計人源化抗體之可能性準則。第一條建議為對於受體，使用來自特定人類免疫球蛋白之構架，該特定人類免疫球蛋白與人源化之供體免疫球蛋白異常同源，或使用來自多種人類抗體之共通構架。第二條建議為若人類免疫球蛋白之構架中之胺基酸為不尋常的且該位置處之供體胺基酸對於人類序列而言為典型的，則可選擇供體胺基酸而非受體。第三條建議為在人源化免疫球蛋白鏈中緊鄰3個CDR之位置中，可選擇供體胺基酸而非受體胺基酸。第四條建議為使用存在於構架位置處的供體胺基酸，在該等構架位置處，胺基酸經預測在抗體之三維模型中的CDR之3A內具有側鏈原子且經預測能夠與CDR相互作用。以上方法僅為熟習此項技術者可用來製備人源化抗體之一些方法的說明。一般熟習此項技術者將熟悉用於抗體人源化之其他方法。在抗體之一些人源化形式中，CDR區外部之一些、大部分或全部胺基酸可由來自人類免疫球蛋白分子之胺基酸置換，但其中一或多個CDR區內之一些、大部分或全部胺基酸不變。胺基酸之小添加、缺失、插入、取代或修飾為准許的，只要其不會消除抗體結合給定抗原之能力即可。適合之人類免疫球蛋白分子包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgM分子。「人源化」抗體保留與原始抗體類似之抗原特異性。然而，使用某些人源化之方法，抗體結合之親和力及/或特異性可使用「定向進化」之方法增加，如Wu等人, Mol. Biol. 294:151, 1999所描述。

完全人類單株抗體亦可藉由免疫大部分人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因座的轉基因小鼠來製備。參見例如美國專利第5,591,669、第5,598,369號、第5,545,806號、第5,545,807號、第6,150,584號及其中所引用之參考文獻，其內容以引用之方式併入本文中。此等動物已經基因修飾從而使得內源性(例如鼠類)抗體之產生出現功能性缺失。動物進一步經修飾以含有全部或一部分人類生殖系免疫球蛋白基因座，使得此等動物之免疫將引起所關注抗原之完全人類抗體的產生。對此等小鼠(例如XenoMouse (Abgenix)、HuMAb小鼠(Medarex/GenPharm))進行免疫之後，單株抗體可根據標準融合瘤技術製備。此等單株抗體將具有人類免疫球蛋白胺基酸序列且因此當向人類投與時不會激起人類抗小鼠抗體(KAMA)反應。

亦存在用於產生人類抗體之活體外方法。此等方法包括噬菌體呈現技術(美國專利第5,565,332號及第5,573,905號)及人類B細胞之活體外刺激(美國專利第5,229,275號及第5,567,610號)。此等專利之內容以引用之方式併入本文中。

如本文所用，術語抗體之「抗原結合片段」 (或簡稱「抗體片段」)係指抗體之全長或指抗體之一或多個片段，其保留與抗原(例如上文所定義之BTN3A蛋白)特異性結合之能力。在特定實施例中，本文所提供之抗體為抗體片段，且更特定言之，包括如本文所揭示之抗體之抗原結合域的任何蛋白。熟知抗體片段包含：Fab片段，由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；F(ab)2片段，包含兩個由鉸鏈區之二硫橋鍵連接之Fab片段的二價片段；由VH及CH1域組成之Fd片段；由抗體之單臂的VL及VH域組成之Fv片段；dAb片段(Ward等人, 1989 Nature 341:544-546)，其由VH域或包含此類抗原結合片段之任何融合蛋白組成；雙功能抗體，其係指具有兩個抗原結合位點之較小抗體片段，該等片段包含與同一條多肽鏈(VH-VL)中之輕鏈可變域(VL)連接的重鏈可變域(VH)。藉由使用過短而使得同一鏈上之兩個域之間不能配對的連接子，迫使域與另一條鏈之互補域配對，且產生兩個抗原結合位點。此外，儘管Fv片段之兩個域VL及VH係由獨立基因編碼，但其可使用重組方法藉由合成連接子接合，使得其能夠製成單鏈蛋白，其中VL及VH區配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv)；參見例如Bird等人, 1988 Science 242:423-426；及Huston等人, 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883)。此類單鏈抗體亦意欲涵蓋在術語抗體之「抗原結合片段」內(在本文中亦簡稱為抗體片段)。更一般而言，如本文中之抗體片段亦意欲涵蓋單域抗體，其為包含抗體之重鏈可變域之全部或一部分或輕鏈可變域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Waltham, MA之Domantis, Inc.；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。此等抗體片段係使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且以與完整抗體相同之方式來篩選供使用的片段。非常適合的抗體片段包括(但不限於) Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv、sc(Fv)2及雙功能抗體。抗體片段可藉由各種技術製得，包括(但不限於)完整抗體之蛋白水解分解以及藉由如本文所描述之重組宿主細胞產生。

如本文所用，術語「單株抗體」係指具有單特異性之抗體分子的製品。單株抗體顯示對特定抗原決定基之單一結合特異性及親和力。因此，術語「人類單株抗體」係指顯示單一結合特異性之抗體，其具有衍生自或基於人類生殖系免疫球蛋白序列或衍生自完全合成序列之可變區及恆定區。製備單株抗體之方法與結合特異性不相關。

「重組抗體」為藉由重組方式產生、表現、生成或分離之抗體，諸如使用轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現的抗體；自重組組合性抗體庫分離之抗體；自因人類免疫球蛋白基因而為轉基因的動物(例如小鼠)分離之抗體；或以任何其他方式產生、表現、生成或分離之抗體，在該等方式中特定免疫球蛋白基因序列(諸如人類免疫球蛋白基因序列)與其他DNA序列一起組裝。重組抗體包括例如嵌合抗體及人源化抗體。在一些實施例中，本發明之重組人類抗體具有與對應天然存在之人類抗體相同的胺基酸序列但與該天然存在之人類抗體結構上不同。舉例而言，在一些實施例中，醣基化模式由於重組人類抗體之重組產生而不同。在一些實施例中，重組人類抗體藉由相對於在人類中天然存在之人類抗體之結構添加或減去至少一個共價化學鍵來進行化學修飾。

如本文所用，「經分離之抗體」係指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如與BTN3A特異性結合的經分離之抗體實質上不含與BTN3A之外的其他抗原特異性結合之抗體)。然而，與BTN3A特異性結合的經分離之抗體可以與其他抗原，諸如來自其他物種之相關BTN3A分子具有交叉反應。另外，經分離之抗體可實質上不含其他細胞材料及/或化學物質。

片語「識別抗原之抗體」及「對於抗原具有特異性之抗體」在本文中可與術語「與抗原特異性結合之抗體」互換使用。術語「抗BTN3A抗體」或「BTN3A抗體」在本文中亦簡化使用，其具有「識別BTN3A之抗體」之含義。

如本文所用，術語「活化抗體」係指能夠直接地或間接地誘導效應細胞之免疫功能的抗體。特定言之，如本文所用，活化抗BTN3A抗體至少具有在與表現BTN3之細胞共培養中誘導γδ T細胞(通常Vγ9Vδ2 T細胞)之活化的能力，其中以在脫粒檢定中所量測，EC50低於5 μg/ml，較佳為1 μg/ml或更低(詳細檢定參見WO/2020/025703)。

如本文所用，在抗體與預定抗原或抗原決定基，尤其BTN3A結合之情形下，術語「結合」通常意謂當藉由例如BIAcore 3000儀器中之表面電漿子共振(SPR)技術測定，通常使用可溶形式之抗原作為配體且抗體作為分析物時，以對應於約10 ^{- 7}M或更低，諸如約10 ^{- 8}M或更低，諸如約10 ^{- 9}M或更低、約10 ^{- 10}M或更低或約10 ^{- 11}M或甚至更低之K _D的親和力結合。BIACORE® (GE Healthcare，Piscaataway，NJ)為常規用於單株抗體之抗原決定基箱組的各種表面電漿子共振檢定形式中之一者。通常，抗體以對應於K _D之親和力與預定抗原結合，該K _D比其與非特異性抗原(例如BSA，酪蛋白)結合之K _D低至少十倍，諸如低至少100倍，例如低至少1,000倍；諸如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍，該非特異性抗原不與預定抗原一致或密切相關。若抗體之K _D極低(即抗體具有高親和力)，則抗體結合抗原之K _D通常比其與非特異性抗原結合之K _D低至少10,000倍。

如本文所用，在抗體之情形下，術語「親和力」意謂抗體與抗原決定基之結合強度。

如本文所用之術語「K _on」或「Kass (K _a)」意欲指特定抗體-抗原相互作用之結合速率，而如本文所用之術語「K _dis(Kd)」或「K _off」意欲指特定抗體-抗原相互作用之解離速率。

如本文所用，術語「K _D」意欲指平衡解離常數，其自k _off與k _on之比率(亦即，k _off/k _on)獲得，且表述為莫耳濃度(M)。K _D值與抗體之濃度(特定實驗所需之抗體的量)相關，且因此，K _D值愈低(較低濃度)且因而抗體之親和力愈高。抗體之K _D值可使用此項技術中沿用已久之方法測定。用於測定mAb之K _D值的較佳方法可見於Harlow等人, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988), Coligan等人編, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)，及Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)中，該等參考文獻以全文引用之方式併入本文中。一種測定抗體之K _D之方法為藉由使用表面電漿子共振或藉由使用諸如Biacore® (亦參見關於親和力評估之詳細資訊Rich RL, Day YS, Morton TA, Myszka DG. High-resolution and high-throughput protocols for measuring drug/human serum albumin interactions using BIACORE®. Anal Biochem. 2001年9月15日; 296(2):197-207)或Octet®系統的生物感測器系統。Octet®平台係基於生物層干涉術(BLI)技術。BLI技術之原理係基於自兩個表面(固定蛋白層及內部參考層)反射之白光的光學干涉圖案。固定於生物感測器尖端表面上之配體與溶液中之分析物之間的結合產生生物感測器尖端處之光學厚度增加，此導致以奈米為單位量測之干涉圖案移位。波長移位(Δλ)為生物層之光學厚度之變化的直接量度，當在一段時間內量測此移位且將其量值標繪為時間之函數時，獲得經典結合/解離曲線。此相互作用以即時量測，允許監測結合特異性、結合速率及解離速率及濃度(參見Abdiche等人. 2008以及結果中之詳情)。親和力量測通常在25℃下進行。

如本文所用，術語「特異性」係指抗體可偵測地結合抗原(諸如BTN3A)上呈現之抗原決定基的能力。在一些實施例中，該術語意欲指與周邊血液單核細胞(PBMC)上所表現之人類BTN3A結合的抗體，以實例中所測定，其較佳地具有低於50 µg/ml且更佳低於10 µg/ml之EC ₅₀(檢定及方案通常揭示於WO/2020/025703中，尤其參考表4)。在其他實施例中，其以100 nM或更低、10 nM或更低、1 nM或更低、100 pM或更低或10 pM或更低之K _D與抗原重組多肽結合，藉由如上文所提及之SPR量測所量測且關於詳情亦參見WO/2020/025703之表4。

「與除BTN3A之外的抗原交叉反應」之抗體意欲指以10 nM或更低、1 nM或更低或100 pM或更低之K _D結合除BTN3A之外之該抗原的抗體。「不與特定抗原交叉反應」之抗體意欲指以1 μM或更大之K _D或10 μM或更大之K _D與該抗原結合的抗體。在某些實施例中，不與抗原交叉反應之此類抗體在標準結合檢定中呈現出基本上不可偵測的針對此等蛋白之結合。在特定實施例中，例如以在Biacore檢定(尤其參見例示於WO/2020/025703中參考表26的相關檢定)中所量測，本發明之人源化抗體(例如mAb1)分別與SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28及SEQ ID NO: 29之石蟹獼猴(cynomolgus) BTN3A1、BTN3A2及BTN3A3交叉反應。

特異性可進一步藉由例如約10:1、約20:1、約50:1、約100:1、10,000:1或更大之與特定抗原結合對比與其他不相關分子之非特異性結合(在此情形下特定抗原為BTN3A多肽)的親和力/親合力之比率來展現。

如本文所用，術語「親合力」係指抗體-抗原複合物之整體穩定性或強度的資訊性量度。其由三個主要因素控制：抗體抗原決定基親和力；抗原與抗體兩者之價數；以及相互作用部分之結構排列。最終，此等因素界定抗體之特異性，亦即，特定抗體與精確抗原抗原決定基結合的可能性。

如本文所用，術語「個體」包括任何人類或非人類動物。術語「非人類動物」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、犬、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。

如本文所用，術語「經最佳化」意謂已使用產生細胞或生物體(一般為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary cell，CHO)或人類細胞)中較佳的密碼子改變核苷酸序列以編碼胺基酸序列。對經最佳化之核苷酸序列進行工程改造以完全或儘可能多地保留原先由起始核苷酸序列編碼之胺基酸序列。由經最佳化之核苷酸序列編碼之胺基酸序列亦稱為經最佳化。

如本文所用，關於多肽序列之術語「一致性」係指兩個分子之間的胺基酸序列一致性。若兩個分子中之一個胺基酸位置由相同胺基酸佔據時，則分子在該位置處係一致的。兩個多肽之間的一致性為一致位置之數目的直接函數。一般而言，對序列進行比對從而獲得最高階匹配(必要時包括空隙)。在考慮為達成兩個序列之最佳比對而需引入之空隙的數目及各空隙之長度的情況下，兩個序列之間的一致性百分比為該等序列所共用之一致位置之數目的函數(亦即一致性%=一致位置之數目/位置之總數目×100)。序列之比較及兩個序列之間的一致性百分比測定可使用數學演算法實現，如下文所描述。

兩個胺基酸序列之間的一致性百分比亦可使用E. Meyers及W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988)之演算法(其已併入ALIGN程式(2.0版)中)，使用PAM120權重殘基表(空隙長度罰分為12且空隙罰分為4)測定。或者，兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可使用公開技術及廣泛可用的電腦程式，諸如BLASTP、FASTA (Atschul等人, J. Molecular Biol. 215:403, 1990)或Needleman及Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970)演算法，其已併入GCG套裝軟體中之GAP程式(Devereux等人, Nucleic Acids Res. 12:387, 1984，通常可在http://www.gcg.com獲得)中，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣且空隙權重為16、14、12、10、8、6或4及長度權重為1、2、3、4、5或6來測定。

兩個核苷酸胺基酸序列之間的一致性百分比亦可使用例如演算法(諸如用於核酸序列之BLASTN程式)，使用字長(W)為11、期望值(E)為10、M=5、N=4及兩股之比較作為預設來測定。

額外的抗體可在標準抗原結合檢定(諸如ELISA結合檢定)中基於其與本發明之其他抗體交叉競爭(例如以統計學上顯著之方式競爭性抑制結合)的能力來識別。測試抗體抑制本發明之抗體與標靶結合之能力表明測試抗體可與該抗體競爭與標靶結合；根據非限制性理論，此類抗體可與標靶上其所競爭之抗體相同或相關(例如結構上類似或空間上接近)的抗原決定基結合。因此，本發明之另一態樣提供結合至與本文所揭示之抗體相同的抗原且與本文所揭示之抗體競爭的抗體。如本文所用，當在等莫耳濃度之競爭抗體存在下，競爭抗體抑制本發明之抗體或抗原結合片段的標靶結合超過50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%時，抗體「競爭」結合。

「組合療法」、「共同投與」、「經組合之投與」或「伴隨投與」係指至少兩種治療劑的經組合之投與，其中第一藥劑(通常BTN3A活化化合物)係在時間間隔內與第二藥劑(例如Bcl2家族抑制劑)及視情況選用之第三藥劑(例如去甲基化劑)在有需要之相同個體中同時或分開投與，其中此等時間間隔允許經組合之搭配物展示出合作或協同效應以用於治療病症(例如癌症且更尤其血液惡性病)。該術語並非欲暗示治療劑必須同時投與及/或經調配以一起遞送，儘管此等遞送方法係在本發明之範疇內。BTN3A活化抗體(例如本文所揭示之ICT01)可與一或多種其他額外療法或治療劑同時或在一或多種其他額外療法或治療劑之前或之後投與。該等術語亦意謂涵蓋其中藥劑不一定藉由相同投與途徑投與的治療方案。

如本文所用，術語協同或協同效應，當與藥劑組合功效的描述連合使用時，意謂組合之任何量測效應大於自個別藥劑效應的總和所預測的效應(亦即大於相加效應)。在一些實施例中，腫瘤生長速率或腫瘤尺寸(例如腫瘤尺寸(例如體積、質量)之變化速率)用於確定藥物之組合是否為協同的(例如若藥物之組合產生相加效應，則當腫瘤生長速率比所預期的速率慢時，藥物之組合為協同的)。在一些實施例中，中值總存活時間(例如＜12個月)係用於確定藥物之組合是否為協同的(例如若藥物之組合產生相加效應，則當個體或個體群體之中值總存活時間比所預期的中值總存活時間更長時，藥物之組合為協同的)。在一些實施例中，完全緩解(CR)及具有不完全計數恢復(CRi)速率之完全緩解係用於確定藥物之組合是否為協同的(與單一療法相比)。在一些實施例中，T細胞擴增亦可用於確定藥物之組合是否為協同的(例如若藥物之組合產生相加效應，則當特異性T細胞子集之擴增速率(與基線值相比群體增加之百分比或增加的絕對細胞數目測定)比所預期的擴增速率更高時，藥物之組合為協同的)。

活化 BTN3A 抗體 本發明之活化抗BTN3A抗體通常展現以下特性中之一或多者： (i) 如藉由SPR (例如專利申請案WO2020025703之實例中所描述)所量測，其以10 nM或更低之K _D，較佳以1 nM或更低之K _D與BTN3A結合； (ii) 如藉由SPR (例如專利申請案WO2020025703之實例中所描述)所量測，其以100 nM或更低之K _D，較佳以10 nM或更低之K _D與石蟹獼猴BTN3A交叉反應； (iii) 如在流動式細胞測量術檢定(如專利申請案WO2020025703之實例中所描述)中所量測，其以50 μg/ml或更低，較佳10 μg/ml或更低之EC ₅₀與人類PBMCs結合； (iv) 其在與表現BTN3之細胞共培養中誘導γδ-T細胞(通常Vγ9Vδ2 T細胞)之活化，其中EC ₅₀低於5 μg/ml，較佳1 μg/ml或更低，如專利申請案WO2020025703之實例中所描述； (v) 其誘導人類PBMC中之Vγ9Vδ2 T細胞的活體外活化，如藉由活化標記物CD69之表面表現所量測，EC ₅₀低於0.1 μg/mL，較佳0.01 μg/mL或更低，例如在100 pg/mL與0.1 μg/mL之間。

BTN3A活化抗體之實例描述於下文段落中。在一些實施例中，BTN3A活化抗體選自由以下組成之群：諸如國際專利申請案WO2012080769；WO2012080351及WO2020025703中所描述之BTN3A抗體。在一些特定實施例中，BTN3A活化抗體選自WO2020025703中所描述之人源化抗體或為WO2012080769及WO2012080351中所描述之BTN3A活化抗體的人源化型式。在一些實施例中，BTN3A活化抗體可選自mAb 20.1及mAb 7.2，其可獲自諸如WO2012080769及WO2012080351中所描述之以CNCM寄存號I-4401及I-4402獲取的融合瘤中之一者或其人源化型式；以及選自WO2020025703中所描述之人源化mAb 1 - 6。

在一些實施例中，BTN3A活化抗體包含WO2012080769及WO2012080351中所描述之抗體20.1或7.2或如WO2020025703中所描述的mAb 1 - 6之六個CDR (VH CDR1(亦稱為HCDR1)、VH CDR2 (亦稱為HCDR2)、VH CDR3 (亦稱為HCDR3)、VL CDR1 (亦稱為LCDR1)、VL CDR2 (亦稱為LCDR2)、VL CDR3 (亦稱為LCDR3))。在特定實施例中，抗BTN3A活化抗體包含如下 表 1中所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3： 表 1 ：根據WO2020025703中所定義之Kabat編號，mAb1、mAb2、mAb4及mAb5、親本鼠類mAb 7.2及鼠類mAb 20.1抗體之CDR區。

原始抗體	HCDR1	HCDR2	HCDR3	LCDR1	LCDR2	LCDR3
mAb 7.2 mAb1 (ICT01) mAb2 mAb4 mAb5	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 13	SEQ ID NO: 14	SEQ ID NO: 15	SEQ ID NO: 16	SEQ ID NO: 17
mAb 20.1	SEQ ID NO: 18	SEQ ID NO: 19	SEQ ID NO: 20	SEQ ID NO: 21	SEQ ID NO: 22	SEQ ID NO: 23

在如本文所揭示使用之抗體的一些實施例中，6個CDR區與WO2012080769及WO2012080351中所描述的抗體20.1或7.2或WO2020025703中所描述之mAb 1 - 6的6個CDR區100%一致，尤其在一些實施例中，如本文所揭示之抗體的6個CDR區與 表 1(尤其mAb 7.2；1；2；4；及5)之6個CDR區100%一致。

如本文所揭示使用之其他抗體包括具有已藉由胺基酸缺失、插入或取代而突變的胺基酸之彼等抗體，但與WO2012080769及WO2012080351中所描述之抗體20.1或7.2或WO2020025703中所描述之mAb 1 - 6的6個CDR區相比，尤其與 表 1中所定義之6個CDR區相比，CDR區中仍具有至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。通常，按照本發明，與WO2012080769及WO2012080351中所描述之抗體20.1或7.2或者WO2020025703中所描述之mAb 1 - 6之CDR序列相比，尤其與 表 1之CDR序列相比，更特定言之與mAb 7.2；1；2；4；及5之CDR序列相比，抗體在一或多個CDR中可具有在1、2、3或4個之間的胺基酸變化(包括缺失、插入或取代)。

在特定實施例中，根據本發明所使用之抗體包含具有取代N5S及K10N (根據Kabat編號亦稱為N53S、K58N)的mAb 20.1之變異體CDRH2。

在其他特定實施例中，根據本發明所使用之抗體包含具有取代L8V (根據Kabat編號亦稱為L31V)的mAb 20.1之變異體CDRL1。

在更特定實施例中，根據本發明所使用之抗體包含具有取代N5S及K10N (根據Kabat編號亦稱為N53S、K58N)的mAb 20.1之變異體CDRH2及具有取代L8V (根據Kabat編號亦稱為L31V)的mAb20.1之變異體CDRL1。

在一個特定實施例中，根據本發明所使用之BTN3A活化抗體包含分別為SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35及SEQ ID NO: 36之重鏈CDR1-3序列以及SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38及SEQ ID NO: 39之輕鏈CDR1-3序列。

在一個特定實施例中，根據本發明所使用之BTN3A活化抗體包含SEQ ID NO: 40之可變重鏈VH及SEQ ID NO: 41之可變輕鏈。

在特定實施例中，該BTN3A活化抗體為雙特異性抗體，其特徵在於包含特異性結合於人類BTN3A之第一結合部分及特異性結合於腫瘤抗原之第二結合部分，該腫瘤抗原通常為靶向該靶向血液惡性病之惡性細胞的腫瘤抗原。舉例而言，該第一結合部分係全長二價抗體，其具有SEQ ID NO: 34之重鏈CDR序列CDRH1、SEQ ID NO: 35之CDRH2、SEQ ID NO: 36之CDRH3及SEQ ID NO: 37之輕鏈CDR序列CDRL1、SEQ ID NO: 38之CDRL2、SEQ ID NO: 39之CDRL3。

其他抗BTN3A活化抗體，尤其mAb20.1活化抗體之變異體揭示於WO2023/161457 (Evobright GmbH)中，該文獻之內容以全文併入本文中。本發明所使用之抗體亦包括與 表 2中所定義之VH及VL區具有至少90%、尤其至少95%、96%、97%、98%、99或100%一致性的抗體。更特定言之，本發明之抗體包括經選擇之人源化重組抗體mAb1、mAb2、mAb4及mAb5，其在結構上特徵在於如下 表 2中所描述的其可變重鏈及輕鏈胺基酸序列以及人類恆定區(同型)： 表 2：mAb1-mAb6之可變重鏈及輕鏈胺基酸序列

抗體	VH 胺基酸序列	VL 胺基酸序列	同型恆定區
mAb1 (ICT01)	SEQ ID NO:1 (VH2 7.2)	SEQ ID NO:2 (Vk1 7.2)	沉默IgG1 L247F/L248E/P350S
mAb2	SEQ ID NO:1 (VH2 7.2)	SEQ ID NO:3 (Vk2 7.2)	沉默IgG1 L247F/L248E/P350S
mAb3	SEQ ID NO:30	SEQ ID NO:31	沉默IgG1 L247F/L248E/P350S
mAb4	SEQ ID NO:1 (VH2 7.2)	SEQ ID NO:2 (Vk1 7.2)	IgG4 S241P/L248E
mAb5	SEQ ID NO:1 (VH2 7.2)	SEQ ID NO:3 (Vk2 7.2)	IgG4 S241P/L248E
mAb6	與mAb3相同	與mAb3相同	IgG4 S241P/L248E

mAb3及mAb6為親本鼠類BTN3A活化抗體之人源化抗體，稱為WO2012/080351中所描述之mAb 20.1。

用於產生mAb1至mAb6的IgG1、IgG4及其突變型式IgG1 L247F/L248E/P350S及IgG4 S241P/L248E之恆定同型區的對應胺基酸及核苷酸編碼序列為此項技術中熟知的(Oganesyan等人, 2008；Reddy等人, 2000)。發現於IgG之C端離胺酸可天然裂解且此修飾不影響抗體之特性；因此，在mAb1至mAb6之構築體中可另外地使此殘基缺失。

mAb1、mAb2、mAb4及mAb5之全長輕鏈及重鏈以及對應編碼序列展示於下表3中。 表 3：全長重鏈及輕鏈DNA編碼序列

抗體	胺基酸序列	DNA 編碼序列
mAb1 (ICT01)	重鏈：SEQ ID NO: 4 輕鏈：SEQ ID NO: 6	重鏈：SEQ ID NO: 8 輕鏈：SEQ ID NO: 10
mAb2	重鏈：SEQ ID NO: 4 輕鏈：SEQ ID NO: 7	重鏈：SEQ ID NO: 8 輕鏈：SEQ ID NO: 11
mAb3	重鏈：SEQ ID NO: 32 輕鏈：SEQ ID NO: 33	-
mAb4	重鏈：SEQ ID NO: 5 輕鏈：SEQ ID NO: 6	重鏈：SEQ ID NO: 9 輕鏈：SEQ ID NO: 10
mAb5	重鏈：SEQ ID NO: 5 輕鏈：SEQ ID NO: 7	重鏈：SEQ ID NO: 9 輕鏈：SEQ ID NO: 11

在可與先前實施例組合之某些實施例中，本文所提供之抗體為上文所定義之抗體的抗體片段。抗體片段包括例如(但不限於) Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、單功能抗體及scFv片段、雙功能抗體、單域或奈米抗體及其他片段。較佳地，其為單價抗體，諸如scFv片段之Fab。

在一些實施例中，本發明之抗體競爭結合至上文所描述之BTN3A抗體，尤其本發明之抗體與選自mAb 20.1及mAb 7.2 (其可獲自諸如WO2012080769及WO2012080351中所描述之以CNCM寄存號I-4401及I-4402可獲取的融合瘤中之一者)以及選自WO2020025703中所描述之mAb 1 - 6的抗體競爭結合。在更特定實施例中，本發明之抗體與選自以下之抗體競爭結合：以藉由以寄存號I-4402寄存於CNCM的融合瘤所產生之mAb 7.2及具有SEQ ID NO: 4之重鏈及SEQ ID NO: 6之輕鏈的抗體。

在一些實施例中，本發明之抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。在本發明之較佳實施例中，BTN3A抗體為人源化抗體。通常，非人類抗體經人源化以降低對人類之免疫原性，同時具有至少親本非人類抗體之相同親和力(或優越親和力)。更特定言之，BTN3A抗體為WO2012080351中所揭示之抗體20.1或7.2之人源化形式。在較佳實施例中，本發明之抗體為如WO2012080351中所揭示之親本抗體mAb 7.2人源化抗體。一般而言，人源化抗體包含一或多個可變域，其中CDR (或其部分)係衍生自非人類抗體(例如鼠類mAb 7.2)，且FR (或其部分)係衍生自具有突變以降低免疫原性的鼠類抗體序列。人源化抗體視情況亦將包含至少一部分人類恆定區。較佳地，根據本發明之重組抗體為人源化沉默抗體，通常為人源化沉默IgG1或IgG4抗體。根據本發明之非常適合的人源化抗BTN3A抗體通常描述於WO2020025703中且包括具有 表 2之VH/VL多肽序列的mAb及具有 表 3之輕/重鏈的mAb。

如本文所用，術語「沉默」抗體係指以在諸如WO2020025703中所描述之彼等結合檢定中所量測不展現或展現較低FcγR結合及/或C1q結合的抗體。在一個實施例中，術語「無或低FcγR及/或C1q結合」意謂沉默抗體展現FcγR及/或C1q結合，該結合至少低於用具有野生型人類IgG1或IgG4同型之對應抗體所觀測到的FcγR及/或C1q結合的50%，例如低於80%。

構架或 Fc 工程改造本發明之抗體可包括對VH及VL內之構架殘基的修飾以降低其免疫原性。

在一些特定實施例中，本發明之抗體為親本鼠類抗體mAb 7.2之人源化單株抗體，其包括至少VH構架區中之以下胺基酸突變：V5Q；V11L；K12V；R66K；S74F；I75S；E81Q；S82AR；R82BS；R83T；D85E；T87S；L108S；及至少Vκ構架區中之以下胺基酸突變：T5N；V15L；R18T；V19I；K42N；A43I；D70G；F73L；Q100G。

在其他特定實施例中，本發明之抗體為親本鼠類抗體mAb 7.2之人源化單株抗體，其與mAb 7.2相比包括至少VH構架區中之以下胺基酸突變：V5Q；V11L；K12V；R66K；S74F；I75S；E81Q；S82AR；R82BS；R83T；D85E；T87S；L108S；及至少Vκ構架區中之以下胺基酸突變：T5N；V15L；R18T；V19I；K42N；A43I；S63T；D70G；F73L；Q100G。

除構架區內進行之修飾以外，本發明之抗體可經工程改造以包括Fc區內的修飾，通常改變抗體之一或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞細胞毒性。

此外，本發明之抗體可經化學修飾(例如可使一或多個化學部分連接至抗體)，或經修飾以改變其醣基化，再改變抗體之一或多種功能特性。此等實施例中之各者進一步詳細描述於下文中。 如本文所用，術語「同型恆定區」或「Fc區」可互換使用來定義免疫球蛋白重鏈之C端區，包括天然序列Fc區及變異體Fc區。人類IgG重鏈Fc區一般定義為包含自IgG抗體之位置C226或自P230至羧基端的胺基酸殘基，其中編號係根據EU編號系統。Fc區之C端離胺酸(殘基K447)可例如在抗體之產生或純化或其對應密碼子在重組構築體中缺失期間予以移除。因此，本發明之抗體的組成可包含移除所有K447殘基之抗體群體、未移除K447殘基之抗體群體及具有帶有或不帶有K447殘基之抗體之混合物的抗體群體。

在一些特定實施例中，CH1之鉸鏈區經修飾以使得鉸鏈區中之半胱胺酸殘基之數目改變，例如增加或減少。此方法進一步描述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。CH1鉸鏈區中之半胱胺酸殘基之數目經改變以例如促進輕鏈與重鏈組裝或提高或降低抗體之穩定性。

在其他實施例中，使抗體之Fc鉸鏈區突變以減少抗體之生物半衰期。更特定言之，將一或多個胺基酸突變引入Fc鉸鏈片段之CH2-CH3域界面區以使得抗體對葡萄球菌蛋白A (Staphylococcyl protein A；SpA)之結合相對於天然Fc鉸鏈域SpA結合減弱。此方法進一步詳細描述於Ward等人之美國專利案第6,165,745號中。

在其他實施例中，藉由用不同胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基來改變Fc區，以改變抗體之效應功能。舉例而言，一或多個胺基酸可經不同胺基酸殘基置換以使得抗體對效應配體具有改變之親和力，但保留親本抗體之抗原結合能力。親和力改變之效應配體可為例如Fc受體或補體之C1組分。此方法進一步詳細描述於Winter等人之美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中。

在另一實施例中，一或多個選自胺基酸殘基之胺基酸可經不同胺基酸殘基置換，以使得抗體具有改變之C1q結合及/或減弱或消除之補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法進一步詳細描述於Idusogie等人之美國專利第6,194,551號中。

在另一實施例中，一或多個胺基酸殘基經改變以從而改變抗體固定補體之能力。此方法進一步描述於Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351中。

在其他實施例中，藉由修飾一或多個胺基酸對Fc區進行修飾以降低抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之能力及/或減小抗體對Fcγ受體之親和力。此類具有降低的效應功能且尤其降低的ADCC之抗體包括沉默抗體。

在某些實施例中，使用IgG1同型之Fc域。在一些特定實施例中，使用IgG1 Fc片段之突變變異體，例如降低或消除融合多肽介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或與Fcγ受體結合之能力的沉默IgG1 Fc。

在某些實施例中，使用IgG4同型之Fc域。在一些特定實施例中，使用IgG4 Fc片段之突變變異體，例如降低或消除融合多肽介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或與Fcγ受體結合之能力的沉默IgG4 Fc。

沉默效應功能可藉由抗體之Fc恆定部分中的突變獲得且已描述於此項技術中(Baudino等人, J.Immunol. 2008；Strohl, CO Biotechnology 20 2009)。沉默IgG1抗體之實例包含三重突變變異體IgG1 L247F L248E P350S。沉默IgG4抗體之實例包含雙重突變變異體IgG4 S241P L248E。

在某些實施例中，Fc域為防止Fc域之位置314處醣基化的沉默Fc突變體。舉例而言，Fc域在位置314處含有天冬醯胺酸之胺基酸取代。此類胺基酸取代之實例為由甘胺酸或丙胺酸置換N314。

在其他實施例中，抗體之醣基化經修飾。舉例而言，可製得非醣基化抗體(亦即，抗體缺乏醣基化)。可改變醣基化以例如提高抗體對抗原之親和力。此類碳水化合物修飾可藉由例如改變抗體序列內之一或多個醣基化位點來完成。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代，從而消除一或多個可變區構架醣基化位點，以藉此消除該位點處之醣基化。此類非醣基化可提高抗體對抗原之親和力。此類方法進一步詳細描述於Co等人之美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中。

本發明所涵蓋之對本文抗體的另一修飾為聚乙二醇化或羥乙基澱粉化或相關技術。抗體可經聚乙二醇化以例如增加抗體之生物(例如血清)半衰期。為了使抗體聚乙二醇化，通常使抗體或其片段與聚乙二醇(PEG) (諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)在使一或多個PEG基團變成與抗體或抗體片段連接之條件下反應。聚乙二醇化可藉由與反應性PEG分子(或類似反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷化反應來進行。如本文所用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋已用於衍生其他蛋白之任一種PEG形式，諸如單(C1-C10)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。在某些實施例中，經聚乙二醇化之抗體係非醣基化抗體。用於聚乙二醇化蛋白之方法為此項技術中所已知，且可應用於本發明之抗體。參見例如Nishimura等人之EP 0 154 316及Ishikawa等人之EP 0 401 384。

另一可能性為本發明之抗體的至少抗原結合區與能夠與血清蛋白(諸如人類血清白蛋白)結合之蛋白融合以增加所得分子之半衰期。此類方法例如描述於Nygren等人, EP 0 486 525中。

在某些實施例中，通常存在於人類IgG重鏈恆定域上之C端離胺酸經工程改造出去以減少非均質性，此係由於在製造或儲存期間通常觀測到此減少之裂解所致。此類修飾並不可察覺地改變此等抗體之合乎需要的功能，同時賦予此等分子穩定性益處。

編碼本發明之抗體的核酸分子本文亦揭示編碼本發明之抗BTN3A抗體的核酸分子。可變輕鏈及重鏈核苷酸序列之實例為編碼mAb1、mAb2、mAb4及mAb5中之任一者的可變輕鏈及重鏈胺基酸序列之彼等核苷酸序列，可變輕鏈及重鏈胺基酸序列容易地衍生自 表 1及 表 2，且使用基因密碼並視宿主細胞物種而定視情況考慮密碼子偏差。

本發明亦係關於衍生自可變輕鏈及重鏈胺基酸序列的核酸分子已經最佳化以便蛋白在哺乳動物細胞(例如CHO細胞株)中表現。

核酸可存在於全細胞、細胞溶解產物中或可為以部分純化或基本上純的形式的核酸。當藉由標準技術(包括鹼/SDS處理、CsCl聚束、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中熟知的其他技術)使核酸與其他細胞組分或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白)純化遠離時，核酸「經分離」或「呈現實質上純」 (Ausubel等人, 1988, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons))。本發明之核酸可為例如DNA或RNA且可含有或可不含有內含子序列。在一個實施例中，核酸可存在於載體中，諸如噬菌體呈現載體或存在於重組質體載體中。

本發明之核酸可使用標準分子生物學技術獲得。一旦獲得編碼例如VH及VL區段之DNA片段，則可藉由標準重組DNA技術進一步操控此等DNA片段，例如將可變區基因轉化成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在此等操控中，將編碼VL或VH之DNA片段(例如 表 1中所定義之VL及VH)可操作地連接至另一DNA分子或編碼另一蛋白之片段，諸如抗體恆定區或可撓性連接子。如此上下文中所用，術語「可操作地連接」意欲意謂兩個DNA片段以功能性方式接合，例如使得由兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保持同框，或使得蛋白在所需啟動子控制下表現。

編碼VH區的經分離之DNA可藉由將編碼VH之DNA可操作地連接至編碼重鏈恆定區(CH1、CH2及CH3)之另一DNA分子而轉化成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列為此項技術中已知的(Kabat等人, K.S. (1992). Sequences of Proteins of Immunological Interest (DIANE Publishing))且涵蓋此等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區。在一些實施例中，重鏈恆定區選自IgG1同型，例如人類IgG1同型。在其他實施例中，重鏈恆定區選自IgG4同型，例如人類IgG4同型。對於Fab片段重鏈基因，編碼VH之DNA可操作地連接至僅編碼重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。

編碼VL區的經分離之DNA可藉由將編碼VL之DNA可操作地連接至編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子來轉化成全長輕鏈基因(以及轉化成Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列為此項技術中已知的(Kabat等人, 1992，參見上文)且涵蓋此等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。

為了產生scFv基因，將編碼VH及VL之DNA片段可操作地連接至編碼可撓性連接子(例如編碼胺基酸序列(Gly4 -Ser) ₃)的另一片段，從而VH及VL序列可表現為連續單鏈蛋白，其中VL及VH區藉由可撓性連接子接合(Bird等人, 1988, 參見上文；Huston等人, 1988, 參見上文；McCafferty, J.等人, 1990. Nature 348, 552-554)。

產生單株抗體之轉染瘤的產生本發明之抗體可使用例如此項技術中所熟知的重組DNA技術及基因轉染方法之組合在宿主細胞轉染瘤中產生(Morrison, 1985; Science 229, 1202-1207)。

舉例而言，為了表現抗體或其抗體片段，編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA可藉由標準分子生物學或生物化學技術(例如DNA化學合成、PCR擴增或使用表現所關注抗體之融合瘤進行cDNA選殖)獲得且可將DNA插入表現載體中從而將基因可操作地連接至轉錄及轉譯控制序列。在此情形下，術語「可操作地連接」意欲意謂抗體基因接合至載體中，使得載體內之轉錄及轉譯控制序列發揮其調節抗體基因之轉錄及轉譯的預期功能。選擇與所用表現宿主細胞相容的表現載體及表現控制序列。抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因可插入至單獨的載體中，或更通常，兩個基因插入至同一表現載體中。藉由標準方法(例如接合抗體基因片段及載體上的互補限制性位點，或若不存在限制性位點時，則進行鈍端接合)將抗體基因插入至表現載體中。藉由插入已編碼所要同型之重鏈恆定及輕鏈恆定區的表現載體中，本文所描述之抗體的輕鏈及重鏈可變區可用於產生任何抗體同型之全長抗體基因，使得VH區段可操作地連接至載體內之一或多個CH區段且VL區段可操作地連接至載體內之CL區段。或者或另外，重組表現載體可編碼促進抗體鏈自宿主細胞分泌之訊息肽。抗體鏈基因可選殖至載體中，使得訊息肽同框連接至抗體鏈基因之胺基端。訊息肽可為免疫球蛋白訊息肽或異源訊息肽(亦即，來自非免疫球蛋白蛋白質之訊息肽)。

除抗體鏈基因以外，本文所揭示之重組表現載體亦攜帶控制抗體鏈基因在宿主細胞中之表現的調控序列。術語「調控序列」意欲包括啟動子、強化子及控制抗體鏈基因之轉錄或轉譯的其他表現控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。此類調控序列描述於例如Goeddel之公開案(Goeddel, D.V. (1990). [1] Systems for heterologous gene expression. Methods in Enzymology, (Academic Press), 第3-7頁)中。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計，包括調控序列之選擇，可視諸如所轉型之宿主細胞之選擇、所需蛋白之表現量等因素而定。用於哺乳動物宿主細胞表現之調控序列包括在哺乳動物細胞中引導高蛋白表現量之病毒元件，諸如衍生自細胞巨大病毒(CMV)、猴病毒40 (Simian Virus 40，SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))及多瘤病毒之啟動子及/或強化子。或者，可使用非病毒調控序列，諸如泛蛋白啟動子或P-血球蛋白啟動子。再者，由來自不同來源之序列構成的調控元件，諸如SRa啟動子系統，該系統含有來自SV40早期啟動子之序列及人類T細胞白血病病毒1型之長末端重複序列(Takebe等人, 1988, Mol. Cell. Biol. 8, 466-472)。

除抗體鏈基因及調控序列以外，本發明之重組表現載體亦可攜帶另外的序列，諸如調控載體在宿主細胞中之複製的序列(例如複製起點)及可選標記基因。可選標記基因有助於選擇已引入載體之宿主細胞(參見例如全部由Axel等人頒予之美國專利第4,399,216號、第4,634,665號及第5,179,017號)。舉例而言，在已引入載體之宿主細胞上，可選標記基因通常賦予對諸如G418、潮黴素(hygromycin)或胺甲喋呤之藥物的抗性。可選標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於具有胺甲喋呤選擇/擴增之dhfr-宿主細胞)及neo基因(用於G418選擇)。

對於輕鏈及重鏈之表現，將編碼重鏈及輕鏈之一或多個表現載體藉由標準技術轉染至宿主細胞中。術語「轉染」之各種形式意欲涵蓋常用於將外源性DNA引入原核或真核宿主細胞中的各種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沉澱、DEAE-聚葡萄糖轉染及其類似技術。理論上有可能在原核或真核宿主細胞中表現本發明之抗體。論述抗體在真核細胞(例如哺乳動物宿主細胞、酵母菌或絲狀真菌)中之表現，因為此類真核細胞且尤其哺乳動物細胞比原核細胞更可能組裝且分泌適當摺疊及免疫活性抗體。

在一個特定實施例中，本發明之選殖或表現載體包含可操作地連接至適合啟動子序列之mAb1、mAb2、mAb4及mAb5中之任一者的重鏈及輕鏈之編碼序列中之一者。

用於表現本發明之重組抗體的哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，該等CHO細胞包括與DHFR可選標記(描述於Kaufman及Sharp, 1982中)一起使用之dhfr- CHO細胞(描述於Urlaub及Chasin, 1980中)、CHOK1 dhfr+細胞株、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞，例如GS CHO細胞株連同GS Xceed ^TM基因表現系統(Lonza)。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，藉由培養宿主細胞持續足以使抗體在宿主細胞中表現的時段及視情況，使抗體分泌至宿主細胞生長之培養基中來產生抗體。在抗體分泌之後可使用標準蛋白純化方法例如自培養基回收及純化抗體(Shukla等人, 2007, J. Chromatogr. B 848, 28-39)。

在一個特定實施例中，本發明之宿主細胞為經表現載體轉染之宿主細胞，該表現載體具有分別適用於可操作地連接至適合的啟動子序列之mAb1、mAb2、mAb4及mAb5之表現的編碼序列。

舉例而言，本發明係關於一種宿主細胞，其至少包含分別編碼mAb1之重鏈及輕鏈的SEQ ID NO: 8及10之核酸。

隨後可在合適條件下進一步培養後一宿主細胞以便表現及產生分別選自由mAb1、mAb2、mAb3、mAb4及mAb5組成之群的本發明之抗體。

或者，可將無細胞表現系統用於產生mAb1、mAb2、mAb3、mAb4及mAb5中之任一者。通常，已描述蛋白或抗體之無細胞表現的方法(Stech等人, 2017, Sci. Rep. 7, 12030)。

抗 BTN3A 免疫結合物在另一態樣中，本發明提供如本文所揭示之抗BTN3A抗體或其片段，其與治療部分結合。此類結合物在本文中稱為「免疫結合物」。包括一或多種細胞毒素之免疫結合物稱為「免疫毒素」。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害(例如殺死)之任何藥劑。

可使用此項技術中可用的連接子技術使細胞毒素與本發明之抗體結合。已用於使細胞毒素與抗體結合之連接子類型的實例包括(但不限於)腙、硫醚、酯、二硫化物及含肽之連接子，諸如纈胺酸-瓜胺酸連接子。可選擇例如易於藉由胞溶體隔室內之低pH裂解或易於藉由蛋白酶裂解，諸如優先在腫瘤組織中表現之蛋白酶，諸如組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B、C、D)的連接子。

關於細胞毒素之類型、連接子及用於使治療劑與抗體結合之方法的進一步論述，亦參見Panowski等人, 2013關於抗體藥物結合物之綜述。

本發明之抗體亦可與放射性同位素結合以生成細胞毒性放射性藥品，亦稱為放射性免疫結合物。可與抗體結合以便診斷或治療上使用之放射性同位素的實例包括(但不限於)碘 ¹³¹、銦 ¹¹¹、釔 ⁹⁰及鎦 ¹⁷⁷。用於製備放射性免疫結合物之方法為此項技術中確定的。

雙特異性或多特異性抗 BTN3A 抗體在另一態樣中，本文進一步揭示雙特異性或多特異性分子，其包含本發明之抗BTN3A抗體。可將抗體衍生為或連接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白(例如受體之另一抗體或配體)，以產生與至少兩個不同結合位點或標靶分子結合之雙特異性分子。實際上可將抗體衍生為或連接至超過一種其他功能分子，以產生與超過兩個不同結合位點及/或標靶分子結合之多特異性分子；此類多特異性分子亦意欲由如本文所用之術語「雙特異性分子」涵蓋。為產生雙特異性分子，本發明之抗體可功能性連接(例如藉由化學偶合、基因融合、非共價結合或以其他方式)至一或多個其他結合分子(諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物)，從而產生雙特異性分子。

因此，本發明包括雙特異性分子，該等雙特異性分子包含至少一種針對BTN3A之第一結合特異性，例如mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5及mAb6 (或其功能變異體)中之任一者的一個抗原結合部分，以及針對第二標靶抗原決定基之第二結合特異性。

另外，對於其中雙特異性分子為多特異性之實施例，除第一及第二標靶抗原決定基之外，分子亦可進一步包括第三結合特異性。

在一個實施例中，如本文所揭示之雙特異性分子包含至少一種抗體或其抗體片段作為結合特異性，包括例如Fab、Fab'、F(ab') ₂、Fv、單功能抗體或單鏈Fv。抗體亦可為輕鏈或重鏈二聚體或其任何最小片段，諸如Fv或單鏈構築體，如Ladner等人之美國專利第4,946,778號中所描述。

可用於本文所揭示之雙特異性分子中的其他抗體為鼠類、嵌合及人源化單株抗體。

本發明之雙特異性分子可藉由使用此項技術中已知之方法結合成分結合特異性來製備。舉例而言，雙特異性分子之各結合特異性可分別產生且隨後彼此結合。當結合特異性為蛋白或肽時，可使用多種偶合劑或交聯劑進行共價結合。交聯劑之實例包括蛋白A、碳化二亞胺、N-丁二醯亞胺基-S-乙醯基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) (DTNB)、鄰伸苯基二順丁烯二醯亞胺(oPDM)、N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)及4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-l-甲酸磺基丁二醯亞胺酯(磺基-SMCC) (Karpovsky等人, 1984 J. Exp. Med. 160, 1686-1701；Liu等人, 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 8648-8652)。其他方法包括描述於Brennan等人, 1985, Science 229, 81-83；Glennie等人1987. J. Immunol. 139, 2367-2375；及Paulus, 1985 Behring Inst. Mitt. 118-132中之方法。

或者，兩種結合特異性可在同一載體中編碼，且在同一宿主細胞中表現及組裝。此方法在雙特異性分子為mAb×mAb、mAb×scFv、mAb×Fab、mAb×F(ab') ₂或配體×Fab融合蛋白之情況下尤其適用。在特定實施例中，雙特異性分子可包括抗BTN3A抗體之融合物，該抗BTN3A抗體包括全長重鏈及輕鏈以及與標靶抗原決定基結合之scFv。在相關更特定實施例中，scFv在抗體之重鏈及輕鏈的C端部分融合(對標靶抗原決定基之二價結合特異性)。本發明之雙特異性分子可為包含一個單鏈抗體及一個結合決定子的單鏈分子，或包含兩個結合決定子的單鏈雙特異性分子。

雙特異性分子與其特異性標靶之結合可藉由例如酶連接免疫吸附檢定(ELISA)、放射免疫檢定(REA)、FACS分析、生物檢定(例如生長抑制及細胞凋亡)或西方墨點檢定(Western Blot assay)來確認。此等檢定中之各者通常藉由採用經標記之試劑(例如抗體)來偵測尤其關注之蛋白-抗體複合物的存在，該經標記之試劑對所關注之複合物具特異性。

Bcl2 家族抑制劑 本發明係關於活化BTN3A抗體與至少一種Bcl2家族抑制劑之組合的用途。

在細胞中，細胞凋亡係藉由凋亡蛋白酶活化級聯誘導，該凋亡蛋白酶活化級聯可經由外源性及內源性路徑觸發。內源性路徑係由BCL-2家族蛋白調節之粒線體完整性之破壞引起的。B細胞淋巴瘤2 (BCL-2)為此家族中第一個被鑑別之蛋白，由此得其名稱。成員之特徵為表現四個BCL同源(BH)域。已在人類中鑑別出六個抗細胞凋亡(BCL-2、BCL-XL、BCL-w、BCL-2相關之蛋白A1 (Bfl-1/A1)、骨髓細胞白血病1 (MCL-1)、及BCL-B/Boo)及十個促細胞凋亡家庭成員(其中BAX及BAK)。在恆定條件下，抗細胞凋亡蛋白與關鍵的細胞凋亡誘導蛋白BAX及BAK結合，此確保細胞存活。在壓力(諸如存活信號喪失、DNA損傷、化學物質或治療劑)下，此平衡會受到干擾，粒線體膜完整性喪失，且細胞凋亡開始(Perini等人, 2018 J Hematol Oncol. 11(1):65；Roberts, Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2020年12月4日;2020(1):1-9)。

如本文所用，術語Bcl2家族抑制劑係指(i)BCL-2及BCL-XL抑制劑；(ii)選擇性BCL-2抑制劑及(iii)MCL-1之抑制劑。

在一個實施例中，Bcl2家族抑制劑為選自以下之Bcl2抑制劑：(i)BCL-2及BCL-XL抑制劑；及(ii)選擇性BCL-2抑制劑。

在特定實施例中，BCL-2家族蛋白之抑制劑包括MCL-1之抑制劑，諸如AZD5991 (例如CAS編號2143010-83-5)及S64315 (MIK665) (例如CAS編號1799631-75-6)。

在特定實施例中，Bcl2抑制劑係選自BCL-2及BCL-XL抑制劑，該等BCL-2及BCL-XL抑制劑包括：ABT-737 (例如CAS編號852808-04-9)、納維托克(例如CAS編號923564-51-6)及AZD4320 (例如CAS編號1357576-48-7)。

較佳地，Bcl-2抑制劑係選自由以下組成之群：維納妥拉、納維托克、奧巴克拉(Obatoclax)，甚至更佳為維納妥拉。

維納妥拉(DCI) (亦稱為ABT-199)選擇性結合且抑制B細胞淋巴瘤-2 (BCL-2)蛋白。在一些血癌中，BCL-2防止癌細胞經歷細胞凋亡。維納妥拉之IUPAC名稱為4-[4-[[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基環己烯-1-基]甲基]哌𠯤-1-基]-N-[3-硝基-4-(㗁烷-4-基甲胺基)苯基]磺醯基-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲醯胺。

維納妥拉具有下式：

維納妥拉以VENCLEXTA™出售，其呈錠劑形式。維納妥拉在美國指定：(i)用於治療患有慢性淋巴球性白血病(CLL)或小淋巴球性淋巴瘤(SLL)之成人患者；(ii)與可注射5-阿紮胞苷或地西他濱或低劑量阿糖胞苷(Cytarabine)組合，用於治療年齡為75歲或更大中之新近診斷的急性骨髓性白血病(AML)，或治療患有妨礙使用密集誘導化學療法之共生病症的成人。在一些實施例中，患者每4週連續10日每日一次皮下接受20 mg/m ²阿糖胞苷作為低劑量阿糖胞苷。

納維托克(亦稱為ABT-263)選擇性與細胞凋亡抑制因子蛋白Bcl-2、Bcl-XL及Bcl-w結合且防止其與細胞凋亡效應子Bax及Bak蛋白結合。納維托克之IUPAC名稱為4-[4-[[2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基環己烯-1-基]甲基]哌𠯤-1-基]-N-[4-[[(2R)-4-𠰌啉-4-基-1-苯基氫硫基丁-2-基]胺基]-3-(三氟甲基磺醯基)苯基]磺醯基苯甲醯胺。

奧巴克拉(亦稱為GX15-070)為Bcl-2家族蛋白之泛抑制劑，具有促細胞凋亡活性。奧巴克拉為Bcl-2家族蛋白之BH3結合溝的選擇性拮抗劑，其在一些癌症中過度表現。奧巴克拉之IUPAC名稱為(2Z)-2-[(5Z)-5-[(3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基)亞甲基]-4-甲氧基吡咯-2-亞基]吲哚。

S64315 (亦稱為MIK665)為高效且選擇性的MCL-1之抑制劑，由於MCL-1在多種人類癌症(包括造血及淋巴來源之癌症)中高表現因此其具有促細胞凋亡活性及抗腫瘤活性。S64315之IUPAC名稱為(R)-2-((5-(3-氯-2-甲基-4-(2-(4-甲基哌𠯤-1-基)乙氧基)苯基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3-(2-((2-(2-甲氧苯基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)丙酸。

在較佳實施例中，用於本發明之組合中的該Bcl-2抑制劑為維納妥拉。

去甲基化劑 在某些實施例中，本文所描述之組合療法包括去甲基化劑。去甲基化劑亦稱為HMA或去甲基劑，其抑制DNA甲基化。在某些實施例中，去甲基化劑阻斷DNA甲基轉移酶之活性。在某些實施例中，去甲基化劑包含(但不限於)阿紮胞苷、地西他濱。

阿紮胞苷亦稱為5-AC、5-阿紮胞苷、氮雜胞苷(azacitidine)、拉達卡黴素(ladakamycin)、5-AZC、AZA-CR、U-18496、4-胺基-1-β-D-呋喃核糖基-1,3,5-三𠯤-2(1H)-酮、4-胺基-1-[(2R,3R,4S,5R)3,4-二羥基-5-(羥基甲基)氧雜環戊-2-基]-l,3,5-三𠯤-2-酮或VIDAZA®。

阿紮胞苷為具有抗腫瘤活性的胞苷之嘧啶核苷類似物。阿紮胞苷併入DNA中，其在DNA中可逆地抑制DNA甲基轉移酶，從而阻斷DNA甲基化。阿紮胞苷對DNA之去甲基化可活化由高甲基化而沉默之腫瘤抑制基因，從而產生抗腫瘤作用。阿紮胞苷亦可併入RNA中，從而破壞正常RNA功能且削弱tRNA胞嘧啶-5-甲基轉移酶活性。

在一些實施例中，阿紮胞苷係以如下劑量投與：約25 mg/m ²至約150 mg/m ²，例如約50 mg/m ²至約100 mg/m ²、約70 mg/m ²至約80 mg/m ²、約50 mg/m ²至約75 mg/m ²、約75 mg/m ²至約125 mg/m ²、約50 mg/m ²、約75 mg/m ²、約100 mg/m ²、約125 mg/m ²或約150 mg/m ²。在一些實施例中，阿紮胞苷係每日一次投與。在一些實施例中，阿紮胞苷係靜脈內投與。在其他實施例中，阿紮胞苷係皮下投與。在一些實施例中，阿紮胞苷係例如以28天週期以約50 mg/m ²至約100 mg/m ²(例如約75 mg/m ²)之劑量投與，例如連續約5至7日。舉例而言，阿紮胞苷可在28天週期之第1天至第7天以約75 mg/m ²之劑量投與連續七日。作為另一實例，阿紮胞苷可在28天週期之第1天至第5天以約75 mg/m ²之劑量投與連續五日，隨後兩天中斷，接著在第8天至第9天連續兩日投與。作為另一實例，阿紮胞苷可在28天週期之第1天至第6天以約75 mg/m ²之劑量投與連續六日，隨後一天中斷，接著在第8天允許一次投與。

組合套組及組合物 組合套組包含如先前所定義之抗BTN3A抗體及Bcl2家族抑制劑(例如Bcl2抑制劑)的本發明之組合可以組合套組形式呈現。根據本發明，如本文所用之術語「組合套組」或「分裝部分之套組」意謂用於投與BTN3A活化抗體(例如mAb1)及Bcl2家族抑制劑(例如Bcl2抑制劑(例如維納妥拉))的一或多種醫藥組合物。當兩種化合物同時投與時，組合套組可含有例如獨立醫藥組合物中之組分(適合地為抗BTN3A抗體及Bcl2家族抑制劑)。當組分(適合地為BTN3A活化抗體及Bcl2抑制劑)不同時投與時，組合套組將在獨立醫藥組合物中(在單一封裝中或在單獨的封裝中之獨立醫藥組合物中)含有活性成分。

在一個態樣中，提供一種分裝部分之套組，其包含： (i) BTN3A活化抗體，例如mAb1，與醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑結合，通常為包含如先前所定義之BTN3A活化抗體的組合物；及 (ii) Bcl2抑制劑，例如維納妥拉，與醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑及/或載劑結合，通常為包含如先前所定義之Bcl2抑制劑的組合物；及 (iii) 視情況選用之去甲基化劑，諸如阿紮胞苷或地西他濱。

在本發明之一個實施例中，分裝部分之套組包含： (i) BTN3A活化抗體，例如mAb1，與醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑結合，通常為包含如先前所定義之BTN3A活化抗體的組合物；及 (ii) Bcl2抑制劑，例如維納妥拉，與醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑及/或載劑結合，通常為包含如先前所定義之Bcl2抑制劑的組合物；及 (iii) 視情況選用之去甲基化劑，諸如阿紮胞苷或地西他濱，與醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑及/或載劑結合， 其中組分以適合於依序、分開及/或同時投與之形式提供。

在一個實施例中，分裝部分之套組包含： (i) 第一容器，其包含BTN3A活化抗體，該BTN3A活化抗體與醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑及/或載劑結合，通常為包含如先前所定義之BTN3A活化抗體的組合物；及 (ii) 第二容器，其包含Bcl2家族抑制劑，例如Bcl2抑制劑，該Bcl2家族抑制劑與醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑及/或載劑結合，通常為包含如先前所定義之Bcl2家族抑制劑，例如Bcl2抑制劑的組合物；及 (iii) 視情況選用之第三容器，其包含如先前所定義之去甲基化劑，諸如阿紮胞苷或地西他濱。

組合套組亦可提供有說明書，諸如劑量及投與說明書。此類劑量及投與說明書可為提供給醫生之種類，或其可為由醫生所提供之種類，諸如向患者提供之說明書。

組合物因此，根據本發明，如本文所定義之BTN3A活化抗體及如本文所定義之Bcl2家族抑制劑可例如與醫藥學上可接受之載劑(例如醫藥組合物)單獨地調配成獨立組合物。

如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」係指稀釋劑、佐劑或賦形劑且包括生理學上相容之任何及全部溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及類似物。組合物除包含活性化合物(亦即，BTN3A活化抗體及/或Bcl2家族抑制劑)以外，可進一步包含以下化合物中之一或多者。

無菌磷酸鹽緩衝生理鹽水為醫藥學上可接受之載劑的一個實例。其他適合之載劑為此項技術者所熟知的。(Remington及Gennaro, 1995)調配物可進一步包括一或多種賦形劑、防腐劑、增溶劑、緩衝劑、白蛋白以防止小瓶表面上的蛋白損失等。

醫藥組合物之形式、投與途徑、劑量及方案天然地視所治療之病狀、疾病之嚴重程度、患者之年齡、體重及性別等而定。

本發明之醫藥組合物可經調配用於局部、經口、非經腸、鼻內、靜脈內、肌肉內、皮下或眼內投與及類似投與方式。

較佳地，醫藥組合物含有用於能夠注射之調配物的醫藥學上可接受之媒劑。此等媒劑尤其可為等張無菌生理鹽水溶液(磷酸單鈉或磷酸二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂及其類似者或此類鹽之混合物)，或乾燥，尤其冷凍乾燥的組合物，其在視情況而添加除菌水或生理鹽水時，准許構成可注射溶液。

用於投與之劑量可隨各種參數而調適，且特定言之隨所用投與模式、相關病理學或者所需治療持續時間而調適。

包含 BTN3A 活化抗體之組合物及給藥方案在一些實施例中，如本文所定義之BTN3A活化抗體可由此調配在組合物(例如上文所定義之醫藥組合物)中，該組合物含有本文所揭示的抗體中之一種或組合，例如一種選自由mAb1、mAb2、mAb3、mAb4及mAb5或其抗原結合部分組成之群的抗體，其與醫藥學上可接受之載劑一起調配。

本發明之抗體可調配成如上文所定義之中性或鹽形式的組合物。醫藥學上可接受之鹽包括酸加成鹽(由蛋白之游離胺基形成)且其由無機酸(諸如鹽酸或磷酸)或有機酸(諸如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸及類似物)形成。由游離羧基形成之鹽亦可衍生自無機鹼，諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；及有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸、普魯卡因(procaine)及其類似鹼。用於輸注或皮下注射抗體之溶液的適合調配物已在此項技術中描述，且例如在Cui等人(Drug Dev Ind Pharm 2017, 43(4): 519-530)中進行了綜述。在較佳實施例中，如上文所定義抗BTN3A抗體經調配以用於靜脈內輸注。

包含BTN3A活化抗體之醫藥組合物可以各種濃度調配。舉例而言，調配物可包含濃度介於0.1 μΜ與1 mM之間，更佳介於1 μΜ與500 μΜ之間、介於500 μΜ與1 mM之間、介於300 μΜ與700 μΜ之間、介於1 μΜ與200 μΜ之間、介於100 μΜ與200 μΜ之間、介於200 μΜ與300 μΜ之間、介於300 μΜ與400 μΜ之間、介於400 μΜ與500 μΜ之間、介於500 μΜ與600 μΜ之間、介於600 μΜ與700 μΜ之間、介於800 μΜ與900 μΜ之間或介於900 μΜ與1 mM之間的活化BTN3A活化抗體。通常，調配物包含濃度介於300 μΜ與700 μΜ之間的BTN3A活化抗體。

通常，人類患者中活化BTN3A活化抗體的治療劑量將在每次投與100 pg至700 mg之範圍內(基於70 kg之體重)。舉例而言，最大治療劑量可在每次投與0.1至10 mg/kg之範圍內，例如介於0.1與5 mg/kg之間或介於1與5 mg/kg之間或介於0.1與2 mg/kg之間。應瞭解，由腫瘤學家/醫師所判定，此類劑量可以不同間隔投與；舉例而言，劑量可每日、每週兩次、每週、每兩週、每三週或每月投與。

通常，在特定實施例中，該活化BTN3A活化抗體以各劑量包含於20 μg與200 mg之間，尤其介於1 mg與200 mg之間或介於7 mg與200 mg之間的劑量通常每21天靜脈內投與。

在特定實施例中，用於靜脈內投與活化抗BTN3A抗體之適合劑量可選自1、7、10、20、50、75、100、125、150、175及200 mg。

在特定實施例中，根據本發明方法所使用的活化BTN3A活化抗體(較佳為如下文所描述之mAb1)以各劑量包含於20 μg與200 mg之間的劑量靜脈內投與，較佳地，第二劑量在第一劑量之後至少15天(通常約21天之後)投與。

包含 Bcl2 家族抑制劑之組合物及給藥方案使用Bcl2家族抑制劑之療法可根據每週增量時程開始，在數天或數週之特定時間內達到推薦的每日劑量。

為治療慢性淋巴球性白血病(CLL)及小淋巴球性淋巴瘤(SLL)，維納妥拉當前係在第1週內以20 mg之每日劑量、在第2週內以50 mg之每日劑量、在第3週內以100 mg之每日劑量、在第4週內以200 mg之每日劑量以及在第5週及第5週之外以400 mg之每日劑量投與。為用另一藥劑(諸如可注射5-阿紮胞苷)之療法組合治療AML，維納妥拉當前係在第1天以100 mg之每日劑量、在第2天以200 mg之每日劑量以及在第3天及第3天之外以400 mg之每日劑量投與。VIDAZA® (用於注射之5-阿紮胞苷)係以28天週期，自維納妥拉治療之第1天開始，在各週期之第1天至第7天以75 mg/m ²之劑量靜脈內或皮下投與。

在一些實施例中，維納妥拉係經口投與。在一些實施例中，維納妥拉係以錠劑形式投與。在一些實施例中，維納妥拉係每日投與。在一些實施例中，維納妥拉係以約20 mg至約400 mg，諸如約20 mg、約50 mg、約100 mg、約200 mg或約400 mg之劑量投與。在一些實施例中，維納妥拉係以約400 mg之劑量投與。

在一些實施例中，5-阿紮胞苷及維納妥拉係同時投與。在一些實施例中，5-阿紮胞苷及維納妥拉係依序投與。在一些實施例中，當依序投與5-阿紮胞苷及維納妥拉時，首先投與5-阿紮胞苷。在一些實施例中，5-阿紮胞苷及維納妥拉係以單獨劑型投與，諸如適用於靜脈內或皮下使用之注射劑及/或用於經口使用之錠劑或膠囊。在一些實施例中，5-阿紮胞苷及維納妥拉共同調配為單一單位劑型，諸如適用於靜脈內或皮下使用之注射劑或用於經口使用之錠劑或膠囊。

熟習此項技術者可確定具有其他Bcl2家族抑制劑之其他特定給藥方案，尤其關於藉由本發明之組合療法所治療的治療適應症的規定方案。

本發明之組合的用途及方法 本發明提供一種治療組合，其包含BTN3A活化抗體(例如mAb1)及Bcl2家族抑制劑(例如Bcl2抑制劑(例如維納妥拉))及視情況選用之去甲基化劑(例如阿紮胞苷)；如先前所定義用於治療癌症，尤其血液惡性病，且更佳急性骨髓性白血病。

本發明亦提供一種治療有需要之患者中之癌症的方法，其包含向該患者組合、同時、依序或分開投與治療有效量之BTN3A活化抗體(例如mAb1)與治療有效量之Bcl2家族抑制劑(例如Bcl2抑制劑(例如維納妥拉))及視情況與治療有效量之去甲基化劑(諸如阿紮胞苷或地西他濱)。

如本文所用，術語「治療(treat)」、「治療(treating)」或「治療(treatment)」係指以下中之一或多者：(1)抑制疾病；例如抑制正經歷或顯示疾病、病狀或病症的病變或症狀之個體的疾病、病狀或病症(亦即，遏制病變及/或症狀進一步進展)；及(2)減輕疾病；例如減輕正經歷或顯示疾病、病狀或病症的病變或症狀之個體的疾病、病狀或病症(亦即，逆轉病變及/或症狀)，諸如降低疾病之嚴重程度或減少或緩解疾病之一或多個症狀。特定言之，關於急性骨髓性白血病之治療，術語「治療」可指抑制AML芽細胞之增殖或AML芽細胞數目之減少。

本發明之抗體為BTN3A活化抗體且可活化細胞溶解功能、細胞介素產生及/或Vγ9Vδ2 T細胞之增殖，且由此可用於克服癌症患者中及在慢性感染期間所觀測到的免疫抑制機制(尤其參見WO2012/080769、WO2012/080351及WO2020/025703)。本發明之結果現展示本發明組合促進對人類PBMC中之AML芽細胞的進一步協同性及特異性Vγ9Vδ2 T細胞殺死，突出其治療重要性，尤其用於治療血液惡性病。

如本文所用，術語「癌症」、「過度增殖」及「贅生性」係指細胞具有自主生長能力，亦即以快速增殖性細胞生長為特徵之異常狀態或狀況。過度增殖性及贅生性疾病狀態可分類為病理性，亦即表徵或構成疾病狀態，或可分類為非病理性的，亦即與正常之偏差但不與疾病狀態相關。術語意謂包括所有類型之癌腫生長或致癌過程、轉移性組織或惡性轉型細胞、組織或器官(與組織病理學類型或侵襲階段無關)。

癌症之實例包括(但不限於)血液惡性病，諸如白血病(例如急性骨髓性白血病(AML)或慢性淋巴球性白血病(CLL)，包括慢性B細胞白血病)、淋巴瘤(例如小淋巴球性淋巴瘤(SLL))、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤或骨髓瘤(例如多發性骨髓瘤(MM))。在一些實施例中，血液癌為骨髓發育不良症候群(MDS) (例如較低危MDS，例如極低危MDS、低危MDS或中危MDS，或較高危骨髓發育不良症候群，例如高危MDS或極高危MDS)。

在一些實施例中，需要此類治療之個體為患有血液惡性病(例如急性骨髓性白血病)之個體，其不適合用於密集誘導化學療法。

在一些實施例中，需要此類治療之個體係75歲或更大及/或具有共生病症。

在一些實施例中，需要此類治療之個體為經指示用於根據標準護理用維納妥拉與去甲基化劑組合治療的個體。

本發明之組合療法中之各治療劑(亦即，如先前所定義之BTN3A活化抗體、Bcl2抑制劑及視情況選用之去甲基化劑)可在以任何順序依序投與之獨立藥劑中投與。抗BTN3A抗體(例如mAb1)、Bcl2家族抑制劑(例如Bcl2抑制劑(諸如維納妥拉))及去甲基化劑(例如阿紮胞苷)通常調配成如先前所描述之獨立組合物。

當組合療法中之治療劑呈不同劑型(一種藥劑為錠劑或膠囊且另一藥劑為無菌液體)及/或根據不同給藥時程投與(例如化學治療劑為至少每日投與且生物治療劑以更低頻率投與，諸如每週一次、每兩週一次或每三週一次)時，依序投與(例如在獨立醫藥組合物中)尤其適用。

在一些實施例中，BTN3A活化抗體(例如mAb1)係在第一次投與Bcl2家族抑制劑(例如Bcl2抑制劑(例如維納妥拉))之前投與，而在其他實施例中，BTN3A活化抗體(例如mAb1)係在投與Bcl2家族抑制劑(例如Bcl2抑制劑(例如維納妥拉))之後投與。

選擇用於本發明之組合療法的給藥方案(在本文中亦稱為投與方案)取決於若干因素，包括實體之血清或組織周轉率、症狀之程度、實體之免疫原性及所治療個體中之標靶細胞、組織或器官之可近性。較佳地，給藥方案使遞送至患者的各治療劑之量最大化，同時符合可接受的副作用水平。因此，組合中之各生物治療劑及化學治療劑之劑量及給藥頻率部分地取決於特定治療劑、所治療癌症之嚴重程度及患者特徵。可獲得選擇適當劑量之抗體、細胞介素及小分子的指導。參見例如Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK；Kresina (編) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY；Bach (編) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY；Baert等人(2003) New Engl. J. Med. 348:601-608；Milgrom等人(1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973；Slamon等人(2001) New Engl. J. Med. 344:783-792；Beniaminovitz等人(2000) New Engl. J. Med. 342:613-619；Ghosh等人(2003) New Engl. J. Med. 348:24-32；Lipsky等人(2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602；Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 第57版)；Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 第57版(2002年11月)。可由臨床師確定適當的給藥方案，例如使用此項技術中已知或疑似影響治療或預測影響治療之參數或因素，且將視例如患者之臨床病史(例如先前療法)、所治療之癌症的類型及階段及對組合療法中之治療劑中之一或多者之反應的生物標記物而定。

由主治醫務人員所判定可使用任何適合的劑量範圍。可調整給藥方案以提供最佳所需反應(例如治療或預防反應)。劑量已揭示於與Bcl2家族抑制劑相關之先前部分中。在組合療法之一些實施例中，如本文所定義之Bcl2家族抑制劑且尤其維納妥拉之適合的劑量範圍可例如為10 mg至600 mg。在一些實施例中，例示性劑量為約100 mg至400 mg。在一些實施例中，投與方案包括每日提供Bcl2家族抑制劑(例如Bcl2抑制劑(例如維納妥拉))。

在一些實施例中，組合療法中之至少一種治療劑使用當該藥劑用作治療相同癌症之單一療法時通常採用之相同給藥方案(治療之劑量、頻率及持續時間)來投與。

舉例而言，維納妥拉係以與推薦用於治療新近診斷患有急性骨髓性白血病之患者的給藥方案相同的給藥方案與去甲基化劑(諸如阿紮胞苷)組合投與(參見「Practical Dosing Considerations for Venetoclax」, Cancernetwork.com, Oncology, 第33卷, 第9期, 第33卷, 第9期)。

當Bcl2家族抑制劑(例如Bcl2抑制劑(例如維納妥拉))與去甲基化劑(例如阿紮胞苷)組合投與時，去甲基化劑可在各週期之第1天至第5天及第8天至第9天以75 mg/m ²每日一次皮下投與。在出現淋巴球減少症之情況下，建議在週期之間進行長達14天之恢復(Jonas and Pollyea, 2019; Leukemia 33: 2795-2804)，且投與生長因子以至少治療嗜中性白血球減少症。由患者反應來確定後續週期，但其與第1週期非常類似。

在其他實施例中，患者在組合療法中接受比當藥劑用作單一療法時更低的總量(例如更小劑量、不太頻繁給藥及/或更短治療持續時間)之至少一種治療劑。

關於用於本發明治療組合之BTN3A活化抗體的給藥方案，可使用由主治醫務人員確定的任何適合之劑量範圍。

可調整給藥方案以提供最佳所需反應(例如治療或預防反應)。本發明之抗體可在治療混合物內調配以包含約1至200.0毫克。應瞭解，由腫瘤學家/醫師所判定，此類劑量可以不同間隔投與；舉例而言，劑量可每日、每週兩次、每週、每兩週、每三週或每月投與。

通常，在特定實施例中，該BTN3A活化抗體(例如mAb1)以各劑量包含於1 mg與200 mg之間，例如介於20與100 mg之間的劑量通常每21天靜脈內投與。在特定實施例中，用於靜脈內投與活化BTN3A抗體(例如mAb1)的適合之劑量可選自1、7、10、20、50、75、100、125、150、175及200 mg。

在特定實施例中，根據本發明之組合方法所使用的活化BTN3A抗體(較佳為如下文所描述之mAb1)以各劑量包含於7 mg與200 mg之間的劑量靜脈內投與，較佳地，第二劑量在第一劑量之後至少15天，通常每21天一次，持續1至22個週期之後投與。

在一些實施例中，Bcl-2家族抑制劑(例如Bcl-2抑制劑(例如維納妥拉))係以約10 mg至約500 mg，例如約20 mg至約400 mg、約50 mg至約350 mg、約100 mg至約300 mg、約150 mg至約250 mg、50 mg至約500 mg、約100 mg至約500 mg、約150 mg至約500 mg、約200 mg至約500 mg、約250 mg至約500 mg、約300 mg至約500 mg、約350 mg至約500 mg、約400 mg至約500 mg、約450 mg至約500 mg、約10 mg至約400 mg、約10 mg至約350 mg、約10 mg至300 mg、約10 mg至約250 mg、約10 mg至約200 mg、約10 mg至約150 mg、約10 mg至約100 mg、約10 mg至約50 mg、約50 mg至約150 mg、約150 mg至約250 mg、約250 mg至約350 mg或約350 mg至約400 mg之劑量組合、分開、依序或同時投與。在一些實施例中，Bcl-2抑制劑(例如維納妥拉)係以如下劑量投與：約20 mg、50 mg、100 mg、150 mg、200 mg、250 mg、300 mg、350 mg、400 mg、450 mg或500 mg。在一些實施例中，Bcl-2抑制劑(例如維納妥拉)係每日一次投與。在一些實施例中，Bcl-2家族抑制劑(例如Bcl-2抑制劑)係經口投與。

在一些實施例中，Bcl-2家族抑制劑(例如Bcl-2抑制劑(例如維納妥拉))係以約350 mg至約450 mg (例如約400 mg)之劑量每日一次，例如在21天週期之每日經口投與。在一些實施例中，Bcl-2抑制劑之劑量在第一週期中的4天之時段內漸增以達到約400毫克/天之劑量。舉例而言，第1週期第1天、第2天、第3天以及第4天及之後的劑量分別為約100 mg、約200 mg、約300 mg及約400 mg。

在一些實施例中，Bcl-2家族抑制劑(例如Bcl-2抑制劑(例如維納妥拉))在增量(ramp-up)週期內投與例如約5週，隨後以固定劑量投與例如至少約24個月。在一些實施例中，Bcl-2抑制劑係以如下劑量投與：一天一次約10 mg至約30 mg (例如約20 mg)持續例如約1週；接著一天一次約40 mg至約60 mg (例如約50 mg)持續例如約1週；接著一天一次約80 mg至約120 mg (例如約100 mg)持續例如約1週；接著一天一次約150 mg至約250 mg (例如約200 mg)持續例如約1週；接著一天一次約350 mg至約450 mg (例如約400 mg)持續例如約1週；及接著以固定劑量，一天一次例如約350 mg至約450 mg (例如約400 mg)持續例如至少約24個月。

在特定實施例中，Bcl2家族抑制劑(例如Bcl-2抑制劑(例如維納妥拉))係例如以介於10 mg與600 mg之間的單位劑量，視情況與阿紮胞苷或地西他濱組合每日一次投與至少5至9天，隨後至少14天之恢復期。

在特定實施例中，Bcl2家族抑制劑(例如Bcl-2抑制劑(例如維納妥拉))及去甲基化劑(例如阿紮胞苷)首先投與至少一個週期，隨後至少10至14天之恢復期，且該BTN3A活化抗體例如在至少10至14天之該恢復期之後投與，或與該Bcl2抑制劑及去甲基化劑投與的第2週期一起投與。

在其他特定實施例中，Bcl2家族抑制劑(例如Bcl-2抑制劑(例如維納妥拉))及去甲基化劑(例如阿紮胞苷)之第一次投與發生在用BTN3A活化抗體(例如mAb1)治療之第一個週期之後，較佳在第一次投與該BTN3A活化抗體後21天之後。

在特定實施例中，根據本發明方法所使用的活化BTN3A抗體(較佳為如下文所描述之mAb1)以各劑量包含於7 mg與200 mg之間的劑量靜脈內投與，較佳地第二劑量在第一劑量之後至少15天投與，通常在每21天一次持續1至22個週期之後投與；且Bcl2家族抑制劑(例如Bcl-2抑制劑(例如維納妥拉))係例如以介於10 mg與600 mg之間的單位劑量，視情況與阿紮胞苷或地西他濱組合每日一次投與至少5至9天，隨後至少14天之恢復期，且其中首先投與維納妥拉及去甲基化劑(例如阿紮胞苷)持續至少一個週期，隨後至少10至14天之恢復期，且該BTN3A活化抗體例如在至少10至14天之該恢復期之後投與。

在特定實施例中，如本文所揭示之組合療法(通常為如先前所描述之mAb1及Bcl2家族抑制劑(例如Bcl-2抑制劑，尤其維納妥拉))可與其他抗腫瘤劑組合投與。

在其他特定實施例中，如本文所揭示之組合療法(通常為如先前所描述之mAb1及該Bcl2家族抑制劑(例如Bcl-2抑制劑，尤其維納妥拉))可與細胞療法(尤其γδT細胞療法)組合投與。

本發明因此係關於如本文所定義之組合，其係用於活體內增強有需要之個體(通常患有癌症)中之γδ T細胞療法中的腫瘤細胞，其中BTN3A活化抗體及Bcl2家族抑制劑(例如Bcl-2抑制劑)可向個體伴隨、同時、並行或依序投與。

如本文所用，術語γδ T細胞療法係指包含向有需要之個體投與至少有效量之γδ T細胞的療法。此類γδ T細胞可為同種異體的或自體的。在特定實施例中，γδ T細胞可藉由特定基因之缺失或剔除或插入或嵌入來進行基因工程改造。在特定實施例中，該等γδ T細胞包括表現嵌合抗原受體之γδ T細胞。γδ T細胞可已經活體外擴增及/或純化。或者，γδ T細胞亦可包含於細胞組合物中，該細胞組合物包含其他血細胞及例如免疫系統之其他細胞。對於關於γδ T細胞療法之參考文獻，請參見Pauza CD.等人, Front Immunol. 2018年6月8日;9:1305. doi: 10.3389；Saudemont A.等人, Front Immunol. 2018年2月5日;9:153. doi: 10.3389。

因此，本發明係關於一種治療患有癌症之個體的方法，該癌症包括實體腫瘤或血液惡性病，尤其白血病(諸如急性骨髓性白血病)及具有腫瘤細胞(例如血液腫瘤細胞)，該方法包含： (i) 向該個體投與有效量的如本文所揭示之抗BTN3A活化抗體(通常為mAb1、mAb2、mAb3、mAb4或mAb5)與有效量之Bcl2抑制劑(例如維納妥拉)及視情況選用之去甲基化劑(例如阿紮胞苷)之組合，及， (ii) 向該個體投與有效量之γδ T細胞組合物， 其中該有效量之抗BTN3A抗體及該有效量之Bcl2抑制劑的組合具有增強由該γδ T細胞組合物介導之針對該等腫瘤細胞的抗腫瘤細胞溶解的能力。

已充分描述之本發明現藉由以下實例進一步說明，該等實例僅為說明性的且並不意謂進一步限制。 表 4：本發明中所使用之序列

SEQ ID NO:	類型	序列之描述	序列
1	aa	mAb 7.2之人源化重鏈可變區VH2	QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYIFTRYYMYWVKQRPGQGLEWIGEINPNNGGTKFNEKFKNRATLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCSREDDYDGTPFAMDYWGQGTLVTVSS
2	aa	mAb 7.2之人源化輕鏈可變區Vk1	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFTGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIK
3	aa	mAb 7.2之人源化輕鏈可變區Vk2	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIK
4	aa	mAb 1及mAb 2之全長重鏈(VH2 7.2沉默IgG1)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYIFTRYYMYWVKQRPGQGLEWIGEINPNNGGTKFNEKFKNRATLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCSREDDYDGTPFAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
5	aa	mAb 4及mAb 5之全長重鏈(VH2 7.2沉默IgG4)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYIFTRYYMYWVKQRPGQGLEWIGEINPNNGGTKFNEKFKNRATLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCSREDDYDGTPFAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
6	aa	mAb 1及mAb 4之全長輕鏈(Vk1 7.2)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFTGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
7	aa	mAb 2及mAb 5之全長輕鏈(Vk2 7.2)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
8	nt	mAb 1及mAb 2之全長重鏈(VH2 7.2沉默IgG1)	CAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACATCTTCACCAGATACTATATGTATTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAACAATGGTGGTACTAAGTTCAATGAGAAGTTCAAGAACAGGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCATCAGCACAGCATACATGGAGCTCAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCGGTCTATTATTGTTCAAGAGAGGATGATTACGACGGGACCCCCTTTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAATTCGAGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTGA
9	nt	mAb 4及mAb 5之全長重鏈(VH2 7.2沉默IgG4)	CAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACATCTTCACCAGATACTATATGTATTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAACAATGGTGGTACTAAGTTCAATGAGAAGTTCAAGAACAGGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCATCAGCACAGCATACATGGAGCTCAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCGGTCTATTATTGTTCAAGAGAGGATGATTACGACGGGACCCCCTTTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAATGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCGAGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTTGA
10	nt	mAb 1及mAb 4之全長輕鏈(Vk1 7.2)	GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCAGTCTGTCTGCATCCGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCATGCCAGTCAGAACATTAATGTTTGGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAACTCTTGATCTATAAGGCTTCCAACTTGCACACAGGCGTCCCATCAAGATTTACTGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACATTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGACATTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTCAAACTTATCCATACACGTTCGGACAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
11	nt	mAb 2及mAb 5之全長輕鏈(Vk2 7.2)	GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCAGTCTGTCTGCATCCGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCATGCCAGTCAGAACATTAATGTTTGGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAACTCTTGATCTATAAGGCTTCCAACTTGCACACAGGCGTCCCATCAAGATTTAGTGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACATTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGACATTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTCAAACTTATCCATACACGTTCGGACAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
12	aa	mAb 7.2、mAb 1、mAb 2、mAb 4及mAb 5之HCDR1	RYYMY
13	aa	mAb 7.2、mAb 1、mAb 2、mAb 4及mAb 5之HCDR2	EINPNNGGTKFNEKFKN
14	aa	mAb 7.2、mAb 1、mAb 2、mAb 4及mAb 5之HCDR3	EDDYDGTPFAMDY
15	aa	mAb 7.2、mAb 1、mAb 2、mAb 4及mAb 5之LCDR1	HASQNINVWLS
16	aa	mAb 7.2、mAb 1、mAb 2、mAb 4及mAb 5之LCDR2	KASNLHT
17	aa	mAb 7.2、mAb 1、mAb 2、mAb 4及mAb 5之LCDR3	QQGQTYPYT
18	aa	mAb 20.1之HCDR1	RYYLY
19	aa	mAb 20.1之HCDR2	EINPNNGGTKFNEKFKS
20	aa	mAb 20.1之HCDR3	EDDYDGTPDAMDY
21	aa	mAb 20.1之LCDR1	HASQNINLWLS
22	aa	mAb 20.1之LCDR2	RASNLHT
23	aa	mAb 20.1之LCDR3	QQGHSYPYT
24	aa	人類BTN3A1	MKMASFLAFLLLNFRVCLLLLQLLMPHSAQFSVLGPSGPILAMVGEDADLPCHLFPTMSAETMELKWVSSSLRQVVNVYADGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDGITAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSDLHVDVKGYKDGGIHLECRSTGWYPQPQIQWSNNKGENIPTVEAPVVADGVGLYAVAASVIMRGSSGEGVSCTIRSSLLGLEKTASISIADPFFRSAQRWIAALAGTLPVLLLLLGGAGYFLWQQQEEKKTQFRKKKREQELREMAWSTMKQEQSTRVKLLEELRWRSIQYASRGERHSAYNEWKKALFKPADVILDPKTANPILLVSEDQRSVQRAKEPQDLPDNPERFNWHYCVLGCESFISGRHYWEVEVGDRKEWHIGVCSKNVQRKGWVKMTPENGFWTMGLTDGNKYRTLTEPRTNLKLPKPPKKVGVFLDYETGDISFYNAVDGSHIHTFLDVSFSEALYPVFRILTLEPTALTICPA
25	aa	人類BTN3A2	MKMASSLAFLLLNFHVSLLLVQLLTPCSAQFSVLGPSGPILAMVGEDADLPCHLFPTMSAETMELKWVSSSLRQVVNVYADGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDGITAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSNLHVEVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPQIQWSNAKGENIPAVEAPVVADGVGLYEVAASVIMRGGSGEGVSCIIRNSLLGLEKTASISIADPFFRSAQPWIAALAGTLPILLLLLAGASYFLWRQQKEITALSSEIESEQEMKEMGYAATEREISLRESLQEELKRKKIQYLTRGEESSSDTNKSA
26	aa	人類BTN3A3	MKMASSLAFLLLNFHVSLFLVQLLTPCSAQFSVLGPSGPILAMVGEDADLPCHLFPTMSAETMELRWVSSSLRQVVNVYADGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDGITAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSDLHIEVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPQIKWSDTKGENIPAVEAPVVADGVGLYAVAASVIMRGSSGGGVSCIIRNSLLGLEKTASISIADPFFRSAQPWIAALAGTLPISLLLLAGASYFLWRQQKEKIALSRETEREREMKEMGYAATEQEISLREKLQEELKWRKIQYMARGEKSLAYHEWKMALFKPADVILDPDTANAILLVSEDQRSVQRAEEPRDLPDNPERFEWRYCVLGCENFTSGRHYWEVEVGDRKEWHIGVCSKNVERKKGWVKMTPENGYWTMGLTDGNKYRALTEPRTNLKLPEPPRKVGIFLDYETGEISFYNATDGSHIYTFPHASFSEPLYPVFRILTLEPTALTICPIPKEVESSPDPDLVPDHSLETPLTPGLANESGEPQAEVTSLLLPAHPGAEVSPSATTNQNHKLQARTEALY
27	aa	用於重組蛋白產生之石蟹獼猴(食蟹猴( m. fascicularis)) BTN3A1胞外域	MGSSLAFLLLSFHVCVLLLQLLMPHSAQFAVVGPPGPILAMVGEDADLPCHLFPTMSAETMELRWVSSNLRQVVNVYADGKEVEDRQSAAYRGRTSILRDGITAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSDLHIDVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPQIRWSNDKGENIPAVEAPVFVDGVGLYAVAASVILRGSSGEGVSCTIRSSLLGLEKTTSISIAG
28	aa	用於重組蛋白產生之石蟹獼猴(食蟹猴) BTN3A2胞外域	MGSSLAFLLLNFHVSFFLVQLLTPCSAQFSVLGPSGPILAMVGEDADLPCHLFPTMSAETMELRWVSSSLRQVVNVYADGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDDIAAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDADFYEKALVELKVAALGSNLHVEVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPKIQWSNAKGQNIPAVEAPVVADGVGLYAVAASVIMRGGSGESVSCIIRNSVLGLEKTASISIAD
29	aa	用於重組蛋白產生之石蟹獼猴(食蟹猴) BTN3A3胞外域	MANFLAFLLLNFRVCLLLVQLLTPCSAQFAVLGPHGPILAMVGEDVDLPCHLFPTMSAETMELRWVSSSLRQVVNVYSDGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDGITAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSDLHIEVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPQIQWSNTKGQHIPAVKAPVVADGVGLYAVAASVIMRGSSGEGVSCIIRNSLLGLEKTASISITD
30	aa	VH人源化mAb20.1	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYYLYWVKQRPGQGLEWIGEINPNNGGTKFNEKFKSRATMTVDKSTRTTYMELSSLRSEDTAVYYCSREDDYDGTPDAMDYWGQGTLVTVSS
31	aa	VL人源化mAb20.1	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINLWLSWYQQKPGKAPKLLIYRASNLHTGVPSRFSGSGSATDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGHSYPYTFGGGTKVDIK
32	aa	重鏈人源化mAb20.1	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYYLYWVKQRPGQGLEWIGEINPNNGGTKFNEKFKSRATMTVDKSTRTTYMELSSLRSEDTAVYYCSREDDYDGTPDAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
33	aa	輕鏈人源化mAb20.1	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINLWLSWYQQKPGKAPKLLIYRASNLHTGVPSRFSGSGSATDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGHSYPYTFGGGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
34	aa	變異體mAb20.1之CDRH1	RYYLY
35	aa	變異體mAb20.1之CDRH2	EINP S NGGT N FNEKFKS
36	aa	變異體mAb20.1之CDRH3	EDDYDGTPDAMDY
37	aa	變異體mAb20.1之CDRL1	HASQNIN V WLS
38	aa	變異體mAb20.1之CDRL2	KASNLHT
39	aa	變異體mAb20.1之CDRL3	QGQSYPLT
40	aa	變異體mAb20.1之VH	QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTRYYLYWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGGTNFNEKFKSKATLTVDKSSRTTYIQLSSLTSEDSAVYYCSREDDYDGTPDAMDYWGQGTAVTVSS
41	aa	變異體mAb20.1之VL	DIQMNQSPSSLSASLGDTITITCHASQNINVWLSWYQQKPGNIPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQSYPLTFGGGTKLDIK

實例 1. 本發明之方法及檢定 表徵根據本發明所使用之BTN3A活化抗體之方法 1 . 1 結合親和力檢定：多循環動力學檢定 ( SPR )可使用運行Biacore T200評估軟體V2.0.1 (Uppsala, Sweden)的Biacore T200 (序列號1909913)儀器對抗BTN3A抗體進行多循環動力學分析。

將經純化之抗體於2% BSA/PBS中稀釋至2 μg/ml之濃度。在各循環開始時，各抗體以約146.5 RU之密度(RL)捕獲在蛋白A上(獲得約50 RU之RMax的理論值)。在捕獲之後，在注射BTN3A1抗原(Sino Biological目錄號15973-H08H)之前使表面穩定。BTN3A1在0.1% BSA/HBS-P+ (運行緩衝液)中以25至0.78 nM之兩倍稀釋範圍進行滴定。監測結合期持續400秒且監測解離期持續35分鐘(2100秒)。使用50 μl/min之流動速率獲得動力學資料，以使任何潛在的質傳效應降至最低。在各循環結束時使用兩次10 mM甘胺酸-HCL pH 1.5之注射以進行蛋白A表面之再生。對各測試抗體進行兩次空白檢驗(無BTN3A1)及一次單一濃度分析物之重複檢驗以檢查在動力學循環內表面及分析物之穩定性。自Fc2、Fc3及Fc4之信號減去來自參考通道Fc1之信號以校正非特異性結合至參考表面中之差異。另外，為各Fc減去空白運行以校正任何與抗原無關的信號變化，諸如偏移。在全局RMax參數且無大量信號(恆定RI = 0 RU)下，使用一對一結合數學模型擬合感測器圖譜。

1 . 2 藉由流動式細胞測量術對人類 PBMC 進行 結合檢定根據本發明所使用之BTN3A活化抗體亦可針對其與人類PBMC (自健康供體之血液分離)的結合進行表徵。使用Lymphoprep (Axis-shield, Dundee, UK)密度離心自白血球層分離PBMC。隨後將PBMC冷凍且在-80℃下或在液氮中儲存直至需要時。

將100 μl細胞(1×10 ⁶個細胞/毫升)轉移至新製U形底96孔盤之各孔中，隨後將盤離心且棄去上清液。

在含有2 mM EDTA之PBS中製備0.001 μg/ml至150 μg/ml的抗體之連續稀釋液。將人類PBMC再懸浮於50 μl之所製備的經稀釋之測試抗體滴定系列中。

在4℃下於暗處培育30分鐘之後，將盤離心且用150微升/孔之PBS + 2 mM EDTA洗滌兩次，隨後將細胞再懸浮於50 μl的混合物中，該混合物由在PBS + 2 mM EDTA中經1/100稀釋的山羊抗人類抗體(經PE標記)及經1/500稀釋的活/死純IR構成。

在4℃下於暗處培育15分鐘之後，將盤離心且用150微升/孔PBS + 2 mM EDTA洗滌一次，隨後將細胞再懸浮於200 μl PBS + 2 mM EDTA中。在BD LSR Fortessa細胞計數器上分析細胞。使用FlowJo軟體(版本10, FlowJo, LLC, Ashland, USA)分析資料。

可對石蟹獼猴PBMC及對達烏迪伯基特氏淋巴瘤(Daudi Burkitt's lymphoma)細胞株執行相同方案。

1.3 活體外功能性功效： γδ -T 細胞脫粒檢定該檢定由以下組成：量測抗BTN3A抗體對針對達烏迪伯基特氏淋巴瘤細胞株之γδ-T細胞脫粒的活化或抑制作用((Harly等人, 2012, Blood第120卷, 第11期, 第2269-2279頁)。藉由用唑來膦酸(1 μM)及IL2 (200 UI/mL)培養11至13天來使γδ-T細胞自健康供體之PBMC擴增。在第5天、第8天以及其後每2天添加IL2。γδ-T細胞之百分比在培養開始時測定且藉由流動式細胞測量術評估培養時間，直至其達到至少80%。隨後將冷凍或新鮮的γδ-T細胞用於針對達烏迪細胞株之脫粒檢定(效應：標靶(E:T)比率為1:1)，從而在10 μg/mL 7.2及/或20.1人源化變異體及/或其嵌合型式存在下，將細胞在37℃下共培養4小時。PMA (20 ng/mL)加離子黴素(Ionomycin) (1 µg/mL)之活化充當γδ-T細胞脫粒之陽性對照，且培養基獨自充當陰性對照。在4小時共培育結束時，藉由流動式細胞測量術分析細胞以評估對於CD107a (LAMP-1，胞溶體相關膜蛋白-1) + CD107b (LAMP-2)呈陽性的γδ-T細胞之百分比。在活化誘導之顆粒胞外分泌以後將CD107移動至細胞表面，由此表面CD107之量測為用於識別最近脫粒之細胞溶解T細胞的敏感標記。

可使用自患者分離之AML芽細胞代替達烏迪細胞作為標靶細胞來執行相同方案。

1.4 活體外功能性功效 ： PBMC 中之 Vγ9Vδ2 T 細胞活化檢定由以下組成：量測BTN3A活化抗體對PBMC中之Vγ9Vδ2 T細胞之活化作用。藉由周邊血液(EDTA-白血球層或肝素化全血)之Ficoll密度梯度離心分離人類PBMC。當使用全血時，將RBC在室溫下使用1× RBC溶解緩衝液(eBioscience)耗盡10分鐘且隨後用PBS + 1% FBS洗滌。

在37℃、體積為200 μL之5% CO2下在96圓底孔盤中，將PBMC或RBC耗盡之細胞與濃度增加之BTN3A活化抗體(劑量範圍在0.00001至100 μg/mL)一起在含有10% FBS、1%青黴素/鏈黴素之RPMI 1640中以1.5至3×106個細胞/毫升培養。在培養兩天之後藉由流動式細胞測量術分析活化標記物表面表現來監測活化狀態。在PBS + 2% FBS及2 mM EDTA (FACS緩衝液)中洗滌細胞。將細胞以1800 rpm離心5分鐘且隨後在室溫(RT)下與10 µL FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)一起培育10分鐘，隨後添加30至50 µL在FACS緩衝液中製備的適當抗體混合物，該抗體混合物至少含有螢光結合之抗CD3、抗Vγ9或Vδ2 TCR及抗CD69抗體。在所有實驗中均添加存活性標記物(LIVE/DEAD可固定死細胞染劑)以便自分析中排除死細胞。將細胞在4℃下培育30分鐘且在FACS緩衝液中洗滌2次，之後在Cytofix固定緩衝液(BD Bioscience)中固定及進行流動式細胞測量術分析。用flowjo V-10.6軟體分析資料。活化Vγ9Vδ2 T細胞定義為CD3+Vδ2+ (或Vγ9+或Vδ2+Vγ9+) CD69+。

1.5 活體外 V γ 9V δ 2 T 細胞擴增 藉由自普羅旺斯阿爾卑斯藍色海岸(法國)的法國血液機構(Etablissement Français du Sang，EFS)獲得的周邊血液之Ficoll密度梯度離心分離周邊血液單核細胞(PBMC)。為了擴增Vγ9Vδ2 T細胞，在rHuIL-2 (200 UI/mL)及胺基雙膦酸鹽(唑來膦酸鹽，1 µM)存在下，將300×10 ⁶個PBMC於75 cm2燒瓶中以1.5×10 ⁶個細胞/毫升再懸浮於補充有10% FBS及1%丙酮酸鈉的RPMI1640中10至14天。自第5天起，每2天或3天更新rHuIL-2且將細胞保持在1×10 ⁶個細胞/毫升。在擴增階段結束時，藉由流動式細胞測量術評估Vγ9Vδ2 T細胞之純度，且若Vγ9Vδ2 T細胞之數目達到活細胞之80%，則將此等細胞接著冷凍於CryoStor CS10中以供未來使用。

1.6 小鼠模型 所選小鼠品系為缺乏成熟T細胞、B細胞及自然殺手(NK)細胞且亦缺乏多種細胞介素信號傳導路徑的高度免疫缺乏NSG小鼠，因此使其成為人類細胞移植的理想選擇。將六至八週齡的雌性NSG小鼠共同圈養在TrGET平台設施(法國馬賽癌症研究中心(Cancer Research Center of Marseille, France))之通風架上的一次性標準籠中。將小鼠圈養在無菌條件下，其中任意提供滅菌食物及水且維持12小時光照及12小時黑暗循環且處於溫度及濕度控制下。籠中有豐富的環境以及墊層材料。

NSG小鼠在第0天經由尾部靜脈靜脈內(iv)注射每隻小鼠0.2×106個表現螢光素酶(luc2)之MOLM-14 (CVCL_7916)細胞，體積為100 µl。在添加無內毒素螢光素(30 mg/kg)之後在第0天使用PhotonIMAGER (Biospace Lab)進行生物冷光分析，且基於生物冷光信號之強度將小鼠隨機分成6至8隻小鼠的同質組(表5)。在第1天、第8天、第15天及第23天，iv注射3×106個人類活體外擴增之Vγ9Vδ2 T細胞及rHuIL-15/IL-15Rα-Fc複合物。在第1天、第5天、第8天、第11天、第15天、第18天、第23天及第25天，iv注射ICT01或hIgG1S。

將rHuIL-15/IL-15Rα-Fc複合物在室溫(RT)下預複合30分鐘(每隻小鼠0.2 ug rHuIL-15+1.2 ug IL-15Rα-Fc)且在注射之前將其與Vγ9Vδ2 T細胞及ICT01或其同型對照(hIgG1S)混合。各注射之最終體積為200 µl。

在第1天至第4天經由經口管飼(og)向小鼠投與維納妥拉，且隨後每週5天向小鼠投與總共持續3週。在第1天至第4天與維納妥拉治療同時經由腹膜內(ip)注射投與5-阿紮胞苷。在Vγ9Vδ2 T細胞轉移之後4至6小時投與維納妥拉及5-阿紮胞苷。

在細胞注射之後第0天、第7天、第14天、第21天及第28天，量測由MOLM-14細胞發射之生物冷光信號以跟蹤腫瘤生長。每日監測小鼠之疾病症狀(顯著體重減輕、變皺的皮毛、駝背、無力及活動性降低)確定具有痛苦跡象的經注射之動物的殺死時間。存活曲線藉由卡本-麥爾方法估計且使用對數秩測試進行比較。

2. 結果 2.1 ICT01 介導的 Vγ9Vδ2 T 細胞之活化增加對 Bcl - 2 家族成員之抑制劑的抗性。 在來自健康供體之周邊血液單核細胞(HD-PBMC)中，使用細胞凋亡標記物凋亡蛋白酶3/7及流動式細胞測量術分析中之死細胞標記物來評估ICT01在用Bcl-2家族成員抑制劑處理後對Vγ9Vδ2 T細胞之存活的影響。

將周邊血液單核細胞(PBMC)藉由來自健康供體(HD，n=4-6)之周邊血液之Ficoll密度梯度離心(EDTA-白血球層)分離，在PBMC培養基(補充有10%胎牛血清(FBS)、1%青黴素/鏈黴素及1 mM丙酮酸鈉之RPMI 1640培養基)中培養，且在存在或不存在濃度增加之維納妥拉(0-0.1 µM)、5-阿紮胞苷(0-0.4 µM)或組合或ABT-737 (0-1.875 µM)、納維托克(0-1.875 µM)或MIK665 (0-1.875 µM)下，用以1 µg/mL使用之ICT01或其同型對照(hIgG1S)進行處理。將細胞在第2天收穫，以1800 rpm離心5分鐘且隨後在室溫(RT)下與25 µl FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)一起培育10分鐘，隨後添加25 µL在PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA (FACS緩衝液)中製備的以下抗體混合物：用於鑑別免疫子集之抗CD4-BUV395、CD56-BV421、Vd2-PE、CD3-PE-CF594及CD8-A700抗體，添加抗CD25-BV650及CD69-APC抗體以監測Vγ9Vδ2 T細胞之活化狀態，且添加存活性標記物(LIVE/DEAD™可固定死細胞染劑)以區別活細胞及死細胞。將細胞在室溫(RT)下培育20分鐘且用FACS緩衝液洗滌2次。添加凋亡蛋白酶3/7綠色偵測試劑(ThermoFisher)以測定細胞凋亡且在室溫下培育細胞30分鐘，隨後進行流動式細胞測量術分析。

雖然5-阿紮胞苷對Vγ9Vδ2 T細胞之存活無影響，但用維納妥拉處理導致Vγ9Vδ2 T細胞以濃度依賴性方式細胞凋亡及死亡(與無維納妥拉條件相比，使用0.01 µM維納妥拉可使活細胞減少約29%，使用0.1 µM維納妥拉可使細胞減少高達約49%) (圖1a、圖1b)。相比之下，用ICT01同時處理顯著降低由維納妥拉誘導之細胞死亡(與無維納妥拉條件相比，使用0.01 µM維納妥拉使得存活率降低約11%且使用0.1 µM維納妥拉使得存活率降低約30%) (圖1c、圖1d)。如所預期，與hIgG1S相比，ICT01誘導的Vγ9Vδ2 T細胞之特異性活化展示為治療之2天後CD69及CD25之表現增加(圖1e且資料未展示)。此指示ICT01對Vγ9Vδ2 T細胞之活化部分保護其免於維納妥拉誘導之細胞死亡。

如對於維納妥拉所描述，用其他Bcl-2家族成員抑制劑處理會以濃度依賴性方式誘導Vγ9Vδ2 T細胞之細胞凋亡及死亡，其中ABT-737、納維托克及MIK665之EC ₅₀分別為0.24 µM、0.16 µM及0.24 µM (圖2a)。當PBMC同時用ICT01處理時，觀測到由Bcl-2家族成員抑制劑誘導之Vγ9Vδ2 T細胞死亡顯著下降。對於ABT-737，Vγ9Vδ2 T細胞死亡之EC ₅₀自存在同型對照下之0.23 µM增加至存在ICT01下之0.46 µM (圖2b)，對於納維托克，Vγ9Vδ2 T細胞死亡之EC ₅₀自存在同型對照下之0.16 µM增加至存在ICT01下之0.20 µM (圖2c)，且對於MIK665，Vγ9Vδ2 T細胞死亡之EC ₅₀自存在同型對照下之0.24 µM增加至存在ICT01下之0.78 µM (圖2d)。

在類似實驗中，在用維納妥拉進行2天處理之前，用ICT01或其同型對照hIgG1S刺激新分離之PBMC 1天(圖3a)。在培育時間結束時，藉由流動式細胞測量術評估活Vγ9Vδ2 T細胞之數目。結果顯示用ICT01活化(藉由CD25之表面表現增加證實(圖3b))顯著降低維納妥拉誘導之Vγ9Vδ2 T細胞之細胞死亡(圖3c、圖3d)。

總而言之，此等結果指示ICT01對Vγ9Vδ2 T細胞之活體外活化可保護Vγ9Vδ2 T細胞免於由維納妥拉及其他Bcl-2家族成員之抑制劑誘導之細胞死亡。此將為單一療法提供作為Vγ9Vδ2 T細胞之數目的優點，該等Vγ9Vδ2 T細胞之數目在抗癌免疫中係重要的，可與維納妥拉(或其他Bcl-2家族成員抑制劑)協同作用殺死AML芽細胞。

2.2 維納妥拉及 5 - 阿紮胞苷不影響 ICT01 誘導的 V γ 9V δ 2 T 細胞之活化及增殖 ICT01已展示可誘導靜息Vγ9Vδ2 T細胞之活化及增殖。為進一步評估維納妥拉及5-阿紮胞苷對Vγ9Vδ2 T細胞之影響，在有或無維納妥拉、5-阿紮胞苷或組合下培養的健康供體衍生之PBMC中量測ICT01誘導之表型活化、IFNγ產生及增殖。

ICT01誘導的Vγ9Vδ2 T細胞之表型活化係由CD25之上調指示。因此，在存在或不存在濃度增加之維納妥拉(0-0.1 µM)、5-阿紮胞苷(0-0.4 µM)或組合下，在PBMC培養基(補充有10% FBS、1%青黴素/鏈黴素及1 mM丙酮酸鈉之RPMI 1640培養基)中，用以1 µg/mL使用之ICT01或其同型對照(hIgG1S)培養來自健康供體(HD，n=6)之人類PBMC。將細胞在第4天收穫，以1800 rpm離心5分鐘且隨後在室溫(RT)下與25 µl FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)一起培育10分鐘，隨後添加25 µL在PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA (FACS緩衝液)中製備的以下抗體混合物：用於鑑別免疫子集之抗CD4-BV650、CD56-FITC、Vd2-PE、CD3-PE-CF594及CD8-A700抗體，添加抗CD25-BV650抗體以監測活化狀態，且添加存活性標記物(LIVE/DEAD™可固定死細胞染劑)以區別活細胞及死細胞。將細胞在4℃下培育20分鐘且在FACS緩衝液中洗滌2次，隨後進行流動式細胞測量術分析。

5-阿紮胞苷及維納妥拉對ICT01誘導的Vγ9Vδ2 T細胞之CD25之上調無影響，且因此對其表型活化無影響(圖4a)。

在類似實驗中，在用ICT01或其同型對照hIgG1S刺激兩天之前，用濃度增加之維納妥拉(0-0.1 µM)、5-阿紮胞苷(0-0.4 µM)或組合處理新分離之健康供體衍生之PBMC一天。此外，藉由在所有測試條件下CD25表現之類似誘導所指示，ICT01對Vγ9Vδ2 T細胞之活化不受維納妥拉及5-阿紮胞苷處理影響(圖4b)。

Vγ9Vδ2 T細胞功能藉由活化(NKG2D及DNAM-1)及抑制受體(PD-1、NKG2A、BTLA、TIM3)而嚴格調節。為評估維納妥拉及5-阿紮胞苷處理對Vγ9Vδ2 T細胞表現此等受體之影響，將來自健康供體(HD，n=6)之冷凍的人類PBMC解凍，且在存在或不存在濃度增加之維納妥拉(0-0.1 µM)、5-阿紮胞苷(0-0.4 µM)或組合下，在PBMC培養基(補充有10% FBS、1%青黴素/鏈黴素、1 mM丙酮酸鈉及50 IU/mL IL2之RPMI 1640培養基)中，用以1 µg/mL使用之ICT01或其同型對照(hIgG1S)處理。將細胞在第5天收穫，以1800 rpm離心5分鐘且隨後在室溫下與25 µl FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)一起培育10分鐘，隨後添加25 µL在PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA (FACS緩衝液)中製備的以下抗體混合物：用於鑑別免疫子集之抗CD4-BUV395、Vδ2-PE、CD3-PE-CF594及CD8-A700抗體，用於偵測抑制及活化受體之抗BTLA-BV421、PD1-BV650、DNAM-1-BV785、TIM3-BB515、NKG2A-PE-Vio770及NKG2D-APC抗體，且添加存活性標記物(LIVE/DEAD™可固定死細胞染劑)以區別活細胞及死細胞。將細胞在4℃下培育20分鐘且在FACS緩衝液中洗滌2次，隨後進行流動式細胞測量術分析。

ICT01在培養第5天誘導Vγ9Vδ2 T細胞上所有分析的活化及抑制受體之表現增加，此不受用維納妥拉及5-阿紮胞苷處理的影響(資料未展示)。

為評估維納妥拉及5-阿紮胞苷對細胞介素產生之影響，將來自健康供體(HD，n=6)之新分離之人類PBMC在PBMC培養基(補充有10%胎牛血清(FBS)、1%青黴素/鏈黴素及1 mM丙酮酸鈉之RPMI 1640培養基)中培養，且在存在或不存在濃度增加之維納妥拉(0-0.1 µM)、5-阿紮胞苷(0-0.4 µM)或組合下，用以1 µg/mL使用之ICT01或其同型對照(hIgG1S)處理。另外用50 IU/mL IL2處理一半細胞。在6至8小時共培養之後添加Golgi Stop且將細胞在16小時之後收穫，以1800 rpm離心5分鐘且隨後在室溫(RT)下與25 µl FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)一起培育10分鐘，隨後添加25 µL在PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA (FACS緩衝液)中製備的以下抗體混合物：用於鑑別免疫子集之抗CD4-BV650、Vγ9-FITC、CD3-PE-CF594、CD56-PE-Vio770及CD8-AF700抗體，且添加存活性標記物(LIVE/DEAD™可固定死細胞染劑)以區別活細胞及死細胞。在20分鐘之後，添加100 μL CytoFix溶液(BD Bioscience)，且將細胞在4℃下培育20分鐘。添加100 µL Perm/Wash (BD Bioscience)，將細胞離心且在200 µL Perm/Wash中洗滌一次。在洗滌之後，將細胞在4℃下用抗IFNγ-APC抗體染色30分鐘，用Perm/Wash洗滌兩次且藉由流動式細胞測量術分析。

單獨用維納妥拉或5-阿紮胞苷處理對ICT01誘導的不依賴於IL2之Vγ9Vδ2 T細胞之IFNγ產生無影響(資料未展示)。當單獨用ICT01活化時，用維納妥拉及5-阿紮胞苷組合處理使Vγ9Vδ2 T細胞之IFNγ產生自30.4%降低至25.2%，此在IL2存在下未觀測到(未經處理為89.1%且用維納妥拉及5-阿紮胞苷組合處理為91.7%，資料未展示)。

最終，用CellTrace Violet染劑(CTV，Invitrogen)標記來自健康供體(HD，n=6)之新分離之人類PBMC以測定在存在或不存在濃度增加之維納妥拉(0-0.1 µM)、5-阿紮胞苷(0-0.4 µM)或組合下在PBMC培養基(補充有10% FBS、1%青黴素/鏈黴素及1 mM丙酮酸鈉之RPMI 1640培養基)中，用以1 µg/mL使用之ICT01或其同型對照(hIgG1S)處理後的細胞增殖。另外用50 IU/mL IL2處理一半細胞。將細胞在第4天收穫，以1800 rpm離心5分鐘且隨後在室溫下與25 µl FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)一起培育10分鐘，隨後添加25 µL在PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA (FACS緩衝液)中製備的以下抗體混合物：用於鑑別免疫子集之抗CD4-BV650、CD56-FITC、Vδ2-PE、CD3-PE-CF594及CD8-A700抗體，且添加存活性標記物(LIVE/DEAD™可固定死細胞染劑)以區別活細胞及死細胞。將細胞在4℃下培育20分鐘且在FACS緩衝液中洗滌2次，隨後進行流動式細胞測量術分析。

維納妥拉使ICT01誘導的Vγ9Vδ2 T細胞之增殖增加約10%，此為單獨使用5-阿紮胞苷或組合使用兩種藥劑時未觀測到的(圖4c)。ICT01及IL2誘導的Vγ9Vδ2 T細胞之增殖不受單獨或組合使用維納妥拉及5-阿紮胞苷影響的(圖4d)。

綜合而言，資料表明維納妥拉及5-阿紮胞苷作為單一藥劑或組合處理不會干擾ICT01誘導的Vγ9Vδ2 T細胞之活化或增殖。因此，處理之組合將保護Vγ9Vδ2 T細胞免於維納妥拉誘導之細胞死亡，誘導其增殖及活化，且可能增加患者中細胞毒性Vγ9Vδ2 T細胞之數目。

2.3 用維納妥拉、 HMA 及 BTN3A 活化抗體組合處理 V γ 9V δ 2 T 細胞增加 AML 殺死 藉由使用流動式細胞測量術量測HD-PBMC-AML細胞共培養物中存活的標靶細胞之相對數目，評估維納妥拉及5-阿紮胞苷對抗BTN3A抗體誘導的Vγ9Vδ2 T細胞殺死AML細胞株的影響。

首先，為評估活體外KG1a AML細胞株對維納妥拉及5-阿紮胞苷處理之敏感性，在細胞培養基(補充有20%胎牛血清(FBS)及1 mM丙酮酸鈉之α-MEM + Glutamax)中，用濃度增加之維納妥拉(0-5 µM)、5-阿紮胞苷(0-10 µM)或組合處理細胞2天。在第2天，將細胞以1800 rpm離心5分鐘且棄去上清液。用Cell Titer Glo試劑(Promega)溶解細胞，且使用冷光監測ATP量作為活細胞之量測。

KG1a AML細胞展示維納妥拉之EC ₅₀值為1.82 µM且5-阿紮胞苷之EC ₅₀值為4.72 µM，其中維納妥拉在5 µM下平均存活率為20.2%且5-阿紮胞苷在10 µM下平均存活率為47.2%。5 µM之維納妥拉及10 µM之5-阿紮胞苷的組合使KG1a AML細胞之平均存活率為0.9%，表明維納妥拉及5-阿紮胞苷處理之協同效應(圖5a)。

接著，將KG1a AML細胞用CellTrace CFSE增殖染料(ThermoFisher)進行染色以使得藉由流動式細胞測量術進行特異性偵測，計數，將其與解凍的HD-PBMC共培養，且在PBMC培養基(補充有10%胎牛血清(FBS)及1 mM丙酮酸鈉之RPMI 1640培養基)中，用抗BTN3A mAb ICT01或m20.1或其各別同型對照(hIgG1S或mIgG1)處理。在培養之第一天，添加濃度增加之維納妥拉(0-0.4 µM)、5-阿紮胞苷(0-0.4 µM)或組合。將細胞在共培養之第3天收穫，以1800 rpm離心5分鐘且隨後在室溫(RT)下與25 µl FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)一起培育10分鐘，隨後添加25 µL在PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA (FACS緩衝液)中製備的以下抗體混合物：用於鑑別免疫子集之抗CD56-BV421、CD19-BV421、CD14-BV785、Tγδ-PE及CD3-AF700抗體，且添加存活性標記物(LIVE/DEAD™可固定死細胞染劑)以區別活細胞及死細胞。將細胞在室溫下培育20分鐘，在FACS緩衝液中洗滌一次且在膜聯蛋白V染色緩衝液中洗滌一次。添加與CountBright絕對計數微珠(Invitrogen)混合之膜聯蛋白V-APC探針以測定細胞凋亡及相對細胞數目，隨後在室溫下培育15分鐘，然後進行流動式細胞測量術分析。

在此檢定中，KG1a對BTN3A活化抗體介導之Vγ9Vδ2 T細胞殺死具有相當的抗性(與hIgG1S條件相比，ICT01使活KG1a細胞數目平均減少約20%，且在PBMC供體內具有較大變化性) (圖5b)。在hIgG1S條件下，用5-阿紮胞苷處理對KG1a存活無影響(圖5d)。相比之下，在hIgG1S處理條件下，維納妥拉在最高濃度下使KG1a相對數目減少約28%且與5-阿紮胞苷組合使KG1a相對數目減少44%。與hIgG1S條件相比，在用ICT01活化後，單獨用維納妥拉及5-阿紮胞苷處理對Vγ9Vδ2 T細胞殺死活性具有輕微增加作用。然而，與hIgG1S條件相比，維納妥拉及5-阿紮胞苷之組合顯著將活KG1a細胞之相對數目減少至約46.5% (p＜0.05)，且與無維納妥拉及5-阿紮胞苷處理相比減少至約32.9%，表明組合處理之協同效應。

mAb 20.1 BTN3A活化抗體獲得類似結果(圖6)。在mIgG1條件下，雖然用5-阿紮胞苷處理對KG1a存活無影響，但在與0.4 µM之5-阿紮胞苷組合時，0.1 µM的所使用之維納妥拉使KG1a相對數目減少41%及57%。另外，與單獨使用之m20.1或與同型對照一起使用之維納妥拉及5-阿紮胞苷相比，20.1 mAb與維納妥拉及5-阿紮胞苷之組合顯著減少活KG1a細胞之相對數目，且與對照條件相比，活KG1a細胞減少約67% (圖6)。

綜合而言，此等資料表明用ICT01活化來自健康供體之PBMC會增加Vγ9Vδ2 T細胞對維納妥拉誘導之細胞死亡的存活率，且維納妥拉及5-阿紮胞苷處理不會影響活體外HD衍生之PBMC中Vγ9Vδ2 T細胞之活化或增殖。另外，HD-PBMC中BTN3A抗體活化之Vγ9Vδ2 T細胞與維納妥拉及5-阿紮胞苷處理之組合顯著降低Vγ9Vδ2 T細胞-抗性AML細胞株KG1a之存活率。

2.4 用維納妥拉、 HMA 及 ICT01 組合處理增加 V γ 9V δ 2 T 細胞介導之伯基特氏淋巴瘤及慢性 B 細胞 白血病細胞株之殺死 藉由使用流動式細胞測量術量測HD-PBMC-標靶細胞共培養物中存活的標靶細胞之相對數目，評估維納妥拉及5-阿紮胞苷對BTN3A活化抗體誘導之Vγ9Vδ2 T細胞殺死伯基特氏淋巴瘤及慢性B細胞白血病細胞株的影響。

在存在BTN3A活化抗體ICT01下，Raji氏(伯基特氏淋巴瘤)或JVM-2 (慢性B細胞白血病)與HD-PBMC共培養48小時分別誘導活細胞減少約22%及約16%，且在PBMC供體內具有較大變化性(圖7a、圖7b)。在hIgG1S處理條件下，與單獨hIgG1S條件(對照)相比，在指定濃度下，維納妥拉與5-阿紮胞苷組合使Raji氏及JVM2之相對標靶之數目分別減少約37%及約32%。重要的是，在共培養48小時之後，ICT01、維納妥拉及5-阿紮胞苷之組合仍使活標靶細胞之相對數目減少，且與對照條件相比，活標靶細胞數目減少約55%及約46%，此表明將BTN3A活化抗體(諸如ICT01)與維納妥拉及5-阿紮胞苷對殺死伯基特氏淋巴瘤及慢性B細胞白血病細胞株具有益處。

綜合而言，此等資料表明HD PBMC中BTN3A活化抗體活化之Vγ9Vδ2 T細胞與維納妥拉及5-阿紮胞苷處理之組合顯著降低若干血液癌細胞株之存活率且為治療血液惡性病提供優勢。

2.5 用 Bcl - 2 家族成員抑制劑組合處理 ICT01 活化之 V γ 9V δ 2 T 細胞會增加 AML 殺死 藉由使用流動式細胞測量術量測HD-PBMC-AML細胞共培養物中存活的標靶細胞之相對數目，評估三種Bcl-2家族成員抑制劑ABT-737、納維托克及MIK665對ICT01誘導之Vγ9Vδ2 T細胞殺死AML細胞株的影響。

對於使用ABT-737或納維托克之檢定，使用KG1a細胞。然而，此細胞株不表現MCL-1且因此對MIK665處理具有完全抗性。因此，表現MCL-1之MOLM14細胞用於評定ICT01與MIK665組合之活性的殺死檢定中。

在存在 ICT01 、 ABT - 737 或組合下 ， 殺死與 HD - PBMC 共培養之 KG1a ( 圖 8a ) 。在此實驗中，與對照條件相比，ICT01誘導約21%之KG1a細胞死亡(與先前所獲得之結果類似(圖5b))。用0.25 µM及0.5 µM的ABT-737單獨處理分別誘導約34%及約54%之KG1a細胞死亡。當KG1a及HD-PBMC之共培養物用ICT01及ABT-737之組合處理時，與對照相比，活KG1a細胞之數目減少約53%及約71% (對於分別以0.25 µM及0.5 µM所使用之ABT-737)，表明此組合對AML細胞株殺死具有益處(圖8a)。

在存在 ICT01 、納維托克或組合下 ， 殺死與 HD - PBMC 共培養之 KG1a ( 圖 8b ) 。用0.25 µM及0.5 µM的納維托克單獨處理分別誘導約51%及約71%之KG1a細胞死亡。當KG1a及HD-PBMC之共培養物用ICT01及納維托克之組合處理時，與對照相比，活KG1a細胞之數目減少約65%及約88% (對於分別以0.25 µM及0.5 µM所使用之納維托克)，表明此組合對AML細胞株殺死具有益處(圖8b)。

在存在 ICT01 、 MIK665 或組合下 ， 殺死與 HD - PBMC 共培養之 MOLM14 ( 圖 8c ) 。在此實驗中，與對照條件相比，ICT01誘導約56%之MOLM14細胞死亡。用0.025 µM及0.05 µM的MIK665單獨處理分別誘導約52%及約72%之MOLM14細胞死亡。當MOLM14及HD-PBMC之共培養物用ICT01及MIK665之組合處理時，與對照相比，活MOLM14細胞之數目減少約85%及約93% (對於分別以0.025 µM及0.05 µM所使用之MI-665)，表明此組合對AML細胞株殺死具有益處(圖8c)。

綜合而言，此等資料表明HD-PBMC中ICT01活化之Vγ9Vδ2 T細胞與Bcl-2家族成員抑制劑處理之組合顯著降低AML細胞株之存活率，證實使用ICT01與Bcl-2家族成員抑制劑之組合治療血液惡性病之潛力。

2.6 ICT01 與維納妥拉及 5 - 阿紮胞苷組合顯著延長 MOLM - 14 移植之 NSG 小鼠之存活率 在異種移植模型中評估ICT01與維納妥拉及5-阿紮胞苷之組合對MOLM-14 (一種AraC抗性人類AML衍生之細胞株)之活體內功效，該異種移植模型使用移植有人類腫瘤細胞株且經人類Vγ9Vδ2 T細胞過繼轉移之NSG小鼠。此研究之目的為評估重複iv注射ICT01活化之人類Vγ9Vδ2 T細胞與Ven/Aza之組合對腫瘤生長及對小鼠存活率的影響。

NSG小鼠在第0天注射MOLM-14且基於生物冷光信號之強度隨機分成同質組。不同實驗組概述於表5中。 表5：MOLM-14小鼠模型：組描述

組	動物數目	處理
1	7	PBS
2	8	維納妥拉(40 mg/kg) +阿紮胞苷(2 mg/kg)
3	6	Vγ9Vδ2 T細胞(3×10 6個細胞) + rHuIL-15/IL-15Rα-Fc + hIgG1S (1 mg/kg)
4	6	Vγ9Vδ2 T細胞(3x×10 6個細胞) + rHuIL-15/IL-15Rα-Fc + ICT01 (1 mg/kg)
5	6	Vγ9Vδ2 T細胞(3×10 6個細胞) + rHuIL-15/IL-15Rα-Fc + hIgG1S (1 mg/kg) +維納妥拉(40 mg/kg) +阿紮胞苷(2 mg/kg)
6	6	Vγ9Vδ2 T細胞(3×10 6個細胞) + rHuIL-15/IL-15Rα-Fc + ICT01 (1 mg/kg) +維納妥拉(40 mg/kg) +阿紮胞苷(2 mg/kg)

如表6中所展示，注射不相關對照同型抗體(hIgG1S)之人類Vγ9Vδ2 T細胞對MOLM-14活體內生長無基礎控制(第1組相對於第3組)。相比之下，如由較低生物冷光信號及中值存活期所展示(表6及圖9)，當用BTN3A活化mAb ICT01投與人類Vγ9Vδ2 T細胞(第3組及第4組之中值存活期分別為24天及28天)或在用維納妥拉及5-阿紮胞苷處理之小鼠中(第1組及第2組之中值存活期分別為24天及29天)時，腫瘤生長顯著延遲。維納妥拉及5-阿紮胞苷處理與轉移未活化之人類Vγ9Vδ2 T細胞的組合將小鼠之中值存活期延長至32.5天(第2組及第3組相對於第5組)，指示維納妥拉及5-阿紮胞苷處理使得細胞更容易被人類Vγ9Vδ2 T細胞殺死(表7)。

重要的是，用ICT01、人類Vγ9Vδ2 T細胞、維納妥拉及5-阿紮胞苷處理小鼠驚人地使中值存活期提高至42.5天(第6組) (圖9)。

此等資料證實BTN3A活化抗體(諸如ICT01)與Bcl2家族抑制劑(諸如維納妥拉)及5-阿紮胞苷之組合可為治療AML患者之有前景的方法。 表6：MOLM-14小鼠模型：在腫瘤細胞移植之後第0天、第7天、第14天、第21天及第28天的每組平均生物冷光量測。

		第 0 天	第 7 天	第 14 天	第 21 天	第 28 天
第1 組 PBS	平均值 ( n = 7 )	13511	57370	18157143	255250000	不適用
SD	6786	49656	10418430	42311346	不適用
SEM	2565	18768	3937797	21155673	不適用
第 2 組 Ven/Aza	平均值 (n=8)	12689	6090	637750	26611250	53466667
SD	7980	2121	461839	15863431	63784408
SEM	2821	750	163285	5608570	26039875
第 3 組 Vγ9Vδ2 T 細胞 + hIgG1S	平均值 (n=6)	14960	31708	10378333	264250000	不適用
SD	4550	16033	8824850	87887712	不適用
SEM	1858	6545	3602730	43943856	不適用
第 4 組 Vγ9Vδ2 T 細胞 + ICT01	平均值 (n=6)	15967	18452	2275500	36636667	141333333
SD	7121	18566	2699914	35198478	40771722
SEM	2907	7580	1102235	14369719	23539565
第5 組 V γ9V δ2 T 細胞 + hIgG1S + Ven /Aza	平均值 (n=6)	15384	5505	181083	13166667	39780000
SD	6492	2690	79402	17040405	16640222
SEM	2650	1098	32416	6956716	7441734
第6 組 V γ9V δ2 T 細胞 + ICT01 + Ven /Aza	平均值 (n=6)	15076	2615	26817	1023833	4794167
SD	6099	1540	10929	793413	5125556
SEM	2490	629	4462	323909	2092499

表7：MOLM-14小鼠模型：動物存活期。各組之中值存活期。

組	中值存活期 ( 天數 )
第 1 組： PBS ( n = 7 )	24
第 2 組：Ven /Aza (n =8 )	29
第3 組 ：V γ9V δ2 T 細胞 + hIgG1S (n =6 )	24
第4 組 ：V γ9V δ2 T 細胞 + ICT01 (n =6 )	28
第5 組 ：V γ9V δ2 T 細胞 + hIgG1S + Ven /Aza (n =6 )	32.5
第6 組 ：V γ9V δ2 T 細胞 + ICT01 + Ven /Aza (n =6 )	42.5

圖 1 ： 用 ICT01 活化 V γ 9V δ 2 T 細胞保護其免於維納妥拉誘導之細胞死亡。A)在用維納妥拉(左側)或5-阿紮胞苷(右側)處理後48小時，HD-PBMC中之活(黑色)、凋亡(淺灰色)或死(深灰色) Vγ9Vδ2 T細胞的平均值±SEM頻率。N=4 HD。B)在用維納妥拉、5-阿紮胞苷或組合處理48小時後，HD-PBMC中之活Vγ9Vδ2 T細胞的平均頻率。N=4 HD。C)在ICT01 (右側)或其同型對照(hIgG1S，左側)存在下，在用維納妥拉處理後48小時，HD-PBMC中之活(黑色)、凋亡(淺灰色)或死(深灰色) Vγ9Vδ2 T細胞的平均值±SEM頻率。N=4 HD。D)在ICT01 (黑色)或其同型對照(hIgG1S，淺灰色)存在下，在用維納妥拉處理後48小時，HD-PBMC中之活Vγ9Vδ2 T細胞的平均值±SEM頻率，正規化為無維納妥拉條件。N=4 HD，各點代表一個健康供體。*** p＜0.005，雙向ANOVA。E)用ICT01 (黑色)或其同型對照(hIgG1S，淺灰色)處理48小時的HD-PBMC中之Vγ9Vδ2 T細胞之平均值±SEM CD69中值平均螢光強度(MFI)。N=5 HD，各點代表一個健康供體。 圖 2 ： 用 ICT01 活化 V γ 9V δ 2 T 細胞保護其免於 Bcl - 2 家族成員抑制劑 ( 納維托克 ( Navitoclax ) 、 ABT - 737 及 MIK665 ) 誘導之細胞死亡。A)展示用增加濃度之指定Bcl-2家族成員抑制劑處理48小時後藉由流動式細胞測量術所評估的HD-PBMC中之活Vγ9Vδ2 T細胞之平均頻率的熱圖。對於ABT-737，N=3 HD，且對於納維托克及MIK665，N=5。B-D)在1 µg/mL ICT01 (黑色)或其同型對照hIgG1S (淺灰色)存在下，在用指定濃度之ABT-737 (N=3 HD) (B)、納維托克(N=5 HD) (C)或MIK665 (N=5 HD) (D)處理48小時後，藉由流動式細胞測量術所評估的HD-PBMC中之活Vγ9Vδ2 T細胞之頻率(平均值±SEM)。資料經正規化為無ABT-737、納維托克或MIK665處理，且各點代表一個健康供體。* p＜0.05，** p＜0.01，*** p＜0.001，**** p＜0.0001，雙向ANOVA 。 圖 3 ： 處理前 ICT01 介導之活化降低 V γ 9V δ 2 T 細胞之維納妥拉敏感性。A)處理順序之示意性圖示。B)在用ICT01 (黑色)或其同型對照(hIgG1S，淺灰色)及維納妥拉處理之第3天，HD-PBMC中之CD25+ Vγ9Vδ2 T細胞之平均值±SEM頻率。N=6 HD。C)活Vγ9Vδ2 T細胞之平均值±SEM相對數目及D)在用ICT01 (黑色)或其同型對照(hIgG1S，淺灰色)及維納妥拉處理之第3天，相對於無維納妥拉條件，活Vγ9Vδ2 T細胞之平均值±SEM %。N=5 HD。各點代表一個健康供體。*p＜0.05，雙向ANOVA 。 圖 4 ： 用 ICT01 刺激之 HD - PBMC 中之 V γ 9V δ 2 T 細胞表型活化及增殖主要不受用維納妥拉及 5 - 阿紮胞苷處理之影響 ：A)處理順序之示意性圖示(左側)及在ICT01 (黑色)或其同型對照(hIgG1S，淺灰色)存在下，在用維納妥拉、5-阿紮胞苷或組合處理之第4天，HD-PBMC中之表現CD25之Vγ9Vδ2 T細胞的平均值±SEM頻率(右側)。N=6 HD，各點代表一個健康供體。B)處理順序之示意性圖示(左側)及在用維納妥拉、5-阿紮胞苷或組合處理隨後用ICT01 (黑色)或其同型對照(hIgG1S，淺灰色)處理之第3天，HD-PBMC中之表現CD25之Vγ9Vδ2 T細胞的平均值±SEM頻率(右側)。N=6 HD，各點代表一個健康供體。C及D)在不存在(C)或存在IL2 (D)之情況下，在用維納妥拉、5-阿紮胞苷或組合及ICT01 (黑色)或其同型對照(hIgG1S，淺灰色)處理之第4天，HD-PBMC中之Cell Trace Violet (CTV)暗Vγ9Vδ2 T細胞的平均值±SEM頻率，N=6 HD，各點代表一個健康供體，*p＜0.05，RN單向ANOVA。 圖 5 ： 依序用 ICT01 活化之 V γ 9V δ 2 T 細胞處理 ， 隨後用維納妥拉及 5 - 阿紮胞苷處理顯著減少抗性 AML 細胞株細胞之數目。A) KG1a細胞株對維納妥拉、5-阿紮胞苷或組合之敏感性。圖中展示在用維納妥拉、5-阿紮胞苷或組合處理48小時之後，相對於反映活KG1a AML細胞之未經處理的條件的發光信號之平均值。N=2次實驗。B)在與用ICT01 (黑色)或其同型對照(hIgG1S，淺灰色)以0.1或1 µg/mL處理之HD-PBMC (E:T比率25:1)共培養3天之後，藉由流動式細胞測量術監測之活KG1a AML細胞的平均值±SEM相對數目。N=6，各點代表一個健康供體。C) HD-PBMC殺死KG1a AML細胞之處理方案的示意性圖示。D)在ICT01 (黑色)或其同型對照(hIgG1S，淺灰色)存在及用維納妥拉、5-阿紮胞苷或組合處理下與HD-PBMC共培養3天之後，活KG1a AML細胞之相對數目(平均值±SEM) (左側)及相對於無維納妥拉或5-阿紮胞苷處理之活KG1a AML細胞的頻率(平均值±SEM) (右側)。N=6，各點代表一個健康供體，* p＜0.05，威爾克森測試(Wilcoxon test)。 圖 6 ：用抗 BTN3A m20 . 1 及維納妥拉及 5 - 阿紮胞苷處理顯著改善 Vγ9Vδ2 T 細胞介導之 AML 細胞株 KG1a 之殺死。在m20.1或同型對照(0.1 µg/mL)存在下，KG1a細胞與HD-PBMC以5:1之比率共培養。在6小時之後，將指定濃度之維納妥拉、5-阿紮胞苷或組合添加至培養物中。在48小時之後藉由流動式細胞測量術監測活KG1a之相對數目。圖中展示在m20.1 (黑色)或其同型對照mIgG1 (淺灰色)存在及用維納妥拉、5-阿紮胞苷或組合處理下與HD-PBMC共培養2天之後，活KG1a AML細胞之相對數目(平均值±SEM)。N=6，各點代表一個健康供體，* p＜0.05，** p＜0.01，*** p＜0.001，**** p＜0.0001，雙向ANOVA。 圖 7 ： 用 ICT01 活化之 V γ 9V δ 2 T 細胞處理 ， 隨後用維納妥拉及 5 - 阿紮胞苷處理顯著減少活伯基特氏淋巴瘤 ( Burkitt Lymphoma ) 及慢性 B 細胞白血病細胞株之數目。在ICT01或同型對照(0.1 µg/mL或1 µg/mL)存在下，Raji氏細胞(伯基特氏淋巴瘤)或JVM2細胞(慢性B細胞白血病)與HD-PBMC以5:1之比率共培養。在6小時之後，將指定濃度之維納妥拉、5-阿紮胞苷或組合添加至培養物中。在48小時之後藉由流動式細胞測量術監測活Raji (A)或JVM2 (B)之相對數目。圖中展示在ICT01 (黑色)或其同型對照hIgG1S (淺灰色)存在及指定濃度之維納妥拉及5-阿紮胞苷下與HD-PBMC共培養2天之後，活Raji (A)或JVM2 (B)之相對數目(平均值±SEM)。N=6，各點代表一個健康供體，* p＜0.05，** p＜0.01，雙向ANOVA。 圖 8 ： 用 ICT01 活化之 V γ 9V δ 2 T 細胞處理 ， 隨後用 Bcl - 2 家族成員之抑制劑處理顯著減少活 AML 細胞株之數目。在ICT01或同型對照(0.1 µg/mL)存在下，KG1a或MOLM14 AML細胞株與HD-PBMC以5:1之比率共培養。在6小時之後，將指定濃度之ABT-737、納維托克或MIK665添加至培養物中。A)在ICT01 (黑色)或其同型對照hIgG1S (淺灰色)存在及用指定濃度之ABT-737處理下與HD-PBMC共培養2天之後，活KG1a細胞之相對數目(平均值±SEM)。B)在ICT01 (黑色)或其同型對照hIgG1S (淺灰色)存在及用指定濃度之納維托克處理下與HD-PBMC共培養2天之後，活KG1a細胞之相對數目(平均值±SEM)。C)在ICT01 (黑色)或其同型對照hIgG1S (淺灰色)存在及用指定濃度之MIK665處理下與HD-PBMC共培養2天之後，活MOLM14細胞之相對數目(平均值±SEM)。N=6 HD，各點代表一個健康供體，* p＜0.05，雙向ANOVA。 圖 9 ： ICT01 與維納妥拉及 5 - 阿紮胞苷組合顯著延長 MOLM - 14 移植之 NSG 小鼠之存活率 ：各處理組之卡本-麥爾存活曲線(Kaplan-Meier survival curve)顯示ICT01與維納妥拉及5-阿紮胞苷組合的改良功效。使用對數秩(Mantel-Cox)測試進行統計分析。** p ＜ 0.005，*** p ＜ 0.0005。

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Claims (15)

1. 一種BTN3A活化抗體，其係用於治療有需要之個體之癌症，其中治療有效量之該BTN3A活化抗體係與治療有效量之Bcl2抑制劑化合物同時、依序或分開投與該個體，視情況進一步與去甲基化劑組合投與。
2. 如請求項1所使用之BTN3A活化抗體，其中該Bcl2抑制劑為維納妥拉(Venetoclax)。
3. 如請求項1至2中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該BTN3A活化抗體包含(a)可變重鏈(VH)多肽，其包含與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，及(b)可變輕鏈(VL)多肽，其包含與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
4. 如請求項1至3中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該抗BTN3A抗體為包含SEQ ID NO: 4之重鏈及SEQ ID NO: 6之輕鏈的抗體。
5. 如請求項1至4中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該BTN3A活化抗體與維納妥拉同時、依序或分開組合投與，進一步與阿紮胞苷(Azacytidine)或地西他濱(Decitabine)組合投與。
6. 如請求項1至5中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該癌症為血液惡性病，例如急性骨髓性白血病。
7. 如請求項1至6中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該癌症為急性骨髓性白血病，且其中該BTN3A活化抗體為包含SEQ ID NO: 4之重鏈及SEQ ID NO: 6之輕鏈的抗體，且該BTN3A活化抗體係與維納妥拉同時、依序或分開組合投與，進一步與阿紮胞苷或地西他濱組合投與。
8. 如請求項1至7中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該個體不適合於密集化學療法。
9. 如請求項1至8中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該BTN3A活化抗體係每三週一次或每四週一次投與。
10. 如請求項1至9中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該BTN3A活化抗體係經靜脈內投與。
11. 如請求項1至10中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該BTN3A活化抗體係以約7至約200 mg，例如75 mg之單位劑量投與，例如每21天投與一次持續1至22個週期。
12. 如請求項1至11中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中維納妥拉係每日一次經口投與。
13. 如請求項1至12中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中維納妥拉係以約50 mg至約500 mg之單位劑量經口投與。
14. 如請求項1至13中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該去甲基化劑包含阿紮胞苷。
15. 如請求項1至14中任一項所使用之BTN3A活化抗體，其中該去甲基化劑係以約50 mg/m ²至約100 mg/m ²之劑量投與。