ES2890677T3 - Composiciones para modular la expresión de ataxina 2 - Google Patents

Abstract

Un oligonucleótido modificado de cadena sencilla que consiste de 12 a 30 nucleósidos enlazadas y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende por lo menos 12 nucleobases consecutivas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de las SEQ ID NO: 18, 19 o 98, en donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es por lo menos un 90% complementaria a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 y en donde el oligonucleótido modificado de cadena sencilla reduce la expresión del ARNm y/o proteína de ataxina 2.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones para modular la expresión de ataxina 2

Campo

En la presente se divulgan composiciones y métodos para reducir la expresión de ARNm y proteína de ataxina 2 (ATXN2) en un animal. Tales métodos son útiles para tratar, prevenir o mejorar enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2), la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y el parkinsonismo inhibiendo la expresión de ataxina 2 inhibiendo la expresión de ataxina 2 en un animal.

Antecedentes

La ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2) es una enfermedad neurodegenerativa autosómica dominante caracterizada por la pérdida progresiva funcional y celular de neuronas en el cerebelo, el tronco encefálico y la médula espinal. La causa de la SCA2 es la expansión de CAG en el gen ATXN2 que da como resultado la expansión de poliglutamina (polyQ) en la proteína ataxina-2. Los pacientes con SCA2 se caracterizan por ataxia cerebelosa progresiva, movimientos oculares sacádicos lentos y otras características neurológicas como neuropatía (Pulst, S.M. (ed.), Genetics of Movement Disorders. Elsevier, Inc., Amsterdam, 2003, págs. 19-34.). La expansión moderada de CAG en el gen ATXN2 también se asocia con parkinsonismo o esclerosis lateral amiotrófica (ELA) indistinguible de las formas idiopáticas de estas enfermedades (Kim et al, Arch. Neurol, 2007, 64: 1510-1518; Ross et al, Hum. Mol. Genet, 2011, 20: 3207-3212; Corrado et al, Hum. Genet, 2011, 130: 575-580; Elden et al., Nature, 2010, 466: 1069­ 1075; Van Damme et al., Neurology, 2011, 76: 2066-2072).

Las funciones patogénicas de las proteínas de la enfermedad poliQ que se producen con la expansión de poliQ pueden atribuirse a la ganancia de toxicidad asociada con el desarrollo de cuerpos de inclusión intranucleares 0 con oligómeros tóxicos solubles (Lajoie et al, PLoS One, 2011, 5: e15245). Mientras que los cerebros de pacientes con SCA2 se caracterizan por la pérdida de células de Purkinje, las células de Purkinje de SCA2 carecen de cuerpos de inclusión, lo que indica que la ataxina-2 expandida con poliQ puede provocar toxicidad que no está relacionada con la formación de cuerpos de inclusión (Huynh et al, Ann. Neurol, 1999, 45: 232- 241). Las funciones ganadas en la ataxina-2 expandida con poliQ pueden incluir acumulación anómala en los cuerpos de Golgi (Huynh et al, Hum. Mol Genet., 2003, 12: 1485-1496), ganancia de funciones normales (Duvick et al, Neuron, 2010, 67: 929-935) y secuestro de factores de transcripción (TF) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa como para otras proteínas poliQ (Yamanaka et al, Methods Mol. Biol, 2010: 648, 215-229; Koshy et al, Hum. Mol Genet, 1996, 5: 1311-1318; Burke et al., Nat. Med., 1996, 2: 347-350). Se han caracterizado algunas funciones normales de la ataxina-2. La ataxina-2 está presente en gránulos de estrés y cuerpos P, lo que sugiere funciones en el secuestro de ARNm y la regulación de la traducción de proteínas durante el estrés (Nonhoff et al, Mol Biol Cell, 2007, 18: 1385-1396). La sobreexpresión de ataxina-2 interfería con el ensamblaje del cuerpo P, mientras que la subexpresión interfería con el ensamblaje de los gránulos de tensión (Nonhoff et al, Mol. Biol. Cell, 2007, 18: 1385-1396). Las interacciones con la proteína de unión a poliA 1, el factor de corte y empalme de ARN A2BPl/Fox1 y los polirribosomas apoyan aún más las funciones de la ataxina-2 en el metabolismo del ARN (Shibata et al, Hum. Mol. Genet., 2000, 9: 1303-1313; Ciosk et al, Development, 2004, 131: 4831 -4841; Satterfield et al., Hum. Mol. Genet, 2006, 15: 2523-2532). La ataxina-2 es un regulador de la internalización y señalización del receptor de EGF mediante sus interacciones con la quinasa SRC y la proteína endocítica CIN85 (Nonis et al, Cell Signal., 2008, 20: 1725-1739). La ataxina-2 también interactúa con la proteína relacionada con ELA TDP-43 de una manera dependiente del ARN y la ELA familiar y esporádica se asocia con la aparición de una expansión de repetición de cAg normal prolongada ATXN2 (Elden et al, Nature, 2010, 466: 1069-1075; Van Damme et al, Neurology, 2011, 76: 2066-2072).

Actualmente, hay una falta de opciones aceptables para tratar tales enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, un objeto de la presente es divulgar métodos para el tratamiento de tales enfermedades.

La WO 2010/014592 analiza ampliamente métodos para inhibir la expresión de proteína de poliglutamina. Sumario de la invención

La presente invención proporciona un oligonucleótido modificado de cadena sencilla que consiste de 12 a 30 nucleósidos enlazadas y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende por lo menos 12 nucleobases consecutivas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de las SEQ ID NO: 18, 19 o 98, en donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es por lo menos un 90% complementaria a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 y en donde el oligonucleótido modificado de cadena sencilla reduce la expresión del ARNm y/o proteína de ataxina 2.

La invención también proporciona un oligonucleótido modificado de cadena sencilla que consiste de 20 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende por lo menos 15 nucleobases consecutivas de la SEQ ID NO: 18, en donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es por lo menos un 100% complementaria a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, en donde por lo menos un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende un azúcar modificado, en donde el por lo menos un azúcar modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietilo, en donde por lo menos un nucleósido comprende una nucleobase modificada que es una 5-metilcitosina, en donde por lo menos un enlace internucleosídico es un enlace de fosforotioato y por lo menos un enlace internucleosídico es un enlace de fosfodiéster, y en donde el oligonucleótido modificado de cadena sencilla reduce la expresión del ARNm y/o proteína de ataxina 2.

La invención también proporciona un oligonucleótido modificado de cadena sencilla que consiste de 20 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende por lo menos 19 nucleobases consecutivas de la SEQ ID NO: 19, en donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es por lo menos un 100% complementaria a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, en donde por lo menos un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende un azúcar modificado, en donde el por lo menos un azúcar modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietilo, en donde por lo menos un nucleósido comprende una nucleobase modificada que es una 5-metilcitosina, en donde por lo menos un enlace internucleosídico es un enlace de fosforotioato y por lo menos un enlace internucleosídico es un enlace de fosfodiéster, y en donde el oligonucleótido modificado de cadena sencilla reduce la expresión del ARNm y/o proteína de ataxina 2.

La invención también proporciona una composición que comprenden el oligonucleótido modificado de cadena sencilla de la invención y por lo menos uno de un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en donde el diluyente farmacéuticamente aceptable es solución salina tamponada con fosfato (PBS). Sumario de la divulgación

En la presente se divulgan métodos, compuestos y composiciones para modular la expresión de ARNm y proteína de Ataxina 2 (ATXN2). En ciertas realizaciones, los compuestos útiles para modular la expresión de ARNm y proteína de Ataxina 2 son compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son oligonucleótidos modificados.

En ciertas realizaciones, la modulación puede producirse en una célula o tejido. En ciertos ejemplos, la célula o tejido está en un animal. En ciertos ejemplos, el animal es un humano. En ciertas realizaciones, se reducen los niveles de ARNm de Ataxina 2. En ciertas realizaciones, se reducen los niveles de proteína de ataxina 2. Tal reducción puede producirse de una manera dependiente del tiempo o de unamanera dependiente de la dosis.

También se divulgan métodos, compuestos y composiciones útiles para prevenir, tratar y mejorar enfermedades, trastornos y afecciones. En ciertas realizaciones, tales enfermedades, trastornos y afecciones relacionadas con la Ataxina 2 son enfermedades neurodegenerativas. En ciertas realizaciones, tales enfermedades, trastornos y afecciones neurodegenerativas incluyen ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2), esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y parkinsonismo.

Tales enfermedades, trastornos y afecciones pueden tener uno o más factores de riesgo, causas o resultados en común. Ciertos factores de riesgo y causas para el desarrollo de un trastorno neurodegenerativo incluyen envejecer, tener antecedentes personales o familiares o predisposición genética. Ciertos síntomas y resultados asociados con el desarrollo de un trastorno neurodegenerativo incluyen, pero no se limitan a, ataxia, dificultades para hablar y tragar, rigidez, temblores, oftalmoplejía, ralentización sacádica, neuropatía periférica, atrofia, distonía, corea y demencia.

En ciertos ejemplos, los métodos de tratamiento incluyen administrar un compuesto antisentido de Ataxina 2 a un individuo con necesidad de ello. En ciertos ejemplos, los métodos de tratamiento incluyen administrar un oligonucleótido modificado de Ataxina 2 a un individuo con necesidad de ello.

Descripción detallada

Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son ejemplares y explicativas solamente y no son restrictivas de la invención, como se reivindica. En la presente, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se usa en la presente, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, como se usa en la presente, el uso de "y" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "que incluye" así como otras formas, como "incluye" e "incluido", no es limitativo. Además, términos como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.

Los encabezados de las secciones usados en la presente son solo con propósitos organizativos y no debe interpretarse que limitan la materia descrita.

Definiciones

A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica descritas en la presente son las bien conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Pueden usarse técnicas estándar para síntesis química y análisis químico.

A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:

"2-O-metoxietil" (también de 2'-MOE y ² -OCH²CH²-OCH³ y MOE) se refiere a una modificación de O-metoxietilo de la posición 2' de un anillo de furanosa. Un azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo es un azúcar modificado.

"Nucleósido 2'-MOE" (también nucleósido 2'-O-metoxietilo) significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar modificado con 2'-MOE.

"Nucleósido 2' sustituido" significa un nucleósido que comprende un sustituyente en la posición 2' del anillo de furanosa distinto de H u OH. En ciertas realizaciones, los nucleósidos 2' sustituidos incluyen nucleósidos con modificaciones de azúcares bicíclicos.

"5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.

"Aproximadamente" significa dentro del ±7% de un valor. Por ejemplo, si se indica, "los compuestos afectaron por lo menos aproximadamente al 70% de inhibición de Ataxina 2", se implica que los niveles de Ataxina 2 se inhiben dentro de un intervalo del 63% y el 77%.

"Administrado concomitantemente" se refiere a la coadministración de dos agentes farmacéuticos de cualquier manera en la que los efectos farmacológicos de ambos se manifiesten en el paciente al mismo tiempo. La administración concomitante no requiere que ambos agentes farmacéuticos se administren en una única composición farmacéutica, en la misma forma de dosificación o por la misma vía de administración. No es necesario que los efectos de ambos agentes farmacéuticos se manifiesten al mismo tiempo. Los efectos solo necesitan superponerse durante un período de tiempo y no es necesario que sean coextensivos.

"Administrar" significa proporcionar un agente farmacéutico a un animal e incluye, pero no se limita a, la administración por un profesional médico y la autoadministración.

"Mejoría" se refiere a una disminución, ralentización, detención o reversión de por lo menos un indicador de la gravedad de una afección o enfermedad. La gravedad de los indicadores puede determinarse mediante medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas por los expertos en la técnica.

"Animal" se refiere a un animal humano o no humano, incluyendo pero no limitado a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluyendo pero no limitados a, monos y chimpancés.

"Anticuerpo" se refiere a una molécula caracterizada por reaccionar específicamente con un antígeno de alguna manera, donde el anticuerpo y el antígeno se definen cada uno en términos del otro. Anticuerpo puede referirse a una molécula de anticuerpo completa o cualquier fragmento o región de la misma, como la cadena pesada, la cadena ligera, la región Fab y la región Fc.

"Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido con su ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico o proteína objetivo codificada por dicho ácido nucleico objetivo.

"Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo a través de enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos de cadena sencilla y de cadena doble, como oligonucleótidos antisentido, ARNip, ARNhc, ARNmc y compuestos basados en ocupación.

"Inhibición antisentido" significa la reducción de los niveles de ácido nucleico objetivo en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico objetivo en comparación con los niveles de ácido nucleico objetivo o en ausencia del compuesto antisentido.

"Mecanismos antisentido" son todos aquellos mecanismos que implican la hibridación de un compuesto con un ácido nucleico objetivo, en donde el resultado o efecto de la hibridación es o la degradación o la ocupación del objetivo con estancamiento concomitante de la maquinaria celular que implica, por ejemplo, transcripción o corte y empalme.

"Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido de cadena sencilla que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridación con un segmento correspondiente de un ácido nucleico objetivo.

"Ataxina 2" significa el gen de mamífero Ataxina 2 (ATXN2), incluyedo el gen humano Ataxina 2 (ATXN2). La ataxina 2 humana se ha mapeado en el cromosoma humano 12q24.1.

"Enfermedad asociada a Ataxina 2" significa cualquier enfermedad asociada con cualquier ácido nucleico de Ataxina 2 o producto de expresión del mismo. Tales enfermedades pueden incluir una enfermedad neurodegenerativa. Tales enfermedades neurodegenerativas pueden incluir ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2), esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y parkinsonismo.

"ARNm de ataxina 2" significa cualquier producto de expresión de ARN mensajero de una secuencia de ADN que codifica Ataxina 2.

"Ácido nucleico de Ataxina 2" significa cualquier ácido nucleico que codifica Ataxina 2. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un ácido nucleico de Ataxina 2 incluye una secuencia de ADN que codifica Ataxina 2, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica Ataxina 2 (incluyendo ADN genómico que comprende intrones y exones) y una secuencia de ARNm que codifica Ataxina 2. "ARNm de Ataxina 2" significa un ARNm que codifica una proteína de Ataxina 2.

"Proteína de Ataxina 2" significa el producto de expresión polipeptídica de un ácido nucleico de Ataxina 2. "Complementariedad de bases" se refiere a la capacidad para el emparejamiento de bases preciso de nucleobases de un oligonucleótido antisentido con nucleobases correspondientes en un ácido nucleico objetivo (es decir, hibridación), y está mediada por la unión de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inversa entre las nucleobases correspondientes.

"Azúcar bicíclico" significa un anillo de furanosa modificado por la formación de puente de dos átomos. Un azúcar bicíclico es un azúcar modificado.

"Nucleósido bicíclico" (también BNA) significa un nucleósido que tiene una fracción de azúcar que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar, formando de este modo un sistema de anillo bicíclico. En ciertas realizaciones, el puente conecta el carbono 4' y el carbono 2' del anillo de azúcar.

"Estructura de caperuza" o "fracción de caperuza terminal" significa modificaciones químicas, que se han incorporado en cualquier extremo terminal de un compuesto antisentido.

"cEt" o "etilo restringido" significa un nucleósido bicíclico que tiene una fracción de azúcar que comprende un puente que conecta el carbono 4' y el carbono 2', en donde el puente tiene la fórmula: 4'-CH(CH³)-O-2'.

"Etil nucleósido restringido" (también cEt nucleósido) significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH(CH³)-O-2'.

"Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que de alguna manera es químicamente diferente a otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene nucleósidos 2'-O-metoxietilo es químicamente distinta de una región que tiene nucleósidos sin modificaciones 2'-O-metoxietilo.

"Compuesto antisentido quimérico" significa un compuesto antisentido que tiene por lo menos dos regiones químicamente distintas, cada posición teniendo una pluralidad de subunidades.

"Coadministración" significa la administración de dos o más agentes farmacéuticos a un individuo. Los dos o más agentes farmacéuticos pueden estar en una única composición farmacéutica o pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Cada uno de los dos o más agentes farmacéuticos puede administrarse a través de la misma o diferentes vías de administración. La coadministración comprende la administración paralela o secuencial.

“Complementariedad” significa la capacidad de apareamiento entre bases nucleicas de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.

"Comprender", "comprende" y "que comprende" se entenderá que implica la inclusión de un paso o elemento o grupo de pasos o elementos expuestos pero no la exclusión de cualquier otro paso o elemento o grupo de pasos o elementos.

"Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.

"Diseñar" o "diseñado para" se refiere al proceso de diseñar un compuesto oligomérico que híbrida específicamente con una molécula de ácido nucleico seleccionada.

"Diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero que es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, en los fármacos que se inyectan, el diluyente puede ser un líquido, por ejemplo, una solución salina.

"Dosis" significa una cantidad específica de un agente farmacéutico proporcionada en una sola administración o en un período de tiempo específico. En ciertas realizaciones, una dosis puede administrarse en uno, dos o más bolos, comprimidos o inyecciones. Por ejemplo, en ciertas realizaciones en las que se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen que no se adapta fácilmente a una sola inyección, por lo tanto, pueden usarse dos o más inyecciones para lograr la dosis deseada. En ciertas realizaciones, el agente farmacéutico se administra mediante infusión durante un período de tiempo prolongado o de continuamente. Las dosis pueden indicarse como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes.

"Cantidad eficaz" en el contexto de modular una actividad o de tratar o prevenir una afección significa la administración de esa cantidad de agente farmacéutico a un sujeto con necesidad de tal modulación, tratamiento o profilaxis, ya sea en una única dosis o como parte de una serie, que es eficaz para la modulación de ese efecto, o para el tratamiento, la profilaxis o la mejora de esa afección. La cantidad eficaz puede variar entre los individuos dependiendo de la salud y el estado físico del individuo a tratar, el grupo taxonómico de los individuos a tratar, la formulación de la composición, la evaluación del estado médico del individuo y otros factores relevantes.

"Eficacia" significa la capacidad de producir un efecto deseado.

"Expresión" incluye todas las funciones mediante las cuales la información codificada de un gen se convierte en estructuras presentes y que operan en una célula. Tales estructuras incluyen, pero no se limitan a, los productos de transcripción y traducción.

"Complementariedad completa" o "100% complementario" significa que cada nucleobase de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en un segundo ácido nucleico. En ciertas realizaciones, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo es un segundo ácido nucleico.

“Gapmer” significa un compuesto antisentido quimérico en el que una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión de RNasa H se coloca entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. A la región interna puede hacerse referencia como "espacio" y las regiones externas puede hacerse referencia como "alas".

"Espacio estrechado" significa un compuesto antisentido quimérico que tiene un segmento de espacio de 9 o menos 2-desoxirribonucleósidos contiguos colocados entre e inmediatamente adyacentes a los segmentos de ala 5' y 3' que tienen de 1 a 6 nucleósidos.

"Espacio ampliado" significa un compuesto quimérico antisentido que tiene un segmento de espacio de 12 o más 2-desoxirribonucleósidos contiguos colocados entre e inmediatamente adyacentes a los segmentos de ala 5' y 3' que tienen de 1 a 6 nucleósidos.

"Hibridación" significa el alineamiento de moléculas de ácido nucleico complementarias. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no se limitan a, un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no se limitan a, un oligonucleótido antisentido y un objetivo de ácido nucleico.

"Identificar un animal que tiene una enfermedad asociada a Ataxina 2" significa identificar un animal al que se le ha diagnosticado una enfermedad asociada a Ataxina 2 o que está predispuesto a desarrollar una enfermedad asociada a Ataxina 2. Los individuos predispuestos a desarrollar una enfermedad asociada a Ataxina 2 incluyen aquellos que tienen uno o más factores de riesgo para desarrollar una enfermedad asociada a Ataxina 2 incluyendo, envejecer, tener historial personal o familiar o predisposición genética a una o más enfermedades asociadas a Ataxina 2. Tal identificación puede lograrse mediante cualquier método, incluyendo la evaluación del historial médico de un individuo y las pruebas o evaluaciones clínicas estándar, como las pruebas genéticas.

"Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes.

"Individuo" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.

"Inhibir Ataxina 2" significa reducir el nivel o expresión de un ARNm y/o proteína de Ataxina 2. En ciertas realizaciones, los niveles de ARNm y/o proteína de Ataxina 2 se inhiben en presencia de un compuesto antisentido dirigido a Ataxina 2, que incluyen un oligonucleótido antisentido que se dirige a Ataxina 2, en comparación con la expresión de ARNm y/o niveles de proteína de Ataxina 2 en ausencia de un compuesto antisentido de Ataxina 2, como un oligonucleótido antisentido.

"Inhibir la expresión o actividad" se refiere a una reducción o bloqueo de la expresión o actividad y no indica necesariamente una eliminación total de la expresión o actividad.

"Enlace internucleosídico" se refiere al enlace químico entre nucleósidos.

"Nucleósidos enlazados" significa nucleósidos adyacentes enlazados entre sí por un enlace internucleosídico.

"Ácido nucleico bloqueado" o "LNA" o "nucleósidos de LNA" significa monómeros de ácido nucleico que tienen un puente que conecta dos átomos de carbono entre la posición 4' y 2' de la unidad de azúcar del nucleósido, formando de este modo un azúcar bicíclico. Ejemplos de tales azúcares bicíclicos incluyen, pero no se limitan a A) a-L-Metilenoxi (4'-CH2-O-2 ') LNA, (B) p-D-Metilenoxi (4'-CH2-O-2') LNA, (C) Etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2') LNA, (D) Aminooxi (4'-CH2-O-N(R)-2') LNA y (^e ) Oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') LNA, como se representa a continuación.

Como se usa en la presente, los compuestos de LNA incluyen, pero no se limitan a, compuestos que tienen por lo menos un puente entre la posición 4' y 2' del azúcar en donde cada uno de los puentes comprende independientemente 1 o de 2 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de -[C(Ri )(R2)n]-, -C(Ri )=C(R2)-, -C(Ri )=N-, -C(=NRi )-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ri )2-, -S(=O)x- y -N(Ri )-;en donde: x es 0, 1 o 2; n es 1, 2, 3 o 4; cada Ri y R2 es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo alquilo, Ci -Ci2 , alquilo Ci -Ci2 sustituido, alquenilo C2-Ci2 , alquenilo C2-Ci2 sustituido, alquinilo C2-Ci2 , alquinilo C2-Ci2 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7, radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJi , N JJ2, SJi , N3, COOJi , acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-Ji ) o sulfoxilo (S(=O)-Ji ) y cada Ji y J2 es, independientemente, H, , alquilo Ci -Ci2 sustituido, alquenilo C2-Ci2 , alquenilo C2-Ci2 sustituido, alquinilo C2-Ci2 , alquinilo C2-Ci2 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo Ci -Ci2 , aminoalquilo Ci -Ci2 sustituido o un grupo protector.

Los ejemplos de grupos puente 4'- 2' abarcados dentro de la definición de LNA incluyen, pero no se limitan a, una de las fórmulas: -[C(Ri )(R2)n]-, -[C(Ri )(R2)n]-O-, -C(Ri R2)-N(Ri )-O- o -C(Ri R2)-O-N(Ri )-. Además, otros grupos puente abarcados por la definición de LNA son puentes 4-CH²-2', 4'-(CH²)²-2', 4'-(CH²)³-2', 4'-CH²-O-2', 4'-(CH²)²-O-2', 4'-CH²-O-N(Ri )-2' y 4'-CH²-N(Ri )-O-2'-, en donde cada Ri y R2 es, independientemente, H, un grupo protector o 2alquilo Ci -Ci2.

También se incluyen dentro de la definición de LNA los LNA en los que el grupo hidroxilo 2'- del anillo de azúcar ribosilo está conectado al átomo de carbono 4' del anillo de azúcar, formando de este modo un metilenoxi (4'-CH2-O-² ') para formar la fracción de azúcar bicíclico. El puente también puede ser un grupo metileno (-CH2-) que conecta el átomo de oxígeno 2' y el átomo de carbono 4', para lo cual se usa el término metilenoxi (4'-CH²-O-2') LNA. Además; en el caso de la fracción de azúcar bicílico que tiene un grupo puente de etileno en esta posición, se usa el término etilenoxi (⁴ -CH2CH2-O-² ') LNA, El a-L-metilenoxi (4'-CH²-O-2'), un isómero de metilenoxi (⁴ -CH2-O-2') LNA también está incluido dentro de la definición de LNA, como se usa en la presente.

"Malapareamiento" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso en el que una nucleobase de un primer ácido nucleico no es capaz de aparearse con la nucleobase correspondiente de un segundo ácido nucleico u objetivo.

"Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleósido de origen natural (es decir, un enlace internucleósido fosfodiéster).

"Nucleobase modificada" significa cualquier nucleobase distinta de adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).

"Nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, una fracción de azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.

"Nucleótido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, una fracción de azúcar modificado, enlace internucleosídico modificado y/o nucleobase modificada.

"Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende por lo menos un enlace internucleosídico modificado, azúcar modificado y/o nucleobase modificada.

"Azúcar modificado" significa sustitución y/o cualquier cambio de una fracción de azúcar natural.

"Monómero" significa una sola unidad de un oligómero. Los monómeros incluyen, pero no se limitan a, nucleósidos y nucleótidos, ya sean de origen natural o modificados.

“Motivo” significa el patrón de nucleósidos no modificados y modificados en un compuesto antisentido. "Fracción de azúcar natural" significa una fracción de azúcar que se encuentra en el ADN (2'-H) o ARN (2'-OH).

"Enlace internucleosídico de origen natural" significa un enlace fosfodiéster de 3' a 5'.

"Nucleobase no complementaria" se refiere a un par de nucleobases que no forman enlaces de hidrógeno entre sí ni soportan de otra manera la hibridación.

"Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye, pero no se limita a, ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos de cadena sencilla, ácidos nucleicos de cadena doble, ácidos ribonucleicos interferentes pequeños (ARNip) y microARN (miARN).

"Nucleobase" significa una fracción heterocíclica capaz de aparearse con una base de otro ácido nucleico. "Complementariedad de nucleobases" se refiere a una nucleobase que es capaz de apareamiento de bases con otra nucleobase. Por ejemplo, en el ADN, la adenina (A) es complementaria a la timina (T). Por ejemplo, en el ARN, la adenina (A) es complementaria al uracilo (U). En ciertas realizaciones, la nucleobase complementaria se refiere a una nucleobase de un compuesto antisentido que es capaz de aparearse con una nucleobase de su ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, si una nucleobase en una determinada posición de un compuesto antisentido es capaz de formar enlaces de hidrógeno con una nucleobase en una determinada posición de un ácido nucleico objetivo, entonces la posición del enlace de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico objetivo se considera complementaria en esa pareja de nucleobases.

"Secuencia de nucleobases" significa el orden de nucleobases contiguas independientemente de cualquier azúcar, enlace y/o modificación de nucleobases.

"Nucleósido" significa una nucleobase enlazada a un azúcar.

"Mimético de nucleósido" incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar el azúcar o el azúcar y la base y no necesariamente el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, miméticos de nucleósidos que tienen miméticos de azúcares morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, biciclo o triciclo, por ejemplo, unidades de azúcar no furanosa. El mimético de nucleótido incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar el nucleósido y el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos o morfolinos (morfolinos enlazados por -N(H)-C(=O)-O- u otro enlace no fosfodiéster). El sustituto de azúcar se superpone con el término mimético de nucleósidos, un poco más amplio, pero se pretende que indique el reemplazo de la unidad de azúcar (anillo de furanosa) únicamente. Los anillos de tetrahidropiranilo proporcionados en la presente son ilustrativos de un ejemplo de un sustituto de azúcar en el que el grupo de azúcar de furanosa se ha reemplazado por un sistema de anillo de tetrahidropiranilo. "Mimético" se refiere a grupos que están sustituidos por un azúcar, una nucleobase y/o un enlace internucleosídico. Generalmente, se usa un mimético en lugar del azúcar o la combinación de azúcar- enlace internucleosídico, y la nucleobase se mantiene para la hibridación con un objetivo seleccionado.

"Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato enlazado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido.

"Efecto fuera del objetivo" se refiere a un efecto biológico no deseado o perjudicial asociado con la modulación de la expresión de ARN o proteína de un gen distinto del ácido nucleico objetivo deseado. "Compuesto oligomérico" u "oNgómero" significa un polímero de subunidades monoméricas enlazaas que es capaz de hibridar con por lo menos una región de una molécula de ácido nucleico.

"Oligonucleótido" significa un polímero de nucleósidos enlazados, cada uno de los cuales puede estar modificado o no modificado, independientemente uno de otro.

"Administración parenteral" significa la administración mediante inyección (por ejemplo, inyección en bolo) o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular.

"Péptido" significa una molécula formada enlazando por lo menos dos aminoácidos mediante enlaces amida. Sin limitación, como se usa en la presente, péptido se refiere a polipéptidos y proteínas.

"Agente farmacéutico" significa una sustancia que proporciona un beneficio terapéutico cuando se administra a un individuo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido dirigido a Ataxina 2 es un agente farmacéutico.

"Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para administrar a un sujeto. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender un oligonucleótido antisentido y una solución acuosa estéril.

"Derivado farmacéuticamente aceptable" abarca sales farmacéuticamente aceptables, conjugados, profármacos o isómeros de los compuestos descritos en la presente.

"Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no le imparten efectos toxicológicos no deseados.

"Enlace fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos donde el enlace fosfodiéster se modifica reemplazando uno de los átomos de oxígeno que no forman puentes por un átomo de azufre. Un enlace fosforotioato es un enlace internucleosídico modificado.

"Porción" significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlazadas) de un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.

"Prevenir" o "previniendo" se refiere a retrasar o impedir la aparición o el desarrollo de una enfermedad, trastorno o afección durante un período de tiempo de minutos a días, de semanas a meses o indefinidamente.

"Profármaco" significa un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en una forma activa (es decir, un fármaco) dentro del cuerpo o células del mismo mediante la acción de enzimas endógenas u otros agentes químicos y/o afecciones.

"Cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio profiláctico o preventivo a un animal.

"Región" se define como una porción del ácido nucleico objetivo que tiene por lo menos una estructura, función o característica identificable.

"Ribonucleótido" significa un nucleótido que tiene un hidroxi en la posición 2' de la porción de azúcar del nucleótido. Los ribonucleótidos pueden modificarse con cualquiera de una variedad de sustituyentes.

"Sales" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no imparten al mismo efectos toxicológicos no deseados.

Los "segmentos" se definen como subporciones más pequeñas de regiones dentro de un ácido nucleico objetivo.

Las versiones "acortadas" o "truncadas" de los oligonucleótidos antisentido enseñadas en la presente tienen uno, dos o más nucleósidos eliminados.

"Efectos secundarios" significa respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento distinto de los efectos deseados. En ciertas realizaciones, los efectos secundarios incluyen, sin limitación, reacciones en el sitio de inyección, anomalías en las pruebas de función hepática, anomalías en la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anomalías del sistema nervioso central y miopatías.

"Oligonucleótido de cadena sencilla" significa un oligonucleótido que no está hibridado con una cadena complementaria.

"Sitios", como se usa en la presente, se definen como posiciones de nucleobases únicas dentro de un ácido nucleico objetivo.

"Ralentiza la progresión" significa una disminución en el desarrollo de la enfermedad.

"Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico objetivo para inducir un efecto deseado, a la vez que muestra efectos mínimos o nulos sobre ácidos nucleicos no objetivo en condiciones en las que se desea una unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos.

"Condiciones rigurosas de hibridación" o "condiciones rigurosas" se refiere a condiciones en las que un compuesto oligomérico hibridará con su secuencia objetivo, pero con un número mínimo de otras secuencias.

"Sujeto" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.

"Objetivo" se refiere a una proteína, cuya modulación se desea.

"Gen objetivo" se refiere a un gen que codifica un objetivo.

"Dirigir" o "dirigido" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que hibridará específicamente con un ácido nucleico objetivo e inducirá un efecto deseado.

"Ácido nucleico objetivo", "ARN objetivo" y "transcrito de ARN objetivo" y "objetivo de ácido nucleico" significan todos un ácido nucleico capaz de ser objetivo de compuestos antisentido.

"Región objetivo" significa una porción de un ácido nucleico objetivo a la que se dirigen uno o más compuestos antisentido.

"Segmento objetivo" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico objetivo al que se dirige un compuesto antisentido. "Sitio objetivo 5 '" se refiere al nucleótido más 5' de un segmento objetivo. "Sitio objetivo 3 '" se refiere al nucleótido más 3' de un segmento objetivo.

"Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.

"Tratar" o "tratando" o "tratamiento" se refiere a administrar una composición para efectuar una alteración o mejora de la enfermedad o afección.

"Nucleobases no modificadas" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).

"Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases, fracciones de azúcar y enlaces internucleosídicos de origen natural. En ciertas realizaciones, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, p-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleósido).

"Segmento de ala" significa una pluralidad de nucleósidos modificados para impartir a un oligonucleótido propiedades como actividad inhibidora mejorada, afinidad de unión aumentada por un ácido nucleico objetivo, o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.

Ciertas realizaciones

Ciertas realizaciones divulgan métodos, compuestos y composiciones para inhibir la expresión de ARNm y proteína de Ataxina 2. Ciertas realizaciones divulgan métodos, compuestos y composición para disminuir los niveles de ARNm y proteína de Ataxina 2.

Ciertas realizaciones incluyenn compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de Ataxina 2. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico de Ataxina 2 es la secuencia expuesta en el N° de registro de GENBANK NM_002973.3 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 1), el complemento del N° de registro de GENBANK NT_009775.17 truncado de los nucleótidos 2465000 a 2616000 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 2) y

el N° de registro de GENBANK BX410018.2 (incorporado en la presente como SEQ Id NO: 3).

Ciertas realizaciones divulgan métodos para el tratamiento, la prevención o la mejora de enfermedades, trastornos y afecciones asociadas con Ataxina 2 en un individuo con necesidad de ello. También se divulgan métodos para la preparación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad, trastorno o afección asociada con la Ataxina 2. Las enfermedades, trastornos y afecciones asociadas a la Ataxina 2 incluyen enfermedades neurodegenerativas. En ciertas realizaciones, las enfermedades asociadas a Ataxina 2 incluyen ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2), esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y parkinsonismo.

Ciertas realizaciones divulgan en la presente compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado

que consiste de 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende por lo menos 8, por lo menos 9, por lo menos 10, por lo menos 11, por lo menos 12, por lo menos 13, por lo menos 14, por lo menos 15, por lo menos 16, por lo menos 17, por lo menos 18, por lo menos 19 o por lo menos 20 nucleobases consecutivas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de las SEQ ID NO: 11-165.

En ciertas realizaciones divulgadas en la presente, la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es por lo menos un 80%, por lo menos un 81%, por lo menos un 82%, por lo menos un 83%, por lo menos un 84%, por lo menos un 85%, por lo menos un 86%, por lo menos un 87%, menos un 89%, por lo menos

un 90%, por lo menos

91%, por lo menos un 92%, menos un 94%, por lo menos un 95%, por lo menos un 96%, por lo menos un 97%, menos un 99% o un 100% complementaria a la SEQ ID NO: 1, SeQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.

La invención reivindicada es un oligonucleótido modificado de cadena sencilla.

En ciertas realizaciones, por lo menos un enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un

enlace internucleosídico modificado.

En ciertas realizaciones, por lo menos un enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleosídico fosforotioato.

En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleosídico fosforotioato.

En ciertas realizaciones, por lo menos un enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico fosfodiéster.

En ciertas realizaciones, por lo menos un enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y por lo menos

un enlace internucleósido es un enlace fosfodiéster.

En ciertas realizaciones, por lo menos un nucleósido comprende una nucleobase modificada.

En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.

En ciertas realizaciones, por lo menos un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende un azúcar modificado.

En ciertas realizaciones, por lo menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico.

En ciertas realizaciones, el azúcar bicíclico comprende un enlace químico entre la posición 2' y 4' del puente 4'-CH2-N(R)-O-2' del azúcar donde R es, independientemente, H, alquilo C1-C12, o un grupo protector.

En ciertas realizaciones, el azúcar bicíclico comprende un puente 4'-CH2-N(R)-O-2' en donde R es, independientemente, H, alquilo C1-C12 o un grupo protector.

En ciertas realizaciones, por lo menos un azúcar modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietilo.

En ciertas realizaciones, el azúcar modificado comprende un grupo 2'-O (CH²)²-OCH³.

En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende:

un segmento de espacio que consiste de 10 desoxinucleósidos enlazados;

un segmento de ala 5' que consiste de 5 nucleósidos enlazados; y

un segmento de ala 3' que consiste de 5 nucleósidos enlazados;

en donde el segmento de espacio se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.

En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consiste de 20 nucleósidos enlazados.

Ciertas realizaciones incluyen composiciones que comprenden cualquier compuesto descrito en la presente o una sal del mismo y por lo menos uno de un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Ciertas realizaciones divulgan métodos que comprenden administrar a un animal cualquier compuesto o composición descritos en la presente.

En ciertas realizaciones, el animal es un humano.

En ciertas realizaciones, la administración del compuesto previene, trata, mejora o ralentiza la progresión de una enfermedad, trastorno o afección asociada a Ataxina 2.

En ciertas realizaciones, la enfermedad, trastorno o afección de Ataxina 2 es ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2), esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y parkinsonismo.

Ciertas realizaciones divulgan el uso de cualquiera de los compuestos o composiciones descritos en la presente para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno neurodegenerativo.

Compuestos antisentido

Los compuestos oligoméricos incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido y ARNip. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" para un ácido nucleico objetivo, lo que significa que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo a través de enlaces de hidrógeno.

En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al que se dirige. En ciertas de tales realizaciones, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al que se dirige.

En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene una longitud de 12 a 30 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene una longitud de 12 a 25 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene una longitud de 12 a 22 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene una longitud de 14 a 20 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene una longitud de 15 a 25 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene una longitud de 18 a 22 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene una longitud de 19 a 21 subunidades. En ciertos ejemplos, en los que el compuesto antisentido tiene de 8 a 80, de 12 a 50, de 13 a 30, de 13 a 50, de 14 a 30, de 14 a 50, de 15 a 30, de 15 a 50, de 16 a 30, de 16 a 50, de 17 a 30, de 17 a 50, de 18 a 30, de 18 a 50, de 19 a 30, de 19 a 50, o de 20 a 30 subunidades enlazadas de longitud.

En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene 12 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene 13 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene 14 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene 15 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene 16 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene 17 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene 18 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene 19 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene 20 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene 21 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene 22 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene 23 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene una longitud de 24 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene 25 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene 26 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene 27 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene 28 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene 29 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene 30 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones divulgadas en la presente, el compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 tiene 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 subunidades enlazadas de longitud, o un intervalo definido por dos de cualquiera de los valores anteriores. En ciertas realizaciones el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido, y las subunidades enlazadas son nucleósidos.

En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de Ataxina 2 pueden acortarse o truncarse. Por ejemplo, puede eliminarse una sola subunidad del extremo 5' (truncamiento 5') o, alternativamente, del extremo 3' (truncamiento 3'). Un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 5', o alternativamente puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, los nucleósidos eliminados pueden dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido eliminado del extremo 5' y un nucleósido eliminado del extremo 3'.

Cuando solo hay una única subunidad adicional en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional puede estar localizada en el extremo 5' o 3' del compuesto antisentido. Cuando hay dos o más subunidades adicionales, las subunidades añadidas pueden ser adyacentes entre sí, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene dos subunidades añadidas al extremo 5' (adición 5'), o alternativamente al extremo 3' (adición 3'), del compuesto antisentido. Alternativamente, las subunidades añadidas pueden dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunidad añadida al extremo 5' y una subunidad añadida al extremo 3'.

Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases malapareadas sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), se probaron una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud para determinar su capacidad para inducir la escisión de un ARN objetivo en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases malapareadas cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido fueron capaces de dirigir la escisión específica del ARNm objetivo, aunque en menor grado que los oligonucleótidos antisentido que no contenían malapareamientos. De manera similar, la escisión específica del objetivo se logró usando oligonucleótidos antisentido de 13 nucleobases, incluyendo aquellos con 1 o 3 malapareamientos.

Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93: 463-471, marzo de 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene una complementariedad del 100% con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 malapareamientos con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión de tanto bcl-2 como bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.

Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16: 3341-3358, 1988) probaron una serie de oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases en tándem, y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 nucleobases compuestos de la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en tándem, respectivamente, por su capacidad para detener la traducción de DHFR humano en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobase por sí solo fue capaz de inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases antisentido.

Motivos de compuestos antisentido

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de Ataxina 2 tienen subunidades químicamente modificadas dispuestas en patrones o motivos para conferir a los compuestos antisentido propiedades como actividad inhibidora mejorada, afinidad de unión aumentada por un ácido nucleico objetivo o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.

Los compuestos antisentido quiméricos contienen típicamente por lo menos una región modificada para conferir una resistencia aumentada a la degradación por nucleasas, una captación celular aumentada, una afinidad de unión por el ácido nucleico objetivo aumentada y/o una actividad inhibidora aumentada. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede servir opcionalmente como sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que escinde la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN.

Los compuestos antisentido que tienen un motivo gapmer se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gapmer, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión de RNasaH se coloca entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gapmer, el segmento de espacio generalmente sirve como sustrato para la escisión de endonucleasas, mientras que los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, las regiones de un gapmer se diferencian por los tipos de fracciones de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de fracciones de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gapmer pueden incluir en algunas realizaciones p-D-ribonucleósidos, p-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos 2' modificados (tales nucleósidos 2' modificados pueden incluir 2'-MOE, y 2'-O-CH³, entre otros), y nucleósidos modificados con azúcar bicíclico (tales nucleósidos modificados con azúcar bicíclico pueden incluir los que tienen un puente 4'-(CH²) n-O-2 ', donde n = 1 o n = 2 y 4'-CH2-O-CH2-² '). En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir varios fracciones de azúcar modificado, que incluyen, por ejemplo, 2'-MOE. En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir varios fracciones de azúcar modificado y no modificado. En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir varias combinaciones de nucleósidos 2'-MOE y 2'-desoxinucleósidos.

Cada región distinta puede comprender fracciones de azúcar uniformes, variantes o fracciones de azúcar alternas. El motivo del ala-espacio-ala se describe con frecuencia como "X-Y-Z", donde "X" representa la longitud del ala 5', "Y" representa la longitud del espacio y "Z" representa la longitud del ala 3'. "X" y "Z" pueden comprender fracciones de azúcar uniformes, variantes o alternas. En ciertas realizaciones, "X" e "Y" pueden incluir uno o más 2'-desoxinucleósidos. "Y" puede comprender 2'-desoxinucleósidos. Como se usa en la presente, un gapmer descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que el espacio se coloca inmediatamente adyacente a cada una de las alas 5' y 3'. Por tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el ala 5' y el espacio, o el espacio y el ala 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en la presente puede tener un motivo gapmer. En ciertas realizaciones, "X" y "Z" son iguales; en otras realizaciones son diferentes.

En ciertas realizaciones, los gapmers descritos en la presente incluyen, por ejemplo, 20-meros que tienen un motivo de 5-10-5.

En ciertas realizaciones, los gapmers descritos en la presente incluyen, por ejemplo, 19-meros que tienen un motivo de 5-9-5.

En ciertas realizaciones, los gapmers descritos en la presente incluyen, por ejemplo, 18-meros que tienen un motivo de 5-8-5.

En ciertas realizaciones, los gapmers descritos en la presente incluyen, por ejemplo, 18-meros que tienen un motivo de 4-8-6.

En ciertas realizaciones, los gapmers descritos en la presente incluyen, por ejemplo, 18-meros que tienen un motivo de 6-8-4.

En ciertas realizaciones, los gapmers proporcionados en la presente incluyen, por ejemplo, 18-meros que tienen un motivo de 5-7-6.

Ácidos nucleicos objetivo, regiones objetivo y secuencias de nucleótidos

Las secuencias de nucleótidos que codifican la Ataxina 2 incluyen, sin limitación, las siguientes: N° de acceso GENBANK NM_002973.3 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 1), el complemento del N° de acceso GENBANKNT 009775.17 truncado de los nucleótidos 2465000 a 2616000 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 2) y N° de acceso GENBANK BX410018.2 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 3).

Se entiende que la secuencia expuesta en cada SEQ ID NO en los Ejemplos contenidos en la presente es independiente de cualquier modificación de una fracción de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Como tales, los compuestos antisentido definidos por una SEQ ID NO pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones de una fracción de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos por el número de Isis (N° Isis) indican una combinación de secuencia y motivo de nucleobases.

En ciertas realizaciones, una región objetivo es una región definida estructuralmente del ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, una región objetivo puede abarcar una UTR 3', una UTR 5', un exón, un intrón, una unión exón/intrón, una región codificante, una región de inicio de la traducción, una región de terminación de la traducción u otra región definida de ácido nucleico. Las regiones estructuralmente definidas para Ataxina 2 pueden obtenerse mediante el número de acceso de bases de datos de secuencias como NCBI. En ciertas realizaciones, una región objetivo puede abarcar la secuencia desde un sitio objetivo 5' de un segmento objetivo dentro de la región objetivo hasta un sitio objetivo 3' de otro segmento objetivo dentro de la misma región objetivo.

El direccionamiento incluye la determinación de por lo menos un segmento objetivo con el que hibrida un compuesto antisentido, de tal manera que se produce el efecto deseado. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es una reducción en los niveles de ácido nucleico objetivo de ARNm. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es la reducción de los niveles de proteína codificada por el ácido nucleico objetivo o un cambio fenotípico asociado con el ácido nucleico objetivo.

Una región objetivo puede contener uno o más segmentos objetivo. Es posible que se superpongan múltiples segmentos objetivo dentro de una región objetivo. Alternativamente, pueden no superponerse. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo están separados por no más de aproximadamente 300 nucleótidos. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo están separados por un número de nucleótidos que es, es aproximadamente, no es más de, no es más de aproximadamente, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nucleótidos en el ácido nucleico objetivo, o es un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo están separados por no más de, o no más de aproximadamente, 5 nucleótidos en el ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo son contiguos. Se contemplan regiones objetivo definidas por in intervalo que tiene un ácido nucleido de partida que es cualquiera de los sitios objetivo 5' o los sitios objetivo 3' enumerados en la presente.

Los segmentos objetivo adecuados se pueden encontrar dentro de una UTR 5', una región codificante, una UTR 3', un intrón, un exón o una unión exón/intrón. Los segmentos objetivo que contienen un codón de inicio o un codón de parada también son segmentos objetivo adecuados. Un segmento objetivo adecuado puede excluir específicamente una cierta región definida estructuralmente, como el codón de inicio o el codón de parada.

La determinación de segmentos objetivo adecuados puede incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico objetivo con otras secuencias en todo el genoma. Por ejemplo, puede usarse el algoritmo BLAST para identificar regiones de similitud entre diferentes ácidos nucleicos. Esta comparación puede evitar la selección de secuencias de compuestos antisentido que pueden hibridar de una manera no específica con secuencias distintas de un ácido nucleico objetivo seleccionado (es decir, secuencias no objetivo o fuera de la objetivo).

Puede haber variación en la actividad (por ejemplo, según se define por el porcentaje de reducción de los niveles de ácido nucleico objetivo) de los compuestos antisentido dentro de una región objetivo activa. En ciertas realizaciones, las reducciones en los niveles de ARNm de Ataxina 2 son indicativas de la inhibición de la expresión de Ataxina 2. Las reducciones en los niveles de una proteína de Ataxina 2 también son indicativas de la inhibición de la expresión del ARNm objetivo. Los cambios fenotípicos son indicativos de la inhibición de la expresión de Ataxina 2. La mejora de la función neurológica es indicativa de la inhibición de la expresión de Ataxina 2. La función motora y la memoria mejoradas son indicativas de la inhibición de la expresión de Ataxina 2.

Hibridación

En algunas realizaciones, se produce la hibridación entre un compuesto antisentido divulgado en la presente y un ácido nucleico de Ataxina 2. El mecanismo de hibridación más común implica enlaces de hidrógeno (por ejemplo, enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o de Hoogsteen invertidos) entre nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.

La hibridación puede producirse en varias condiciones. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y composición de las moléculas de ácido nucleico que se van a hibridar.

Los métodos para determinar si una secuencia puede hibridar específicamente con un ácido nucleico objetivo son bien conocidos en la técnica. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido incluidos en la presente pueden hibridar específicamente con un ácido nucleico de Ataxina 2.

Complementariedad

Un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido puede unirse mediante enlaces de hidrógeno con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico objetivo, de manera que se producirá un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico objetivo, como un ácido nucleico de Ataxina 2).

Pueden tolerarse nucleobases no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico de Ataxina 2 siempre que el compuesto antisentido siga siendo capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico objetivo. Además, un compuesto antisentido puede hibridar sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico de Ataxina 2 de tal manera que los segmentos intermedios o adyacentes no estén implicados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de lazo, un malapareamiento o una estructura de horquilla).

En ciertas realizaciones divulgadas en la presente, los compuestos antisentido, o una porción específica de los mismos, son, o son por lo menos, un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o, 99% o 100% complementarios a un ácido nucleico de Ataxina 2, una región objetivo, un segmento objetivo o una porción específica de los mismos. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo puede determinarse usando métodos de rutina.

Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias a una región objetivo y, por lo tanto, hibridaría específicamente, representaría un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleobases complementarias y no es necesario que sean contiguas entre sí o con nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleobases de longitud y 4 (cuatro) nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico objetivo tendrían una complementariedad global del 77,8% con el ácido nucleico objetivo. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico objetivo puede determinarse de manera rutinaria usando programas BLAST (herramientas básicas de búsqueda de alineamiento local) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649656). El porcentaje de homología, la identidad de secuencia o la complementariedad, pueden determinarse, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando la configuración predeterminada, que usa el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482489).

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido incluidos en la presente, o porciones especificadas de los mismos, son completamente complementarios (es decir, 100% complementarios) con un ácido nucleico objetivo, o una porción especificada del mismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede ser completamente complementario con un ácido nucleico de Ataxina 2, o una región objetivo, o un segmento objetivo o secuencia objetivo del mismo. Como se usa en la presente, "completamente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de apareamiento de bases preciso con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es completamente complementario con una secuencia objetivo que tiene 400 nucleobases de longitud, siempre que haya una porción correspondiente de 20 nucleobases del ácido nucleico objetivo que sea completamente complementaria con el compuesto antisentido. También puede usarse completamente complementario en referencia a una porción específica del primer y/o segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser "completamente complementaria" con una secuencia objetivo que tiene 400 nucleobases de longitud. La porción de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobases es completamente complementaria a la secuencia objetivo si la secuencia objetivo tiene una porción de 20 nucleobases correspondiente en la que cada nucleobase es complementaria a la porción de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, todo el compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser o no completamente complementario con la secuencia objetivo, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias con la secuencia objetivo.

La localización de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5' o en el extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, la nucleobase o las nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más nucleobases no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, estar enlazadas) o no contiguas. En una realización, una nucleobase no complementaria se localiza en el segmento de ala de un oligonucleótido antisentido gapmer.

En ciertas realizaciones divulgadas en la presente, los compuestos antisentido que tienen o tienen hasta 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases de longitud comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobases no complementarias con respecto a un ácido nucleico objetivo, como un ácido nucleico de Ataxina 2, o una porción especificada del mismo.

En ciertas realizaciones divulgadas en la presente, los compuestos antisentido que tienen, o tienen hasta 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 nucleobases no complementarias con respecto a un ácido nucleico objetivo, como un ácido nucleico de Ataxina 2, o una porción específica del mismo.

Los compuestos antisentido divulgados en la presente también incluyen aquellos que son complementarios a una porción de un ácido nucleico objetivo. Como se usa en la presente, "porción" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlazadas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico objetivo. Una "porción" también puede referirse a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En ciertas realizaciones divulgadas en la presente, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 8 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones divulgadas en la presente, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 9 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones divulgadas en la presente, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 10 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones divulgadas en la presente, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 11 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 12 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones divulgas en la presente, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 13 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones divulgas en la presente, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 14 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones divulgas en la presente, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 15 nucleobases de un segmento objetivo. También se divulgan compuestos antisentido que son complementarios con por lo menos una porción de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleobases de un segmento objetivo, o un intervalo definido por dos cualquiera de estos valores.

Identidad

Los compuestos antisentido incluidos en la presente también pueden tener un porcentaje de identidad definido con una secuencia de nucleótidos particular, SEQ ID NO, o compuesto representado por un número Isis específico, o porción de los mismos. Como se usa en la presente, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia divulgada en la presente si tiene la misma capacidad de apareamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN divulgada se consideraría idéntico a la secuencia de ADN ya que tanto el uracilo como la timidina se aparean con la adenina. También se contemplan versiones acortadas y alargadas de los compuestos antisentido divulgados en la presente, así como compuestos que tienen bases no idénticas con respecto a los compuestos antisentido divulgados en la presente. Las bases no idénticas pueden estar adyacentes entre sí o dispersas por todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen un apareamiento de bases idéntico con respecto a la secuencia con la que se está comparando.

En ciertas realizaciones divulgadas en la presente, los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, son por lo menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticos a uno o más de los compuestos antisentido o SEQ ID NO, o una porción de los mismos, divulgados en la presente.

En ciertas realizaciones divulgadas en la presente, se compara una porción del compuesto antisentido con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones divulgadas en la presente, se compara una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo.

En ciertas realizaciones divulgas en la presente, se compara una porción del oligonucleótido antisentido con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, se compara una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo.

Modificaciones

Un nucleósido es una combinación de base y azúcar. La porción de nucleobase (también conocida como base) del nucleósido es normalmente una fracción de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato enlazado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede enlazarse a la fracción hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través del enlace covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura de oligonucleótidos, se hace referencia comúnmente a que los grupos fosfato forman los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido.

Las modificaciones de compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios en enlaces internucleosídicos, fracciones de azúcar o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados a menudo se prefieren sobre las formas nativas debido a propiedades deseables como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por el ácido nucleico objetivo, estabilidad aumentada en presencia de nucleasas o actividad inhibidora aumentada.

También pueden emplearse nucleósidos químicamente modificados para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado por su ácido nucleico objetivo. En consecuencia, a menudo pueden obtenerse resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen tales nucleósidos químicamente modificados.

Enlaces internucleosídicos modificados

El enlace internucleosídico de origen natural de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'. A menudo se seleccionan compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internucleosídicos modificados, es decir, de origen no natural, sobre compuestos antisentido que tienen enlaces internucleosídicos de origen natural debido a propiedades deseables como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por los ácidos nucleicos objetivo y aumento estabilidad en presencia de nucleasas.

Los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleosídicos modificados incluyen enlaces internucleosídicos que retienen un átomo de fósforo así como enlaces internucleosídicos que no tienen un átomo de fósforo. Los enlaces internucleósidos que contienen fósforo representativos incluyen, pero no se limitan a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los métodos de preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de Ataxina 2 comprenden uno o más enlaces internucleosídicos modificados. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados se intercalan por todo el compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico de un compuesto antisentido es un enlace internucleosídico fosforotioato.

Fracciones de azúcar modificado

Los compuestos antisentido pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en los que el grupo azúcar se ha modificado. Tales nucleósidos modificados con azúcar pueden impartir estabilidad de nucleasa mejorada, afinidad de unión aumentada o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los nucleósidos comprenden fracciones de anillo de ribofuranosa químicamente modificados. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa químicamente modificados incluyen, sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluyendo los grupos sustituyentes 5' y 2', la unión de átomos del anillo no geminal para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo ribosilo por S, N(R) o C(R¹)(R² ) (R, R¹ y R² son cada uno independientemente H, alquilo C-i-C- ô un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Ejemplos de azúcares químicamente modificados incluyen nucleósido sustituido con metilo 2'-F-5 '(ver la Solicitud Internacional de PCT WO 2008/101157 publicada el 21/8/08 para otros nucleósidos 5', 2'-bis sustituidos divulgados) o el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S con sustitución adicional en la posición 2' (ver la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o, alternativamente, sustitución 5' de un BNA (ver la Solicitud Internacional de PCT WO 2007/134181 publicada el 22/11/07 en donde LNA está sustituido con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo).

Ejemplos de nucleósidos que tienen fracciones de azúcar modificados incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, 2'-OCH2CH3, 2'-OCH2CH2F y 2-O(CH²)²OCH³. El sustituyente en la posición 2' también puede seleccionarse de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O­ alquilo C¹-C¹⁰, OCF3, OCH2F, O(CH²)²-O-N(Rm)(Rn), O-CH²-C(=O)-N(Rm)(Rn), y O-CH²-C(=O)-N(Rm)-(CH²)²-N(Rm)(Rn), en donde cada R¹, Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C¹-C¹⁰ sustituido o no sustituido.

Como se usa en la presente, "nucleósidos bicíclicos" se refiere a nucleósidos modificados que comprenden una fracción de azúcar bicíclico. Los ejemplos de nucleósidos bicíclicos incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo de ribosilo 4' y 2'. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido incluidos en la presente incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos que comprenden un puente 4' a 2'. Ejemplos de tales nucleósidos bicíclicos con puente 4' a 2' incluyen, pero no se limitan a una de las fórmulas: 4-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (y análogos de los mismos ver la Patente de Estados Unidos 7.399.845, presentada el 15 de julio de 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (y análogos del mismo, ver la solicitud internacional publicada WO/2009/006478, publicada el 8 de enero de 2009); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (y análogos del mismo, ver la solicitud internacional publicada WO/2008/150729, publicada el 11 de diciembre de 2008); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (ver la solicitud de Patente de Estados Unidos publicada US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4'-CH2-N(R)-O-2', en donde R es H, alquilo C¹-C¹², o un grupo protector (ver la Patente de Estados Unidos 7.427.672, concedida el 23 de septiembre de 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (ver Chattopadhyaya et al, J. Org Chem, 2009, 74, 118-134); y 4'-CH2-C-(=CH2)-2' (y análogos del mismo, ver la solicitud internacional publicada WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre de 2008).

También pueden encontrarse informes adicionales relacionados con nucleósidos bicíclicos en la bibliografía publicada (ver por ejemplo: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; y Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Patentes de Estados Unidos N° 6.268.490; 6.525.191; 6.670.461; 6.770.748; 6.794.499; 7.034.133; 7.053.207; 7.399.845; 7.547.684; y 7.696.345; Publicación de patente de Estados Unidos N° US2008-0039618; US2009-0012281; Patentes de Estados Unidos N° de serie 60/989.574; 61/026.995; 61/026.998; 61/056.564; 61/086.231; 61/097.787; y 61/099.844; Solicitudes internacionales de PCT publicadas WO 1994/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; y WO 2009/006478. Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores puede prepararse con una o más configuraciones de azúcar estereoquímicas que incluyen, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (ver la solicitud internacional de PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como ^{W o} 99/14226).

En ciertas realizaciones, las fracciones de azúcar bicíclico de nucleósidos de BNA incluyen, pero no se limitan a, compuestos que tienen por lo menos un puente entre la posición 4' y 2' de la fracción de azúcar pentofuranosilo en donde dichos puentes comprenden independientemente 1 o de 2 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de -[C(Ra)(Rb)n]-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=O)-, -C(=NRa)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)²-, -S(=O)x-, y -N(Ra)-;

en donde:

x es 0, 1 o 2;

n es 1, 2, 3 o 4;

cada Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7, radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1), o sulfoxilo (S(=O)-J1);

cada J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido o un grupo protector.

En ciertas realizaciones, el puente de una fracción de azúcar bicíclico es -[C(Ra)(Rb)a]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- o -C(RaRb)-O-N(R)-. En ciertas realizaciones, el puente es 4'-CH²-2', 4'-(CH²)²-2', 4'-(CH²)³-2', 4'-CH²-O-2', 4'-(CH²)²-O-2', 4'-CH²-O-N(R)-2' y 4'-CH²-N(R)-O-2'- en donde cada R es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.

En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos se definen además por la configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente metileno-oxi 4'-2', puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Previamente, se han incorporado a-L-metilenoxi (4'-CH²-O-2') BNA en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).

En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos incluyen, pero no se limitan a, (A) a-L-metilenoxi 4'-CH²-O-2') BNA, (B) p-D-metileneoxi (4'-CH²-O-2') BNA, (C) etileneoxi (4'-(CH²)²-O-2') BNA, (D) aminooxi (4'-CH²-O-N(R)-2') BNA, (E) oxiamino (4'-CH²-N(R)-O-2') BNA, y (F) metil(metileneoxi) (4'-CH(CH³)-O-2') BNA, (G) metilen-tio (4'-CH2-S-² ') BNA, (H) metilen-amino (4'-CH²-N(R)-2') BNA, (I) metil carbociclíco (4'-CH²-CH(CH³)-2') BNA, y (J) propilen carbocíclo (4'-(CH²)³-2') BNA como se muestra a continuación.

en donde Bx es la fracción de base y R es independientemente H, un grupo protector o alquilo C1-C12.

En ciertas realizaciones, se incluyen nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula I:

en donde:

Bx es una fracción de base heterocíclica;

-Qa-Qb-Qc -es -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc) -, -CH2-N(Rc)-O- o -N(Rc)-O-CH 2;

Re es alquilo C1-C12 o un grupo protector de amino; y

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.

En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula II:

en donde:

Bx es una fracción de base heterocíclica;

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;

Za es alquilo C¹-C⁶, alquenilo C²-C⁶ , alquinilo C²-C⁶, alquilo C¹-C⁶ sustituido, alquenilo

sustituido, alq C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tio sustituido.

En una realización, cada uno de los grupos sustituidos está, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc, y NJeC(=X)NJcJd, en donde cada Jc, Jd y Je es, independientemente, H, alquilo C1-C sustituido y X es O o NJc.

En ciertas realizaciones, se incluyen nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula III:

en donde:

Bx es una fracción de base heterocíclica;

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de

fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;

Zb es a alquilo C¹-C⁶, alquenilo C²-C⁶, alquinilo C²-C⁶, alquilo C¹-C⁶ sustituido, alquenilo C²-C⁶ sustituido, alquinilo C²-C⁶ sustituido o acilo (C(=O)-).

En ciertas realizaciones, se incluyen nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula IV:

en donde:

Bx es una fracción de base heterocíclica;

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;

Rd es alquilo C¹-C⁶ , alquilo C¹-C⁶ sustituido, alquenilo C²-C⁶, alquenilo C²-C⁶ sustituido, alquinilo C²-C⁶ o alquinilo

C²-C⁶ sustituido;

cada qa, qb, qc y qd es, independientemente, H, halógeno, alquilo C¹-C⁶, alquilo C¹-C⁶ sustituido, alquenilo C²-C⁶ sustituido, alquinilo C²-C⁶ o alquinilo C²-C⁶ sustituido, alcoxilo C¹-C⁶, alcoxilo C¹-C⁶ sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C¹-C⁶ o aminoalquilo C¹-C⁶ sustituido;

En ciertas realizaciones, se incluyen nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula V:

en donde:

Bx es una fracción de base heterocíclica;

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;

qa, qb, qe y qf son cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12 o alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxi C1-C12, alcoxi C1-C12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2J NJJk, N3, CN, C(=O)OJj, C (= O )N J C(=O)Jj, O-C(=O)NJJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJko N(H)C(=S)NJjJk;

o qe y qf juntos son =C(qg)(qh);

qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido.

Se ha descrito la síntesis y preparación de los monómeros de metilenoxi (4-CH2-O-2') BNA adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina y uracilo, junto con su oligomerización y propiedades de reconocimiento de ácidos nucleicos. (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Los b Na y su preparación también se describen en la WO 98/39352 y la WO 99/14226.

También se han preparado análogos de metilenoxi (4-CH2-O-2') BNA y 2'-tio-BNA (Kumar et al., Bioorg.

Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). También se ha descrito la preparación de análogos de nucleósidos bloqueados que comprenden dúplex de oligodesoxirribonucleótidos como sustratos para polimerasas de ácidos nucleicos (Wengel et al., WO 99/14226). Además, se ha descrito en la técnica la síntesis de 2'-amino-BNA, un nuevo análogo de oligonucleótido de alta afinidad conformacionalmente restringido (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63,

10035-10039). Además, se han preparado 2'-amino- y 2-metilamino-BNA y se ha informado con anterioridad de la estabilidad térmica de sus dúplex con cadenas complementarias de ARN y ADN.

En ciertas realizaciones, se incluyen nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula VI:

en donde:

Bx es una fracción de base heterocíclica;

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;

cada qi, qj, qk y ql es, independientemente, H, halógeno, , alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12 o alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxilo C1-C12, alcoxilo C1-C12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJkor N(H)C(=S)NJjJk; y

qiy qj o ql y qk juntos son = C(qg)(qh), en donde qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1C12 sustituido.

Se ha descrito un nucleósido carbocíclico bicíclico que tiene un puente 4'-(CH²)³-2' y el puente análogo de alquenilo 4'-CH=CH-CH²-2' (Freier et al, Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 y Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). También se ha descrito la síntesis y preparación de nucleósidos carbocíclicos bicíclicos junto con sus estudios de oligomerización y bioquímicos (Srivastava et al, J. Am. Chem. Soc, 2007, 129(26), 8362-8379).

Como se usa en la presente, "nucleósido bicíclico 4'-2' " o "nucleósido bicíclico 4'a 2' " se refiere a un nucleósido bicíclico que comprende un anillo de furanosa que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de furanosa que conecta el átomo de carbono 2' y el átomo de carbono 4' del anillo de azúcar.

Como se usa en la presente, "nucleósidos monocíclicos" se refiere a nucleósidos que comprenden fracciones de azúcar modificado que no son fracciones de azúcar bicíclico. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar, o el análogo de la fracción de azúcar, de un nucleósido puede modificarse o sustituirse en cualquier posición.

Como se usa en la presente, "azúcar 2' modificado" significa un azúcar furanosilo modificado en la posición 2'. En ciertas realizaciones, tales modificaciones incluyen sustituyentes seleccionados de: un haluro, que incluye pero no se limita a, alcoxi sustituido y no sustituido, tioalquilo sustituido y no sustituido, amino alquilo sustituido y no sustituido, alquilo sustituido y no sustituido, alilo sustituido y no sustituido, y alquinilo sustituido y no sustituido. En ciertas realizaciones, las modificaciones 2' se seleccionan de sustituyentes que incluyen, pero no se limitan a: O[(CH²)nO]mCH³, O(CH2)NH2, O(CH²)nCH³, O(CH2)F, O(CH2)ONH2, OCH²C(=O)N(H)CH³, y O(CH2)ON[(CH2)nCH3]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros grupos sustituyentes 2' también pueden seleccionarse de: alquilo C1-C12, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, CI, Br, CN, F, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo informador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un compuesto antisentido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral 2'-MOE (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Se ha descrito que tal sustitución 2'-MOE tiene una afinidad de unión mejorada en comparación con nucleósidos no modificados y con otros nucleósidos modificados, como 2'-O-metilo, O-propilo y O-aminopropilo. También se ha demostrado que los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2'-MOE son inhibidores antisentido de la expresión génica con características prometedoras para uso in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; y Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).

Como se usa en la presente, un "nucleósido de tetrahidropirano modificado" o "nucleósido de THP modificado" significa un nucleósido que tiene un "azúcar" de tetrahidropirano de seis miembros sustituido en por el residuo de pentofuranosilo en nucleósidos normales (un sustituto de azúcar). Los nucleósidos de THP modificados incluyen, pero no se limitan a, lo que se denomina en la técnica ácido nucleico de hexitol (HNA), ácido nucleico de anitol (ANA), ácido nucleico de manitol (MNA) (ver Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854), fluoro HNA (F-HNA) o aquellos compuestos que tienen la Fórmula VII:

en donde independientemente para cada uno de dicho por lo menos un análogo de nucleósido de tetrahidropirano de Fórmula VII:

Bx es una fracción de base heterocíclica;

Ta y Tb son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el análogo de nucleósido de tetrahidropirano con el compuesto antisentido o uno de Ta y Tb es un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el análogo de nucleósido de tetrahidropirano al compuesto antisentido y el otro de Ta y Tb es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado enlazado o un grupo 5' o 3-terminal;

q-i , q2, q3, q4, q5, q⁶ y q7 son cada uno independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6sustituido, alquenilo C2-C⁶, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido; y cada uno de Ri y R2 se selecciona de hidrógeno, hidroxilo, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1J2, SJi , N3, OC(=X)Ji , OC(=X)NJi J2, NJ3C(=X)NJi J2 y CN, en donde X es O, S o NJi y cada Ji , J2 y J3 es, independientemente, H o alquilo C1-C6.

En ciertas realizaciones, se incluyen los nucleósidos de THP modificados de Fórmula VII en donde qi , q2, q³, q4, q5, q⁶ y q7 son cada uno H. En ciertas realizaciones, por lo menos uno de qi , q2, q3, q4, q5, q⁶ y q7 es distinto de H. En ciertas realizaciones, por lo menos uno de qi , q2, q3, q4, q5, q⁶ y q7 es metilo. En ciertas realizaciones, se incluyen los nucleósidos de THP de fórmula VII en donde uno de Ri y R2 es fluoro. En ciertas realizaciones, Ri es fluoro y R2 es H; Ri es metoxi y R2 es H, y Ri es H y R2 es metoxietoxi.

Como se usa en la presente, "2' modificado" o "2' sustituido" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 2' distinto de H u OH. Los nucleósidos 2' modificados incluyen, pero no están limitados a, nucleósidos bicíclicos en los que el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar conecta el carbono 2' y otro carbono del anillo de azúcar; y nucleósidos con sustituyentes 2' que noforman puentes, como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH²)²ScH³, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), o O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. Los nucleósidos 2' modificados pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo en otras posiciones del azúcar y/o en la nucleobase.

Como se usa en la presente, "2'-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo fluoro en la posición 2'.

Como se usa en la presente, "2'-OMe" o "² -OCH3" o "2'-O-metilo" se refieren cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.

Como se usa en la presente, "MOE" o "2'-MOE" o "² -OCH2CH2OCH3" o "2'-O-metoxietilo" se refiere cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH2CH2OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.

Como se usa en la presente, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, se modifican uno o más de la pluralidad de nucleósidos. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos (ADN).

También se conocen en la técnica muchos otros sistemas de anillos sustitutos de azúcares biciclo y triciclo que pueden usarse para modificar nucleósidos para su incorporación en compuestos antisentido (ver, por ejemplo, artículo de revisión: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854).

Tales sistemas de anillos pueden experimentar varias sustituciones adicionales para mejorar la actividad.

Los métodos para la preparación de azúcares modificados son bien conocidos por los expertos en la técnica.

En los nucleótidos que tienen fracciones de azúcar modificado, las fracciones de nucleobases (naturales, modificadas o una combinación de los mismos) se mantienen para la hibridación con un ácido nucleico objetivo apropiado.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos que tienen fracciones de azúcar modificado. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar modificado es 2'-MOE. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados con 2'-MOE están dispuestos en un motivo gapmer. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar modificado es un nucleósido bicíclico que tiene un grupo puente (4'-CH(CH³)-O-2'). En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados (4'-CH(CH³)-O-2') están dispuestos a lo largo de las alas de un motivo gapmer.

Composiciones y métodos para formular composiciones farmacéuticas

Pueden mezclarse oligonucleótidos antisentido con sustancias activas o inertes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y los métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de una variedad de criterios, que incluyen, pero no se limitan a, la vía de administración, la extensión de la enfermedad o la dosis a administrar.

Un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 puede utilizarse en composiciones farmacéuticas combinando el compuesto antisentido con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable adecuado. Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS). La PBS es un diluyente adecuado para su uso en composiciones que se administran por vía parenteral. Por consiguiente, en una realización, en los métodos descritos en la presente se emplea una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, el diluyente farmacéuticamente aceptable es PBS. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualquier sal farmacéuticamente aceptable, éster o sales de tales ésteres, o cualquier otro oligonucleótido que, tras la administración a un animal, incluyendo un humano, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito o residuo biológicamente activo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la divulgación también se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de tales profármacos y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de sodio y potasio.

Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido que son escindidos por nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el compuesto antisentido activo.

Compuestos antisentido conjugados

Los compuestos antisentido pueden enlazarse covalentemente con una o más fracciones o conjugados que mejoran la actividad, distribución celular o captación celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Los grupos conjugados típicos incluyen fracciones de colesterol y fracciones de lípidos. Los grupos conjugados adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes.

Los compuestos antisentido también pueden modificarse para que tengan uno o más grupos estabilizantes que generalmente están unidos a uno o ambos extremos terminales de los compuestos antisentido para mejorar propiedades como, por ejemplo, la estabilidad de nucleasas. Incluidas en los grupos estabilizadores están las estructuras de caperuza. Estas modificaciones terminales protegen el compuesto antisentido que tiene un ácido nucleico terminal de la degradación de las exonucleasas y pueden ayudar en la administración y/o localización dentro de una célula. La caperuza puede estar presente en el extremo terminal 5' (caperuza 5') o en el extremo terminal 3' (caperuza 3'), o puede estar presente en ambos extremos. Las estructuras de caperuza son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, caperuzas abásicas desoxi invertidas. Grupos estabilizadores 3' y 5' adicionales que pueden usarse para tapar uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para impartir estabilidad de nucleasas incluyen los divulgados en la WO 03/004602 publicada el 16 de enero de 2003.

Cultivo celular y tratamiento con compuestos antisentido

Los efectos de los compuestos antisentido sobre el nivel, la actividad o la expresión de los ácidos nucleicos de Ataxina 2 pueden probarse in vitro en una variedad de tipos de células. Los tipos de células usados para tales análisis están disponibles de proveedores comerciales {por ejemplo, American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) y se cultivan de acuerdo con las instrucciones del proveedor usando reactivos disponibles comercialmente (por ejemplo, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, ^{c A ) .} Los tipos de células ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, células HepG2, células Hep3B y hepatocitos primarios.

Prueba in vitro de oligonucleótidos antisentido

En la presente se describen métodos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que pueden modificarse apropiadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido.

Las células pueden tratarse con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente un 60-80% de confluencia en cultivo.

Un reactivo usado comúnmente para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, CA). Pueden mezclarse oligonucleótidos antisentido con LIPOFECTIN en OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTIN que puede variar entre 2 y 12 ug/ml por oligonucleótido antisentido 100 nM.

Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINE (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINA en medio de suero reducido con OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINE que puede variar de 2 a 12 ug/ml por oligonucleótido antisentido 100 nM.

Otra técnica usada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la electroporación.

Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido mediante métodos de rutina. Las células pueden recogerse 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido, momento en el que se miden los niveles de ARN o proteína de ácidos nucleicos objetivo mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente. En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples repeticiones, los datos se presentan como la media de los tratamientos replicados.

La concentración de oligonucleótido antisentido usada varía de una línea celular a otra. Los métodos para determinar la concentración óptima de oligonucleótidos antisentido para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se usan típicamente a concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINE. Los oligonucleótidos antisentido se usan a concentraciones más altas que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan usando electroporación.

Aislamiento de ARN

El análisis de ARN puede realizarse en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.

Análisis de inhibición de niveles o expresión de objetivo

La inhibición de los niveles o la expresión de un ácido nucleico de Ataxina 2 puede ensayarse de una variedad de maneras conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ácido nucleico objetivo pueden cuantificarse mediante, por ejemplo, análisis de transferencia Northern, reacción en cadena de polimerasa (PCR) competitiva o PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN puede realizarse en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis de transferencia Northern también es rutinario en la técnica. La PCR cuantitativa en tiempo real puede realizarse de manera conveniente usando el sistema de detección de secuencias disponible comercialmente ABI PRISM 7600, 7700 o 7900, disponible de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y usado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Análisis de PCR en tiempo real cuantitativa de los niveles de ARN objetivo

La cuantificación de los niveles de ARN objetivo puede realizarse mediante PCR en tiempo real cuantitativa usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7600, 7700 o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los métodos de PCR en tiempo real cuantitativa son bien conocidos en la técnica.

Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a una reacción de transcriptasa inversa (RT), que produce ADN complementario (ADNc) que luego se usa como sustrato para la amplificación por PCR en tiempo real. Las reacciones de RT y PCR en tiempo real se realizan secuencialmente en el mismo pocillo de muestra. Los reactivos de RT y PCR en tiempo real pueden obtenerse de Invitrogen (Carlsbad, CA). Las reacciones de PCR en tiempo real RT se llevan a cabo mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.

Las cantidades objetivo de genes (o ARN) obtenidas por PCR en tiempo real se normalizan usando o el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, como la ciclofilina A, o cuantificando el ARN total usando RIBOGREEⁿ (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). La expresión de ciclofilina A se cuantifica mediante PCR en tiempo real, ejecutándose simultáneamente con el objetivo, multiplexando o por separado. El ARN total se cuantifica usando el reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN (Invetrogen, Inc. Eugene, OR). Los métodos de cuantificación de ARN por RIBOGREEN se enseñan en Jones, L.J., et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Se usa un instrumento CYTOFLUOR 4000 (PE Applied Biosystems) para medir la fluorescencia de RIBOGREEN.

Las sondas y los cebadores están diseñados para hibridar con un ácido nucleico de Ataxina 2. Los métodos para diseñar cebadores y sondas de PCR en tiempo real son bien conocidos en la técnica y pueden incluir el uso de software como el software PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Análisis de niveles de proteínas

La inhibición antisentido de los ácidos nucleicos de Ataxina 2 puede evaluarse midiendo los niveles de proteína de Ataxina 2. Los niveles de proteína de Ataxina 2 pueden evaluarse o cuantificarse de varias maneras bien conocidas en la técnica, como inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western (inmunotransferencia), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayos cuantitativos de proteínas, ensayos de actividad de proteínas (por ejemplo, ensayos de actividad de caspasa), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a una objetivo pueden identificarse y obtenerse de una variedad de fuentes, como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o pueden prepararse mediante métodos convencionales de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales bien conocidos en la técnica.

Ensayo in vivo de compuestos antisentido

Los compuestos antisentido, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, se prueban en animales para evaluar su capacidad para inhibir la expresión de Ataxina 2 y producir cambios fenotípicos, como una función motora y cognitiva mejoradas. En ciertas realizaciones, la función motora se mide mediante análisis de inicio de la marcha, rotarod, fuerza de agarre, ascenso de poste, rendimiento en campo abierto, barra de equilibrio, prueba de la huella de la pata trasera en el animal.

Las pruebas pueden realizarse en animales normales o en modelos experimentales de enfermedades. Para la administración a animales, los oligonucleótidos antisentido se formulan en un diluyente farmacéuticamente aceptable, como solución salina tamponada con fosfato. La administración incluye vías de administración parenterales, como intraperitoneal, intravenosa y subcutánea. El cálculo de la dosificación de oligonucleótidos antisentido y la frecuencia de dosificación está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica y depende de factores como la vía de administración y el peso corporal del animal. Después de un período de tratamiento con oligonucleótidos antisentido, el ARN se aísla del tejido del SNC o del LCR y se miden los cambios en la expresión del ácido nucleico de Ataxina 2.

Ciertas indicaciones

En la presente se divulgan métodos, compuestos y composiciones para tratar a un individuo que comprenden administrar una o más composiciones farmacéuticas descritas en la presente. En ciertos ejemplos, el individuo tiene una enfermedad neurodegenerativa. En ciertos ejemplos, el individuo tiene riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa, que incluye, pero no se limita a, ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2), esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y parkinsonismo. En ciertos ejemplos, se ha identificado que el individuo tiene una enfermedad asociada a Ataxina 2. En ciertos ejemplos, en la presente se divulgan métodos para reducir profilácticamente la expresión de Ataxina 2 en un individuo. Ciertos ejemplos incluyen tratar a un individuo con necesidad de ello administrando a un individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2.

En un ejemplo, la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 se acompaña de la monitorización de los niveles de Ataxina 2 en un individuo, para determinar la respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido. Un médico puede usar la respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido para determinar la cantidad y duración de la intervención terapéutica.

En ciertos ejemplos, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 da como resultado la reducción de la expresión de Ataxina 2 en por lo menos un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100%, o un intervalo definido por dos cualquiera de estos valores. En ciertos ejemplos, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Ataxina 2 da como resultado una función motora mejorada en un animal. En ciertos ejemplos, la administración de un compuesto antisentido de Ataxina 2 mejora la función motora en por lo menos un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100%, o un intervalo definido por dos cualquiera de estos valores.

En ciertos ejemplos, las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido dirigido a Ataxina 2 se usan para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente que padece o es susceptible a una enfermedad neurodegenerativa que incluye ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2), esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y parkinsonismo.

EJEMPLOS

Divulgación no limitativa

Aunque ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solamente para ilustrar los compuestos descritos en la presente y no se pretende que limiten los mismos.

Ejemplo 1: Inhibición antisentido de ataxina 2 humana en células HepG2 por gapmers MOE

Se diseñaron oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de Ataxina 2 y se probaron sus efectos sobre el ARNm de Ataxina 2 in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 4.500 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de Ataxina 2 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3642 (secuencia directa ACCAAAGAGTAGTTAATGGAGGTGTTC, designada en la presente como SEQ ID NO: 5; secuencia inversa AGAAGGTGGGCGAGAGGAA, designada en la presente como SEQ ID NO: 6; secuencia de sondas CTGGCCATCGCCTTGCCCA, designada en la presente como SEQ ID NO: 7) para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de Ataxina 2 se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de Ataxina 2, con respecto a las células de control no tratadas.

Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de las Tablas siguientes se diseñaron como gapmers 5-10-5 MOE. Los gapmers tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento del espacio central está compuesto por diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato. Todos los residuos de citosina en cada gapmer son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más en 5' al que se dirige el gapmer en la secuencia del gen humano. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el gapmer en la secuencia del gen humano. Cada gapmer enumerado en las Tablas siguientes está dirigido o al ARNm de Ataxina 2 humana, designada en la presente como SEQ ID NO: 1 (N° de registro GENBANK NM_002973.3) o la secuencia genómica de Ataxina 2 humana, designada en la presente como SEQ ID NO: 2 (el complemento del N° de registro GENBANK NT_ 009775.17 truncado de los nucleótidos 2465000 a 2616000). Algunos oligonucleótidos no se dirigen a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, sino que se dirigen a una secuencia de gen variante, SEQ ID NO: 3 (N° de registro GENBANK BX410018.2). "n/a" indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia genética particular con un 100% de complementariedad.

Tabla 1

continuación

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Tabla 2

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Tabla 3

Ejemplo 2: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de ataxina 2 humana en células HepG2 por gapmers MOE

Los gapmers del Ejemplo 1 que muestran una inhibición in vitro significativa del ARNm de Ataxina 2 se seleccionaron y probaron a varias dosis en células HepG2. Las células se sembraron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,625 j M, 1,250 j M, 2,500 ^j M, 5,000 ^j M y 10,000 ^j M de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla siguiente. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de ataxina 2 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebadores humano RTS3642 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de ataxina 2 se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, según se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de ataxina 2 con respecto a las células de control no tratadas.

También se presenta la concentración inhibidora media máxima (IC⁵⁰) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de ataxina 2 se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.

Tabla 4

continuación

Ejemplo 3: Inhibición antisentido de ataxina 2 humana en un modelo de ratón SCA2 BAC

Los Gapmers del Ejemplo 1 que muestran una inhibición in vitro significativa del ARNm de ataxina 2 se seleccionaron y probaron in vivo en un modelo de ratón SCA2[Q22]-BAC. Este modelo de ratón fue creado en el laboratorio Pulst (Universidad de Utah, Salt Lake City), usando ratones de fondo híbrido FVB/B6, para el estudio de la ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2). Estos ratones poseen la región del gen ATXN2 humano de 176 kb completa, incluyendo la secuencia en sentido ascendente de 16 kb y la secuencia en sentido descendente de 2,5 kb.

Tratamiento

A grupos de 3 ratones cada uno se les administró solución salina normal (0,9%) u oligonucleótido antisentido mediante inyecciones intracerebroventriculares. Se infundió individualmente a ratones de cinco a siete semanas de edad con una mezcla de oxígeno e isoflurano al 3% durante 3-4 minutos para producir sedación. Luego, se eliminó el cabello del cuero cabelludo con una herramienta de corte. El ratón se colocó en un instrumento estereotáxico (Stoelting Just for Mouse). Se limpió el cuero cabelludo, primero con un exfoliante de yodo y luego con etanol al 70%. Se hizo una incisión con una hoja de bisturí N° 10 desde la región inmediatamente posterior al lugar entre los ojos hasta la región 1,5 cm por detrás. Se retiró el periostio con un hisopo de algodón estéril. Se colocó una jeringuilla Hamilton con una aguja de calibre 26 en el portaagujas del instrumento estereotáxico y se llenó hasta la marca 10 de j l con solución salina normal (0,9%) u oligonucleótido antisentido (250 |jg) en solución salina (0,9%). La aguja se colocó en el bregma del cráneo y luego se colocó 1 mm a la derecha y 0,46 mm posterior. Luego, se insertó la punta de la aguja justo a través del cráneo y luego se colocó 2,5 mm hacia abajo en el ventrículo lateral derecho. A continuación, se presionó el émbolo de la jeringuilla para administrar el volumen deseado de 5-7 jl. Después de una espera de 4 minutos para permitir que se igualase la presión ventricular, se retiró la aguja y se suturó el cuero cabelludo. Luego, la incisión se trató con una solución de povidona y el ratón regresó a su jaula boca arriba para recuperarse. Los ratones se monitorizaron diariamente.

Análisis de ARN

Después de 7 días, los ratones se colocaron en isoflurano hasta que dejaron de respirar. Luego se extrajo el cerebro. Se recogieron tres porciones del cerebro en secciones coronales, incluyendo una sección de 3 mm para el análisis de ARN. Se aisló ARN de 30 mg de tejido usando el kit RNeasy (Qiagen). El ADNc se generó usando el kit de transcripción inversa QuantiTect (Qiagen). La PCR en tiempo real (qPCR) se realizó mediante el método SYBR Green con curvas estándar en el iCycler (Bio-Rad) en placas de 96 pocillos por cuadriplicado. Las reacciones fueron de 20 jl, que consistían de 15 ng de ADNc, 2 j l de cada cebador (0,3 jM final) y 10 j l de SYBR Green Master Mix (Bio-Rad). Los parámetros de ciclado incluyeron un paso de desnaturalización de 95° durante 10 segundos, incubación a la temperatura de alineamiento durante 20 segundos y una segunda incubación durante 40 segundos a 72°. Cada placa incluía una curva estándar usando ARN cerebeloso preparado a partir de múltiples ratones transgénicos pGL2-5A3. Los amplicones individuales se verificaron mediante análisis de desnaturalización y electroforesis en gel.

Los resultados del análisis de ARN para ataxina 2 humana y de ratón se presentan en la Tabla siguiente. Como se ha indicado, algunos de los oligonucleótidos de ISIS disminuyeron el ARNm de ataxina 2 humana en los cerebros de los ratones.

Tabla 5

Ejemplo 4: Inhibición antisentido de ataxina 2 humana en un modelo de ratón ATXN2-Q127

Los Gapmers del Ejemplo 1 que muestran una inhibición in vitro significativa de ARNm de ataxina 2 se seleccionaron y probaron in vivo en un modelo de ratón ATXN2-Q127. Este modelo de ratón (Hansen, S.T. et al., Human. Molecular Genetics 2012. 1-13) expresa el ADN complementario ATXN2Q127 mutante de longitud completa bajo la regulación del promotor de la proteína 2 de células de Purkinje (Pcp2). Este modelo muestra un fenotipo de deterioro motor progresivo de inicio temprano acompañado por la formación de agregados citoplásmicos difusos en las células cerebelosas de Purkinje.

Tratamiento

A grupos de 3 ratones cada uno se les administró solución salina normal (0,9%) u oligonucleótido antisentido mediante inyecciones intracerebroventriculares. Se infundió individualmente a ratones de cinco a siete semanas de edad con una mezcla de oxígeno e isoflurano al 3% durante 3-4 minutos para producir sedación. Luego, se retiró el cabello del cuero cabelludo con una herramienta de corte. El ratón se colocó en un instrumento estereotáxico (Stoelting Just for Mouse). Se limpió el cuero cabelludo, primero con un exfoliante de yodo y luego con etanol al 70%. Se hizo una incisión con una hoja de bisturí N° 10 desde la región inmediatamente posterior al lugar entre los ojos hasta la región 1,5 cm por detrás. El periostio se retiró con un hisopo de algodón estéril. Se colocó una jeringuilla Hamilton con una aguja de calibre 26 en el portaagujas del instrumento estereotáxico y se llenó hasta la marca de 10 j l con solución salina normal (0,9%) u oligonucleótido antisentido (250 |jg) en solución salina (0,9%). La aguja se colocó en el bregma del cráneo y luego se colocó 1 mm a la derecha y 0,46 mm posterior. Luego, se insertó la punta de la aguja justo a través del cráneo y luego se colocó 2,5 mm hacia abajo en el ventrículo lateral derecho. Luego, se presionó el émbolo de la jeringuilla para administrar el volumen deseado de 5-7 jl. Después de una espera de 4 minutos para permitir que se igualase la presión ventricular, se retiró la aguja y se suturó el cuero cabelludo. Luego, la incisión se trató con una solución de povidona y el ratón regresó a su jaula boca arriba para recuperarse. Los ratones se monitorizaron diariamente.

Análisis de ARN

Después de 7 días, los ratones se colocaron en isoflurano hasta que dejaron de respirar. Luego se extrajo el cerebro. Se recogieron tres porciones del cerebro en secciones coronales, incluyendo una sección de 3 mm para el análisis de ARN. Se aisló ARN de 30 mg de tejido usando el kit RNeasy (Qiagen). El ADNc se generó usando el kit de transcripción inversa QuantiTect (Qiagen). La PCR en tiempo real (qPCR) se realizó mediante el método SYBR Green con curvas estándar en el iCycler (Bio-Rad) en placas de 96 pocillos por cuadriplicado. Las reacciones fueron de 20 jl, que consistían de 15 ng de ADNc, 2 j l de cada cebador (0,3 jM final) y 10 j l de SYBR Green Master Mix (Bio-Rad). Los parámetros de ciclado incluyeron un paso de desnaturalización de 95° durante 10 segundos, incubación a la temperatura de alineamiento durante 20 segundos y una segunda incubación durante 40 segundos a 72°. Cada placa incluía una curva estándar usando ARN cerebeloso preparado a partir de múltiples ratones transgénicos pGL2-5A3. Los amplicones individuales se verificaron mediante análisis de desnaturalización y electroforesis en gel. Todos los niveles de ARNm se normalizaron al gen constitutivo, actina.

Los resultados del análisis de ARN para ataxina 2 humana y de ratón se presentan en la Tabla siguiente. Como se ha indicado, algunos de los oligonucleótidos de ISIS disminuyeron el ARNm de ataxina 2 humana en los cerebros de los ratones.

También se realizó un análisis de qPCR del marcador para microgliosis, AIF/Iba1, para medir la inflamación. Los resultados se presentan en la tabla siguiente.

Tabla 7

Ejemplo 4: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de ataxina 2 humana en un modelo de ratón ATXN2-Q127

Se probó ISIS 564133 en diferentes dosis en el modelo de ratón ATXN2-Q127.

Tratamiento

A grupos de 3 ratones cada uno se les administró solución salina normal (0,9%) o ISIS 564133 mediante inyecciones intracerebroventriculares a dosis de 50 |jg, 100 |jg, 200 |jg, 250 |jg o 300 |jg. A los ratones se les administró de la misma manera que se ha descrito en los estudios anteriores y se monitorizaron diariamente.

Análisis de ARN

Después de 7 días, los ratones se colocaron en isoflurano hasta que dejaron de respirar. Luego se extrajo el cerebro. Se recogieron tres porciones del cerebro en secciones coronales, incluyendo una sección de 3 mm para el análisis de ARN, como se ha descrito anteriormente. Todos los niveles de ARNm se normalizaron al gen constitutivo, actina.

Los resultados del análisis de ARN para ataxina 2 humana y de ratón se presentan en la Tabla siguiente.

Tabla 8

Ejemplo 5: Inhibición antisentido dependiente del tiempo de ataxina 2 humana en un modelo de ratón ATXN2-Q127

Se administró ISIS 564133 y se probó la reducción del nivel de ARNm en diferentes puntos temporales en el modelo de ratón ATXN2-Q127.

Tratamiento

A grupos de 3 ratones cada uno se les administró solución salina normal (0,9%) o ISIS 564133 mediante inyecciones intracerebroventriculares a dosis de 200 |jg. A los ratones se les administró de la misma manera que se ha descrito en los estudios anteriores y se controlaron diariamente.

Análisis de ARN

Después de 9 días, 18 días, 27 días y 84 días, se colocaron grupos de ratones en isoflurano hasta que dejaron de respirar. Luego se extrajo el cerebro. Se recogieron tres porciones del cerebro en secciones coronales, incluyendo una sección de 3 mm para el análisis de ARN, como se ha descrito anteriormente. Todos los niveles de ARNm se normalizaron al gen constitutivo, actina.

Los resultados del análisis de ARN para Ataxina 2 humana se presentan en la Tabla siguiente. Se realizó un análisis Western de las muestras de proteína correspondientes y se confirmaron los resultados de qPCR.

Tabla 9

La tinción inmunohistoquímica de las células de Purkinje del cerebelo el día 7 se realizó usando un anticuerpo anti-oligonucleótido de conejo generado internamente. Los resultados demostraron que el oligonucleótido ISIS se localizó en las células cerebelosas de Purkinje de ratones ATXN-Q127.

Ejemplo 6: Efecto de la inhibición antisentido de ataxina 2 humana en un modelo de ratón ATXN2-Q127 Se administró oligonucleótido ISIS en el modelo de ratón ATXN2-Q127 y en ratones de tipo salvaje. El día 3, se evaluó el rendimiento motor mediante la prueba rotarod.

A grupos de ratones ATXN2-Q127 se les administró solución salina normal (0,9%) o ISIS 564133 a 50 jg, 100 jg o 200 jg mediante inyecciones intracerebroventriculares de la misma manera que se ha descrito en los estudios anteriores. A grupos de ratones de tipo salvaje se les administró solución salina normal (0,9%) u oligonucleótido ISIS a 200 jg mediante inyecciones intracerebroventriculares dosificadas de la misma manera que se ha descrito en los estudios anteriores. A grupos de ratones ATXN2-Q127 se les administró solución salina normal (0,9%)) o ISIS 546127 o ISIS 564216 a 200 |jg mediante inyecciones intracerebroventriculares dosificadas de la misma manera descrita en los estudios anteriores. Después de 6 semanas, los ratones se sometieron a la prueba rotarod.

Ensayo rotarod

El ensayo rotarod de aceleración se realizó en el rotarod Rotamex. La prueba rotarod se llevó a cabo durante cinco días. El primer día, los ratones se aclimatan al técnico manipulando a los ratones. En el segundo día, los ratones se introducen en el rotarod en un paradigma de 4 minutos que incluye 2 minutos a una velocidad constante de 10 RPM, luego 2 minutos a una velocidad que varía de 10 a 30 RPM. Las pruebas en los días 3-5 fueron idénticas, donde los ratones se colocaron en el rotarod a una velocidad de 0 RPM, luego el rotarod se aceleró a 40 RPM durante 6 minutos. Esto se hace dos veces al día y se registró un valor medio de "latencia para caer" por día, en segundos. La latencia para caer se define como la cantidad de tiempo antes de que el animal se caiga del rotarod. Se registra automáticamente, cuando el ratón ya no interrumpe los haces infrarrojos dirigidos por encima del rotarod. El tiempo hasta la primera rotación pasiva (cuando los ratones dejan de caminar y se agarran y giran con la varilla) también se registra automáticamente y generalmente refleja la latencia hasta el tiempo de caída. El estudio consistió en tres pruebas consecutivas de 5 minutos cada una con un período de descanso de 20 minutos entre las pruebas. En los días 3-5, se permitió que los ratones descansaran durante 1,5-2 horas entre las dos pruebas repetidas realizadas en cada uno de esos días.

Los resultados de la prueba rotarod se presentan en la tabla siguiente. Como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con ASO mejora el rendimiento de rotarod hasta aproximadamente un 20%.

Tabla 10

Ejemplo 7: Efecto de la inhibición antisentido de ataxina 2 humana en un modelo de ratón ATXN2-Q127 Se administró oligonucleótido ISIS en el modelo de ratón ATXN2-Q127 y en ratones de tipo salvaje. Se evaluó la expresión cerebelosa de Ataxina 2, así como varios genes de células de Purkinje (PC).

A grupos de ratones ATXN2-Q127 se les administró solución salina normal (0,9%) o ISIS 564133 a 200 |jg mediante inyecciones intracerebroventriculares dosificadas de la misma manera descrita en los estudios anteriores. A grupos de ratones de tipo salvaje se les administró solución salina normal (0,9%) o ISIS 564133 a 200 jg mediante inyecciones intracerebroventriculares dosificadas de la misma manera descrita en los estudios anteriores. Después de 5 semanas, se sacrificó a los ratones y se evaluó la expresión cerebelosa de varios niveles de ARNm de genes.

Análisis de ARN

Se colocaron grupos de ratones en isoflurano hasta que dejaron de respirar. Luego se extrajo el cerebro. Se recogieron tres porciones del cerebro en secciones coronales, incluyendo una sección de 3 mm para el análisis de ARN, como se ha descrito anteriormente. Todos los niveles de ARNm se normalizaron al gen constitutivo, actina. Se midieron los niveles de ARN de ataxina 2 humana, ataxina 2 murina, Pcp2, Calbl, Rgs8 y Fam107b. Se ha demostrado que los cambios de transcripción en varios de estos genes específicos de PC disminuyen progresivamente en modelos de SCA2 (Hansen, S.T. et al., Hum. Mol. Genet. 2013. 22: 271-283).

Los resultados del análisis de ARN se presentan en la Tabla siguiente y demuestran que el tratamiento con oligonucleótidos ISIS dirigidos a ataxina 2 aumentó los niveles de expresión de todos los genes específicos de PC en comparación con el grupo de control transgénico.

Tabla 11

Ejemplo 8: Efecto de la inhibición antisentido de ataxina 2 humana en un modelo de ratón ATXN2-Q127 Se administró oligonucleótido ISIS en el modelo de ratón ATXN2-Q127 y en ratones de tipo salvaje. Se evaluó el rendimiento motor mediante la prueba rotarod.

A grupos de ratones ATXN2-Q127 (7,5 semanas de edad) se les administró solución salina normal (0,9%) o ISIS 546127 o ISIS 564216 a 200 |jg mediante inyecciones intracerebroventriculares dosificadas de la misma manera descrita en los estudios anteriores. Después de 5 semanas y 9 semanas, se sometió a los ratones a la prueba rotarod.

Ensayo rotarod

El ensayo rotarod de aceleración se realizó en el rotarod Rotamex. La prueba rotarod se llevó a cabo durante cinco días. El primer día, los ratones se aclimatan al técnico manipulando a los ratones. En el segundo día, los ratones se introducen en el rotarod en un paradigma de 4 minutos que incluye 2 minutos a una velocidad constante de 10 RPM, luego 2 minutos a una velocidad que varía de 10 a 30 RPM. Las pruebas en los días 3-5 fueron idénticas, donde los ratones se colocaron en el rotarod a una velocidad de 0 RPM, luego el rotarod se aceleró a 40 RPM durante 6 minutos. Esto se hace dos veces al día y se registró un valor medio de "latencia para caer" por día, en segundos. La latencia para caer se define como la cantidad de tiempo antes de que el animal se caiga del rotarod. Se registra automáticamente, cuando el ratón ya no interrumpe los haces infrarrojos dirigidos por encima del rotarod. El tiempo hasta la primera rotación pasiva (cuando los ratones dejan de caminar y se agarran y giran con la varilla) también se registra automáticamente y generalmente refleja la latencia hasta el tiempo de caída. El estudio consistió en tres pruebas consecutivas de 5 minutos cada una con un período de descanso de 20 minutos entre las pruebas. En los días 3-5, se permitió que los ratones descansaran durante 1,5-2 horas entre las dos pruebas repetidas realizadas en cada uno de esos días.

Los resultados de la prueba rotarod se presentan en la tabla siguiente. Como se muestra en la Tabla siguiente, el tratamiento con ASO mejora el rendimiento de rotarod hasta aproximadamente un 20% en la semana 5 y aproximadamente un 27% en la semana 9.

Tabla 13

Ejemplo 9: Efecto de la inhibición antisentido de la ataxina 2 humana en un modelo de ratón ATXN2-Q127 Se administró oligonucleótido ISIS en el modelo de ratón ATXN2-Q127. El rendimiento motor se evaluó usando la prueba rotarod.

Se sometió a ratones ATXN2-Q127 de siete semanas de edad a la prueba rotarod, luego se dividieron en dos grupos de 30 ratones cada uno, de tal manera que el rendimiento medio de rotarod, el peso medio y la composición del sexo fueran iguales en ambos grupos. A las 8 semanas de edad, un grupo de ratones recibió solución salina normal mediante inyección intracerebroventricular (ICV) y un grupo recibió ISIS 564216 a 210 jg mediante inyección ICV, dosificado de la misma manera descrita en los estudios anteriores. Cinco semanas más tarde (13 semanas de edad), los ratones se sometieron de nuevo a la prueba rotarod. Seis semanas después de la inyección (14 semanas de edad), los ratones recibieron una segunda inyección de ICV, idéntica a la inyección recibida a las 8 semanas de edad. Cinco semanas más tarde (19 semanas de edad, 11 semanas después de la primera inyección de ICV), se sometió a los ratones a una tercera prueba rotarod.

Prueba rotarod

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un oligonucleótido modificado de cadena sencilla que consiste de 12 a 30 nucleósidos enlazadas y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende por lo menos 12 nucleobases consecutivas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de las SEQ ID NO: 18, 19 o 98, en donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es por lo menos un 90% complementaria a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 y en donde el oligonucleótido modificado de cadena sencilla reduce la expresión del ARNm y/o proteína de ataxina 2.

2. El oligonucleótido modificado de cadena sencilla de la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es por lo menos un 95%, o un 100% complementaria a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2

3. El oligonucleótido modificado de cadena sencilla de cualquier reivindicación anterior, en donde por lo menos un enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico modificado, opcionalmente en donde:

a) por lo menos un enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleosídico fosforotioato; o b) cada enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleosídico fosforotioato.

4. El oligonucleótido modificado de cadena sencilla de cualquier reivindicación anterior, en donde

a) por lo menos un enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico fosfodiéster; y/o

b) por lo menos un enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y por lo menos un enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico fosfodiéster.

5. El oligonucleótido modificado de cadena sencilla de cualquier reivindicación anterior, en donde por lo menos un nucleósido comprende una nucleobase modificada; opcionalmente en donde la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.

6. El oligonucleótido modificado de cadena sencilla de cualquier reivindicación anterior, en donde por lo menos un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende un azúcar modificado.

7. El oligonucleótido modificado de cadena sencilla de la reivindicación 6, en donde el por lo menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico; opcionalmente en donde el azúcar bicíclico comprende un puente 4'-CH(R)-O-2' en donde R es, independientemente, H, alquilo C¹-C¹², o un grupo protector; opcionalmente además en donde: a) R es metilo; o

b) R es H.

8. El oligonucleótido modificado de cadena sencilla de la reivindicación 6, en donde el por lo menos un azúcar modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietilo o un grupo 2'-O-metilo.

9. El oligonucleótido modificado de cadena sencilla de cualquier reivindicación anterior, en donde el oligonucleótido modificado comprende:

un segmento de espacio que consiste de 10 desoxinucleósidos enlazados;

un segmento de ala 5' que consiste de 5 nucleósidos enlazados; y

un segmento de ala 3' que consiste de 5 nucleósidos enlazados;

en donde el segmento de espacio se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.

10. El oligonucleótido modificado de cadena sencilla de cualquier reivindicación anterior, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 20 nucleósidos enlazados.

11. El oligonucleótido modificado de cadena sencilla de cualquier reivindicación anterior que consiste de 20 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende por lo menos 15 nucleobases consecutivas de la SEQ ID NO: 18, en donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es 100% complementaria con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID: NO: 2, en donde por lo menos un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende un azúcar modificado, en donde el por lo menos un azúcar modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietilo, en donde por lo menos un nucleósido comprende una nucleobase modificada que es una 5-metilcitosina, en donde por lo menos un enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y por lo menos un enlace internucleosídico es un enlace fosfodiéster, y en donde el oligonucleótido modificado de cadena sencilla reduce la expresión de ARNm y/o proteína de Ataxina 2.

12. El oligonucleótido modificado de cadena sencilla de cualquier reivindicación anterior que consiste de 20 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende por lo menos 19 nucleobases consecutivas de la SEQ ID NO: 19, en donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es 100% complementaria con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID: NO: 2, en donde por lo menos un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende un azúcar modificado, en donde el por lo menos un azúcar modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietilo, en donde por lo menos un nucleósido comprende una nucleobase modificada que es una 5­ metilcitosina, en donde por lo menos un enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y por lo menos un enlace internucleosídico es un enlace fosfodiéster, y en donde el oligonucleótido modificado de cadena sencilla reduce la expresión de ARNm y/o proteína de Ataxina 2.

13. Una composición que comprende el oligonucleótido modificado de cadena sencilla de cualquier reivindicación anterior y por lo menos un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable, en donde opcionalmente el diluyen farmacéuticamente aceptable es solución salina tamponada con fosfato (PBS).

14. La composición de la reivindicación 13, en donde el oligonucleótido modificado es una sal de sodio.