RU2731896C1 - Тест-система для анализа функциональной активности антител против pd-1 и антител против pd-l1 - Google Patents
Тест-система для анализа функциональной активности антител против pd-1 и антител против pd-l1 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2731896C1 RU2731896C1 RU2019120893A RU2019120893A RU2731896C1 RU 2731896 C1 RU2731896 C1 RU 2731896C1 RU 2019120893 A RU2019120893 A RU 2019120893A RU 2019120893 A RU2019120893 A RU 2019120893A RU 2731896 C1 RU2731896 C1 RU 2731896C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- test system
- cells
- functional activity
- antibodies against
- Prior art date
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 84
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 title claims abstract description 35
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims abstract description 50
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 49
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims abstract description 33
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 31
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 24
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 claims abstract 6
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 claims abstract 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 165
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 44
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 30
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 19
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 claims description 13
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 claims description 13
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 11
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 10
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 5
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 90
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 90
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 55
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 54
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 21
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 20
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 16
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 15
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 12
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 10
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 10
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 8
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 6
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 231100000617 superantigen Toxicity 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 5
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 4
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 4
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 4
- 108091008029 Immune checkpoint ligands Proteins 0.000 description 4
- 102000037977 Immune checkpoint ligands Human genes 0.000 description 4
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 4
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 4
- 108091008028 Immune checkpoint receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000037978 Immune checkpoint receptors Human genes 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 4
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 101000946860 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Proteins 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- 108091007744 Programmed cell death receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 102100035794 T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Human genes 0.000 description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 101100259716 Arabidopsis thaliana TAA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100029822 B- and T-lymphocyte attenuator Human genes 0.000 description 2
- 101710144268 B- and T-lymphocyte attenuator Proteins 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 description 2
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 2
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 2
- 101710099301 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101000686985 Mouse mammary tumor virus (strain C3H) Protein PR73 Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 101100259832 Oryza sativa subsp. japonica TAR2 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000254064 Photinus pyralis Species 0.000 description 2
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 2
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 2
- SAZUGELZHZOXHB-UHFFFAOYSA-N acecarbromal Chemical compound CCC(Br)(CC)C(=O)NC(=O)NC(C)=O SAZUGELZHZOXHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- -1 biological molecule Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 102000048776 human CD274 Human genes 0.000 description 2
- 102000048362 human PDCD1 Human genes 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 2
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 101100256358 Caenorhabditis elegans seb-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101000818543 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase ZAP-70 Proteins 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100021317 Inducible T-cell costimulator Human genes 0.000 description 1
- 101710205775 Inducible T-cell costimulator Proteins 0.000 description 1
- 102000037984 Inhibitory immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008026 Inhibitory immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101000574441 Mus musculus Alkaline phosphatase, germ cell type Proteins 0.000 description 1
- 108010018525 NFATC Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 102100035413 Nuclear factor of activated T-cells 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100034400 Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710151538 Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100034399 Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710151545 Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100034398 Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710151215 Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 4 Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241001247959 Omphalotus olearius Species 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 239000012270 PD-1 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012668 PD-1-inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012269 PD-1/PD-L1 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012271 PD-L1 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 101710094000 Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000508269 Psidium Species 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000242743 Renilla reniformis Species 0.000 description 1
- 102000036646 Signalosomes Human genes 0.000 description 1
- 108091007411 Signalosomes Proteins 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 108091005906 Type I transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100021125 Tyrosine-protein kinase ZAP-70 Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 102000043321 human CTLA4 Human genes 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 230000032832 immune response to tumor cell Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000003259 immunoinhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 208000019420 lymphoid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000005375 negative regulation of lymphocyte activation Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940121655 pd-1 inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229940121653 pd-1/pd-l1 inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229940121656 pd-l1 inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229960002621 pembrolizumab Drugs 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008646 thermal stress Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
- G01N33/5041—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving analysis of members of signalling pathways
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Заявлена группа изобретений, включающая тест-систему для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1 (варианты), набор, содержащий вышеуказанную тест-систему, применение тест-системы для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, применение набора для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, способ анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1. Способ определения функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1. В одном из вариантов реализации тест-система содержит в себе эффекторные репортерные клетки, имеющие на своей поверхности функциональный CD3 комплекс, PD-1 и содержащие репортерный ген под контролем CD3-зависимого промотора, клетки-мишени, представляющие на своей поверхности PD-L1, активатор CD3-зависимого сигнального каскада, где активатор CD3-зависимого сигнального каскада представляет собой биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом. Изобретение расширяет арсенал средств для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1. 7 н. и 9 з.п. ф-лы, 12 ил., 8 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биотехнологии и биоинженерии, в частности к тест-системам и их применению для анализа функциональной активности антител против PD-1 (aPD-1) и антител против PD-L1 (aPD-L1).
Уровень техники
Одним из наиболее перспективных подходов к активации терапевтического противоопухолевого иммунитета является блокада ингибиторных иммунных контрольных точек. Ингибиторные иммунные контрольные точки – это система механизмов, которые регулируют активацию иммунного ответа, препятствуя запуску аутоиммунных процессов, а также модулируют его, уменьшая вызванные иммунными клетками повреждения в органах и тканях. Опухолевые клетки могут использовать такие контрольные точки для предотвращения активации опухоль-специфических лимфоцитов, таким образом, приобретая устойчивость к действию иммунной системы. Поскольку многие из иммунных контрольных точек инициируются лиганд-рецепторными взаимодействиями, они могут блокироваться агентами, которые ингибируют эти взаимодействия. Одним из примеров таких агентов являются антитела против PD-1 (рецептор запрограммированной клеточной смерти 1) или антитела против PD-L1 (лиганда рецептора запрограммированной клеточной смерти 1).
PD-1 – белок, присутствующий преимущественно на активированных T-лимфоцитах. Взаимодействие PD-1+ (PD-1-положительных) лимфоцитов с клетками, несущими его природные лиганды PD-L1 или PD-L2 (лиганды рецептора запрограммированной клеточной смерти 1 и 2), блокирует активацию лимфоцитов (Freeman, G.J., Long, A.J., Iwai, Y., Bourque, K., Chernova, T., Nishimura, H., Fitz, L.J., Malenkovich, N., Okazaki, T., Byrne, M.C., Horton, H.F., Fouser, L., Carter, L., Ling, V., Bowman, M.R., Carreno, B.M., Collins, M., Wood, C.R., Honjo, T. (2000) Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation, J. Exp. Med., 192, 1027–1034, doi: 10.1084/jem.192.7.1027; Latchman, Y., Wood, C.R., Chernova, T., Chaudhary, D., Borde, M., Chernova, I., Iwai, Y., Long, A.J., Brown, J.A., Nunes, R., Greenfield, E.A., Bourque, K., Boussiotis, V.A., Carter, L.L., Carreno, B.M., Malenkovich, N., Nishimura, H., Okazaki, T., Honjo, T., Sharpe, A.H., Freeman, G.J. (2001) PD-L2 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation, Nat. Immunol., 2, 261–268, doi: 10.1038/85330). Это происходит вследствие образования комплекса PD-1 со своим лигандом, что вызывает ингибирование CD3-зависимой активации Т-лимфоцита (Sheppard, K.A., Fitz, L.J., Lee, J.M., Benander, C., George, J.A., Wooters, J., Qiu, Y., Jussif, J.M., Carter, L.L., Wood, C.R., Chaudhary, D. (2004) PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta, FEBS Lett., 547, 37–41, doi: 10.1016/j.febslet.2004.07.083). Известны белки, с которыми взаимодействует PD-1, и сигнальные каскады, на которые он влияет, но последовательность молекулярных взаимодействий, определяющих его активность, четко не определена (Bardhan, K., Anagnostou, T., Boussiotis, V.A. (2016) The PD1 : PD-L1/2 Pathway from Discovery to Clinical Implementation, Front. Immunol., 7, 550, doi: 10.3389/fimmu.2016.00550; Arasanz, H., Gato-Canas, M., Zuazo, M., Ibanez-Vea, M., Breckpot, K., Kochan, G., Escors, D. (2017) PD1 signal transduction pathways in T cells, Oncotarget, 8, 51936–51945, doi: 10.18632/oncotarget.17232). Такой механизм ингибирования иммунного ответа служит защитой от чрезмерной активации Т-лимфоцитов и развития аутоиммунных реакций, но в то же время может препятствовать развитию иммунного ответа на опухолевые клетки (Alsaab, H.O., Sau, S., Alzhrani, R., Tatiparti, K., Bhise, K., Kashaw, S.K., Iyer, A.K. (2017) PD-1 and PD-L1 Checkpoint Signaling Inhibition for Cancer Immunotherapy: Mechanism, Combinations, and Clinical Outcome, Front. Pharmacol., 8, 561, doi: 10.3389/fphar.2017.00561).
Блокирование взаимодействия PD-1/PD-L1, но не PD-1/PD-L2 с целью отмены негативной иммунной регуляции является одной из наиболее успешных стратегий борьбы с рядом онкологических заболеваний. В 2014 году были зарегистрированы первые терапевтические антитела против PD-1, в 2016 – против PD-L1 (Gong. J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. (2018) Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations, J. Immunother. Cancer, 6, 8, doi: 10.1186/s40425-018-0316-z). К концу 2018 года зарегистрировано более 2000 клинических исследований препаратов, блокирующих взаимодействие PD-1/PD-L1 (Tang, J., Yu, J.X., Hubbard-Lucey, V.M., Neftelinov, S.T., Hodge, J.P., Lin, Y. (2018) Trial watch: The clinical trial landscape for PD1/PDL1 immune checkpoint inhibitors, Nat. Rev. Drug Discov., 17, 854–855, doi: 10.1038/nrd.2018.210).
Для характеристики терапевтических препаратов необходим метод определения их функциональной активности. Такой метод должен отражать механизм действия и позволять количественно сравнивать препараты между собой (Rockville, M.D. (2012) United States Pharmacopeia and National Formulary (USP 35-NF 30), United States Pharmacopeial Convention, 1032, 5160–5174).
Из уровня техники известен традиционный метод оценки противоопухолевых эффектов блокады моноклональных антител с использованием моделей животных путем фенотипического анализа опухолевых масс у мышей с опухолями среднего времени выживания, общей выживаемости мышей и т.д. (Lindauer, A., Valiathan, C., Mehta, K., Sriram, V., de Greef, R., Elassaiss-Schaap, J., & de Alwis, D. (2016) Translational Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Modeling of Tumor Growth Inhibition Supports Dose-Range Selection of the Anti-PD-1 Antibody Pembrolizumab. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology, 6(1), 11–20. doi:10.1002/psp4.12130). Однако, такой анализ требует очень высоких денежных и временных затрат.
Из уровня техники известны методы, основанные на использовании первичных клеток человека (Carven Gregory John, Dulos Gradus Johannes, Elassaiss-Schaap Jeroen (2012), Bioassays for determining PD-1 modulation, WIPO, WO2012018538). Однако, они являются неудобными и плохо воспроизводимыми (Hsieh, Y.T., Aggarwal, P., Cirelli, D., Gu, L., Surowy, T., Mozier, N.M. (2017) Characterization of FcγRIIIA effector cells used in in vitro ADCC bioassay: Comparison of primary NK cells with engineered NK-92 and Jurkat T cells, J. Immunol. Methods, 441, 56–66, doi: 10.1016/j.jim.2016.12.002).
Наиболее близкой к заявляемому изобретению является система для определения активности антител против PD-1 или антител против PD-L1, содержащая: (а) эффекторную клетку, представляющую на своей поверхности рецептор иммунной контрольной точки (ICR), Т-клеточный рецептор (TCR) и содержащую репортерный ген; и (b) антигенпрезентирующую клетку, представляющую на своей поверхности активатор Т-клеточного рецептора и лиганд иммунной контрольной точки (ICL); где ICR и ICL образуют комплекс ICR / ICL при взаимодействии. В ней в качестве активатора Т-клеточного рецептора использованы трансмембранные антитела против CD3 (Cong, M., Cheng Z.J., Karassina, N., Grailer, J., Fan, F. (2015) Systems and methods for assessing modulators of immune checkpoints, WIPO, WO2016081854). Однако, в данной системе отсутствует возможность варьирования концентрации активатора TCR для оптимизации системы. Если экспрессия встроенного репортерного гена не удовлетворяет требованиям, то необходимо делать линию антигенпрезентирующих клеток заново, что занимает несколько месяцев и требует дополнительных денежных затрат.
Таким образом, целью данной работы стала разработка новой эффективной системы тестирования антител против PD-1 и антител против PD-L1, а также способа анализа антител против PD-1 и антител против PD-L1 с помощью данной тест-системы. Изобретение позволяет избежать дополнительных генно-инженерных работ, что делает его удобным в применении, и как следствие сократить временные и денежные затраты. Кроме того, изобретение позволяет оценивать ингибирующее влияние PD-1 на активацию CAR-T клеток, опосредованную химерным антигенным рецептором (CAR). Подход может быть использован при разработке препаратов на основе CAR для определения кандидатов CAR, ингибирующее влияние PD-1 на которые является минимальным.
Краткое описание изобретения
В заявляемом изобретении представлены тест-система и набор, предназначенные для анализа функциональной активности антител против PD-1 и антител против PD-L1. Изобретение также включает в себя применение указанных тест-системы и набора, способ анализа и способ оценки функциональной активности антител против PD-1 и антител против PD-L1 с использованием данной тест-системы.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к тест-системе для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащая:
а. эффекторные репортерные клетки, имеющие на своей поверхности функциональный CD3 комплекс или его производное, PD-1, и содержащие репортерный ген под контролем CD3-зависимого промотора,
б. клетки-мишени, представляющие на своей поверхности PD-L1,
в. Активатор CD3-зависимого сигнального каскада,
где активатор CD3-зависимого сигнального каскада представляет собой биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к тест-системе для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащей:
а. эффекторные репортерные клетки, имеющие на своей поверхности производное функционального CD3 комплекса, активатор CD3-зависимого сигнального каскада, PD-1, и содержащие репортерный ген под контролем CD3-зависимого промотора,
б. клетки-мишени, представляющие на своей поверхности PD-L1,
где производным функционального CD3 комплекса и активатором CD3-зависимого сигнального каскада одновременно является химерный антигенный рецептор, включающий в себя домен CD3.
В некоторых вариантах биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом, представляет собой растворимое антитело.
В некоторых вариантах биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом, представляет собой биспецифическое анти-CD3/анти-TAA антитело (aCD3/aTAA), в частности анти-CD3/анти-CD19 антитело, анти-CD3/анти-CD20 антитело.
В некоторых вариантах эффекторные репортерные клетки представляют собой Т-лимфоциты, в частности клетки Jurkat.
В некоторых вариантах клетки-мишени представляют собой Raji или CHO-K1.
В некоторых вариантах репортерный ген выбран из гена, кодирующего флюоресцентный или люминесцентный белок, в частности люциферазу.
В некоторых вариантах CD3-зависимый промотор выбран из NFAT-чувствительного промотора или NF-кB-чувствительного промотора.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к набору для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащему описанную выше тест-систему и при необходимости инструкцию.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению описанной выше тест-системы для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению описанного выше набора для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, включающему:
а. добавление к описанной выше тест-системе антитела против PD-1 или антитела против PD-L1,
б. инкубацию,
в. измерение интенсивности сигнала продукта экспрессии репортерного гена,
г. обработку полученных данных.
В некоторых вариантах обработка полученных данных в описанном выше способе включает установление значения ЕС50 антитела против PD-1 или антитела против PD-L1.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу определения функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, включающему:
а. добавление к описанной выше тест-системе антитела против PD-1 или антитела против PD-L1,
б. инкубацию,
в. измерение интенсивности сигнала продукта экспрессии репортерного гена,
г. обработку полученных данных, в том числе установление значения ЕС50 антитела против рецептора PD-1 или антитела против лиганда PD-L1,
д. расчет отношения экспериментально определенной EC50 стандартного образца, активность которого принимают за 100%, к экспериментально определенной EC50 сравниваемого антитела против рецептора PD-1 или антитела против лиганда PD-L1, умноженного на 100%.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Способы активации CD3 для системы тестирования ингибиторов взаимодействия PD-1/PD-L1. а – Эффекторная клетка имеет TCR, специфичный к комплексу пептид/MHC клетки-мишени. Их взаимодействие приводит к CD3-зависимой активации эффекторной клетки. б – Суперантиген связывает TCR эффекторной клетки и MHC-II антигенпрезентирующей клетки, имитируя взаимодействие TCR/MHC. в – Растворимые aCD3ε при взаимодействии с CD3 эффекторной клетки вызывают ее CD3-зависимую активацию. г – Трансмембранные aCD3ε, представленные на клетке активаторе, при контакте с эффекторной клеткой взаимодействуют с CD3 эффекторных клеток и вызывают в их CD3-зависимую активацию. д – В эффекторной клетке, имеющей CAR против TAA, содержащий сигнальный домен CD3ζ, при контакте с TAA+ (TAA положительной) клеткой-мишенью активируются CD3-зависимые сигнальные каскады. е – При контакте клетки-мишени с эффекторной клеткой связанное с TAA биспецифическое антитело против CD3 и TAA связывается с CD3 эффекторной клетки, что приводит к ее CD3-зависимой активации.
Фиг. 2. Сравнение эффективности CD3-зависимой стимуляции NFAT-сигнального каскада растворимыми активирующими агентами. Суспензию, состоявшую из указанной комбинации клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 (J-PD-1), Raji (R), Raji PD-L1 (R-PD-L1), инкубировали в присутствии одного из активирующих агентов в указанной концентрации, а также в присутствии (+aPD-1), либо в отсутствие (–aPD-1) aPD-1 в концентрации 50 мкг/мл. Эффективность активации оценивали по уровню синтеза люциферазы путем измерения люминесценции.
Фиг. 3. Зависимость активации репортерной системы от концентрации aCD3/aTAA. В клеточном тесте использовали суспензию клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 (Jurkat-PD-1), содержавшую (кривые 2 и 3), либо не содержавшую (кривая 1) клетки Raji PD-L1 (Raji-PD-1). В случае кривой 3 – к клеткам добавляли в aPD-1 в концентрации 50 мкг/мл. В качестве активирующего агента использовали aCD3/aTTA1. Относительная активация (кривая 4) – отношение интенсивности люминесценции кривой 3 к кривой 2 для соответствующих концентраций aCD3/aTAA.
Фиг. 4. Зависимость активации репортерной системы от концентрации aCD3/aTAA. В клеточном тесте использовали суспензию клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 (Jurkat-PD-1), содержавшую (кривые 2 и 3), либо не содержавшую (кривая 1) клетки Raji PD-L1 (Raji-PD-1). В случае кривой 3 – к клеткам добавляли в aPD-1 в концентрации 50 мкг/мл. В качестве активирующего агента использовали aCD3/aTАA2. Относительная активация (кривая 4) – отношение интенсивности люминесценции кривой 3 к кривой 2 для соответствующих концентраций aCD3/aTAA.
Фиг. 5. Зависимость активации репортерной системы от концентрации aPD-1 в присутствии различных активирующих агентов. В клеточном тесте использовали суспензию клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 (кривые 1–3), либо Jurkat NFAT-FLuc PD-1 CAR (кривая 4) с добавлением клеток Raji PD-L1 (кривые 1, 2 и 4), либо CHO PDL1 tmaCD3 (кривая 3). В случае кривых 1 и 2 суспензия клеток содержала, соответственно, aCD3/aTAA1 и aCD3/aTAA2 в концентрации 1 нг/мл. Результаты приведены в значениях интенсивности люминесценции.
Фиг. 6. Зависимость активации репортерной системы от концентрации aPD-1 в присутствии различных активирующих агентов. В клеточном тесте использовали суспензию клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 (кривые 1–3), либо Jurkat NFAT-FLuc PD-1 CAR (кривая 4) с добавлением клеток Raji PD-L1 (кривые 1, 2 и 4), либо CHO PDL1 tmaCD3 (кривая 3). В случае кривых 1 и 2 суспензия клеток содержала, соответственно, aCD3/aTAA1 и aCD3/aTAA2 в концентрации 1 нг/мл. Результаты приведены в единицах относительной активации. Относительную активацию определяли как отношение интенсивности люминесценции при данной концентрации aPD-1 к интенсивности люминесценции в варианте без добавления aPD-1 для каждого активатора.
Фиг. 7. Исследование специфичности репортерной системы. В клеточном тесте использовали aPD-1 (1), либо aPD-L1 (2), либо aCTLA4 (3), либо aHER2 (4) в указанных концентрациях. Исследование проводили согласно методике, описанной в разделе «функциональные тесты».
Фиг. 8. Использование разработанного клеточного теста для оценки специфической активности aPD-1 и aPD-L1. В клеточном тесте использовали aPD-1, исходные (1), либо проинкубированные в течении 1 ч при температуре 50 °С (2), 70 °С (3), либо 90 °С (4). Для вариантов (1–3) указаны соответствующие значения EC50. Исследование проводили согласно методике, описанной в разделе «функциональные тесты».
Фиг. 9. Использование разработанного клеточного теста для оценки специфической активности aPD-1 и aPD-L1. В клеточном тесте aPD-L1, исходные (1), либо проинкубированные в течении 1 ч при температуре 50 °С (2), 70 °С (3), либо 90 °С (4). Для вариантов (1–3) указаны соответствующие значения EC50. Исследование проводили согласно методике, описанной в разделе «функциональные тесты».
Фиг. 10. Исследование линейного диапазона тест-системы. Сравнение ожидаемой и экспериментально определенной активности aPD-1. Измеряли EC50 заранее подготовленных разведений (в диапазоне концентраций 50 – 200 % относительно стандарта, активность которого принимали за 100%) антител. Экспериментально определенную активность рассчитывали, как отношение экспериментально определенной EC50 стандарта к EC50 для данной концентрации, умноженное на 100%.
Фиг. 11. Исследование линейного диапазона тест-системы. Сравнение ожидаемой и экспериментально определенной активности aPD-L1. Измеряли EC50 заранее подготовленных разведений (в диапазоне концентраций 50 – 200 % относительно стандарта, активность которого принимали за 100%) антител. Экспериментально определенную активность рассчитывали, как отношение экспериментально определенной EC50 стандарта к EC50 для данной концентрации, умноженное на 100%.
Фиг. 12. Схема работы тест-системы для оценки функциональной активности aPD-1 и aPD-L1, основанная на использовании бисфецифических aCD3/aTAA. а – Система без добавления ингибиторов взаимодействия PD-1/PD-L1. При контакте эффекторной клетки и клетки-мишени aCD3/aTAA, связавшиеся с TAA клетки-мишени, взаимодействуют с CD3 эффекторной клетки, что активирует ее CD3-зависимый NFAT сигнальный каскад. При этом происходит взаимодействие PD-1 эффекторной клетки с PD-L1 клетки-мишени, что ингибирует активацию CD3-зависимого NFAT сигнального каскада. б – Добавленные в систему aPD-1 или aPD-L1 (в) связываются со своей мишенью, что блокирует взаимодействие PD-1/PD-L1 и реактивирует CD3-зависимый NFAT сигнальный каскад.
Определения и общие методы
Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области.
Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.
PD-1 является ингибиторным членом семейства рецепторов CD28, которое включает в себя также CD28 (Cluster of Differentiation 28), CTLA-4 (Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4), ICOS (Inducible T-cell COStimulator) и BTLA (B- and T-lymphocyte attenuator). PD-1 экспрессируется активированными В-клетками, Т-клетками и миелоидными клетками (Agata et al., supra; Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennet et al. (2003) J Immunol 170: 711-8). PD-1 является трансмембранным белком типа I 55 кДа, который является частью суперсемейства генов Ig (Agata et al. (1996) Int Immunol 8: 765-72). PD-1 содержит мембранопроксимальный иммунорецепторный ингибирующий мотив на основе тирозина (ITIM) и мембранодистальный мотив переключения на основе тирозина (ITSM) (Thomas, M.L. (1995) J Exp Med 181: 1953-6; Vivier, E и Daeron, M (1997) Immunol Today 18: 286-91). PD-1, хотя и является структурно сходным с CTLA-4, лишен мотива MYPPPY, который является критическим для связывания В7-1 и В7-2. Были идентифицированы два лиганда для PD-1, PD-L1 и PD-L2, которые, как было показано, отрицательно регулируют активацию Т-клеток после связывания с PD-1 (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2: 261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32: 634-43). Как PD-L1, так и PD-L2 являются гомологами В7, которые связываются с PD-1, но не связываются с другими членами семейства CD28.
PD-L1, также известный как кластер дифференцировки 274 (CD274) или гомолог 1 B7 (B7-H1), является трансмембранным белком 1 типа, массой 40 кДа. Состоит из 3 доменов: внеклеточного, представленного Ig V и C-подобными доменами (220), трансмембранного (21) и внутриклеточного (31). Он играет важную роль в супрессии иммунной системы в период беременности, при пересадке чужеродной ткани, некоторых заболеваниях, например, при гепатите. В нормальных условиях, в ответ на собственные антигены, в лимфатических узлах и селезенке аккумулируется некоторое количество антиген-специфичных CD8+ Т-эффекторных клеток, с целью предотвращения аутоиммунного процесса, формируются PD-1/PD-L1 или B7-1/PD-L1 комплексы, это приводит к передаче ингибиторного сигнала, снижающего пролиферацию данных CD8+ T-клеток в лимфоузлах. Таким образом PD-1/PD-L-взаимодействие является одним из ключевых в развитии иммунной толерантности.
Под термином «тест-система» в контексте данного изобретения подразумевается смесь компонентов для проведения анализа активности антител. Причем данная смесь может быть помещена в любое подходящее для этого устройство или емкость (микросферы, биочип, аналитические полоски, аффинные колонки, планшеты, пробирки и пр.).
Термин «набор» объединяет все комплектующие, в том числе саму тест-систему и при необходимости инструкцию проведения анализа.
Термин «антитело» или «иммуноглобулин» (Ig), как использовано в данном описании, включает целые антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. «антигенсвязывающую часть») или его отдельные цепи. Термин «антитело» используется здесь в самом широком смысле и конкретно охватывает человеческие, нечеловеческие (например, мышиные) и гуманизированные моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, моноспецифические антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), одноцепочечные антитела и фрагменты антител, если они проявляют желаемую биологическую активность. Антитела могут существовать как интактные иммуноглобулины, так и в виде модификаций различных форм, например, FabFc2, Fab, Fv, Fd, (FabN)2, Fv фрагмент, содержащий только легкие и тяжелые цепи вариабельных регионов, одноцепочечного антитела (например, scFv) и тому подобное. Тяжелая и легкая цепи Fv могут быть получены из одного и того же антитела или различных антител, тем самым производя химерную область Fv. Антитело может быть животного (в частности, мыши или крысы) или человеческого происхождения, может быть химерным или гуманизированным. «Антитела» согласно изобретению могут представлять собой антитела любого класса (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, предпочтительно IgG) или подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2, предпочтительно IgG1).
Термин «антигенсвязывающая часть» антитела или «антигенсвязывающий фрагмент» (или просто «часть антитела» или «фрагмент антитела»), как использовано в данном описании, относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, включенных в термин «антигенсвязывающая часть» антитела, включают (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH 1; (ii) F(ab’)2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd- фрагмент, состоящий из доменов VH и CH 1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH в едином плече антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH/VHH; и (vi) выделенная определяющая комплементарность области (CDR). Кроме того, две области Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются разными генами, они могут быть соединены при помощи рекомбинантных способов с использованием синтетического линкера, который дает возможность получать их в виде единой белковой цепи, в которой области VL и VH спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Предполагается, что такие одноцепочечные молекулы также включены в термин «антигенсвязывающая часть» антитела. Такие фрагменты антител получают с использованием общепринятых способов, известных специалистам в данной области, и эти фрагменты подвергают скринингу таким же образом, как и интактные антитела.
Выражение «функциональная активность» по отношению к антителу или антигенсвязывающему фрагменту против PD-1 или PD-L1 по данному изобретению означает способность связываться с PD-1 или PD-L1 и препятствовать образованию комплекса PD-1/PD-L1.
Термин «биспецифичное антитело» или «биспецифический антигенсвязывающий фрагмент» означает антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающие домены, которые способны к специфическому связыванию с двумя различными эпитопами на одной биологической молекуле или способны к специфическому связыванию с эпитопами на двух различных биологических молекулах. Биспецифичное антитело также упоминается в настоящем документе, как обладающее «двойной специфичностью» или как являющееся антителом с «двойной специфичностью».
Термин «моноклональное антитело» или «mAb» относится к антителу, которое синтезировано и выделено отдельной клональной популяцией клеток. Клональная популяция может быть клональной популяцией иммортализованных клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммортализованные клетки в клональной популяции являются гибридными клетками, гибридомами, которые обычно получают путем слияния отдельных В-лимфоцитов от иммунизированных животных с отдельными клетками лимфоцитарной опухоли. Гибридомы представляют собой тип сконструированных клеток и не встречаются в природе.
Термин «растворимое антитело» относится к антителу, которое исходно является компонентом раствора. В отличие от трансмембранного антитела, которое исходно представлено на поверхности клеточной мембраны.
Термин «ED50» («EC50») (50% эффективная доза/концентрация) относится к концентрациям препарата, при которых измеряемый максимально возможный биологический эффект достигается на 50% (может включать цитотоксичность).
Термин «эффекторные клетки», используемый здесь, обозначает клетки, которые представляют на своей поверхности TCR, CD3, CAR, рецепторы Fc-фрагмента антител (FcR), B-клеточный рецептор (BCR), содержащие ITAM сигнальные мотивы, и осуществляют эффекторные функции. Примером природных эффекторных клеток являются T-лимфоциты, натуральные киллеры (NK), моноциты и т.д. Природные эффекторные клетки могут быть выделены из их природного источника, например, из цельной крови или PBMC. Также этот термин относится к другим клеткам, представляющим на своей поверхности TCR, CD3, CAR, FcR, BCR или их производные, содержащие ITAM сигнальные мотивы.
Термин «клетка-мишень», используемый здесь, обозначает клетку, с которой специфично связывается эффекторная клетка, что обеспечивает активацию ее эффекторных функций. Такие клетки представляют на своей поверхности главный комплекс гистосовместимости (MHC), другие трансмембранные или мембранно-связанные соединения, специфично связывающие TCR, CD3, FcR, CAR, BCR или их производные эффекторных клеток напрямую или опосредованно другими соединениями. Примером таких клеток могут быть B-лимфоциты, моноциты, дендритные клетки, иммортализованные клеточные линии и т.д.
Термин «репортерный ген», используемый здесь, относится к гетерологичному гену, кодирующему репортерный белок, экспрессия которого находится под контролем регулируемого промотора, и продукт экспрессии которого может быть с легкостью определен и подвергнут количественной оценке, когда конструкцию, содержащую этот ген, вводят в ткани или клетки. Примеры репортерных белков, известных и используемых в данной области техники, включают люциферазу (Luc), зеленый флюоресцентный белок (GFP), хлорамфеникол-ацетилтрансферазу (САТ), β-галактозидазу (LacZ), β-глюкуронидазу (Gus), секретируемую эмбриональную щелочную фосфатазу (SEAP) и подобные. Гены селективных маркеров могут также считаться репортерными генами.
Термины «промотор» и «промоторная последовательность» используются взаимозаменяемо и относятся к последовательности ДНК, способной к контролированию экспрессии кодирующей последовательности. Источниками промоторных последовательностей могут служить природные гены или комбинации их участков, отвечающих за контроль его экспрессии. Также промоторы могут включать и сегменты синтетической ДНК. Квалифицированным в данной области техники специалистам понятно, что различные промоторы могут управлять экспрессией гена в различных тканях или типах клеток, или на различных стадиях развития, или в ответ на различные условия окружающей среды или физиологические условия. Промоторы, обеспечивающие стабильную экспрессию гена в большинстве периодов времени, обычно именуют «конститутивными промоторами». Промоторы, которые вызывают экспрессию гена в специфическом типе клеток, обычно именуют «клеточноспецифическими» или «тканеспецифическими» промоторами. Промоторы, которые вызывают экспрессию гена на специфической стадии развития или клеточной дифференциации, обычно именуют «специфичными в отношении развития промоторами» или «специфичными в отношении клеточной дифференциации промоторами». Промоторы, которые индуцируются и вызывают экспрессию гена после воздействия или обработки клетки агентом, биологической молекулой, химическим веществом, лигандом, светом и подобными, которые индуцируют промотор, обычно именуют «индуцибельными промоторами» или «регулируемыми промоторами». Дополнительно признается, что, поскольку в большинстве случаев точные границы регуляторных последовательностей не вполне определены, фрагменты ДНК различных длин могут иметь одинаковую промоторную активность.
Промоторная последовательность обычно ограничена на своем 3' конце местом инициации транскрипции и простирается выше (в 5' направлении) с включением элементов, необходимых для инициации транскрипции на уровнях, определяемых выше фона. Внутри промоторной последовательности будут обнаруживаться место инициации транскрипции (подходящим образом определяемое, например, с помощью картирования с использованием нуклеазы S1), а также белоксвязывающие домены (консенсусные последовательности), ответственные за связывание РНК-полимеразы.
Термин «функциональный CD3 комплекс», используемый здесь, относится к комплексу, представленному на поверхности эффекторной клетки и включающему в себя хотя бы одну субъединицу CD3 или ее производное, содержащее ITAM сигнальные мотивы, которые способны обеспечить активацию CD3-зависимых сигнальных каскадов. Производные CD3 комплекса – полипептиды, имеющие в своем составе аминокислотную последовательность белков, составляющих CD3 комплекс, или ее фрагменты.
Термин «CD3» относится к мультипротеиновому комплексу на поверхности Т-лимфоцитов, являющемуся основным корецептором Т-клеточного рецептора. У млекопитающих образован 6 субъединицами: CD3γ, CD3δ, двумя CD3ε и двумя CD3ζ. В функции комплекса CD3 входит передача сигналов в клетку, а также стабилизация Т-клеточного рецептора на поверхности мембраны. Один из белков кластера дифференцировки.
Термин «CD3-зависимый промотор» относится к промотору, который при активации одного или нескольких CD3-зависимых сигнальных каскадов обеспечивает экспрессию гена, который он контролирует.
Термин «CD3-зависимый сигнальный каскад» относится к сигнальным каскадам, которые активируются в ответ на стимуляцию TCR, субъединиц CD3 или их производных, содержащих ITAM сигнальные мотивы. Примерами являются NFAT, NF-κB, Ras/MAPK, PKC и другие сигнальные каскады.
Термин «опухоль-ассоциированный антиген» (TAA, опухолевый антиген) относится к антигенам, продуцируемым раковыми клетками и способным вызвать иммунный ответ организма. Эта способность делает опухолевые антигены важнейшим целевым объектом иммунотерапии рака. Кроме того, эти антигены являются одними из онкомаркеров, определяемых в диагностике рака.
В организме опухолевые антигены являются результатом измененного генома раковой клетки. Из-за этих изменений возникают чуждые организму продукты генов или даже белки, которые, к примеру, существуют только в эмбриональный период развития. Эти чужеродные продукты – опухолевые антигены – могут находиться в цитоплазме клетки или на её поверхности, а также и во внеклеточном пространстве.
Термин «NFAT» (ядерный фактор активированных T-лимфоцитов) относится к белкам семейства NFAT, которые являются факторами транскрипции, и клеточная локализация которых зависит от их фосфорилирования. В фосфорилированной форме NFAT локализуется в цитоплазме, при дефосфорилировании, вызванном, например, активацией CD3, происходит его переход в ядро, где он специфично связывается с определенными последовательностями ДНК в промоторах генов, что приводит к активации их экспрессии.
Выражение «NFAT-чувствительный промотор» или «NF-κB-чувствительный промотор» относится к промоторам, содержащим последовательности ДНК, с которыми специфично связываются соответствующие транскрипционные факторы, что активирует экспрессию генов, которые контролируются соответствующими промоторами.
Термин «NF-κB» (ядерный фактор энхансера легкой цепи активированных B-лимфоцитов) относится к семейству белков NF-κB, которые являются факторами транскрипции, и клеточная локализация которых зависит от их фосфорилирования. В дефосфорилированной форме NF-κB локализуется в цитоплазме, при фосфорилировании NF-κB, вызванном, например, активацией CD3, происходит его переход в ядро, где он специфично связывается с определенными последовательностями ДНК в промоторах генов, что приводит к активации их экспрессии.
Термин «CAR» (химерный антигенный рецептор) относится к рекомбинантному гибридному белку, сочетающему фрагмент антитела, обладающему способностью избирательно связываться с конкретными антигенами, и сигнализирующие домены, способные активировать клетки, представляющие его на своей поверхности.
Термин «CAR-T» относится к Т-клеткам, представляющим CAR на своей поверхности.
Выражение «стандартный образец» относится к препарату, охарактеризованному по определенным параметрам, который используется в качестве препарата сравнения для определения аналогичных параметров исследуемых образцов.
Подробное описание изобретения
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к тест-системе для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащей:
а. эффекторные репортерные клетки, имеющие на своей поверхности функциональный CD3 комплекс или его производное, PD-1, и содержащие репортерный ген под контролем CD3-зависимого промотора,
б. клетки-мишени, представляющие на своей поверхности PD-L1,
в. Активатор CD3-зависимого сигнального каскада,
где активатор CD3-зависимого сигнального каскада представляет собой биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к тест-системе для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащей:
а. эффекторные репортерные клетки, имеющие на своей поверхности производное функционального CD3 комплекса, активатор CD3-зависимого сигнального каскада, PD-1, и содержащие репортерный ген под контролем CD3-зависимого промотора,
б. клетки-мишени, представляющие на своей поверхности PD-L1,
где производным функционального CD3 комплекса и активатором CD3-зависимого сигнального каскада одновременно является химерный антигенный рецептор, включающий в себя домен CD3.
Тест-система для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1 должна состоять из эффекторных PD-1+ клеток и PD-L1. Функция PD-1-опосредованного ингибирования CD3-зависимой активации подразумевает, что эффекторная клеточная линия должна иметь функциональный CD3 комплекс на поверхности. Для оценки уровня CD3-зависимой активации и степени ее ингибирования удобно использовать репортерную систему, например, на основе использования репортерных генов, в качестве которых могут быть использованы гены, кодирующие флюоресцентный (GFP, RFP, BFP и т.д.) или люминесцентный (FLuc, RLuc, GLuc и т.д.) белок, в частности люциферазу светляка. Экспрессия репортерного гена должна осуществляться под контролем CD3-зависимого промотора. PD-1 при взаимодействии с PD-L1 способен подавлять NFAT и NF-κB сигнальные каскады, активируемые CD3 (Jutz, S., Leitner, J., Schmetterer, K., Doel-Perez, I., Majdic, O., Grabmeier-Pfistershammer, K., Paster, W., Huppa, J.B., Steinberger, P. (2016) Assessment of costimulation and coinhibition in a triple parameter T cell reporter line: Simultaneous measurement of NF-κB, NFAT and AP-1, J. Immunol. Methods, 430, 10–20, doi: 10.1016/j.jim.2016.01.007).
В некоторых вариантах репортерный ген выбран из гена, кодирующего флюоресцентный или люминесцентный белок. В некоторых вариантах осуществления репортерный ген представляет собой люциферазу, бета-лактамазу, CAT, SEAP, флюоресцентный белок, генный продукт и др. В некоторых вариантах осуществления люциферазу выбирают из таковых, обнаруженных у Omphalotus olearius, светлячков (например, Photinus pyralis), Renilla reniformi, их мутантов, их частей, их вариантов и любых другие ферменты люциферазы, подходящие для описанных систем и способов.
В некоторых вариантах CD3-зависимый промотор выбран из NFAT-чувствительного промотора или NF-кB-чувствительного промотора. Использование NFAT сигнального пути предпочтительнее, т.к. NF-κB сигнальный путь имеет множество других способов активации, т.е. является менее специфичным маркером CD3-зависимой активации (Pahl, H.L. (1999) Activators and target genes of Rel/NF-kappaB transcription factors, Oncogene, 18, 6853–6866, doi: 10.1038/sj.onc.1203239; Rao, A., Luo, C, Hogan, P.G. (1997) Transcription factors of the NFAT family: regulation and function, Annu. Rev. Immunol., 15, 707–747, doi: 10.1146/annurev.immunol.15.1.707; Vaeth, M., Feske, S. (2018) NFAT control of immune function: New Frontiers for an Abiding Trooper, F1000Res., 7, 260, doi: 10.12688/f1000research.13426.1). Также могут быть использованы Ras/MARK-чувствительный промотор, PKC-чувствительный промотор.
NFAT-чувствительный промотор представляет собой последовательность ДНК, которая содержит одну или несколько последовательностей, с которой специфично связывается NFAT. При связывании NFAT-чувствительного промотора с фактором транскрипции NFAT (например, NFATcl, NFATc2, NFATc3, NFATc4 или NFAT5) транскрипция связанных последовательностей нуклеиновых кислот (например, нижестоящих генов) усиливается. Одним из примеров последовательности ДНК, специфично связываемой NFAT, является GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT (SEQ ID NO: 1) В некоторых вариантах осуществления промотор NFAT содержит повторы SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления промотор NFAT содержит один или несколько элементов ответа NFAT, имеющих по меньшей мере 50% (например, больше 50%, больше 60%, больше 70%, больше 80%, больше 90%, больше 95% и диапазоны в них) идентичность последовательности с SEQ ID NO: 1, где элементы ответа NFAT связываются с фактором транскрипции семейства NFAT для усиления транскрипции ассоциированных (например, нисходящих) генов.
Для функциональных клеточных тестов предпочтительно использование иммортализованных клеточных линий, позволяющих избежать проблем с точностью и воспроизводимостью результатов, присущих методам анализа c использованием первичных клеток (Hsieh, Y.T., Aggarwal, P., Cirelli, D., Gu, L., Surowy, T., Mozier, N.M. (2017) Characterization of FcγRIIIA effector cells used in in vitro ADCC bioassay: Comparison of primary NK cells with engineered NK-92 and Jurkat T cells, J. Immunol. Methods, 441, 56–66, doi: 10.1016/j.jim.2016.12.002). Также это позволяет при помощи методов генной и клеточной инженерии создавать клетки с необходимым фенотипом.
В некоторых вариантах осуществления эффекторная клетка представляет собой Т-клетку, включая, но не ограничиваясь этим, клетки Jurkat, HuT-78, CEM, Molt-4 и т.д. В частности, предъявленным требованиям удовлетворяет человеческая клеточная линия Т-клеточного происхождения Jurkat, которая более 30 лет успешно используется в исследовании процессов CD3-зависимой активации. На ее основе в рамках данной работы создали стабильную клеточную линию Jurkat NFAT-FLuc PD-1, экспрессирующую ген, кодирующий PD-1, и содержащую в геноме репортерный ген, кодирующий люциферазу светляка под контролем NFAT-чувствительного промотора.
Помимо эффекторных клеток тест-система должна включать в себя PD-L1 и активатор CD3-зависимого сигнального каскада. Наиболее физиологичным является использование PD-L1+ (PD-L1-положительных) клеток-мишеней в качестве носителя PD-L1. В качестве клеток-мишеней могут быть использованы любые клетки, представляющие на своей поверхности PD-L1. В одном из вариантов воплощения изобретения клетки-мишени представляют собой производные клеточной линии Raji или CHO-K1, представляющие на своей поверхности PD-L1.
В качестве активатора CD3-зависимого сигнального каскада могут быть использованы биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом, или CAR, включающий в себя домен CD3. CAR, являющийся производным CD3 комплекса, представляется на поверхности эффекторных репортерных клеток, одновременно является и активатором CD3-зависимого сигнального каскада.
В некоторых вариантах биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом, представляет собой растворимое антитело. Т.е. растворимое биспецифическое антитело в данном варианте является отдельным компонентом тест-системы.
В некоторых вариантах биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом, представляет собой биспецифическое анти-CD3/анти-TAA антитело, в частности, анти-CD3/анти-CD19, анти-CD3/анти-CD20.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к набору для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащему описанную выше тест-систему и при необходимости инструкцию.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению описанной выше тест-системы для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению описанного выше набора для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, включающему:
а. добавление к описанной выше тест-системе антитела против PD-1 или антитела против PD-L1,
б. инкубацию,
в. измерение интенсивности сигнала продукта экспрессии репортерного гена,
г. обработку полученных данных.
В некоторых вариантах обработка полученных данных в описанном выше способе включает установление значения ЕС50 антитела против PD-1 или антитела против PD-L1. Экспериментально определенную активность рассчитывали, как отношение экспериментально определенной EC50 стандарта к EC50 проверяемого объекта для данной концентрации, умноженное на 100%.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу определения функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, включающему:
а. добавление к тест-системе по п. 1 антитела против PD-1 или антитела против PD-L1,
б. инкубацию,
в. измерение интенсивности сигнала продукта экспрессии репортерного гена,
г. обработку полученных данных, в том числе установление значения ЕС50 антитела против PD-1 или антитела против PD-L1,
д. расчет отношения экспериментально определенной EC50 стандартного образца, активность которого принимают за 100%, к экспериментально определенной EC50 сравниваемого антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, умноженного на 100%.
Такие анализы могут проводиться с использованием систем, способов, устройств, робототехники и другого оборудования, известного в данной области техники. Например, клетки-мишени и эффекторные клетки совместно культивируют в 96- или 384-луночных планшетах, и робототехнику используют для эффективного введения библиотеки тестируемых антител и для обнаружения сигнала репортера. В некоторых вариантах осуществления предоставляются компоненты, композиции, устройства, оборудование и т.д. (например, вместе с описанными здесь компонентами анализа (например, эффекторными клетками и клетками-мишенями)) для проведения анализов. В некоторых вариантах осуществления компоненты могут включать питательные среды, сыворотку, питательные добавки (например, достаточные для совместного культивирования клеток-мишеней и эффекторных клеток), буферы, репортерный субстрат (например, люциферин, коелентеразин или их производные и т.д.) средства контроля или стандартные образцы (например, положительные контроли, о которых известно, что они ингибируют взаимодействия PD-1 с PD-L1) и т.д.
В некоторых вариантах осуществления предусмотрены культуральные колбы и флаконы, микроцентрифужные пробирки, микропланшеты, включающие 96- и 384-луночные планшеты, считыватели, водяную баню, CO2-инкубатор, одноканальные и многоканальные пипетки и т.д. В некоторых вариантах осуществления предусмотрены робототехника для анализов с высокой пропускной способностью (например, выдача реагентов, организация образцов, обнаружение репортерных генов и т.д.), инструменты для обнаружения репортерных генов (например, флюориметр, люминометр, спектрофотометр, планшеты Taqman, ELISA и т.д.) и т.д.
В некоторых вариантах осуществления все или часть компонентов для выполнения анализа, описанного в данном документе, предоставляются в виде набора. Компоненты могут быть в отдельных контейнерах, которые упакованы вместе или отдельно для удобства или других соображений. В некоторых вариантах осуществления компоненты (например, клетки-мишени, эффекторные клетки и т.д.) предоставляются в заранее определенных количествах в соответствии с размером и / или количеством анализов, которые пользователь намеревается выполнить. В некоторых вариантах осуществления также предусмотрены принадлежности (например, сосуды, чашки и т.д.), инструкции, другие компоненты (например, буферы, контроли, носитель, субстрат для репортерного белка и т.д.) и т.д.
Тест-система может быть использована на стадии разработки aPD-1 и aPD-L1 для сравнения кандидатов, оценки их стабильности, а также характеристики серий терапевтического препарата для подтверждения их эквивалентности, требующей в большинстве случаев соответствия 80–125% активности относительно стандартного образца.
Возможно дополнительное улучшение параметров данной тест-системы, например, за счет снижения фонового сигнала путем использования дестабилизированной версии репортерного белка люциферазы.
Примеры
Материалы и методы.
Реактивы
Среды DMEM/F12 и RPMI-1640 («ПанЭко», Россия); инактивированная эмбриональная бычья сыворотка («Gibco», США); классические моноклональные антитела против PD-1 человека, PD-L1 человека, цитотоксического Т-лимфоцит-ассоциированного белка 4 (CTLA4) человека (aCTLA4), рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER2) (aHER2), биспецифические моноклональные антитела против CD3 человека и опухоль-ассоциированного антигена человека 1 (aCD3/aTAA1) и 2 (aCD3/aTAA2) («BIOCAD», Россия); мышиное моноклональное антитело против CD3 человека, клон HIT3a («BD», США); набор для детекции активности люциферазы ONE-Glo («Promega», США); стафилококковый энтеротоксин Б (SEB) («Toxin Technology», США).
Клеточные линии.
Клетки Jurkat, Raji и CHO-K1 культивировали при 37 °С в атмосфере с 5% CO2 в соответствующей питательной среде с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, в случае клеток Jurkat, Raji – в среде RPMI-1640, в случае CHO-K1 – в среде DMEM/F12. Все клеточные линии, использованные для инженерии, а также полученные на их основе репортерные линии, были протестированы на отсутствие контаминации микоплазмами набором VenorTM GeM Mycoplasma Detection Kit, PCR-based («Sigma Aldrich», США).
Пример 1
Создание генетических конструкций
Плазмидный вектор pOGI_NFAT-FLuc создан на основе вектора pOGI («BIOCAD», Россия), он содержит ген, кодирующий люциферазу светляка Photinus pyralis (FLuc), под контролем минимального промотора интерлейкина 2 (IL-2), содержащего 3 копии последовательностей, связывающих ядерный фактор активированных T-лимфоцитов (NFAT), а также экспрессионную кассету с геном устойчивости к гигромицину.
Плазмидные вектора pSX_tmaCD3, pSX_PD-1 и pSX_PD-L1 созданы на основе вектора pSX («BIOCAD», Россия). pSX_tmaCD3 содержит ген, кодирующий антитело OKT3 в формате одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), слитое с трансмембранным доменом рецептора тромбоцитарного фактора роста, под контролем цитомегаловирусного (CMV) промотора, а также экспрессионную кассету с геном устойчивости к пуромицину. pSX_PD-1 содержит ген, кодирующий PD-1 человека, под контролем CMV промотора, а также экспрессионную кассету с геном устойчивости к генетицину (неомицину). pSX_PD-L1 содержит ген, кодирующий PD-L1 человека, под контролем CMV промотора, а также экспрессионную кассету с геном устойчивости к генетицину (неомицину).
Пример 2
Создание стабильных клеточных линий
Клеточную линию Jurkat NFAT-FLuc создали путем электропорации клеток Jurkat вектором pOGI_NFAT-FLuc с последующей селекцией клеток на гигромицине Б. Из них отобрали резистентные клоны, показавшие максимальное увеличение экспрессии люциферазы при добавлении aCD3.
Клеточную линию Jurkat NFAT-FLuc PD-1 создали электропорацией клеток Jurkat NFAT-FLuc вектором pSX_PD-1 с последующей селекцией на генетицине. Целевые клоны отбирали по максимальному содержанию PD-1 на поверхности клеток, которое определяли с помощью проточного цитофлуориметра Guava 12HT («Millipore», США) после окрашивания клеток aPD-1.
Клеточную линию Raji PD-L1 создали электропорацией клеток Raji вектором pSX_PD-L1 с последующей селекцией на генетицине. Целевые клоны отбирали по максимальному содержанию PD-L1 на поверхности клеток, которое определяли методом проточной цитофлуориметрии после окрашивания клеток aPD-L1.
Клеточную линию Jurkat NFAT-FLuc PD-1 CAR создали трансдукцией клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 лентивирусными частицами, кодирующими химерный антигенный рецептор (CAR), соединенный пептидным линкером T2A с зеленым флюоресцентным белком (GFP) («BIOCAD», Россия). Пул клеток анализировали на наличие GFP-позитивных клеток методом проточной цитофлуориметрии.
Клеточную линию CHO PD-L1 tmaCD3 создали трансфекцией клеток CHO-K1 вектором pSX_PD-L1 и pSX_tmaCD3 с последующей селекцией на генетицине и пуромицине. Клоны скринировали с помощью флюоресцентно меченных антител против PD-L1 и Fc-фрагмента антител человека методом проточной цитофлуориметрии. Целевые клоны отбирали по максимальному содержанию PD-L1 и трансмембранных aCD3 (tmaCD3) на поверхности клеток, которое определяли методом проточной цитофлуориметрии окрашиванием клеток aPD-L1 и антителами против Fc-фрагмента антител человека.
Пример 3
Функциональные тесты
Тесты проводили в белых культуральных 96-луночных планшетах для работы с люминесценцией («SPL Life Sciences», Республика Корея). Если не указано другое, суспензия содержала 50 000 клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 и 25 000 клеток Raji PDL1 на лунку и aCD3/aTAA1 в концентрации 1 нг/мл. В случае замены клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 клетками Jurkat NFAT-FLuc PD-1 CAR, их количество также составляло 50 000 клеток на лунку. В случае замены клеток Raji PD-L1 клетками Raji, либо CHO PD-L1 tmaCD3, их количество также составляло 25 000 клеток на лунку. Конечный объем клеточной суспензии в лунке составлял 100 мкл, все компоненты суспензии готовили в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки. После добавления всех компонентов планшеты инкубировали в течение 16 ч при 37 °С в атмосфере с 5% CO2, далее измеряли интенсивность люминесценции в лунках с использованием набора ONE-Glo и планшетного ридера SPARK 20M («Tecan», Швейцария).
Пример 4
Обработка данных
Для построения кривых зависимости величины активации клеток от концентрации указанного в эксперименте антитела использовали 4-х параметрическую логистическую аппроксимирующую функцию. Уравнение функции выглядит следующим образом:
где x – концентрация антитела, в нг/мл; max – верхняя асимптота; min – нижняя асимптота; Hillslope – параметр кривизны; EC50 – значение полуэффективной концентрации, в нг/мл.
Аппроксимацию и построение графиков проводили в программном пакете SigmaPlot, (SYSTAT Software). Из аппроксимирующего уравнения кривой определяли параметр полуэффективной концентрации (EC50). Измерения всех экспериментальных точек проводили как минимум в двух повторах. Точки, приведенные на рисунках, соответствуют среднему значению по всем повторам, планки погрешностей, приведенные на рисунках, – значениям стандартного отклонения для соответствующих повторов.
Пример 5
Выбор варианта активации CD3
В ходе данной работы рассмотрены несколько вариантов активации CD3, которые могут быть использованы в тест-системе (фиг. 1):
1. Взаимодействие T-клеточного рецептора (TCR) со специфичным ему комплексом пептида и главного комплекса гистосовместимости (MHC) является способом активации, наиболее близким к природному механизму действия (фиг. 1, а).
2. Суперантигены способны одновременно связывать β-цепь TCR с MHC класса 2 (MHC-II), что имитирует узнавание TCR комплекса MHC/пептид (фиг. 1, б). В качестве примера суперантигена в работе использовали SEB (стафилококковый энтеротоксин Б).
3. Растворимые активирующие антитела против CD3ε наиболее часто используют для активации CD3 (фиг. 1, в).
4. Трансмембранные антитела против CD3ε, представленные на клетках-мишенях, обычно используют в описанных тест-системах для aPD-1 и aPD-L1 (фиг. 1, г).
5. CAR+ (CAR-положительные) эффекторные клетки могут оказаться интересной альтернативой для тестирования aPD-1 и aPD-L1. Внутриклеточная часть CAR обычно включает в себя сигнальный домен CD3ζ, который обеспечивает активацию сигнальных каскадов, аналогичных полноразмерному CD3 комплексу (фиг. 1, д). Есть сообщения об усилении эффекта CAR-T терапии при ее совмещении с блокаторами PD-1/PD-L1.
6. Биспецифические aCD3/aTAA являются еще одним вариантом активации CD3 (фиг. 1, е). В одном из вариантов воплощения изобретения TAA (опухоль-ассоциированный антиген человека) выбран из TAA1 или TAA2, где TAA1 является CD20, TAA2 является CD19,
Активация, опосредованная взаимодействием TCR с комплексом MHC/пептид, сложна с точки зрения практической реализации относительно других подходов и далее рассматриваться в данной работе не будет.
Для определения оптимального варианта активации CD3 при разработке тест-системы сначала сравнили только растворимые активаторы: aCD3, aCD3/aTAA1, aCD3/aTAA2 и SEB (фиг. 2). Активаторы CD3 оценивали по двум параметрам: абсолютная активация (интенсивность люминесценции образца в системе, содержащей эффекторные клетки, клетки-мишени, активатор и aPD-1) и относительная активация (отношение интенсивности люминесценции образцов, содержащих эффекторные клетки, клетки-мишени, активатор и aPD-1, к интенсивности люминесценции аналогичных образцов, не содержащих aPD-1). Абсолютная активация тест-системы на основе aCD3/aTAA1 и aCD3/aTAA2 примерно в 2–3 раза больше, чем на основе aCD3 и SEB. При этом стоит отметить, что концентрации aCD3 и SEB, используемые в исследовании, превышают концентрацию биспецифических антител 1000 и 100 раз соответственно. Растворимые aCD3, в отличие от других описанных выше активаторов CD3, вызывают активацию всех эффекторных клеток, а не только тех, которые непосредственно взаимодействуют с клетками-мишенями. При использовании PD-L1+ клеток-мишеней опосредованное PD-1 подавление CD3-зависимой активации происходит не во всех эффекторных клетках. Это приводит к повышению фонового уровня сигнала в системе и, как следствие, низкому значению относительной активации. Относительная активация для тест-системы с использованием aCD3/aTAA1 и aCD3/aTAA2 составляет примерно 5–6 раз, aCD3 – 1,5 раза, SEB – 2 раза. Таким образом, aCD3 и SEB уступают биспецифическим антителам по абсолютной и относительной активации и не рассматривались в дальнейших исследованиях. Также суперантигены являются токсинами, что делает их использование нежелательным, если есть альтернативные варианты.
Преимущество растворимых активаторов CD3 по сравнению с трансмембранными активирующими молекулами заключается в возможности подбора их оптимальной концентрации, что делает систему более гибкой (фиг. 3, фиг. 4). Максимальную кратность увеличения интенсивности люминесценции при добавлении aPD-1 наблюдали в диапазоне 0,1–1 нг/мл для обоих aCD3/aTAA. Для экспериментов использовали концентрацию aCD3/aTAA 1 нг/мл, при которой сохраняется максимальный уровень относительной активации и наблюдаются более высокие абсолютные значения интенсивности люминесценции.
Далее мы сравнили 4 тест-системы, основанные на одном из следующих вариантов активации: двух вариантов aCD3/aTAA, клеток-мишеней с трансмембранным aCD3 (антителом против CD3) или CAR+ эффекторных клеток (фиг. 5, фиг. 6). По значениям абсолютной активации вариант с использованием CAR+ эффекторных клеток примерно в 5 раз превосходит варианты, основанные на aCD3/aTAA и клетках-мишенях с трансмембранным aCD3. Относительная активация в вариантах с aCD3/aTAA превосходит варианты с использованием трансмембранных молекул в 2-3 раза. При этом по относительной активации тест-система с использованием aCD3/aTAA1 превосходит систему на основе aCD3/aTAA2.
Экспериментально показали, что из всех проверенных вариантов максимальная относительная активация при добавлении aPD-1 наблюдается при использовании биспецифических aCD3/aTAA в качестве активаторов CD3 (фиг. 2, фиг. 5, фиг. 6). Кроме того, к преимуществам их использования можно отнести низкий фоновый сигнал (в отличие от aCD3), исключение дополнительных генно-инженерных работ (в отличие от CAR и tmaCD3), нетоксичность (в отличие от суперантигенов).
Тест-система, содержащая CAR качестве активаторов CD3, хоть и требует больше генно-инженерных работ по сравнению с тест-системой, содержащей биспецифические aCD3/aTAA антитела качестве активаторов CD3, позволяет оценивать ингибирующее влияние PD-1 на CAR-опосредованную активацию CAR-T клеток. Потенциально подход может быть использован для разработки препаратов на основе CAR.
Пример 6
Характеристика тест-системы
Для доказательства специфичности выбранной тест-системы ее использовали для тестирования aPD-1, aPD-L1, aCTLA4 и aHER2 (фиг. 7). В выбранной тест-системе подавление CD3-зависимой активации обеспечивается наличием PD-1 на эффекторных клетках и PD-L1 на клетках-мишенях. Реактивация NFAT-зависимой экспрессии гена, кодирующего FLuc, происходит при добавлении aPD-1 или aPD-L1, но не aCTLA4 или aHER2, используемых в качестве отрицательного контроля. Кривые зависимости интенсивности люминесценции образцов от концентрации антител могут быть описаны 4-х параметрическим логистическим уравнением, что позволяет сравнивать исследуемые препараты по значениям EC50.
Пример 7
Исследование стабильности образцов aPD-1 и aPD-L1
По 50 мкл исходных растворов aPD-1 и aPD-L1 (c концентрацией 25 мг/мл) инкубировали в микропробирках объемом 200 мкл в ПЦР-амплификаторе («Bio-Rad», США) в течение 1 ч при указанных температурах. Исследование проводили как описано в примере 3 «Функциональные тесты».
Для определения способности тест-системы различать препараты ингибиторов PD-1/PD-L1 с различной активностью мы использовали препараты aPD-1 и aPD-L1, которые были подвергнуты термическому стрессу (фиг. 8, фиг. 9). Наблюдается прямая зависимость между значениями EC50 и температуры, при которой были проинкубированы препараты. Таким образом система способна различать препараты aPD-1 и aPD-L1 с различным уровнем активности и может быть успешно использована для определения их стабильности.
Пример 8
Исследование линейного диапазона тест-системы.
Для сравнения ожидаемой и экспериментально определенной активности aPD-1 и aPD-L1 готовили разведения данных препаратов в концентрациях 200%, 140%, 70% и 50% относительно концентрации стандартного образца, максимальная конечная концентрация которого в тесте составляла 100 мкг/мл, его активность принимали за 100%. Исследование проводили, как описано в разделе «Функциональные тесты». Экспериментально определенную активность рассчитывали, как отношение экспериментально определенной EC50 стандарта к экспериментально определенной EC50 для данной концентрации, умноженное на 100%.
Тест-система может быть использована, если активность исследуемого образца совпадает с диапазоном, в котором система сохраняет линейную зависимость активности препарата от его концентрации. Для определения линейности тест-системы в диапазоне 50–200% были использованы препараты aPD-1 и aPD-L1 с ожидаемой активностью 50%, 70%, 100%, 140% и 200% относительно стандарта, активность которого принимали за 100% (фиг. 10, фиг. 11). Показано, что их активность в эксперименте схожа с ожидаемой. Система является линейной в диапазоне 50–200% относительно активности стандарта для aPD-1 и aPD-L1.
Таким образом, разработанная тест-система, содержащая биспецифические aCD3/aTAA антитела в качестве активаторов CD3 (фиг. 12), характеризуется максимальной относительной активацией при добавлении aPD-1 среди всех проверенных вариантов (фиг. 2, фиг. 5, фиг. 6). Кроме того, к преимуществам ее использования можно отнести низкий фоновый сигнал (в отличие от aCD3), исключение дополнительных генно-инженерных работ (в отличие от CAR и tmaCD3), нетоксичность (в отличие от суперантигенов).
Claims (32)
1. Тест-система для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащая:
а. эффекторные репортерные клетки, имеющие на своей поверхности функциональный CD3 комплекс, PD-1 и содержащие репортерный ген под контролем CD3-зависимого промотора,
б. клетки-мишени, представляющие на своей поверхности PD-L1,
в. активатор CD3-зависимого сигнального каскада,
где активатор CD3-зависимого сигнального каскада представляет собой биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом.
2. Тест-система для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащая:
а. эффекторные репортерные клетки, имеющие на своей поверхности производное функционального CD3 комплекса, активатор CD3-зависимого сигнального каскада, PD-1 и содержащие репортерный ген под контролем CD3-зависимого промотора,
б. клетки-мишени, представляющие на своей поверхности PD-L1,
где производным функционального CD3 комплекса и активатором CD3-зависимого сигнального каскада одновременно является химерный антигенный рецептор, включающий в себя домен CD3.
3. Тест-система по п. 1, где биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом, представляет собой биспецифическое анти-СD3/анти-ТАА антитело.
4. Тест-система по п. 3, где анти-СD3/анти-ТАА антитело выбрано из анти-CD3/aнти-CD19 антитела, анти-CD3/aнти-CD20 антитела.
5. Тест-система по пп. 1, 2, где эффекторные репортерные клетки представляют собой Т-лимфоциты.
6. Тест-система по п. 5, где Т-лимфоциты представляют собой Jurkat.
7. Тест-система по пп. 1, 2, где клетки-мишени представляют собой Raji или СНО-K1.
8. Тест-система по пп. 1, 2, где репортерный ген выбран из гена, кодирующего флюоресцентный или люминесцентный белок.
9. Тест-система по п. 8, где люминесцентный белок представляет собой люциферазу.
10. Тест-система по пп. 1, 2, где СD3-зависимый промотор выбран из NFAT-чувствительного промотора или NF-κВ-чувствительного промотора.
11. Набор для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащий тест-систему по любому из пп. 1-10, и при необходимости инструкцию.
12. Применение тест-системы по любому из пп. 1-10 для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1.
13. Применение набора по п. 11 для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1.
14. Способ анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, включающий:
а. добавление к тест-системе по любому из пп. 1-10 антитела против PD-1 или антитела против PD-L1,
б. инкубацию,
в. измерение интенсивности сигнала продукта экспрессии репортерного гена,
г. обработку полученных данных.
15. Способ по п. 14, где обработка полученных данных включает установление значения ЕС50 антитела против PD-1 или антитела против PD-L1.
16. Способ определения функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, включающий:
а. добавление к тест-системе по любому из пп. 1-10 антитела против PD-1 или антитела против PD-L1,
б. инкубацию,
в. измерение интенсивности сигнала продукта экспрессии репортерного гена,
г. обработку полученных данных, в том числе установление значения ЕС50 антитела против PD-1 или антитела против PD-L1,
д. расчет отношения экспериментально определенной ЕС50 стандартного образца, активность которого принимают за 100%, к экспериментально определенной ЕС50 сравниваемого антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, умноженного на 100%.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019120893A RU2731896C1 (ru) | 2019-07-04 | 2019-07-04 | Тест-система для анализа функциональной активности антител против pd-1 и антител против pd-l1 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019120893A RU2731896C1 (ru) | 2019-07-04 | 2019-07-04 | Тест-система для анализа функциональной активности антител против pd-1 и антител против pd-l1 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2731896C1 true RU2731896C1 (ru) | 2020-09-09 |
Family
ID=72421809
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019120893A RU2731896C1 (ru) | 2019-07-04 | 2019-07-04 | Тест-система для анализа функциональной активности антител против pd-1 и антител против pd-l1 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2731896C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2282191C2 (ru) * | 2004-06-07 | 2006-08-20 | Уральский НИИ охраны материнства и младенчества | Способ определения функциональной активности антихламидийных антител |
| WO2012018538A2 (en) * | 2010-07-26 | 2012-02-09 | Schering Corporation | Bioassays for determining pd-1 modulation |
| US20160169869A1 (en) * | 2014-11-20 | 2016-06-16 | Promega Corporation | Systems and methods for assessing modulators of immune checkpoints |
-
2019
- 2019-07-04 RU RU2019120893A patent/RU2731896C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2282191C2 (ru) * | 2004-06-07 | 2006-08-20 | Уральский НИИ охраны материнства и младенчества | Способ определения функциональной активности антихламидийных антител |
| WO2012018538A2 (en) * | 2010-07-26 | 2012-02-09 | Schering Corporation | Bioassays for determining pd-1 modulation |
| US20160169869A1 (en) * | 2014-11-20 | 2016-06-16 | Promega Corporation | Systems and methods for assessing modulators of immune checkpoints |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bloemberg et al. | A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells | |
| Bhatt et al. | KIR3DL3 is an inhibitory receptor for HHLA2 that mediates an alternative immunoinhibitory pathway to PD1 | |
| CN107106608B (zh) | 用于评估免疫检查点调节剂的系统和方法 | |
| US20240084253A1 (en) | Method of assessing activity of recombinant antigen receptors | |
| Fuertes Marraco et al. | Inhibitory receptors beyond T cell exhaustion | |
| Hecht et al. | ILDR2 is a novel B7-like protein that negatively regulates T cell responses | |
| KR20150094674A (ko) | 고처리량 수용체:리간드 확인을 위한 방법 | |
| Kwong et al. | Generation, affinity maturation, and characterization of a human anti-human NKG2D monoclonal antibody with dual antagonistic and agonistic activity | |
| Zhou et al. | 4IgB7‐H3 is the major isoform expressed on immunocytes as well as malignant cells | |
| KR102499955B1 (ko) | 항체 선택 방법 | |
| US20220348657A1 (en) | Bioassay for t-cell co-stimulatory proteins containing fc domains | |
| Elsayed et al. | Generation of a novel fully human non-superagonistic anti-CD28 antibody with efficient and safe T-cell co-stimulation properties | |
| RU2731896C1 (ru) | Тест-система для анализа функциональной активности антител против pd-1 и антител против pd-l1 | |
| US20220154174A1 (en) | Method of Selecting for Antibodies | |
| US20200174011A1 (en) | Antigen receptor screening assay | |
| Jeon et al. | Establishment of HLA class I and MICA/B null HEK-293T panel expressing single MICA alleles to detect anti-MICA antibodies | |
| CN107435065A (zh) | 鉴定灵长类抗体的方法 | |
| Jost et al. | CAR-J cells for antibody discovery and lead optimization of TCR-like immunoglobulins | |
| US20250066760A1 (en) | Chimeric antigen receptor (car) vectors and libraries and methods of high throughput car screening | |
| EP4226943A1 (en) | Therapeutic agent for immune/inflammatory disease | |
| Chandan et al. | Receptomics and Extracellular Interactomics for Biotherapeutic Characterization | |
| Dubovik et al. | Modular cell line for scalable and rapid in vitro evaluation of chimeric antigen receptors | |
| US10042975B2 (en) | Method for identifying antigen-specific antibodies in primate | |
| HK40077368A (en) | Methods of measuring cell-mediated killing by effectors | |
| CN114787373A (zh) | 测量通过效应子进行的细胞介导的杀伤的方法 |