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ES2878008T3 - Inmunoconjugados de dominio variable dual y usos de los mismos - Google Patents

Inmunoconjugados de dominio variable dual y usos de los mismos Download PDF

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ES2878008T3
ES2878008T3 ES16847428T ES16847428T ES2878008T3 ES 2878008 T3 ES2878008 T3 ES 2878008T3 ES 16847428 T ES16847428 T ES 16847428T ES 16847428 T ES16847428 T ES 16847428T ES 2878008 T3 ES2878008 T3 ES 2878008T3
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immunoglobulin
amino acid
linker
seq
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ES16847428T
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English (en)
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Christoph Rader
Alex R Nanna
William R Roush
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Scripps Research Institute
Original Assignee
Scripps Research Institute
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Publication date
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Abstract

Un inmunoconjugado que tiene la fórmula Ig-(L-D)n, en el que: (a) Ig es una molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, en la que la molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual comprende: (i) un primer dominio variable que se une a una diana de unión; y (ii) un segundo dominio variable que comprende un residuo reactivo; (b) L es un conector que se conjuga covalentemente al residuo reactivo del segundo dominio variable de lg; (c) D es una fracción de fármaco; y (d) n se selecciona de un entero desde 1 hasta 12.

Description

DESCRIPCIÓN
Inmunoconjugados de dominio variable dual y usos de los mismos
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la fecha de presentación de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos No. de Serie 62/220,148, presentada el 17 de septiembre de 2015. Esta solicitud también reivindica el beneficio de prioridad de la fecha de presentación de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos No. de Serie 62/327,849, radicada el 26 de abril de 2016.
Derechos gubernamentales
Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno de los Estados Unidos bajo el Número de Concesión CA174844 otorgado por los NIH. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre la invención.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a inmunoconjugados de dominio variable dual, así como a métodos para preparar y utilizar los mismos en la prevención y tratamiento del cáncer y otras enfermedades.
Incorporación del listado de secuencias
Se presenta electrónicamente un listado de secuencias contenido en el archivo llamado “P34344WO00.txt” que tiene 85,476 bytes (medidos en MSWindows®) y creado el 16 de septiembre de 2016 que comprende 24 secuencias, se archiva
Antecedentes de la invención
Los tumores malignos (cánceres) son la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos, después de las enfermedades cardíacas (Boring et al., CA Cancel J. Clin. 43:7 (1993)). El cáncer se caracteriza por el aumento del número de células anormales o neoplásicas derivadas de un tejido normal que proliferan para formar una masa tumoral, la invasión de los tejidos adyacentes por estas células tumorales neoplásicas y la generación de células malignas que eventualmente se diseminan a través de la sangre o el sistema linfático a los ganglios linfáticos regionales y a sitios distantes a través de un proceso llamado metástasis. En un estado canceroso, una célula prolifera bajo condiciones en las que las células normales no crecerían. El cáncer se manifiesta en una amplia variedad de formas, caracterizadas por diferentes grados de invasividad y agresividad.
En un intento por descubrir dianas celulares efectivas para la terapia del cáncer, los investigadores han buscado identificar polipéptidos transmembrana o asociados a la membrana que se expresan específicamente sobre la superficie de uno o más tipos particulares de células cancerosas en comparación con una o más células no cancerosas normales. A menudo, dichos polipéptidos asociados a la membrana se expresan más abundantemente sobre la superficie de células cancerosas en comparación con la superficie de células no cancerosas. La identificación de dichos polipéptidos de antígenos de superficie celular asociados a tumor ha dado lugar a la capacidad de dirigirse específicamente a las células cancerosas para destrucción mediante terapias basadas en anticuerpos.
El uso de conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC), es decir, inmunoconjugados, para el suministro local de agentes citotóxicos o citostáticos, es decir, fármacos para matar o inhibir células tumorales en el tratamiento del cáncer permite el suministro dirigido de una fracción de fármaco para células tumorales y acumulación intracelular en las mismas, donde la administración sistémica de estos agentes farmacológicos no conjugados puede dar como resultado niveles inaceptables de toxicidad para las células normales así como para las células tumorales que se buscan eliminar. Los esfuerzos para mejorar el índice terapéutico, es decir, la eficacia máxima y la toxicidad mínima de los ADC se han centrado en la selectividad de los anticuerpos policlonales y monoclonales (mAb), así como en las propiedades de conexión de fármacos y liberación de fármacos (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5: 543-549). Las fracciones de fármaco utilizadas en conjugados de fármaco de anticuerpo incluyen toxinas de proteínas bacterianas tales como toxina diftérica, toxinas de proteínas vegetales tales como ricina, las moléculas pequeñas tales como auristatinas, geldanamicina (Mandler et al (2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623), caliqueamicina (Lode et al (1998) Cancer Res. 58: 2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342), daunomicina, doxorrubicina, metotrexato y vindesina (Rowland et al (1986) supra). Las fracciones de fármaco pueden afectar los mecanismos citotóxicos y citostáticos, que incluyen la unión a tubulina, la unión al ADN o la inhibición de la topoisomerasa. Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con anticuerpos grandes o ligandos de receptores de proteínas. El documento WO2011/050262 divulga anticuerpos con un dominio variable dual (reivindicación 1). Los conjugados de los mismos se describen en la reivindicación 29, 30, 31. El DVD dirigido a HER2 se divulga en la tabla 11. No se menciona cómo y dónde se adhiere el fármaco al dominio variable dual de la molécula de inmunoglobulina.
Los medios convencionales para adherir, es decir, conectar mediante enlaces covalentes, una fracción (por ejemplo, una fracción de fármaco) a un anticuerpo generalmente conducen a una mezcla heterogénea de moléculas donde las fracciones se adhieren en varios sitios del anticuerpo. Por ejemplo, los fármacos citotóxicos se han conjugado normalmente con anticuerpos a través de los numerosos residuos de lisina de un anticuerpo, generando una mezcla heterogénea de conjugado anticuerpo-fármaco. Dependiendo de las condiciones de reacción, la mezcla heterogénea contiene normalmente una distribución de anticuerpos con de 0 a aproximadamente 8, o más, fracciones de fármaco adheridas. Además, dentro de cada subgrupo de conjugados con una relación entera particular de fracciones de fármaco a anticuerpo, hay una mezcla potencialmente heterogénea en la que la fracción de fármaco se adhiere en varios sitios del anticuerpo. Los métodos analíticos y preparativos pueden ser inadecuados para separar y caracterizar las moléculas de especies conjugadas de anticuerpo-fármaco dentro de la mezcla heterogénea resultante de una reacción de conjugación. Los anticuerpos son biomoléculas grandes, complejas y estructuralmente diversas, a menudo con muchos grupos funcionales reactivos. Sus reactividades con reactivos conectores e intermedios conectores de fármacos dependen de factores tales como el pH, concentración, concentración de sal y cosolventes. Adicionalmente, el proceso de conjugación de múltiples etapas puede no ser reproducible debido a las dificultades para controlar las condiciones de reacción y caracterizar los reactivos e intermedios.
Resumen
La invención se define por las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo con fines informativos. Se proporcionan inmunoconjugados de dominio variable dual (DVD) y usos de los mismos. Los aspectos de los inmunoconjugados en cuestión incluyen una molécula de inmunoglobulina DVD que tiene un primer y un segundo dominio variable, y una fracción de carga (por ejemplo, una fracción de fármaco) que se conjuga covalentemente al segundo dominio variable mediante un conector. También se proporcionan métodos para preparar y utilizar los inmunoconjugados en cuestión en la prevención y/o el tratamiento del cáncer y otras enfermedades.
Aspectos de la invención incluyen un inmunoconjugado que tiene la fórmula Ig-(L-D)n, en la que: Ig es una molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual, o un fragmento de inmunoglobulina (fragmento de unión a antígeno) de la misma, en la que la molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual comprende un primer dominio variable que se une a una diana de unión, y un segundo dominio variable que comprende un residuo reactivo; L es un conector que se conjuga covalentemente al residuo reactivo del segundo dominio variable de Ig; D es una fracción de fármaco; y n se selecciona de un entero desde 1 hasta 12, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12. En un aspecto, un residuo reactivo permite la adhesión estequiométrica de L, y abarca, pero no se limita a, aminoácidos naturales y no naturales que contienen SH, NH2, OH, SeH, N3, alquino, alqueno, alquinos deformados, alquenos deformados, C=O y C-H activado como grupos funcionales reactivos.
Aspectos adicionales de la invención incluyen un inmunoconjugado que tiene la fórmula Ig-(L-D)n, en la que: Ig es una molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, en la que la molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual comprende un primer dominio variable que se une a una diana de unión, y un segundo dominio variable que comprende un residuo de lisina reactivo; L es un conector que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo del segundo dominio variable de Ig; D es una fracción de fármaco; y n es 1 o 2.
Breve descripción de las secuencias
Las SEQ ID NOs: 1 y 2 son secuencias de aminoácidos de conectores de péptido.
La SEQ ID NO: 3 es una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera de un anticuerpo 38C2 humanizado (h38C2).
La SEQ ID NO: 4 es una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada de un anticuerpo 38C2 humanizado (h38C2).
La SEQ ID NO: 5 es una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera de una inmunoglobulina HER2-h38C2-DVD1.
La SEQ ID NO: 6 es una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada de una inmunoglobulina HER2-h38C2-DVD1.
La SEQ ID NO: 7 es una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera de una inmunoglobulina HER2-h38C2-DVD2.
La SEQ ID NO: 8 es una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada de una inmunoglobulina HER2-h38C2-DVD2.
La SEQ ID NO: 9 es una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera de una inmunoglobulina IMGN-853 FOLR1-h38C2-DVD1.
La SEQ ID NO: 10 es una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada de una inmunoglobulina IMGN-853 FOLR1-h38C2-DVD1.
La SEQ ID NO: 11 es una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera de una inmunoglobulina IMGN-853 FOLR1-h38C2-DVD2.
La SEQ ID NO: 12 es una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada de una inmunoglobulina IMGN-853 FOLR1-h38C2-DVD2.
La SEQ ID NO: 13 es una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera de una inmunoglobulina farletuzumab FOLR1-h38C2-DVD1.
La SEQ ID NO: 14 es una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada de una inmunoglobulina farletuzumab FOLR1-h38C2-DVD1.
La SEQ ID NO: 15 es una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera de una inmunoglobulina farletuzumab FOLR1-h38C2-DVD2.
La SEQ ID NO: 16 es una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada de una inmunoglobulina farletuzumab FOLR1-h38C2-DVD2.
La SEQ ID NO: 17 es una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera de una inmunoglobulina CD138-h38C2-DVD1.
La SEQ ID NO: 18 es una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada de una inmunoglobulina CD138-h38C2-DVD1.
La SEQ ID NO: 19 es una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera de una inmunoglobulina CD138-h38C2-DVD2.
La SEQ ID NO: 20 es una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada de una inmunoglobulina CD138-h38C2-DVD2.
La SEQ ID NO: 21 es una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera de una inmunoglobulina CD79b-h38C2-DVD1.
La SEQ ID NO: 22 es una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada de una inmunoglobulina CD79b-h38C2-DVD1.
La SEQ ID NO: 23 es una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera de una inmunoglobulina CD79b-h38C2-DVD2.
La SEQ ID NO: 24 es una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada de una inmunoglobulina CD79b-h38C2-DVD2.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es una ilustración esquemática de una molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual que incluye dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas.
La FIG. 2 es una ilustración esquemática de un inmunoconjugado variable de dominio dual que tiene una fracción de fármaco adherida a un residuo de lisina reactivo sobre cada cadena pesada.
La FIG. 3 es una ilustración esquemática de un inmunoconjugado HER2-h38C2-DVD1 y HER2-h38C2-DVD2.
La FIG. 4 es una ilustración esquemática de un inmunoconjugado FOLR1-h38C2-DVD1 y FOLR1-h38C2-DVD2. La FIG. 5 es una ilustración esquemática de un inmunoconjugado CD138-h38C2-DVD1 y CD138-h38C2-DVD2. La FIG. 6 es una ilustración esquemática de un inmunoconjugado variable de dominio dual, varios fragmentos de unión del mismo, y un inmunoconjugado variable de dominio dual biespecífico.
La FIG. 7 representa varios ejemplos no limitantes de conectores escindibles.
La FIG. 8 representa varios ejemplos no limitantes de conectores no escindibles.
La FIG. 9 representa varios ejemplos no limitantes de conector reversibles.
La FIG. 10 representa varios ejemplos no limitantes de conector irreversibles.
La FIG. 11 representa un proceso de reacción para síntesis química de una p-Lactama-Cit-Val-MMAF.
La FIG. 12 representa un proceso de reacción para síntesis química de una p-Lactama-conector PEG-MMAF.
La FIG. 13 representa varios ejemplos no limitantes de reacciones de conector con una inmunoglobulina utilizando conectores reversibles y irreversibles.
La FIG. 14 representa varios ejemplos no limitantes de fracciones de fármaco.
La FIG. 15 es una ilustración esquemática de una reacción de conjugación de inmunoglobulina, en la que la conjugación tiene lugar en los residuos de lisina reactivos en el segundo dominio variable (dominio variable h38C2). La FIG. 16 representa un ejemplo no limitante de una reacción de síntesis en fase sólida que se puede utilizar para producir una composición de conector de hidrocarburos de p-lactama-MMAF para uso en conjugación a una molécula de inmunoglobulina.
La FIG. 17 proporciona datos de unión que demuestran la unión específica de un inmunoconjugado variable de dominio dual anti-HER2 a células HER2+.
La FIG. 18 representa dos gráficos que proporcionan datos a partir de un primer ensayo de citotoxicidad que demuestra la muerte celular por un inmunoconjugado variable de dominio dual anti-HER2.
La FIG. 19 representa dos gráficos que proporcionan datos a partir de un segundo ensayo de citotoxicidad que demuestra la muerte celular por un inmunoconjugado variable de dominio dual anti-HER2.
La FIG. 20 representa dos gráficos que proporcionan datos a partir de un tercer ensayo de citotoxicidad que demuestra la muerte celular por un inmunoconjugado variable de dominio dual anti-HER2.
La FIG. 21 muestra estructuras de ejemplos no limitantes de DVD1 y DVD2, así como tinción de Coomassie para confirmar el tamaño y pureza esperados.
La FIG. 22 proporciona una ilustración esquemática así como datos de citometría de flujo que demuestran la unión selectiva a células SKBR3 que expresan HER2 y no unión a células MDA-MB-468 negativas a HER2.
La FIG. 23 proporciona una ilustración esquemática así como datos de citometría de flujo que demuestran el marcado de p-lactama biotina de DVD1 y DVD2 y la unión a células SKBR3 (HER2+) utilizando estreptavidina PE para detección. No se observó detección con células MDA-MB-468 (HER2-).
La FIG. 24 proporciona datos gráficos que demuestran la citotoxicidad de ADC anti-HER2 DVD1 contra SKBR3 (HER2+) y no citotoxicidad contra células MDA-MB-468 (HER2-).
La FIG. 25 proporciona ilustraciones esquemáticas de la estructura de los ADC IMGN anti-FOLRI, FAR anti-FOLRl, y anti-CD138 d Vd , así como datos de Coomassie Gel de DVD no conjugados.
La FIG. 26 proporciona datos gráficos que demuestran la citotoxicidad de ADCs anti-FOLRl contra células IGROV1 (FOLR1+).
La FIG. 27 proporciona datos gráficos que demuestran la citotoxicidad de ADC anti-CD 13 8 contra células H929 (CD138+).
La FIG. 28 proporciona datos gráficos que demuestran la actividad catalítica de diversas composiciones, que incluyen DVD1, h38C2, trastuzumab y DVD1-ADC.
La FIG. 29 proporciona datos gráficos que demuestran la citotoxicidad de DVD1-ADC contra células SKBR3, BT474, KPL4, DYT2, y MDA-MB-468.
La FIG. 30 proporciona datos gráficos que representan el volumen del tumor en función de la dosis en un modelo de xenoinjerto in vivo de ratones NSG implantados con KPL4 (n = 2 por grupo) y respuesta a la dosis con DVD 1-ADC. La FIG. 31 proporciona datos gráficos que representan el volumen del tumor en función de la dosis en un xenoinjerto in vivo de ratones NSG implantados con KPL4 (n = 7 o 8 por grupo).
La FIG. 32 proporciona una ilustración esquemática de un ejemplo no limitante de una composición DVD1-Fab, así como datos de Coomassie Gel, datos de actividad catalítica, y datos de citotoxicidad contra células KPL4 (HER2+). La FIG. 33 proporciona datos de espectroscopía de masas MALDI-TOF de cadenas pesadas de DVD1 y DVD1-ADC. La FIG. 34 proporciona ilustraciones esquemáticas de varios ejemplos no limitantes de composiciones de DVD. La FIG. 35 proporciona datos gráficos que representan la actividad catalítica de composiciones biespecíficas basadas en h38C2 adicionales.
La FIG. 36 proporciona datos gráficos que demuestran la actividad catalítica de varias composiciones que incluyen h38C2, DVD1, DVD2, y trastuzumab.
La FIG. 37A proporciona una ilustración esquemática de una estructura de p-lactama MMAF para preparación de ADC. La FIG. 37B proporciona una ilustración esquemática de un sitio de adhesión a fármaco (estrella) en la lisina de h38C2 (círculo).
La FIG. 37C proporciona datos gráficos que demuestran una pérdida completa de la actividad catalítica de anti-HER2 DVD1/MMAF, lo que confirma conjugación completa; el anti-HER2 DVD1 no conjugado sirve como control positivo; la alanina mutada anti-HER2 DVD1 (naranja) y trastuzumab IgG1 (violeta) sirven como controles negativos.
La FIG. 38 proporciona datos gráficos que representan la actividad in vitro de anti-HER2 DVD1/MMAF contra células HER2+.
La FIG. 39 proporciona datos gráficos que representan actividad in vitro de anti-CD138 DVD1/MMAF y anti-CD79b DVD1/MMAF.
La FIG. 40A proporciona datos gráficos que representan el tiempo de vuelo de ionización por electropulverización (ESI-TOF) de anti-HER2 DVD1 reducido no conjugado.
La FIG. 40B proporciona datos gráficos que representan el tiempo de vuelo de ionización por electropulverización (ESI-TOF) de anti-HER2 DVD1/MMAF reducido conjugado.
La FIG. 41A proporciona datos gráficos que representan el tiempo de vuelo de ionización por electropulverización (ESI-TOF) de mutante de Alanina de mutante Ala anti-HER2 DVD1 Ala reducido.
La FIG. 41B proporciona datos gráficos que representan el tiempo de vuelo de ionización por electropulverización (ESI-TOF) de mutante de Alanina de mutante Ala anti-HER2 DVD1/MMAF Ala reducido.
La FIG. 42A proporciona datos gráficos que representan la actividad in vivo del conjugado anti-HER2 DVD1/MMAF en función del volumen tumoral.
La FIG. 42B proporciona una curca de supervivencia Kaplan-Meier que representa la actividad in vivo del conjugado anti-HER2 DVD1/MMAF.
La FIG. 43A proporciona un SDS-PAGE teñido con Coomassie de ambos anti-CD138 DVD1 y anti-CD79b DVD1. La FIG. 43B proporciona datos gráficos que representan la actividad catalítica de anti-CD138 DVD1/MMAF y anti-CD79b DVD1/MMAF.
La FIG. 44 proporciona un esquema de síntesis en fase sólida de p-lactama MMAF.
La FIG. 45 proporciona datos gráficos que representan que todos los DVD tienen actividad catalítica esencialmente idéntica a la h38C2 IgG1 original.
La FIG. 46 proporciona datos de citometría de flujo que indican la unión de todos los DVD contra las células que expresan la diana.
Descripción detallada
La invención se define por las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo con fines informativos. Se proporcionan inmunoconjugados de dominio variable dual (DVD) y usos de los mismos. Los aspectos de los inmunoconjugados en cuestión incluyen una molécula de inmunoglobulina DVD que tiene un primer y un segundo dominio variable, y una fracción de fármaco que se conjuga covalentemente al segundo dominio variable mediante un conector. También se proporcionan métodos para preparar y utilizar los inmunoconjugados en cuestión en la prevención y/o el tratamiento del cáncer y otras enfermedades.
Cuando se proporciona un rango de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese rango y cualquier otro intermedio o establecido en ese rango indicado, está abarcado dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos rangos más pequeños se pueden incluir independientemente en los rangos más pequeños y también están abarcados dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el rango indicado. Cuando el rango indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen uno o ambos de los límites incluidos también se incluyen en la invención.
En el presente documento se presentan determinados rangos con valores numéricos precedidos por el término “aproximadamente”. El término “aproximadamente” se utiliza en el presente documento para proporcionar soporte literal para el número exacto que precede, así como un número que está cerca o aproximadamente al número que precede el término. Para determinar si un número está cerca o aproximadamente a un número mencionado específicamente, el número cercano o aproximado no mencionado puede ser un número que, en el contexto en el que se presenta, proporciona el equivalente sustancial del número mencionado específicamente.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a aquellos descritos en el presente documento también se puede utilizar en la práctica o prueba de la presente invención, ahora se describen métodos y materiales ilustrativos representativos.
Se observa que, como se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el” incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Cabe señalar además que las reivindicaciones se pueden redactar para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración está destinada a servir como base antecedente para el uso de dicha terminología exclusiva como “únicamente”, “solo” y similares en relación con la mención de elementos de reivindicación o el uso de una limitación “negativa”.
Cualquier método mencionado se puede llevar a cabo en el orden de los eventos mencionados o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.
La práctica de la presente invención puede emplear, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (que incluyen técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que se encuentran dentro de los conocimientos de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía, tales como, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition (Sambrook et al., 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait, ed., 1984); “Animal Cell Culture” (R. I. Freshney, ed., 1987); “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.); “Current Protocols in Molecular Biology” (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis et al., ed., 1994); “A Practical Guide to Molecular Cloning” (Perbal Bernard V., 1988); “Phage Display: A Laboratory Manual” (Barbas et al., 2001).
Definiciones
El término “inmunoglobulina” o “anticuerpo”, como se utiliza indistintamente en el presente documento, se refiere a una glicoproteína heterotetramérica de 4 cadenas básica compuesta por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena L se conecta a una cadena H por un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H se conectan entre sí por uno o más enlaces disulfuro dependiendo del isotipo de la cadena H. Cada cadena H y L tiene un terminal N y un terminal C, y también tiene puentes disulfuro intracadena regularmente espaciados. Cada cadena H tiene en el terminal N un dominio variable (Vh) seguido de tres dominios constantes (Ch1, Ch2 y Ch3). Cada cadena L tiene en el terminal N un dominio variable (Vl) seguido de un dominio constante (Cl). El Vl está alineado con el Vh y el Cl está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada (Ch1). Se considera que determinados residuos de aminoácidos forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena L y la cadena H. El emparejamiento de un Vh y Vl juntos forma un único sitio de unión a antígeno.
La cadena L de cualquier especie de vertebrado se puede asignar a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda, en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (Ch), las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases o isotipos. Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que tienen cadenas pesadas designadas a, 8, £, y y M, respectivamente. Las clases y y a se dividen adicionalmente en subclases sobre la base de diferencias relativamente menores en la secuencia y función de Ch, por ejemplo, los seres humanos expresan las siguientes subclases: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2.
La “región variable” o “dominio variable” de una inmunoglobulina se refiere a los dominios de terminal N de la cadena H o L de la inmunoglobulina. El dominio variable de la cadena H se puede denominar “Vh”. El dominio variable de la cadena ligera se puede denominar “Vl”. Estos dominios son generalmente las partes más variables de una inmunoglobulina y contienen los sitios de unión al antígeno.
El término “variable” se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre las inmunoglobulinas. El dominio V media la unión del antígeno y define la especificidad de una inmunoglobulina particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de la extensión de 110 aminoácidos de la mayoría de los dominios variables. En cambio, las regiones V consisten en tramos relativamente invariantes llamados regiones marco (FR) de 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas de extrema variabilidad llamadas “regiones hipervariables” que tienen cada una de 9-12 aminoácidos de longitud. Los dominios variables de las cadenas H y L nativas comprenden cada uno cuatro FR, que adoptan en gran medida una configuración de hoja p, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que se conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de hoja p. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por los FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de las inmunoglobulinas (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no participan directamente en la unión de una inmunoglobulina a un antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras, como la participación de la inmunoglobulina en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
Una inmunoglobulina “intacta” es una que comprende un sitio de unión a antígeno así como una Cl y al menos dominios constantes de la cadena H, Ch1, Ch2 y Ch3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o variantes de secuencia de aminoácidos de los mismos. Una inmunoglobulina intacta puede tener una o más funciones efectoras.
Una “inmunoglobulina desnuda” para los propósitos de la presente es una inmunoglobulina que no está conjugada con una fracción de fármaco.
Los “fragmentos de inmunoglobulina” comprenden una porción de una inmunoglobulina intacta, preferiblemente la unión a antígeno o la región variable de la inmunoglobulina intacta. Ejemplos de fragmentos de inmunoglobulina incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; diacuerpos; inmunoglobulinas lineales (véase Patente de Estados Unidos No. 5,641,870, Ejemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062); moléculas de inmunoglobulina de cadena sencilla; e inmunoglobulinas multiespecíficas formadas a partir de fragmentos de inmunoglobulina. En algunos aspectos, los fragmentos de inmunoglobulina incluyen todos los posibles formatos de fragmentos alternativos. En algunos aspectos, los fragmentos de inmunoglobulina pueden ser biespecíficos. En algunos aspectos, los fragmentos de inmunoglobulina pueden ser bi-paratópicos. En algunos aspectos, los fragmentos de inmunoglobulina pueden ser triespecíficos. En algunos aspectos, los fragmentos de inmunoglobulina pueden ser multiméricos. En algunos aspectos, u fragmento de inmunoglobulina comprende un sitio de unión a antígeno de la inmunoglobulina intacta y se esta manera retiene la capacidad para unirse al antígeno. En algunos aspectos, el fragmento de inmunoglobulina contiene dominios variables únicos que tienen la capacidad de unirse al antígeno. En algunos aspectos, los fragmentos de inmunoglobulina se modifican adicionalmente (sin limitarse a la adición de péptidos, pegilación, hesilación, glicosilación) para modular la actividad, propiedades, comportamiento farmacocinético y eficacia in vivo.
La digestión con papaína de inmunoglobulinas produce dos fragmentos idénticos de unión a antígeno, denominados fragmentos “Fab”, y un fragmento “Fc” residual, una designación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El fragmento Fab consta de una cadena L completa junto con el dominio de región variable de la cadena H (Vh) y el primer dominio constante de una cadena pesada (Ch1). Cada fragmento Fab es monovalente con respecto a la unión al antígeno, es decir, tiene un único sitio de unión al antígeno. El tratamiento con pepsina de una inmunoglobulina produce un único fragmento grande F(ab')2 que corresponde aproximadamente a dos fragmentos Fab conectados por disulfuro que tienen actividad de unión al antígeno divalente y todavía es capaz de entrecruzar el antígeno. Los fragmentos Fab' se diferencian de los fragmentos Fab por tener pocos residuos adicionales en el terminal carboxi del dominio Ch1 que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra de inmunoglobulina. Fab'-SH es la designación en el presente documento para Fab' en la que el residuo o residuos de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de inmunoglobulina F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de inmunoglobulina.
El fragmento Fc comprende las porciones de terminal carboxi de ambas cadenas H mantenidas juntas por disulfuros. Las funciones efectoras de las inmunoglobulinas están determinadas por secuencias en la región Fc, región que también es la parte reconocida por los receptores Fc (FcR) que se encuentran en ciertos tipos de células.
“Fv” es el fragmento de inmunoglobulina mínimo que contiene un sitio de unión y reconocimiento de antígeno completo. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio de región variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación estrecha no covalente. En una especie de Fv de cadena sencilla (scFv), un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera se pueden conectar covalentemente mediante un conector de péptido flexible de modo que las cadenas ligeras y pesadas se pueden asociar en una estructura “dimérica” análoga a aquella en una especie Fv de dos cadenas. A partir del plegamiento de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada uno de la cadena H y L) que contribuyen con los residuos de aminoácidos para la unión del antígeno y confieren especificidad de unión al antígeno a la inmunoglobulina. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque normalmente con una afinidad menor que el sitio de unión completo. Cuando se utiliza en el presente documento con referencia a una molécula de inmunoglobulina DVD, el término “Fv” se refiere a un fragmento de unión que incluye tanto el primer como el segundo dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera.
“Fv de cadena sencilla” también abreviado como “sFv” o “scFv” son fragmentos de inmunoglobulina que comprenden los dominios de inmunoglobulina VHy Vl conectados en una única cadena polipeptídica. Preferiblemente, el polipéptido sFv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios Vh y Vl que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de sFv, véase Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra. Cuando se utiliza en el presente documento con referencia a una molécula de inmunoglobulina DVD, el término “scFv” se refiere a un fragmento de unión que incluye tanto el primer como el segundo dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera.
El término “inmunoglobulina de dominio variable dual” o “DVD-Ig” como se utiliza en el presente documento se refiere a una molécula de inmunoglobulina como se describió anteriormente, en la que las cadenas H y L incluyen un segundo dominio variable ubicado adyacente al primer dominio variable. Por tanto, la cadena L de un DVD-Ig incluye, desde el terminal N hasta el terminal C, los siguientes dominios: Vl1-Vl2-Cl. Por tanto, la cadena H de un DVD-Ig incluye, desde el terminal N hasta el terminal C, los siguientes dominios: Vh1-Vh2-Ch1-Ch2-Ch3. El emparejamiento de Vl1 y Vh1 juntos forma un primer sitio de unión al antígeno. El emparejamiento de Vl2 y Vh2 juntos forma un segundo sitio de unión al antígeno.
A menos que se indique lo contrario, el término “ inmunoglobulina” o “anticuerpo” incluye específicamente anticuerpos IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgAl, IgA2, IgD e IgM humanos y no humanos nativos, que incluyen variantes de origen natural.
El término “nativo” con referencia a un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo o inmunoglobulina) se utiliza en el presente documento para referirse a un polipéptido que tiene una secuencia que se produce en la naturaleza, independientemente de su modo de preparación. El término “no nativo” con referencia a un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo o inmunoglobulina) se utiliza en el presente documento para referirse a un polipéptido que tiene una secuencia que no se encuentra en la naturaleza.
El término “polipéptido” se utiliza en el presente documento en el sentido más amplio e incluye secuencias de péptidos. El término “péptido” generalmente describe cadenas moleculares lineales de aminoácidos que contienen hasta aproximadamente 30, preferiblemente hasta aproximadamente 60 aminoácidos conectados covalentemente por enlaces peptídicos.
El término “monoclonal”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo o molécula de inmunoglobulina (por ejemplo, una molécula de DVD Ig) obtenida de una población de inmunoglobulinas sustancialmente homogéneas, es decir, las inmunoglobulinas individuales que comprenden la población son idénticas excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Las inmunoglobulinas monoclonales son muy específicas y se dirigen contra un sitio de antígeno único. Adicionalmente, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada inmunoglobulina monoclonal está dirigida contra un único determinante del antígeno. El modificador “monoclonal” indica el carácter de la inmunoglobulina que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de inmunoglobulinas, y no se debe interpretar que requiera la producción del anticuerpo mediante cualquier método particular. Por ejemplo, las inmunoglobulinas monoclonales de acuerdo con la presente invención se pueden preparar mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495, o se pueden preparar mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos No. 4,816,567).
Las inmunoglobulinas monoclonales del presente documento incluyen específicamente inmunoglobulinas “quiméricas” en las que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (Patente de Estados Unidos No. 4,816,567; y Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855).
Las formas “humanizadas” de inmunoglobulinas no humanas (por ejemplo, de roedores, por ejemplo, de murino o de conejo) son inmunoglobulinas que contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulinas no humanas. En su mayor parte, las inmunoglobulinas humanizadas son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable del receptor son reemplazados por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, hámster, conejo, pollo, bovino o primate no humano que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) Fv de la inmunoglobulina humana también se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Adicionalmente, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, la inmunoglobulina humanizada comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR. son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. La inmunoglobulina humanizada también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para obtener detalles adicionales, véase Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; y Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596.
El término “inmunoglobulina humana”, como se utiliza en el presente documento, pretende incluir inmunoglobulinas que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Las inmunoglobulinas humanas de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulinas de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, el término “inmunoglobulina humana”, como se utiliza en el presente documento, no pretende incluir inmunoglobulinas en las que las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.
Una inmunoglobulina “aislada” en el presente documento es una que ha sido identificada y separada y/o recuperada de un componente de su entorno natural en una célula anfitriona recombinante. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos de la inmunoglobulina y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos, así como subproductos no deseados de la producción. En algunos aspectos, una inmunoglobulina aislada en el presente documento se purificará (1) a más del 95 % en peso, o más del 98 % en peso, o más del 99 % en peso, según se determina mediante los métodos SDS-PAGE o SEC-HPLC, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos de terminal N o interna mediante el uso de un secuenciador de aminoácidos, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinte de plata. Normalmente, se preparará una inmunoglobulina aislada mediante al menos una etapa de purificación.
El término “unión específica” o “se une específicamente a” o es “específico para” se refiere a la unión de una fracción de unión a una diana de unión, tal como la unión de una inmunoglobulina a un antígeno diana, por ejemplo, un epítopo sobre un polipéptido, péptido u otra diana particular (por ejemplo, una diana de glicoproteína), y significa una unión que es mediblemente diferente de una interacción no específica (por ejemplo, una interacción no específica se puede unir a albúmina o caseína de suero bovino). La unión específica se puede medir, por ejemplo, al determinar la unión de una fracción de unión, o una inmunoglobulina, a una molécula diana en comparación con la unión a una molécula de control. Por ejemplo, la unión específica se puede determinar por competencia con una molécula de control que es similar a la diana, por ejemplo, un exceso de diana no marcada. En este caso, la unión específica está indicada si la unión de la diana marcada a una sonda se inhibe competitivamente por un exceso de la diana no marcada. El término “unión específica” o “se une específicamente a” o es “específico para” un polipéptido particular o un epítopo sobre una diana polipeptídica particular, como se utiliza en el presente documento, se puede exhibir, por ejemplo, por una molécula que tiene una Kc para la diana de al menos aproximadamente 200 nM, alternativamente al menos aproximadamente 150 nM, alternativamente al menos aproximadamente 100 nM, alternativamente al menos aproximadamente 60 nM, alternativamente al menos aproximadamente 50 nM, alternativamente al menos aproximadamente 40 nM, alternativamente al menos aproximadamente 30 nM, alternativamente al menos aproximadamente 20 nM, alternativamente al menos aproximadamente 10 nM, alternativamente al menos aproximadamente 8 nM, alternativamente al menos aproximadamente 6 nM, alternativamente al menos aproximadamente 4 nM, alternativamente al menos aproximadamente 2 nM, alternativamente al menos aproximadamente 1 nM, o más. En ciertos casos, el término “unión específica” se refiere a la unión en la que una molécula se une a un polipéptido o epítopo particular en un polipéptido particular sin unirse sustancialmente a ningún otro polipéptido o epítopo polipeptídico.
La “afinidad de unión” se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, una inmunoglobulina) y su socio de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, como se utiliza en el presente documento, “afinidad de unión” se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, inmunoglobulina y antígeno). La afinidad de una molécula X por su socio Y generalmente se puede representar mediante la constante de disociación (Kd). Por ejemplo, la Kd puede ser aproximadamente 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM, o más fuerte. La afinidad se puede medir mediante métodos comunes conocidos en la técnica, que incluyen aquellos descritos en el presente documento. Los anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad generalmente se unen al antígeno más rápido y tienden a permanecer unidos por más tiempo. Se conocen en la técnica una variedad de métodos para medir la afinidad de unión.
Como se utiliza en el presente documento, el “Kd” o “valor de Kd” se refiere a una constante de disociación medida por una técnica apropiada para la inmunoglobulina y el par diana, por ejemplo, utilizando ensayos de resonancia de plasmón de superficie, por ejemplo, utilizando un Biacore X100 o un Biacore T200 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) a 25 ° C con chips de antígeno CM5 inmovilizados.
Los términos “conjugado”, “conjugado” y “conjugación” se refieren a todas y cada una de las formas de conexión covalente o no covalente e incluyen, sin limitación, fusión química o genética directa, acoplamiento a través de un conector o un agente entrecruzador y asociación no covalente.
El término “fusión” se utiliza en el presente documento para referirse a la combinación de secuencias de aminoácidos de diferente origen en una cadena polipeptídica mediante la combinación en marco de sus secuencias de nucleótidos codificantes. El término “fusión” abarca explícitamente fusiones internas, es decir, inserción de secuencias de diferente origen dentro de una cadena polipeptídica, además de la fusión a uno de sus terminales. El término “fusión” se utiliza en el presente documento para referirse a la combinación de secuencias de aminoácidos de diferente origen.
El término “epítopo” incluye cualquier determinante molecular capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina. En ciertos aspectos, los determinantes de epítopos incluyen agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo o sulfonilo y, en ciertos aspectos, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de un antígeno que se une a una inmunoglobulina. Una “región de unión” es una región sobre una diana de unión unida por una molécula de unión.
El término “diana” o “diana de unión” se utiliza en el sentido más amplio e incluye específicamente polipéptidos, sin limitación, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos, células y otras moléculas con o sin función biológica tal como existen en la naturaleza.
El término “antígeno” se refiere a una entidad o fragmento de la misma, que se puede unir a una inmunoglobulina o desencadenar una respuesta inmunitaria celular. Un inmunógeno se refiere a un antígeno, que puede provocar una respuesta inmunitaria en un organismo, particularmente un animal, más particularmente un mamífero, que incluye un ser humano. El término antígeno incluye regiones conocidas como determinantes antigénicos o epítopos, como se definió anteriormente.
Un “sitio de unión a antígeno” o “región de unión a antígeno” de una inmunoglobulina de la presente invención contiene normalmente seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) dentro de cada dominio variable, y que contribuyen en diversos grados a la afinidad del sitio de unión para el antígeno. En cada dominio variable hay tres CDR de dominio variable de cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3) y tres CDR de dominio variable de cadena ligera (CDRL1, CDRL2 y CDRL3). La extensión de las CDR y las regiones marco (FR) se determina mediante comparación con una base de datos compilada de secuencias de aminoácidos en la que esas regiones se han definido de acuerdo con la variabilidad entre las secuencias y/o la información estructural de los complejos anticuerpo/antígeno. También se incluyen dentro del alcance de la invención los sitios de unión a antígenos funcionales que comprenden menos CDR (es decir, donde la especificidad de unión está determinada por tres, cuatro o cinco CDR). Menos de un conjunto completo de 6 CDR puede ser suficiente para unirse a algunas dianas de unión. Por tanto, en algunos casos, las CDR de un dominio Vh o Vl solo serán suficientes. Adicionalmente, ciertos anticuerpos pueden tener sitios de unión no asociados a CDR para un antígeno. Dichos sitios de unión se incluyen específicamente dentro de la presente definición.
El término “célula anfitriona”, como se utiliza en la solicitud actual, indica cualquier tipo de sistema celular que se pueda diseñar por ingeniería para generar las inmunoglobulinas de acuerdo con la presente invención. En un aspecto, las células de ovario de hámster chino (CHO) se utilizan como células anfitrionas. En algunos aspectos, E. coli se utiliza como células anfitrionas.
Como se utiliza en el presente documento, las expresiones “célula”, “estirpe celular” y “cultivo celular” se utilizan indistintamente y todas estas designaciones incluyen la progenie. Por tanto, las palabras “transformantes” y “células transformadas” incluyen la célula en cuestión primaria y los cultivos derivados de la misma sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada en la célula originalmente transformada.
Un ácido nucleico está “conectado operativamente” cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretor está conectado operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está conectado operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosoma está conectado operativamente a una secuencia codificante si está posicionado para facilitar la traducción. Generalmente, “conectado operativamente” significa que las secuencias de ADN que se conectan son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué ser contiguos. La ligación se logra mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, los adaptadores o conectores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan de acuerdo con la práctica convencional.
El “porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos” con respecto a una secuencia de péptidos o polipéptidos, es decir, las secuencias de polipéptidos del anticuerpo h38C2 identificadas en el presente documento, se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia de péptidos o polipéptidos específica después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos se puede lograr de diversas formas que están dentro de la experticia en la técnica, por ejemplo, utilizando software informático disponible públicamente como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Aquellos expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluidos los algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima en toda la longitud de las secuencias que se comparan.
“Tratar” o “tratamiento” se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en el que el objeto es prevenir o ralentizar (disminuir) una afección o trastorno patológico dirigido. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen el trastorno, así como aquellos propensos a tener el trastorno, o aquellos en quienes se debe prevenir el trastorno. Por ejemplo, un sujeto o mamífero es “tratado” exitosamente por cáncer, si, después de recibir una cantidad terapéutica de un inmunoconjugado en cuestión de acuerdo con los métodos de la presente invención, el sujeto muestra una reducción observable y/o medible en o ausencia de uno o más de lo siguiente: reducción en el número de células cancerosas o ausencia de células cancerosas; reducción del tamaño del tumor; inhibición (es decir, ralentización hasta cierto grado y preferiblemente detención) de la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos, que incluye la propagación del cáncer a tejidos blandos y huesos; inhibición (es decir, ralentización hasta cierto grado y, preferiblemente, detención) de la metástasis tumoral; inhibición, hasta cierto punto, del crecimiento tumoral; y/o alivio hasta cierto grado de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer específico; reducción de la morbilidad y/o mortalidad y mejora de la calidad de vida.
Inmunoglobulinas de dominio variable dual
Aspectos de la invención incluyen moléculas de inmunoglobulina de dominio variable dual (DVD) con un primer dominio variable que se une a un antígeno diana, y un segundo dominio variable que incluye únicamente residuos reactivos que proporcionan un sitio para adhesión covalente de una molécula conectora. Una molécula de inmunoglobulina DVD en cuestión incluye dos cadenas ligeras idénticas, así como dos cadenas pesadas idénticas. Cada cadena ligera y cada cadena pesada incluye un terminal N y un terminal C. Cada cadena ligera incluye un primer y un segundo dominio variable, designado como Vl1 y Vl2, así como un dominio constante, designado como Cl. En algunos aspectos, una cadena ligera comprende una cadena ligera kappa. En algunos aspectos, una cadena ligera comprende una cadena ligera lambda.
Aspectos de la invención incluyen moléculas de inmunoglobulina de dominio variable dual (DVD) con un primer dominio variable que se une a un antígeno diana, y un segundo dominio variable que incluye un único residuo de lisina reactivo que proporciona un sitio para adhesión covalente de una molécula conectora. Una molécula de inmunoglobulina DVD en cuestión incluye dos cadenas ligeras idénticas, así como dos cadenas pesadas idénticas. Cada cadena ligera y cada cadena pesada incluye un terminal N y un terminal C. Cada cadena ligera incluye un primer y un segundo dominio variable, designado como Vl1 y Vl2, así como un dominio constante, designado como Cl. En algunos aspectos, una cadena ligera comprende una cadena ligera kappa. En algunos aspectos, una cadena ligera comprende una cadena ligera lambda.
En algunos aspectos, cada cadena pesada incluye un primer y un segundo dominio variable, designado como Vh1 y Vh2, así como un dominio constante designado como Ch1, seguido por dominios de región Fc de cadena pesada. En algunos aspectos, los dominios de región Fc sobre una cadena pesada pueden incluir dominios de región Fc que son específicos a un tipo o subtipo de inmunoglobulina particular, que incluye pero no se limita a regiones Fc de un anticuerpo IgG (tal como un IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgA (tal como un IgAl o IgA2), IgM, IgE o IgD. Por ejemplo, en algunos aspectos, una inmunoglobulina pertenece a la clase IgG, y la cadena pesada comprende una cadena pesada Y. En algunos aspectos, una inmunoglobulina pertenece a la clase IgG1, y la cadena pesada comprende una cadena pesada y1. En algunos aspectos, una inmunoglobulina pertenece a la clase IgG2, y la cadena pesada comprende una cadena pesada y2. En algunos aspectos, una inmunoglobulina pertenece a la clase IgG3, y la cadena pesada comprende una cadena pesada y3. En algunos aspectos, una inmunoglobulina pertenece a la clase IgG4, y la cadena pesada comprende una cadena pesada Y4.
En algunos aspectos, una inmunoglobulina pertenece a la clase IgA, y una cadena pesada comprende una cadena pesada a. En algunos aspectos, una inmunoglobulina pertenece a la clase IgAl, y una cadena pesada comprende una cadena pesada a1. En algunos aspectos, una inmunoglobulina pertenece a la clase IgA2, y una cadena pesada comprende una cadena pesada a2.
En algunos aspectos, una inmunoglobulina pertenece a la clase IgD, y una cadena pesada comprende una cadena pesada 8. En algunos aspectos, una inmunoglobulina pertenece a la clase IgE, y una cadena pesada comprende una cadena pesada £. En algunos aspectos, una inmunoglobulina pertenece a la clase IgM, y una cadena pesada comprende una cadena pesada p.
En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina puede contener una secuencia de polipéptidos nativa que se origina en la naturaleza.
La organización de los dominios variables y constantes a lo largo de la cadena ligera en general procede desde el terminal N hasta el terminal C como Vl1-Vl2-Cl. Sin embargo, en ciertos aspectos, se puede reversar la organización de los dominios variables sobre la cadena ligera, de tal manera que la organización desde el terminal N hasta el terminal C sea Vl2-Vl1-Cl. Esta misma organización se aplica a fragmentos de unión de las inmunoglobulinas DVD en cuestión, en las que la organización desde el terminal N hasta el terminal C pueden ser Vl1-Vl2 o Vl2-Vl1. Del mismo modo, la organización de los dominios variables y constantes a lo largo de la cadena pesada en general procede desde el terminal N hasta el terminal C como Vh1-Vh2-Ch1-Fc, pero se puede modificar para reflejar la organización de los dominios sobre una cadena ligera de tal manera que los dominios apropiados sobre una cadena ligera se emparejan con los dominios apropiados sobre una cadena pesada cuando se ensambla la molécula de inmunoglobulina, o fragmento de unión de la misma.
En ciertos aspectos, la organización de los dominios variables y constantes a lo largo de una cadena ligera y pesada se puede organizar de tal manera que la secuencia de los dominios a lo largo de una cadena ligera procede desde el terminal N hasta el terminal C como Vl1-Vl2-Ch1, y la organización de dominios a lo largo de una cadena pesada procede desde el terminal N hasta el terminal C como Vh1-Vh2-Cl-Fc. Esta organización en particular se denomina organización CrossMAb y se describe en detalle en Klein et al., MAbs 4, 653-663 (2012), cuya divulgación se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad. En ciertos aspectos, se puede utilizar una organización CrossMAb para generar inmunoglobulinas DVD biespecíficas, que se describen más adelante.
En algunos aspectos, un primer y segundo dominio variable se conectan a lo largo de su cadena ligera o cadena pesada por una secuencia conectora de péptidos. Una secuencia conectora de péptidos puede ser una única secuencia de aminoácidos o polipéptidos. En algunos aspectos, una secuencia conectora de péptidos es ASTKGP (SEQ ID NO: 1) o TVAAPSv Fif Pp (SEQ ID NO: 2). Las secuencias conectoras de péptidos que se pueden utilizar para conectar un primer y segundo dominio variable de las inmunoglobulinas DVD en cuestión se proporcionan en la Patente de Estados Unidos No. 7,612,181.
Como se representa en la FIG. 1, el ensamble de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas resulta en la formación de una molécula de inmunoglobulina DVD, con varios enlaces disulfuro intercadena e intracadena que estabilizan las interacciones de las cadenas ligera y pesada.
Aspectos de las moléculas de inmunoglobulina DVD en cuestión incluyen un primer dominio variable con funcionalidad de unión a antígeno. Las secuencias Vl1 y Vh1 de las moléculas de inmunoglobulina DVD en cuestión se seleccionan para unirse específicamente a una diana, tal como, por ejemplo, un antígeno sobre una célula tumoral. Las inmunoglobulinas pueden ejercer efectos antitumorales que inducen apoptosis, citotoxicidad redirigida, que interfieren con las interacciones ligando-receptor o que previenen la expresión de proteínas que son críticas para un fenotipo neoplásico. Además, las inmunoglobulinas se pueden dirigir a componentes del microambiente tumoral, que perturba las estructuras vitales tales como la formación de vasculatura asociada a tumor. Las inmunoglobulinas también se pueden dirigir a receptores cuyos ligandos son factores de crecimiento, tales como el receptor del factor de crecimiento epidérmico, inhibiendo de esta manera la unión de ligandos naturales que estimulan las células a las células tumorales dirigidas. Alternativamente, las inmunoglobulinas pueden inducir ADCC, ADCP o CDC.
Un experto en la técnica se dará cuenta de que se conocen antígenos asociados a tumores para prácticamente cualquier tipo de cáncer. Las dianas de unión específicas asociadas a tumor que pueden ser dirigidas por el primer dominio variable de una molécula de inmunoglobulina DVD en cuestión incluyen, pero no se limitan a, HER2 (ERBB2), FOLR1, FOLR2, CD138, CD19, CD79A, CD79B, ROR1, ROR2, FCRM, CS1, GPA33, MSLN, CD52, CD20, CD3, CD4, CD8, CD20, CD21, CD22, CD23, CD30, CD33, CD38, CD44, CD56, CD70, BCMA, BMP6, IL12A, ILIA, IL1B, IL2, IL24, INHA, TNF, TNFSF10, BMP6 , EGF, FGF1, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6 , FGF7, FGF8, FGF9, GRP, IGF1, IGF2, IL12A, ILIA, IL1B, IL2, INHA, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, VEGF, CDK2, EGF, FGF10, FGF18, FGF2, FGF4, FGF7, IGF1, IGF1R, IL2, VEGF, BCL2, CD164, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, GNRH1, IGFBP6 , IL1A, IL1B, ODZ1, PAWR, PLG, TGFB1I1, AR, BRCA1, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK9, E2F1, EGFR (ERBB1), HER3 (ERBB3), HER4 (ERBB4), ENO1, ESR1, ESR2, IGFBP3, IGFBP6, IL2, INSL4, MYC, NOX5, NR6A1, PAP, PCNA, PRKCQ, PRKD1, PRL, TP53, FGF22, FGF23, FGF9, IGFBP3, IL2, INHA, KLK6, TP53, CHGB, GNRH1, IGF1, IGF2, INHA, INSL3, INSL4, PRL, KLK6 , SHBG, NR1D1, NR1H3, NR1I3, NR2F6, NR4A3, ESR1, ESR2, NR0B1, NR0B2, NR1D2, NR1H2, NR1H4, NR1I2, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR5A1, NR5A2, NR6A1, PGR, RARB, FGF1, FGF2, FGF6 , KLK3, KRT1, APOC1, BRCA1, CHGA, CHGB, CLU, COL1A1, COL6A1, EGF, ERK8, FGF1, FGF10, FGF11, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GNRH1, IGF1, IGF2, IGFBP3, IGFBP6 , IL12A, ILIA, IL1B, IL2, IL24, INHA, INSL3, INSL4, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, MMP2, MMP9, MSMB, NTN4, ODZ1, PAP, PLAU, PRL, PSAP, SERPINA3, SHBG, TGFA, TIMP3, CD44, CDH1, CDH10, CDH19, CDH20, CDH7, CDH9, CDH1, CDH10, CDH13, CDH18, CDH19, CDH20, CDH7, CDH8, CDH9, ROBO2, CD44, ILK, ITGA1, APC, CD164, COL6A1, MTSS1, PAP, TGFB1I1, AGR2, AIG1, AKAP1, AKAP2, CANT1, CAVI, CDH12, CLDN3, CLN3, CYB5, CYC1, DAB21P, DES, DNCL1, ELAC2, ENO2, ENO3, FASN, FLJ12584, FLJ25530, GAGEB1, GAGEC1, GGT1, GSTP1, HIP1, HUMCYT2A, IL29, K6HF, KAI1, KRT2A, MIB1, PARTI, PATE, PCA3, PIAS2, PIK3CG, PPID, PR1, PSCA, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, STEAP, STEAP2, TPM1, TPM2, TRPC6, ANGPT1, ANGPT2, ANPEP, ECGF1, EREG, FGF1, FGF2, FIGF, FLT1, JAG1, KDR, LAMA5, NRP1, NRP2, PGF, PLXDC1, STAB1, VEGF, VEGFC, ANGPTL3, BAI1, COL4A3, IL8, LAMA5, NRP1, NRP2, STAB1, ANGPTL4, PECAM1, PF4, PROK2, SERPINF1, TNFAIP2, CCL11, CCL2, CXCL1, CXCL10, CXCL3, CXCL5, CXCL6 , CXCL9, IFNA1, IFNB1, IFNG, IL1B, IL6, MDK, EDG1, EFNA1, EFNA3, EFNB2, EGF, EPHB4, FGFR3, HGF, IGF1, ITGB3, PDGFA, TEK, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFBR1, CCL2, CDH5, COL18A1, EDG1, ENG, ITGAV, ITGB3, THBS1, THBS2, BAD, BAG1, BCL2, CCNA1, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CDH1 (E-caderina), CDKN1B (p27Kip1), CDKN2A (p16INK4a), COL6A1, CTNNB1 (b-catenina), CTSB (catepsina B), ESR1, ESR2, F3 (TF), FOSL1 (FRA-1), GATA3, GSN (Gelsolina), IGFBP2, IL2RA, IL6, IL6R, IL6ST (glicoproteína 130), ITGA6 (integrina a6), JUN, KLK5, KRT19, MAP2K7 (c-Jun), MKI67 (Ki-67), NGFB (NGF), NGFR, NME1 (NM23A), PGR, PLAU (uPA), PTEN, SERPINB5 (maspina), SERPINE1 (PAI-1), TGFA, THBS1 (trombospondina-1), TIE (Tie-1), TNFRSF6 (Fas), TNFSF6 (FasL), tOp2A (topoisomerasa Iia), TP53, AZGP1 (zinc-a-glicoproteína), BpAg1 (plectina), CDKN1A (p21Wap1/Cip1), CLDN7 (claudin-7), CLU (clusterina), FGF1, FLRT1 (fibronectina), GABRP (GABAa), GNAS1, ID2, ITGA6 (a6 integrin), ITGB4 (integrina b 4), KLF5 (GC Box BP), KRT19 (Keratina 19), KRTHB6 (queratina tipo II específica para cabello), MACMARCKS, MT3 (metalotioneína-III), MUC1 (mucina), PTGS2 (COX-2), RAc2 (p21Rac2), S100A2, SCGB1D2 (lipophilin B), SCGB2A1 (mamaglobina 2), SCGB2A2 (mamaglobina 1), SPRR1B (Spr1), THBS1, THBS2, THBS4, y TNFAIP2 (B94).
Las secuencias de aminoácidos de un primer dominio región variable, que proporciona funcionalidad de unión a antígeno, pueden incluir secuencias de aminoácidos quiméricas, humanizadas, o humanas. Cualquier combinación adecuada de dichas secuencias se pueden incorporar en un primer dominio variable de una molécula de inmunoglobulina DVD en cuestión.
Las secuencias de la región variable de unión a antígenos se pueden seleccionar de varios anticuerpos monoclonales capaces de unirse a objetivos específicos y bien conocidos en la técnica. Estos incluyen, pero no se limitan a anticuerpo anti-TNF (Patente de Estados Unidos No. 6,258,562), anticuerpo anti-IL-12 y o anti-IL-12p40 (Patente de Estados Unidos No. 6,914,128); anticuerpo anti-IL-18 (US 2005/0147610 A1), anti-C5, anti-CBL, anti-CD147, antigp120, anti-VLA4, anti-CD11a, anti-CD18, anti-VEGF, anti-CD40L, anti-Id, anti- ICAM-1, anti-CXCL13, anti-CD2, anti-EGFR, anti-TGF-beta 2, anti-E-selectina, anti-Fact VII, anti-Her2/neu, anti-F gp, anti-CD11/18, anti-CD14, anti-ICAM-3, anti-CD80, anti-CD4, anti-CD3, anti-CD23, anti-beta2-integrina, anti-alfa4beta7, anti-CD52, anti-HLA DR, anti-CD22, anti-CD20, anti-MIF, anti-CD64 (FcR), anti-TCR alfa beta, anti-CD2, anti-Hep B, anti-CA 125, anti-EpCAM, anti-gp120, anti-CMV, anti-gpIIbIIIa, anti-IgE, anti-CD25, anti-CD33, anti-HLA, integrina anti-VNR, anti-IL-1 alfa, anti-IL-lbeta, receptor anti-IL-1, receptor anti-IL-2, anti-IL-4, receptor anti-IL4, anti-IL5, receptor anti-IL-5, anti-IL-6, anti-IL-8, anti-IL-9, anti-IL-13, receptor anti-IL-13, anti-IL-17, y anti-IL-23 (véase Presta LG. 2005 Selection, design, and engineering of therapeutic antibodies J Allergy Clin Immunol. 116:731-6 y Clark, M., “Antibodies for Therapeutic Applications,” Departamento de Patología de la Universidad de Cambridge, UK, 15 Oct. 2000, publicada en línea en la página de inicio de M. Clark en el sitio web del Departamento de Patología de la Universidad de Cambridge).
Las secuencias de la región variable de unión a antígeno también se pueden seleccionar de varios anticuerpos terapéuticos aprobados para uso, en ensayos clínicos o en desarrollo para uso clínico. Dichos anticuerpos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, RITUXAN®, IDEC/Genentech/Roche) (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 5,736,137), un anticuerpo anti-CD20 quimérico aprobado para tratar el linfoma no Hodgkin; HUMAX-CD20®, un anti-CD20 que Genmab está desarrollando actualmente, un anticuerpo anti-CD20 descrito en la Patente de Estados Unidos No. 5,500,362, AME-133 (Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (Intracel), y PRO70769 (PCT/US2003/040426, titulada “Variantes de Inmunoglobulina y Usos de las Mismas”), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech) (véase por ejemplo Patente de Estados Unidos No. 5,677,171), un anticuerpo anti-Her2/neu humanizado aprobado para tratar cáncer de mama; pertuzumab (rhuMab-2C4, OMNITARG®), que se desarrolla actualmente por Genentech; un anticuerpo anti-Her2 descrito en la Patente de Estados Unidos No. 4,753,894; cetuximab (ERBiTuX®, Imclone) (Patente de Estados Unidos No. 4,943,533; PCT WO 96/40210), un anticuerpo anti-EGFR quimérico en ensayos clínicos para una variedad de cánceres; ABX-EGF (Patente de Estados Unidos No. 6,235,883), que se desarrolla actualmente por Abgenix-Immunex-Amgen; HUMAX-EGFR™ (U.S. Ser. No. 10/172,317), que se desarrolla actualmente por Genmab; 425, EMD55900, EMD62000, y EMD72000 (Merck KGaA) (Patente de Estados Unidos No. 5,558,864; Murthy et al. 1987, Arch Biochem Biophys. 252(2):549-60; Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem. 35(4):315-20; Kettleborough et al., 1991, Protein Eng. 4(7):773-83); ICR62 (Institute of Cancer Research) (PCT WO 95/20045; Modjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22(1-3):129-46; Modjtahedi et al., 1993, BrJ Cancer. 1993, 67(2):247-53; Modjtahedi et al, 1996, BrJ Cancer, 73(2):228-35; Modjtahedi et al, 2003, Int J Cancer, 105(2):273-80); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canada y Centro de Immunologia Molecular, Cuba (Patente de Estados Unidos No. 5,891,996; Patente de Estados Unidos No. 6,506,883; Mateo et al, 1997, Immunotechnology, 3(1):71-81); mAb-806 (Ludwig Institute for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al. 2003, Proc Natl Acad Sci USA. 100(2):639-44); KSB-102 (KS Biomedix); MR1-1 (IVAX, National Cáncer Institute) (PCT WO 0162931A2); y SC100 (Scancell) (PCT WO 01/88138); alemtuzumab (CAMPATH®, Millennium), un anticuerpo monoclonal humanizado actualmente aprobado para tratamiento de leucemia linfocítica crónica de células B; muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3®), un anticuerpo anti-CD3 desarrollado por Ortho Biotech/Johnson & Johnson, ibritumomab tiuxetan (ZEVALIN®), un anticuerpo anti-CD20 desarrollado por IDEC/Schering AG, gemtuzumab ozogamicina (MYLOTARG®), un anticuerpo anti-CD33 (proteína p67) desarrollado por Celltech/Wyeth, alefacept (AMEVIVE ®), una fusión Fc anti-LFA-3 desarrollada por Biogen), abciximab (REOPRO®), desarrollado por Centocor/Lilly, basiliximab (SIMULECT®), desarrollado por Novartis, palivizumab (SYNAGIS®), desarrollado por Medimmune, infliximab (REMICADE®), una anticuerpo anti-TNFalfa desarrollado por Centocor, adalimumab (HUMIRA®), un anticuerpo anti-TNFalfa desarrollado por Abbott, HUMICADE®, un anticuerpo anti-TNFalfa desarrollado por Celltech, etanercept (ENBREL®), una fusión Fc anti-TNFalfa desarrollada por Immunex/Amgen, ABX-CBL, un anticuerpo anti-CD147 que se desarrolla por Abgenix, ABX-IL8, un anticuerpo anti-IL8 que se desarrolla por Abgenix, ABX-MA1, una anticuerpo anti-MUC18 que se desarrolla por Abgenix, Pemtumomab (R1549, 90Y-muHMFG1), un anti-MUCl en desarrollo por Antisoma, Therex (R1550), un anticuerpo anti-MUCl que se desarrolla por Antisoma, AngioMab (AS 1405), que se desarrolla por Antisoma, HuBC-1, que se desarrolla por Antisoma, Tioplatino (AS1407) que se desarrolla por Antisoma, ANTEGREN® (natalizumab), un anticuerpo anti-alfa-4-beta-1 (VLA4) y alfa-4-beta-7 que se desarrolla por Biogen, VLA-1 mAb, un anticuerpo anti-VLA-1 integrina que se desarrolla por Biogen, LTBR mAb, un anticuerpo del receptor beta anti-linfotoxina (LTBR) que se desarrolla por Biogen, CAT-152, un anticuerpo anti-TGF-p2 que se desarrolla por Cambridge Antibody Technology, J695, un anticuerpo anti-IL-12 que se desarrolla por Cambridge Antibody Technology y Abbott, CAT-192, un anticuerpo anti-TGFp1 que se desarrolla por Cambridge Antibody Technology y Genzyme, CAT-213, un anticuerpo anti-Eotaxinl que se desarrolla por Cambridge Antibody Technology, LYMPHOSTAT-B® un anticuerpo anti-Blys que se desarrolla por Cambridge Antibody Technology y Human Genome Sciences Inc., TRAIL-R1mAb, un anticuerpo anti-TRAIL-Rl que se desarrolla por Cambridge Antibody Technology y Human Genome Sciences, Inc., AVASTIN® bevacizumab, rhuMAb-VEGF), un anticuerpo anti-VEGF que se desarrolla por Genentech, un anticuerpo de la familia del receptor anti-HER que se desarrolla por Genentech, Anti-Tissue Factor (ATF), un anticuerpo de Factor anti-Tejido que se desarrolla por Genentech, XOLAIR® (Omalizumab), un anticuerpo anti-IgE que se desarrolla por Genentech, RAPTIVA® (Efalizumab), un anticuerpo anti-CD11a que se desarrolla por Genentech y Xoma, Anticuerpo MLN-02 (anteriormente LDP-02), que se desarrolla por Genentech y Millennium Pharmaceuticals, HUMAX CD4®, un anticuerpo anti- CD4 que se desarrolla por Genmab, HUMAX™-IL15, un anticuerpo anti-IL15 que se desarrolla por Genmab y Amgen, HUMAX™-Inflam, que se desarrolla por Genmab y Medarex, HUMAX™-Cancer, un anticuerpo anti-Heparanasa I que se desarrolla por Genmab y Medarex y Oxford GlycoSciences, HUMAX™-Linfoma, que se desarrolla por Genmab y Amgen, HUMAX™-TAC, que se desarrolla por Genmab, IDEC-131, y anticuerpo anti-CD40L que se desarrolla por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-151 (Clenoliximab), un anticuerpo anti-CD4 que se desarrolla por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-114, un anticuerpo anti-CD80 que se desarrolla por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-152, un anti-CD23 que se desarrolla por IDEC Pharmaceuticals, anticuerpos del factor de migración anti-macrófago (MIF) que se desarrollan por IDEC Pharmaceuticals, BEC2, un anticuerpo anti-idiotíopico que se desarrolla por Imclone, IMC-1C11, un anticuerpo anti-KDR que se desarrolla por Imclone, DC101, un anticuerpo anti-flk-1 que se desarrolla por Imclone, anticuerpos de caderina anti-VE que se desarrollan por Imclone, CEA-CIDF® (labetuzumab), un un anticuerpo anti-antígeno carcinoembrionario (CEA) que se desarrolla por Immunomedics, LYMPHOCIDE® (Epratuzumab), un anticuerpo anti-CD22 que se desarrolla por Immunomedics, AFP-Cide, que se desarrolla por Immunomedics, MyelomaCide, que se desarrolla por Immunomedics, LkoCide, que se desarrolla por Immunomedics, ProstaCide, que se desarrolla por Immunomedics, MDX-010, un anticuerpo anti-CTLA4 que se desarrolla por Medarex, MDX-060, un anticuerpo anti-CD30 que se desarrolla por Medarex, MDX-070 que se desarrolla por Medarex, MDX-018 que se desarrolla por Medarex, OSIDFM® (IDM-1), y anticuerpo anti-Her2 que se desarrolla por Medarex y Immuno-Designed Molecules, HUMAX®-CD4, un anticuerpo anti-CD4 que se desarrolla por Medarex y Genmab, HuMax- IL15, un anticuerpo anti-IL15 que se desarrolla por Medarex y Genmab, CNTO 148, un anticuerpo anti-TNFa que se desarrolla por Medarex y Centocor/J&J, CNTO 1275, un anticuerpo anti-citoquina que se desarrolla por Centocor/J&J, MOR101 y MOR102, anticuerpos anti-molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) (CD54) que se desarrollan por MorphoSys, MOR201, un anticuerpo del receptor 3 del factor de crecimiento de anti-fibroblastos (FGFR-3) que se desarrolla por MorphoSys, NUVION® (visilizumab), un anticuerpo anti-CD3 que se desarrolla por Protein Design Labs, HUZAF®, un anticuerpo anti-interferón gamma que se desarrolla por Protein Design Labs, Integrina Anti-a 5p1, que se desarrolla por Protein Design Labs, anti-IL- 12, que se desarrolla por Protein Design Labs, ING-1, un anticuerpo anti-Ep-CAM que se desarrolla por Xoma, XOLAIR® (Omalizumab) un anticuerpo anti-IgE humanizado desarrollado por Genentech y Novartis, y MLN01, un anticuerpo anti-Beta2 integrina que se desarrolla por Xoma.
Aspectos de una molécula de inmunoglobulina DVD en cuestión incluyen un segundo dominio variable de un anticuerpo 38C2, que incluye un residuo de lisina reactivo. Se describe un anticuerpo 38C2, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 8,252,902. En resumen, una región variable de cadena pesada del anticuerpo 38C2 incluye un único residuo de lisina reactivo que puede reaccionar con un conector, proporcionando de esta manera un punto de adhesión para conjugación con una fracción de fármaco. Como tal, las moléculas de inmunoglobulina que incluyen un dominio variable del anticuerpo 38C2 contienen dos de dichos puntos de adhesión (uno sobre cada cadena pesada) que se pueden utilizar para conjugación con una fracción de fármaco. Una vez se ha conjugado un residuo de lisina reactivo a un conector, se pierde la funcionalidad de unión del dominio variable 38C2, lo que significa que el dominio variable ya no se une a una diana. Como tal, sin estar limitado por ninguna teoría en particular, un dominio variable de anticuerpo 38C2 que se utiliza en las moléculas de inmunoglobulina DVD en cuestión proporciona un punto de adhesión para conjugación, pero no proporciona funcionalidad de unión a antígeno.
Una secuencia de aminoácidos de un dominio variable de cadena ligera (Vl) de un anticuerpo 38C2 humanizado se proporciona en la SEQ ID NO: 3. Una secuencia de aminoácidos de un dominio variable de cadena pesada (Vh) de un anticuerpo 38C2 humanizado se proporciona en la SEQ ID NO: 4.
En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina DVD en cuestión incluye una secuencia de dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo 38C2 humanizado (SEQ ID NO: 3) como una secuencia de dominio Vl2. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina DVD en cuestión incluye una secuencia de dominio Vl2 que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 3, por ejemplo, tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente tiene al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 3.
En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina DVD en cuestión incluye una secuencia de dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo 38C2 humanizado (SEQ ID NO: 4) como una secuencia de dominio Vh2. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina DVD en cuestión incluye una secuencia de dominio VH2 que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 4, por ejemplo, tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente tiene al menos aproximadamente 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 4, e incluye un residuo de lisina reactivo.
Una molécula de inmunoglobulina DVD en cuestión puede abarcar secuencias de inmunoglobulinas quiméricas, humanizadas y humanas, y en algunos aspectos, puede contener cualquier mezcla de las mismas. Por ejemplo, en algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina DVD puede incluir un primer dominio variable quimérico, y puede incluir un segundo dominio variable humano. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina DVD puede incluir un primer dominio variable humanizado, y puede contener un segundo dominio variable humano. Se puede utilizar cualquier combinación adecuada de secuencias de inmunoglobulinas quiméricas, humanizadas y humanas en las moléculas de inmunoglobulina DVD en cuestión.
En algunos aspectos, una inmunoglobulina DVD de la invención se puede modificar con respecto a la función efectora, por ejemplo, para mejorar la ADCC, ADCP o CDC de la inmunoglobulina. Esto se puede lograr al introducir una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc de una inmunoglobulina. Alternativa o adicionalmente, se pueden introducir residuos de cisteína en la región Fc, permitiendo de esta manera la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. Una inmunoglobulina generada de esta manera puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o un aumento de ADCC, ADCP o CDC. Véase Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Para aumentar la vida media en suero de una inmunoglobulina, se puede incorporar un epítopo de unión al receptor de rescate en una inmunoglobulina (especialmente un fragmento de inmunoglobulina) como se describe, por ejemplo en la Patente de Estados Unidos 5,739,277. Como se utiliza en el presente documento, el término “epítopo de unión al receptor de rescate” se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG-i, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de aumentar la vida media en suero in vivo de la Molécula de IgG.
Como se representa en la FIG. 2, una molécula de inmunoglobulina DVD de acuerdo con aspectos de la invención incluye un primer dominio variable que proporciona funcionalidad de unión a antígeno, y un segundo dominio variable de un anticuerpo 38C2, que incluye un único residuo de lisina reactivo que se puede conjugar a un conector.
En un aspecto específico, una inmunoglobulina DVD incluye un primer dominio variable que se une a HER2, e incluye un dominio variable de anticuerpo 38C2 humanizado como un segundo dominio variable. Los dominios variables se conectan cobre cada cadena ligera y pesada con una secuencia conectora de péptidos ASTKGP (SEQ ID NO: 1). Este aspecto particular se refiere a “HER2-h38C2-DVD1” y se representa en la FIG. 3. Una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de este aspecto se proporciona en la SEQ ID NO: 5. Una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de este aspecto se proporciona en la SEQ ID NO: 6. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina HER2-h38C2-DVD1 en cuestión incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 5, por ejemplo, tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente tiene al menos aproximadamente 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 5. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina HER2-h38C2-DVD1 en cuestión incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 6, por ejemplo, tiene al menos aproximadamente 80 %de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente tiene al menos aproximadamente 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 6, e incluye un residuo de lisina reactivo.
En otro aspecto específico, una inmunoglobulina DVD incluye un primer dominio variable que se une a HER2, e incluye un dominio variable de anticuerpo 38C2 humanizado como un segundo dominio variable. Los dominios variables se conectan sobre cada cadena ligera y pesada con una secuencia conectora de péptidos TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 2). Este aspecto particular se refiere a “HER2-h38C2-DVD2” y se representa en la FIG. 3. Una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de este aspecto se proporciona en la SEQ ID NO: 7. Una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de este aspecto se proporciona en la SEQ ID NO: 8. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina HER2-h38C2-DVD2 en cuestión incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 7, por ejemplo, tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente tiene al menos aproximadamente 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 7. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina HER2-h38C2-DVD2 en cuestión incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 8, por ejemplo, tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente tiene al menos aproximadamente 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 8, e incluye un residuo de lisina reactivo.
En un aspecto específico, una inmunoglobulina DVD incluye un primer dominio variable de un anticuerpo anti-FOLRl IMAGE-853 (Immunogen, Waltham MA), que se une a FOLR1, e incluye un dominio variable de anticuerpo 38C2 humanizado como un segundo dominio variable. Los dominios variables se conectan sobre cada cadena ligera y pesada con una secuencia conectora de péptidos ASTKGP (SEQ ID NO: 1). Este aspecto particular se refiere a “IMGN-853 FOLR1-h38C2-DVD1” y se representa esquemáticamente en la FIG. 4. Una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de este aspecto se proporciona en la SEQ ID NO: 9. Una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de este aspecto se proporciona en la SEQ ID NO: 10. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina IMGN-853 FOLR1- h38C2-DVD1 en cuestión incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 9, por ejemplo, tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente tiene al menos aproximadamente 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 9. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina IMGN-853 FOLR1-h38C2- DVD1 en cuestión incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 10, por ejemplo, tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente tiene al menos aproximadamente 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 10, e incluye un residuo de lisina reactivo.
En otro aspecto específico, una inmunoglobulina DVD incluye un primer dominio variable de un anticuerpo anti-FOLRl IMAGE-853 (Immunogen, Waltham MA), que se une a FOLR1, e incluye un dominio variable de anticuerpo 38C2 humanizado como un segundo dominio variable. Los dominios variables se conectan sobre cada cadena ligera y pesada con una secuencia conectora de péptidos TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 2). Este aspecto particular se refiere a “IMGN-853 FOLR1-h38C2- DVD2” y se representa esquemáticamente en la FIG. 4. Una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de este aspecto se proporciona en la SEQ ID NO: 11. Una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de este aspecto se proporciona en la SEQ ID NO: 12. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina IMGN-853 FOLR1-h38C2-DVD2 en cuestión incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 11, por ejemplo, tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente tiene al menos aproximadamente 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 11. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina IMGN-853 FOLR1-h38C2-DVD2 en cuestión incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 12, por ejemplo, tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente tiene al menos aproximadamente 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 12 , e incluye un residuo de lisina reactivo.
En un aspecto específico, una inmunoglobulina DVD incluye un primer dominio variable de un anticuerpo farletuzumab (Morphotek, Inc., Exton PA), que se une a FOLR1, e incluye un dominio variable de anticuerpo 38C2 humanizado como un segundo dominio variable. Los dominios variables se conectan sobre cada cadena ligera y pesada con una secuencia conectora de péptidos ASTKGP (SEQ ID NO: 1). Este aspecto particular se refiere a “farletuzumab FOLR1-h38C2-DVD1” y se representa esquemáticamente en la FIG. 4. Una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de este aspecto se proporciona en la SEQ ID NO: 13. Una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de este aspecto se proporciona en la SEQ ID NO: 14. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina farletuzumab FOLR1-h38C2- DVD1 en cuestión incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 13, por ejemplo, tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente tiene al menos aproximadamente 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 13. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina farletuzumab FOLR1-h38C2- DVD1 en cuestión incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 14, por ejemplo, tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente tiene al menos aproximadamente 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 14, e incluye un residuo de lisina reactivo.
En otro aspecto específico, una inmunoglobulina DVD incluye un primer dominio variable de un anticuerpo farletuzumab (Morphotek, Inc., Exton PA), e incluye un dominio variable de anticuerpo 38C2 humanizado como un segundo dominio variable. Los dominios variables se conectan sobre cada cadena ligera y pesada con una secuencia conectora de péptidos TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 2). Este aspecto particular se refiere a “farletuzumab FOLR1-h38C2-DVD2” y se representa esquemáticamente en la FIG. 4. Una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de este aspecto se proporciona en la SEQ ID NO: 15. Una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de este aspecto se proporciona en la SEQ ID NO: 16. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina farletuzumab FOLR1-h38C2-DVD2 en cuestión incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 15, por ejemplo, tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente tiene al menos aproximadamente 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 15. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina farletuzumab FOLR1-h38C2-DVD2 en cuestión incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 16, por ejemplo, tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente tiene al menos aproximadamente 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 16, e incluye un residuo de lisina reactivo.
En un aspecto específico, una inmunoglobulina DVD incluye un primer dominio variable que se une a CD138, e incluye un dominio variable de anticuerpo 38C2 humanizado as el segundo dominio variable. Los dominios variables se conectan sobre cada cadena ligera y pesada con una secuencia conectora de péptidos ASTKGP (SEQ ID NO: 1). Este aspecto particular se refiere a “CD138-h38C2-DVD1” y se representa en la FIG. 5. Una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de este aspecto se proporciona en la SEQ ID NO: 17. Una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de este aspecto se proporciona en la SEQ ID NO: 18. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina CD138-h38C2-DVD1 en cuestión incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 17, por ejemplo, tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente tiene al menos aproximadamente 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 17. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina CD138-h38C2-DVD1 en cuestión incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 18, por ejemplo, tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente tiene al menos aproximadamente 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 18, e incluye un residuo de lisina reactivo.
En otro aspecto específico, una inmunoglobulina DVD incluye un primer dominio variable que se une a CD138, e incluye un dominio variable de anticuerpo 38C2 humanizado como un segundo dominio variable. Los dominios variables se conectan sobre cada cadena ligera y pesada con una secuencia conectora de péptidos TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 2). Este aspecto particular se refiere a “CD138-h38C2-DVD2” y se representa en la FIG. 5. Una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de este aspecto se proporciona en la SEQ ID NO: 19. Una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de este aspecto se proporciona en la SEQ ID NO: 20. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina CD138-h38C2-DVD2 en cuestión incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 19, por ejemplo, tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente tiene al menos aproximadamente 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 19. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina CD138-h38C2-DVD2 en cuestión incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 20, por ejemplo, tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente tiene al menos aproximadamente 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 20, e incluye un residuo de lisina reactivo.
En un aspecto específico, una inmunoglobulina DVD incluye un primer dominio variable que se une a CD79b, e incluye un dominio variable de anticuerpo 38C2 humanizado as el segundo dominio variable. Los dominios variables se conectan sobre cada cadena ligera y pesada con una secuencia conectora de péptidos ASTKGP (SEQ ID NO: 1). Este aspecto particular se refiere a “CD79b-h38C2-DVD1.” Una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de este aspecto se proporciona en la SEQ ID NO: 21. Una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de este aspecto se proporciona en la SEQ ID NO: 22. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina CD79b-h38C2- DVD1 en cuestión incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 21, por ejemplo, tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente tiene al menos aproximadamente 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 21. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina CD79b-h38C2- DVD1 en cuestión incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 22, por ejemplo, tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente tiene al menos aproximadamente 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 22, e incluye un residuo de lisina reactivo.
En otro aspecto específico, una inmunoglobulina DVD incluye un primer dominio variable que se une a CD79b, e incluye un dominio variable de anticuerpo 38C2 humanizado como un segundo dominio variable. Los dominios variables se conectan sobre cada cadena ligera y pesada con una secuencia conectora de péptidos TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 2). Este aspecto particular se refiere a “CD79b-h38C2-DVD2.” Una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de este aspecto se proporciona en la SEQ ID NO: 23. Una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de este aspecto se proporciona en la SEQ ID NO: 24. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina CD79bh38C2- DVD2 en cuestión incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 23, por ejemplo, tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente tiene al menos aproximadamente 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 23. En algunos aspectos, una molécula de inmunoglobulina CD79b-h38C2-DVD2 en cuestión incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 24, por ejemplo, tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente tiene al menos aproximadamente 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 24, e incluye un residuo de lisina reactivo.
En ciertos aspectos, una molécula de inmunoglobulina DVD en cuestión es biespecífica en que un brazo de la inmunoglobulina incluye un primer dominio variable con especificidad de unión para una primera diana de unión, y el segundo brazo incluye un primer dominio variable con especificidad de unión para una segunda diana de unión. Dichos aspectos proporcionan la capacidad de unirse a dos diferentes dianas, proporcionando de esta manera funcionalidad adicional. Una molécula de inmunoglobulina DVD biespecífica ilustrativa se representa en la FIG. 6.
En ciertos aspectos, una molécula de inmunoglobulina DVD en cuestión es bi-paratópica, en que ese brazo de la inmunoglobulina incluye un primer dominio variable con especificidad de unión para una primera diana de unión, y el segundo brazo incluye un primer dominio variable con especificidad de unión para la misma diana de unión, pero un epítopo de unión diferente. Dichos aspectos proporcionan la capacidad de unirse a la misma diana que cubre dos epítopos de unión diferentes, pero potencialmente algo superpuestos, proporcionando de esta manera la funcionalidad de entrecruzamiento de la diana, lo que desencadena el tráfico lisosómico después de la internalización.
En ciertos aspectos, una molécula de inmunoglobulina es una molécula de inmunoglobulina intacta que incluye una primera y segunda región variable, como se describió anteriormente, y también incluye un dominio Cl sobre la cadena ligera, así como dominios constantes de cadena pesada Ch1, Ch2, y Ch3. Un dominio constante puede comprender una secuencia nativa o no nativa, o una variante de secuencia de aminoácidos de la misma. En ciertos aspectos, una molécula de inmunoglobulina puede ser un fragmento de inmunoglobulina. Ejemplos de fragmentos de inmunoglobulina incluyen, pero no se limitan a, fragmentos (Fab')2, Fab', Fab, y Fv, cuyos ejemplos no limitantes se representan en la FIG. 6.
Producción de inmunoglobulinas en DVD
Las inmunoglobulinas de DVD de la presente invención se pueden producir mediante cualquiera de una serie técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, expresión de células anfitrionas, en la que el vector o los vectores de expresión que codifican las cadenas pesadas de DVD y/o ligeras de DVD se transfectan en una célula anfitriona mediante técnicas estándar. Se pretende que varias formas del término “transfección” abarquen una amplia variedad de técnicas comúnmente utilizadas para la introducción de ADN exógeno en una célula anfitriona procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano y similares. Aunque es posible expresar las inmunoglobulinas DVD de la invención en células anfitrionas procariotas o eucariotas, la expresión de inmunoglobulinas DVD en células eucariotas es preferible, y más preferible en células anfitrionas de mamíferos, porque son más probables dichas células eucariotas (y en particular células de mamíferos) que las células procarióticas para ensamblar y secretar una inmunoglobulina DVD correctamente plegada e inmunológicamente activa.
Las células anfitrionas de mamífero preferidas para expresar las inmunoglobulinas recombinantes de la invención incluyen Ovario de Hámster Chino (células CHO) (que incluyen las células dhfr-CHO, descritas en Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en R.J. Kaufman y P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), células de Riñón Embrionario Humano (HEK), células de mieloma NS0, células COS y Células SP2. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican inmunoglobulinas DVD en células anfitrionas de mamíferos, las inmunoglobulinas DVD se producen al cultivar las células anfitrionas durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión de las inmunoglobulinas DVD en las células anfitrionas o, más preferiblemente, la secreción de las inmunoglobulinas DVD en el medio de cultivo en el que se cultivan las células anfitrionas. Las inmunoglobulinas DVD se pueden recuperar del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteínas estándar.
En un sistema preferido para la expresión recombinante de inmunoglobulinas de DVD de la invención, se introduce un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada de DVD como la cadena ligera de DVD en células dhfr-CHO mediante transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, cada uno de los genes de la cadena ligera y pesada de DVD está ligado operativamente a elementos reguladores del potenciador de CMV/promotor de AdMLP para impulsar altos niveles de transcripción de los genes. Un vector de expresión recombinante también porta un gen DHFR, que permite la selección de células CHO que han sido transfectadas con el vector utilizando selección/amplificación con metotrexato. Las células anfitrionas transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas ligera y pesada de DVD y se recupera inmunoglobulina de DVD intacta del medio de cultivo. Se utilizan técnicas estándar de biología molecular y cultivo de tejidos para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células anfitrionas, seleccionar transformantes, cultivar las células anfitrionas y recuperar la inmunoglobulina DVD del medio de cultivo. Además, los aspectos de la invención incluyen un método para sintetizar una inmunoglobulina DVD de la invención al cultivar una célula anfitriona de la invención en un medio de cultivo adecuado hasta que se sintetiza una inmunoglobulina DVD de la invención. Un método puede comprender adicionalmente aislar la inmunoglobulina DVD del medio de cultivo para producir una inmunoglobulina aislada.
Una característica de las inmunoglobulinas DVD en cuestión es que se pueden producir y purificar de formas similares a los anticuerpos convencionales. La producción de inmunoglobulinas DVD puede dar como resultado un producto principal único y homogéneo con la actividad deseada, sin ninguna modificación de secuencia de la región constante o modificaciones químicas de ningún tipo.
Conectores
Los aspectos de un inmunoconjugado en cuestión incluyen conectores, que pueden comprender uno o más componentes conectores. Los conectores de acuerdo con aspectos de la invención sirven para unir una fracción de carga (por ejemplo, una fracción de fármaco) a un DVD-Ig, y pueden emplear cualquier química adecuada. Se pueden incluir varios tipos de funcionalidad de conector en los inmunoconjugados en cuestión, que incluyen, pero no se limitan a, conectores escindibles y conectores no escindibles, así como conectores reversibles y conectores irreversibles.
Los conectores escindibles son aquellos que se basan en procesos dentro de una célula diana para liberar una fracción de fármaco, tales como la reducción del citoplasma, la exposición a condiciones ácidas en un lisosoma o endosoma, o la escisión por enzimas específicas (por ejemplo, proteasas) dentro de la célula. Como tal, los conectores escindibles permiten que una fracción de fármaco adherida se libere en su forma original después de que un inmunoconjugado se haya internalizado y procesado dentro de una célula diana. Los conectores escindibles incluyen, pero no se limitan a, aquellos cuyos enlaces pueden ser escindidos por enzimas (por ejemplo, conectores de péptido); condiciones reductoras (por ejemplo, conectores disulfuro); o condiciones ácidas (por ejemplo, hidrazonas y carbonatos). Se proporcionan ejemplos no limitantes de conectores escindibles en la FIG. 7.
Los conectores no escindibles utilizan la degradación catabólica de un inmunoconjugado para la liberación de la fracción de fármaco. Una fracción de fármaco liberada generalmente retiene el conector así como el residuo de aminoácido de la inmunoglobulina a la que se conjugó el conector. Los conectores no escindibles incluyen, pero no se limitan a, conectores PEG, conectores de hidrocarburo y conectores de tioéter. Se proporcionan ejemplos no limitantes de conectores no escindibles en la FIG. 8.
Los aspectos de un inmunoconjugado en cuestión también pueden incluir conectores reversibles e irreversibles. Los conectores reversibles utilizan enlaces químicos que se pueden romper o revertir fácilmente utilizando reactivos adecuados. Como tal, después de la formación de un conector reversible, el conector se puede romper en una posición deseada mediante tratamiento con un reactivo, liberando de esta manera la molécula de inmunoglobulina del conector. Se proporcionan ejemplos no limitantes de conectores reversibles en la FIG. 9, e incluyen, por ejemplo, fracciones de dicetona. Los conectores irreversibles utilizan enlaces químicos que no pueden romperse o revertirse fácilmente después de su formación. Como tal, después de la formación de un conector irreversible, no se puede liberar fácilmente una molécula de inmunoglobulina. Se proporcionan ejemplos no limitantes de conectores irreversibles en la FIG. 10, e incluyen, por ejemplo, fracciones de p-lactama. Se representan reacciones de conector de ejemplo en las que una inmunoglobulina se conjuga con un conector reversible o irreversible en la Fig. 13.
Además de las fracciones de p-lactama y dicetona, en algunos aspectos, se pueden utilizar otras fracciones, tales como, por ejemplo, vinil dicetonas y provinil dicetonas para la conjugación. En algunos aspectos, se pueden utilizar fracciones electrofílicas (asas), solas o en combinación, con dichas fracciones. Las fracciones electrofílicas se pueden utilizar para la conjugación específica de sitio con la lisina única y únicamente reactiva de un dominio variable h38C2, y también se pueden utilizar para la conjugación no específica después de que se haya conjugado una lisina h38C2 con una fracción de fármaco. Ejemplos no limitantes de otras fracciones incluyen 6-maleimidocaproilo (“MC”), maleimidopropanoilo (“MP”), valina-citrulina (“val-cit” o “vc”), alanina-fenilalanina (“ala-phe”), p-aminobenciloxicarbonilo (un “PAB”), y aquellos resultantes de la conjugación con reactivos conectores: 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo que forma una fracción conectora ácido 4-mercaptopentanoico (“SPP”), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1 carboxilato de N-succinimidilo que forma una fracción conectora ácido 4-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)metil)ciclohexanocarboxílico (“SMCC”, también denominado en el presente documento “MCC”), 4 (piridin-2-ildisulfanil)butanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo que forma una fracción conectora ácido 4-mercaptobutanoico (“SPDB”), (4-yodo-acetil)aminobenzoato de N-succinimidilo (“SIAB”), etilenoxi-CH2CH2O- como uno o más unidades de repetición (“EO” o “PEO”). Se proporciona más información en Sinha et al., Nat. Protoc. 2, 449- 456(2007).
En algunos aspectos, un componente conector puede comprender una unidad de aminoácidos. En uno de tales aspectos, una unidad de aminoácidos permite la escisión del conector por una proteasa, facilitando de esta manera la liberación del fármaco del inmunoconjugado tras la exposición a proteasas intracelulares, tales como enzimas lisosomales. Véase, por ejemplo, Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21: 778-784. Ejemplos no limitantes de unidades de aminoácidos incluyen, pero no se limitan a, un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido y un pentapéptido. Ejemplos no limitantes de dipéptidos incluyen: valina-citrulina (vc o val-cit), alanina-fenilalanina (af o ala-phe); fenilalanina-lisina (fk o phe-lys); o N-metil-valina-citrulina (Me-val-cit). Ejemplos no limitantes de tripéptidos incluyen: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Una unidad de aminoácidos puede comprender residuos de aminoácidos que se producen de forma natural, así como aminoácidos menores y análogos de aminoácidos de origen no natural, tales como citrulina. Las unidades de aminoácidos se pueden diseñar y optimizar en su selectividad para la escisión enzimática por una enzima particular, por ejemplo, una proteasa asociada a tumores, catepsina B, C y D, o una proteasa de plasmina.
En algunos aspectos, un conector L puede ser un conector de tipo ramificado o dendrítico para la adhesión covalente de más de una fracción de fármaco a través de una fracción de conector multifuncional ramificado a una inmunoglobulina (Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). Ejemplos no limitantes de conectores dendríticos ramificados incluyen unidades de dendrímero de 2,6-bis(hidroximetil)-p-cresol y 2,4,6-tris(hidroximetil)-fenol (documento WO 2004/01993; Szalai et al (2003) J. Amer. Chem. Soc. 125:15688-15689; Shamis et al (2004) J. Amer. Chem. Soc. 126:1726-1731; Amir et al (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499). Los conectores ramificados pueden aumentar la relación molar de fármaco a inmunoglobulina, es decir, la carga, que está relacionada con la potencia del ADC. Así, por ejemplo, cuando una inmunoglobulina lleva solo un residuo de aminoácido reactivo para la conjugación, se pueden adherir una multitud de fracciones de fármaco a través de un conector ramificado.
Los componentes conectores, que incluyen el ensanchador, el espaciador y las unidades de aminoácidos, se pueden sintetizar mediante métodos conocidos en la técnica, tales como aquellos descritos en la Publicación de Patente de Estados Unidos No. 2005/0238649 A1.
Fracciones de carga
Los aspectos de la invención incluyen moléculas de inmunoglobulina que se conjugan con una o más fracciones de carga mediante un conector, como se describió anteriormente. Las fracciones de carga incluyen ampliamente, pero no se limitan a, fracciones biológicamente activos, tales como fracciones de fármaco y fracciones de modificación de la expresión, así como fracciones no biológicamente activas, tales como fracciones detectables (por ejemplo, marcadores detectables). Cada una de estas fracciones se describe adicionalmente en el presente documento.
Ejemplos no limitantes de fracciones de fármacos incluyen agentes citotóxicos y citostáticos que son capaces de matar una célula diana o detener el crecimiento de una célula diana. En algunos aspectos, las fracciones de fármacos incluyen toxinas, agentes quimioterapéuticos, antibióticos, isótopos radiactivos, isótopos radiactivos quelados y enzimas nucleolíticas.
En algunos aspectos, una fracción de fármaco se selecciona del grupo que consiste en auristatina; dolostatina; cemadotin; MMAF; MMAE; maitansinoides (que incluyen, pero no se limitan a, DM1, DM3 y DM4); pirrolobenzodiazepinas (PBD, que incluyen, pero no se limitan a, PBD monoméricos y diméricos); enediinas (que incluyen pero no se limitan a caliqueamicinas y tiancimicinas); camptotecinas (que incluyen pero no se limitan a SN-38); y doxorrubicina (que incluyen, pero no se limitan a una MMDX o productos de bioactivación del mismo, tales como, por ejemplo, PNU-159682).
En ciertos aspectos, una fracción de fármaco de los inmunoconjugados de la presente invención se selecciona de un grupo que consiste en un inhibidor de V-ATPasa, un agente proapoptótico, un inhibidor de Bcl2, un inhibidor de MCL1, un inhibidor de HSP90, un inhibidor IAP, un inhibidor de mTor, un estabilizador de microtúbulos, un desestabilizador de microtúbulos, una auristatina, una dolastatina, un maitansinoide, una MetAP (metionina aminopeptidasa), un inhibidor de la exportación nuclear de proteínas CRM1, un inhibidor de DPPIV, un inhibidor de proteasoma, un inhibidor de reacciones de transferencia de fosforilo en las mitocondrias, un inhibidor de la síntesis de proteínas, un inhibidor de la quinasa, un inhibidor de CDK2, un inhibidor de CDK9, un inhibidor de la quinesina, un inhibidor de HDAC, un agente que daña el ADN, un agente alquilante del ADN, un intercalador del ADN, un aglutinante del surco menor del ADN y un inhibidor de DHFR.
Además, una inmunoglobulina en cuestión (o un fragmento de unión de la misma) se puede conjugar con una fracción de fármaco que modifica una respuesta biológica dada. Las fracciones de fármaco no se deben interpretar como limitadas a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, una fracción de fármaco puede ser una proteína, péptido o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, toxina del cólera o toxina diftérica, una proteína tal como factor de necrosis tumoral, a-interferón, p-interferón, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador del plasminógeno tisular, una citocina, un agente apoptótico, un agente anti-angiogénico o un modificador de la respuesta biológica tal como, por ejemplo, una linfocina.
En algunos aspectos, una fracción de fármaco puede ser una citotoxina, un fármaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o una radiotoxina. Ejemplos de citotoxinas incluyen, pero no se limitan a, taxanos, agentes alquilantes de ADN (por ejemplo, análogos de CC-1065), antraciclinas, análogos de tubulisina, análogos de duocarmicina, auristatina E, auristatina F, maitansinoides y agentes citotóxicos que comprenden una fracción de polietilenglicol reactiva, taxón, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Las fracciones de fármacos también pueden incluir, por ejemplo, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil descarbazina), agentes de ablación (por ejemplo, mecloretamina, tiotepa clorambucilo, meifalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino, antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)), y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). Véase, por ejemplo, Publicación de Patente de Estados Unidos No.
20090304721.
Otros ejemplos no limitantes de citotoxinas que se pueden conjugar con los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos (fragmentos de unión a antígenos) o equivalentes funcionales de la invención incluyen duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas y auristatinas, y derivados de las mismas.
Las inmunoglobulinas, o fragmentos de unión de las mismas, de la presente invención también se pueden conjugar con un isótopo radiactivo o un isótopo radiactivo quelado para generar radiofármacos citotóxicos, denominados radioinmunoconjugados. Ejemplos de isótopos radiactivos que se pueden conjugar con anticuerpos para uso diagnóstico o terapéutico incluyen, pero no se limitan a, yodo-131, indio-111, itrio-90, lutecio-177, bismuto-213 y astato-211. Los métodos para preparar radioinmunoconjugados se establecen en la técnica. Ejemplos de radioinmunoconjugados que están disponibles comercialmente, incluyen Zevalin™ (DEC Pharmaceuticals) y Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals), y se pueden utilizar métodos similares para preparar radioinmunoconjugados utilizando los anticuerpos de la invención. En ciertos aspectos, el quelante macrocíclico es ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N”,N'”-tetraacético (DOTA) que se puede adherir a una inmunoglobulina mediante una molécula conectora.
En algunos aspectos, una fracción de fármaco incluye una única unidad de fármaco, como se describió anteriormente. En otros aspectos, una fracción de fármaco incluye una pluralidad de unidades de fármaco idénticas, tales como 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9 o 10 unidades de fármaco sobre la misma fracción de fármaco. En ciertos aspectos, una fracción de fármaco incluye dos unidades de fármaco diferentes en la misma fracción de fármaco. Por ejemplo, en algunos aspectos, una única fracción de fármaco puede incluir tanto una unidad de fármaco MMAF como una unidad de fármaco monómero PBD. Adicionalmente, en ciertos aspectos, un inmunoconjugado en cuestión puede incluir una primera fracción de fármaco conjugada con un primer brazo del inmunoconjugado y una segunda fracción de fármaco conjugada con el segundo brazo del inmunoconjugado. Como tal, se puede conjugar cualquiera de una variedad de combinaciones de fracciones de fármaco a un DVD-Ig en cuestión a través de un conector. Ejemplos no limitantes de fracciones de fármacos se representan en la FIG. 14.
Las fracciones modificadoras de la expresión incluyen, pero no se limitan a, ARN que no codifica proteínas (“ARNncp”). En un aspecto, un ARNncp incluye, pero no se limita a, un ARNmicro (ARNmi), un ARNmi precursor, un ARN de interferencia pequeña (ARNip), un a Rn pequeño y un precursor que codifica el mismo, un ARNip heterocromático (ARNip-hc), un ARN que interactúa con piwi (ARNip), un ARN de doble cadena en horquilla (ARNdc en horquilla), un ARNip de acción trans (ARNip-ta), un ARNip antisentido natural (ARNip nat), un ARN trazador (ARNtc), un A r N guía (ARNg) y un ARN de guía única (ARNgu). En un aspecto, un ARNip comprende una longitud que varía de aproximadamente 20 a aproximadamente 25 pares base, tal como de aproximadamente 20 a aproximadamente 24 pares base, tal como de aproximadamente 21 a aproximadamente 25 pares base, o de aproximadamente 22 a aproximadamente 24 pares base. En un aspecto, un ARN pequeño comprende una longitud que varía de aproximadamente 22 a aproximadamente 26 pares base, tal como de aproximadamente 22 a aproximadamente 25 pares base, tal como de aproximadamente 23 a aproximadamente 26 pares base, o de aproximadamente 24 a aproximadamente 25 pares base.
Se puede encontrar una descripción general y revisión de la tecnología de ARNip en: Resnier et al., “A review of the current status of siRNA nanomedicines in the treatment of cancer”, Biomaterials 34 (2013) 6429-43.
También se puede encontrar una descripción general y revisión de la tecnología de ARNip en: Song et al., “Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors”, Nature Biotechnology 23, 709-717 (2005).
Las fracciones detectables incluyen, pero no se limitan a, marcadores o fracciones que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromofóricos, densos en electrones, quimioluminiscentes y radiactivos), así como fracciones, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansil, umbeliferona, luceriferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga. y luciferasa bacteriana (Patente de Estados Unidos No. 4,737,456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacáridos oxidasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tal como uricasa y xantina oxidasa, junto con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte como h Rp , lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de giro, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables, y similares.
Inmunoconjugados
Un aspecto de la invención incluye inmunoconjugados, en los que una DVD-Ig en cuestión se conjuga a una o más fracciones de fármaco a través de un conector. En algunos aspectos, un inmunoconjugado en cuestión se describe generalmente por la fórmula Ig-(L-D)n, en la que Ig es una molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual, L es un conector, D es una fracción de fármaco, y n es un entero seleccionado de 1 a 12, tal como 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10 o 11. En un aspecto, n es 1 o 2.
En ciertos aspectos, un segundo dominio variable de Ig incluye un residuo de lisina reactivo, y un inmunoconjugado se crea utilizando una reacción de conjugación controlada en la que una composición de conector/fracción de fármaco se conjuga al residuo de lisina reactivo sobre cada cadena pesada de una Ig desnuda. Se describen las condiciones para esta reacción, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 8,252,902. En resumen, la reacción se puede llevar a cabo a temperatura ambiente en una solución de IX PBS, DMSO al 2 % al hacer reaccionar la Ig con una composición de conector/fracción de fármaco, resultando de esta manera en la adhesión de un conector/fracción de fármaco a cada uno de los residuos de lisina reactivos sobre la Ig. El resultado es un inmunoconjugado que tiene dos fracciones de fármaco adheridas a través de conectores a los residuos de lisina reactivos sobre cada cadena pesada de la Ig. Una representación esquemática de una reacción de ejemplo se proporciona en la FIG. 15.
En ciertos aspectos, se pueden conjugar fracciones de fármaco adicionales a una molécula de Ig utilizando técnicas de conjugación no controladas. Por ejemplo, en ciertos aspectos, los residuos de aminoácidos distintos del único residuo de lisina reactivo de forma única del dominio variable 38C2 se pueden utilizar como puntos de adhesión para conjugación de una fracción de fármaco a través de un conector. El resultado de dicha conjugación no controlada es un inmunoconjugado que tiene una o más fracciones de fármaco adheridas a los otros residuos de aminoácidos sobre la molécula de inmunoglobulina. Tal conjugación adicional se puede lograr al hacer reaccionar una composición de conector/fracción de fármaco con, por ejemplo, residuos de lisina sobre la molécula de inmunoglobulina distinta de la única lisina únicamente reactiva en el segundo dominio variable, o residuos de cisteína estándar o diseñados por ingeniería sobre la molécula de inmunoglobulina, o uno o más residuos de selenocisteína diseñados por ingeniería sobre la molécula de inmunoglobulina. El resultado de dicha conjugación no controlada es un inmunoconjugado con un número promedio de fracciones de fármaco que varía desde aproximadamente 1 a aproximadamente 20 fracciones de fármaco por anticuerpo, dependiendo del número de residuos de aminoácidos que están disponibles parar reaccionar con la composición de conector/fracción de fármaco. En ciertos aspectos, el número promedio de fracciones de fármaco por molécula de inmunoglobulina logrado utilizando un enfoque de conjugación no controlada es aproximadamente 1 a aproximadamente 8, tal como 2, 3, 4, 5, 6, o 7 fracciones de fármaco por inmunoglobulina.
En un aspecto, un inmunoconjugado incluye una molécula de inmunoglobulina HER2-h38C2-DVD1 con una fracción de fármaco de MMAF conjugada a cada uno de los residuos de lisina reactivos a través de un conector irreversible. En un aspecto, un inmunoconjugado incluye una molécula de inmunoglobulina HER2-h38C2-DVD2 con una fracción de fármaco de MMAF conjugada a cada uno de los residuos de lisina reactivos a través de un conector irreversible.
En un aspecto, un inmunoconjugado incluye una molécula de inmunoglobulina IMGN-853 FOLR1-h38C2-DVD1 con una fracción de fármaco de MMAF conjugada a cada uno de los residuos de lisina reactivos a través de un conector irreversible. En un aspecto, un inmunoconjugado incluye una molécula de inmunoglobulina IMGN-853 FOLR1-h38C2-DVD2 con una fracción de fármaco de MMAF conjugada a cada uno de los residuos de lisina reactivos a través de un conector irreversible.
En un aspecto, un inmunoconjugado incluye una molécula de inmunoglobulina farletuzumab FOLR1-h38C2-DVD1 con una fracción de fármaco de MMAF conjugada a cada uno de los residuos de lisina reactivos a través de un conector irreversible. En un aspecto, un inmunoconjugado incluye una molécula de inmunoglobulina farletuzumab FOLR1-h38C2-DVD2 con una fracción de fármaco de MMAF conjugada a cada uno de los residuos de lisina reactivos a través de un conector irreversible.
En un aspecto, un inmunoconjugado incluye una molécula de inmunoglobulina CD138-h38C2-DVD1 con una fracción de fármaco de MMAF conjugada a cada uno de los residuos de lisina reactivos a través de un conector irreversible.
En un aspecto, un inmunoconjugado incluye una molécula de inmunoglobulina CD138-h38C2-DVD2 con una fracción de fármaco de MMAF conjugada a cada uno de los residuos de lisina reactivos a través de un conector irreversible.
Aplicaciones de inmunoconjugados
Los inmunoconjugados pueden tener aplicaciones y métodos de uso preventivos, terapéuticos y de diagnóstico generalizados, que incluyen, pero no se limitan a, el tratamiento de varios cánceres y otras enfermedades al dirigir y matar células que expresan un antígeno tumoral particular. Los inmunoconjugados se pueden utilizar ampliamente para el tratamiento de cualquiera de una variedad de cánceres. Se anticipa que cualquier tipo de tumor y cualquier tipo de antígeno asociado a tumor pueden ser dirigidos por los inmunoconjugados en cuestión. Ejemplos de tipos de cáncer incluyen, sin limitación, cánceres hematológicos, carcinomas, sarcomas, melanoma y cánceres del sistema nervioso central.
Ejemplos no limitantes de cánceres hematológicos que se pueden tratar con los inmunoconjugados en cuestión incluyen leucemia, leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica crónica, linfoma, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, mieloma y síndrome mielodisplásico.
Ejemplos no limitantes de carcinomas que se pueden tratar con los inmunoconjugados en cuestión incluyen cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello, tiroides, pulmón, nasofaríngeo, colorrectal, de hígado, vejiga urinaria, ovario, cuello uterino, endometrial, próstata, gástrico, esofágico, pancreático, renal, y de mama.
Ejemplos no limitantes de sarcomas que se pueden tratar con los inmunoconjugados en cuestión incluyen angiosarcoma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, fibrosarcoma, tumor del estroma gastrointestinal, leiomiosarcoma, liposarcoma, tumor maligno de la vaina del nervio periférico, osteosarcoma, sarcoma pleomórfico, rabdomiosarcoma, sarcoma de Kaposi y sarcoma sinovial.
Ejemplos no limitantes de cánceres del sistema nervioso central que se pueden tratar con los inmunoconjugados en cuestión incluyen glioma, meningioma y neuroma.
Ejemplos no limitantes de otros cánceres que se pueden tratar con los inmunoconjugados en cuestión incluyen melanoma.
En algunos casos, los métodos de uso de los inmunoconjugados en cuestión implican administrar un inmunoconjugado a un sujeto, como se describió anteriormente, en conjunto con una o más terapias adicionales para tratar un cáncer particular. Como tal, un inmunoconjugado en cuestión se puede utilizar solo para tratar un cáncer particular, o alternativamente, se puede utilizar en combinación con o como un adjunto al tratamiento convencional con otros medicamentos, por ejemplo, agentes antineoplásicos. Se pueden utilizar generalmente los inmunoconjugados en combinación con cualesquier agentes antineoplásicos, tales como agentes quimioterapéuticos convencionales y/o experimentales, tratamientos de radiación, y similares.
Por ejemplo, en algunos aspectos, una terapia adicional puede incluir un anticuerpo, un agente antineoplásico, un agente citotóxico, un agente antiangiogénico, o un agente inmunosupresor. Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos adicionales incluyen cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo, ifosfamida, doxorrrubicina, daunorrubicina, valrubicina, idarrubicina, epirrubicina, actinomicina, bleomicina, plicamicina, mitomicina, bevacizumab, imatinib, erlotinib, gefitinib, ibrutinib, idelalisib, lenalidomida, vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, paclitaxel, y docetaxel.
Composiciones farmacéuticas de inmunoconjugados
Para usos terapéuticos, los inmunoconjugados se pueden formular en composiciones farmacéuticas. Una composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como apreciará el experto en la técnica, la ruta y/o el modo de administración variarán dependiendo de la enfermedad o afección diana y los resultados deseados. Para administrar un compuesto de la invención mediante ciertas rutas de administración, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o coadministrar el compuesto con, un material para prevenir su inactivación. Por ejemplo, se puede administrar un compuesto a un sujeto en un portador apropiado, por ejemplo, liposomas o un diluyente. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones tampón salinas y acuosas. Los portadores farmacéuticos incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica.
Las composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y/o agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede garantizarse tanto mediante procedimientos de esterilización como mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Además, se puede producir una absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tales como el monoestearato de aluminio y la gelatina.
Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de tratamiento en particular. administración, sin ser tóxico para el paciente. Un nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, la ruta de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se emplea, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, estado, salud general e historial médico previo del paciente que está siendo tratado, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
Una composición debe ser estéril y fluida en la medida en que pueda suministrarse mediante jeringa. Además de agua, el portador es preferiblemente una solución salina tamponada isotónica.
Aspectos de la invención incluyen un inmunoconjugado que tiene la fórmula Ig-(L-D)n, en la que: Ig es una molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, en la que la molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual comprende un primer dominio variable que se une a una diana de unión, y un segundo dominio variable que comprende un residuo reactivo; L es un conector que se conjuga covalentemente al residuo reactivo del segundo dominio variable de Ig; D es una fracción de fármaco; y n es un entero seleccionado de 1 a 12, tal como desde 1 a 11, desde 2 a 12, desde 3 a 10, desde 4 a 9, desde 5 a 8, desde 6 a 7, desde 1 a 3, desde 4 a 6, desde 7 a 9, o desde 10 a 12. En algunos aspectos, n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12. Aspectos adicionales de la invención incluyen un inmunoconjugado que tiene la fórmula Ig-(LD)n, en la que: Ig es una molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, en la que la molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual comprende un primer dominio variable que se une a una diana de unión, y un segundo dominio variable que comprende un residuo de lisina reactivo; L es un conector que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo del segundo dominio variable de Ig; D es una fracción de fármaco; y n es 1 o 2. En algunos aspectos, un primer dominio variable de Ig se posiciona más cerca a un terminal N que un segundo dominio variable. En algunos aspectos, la Ig puede ser una molécula de inmunoglobulina biespecífica. En algunos aspectos, D comprende 2 o más fracciones de fármaco diferentes. En algunos aspectos, un fragmento de unión a antígeno comprende un primer y segundo dominio variable de Ig, y se selecciona de un Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv. En algunos aspectos, Ig comprende una secuencia de inmunoglobulinas quimérica. En algunos aspectos, Ig comprende una secuencia de inmunoglobulinas humanizadas. En algunos aspectos, Ig comprende una secuencia de inmunoglobulinas humana. En algunos aspectos, un segundo dominio variable de Ig comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, un segundo dominio variable de Ig comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.
En algunos aspectos, una diana de unión es un antígeno de superficie de células de tumor. En algunos aspectos, un antígeno de superficie de células de tumor se selecciona de HER2, FOLR1 y CD138. En algunos aspectos, un primer dominio variable de Ig se une a HER2. En algunos aspectos, un primer dominio variable de Ig se une a FOLR1. En algunos aspectos, un primer dominio variable de Ig se une a CD138.
Aspectos de la invención incluyen un inmunoconjugado que tiene la fórmula Ig-(L-D)n, en la que: Ig es una molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, en la que la molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual comprende un primer dominio variable que se une a una diana de unión, y un segundo dominio variable que comprende un residuo de lisina reactivo; L es un conector que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo del segundo dominio variable de Ig; D es una fracción de fármaco; y n es un entero seleccionado de 1 a 12. Aspectos adicionales de la invención incluyen un inmunoconjugado que tiene la fórmula Ig-(L-D)n, en la que: Ig es una molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, en la que la molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual comprende un primer dominio variable que se une a una diana de unión, y un segundo dominio variable que comprende un residuo de lisina reactivo; L es un conector que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo del segundo dominio variable de Ig; D es una fracción de fármaco; y n es 1 o 2. En algunos aspectos, D es un agente citotóxico. En algunos aspectos, un agente citotóxico se selecciona de una toxina, un agente quimioterapéutico, un antibiótico, un isótopo radiactivo, un isótopo radiactivo quelado y una enzima nucleolítica. En algunos aspectos, D es una auristatina, una dolostatina o una cemadotina. En algunos aspectos, D es una MMAE o una MMAF. En algunos aspectos, D es una camptotecina. En algunos aspectos, una camptotecina es SN-38. En algunos aspectos, D es un maitansinoide. En algunos aspectos, un maitansinoide es DM1, DM3 o DM4. En algunos aspectos, D es una pirrolobenzodiazepina (PBD). En algunos aspectos, D es una enedina. En algunos aspectos, D es una caliqueamicina. En algunos aspectos, D es una tiancimicina. En algunos aspectos, D es una doxorrrubicina. En algunos aspectos, D es una MMDX. En algunos aspectos, D es un PNU-159682.
Aspectos de la invención incluyen un inmunoconjugado que tiene la fórmula Ig-(L-D)n, en la que: Ig es una molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, en la que la molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual comprende un primer dominio variable que se une a una diana de unión, y un segundo dominio variable que comprende un residuo reactivo; L es un conector que se conjuga covalentemente al residuo reactivo del segundo dominio variable de Ig; D es una fracción de fármaco; y n se selecciona de un entero desde 1 hasta 12.Aspectos adicionales de la invención incluyen un inmunoconjugado que tiene la fórmula Ig-(L-D)n, en la que: Ig es una molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, en la que la molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual comprende un primer dominio variable que se une a una diana de unión, y un segundo dominio variable que comprende un residuo de lisina reactivo; L es un conector que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo del segundo dominio variable de Ig; D es una fracción de fármaco; y n es 1 o 2. En algunos aspectos, L es un conector reversible. En algunos aspectos, L es un conector irreversible. En algunos aspectos, L es a conector escindible. En algunos aspectos, L es un conector no escindible. En algunos aspectos, L es a conector ramificado. En algunos aspectos, L es un conector lineal.
Aspectos de la invención incluyen composiciones farmacéuticas para el tratamiento de cáncer, en las que la composición farmacéutica comprende una cantidad efectiva de un inmunoconjugado y un portador farmacéuticamente aceptable.
Aspectos de la invención incluyen el uso de un inmunoconjugado en la preparación de un medicamento para tratar cáncer. En algunos aspectos, un cáncer es un cáncer hematológico, un carcinoma, un sarcoma, un melanoma, o un cáncer del sistema nervioso central. En algunos aspectos, un cáncer hematológico es una leucemia, linfoma, mieloma, o síndrome mielodisplásico. En algunos aspectos, una leucemia es una leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena crónica, o leucemia linfocítica crónica. En algunos aspectos, un linfoma es linfoma de Hodgkin o linfoma no Hodgkin. En algunos aspectos, un carcinoma es un cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello, tiroides, pulmón, nasofaríngeo, colorrectal, de hígado, vejiga urinaria, ovario, cuello uterino, endometrial, de próstata, gástrico, esofágico, pancreático, renal, o de mama. En algunos aspectos, un sarcoma es un angiosarcoma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, fibrosarcoma, tumor del estroma gastrointestinal, leiomiosarcoma, liposarcoma, tumor maligno de la vaina del nervio periférico, osteosarcoma, sarcoma pleomórfico, rabdomiosarcoma, sarcoma de Kaposi o sarcoma sinovial. En algunos aspectos, un cáncer del sistema nervioso central es un glioma, meningioma o neuroma.
En algunos aspectos, un medicamento adicional comprende una cantidad efectiva de un segundo agente terapéutico. En algunos aspectos, un segundo agente terapéutico es un anticuerpo, un agente antineoplásico, un agente citotóxico, un agente antiangiogénico, o un agente inmunosupresor. En algunos aspectos, un segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en: cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo, ifosfamida, doxorrrubicina, daunorrubicina, valrubicina, idarrubicina, epirrubicina, actinomicina, bleomicina, plicamicina, mitomicina, bevacizumab, imatinib, erlotinib, gefitinib, ibrutinib, idelalisib, lenalidomida, vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, paclitaxel, y docetaxel.
Aspectos de la invención incluyen un inmunoconjugado que tiene la fórmula Ig-(L-D)n, en la que: Ig comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 5 y 6 y la diana de unión del primer dominio variable es HER2; L es un conector irreversible, lineal que se conjuga covalentemente a un residuo de lisina reactivo de Ig; D es MMAF; y n es 2.
Aspectos de la invención incluyen un inmunoconjugado que tiene la fórmula Ig-(L-D)n, en la que: Ig comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 7 y 8 y la diana de unión del primer dominio variable es HER2; L es un conector irreversible, lineal que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo de Ig; D es MMAF; y n es 2.
Aspectos de la invención incluyen un inmunoconjugado que tiene la fórmula Ig-(L-D)n, en la que: Ig comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 9 y 10 y la diana de unión del primer dominio variable es FOLR1; L es un conector irreversible, lineal que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo de Ig; D es MMAF; y n es 2.
Aspectos de la invención incluyen un inmunoconjugado que tiene la fórmula Ig-(L-D)n, en la que: Ig comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 11 y 12 y la diana de unión del primer dominio variable es FOLR1; L es un conector irreversible, lineal que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo de Ig; D es MMAF; y n es 2.
Aspectos de la invención incluyen un inmunoconjugado que tiene la fórmula Ig-(L-D)n, en la que: Ig comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 13 y 14 y la diana de unión del primer dominio variable es FOLR1; L es un conector irreversible, lineal que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo de Ig; D es MMAF; y n es 2.
Aspectos de la invención incluyen un inmunoconjugado que tiene la fórmula Ig-(L-D)n, en la que: Ig comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 15 y 16 y la diana de unión del primer dominio variable es FOLR1; L es un conector irreversible, lineal que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo de Ig; D es MMAF; y n es 2.
Aspectos de la invención incluyen un inmunoconjugado que tiene la fórmula Ig-(L-D)n, en la que: Ig comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 17 y 18 y la diana de unión del primer dominio variable es CD138; L es un conector irreversible, lineal que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo de Ig; D es MMAF; y n es 2.
Aspectos de la invención incluyen un inmunoconjugado que tiene la fórmula Ig-(L-D)n, en la que: Ig comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 19 y 20 y la diana de unión del primer dominio variable es CD138; L es un conector irreversible, lineal que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo de Ig; D es MMAF; y n es 2.
En algunos aspectos, una inmunoglobulina se compone de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. En un aspecto, una cadena ligera de inmunoglobulina comprende una cadena ligera kappa. En un aspecto, una cadena ligera de inmunoglobulina comprende una cadena ligera lambda. En un aspecto, una inmunoglobulina es una inmunoglobulina IgA, que tiene una cadena pesada a. En un aspecto, una inmunoglobulina es una inmunoglobulina IgAl. En un aspecto, una inmunoglobulina es una inmunoglobulina IgA2. En un aspecto, una inmunoglobulina es una inmunoglobulina IgD, que tiene una cadena pesada 8. En un aspecto, una inmunoglobulina es una inmunoglobulina IgE, que tiene una cadena pesada £. En un aspecto, una inmunoglobulina es una inmunoglobulina IgG, que tiene una cadena pesada y. En un aspecto, una inmunoglobulina es una inmunoglobulina IgG1. En un aspecto, una inmunoglobulina es una inmunoglobulina IgG2. En un aspecto, una inmunoglobulina es una inmunoglobulina IgG3. En un aspecto, una inmunoglobulina es una inmunoglobulina IgG4. En un aspecto, una inmunoglobulina es una inmunoglobulina IgM, que tiene una p cadena pesada.
En un aspecto, una inmunoglobulina comprende al menos una región variable. En un aspecto, una inmunoglobulina es una inmunoglobulina intacta. En un aspecto, una inmunoglobulina es una inmunoglobulina desnuda. En un aspecto, una inmunoglobulina es un fragmento de inmunoglobulina. En un aspecto, un fragmento de inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste en: Fab, Fab', F(ab')2, Fv y scFv.
En algunos aspectos, una inmunoglobulina es una inmunoglobulina de dominio variable dual. En algunos aspectos, una inmunoglobulina comprende una secuencia de polipéptidos nativa. En algunos aspectos, una inmunoglobulina comprende una secuencia de polipéptidos no nativa. En algunos aspectos, una inmunoglobulina comprende un polipéptido. En algunos aspectos, una inmunoglobulina es una inmunoglobulina monoclonal. En algunos aspectos, una inmunoglobulina comprende una inmunoglobulina quimérica. En algunos aspectos, una inmunoglobulina comprende una inmunoglobulina humanizada. En algunos aspectos, una inmunoglobulina comprende una inmunoglobulina humana. En algunos aspectos, una inmunoglobulina es una inmunoglobulina aislada. En algunos aspectos, una inmunoglobulina comprende una secuencia de polipéptidos que es una fusión de dos o más secuencias de polipéptidos. En algunos aspectos, una inmunoglobulina es una inmunoglobulina conjugada.
En algunos aspectos, la inmunoglobulina se une específicamente a o es específica para una diana de unión. En algunos aspectos, una inmunoglobulina tiene una afinidad de unión. En algunos aspectos, una inmunoglobulina tiene un valor Kd. En algunos aspectos, una inmunoglobulina se une a un epítopo. En algunos aspectos, una inmunoglobulina se une a una diana o diana de unión. En algunos aspectos, una diana de unión comprende una región de unión, a la que se une una inmunoglobulina. En algunos aspectos, una inmunoglobulina se une a un antígeno. En algunos aspectos, una inmunoglobulina comprende un sitio de unión a antígeno o región de unión a antígeno.
En algunos aspectos, una inmunoglobulina se produce en una célula anfitriona. En algunos aspectos, una inmunoglobulina se produce por una estirpe celular o un cultivo celular. En algunos aspectos, una inmunoglobulina se produce a partir de una secuencia de ácidos nucleicos que está operativamente conectada a otra secuencia de ácidos nucleicos.
En algunos aspectos, una secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina tiene un porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos con otra secuencia de aminoácidos.
En algunos aspectos, un inmunoconjugado se utiliza para tratamiento de un sujeto o mamífero.
Los siguientes ejemplos, secuencias y figuras se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención, cuyo verdadero alcance se establece en las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Ejemplo 1: Síntesis química de p-lactama-Cit-Val-MMAF
Se hacen referencias a compuestos químicos marcados 1-6 en la FIG. 11. A 332 mg del Compuesto 1 (Gervay-Hague, J. et al. JACS. 2011, 133(10), 3230-3233) se agregan 107 mg de NHS (1 eq) y 3 ml de THF seco. La reacción se enfría a 0 °C, luego se agregan 0.143 ml (1 eq) de DIC. La reacción se calienta a temperatura ambiente durante 24 h, se filtra a través de celita y el solvente se elimina al vacío. Se agregan 350 mg (1 eq) de Val-Cit-PAB (Trail, P.A. et al. Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869), luego se agregan 5.6 ml de DMF seca y la reacción se agita durante 16 h.
La formación de producto se confirma después de 16 horas mediante LC/MS. El solvente se elimina al vacío y el material bruto se tritura con CH2Ch, luego se filtra y se enjuaga con hexanos. El sólido marrón crudo se purifica mediante cromatografía en columna (CH2Ch: MeOH 9:1, Rf = 0.2) (rendimiento del 61 %).
Se combinan 312 mg de compuesto 2, 505 mg de bis-nitrocarbonato (3 eq), 0.193 ml de DIPEA (2 eq) y 7 ml de DMF seca y se agita durante 16 h. El solvente se elimina al vacío y el material bruto se purifica mediante HPLC de fase inversa. (Rendimiento del 35 %).
Se combinan 38 mg del compuesto 3.22 mg del compuesto 4 (Barbas, CF et al. ACS Med. Chem. Lett., 2014, 5(2), 133-137), 6 mg de CuSO45H2O, 0.5 ml de DMF y 0.25 ml de H2O y se desgasifica durante 30 min. A continuación, se agregan 12 pl de ascorbato de sodio 1 M y la reacción se agita durante 1.5 h, luego se purifica mediante HPLC de fase inversa. (Rendimiento del 60 %).
Se combinan 2.0 mg de MMAF, 4.8 mg del compuesto 5 (1.5 eq), 0.2 mg de Oxima (0.5 eq), 0.77 pl de DIPEA (1,6 eq) y 70 pl de DMF seca en un vial de microondas secado a la llama. Después de 72 h, se agregan 0.2 mg adicionales de Oxima (0.5 eq) y 0.48 pl de DIPEA (1 eq). 24 h después, la reacción se purifica mediante HPLC de fase inversa para obtener 1.9 mg del compuesto 6 (Rendimiento del 40 %).
Ejemplo 2: Síntesis química de p-lactama-conector PEG-MMAF
Se hacen referencias a compuestos químicos marcados 1-5 en la FIG. 12. Se disuelven 332 mg del compuesto 1 (Okoth, R. et al. J. Org. Chem., 2013, 9, 608-612) en 1.6 ml de MeCN. Se disuelven 173 mg de anhídrido glutárico (1 eq) en 1 ml de MeCN y se agregan al compuesto 1 durante 30 min. 18 h más tarde, el solvente se elimina al vacío. El producto bruto se disuelve en CH2Ch y se purifica mediante cromatografía en columna (95:5, CH2Ch: MeOH) (Rendimiento del 88 %).
Se combinan 18 mg del compuesto 2, 22 mg del compuesto 3 (Barbas, C,F. et al. ACS Med. Chem. Lett., 2014, 5(2), 133-137), 6 mg de CuSO45H2O (0.5 eq), 0.25 ml de DMF y 0.25 ml de H2O y se desgasifica durante 30 min. A continuación, se agregan 12 pl de ascorbato de sodio 1 M y la reacción se agita durante 1.5 h, luego se purifica mediante HPLC de fase inversa. (Rendimiento del 43 %).
Se combinan 3 mg del compuesto 4, 7 mg de tamices moleculares de 4Á, 1.5 mg de HATU (1 eq), 1.5 pl de DIPEA (2 eq) y 33 pl de DMF seca en un vial secado a la llama. Después de 1 hora, se agregan 1.4 mg de MMAF con 40 pl de DMF seco. Después de 1.5 h, se purificó utilizando HPLC de fase inversa para obtener el compuesto 5 (Rendimiento del 82 %).
Ejemplo 3: Síntesis química en fase sólida de p-lactama- conector de hidrocarburo -MMAF
Se hacen referencias a compuestos químicos marcados 1-7 en la FIG. 44. Se agrega Fmoc-Phe-OH (15 eq) disuelto en 4 ml de CH2Ch seco y 0.5 ml de DIPEA a la resina de clorotritilo previamente hinchada. La mezcla se agita durante 4 h, luego se elimina el solvente y se agita con MeOH durante 20 min para obtener la resina 1. La mezcla luego se desprotege con piperidina al 20 % en DMF (2 ml x 20 min x 2 veces), se lava con DMF y se agitado con una solución recién preparada de Fmoc-Dap-OH (3 equiv.), HATU (3 equiv.) y DIPEA (10 equiv.) en DMF (1.5 ml) a temperatura ambiente (durante la noche), luego se escurre y lava con DMF para obtener resina 2. A continuación, la mezcla se desprotege con Fmoc con piperidina al 20% en DMF (2 m lx 20 m inx 2 veces), se agita con una solución recién preparada de Fmoc-Dil-OH (2.5 equiv.), HATU (2.5 equiv.) y DIPEA (5 equiv.) en DMF (2.5 ml) a temperatura ambiente (durante la noche) y se lava con DMF para obtener la resina 3. La resina no funcionalizada se recubre con una solución de anhídrido acético (10:10:80 v/v de Ac2O:DIEA:DMF) a temperatura ambiente (30 min). La resina 3 se desprotege con Fmoc con piperidina al 20 % en DMF (2 ml x 20 min x 2 veces), se agita con una solución recién preparada de Fmoc-Val-OH (6.0 equiv.), HATU (6.0 equiv.) Y DIEA (12 equiv.) En DMF (4,2 ml) a temperatura ambiente (durante la noche) y luego se lava con DMF. La resina no funcionalizada luego se protege con una solución de anhídrido acético (10:10:80 v/v de Ac2O:DIPEA:DMF) a temperatura ambiente (30 min) y se lava con DMF para obtener la resina 4. La resina 4 se desprotege con Fmoc con piperidina al 20 % en DMF (2 ml x 20 min x 2 veces), se agita con una solución recién preparada de Fmoc-N-metil-Val-OH (5 equiv), HATU (5 eq), DIPEA (10 equiv) en DMF (4.2 ml) a temperatura ambiente (3 h), luego se lava con DMF. La resina no funcionalizada luego se protege con una solución de anhídrido acético (10:10:80 v/v de Ac2O:DIPEA:DMF) a temperatura ambiente (30 min) y se lava con DMF para obtener la resina 5. La resina 5 se desprotege con Fmoc con piperidina al 20 % en DMF (2 ml x 20 min x 2 veces), se agita con una solución recién preparada de ácido Fmoc-caproico (6 equiv), HATU (6 equiv) y DIEA (12 eq) en DMF (2.5 ml) a temperatura ambiente (durante la noche) y luego se lava con DMF. A continuación, la resina no funcionalizada se protege con una solución de anhídrido acético (10:10:80 v/v de Ac2O:DIPEA:DMF) a temperatura ambiente (30 min) y se lava con DMF para obtener la resina 6. La resina 6 se desprotege con Fmoc con piperidina al 20 % en DMF (2 ml x 20 min x 2 veces), se lava con DMF y luego se agita con una solución recién preparada de éster de p-lactama pfp (Magano, J. Org. Process Res. Dev., 2014, 18(1), 142-151) (3 equiv.) y DIPEA (3 equiv.) En DMF (1.5 ml) a temperatura ambiente (1 h). A continuación, la resina se lava, secuencialmente, con DMF y DCM. A continuación, la resina se trata con una solución diluida de AcOH (1:1:8 v/v de AcOH:TFE:DCM; 2.5 m lx 30 m in x2 veces) para escindir el producto peptídico, se concentra al vacío y se purifica utilizando HPLC de fase inversa, dando el compuesto 7.
Ejemplo 4: Clonación, expresión y purificación de HER2-h38C2-DVD1 y DVD2
El ADN que fusiona la secuencia de dominio variable de anti-HER2 con la secuencia de dominio variable de h38C2 se sintetiza de forma personalizada como Fragmentos Génicos gBlocks (Integrated DNA Technologies) o se prepara mediante PCR. Dos versiones con diferentes secuencias conectoras de péptidos (ASTKGP (SEQ ID NO: 1) para DVD1 o TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 2) para DVD2) separan las secuencias de dominio variable. Todos los anticuerpos utilizan dominios constantes de IgG1 humana. El ADN se amplifica mediante PCR y se clona en pCEP4 (Invitrogen) con ligación NheI/XhoI. El ADN se verifica mediante secuenciación de ADN y todos los plásmidos se purifican con el kit QIAGEN Plasmid Maxi para transfecciones.
Se mantienen células 293 de riñón embrionario humano (HEK) (ATCC) en DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco con GlutaMAX; Life Technologies) que contiene 10 % (v/v) de Suero Bovino Fetal (FBS; Life Technologies) y 1 % (v/v) de Penicilina Estreptomicina (Pen Strep; Life Technologies) en una atmósfera humidificada de CO2 al 5 % a 37 °C. Los vectores de expresión de células de mamífero descritos anteriormente se transfectan transitoriamente en células HEK 293 utilizando polietilenimina (PEI; Polysciences). Después de 12-16 h de transfecciones, el medio se reemplaza con DMEM reciente sin FBS. Los sobrenadantes del cultivo se recolectan los días 3, 6 y 9 después de las transfecciones y se filtran utilizando unidades de filtro Stericup de 0.45 pm (Millipore). Los sobrenadantes se cargan en una columna de Proteína A recombinante de 1 ml (HiTrap; GE Healthcare) conectada a un sistema ÁKTApurifier (GE Healthcare). Se utiliza PBS para el equilibrio y lavado de la columna, ácido acético 0.5 M (pH 3.0) para la elución y Tris-HCl 1 M (pH 8.0) para la neutralización inmediata. El eluido neutralizado se intercambia con tampón en PBS y se concentra simultáneamente utilizando dispositivos de filtro centrífugo de corte de 30 kDa (Millipore). Se determina que todas las inmunoglobulinas tienen una pureza > 95 % mediante SDS-PAGE.
Ejemplo 5: Clonación, expresión y purificación de FOLR1-h38C2-DVD1 y DVD2
El ADN que fusiona la secuencia del dominio variable de anti-FOLR1 con la secuencia del dominio variable de h38C2 se sintetiza de forma personalizada como Fragmentos Génicos gBlocks (Integrated DNA Technologies) o se prepara mediante PCR. Dos versiones con diferentes secuencias conectoras de péptidos (ASTKGP (SEQ ID NO: 1) para DVD1 0 TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 2) para DVD2) separan las secuencias de dominio variable. Todos los anticuerpos utilizan dominios constantes de IgG1 humana. El ADN se amplifica mediante PCR y se clona en pCEP4 (Invitrogen) con ligación NheI/XhoI. El ADN se verifica mediante secuenciación de ADN y todos los plásmidos se purifican con el kit QIAGEN Plasmid Maxi para transfecciones.
Se mantienen células 293 de riñón embrionario humano (HEK) (ATCC) en DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco con GlutaMAX; Life Technologies) que contiene 10 % (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Life Technologies) y 1 % (v/v) de Penicilina Estreptomicina (Pen Strep; Life Technologies) en una atmósfera humidificada de CO2 al 5 % a 37 °C. Los vectores de expresión de células de mamífero descritos anteriormente se transfectan transitoriamente en células HEK 293 utilizando polietilenimina (PEI; Polysciences). Después de 12-16 h de transfecciones, el medio se reemplaza con DMEM reciente sin FBS. Los sobrenadantes del cultivo se recolectan los días 3, 6 y 9 después de las transfecciones y se filtran utilizando unidades de filtro Stericup de 0.45 pm (Millipore). Los sobrenadantes se cargan en una columna de Proteína A recombinante de 1 ml (HiTrap; GE Healthcare) conectada a un sistema ÁKTApurifier (GE Healthcare). Se utiliza PBS para el equilibrio y lavado de la columna, ácido acético 0.5 M (pH 3.0) para la elución y Tris-HCl 1 M (pH 8.0) para la neutralización inmediata. El eluido neutralizado se intercambia con tampón en PBS y se concentra simultáneamente utilizando dispositivos de filtro centrífugo de corte de 30 kDa (Millipore). Se determina que todas las inmunoglobulinas tienen una pureza > 95 % mediante SDS-PAGE.
Ejemplo 6: Clonación, expresión y purificación de CD138-h38C2-DVD1 y DVD2
El ADN que fusiona la secuencia de dominio variable de anti-CD138 con la secuencia de dominio variable de h38C2 se sintetiza de forma personalizada como Fragmentos Génicos gBlocks (Integrated DNA Technologies) o se prepara mediante PCR. Dos versiones con diferentes secuencias conectoras de péptidos (ASTKGP (SEQ ID NO: 1) para DVD1 0 TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 2) para DVD2) separan las secuencias de dominio variable. Todos los anticuerpos utilizan dominios constantes de IgG1 humana. El ADN se amplifica mediante PCR y se clona en pCEP4 (Invitrogen) con ligación NheI/XhoI. El ADN se verifica mediante secuenciación de ADN y todos los plásmidos se purifican con el kit QIAGEN Plasmid Maxi para transfecciones.
Se mantienen células 293 de riñón embrionario humano (HEK) (ATCC) en DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco con GlutaMAX; Life Technologies) que contiene 10 % (v/v) de suero bovino fetal (FBS; Life Technologies) y 1 % (v/v) de Penicilina Estreptomicina (Pen Strep; Life Technologies) en una atmósfera humidificada de CO2 al 5 % a 37 °C. Los vectores de expresión de células de mamífero descritos anteriormente se transfectan transitoriamente en células HEK 293 utilizando polietilenimina (PEI; Polysciences). Después de 12-16 h de transfecciones, el medio se reemplaza con DMEM reciente sin FBS. Los sobrenadantes del cultivo se recolectan los días 3, 6 y 9 después de las transfecciones y se filtran utilizando unidades de filtro Stericup de 0.45 pm (Millipore). Los sobrenadantes se cargan en una columna de Proteína A recombinante de 1 ml (HiTrap; GE Healthcare) conectada a un sistema ÁKTApurifier (GE Healthcare). Se utiliza PBS para el equilibrio y lavado de la columna, ácido acético 0.5 M (pH 3.0) para la elución y Tris-HCl 1 M (pH 8.0) para la neutralización inmediata. El eluido neutralizado se intercambia con tampón en PBS y se concentra simultáneamente utilizando dispositivos de filtro centrífugo de corte de 30 kDa (Millipore). Se determina que todas las inmunoglobulinas tienen una pureza > 95 % mediante SDS-PAGE.
Ejemplo 7: Conjugación de p-lactama-MMAF a inmunoglobulina DVD
A 300 |jg de inmunoglobulina de dominio variable dual que comprende dominios variables h38C2 (cada uno con una única lisina únicamente reactiva) en 270 j l de PBS agregue 1.2 j l de DMSO, agregue 1.5 j l (solución madre 10 mM en DMSO, 10 eq) de p-lactama-MMAF y centrifugue, luego incube a temperatura ambiente por 2 h. Cargue la solución de conjugado anticuerpo-fármaco en una columna Sephadex preempaquetada G-25 (GE Healthcare) que está equilibrada con PBS. Eluya el conjugado anticuerpo-fármaco utilizando Pb S.
Ejemplo 8: Análisis de unión de inmunoconjugado anti-HER2 a células HER+ y HER'
Como se representa en la FIG. 17, las estirpes celulares de cáncer de mama humano SK-BR-3 y MDA-MB-468 se adquieren de ATCC. Ambas estirpes celulares se mantienen a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 % humidificada en DMEM completado con FBS al 10% y Pen Strep al 1%. Las células se recolectan utilizando TrypLE (Life Technologies) y se transfieren a una placa de microtitulación de 96 pozos en forma de V y se lavan con 200 j l de tampón FAc S (FBS al 1 % en PBS). Se agrega 1 jg de DVD en 100 j l de PBS a cada pozo y se incuba durante 30 min sobre hielo. Las células se lavan con 200 j l de tampón FACS y luego se tiñen con Fcg antihumano de cabra conjugado con 647 (Jackson ImmunoResearch) (10 jl, diluido 1:100 en Tampón FAC) sobre hielo durante 20 min. Las células se lavan con 200 j l de tampón FACS (x2), se resuspenden en 200 ml de tampón FACS y se mide la fluorescencia mediante citometría de flujo (BD Facs Canto II). Los datos se analizan utilizando el software FlowJo (Tree Star, Inc.).
Ejemplo 9: Ensayos de citotoxicidad con inmunoconjugados anti-HER2
Las estirpes celulares de cáncer de mama humano SK-BR-3 y MDA-MB-468 se mantienen a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5 % en DMEM completado con FBS al 10 % y Pen Strip al 1 %. Las células se recolectan utilizando TrypLE (Life Technologies) y se transfieren a una placa de cultivo de tejidos de 96 pozos de fondo plano (5000 células/pozo) 24 horas antes del tratamiento. Se preparan diluciones en serie en DMEM completado con FBS al 10 % y Pen Strep al 1 %. Se retira el medio celular original y se agregan 100 j l de solución de tratamiento (realizado por triplicado) y la placa de cultivo se mantiene a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5 % durante 72 h. Se agregan 20 j l de CellTiter 96® Aqueous One Solution (Promega) a cada pozo y la placa se revela a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5 %. A continuación, las células se ponen en contacto con un inmunoconjugado o con una de varias composiciones de control.
Con referencia a los gráficos representados en la FIG. 18, DVD1 se refiere a la inmunoglobulina HER2-h38C2-DVD1 desnuda (es decir, sin una composición de conector/fracción de fármaco conjugada a la misma); ADC DVD1 se refiere a la inmunoglobulina DVD1 con un p-lactama- conector de hidrocarburo -MMAF unido a la misma; trast se refiere a un anticuerpo anti-HER2 desnudo (trastuzumab); trast pro se refiere al anticuerpo anti-HER2 desnudo que se ha mezclado con una composición de p-lactama- conector de hidrocarburo -MMAF; h38C2 pro se refiere a un anticuerpo h38C2 que se ha conjugado con una composición de p-lactama- conector de hidrocarburo-MMAF pero no incluye un dominio de unión a la región variable de HER2; y fármaco libre se refiere a la composición de p-lactama-conector de hidrocarburo-MMAF.
Con referencia a los gráficos representados en la FIG. 19, h38C2 pro se refiere a un anticuerpo h38C2 que se ha conjugado con una composición de p-lactama-conector de hidrocarburo-MMAF pero no incluye un dominio de unión a la región variable de HER2; trast pro se refiere al anticuerpo anti-HER2 desnudo que se ha mezclado con una composición de p-lactama-conector de hidrocarburo-MMAF; trast se refiere a un anticuerpo anti-HER2 desnudo (trastuzumab); DVD1 se refiere a la inmunoglobulina h38C2-DVD1 de conector de péptido corto de HER2 desnuda (es decir, sin una composición de conector/fracción de fármaco conjugada a la misma); DVD2 se refiere a la inmunoglobulina h38C2-DVD2 de conector de péptido largo de HER2 desnuda (es decir, sin una composición de conector/fracción de fármaco conjugada a la misma); ADC DVD1 se refiere a la inmunoglobulina DVD1 con un plactama-conector de hidrocarburo-MMAF unido a la misma; y ADC DVD2 se refiere a la inmunoglobulina DVD2 con un p-lactama-conector de hidrocarburo-MMAF unido a la misma.
Con referencia a los gráficos representados en la FIG. 20, DVD1 se refiere a la inmunoglobulina h38C2-DVD1 de conector de péptido corto HER2 desnuda (es decir, sin una composición de conector/fracción de fármaco conjugada a la misma); DVD2 se refiere a la inmunoglobulina h38C2-DVD2 de conector de péptido largo HER2 desnuda (es decir, sin una composición de conector/fracción de fármaco conjugada a la misma); ADC DVD1 se refiere a la inmunoglobulina DVD1 con un p-lactama-conector de hidrocarburo-MMAF unido a la misma; ADC DVD2 se refiere a la inmunoglobulina DVD2 con un p-lactama-conector de hidrocarburo-MMAF unido a la misma; trast se refiere a un anticuerpo anti-HER2 desnudo (trastuzumab); ADC trast se refiere al anticuerpo anti-HER2 desnudo que se ha mezclado con una composición de p-lactama-conector de hidrocarburo-MMAF; y ADC h38C2 se refiere a un anticuerpo h38C2 que se ha conjugado con una composición de p-lactama-conector de hidrocarburo-MMAF pero no incluye un dominio de unión de región variable de HER2.
La citotoxicidad se evalúa en base a la fluorescencia utilizando un lector de placas (Spectramax M5) a 490 nM. Los resultados se proporcionan en los gráficos de la FIG. 18, FIG. 19 y FIG. 20.
Ejemplo 10: Análisis de peso molecular de composiciones de DVD
La pureza de las composiciones de DVD se confirmó utilizando SDS-PAGE teñida con Coomassie bajo condiciones reductoras (tamaño = 200 kDa) y no reductoras (cadena pesada = 70 kDa, cadena ligera = 40 kDa) tanto para DVD1 como para DVD2. Los resultados se proporcionan en la FIG. 21 y FIG. 25.
Ejemplo 11: Unión selectiva de composiciones de DVD demostrada por citometría de flujo
Se incubaron DVD1 y DVD2 con SKBR3 (HER2+) o MDA-MB-468 (HER2-) durante 30 min sobre hielo y después se tiñeron con antihumano de cabra F(ab')2 conjugado con AlexaFluor 647 (Jackson ImmunoResearch). Los resultados se proporcionan en la FIG. 22. Los resultados demuestran que las composiciones de DVD1 y DVD2 se unen selectivamente a células SKBR3 (HER+).
Para examinar la unión no específica de p-lactama biotina, se incubaron DVD1 y DVD2 con 3 eq de p-lactama biotina (denominado “Compuesto” en las figuras) a temperatura ambiente durante 2 horas, luego se incubaron con SKBR3. (HER2+) o MDA-MB-468 (HER2-) durante 30 min sobre hielo y se tiñeron con Estreptavidina conjugada con PE (BioLegend). Los resultados se proporcionan en la FIG. 23. Los resultados demuestran que las composiciones de DVD1 y DVD2 se unieron selectivamente a las células SKBR3 (HER+), mientras que el compuesto de p-lactama biotina no se unió a las células HER2+ de una manera no específica.
Ejemplo 12: Citotoxicidad de ADC contra células SKBR3 (HER2+), BT474 (HER2+), KPL4 (HER2+), DYT2 (HER2+) y MDA-MB-468 (HER2-)
Los tipos de células indicados se sembraron en placas de 96 pozos a 5 x 103 células por pozo. Se dejó que las células se adhirieran durante la noche. Se agregaron diluciones en serie de ADC a las células en concentraciones que variaban entre 0 y 10 nM. Después de incubación durante 72 h, se midió la viabilidad celular utilizando el Ensayo de Proliferación Celular CellTiter 96 AQueous One Solution (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. La viabilidad celular se calculó como porcentaje de células no tratadas (= 100 %). Los resultados se proporcionan en la FIG. 24 y FIG. 29. Los resultados demuestran que los ADC tenían actividad citotóxica contra las células HER2+.
Ejemplo 13: Citotoxicidad de ADC contra células IGROV1 (FOLR1+) y H929 (CD138+)
Las estirpes celulares de cáncer humano IGROV1 (FOLR1+) y H929 (CD138+) se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 % humidificada en DMEM o RPMI completada con FBS al 10 % y Strep Pen al 1 %. Las células IGROV se recolectaron utilizando TrypLE (Life Technologies) y se transfirieron a una placa de cultivo de tejido de 96 pozos de fondo plano (5000 células/pozo) 24 h antes del tratamiento. Las células H929 se trataron inmediatamente. Se prepararon diluciones en serie en DMEM o RPMI completadas con FBS al 10 % y Pen Strep al 1 %. Para las células IGROV1, se eliminó el medio celular original y se agregaron 100 pl de solución de tratamiento (realizado por triplicado) y la placa de cultivo se mantuvo a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 % humidificada durante 72 h. Para H929 se agregaron 100 pl de solución de tratamiento. A continuación, las células se pusieron en contacto con un inmunoconjugado o con una de varias composiciones de control. Se agregaron 20 pl de CellTiter 96® Aqueous One Solution (Promega) a cada pozo y la placa se desarrolló a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5 %. Los resultados se proporcionan en la FIG. 26 y FIG. 27. Los resultados demuestran que los inmunoconjugados tenían actividad citotóxica contra los tipos de células diana.
Ejemplo 14: Actividad catalítica de composiciones de DVD
Se dispensaron 98 pl de anticuerpo (1 mM en PBS) en una placa de 96 pozos. A continuación, se agregaron 2 pl de Methodol (10 mM en EtOH) y se registró la excitación (Aext = 330 nM) y la emisión (Aem = 452 nM) cada 5 min utilizando un espectrofluorómetro. A 548 pl de DVD1 (10.33 mg/ml, 51.7 pM) se agregaron 11.3 pl (10 mM en DMSO) de plactama MMAF (4 eq con respecto al anticuerpo). La solución se agitó con vórtex, se incubó a temperatura ambiente durante 4 horas y se purificó utilizando una columna de desalación PD-10 (GE Healthcare). Los conjugados en PBS se almacenaron a 4 °C para uso a corto plazo y a -80 °C en alícuotas para uso a largo plazo. Las concentraciones de anticuerpos se determinaron en base a la absorbancia a 280 nM. Se utilizó h38C2 IgG1 como control positivo utilizando las mismas condiciones de conjugación. La actividad catalítica se evaluó utilizando un ensayo conocido, como se describe en Sinha, SC. Nature Protocols 2, 449 - 456 (2007). Se utilizaron DVD1 no conjugado y h38C2 IgG1 como controles positivos. Se utilizó trastuzumab IgG1 como control negativo. Las ilustraciones esquemáticas de varias composiciones de DVD se proporcionan en la FIG. 34. Los resultados del ensayo de actividad catalítica se proporcionan en la FIG. 28, FIG. 32 y FIG. 35. Los resultados demuestran que la actividad catalítica de cada composición se correlaciona con el número de residuos de lisina reactiva disponibles. Por ejemplo, como se proporciona en la FIG. 35, h38C2-IgG1 (que tiene 2 dominios variables que contienen cada uno 1 residuo de lisina reactivo) exhibió aproximadamente el doble de actividad catalítica de DVD1-Fab (que tiene 1 dominio variable que contiene 1 residuo de lisina reactivo). La actividad catalítica de ciertas composiciones (por ejemplo, las composiciones en formato scFv y DART, que como se muestra en la Figura 34) mostró una actividad catalítica disminuida en comparación con Fab, scFab, IgG y sus correspondientes composiciones en formato DVD. Las composiciones que no tienen residuos de lisina reactivos (por ejemplo, Trastuzumab) no mostraron actividad catalítica.
Ejemplo 15: Análisis por espectroscopia de masas de composiciones de DVD
El DVD1 no conjugado y el Conjugado Anticuerpo-Fármaco (ADC) se desglicosilaron utilizando PNGasa F (New England Biolabs) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se redujeron utilizando DTT (la concentración final fue DTT 50 mM) y se analizaron utilizando Espectrometría de Masas MALDI-TOF. La masa de la cadena pesada de ADC se correspondía con 1 fármaco por cadena pesada, lo que demuestra la conjugación precisa de un número definido de moléculas de fármaco por DVD. Los resultados se proporcionan en la FIG. 33.
Ejemplo 16: Citotoxicidad in vivo de composiciones de DVD
Se inocularon células KPL-4 (HER2+) en una mezcla 1:1 de PBS y BD Matrigel (BD Bioscience) por vía subcutánea en la almohadilla de grasa mamaria de ratones NSG hembra de 7 semanas (Laboratorio Jackson) (5 x 106 por ratón). Cuando los tumores alcanzaron ~200 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a 7 grupos de 2 ratones cada uno y se trataron con ADC anti-HER2 DVD1 a 2.5, 5.0, 10 o 20 mg/kg, o con anti-HER2 DVD1 no conjugado a 10 mgkg, o con vehículo (PBS) solo, o con ado-trastuzumab emtansina biosimilar (Levena Biopharma) a 10 mg/kg mediante inyección i.v. (vena de la cola) cada 4 días por un total de 4 ciclos (* Nota: el grupo de ADC de 20 mg/kg fue de solo 1 ciclo). Los ratones se dosificaron previamente con 250 pl de suero de rata estéril 1 día antes de 2/4 inyecciones. El tamaño del tumor se controló cada 4 días mediante una medición con calibrador. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales del Instituto de Investigación Scripps y se realizaron de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los resultados se proporcionan en la FIG. 30. Los resultados demuestran que los ADC pudieron reducir el volumen del tumor en comparación con el control del vehículo (por ejemplo, PBS).
Se inocularon células KPL-4 (HER2+) en una mezcla 1:1 de PBS y BD Matrigel (BD Bioscience) por vía subcutánea en la almohadilla de grasa mamaria de ratones NSG hembra de 7 semanas (Laboratorio Jackson) (6 x 106 por ratón). Cuando los tumores alcanzaron ~200 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a 5 grupos de 7 u 8 ratones cada uno y se trataron con ADC anti-HER2 DVD1 a 5 o 10 mg/kg, o con anti-HER2 DVD1 no conjugado a 10 mg/kg, o con vehículo (PBS) solo, o con biosimilar de adotrastuzumab emtansina (Levena Biopharma) a 5 mg/kg mediante inyección i.v. (vena de la cola) cada 7 días durante un total de 4 ciclos. Los ratones se dosificaron previamente con 250 pl de suero humano estéril (Sigma Aldrich) 1 día antes de cada inyección. El tamaño del tumor se controló cada 4 días mediante una medición con calibrador. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales del Instituto de Investigación Scripps y se realizaron de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los resultados se proporcionan en la FIG. 31. Los resultados demuestran que los ADC fueron capaces de reducir el volumen del tumor en comparación con el control del vehículo (por ejemplo, PBS).
Ejemplo 17: Clonación, expresión, purificación, actividad catalítica y citotoxicidad de DVD1-Fab
Se clonaron fragmentos de PCR en el vector de expresión de mamífero pCEP4 (Invitrogen) mediante ligación Nhe1-HF/Xho1. La cadena pesada contenía el primer dominio constante de IgG1 humana (CH1) en el terminal C. La cadena ligera contenía el primer dominio constante de C kappa (Ck) humana en el terminal C. Los vectores de expresión de células de mamífero se cotransfectaron transitoriamente (cadena ligera y pesada) en células 293 de Riñón Embrionario Humano (HEK) (Life Technologies) con polietilenimina (PEI). La composición de DVD1-Fab se purificó utilizando una columna HiTrap Proteína A HP (GE Healthcare). Los rendimientos típicos fueron de 10 mg/L. Se utilizó SDS-PAGE para confirmar la pureza y se evaluó la actividad catalítica como se describe en el Ejemplo 14. Se utilizó h38C2 IgG1 como control positivo y trastuzumab IgG1 como control negativo. La citotoxicidad se evaluó como se describe en el Ejemplo 12. Los resultados se proporcionan en la FIG. 32. Como se esperaba, la composición de DVD1-Fab tenía aproximadamente la mitad de la actividad catalítica de la composición de h38C2-IgG1. Los datos de citotoxicidad demuestran que tanto el DVD1-ADC como el DVD1-Fab-ADC tenían actividad citotóxica contra las células HER2+. Como se esperaba, debido a la menor cantidad de fármaco en el DVD1-Fab-ADC en comparación con la composición de DVD1-ADC, la actividad citotóxica del DVD1-Fab-ADC fue menor que la de la composición de DVD1-ADC.
Ejemplo 18: Clonación, expresión, purificación y actividad catalítica de DVD2-Fab
Los DVD anti-HER2 se preparan al conectar el Vh y Vl de trastuzumab al Vh y Vl de h38C2 mediante un conector corto (ASTKGP) o largo (t Va APSVFIFPP) para DVD1 y DVD2 respectivamente. Los DVD anti-CD138 y anti-CD79b se expresan utilizando el conector corto (ASTKGP). Las secuencias deseadas se sintetizan como gBlocks (Integrated DNA Technologies) y se expresan con una cadena pesada de IgG1 humana o un dominio constante de cadena ligera k. Los casetes de expresión de DVD se clonan con Nhel/Xhol en el vector de expresión de mamífero pCEP4 y se transfectan transitoriamente en células HEK 293 para producción. Los sobrenadantes se recolectan 3 veces durante un período de 9 días seguido de filtración y purificación utilizando columnas HiTrap Proteína A HP de 1 ml (GE Healthcare Life Sciences) junto con un instrumento ÁKTA FPLC (GE Healthcare Life Sciences). Los rendimientos son normalmente de 10 mg/L. La pureza de los DVD se confirma mediante SDS-PAGE seguido de tinción de Coomassie, y la concentración se determina al medir la absorbancia a 280 nm. Para asegurar que la reactividad Lys de h38C2 se retenga en formato DVD, su actividad se evaluó directamente utilizando un ensayo que se basaba en su actividad de aldolasa catalítica para convertir el metodol en su aldehído original mediante una reacción retroaldólica. La formación del aldehído fluorescente se cuantifica utilizando un fluorímetro.
Específicamente, los DVD o IgG1 se diluyen a 1 pM en PBS (pH 7.4) y se dispensan en alícuotas de 98 pl en una placa de 96 pozos por triplicado. Luego, se agregan 2 pl de metodool 10 mM en etanol y la fluorescencia se evalúa inmediatamente utilizando un instrumento SpectraMax M5 (Molecular Devices) con software SoftMax Pro, una longitud de onda de excitación (Aext) establecida en 330 nm, una longitud de onda de emisión (Aem) establecida en 452 nm y comenzando en 0 min utilizando puntos de tiempo de 5 min. La señal se determina al normalizar a 98 pl de PBS con 2 pl de la preparación de la metodología agregada.
La FIG. 36 muestra la actividad de la lisina h38C2 que se mide directamente utilizando metodol como sustrato, que se convierte en un aldehído fluorescente y se detecta. El DVD1 tenía la misma actividad que la IgG1 de h38C2 original y el DVD2 tenía una actividad disminuida. Trastuzumab IgG1 se utiliza como control negativo.
Ejemplo 19: Generación de conjugados de fármacos basados en DVD y evaluación de su actividad contra estirpes celulares de cáncer de mama HER2+ in vitro
Para preparar el ADC deseado, se sintetiza un compuesto de monometil auristatina F (MMAF) funcionalizado con plactama con un conector no escindible (Fig. 37A). El asa de p-lactama se utiliza para la conjugación porque reacciona irreversiblemente con la Lys de h38C2 al formar un enlace amida estable, evitando de esta manera la posibilidad de una liberación prematura del fármaco. MMAF se elige con un conector no escindible porque esta carga útil se ha utilizado para preparar ADC potentes contra una variedad de dianas y se ha informado que los conectores no escindibles tienen dosis máximas toleradas más altas. Los ADC se preparan al incubar DVD1 con 4 equivalentes de p-lactama MMAF (2 equivalentes con respecto a cada residuo de Lys) en PBS durante 4 horas (Fig. 37B). La Fig. 44 proporciona un esquema de síntesis en fase sólida de p-lactama MMAF. Dado que Lys reacciona con la fracción de p-lactama para formar un enlace amida, la Lys ya no es catalíticamente activa, por lo que la conjugación completa se confirma por la pérdida de actividad catalítica (Fig. 37C).
Todas las conjugaciones se realizan en PBS (pH 7.4) después de que los anticuerpos se concentran a 50 pM (10.0 mg/ml) utilizando un dispositivo de filtro centrífugo de corte de 30 kDa. Se agregan 6.0 pl de p-lactama-MMAF (1 mM de una solución de DMSO al 10 % en PBS, 4 eq) a 300 mg de anticuerpo para un volumen de reacción final de 36 pl. La solución se incuba durante 4 horas a temperatura ambiente. Todas las conjugaciones se consideran completas por pérdida de actividad catalítica utilizando el método de ensayo utilizando una porción de la reacción bruta diluida a 1 pM utilizando PBS. Una vez finalizado, el compuesto que no ha reaccionado se elimina utilizando una columna de desalación PD-10 (GE Healthcare). Para preparar ADC a mayor escala, se agregaron 11.3 pl de plactama-MMAF (10 mM en DMSO al 100 %) a 5.7 mg de anticuerpo para un volumen de reacción final de 560 pl. La solución se incubó durante 4 horas a temperatura ambiente y se purificó como se describió previamente. Los conjugados en PBS se almacenan a 4 °C para uso a corto plazo y a -80 °C en alícuotas para uso a largo plazo. Las concentraciones de anticuerpos se determinan con el Ensayo de Proteína Bio-Rad, utilizando una concentración conocida de un anticuerpo no conjugado como estándar.
Las células se siembran en placas de 96 pozos a 5 x 103 células por pozo para todas las células BC, excepto KPL-4 (3 x 103 células por pozo). 2.0 x 104 células por pozo para células MM o Ramos. Se deja que las células BC se adhieran durante la noche y las células en suspensión se tratan inmediatamente. Se agregan diluciones en serie de anticuerpos no conjugados y ADC a las células en concentraciones que varían entre 0 y 10 nM. Después de la incubación durante 72 h, se midió la viabilidad celular utilizando el Ensayo de Proliferación Celular CellTiter 96 AQueous One Solution (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. La viabilidad celular se calcula como porcentaje de células no tratadas (= 100 %).
La citotoxicidad in vitro del conjugado se evalúa contra células BC HER2+ (SK-BR-3) y HER2-(MDA-MB-468). El ADC es muy potente contra las células que expresan la diana (IC50 = picomolar de dos dígitos) sin que se observe citotoxicidad con la estirpe celular HER2-(Fig. 29: panel SKBR3 (HER2+)). Como control negativo, se incuba h38C2 IgG1 con p-lactama MMAF en paralelo y se prueba frente a estas estirpes celulares. Dado que h38C2 carece del dominio de dirección anti-HER2 adicional, no se observa citotoxicidad como se predijo. También se encuentra que el ADC es muy potente contra varias otras estirpes celulares HER2+ (Fig. 38). Refiriéndose a la FIG. 38, se representa la citotoxicidad in vitro de anti-HER2 DVD1/MMAF después de la incubación con estirpes celulares HER2+ Bc MDA-MB-361, BT-474 y KPL-4 durante 72 h a 37 °C (media ± SD de triplicados). Para demostrar la utilidad de esta estrategia, también se preparan dos ADC adicionales al sustituir el dominio variable de dirección de HER2 por un dominio de dirección de CD138 y CD79b. Ambos antígenos son dianas ADC clínicamente establecidas para el tratamiento de mieloma múltiple (MM) y linfoma no Hodgkin (NHL). Ambos ADC son muy potentes (IC50 = picomolar de dos dígitos) contra las células que expresan la diana (Fig. 39). Refiriéndose a la FIG. 39A, se representa la citotoxicidad del conjugado anti-CD138 DVD1/MMAF después de incubación con las estirpes celulares CD138 MM U-266 y NCI-H929 durante 72 h a 37 °C (media ± SD de triplicados). Refiriéndose a la FIG. 39B, se representa la citotoxicidad del conjugado anti-CD79b DVD1/MMAF después de incubación con la estirpe celular de linfoma de Burkitt CD79b+ (Ramos) durante 72 h a 37 °C (media ± SD de triplicados). Anti-HER2 DVD1/MMAF y h38C2 IgG1/MMAF se utilizan como controles negativos.
Ejemplo 20: Caracterización analítica de conjugados de fármacos anti-HER2 DVD1/MMAF
Para confirmar la carga de fármaco de esta plataforma de ADC, se utiliza espectrometría de masas para determinar la masa de la cadena pesada y ligera. Todas las muestras se desglicosilan con PNGasa F (New England Biolabs) durante la noche a 37 °C bajo condiciones reductoras (DTT 50 mM en PBS). La PNGasa F se elimina con un SpinTrap Proteína G HP (GE Healthcare) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras se reducen de nuevo antes del análisis de la muestra (DTT 10 mM en PBS). Los datos se obtienen en un espectrómetro de masas de Tiempo de Vuelo de Ionización por Electropulverización (ESI-TOF) de Agilent. Las masas desconvolucionadas se obtienen utilizando el software Agilent BioConfirm. Dado que la única lisina que se espera que reaccione con el compuesto farmacológico p-lactama MMAF se encuentra en la cadena pesada, la masa de la cadena pesada solo debe aumentar mediante la adición de un compuesto farmacológico y no se debe observar ninguna modificación en la cadena ligera. Cuando se compara la masa de DVD1 anti-HER2 no conjugado con DVD1/MMAF anti-HER2, la masa aumenta correspondiente a la adición de una única molécula de fármaco sin que se detecte ningún cambio en la masa de la cadena ligera (Fig. 40). Refiriéndose a la FIG. 40, el anti-HER2 DVD1 no conjugado (Fig. 40A) y el anti-HER2 DVD1/MMAF conjugado (Fig. 40B) se desglicosilan primero con PNGasa F y se reducen con DTT 10 mM antes del análisis. No se detecta conjugación sobre la cadena ligera y el aumento de masa de la cadena pesada (~1160 Da) corresponde a la adición de p-lactama MMAF. No se detectan especies no conjugadas o con mayor carga de fármaco. Por tanto, la relación de fármaco a anticuerpo (DAR) es 2 para el anti-HER2 DVD1/MMAF intacto. No se detectan especies con mayor carga de fármaco. Adicionalmente, cuando la Lys se muta a alanina (Ala) y se conjuga en paralelo con p-lactama MMAF, no se detecta modificación (Fig. 41). Refiriéndose a la FIG. 41, Anti-HER2 DVDl se muta para reemplazar la lisina de h38C2 con una alanina y se incuba con p-lactama MMAF utilizando las condiciones del Ejemplo 19. En la FIG. 41, el mutante Ala anti-HER2 DVD1 no conjugado (Fig. 41A) y el mutante Ala anti-HER2 DVD1/MMAF conjugado (Fig. 41B) se desglicosilan primero con PNGasa F y se reducen con DTT 10 mM antes del análisis. No se detecta conjugación en la cadena ligera o pesada después de la incubación con p-lactama MMAF, lo que indica la lisina de h38C2 como el sitio de unión del fármaco. Estos datos, combinados con el hecho de que el a Dc ya no es catalíticamente activo, sugieren fuertemente que el residuo de Lys es el único punto de conjugación. Dado que los ADC basados en DVD se componen de dos cadenas pesadas y ligeras, el DAR es por lo tanto 2.
Ejemplo 21: Evaluación de anti-HER2 DVD1/MMAF en un modelo de ratón de xenoinjerto de cáncer de mama humano
Haciendo referencia a la FIG. 43A, SDS-PAGE teñida con Coomassie confirma la pureza de ambos anti-CD138 DVD1 y anti-CD79b DVD1 bajo condiciones no reductoras (esperadas = ~200 kDa) y reductoras (cadena pesada esperada = ~63 kDa, cadena ligera = ~36 kDa). Los pesos moleculares de una escalera de proteínas previamente teñida se muestran a la izquierda. Refiriéndose a la FIG. 43B, anti-CD138 DVD1 y anti-CD79b DVD1 se incuban con 4 equivalentes de p-lactama MMAF como se describe para la preparación de anti-HER2 DVD1/MMAF. La conjugación completa se confirma al evaluar la actividad catalítica del anti-CD 138 DVD1/MMAF y anti-CD79b DVD1/MMAF resultantes con anti-HER2 DVD1 no conjugado como control positivo y trastuzumab IgG1 como control negativo. La pérdida completa de actividad catalítica confirma la conjugación completa.
El anti-HER2 DVD1/MMAF se evalúa in vivo. Los estudios de xenoinjerto BC se llevan a cabo utilizando células KPL-4 con ratones NSG hembra. Se inoculan células KPL-4 (6x 106 por ratón) en una mezcla 1:1 de PBS y BD Matrigel (BD Bioscience) por vía subcutánea en la almohadilla de grasa mamaria de ratones NSG hembra de 7 semanas de edad (The Jackson Laboratory). Cuando los tumores alcanzan ~150 mm3, los ratones se asignan aleatoriamente a 5 grupos de 7-8 ratones cada uno y se tratan con anti-HER2 DVD1/MMAF a 5 mg/kg o 10 mg/kg, o con anti-HER2 DVD1 no conjugado a 10 mg/kg, o con biosimilar de ado-trastuzumab emtansina (Levena Biopharma) a 5 mg/kg, o con vehículo (PBS) solo, mediante inyección i.v. (vena de la cola) cada 4 días durante un total de 4 ciclos. Los ratones se dosifican previamente con 250 pl de suero humano filtrado de forma estéril (Sigma Aldrich) 24 horas antes de cada ciclo mediante inyección i.p. El tamaño del tumor se monitoriza cada 4 días utilizando una medición con calibrador. Todos los procedimientos están aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales del Instituto de Investigación Scripps y se realizan de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
Se tratan ratones portadores de tumores establecidos (~150 mm3) cada cuatro días con una inyección intravenosa (i.v.) de 5 mg/kg o 10 mg/kg de anti-HER2 DVD1/Mm A f , 10 mg/kg de anti-HER2 DVD1 no conjugado, el ADC de referencia adotrastuzumab emtansina a 5 mg/kg, o vehículo para un total de cuatro tratamientos. Dado que los ratones NSG carecen de IgG en suero, a cada animal se le administra una dosis previa de 250 pl de suero humano para evitar la depuración de los anticuerpos inyectados mediante la unión de los macrófagos a los dominios constantes. Se observa una regresión tumoral significativa e inhibición del crecimiento para ambas dosis de anti-HER2 DVD1/MMAF

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un inmunoconjugado que tiene la fórmula Ig-(L-D)n, en el que:
(a) Ig es una molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, en la que la molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual comprende:
(i) un primer dominio variable que se une a una diana de unión; y
(ii) un segundo dominio variable que comprende un residuo reactivo;
(b) L es un conector que se conjuga covalentemente al residuo reactivo del segundo dominio variable de lg;
(c) D es una fracción de fármaco; y
(d) n se selecciona de un entero desde 1 hasta 12.
2. El inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el residuo reactivo es una lisina, o en el que n es 1 o 2, o en el que el primer dominio variable de Ig se posiciona más cerca a un terminal N que el segundo dominio variable, o en el que Ig es una molécula de inmunoglobulina biespecífica o en el que D comprende 2 o más de las mismas o diferentes fracciones de fármaco.
3. El inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el fragmento de unión a antígeno comprende el primer y segundo dominios variables de Ig, y se selecciona de un Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv, opcionalmente en el que el fragmento de unión a antígeno comprende un Fab.
4. El inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que Ig comprende una secuencia de inmunoglobulinas quimérica, o en el que Ig comprende una secuencia de inmunoglobulinas humanizadas o en el que Ig comprende una secuencia de inmunoglobulinas humana, o en el que el segundo dominio variable de Ig comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, o en el que el segundo dominio variable de Ig comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, o en el que la diana de unión es un antígeno de superficie de células de tumor, opcionalmente en el que el antígeno de superficie de células de tumor se selecciona de HER2, FOLR1, CD138 y CD79b, opcionalmente en el que el primer dominio variable de Ig se une a HER2, FOLRI, CD 138, o CD79b.
5. El inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la fracción de fármaco es un agente citotóxico, opcionalmente en el que el agente citotóxico se selecciona de una toxina, un agente quimioterapéutico, un antibiótico, un isótopo radiactivo, un isótopo radiactivo quelado y una enzima nucleolítica.
6. El inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que D es:
i) una auristatina, una dolostatina o una cemadotina, opcionalmente en el que D es una MMAE o una MMAF;
ii) una camptotecina, opcionalmente en la que la camptotecina es SN-38;
iii) un maitansinoide, opcionalmente en el que el maitansinoide es DM1, DM3 o DM4;
iv) una pirrolobenzodiazepina (PBD);
v) una enedina, opcionalmente una caliqueamicina;
vi) una tiancimicina;
vii) una doxorrrubicina, opcionalmente una MMDX;
viii) un PNU-159682; o
ix) un ARNip.
7. El inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que L es un conector reversible, conector irreversible, conector escindible, conector no escindible, conector ramificado, o un conector lineal.
8. El inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 2, en el que:
(a) Ig comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 5 y 6 y la diana de unión del primer dominio variable es HER2;
(b) L es un conector irreversible, lineal que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo de Ig;
(c) D es MMAF; y
(d) n es 1 a 12,
o
(a) Ig comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 7 y 8 y la diana de unión del primer dominio variable es HER2;
(b) L es un conector irreversible, lineal que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo de Ig;
(c) D es MMAF; y
(d) n es 1 a 12,
o
(a) Ig comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 9 y 10 y la diana de unión del primer dominio variable es FOLR1;
(b) L es un conector irreversible, lineal que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo de Ig;
(c) D es MMAF; y
(d) n es 1 a 12,
o
(a) Ig comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 11 y 12 y la diana de unión del primer dominio variable es FOLR1;
(b) L es un conector irreversible, lineal que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo de Ig;
(c) D es MMAF; y
(d) n es 1 a 12,
o
(a) Ig comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 13 y 14 y la diana de unión del primer dominio variable es FOLR1;
(b) L es un conector irreversible, lineal que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo de Ig;
(c) D es MMAF; y
(d) n es 1 a 12,
o
(a) Ig comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 15 y 16 y la diana de unión del primer dominio variable es FOLR1;
(b) L es un conector irreversible, lineal que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo de Ig;
(c) D es MMAF; y
(d) n es 1 a 12,
o
(a) Ig comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 17 y 18 y la diana de unión del primer dominio variable es CD 138;
(b) L es un conector irreversible, lineal que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo de Ig;
(c) D es MMAF; y
(d) n es 1 a 12,
o
(a) Ig comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 19 y 20 y la diana de unión del primer dominio variable es CD 138;
(b) L es un conector irreversible, lineal que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo de Ig;
(c) D es MMAF; y
(d) n es 1 a 12,
o
(a) Ig comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 21 y 22 y la diana de unión del primer dominio variable es CD79b;
(b) L es un conector irreversible, lineal que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo de Ig;
(c) D es MMAF; y
(d) n es 1 a 12,
o
(a) Ig comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 23 y 24 y la diana de unión del primer dominio variable es CD79b;
(b) L es un conector irreversible, lineal que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo de Ig;
(c) D es MMAF; y
(d) n es 1 a 12.
9. El inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 8, en el que n es 1 o 2.
10. Un inmunoconjugado que tiene la fórmula Ig-(L-D)n, en la que:
(a) Ig es una molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, en la que la molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual comprende:
(i) un primer dominio variable que se une a una diana de unión; y
(ii) un segundo dominio variable que comprende un residuo de lisina reactivo;
(b) L es un conector que se conjuga covalentemente al residuo de lisina reactivo del segundo dominio variable de Ig; (c) D es una fracción de fármaco; y
(d) n es 1 a 12,
opcionalmente en el que n es 1 o 2.
11. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva del inmunoconjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y un portador farmacéuticamente aceptable.
12. El inmunoconjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o la composición farmacéutica de la reivindicación 11, para uso en terapia o diagnóstico.
13. El inmunoconjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o la composición farmacéutica de la reivindicación 11, para uso en prevenir, tratar o diagnosticar cáncer.
14. El inmunoconjugado o composición farmacéutica, para uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el cáncer es un cáncer hematológico, un carcinoma, un sarcoma, un melanoma, o un cáncer del sistema nervioso central, opcionalmente en el que el cáncer hematológico es una leucemia, linfoma, mieloma, o síndrome mielodisplásico, opcionalmente en el que la leucemia es una leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena crónica, o leucemia linfocítica crónica, opcionalmente en el que el linfoma es linfoma de Hodgkin o linfoma de no Hodgkin, opcionalmente en el que el carcinoma es un cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello, tiroides, pulmón, nasofaríngeo, colorrectal, de hígado, vejiga urinaria, ovario, cuello uterino, endometrial, de próstata, gástrico, esofágico, pancreático, renal, o de mama opcionalmente en el que el sarcoma es un angiosarcoma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, fibrosarcoma, tumor del estroma gastrointestinal, leiomiosarcoma, liposarcoma, tumor maligno de la vaina del nervio periférico, osteosarcoma, sarcoma pleomórfico, rabdomiosarcoma, sarcoma de Kaposi o sarcoma sinovial, opcionalmente en el que el cáncer del sistema nervioso central es un glioma, meningioma o neuroma.
15. El inmunoconjugado o composición farmacéutica, para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14,en el que el inmunoconjugado o composición farmacéutica comprende adicionalmente una cantidad efectiva de un segundo agente terapéutico, opcionalmente en el que el segundo agente terapéutico es un anticuerpo, un agente antineoplásico, un agente citotóxico, un agente antiangiogénico, o un agente inmunosupresor, opcionalmente en el que el segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo, ifosfamida, doxorrrubicina, daunorrubicina, valrubicina, idarrubicina, epirrubicina, actinomicina, bleomicina, plicamicina, mitomicina, bevacizumab, imatinib, erlotinib, gefitinib, ibrutinib, idelalisib, lenalidomida, vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, paclitaxel, y docetaxel.
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