ES2905615T3 - Sistemas y métodos para evaluar moduladores de puntos de control inmunitario - Google Patents
Sistemas y métodos para evaluar moduladores de puntos de control inmunitario Download PDFInfo
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Abstract
Una composición que comprende: (a) una célula efectora que muestra sobre su superficie (i) un receptor de linfocitos T (TCR) y (ii) un receptor de punto de control inmunitario (ICR) que comprende un receptor inmunoinhibidor seleccionado entre el grupo que consiste en: PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, TIGIT, CD160, BTLA, y receptor de IL-10, en donde la célula efectora comprende un gen que codifica una proteína indicadora fluorescente o bioluminiscente, cuya expresión está bajo el control de un promotor de factor nuclear de linfocitos T activados (NFAT), en donde el promotor de NFAT comprende uno o más elementos de respuesta a NFAT que tienen al menos un 50 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, y en donde los elementos de respuesta a NFAT se unen a un factor de transcripción de la familia NFAT para mejorar la transcripción de genes asociados; y (b) una célula presentadora de antígeno (APC) que muestra sobre su superficie: (i) un activador de receptor de linfocitos T (TCR) y (ii) un ligando de punto de control inmunitario (ICL) seleccionado entre el grupo que consiste en PD-L1, PD-L2, B7-H4, CD155, galectina-9, y HVEM, en donde el activador de TCR es un anticuerpo anti grupo de diferenciación 3 (CD3); en donde el ICR y el ICL forman un complejo ICR/ICL tras la interacción, y en donde la formación del complejo ICR/ICL da como resultado una expresión alterada de la proteína indicadora fluorescente o bioluminiscente.
Description
DESCRIPCIÓN
Sistemas y métodos para evaluar moduladores de puntos de control inmunitario
En el presente documento se describen composiciones, sistemas y métodos para evaluar moduladores de puntos de control inmunitario. En particular, se proporcionan células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC) y células efectoras inmunitarias para evaluar la potencia de los agentes de ensayo para inhibir los puntos de control inmunitario.
ANTECEDENTES
Entre los enfoques más prometedores para activar la inmunidad antitumoral terapéutica se encuentra el bloqueo de puntos de control inmunitario. Los puntos de control inmunitario se refieren a una plétora de vías inhibitorias integradas en el sistema inmunitario que son decisivas para mantener la autotolerancia y modular la duración y la amplitud de las respuestas inmunitarias fisiológicas. Ahora está claro que los tumores incorporan ciertas vías de punto de control inmunitario como mecanismo importante de resistencia inmunitaria, en particular frente a linfocitos T que son específicos para antígenos tumorales. Dado que muchos de los puntos de control inmunitario se inician mediante interacciones ligando-receptor, se pueden bloquear mediante agentes que inhiben estas interacciones, por ejemplo, anticuerpos específicos para el ligando o el receptor.
Una interacción ligando-receptor que se ha investigado como diana para el tratamiento del cáncer es la interacción entre la proteína transmembrana de muerte celular programada 1 (PD-1; también conocida como CD279) y su ligando, el ligando 1 de PD-1 (PD-L1) y ligando 2 de PD-1 (PD-L2). En fisiología normal, PD-L1 y PD-L2 en la superficie de una célula se unen a PD-1 en la superficie de una célula inmunitaria, lo que inhibe la actividad de la célula inmunitaria. El aumento regulado de PD-L1 en la superficie de algunas células cancerosas puede permitir que evadan el sistema inmunitario del hospedador al inhibir los linfocitos T que, de lo contrario, podrían atacar a los tumores. Los anticuerpos que se unen a PD-1 o PD-L1 y que, por lo tanto, bloquean la interacción, derrotan al mecanismo inhibidor y permiten que las células inmunitarias ataquen a las células cancerosas o tumor. Se han publicado resultados de ensayos clínicos iniciales con un anticuerpo IgG4 frente a PD-1 denominado NIVOLUMAB (Pardoll, DM (22 de marzo de 2012). "The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy". Nature reviews cancer. 12 (4): 252-64).
El documento de patente US2006/0034810 desvela sistemas que comprenden una célula efectora que expresa PD-1 y una célula presentadora de antígeno que expresa PD-L1 o PD-L2. La célula presentadora de antígeno artificial de D7 muestra sobre su superficie un activador de TCR y un ligando de punto de control inmunitario. La APC puede comprender, entre otras, CD80, PD-L1, PD-L2 o HVEM.
Los métodos tradicionales de medición de anticuerpos frente a receptores de inmunobloqueo tienen numerosos inconvenientes. Por ejemplo, para evaluar los efectos antitumorales del bloqueo de Ac. m. (anticuerpo monoclonal) se pueden usar modelos animales mediante análisis fenotípico de masas tumorales en ratones portadores de tumores, tiempo medio de supervivencia, tasa de supervivencia general de los ratones, etc. Tal análisis tiene, como principales inconvenientes, un coste y un tiempo prohibitivos. Como alternativa, para estudiar fármacos de inmunoterapia sobre el bloqueo inhibidor de la producción de citoquinas se pueden usar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) recién aisladas. Por ejemplo, en estudios clínicos se han usado PBMC crioconservadas, que informaron de una expresión significativamente reducida tanto de PD-1 como de PD-L1 en linfocitos T CD3+/CD8+ derivados de PBMC y monocitos CD45+/CD14+ obtenidos a partir de sujetos de control adultos. Sin embargo, el aislamiento de las PBMC es tedioso y tales experimentos producen una gran variabilidad en los resultados. Por último, se han desarrollado ensayos basados en células para medir la producción de IL-2 (ensayo basado en ELISA) en células Jurkat que expresan receptores de punto de control inmunitario; sin embargo, tales ensayos requieren para su realización un mínimo de dos días después de la estimulación con anticuerpos. Se necesitan métodos convenientes para medir la eficacia de los anticuerpos frente a receptores de punto de control inmunitario.
SUMARIO
La invención es como se describe en las reivindicaciones.
En el presente documento se describen composiciones, sistemas y métodos para evaluar moduladores de puntos de control inmunitario. En particular, se proporcionan células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC) y células efectoras inmunitarias para evaluar la potencia de los agentes de ensayo (por ejemplo, anticuerpos) para inhibir puntos de control inmunitario.
En algunas opciones, en el presente documento se describen composiciones que comprenden una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) o gotita fosfolipídica, que muestra sobre su superficie: (1) un activador de elemento sensible a antígeno, y (2) un ligando de punto de control inmunitario (ICL). En algunas opciones, el activador de elemento sensible a antígeno es un activador del complejo de receptor de linfocitos T (TCR). En
algunas opciones, se proporcionan composiciones que comprenden una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) o gotita fosfolipídica que muestra sobre su superficie un activador de receptor de linfocitos T (TCR) y un ligando de punto de control inmunitario (ICL). Aunque las opciones que se describen en el presente documento se describen generalmente con referencia al complejo de TCR y un activador de TCR, las composiciones, sistemas y métodos que se describen en el presente documento también se pueden aplicar a otros elementos sensibles a antígeno y activadores de los mismos. En algunas opciones, la aAPC muestra además sobre su superficie un segundo (o tercero, cuarto, etc.), ligando de punto de control inmunitario diferente.
En algunas opciones, el activador de TCR es una entidad molecular mostrada en la superficie (por ejemplo, proteína, péptido, polipéptido, etc.) que se une a, o que interactúa de otro modo con un componente del complejo de TCR para activar el complejo de TCR y las vías dependientes de TCR. En algunas opciones, el activador de TCR es un anticuerpo anti grupo de diferenciación 3 (anti-CD3), una proteína de fusión de membrana que contiene un fragmento de anticuerpo de anti-CD3, o un fragmento de anticuerpo del mismo, complejo principal de histocompatibilidad (MHC), etc.
En algunas opciones, el ICL es una entidad molecular (por ejemplo, proteína, péptido, polipéptido, etc.) que interactúa con un receptor de punto de control inmunitario (ICR) en una célula efectora (por ejemplo, linfocito T, Jurkat, etc.) para modular (por ejemplo, inhibir, mejorar, etc.) la respuesta inmunitaria de la célula efectora. En algunas opciones, el ICL es cualquier ligando de punto de control inmunitario adecuado, que incluye, pero no se limita a, PD-L1, PD-L2, B7-H4, CD155, galectina-9, HVEM, etc.
En algunas opciones, en el presente documento se describen composiciones que comprenden una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra sobre su superficie: (1) un activador de TCR (por ejemplo, anti-CD3) y (2) un ligando de punto de control inmunitario (por ejemplo, PD-L1).
En algunas opciones, los elementos artificiales, exógenos, y/o genomanipulados de una APC incluyen, pero no se limitan a: un activador de TCR (por ejemplo, anticuerpo anti-CD3, MHC, etc.), un ligando de punto de control inmunitario (por ejemplo, PD-L1), etc.
En algunas opciones, en el presente documento se describen composiciones que comprenden células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC) o gotitas fosfolipídicas que muestran sobre su superficie un activador de receptor de linfocitos T (TCR) y un ligando de punto de control inmunitario (ICL). En algunas opciones, tras la interacción de la aAPC o gotita fosfolipídica con una célula efectora que comprende un TCR y un receptor de punto de control inmunitario (ICR), el activador de TCR activa el TCR de la célula efectora, y el ICL interactúa con el ICR formando un complejo ICR/ICL. En algunas opciones, la formación del complejo ICR/ICL modula los efectos corriente abajo de la activación de TCR. En algunas opciones, el activador de TCR es un anticuerpo anti grupo de diferenciación 3 (CD3), o fragmento de anticuerpo del mismo, o complejo principal de histocompatibilidad (MHC). En algunas opciones, el ICL se selecciona entre el grupo que consiste en PD-L1, PD-L2, B7-H4, CD155, galectina-9 y HVEM.
En algunas opciones, en el presente documento se describen sistemas que comprenden: (a) una célula presentadora de antígeno artificial o gotita fosfolipídica que muestra sobre su superficie: (i) un activador de receptor de linfocitos T (TCR) y (ii) un ligando de punto de control inmunitario (ICL); y (b) una célula efectora artificial que muestra sobre su superficie un receptor de punto de control inmunitario (ICR) y que comprende: (i) un complejo de TCR y (ii) un indicador (por ejemplo, un indicador dependiente de la vía de TCR) de uno o más de: (A) formación del complejo ICR/ICL, (B) activación de TCR, y/o (C) el indicador dependiente de la vía de activación de TCR. En algunas opciones, la formación de un complejo ICR/ICL da como resultado una alteración detectable en la señal (por ejemplo, cambio en la actividad, cambio en la expresión, etc.), del indicador dependiente de la vía de activación de TCR (por ejemplo, frente a la ausencia de interacción de ICR/ICL). En algunas opciones, los sistemas comprenden además un agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo. En algunas opciones, el agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo inhibe la formación del complejo ICR/ICL dando como resultado la inhibición de la señal del indicador dependiente de la vía de activación de TCR. En algunas opciones, la alteración de la señal del indicador dependiente de la vía de activación de TCR es al menos 2 veces (por ejemplo, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces, 14 veces, 15 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1000 veces, 2000 veces, 5000 veces, y cualquier intervalo entre los mismos). En algunas opciones, el activador de TCR es una entidad molecular mostrada en la superficie (por ejemplo, proteína, péptido, polipéptido, etc.) que se une a, o que interactúa de otro modo con, un componente del complejo de TCR para activar el complejo de TCR y vías dependientes de TCR. En algunas opciones, el activador de TCR es un anticuerpo anti grupo de diferenciación 3 (anti-CD3) o fragmento de anticuerpo del mismo, complejo principal de histocompatibilidad (MHC), etc.
En algunas opciones, el ICL es una entidad molecular (por ejemplo, proteína, péptido, polipéptido, etc.) que interactúa con un receptor de punto de control inmunitario (ICR) sobre una célula efectora (por ejemplo, linfocito T, Jurkat, etc.) para modular (por ejemplo, inhibir, mejorar, etc.) la respuesta inmunitaria de la célula efectora. En algunas opciones, el ICL es cualquier ligando de punto de control inmunitario adecuado, que incluye, pero no se
limita a, PD-L1, PD-L2, B7-H4, CD155, galectina-9, HVEM, etc.
En algunas opciones, la célula efectora artificial es un linfocito T seleccionado entre el grupo que incluye, pero no se limita a, células Jurkat, HuT-78, CEM, Molt-4, etc., que se ha genomanipulado para que contenga, exprese, etc., uno o más elementos (por ejemplo, un constructo de indicador, gen exógeno, etc.) no nativos para la célula precursora (por ejemplo, no artificial).
En algunas opciones, el ICR es cualquier receptor inmunoinhibidor adecuado que incluye, pero no se limita a, PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, TIGIT, CD160, BTLA, receptor de IL-10, etc.
En algunas opciones, el complejo de TCR es un complejo octamérico de cadenas a y p de receptor de TCR variables con tres módulos de señalización diméricos CD38/e, CD3y/£, y CD247 Z/Z o Z/n.
En algunas opciones, el indicador (por ejemplo, indicador dependiente de la vía de activación de TCR) es un elemento sobre o dentro de una célula efectora que tiene una característica (por ejemplo, actividad, expresión, concentración, localización, interacciones, modificación, etc.) que depende de, o se correlaciona con, uno o más de (i) formación del complejo ICR/ICL, (ii) activación de TCR, y/o (iii) activación de la vía de señalización de TCR. En algunas opciones, el indicador se encuentra corriente abajo de la formación del complejo ICR/ICL y/o activación de TCR (por ejemplo, un constructo de indicador genomanipulado, un elemento/señal/interacción detectable que se produce naturalmente dentro de dicha célula efectora). En algunas opciones, un indicador es un elemento sobre o dentro de la célula efectora que tiene una característica (por ejemplo, actividad, expresión, concentración, localización, interacciones, modificación, etc.) que está alterada mediante una o más de (i) formación del complejo ICR/ICL, (ii) activación de TCR, y/o (iii) la vía de señalización de TCR. En algunas opciones, el indicador es intrínseco a la célula efectora (por ejemplo, un elemento intrínseco de linfocitos T, células Jurkat, etc.). En tales opciones, las alteraciones en las características de ese indicador intrínseco se pueden detectar como una señal de la presencia, ausencia y/o nivel de uno o más de i) formación del complejo ICR/ICL, (ii) activación de TCR, y/o (iii) la activación de la vía de señalización de TCR. Algunos indicadores y/o señales intrínsecos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a: expresión génica (por ejemplo, de un gen dependiente de la vía de TCR), concentración de proteína (por ejemplo, una proteína expresada por un gen dependiente de la vía de TCR), una interacción proteína-proteína (por ejemplo, mediada por la formación del complejo ICR/ICL y/o activación de TCR), actividad de una proteína dependiente de TCR (por ejemplo, una enzima, proteinasa, quinasa), localización y movimiento de un elemento intrínseco de célula efectora, etc. En algunas opciones, el indicador es extrínseco a la célula efectora (por ejemplo, un elemento indicador o constructo que se ha introducido o genomanipulado en la célula efectora). En tales opciones, las alteraciones en una característica del indicador extrínseco y/o genomanipulado se pueden detectar como una señal de la presencia, ausencia y/o nivel de uno o más de: (i) formación del complejo ICR/ICL, (ii) activación de TCR, y/o (iii) la activación de la vía de señalización de TCR. Algunos indicadores y/o señales extrínsecos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a: expresión de un constructo de indicador dependiente de TCR y/o dependiente de la vía de TCR (por ejemplo, bajo el control de un elemento de respuesta a NFAT, elemento de respuesta a NF-kB, elemento de respuesta a AP1, un promotor que contiene uno o varios de los elementos de respuesta mencionados, promotor de IL-2), actividad de un indicador cuya activación y/o expresión es dependiente de TCR o de la vía de TCR (por ejemplo, luciferasa, beta lactamasa, CAT, SEAP, proteína fluorescente, etc.), una interacción proteína-proteína, movimiento de proteína, detección de aumento regulado de genes endógenos mediante qPCR, etc.
En algunas opciones, en el presente documento se describen sistemas que comprenden: (a) una célula presentadora de antígeno artificial o gotita fosfolipídica que muestra sobre su superficie: (i) un activador de receptor de linfocitos T (TCR), (ii) un primer ligando de punto de control inmunitario (ICL), y (iii) un segundo ICL; y (b) una célula efectora artificial que muestra sobre su superficie: (i) un primer receptor de punto de control inmunitario (ICR), (ii) un segundo ICR, y (iii) un complejo de TCR, y que comprende un indicador (por ejemplo, un indicador dependiente de la vía de TCR) de uno o más de: (A) formación de complejo entre el primer ICR y el primer ICL, (B) formación de complejo entre el segundo ICR y el segundo ICL, (C) activación de TCR, y/o (D) el indicador dependiente de la vía de activación de TCR. En algunas opciones, la formación de un complejo entre el primer ICR y el primer ICL y/o el segundo ICR y el segundo ICL da como resultado una alteración detectable en la señal (por ejemplo, cambio en la actividad, cambio en la expresión, etc.), del indicador dependiente de la vía de activación de TCR (por ejemplo, con respecto a la ausencia de una interacción ICR/ICL). En algunas opciones, los sistemas comprenden además un agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo. En algunas opciones, el agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo inhibe la formación del complejo entre el primer ICR y el primer ICL y/o el segundo ICR y el segundo ICL dando como resultado la inhibición de la señal del indicador dependiente de la vía de activación de TCR. En algunas opciones, la alteración de la señal del indicador dependiente de la vía de activación de TCR es al menos 2 veces (por ejemplo, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces, 14 veces, 15 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1000 veces, 2000 veces, 5000 veces, y cualquier intervalo entre los mismos).
En algunas opciones, en el presente documento se describen sistemas que comprenden: (a) una célula efectora que muestra receptor de linfocitos T (TCR) y un receptor de punto de control inmunitario (ICR) sobre su superficie, y un indicador dependiente de la vía de activación de TCR (por ejemplo, indicador dependiente de promotor de factor
nuclear de linfocitos T activados (NFAT)); y (b) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra un activador de TCR (por ejemplo, anticuerpo anti grupo de diferenciación 3 expresado en la superficie o fragmentos de anticuerpo, complejo principal de histocompatibilidad (MHC), etc.) y un ligando de punto de control inmunitario (ICL); en donde el ICR y el ICL forman un complejo ICR/ICL tras la interacción. En algunas opciones, la formación del complejo ICR/ICL da como resultado una supresión de la expresión del indicador dependiente de promotor de NFAT. En algunas opciones, los sistemas comprenden además un agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo. En algunas opciones, el agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo inhibe la formación del complejo ICR/ICL, dando como resultado un aumento de la expresión del indicador dependiente de promotor de NFAT. En algunas opciones, el aumento de la expresión es al menos 2 veces (por ejemplo, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces, 14 veces, 15 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1000 veces, 2000 veces, 5000 veces, y cualquier intervalo entre los mismos). En algunas opciones, el aumento de la expresión es un aumento de 6-12 veces con respecto a la supresión de la expresión. En algunas opciones, la célula efectora es un linfocito T que incluye, pero no se limita a, células Jurkat, HuT-78, CEM, Molt-4, etc. En algunas opciones, el indicador es una luciferasa, una beta lactamasa, CAT, SEAP, una proteína fluorescente, un producto génico (por ejemplo, detectado mediante qPCR, espectrometría de masas, etc.), etc. En algunas opciones, el ICR es cualquier receptor inmunoinhibidor que incluye, pero no se limita a, PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, TIGIT, CD160, BTLA, receptor de IL-10, etc., y el ICL es cualquier ligando inmunoinhibidor correspondiente que incluye, pero no se limita a, PD-L1, PD-L2, B7-H4, CD155, galectina-9, HVEM, etc. En algunas opciones, el agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo es un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo), proteína, péptido, o molécula pequeña, vacuna, o combinación de los mismos.
En algunas opciones, en el presente documento se describen sistemas que comprenden: (a) una célula efectora que comprende TCR y PD-1 sobre su superficie y un indicador dependiente de la vía de activación de TCR (por ejemplo, dependiente de promotor de NFAT); y (b) una célula presentadora de antígeno artificial que muestra un activador de TCR (por ejemplo, expresión superficial de anticuerpo anti grupo de diferenciación 3 o fragmentos de anticuerpo, complejo principal de histocompatibilidad (MHC), etc.), y PD-L1 sobre su superficie. En algunas opciones, la formación de un complejo PD-1/PD-L1 da como resultado una supresión de la expresión del indicador dependiente de la vía de activación de TCR (por ejemplo, dependiente de promotor de NFAT). En algunas opciones, los sistemas comprenden además un agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo. En algunas opciones, el agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo inhibe la formación del complejo PD-1/PD-L1, dando como resultado un aumento de la expresión del indicador dependiente de la vía de activación de TCR. En algunas opciones, el aumento de la expresión es al menos 2 veces (por ejemplo, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces, 14 veces, 15 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1000 veces, 2000 veces, 5000 veces, y cualquier intervalo entre los mismos).
En algunas opciones, el indicador es una luciferasa, una beta lactamasa, CAT, SEAP, una proteína fluorescente, una interacción proteína-proteína, etc. En algunas opciones, la expresión se detectaba midiendo directamente la cantidad de expresión génica (por ejemplo, mediante qPCR, mediante espectrometría de masas, etc.).
En algunas opciones, en el presente documento se describen composiciones que comprenden una célula efectora artificial que muestra un TCR y cualquier receptor inmunoinhibidor que incluye, pero no se limita a, PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, TIGIT, CD160, BTLA, receptor de IL-10, etc., sobre su superficie y que comprende un indicador dependiente de la vía de activación de TCR (por ejemplo, indicador dependiente de promotor de NFAT) tal como una luciferasa, una beta lactamasa, CAT, SEAP, una proteína fluorescente, etc.
En algunas opciones, en el presente documento se describen sistemas que comprenden: (a) una célula efectora que muestra sobre su superficie un receptor de punto de control inmunitario (ICR) y que comprende un receptor de linfocitos T (TCR); y (b) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra sobre su superficie un activador de receptor de linfocitos T (TCR) y un ligando de punto de control inmunitario (ICL); en donde el ICR y el ICL forman un complejo ICR/ICL tras la interacción. En algunas opciones, la formación del complejo ICR/ICL da como resultado la modulación de la activación de TCR mediante el activador de TCR y/o la modulación de una o más vías dependientes de TCR. En algunas opciones, la modulación comprende: (a) inhibición de la activación de TCR mediante el activador de TCR y/o una o más vías dependientes de TCR; o (b) mejora de la activación de TCR mediante el activador de TCR y/o una o más vías dependientes de TCR. En algunas opciones, el activador de TCR es un anticuerpo anti grupo de diferenciación 3 (CD3), o fragmento de anticuerpo del mismo, o complejo principal de histocompatibilidad (MHC). En algunas opciones, el ICL se selecciona entre el grupo que consiste en PD-L1, PD-L2, B7-H4, CD155, galectina-9, y HVEM. En algunas opciones, el ICR se selecciona entre el grupo que consiste en PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, CD160, TIGIT, receptor de IL-10, y BTLA. En algunas opciones, la célula efectora se selecciona entre el grupo que consiste en una célula de Jurkat, HuT-78, CEM, y Molt-4. En algunas opciones, la célula efectora comprende además un indicador de: activación de TCR, activación de la vía de TCR, y/o modulación del complejo ICR/ICL de activación de TCR o activación de la vía de TCR. En algunas opciones, la característica del indicador comprende: concentración celular, expresión, actividad, localización, o interacciones proteína-proteína. En algunas opciones, la formación del complejo ICR/ICL modula dicha característica. En algunas opciones, el indicador es un indicador natural, por ejemplo, intrínseco para el tipo de célula efectora, que tiene una característica que se puede detectar y se correlaciona con la activación de TCR, activación de la vía de TCR, y/o modulación del complejo ICR/ICL de activación de TCR o activación de la vía de TCR. En algunas opciones, el indicador es un indicador
artificial, por ejemplo, exógeno para el tipo de célula efectora, que tiene una característica que se puede detectar y se correlaciona con la activación de TCR, activación de la vía de TCR, y/o modulación del complejo ICR/ICL de activación de TCR o activación de la vía de TCR. En algunas opciones, el indicador es un gen, cuya expresión está bajo el control de un indicador dependiente de la vía de TCR. En algunas opciones, el indicador dependiente de la vía de TCR es un promotor de factor nuclear de linfocitos T (NFAT) activados. En algunas opciones, el indicador comprende un gen que codifica una proteína seleccionada entre el grupo que consiste en una luciferasa, una beta lactamasa, CAT, SEAP, una proteína fluorescente, o un producto génico cuantificable. En algunas opciones, el sistema comprende además un agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo. En algunas opciones, el agente de bloqueo inhibe la formación del complejo ICR/ICL, dando como resultado la modulación de la activación de TCR o activación de la vía de TCR. En algunas opciones, el agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo es una molécula pequeña, péptido, proteína, o anticuerpo.
En algunas opciones, en el presente documento se describen sistemas que comprenden: (a) una célula efectora que comprende TCR y PD-1 sobre su superficie y una luciferasa dependiente de promotor de NFAT; y (b) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra sobre su superficie: anticuerpo anti-CD3 o fragmento de anticuerpo del mismo y PD-L1. En algunas opciones, la formación de un complejo PD-1/PD-L1 da como resultado una supresión de la expresión de la luciferasa dependiente de promotor de NFAT. En algunas opciones, los sistemas comprenden además un agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo. En algunas opciones, el agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo inhibe la formación del complejo PD-1/PD-L1 dando como resultado un aumento de la expresión de la luciferasa dependiente de promotor de n Fa T.
En algunas opciones, en el presente documento se describen métodos que comprenden: (a) poner en contacto: (i) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra sobre su superficie: (A) un activador de receptor de linfocitos T (TCR) y (B) un ligando de punto de control inmunitario (ICL) con (ii) una célula efectora que comprende un complejo de TCR y que muestra sobre su superficie un receptor de punto de control inmunitario (ICR), en donde la interacción del activador de TCR con el complejo de TCR activa una vía de señalización de TCR, en donde dicho ICR y dicho ICL forman un complejo ICR/ICL tras la interacción, y en donde la formación del complejo ICR/ICL mejora o inhibe la activación de TCR y/o la vía de señalización de TCR; y (b) detectar la presencia, ausencia, y/o nivel de activación de TCR en dicha célula efectora. En algunas opciones, los métodos comprenden además: (c) poner en contacto dicha célula efectora y/o dicha aAPC con un agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo. En algunas opciones, los métodos comprenden además: (d) detectar el efecto de dicho agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo en la (i) formación del complejo ICR/ICL, (ii) activación de TCR, y/o (iii) la vía de señalización de TCR. En algunas opciones, uno o más de (i) formación del complejo ICR/ICL, (ii) activación de TCR, y/o (iii) la vía de señalización de TCR se detectan en presencia y ausencia de dicho agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo para determinar un efecto.
En algunas opciones, la (i) formación del complejo ICR/ICL, (ii) activación de TCR, y/o (iii) la vía de señalización de TCR se detectan basándose en un indicador corriente abajo de la formación del complejo ICR/ICL y/o activación de TCR (por ejemplo, un constructo de indicador genomanipulado, un elemento/señal/interacción detectable que se produce naturalmente dentro de dicha célula efectora). En algunas opciones, un indicador es un elemento sobre o dentro de la célula efectora que tiene una característica (por ejemplo, actividad, expresión, concentración, localización, interacciones, modificación, etc.) que está alterada mediante una o más de (i) formación del complejo ICR/ICL, (ii) activación de TCR, y/o (iii) la vía de señalización de TCR. En algunas opciones, el indicador es intrínseco a la célula efectora (por ejemplo, un elemento intrínseco de linfocitos T, células Jurkat, etc.). En tales opciones, las alteraciones en una característica de ese indicador intrínseco se pueden detectar como una señal de la presencia, ausencia, y/o nivel de uno o más de i) formación del complejo ICR/ICL, (ii) activación de TCR, y/o (iii) la activación de la vía de señalización de TCR. Algunos indicadores y/o señales intrínsecos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a: expresión génica (por ejemplo, de un gen dependiente de la vía de TCR), concentración de proteína (por ejemplo, una proteína expresada por un gen dependiente de la vía de TCR), una interacción proteína-proteína (por ejemplo, mediada por la formación del complejo ICR/ICL y/o activación de TCR), modificación de proteína dependiente de la vía de TCR, actividad de una proteína dependiente de TCR, localización de un elemento celular efector intrínseco, etc. En algunas opciones, el indicador es extrínseco a la célula efectora (por ejemplo, un elemento indicador o constructo que se ha introducido o genomanipulado en la célula efectora). En tales opciones, las alteraciones en las características del indicador extrínseco y/o genomanipulado se pueden detectar como una señal de la presencia, ausencia, y/o nivel de uno o más de: (i) formación del complejo iCr/ICL, (ii) activación de TCR, y/o (iii) la activación de la vía de señalización de TCR. Algunos indicadores y/o señales extrínsecos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a: expresión de un constructo de indicador dependiente de TCR y/o dependiente de la vía de TCR (por ejemplo, bajo el control de un promotor de NFAT), actividad de un indicador cuya activación y/o expresión es dependiente de TCR o de la vía de TCR(por ejemplo, luciferasa, beta lactamasa, CAT, SEAP, proteína fluorescente, etc.), una interacción proteína-proteína, movimiento de proteína, detección de modificación proteica, detección de aumento regulado de genes endógenos mediante qPCR, etc.
En algunas opciones, el activador de TCR es una entidad molecular mostrada en la superficie (por ejemplo, proteína, péptido, polipéptido, etc.) que se une a, o que interactúa de otro modo con, un componente del complejo de TCR para activar el complejo de TCR y vías dependientes de TCR. En algunas opciones, el activador de TCR es un anticuerpo anti grupo de diferenciación 3 (anti-CD3) o fragmentos de anticuerpo del mismo, complejo principal de
histocompatibilidad (MHC), etc.
En algunas opciones, el ICL es una entidad molecular (por ejemplo, proteína, péptido, polipéptido, etc.) que interactúa con un receptor de punto de control inmunitario (ICR) sobre una célula efectora (por ejemplo, linfocito T, Jurkat, etc.) para modular (por ejemplo, inhibir, mejorar, etc.) la respuesta inmunitaria de la célula efectora. En algunas opciones, el ICL es cualquier ligando de punto de control inmunitario adecuado que incluye, pero no se limita, PD-L1, PD-L2, B7-H4, CD155, galectina-9, HVEM, etc.
En algunas opciones, la célula efectora es un linfocito T seleccionado entre el grupo que incluye, pero no se limita a, células Jurkat, HuT-78, CEM, Molt-4, etc. En algunas opciones, la célula efectora es artificial (por ejemplo, genomanipulada para que contenga, exprese, etc., uno o más elementos (por ejemplo, un constructo de indicador, gen exógeno, etc.) no nativa con respecto a la célula precursora (por ejemplo, célula no artificial). En algunas opciones, la célula efectora es un linfocito T humano o animal no genomanipulado.
En algunas opciones, el ICR es cualquier receptor inmunoinhibidor adecuado que incluye, pero no se limita a, PD-1, CT-LA-4, LAG-3, TIM-3, TIGIT, CD160, BTLA, receptor de IL-10, etc.
En algunas opciones, el complejo de TCR es un complejo octamérico de cadenas a y p de receptor de TCR variables con tres módulos de señalización diméricos CD36/e, CD3y/£, y CD247 Z/Z o Z/n.
En algunas opciones, en el presente documento se describen métodos para medir la potencia de un agente de bloqueo de ensayo para inhibir la interacción de un receptor de punto de control inmunitario y un ligando de punto de control inmunitario, que comprende: (a) cocultivar: (i) una célula efectora que muestra receptor de linfocitos T (TCR) y un receptor de punto de control inmunitario (ICR) sobre su superficie y un indicador dependiente de la vía de activación de TCR; (ii) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra un anticuerpo anti grupo de diferenciación 3 (CD3), o fragmento de anticuerpo del mismo, y un ligando de punto de control inmunitario, en donde el ICR y el ICL forman un complejo ICR/ICL tras la interacción; y (iii) un agente de bloqueo de ensayo; (b) incubar la mezcla en (a) para permitir la inducción de la señal; (c) detectar dicha señal de dicho indicador; y (d) comparar dicha señal del sistema de cocultivo celular con y sin el agente de bloqueo de ensayo, en donde una amplificación de señal indica inhibición de dicho complejo ICR/ICL mediante dicho agente de bloqueo de ensayo. En algunas opciones, la célula efectora es un linfocito T que incluye, pero no se limita a, células Jurkat, HuT-78, CEM, Molt-4, etc. En algunas opciones, el indicador es una luciferasa, una beta lactamasa, CAT, SEAP, una proteína fluorescente, etc. En algunas opciones, el ICR puede ser cualquier receptor inmunoinhibidor que incluya, pero no se limite a, PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, TIGIT, CD160, BTlA, receptor de IL-10, etc., y el ICL puede ser cualquier ligando inmunoinhibidor que incluya, pero no se limite a, PD-L1, PD-L2, B7-H4, CD155, galectina-9, HVEM, etc. En algunas opciones, el agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo es un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo), proteína, péptido, o molécula pequeña o combinación de los mismos.
En algunas opciones en el presente documento se describen métodos para medir la potencia de un agente de bloqueo de ensayo para inhibir la interacción de un receptor de punto de control inmunitario y un ligando de punto de control inmunitario, que comprende: (a) cocultivar: (i) una célula efectora que muestra receptor de linfocitos T (TCR) y un receptor de punto de control inmunitario (ICR) sobre su superficie, y un indicador dependiente de la vía de activación de TCR (por ejemplo, indicador dependiente de promotor de NFAT), y (ii) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra un activador de TCR (por ejemplo, un anticuerpo anti grupo de diferenciación 3 (CD3) o fragmento de anticuerpo del mismo) y un ligando de punto de control inmunitario (ICL), en donde el ICR y el ICL forman un complejo ICR/ICL tras la interacción; (b) detectar una señal de dicho indicador; (c) añadir dicho agente de bloqueo de ensayo; (d) repetir la detección de dicha señal de dicho indicador; y (e) comparar dicha señal de la etapa (b) con dicha señal de la etapa (d), en donde una amplificación de señal de la etapa (b) con respecto a la etapa (d) indica inhibición de dicho complejo ICR/ICL mediante dicho agente de bloqueo de ensayo. En algunas opciones, la célula efectora es un linfocito T que incluye, pero no se limita a, células Jurkat, HuT-78, CEM, Molt-4, etc. En algunas opciones, el indicador es una luciferasa, una beta lactamasa, CAT, SEAP, una proteína fluorescente, expresión génica (por ejemplo, cuantificada mediante qPCR), etc. En algunas opciones, el ICR puede ser cualquier receptor inmunoinhibidor que incluya, pero no se limite a, PD-1, CTLA-4, lAg -3, TIM-3, T iGiT, CD160, bTlA, receptor de IL-10, etc., y el ICL puede ser cualquier ligando inmunoinhibidor correspondiente que incluya, pero no se limite a, PD-L1, PD-L2, B7-H4, CD155, galectina-9, HVEM, etc. En algunas opciones, el agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo es un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo), proteína, péptido o molécula pequeña o combinación de los mismos. En algunas opciones, el ICR es PD-1, y el ICL es PD-L1. En algunas opciones, el agente de bloqueo de ensayo es un anticuerpo o una molécula pequeña.
En algunas opciones, en el presente documento se describen métodos para medir la potencia de un agente de bloqueo de ensayo para inhibir la interacción de un receptor de punto de control inmunitario y un ligando de punto de control inmunitario, que comprende: (a) cocultivar: (i) una célula efectora que muestra receptor de linfocitos T (TCR) y un receptor de punto de control inmunitario (ICR) sobre su superficie, y un indicador dependiente de la vía de activación de TCR (por ejemplo, indicador dependiente de promotor de NFAT), y (ii) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra un activador de TCR (por ejemplo, un anticuerpo anti grupo de diferenciación 3 (CD3) o fragmento de anticuerpo del mismo) y un ligando de punto de control inmunitario (ICL), en donde el ICR y
el ICL forman un complejo ICR/ICL tras la interacción; (b) detectar una señal de dicho indicador en presencia de un agente de bloqueo de ensayo; y (c) comparar dicha señal de la etapa (b) con un control (por ejemplo, señal en ausencia de dicho agente de bloqueo de ensayo, una señal de control, fondo, un control cero, un control negativo, etc.), en donde una amplificación de señal con respecto al control indica inhibición de dicho complejo ICR/ICL mediante dicho agente de bloqueo de ensayo. En algunas opciones, los métodos proporcionan además una etapa de adición del agente de bloqueo de ensayo.
En algunas opciones, en el presente documento se describen métodos que comprenden: (a) formar un sistema que comprende: (i) una célula efectora que muestra sobre su superficie un receptor de punto de control inmunitario (ICR), y que comprende un receptor de linfocitos T (TCR) y un indicador dependiente de la vía de TCR, y (ii) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra sobre su superficie un activador de TCR y un ligando de punto de control inmunitario (ICL); en donde el ICR y el ICL forman un complejo ICR/ICL tras la interacción, y en donde la formación del complejo ICR/ICL da como resultado la modulación de la activación de TCR mediante el activador de TCR y/o la modulación de una o más vías dependientes de TCR; y (b) detectar dicho indicador dependiente de la vía de TCR o una señal de dicho indicador. En algunas opciones, los métodos comprenden además añadir al sistema un agente de bloqueo, en donde el agente de bloqueo inhibe la formación del complejo ICR/ICL o inhibe la modulación de la activación de TCR dependiente de ICR/ICL mediante el activador de TCR y/o la modulación de una o más vías dependientes de TCR. En algunas opciones, el indicador dependiente de la vía de TCR o una señal de dicho indicador se detecta: (1) antes, (2) simultáneamente con, y/o (3) después de añadir dicho agente de bloqueo. En algunas opciones, los sistemas comprenden además una etapa de comparar la señal de (1) antes, (2) simultáneamente con, y/o (3) después de añadir dicho agente de bloqueo para determinar el efecto del agente de bloqueo.
En algunas opciones, en el presente documento se describen métodos que comprenden: (a) cocultivar:
(i) una célula efectora que muestra receptor de linfocitos T (TCR) y un receptor de punto de control inmunitario (ICR) sobre su superficie, e indicador dependiente de la vía de TCR, y (ii) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra un activador de TCR y un ligando de punto de control inmunitario (ICL), en donde el ICR y el ICL forman un complejo ICR/ICL tras la interacción; (b) añadir dicho agente de bloqueo de ensayo; (c) detectar dicha señal de dicho indicador; y (d) comparar dicha señal de dicho indicador con un control, en donde una amplificación de señal con respecto al control indica inhibición de dicho complejo ICR/ICL mediante dicho agente de bloqueo de ensayo.
En algunas opciones, en el presente documento se describen métodos para identificar un agente de bloqueo de ICR/ICL, que comprende: (a) cocultivar: (i) una célula efectora que muestra receptor de linfocitos T (TCR) y un receptor de punto de control inmunitario (ICR) sobre su superficie, e indicador dependiente de la vía de TCR, y (ii) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra anticuerpo anti grupo de diferenciación 3 (CD3), o fragmento de anticuerpo del mismo, y un ligando de punto de control inmunitario, en donde el ICR y el ICL forman un complejo ICR/ICL tras la interacción; (b) detectar una señal de dicho indicador; (c) añadir dicho agente de bloqueo de ensayo; (d) repetir la detección de dicha señal de dicho indicador; y (e) comparar dicha señal de la etapa (b) con dicha señal de la etapa (d), en donde una amplificación de señal de la etapa (b) con respecto a la etapa (d) indica inhibición de dicho complejo ICR/ICL mediante dicho agente de bloqueo de ensayo.
En algunas opciones, en el presente documento se describen métodos para identificar un agente de bloqueo de ICR/ICL, que comprenden: (a) poner en contacto: (i) una célula efectora que muestra sobre su superficie PD-1, y que comprende: receptor de linfocitos T (TCR) y un indicador de luciferasa dependiente de factor nuclear de promotor de linfocitos T activados (NFAT), y (ii) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra anticuerpo anti grupo de diferenciación 3 (CD3), o fragmento de anticuerpo del mismo, y PD-L1; y (b) detectar una señal de dicho indicador de luciferasa dependiente de promotor de NFAT. En algunas opciones, los métodos comprenden además: (c) añadir dicho agente de bloqueo de ensayo; y (d) repetir la detección de dicha señal de dicho indicador. En algunas opciones, los métodos comprenden además: (e) comparar dicha señal de la etapa (b) con dicha señal de la etapa (d), en donde una amplificación de señal de la etapa (b) con respecto a la etapa (d) indica inhibición de dicho complejo ICR/ICL mediante dicho agente de bloqueo de ensayo.
En algunas opciones, en el presente documento se describen métodos que comprenden administrar una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra sobre su superficie un activador de receptor de linfocitos T (TCR) y un ligando de punto de control inmunitario (ICL) a un sistema que comprende una célula efectora natural. En algunas opciones, en el presente documento se describen métodos que comprenden administrar una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra sobre su superficie un activador de receptor de linfocitos T (TCR) y un ligando de punto de control inmunitario (ICL) a un sistema que comprende una célula efectora artificial. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 muestra un esquema de un sistema general para evaluar inhibidores de puntos de control inmunitario. Se expone una aAPC que muestra un activador de receptor de linfocitos T (TCR) y un ligando de punto de control inmunitario (ICL) sobre su membrana celular que interactúa con una célula efectora
genomanipulada que muestra un receptor de punto de control inmunitario (ICR), CD28 y el complejo de TCR y que comprende un constructo de indicador dependiente de promotor de la vía de TCR. Después de cocultivar la aAPC y la célula efectora genomanipulada, el activador de TCR activa el complejo de TCR; sin embargo, la interacción de ICR e ICL inhibe la activación de la expresión de la vía de TCR y se produce poca expresión del indicador. En presencia de un agente de bloqueo que inhibe la interacción de ICR/ICL, la vía de TCR se activa, la expresión del indicador del promotor de la vía de TCR se mejora, y la señal del indicador se eleva.
La Figura 2 muestra un esquema de un sistema a modo de ejemplo para evaluar inhibidores de puntos de control inmunitario. Se expone una aAPC que muestra PD-L1 y dominio de Fab de anticuerpo anti-CD3 sobre su membrana celular que interactúa con un linfocito T Jurkat que muestra PD-1, el complejo de TCR, y que comprende constructo de indicador de luciferasa dependiente de promotor de NFAT. Tras la coexpresión de la aAPC y la célula efectora de Jurkat, anti-CD3 activa el complejo de TCR; sin embargo, la interacción de PD-1 y PD-L1 inhibe la activación de la expresión del promotor de NFAT, y se produce poca expresión de la luciferasa. En presencia de un inhibidor de la interacción PD-1/PD-L1, el complejo de TCR activado activa la expresión del indicador de luciferasa del promotor de NFAT, y la señal de luciferasa se eleva.
La Figura 3 muestra un gráfico que representa la especificidad de un ensayo de bloqueo de PD-1/PD-L1 a modo de ejemplo.
La Figura 4 muestra gráficos que representan la activación dependiente de la concentración de la expresión del indicador mediante un anticuerpo anti-PD-L1 en un ensayo de bloqueo de PD-1/PD-L1 a modo de ejemplo. La Figura 5 muestra gráficos que representan la activación dependiente de la concentración de la expresión del indicador mediante un anticuerpo anti-PD-1 en un ensayo de bloqueo de PD-1/PD-L1 a modo de ejemplo.
La Figura 6 muestra un esquema de un sistema análogo al representado en la Figura 2, pero la APC no expresa activador de TCR.
La Figura 7 muestra gráficos que representan la activación dependiente de la concentración de la expresión del indicador mediante un anticuerpo anti-PD-L1 en un ensayo de bloqueo de PD-1/PD-L1, careciendo las aAPC de anti-CD3 unido a membrana genomanipulado.
La Figura 8 muestra gráficos que representan la ausencia de inhibición dependiente de PD-1/PD-L1 de la activación de linfocitos T mediante perlas anti-CD3/PD-L1-Fc.
Las Figuras 9A-9B muestran resultados de citometría de flujo que confirman la unión de PD-L1 a las perlas. La Figura 10 muestra un gráfico que demuestra que las perlas anti-CD3:PD-L1 (proporción 1:9) no lograron inducir la inhibición de la activación de linfocitos T, y, por lo tanto, que el anticuerpo anti-PD-1/PD-L1 no logró inducir la activación de linfocitos T.
La Figura 11 muestra un gráfico que demuestra que anti-PD-L1-Fc de longitud extendida sobre las perlas anti-CD3:PD-L1 no logró inducir la inhibición de la activación de linfocitos T, y, por lo tanto, que el anticuerpo anti-PD-1/PD-L1 no logró inducir la activación de linfocitos T.
La Figura 12 muestra una explicación mecanicista contemplada para la ineficacia de las perlas anti-CD3:PD-L1 para que funcionen como las aAPC anti-CD3:PD-L1 en ensayos de bloqueo a modo de ejemplo.
La Figura 13 muestra un esquema de un sistema a modo de ejemplo para evaluar inhibidores de receptor PD-1 de punto de control inmunitario y su ligando, PD-L2.
Las Figuras 14A-14B muestran gráficos que representan la activación dependiente de la concentración de la expresión del indicador mediante un anticuerpo anti-PD-1 (b) o un anticuerpo anti-PD-L2 (a) en un ensayo de bloqueo de PD-1/PD-L2 a modo de ejemplo.
La Figura 15 muestra un esquema de un sistema a modo de ejemplo para evaluar inhibidores de receptor de punto de control inmunitario CTLA-4 y su ligando, CD80/CD86.
La Figura 16 muestra un gráfico que representa la activación dependiente de la concentración de la expresión del indicador mediante un anticuerpo anti-CTLA-4 en un ensayo de bloqueo de CTLA-4 a modo de ejemplo.
La Figura 17 muestra un esquema de un sistema a modo de ejemplo para evaluar inhibidores de receptor TIGIT de punto de control inmunitario y su ligando, CD155.
La Figura 18 muestra un gráfico que representa la activación dependiente de la concentración de la expresión del indicador mediante un anticuerpo anti-TIGIT en un ensayo de bloqueo de TIGIT/CD155 a modo de ejemplo usando células efectoras TIGIT en linfocitos T Jurkat.
La Figura 19 muestra un esquema de un sistema a modo de ejemplo para evaluar inhibidores de receptor TIGIT de punto de control inmunitario y su ligando, CD155.
La Figura 20 muestra un gráfico que representa la activación dependiente de la concentración de la expresión del indicador mediante un anticuerpo anti-TIGIT en un ensayo de bloqueo de TIGIT/CD155 a modo de ejemplo usando células efectoras TIGIT en linfocitos T CEM.
La Figura 21 muestra un esquema de un sistema a modo de ejemplo para evaluar inhibidores de receptor PD-1 de punto de control inmunitario y su ligando PD-L1.
La Figura 22 muestra un gráfico que representa la producción de IL-2 dependiente de la concentración mediante un anticuerpo anti-PD-1 en un ensayo de bloqueo de PD-1/PD-L1 a modo de ejemplo.
La Figura 23 muestra un esquema de un sistema a modo de ejemplo para evaluar inhibidores de receptor LAG-3 de punto de control inmunitario y su ligando, MHC II.
La Figura 24 muestra gráficos que representan la activación dependiente de la concentración de la expresión del indicador mediante un anticuerpo anti-LAG-3 en un ensayo de bloqueo de LAG-3 a modo de ejemplo.
La Figura 25 muestra un esquema de un sistema a modo de ejemplo para evaluar inhibidores de receptores TIGIT y PD-1 de punto de control inmunitario y sus ligandos, CD155 y PD-L1, respectivamente. Se expone una aAPC que muestra PD-L1 y CD155 y dominio de Fab de anticuerpo anti-CD3 sobre su membrana celular que
interactúa con un linfocito T Jurkat que muestra PD-1, receptor CD226 coestimulador, TIGIT, el complejo de TCR, y que comprende constructo de indicador de luciferasa dependiente de promotor de IL2. Tras la interacción de la aAPC y la célula efectora Jurkat, el Ac. anti-CD3 activa al complejo de TCR y CD155 coestimula CD226. Estos conducen a la activación de promotor de IL-2 que dirige la expresión de luciferasa; sin embargo, la interacción de PD-1 con PD-L1 conduce a La reducción de la activación de la vía de TCR la reducción de la expresión de indicador dependiente de promotor de IL-2. Además, CD155 tiene mayor afinidad de unión con TIGIT que con CD226. Por lo tanto, TIGIT inhibe la interacción de CD155 con CD226 y conduce a la reducción de la expresión de indicador. En presencia de un inhibidor de la interacción de PD-1/PD-L1 y/o TIGIT/CD155, la expresión del indicador de luciferasa del promotor de IL-2 se mejora, y la señal de luciferasa se eleva.
La Figura 26a-b muestra gráficos que representan la activación dependiente de la concentración de la expresión del indicador mediante (a) un anticuerpo anti-PD-1 y (b) un anticuerpo anti-TIGIT en un ensayo de bloqueo de PD-1/TIGIT a modo de ejemplo usando células efectoras de PD-1/TIGIT en linfocitos T Jurkat y aAPC PD-L1/CD155/células CHO-K1. La Figura 26c muestra los efectos de una combinación de anticuerpos anti-PD-1 y anti-TIGIT comparados con cualquiera de los anticuerpos solos.
DEFINICIONES
Como se usa en el presente documento, la expresión "receptor de punto de control inmunitario" ("ICR") se refiere a una proteína de receptor de superficie en una célula inmunitaria (por ejemplo, linfocito T, células Jurkat, etc.) que modula la actividad inmunitaria de la célula cuando está unida a su ligando. En el presente documento son de interés particular los "receptores de punto de control inmunitario inhibidores" que inhiben la actividad inmunitaria celular tras la unión del ligando al receptor. Algunos ejemplos de "receptores de punto de control inmunitario inhibidores" incluyen, pero no se limitan a, PD-1, CTLA-4, La G-3, TIM-3, CD160, TIGIT, receptor de IL-10, y BTLA.
Como se usa en el presente documento, la expresión "ligando de punto de control inmunitario" ("ICL") se refiere a un ligando de un receptor de punto de control inmunitario. Los "ligandos de punto de control inmunitario" son comúnmente proteínas mostradas en la superficie sobre células presentadoras de antígeno (APC). Mediante una interacción con un receptor de punto de control inmunitario mostrado por células inmunitarias, un "ligando de punto de control inmunitario" modula la respuesta inmunitaria de la célula inmunitaria (por ejemplo, linfocito T) a la célula presentadora de antígeno. Algunos ejemplos de "ligandos de punto de control inmunitario" que se unen a receptores de punto de control inmunitario inhibidores incluyen, pero no se limitan a, PD-L1, PD-L2, B7-H4, CD155, galectina-9, HVEM, etc.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "punto de control inmunitario", "vía del punto de control" y "vía del punto de control inmunitario" se refieren a una vía mediante la cual la unión de un ligando de punto de control inmunitario a un receptor de punto de control inmunitario modula la amplitud y calidad de la activación de las células inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T, células Jurkat, HuT-78, CEM, Molt-4, etc.).
Como se usa en el presente documento, la expresión "bloqueo de punto de control inmunitario" se refiere a la inhibición de una vía de punto de control inmunitario mediante la administración o expresión de un "agente de bloqueo". Generalmente, el "agente de bloqueo" previene la interacción del receptor de punto de control inmunitario y el ligando, inhibiendo de ese modo la vía de punto de control. Un agente de bloqueo puede ser una molécula pequeña, péptido, anticuerpo o fragmento del mismo, etc., que se une a un ligando de punto de control inmunitario o receptor de punto de control inmunitario e inhibe la formación del complejo ICR/ICL. Un agente de bloqueo también puede funcionar previniendo la señalización mediante el complejo ICR/ICL.
Como se usa en el presente documento, el término "artificial," como en "célula presentadora de antígeno artificial" o "célula efectora artificial", se refiere a una entidad (por ejemplo, célula, constructo, etc.) que no se produce en la naturaleza. Por ejemplo, una célula genomanipulada para expresar un gen exógeno (por ejemplo, un constructo de indicador) que no es intrínseco al precursor (por ejemplo, una célula no genomanipulada) es "artificial".
Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a una proteína que tiene uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como la miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Se sabe que la unidad estructural básica de la inmunoglobulina (anticuerpo) comprende un tetrámero. Cada tetrámero está formado por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50-70 kD). El extremo N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos, responsable principalmente del reconocimiento de antígeno. Las expresiones cadena ligera variable (Vl) y cadena pesada variable (Vh) se refieren a estas cadenas ligera y pesada respectivamente.
En el presente documento el término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales humanos, no humanos (por ejemplo, murinos) y humanizados (incluyendo anticuerpos
monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos monocatenarios y fragmentos de anticuerpo siempre que muestren la actividad biológica deseada. Los anticuerpos pueden existir como inmunoglobulinas intactas, o como modificaciones en una variedad de formas que incluyen, por ejemplo, FabFc2, Fab, Fv, Fd, (FabN)2, un fragmento de Fv que contiene solo las regiones variables de cadena ligera y pesada, un Fab o fragmento (Fab)N2 que contiene las regiones variables y partes de las regiones constantes, un anticuerpo monocatenario, por ejemplo, scFv, anticuerpos injertados con CDR y similares. Las cadenas pesada y ligera de un Fv se pueden derivar del mismo anticuerpo o de diferentes anticuerpos produciendo de ese modo una región de Fv quimérica. El anticuerpo puede ser de origen animal (especialmente ratón o rata) o humano o puede ser quimérico o humanizado. Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" incluye estas diversas formas.
En el presente documento el término "indicador" se usa en el sentido más amplio para describir una entidad molecular, una característica y/o propiedad que (por ejemplo, concentración, cantidad, expresión, actividad, localización, interacciones (por ejemplo, interacciones proteína-proteína), etc.) se pueden detectar y correlacionar con una característica y/o propiedad de un sistema que contiene el indicador (por ejemplo, célula, lisado celular, sistema in vitro, organismo, sistema in vivo, etc.). Un "indicador" puede ser un elemento intrínseco (por ejemplo, endógeno) del sistema que exhibe una o más propiedades detectables y correlacionables, o un elemento artificial (por ejemplo, exógeno) genomanipulado o introducido en el sistema, que exhibe una característica detectable relacionada con el proceso (por ejemplo, expresión génica) o componente dentro del sistema. Algunos indicadores adecuados incluyen, pero no se limitan a: genes o proteínas intrínsecos (por ejemplo, expresión, concentración, actividad o interacciones proteína-proteína que se pueden correlacionar con el sistema (por ejemplo, procesos celulares)), genes exógenos o proteínas ( por ejemplo, expresión, concentración, actividad o interacciones proteínaproteína que se pueden correlacionar con sistema (por ejemplo, procesos celulares), luciferasas, beta lactamasas, CAT, SEAP, proteínas fluorescentes, etc.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
En el presente documento se describen composiciones, sistemas y métodos para evaluar moduladores de puntos de control inmunitario. En particular, se proporcionan células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC) y células efectoras inmunitarias para evaluar la potencia de los agentes de ensayo (por ejemplo, anticuerpos) para inhibir los puntos de control inmunitario.
En algunas opciones, en el presente documento se describen composiciones que comprenden una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que comprende (por ejemplo, que muestra sobre su superficie): (1) un activador de TCR y (2) un ligando de punto de control inmunitario (ICL).
Una célula presentadora de antígeno (APC), o célula auxiliar, es una célula que procesa y presenta antígenos extraños que forman complejos con complejos principales de histocompatibilidad (m Hc ) sobre su superficie, en un proceso que se conoce como presentación de antígeno. Los linfocitos T pueden reconocer estos complejos usando sus receptores de linfocitos T (TCR) y/o complejos de receptores de linfocitos T. Las células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC) se derivan generalmente de células humanas o xenogénicas primarias o transformadas que se genomanipulan (por ejemplo, usando transducción retroviral o lentiviral) para introducir moléculas que proporcionan las propiedades coestimuladoras y de adhesión necesarias para la formación de la sinapsis inmunitaria. Esta estrategia permite un control estricto del suministro de muchas señales positivas y negativas a los linfocitos T durante la interacción con la aAPC (véase, por ejemplo, Turtle et al. (Cancer J. julio-agosto de 2010; 16(4): 374-81) para revisión de las aAPC en inmunoterapia).
En algunas opciones, se proporcionan aAPC que expresan y/o muestran sobre su superficie un activador de TCR. En algunas opciones, la interacción de un activador de TCR con TCR da como resultado la activación de vías dependientes de TCR y una expresión génica mejorada de promotores corriente abajo de TCR (por ejemplo, expresión dependiente de NFAT). En algunas opciones, se proporcionan aAPC que expresan anticuerpo anti-CD3 (por ejemplo, anticuerpo completo, dominio Fab, etc.). En algunas opciones, se proporcionan aAPC que muestran anticuerpo anti-CD3 (por ejemplo, anticuerpo completo, dominio Fab, etc.), sobre su superficie. Se ha demostrado que los linfocitos T en reposo se activan mediante anticuerpos anti-CD3 (Tsoukas et al., J Immunol. Septiembre de 1985; 135(3): 171).
En algunas opciones, las aAPC que expresan anti-CD3 activan los linfocitos T (por ejemplo, células Jurkat) mediante la unión de anti-CD3 a CD3 mostrado en la superficie dentro del complejo de TCR de los linfocitos T (por ejemplo, células Jurkat). En algunas opciones, la unión de anti-CD3 al complejo de TCR da como resultado una serie de eventos bioquímicos, corriente abajo, mediados por enzimas asociadas, correceptores, moléculas adaptadoras especializadas y factores de transcripción activados o liberados. Por ejemplo, la unión de anti-CD3 al TCR da como resultado la activación de proteínas NfAT (por ejemplo, NFATc1, NFATc2, NFATc3, NFATc4, NFAT5) y un aumento de la expresión génica de promotores de NFAt (por ejemplo, promotores que se unen a NFAT dando como resultado una transcripción mejorada). En algunas opciones, la expresión de un indicador unido a promotor de NFAT (por ejemplo, luciferasa) proporciona una medida cuantitativa de la activación de linfocitos T y bloqueo de punto de control inmunitario. En algunas opciones, otros eventos cadena abajo desencadenados por la unión de anti-CD3 al
TCR proporcionan marcadores adecuados de la activación de linfocitos T (o se pueden manipular para proporcionar marcadores igualmente adecuados). Otros ejemplos de activadores de linfocitos T (por ejemplo, activadores de TCR) incluyen superantígenos, anticuerpos anti-TCR, anticuerpos anti-CD2, anticuerpos anti-CD4, PHA, MHC y péptidos afines, y Con A, cualquiera de los cuales se puede expresar en las aAPC y/o superficie mostrada sobre las mismas para activar células efectoras.
En algunas opciones, se proporcionan aAPC que expresan un ICL (por ejemplo, para uso en sistemas que comprenden células efectoras que muestran ICR). En algunas opciones, se proporcionan aAPC que muestran ICL sobre su superficie que incluyen, pero no se limitan a, PD-L1, PD-L2, B7-H4, CD155, galectina-9, HVEM, etc. En algunas opciones, las aAPC expresan y/o presentan un péptido/polipéptido con al menos un 50 % de identidad de secuencia (por ejemplo, >50 %, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, >95 %, o superior) con todo o una parte de ICL, y retienen al menos un 50 % (por ejemplo, >50 %, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, >95 %, o superior) de la afinidad de ICL hacia ICR. En algunas opciones, se proporcionan aAPC que muestran o expresan un péptido/polipéptido que tiene al menos un 50 % (por ejemplo, >50 %, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, >95 %, o superior) de la afinidad de ICL hacia ICR.
En algunas opciones, se proporcionan aAPC que expresan PD-L1 (por ejemplo, para uso en sistemas que comprenden células efectoras que muestran PD-1). En algunas opciones, se proporcionan aAPC que muestran PD-L1 sobre su superficie. En algunas opciones, las aAPC expresan y/o muestran un péptido/polipéptido con al menos un 50 % de identidad de secuencia (por ejemplo, >50 %, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, >95 %, o superior) con todo o una parte de ICL, y retienen al menos un 50 % (por ejemplo, >50 %, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, >95 %, o superior) de la afinidad de PD-L1. En algunas opciones, proporcionan aAPC que muestran o expresan un péptido/polipéptido que tiene al menos un 50 % (por ejemplo, >50 %, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, >95 %, o superior) de la afinidad de PD-L1 hacia PD-1.
En algunas opciones, en el presente documento se describen sistemas que comprenden: (a) una célula presentadora de antígeno artificial que comprende (por ejemplo, que muestra sobre su superficie): (i) un activador de receptor de linfocitos T (TCR), y (ii) un ligando de punto de control inmunitario (ICL) (por ejemplo, cualquiera de las aAPC descritas anteriormente); y (b) una célula efectora artificial que comprende un receptor de punto de control inmunitario (ICR) (por ejemplo, mostrado sobre su superficie) y que comprende: (i) un complejo de TCR y (ii) un indicador (por ejemplo, indicador de uno o más de: (A) formación del complejo ICR/ICL, (B) activación de TCR, y/o (C) el indicador dependiente de la vía de activación de TCR de la vía de señalización de TCR).
En ciertas opciones, se proporcionan sistemas que comprenden una aAPC (por ejemplo, como se ha descrito en la Sección I mencionada anteriormente o en cualquier parte en el presente documento) y una célula efectora (por ejemplo, célula efectora artificial). Una célula efectora es un linfocito (por ejemplo, linfocito T, célula Jurkat, etc.), que se ha inducido para diferenciarse en una forma capaz de aumentar una respuesta inmunitaria específica. En algunas opciones, se proporcionan células efectoras que expresan y/o muestran proteínas de superficie y/o complejos de proteínas de superficie útiles en los ensayos de bloqueo que se describen en el presente documento (por ejemplo, un elemento sensible a antígeno (por ejemplo, TCR), ICR (por ejemplo, PD-1), etc.). En algunas opciones, una célula efectora útil en las opciones que se describen en el presente documento se ha genomanipulado para expresar un indicador de activación de célula efectora. En algunas opciones, una o más vías implicadas en la activación de linfocitos T activan el indicador y/o expresión del indicador, señalizando de ese modo de forma detectable el bloqueo del punto de control inmunitario y la activación de linfocitos T.
En algunas opciones, una célula efectora muestra numerosos marcadores indicativos de un linfocito T (por ejemplo, linfocito T humano, célula Jurkat, etc.). Por ejemplo, una célula efectora puede mostrar uno o más de: el complejo receptor de linfocitos T y/o componentes del mismo (por ejemplo, CD3, TCRa, TCRp, TCRy, TCRó, etc.), CD4, CD8, CD28, CTLA-4, CD40L, CD2, LFA-1, etc.
La activación de los linfocitos T ocurre mediante la participación simultánea del receptor de linfocitos T y una molécula coestimuladora en el linfocito T mediante el péptido del complejo principal de histocompatibilidad (MHCII) y moléculas coestimuladoras en una célula presentadora de antígeno (APC). Una vez acopladas correctamente mediante la APC, se inician vías de señalización corriente abajo para activar el linfocito T. Por ejemplo, las moléculas coestimuladoras se acoplan a la vía de la fosfoinosítido 3-quinasa (PI3K), generando fosfatidilinositol (3,4,5)-trifosfato (PIP3) en la membrana plasmática y reclutando moléculas de señalización que contienen el dominio PH (por ejemplo, piruvato deshidrogenasa lipoamida quinasa isoenzima 1 (PDK1)) que son esenciales para la activación de PKC0 y la producción final de IL-2. Un conjunto no limitativo de efectos corriente abajo de la activación incluye: fosforilación de CD28, LAT y SLP-76, que permite la agregación de complejos de señalización alrededor de estas proteínas; reclutamiento de s LP-76 a la membrana, donde a continuación puede atraer a PLC-y, VAV1, Itk y potencialmente PI3K; activación de factores de transcripción, tales como NF-kB y AP-1; activación de receptores de calcio en el retículo endoplásmico (ER); liberación de calcio del ER en el citosol, lo que causa el agrupamiento de STIM1 en la membrana del ER y conduce a la activación de canales CRAC de la membrana celular que permiten que fluya calcio adicional en el citosol desde el espacio extracelular; unión de calmodulina por calcio citosólico agregado, que a continuación activa la calcineurina; activación de calcineurina de factor nuclear de linfocitos T activados (NFAT), translocación de NFAT al núcleo; activación de NFAT de la transcripción de un conjunto de genes
pleiotrópicos, más en particular, IL-2, interferones, factor de necrosis tumoral, IL-17, IL-10, IL-4, IL-13, IL-23, IL-1, factor de crecimiento transformante beta, IL-8 y otras quimioquinas, y muchas otras vías. En algunas opciones, cualquiera de estos efectos corriente abajo puede encontrar uso como marcador de bloqueo de un punto de control inmunitario (por ejemplo, al parecerse al efecto corriente abajo con respecto a un indicador detectable).
En algunas opciones, se proporcionan sistemas y métodos para evaluar la potencia de los agentes de bloqueo (por ejemplo, anticuerpos) para inhibir las vías de punto de control inmunitario. Algunos sistemas a modo de ejemplo comprenden: (1) una célula efectora artificial (por ejemplo, linfocito T (por ejemplo, célula Jurkat, etc.), etc.) que muestra un elemento sensible a antígeno (por ejemplo, complejo de receptor de linfocitos T (TCR)) y un receptor de punto de control inmunitario (ICR) sobre su superficie (por ejemplo, PD-1) y que comprende un indicador; (2) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra sobre su superficie un activador del elemento sensible a antígeno de la célula efectora (por ejemplo, anticuerpo anti-CD3 o un fragmento del mismo) y un ligando de punto de control inmunitario (ICL) que corresponde al ICR de la célula efectora (por ejemplo, PD-L1); y (3) un agente de bloqueo de ensayo (por ejemplo, anticuerpo para el ICL o ICR). En algunas opciones, en ausencia del agente de bloqueo (o en el caso de que el agente de bloqueo de ensayo no sea eficaz), el ICR y el ICL interactúan y modulan (por ejemplo, inhiben o mejoran) la señal del constructo de indicador. Sin embargo, en presencia de un agente de bloqueo potente, la interacción del ICR y el ICL se inhibe y la modulación de la señal del indicador por parte del ICR/ICL se inhibe.
En algunas opciones, se proporcionan sistemas y métodos para evaluar la potencia de los agentes de bloqueo (por ejemplo, anticuerpos) para bloquear las vías de punto de control inmunitario inhibidor. Algunos sistemas a modo de ejemplo comprenden: (1) una célula efectora artificial (por ejemplo, linfocito T genomanipulado (por ejemplo, célula Jurkat, etc.), etc.) que muestra un elemento sensible a antígeno (por ejemplo, complejo de receptor de linfocitos T (TCR)) y un receptor de punto de control inmunitario (ICR) sobre su superficie y que comprende un constructo de indicador, cuya expresión depende de la activación del elemento sensible a antígeno; (2) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra sobre su superficie un activador del elemento sensible a antígeno de la célula efectora y un ligando de punto de control inmunitario (ICL) que corresponde al ICR de la célula efectora; y (3) un agente de bloqueo de ensayo (por ejemplo, anticuerpo para el ICL o ICR). En algunas opciones, la activación del elemento sensible a antígeno por interacción con el activador del elemento sensible a antígeno da como resultado una señal (o ausencia de señal) del indicador. En algunas opciones, en ausencia del agente de bloqueo (o en el caso de que el agente de bloqueo de ensayo no sea eficaz), el ICR y el ICL interactúan y modulan la señal del indicador. En presencia de un agente de bloqueo potente, la interacción del ICR y el ICL se inhibe, la modulación la modulación de la señal del indicador por parte del ICR/ICL se bloquea, y la señal del indicador tiende hacia la señal en ausencia de un ICR/ICL. En algunas opciones, cuando se cocultivan células efectoras y las aAPC, se produce un primer nivel de señal del indicador (por ejemplo, porque el complejo ICR/ICL modula la señal del indicador); sin embargo, la adición de un agente de bloqueo potente da como resultado un segundo nivel de señal del indicador (por ejemplo, porque se inhibe la formación de ICR/ICL, y, por lo tanto, la modulación de la señal del indicador por el complejo ICR/ICL se reduce).
En algunas opciones, se proporcionan sistemas y métodos para evaluar la potencia de los agentes de bloqueo (por ejemplo, anticuerpos) en la inhibición de vías de punto de control inmunitario. Algunos sistemas a modo de ejemplo comprenden: (1) una célula efectora (por ejemplo, linfocito T (por ejemplo, célula Jurkat, etc.), etc.) que muestra complejo de receptor de linfocitos T (TCR) y un receptor de punto de control inmunitario (ICR) sobre su superficie y que expresa un indicador dependiente de promotor de NFAT (por ejemplo, luciferasa); (2) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra anticuerpo anti-CD3 (o un fragmento del mismo) y un ligando de punto de control inmunitario (ICL) que corresponde al ICR de la célula efectora; y (3) un agente de bloqueo de ensayo (por ejemplo, anticuerpo para el ICL o iCr ). En algunas opciones, en ausencia del agente de bloqueo (o en el caso de que el agente de bloqueo de ensayo no sea eficaz), el ICR y el ICL interactúan e inhiben la activación del promotor de NFAT por el complejo de TCR unido a anticuerpo CD3, inhibiendo de ese modo la expresión del indicador. Sin embargo, en presencia de un agente de bloqueo potente, la interacción del ICR y el ICL se inhibe, el promotor de NFAT se activa, y el indicador se expresa. En algunas opciones, cuando se cocultivan células efectoras y las aAPC, se produce poca o ninguna señal del indicador (por ejemplo, porque el complejo ICR/ICL inhibe la expresión del indicador); sin embargo, la adición de un agente de bloqueo potente da como resultado un aumento de la expresión del promotor de NFAT y una amplificación de señal del indicador.
En algunas opciones, se proporcionan sistemas y métodos para evaluar la potencia de los agentes de bloqueo (por ejemplo, anticuerpos) para inhibir la vía de punto de control inmunitario de PD-1/PD-L1. Algunos sistemas a modo de ejemplo comprenden: (1) una célula Jurkat que muestra complejo de receptor de linfocitos T (TCR) y PD-1 sobre su superficie y que expresa un indicador de luciferasa inducido por el promotor de NFAT (por ejemplo, luc2); (2) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra anticuerpo anti-CD3 y PD-L1 sobre su superficie; y (3) un agente de bloqueo de ensayo (por ejemplo, anticuerpo frente a PD-1 o PD-L1). En algunas opciones, en ausencia del agente de bloqueo (o en el caso de que el agente de bloqueo de ensayo no sea eficaz), el PD-1 y el PD-L1 interactúan e inhiben la activación del promotor de NFAT por el complejo de TCR unido a anticuerpo anti-CD3; por lo tanto, la expresión de luciferasa se inhibe, y la señal del indicador disminuye. En presencia de un agente de bloqueo potente, se inhibe la interacción de PD-1 y PD-L1, el promotor de NFAT se activa, la expresión de luciferasa se mejora, y la señal del indicador aumenta. En algunas opciones, cuando se cocultivan células efectoras Jurkat y las
aAPC, se expresa poca o ninguna luciferasa, y se genera poca o ninguna señal (por ejemplo, porque el complejo PD-1/PD-L1 inhibe la expresión del indicador); sin embargo, la adición de un agente de bloqueo potente da como resultado un aumento de la expresión de luciferasa y una amplificación de señal del sistema.
En algunas opciones, se proporcionan sistemas y métodos para evaluar la potencia de los agentes de bloqueo (por ejemplo, anticuerpos) para inhibir la vía de punto de control inmunitario de PD-1/PD-L2. Algunos sistemas a modo de ejemplo comprenden: (1) una célula Jurkat que muestra complejo de receptor de linfocitos T (TCR) y PD-1 sobre su superficie y que expresa un indicador de luciferasa inducido por el promotor de NFAT (por ejemplo, luc2); (2) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra anticuerpo anti-CD3 y PD-L2 sobre su superficie; y (3) un agente de bloqueo de ensayo (por ejemplo, anticuerpo frente a PD-1 o PD-L2). En algunas opciones, en ausencia del agente de bloqueo (o en el caso de que el agente de bloqueo de ensayo no sea eficaz), el de PD-1 y el PD-L2 interactúan e inhiben la activación del promotor de NFAT por el complejo de TCR unido a anticuerpo anti-CD3; por lo tanto, la expresión de luciferasa se inhibe, y la señal del indicador disminuye. En presencia de un agente de bloqueo potente, la interacción del PD-1 y PD-L2 se inhibe, el promotor de NFAT se activa, la expresión de luciferasa se mejora, y la señal del indicador aumenta. En algunas opciones, cuando se cocultivan células efectoras Jurkat y las aAPC, se expresa poca o ninguna luciferasa, y se genera poca o ninguna señal (por ejemplo, porque el complejo PD-1/PD-L2 inhibe la expresión del indicador); sin embargo, la adición de un agente de bloqueo potente da como resultado un aumento de la expresión de luciferasa y una amplificación de señal del sistema.
En algunas opciones, se proporcionan sistemas y métodos para evaluar la potencia de los agentes de bloqueo (por ejemplo, anticuerpos) para inhibir una vía de punto de control inmunitario dependiente de la interacción de CD80/CD86 y cT-LA-4. Algunos sistemas a modo de ejemplo comprenden: (1) una célula Jurkat que muestra receptor coestimulador CD28, CTLA-4, el complejo de TCR, y que comprende un constructo indicador de luciferasa dependiente del promotor de IL-2; (2) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra CD80/CD86 y dominio de Fab de anticuerpo anti-CD3 sobre su membrana celular; y (3) un agente de bloqueo de ensayo (por ejemplo, anticuerpo frente a CTLA-4 o CD80/CD86). Tras la interacción de la aAPC y la célula efectora Jurkat, el Ac. anti-CD3 activa el complejo de TCR y CD80/CD86 coestimula a CD28. Esto conduce a la activación del promotor de IL-2, que impulsa la expresión de luciferasa; sin embargo, CTLA-4 tiene mayor afinidad de unión con CD80/CD86 que su afinidad de unión con CD28. Inhibe la interacción de CD80/CD86 con CD28, y la expresión de luciferasa del promotor de IL-2. En presencia de un inhibidor de CTLA-4 con interacción de CD80/CD86, el CD28 activado activa la expresión del indicador de luciferasa del promotor de IL-2, y la señal de luciferasa se eleva.
En algunas opciones, se proporcionan sistemas y métodos para evaluar la potencia de los agentes de bloqueo (por ejemplo, anticuerpos) para inhibir la vía de punto de control inmunitario de TIGIT/CD155. Algunos sistemas a modo de ejemplo comprenden: (1) un linfocito T Jurkat que muestra receptor coestimulador CD226, TIGIT, el complejo de TCR, y que comprende un constructo de indicador de luciferasa dependiente de promotor de IL-2; (2) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra CD155 y dominio de Fab de anticuerpo anti-CD3 sobre su membrana celular; y (3) un agente de bloqueo de ensayo (por ejemplo, anticuerpo frente a TIGIT o CD155). Tras la interacción de la aAPC y la célula efectora Jurkat, el Ac. anti-CD3 activa el complejo de TCR y CD155 coestimula a CD226. Estos conducen a la activación del promotor de IL-2 que impulsa la expresión de luciferasa; sin embargo, CD155 tiene mayor afinidad de unión con TIGIT que con CD226. Por lo tanto, TIGIT inhibe la interacción de CD155 con CD226 y la activación de la expresión de luciferasa del promotor de IL-2. En presencia de un inhibidor de la interacción TIGIT/CD155, el CD226 activado activa la expresión del indicador de luciferasa del promotor de IL-2, y la señal de luciferasa se eleva.
En algunas opciones, se proporcionan sistemas y métodos para evaluar la potencia de los agentes de bloqueo (por ejemplo, anticuerpos) para inhibir la vía de punto de control inmunitario de TIGIT/CD155. Algunos sistemas a modo de ejemplo comprenden: (1) un linfocito T CEM que muestra receptor coestimulador CD226, TIGIT, el complejo de TCR, y que comprende un constructo de indicador de luciferasa dependiente de promotor de IL-2 (por ejemplo, célula efectora CEM artificial); (2) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra CD155 y dominio de Fab de anticuerpo anti-CD3 sobre su membrana celular; y (3) un agente de bloqueo de ensayo (por ejemplo, anticuerpo frente a TIGIT o CD155). Tras la interacción de la aAPC y la célula efectora CEM, el Ac. anti-CD3 activa el complejo de TCR y CD155 coestimula a CD226. Ambos conducen a la activación del promotor de IL-2 que impulsa la expresión de luciferasa; sin embargo, CD155 tiene mayor afinidad de unión con TIGIT que con CD226. Por lo tanto, TIGIT inhibe la interacción de CD155 con CD226 y la activación de la expresión de luciferasa del promotor de IL-2. En presencia de un inhibidor de la interacción TIGIT/CD155, el CD226 activado activa la expresión del indicador de luciferasa del promotor de IL-2, y la señal de luciferasa se eleva.
En algunas opciones, se proporcionan sistemas y métodos para evaluar la potencia de los agentes de bloqueo (por ejemplo, anticuerpos) para inhibir la vía de punto de control inmunitario de PD-1/PD-L1. Algunos sistemas a modo de ejemplo comprenden: (1) un linfocito T Jurkat que muestra PD-1, el complejo de TCR, y un gen de IL-2 endógeno impulsado por el promotor de IL-2 nativo; (2) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra PD-L1 y dominio de Fab de anticuerpo anti-CD3 sobre su membrana celular; y (3) un agente de bloqueo de ensayo (por ejemplo, anticuerpo frente a PD-1 o PD-L1). Tras la interacción de la aAPC y la célula efectora Jurkat, el Ac. anti-CD3 activa el complejo de TCR, activa el promotor de IL-2, y aumenta la producción de IL-2; sin embargo, la interacción de PD-1 y PD-L1 inhibe la activación de la expresión de IL-2 del promotor de IL-2, y se produce poca
producción de proteínas de IL-2. En presencia de un inhibidor de la interacción PD-1/PD-L1, el complejo de TCR activado activa la expresión de IL-2 del promotor de IL-2, y la producción de IL-2 en el medio se eleva.
En algunas opciones, se proporcionan sistemas y métodos para evaluar la potencia de los agentes de bloqueo (por ejemplo, anticuerpos) para inhibir la vía de punto de control inmunitario de LAG-3/MHC II. Algunos sistemas a modo de ejemplo comprenden: (1) un linfocito T Jurkat que muestra LAG-3, el complejo de TCR, y que comprende constructo de indicador de luciferasa dependiente de promotor de NFAT; (2) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) en un linfocito B Raji que muestra MHC II sobre su membrana celular; y (3) un agente de bloqueo de ensayo (por ejemplo, anticuerpo frente a LAG-3 o MHC II). Tras la interacción de la aAPC y la célula efectora Jurkat, el superantígeno presentado por MHC II activa el complejo de TCR y la activación del promotor de NFAT que impulsa la expresión de luciferasa; sin embargo, LAG-3 que se une con MHC II inhibe la activación de TCR. Esto conduce a la inactivación de la expresión de luciferasa del promotor de NFAT. En presencia de un inhibidor de la interacción de LAG-3/MHC II, el t Cr activado activa la expresión del indicador de luciferasa del promotor de NFAT, y la señal de luciferasa se eleva.
En algunas opciones, los sistemas comprenden cualquier combinación adecuada de las aAPC, células efectoras, ICL, ICR, promotores, indicadores, tipos celulares, etc., descritos en el presente documento.
En algunas opciones, los sistemas y métodos descritos en el presente documento hacen uso de la activación de la transcripción de la vía de activación de TCR, corriente abajo del acoplamiento adecuado del TCR por una APC (por ejemplo, anticuerpo anti-CD3 que se une al complejo de TCR). En algunas opciones, se proporcionan células efectoras (por ejemplo, genomanipuladas) con un constructo de indicador que señala la activación de las células. En algunas opciones, se proporciona un constructo con un gen indicador (por ejemplo, luciferasa) bajo el control de una vía de activación de TCR. Tras la activación de las vías de activación del linfocito T, se produce el aumento de la expresión del indicador (por ejemplo, luciferasa) y la activación celular se puede detectar y/o cuantificar en función de la señal del indicador. Como se indicó anteriormente, se ha demostrado experimentalmente que los linfocitos T en reposo se pueden activar mediante anticuerpos anti-CD3 (Tsoukas et al., J Immunol. Septiembre de 1985; 135(3): 1719-23).
En el presente documento se describen opciones que no se limitan a la activación por anti-CD3. En algunas opciones, otras señales estimuladoras de linfocitos T (por ejemplo, mostradas sobre las aAPC) se usan para activar los linfocitos T, que se detecta mediante un indicador dependiente de la vía de activación de TCR. Cuando las células efectoras que comprenden indicadores dependientes de la vía de activación de TCR se ponen en contacto con las aAPC que muestran anticuerpos anti-CD3 (o fragmentos de los mismos), las vías de activación del linfocito T se activan y la señal del indicador aumenta. Sin embargo, tras la formación de un complejo inhibidor ICR/ICL (por ejemplo, entre un ICR sobre la célula efectora y un ICL sobre la aAPC), la activación del linfocito T por el TCR correctamente acoplado se inhibe y la transcripción del indicador de la activación de la vía de TCR se reduce. El bloqueo del complejo ICR/ICL por un agente de bloqueo, restablece la activación de TCR del linfocito T y aumenta la transcripción del indicador de la vía de activación de TCR.
En algunas opciones, un constructo indicador dependiente de la vía de activación de TCR comprende: (1) un elemento de respuesta o promotor de la vía de activación de TCR, y (2) un ácido nucleico que codifica péptido, polipéptido o proteína indicadores detectables. En algunas opciones, las células efectoras (por ejemplo, células Jurkat) se transfectan de forma estable con un constructo indicador dependiente de la vía de activación de TCR. La transfección se lleva a cabo mediante métodos bien conocidos en la técnica; algunos métodos adecuados incluyen transfección basada en agentes químicos, transfección no química, transfección basada en partículas, transfección basada en virus, electroporación y tecnología de edición génica para monitorizar la actividad del promotor endógeno u otros métodos de transfección conocidos.
Un promotor de NFAT es una secuencia de ácidos nucleicos que contiene uno o más elementos de respuesta a NfAt . Cuando se une a un factor de transcripción de NFAT (por ejemplo, NFATc1, NFATc2, NFATc3, NFATc4 o NFAT5), se mejora la transcripción de las secuencias de ácidos nucleicos asociadas (por ejemplo, genes corriente abajo). Un elemento de respuesta a NFAT adecuado es:
GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT (SEQ ID NO: 1).
En algunas opciones, un promotor de NFAT comprende repeticiones de la SEQ ID NO: 1. En algunas opciones, un promotor de NFAT comprende uno o más elementos de respuesta a NFAT que tienen al menos un 50 % (por ejemplo, >50 %, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, >95 %, e intervalos de los mismos) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, en donde los elementos de respuesta a NFAT se unen a un factor de transcripción de la familia NFAT para mejorar la transcripción de genes asociados (por ejemplo, corriente abajo).
En algunas opciones, el elemento de respuesta o promotor de la activación de la vía de TCR es una secuencia promotora de IL-2, un elemento de respuesta a NFkappaB que se une a un factor de transcripción de la familia NFkappaB para mejorar la transcripción de genes asociados (por ejemplo, corriente abajo), un elemento de respuesta a AP1 se une a un factor de transcripción de la familia a P1 para mejorar la transcripción de genes asociados (por ejemplo, corriente abajo), o cualquier combinación de los elementos de respuesta mencionados
anteriormente.
En algunas opciones, el indicador del constructo indicador dependiente de la vía de activación de TCR es cualquier péptido, polipéptido o proteína que produce una señal detectable que incluye, pero no se limita a, una luciferasa, una beta lactamasa, CAT, SEAP, una proteína fluorescente, etc. En algunas opciones, el indicador es un indicador fluorescente o bioluminiscente. En ciertas opciones, un indicador bioluminiscente es una luciferasa. En algunas opciones, una luciferasa se selecciona entre las encontradas en Omphalotus olearius, luciérnagas (por ejemplo, Photinini), Renilla reniformis, mutantes de las mismas, partes de las mismas, variantes de las mismas y cualquier otra enzima luciferasa adecuada para los sistemas y métodos que se describen en el presente documento. Las opciones que se describen en el presente documento no están limitadas por la identidad potencial del indicador.
En algunas opciones, se proporcionan células efectoras que expresan PD-1 (por ejemplo, para uso en sistemas que comprenden las aAPC que muestran PD-L1). En algunas opciones, se proporcionan células efectoras que muestran PD-1 sobre su superficie. En algunas opciones, las células efectoras expresan y/o muestran un péptido/polipéptido con al menos un 50 % de identidad de secuencia (por ejemplo, >50 %, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, >95 %, o superior) con todo o una parte de PD-1, y retienen al menos un 50 % (por ejemplo, >50 %, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, >95 %, o superior) de la afinidad de PD-1 hacia PD-L1. En algunas opciones, se proporcionan células efectoras que muestran o expresan un péptido/polipéptido que tiene al menos un 50 % (por ejemplo, >50 %, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, >95 %, o superior) de la afinidad de PD-1 hacia PD-L1, y al menos un 50 % por ejemplo, >50 %, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, >95 %, o superior) de la capacidad de Pd -1 para inhibir la activación de linfocitos T tras la unión a PD-L1.
En algunas opciones, se proporcionan células efectoras que expresan CD28, CTLA-4, CD226, TIGIT, etc. En algunas opciones, las células efectoras expresan y/o muestran un péptido/polipéptido con al menos un 50 % de identidad de secuencia (por ejemplo, >50 %, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, >95 %, o superior) con todo o una parte de CD28, CTLA-4, CD226, TIGiT, etc., y retienen al menos un 50 % (por ejemplo, >50 %, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, >95 %, o superior) de la afinidad de CD28, CTLA-4, CD226, T iGiT, etc.), hacia ligandos de los mismos (por ejemplo, CD80/CD86, CD155, etc.). En algunas opciones, se proporcionan células efectoras que muestran o expresan un péptido/polipéptido que tiene al menos un 50 % (por ejemplo, >50 %, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, >95 %, o superior) de la afinidad de un receptor (por ejemplo, CD28, CTLA-4, CD226, TIGIT, etc.) hacia un ligando del mismo (por ejemplo, CD80/CD86, CD155, etc.), y al menos un 50 % (por ejemplo, >50 %, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, >95 %, o superior) de la capacidad del receptor para efectuar la activación de los linfocitos T tras la unión al ligando apropiado.
En algunas opciones, se proporcionan células efectoras que expresan y/o muestran uno o más ICR distintos a PD-1 (por ejemplo, para uso en sistemas que comprenden las aAPC que muestran los ICL distintos de PD-L1). Por ejemplo, en algunas opciones, se proporcionan células efectoras que expresan y/o muestran uno o más de CTLA-4, BTLA, etc. Las opciones que se describen en el presente documento no se limitan a los ICR enumerados. Cualquier ICR capaz de interactuar con un ICL para inhibir la actividad de una célula efectora (por ejemplo, linfocito T) puede encontrar uso en las opciones que se describen en el presente documento.
En algunas opciones, en el presente documento se describen sistemas que comprenden las aAPC y células efectoras, en donde las aAPC tienen el potencial de activar las células efectoras (por ejemplo, a través de anti-CD3 de la aAPC que se une al complejo de TCR de la célula efectora), provocando de ese modo la expresión de un indicador detectable (por ejemplo, indicador dependiente de promotor de NFAT) ; sin embargo, la interacción de un ICL (PD-L1) sobre la aAPC y un ICR (PD-1) sobre las células efectoras inhibe la activación de la célula efectora y la expresión del indicador. En algunas opciones, la exposición del sistema a un agente de bloqueo inhibe la interacción ICR/ICL, mejorando la activación de la célula efectora y aumentando la expresión del indicador. En algunas opciones, la potencia del agente de bloqueo es directamente proporcional a la expresión del indicador.
En ciertas opciones, la interacción de PD-1 y PD-L1 es lo que limita la actividad de la célula efectora y la expresión del indicador. Por lo tanto, el bloqueo de la interacción PD-1/PD-L1 activa las células efectoras y aumenta la expresión del indicador y la señal del indicador. El bloqueo de PD-1/PD-L1 se puede lograr mediante una diversidad de mecanismos que incluyen anticuerpos que se unen a PD-1 o PD-L1. Algunos ejemplos de agentes de bloqueo de PD-1 y PD-L1 se describen en los documentos de patente de Estados Unidos N.os 7.488.802; 7.943.743; 8.008.449; 8.168.757; 8.217.149, y las solicitudes de patente publicadas PCT N.os WO03042402, WO2008156712, WO2010089411, WO2010036959, WO2011066342, WO2011159877, WO2011082400, y WO2011161699.
En ciertas opciones, los agentes de bloqueo se seleccionan entre anticuerpos anti-PD-L1 y/o proteínas de unión similares tales como NIVOLUMAB (MDX 1106, BMS 936558, ONO 4538), un anticuerpo frente a IgG4 totalmente humana que se une a, y bloquea, la activación de PD-1 mediante sus ligandos PD-L1 y PD-L2; LAMBROLIZUMAB (MK-3475 o SCH 900475), un anticuerpo frente a IgG4 monoclonal humanizada frente a PD-1; CT-011 un anticuerpo humanizado que se une a PD-1; AMP-224 es una proteína de fusión de PD-L2 con una parte de Fc de anticuerpo; BMS-936559 (MDX- 1105-01) para el bloqueo de PD-L1 (B7-H1).
En algunas opciones, un agente de bloqueo de ensayo (por ejemplo, un agente (por ejemplo, anticuerpo) del que se
sospecha que inhibe la formación del complejo PD-1/PD-L1 o con un efecto desconocido en la formación del complejo ICR/ICL) se administra a un sistema descrito en el presente documento para someter a ensayo la potencia del agente de ensayo para interrumpir la interacción de ICR/ICL. Más generalmente, en el presente documento las opciones comprenden un agente de bloqueo de ensayo (por ejemplo, un agente (por ejemplo, anticuerpo) del que se sospecha que inhibe la formación del complejo ICR/ICL o con un efecto desconocido en la formación del complejo ICR/ICL) se administra a un sistema descrito en el presente documento para someter a ensayo la potencia del agente de ensayo para interrumpir la interacción de ICR/ICL.
En algunas opciones, en el presente documento se describen sistemas y métodos para el cribado de agentes de bloqueo de ensayo para la capacidad de: (1) inhibir las interacciones de ICR/ICL, (2) activar células efectoras, y/o (3) promover la transcripción de promotores de NFAT. En algunas opciones, el agente de bloqueo de ensayo es un compuesto, péptido, proteína, anticuerpo, etc., del que se sospecha que inhibe una interacción de ICR/ICL particular (por ejemplo, la interacción de PD-1 con PD-L1, PD- 1 con PD-L2, CTLA-4 con CD80/CD86, TIGIT con CD155, etc.), o que haya demostrado tal inhibición en otro ensayo. En otras opciones, un agente de bloqueo de ensayo tiene efectos desconocidos en las interacciones de ICR/ICL (por ejemplo, la interacción de PD-1 con PD-L1, PD-1 con PD-L2, CTLA-4 con CD80/CD86, TIGIT con CD155, etc.). Los agentes de bloqueo de ensayo que no se han caracterizado para su efecto en las interacciones de ICR/ICL y/o la capacidad de inducir la activación de células efectoras se pueden someter a ensayo solos o en un privado de múltiples agentes de bloqueo de ensayo (por ejemplo, un cribado de alto rendimiento) usando sistemas y métodos descritos en el presente documento.
En algunas opciones, se proporcionan sistemas y métodos para el cribado de múltiples agentes de bloqueo de ensayo de efecto desconocido o no confirmado en las interacciones de ICR/ICL (por ejemplo, la interacción de PD-1 con PD-L1, PD-1 con PD-L2, CTLA-4 con CD80/CD86, TIGIT con CD155, etc.). En algunas opciones, múltiples agentes de bloqueo de ensayo (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, o más, o intervalos entre los mismos) se introducen en un sistema de ensayo de bloqueo único descrito en el presente documento. En tales opciones, tras detectar un efecto inhibidor sobre las interacciones de ICR/ICL (por ejemplo, la interacción de PD-1 con PD-L1, PD-1 con PD-L2, CTLA-4 con CD80/CD86, TIGIT con CD155, etc.), según lo indique un aumento en la señal del indicador, los agentes de bloqueo de ensayo individuales o grupos más pequeños de los agentes se someterán a ensayo posteriormente en sistemas de ensayo de bloqueo separados (por ejemplo, en recipientes de reacción separados). En otras opciones, múltiples agentes de bloqueo de ensayo (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10.000, 20.000, 50.000, 100.000, o más, o intervalos entre los mismos) se introducen en un sistema de ensayo de bloqueo paralelo descrito en el presente documento. Tales ensayos paralelos se pueden ejecutar usando sistemas, métodos, dispositivos, robótica y otros equipos conocidos en la técnica para facilitar cribados a gran escala y/o de alto rendimiento. Por ejemplo, las aAPC y las células efectoras se cocultivan en placas de 96 o 384 pocillos, y se usa robótica para introducir de forma eficaz una colección de agentes de bloqueo de ensayo y para detectar la señal del indicador.
En algunas opciones, se proporcionan reactivos, composiciones, dispositivos, equipos, etc., (por ejemplo, junto con los componentes de ensayo que se describen en el presente documento (por ejemplo, células efectoras y las aAPC) para llevar a cabo ensayos de bloqueo. En algunas opciones, los reactivos pueden incluir medios de cultivo, suero, suplementos de nutrientes (por ejemplo, eficientes para el cocultivo de las aAPC y células efectoras), tampones, sustrato indicador (por ejemplo, luciferina, coelenteracina (o un derivado de la misma), etc.), agentes de bloqueo de control (por ejemplo, controles positivos conocidos por inhibir las interacciones de ICR/ICL (por ejemplo, la interacción de PD-1 con PD-L1, PD-1 con PD-L2, CTLA-4 con CD80/CD86, TIGIT con CD155, etc.)), etc. En algunas opciones, se proporcionan matraces y vesículas de cultivo, tubos de microcentrífuga, microplacas incluyendo placas de 96 y 384 pocillos, lectores, baño de agua, incubadora de CO2, pipetas monocanal y multicanal, etc. En algunas opciones, se proporciona robótica para ensayos de alto rendimiento (por ejemplo, distribución de reactivo, organización de muestras, detección de indicador, etc.), instrumentos para la detección de indicador (por ejemplo, fluorómetro, luminómetro, espectrómetro, Taqman, placas de ELISA etc.), etc.
En algunas opciones, se describen todos o parte de los componentes para llevar a cabo un ensayo de bloqueo en el presente documento, proporcionados como un kit. Los componentes pueden estar en contenedores separados que se empaquetan juntos o por separado por conveniencia u otras consideraciones. En algunas opciones, los reactivos (por ejemplo, las aAPC, células efectoras, etc.), se proporcionan en cantidades determinadas previamente de acuerdo con el tamaño y/o número de ensayos de bloqueo que el usuario pretende realizar. En algunas opciones, también se proporcionan accesorios (por ejemplo, recipientes, placas, etc.), instrucciones, otros reactivos (por ejemplo, tampones, controles, medios, sustrato indicador, etc.), etc. En algunas opciones, un usuario proporciona uno o más componentes necesarios para usar los componentes (por ejemplo, medios, agente o agentes de bloqueo, sustrato indicado, etc.) del kit para llevar a cabo un ensayo de bloqueo descrito en el presente documento.
En algunas opciones, se proporcionan métodos que utilizan las composiciones y sistemas descritos en el presente documento. Se proporcionan métodos que utilizan las células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC), por ejemplo: para cribar agentes de bloqueo, para desarrollar y además modificar y optimizar agentes de bloqueo, para someter a ensayo la potencia de los agentes de bloqueo, para modular la inmunidad de las células efectoras, para identificar los iCr y/o los ICL, para someter a ensayo la función inmunitaria in vitro o in vivo, etc. En algunas opciones, los métodos utilizan las aAPC en combinación con células efectoras artificiales (por ejemplo, que
comprenden receptores genomanipulados, que comprenden elementos de respuesta a antígeno genomanipulados, que comprenden constructos de indicador genomanipulados, etc.), o células efectoras naturales (por ejemplo, células efectoras de origen humano o animal que comprenden únicamente componentes intrínsecos). En algunas opciones, los métodos se realizan in vitro, in vivo, in situ, en un organismo completo (por ejemplo, modelo humano o animal), en cultivo celular, etc. En algunas opciones, los métodos descritos en el presente documento utilizan cualquiera de aAPC, célula efectora, agente de bloqueo u otros componentes descritos en relación con las composiciones y sistemas en el presente documento.
En algunas opciones, los métodos comprenden poner en contacto (por ejemplo, cocultivar): (a) una célula efectora (por ejemplo, natural o genomanipulada) que comprende un ICR, un elemento sensible a antígeno (por ejemplo, complejo de TCR), y un indicador (por ejemplo, por ejemplo, exógeno o intrínseco) con (b) una aAPC descrita en el presente documento (por ejemplo, que muestra un ICL y un activador de un elemento sensible a antígeno (por ejemplo, un activador de t Cr ). En algunas opciones, los métodos comprenden además detectar la señal de dicho indicado para cuantificar: activación de la inmunidad de la célula efectora por la aAPC, la modulación de la activación de la célula efectora mediante la formación de un complejo ICR/ICL, etc. En algunas opciones, los métodos comprenden además poner en contacto la aAPC y/o célula efectora con un agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo, y detectar la señal de dicho indicador para cuantificar el efecto del agente de bloqueo en uno o más de: activación de la inmunidad de células efectoras, formación de un complejo ICR/ICL, la modulación de la activación de células efectoras por el complejo ICR/ICL, una vía dependiente de elemento sensible a antígeno, una vía dependiente de ICR/ICL, etc.
En algunas opciones, en el presente documento se describen métodos que comprenden: (a) poner en contacto: (i) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra sobre su superficie: (A) un activador de receptor de linfocitos T (TCR) y (B) un ligando de punto de control inmunitario (ICL) con (ii) una célula efectora que comprende un complejo de TCR y que muestra sobre su superficie un receptor de punto de control inmunitario (ICR), en donde la interacción del activador de TCR con el complejo de TCR activa una vía de señalización de TCR, en donde dicho ICR y dicho ICL forman un complejo ICR/ICL tras la interacción, y en donde la formación del complejo ICR/ICL mejora o inhibe la activación de TCR y/o la vía de señalización de TCR; y (b) detectar la presencia, ausencia, y/o nivel de activación de TCR en dicha célula efectora. En algunas opciones, los métodos comprenden además: (c) poner en contacto dicha célula efectora y/o dicha aAPC con un agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo. En algunas opciones, los métodos comprenden además: (d) detectar el efecto de dicho agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo en la (i) formación del complejo ICR/ICL, (ii) activación de TCR, y/o (iii) la vía de señalización de TCR. En algunas opciones, se detectan uno o más de (i) formación del complejo ICR/ICL, (ii) activación de TCR, y/o (iii) la vía de señalización de TCR en presencia y ausencia de dicho agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo para determinar un efecto.
En algunas opciones, en el presente documento se describen métodos que comprenden: (a) poner en contacto: (i) una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC) que muestra sobre su superficie: (A) un activador de receptor de linfocitos T (TCR), y (B) un ligando de punto de control inmunitario (ICL), con (ii) una célula efectora que muestra sobre su superficie un receptor de punto de control inmunitario (ICR) y que comprende un complejo de TCR e indicador (por ejemplo, intrínseco o exógeno), en donde la interacción del activador de TCR con el complejo de TCR activa una vía de señalización de TCR, en donde dicho ICR y dicho ICL forman un complejo ICR/iCl tras la interacción, en donde la formación del complejo ICR/ICL mejora o inhibe la activación de TCR y/o la vía de señalización de TCR, y en donde una señal detectable de dicho indicador (por ejemplo, actividad, luminiscencia, fluorescencia, nivel de expresión, concentración, localización, interacción proteína-proteína, etc.), se correlaciona con el nivel de activación de TCR; y (b) detectar la presencia, ausencia, y/o nivel de activación de TCR en dicha célula efectora. En algunas opciones, los métodos comprenden además: (c) poner en contacto dicha célula efectora y/o dicha aAPC con un agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo. En algunas opciones, los métodos comprenden además: (d) detectar el efecto de dicho agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo en la (i) formación del complejo ICR/ICL, (ii) activación de TCR, y/o (iii) la vía de señalización de TCR. En algunas opciones, uno o más de (i) formación del complejo ICR/ICL, (ii) activación de TCR, y/o (iii) la vía de señalización de TCR se detectan en presencia y ausencia de dicho agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo para determinar un efecto.
En algunas opciones, las aAPC se introducen en un sistema (por ejemplo, sistema de cultivo celular, organismo completo, muestra de tejido, muestra de sangre, etc.), y la interacción de la aAPC y/o un agente de bloqueo con células efectoras dentro del sistema (o vías corriente abajo) se someten a ensayo (por ejemplo, interacción TCR/TCR-activador, interacción ICL/ICR, interrupción de la interacción ICR/ICL por el agente de bloqueo, etc.). En algunas opciones, las células efectoras son células primarias (por ejemplo, células humanas o animales (por ejemplo, aisladas o derivadas de un organismo o una línea de cultivo celular) solo con componentes intrínsecos), y la interacción se somete a ensayo basándose en, por ejemplo, una característica de un indicador intrínseco dentro de la célula efectora (por ejemplo, expresión de un promotor dependiente de la vía de TCR, actividad de una proteína de la vía de t Cr , cambios celulares dependientes de la activación de TCR, interacciones proteína-proteína dependientes de TCR y movimiento de proteína, o detección de regulación del gen indicador mediante cualquier método de administración génica en integración transitoria o estable, etc.). En otras opciones, las células efectoras son células efectoras artificiales y comprenden un constructo de indicador para detectar los efectos de la interacción
aAPC/efecto.
En ciertas opciones, en el presente documento se describen métodos para someter a ensayo la potencia de un agente de bloqueo (o agente de bloqueo de ensayo) para inhibir la interacción de un ICR y un ICL o la señalización de un complejo ICR/ICL. En tales opciones, se monitoriza un indicador o una señal de un indicador (por ejemplo, natural o genomanipulado) dentro de la célula efectora (por ejemplo, en presencia, ausencia, y/o concentración variable de agente de bloqueo) para determinar y/o cuantificar la potencia del agente de bloqueo.
En algunas opciones, se proporcionan métodos de cribado (por ejemplo, una colección de compuestos, péptidos, anticuerpos, etc.) agentes de bloqueo de ensayo. En tales opciones, una serie de sistemas básicamente idénticos que se describen en el presente documento se someten a ensayo en paralelo para identificar la respuesta del sistema a una serie de agentes de bloqueo de ensayo. Tales ensayos se pueden llevar a cabo en formatos de bajo o alto rendimiento y se pueden llevar a cabo por vía manual o se pueden automatizar.
En alguna realización, se proporcionan métodos en los que las aAPC que se describen en el presente documento se introducen en un sistema biológico (por ejemplo, muestra biológica (por ejemplo, muestra de tejido, muestra de sangre, etc.), organismo completo, sistema de cultivo celular, etc.). En algunas opciones, el sistema biológico comprende células efectoras naturales y/o células efectoras que se han genomanipulado de acuerdo con opciones que se describen en el presente documento.
En algunas opciones, los ensayos se realizan como un servicio. En tales opciones, un usuario envía uno o más agentes de bloqueo de ensayo para someterlos a ensayo. Se llevan a cabo uno o más ensayos de bloqueo de acuerdo con las opciones que se describen en el presente documento, y los resultados (por ejemplo, la potencia inhibitoria del agente de bloqueo de ensayo) se informan al usuario. Los resultados del ensayo se pueden informar en cualquier formato adecuado y pueden incluir datos sin procesar (por ejemplo, la señal del indicador en función de la concentración del agente de bloqueo) en forma analizada para proporcionar al usuario resultados fácilmente interpretables.
En el presente documento se describen composiciones, sistemas y métodos que comprenden o que utilizan las aAPC. En algunas opciones, tales composiciones, sistemas y métodos pueden, en cambio, comprender gotitas fosfolipídicas en lugar de las aAPC. Tales gotitas fosfolipídicas muestran y comprenden los mismos elementos que las aAPC (por ejemplo, activador de TCR, ligando de punto de control inmunitario, etc.) descritos en el presente documento y encuentran uso en los mismos métodos (por ejemplo, interactuando con células efectoras).
EXPERIMENTAL
Ejemplo 1
Especificidad del ensayo de bloqueo de PD-1/PD-L1
Los experimentos se realizaron durante el desarrollo de las opciones descritas en el presente documento para someter a ensayo la respuesta detectable del ensayo de bloqueo representado en la Figura 1 a diversas condiciones. Las células efectoras Jurkat que expresan PD-1 e indicador de NFAT-RE-luciferasa se cocultivaron con aAPC PD-L1 o PD-L1+ mostrando ambas anticuerpos anti-CD3 (Figura 2 y Figura 3). La actividad de luciferasa disminuyó significativamente en el sistema de cocultivo que comprende células efectoras Jurkat y aAPC PD-L1+ en comparación con el sistema de cocultivo que comprende células efectoras Jurkat y aAPC PD-L1-. Se incubaron diferentes agentes de bloqueo y se compararon en el sistema que comprende células efectoras Jurkat y las aAPC PD-L1+ (Figura 3). Solo en presencia de un agente de bloqueo específico conocido por bloquear específicamente la interacción PD-1/PD-L1, anticuerpo anti-PD-L1 o anticuerpo anti-PD-1, pero no en presencia de anticuerpo anti-CTLA-4, complejo de TCR activado por anticuerpo anti-CD3 y aumento en la expresión del indicador de luciferasa impulsada por el elemento de respuesta a NFAT. Los experimentos demostraron la especificidad del sistema para las diversas condiciones sometidas a ensayo.
Los experimentos demostraron que la actividad del anticuerpo anti-PD-L1 (Figura 4) y del anticuerpo anti-PD-1 (Figura 5) se puede medir mediante el sistema de indicador. Las células efectoras Jurkat que expresan PD-1 e indicador de NFAT-RE-luciferasa se cocultivaron con aAPC anti-CD3/PD-L1+, en presencia de diluciones en serie de anticuerpo anti-PD-L1 (Figura 4) o anticuerpo anti-PD-1 (Figura 5). Ambos agentes de bloqueo proporcionaron una inhibición dependiente de la concentración de la formación del complejo PD-1/PD-L1, dando como resultado un aumento dependiente de la concentración en las señales de luminiscencia y un aumento de la actividad de luciferasa de 4-6 veces del sistema de indicador.
Ejemplo 2
Ensayo de bloqueo de PD-1/PD-L1 usando las aAPC que no expresan anti-CD3
Los experimentos realizados durante el desarrollo de las opciones descritas en el presente documento demuestran
que los sistemas de ensayo de bloqueo que usan las aAPC expresan PD-L1, pero no expresan anti-CD3, en presencia de anticuerpo anti-CD3 soluble (Figura 6). Las células efectoras Jurkat que expresan PD-1 e indicador de NFAT-RE-luciferasa se cocultivaron con aAPC anti-CD3VPD-L1+, en presencia de anticuerpo anti-CD3 soluble y dilución en serie del agente de bloqueo, anticuerpo anti-PD-L1 (Figura 6). El agente de bloqueo proporcionó una inducción significativamente reducida (< 1,3 veces) de expresión dependiente de NFAT-RE de luciferasa (Figura 7), en comparación con 6 veces de aumento de la expresión de luciferasa del mismo agente de bloqueo en la Figura 4.
Ejemplo 3
Perlas de anti-CD3/PD-Ll en lugar de las aAPC anti-CD3/PD-Ll en el ensayo del bloqueo
Los experimentos realizados durante el desarrollo de las opciones descritas en el presente documento demuestran que las perlas de aAPC anti-CD3/PD-L1 no lograron inhibir la activación de la expresión dependiente de promotor de NFAT de luciferasa mediante células efectoras Jurkat (Figura 8). Las perlas se revistieron con una cantidad fija de anti-CD3 (10 % de proteína). La quimera PD-L1-Fc se revistió de forma simultánea en proporciones molares 1:0 (sin PD-L1), 1:3 y 1:9 de anti-CD3:PD-L1-Fc. Para equilibrar las proporciones molares se usó una IgG irrelevante. Las células efectoras Jurkat que expresan PD-1 y NFAT-RE-luciferasa se incubaron con diluciones de perlas en serie. La expresión de luciferasa dependiente de NFAT-RE fue similar usando perlas anti-CD3:PD-L1-Fc tanto a 1:0, 1:3 como 1:9. El análisis de FACS confirma la presencia de PD-L1 sobre las perlas (Figura 9). Las perlas descritas para la Figura 8 se marcaron con anti-PD-L1-FITC y se analizaron mediante citometría de flujo.
Las perlas anti-CD3/PD-L1 (proporción molar 1:9) no lograron mostrar la inhibición inducida por la participación de PD-1/PD-L1 de activación de linfocitos T, y el anticuerpo anti-PD-L1 no logró inducir la activación de linfocitos T (Figura 10). Las células efectoras Jurkat que expresan PD-1 y NFAT-RE-luciferasa se trataron con perlas anti-CD3:PD-L1-Fc en presencia o ausencia del anticuerpo de bloqueo de PD-L1. La expresión de luciferasa dependiente de NFAT-RE no cambió en presencia de anticuerpo de bloqueo de PD-L1. La longitud extendida de PD-L1 sobre las perlas no remedió la falta de activación por parte de las perlas (Figura 11). Se expone una ilustración de la estrategia para extender PD-L1 lejos de la perla. Las perlas se revistieron con anti-CD3:anti IgG humana en una proporción molar 1:9. A continuación, las perlas se incubaron con la quimera PD-L1-Fc (que contenía una región de Fc de IgG1 humana fusionada con PD-L1) para cargar PD-L1 sobre las perlas. Las células efectoras Jurkat que expresan PD-1 y luciferasa dependiente de NFAT-RE se trataron con estas perlas en presencia o ausencia del anticuerpo de bloqueo de PD-L1. La expresión de luciferasa dependiente de NFAT-RE no se vio afectada por la presencia del anticuerpo de bloqueo de PD-L1.
Se contempla que la rigidez de la colocación de anti-CD3 y PD-L1 sobre las perlas puede impedir una inhibición eficaz del linfocito T (Figura 12). Específicamente, la formación de una sinapsis inmunitaria entre linfocitos T y las aAPC requiere la localización lateral dinámica de ligandos y receptores unidos a la membrana. Tras la unión a PD-L1, se sabe que PD-1 se colocaliza con el TCR en la sinapsis inmunitaria, donde PD-1 puede inhibir directamente la señalización del complejo de TCR. Cuando PD-L1 se localiza en la membrana plasmática de las aAPC, se puede lograr tal localización lateral de PD-1/PD-L1 (ilustración a la izquierda). Cuando PD-L1 se une a la superficie de una perla, la posición del PD-L1 es estática y el movimiento lateral está restringido (ilustración a la derecha). Por lo tanto, PD-1/PD-L1 no se colocalizará con el TCR, y PD-1 no podrá inhibir la señalización del complejo de TCR. Esto es coherente con investigaciones publicadas que indican que PD-1 forma microgrupos coestimuladores negativos con el complejo de TCR, que son necesarios para inhibir la señalización proximal de TCR (Yokosuka et al., J Exp Med. 4 de junio de 2012; 209(6): 1201-17). Las opciones que se describen en el presente documento no se limitan a ningún mecanismo de acción en particular y no es necesario comprender el mecanismo de acción para practicar tales opciones.
Ejemplo 4
Especificidad del ensayo de bloqueo de PD-1/PD-L2
Los experimentos se realizaron durante el desarrollo de las opciones descritas en el presente documento para someter a ensayo la respuesta detectable del ensayo de bloqueo representado en la Figura 13 a diversas condiciones. Se expone una aAPC que presenta PD-L2 y dominio de Fab de anticuerpo anti-CD3 sobre su membrana celular que interactúa con un linfocito T Jurkat que muestra PD-1, el complejo de TCR, y que comprende constructo de indicador de luciferasa dependiente de promotor de NFAT (célula efectora Jurkat). Tras la interacción de la aAPC y la célula efectora Jurkat, el Ac. anti-CD3 activa el complejo de TCR y el promotor de NFAT; sin embargo, la interacción de PD-1 y PD-L2 inhibe activación de TCR y la expresión de luciferasa del promotor de NFAT, y se produce una pequeña expresión de la luciferasa. En presencia de un inhibidor de la interacción PD-1/PD-L2, el complejo de TCR activado activa la expresión del indicador de luciferasa del promotor de NFAT, y la señal de luciferasa se eleva.
Los experimentos demostraron que la actividad del anticuerpo anti-PD-1 (Figura 14b) y del anticuerpo anti-PD-L2 (Figura 14a) se midieron mediante el sistema de indicador. Las células efectoras Jurkat que expresan PD-1 e indicador de NFAT-RE-luciferasa se cocultivaron con aAPC anti-CD3/PD-L2+, en presencia de dilución en serie de
anticuerpo anti-PD-L2 (Figura 14a) o anticuerpo anti-PD-1 (Figura 14b). Ambos agentes de bloqueo proporcionaron la activación dependiente de la concentración de la expresión del indicador, dando como resultado un aumento dependiente de la concentración en las señales de luminiscencia y un aumento de la actividad de luciferasa.
Ejemplo 5
Los experimentos se realizaron durante el desarrollo de las opciones descritas en el presente documento para evaluar inhibidores de receptor de punto de control inmunitario CTLA-4 y su ligando, CD80/CD86, tal como se representa en la Figura 15. Se expone una aAPC en linfocitos B Raji que muestran CD80/CD86 y dominio de Fab de anticuerpo anti-CD3 sobre su membrana celular que interactúa con un linfocito T Jurkat que muestra receptor coestimulador CD28, CTLA-4, el complejo de TCR, y que comprende un constructo de indicador de luciferasa dependiente de promotor de IL-2 (células efectoras Jurkat). Tras la interacción de la aAPC y la célula efectora Jurkat, el Ac. anti-CD3 activa el complejo de TCR y CD80/CD86 coestimula a CD28. Esto conduce a la activación del promotor de IL-2, que impulsa la expresión de luciferasa; sin embargo, CTLA-4 tiene mayor afinidad de unión con CD80/CD86 que su afinidad de unión con CD28. Inhibe la interacción de CD80/CD86 con CD28 y la expresión de luciferasa del promotor de IL-2. En presencia de un inhibidor de CTLA-4 con interacción de CD80/CD86, el CD28 activado activa la expresión del indicador de luciferasa del promotor de IL-2, y la señal de luciferasa se eleva.
Los experimentos demostraron la medición de la actividad del anticuerpo anti-CTLA-4, ipilimumab, mediante el sistema de indicador (Figura 16). Las células efectoras Jurkat que expresan CTLA-4 y un indicador de IL-2-luciferasa se cocultivaron con aAPC anti-CD3/CD80/CD86+, en presencia de una dilución en serie de ipilimumab. El agente de bloqueo proporcionó la activación dependiente de la concentración de la expresión del indicador dando como resultado un aumento dependiente de la concentración en las señales de luminiscencia y un aumento de la actividad de luciferasa.
Ejemplo 6
Los experimentos se realizaron durante el desarrollo de las opciones descritas en el presente documento para evaluar inhibidores de receptor TIGIT de punto de control inmunitario y su ligando, CD155, tal como se representa en la Figura 17. Se expone una aAPC que muestra CD155 y dominio de Fab de anticuerpo anti-CD3 sobre su membrana celular interactúa con un linfocito T Jurkat que muestra receptor coestimulador CD226, TIGIT, el complejo de TCR, y que comprende un constructo indicador de luciferasa dependiente del promotor de IL-2. Tras la interacción de la aAPC y la célula efectora Jurkat, el Ac. anti-CD3 activa el complejo de TCR y CD155 coestimula a CD226. Estos conducen a la activación del promotor de IL-2 que impulsa la expresión de luciferasa; sin embargo, CD155 tiene mayor afinidad de unión con TIGIT que con CD226. Por lo tanto, TIGIT inhibe la interacción de CD155 con CD226 y la activación de la expresión de luciferasa del promotor de IL-2. En presencia de un inhibidor de la interacción TIGIT/CD155, el CD226 activado activa la expresión del indicador de luciferasa del promotor de IL-2, y la señal de luciferasa se eleva.
Los experimentos demostraron que la actividad del anticuerpo anti-TIGIT (Figura 18) se midió mediante el sistema de indicador. Las células efectoras Jurkat que expresan TIGIT y un indicador de luciferasa dependiente de promotor de IL-2 se cocultivaron con aAPC anti-CD3/CD155 , en presencia de una dilución en serie de anticuerpo anti-TIGIT. El agente de bloqueo proporcionó la activación dependiente de la concentración de la expresión del indicador mediante un anticuerpo anti-TIGIT dando como resultado un aumento de las señales de luminiscencia y un aumento de la actividad de luciferasa.
Ejemplo 7
Los experimentos se realizaron durante el desarrollo de las opciones descritas en el presente documento para evaluar inhibidores de receptor TIGIT de punto de control inmunitario y su ligando, CD155, tal como se representa en la Figura 19. Se expone una aAPC que muestra CD155 y dominio de Fab de anticuerpo anti-CD3 sobre su membrana celular que interactúa con un linfocito T CEM que muestra receptor coestimulador CD226, TIGIT, el complejo de TCR, y que comprende un constructo indicador de luciferasa dependiente del promotor de IL-2 (célula efectora CEM). Tras la interacción de la aAPC y la célula efectora CEM, el Ac. anti-CD3 activa el complejo de TCR y CD155 coestimula a CD226. Ambos conducen a la activación del promotor de IL-2 que impulsa la expresión de luciferasa; sin embargo, CD155 tiene mayor afinidad de unión con TIGIT que con CD226. Por lo tanto, TIGIT inhibe la interacción de CD155 con CD226 y la activación de la expresión de luciferasa del promotor de IL-2. En presencia de un inhibidor de la interacción TIGIT/CD155, el CD226 activado activa la expresión del indicador de luciferasa del promotor de IL-2, y la señal de luciferasa se eleva.
Los experimentos demostraron que la actividad del anticuerpo anti-TIGIT (Figura 20) se midió mediante el sistema de indicador el indicador. Los linfocitos T CEM efectores que expresan TIGIT y un indicador de luciferasa dependiente de promotor de IL-2 se cocultivaron con aAPC anti-CD3/CD155 , en presencia de una dilución en serie de anticuerpo anti-TIGIT. El agente de bloqueo proporcionó la activación dependiente de la concentración de la expresión del indicador mediante un anticuerpo anti-TIGIT dando como resultado un aumento de las señales de luminiscencia y un aumento de la actividad de luciferasa.
Claims (12)
1. Una composición que comprende:
(a) una célula efectora que muestra sobre su superficie (i) un receptor de linfocitos T (TCR) y (ii) un receptor de punto de control inmunitario (ICR) que comprende un receptor inmunoinhibidor seleccionado entre el grupo que consiste en: PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, T iGIT, CD160, Bt LA, y receptor de IL-10, en donde la célula efectora comprende un gen que codifica una proteína indicadora fluorescente o bioluminiscente, cuya expresión está bajo el control de un promotor de factor nuclear de linfocitos T activados (NFAT), en donde el promotor de NFAT comprende uno o más elementos de respuesta a NFAT que tienen al menos un 50 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, y en donde los elementos de respuesta a NFAT se unen a un factor de transcripción de la familia NFAT para mejorar la transcripción de genes asociados; y
(b) una célula presentadora de antígeno (APC) que muestra sobre su superficie: (i) un activador de receptor de linfocitos T (TCR) y (ii) un ligando de punto de control inmunitario (ICL) seleccionado entre el grupo que consiste en PD-L1, PD-L2, B7-H4, CD155, galectina-9, y HVEM, en donde el activador de TCR es un anticuerpo anti grupo de diferenciación 3 (CD3); en donde el ICR y el ICL forman un complejo ICR/ICL tras la interacción, y en donde la formación del complejo ICR/ICL da como resultado una expresión alterada de la proteína indicadora fluorescente o bioluminiscente.
2. La composición de la reivindicación 1, en donde la célula efectora se selecciona entre linfocitos T que incluyen Jurkat, HuT-78, CEM, Molt-4 y linfocitos T primarios.
3. La composición de la reivindicación 2, en donde la formación del complejo ICR/ICL da como resultado la modulación de la activación de TCR mediante el activador de TCR y/o la modulación de una o más vías dependientes de TCR, opcionalmente en donde la modulación comprende:
(a) inhibición de la activación de TCR mediante el activador de TCR y/o una o más vías dependientes de TCR; o (b) mejora de la activación de TCR mediante el activador de TCR y/o una o más vías dependientes de TCR.
4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde:
(i) el promotor de la vía de TCR es el promotor de factor nuclear de linfocitos T activados (NFAT); o,
(ii) la proteína bioluminiscente es una luciferasa.
5. La composición de la reivindicación 1 en donde la célula efectora comprende TCR y PD-1 sobre su superficie, y una luciferasa dependiente de promotor de NFAT; y mostrando la célula presentadora de antígeno (APC) sobre su superficie: anticuerpo anti-CD3 y PD-L1 en donde la formación de un complejo PD-1/PD-L1 da como resultado una supresión de la expresión de la luciferasa dependiente de promotor de NFAT.
6. La composición de la reivindicación 5, en donde el sistema comprende además un agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo, en donde el agente de bloqueo o agente de bloqueo de ensayo es una molécula pequeña, péptido, proteína, o anticuerpo que inhibe la formación del complejo PD-1/PD-L1, dando como resultado un aumento de la expresión de la luciferasa dependiente de promotor de NFAT.
7. Un método para evaluar moduladores de puntos de control inmunitario, comprendiendo dicho método:
(a) producir una composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la producción de la composición comprende cocultivar una célula efectora definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y una célula presentadora de antígeno definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y
(b) detectar una señal fluorescente o bioluminiscente de dicha proteína indicadora fluorescente o bioluminiscente.
8. El método de la reivindicación 7, que comprende además añadir a la composición un agente de bloqueo, en donde el agente de bloqueo es una molécula pequeña, péptido, proteína, o anticuerpo que inhibe la formación del complejo ICR/ICL o inhibe la modulación de la activación de TCR dependiente de ICR/ICL mediante el activador de TCR y/o la modulación de una o más vías dependientes de TCR.
9. El método de la reivindicación 8, en donde dicho indicador dependiente de la vía de TCR o una señal de dicho indicador se detecta: (1) antes, (2) simultáneamente con, y/o (3) después de añadir dicho agente de bloqueo, opcionalmente en donde el método comprende además una etapa de comparar la señal de (1) antes, (2) simultáneamente con, y/o (3) después de añadir dicho agente de bloqueo para determinar el efecto del agente de bloqueo.
10. El método de la reivindicación 8, que comprende además:
(c) añadir un agente de bloqueo de ensayo;
(d) detectar dicha señal de dicho indicador; y
(e) comparar dicha señal de dicho indicador con un control, en donde una amplificación de señal con respecto al control indica inhibición de dicho complejo ICR/ICL mediante dicho agente de bloqueo de ensayo.
11. El método de la reivindicación 8, que comprende además:
(c) detectar una señal de dicho indicador;
(d) añadir un agente de bloqueo de ensayo;
(e) repetir la detección de dicha señal de dicho indicador; y
(f) comparar dicha señal de la etapa (c) con dicha señal de la etapa (e), en donde una amplificación de señal de la etapa (c) con respecto a la etapa (e) indica inhibición de dicho complejo ICR/ICL mediante dicho agente de bloqueo de ensayo.
12. El método de la reivindicación 8, que comprende además:
(c) añadir dicho agente de bloqueo de ensayo; y
(d) repetir la detección de dicha señal de dicho indicador,
opcionalmente que comprende además:
(e) comparar dicha señal de la etapa (b) con dicha señal de la etapa (d), en donde una amplificación de señal de la etapa (b) con respecto a la etapa (d) indica inhibición de dicho complejo ICR/ICL mediante dicho agente de bloqueo de ensayo.
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