ES2887187T3

ES2887187T3 - Formulaciones de VWF recombinante

Info

Publication number: ES2887187T3
Application number: ES08866246T
Authority: ES
Inventors: Peter Matthiessen; Peter Turecek; Hans-Peter Schwarz; Kurt Schnecker
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2007-12-28
Filing date: 2008-12-23
Publication date: 2021-12-22
Anticipated expiration: 2028-12-23
Also published as: TW201731488A; EP2244814B1; EP2244814A2; TWI515006B; TWI600437B; US11191837B2; TW200940084A; SG10201608059VA; CN105816858A; KR101643277B1; KR20160091434A; CN105816858B; BRPI0821474A2; JP2011508742A; AU2008345135A1; US20090192076A1; NZ586383A; MX2010007150A; WO2009086400A2; BRPI0821474B1

Abstract

Formulación farmacéutica líquida estable de un factor de von Willebrand recombinante (rVWF) que comprende: (a) un rVWF; (b) un agente de tamponamiento; (c) una o más sales; (d) un agente estabilizante; y (e) opcionalmente un tensioactivo; en la que el rVWF es capaz de provocar la aglutinación de plaquetas estabilizadas en presencia de ristocetina; en la que dicho rVWF comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: a) la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3; b) un análogo, fragmento o variante biológicamente activo de a); c) un polipéptido codificado por el polinucleótido expuesto en SEQ ID NO: 1; d) un análogo, fragmento o variante biológicamente activo de c); y e) un polipéptido codificado por un polinucleótido que se hibrida con el polinucleótido expuesto en SEQ ID NO: 1 en condiciones de hibridación moderadamente estrictas; en la que dicho tampón está compuesto por un agente de tamponamiento de pH en un intervalo de 0,1 mM a 500 mM y en la que el pH está en un intervalo de 2,0 a 12,0; en la que dicha sal está a una concentración de 1 a 500 mM; en la que dicho agente estabilizante está a una concentración de 0,1 a 1000 mM y se selecciona del grupo que consiste en manitol, lactosa, sorbitol, xilitol, sacarosa, trehalosa, manosa, maltosa, lactosa, glucosa, rafinosa, celobiosa, gentiobiosa, isomaltosa, arabinosa, glucosamina, fructosa y combinaciones de estos agentes estabilizantes; y en la que dicho tensioactivo está a una concentración de 0,01 g/l a 0,5 g/l.

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones de VWF recombinante

Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional estadounidense n.° 61/017.418, presentada el 28 de diciembre de 2007, y de la solicitud provisional estadounidense n.° 61/017.881, presentada el 31 de diciembre de 2007.

Campo de la invención

En general, la invención se refiere a formulaciones de VWF recombinante y a métodos para elaborar una composición que comprende VWF recombinante.

Antecedentes de la invención

El factor de von Willebrand (VWF) es una glicoproteína que circula en el plasma como una serie de multímeros cuyo tamaño oscila desde aproximadamente 500 hasta 20.000 kD. Las formas multiméricas del VWF se componen de subunidades polipeptídicas de 250 kD unidas por enlaces disulfuro. El VWF interviene en la adhesión inicial de las plaquetas al subendotelio de la pared vascular dañada. Sólo los multímeros más grandes presentan actividad hemostática. Se supone que las células endoteliales secretan formas poliméricas grandes de VWF y que esas formas de VWF que tienen un peso molecular bajo (VWF de bajo peso molecular) surgen de la escisión proteolítica. Los multímeros de gran masa molecular se almacenan en los cuerpos de Weibel-Pallade de las células endoteliales y se liberan tras la estimulación.

El VWF es sintetizado por las células endoteliales y los megacariocitos como prepro-VWF que consiste en gran medida en dominios repetidos. Al escindir el péptido señal, el pro-VWF se dimeriza a través de enlaces disulfuro en su región C-terminal. Los dímeros sirven como protómeros para la multimerización, que se rige por los enlaces disulfuro entre los extremos libres. El ensamblaje a los multímeros es seguido por la eliminación proteolítica de la secuencia del propéptido (Leyte et al., Biochem. J. 274 (1991), 257-261).

El producto primario de traducción predicho a partir del ADNc clonado del VWF es un polipéptido precursor de 2813 residuos (prepro-VWF). El prepro-VWF consiste en un péptido señal de 22 aminoácidos y un propéptido de 741 aminoácidos, y el VWF maduro comprende 2050 aminoácidos (Ruggeri Z.A., y Ware, J., FASEB J., 308-316 (1993)).

Los defectos en el VWF son la causa de la enfermedad de Von Willebrand (VWD), que se caracteriza por un fenotipo hemorrágico más o menos pronunciado. La VWD de tipo 3 es la forma más grave en la que el VWF falta por completo, y la VWD de tipo 1 se está relacionada con una pérdida cuantitativa del VWF y su fenotipo puede ser muy leve. La VWD de tipo 2 está relacionada con defectos cualitativos del VWF y puede ser tan grave como la VWD de tipo 3. La VWD de tipo 2 tiene muchas subformas, algunas de las cuales están asociadas con la pérdida o disminución de los multímeros de alto peso molecular. El síndrome de Von Willebrand de tipo 2a (VWS-2A) se caracteriza por una pérdida tanto de multímeros intermedios como grandes. El VWS-2B se caracteriza por una pérdida de los multímeros de mayor peso molecular. En la técnica se conocen otras enfermedades y trastornos relacionados con el VWF.

Las patentes estadounidenses n.os 6.531.577, 7.166.709 y la solicitud de patente europea n.° 04380188.5 describen formulaciones de VWF derivadas de plasma. Sin embargo, además de los problemas de cantidad y pureza con el VWF derivado de plasma, también existe el riesgo de patógenos de transmisión hemática (por ejemplo, virus y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob variante (vCID). Los documentos WO9300107, US5900476, US6005077, EP1522312 describen diversas composiciones que comprenden VWF (factor de von Willebrand).

Por tanto, existe una necesidad en la técnica de desarrollar una formulación farmacéutica estable que comprenda VWF recombinante.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona formulaciones útiles para las composiciones que comprenden VWF recombinante, dando como resultado una composición farmacéutica altamente estable. La composición farmacéutica estable es útil como agente terapéutico en el tratamiento de individuos que padecen trastornos o estados que pueden beneficiarse de la administración de VWF recombinante.

En una realización, la invención proporciona una formulación farmacéutica líquida estable de un factor de von Willebrand recombinante (rVWF) que comprende: (a) un rVWF; (b) un agente de tamponamiento; (c) una o más sales; (d) opcionalmente un agente estabilizante; y (e) opcionalmente un tensioactivo; en la que el rVWF comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: a) la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3; b) un análogo, fragmento o variante biológicamente activo de a); c) un polipéptido codificado por el polinucleótido expuesto en SEQ ID NO: 1; d) un análogo, fragmento o variante biológicamente activo de c); y e) un polipéptido codificado por un polinucleótido que se hibrida con el polinucleótido expuesto en SEQ ID NO: 1 en condiciones de hibridación moderadamente estrictas; en la que el tampón está compuesto por un agente de tamponamiento de pH en un intervalo de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 500 mM y en la que el pH está en un intervalo de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 12,0; en la que la sal está a una concentración de aproximadamente 1 a 500 mM; en la que el agente estabilizante está a una concentración de aproximadamente 0,1 a 1000 mM; y en la que el tensioactivo está a una concentración de aproximadamente 0,01 g/l a 0,5 g/l según la reivindicación 1.

En otra realización, se proporciona la formulación anteriormente mencionada en la que el rVWF comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3. En otra realización, se proporciona una formulación anteriormente mencionada en la que el agente de tamponamiento se selecciona del grupo que consiste en citrato de sodio, glicina, histidina, Tris y combinaciones de estos agentes. En aún otra realización, se proporciona una formulación anteriormente mencionada en la que el agente de tamponamiento es citrato. En todavía otra realización de la invención, se proporciona la formulación anteriormente mencionada en la que el pH está en el intervalo de 6,0 8,0 ó 6,5-7,3. En una realización relacionada, se proporciona la formulación anteriormente mencionada en la que el pH es 7,0. En otra realización, se proporciona una formulación anteriormente mencionada en la que el agente de tamponamiento es citrato y el pH es 7,0.

En todavía otra realización, se proporciona una formulación anteriormente mencionada en la que la sal se selecciona del grupo que consiste en cloruro de calcio, cloruro de sodio y cloruro de magnesio. En otra realización, se proporciona la formulación anteriormente mencionada en la que la sal está en un intervalo de concentración de 0,5 a 300 mM. En otra realización, se proporciona la formulación anteriormente mencionada en la que la sal es cloruro de calcio a una concentración de 10 mM.

En otra realización, se proporciona una formulación anteriormente mencionada en la que el rVWF comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3; en la que el agente de tamponamiento es citrato y el pH es 7,0; y en la que la sal es cloruro de calcio a una concentración de 10 mM. En otra realización, se proporciona una formulación anteriormente mencionada en la que el rVWF comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3; en la que el agente de tamponamiento es citrato de sodio y el pH es 7,0; y en la que la sal es cloruro de calcio a una concentración de 10 mM y NaCl a una concentración de 100 mM.

La presente invención también contempla otras formulaciones. Por ejemplo, en una realización, se proporciona una formulación anteriormente mencionada en la que el uno o más agentes de tamponamiento son histidina y Tris a una concentración de 3,3 mM cada uno. En otra realización, se proporciona la formulación anteriormente mencionada en la que el pH es 7,0. En aún otra realización, se proporciona una formulación anteriormente mencionada en la que la primera sal es cloruro de sodio a una concentración de 30 mM y la segunda sal es cloruro de calcio a una concentración de 0,56 mM.

En todavía otra realización de la invención, se proporciona una formulación anteriormente mencionada en la que el agente estabilizante se selecciona del grupo que consiste en manitol, lactosa, sorbitol, xilitol, sacarosa, trehalosa, manosa, maltosa, lactosa, glucosa, rafinosa, celobiosa, gentiobiosa, isomaltosa, arabinosa, glucosamina, fructosa y combinaciones de estos agentes estabilizantes. En otra realización, se proporciona la formulación anteriormente mencionada en la que los agentes estabilizantes son trehalosa a una concentración de 7,8 mM y manitol a una concentración de 58,6 mM.

En otra realización, se proporciona una formulación anteriormente mencionada en la que el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en digitonina, Triton X-100 (octilfenil éter de polioxietileno), Triton X-114 (terc-octilfenil éter de polietilenglicol), TWEEN-20, TWEEN-80 (polisorbatos) y combinaciones de estos tensioactivos. En otra realización, se proporciona la formulación anteriormente mencionada en la que el tensioactivo es TWEEN-80 a 0,03 g/l.

En una realización de la invención, se proporciona una formulación anteriormente mencionada en la que el rVWF comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3; en la que los agentes de tamponamiento son histidina a una concentración de 3,3 mM y Tris a una concentración de 3,3 mM a pH 7,0; en la que la primera sal es cloruro de sodio a una concentración de 30 mM y la segunda sal es cloruro de calcio a una concentración de 0,56 mM; en la que los agentes estabilizantes son trehalosa a una concentración de 7,8 mM y manitol a una concentración de 58,6 mM; y en la que el tensioactivo es TWEEN-80 a 0,03 g/l.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra que el rVWF no es estable en tampón Advate después de 26 semanas, debido a la presencia de glutatión.

La figura 2 muestra que el rVWF es estable en tampón Advate 1:3 hasta 12 semanas a 4°C.

La figura 3 muestra que la estabilidad de una formulación a base de citrato es mejor que la formulación de tampón Advate 1:3 que contiene glutatión 0,1 M.

La figura 4 muestra que la concentración de rVWF es estable a lo largo de 26 semanas en tampón Advate.

La figura 5 muestra que la concentración de rVWF es estable a lo largo del tiempo en tampón Advate 1:3.

La figura 6 muestra que la concentración de rVWF es estable a lo largo del tiempo en el tampón a base de citrato.

La figura 7 muestra que la mayoría de los excipientes aumentan la temperatura de desplegamiento de rVWF en aproximadamente 1 ó 2°C.

La figura 8 muestra que CaCh 10 mM aumenta la temperatura de desplegamiento de rVWF en de aproximadamente 8°C a aproximadamente 67°C.

La figura 9 muestra que el efecto de CaCh es similar a pH 7,3 y a pH 6,5.

Descripción detallada de la invención

Definición de términos

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Las siguientes referencias proporcionan a un experto una definición general de muchos de los términos usados en esta invención: Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2a ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5a ED., R. Rieger, et al. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale and Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991).

Cada publicación, solicitud de patente, patente y otra referencia citada en el presente documento se incorpora por referencia en su totalidad en la medida en que no sean inconsecuentes con la presente divulgación.

Cabe destacar que, tal como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen una referencia plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

Tal como se usa en el presente documento, los siguientes términos tienen el significado que se les atribuye, a menos que se especifique lo contrario.

El término “que comprende”, con respecto a un compuesto peptídico, significa que un compuesto puede incluir aminoácidos adicionales en uno o ambos extremos amino y carboxilo terminales de la secuencia dada. Por supuesto, estos aminoácidos adicionales no deben interferir significativamente con la actividad del compuesto. Con respecto a una composición de la presente invención, el término “que comprende” significa que una composición puede incluir componentes adicionales. Estos componentes adicionales no deben interferir significativamente con la actividad de la composición.

El término “farmacológicamente activo” significa que se determina que una sustancia así descrita tiene una actividad que afecta a un parámetro médico (por ejemplo, pero sin limitarse a, presión arterial, hemograma, nivel de colesterol) o a un estado patológico (por ejemplo, pero sin limitarse a, cáncer, trastornos autoinmunitarios).

Tal como se usan en el presente documento, los términos “expresar”, “que expresa” y “expresión” significan permitir o hacer que se manifieste la información en un gen o una secuencia de ADN, por ejemplo, produciendo una proteína mediante la activación de las funciones celulares implicadas en la transcripción y traducción de un gen o una secuencia de ADN correspondiente. Una secuencia de ADN se expresa en o por una célula para formar un “producto de expresión” tal como una proteína. También puede decirse que el producto de expresión en sí, por ejemplo, la proteína resultante, se “expresa”. Un producto de expresión puede caracterizarse como intracelular, extracelular o secretado. El término “ intracelular” significa dentro de una célula. El término “extracelular” significa fuera de una célula, tal como una proteína transmembrana. Una sustancia es “secretada” por una célula si aparece en una medida significativa fuera de la célula, desde algún lugar sobre o dentro de la célula.

Tal como se usa en el presente documento, un “polipéptido” se refiere a un polímero que se compone de residuos de aminoácidos, variantes estructurales, variantes estructurales que se producen de manera natural relacionadas y análogos sintéticos que no se producen de manera natural de los mismos unidos mediante enlaces peptídicos. Los polipéptidos sintéticos pueden prepararse, por ejemplo, usando un sintetizador automatizado de polipéptidos. El término “proteína” se refiere normalmente a polipéptidos grandes. El término “péptido” se refiere normalmente a polipéptidos cortos.

Tal como se usa en el presente documento, un “fragmento” de un polipéptido se refiere a cualquier porción de un polipéptido o una proteína más pequeña que el producto de expresión de un polipéptido o una proteína de longitud completa.

Tal como se usa en el presente documento, un “análogo” se refiere a cualquiera de dos o más polipéptidos sustancialmente similares en estructura y que tienen la misma actividad biológica, pero que pueden tener diferentes grados de actividad, o bien para la molécula completa o bien para un fragmento de la misma. Los análogos difieren en la composición de sus secuencias de aminoácidos basándose en una o más mutaciones que implican la sustitución de uno o más aminoácidos por otros aminoácidos. Las sustituciones pueden ser conservadoras o no conservadoras basándose en la relación fisicoquímica o funcional del aminoácido que se reemplaza y del aminoácido que lo reemplaza.

Tal como se usa en el presente documento, una “variante” se refiere a un polipéptido, una proteína o un análogo de los mismos que se modifica para comprender restos químicos adicionales que normalmente no forman parte de la molécula. Tales restos pueden modular la solubilidad, la absorción, la semivida biológica, etc., de la molécula. Alternativamente, los restos pueden disminuir la toxicidad de la molécula y eliminar o atenuar cualquier efecto secundario indeseable de la molécula, etc. Los restos capaces de mediar tales efectos se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). En la técnica se conocen bien procedimientos para acoplar tales restos a una molécula. Por ejemplo, la variante puede ser un factor de coagulación sanguínea que tiene una modificación química que confiere una semivida más larga in vivo a la proteína. En diversos aspectos, los polipéptidos se modifican por glicosilación, pegilación y/o polisialilación.

VWF recombinante

Las secuencias de polinucleótidos y aminoácidos de prepro-VWF se exponen en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, y están disponibles en los números de registro de GenBank NM_000552 y NP_000543, respectivamente. La secuencia de aminoácidos correspondiente a la proteína VWF madura se expone en SEQ ID NO: 3 (correspondiente a los aminoácidos 764-2813 de la secuencia de aminoácidos de prepro-VWF de longitud completa).

Una forma de rVWF útil tiene al menos la propiedad de estabilizar in vivo, por ejemplo, unir, al menos una molécula de factor VIII (FVIII) y tener opcionalmente un patrón de glicosilación que es farmacológicamente aceptable. Los ejemplos específicos del mismo incluyen VWF sin el dominio A2, por tanto, resistente a la proteólisis (Lankhof et al., ^{Thromb. Haemost. 77: 1008-1013, 1997), y el fragmento de}VwF ^{de Val 449 a Asn 730 que incluye el dominio de}unión a la glicoproteína 1b y sitios de unión para el colágeno y la heparina (Pietu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 1339-1347, 1989). La determinación de la capacidad de un VWF para estabilizar al menos una molécula de FVIII puede llevarse a cabo en mamíferos deficientes en VWF según métodos conocidos en el estado de la técnica.

El rVWF de la presente invención puede producirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Un ejemplo específico se divulga en el documento WO86/06096, publicado el 23 de octubre de 1986, y en la solicitud de patente estadounidense n.° 07/559.509, presentada el 23 de julio de 1990, que se incorpora en el presente documento por referencia con respecto a los métodos de producción del VWF recombinante. Por tanto, en la técnica se conocen métodos para (i) producir ADN recombinante mediante ingeniería genética, por ejemplo, mediante transcripción inversa de ARN y/o amplificación de ADN, (ii) introducir ADN recombinante en células procariotas o eucariotas por transfección, por ejemplo, mediante electroporación o microinyección, (iii) cultivar dichas células transformadas, por ejemplo, de manera continua o discontinua, (iv) expresar el VWF, por ejemplo, de manera constitutiva o por inducción, y (v) aislar dicho VWF, por ejemplo, a partir del medio de cultivo o recogiendo las células transformadas, con el fin de (vi) obtener el rVWF purificado, por ejemplo, mediante cromatografía de intercambio aniónico o cromatografía de afinidad. Un VWF recombinante puede elaborarse en células huésped transformadas usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, las secuencias que codifican para el polipéptido pueden extraerse del ADN usando enzimas de restricción adecuadas.

Alternativamente, la molécula de ADN podría sintetizarse usando técnicas de síntesis química, tales como el método del fosforamidato. También podría usarse una combinación de estas técnicas.

La invención también proporciona vectores que codifican para polipéptidos de la invención en un huésped apropiado. El vector comprende el polinucleótido que codifica para el polipéptido unido operativamente a secuencias de control de la expresión apropiadas. Los métodos para llevar a cabo esta unión operativa, o bien antes o bien después de la inserción del polinucleótido en el vector, son bien conocidos. Las secuencias de control de la expresión incluyen promotores, activadores, potenciadores, operadores, sitios de unión al ribosoma, señales de inicio, señales de parada, señales de cápside, señales de poliadenilación y otras señales relacionadas con el control de la transcripción o traducción. El vector resultante que contiene el polinucleótido se usa para transformar un huésped apropiado. Esta transformación puede realizarse mediante métodos bien conocidos en la técnica.

En la práctica de esta invención puede usarse cualquiera de un gran número de células huésped disponibles y bien conocidas. La selección de un huésped particular depende de varios factores reconocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, la compatibilidad con el vector de expresión elegido, la toxicidad de los péptidos codificados por la molécula de ADN, la tasa de transformación, la facilidad de recuperación de los péptidos, las características de expresión, la seguridad biológica y los costes. Hay que encontrar un equilibrio entre estos factores, teniendo en cuenta que no todas las células huésped son igualmente eficaces para la expresión de una secuencia de ADN particular. Dentro de estas directrices generales, las células huésped microbianas útiles incluyen bacterias, levaduras y otros hongos, insectos, plantas, células de mamíferos (incluyendo humanos) en cultivo, u otros huéspedes conocidos en la técnica.

A continuación, se cultiva y purifica el huésped transformado. Las células huésped pueden cultivarse en condiciones de fermentación convencionales para que se expresen los compuestos deseados. Tales condiciones de fermentación son bien conocidas en la técnica. Por último, los polipéptidos se purifican a partir del cultivo mediante métodos bien conocidos en la técnica.

Dependiendo de la célula huésped usada para expresar un compuesto de la invención, los grupos de hidratos de carbono (oligosacáridos) pueden unirse convenientemente a sitios que se sabe que son sitios de glicosilación en las proteínas. Generalmente, los oligosacáridos ligados a O se unen a residuos de serina (Ser) o treonina (Thr), mientras que los oligosacáridos ligados a N se unen a residuos de asparagina (Asn) cuando forman parte de la secuencia Asn-X-Ser/Thr, donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. X es preferiblemente uno de los 19 aminoácidos que se producen de manera natural sin contar la prolina. Las estructuras de los oligosacáridos ligados a N y a O y los residuos de azúcar que se encuentran en cada tipo son diferentes. Un tipo de azúcar que se encuentra habitualmente en ambos es el ácido N-acetilneuramínico (denominado ácido siálico). El ácido siálico es habitualmente el residuo terminal tanto de los oligosacáridos ligados a N como de los ligados a O y, en virtud de su carga negativa, puede conferir propiedades ácidas al compuesto glicosilado. Tal(es) sitio(s) puede(n) incorporarse en el ligador de los compuestos de esta invención y preferiblemente se someten a glicosilación por una célula durante la producción recombinante de los compuestos polipeptídicos (por ejemplo, en células de mamíferos tales como CHO, BHK, COS). Sin embargo, tales sitios pueden someterse a glicosilación adicional mediante procedimientos sintéticos o semisintéticos conocidos en la técnica.

Alternativamente, los compuestos pueden elaborarse mediante métodos sintéticos. Por ejemplo, pueden usarse técnicas de síntesis en fase sólida. Las técnicas adecuadas son bien conocidas en la técnica, e incluyen las descritas en Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, págs. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart y Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; patente estadounidense n.° 3.941.763; Finn et al. (1976), The Proteins (3a ed.) 2: 105-253; y Erickson et al. (1976), The Proteins (3a ed.) 2: 257-527. La síntesis en fase sólida es la técnica preferida para elaborar péptidos individuales, ya que es el método más rentable para elaborar péptidos pequeños.

Fragmentos, variantes y análogos del VWF

En la técnica se conocen bien métodos para preparar fragmentos, variantes o análogos polipeptídicos.

Los fragmentos de un polipéptido se preparan usando, sin limitación, escisión enzimática (por ejemplo, tripsina, quimotripsina) y también usando medios recombinantes para generar un fragmento de polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos específica. Pueden generarse fragmentos polipeptídicos que comprenden una región de la proteína que tiene una actividad particular, tal como un dominio de multimerización o cualquier otro dominio identificable del VWF conocido en la técnica.

También se conocen bien métodos de elaboración de análogos polipeptídicos. Los análogos de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido pueden ser análogos de sustitución, inserción, adición o deleción. Los análogos de deleción, incluyendo los fragmentos de un polipéptido, carecen de uno o más residuos de la proteína nativa que no son esenciales para la función o actividad inmunogénica. Los análogos de inserción implican la adición de, por ejemplo, aminoácidos en un punto no terminal del polipéptido. Este análogo puede incluir la inserción de un epítopo inmunorreactivo o simplemente un único residuo. Los análogos de adición, incluyendo los fragmentos de un polipéptido, incluyen la adición de uno o más aminoácidos en cualquiera de los dos extremos de una proteína, e incluyen, por ejemplo, las proteínas de fusión.

Los análogos de sustitución normalmente intercambian un aminoácido de tipo natural por otro en uno o más sitios dentro de la proteína, y pueden estar diseñados para modular una o más propiedades del polipéptido sin la pérdida de otras funciones o propiedades. En un aspecto, las sustituciones son sustituciones conservadoras. Por “sustitución conservadora de aminoácidos” se entiende la sustitución de un aminoácido por otro que tiene una cadena lateral de carácter químico similar. Los aminoácidos similares para realizar sustituciones conservadoras incluyen los que tienen una cadena lateral ácida (ácido glutámico, ácido aspártico); una cadena lateral básica (arginina, lisina, histidina); una cadena lateral de amida polar (glutamina, asparagina) una cadena lateral alifática hidrófoba (leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina); una cadena lateral aromática (fenilalanina, triptófano, tirosina); una cadena lateral pequeña (glicina, alanina, serina, treonina, metionina); o una cadena lateral de hidroxilo alifática (serina, treonina).

Los análogos pueden ser sustancialmente homólogos o sustancialmente idénticos al VWF recombinante del que derivan. Los análogos preferidos son aquellos que conservan al menos parte de la actividad biológica del polipéptido de tipo natural, por ejemplo, la actividad de coagulación sanguínea.

Las variantes polipeptídicas contempladas incluyen polipéptidos modificados químicamente por técnicas tales como ubiquitinación, glicosilación, incluyendo polisialación, conjugación con agentes terapéuticos o de diagnóstico, marcaje, unión covalente de polímeros tal como pegilación (derivación con polietilenglicol), introducción de enlaces no hidrolizables e inserción o sustitución por síntesis química de aminoácidos tales como ornitina, que normalmente no se producen en las proteínas humanas. Las variantes conservan las mismas o esencialmente las mismas propiedades de unión de las moléculas no modificadas de la invención. Tal modificación química puede incluir la unión directa o indirecta (por ejemplo, mediante un ligador) de un agente al polipéptido v W f . En el caso de unión indirecta, se contempla que el ligador puede ser hidrolizable o no hidrolizable.

La preparación de análogos polipeptídicos pegilados comprenderá generalmente las etapas de (a) hacer reaccionar el polipéptido con polietilenglicol (tal como un derivado de éster o aldehído reactivo de PEG) en condiciones en las que el polipéptido del constructo de unión se une a uno o más grupos PEG, y (b) obtener el/los producto(s) de reacción. En general, las condiciones óptimas de reacción para las reacciones de acilación se determinarán basándose en los parámetros conocidos y el resultado deseado. Por ejemplo, cuanto mayor sea la razón de PEG:proteína, mayor será el porcentaje de producto polipegilado. En algunas realizaciones, el constructo de unión tendrá un único resto PEG en el extremo N-terminal. El polietilenglicol (PEG) puede unirse al factor de coagulación sanguínea para proporcionar una semivida más larga in vivo. El grupo PEG puede tener cualquier peso molecular conveniente y puede ser lineal o ramificado. El peso molecular promedio del PEG oscila desde aproximadamente 2 kiloDalton (“kD”) hasta aproximadamente 100 kDa, desde aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 50 kDa o desde aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 10 kDa. Los grupos PEG se unen al factor de coagulación sanguínea mediante acilación o alquilación reductora a través de un grupo reactivo natural o modificado por ingeniería en el resto PEG (por ejemplo, un grupo aldehído, amino, tiol o éster) a un grupo reactivo en el factor de coagulación sanguínea (por ejemplo, un grupo aldehído, amino o éster) o mediante cualquier otra técnica conocida en la técnica.

Los métodos para preparar el polipéptido polisialilado se describen en la publicación de patente estadounidense 20060160948, Fernandes y Gregoriadis; Biochim. Biophys. Acta 1341: 26-34, 1997, y Saenko et al., Haemophilia 12:42-51,2006. Brevemente, una disolución de ácido colomínico que contiene NaIO40,1 M se agita en la oscuridad a temperatura ambiente para oxidar el CA. La disolución de CA activado se dializa contra, por ejemplo, tampón fosfato de sodio 0,05 M, pH 7,2 en la oscuridad, y esta disolución se añadió a una disolución de rVWF y se incubó durante 18 h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación suave. A continuación, los reactivos libres pueden separarse del conjugado rVWF-poli(ácido siálico) mediante ultrafiltración/diafiltración. La conjugación de rVWF con el poli(ácido siálico) también puede lograrse usando glutaraldehído como reactivo de reticulación (Migneault et al., Biotechniques 37: 790-796, 2004).

Se contempla además que un polipéptido de la invención puede ser una proteína de fusión con un segundo agente que es un polipéptido. En una realización, el segundo agente que es un polipéptido, sin limitación, es una enzima, un factor de crecimiento, un anticuerpo, una citocina, una quimiocina, un receptor de superficie celular, el dominio extracelular de un receptor de superficie celular, una molécula de adhesión celular o un fragmento o dominio activo de una proteína descrita anteriormente. En una realización relacionada, el segundo agente es un factor de coagulación sanguínea, tal como el factor VIII, el factor VII o el factor IX. La proteína de fusión contemplada se elabora mediante técnicas químicas o recombinantes bien conocidas en la técnica.

También se contempla que los polipéptidos prepro-VWF y pro-VWF pueden proporcionar un beneficio terapéutico en las formulaciones de la presente invención. Por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.005.502 describe una preparación farmacéutica que comprende cantidades sustanciales de pro-VWF que induce la generación de trombina in vitro. Además de los fragmentos, variantes o análogos recombinantes y biológicamente activos del VWF maduro que se produce de manera natural, la presente invención contempla el uso de fragmentos, variantes o análogos recombinantes y biológicamente activos del prepro-VWF (expuesto en SEQ ID NO: 2) o de los polipéptidos pro-VWF (residuos de aminoácidos 23 a 764 de SEQ ID NO: 2) en las formulaciones descritas en el presente documento.

Los polinucleótidos que codifican para fragmentos, variantes y análogos pueden generarse fácilmente por un trabajador experto en codificar fragmentos, variantes o análogos biológicamente activos de la molécula que se produce de manera natural que poseen la misma actividad biológica o similar que la molécula que se produce de manera natural. Estos polinucleótidos pueden prepararse mediante técnicas de PCR, digestión/ligación de la molécula codificadora de ADN y similares. Por tanto, un experto en la técnica podrá generar cambios de una sola base en la cadena de ADN para dar lugar a un codón alterado y a una mutación de aminoácido, usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, mutagénesis específica de sitio. Tal como se usa en el presente documento, la expresión “condiciones de hibridación moderadamente estrictas” significa, por ejemplo, hibridación a 42°C en formamida al 50% y lavado a 60°C en 0,1 x SSC, SDS al 0,1%. Los expertos en la técnica entienden que la variación de estas condiciones se produce basándose en la longitud y el contenido de bases de nucleótidos GC de las secuencias que van a hibridarse. Las fórmulas convencionales en la técnica son apropiadas para determinar las condiciones exactas de hibridación. Véase Sambrook et al., 9.47-9.51 en Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989).

Formulaciones y excipientes en general

Los excipientes son aditivos que se incluyen en una formulación porque o bien imparten o bien potencian la estabilidad y la administración de un medicamento. Independientemente del motivo de su inclusión, los excipientes son un componente integral de un medicamento y, por tanto, deben ser seguros y bien tolerados por los pacientes. En el caso de los fármacos proteicos, la elección de los excipientes es especialmente importante porque pueden afectar tanto a la eficacia como a la inmunogenicidad del fármaco. Por tanto, las formulaciones de proteínas deben desarrollarse con una selección adecuada de excipientes que ofrezcan estabilidad, seguridad y comerciabilidad adecuadas.

El principal reto en el desarrollo de formulaciones para proteínas terapéuticas es estabilizar el producto frente a las tensiones de la fabricación, el transporte y el almacenamiento. El papel de los excipientes en las formulaciones es proporcionar estabilización frente a estas tensiones. Los excipientes también pueden emplearse para reducir la viscosidad de las formulaciones de proteínas de alta concentración con el fin de permitir su administración y mejorar la comodidad del paciente. En general, los excipientes pueden clasificarse basándose en los mecanismos por los que estabilizan las proteínas frente a diversas tensiones químicas y físicas. Algunos excipientes se usan para aliviar los efectos de una tensión específica o para regular una susceptibilidad particular de una proteína específica. Otros excipientes tienen efectos más generales sobre la estabilidad física y covalente de las proteínas. Los excipientes descritos en el presente documento se organizan por su tipo químico o por su papel funcional en las formulaciones. Al comentar cada tipo de excipiente, se describen brevemente los modos de estabilización.

Dadas las enseñanzas y la directriz proporcionadas en el presente documento, los expertos en la técnica sabrán qué cantidad o intervalo de excipiente puede incluirse en cualquier formulación particular para lograr una formulación biofarmacéutica de la invención que fomente la retención en la estabilidad del biofármaco (por ejemplo, un polipéptido). Por ejemplo, la cantidad y el tipo de una sal que debe incluirse en una formulación biofarmacéutica de la invención puede seleccionarse en función de la osmolalidad deseada (es decir, isotónica, hipotónica o hipertónica) de la disolución final, así como de las cantidades y la osmolalidad de otros componentes que deben incluirse en la formulación. Del mismo modo, ejemplificando con referencia al tipo de poliol o azúcar incluido en una formulación, la cantidad de un excipiente de este tipo dependerá de su osmolalidad.

A modo de ejemplo, la inclusión de aproximadamente el 5% de sorbitol puede lograr la isotonicidad, mientras que se necesita alrededor del 9% de un excipiente de sacarosa para lograr la isotonicidad. La selección de la cantidad o el intervalo de concentraciones de uno o más excipientes que pueden incluirse en una formulación biofarmacéutica de la invención se ha ejemplificado anteriormente haciendo referencia a sales, polioles y azúcares. Sin embargo, los expertos en la técnica entenderán que las consideraciones descritas en el presente documento y ejemplificadas adicionalmente con referencia a excipientes específicos son igualmente aplicables a todos los tipos y combinaciones de excipientes, incluyendo, por ejemplo, sales, aminoácidos, otros agentes de tonicidad, tensioactivos, estabilizadores, agentes de carga, crioprotectores, lioprotectores, antioxidantes, iones metálicos, agentes quelantes y/o conservantes.

Además, cuando un excipiente particular se indica en concentración molar, los expertos en la técnica reconocerán que también se contempla el porcentaje (%) p/v equivalente (por ejemplo, (gramos de sustancia en una muestra de disolución/ml de disolución) X 100%) de la disolución.

Por supuesto, un experto habitual en la técnica reconocería que las concentraciones de los excipientes descritos en el presente documento comparten una interdependencia dentro de una formulación particular. A modo de ejemplo, la concentración de un agente de carga puede reducirse cuando, por ejemplo, hay una alta concentración de polipéptido o cuando, por ejemplo, hay una alta concentración de agente estabilizante. Además, un experto habitual en la técnica reconocería que, para mantener la isotonicidad de una formulación particular en la que no hay agente de carga, la concentración de un agente estabilizante se ajustaría por consiguiente (es decir, se usaría una cantidad “tonificante” de estabilizador). En la técnica se conocen excipientes habituales y pueden encontrarse en Powell et al., Compendium of Excipients for Parenteral Formulations (1998), PDA J. Pharm. Sci. Technology, 52:238-311.

Tampones y agentes de tamponamiento

Se observa habitualmente que la estabilidad de una formulación de polipéptido farmacológicamente activa es máxima en un estrecho intervalo de pH. Este intervalo de pH de estabilidad óptima debe identificarse pronto durante los estudios de preformulación. Varios enfoques, tales como los estudios de estabilidad en condiciones aceleradas y los estudios de cribado calorimétrico, han demostrado ser útiles en esta tarea (Remmele R.L. Jr., et al., Biochemistry, 38(16): 5241-7 (1999)). Una vez finalizada la formulación, el medicamento debe fabricarse y mantenerse durante toda su vida útil. Por tanto, casi siempre se emplean agentes de tamponamiento para controlar el pH de la formulación.

Los ácidos orgánicos, los fosfatos y el Tris se han empleado habitualmente como tampones en las formulaciones de proteínas. La capacidad tampón de las especies de tamponamiento es máxima a un pH igual al pKa y disminuye a medida que el pH aumenta o se aleja de este valor. El noventa por ciento de la capacidad de tamponamiento existe dentro de una unidad de pH de su pKa. La capacidad tampón también aumenta proporcionalmente al aumentar la concentración del tampón.

Cuando se elige un tampón hay que tener en cuenta varios factores. En primer lugar, hay que definir la especie tampón y su concentración en función de su pKa y del pH deseado de la formulación. Igualmente importante es garantizar que el tampón sea compatible con el polipéptido y otros excipientes de la formulación, y que no catalice ninguna reacción de degradación. Un tercer aspecto importante a tener en cuenta es la sensación de escozor e irritación que el tampón puede inducir tras su administración. Por ejemplo, se sabe que el citrato provoca escozor tras su inyección (Laursen T, et al., Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2): 218-21 (2006)). El potencial de escozor e irritación es mayor para los fármacos que se administran por vía subcutánea (SC) o intramuscular (IM), donde la disolución del fármaco permanece en el lugar durante un periodo de tiempo relativamente más largo que cuando se administra por vía intravenosa (IV), donde la formulación se diluye rápidamente en la sangre tras su administración. En el caso de las formulaciones que se administran por infusión IV directa, es necesario controlar la cantidad total de tampón (y cualquier otro componente de la formulación). Hay que tener especial cuidado con los iones de potasio administrados en forma de tampón fosfato de potasio, que pueden inducir efectos cardiovasculares en el paciente (Hollander-Rodriguez JC, et al., Am. Fam. Physician., 73(2): 283-90 (2006)).

El sistema tampón presente en las composiciones se selecciona para que sea fisiológicamente compatible y para mantener un pH deseado de la formulación farmacéutica. En una realización, el pH de la disolución está entre pH 2,0 y pH 12,0. Por ejemplo, el pH de la disolución puede ser 2,0, 2,3, 2,5, 2,7, 3,0, 3,3, 3,5, 3,7, 4,0, 4,3, 4,5, 4,7, 5,0, 5,3, 5,5, 5,7, 6,0, 6,3, 6,5, 6,7, 7,0, 7,3, 7,5, 7,7, 8,0, 8,3, 8,5, 8,7, 9,0, 9,3, 9,5, 9,7, 10,0, 10,3, 10,5, 10,7, 11,0, 11,3, 11,5, 11,7 ó 12,0.

El compuesto de tamponamiento del pH puede estar presente en cualquier cantidad adecuada para mantener el pH de la formulación en un nivel predeterminado. En una realización, la concentración de tamponamiento del pH está entre 0,1 mM y 500 mM (1 M). Por ejemplo, se contempla que el agente de tamponamiento del pH sea al menos 0,1, 0,5, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500 mM.

Los agentes de tamponamiento de pH a modo de ejemplo usados para tamponar la formulación tal como se establece en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, glicina, histidina, glutamato, succinato, fosfato, acetato, citrato, Tris y aminoácidos o mezclas de aminoácidos, incluyendo, pero sin limitarse a, aspartato, histidina y glicina.

Sales

A menudo se añaden sales para aumentar la fuerza iónica de la formulación, lo que puede ser importante para la solubilidad, la estabilidad física y la isotonicidad de las proteínas. Las sales pueden afectar a la estabilidad física de las proteínas de diversas maneras. Los iones pueden estabilizar el estado nativo de las proteínas al unirse a los residuos cargados en la superficie de la proteína. Por otra parte, las sales pueden estabilizar el estado desnaturalizado al unirse a grupos peptídicos a lo largo de la estructura principal de la proteína (-CONH-). Las sales también pueden estabilizar la conformación nativa de la proteína protegiendo las interacciones electrostáticas repulsivas entre residuos de una molécula de proteína. Las sales en las formulaciones de proteínas también pueden proteger las interacciones electrostáticas atractivas entre moléculas de proteínas que pueden conducir a la agregación y a la insolubilidad de las proteínas. En las formulaciones proporcionadas, la concentración de sales está entre 0,1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 y 500 mM.

Estabilizadores y agentes de carga

En las presentes formulaciones farmacéuticas, puede añadirse un estabilizador (o una combinación de estabilizadores) para evitar o reducir la agregación y la degradación química inducidas por el almacenamiento. Una disolución turbia o nebulosa tras la reconstitución indica que la proteína ha precipitado o al menos se ha agregado. El término “estabilizador” significa un excipiente capaz de evitar la agregación u otra degradación física, así como la degradación química (por ejemplo, autolisis, desamidación, oxidación, etc.) en estado acuoso. Los estabilizadores que se emplean convencionalmente en las composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, sacarosa, trehalosa, manosa, maltosa, lactosa, glucosa, rafinosa, celobiosa, gentiobiosa, isomaltosa, arabinosa, glucosamina, fructosa, manitol, sorbitol, glicina, HCl de arginina, compuestos polihidroxilados, incluyendo polisacáridos tales como dextrano, almidón, hidroxietilalmidón, ciclodextrinas, N-metilpirrolidona, celulosa y ácido hialurónico, cloruro de sodio, [Carpenter et al., Develop. Biol. Standard 74:225, (1991)]. En las presentes formulaciones, el estabilizador se incorpora a una concentración de aproximadamente 0,1, 0,5, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900 ó 1000 mM.

Si se desea, las formulaciones también incluyen cantidades apropiadas de agentes de carga y reguladores de la osmolaridad. Los agentes de carga incluyen, por ejemplo, manitol, glicina, sacarosa, polímeros tales como dextrano, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulosa, lactosa, sorbitol, trehalosa o xilitol. En una realización, el agente de carga es manitol. El agente de carga se incorpora a una concentración de aproximadamente 0,1, 0,5, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900 ó 1000 mM.

Tensioactivos

Las moléculas de proteínas tienen una alta propensión a interaccionar con las superficies, lo que las hace susceptibles a adsorción y desnaturalización en las superficies de contacto aire-líquido, vial-líquido y líquido-líquido (aceite de silicona). Se ha observado que esta ruta de degradación es inversamente dependiente de la concentración de proteína y da lugar o bien a la formación de agregados de proteínas solubles e insolubles o bien a la pérdida de la proteína a partir de la disolución mediante la adsorción a las superficies. Además de la adsorción a la superficie del recipiente, la degradación inducida por la superficie se agrava con la agitación física, tal como la que se experimentaría durante el transporte y la manipulación del producto.

Los tensioactivos se usan habitualmente en las formulaciones de proteínas para evitar la degradación inducida por la superficie. Los tensioactivos son moléculas anfipáticas capaces de superar en la competencia a las proteínas por las posiciones interfaciales. Las porciones hidrófobas de las moléculas de tensioactivo ocupan posiciones interfaciales (por ejemplo, aire/líquido), mientras que las porciones hidrófilas de las moléculas permanecen orientadas hacia el disolvente a granel. A concentraciones suficientes (normalmente en torno a la concentración micelar crítica del detergente), una capa superficial de moléculas de tensioactivo sirve para impedir que las moléculas de proteínas se adsorban en la superficie de contacto. De este modo, se minimiza la degradación inducida por la superficie. Los tensioactivos más habitualmente usados son los ésteres de ácidos grasos de los polietoxilatos de sorbitano, es decir, el polisorbato 20 y el polisorbato 80. Ambos difieren únicamente en la longitud de la cadena alifática que confiere carácter hidrófobo a las moléculas, C-12 y C-18, respectivamente. Por consiguiente, el polisorbato 80 es más tensioactivo y tiene una concentración micelar crítica más baja que el polisorbato 20.

Los detergentes también pueden afectar a la estabilidad conformacional termodinámica de las proteínas. También en este caso, los efectos de un determinado excipiente detergente serán específicos para cada proteína. Por ejemplo, se ha demostrado que los polisorbatos reducen la estabilidad de algunas proteínas y aumentan la de otras. La desestabilización de las proteínas por parte de los detergentes puede racionalizarse en cuanto a las colas hidrófobas de las moléculas de detergente, que pueden participar en la unión específica con estados parcial o totalmente desplegados de la proteína. Este tipo de interacciones podría provocar un desplazamiento en el equilibrio conformacional hacia los estados más expandidos de la proteína (es decir, aumentar la exposición de las porciones hidrófobas de la molécula de proteína como complemento a la unión del polisorbato). Alternativamente, si el estado nativo de la proteína presenta algunas superficies hidrófobas, la unión del detergente al estado nativo puede estabilizar esa conformación.

Otro aspecto de los polisorbatos es que son inherentemente susceptibles a la degradación oxidativa. A menudo, como materias primas, contienen cantidades suficientes de peróxidos para provocar la oxidación de las cadenas laterales de los residuos de proteínas, especialmente la metionina. El potencial de daño oxidativo derivado de la adición del estabilizador enfatiza el punto de que deben usarse las concentraciones eficaces más bajas de excipientes en las formulaciones. En el caso de los tensioactivos, la concentración eficaz para una proteína determinada dependerá del mecanismo de estabilización. Se ha postulado que si el mecanismo de estabilización del tensioactivo está relacionado con la evitación de la desnaturalización en la superficie, la concentración eficaz estará en torno a la concentración micelar crítica del detergente. Por el contrario, si el mecanismo de estabilización está asociado a interacciones específicas entre proteína y detergente, la concentración eficaz de tensioactivo estará relacionada con la concentración de proteína y la estequiometría de la interacción (Randolph T.W., et al., Pharm Biotechnol., 13:159-75 (2002)).

También pueden añadirse tensioactivos en cantidades adecuadas para evitar el fenómeno de agregación relacionado con la superficie durante la congelación y el secado [Chang, B, J. Pharm. Sci. 85:1325, (1996)]. Los tensioactivos a modo de ejemplo incluyen tensioactivos aniónicos, catiónicos, no iónicos, zwitteriónicos y anfóteros, incluyendo tensioactivos derivados de aminoácidos que se producen de manera natural. Los tensioactivos aniónicos incluyen, pero no se limitan a, laurilsulfato de sodio, sulfosuccinato de dioctilo-sodio y sulfonato de dioctilo-sodio, ácido quenodesoxicólico, sal de sodio de N-lauroilsarcosina, dodecilsulfato de litio, sal de sodio del ácido 1-octanosulfónico, colato de sodio hidratado, desoxicolato de sodio y sal de sodio del ácido glicodesoxicólico. Los tensioactivos catiónicos incluyen, pero no se limitan a, cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio, cloruro de cetilpiridinio monohidratado y bromuro de hexadeciltrimetilamonio. Los tensioactivos zwitteriónicos incluyen, pero no se limitan a, CHAPS, CHAPSO, SB3-10 y SB3-12. Los tensioactivos no iónicos incluyen, pero no se limitan a, digitonina, Triton X-100, Triton X-114, TWEEN-20 y TWEEN-80. Los tensioactivos también incluyen, pero no se limitan a, lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, aceite de ricino hidrogenado 10, 40, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, lecitina de soja y otros fosfolípidos tales como dioleilfosfatidilcolina (DOPC), dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) y dioleilfosfatidilglicerol (DOPG); éster de ácidos grasos de sacarosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. Por tanto, se proporcionan composiciones que comprenden estos tensioactivos, o bien individualmente o bien como una mezcla en diferentes razones. En las presentes formulaciones, el tensioactivo se incorpora a una concentración de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5 g/l.

Otros componentes excipientes habituales

Aminoácidos

Los aminoácidos han encontrado un uso versátil en las formulaciones de proteínas como tampones, agentes de carga, estabilizadores y antioxidantes. La histidina y el ácido glutámico se emplean para tamponar las formulaciones de proteínas en el intervalo de pH de 5,5 a 6,5 y de 4,0 a 5,5, respectivamente. El grupo imidazol de la histidina tiene un pKa = 6,0 y el grupo carboxilo de la cadena lateral del ácido glutámico tiene un pKa de 4,3, lo que hace que estos aminoácidos sean adecuados para tamponar en sus intervalos de pH respectivos. El ácido glutámico es especialmente útil en estos casos (por ejemplo, Stemgen®). La histidina se encuentra habitualmente en las formulaciones de proteínas comercializadas (por ejemplo, Xolair®, Herceptin®, Recombinate®), y este aminoácido proporciona una alternativa al citrato, un tampón conocido por escocer tras su inyección. Curiosamente, también se ha informado de que la histidina tiene un efecto estabilizante, tal como se ha observado en formulaciones con ABX-IL8 (un anticuerpo IgG2), con respecto a la agregación cuando se usa a altas concentraciones tanto en presentaciones líquidas como liofilizadas (Chen B, et al., Pharm Res., 20(12): 1952-60 (2003)). También se observó que la histidina (hasta 60 mM) reducía la viscosidad de una formulación de alta concentración de este anticuerpo. Sin embargo, en el mismo estudio, los autores observaron un aumento de la agregación y decoloración en las formulaciones que contenían histidina durante los estudios de congelación-descongelación del anticuerpo en recipientes de acero inoxidable. Los autores atribuyeron esto a un efecto de los iones de hierro lixiviados por la corrosión de los recipientes de acero. Otra nota de precaución con la histidina es que experimenta fotooxidación en presencia de iones metálicos (Tomita M, et al., Biochemistry, 8(12): 5149-60 (1969)). El uso de la metionina como antioxidante en las formulaciones parece prometedor; se ha observado que es eficaz contra una serie de tensiones oxidativas (Lam XM, et al., J Pharm Sci., 86(11): 1250-5 (1997)).

Se ha demostrado que los aminoácidos glicina, prolina, serina y alanina estabilizan las proteínas mediante el mecanismo de exclusión preferente. La glicina es también un agente de carga habitualmente usado en formulaciones liofilizadas (por ejemplo, Neumega®, Genotropin®, Humatrope®). La arginina ha demostrado ser un agente eficaz para inhibir la agregación y se ha usado tanto en formulaciones líquidas como liofilizadas (por ejemplo, Activase®, Avonex®, Enbrel® líquido). Además, se ha atribuido la eficacia potenciada de replegamiento de determinadas proteínas en presencia de arginina a su supresión de la reacción de agregación competitiva durante el replegamiento.

Antioxidantes

La oxidación de los residuos de las proteínas procede de varias fuentes diferentes. Más allá de la adición de antioxidantes específicos, la prevención del daño oxidativo de las proteínas implica el control cuidadoso de una serie de factores a lo largo del procedimiento de fabricación y almacenamiento del producto, tales como el oxígeno atmosférico, la temperatura, la exposición a la luz y la contaminación química. Los antioxidantes farmacéuticos más habitualmente usados son agentes reductores, eliminadores de oxígeno/radicales libres o agentes quelantes. Los antioxidantes en las formulaciones de proteínas terapéuticas son solubles en agua y permanecen activos durante toda la vida útil del producto. Los agentes reductores y los eliminadores de oxígeno/radicales libres actúan eliminando las especies activas de oxígeno en disolución. Los agentes quelantes, tales como el EDTA, son eficaces al unir trazas de contaminantes metálicos que fomentan la formación de radicales libres. Por ejemplo, el EDTA se usó en la formulación líquida del factor de crecimiento de fibroblastos ácido para inhibir la oxidación catalizada por iones metálicos de los residuos de cisteína. El EDTA se ha usado en productos comercializados como Kineret® y Ontak®.

Además de la eficacia de diversos excipientes para evitar la oxidación de las proteínas, es preocupante la posibilidad de que los propios antioxidantes induzcan otros cambios covalentes o físicos en la proteína. Por ejemplo, los agentes reductores pueden provocar la interrupción de los enlaces disulfuro intramoleculares, lo que puede conducir a un desprendimiento de disulfuro. En presencia de iones de metales de transición, se ha demostrado que el ácido ascórbico y el EDTA fomentan la oxidación de la metionina en una serie de proteínas y péptidos (Akers MJ, y Defelippis MR. Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. En: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Sven Frokjaer, Lars Hovgaard, editores. Pharmaceutical Science. Taylor and Francis, RU (1999)); Fransson J.R., J. Pharm. Sci. 86(9): 4046-1050 (1997); Yin J, et al., Pharm Res., 21(12): 2377-83 (2004)). Se ha informado de que el tiosulfato de sodio reduce los niveles de oxidación de metionina inducida por la luz y la temperatura en rhuMab HER2; sin embargo, en este estudio también se informó de la formación de un aducto de tiosulfato-proteína (Lam XM, Yang JY, et al., J Pharm Sci. 86(11): 1250-5 (1997)). La selección de un antioxidante apropiado se realiza según las tensiones y sensibilidades específicas de la proteína.

Iones metálicos

En general, los iones de metales de transición no son deseados en las formulaciones de proteínas porque pueden catalizar reacciones de degradación física y química en las proteínas. Sin embargo, algunos iones metálicos específicos se incluyen en las formulaciones cuando son cofactores de las proteínas y en las formulaciones en suspensión de proteínas en las que forman complejos de coordinación (por ejemplo, suspensión de zinc de la insulina). Recientemente, se ha propuesto el uso de iones de magnesio (10-120 mM) para inhibir la isomerización del ácido aspártico para dar ácido isoaspártico (documento WO 2004039337).

Dos ejemplos en los que los iones metálicos confieren estabilidad o aumentan la actividad de las proteínas son la desoxirribonucleasa humana (ADNasarh, Pulmozyme®) y el factor VIII. En el caso de la ADNasarh, los iones Ca+2 (hasta 100 mM) aumentaron la estabilidad de la enzima a través de un sitio de unión específico (Chen B, et al., J Pharm Sci., 88(4): 477-82 (1999)). De hecho, la retirada de los iones de calcio a partir de la disolución con EGTA provocó un aumento de la desamidación y agregación. Sin embargo, este efecto sólo se observó con los iones Ca+2; se observó que otros cationes divalentes, Mg+2, Mn+2 y Zn+2, desestabilizaban la ADNasarh. Se observaron efectos similares en el factor VIII. Los iones Ca+2 y Sr+2 estabilizaron la proteína mientras que otros como Mg+2, Mn+2 y Zn+2, Cu+2 y Fe+2 desestabilizaron la enzima (Fatouros, A., et al., Int. J. Pharm., 155, 121-131 (1997). En otro estudio con el factor VIII, se observó un aumento significativo de la tasa de agregación en presencia de iones Al+3 (Derrick TS, et al., J. Pharm. Sci., 93(10): 2549-57 (2004)). Los autores señalan que otros excipientes, tales como las sales tampón, están a menudo contaminados con iones Al+3 e ilustran la necesidad de usar excipientes de calidad apropiada en los productos formulados.

Conservantes

Los conservantes son necesarios cuando se desarrollan formulaciones parenterales multiuso que implican más de una extracción a partir del mismo recipiente. Su función principal es inhibir el crecimiento microbiano y garantizar la esterilidad del producto durante toda la vida útil o el plazo de uso del medicamento. Los conservantes usados habitualmente incluyen alcohol bencílico, fenol y m-cresol. Aunque los conservantes tienen una larga historia de uso, el desarrollo de formulaciones de proteínas que incluyan conservantes puede ser un reto. Los conservantes casi siempre tienen un efecto desestabilizante (agregación) sobre las proteínas, y esto se ha convertido en un factor importante que limita su uso en las formulaciones de proteínas multidosis (Roy S, et al., J Pharm Sci., 94(2): 382-96 (2005)).

Hasta la fecha, la mayoría de los fármacos proteicos se han formulado para un único uso. Sin embargo, cuando las formulaciones multidosis son posibles, tienen la ventaja añadida de permitir la comodidad del paciente y una mayor comercialización. Un buen ejemplo es el de la hormona de crecimiento humana (hGH), donde el desarrollo de formulaciones conservadas ha conducido a la comercialización de presentaciones de pluma de inyección más convenientes y multiuso. En la actualidad existen en el mercado al menos cuatro dispositivos de pluma que contienen formulaciones conservadas de hGH. Norditropin® (líquido, Novo Nordisk), Nutropin AQ® (líquido, Genentech) y Genotropin (liofilizado - cartucho de doble cámara, Pharmacia & Upjohn) contienen fenol, mientras que Somatrope® (Eli Lilly) está formulado con m-cresol.

Hay que tener en cuenta varios aspectos durante el desarrollo de la formulación de las formas de dosificación conservadas. La concentración eficaz del conservante en el medicamento debe optimizarse. Esto requiere someter a prueba un conservante determinado en la forma de dosificación con intervalos de concentración que confieran eficacia antimicrobiana sin comprometer la estabilidad de la proteína. Por ejemplo, en el desarrollo de una formulación líquida para el receptor de interleucina 1 (tipo I), se examinaron con éxito tres conservantes usando calorimetría diferencial de barrido (DSC). Los conservantes se clasificaron basándose en su impacto en la estabilidad a las concentraciones usadas habitualmente en los productos comercializados (Remmele RL Jr., et al., Pharm Res., 15(2): 200-8 (1998)).

Algunos conservantes pueden provocar reacciones en el sitio de inyección, que es otro factor que debe tenerse en cuenta a la hora de elegir un conservante. En los ensayos clínicos que se centraron en la evaluación de conservantes y tampones en Norditropin, se observó que la percepción del dolor era menor en las formulaciones que contenían fenol y alcohol bencílico en comparación con una formulación que contenía m-cresol (Kappelgaard A.M., Horm Res. 62 Supl. 3:98-103 (2004)). Curiosamente, entre los conservantes usados habitualmente, el alcohol bencílico posee propiedades anestésicas (Minogue SC y Sun DA., Anesth Analg., 100(3): 683-6 (2005)).

Liofilización

También se contempla que las formulaciones que comprenden un polipéptido de VWF de la invención pueden liofilizarse antes de su administración. La liofilización se lleva a cabo mediante técnicas habituales en la técnica y debe optimizarse para la composición que esté desarrollándose [Tang et al., Pharm Res. 21:191-200, (2004) y Chang et al., Pharm Res. 13:243-9 (1996)].

Un ciclo de liofilización se compone, en un aspecto, de tres etapas: congelación, secado primario y secado secundario [A.P. Mackenzie, Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol 278:167 (1977)]. En la etapa de congelación, la disolución se enfría para iniciar la formación de hielo. Además, esta etapa induce la cristalización del agente de carga. El hielo se sublima en la etapa de secado primario, que se lleva a cabo reduciendo la presión de la cámara por debajo de la presión de vapor del hielo, usando un vacío e introduciendo calor para fomentar la sublimación. Por último, el agua adsorbida o ligada se retira en la etapa de secado secundario a una presión de cámara reducida y a una temperatura de estante elevada. El procedimiento produce un material conocido como torta liofilizada. Posteriormente, la torta puede reconstituirse o bien con agua estéril o bien con un diluyente adecuado para inyección.

El ciclo de liofilización no sólo determina el estado físico final de los excipientes, sino que también afecta a otros parámetros tales como el tiempo de reconstitución, el aspecto, la estabilidad y el contenido final de humedad. La estructura de la composición en el estado congelado pasa por varias transiciones (por ejemplo, transiciones vítreas, humectaciones y cristalizaciones) que se producen a temperaturas específicas y pueden usarse para comprender y optimizar el proceso de liofilización. La temperatura de transición vítrea (Tg y/o Tg') puede proporcionar información sobre el estado físico de un soluto y puede determinarse mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC). La Tg y la Tg' son un parámetro importante que debe tenerse en cuenta al diseñar el ciclo de liofilización. Por ejemplo, la Tg' es importante para el secado primario. Además, en el estado seco, la temperatura de transición vítrea proporciona información sobre la temperatura de almacenamiento del producto final.

Métodos de preparación

La presente invención contempla además métodos para la preparación de formulaciones farmacéuticas. Una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, agua estéril para inyección, agua con conservantes para uso multidosis o agua con cantidades apropiadas de tensioactivos (por ejemplo, polisorbato-20), solución salina al 0,4%, glicina al 0,3% o suspensiones acuosas, pueden contener el compuesto activo en mezcla conjunta con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. En diversos aspectos, tales excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma arábiga; los agentes dispersantes o humectantes pueden ser un fosfátido que se produce de manera natural, por ejemplo, lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo, estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo, heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol, tales como monooleato de polioxietilensorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de polietilensorbitano. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes, por ejemplo, p-hidroxibenzoato de etilo, o de n-propilo.

Administración

Para administrar las composiciones a humanos o animales de experimentación, en un aspecto, las composiciones comprenden uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Las expresiones “farmacéuticamente” o “farmacológicamente” aceptable se refieren a entidades moleculares y a composiciones que son estables, inhiben la degradación de las proteínas, tales como productos de agregación y escisión, y además no producen reacciones alérgicas u otras reacciones adversas cuando se administran usando vías bien conocidas en la técnica, tal como se describe a continuación. Los “portadores farmacéuticamente aceptables” incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares clínicamente útiles, incluyendo los agentes divulgados anteriormente.

Las formulaciones farmacéuticas pueden administrarse por vía oral, tópica, transdérmica, parenteral, por pulverización inhalatoria, vaginal, rectal o por inyección intracraneal. El término parenteral, tal como se usa en el presente documento, incluye inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares, inyecciones intracisternales o técnicas de infusión. También se contempla la administración por inyección intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar o la implantación quirúrgica en un lugar determinado. Por lo general, las composiciones están esencialmente libres de pirógenos, así como de otras impurezas que podrían ser perjudiciales para el receptor.

Pueden llevarse a cabo administraciones únicas o múltiples de las composiciones, siendo el médico responsable quien seleccione los niveles de dosis y la pauta. Para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, la dosificación adecuada dependerá del tipo de enfermedad que va a tratarse, tal y como se ha definido anteriormente, de la gravedad y el transcurso de la enfermedad, de si el fármaco se administra con fines preventivos o terapéuticos, de la terapia previa, de la anamnesis del paciente y de su respuesta al fármaco, así como del criterio del médico especialista.

Kits

Como aspecto adicional, la invención incluye kits que comprenden una o más formulaciones farmacéuticas envasadas de una manera que facilita su uso para la administración a los sujetos. En una realización, un kit de este tipo incluye la formulación farmacéutica descrita en el presente documento (por ejemplo, una composición que comprende una proteína o un péptido terapéutico), envasada en un recipiente tal como una botella o un frasco sellado, con una etiqueta fijada al recipiente o incluida en el envase que describe el uso del compuesto o la composición en la práctica del método. En una realización, la formulación farmacéutica se envasa en el recipiente de manera que la cantidad de espacio de cabeza en el recipiente (por ejemplo, la cantidad de aire entre la formulación líquida y la parte superior del recipiente) es muy pequeña. Preferiblemente, la cantidad de espacio de cabeza es insignificante (es decir, casi inexistente). En una realización, el kit contiene un primer recipiente con una composición de proteínas o péptidos terapéuticos y un segundo recipiente con una disolución de reconstitución fisiológicamente aceptable para la composición. En un aspecto, la formulación farmacéutica está envasada en una forma de dosificación unitaria. El kit puede incluir además un dispositivo adecuado para administrar la formulación farmacéutica según una vía de administración específica. Preferiblemente, el kit contiene una etiqueta que describe el uso de las formulaciones farmacéuticas.

Dosificaciones

La pauta posológica implicada en un método para tratar un estado descrito en el presente documento la determinará el médico especialista, teniendo en cuenta diversos factores que modifican la acción de los fármacos, por ejemplo, la edad, el estado, el peso corporal, el sexo y la dieta del paciente, la gravedad de cualquier infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos. A modo de ejemplo, una dosis típica de un VWF recombinante de la presente invención es de aproximadamente 50 U/kg, equivalente a 500 |ig/kg.

Las formulaciones de la invención pueden administrarse mediante un bolo inicial seguido de una infusión continua para mantener los niveles terapéuticos circulantes del medicamento. Como otro ejemplo, el compuesto de la invención puede administrarse como una dosis única. Los expertos habituales en la técnica optimizarán fácilmente las dosis eficaces y las pautas de administración según la buena práctica médica y el estado clínico de cada paciente. La frecuencia de la administración de dosis dependerá de los parámetros farmacocinéticos de los agentes y de la vía de administración. El experto en la técnica determinará la formulación farmacéutica óptima dependiendo de la vía de administración y de la dosificación deseada. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712. Tales formulaciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la tasa de liberación in vivo y la tasa de aclaramiento in vivo de los agentes administrados. Dependiendo de la vía de administración, puede calcularse una dosis adecuada en función del peso corporal, el área de superficie corporal o el tamaño de los órganos. Las dosis adecuadas pueden determinarse mediante el uso de ensayos establecidos para determinar las dosificaciones a nivel sanguíneo junto con los datos apropiados de respuesta a la dosis. La pauta posológica final la determinará el médico especialista, teniendo en cuenta diversos factores que modifican la acción de los fármacos, por ejemplo, la actividad específica del fármaco, la gravedad del daño y la capacidad de respuesta del paciente, la edad, el estado, el peso corporal, el sexo y la dieta del paciente, la gravedad de cualquier infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos. A medida que se lleven a cabo estudios, surgirá más información sobre los niveles de dosificación y la duración del tratamiento adecuados para las distintas enfermedades y estados.

Los siguientes ejemplos no pretenden ser limitativos, sino sólo a modo de ejemplo de realizaciones específicas de la invención.

Ejemplo 1

Experimentos de agitación

Con el fin de determinar la cantidad de precipitación de rVWF en diversas formulaciones, se sometió a prueba el porcentaje de recuperación de rVWF tras la agitación turbulenta en diversas condiciones.

Se sometió rVWF en tampón Advate (NaCl 90 mM, CaCh 1,68 mM, L-histidina 10 mM, Tris 10 mM, glutatión 0,26 mM, trehalosa 23,4 mM, manitol 175,7 mM y TWEEN-80 0,1 g/l, pH 7,0) o tampón Advate 1:3 (tampón Advate diluido 3 veces en agua) a agitación turbulenta en un agitador a temperatura ambiente (TA) durante 0 minutos, 1 minuto, 2,5 horas o 4 días, y se midió el porcentaje de recuperación de rVWF en relación con el material de partida antes de la agitación. Tal como se muestra en la tabla 1, se observaron pérdidas de aproximadamente el 40-80% en tampón Advate, mientras que se observaron pérdidas de aproximadamente el 20-30% en tampón Advate 1:3. El antígeno de VWF, VWF:Ag, corresponde a la cantidad de VWF que puede detectarse en un ELISA específico de VWF usando un anticuerpo policlonal anti-VWF, mientras que VWF:RCo corresponde a la cantidad de VWF que provoca la aglutinación de plaquetas estabilizadas en presencia de ristocetina. En ambos casos, como patrón se usó plasma humano de referencia calibrado frente al patrón real de la OMS (1 ml de plasma de referencia contiene habitualmente 1 U de VWF).

Tabla 1. Influencia del tiempo de agitación turbulenta en la recuperación de rVWF

También se sometió a prueba el efecto de la congelación/descongelación y la liofilización en los experimentos de agitación. La congelación se realizó a -20°C en una cámara frigorífica a -20°C o en hielo seco, la descongelación en ambos casos a TA y en ambos casos se partió de las formulaciones líquidas. En cuanto a la liofilización, las muestras de VWF formuladas descritas en el presente documento se congelaron dentro de un liofilizador a escala piloto a <=-40°C y se liofilizaron usando un programa de liofilización convencional. La agitación se realizó directamente con las formulaciones líquidas (2 ml en viales de 5 ml). Tal como se muestra en la tabla 2, el porcentaje de recuperación de rVWF fue mayor en tampón Advate 1:3 en comparación con tampón Advate.

Tabla 2.

También se midió el porcentaje de recuperación en los experimentos de agitación con el rVWF almacenado en jeringas con espacio de cabeza y sin espacio de cabeza. Curiosamente, cuando el rVWF se almacena en jeringas sin espacio de cabeza y se agita tal como se describió anteriormente, no se observó ninguna precipitación de rVWF. En cambio, cuando el rVWF se almacena en jeringas con espacio de cabeza, se observó algo de precipitación.

En resumen, la agitación turbulenta dio lugar a una pérdida de al menos el 30% de rVWF en tampón Advate o en tampón Advate 1:3, y el tampón Advate mostró una mayor pérdida de recuperación en comparación con el tampón Advate 1:3. Curiosamente, los mismos precipitados observados en los experimentos de agitación turbulenta no se observaron cuando el rVWF se almacenó y transportó -5000 km en un automóvil (que representa la agitación esperada durante el transporte). La precipitación de rVWF pudo eliminarse mediante el almacenamiento en jeringas sin espacio de cabeza.

Ejemplo 2

Estabilidad de VWF recombinante

Se sometió a prueba la estabilidad de rVWF evaluando el nivel de actividad de rVWF presente en diversas formulaciones.

Tal como se muestra en la figura 1, el rVWF no es estable en tampón Advate después de 26 semanas debido a la presencia de glutatión 0,3 mM. Sin embargo, tal como se muestra en la figura 2, el rVWF es más estable en tampón Advate 1:3 (por ejemplo, durante un máximo de 12 semanas a 4°C).

Tal como se muestra en la figura 3, la estabilidad de una formulación a base de citrato (citrato de sodio 15 mM, CaCh 10 mM, NaCl 100 mM, pH 7,0) es mejor que la formulación en tampón Advate 1:3 que contiene glutatión 0,1 M. Asimismo, se midió la concentración de rVWF a lo largo del tiempo en diversos tampones. Tal como se muestra en la figura 4, la figura 5 y la figura 6, la concentración de rVWF es estable a lo largo del tiempo en tampón Advate, tampón Advate 1:3 y tampón a base de citrato, respectivamente.

Ejemplo 4

Caracterización de las formulaciones líquidas

Se usó calorimetría diferencial de barrido (DSC) para evaluar el grado de desplegamiento de la proteína (rVWF) en diversos tampones. Tal como se muestra en la tabla 3, el tampón Advate, pH 7,0, es el óptimo para la estabilización.

La DSC es una técnica termoanalítica en la que se mide la diferencia en la cantidad de calor necesario para aumentar la temperatura de una muestra y las referencias en función de la temperatura. El resultado de un experimento de DSC es una curva de flujo de calor frente a la temperatura o frente al tiempo.

El calorímetro diferencial de barrido puede examinar a través de un intervalo de temperaturas mientras se calienta y se enfría y determina una transición de fase, es decir, la fusión, la cristalización o la transición vítrea, midiendo la cantidad de calor necesario para alcanzar una temperatura determinada. El calorímetro se calibró con un conjunto de metales puros (zinc, indio y estaño) que tienen una capacidad calorífica, Cp, y un punto de fusión, Tm, conocidos. El tampón de referencia respectivo se colocó en el capilar de referencia y la muestra de rVWF se colocó en el capilar de muestra del instrumento.

Tabla 3. Temperatura de desplegamiento en diversos tampones

Componentes y concentraciones del tampón:

A) Advate: NaCl 5,26 g/l

CaCl20,248 g/l

D-Manitol 32 g/l

Trehalosa 8 g/l

L-Histidina 1,56 g/l

Tris 1,2 g/l

Glutatión red. 0,08 g/l pH = 7,0

B) Immunate: Glicina 5,25 g/l

NaCl 2,2 g/l

NaCit3 5,25 g/l

Lisina-HCl 5,25 g/l

CaCl20,62 g/l pH = 6,8

C) Citrato: Glicina 3 g/l

NaCl 2,92 g/l

NaCit32,5 g/l

D-Manitol 30 g/l

Trehalosa 10 g/l pH = 6,8

D) NovoSeven: Glicina 0,75 g/l

NaCl 2,92 g/l

CaCl21,47 g/l

D-Manitol 30 g/l pH = 6,8

rVWF158: Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, sacarosa 5 g/l, pH 7,4

Además, tal como se muestra en la figura 7, la mayoría de los excipientes de la formulación aumentan la temperatura de desplegamiento en aproximadamente 1-2°C. La figura 8 muestra que CaCh 10 mM aumenta la temperatura de desplegamiento en de ~8°C hasta ~67°C, una temperatura de desplegamiento que también puede alcanzar el tampón Advate. Este efecto del CaCh es similar a pH 7,3 ya pH 6,5, tal como se muestra en la figura 9. Por último, se analizó el efecto de la trehalosa y la sacarosa sobre la temperatura de desplegamiento. En comparación con el citrato solo, ni la trehalosa ni la sacarosa aumentaron la temperatura de desplegamiento de rVWF. En la tabla 4 se expone un resumen de los datos de la temperatura de desplegamiento (Tmáx) de rVWF en presencia de diversos excipientes.

Tabla 4.

Además de los diversos tampones, se usó DSC para evaluar la temperatura de desplegamiento de rVWF a diversos valores de pH en tampón Advate. Los resultados se muestran en la tabla 5, a continuación. El tampón Advate, pH 7,0, es el óptimo para la estabilización (es decir, la temperatura de desplegamiento más alta; pico 1) de rVWF.

Tabla 5.

Claims

REIVINDICACIONES

i . Formulación farmacéutica líquida estable de un factor de von Willebrand recombinante (rVWF) que comprende: (a) un rVWF; (b) un agente de tamponamiento; (c) una o más sales; (d) un agente estabilizante; y (e) opcionalmente un tensioactivo;

en la que el rVWF es capaz de provocar la aglutinación de plaquetas estabilizadas en presencia de ristocetina; en la que dicho rVWF comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

a) la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3;

b) un análogo, fragmento o variante biológicamente activo de a);

c) un polipéptido codificado por el polinucleótido expuesto en SEQ ID NO: 1;

d) un análogo, fragmento o variante biológicamente activo de c); y

e) un polipéptido codificado por un polinucleótido que se hibrida con el polinucleótido expuesto en SEQ ID NO: 1 en condiciones de hibridación moderadamente estrictas;

en la que dicho tampón está compuesto por un agente de tamponamiento de pH en un intervalo de 0,1 mM a 500 mM y en la que el pH está en un intervalo de 2,0 a 12,0;

en la que dicha sal está a una concentración de 1 a 500 mM;

en la que dicho agente estabilizante está a una concentración de 0,1 a 1000 mM y se selecciona del grupo que consiste en manitol, lactosa, sorbitol, xilitol, sacarosa, trehalosa, manosa, maltosa, lactosa, glucosa, rafinosa, celobiosa, gentiobiosa, isomaltosa, arabinosa, glucosamina, fructosa y combinaciones de estos agentes estabilizantes; y

en la que dicho tensioactivo está a una concentración de 0,01 g/l a 0,5 g/l.
2. Formulación según la reivindicación 1, en la que el agente de tamponamiento se selecciona del grupo que consiste en citrato de sodio, glicina, histidina, Tris y combinaciones de estos agentes.
3. Formulación según la reivindicación 2, en la que el agente de tamponamiento es citrato de sodio a una concentración de 15 mM.
4. Formulación según la reivindicación 3, en la que el pH está en el intervalo de 6,0-8,0, y preferiblemente el pH está en el intervalo de 6,5-7,3.
5. Formulación según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en la que el pH es 7,0.
6. Formulación según la reivindicación 1, en la que el agente de tamponamiento es citrato y el pH es 7,0.
7. Formulación según la reivindicación 1, en la que la sal se selecciona del grupo que consiste en cloruro de calcio, cloruro de sodio y cloruro de magnesio.
8. Formulación según la reivindicación 1, en la que el rVWF comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3; en la que el agente de tamponamiento es citrato y el pH es 7,0; y en la que la sal es cloruro de calcio a una concentración de 10 mM.
9. Formulación según la reivindicación 1, en la que el rVWF comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3; en la que el agente de tamponamiento es citrato de sodio a una concentración de 15 mM y el pH es 7,0; y en la que la sal es cloruro de calcio a una concentración de 10 mM y cloruro de sodio de 100 mM.
10. Formulación según la reivindicación 2, en la que el uno o más agentes de tamponamiento son histidina y Tris a una concentración de 3,3 mM cada uno.
11. Formulación según la reivindicación 7, en la que la una o más sales son cloruro de sodio a una concentración de 30 mM y cloruro de calcio a una concentración de 0,56 mM.
12. Formulación según la reivindicación 1, en la que los agentes estabilizantes son trehalosa a una concentración de 7,8 mM y manitol a una concentración de 58,6 mM.
13. Formulación según la reivindicación 1, en la que el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en digitonina, Triton X-100 (octilfenil éter de polioxietileno), Triton X-114 (terc-octilfenil éter de polietilenglicol), TWEEN-20, TWEEN-80 (polisorbatos) y combinaciones de estos tensioactivos, y preferiblemente el tensioactivo es TWEEN-80 a 0,03 g/l.
14. Formulación según la reivindicación 1, en la que el rVWF comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3; en la que los agentes de tamponamiento son histidina a una concentración de 3,3 mM y Tris a una concentración de 3,3 mM a pH 7,0; en la que la sal es cloruro de sodio a una concentración de 30 mM y cloruro de calcio a una concentración de 0,56 mM; en la que los agentes estabilizantes son trehalosa a una concentración de 7,8 mM y manitol a una concentración de 58,6 mM; en la que el tensioactivo es TWEEN-80 a 0,03 g/l.
15. Formulación farmacéutica líquida estable de un factor de von Willebrand recombinante (rVWF) que comprende: (a) un rVWF; (b) un agente de tamponamiento; (c) una o más sales; (d) un agente estabilizante; y (e) opcionalmente un tensioactivo;

en la que el rVWF es capaz de provocar la aglutinación de plaquetas estabilizadas en presencia de ristocetina; en la que dicho rVWF comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

a) la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3;

b) un análogo, fragmento o variante biológicamente activo de a);

c) un polipéptido codificado por el polinucleótido expuesto en SEQ ID NO: 1;

d) un análogo, fragmento o variante biológicamente activo de c); y

e) un polipéptido codificado por un polinucleótido que se hibrida con el polinucleótido expuesto en SEQ ID NO: 1 en condiciones de hibridación moderadamente estrictas;

en la que dicho tampón está compuesto por un agente de tamponamiento de pH en un intervalo de 0,1 mM a 500 mM y en la que el pH está en un intervalo de 2,0 a 12,0;

en la que dicho tampón comprende citrato de sodio a una concentración de 15 mM;

en la que dicha sal es CaCh a una concentración de 10 mM;

en la que dicho agente estabilizante está a una concentración de 0,1 a 1000 mM; y

en la que dicho tensioactivo está a una concentración de 0,01 g/l a 0,5 g/l.
16. Formulación según la reivindicación 15, en la que dicho agente de tamponamiento comprende además glicina, histidina, Tris o combinaciones de estos agentes.
17. Formulación según la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en la que el pH está en el intervalo de 6,0-8,0, y preferiblemente el pH está en el intervalo de 6,5-7,3.
18. Formulación según la reivindicación 17, en la que el pH es 7,0.
19. Formulación según la reivindicación 15, en la que el agente estabilizante se selecciona del grupo que consiste en manitol, lactosa, sorbitol, xilitol, sacarosa, trehalosa, manosa, maltosa, lactosa, glucosa, rafinosa, celobiosa, gentiobiosa, isomaltosa, arabinosa, glucosamina, fructosa y combinaciones de estos agentes estabilizantes.
20. Formulación según la reivindicación 15, en la que el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en digitonina, Triton X-100 (octilfenil éter de polioxietileno), Triton X-114 (terc-octilfenil éter de polietilenglicol), TWEEN-20, TWEEN-80 (polisorbatos) y combinaciones de estos tensioactivos, y preferiblemente el tensioactivo es TWEEN-80 a 0,03 g/l.
21. Formulación según la reivindicación 19, en la que los agentes estabilizantes son trehalosa a una concentración de 7,8 mM y manitol a una concentración de 58,6 mM.