[go: up one dir, main page]

CN108025071A - 双重可变结构域免疫缀合物及其用途 - Google Patents

双重可变结构域免疫缀合物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN108025071A
CN108025071A CN201680054340.XA CN201680054340A CN108025071A CN 108025071 A CN108025071 A CN 108025071A CN 201680054340 A CN201680054340 A CN 201680054340A CN 108025071 A CN108025071 A CN 108025071A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
val
thr
leu
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201680054340.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN108025071B (zh
Inventor
克里斯托夫·雷德
亚历克斯·R·南纳
威廉·R·劳什
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Scripps Research Institute
Original Assignee
Scripps Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Scripps Research Institute filed Critical Scripps Research Institute
Publication of CN108025071A publication Critical patent/CN108025071A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108025071B publication Critical patent/CN108025071B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

提供了双重可变结构域(DVD)免疫缀合物及其用途。本发明的免疫缀合物的方面包括DVD免疫球蛋白分子，其具有第一和第二可变结构域和通过接头共价缀合至第二可变结构域的货物部分(例如药物部分)。还提供了制备和使用用于预防和/或治疗癌症和其他疾病的本发明的免疫缀合物的方法。

Description

双重可变结构域免疫缀合物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年9月17日提交的美国临时专利申请序列No.62/220,148的申请日的优先权，该申请的公开内容通过引用整体并入本文。本申请还要求2016年4月26日提交的美国临时专利申请序列No.62/327,849的申请日的优先权，该申请的公开内容通过引用整体并入本文。
政府权利
本发明利用基于由国立卫生研究院授予的资助号CA174844的美国政府的资助进行。美国政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
本发明涉及双重可变结构域免疫缀合物，以及在预防和治疗癌症以及其他疾病中制造和使用它们的方法。
合并序列表
包含在名为“P34344WO00.txt”的文件中的在2016年9月16日创建的85,476字节(在中测量)的序列表包括24个序列，以电子方式提交，并且通过引用整体并入。
背景技术
在美国，恶性肿瘤(癌症)是在心脏病之后的导致死亡的第二大原因，(Boring etal.，CA Cancel J.Clin.43：7(1993))。癌症的特征在于来源于增殖形成肿瘤块的正常组织的异常或肿瘤细胞数量的增加，这些瘤性肿瘤细胞侵入邻近组织，以及恶性细胞的产生，这些恶性细胞最终通过血液或淋巴系统扩散到区域淋巴结以及通过被称为转移的过程扩散到远处。在癌症状态下，细胞在正常细胞不生长的条件下增殖。癌症本身表现为多种形式，其特征在于不同程度的侵入性和侵袭性。
为了发现用于癌症治疗的有效细胞靶标，研究人员试图鉴定与一种或多种正常的非癌细胞相比，在一种或多种特定类型的癌细胞表面上特异性表达的跨膜或其他膜相关多肽。通常，与非癌细胞表面相比，这些膜相关多肽在癌细胞表面上更大量地表达。这种肿瘤相关细胞表面抗原多肽的鉴定已经产生了通过基于抗体的疗法特异性靶向癌细胞进行破坏的能力。
抗体-药物缀合物(ADC)(即免疫缀合物)用于局部递送细胞毒剂或细胞抑制剂(即在癌症治疗中杀死或抑制肿瘤细胞的药物)允许药物部分靶向递送至肿瘤细胞并且在其中进行细胞内积累，其中这些未结合的药物制剂的全身性施用可导致对正常细胞以及试图消除的肿瘤细胞的不可接受水平的毒性。努力改善治疗指数，即ADC的最大功效和最小毒性，已经集中在多克隆和单克隆抗体(mAbs)的选择性以及药物连接和药物释放性质上(Lambert,J.(2005)Curr.Opinion in Pharmacology 5:543-549)。抗体药物缀合物中使用的药物部分包括细菌蛋白毒素(例如白喉毒素)、植物蛋白毒素(例如蓖麻毒蛋白)、小分子(例如auristatins)、格尔德霉素(Mandler et al(2000)J.of the Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581；Mandler et al(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028；Mandler et al(2002)Bioconjugate Chem.13:786-791)、美登木素生物碱(EP 1391213；Liu et al(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623)、加利车霉素(Lode et al(1998)Cancer Res.58:2928；Hinman et al(1993)Cancer Res.53:3336-3342)、道诺霉素、阿霉素、甲氨蝶呤和长春地辛(Rowland et al(1986)supra)。药物部分可影响细胞毒素和细胞生长抑制机制，包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制。当与大抗体或蛋白质受体配体缀合时，一些细胞毒性药物倾向于无活性或活性较低。
将部分(例如，药物部分)附接(即通过共价键连接)至抗体的常规手段通常导致分子的异质混合物，其中部分连接在抗体上的许多位点。例如，细胞毒性药物通常已经通过抗体的常常多个赖氨酸残基缀合至抗体，产生异质性抗体-药物缀合混合物。根据反应条件，非均相混合物通常含有具有0至约8个或更多个附接的药物部分的抗体的分布。此外，在具有药物部分比抗体的特定整数比率的每个缀合物亚组内是潜在不均匀混合物，其中药物部分连接在抗体上不同位点。分析和制备方法可能不足以分离和表征由缀合反应产生的异质混合物内的抗体-药物缀合物物质分子。抗体是大型的、复杂的和结构多样的生物分子，通常具有许多反应性官能团。它们与接头试剂和药物接头中间体的反应性取决于诸如pH、浓度、盐浓度和共溶剂等因素。此外，由于难以控制反应条件和表征反应物和中间体，所以多步缀合过程可能是不可重复的。
发明内容
提供了双重可变结构域(DVD)免疫缀合物及其用途。本发明的免疫缀合物的方面包括具有第一可变结构域和第二可变结构域的DVD免疫球蛋白分子和通过接头共价缀合至第二可变结构域的货物(cargo)部分(例如药物部分)。还提供了制备和使用用于预防和/或治疗癌症和其他疾病的本发明的免疫缀合物的方法。
本发明的方面包括具有式Ig-(L-D)n的免疫缀合物，其中：Ig是双重可变结构域免疫球蛋白分子或其免疫球蛋白片段(抗原结合片段)，其中双重可变结构域免疫球蛋白分子包含与结合靶标结合的第一可变结构域和包含反应性残基的第二可变结构域；L是与Ig的第二可变结构域的反应性残基共价缀合的接头；D是药物部分；并且n选自1至12的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。在一个方面，反应性残基使得能够化学计量附接L，并且包括但不限于含有作为反应性官能团的SH、NH2、OH、SeH、N3、炔烃、烯烃、应变炔烃、应变烯烃、C＝O和活化的C-H的天然和非天然氨基酸。
本发明的其他方面包括具有式Ig-(L-D)n的免疫缀合物，其中：Ig是双重可变结构域免疫球蛋白分子或其抗原结合片段，其中双重可变结构域免疫球蛋白分子包含与结合靶标结合的第一可变结构域和包含反应性赖氨酸残基的第二可变结构域；L是与Ig的第二可变结构域的反应性赖氨酸残基共价缀合的接头；D是药物部分；并且n是1或2。
序列的简要描述
SEQ ID NO:1和2是肽接头的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是人源化38C2(h38C2)抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是人源化38C2(h38C2)抗体的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是HER2-h38C2-DVD1免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是HER2-h38C2-DVD1免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是HER2-h38C2-DVD2免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8是HER2-h38C2-DVD2免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是IMGN-853 FOLR1-h38C2-DVD1免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10是IMGN-853 FOLR1-h38C2-DVD1免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是IMGN-853 FOLR1-h38C2-DVD2免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12是IMGN-853 FOLR1-h38C2-DVD2免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13是法勒珠单抗(Farletuzumab)FOLR1-h38C2-DVD1免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14是法勒珠单抗FOLR1-h38C2-DVD1免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15是法勒珠单抗FOLR1-h38C2-DVD2免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16是法勒珠单抗FOLR1-h38C2-DVD2免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17是CD138-h38C2-DVD1免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18是CD138-h38C2-DVD1免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19是CD138-h38C2-DVD2免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20是CD138-h38C2-DVD2免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21是CD79b-h38C2-DVD1免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22是CD79b-h38C2-DVD1免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23是CD79b-h38C2-DVD2免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24是CD79b-h38C2-DVD2免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列。
附图说明
图1是包含两条相同轻链和两条相同重链的双重可变结构域免疫球蛋白分子的示意图。
图2是具有与每条重链上的反应性赖氨酸残基附接的药物部分的双重可变结构域免疫缀合物的示意图。
图3是HER2-h38C2-DVD1和HER2-h38C2-DVD2免疫缀合物的示意图。
图4是FOLR1-h38C2-DVD1和FOLR1-h38C2-DVD2免疫缀合物的示意图。
图5是CD138-h38C2-DVD1和CD138-h38C2-DVD2免疫缀合物的示意图。
图6是双重可变结构域免疫缀合物、其各种结合片段和双特异性双重可变结构域免疫缀合物的示意图。
图7描绘了可裂解的接头的多种非限制性示例。
图8描绘了不可裂解的接头的多种非限制性示例。
图9描绘了可逆接头的多种非限制性示例。
图10描绘了不可逆接头的多种非限制性示例。
图11描述了用于化学合成β-内酰胺-Cit-Val-MMAF的反应过程。
图12描述了用于化学合成β-内酰胺-PEG接头-MMAF的反应过程。
图13描绘了使用可逆和不可逆接头与免疫球蛋白进行接头反应的多种非限制性示例。
图14描绘了药物部分的多种非限制性示例。
图15是免疫球蛋白缀合反应的示意图，其中缀合发生在第二可变结构域(h38C2可变结构域)中的反应性赖氨酸残基处。
图16描述了固相合成反应的非限制性示例，其可用于产生用于缀合至免疫球蛋白分子的β-内酰胺-烃接头-MMAF组合物。
图17提供了证明抗HER2双重可变结构域免疫缀合物与HER2+细胞的特异性结合的结合数据。
图18描绘了提供来自第一细胞毒性测定的数据的两幅图，其表明了通过抗-HER2双重可变结构域免疫缀合物杀死细胞。
图19描绘了提供来自第二细胞毒性测定的数据的两幅图，其表明了通过抗-HER2双重可变结构域免疫缀合物杀死细胞。
图20描绘了提供来自第三细胞毒性测定的数据的两幅图，其表明了通过抗-HER2双重可变结构域免疫缀合物杀死细胞。
图21显示DVD1和DVD2的非限制性示例结构，以及考马斯染色以确认预期的尺寸和纯度。
图22提供了示意性说明以及流式细胞术数据，其表明了选择性结合HER2表达的SKBR3细胞并且不结合HER2阴性MDA-MB-468细胞。
图23提供了示意图以及流式细胞术数据，其表明了DVD1和DVD2的β-内酰胺生物素标记以及与SKBR3细胞的结合(HER2+)，使用链霉亲和素PE进行检测。对于MDA-MB-468细胞(HER2-)未观察到检测。
图24提供了图形数据，其表明抗F-HER2 DVD1 ADC对SKBR3(HER2+)的细胞毒性，并且对MDA-MB-468(HER2-)细胞没有细胞毒性。
图25提供了IMGN抗FOLR1、FAR抗FOLR1和抗CD138 DVD ADC的结构以及来自未结合的DVD的考马斯凝胶数据的示意图。
图26提供了表明抗FOLR1 ADC对IGROV1(FOLR1+)细胞的细胞毒性的图形数据。
图27提供了表明抗CD138 ADC对H929(CD138+)细胞的细胞毒性的图形数据。
图28提供了表明各种组合物(包括DVD1、h38C2、曲妥珠单抗和DVD1-ADC)的催化活性的图形数据。
图29提供了表明DVD1-ADC对SKBR3、BT474、KPL4、DYT2和MDA-MB-468细胞的细胞毒性的图形数据。
图30提供描绘KPL4植入的NSG小鼠(n＝2/组)的体内异种移植模型中的肿瘤体积与剂量的函数关系以及使用DVD1-ADC的剂量响应的图形数据。
图31提供了描绘KPL4植入的NSG小鼠(每组n＝7或8)的体内异种移植物中的肿瘤体积与剂量的函数关系的图形数据。
图32提供了DVD1-Fab组合物以及针对KPL4(HER2+)细胞的考马斯凝胶数据、催化活性数据和细胞毒性数据的非限制性示例的示意图。
图33提供了来自DVDl和DVD1-ADC重链的MALDI-TOF质谱数据。
图34提供了DVD组合物的多种非限制性示例的示意图。
图35提供了描绘额外的基于h38C2的双特异性组合物的催化活性的图形数据。
图36提供了表明各种组合物(包括h38C2、DVD1、DVD2和曲妥珠单抗)的催化活性的图形数据。
图37A提供了用于ADC制备的β-内酰胺MMAF的结构的示意图。
图37B提供了h38C2的赖氨酸(圆圈)处的药物附着位点(星号)的示意图。
图37C提供了图形数据，其表明了抗-HER2 DVD1/MMAF的催化活性完全丧失，从而证实了完全缀合；未缀合的抗HER2 DVD1充当阳性对照；丙氨酸突变的抗HER2 DVD1(橙色)和曲妥珠单抗IgG1(紫色)作为阴性对照。
图38提供了描绘抗HER2 DVD1/MMAF对HER2+细胞的体外活性的图形数据。
图39提供了描绘抗CD138 DVD1/MMAF和抗CD79b DVD1/MMAF的体外活性的图形数据。
图40A提供了描绘还原的未缀合的抗HER2 DVD1的电喷雾电离飞行时间(ESI-TOF)的图形数据。
图40B提供了描绘还原的缀合的抗-HER2 DVD1/MMAF的电喷雾电离飞行时间(ESI-TOF)的图形数据。
图41A提供了描绘还原的抗HER2 DVD1 Ala突变体的丙氨酸突变体的电喷雾电离飞行时间(ESI-TOF)的图形数据。
图41B提供了描绘还原的抗HER2 DVD1/MMAF Ala突变体的丙氨酸突变体的电喷雾电离飞行时间(ESI-TOF)的图形数据。
图42A提供了描绘抗HER2 DVD1/MMAF缀合物的体内活性与肿瘤体积的函数关系的图形数据。
图42B提供描绘抗HER2 DVD1/MMAF缀合物的体内活性的Kaplan-Meier存活曲线。
图43A提供了抗CD138 DVD1和抗CD79b DVD1的考马斯染色SDS-PAGE。
图43B提供了描绘抗CD138 DVD1/MMAF和抗CD79b DVD1/MMAF的催化活性的图形数据。
图44提供了β-内酰胺MMAF的固相合成方案。
图45提供了描绘所有DVD对亲本h38C2 IgG1具有基本相同的催化活性的图形数据。
图46提供了流式细胞术数据，其表明了所有DVD针对靶标表达细胞的结合。
具体实施方式
提供了双重可变结构域(DVD)免疫缀合物及其用途。本发明的免疫缀合物的方面包括具有第一可变结构域和第二可变结构域的DVD免疫球蛋白分子以及通过接头共价缀合至第二可变结构域的药物部分。还提供了制备和使用用于预防和/或治疗癌症和其他疾病的本发明的免疫缀合物的方法。
在更详细地描述本发明之前，应该理解的是，本发明不限于所描述的特定方面，因此当然可以变化。还应该理解的是，这里使用的术语仅用于描述特定方面的目的，而不是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限制。
在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则每个插入值至该下限单位的十分之一、在该范围的上限和下限之间以及在所述范围内的任何其它陈述值或插入值包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小的范围内，并且也包含在本发明内，受到在所述范围内的任何特别排除的限制。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，排除这些所包括的限制中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。
本文给出了某些范围，其中数值之前是术语“约”。术语“约”在本文中用于为其之后的确切数字以及接近或逼近于该术语之后的数字提供文字支持。在确定数字是否接近或逼近具体列举的数字时，近似或逼近未列举的数字可以是在其所呈现的上下文中提供具体列举的数字的实质等同方案的数字。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中也可以使用与本文所述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料，但是现在描述代表性的说明性方法和材料。
本说明书中引用的所有出版物和专利通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利被具体和单独地指示为通过引用并入并且通过引用并入本文以公开和描述引用出版物所关联的方法和/或材料。任何出版物的引用是为了在申请日之前的其公开内容，并且不应该被解释为承认本发明由于先前的发明而无权先于这种出版物。此外，所提供的公开日期可能与可能需要独立确认的实际公开日期不同。
注意，如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物。还应注意，可以起草权利要求来排除任何可选要素。因此，该陈述意在用作与权利要求要素的陈述有关的诸如“唯一”、“仅”等等排他术语的使用或“否定”限制的使用的先行基础。
对于本领域技术人员在阅读本公开后将显而易见的是，本文描述和示出的单独方面中的每一个具有分立的组件和特征，其可以容易地与其他几个方面中的任何一个的特征分开或组合而不偏离本发明的范围或精神。任何所述的方法都可以按照所述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序来执行。
除非另有说明，否则本发明的实践可以使用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、以及免疫学等等在本领域技术范围内的常规技术。文献中充分解释了这些技术，这些技术如"Molecular Cloning:A Laboratory Manual",secondedition(Sambrook et al.,1989)；"Oligonucleotide Synthesis"(M.J.Gait,ed.,1984)；"Animal Cell Culture"(R.I.Freshney,ed.,1987)；"Methods in Enzymology"(Academic Press,Inc.)；"Current Protocols in Molecular Biology"(F.M.Ausubel etal.,eds.,1987,and periodic updates)；"PCR:The Polymerase Chain Reaction",(Mullis et al.,ed.,1994)；"A Practical Guide to Molecular Cloning"(PerbalBernard V.,1988)；"Phage Display:A Laboratory Manual"(Barbas et al.,2001)。
定义
如本文可互换使用的术语“免疫球蛋白”或“抗体”是指包含两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链的碱性4-链异源四聚糖蛋白。每条L链通过一个共价二硫键与H链相连，而两条H链通过一个或多个二硫键相互连接，具体取决于H链同种型。每个H链和L链具有N-端和C-端，并且还具有规则间隔的链内二硫桥。每条H链在N-端具有可变结构域(VH)，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。每条L链在N-端具有可变结构域(VL)，随后是一个恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一恒定域(CH1)对齐。相信特定的氨基酸残基在L链可变结构域和H链可变结构域之间形成界面。配对的VH和VL一起形成单个抗原结合位点。
来自任何脊椎动物物种的L链可以基于它们的恒定结构域的氨基酸序列被分配到两种明显不同的类型(称为κ和λ)中的一种。根据其重链的恒定结构域(CH)的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白归入不同的类别或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其分别具有分别命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。基于CH序列和功能中相对较小的差异，将γ和α类进一步分成亚类，例如，人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
免疫球蛋白的“可变区”或“可变结构域”是指免疫球蛋白的H或L链的N-端结构域。H链的可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是免疫球蛋白最可变的部分，并含有抗原结合位点。
术语“可变”是指可变结构域的某些片段在免疫球蛋白中的序列方面广泛不同的事实。V结构域介导抗原结合并确定特定免疫球蛋白对其特定抗原的特异性。然而，变异性并不是均匀分布在大多数可变结构域的110个氨基酸范围内。相反，V区由被称为“高变区”的有极端可变性的较短区分隔的15-30个氨基酸的被称为框架区(FR)的相对不变的区段组成，其中所述较短区各自为9-12个氨基酸长。天然H链和L链的可变结构域各自包含四个FR，大部分采用β-折叠构型(β-sheet configuration)，其通过三个高变区连接，这三个高变区形成连接β-折叠结构的环，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密靠近在一起，并与另一条链的高变区一起促成免疫球蛋白的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定结构域不直接参与将免疫球蛋白与抗原结合，但表现出各种效应器功能，例如免疫球蛋白参与抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒作用(CDC)。
“完整”免疫球蛋白是包含抗原结合位点以及CL和至少H链恒定结构域CH1、CH2和CH3的免疫球蛋白。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。完整的免疫球蛋白可以具有一种或多种效应器功能。
出于本文目的的“裸露免疫球蛋白”是未缀合至药物部分的免疫球蛋白。
“免疫球蛋白片段”包含完整免疫球蛋白的一部分，优选完整免疫球蛋白的抗原结合区或可变区。免疫球蛋白片段的示例包括但不限于Fab，Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体；线性免疫球蛋白(参见美国专利No.5,641,870,实施例2；Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])；单链免疫球蛋白分子；和由免疫球蛋白片段形成的多特异性免疫球蛋白。在一些方面，免疫球蛋白片段包括所有可能的备选片段形式。在一些方面，免疫球蛋白片段可以是双特异性的。在一些方面，免疫球蛋白片段可以是双互补位的(bi-paratopic)。在一些方面，免疫球蛋白片段可以是三特异性的。在一些方面，免疫球蛋白片段可以是多聚体的。在一些方面，免疫球蛋白片段包含完整免疫球蛋白的抗原结合位点并因此保留结合抗原的能力。在一些方面，免疫球蛋白片段含有具有结合抗原的能力的单个可变结构域。在一些方面，免疫球蛋白片段被进一步修饰(不限于肽加成、聚乙二醇化、甲磺酰化、糖基化)以调节活性、属性、药代动力学行为和体内效力。
免疫球蛋白的木瓜蛋白酶消化产生称为“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段和残余“Fc”片段(一种反映容易结晶的能力的名称)。Fab片段由整个L链连同H链的可变区结构域(VH)和一个重链的第一恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段相对于抗原结合是单价的，即它具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理免疫球蛋白产生单个大F(ab')2片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性并仍能够交联抗原的两个二硫键连接的Fab片段。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基端具有额外的少量残基，包括来自免疫球蛋白铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文对Fab'的命名，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基。F(ab')2免疫球蛋白片段最初是作为Fab'片段对产生的，在Fab'片段对之间具有铰链半胱氨酸。免疫球蛋白片段的其他化学偶联也是已知的。
Fc片段包含通过二硫化物结合在一起的两条H链的羧基端部分。免疫球蛋白的效应子功能由Fc区中的序列决定，该区域也是在某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别的部分。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小免疫球蛋白片段。该片段由紧密非共价结合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)物质中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链可以在“二聚体”结构中缔合，类似于双链Fv物质中的缔合。从这两个结构域的折叠发出六个高变环(来自H和L链的各自3个环)，其贡献氨基酸残基用于抗原结合并赋予免疫球蛋白抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅包含三个特异于抗原的CDR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，但通常以比整个结合位点更低的亲和力实现。当在本文中参照DVD免疫球蛋白分子使用时，术语“Fv”是指包含重链和轻链的第一可变结构域和第二可变结构域的结合片段。
也简写为“sFv”或“scFv”的“单链Fv”是包含连接成单一多肽链的VH和VL免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白片段。优选地，sFv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得sFv能够形成抗原结合所需的结构。关于sFv的综述，参见Plückthun in The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)；Borrebaeck 1995,下文。当在本文中参照DVD免疫球蛋白分子使用时，术语“scFv”是指包含重链和轻链的第一可变结构域和第二可变结构域的结合片段。
如本文所用的术语“双重可变结构域免疫球蛋白”或“DVD-Ig”是指如上所述的免疫球蛋白分子，其中H和L链都包含位于第一可变结构域附近的第二可变结构域。因此，DVD-Ig的L链从N-端到C-端包括以下结构域：VL1-VL2-CL。因此，DVD-Ig的H链从N-端到C-端包括以下结构域：VH1-VH2-CH1-CH2-CH3。VL1和VH1的配对一起形成第一抗原结合位点。VL2和VH2的配对一起形成第二抗原结合位点。
除非另有说明，否则术语“免疫球蛋白”或“抗体”具体包括天然人和非人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA1、IgA2、IgD和IgM抗体，包括天然存在的变体。
关于多肽(例如抗体或免疫球蛋白)的术语“天然的”在本文中用于指具有天然存在的序列的多肽，而不管其制备方式如何。关于多肽(例如抗体或免疫球蛋白)的术语“非天然”在本文中用于指具有不存在于自然界中的序列的多肽。
术语“多肽”在本文中以最广泛的含义使用，并且包括肽序列。术语“肽”通常描述含有通过肽键共价连接的多达约30个，优选多达约60个氨基酸的线性氨基酸分子链。
如本文中使用的术语“单克隆”是指从基本上同质的免疫球蛋白的群体获得的抗体或免疫球蛋白分子(例如DVD Ig分子)，即包含该群体的单个免疫球蛋白是相同的，除了可以少量存在的可能天然发生的突变。单克隆免疫球蛋白针对单个抗原位点是高度特异性的。此外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相比，每种单克隆免疫球蛋白针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表示免疫球蛋白的从大体上均质的免疫球蛋白群体获得的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明的单克隆免疫球蛋白可以通过首先由and Milstein(1975)Nature 256:495描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见例如美国专利No.4,816,567)。
本文中的单克隆免疫球蛋白具体包括“嵌合”免疫球蛋白，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种的抗体中的相应序列相同或同源，而这些链的其余部分与衍生自另一物种的抗体中的相应序列以及这些抗体的片段相同或同源，只要它们表现出所需的生物活性即可(美国专利No.4,816,567；and Morrison et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855)。
非人(例如啮齿动物，例如鼠或兔)免疫球蛋白的“人源化”形式是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的免疫球蛋白。大多数情况下，人源化免疫球蛋白是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)的高变区的残基替代，所述非人物种如具有所需的特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、仓鼠、兔、鸡、牛或非人灵长类。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基也被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些改性以进一步改进抗体性能。通常，人源化免疫球蛋白将包含基本上所有的至少一个可变结构域，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化免疫球蛋白任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。对于更多的细节，参见Jones et al.(1986)Nature 321:522-525；Riechmann et al.(1988)Nature 332:323-329；和Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596。
如本文所使用的，术语“人免疫球蛋白”意指包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的免疫球蛋白。本发明的人免疫球蛋白可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中并且特别在CDR3中。然而，如本文所使用的，术语“人免疫球蛋白”不意指包括其中来源于另一种哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已经嫁接到人框架序列上的免疫球蛋白。
本文中的“分离的”免疫球蛋白是已经在重组宿主细胞中从该免疫球蛋白的天然环境的成分中鉴定并分离和/或复原的免疫球蛋白。其天然环境的污染成分是会干扰免疫球蛋白的诊断或治疗用途的物质，并且可能包含酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质、以及不希望的生产副产物。在一些方面，本文中的分离的免疫球蛋白将(1)被纯化至如通过SDS-PAGE或SEC-HPLC方法所测定的大于95重量％、或大于98重量％、或大于99重量％程度，(2)被纯化至足以通过使用氨基酸测序仪获得N-端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)被纯化至使用考马斯蓝或者优选银染在还原性或非还原性条件下通过SDS-PAGE获得的均一化。通常，分离的免疫球蛋白将通过至少一个纯化步骤来制备。
术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异于”是指结合部分与结合靶标的结合，例如免疫球蛋白与靶标抗原的结合，例如与特定多肽、肽上的表位或其他靶标(例如糖蛋白靶标)的结合，并且意指与非特异性相互作用可测量地不同的结合(例如，非特异性相互作用可以与牛血清白蛋白或酪蛋白结合)。例如，可以相比于与对照分子结合，通过测定结合部分或免疫球蛋白与靶标分子的结合来测量特异性结合。例如，可以通过与靶标相似的对照分子(例如过量的未标记的靶标)竞争来确定特异性结合。在这种情况下，如果标记靶标与探针的结合被过量的未标记的靶标竞争性抑制，则表明特异性结合。本文使用的术语“特异性结合”或“特异性结合于”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位可以例如通过具有针对靶标的至少约200nM的Kd的分子显示，该Kd替代地为至少约200nM，替代地为至少约150nM，替代地为至少约100nM，替代地为至少约60nM，替代地为至少约50nM，替代地为至少约40nM，替代地为至少约30nM，替代地为至少约50nM约20nM，替代地为至少约10nM，替代地为至少约8nM，替代地为至少约6nM，替代地为至少约4nM，替代地为至少约2nM，替代地为至少约1nM或更大。在某些情况下，术语“特异性结合”是指其中分子与特定多肽或特定多肽上的表位结合而基本上不与任何其他多肽或多肽表位结合这样的结合。
“结合亲和力”是指分子(例如免疫球蛋白)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文所使用的，“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如免疫球蛋白和抗原)之间的1：1的相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)表示。例如，Kd可以是约200nM、150nM、100nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、1nM、或更强。亲和力可以通过本领域已知的常用方法来测量，包括本文所述的那些方法。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并倾向于容易地解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并趋于保持更长的结合。测量结合亲和力的多种方法在本领域中是已知的。
如本文所使用的，“Kd”或“Kd值”是指通过适用于免疫球蛋白和靶标配对的技术测量的解离常数，例如使用表面等离子体共振测定法，例如使用Biacore X100或BiacoreT200(GE Healthcare，Piscataway，NJ)，在25℃用固定的抗原CM5芯片进行测量。
术语“缀合物”，“缀合的”和“缀合”是指任何和所有形式的共价或非共价键，并且包括但不限于直接的遗传或化学融合，通过接头或交联剂的偶联，以及非共价缔合。
术语“融合”在本文中用于指一条多肽链中不同来源的氨基酸序列通过它们的编码核苷酸序列的框内组合进行的组合。术语“融合”明确地包括内部融合，即，除了融合到多肽链的一个端之外，还在多肽链内插入不同来源的序列。术语“融合”在本文中用于指不同来源的氨基酸序列的组合。
术语“表位”包括能够与免疫球蛋白特异性结合的任何分子决定簇。在某些方面，表位决定簇包括分子(例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基)的化学活性表面分组，并且在某些方面可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位是由免疫球蛋白结合的抗原区域。“结合区”是由结合分子结合的结合靶标上的区域。
术语“靶标”或“结合靶标”以最广泛的含义使用，并且具体包括但不限于多肽、核酸、碳水化合物、脂质、细胞和其他分子，所述其他分子具有或不具有在它们存在于自然界中时具有的生物功能。
术语“抗原”是指可以结合免疫球蛋白或引发细胞免疫应答的实体或其片段。免疫原是指可以在生物体，特别是动物，更特别是包括人在内的哺乳动物中引发免疫应答的抗原。术语抗原包括如上所定义的已知为抗原决定簇或表位的区域。
本发明的免疫球蛋白的“抗原结合位点”或“抗原结合区”通常在每个可变结构域内含有六个互补决定区(CDR)，并且其有助于在不同程度上改变对抗原结合位点的亲和力的程度。在每个可变结构域内存在三个重链可变结构域CDR(CDRH1，CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变结构域CDR(CDRL1，CDRL2和CDRL3)。通过与编译的氨基酸序列的数据库进行比较来确定CDR和框架区(FR)的程度，其中根据序列间的差异和/或来自抗体/抗原复合物的结构信息确定了这些区域。在本发明的范围内还包括包含较少的CDR的功能性抗原结合位点(即，其中结合特异性由三个、四个或五个CDR确定)。不到一组完整的6个CDR可足以结合一些结合靶标。因此，在一些情况下，单独的VH或VL结构域的CDR将是足够的。此外，某些抗体可能具有用于抗原的非CDR相关结合位点。这种结合位点具体包括在本定义中。
如在本申请中使用的术语“宿主细胞”表示根据本发明可以工程化以产生免疫球蛋白的任何种类的细胞系统。在一方面，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用作宿主细胞。在一些方面，大肠杆菌用作宿主细胞。
如本文所使用的，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这样的名称包括子代。因此，词语“转化体”和“转化细胞”包括主要受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移的数量。还应该理解的是，由于有意或无意的突变，所有后代在DNA含量上可能不完全相同。包括与最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变体后代。
核酸当其处于与另一核酸序列有功能关系时，是“可操作地连接”的。例如，如果前体序列(pre-sequence)或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前体蛋白质，则其与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则该核酸体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情况下是连续的并且在阅读框中。但是，增强子不必是连续的。连接通过在方便的限制性位点进行连接来完成。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸适配器或接头。
关于肽或多肽序列(即本文鉴定的h38C2抗体多肽序列)的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为候选序列中的氨基酸残基与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基在比对序列并且如果需要引入缺口以实现最大百分比序列同一性后相同的百分比，并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守取代。为了确定百分比氨基酸序列同一性的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件实现。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括为了在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
“处理”或“治疗”是指治疗性治疗和预防性或预防措施，其中目标是预防或减缓(减轻)靶向病理状况或病症。需要治疗的患者包括那些已经患有该病症的患者，以及那些容易患有该病症的患者，或者必须预防该病症的患者。例如，如果在根据本发明的方法接受治疗量的本发明的免疫缀合物后，受试者显示可观察到和/或可测量的以下一种或更多种的减少或不存在以下一种或更多种：癌细胞数量减少或癌细胞不存在；肿瘤尺寸减少；癌细胞浸润到外周血中被抑制(即，在一定程度上减缓并且优选停止)，包括癌症扩散到软组织和骨中被抑制；肿瘤转移被抑制(即，在一定程度上减缓并且优选停止)；在一定程度上抑制了肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与特定癌症相关的一种或多种症状；降低的发病率和/或死亡率以及生活质量问题的改善，则受试者或哺乳动物的癌症被成功“治疗”。
双重可变结构域免疫球蛋白
本发明的方面包括双重可变结构域(DVD)免疫球蛋白分子，其具有结合靶标抗原的第一可变结构域和第二可变结构域，该第二可变结构域包括为接头分子的共价附接提供位点的独特反应性残基。本发明的DVD免疫球蛋白分子包括两条相同的轻链以及两条相同的重链。每条轻链和每条重链包含N-端和C-端。每条轻链包含命名为VL1和VL2的第一可变结构域和第二可变结构域以及命名为CL的恒定结构域。在一些方面，轻链包含κ轻链。在一些方面，轻链包含λ轻链。
本发明的方面包括具有结合靶标抗原的第一可变结构域和第二可变结构域的双重可变结构域(DVD)免疫球蛋白分子，该第二可变结构域包括为接头分子的共价附接提供位点的单个独特反应性赖氨酸残基。本发明的DVD免疫球蛋白分子包括两条相同的轻链以及两条相同的重链。每条轻链和每条重链包含N-端和C-端。每条轻链包含命名为VL1和VL2的第一可变结构域和第二可变结构域以及命名为CL的恒定结构域。在一些方面，轻链包含κ轻链。在一些方面，轻链包含λ轻链。
在一些方面，每条重链包含称为VH1和VH2的第一可变结构域和第二可变结构域，以及称为CH1的恒定结构域，接着是重链Fc区结构域。在一些方面，重链上的Fc区结构域可包括对特定免疫球蛋白类型或亚型特异的Fc区结构域，包括但不限于来自IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgA(例如IgA1或IgA2)、IgM、IgE或IgD抗体的Fc区。例如，在一些方面，免疫球蛋白属于IgG类，并且重链包含γ重链。在一些方面，免疫球蛋白属于IgG1类，并且重链包含γ1重链。在一些方面，免疫球蛋白属于IgG2类，并且重链包含γ2重链。在一些方面，免疫球蛋白属于IgG3类，并且重链包含γ3重链。在一些方面，免疫球蛋白属于IgG4类，并且重链包含γ4重链。
在一些方面，免疫球蛋白属于IgA类，并且重链包含α重链。在一些方面，免疫球蛋白属于IgA1类，并且重链包含α1重链。在一些方面，免疫球蛋白属于IgA2类，并且重链包含α2重链。
在一些方面，免疫球蛋白属于IgD类，并且重链包含δ重链。在一些方面，免疫球蛋白属于IgE类，并且重链包含ε重链。在一些方面，免疫球蛋白属于IgM类，并且重链包含μ重链。
在一些方面，免疫球蛋白分子可含有天然存在的天然多肽序列。
沿着轻链的可变结构域和恒定结构域的构造一般作为VL1-VL2-CL从N-端行进到C-端。然而，在某些方面，轻链上的可变结构域的构造可以颠倒，使得从N-端到C-端的构造是VL2-VL1-CL。该相同的构造适用于本发明的DVD免疫球蛋白的结合片段，其中从N-端到C-端的构造可以是VL1-VL2或VL2-VL1。类似地，沿着重链的可变结构域和恒定结构域的构造一般作为VH1-VH2-CH1-Fc从N-端行进到C-端，但可以被修饰以反映轻链上结构域的构造使得当免疫球蛋白分子或其结合片段被组装时，轻链上的适当结构域与重链上的适当结构域配对。
在某些方面，沿着轻链和重链的可变结构域和恒定结构域的构造可以被组织，使得沿着轻链的结构域的序列作为VL1-VL2-CH1从N-端行进到C-端，并且沿着重链的结构域的构造作为VH1-VH2-CL-Fc从N-端行进到C-端。这个特定的构造被称为CrossMAb构造，并且在Klein et al.,mAbs 4,653-663(2012)中详细描述，其公开内容通过引用整体并入本文。在某些方面，可以使用CrossMAb构造来产生双特异性DVD免疫球蛋白，其在下文中进一步描述。
在一些方面，第一可变结构域和第二可变结构域通过肽接头序列沿着它们的轻链或重链连接。肽接头序列可以是单个氨基酸或多肽序列。在一些方面，肽接头序列是ASTKGP(SEQ ID NO：1)或TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO：2)。可用于连接本发明的DVD免疫球蛋白的第一可变结构域和第二可变结构域的其他肽接头序列提供于美国专利No.7,612,181中，其公开内容通过引用的方式整体并入本文中。
如图1所示，两条轻链和两条重链的组装导致形成DVD免疫球蛋白分子，其中各种链间和链内二硫键稳定轻链和重链的相互作用。
本发明的DVD免疫球蛋白分子的方面包括具有抗原结合功能的第一可变结构域。选择本发明的DVD免疫球蛋白分子的VL 1和VH 1序列以特异性结合靶标，诸如例如肿瘤细胞上的抗原。免疫球蛋白可以通过诱导细胞凋亡，重定向细胞毒性，干扰配体-受体相互作用或阻止对肿瘤表型关键的蛋白质的表达来发挥抗肿瘤作用。此外，免疫球蛋白可以靶向肿瘤微环境的成分，扰乱重要的结构，例如扰乱肿瘤相关的脉管系统的形成。免疫球蛋白还可以靶向其配体为生长因子的受体，如表皮生长因子受体，从而抑制刺激细胞的天然配体与靶向肿瘤细胞的结合。替代地，免疫球蛋白可诱导ADCC、ADCP或CDC。
本领域技术人员将认识到与肿瘤相关的抗原已知针对实际上任何类型的癌症。可由本发明的DVD免疫球蛋白分子的第一可变结构域靶向的特定肿瘤相关的结合靶标包括但不限于：
HER2(ERBB2)，FOLR1，FOLR2，CD138，CD19，CD79A，CD79B，ROR1，
ROR2，FCRM，CS1，GPA33，MSLN，CD52，CD20，CD3，CD4，CD8，CD20，CD21，CD22，
CD23，CD30，CD33，CD38，CD44，CD56，CD70，BCMA，BMP6，IL12A，IL1A，IL1B，IL2，
IL24，INHA，TNF，TNFSF10，BMP6，EGF，FGF1，FGF10，FGF11，FGF12、FGF13，FGF14，
FGF16，FGF17，FGF18，FGF19，FGF2，FGF20，FGF21，FGF22，FGF23，FGF3，FGF4，
FGF5，FGF6，FGF7，FGF8，FGF9，GRP，IGF1，IGF2，IL12A，IL1A，IL1B，IL2，INHA，
TGFA，TGFB1，TGFB2，TGFB3，VEGF，CDK2，EGF，FGF10，FGF18，FGF2，FGF4，FGF7，
IGF1，IGF1R，IL2，VEGF，BCL2，CD164，CDKN1A，CDKN1B，CDKN1C，CDKN2A，
CDKN2B，CDKN2C，CDKN3，GNRH1，IGFBP6，IL1A，IL1B，ODZ1，PAWR，PLG，
TGFB1I1，AR，BRCA1，CDK3，CDK4，CDK5，CDK6，CDK7，CDK9，E2F1，EGFR
(ERBB1)，HER3(ERBB3)，HER4(ERBB4)，ENO1，ESR1，ESR2，IGFBP3，IGFBP6，IL2，
INSL4，MYC，NOX5，NR6A1，PAP，PCNA，PRKCQ，PRKD1，PRL，TP53，FGF22，FGF23，
FGF9，IGFBP3，IL2，INHA，KLK6，TP53，CHGB，GNRH1，IGF1，IGF2，INHA，INSL3，
INSL4，PRL，KLK6，SHBG，NR1D1，NR1H3，NR1I3，NR2F6，NR4A3，ESR1，ESR2，
NR0B1，NR0B2，NR1D2，NR1H2，NR1H4，NR1I2，NR2C1，NR2C2，NR2E1，NR2E3，
NR2F1，NR2F2，NR3C1，NR3C2，NR4A1，NR4A2，NR5A1，NR5A2，NR6A1，PGR，RARB，
FGF1，FGF2，FGF6，KLK3，KRT1，APOC1，BRCA1，CHGA，CHGB，CLU，COL1A1，
COL6A1，EGF，ERK8，FGF1，FGF10，FGF11，FGF13，FGF14，FGF16，FGF17，FGF18，
FGF2，FGF20，FGF21，FGF22，FGF23，FGF3，FGF4，FGF5，FGF6，FGF7，FGF8，FGF9，
GNRH1，IGF1，IGF2，IGFBP3，IGFBP6，IL12A，IL1A，IL1B，IL2，IL24，INHA，INSL3，
INSL4，KLK10，KLK12，KLK13，KLK14，KLK15，KLK3，KLK4，KLK5，KLK6，KLK9，
MMP2，MMP9，MSMB，NTN4，ODZ1，PAP，PLAU，PRL，PSAP，SERPINA3，SHBG，
TGFA，TIMP3，CD44，CDH1，CDH10，CDH19，CDH20，CDH7，CDH9，CDH1，CDH10，
CDH13，CDH18，CDH19，CDH20，CDH7，CDH8，CDH9，ROBO2，CD44，ILK，ITGA1，
APC，CD164，COL6A1，MTSS1，PAP，TGFB1I1，AGR2，AIG1，AKAP1，AKAP2，CANT1，
CAV1，CDH12，CLDN3，CLN3，CYB5，CYC1，DAB21P，DES，DNCL1，ELAC2，ENO2，
ENO3，FASN，FLJ12584，FLJ25530，GAGEB1，GAGEC1，GGT1，GSTP1，HIP1，
HUMCYT2A，IL29，K6HF，KAI1，KRT2A，MIB1，PART1，PATE，PCA3，PIAS2，PIK3CG，
PPID，PR1，PSCA，SLC2A2，SLC33A1，SLC43A1，STEAP，STEAP2，TPM1，TPM2，
TRPC6，ANGPT1，ANGPT2，ANPEP，ECGF1，EREG，FGF1，FGF2，FIGF，FLT1，JAG1，
KDR，LAMA5，NRP1，NRP2，PGF，PLXDC1，STAB1，VEGF，VEGFC，ANGPTL3，BAI1，
COL4A3，IL8，LAMA5，NRP1，NRP2，STAB1，ANGPTL4，PECAM1，PF4，PROK2，
SERPINF1，TNFAIP2，CCL11，CCL2，CXCL1，CXCL10，CXCL3，CXCL5，CXCL6，
CXCL9，IFNA1，IFNB1，IFNG，IL1B，IL6，MDK，EDG1，EFNA1，EFNA3，EFNB2，EGF，
EPHB4，FGFR3，HGF，IGF1，ITGB3，PDGFA，TEK，TGFA，TGFB1，TGFB2，TGFBR1，
CCL2，CDH5，COL18A1，EDG1，ENG，ITGAV，ITGB3，THBS1，THBS2，BAD，BAG1，
BCL2，CCNA1，CCNA2，CCND1，CCNE1，CCNE2，CDH1(E-钙粘蛋白)，CDKN1B(p27Kip1)，CDKN2A(pl6INK4a)，COL6A1，CTNNB1(b-连环蛋白)，CTSB(组织蛋白酶B)，ESR1，ESR2，F3(TF)，FOSL1(FRA-1)，GATA3，GSN(凝溶胶蛋白)，IGFBP2，IL2RA，IL6,IL6R,IL6ST(糖蛋白130),ITGA6(a6整联蛋白),JUN,KLK5,KRT19,MAP2K7(c-Jun),MKI67(Ki-67),NGFB(NGF),NGFR,NME1(NM23A),PGR,PLAU(uPA),PTEN,SERPINB5(乳腺丝抑蛋白),SERPFE1(PAI-1),TGFA,THBS1(血小板反应蛋白-1),TIE(Tie-1),TNFRSF6(Fas),TNFSF6(FasL),TOP2A(拓扑异构酶Iia),TP53,AZGP1(锌-a-糖蛋白),BPAG1(网蛋白),CDKN1A(p21Wapl/Cipl),CLDN7(密封蛋白-7),CLU(丛生蛋白),FGF1,FLRT1(纤连蛋白),GABRP(GABAa),GNAS1,ID2,ITGA6(a6整联蛋白),ITGB4(b 4整联蛋白),KLF5(GC Box BP),KRT19(角蛋白19),KRTHB6(毛发特异性II型角蛋白),MACMARCKS,MT3(金属硫蛋白-III),MUC1(粘蛋白),PTGS2(COX-2),RAC2(p21Rac2),S100A2,SCGB1D2(亲脂素B),SCGB2A1(乳房珠蛋白2),SCGB2A2(乳房珠蛋白1),SPRRIB(Sprl),THBSl,THBS2,THBS4,和TNF AIP2(B94)。
提供抗原结合功能的第一可变结构域的氨基酸序列可以包括嵌合的、人源化的或人的氨基酸序列。此类序列的任何适合的组合可以掺入本发明的DVD免疫球蛋白分子的第一可变结构域中。
抗原结合可变区序列可以选自能够结合特定靶标并且为本领域所公知的各种单克隆抗体。这些包括但不限于：抗TNF抗体(美国专利No.6,258,562)，抗IL-12和/或抗IL-12p40抗体(美国专利No.6,914,128)；抗IL-18抗体(US 2005/0147610Al)，抗C5，抗CBL，抗CD147，抗gp120，抗VLA4，抗CD11a，抗CD18，抗VEGF，抗CD40L，抗-Id，抗-ICAM-1，抗-CXCL13，抗-CD2，抗-EGFR，抗TGF-β2，抗E-选择素，抗-Fact VII，抗Her 2/neu，抗F gp，抗CD11/18，抗CD14，抗ICAM-3，抗CD80，抗CD4，抗CD3，抗CD23，抗β2-整合，抗α4β7，抗CD52，抗HLA DR，抗CD22，抗CD20，抗MIF，抗CD64(FcR)，抗TCRαβ，抗CD2，抗Hep B，抗CA 125，抗EpCAM，抗gp120，抗CMV，抗gpIIbIIIa，抗IgE，抗CD25，抗CD33，抗HLA，抗VNR整联蛋白，抗IL-1α，抗IL-1β，抗IL-1受体，抗IL-2受体，抗IL-4，抗IL4受体，抗IL5，抗IL-5受体，抗IL-6，抗IL-8，抗IL-9，抗IL-13，抗IL-13受体，抗IL-17和抗IL-23(参见Presta LG.2005Selection,design,andengineering of therapeutic antibodies J Allergy Clin Immunol.116:731-6和Clark,M.,"Antibodies for Therapeutic Applications,"英国剑桥大学病理学系，2000年10月15日，在剑桥大学病理学系网站M.Clark的主页上在线发表)。
抗原结合可变区序列还可以选自批准在临床试验或在用于临床使用的研发中使用的各种治疗性抗体。这样的治疗性抗体包括但不限于：IDEC/Genentech/Roche)(参见例如美国专利No.5,736,137)，被批准用于治疗非霍奇金淋巴瘤的嵌合抗CD20抗体；目前Genmab正在研发的抗CD20抗体，描述于美国专利No.5,500,362中的抗CD20抗体，AME-133(Applied Molecular Evolution),hA20(Immunomedics,Inc.),HumaLYM(Intracel),以及PRO70769(PCT/US2003/040426,名称为"ImmunoglobulinVariants and Uses Thereof"),曲妥珠单抗(Genentech)(参见例如美国专利No.5,677,171),批准用于治疗乳腺癌的人源化抗Her2/neu抗体；当前正在由Genentech研发的帕妥珠单抗(rhuMab-2C4,)；在美国专利No.4,753,894描述的抗Her2抗体；西妥昔单抗(Imclone)(美国专利No.4,943,533；PCT WO96/40210),在用于多种癌症的临床试验中的嵌合抗EGFR抗体；目前正在由Abgenix-Immunex-Amgen研发的ABX-EGF(美国专利No.6,235,883)；目前正由Genmab研发的HUMAX-EGFRTM(美国序列No.10/172,317)；425,EMD55900,EMD62000,和EMD72000(Merck KGaA)(美国专利No.5,558,864；Murthy et al.1987,Arch Biochem Biophys.252(2):549-60；Rodeck et al.,1987,J Cell Biochem.35(4):315-20；Kettleborough et al.,1991,Protein Eng.4(7):773-83)；ICR62(Institute of Cancer Research)(PCT WO 95/20045；Modjtahedi et al.,1993,J.Cell Biophys.1993,22(1-3):129-46；Modjtahedi et al.,1993,Br J Cancer.1993,67(2):247-53；Modjtahedi et al,1996,Br J Cancer,73(2):228-35；Modjtahedi et al,2003,Int J Cancer,105(2):273-80)；TheraCIM hR3(YMBiosciences,Canada and Centro de Immunologia Molecular,Cuba(美国专利No.5,891,996；美国专利No.6,506,883；Mateo et al,1997,Immunotechnology,3(1):71-81)；mAb-806(Ludwig Institute for Cancer Research,Memorial Sloan-Kettering)(Jungbluthet al.2003,Proc Natl Acad Sci USA.100(2):639-44)；KSB-102(KS Biomedix)；MRl-1(IVAX,National Cancer Institute)(PCT WO 0162931A2)；和SC1OO(Scancell)(PCT WO01/88138)；alemtuzumab(Millennium)，一种目前被批准用于治疗B细胞慢性淋巴细胞性白血病的人源化单克隆抗体；muromonab-CD3(Orthoclone)，由Ortho Biotech/Johnson&Johnson开发的抗CD3抗体，ibritumomab tiuxetan由IDEC/Schering AG开发的抗CD20抗体，杰米珠单抗奥佐米星由Celltech/Wyeth开发的抗CD33(p67蛋白)抗体，alefacept由Biogen开发的抗LFA-3Fc融合蛋白，由Centocor/Lilly研发的abciximab由Novartis开发的basiliximab由Medimmune开发的帕利珠单抗infliximab由Centocor开发的抗TNFα抗体，阿达木单抗由Abbott开发的抗TNFα抗体，由Celltech开发的抗TNFα抗体，etanercept由Immunex/Amgen开发的抗TNFαFc融合物，ABX-CBL，由Abgenix开发的抗CD147抗体，ABX-IL8，由Abgenix开发的抗IL8抗体，ABX-MA1，由Abgenix开发的抗MUC18抗体，Pemtumomab(R1549,90Y-muHMFG1)由Antisoma开发的抗MUC1，Therex(R1550),由Antisoma开发的抗MUC1抗体，由Antisoma开发的AngioMab(AS1405)，由Antisoma开发的HuBC-1，由Antisoma开发的Thioplatin(AS1407)，(那他珠单抗)，由Biogen开发的抗α-4-β-1(VLA4)和α-4-β-7抗体，VLA-1mAb，由Biogen开发的抗VLA-1整联蛋白抗体，LTBR mAb,由Biogen开发的抗淋巴毒素β受体(LTBR)抗体，CAT-152，由Cambridge Antibody Technology开发的抗TGF-β2抗体，J695，正在由Cambridge Antibody Technology和Abbott开发的抗IL-12抗体，CAT-192，由Cambridge Antibody Technology和Genzyme开发的抗TGF-β1抗体，CAT-213，由CambridgeAntibody Technology开发的抗Eotaxin1抗体， 由CambridgeAntibody Technology和Human Genome Sciences Inc.开发的抗Blys抗体，TRAIL-R1mAb，由Cambridge Antibody Technology和Human Genome Sciences Inc.开发的抗TRAIL-R1抗体，贝伐单抗，rhuMAb-VEGF，由Genentech开发的抗VEGF抗体，由Genentech开发的抗HER受体家族抗体，抗-组织因子(ATF)，由Genentech开发的抗组织因子抗体，(Omalizumab)，由Genentech开发的抗IgE抗体，(Efalizumab)，由Genentech和Xoma开发的抗CD11a抗体，由Genentech和Millennium Pharmaceuticals开发的MLN-02抗体(以前称为LDP-02)，HUMAX由Genmab开发的抗CD4抗体，HUMAXTM-IL15，一种由Genmab和Amgen开发的抗IL15a抗体，由Genmab和Medarex开发的HUMAXTM-Inflam，HUMAXTM-癌症，由Genmab和Medarex以及Oxford GlycoSciences开发的抗Heparanase I抗体，由Genmab和Amgen开发的HUMAXTM-淋巴瘤，由Genmab开发的HUMAXTM-TAC，IDEC-131，由IDEC Pharmaceuticals开发的抗CD40L抗体，IDEC-151(Clenoliximab)，由IDEC Pharmaceuticals开发的抗CD4抗体，IDEC-114，由IDEC Pharmaceuticals开发的抗CD80抗体，IDEC-152，由IDEC Pharmaceuticals开发的抗CD23，由IDEC Pharmaceuticals开发的抗巨噬细胞迁移因子(MIF)抗体，BEC2，由Imclone开发的抗独特型抗体，IMC-1C11,由Imclone开发的抗KDR抗体，DC101，由Imclone开发的抗flk-1抗体，由Imclone开发的抗VE钙粘蛋白抗体，(拉贝珠单抗)，由Immunomedics开发的抗癌胚抗原(CEA)抗体，(Epratuzumab),由Immunomedics开发的抗CD22抗体，由Immunomedics开发的AFP-Cide，由Immunomedics开发的MyelomaCide,由Immunomedics开发的LkoCide,由Immunomedics开发的ProstaCide，MDX-010，由Medarex开发的抗-CTLA4抗体，MDX-060，由Medarex开发的抗CD30抗体，由Medarex开发的MDX-070，由Medarex开发的MDX-018，(IDM-1),由Medarex和Immuno-Designed Molecules开发的抗Her2抗体，由Medarex和Genmab开发的抗CD4抗体，HuMax-IL15，由Medarex和Genmab开发的抗IL15抗体，CNTO 148，由Medarex和Centocor/J&J开发的抗TNFα抗体，CNTO1275，由Centocor/J&J开发的抗细胞因子抗体，MOR101和MOR102，由MorphoSys开发的抗细胞间粘附分子-1(ICAM-1)(CD54)抗体，MOR201，由MorphoSys开发的抗成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)抗体，(visilizumab)，由Protein Design Labs开发的抗CD3抗体，由Protein Design Labs开发的抗-γ干扰素抗体，由Protein DesignLabs开发的Anti-α5β1整合素，由Protein Design Labs开发的抗IL-12，ING-1,由Xoma开发的抗Ep-CAM抗体，(Omalizumab)，由Genentech和Novartis开发的人源化抗IgE抗体(Omalizumab)，和MLN01,由Xoma开发的抗β2整联蛋白抗体。本段中的所有以上引用的内容明确地通过引用并入本文。
本发明的DVD免疫球蛋白分子的方面包括来自38C2抗体的第二可变结构域，其包含反应性赖氨酸残基。例如在美国专利No.8,252,902中描述了38C2抗体，其公开内容通过引用整体并入本文。简而言之，38C2抗体的重链可变区包括可以与接头反应的单一的唯一反应性赖氨酸残基，由此提供与药物部分缀合的附接点。如此，包含38C2抗体的可变结构域的免疫球蛋白分子含有两个可用于与药物部分结合的这种连接点(每个重链上有一个连接点)。一旦反应性赖氨酸残基与接头缀合，38C2可变结构域的结合功能就丧失，这意味着可变结构域不再与靶标结合。因此，虽然不受任何具体理论的限制，但用于本发明的DVD免疫球蛋白分子中的38C2抗体的可变结构域为缀合提供了附接点，但不提供抗原结合功能。
人源化38C2抗体的轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列在SEQ ID NO:3中提供。人源化38C2抗体的重链可变结构域(VH)的氨基酸序列在SEQ ID NO:4中提供。
在一些方面，本发明的DVD免疫球蛋白分子包含作为VL2结构域序列的人源化38C2抗体的轻链可变结构域序列(SEQ ID NO:3)。在一些方面，本发明的DVD免疫球蛋白分子包括与SEQ ID NO:3基本上相似的VL2结构域序列，例如，与SEQ ID NO:3具有至少约80％的氨基酸序列同一性，或者与SEQ ID NO:3具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
在一些方面，本发明的DVD免疫球蛋白分子包含作为VH2结构域序列的人源化38C2抗体(SEQ ID NO:4)的重链可变结构域序列。在一些方面，本发明的DVD免疫球蛋白分子包括与SEQ ID NO:4基本上相似的VH2结构域序列，例如，与SEQ ID NO:4具有至少约80％的氨基酸序列同一性，替代地，与SEQ ID NO:4具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性，并且包括反应性赖氨酸残基。
本发明的DVD免疫球蛋白分子可以包含嵌合、人源化和人免疫球蛋白序列，并且在一些方面，可以包含其任何混合物。例如，在一些方面，DVD免疫球蛋白分子可以包括嵌合第一可变结构域，并且可以包括人第二可变结构域。在一些方面，DVD免疫球蛋白分子可以包括人源化第一可变结构域，并且可以包含人第二可变结构域。可以在本发明的DVD免疫球蛋白分子中使用嵌合、人源化和人免疫球蛋白序列的任何适合的组合。
在一些方面，本发明的DVD免疫球蛋白可针对效应子功能进行修饰，例如以增强免疫球蛋白的ADCC、ADCP或CDC。这可以通过在免疫球蛋白的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现。可替代地或附加地，可以将半胱氨酸残基引入Fc区，由此允许在该区域中形成链间二硫键。如此产生的免疫球蛋白可具有改善的内化能力和/或增加的ADCC、ADCP或CDC。参见Caron et al.,J.Exp Med.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.J.Immunol.148:2918-2922(1992)。例如，为了增加免疫球蛋白的血清半衰期，可以将补救受体结合表位掺入免疫球蛋白(尤其是免疫球蛋白片段)中，如美国专利5,739,277中所述。如本文所使用的，术语“补救受体结合表位”是指IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位，其负责增加IgG分子的体内血清半衰期。
如图2所示，根据本发明的方面的DVD免疫球蛋白包括提供抗原结合功能性的第一可变结构域和来自38C2抗体的第二可变结构域，其包含可以与接头缀合的单一的唯一反应性赖氨酸残基。
在一个具体的方面，DVD免疫球蛋白包含结合HER2的第一可变结构域，并且包含作为第二可变结构域的人源化38C2抗体可变结构域。可变结构域在每条轻链和重链上与肽接头序列ASTKGP(SEQ ID NO:1)连接。这个特定方面被称为“HER2-h38C2-DVD1”并且在图3中被描绘。该方面的轻链氨基酸序列在SEQ ID NO:5中提供。该方面的重链氨基酸序列在SEQID NO:6中提供。在一些方面，本发明的HER2-h38C2-DVD1免疫球蛋白分子包括与SEQ IDNO:5基本上相似的轻链氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO:5具有至少约80％的氨基酸序列同一性，替代地与SEQ ID NO:5具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。在一些方面，本发明的HER2-h38C2-DVD1免疫球蛋白分子包括与SEQ ID NO:6基本上相似的重链氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO:6具有至少约80％的氨基酸序列同一性，替代地，与SEQID NO:6具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性，并且包括反应性赖氨酸残基。
在另一个具体方面，DVD免疫球蛋白包含结合HER2的第一可变结构域，并且包含作为第二可变结构域的人源化38C2抗体可变结构域。可变结构域在每条轻链和重链上与肽接头序列TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:2)连接。这个特定方面被称为“HER2-h38C2-DVD2”并且在图3中被描绘。该方面的轻链氨基酸序列在SEQ ID NO:7中提供。该方面的重链氨基酸序列在SEQ ID NO:8中提供。在一些方面，本发明的HER2-h38C2-DVD2免疫球蛋白分子包括与SEQID NO:7基本上相似的轻链氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO:7具有至少约80％的氨基酸序列同一性，替代地与SEQ ID NO:7具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。在一些方面，本发明的HER2-h38C2-DVD2免疫球蛋白分子包括与SEQ ID NO:8基本上相似的重链氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO:8具有至少约80％的氨基酸序列同一性，替代地，与SEQ ID NO:8具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性，并且包括反应性赖氨酸残基。
在一个具体的方面，DVD免疫球蛋白包含结合FOLR1的来自IMGN-853抗FOLRl抗体(Immunogen,Waltham MA)的第一可变结构域，并且包含作为第二可变结构域的人源化38C2抗体可变结构域。可变结构域在每条轻链和重链上与肽接头序列ASTKGP(SEQ ID NO:1)连接。这个特定方面被称为“IMGN-853 FOLRl-h38C2-DVD1”并且在图4中被示意地描绘。该方面的轻链氨基酸序列在SEQ ID NO:9中提供。该方面的重链氨基酸序列在SEQ ID NO:10中提供。在一些方面，本发明的IMGN-853 FOLR1-h38C2-DVD1免疫球蛋白分子包括与SEQ IDNO:9基本上相似的轻链氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO:9具有至少约80％的氨基酸序列同一性，替代地与SEQ ID NO:9具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。在一些方面，本发明的IMGN-853 FOLR1-h38C2-DVD1免疫球蛋白分子包括与SEQ ID NO:10基本上相似的重链氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO:10具有至少约80％的氨基酸序列同一性，替代地，与SEQ ID NO:10具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性，并且包括反应性赖氨酸残基。
在另一个具体的方面，DVD免疫球蛋白包含结合FOLR1的来自IMGN-853抗FOLRl抗体(Immunogen,Waltham MA)的第一可变结构域，并且包含作为第二可变结构域的人源化38C2抗体可变结构域。可变结构域在每条轻链和重链上与肽接头序列TVAAPSVFIFPP(SEQID NO:2)连接。这个特定方面被称为“IMGN-853 FOLRl-h38C2-DVD2”并且在图4中被示意地描绘。该方面的轻链氨基酸序列在SEQ ID NO:11中提供。该方面的重链氨基酸序列在SEQID NO:12中提供。在一些方面，本发明的IMGN-853 FOLR1-h38C2-DVD2免疫球蛋白分子包括与SEQ ID NO:11基本上相似的轻链氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO:11具有至少约80％的氨基酸序列同一性，替代地与SEQ ID NO:11具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。在一些方面，本发明的IMGN-853FOLR1-h38C2-DVD2免疫球蛋白分子包括与SEQ IDNO:12基本上相似的重链氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO:12具有至少约80％的氨基酸序列，替代地，与SEQ ID NO:12具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性，并且包括反应性赖氨酸残基。
在一个具体的方面，DVD免疫球蛋白包含结合FOLR1的来自法勒珠单抗抗体(Morphotek,Inc.,Exton PA)的第一可变结构域，并且包含作为第二可变结构域的人源化38C2抗体可变结构域。可变结构域在每条轻链和重链上与肽接头序列ASTKGP(SEQ ID NO:1)连接。这个特定方面被称为“法勒珠单抗FOLR1-h38C2-DVD1”并且在图4中被示意地描绘。该方面的轻链氨基酸序列在SEQ ID NO:13中提供。该方面的重链氨基酸序列在SEQ ID NO:14中提供。在一些方面，本发明的法勒珠单抗FOLR1-h38C2-DVD1免疫球蛋白分子包括与SEQID NO:13基本上相似的轻链氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO:13具有至少约80％的氨基酸序列同一性，替代地与SEQ ID NO:13具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。在一些方面，本发明的法勒珠单抗FOLR1-h38C2-DVD1免疫球蛋白分子包括与SEQ IDNO:14基本上相似的重链氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO:14具有至少约80％的氨基酸序列同一性，替代地，与SEQ ID NO:14具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性，并且包括反应性赖氨酸残基。
在另一个具体的方面，DVD免疫球蛋白包含来自法勒珠单抗抗体(Morphotek,Inc.,Exton PA)的第一可变结构域，并且包含作为第二可变结构域的人源化38C2抗体可变结构域。可变结构域在每条轻链和重链上与肽接头序列TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:2)连接。这个特定方面被称为“法勒珠单抗FOLR1-h38C2-DVD2”并且在图4中被示意地描绘。该方面的轻链氨基酸序列在SEQ ID NO:15中提供。该方面的重链氨基酸序列在SEQ ID NO:16中提供。在一些方面，本发明的法勒珠单抗FOLR1-h38C2-DVD2免疫球蛋白分子包括与SEQ IDNO:15基本上相似的轻链氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO:15具有至少约80％的氨基酸序列同一性，替代地与SEQ ID NO:15具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。在一些方面，本发明的法勒珠单抗FOLR1-h38C2-DVD2免疫球蛋白分子包括与SEQ ID NO:16基本上相似的重链氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO:16具有至少约80％的氨基酸序列同一性，替代地，与SEQ ID NO:16具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性，并且包括反应性赖氨酸残基。
在一个具体的方面，DVD免疫球蛋白包含结合CD138的第一可变结构域，并且包含作为第二可变结构域的人源化38C2抗体可变结构域。可变结构域在每条轻链和重链上与肽接头序列ASTKGP(SEQ ID NO:1)连接。这个特定方面被称为“CD138-h38C2-DVD1”并且在图5中被示意地描绘。该方面的轻链氨基酸序列在SEQ ID NO:17中提供。该方面的重链氨基酸序列在SEQ ID NO:18中提供。在一些方面，本发明的CD138-h38C2-DVD1免疫球蛋白分子包括与SEQ ID NO:17基本上相似的轻链氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO:17具有至少约80％的氨基酸序列同一性，替代地与SEQ ID NO:17具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。在一些方面，本发明的CD138-h38C2-DVD1免疫球蛋白分子包括与SEQ IDNO:18基本上相似的重链氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO:18具有至少约80％的氨基酸序列同一性，替代地，与SEQ ID NO:18具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性，并且包括反应性赖氨酸残基。
在另一个具体的方面，DVD免疫球蛋白包含结合CD138的第一可变结构域，并且包含作为第二可变结构域的人源化38C2抗体可变结构域。可变结构域在每条轻链和重链上与肽接头序列TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:2)连接。这个特定方面被称为“CD138-h38C2-DVD2”并且在图5中被示意地描绘。该方面的轻链氨基酸序列在SEQ ID NO:19中提供。该方面的重链氨基酸序列在SEQ ID NO:20中提供。在一些方面，本发明的CD138-h38C2-DVD2免疫球蛋白分子包括与SEQ ID NO:19基本上相似的轻链氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO:19具有至少约80％的氨基酸序列同一性，替代地与SEQ ID NO:19具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。在一些方面，本发明的CD138-h38C2-DVD2免疫球蛋白分子包括与SEQID NO:20基本上相似的重链氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO:20具有至少约80％的氨基酸序列同一性，替代地，与SEQ ID NO:20具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性，并且包括反应性赖氨酸残基。
在一个具体的方面，DVD免疫球蛋白包含结合CD79b的第一可变结构域，并且包含作为第二可变结构域的人源化38C2抗体可变结构域。可变结构域在每条轻链和重链上与肽接头序列ASTKGP(SEQ ID NO:1)连接。这个特定方面被称为“CD79b-h38C2-DVD1”。该方面的轻链氨基酸序列在SEQ ID NO:21中提供。该方面的重链氨基酸序列在SEQ ID NO:22中提供。在一些方面，本发明的CD79b-h38C2-DVD1免疫球蛋白分子包括与SEQ ID NO:21基本上相似的轻链氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO:21具有至少约80％的氨基酸序列同一性，替代地与SEQ ID NO:21具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。在一些方面，本发明的CD79b-h38C2-DVD1免疫球蛋白分子包括与SEQ ID NO:22基本上相似的重链氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO:22具有至少约80％的氨基酸序列同一性，替代地，与SEQ ID NO:22具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性，并且包括反应性赖氨酸残基。
在另一个具体的方面，DVD免疫球蛋白包含结合CD79b的第一可变结构域，并且包含作为第二可变结构域的人源化38C2抗体可变结构域。可变结构域在每条轻链和重链上与肽接头序列TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:2)连接。这个特定方面被称为“CD79b-h38C2-DVD2”。该方面的轻链氨基酸序列在SEQ ID NO:23中提供。该方面的重链氨基酸序列在SEQ ID NO:24中提供。在一些方面，本发明的CD79b-h38C2-DVD2免疫球蛋白分子包括与SEQ ID NO:23基本上相似的轻链氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO:23具有至少约80％的氨基酸序列同一性，替代地与SEQ ID NO:23具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。在一些方面，本发明的CD79b-h38C2-DVD2免疫球蛋白分子包括与SEQ ID NO:24基本上相似的重链氨基酸序列，例如，与SEQ ID NO:24具有至少约80％的氨基酸序列同一性，替代地，与SEQ ID NO:24具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性，并且包括反应性赖氨酸残基。
在某些方面，本发明的DVD免疫球蛋白分子是双特异性的，因为免疫球蛋白的一个臂包含对第一结合靶标具有结合特异性的第一可变结构域，并且第二臂包含对第二结合靶标具有结合特异性的第一可变结构域。这些方面提供了结合到两个不同靶标的能力，从而提供了额外的功能。示例性的双特异性DVD免疫球蛋白分子在图6中描绘。
在某些方面，本发明的DVD免疫球蛋白分子是双互补位的，因为免疫球蛋白的一个臂包含对第一结合靶具有结合特异性的第一可变结构域，并且第二臂包含对相同的结合靶标(但是对于不同的结合表位)具有结合特异性的第一可变结构域。这些方面提供了结合覆盖两个不同但可能略微重叠的结合表位的相同靶标的能力，由此提供靶标交联功能，在内化后触发溶酶体运输。
在某些方面，免疫球蛋白分子是完整的免疫球蛋白分子，其包含如上所述的第一可变区和第二可变区，并且还包含轻链上的CL结构域，以及重链恒定结构域CH1、CH2和CH3。恒定结构域可以包含天然或非天然序列或其氨基酸序列变体。在某些方面，免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白片段。免疫球蛋白片段的示例包含但不限于(Fab')2、Fab'、Fab和Fv片段，其非限制性示例于图6中描绘。
DVD免疫球蛋白的生产
本发明的DVD免疫球蛋白可以通过本领域已知的多种技术中的任何一种来生产。例如，来自宿主细胞的表达，其中通过标准技术将编码DVD重链和/或DVD轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式意在涵盖通常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞中的各种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的DVD免疫球蛋白，但是真核细胞中DVD免疫球蛋白的表达是优选的，并且最优选在哺乳动物宿主细胞中的表达，因为这样的真核细胞(特别是哺乳动物细胞)是比原核细胞更容易组装和分泌适当折叠和免疫激活的DVD免疫球蛋白。
用于表达本发明重组免疫球蛋白的优选哺乳动物宿主细胞包含中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包含在Urlaub and Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中所述的dhfr-CHO细胞，其与DHFR选择标记物一起使用，例如，如R.J.Kaufman andP.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中所述)，人胚胎肾(HEK)细胞，NS0骨髓瘤细胞，COS细胞和SP2细胞。当将编码DVD免疫球蛋白的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞一段时间来产生DVD免疫球蛋白，所述时间足以允许在宿主细胞中表达DVD免疫球蛋白，或者更优选分泌DVD免疫球蛋白到宿主细胞所生长的培养基中。使用标准蛋白质纯化方法可以从培养基中回收DVD免疫球蛋白。
在本发明的用于重组表达DVD免疫球蛋白的优选系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码DVD重链和DVD轻链的重组表达载体导入dhfr-CHO细胞。在重组表达载体内，DVD重链和轻链基因各自可操作地连接CMV增强子/AdMLP启动子调节元件以驱动基因的高水平转录。重组表达载体也携带DHFR基因，其允许使用甲氨蝶呤选择/扩增来选择已经用载体转染的CHO细胞。培养选择的转化体宿主细胞以允许表达DVD重链和轻链，并从培养基中回收完整的DVD免疫球蛋白。使用标准分子生物学和组织培养技术来制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞并从培养基中回收DVD免疫球蛋白。另外，本发明的方面包含合成本发明的DVD免疫球蛋白的方法，其通过在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞直至合成本发明的DVD免疫球蛋白。该方法可以进一步包含从培养基中分离DVD免疫球蛋白以产生分离的免疫球蛋白。
本发明的DVD免疫球蛋白的一个特征是它们可以以与常规抗体类似的方式产生和纯化。本发明的DVD免疫球蛋白的生产可以导致具有期望的活性的、没有任何序列修饰的恒定区或任何种类的化学修饰的同质的单一的主要产品。
接头
本发明的免疫缀合物的方面包含接头，其可以包含一种或多种接头成分。根据本发明的方面的接头用于将货物部分(例如药物部分)连接到DVD-Ig，并且可以采用任何合适的化学物质。本发明的免疫缀合物中可包含各种类型的接头功能性，其包括但不限于可裂解的接头和不可裂解的接头，以及可逆接头和不可逆接头。
可裂解的接头是依靠靶标细胞内的过程以释放药物部分的那些，如细胞质中的还原，暴露于溶酶体或内体中的酸性条件或者通过细胞内特定酶(例如蛋白酶)的可裂解。如此，可裂解的接头允许附接的药物部分在免疫缀合物已被内化并在靶细胞内处理后以其原始形式释放。可裂解的接头包含但不限于那些可以被酶裂解的键(例如肽接头)；还原条件(例如二硫键接头)；或酸性条件(例如腙和碳酸酯)。可裂解的接头的非限制性示例在图7中提供。
不可裂解的接头利用免疫缀合物的分解代谢降解来释放药物部分。释放的药物部分通常保留接头以及接头所缀合的免疫球蛋白的氨基酸残基。不可裂解的接头包含但不限于PEG接头、烃接头和硫醚接头。不可裂解的接头的非限制性示例在图8中提供。
本发明的免疫缀合物的方面还可以包含可逆和不可逆接头。可逆连接器利用化学键，所述化学键可以使用合适的试剂容易地断裂或逆转。如此，在形成可逆接头后，接头可通过用试剂处理而在所需位置断裂，从而从接头释放免疫球蛋白分子。可逆接头的非限制性示例在图9中提供，并且包含例如二酮部分。不可逆转接头使用化学键，该化学键在形成后不易断裂或逆转。如此，在形成不可逆接头之后，免疫球蛋白分子不能被容易地释放。在图10中提供了不可逆接头的非限制性示例，并且包含例如β-内酰胺部分。其中免疫球蛋白与可逆或不可逆接头缀合的示例性接头反应于图13中描绘。
除了β-内酰胺和二酮部分之外，在一些方面，其他部分(例如乙烯基二酮和前(pro)乙烯基二酮)可以用于缀合。在一些方面，亲电子部分(柄)可以单独使用或与这些部分组合使用。亲电子部分可以用于与h38C2可变结构域的单一的唯一反应性赖氨酸进行位点特异性结合，并且也可以在h38C2赖氨酸已与药物部分缀合后用于非特异性缀合。其它部分的非限制性示例包含6-马来酰亚胺己酰基(“MC”)、马来酰亚胺丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)以及由与以下接头试剂缀合产生的那些：形成接头部分4-巯基戊酸的N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶硫基)戊酸酯(“SPP”)，形成接头部分4-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)甲基)环己烷羧酸的N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1羧酸酯(“SMCC”，在本文中也称为“MCC”)，形成接头部分4-巯基丁酸的2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸酯(“SPDB”)，N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)，作为一种或多种重复单元的亚乙基氧基-CH2CH2O-(“EO”或“PEO”)。进一步的信息在Sinha et al.,Nat.Protoc.2,449-456(2007)中提供，其公开内容通过引用整体并入本文。
在一些方面，接头成分可以包含氨基酸单元。在一个这样的方面，氨基酸单元允许通过蛋白酶切割接头，从而在暴露于细胞内蛋白酶(如溶酶体酶)时促进药物从免疫缀合物释放。参见例如Doronina et al.(2003)Nat.Biotechnol.21:778-784。氨基酸单元的非限制性示例包含但不限于二肽、三肽、四肽和五肽。二肽的非限制性示例包含：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)，丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)；苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)；或N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。三肽的非限制性实例包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。氨基酸单元可以包含天然存在的氨基酸残基，以及次要氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，例如瓜氨酸。可以设计和优化氨基酸单位的选择性，以用于通过特定的酶(例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D或纤溶酶蛋白酶)进行酶切割。
在一些方面，接头L可以是用于通过支链多功能接头部分将多于一个的药物部分共价连接至免疫球蛋白的支链或树枝型接头(Sun et al(2002)Bioorganic&MedicinalChemistry Letters 12:2213-2215；Sun et al(2003)Bioorganic&Medicinal Chemistry11:1761-1768)。支链树状连接体的非限制性示例包含2,6-双(羟甲基)-对-甲酚和2,4,6-三(羟甲基)-苯酚树状体单元(WO 2004/01993；Szalai et al(2003)J.Amer.Chem.Soc.125:15688-15689；Shamis et al(2004)J.Amer.Chem.Soc.126:1726-1731；Amir et al(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42:4494-4499)。支链接头可以增大药物比免疫球蛋白的摩尔比，即负载，这与ADC的效力有关。因此，例如，在免疫球蛋白仅具有一个用于缀合的反应性氨基酸残基的情况下，多个药物部分可以通过支链接头连接。
包含延伸物、间隔和氨基酸单元的接头成分可以通过本领域已知的方法合成，这些方法如在美国专利公开No.2005/0238649A1中描述的那些，其通过引用整体并入本文。
货物部分
如上所述，本发明的方面包含通过接头与一个或多个货物部分缀合的免疫球蛋白分子。货物部分广泛地包含但不限于生物活性部分，例如药物部分和表达修饰部分，以及非生物活性部分，例如可检测部分(例如可检测标记)。本文进一步描述了这些部分中的每一种。
药物部分的非限制性示例包含能够杀死靶细胞或阻止靶细胞生长的细胞毒性剂和细胞抑制剂。在一些方面，药物部分包含毒素、化学治疗剂、抗生素、放射性同位素、螯合放射性同位素和溶核酶。
在一些方面，药物部分选自奥瑞斯他汀(auristatin)；多拉司他汀(dolostatin)；西马多丁(cemadotin)；MMAF；MMAE；美登木素类(包含但不限于DM1、DM3和DM4)；吡咯并苯并二氮卓(PBD，包含但不限于单体和二聚PBD)；烯二炔类(包含但不限于加利车霉素和天赐米星(tiancimycins))；喜树碱(包含但不限于SN-38)；和阿霉素(包含但不限于MMDX或其生物活化产物，例如PNU-159682)。
在某些方面，本发明的免疫缀合物的药物部分选自由V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、奥瑞斯他汀(auristatin)、多拉司他汀、美登木素生物碱、MetAP(蛋氨酸氨肽酶)、蛋白质CRM1的核输出抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酸转移反应的抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合剂和DHFR抑制剂。
此外，可将本发明的免疫球蛋白(或其结合片段)缀合至修饰给定生物反应的药物部分。药物部分不应被解释为限于经典化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质、肽或多肽。这样的蛋白质可以包含例如毒素，例如相思豆毒素，蓖麻毒蛋白A，假单胞菌外毒素，霍乱毒素或白喉毒素，蛋白质，如肿瘤坏死因子，α-干扰素，β-干扰素，神经生长因子，血小板衍生的生长因子，组织纤溶酶原激活剂，细胞因子，凋亡剂，抗血管生成剂或生物反应调节剂，例如淋巴因子。
在一些方面，药物部分可以是细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性毒素。细胞毒素的示例包含但不限于紫杉烷，DNA-烷化剂(例如CC-1065类似物)，蒽环类抗生素，微管蛋白抑制素类似物，倍癌霉素(duocarmycin)类似物，奥瑞斯他汀E，奥瑞斯他汀F，美登木素类和包含反应性聚乙二醇部分的细胞毒剂，taxon，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，依米丁，丝裂霉素，依托泊苷，tenoposide，长春新碱，长春碱，秋水仙碱，阿霉素，柔红霉素，二羟基炭疽菌素二酮，米托蒽醌，光辉霉素，放线菌素D，1-脱氢睾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。药物部分还可以包含例如抗代谢物(例如甲氨喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)，消融剂(例如，二氯甲基二乙胺、噻替哌苯丁酸氮芥、美普兰、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)，环磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，链脲佐菌素，丝裂霉素C和顺式-二氯二胺铂(II)(DDP)，顺铂，蒽环类药物(如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如更生霉素(以前称为放线菌素)，博来霉素，光辉霉素和安曲霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。参见例如美国专利公开No.20090304721，其通过引用整体并入本文。
可以与本发明的抗体、抗体片段(抗原结合片段)或功能等同物缀合的细胞毒素的其他非限制性示例包含倍癌霉素、加利车霉素、美登素和奥瑞斯他汀及其衍生物。
本发明的免疫球蛋白或其结合片段也可以与放射性同位素或螯合的放射性同位素缀合以产生细胞毒性放射性药物，称为放射性免疫缀合物。可以与抗体缀合用于诊断或治疗用途的放射性同位素的示例包含但不限于碘-131，铟-111，钇-90，镥-177，铋-213和砹-211。本领域形成了制备放射免疫缀合物的方法。放射免疫缀合物的示例是可商购的，包含ZevalinTM(DEC Pharmaceuticals)和BexxarTM(Corixa Pharmaceuticals)，并且可以使用类似的方法来使用本发明的抗体制备放射免疫缀合物。在某些方面，大环螯合剂是可通过接头分子连接至免疫球蛋白的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N",N"'-四乙酸(DOTA)。
在一些方面，如上所述，药物部分包含单一药物单元。在其他方面，药物部分包含多个相同的药物单元，例如相同药物部分上的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个药物单元。在某些方面，药物部分包含在同一药物部分上的两种不同的药物单元。例如，在一些方面，单一药物部分可以包含MMAF药物单元和PBD单体药物单元两者。此外，在某些方面，本发明的免疫缀合物可以包含与免疫缀合物的第一臂缀合的第一药物部分和与免疫缀合物的第二臂缀合的第二药物部分。这样，药物部分的多种组合中的任何组合可以通过接头缀合至本发明的DVD-Ig。药物部分的非限制性示例在图14中描绘。
表达修饰部分包含但不限于非蛋白质编码RNA(“npcRNA”)。在一个方面，npcRNA包含但不限于：微小RNA(miRNA)，miRNA前体，小干扰RNA(siRNA)，小RNA和编码它的前体，异染色siRNA(hc-siRNA)，Piwi相互作用RNA(piRNA)，发夹双链RNA(发夹dsRNA)，反式作用siRNA(ta-siRNA)，天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)，示踪RNA(tcRNA)，引导RNA(gRNA)和单引导RNA(sgRNA)。在一个方面，siRNA包含范围为约20至约25个碱基对，例如约20至约24个碱基对，例如约21至约25个碱基对或约22至约24个碱基对的长度。在一方面，小RNA包含范围为约22至约26个碱基对的长度，例如约22至约25个碱基对，例如约23至约26个碱基对，或约24至约25个碱基对的长度。
siRNA技术的一般描述和综述可以在以下文献中找到：Resnier et al.,"Areview of the current status of siRNA nanomedicines in the treatment ofcancer",Biomaterials 34(2013)6429-43，其全部内容通过引用并入本文。
siRNA技术的一般描述和综述也可以在以下文献中找到：Song et al.,"Antibodymediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surfacereceptors",Nature Biotechnology 23,709-717(2005)，其全部内容通过引用并入本文。
可检测部分包含但不限于直接检测的标记或部分(例如荧光、发色团、电子密度、化学发光和放射性标记物)以及例如通过酶促反应或分子相互作用间接检测的诸如酶或配体之类的部分。示例性标记包含但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团，如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹磺酰，伞形酮，蜡酶基，例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456)，萤光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶，例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，其与使用过氧化氢来氧化染料前体(如HRP)的酶偶联，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记物，噬菌体标记物，稳定的自由基等。
免疫缀合物
本发明的一个方面包括免疫缀合物，其中本发明的DVD-Ig通过接头缀合至一个或多个药物部分。在一些方面，本发明的免疫缀合物通常由式Ig-(L-D)n描述，其中Ig为双重可变结构域免疫球蛋白分子，L为接头，D为药物部分，并且n为选自1至12的整数，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或11。在一个方面，n是1或2。
在某些方面，Ig的第二可变结构域包含反应性赖氨酸残基，并且使用受控缀合反应产生免疫缀合物，其中接头/药物部分组合物与裸Ig的每条重链上的反应性赖氨酸残基缀合。例如在美国专利No.8,252,902中描述了该反应的条件，该专利通过引用整体并入本文。简言之，反应可以在室温下在1XPBS，2％DMSO的溶液中通过使Ig与接头/药物部分组合物反应而进行，从而导致一个接头/药物部分与Ig上的每个反应性赖氨酸残基附接。结果是具有通过接头与Ig的每条重链上的反应性赖氨酸残基附接的两个药物部分的免疫缀合物。示例性反应的示意图在图15中提供。
在某些方面，另外的药物部分可以使用不受控制的缀合技术缀合至Ig分子。例如，在某些方面，除38C2可变结构域的单一的唯一反应性赖氨酸残基以外的氨基酸残基可以用作经由接头缀合药物部分的连接点。这种不受控缀合的结果是具有与免疫球蛋白分子上的其他氨基酸残基附接的一个或多个药物部分的免疫缀合物。这样的另外的缀合可以通过使接头/药物部分组合物与免疫球蛋白分子上的例如除了第二可变结构域中的单一的唯一反应性赖氨酸之外的赖氨酸残基、或免疫球蛋白分子上的标准或工程化半胱氨酸残基、或免疫球蛋白分子上的一个或多个工程化硒代半胱氨酸残基反应来实现。这种不受控缀合的结果是每抗体的免疫缀合物具有范围在约1至约20个药物部分的平均数量的药物部分，具体取决于可用于与接头/药物部分组合物反应的氨基酸残基的数量。在某些方面，使用不受控缀合方法获得的每免疫球蛋白的分子药物部分的平均数目是约1至约8个，例如2、3、4、5、6或7个。
在一个方面，免疫缀合物包含具有通过不可逆接头与每个反应性赖氨酸残基缀合的MMAF药物部分的HER2-h38C2-DVD1免疫球蛋白分子。在一个方面，免疫缀合物包含具有通过不可逆接头与每个反应性赖氨酸残基缀合的MMAF药物部分的HER2-h38C2-DVD2免疫球蛋白分子。
在一个方面，免疫缀合物包含具有通过不可逆接头与每个反应性赖氨酸残基缀合的MMAF药物部分的IMGN-853 FOLR1-h38C2-DVD1免疫球蛋白分子。在一个方面，免疫缀合物包含具有通过不可逆接头与每个反应性赖氨酸残基缀合的MMAF药物部分的IMGN-853FOLR1-h38C2-DVD2免疫球蛋白分子。
在一个方面，免疫缀合物包含具有通过不可逆接头与每个反应性赖氨酸残基缀合的MMAF药物部分的法勒珠单抗FOLR1-h38C2-DVD1免疫球蛋白分子。在一个方面，免疫缀合物包含具有通过不可逆接头与每个反应性赖氨酸残基缀合的MMAF药物部分的法勒珠单抗FOLR1-h38C2-DVD2免疫球蛋白分子。
在一个方面，免疫缀合物包含具有通过不可逆接头与每个反应性赖氨酸残基缀合的MMAF药物部分的CD138-h38C2-DVD1免疫球蛋白分子。在一个方面，免疫缀合物包含具有通过不可逆接头与每个反应性赖氨酸残基缀合的MMAF药物部分的CD138-h38C2-DVD2免疫球蛋白分子。
免疫缀合物的应用
免疫缀合物可以具有广泛的预防、治疗和诊断应用，以及使用方法，包含但不限于通过靶向和杀伤表达特定肿瘤抗原的细胞来治疗各种癌症和其他疾病。免疫缀合物可以广泛地用于治疗多种癌症中的任何一种。预计任何类型的肿瘤和任何类型的肿瘤相关抗原都可以被本发明的免疫缀合物靶向。癌症类型的例子包含但不限于血液癌症、癌瘤、肉瘤、黑素瘤或中枢神经系统癌症。
可用本发明的免疫缀合物治疗的血液癌症的非限制性示例包含白血病、急性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞源性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓增生异常综合征。
可用本发明的免疫缀合物治疗的癌瘤的非限制性示例包括皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、肺癌、鼻咽癌、结直肠癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、前列腺癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、肾癌、或乳腺癌。
可用本发明的免疫缀合物治疗的肉瘤的非限制性示例包括血管肉瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、纤维肉瘤、胃肠道间质瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、恶性外周神经鞘瘤、骨肉瘤、多形性肉瘤、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤或滑膜肉瘤。
可用本发明的免疫缀合物治疗的中枢神经系统癌症的非限制性示例包含神经胶质瘤、脑膜瘤或神经瘤。
可以用本发明的免疫缀合物治疗的其他癌症的非限制性示例包含黑素瘤。
在一些情况下，本发明的免疫缀合物的使用方法涉及如上所述将免疫缀合物与一种或多种额外疗法联合施用给受试者以治疗特定癌症。因此，本发明的免疫缀合物可以单独用于治疗特定的癌症，或者替代地，可以与利用其他药物(例如抗肿瘤剂)的常规治疗组合使用或作为辅助剂使用。免疫缀合物通常可以与任何抗肿瘤剂(例如常规和/或实验性化学治疗剂、放射治疗等)组合使用。
例如，在一些方面，另外的治疗可以包括抗体、抗肿瘤剂、细胞毒性剂、抗血管生成剂或免疫抑制剂。其他治疗剂的非限制性示例包括顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、异环磷酰胺(ifosfamide)、阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、戊柔比星(valrubicin)、伊达比星(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、放线菌素(actinomycin)、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)、丝裂霉素(mitomycin)、贝伐单抗(bevacizumab)、伊马替尼(imatinib)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、依鲁替尼(ibrutinib)、艾德拉尼(idelalisib)、来那度胺(lenalidomide)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春地辛(vindesine)、紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel)。
免疫缀合物的药物组合物
对于治疗用途，可将免疫缀合物配制成药物组合物。本发明的药物组合物可以通过本领域已知的多种方法施用。如本领域技术人员将理解的，施用的途径和/或模式将根据目标疾病或病症和期望的结果而变化。为了通过某些施用途径施用本发明的化合物，可能有必要将该化合物涂覆用以防止其失活的材料或将该化合物与该材料一起施用。例如，化合物可以在合适的载体(例如脂质体或稀释剂)中施用给受试者。药学上可接受的稀释剂包含盐水和缓冲水溶液。药物载体包含无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是公知的。
组合物还可以含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和/或分散剂。通过灭菌程序和通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯(paraben)、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可以确保防止微生物的存在。将等渗剂如糖、氯化钠等包含在组合物中也会是可取的。另外，可通过包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来延长可注射药物形式的吸收。
本发明药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得有效实现对于特定患者、组合物和给药模式的期望治疗响应的活性成分的量，而不会对患者产生毒性。选定的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所用的本发明特定组合物的活性、给药途径、给药时间、所用的具体化合物的排泄速率、治疗的持续时间、其他药物、与所用特定组合物组合使用的化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史、以及医学领域中众所周知的类似因素。
组合物必须是无菌的并且在一定程度上是流体使得组合物可通过注射器递送。除了水之外，载体优选是等渗缓冲盐溶液。
本发明的方面包括具有式Ig-(L-D)n的免疫缀合物，其中：Ig是双重可变结构域免疫球蛋白分子或其抗原结合片段，其中所述双重可变结构域免疫球蛋白分子包含与结合靶标结合的第一可变结构域和包含反应性残基的第二可变结构域；L是与Ig的第二可变结构域的反应性残基共价缀合的接头；D是药物部分；并且n是选自1至12的整数，例如选自1至11，选自2至12，选自3至10，选自4至9，选自5至8，选自6至7，选自1至3，选自4至6，选自7至9，或选自10至12的整数。在一些方面，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。本发明的另外的方面包括具有式Ig-(L-D)n的免疫缀合物，其中：Ig是双重可变结构域免疫球蛋白分子或其抗原结合片段，其中所述双重可变结构域免疫球蛋白分子包含与结合靶标结合的第一可变结构域和包含反应性赖氨酸残基的第二可变结构域；L是与Ig的第二可变结构域的反应性赖氨酸残基共价缀合的接头；D是药物部分；并且n是1或2。在一些方面，Ig的第一可变结构域比第二可变结构域更靠近N-端定位。在一些方面，Ig可以是双特异性免疫球蛋白分子。在一些方面，D包含2个或更多个不同的药物部分。在一些方面，抗原结合片段包含Ig的第一可变结构域和第二可变结构域，并且选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。在一些方面，Ig包含嵌合免疫球蛋白序列。在一些方面，Ig包含人源化免疫球蛋白序列。在一些方面，Ig包含人免疫球蛋白序列。在一些方面，Ig的第二可变结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些方面，Ig的第二可变结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一些方面，结合靶标是肿瘤细胞表面抗原。在一些方面，肿瘤细胞表面抗原选自HER2、FOLR1和CD138。在一些方面，Ig的第一可变结构域与HER2结合。在一些方面，Ig的第一可变结构域与FOLR1结合。在一些方面，Ig的第一可变结构域与CD138结合。
本发明的方面包括具有式Ig-(L-D)n的免疫缀合物，其中：Ig是双重可变结构域免疫球蛋白分子或其抗原结合片段，其中所述双重可变结构域免疫球蛋白分子包含与结合靶标结合的第一可变结构域和包含反应性赖氨酸残基的第二可变结构域；L是与Ig的第二可变结构域的反应性赖氨酸残基共价缀合的接头；D是药物部分；并且n是选自1至12的整数。本发明的另外的方面包括具有式Ig-(L-D)n的免疫缀合物，其中：Ig是双重可变结构域免疫球蛋白分子或其抗原结合片段，其中所述双重可变结构域免疫球蛋白分子包含与结合靶标结合的第一可变结构域和包含反应性赖氨酸残基的第二可变结构域；L是与Ig的第二可变结构域的反应性赖氨酸残基共价缀合的接头；D是药物部分；并且n是1或2。在一些方面，D是细胞毒素剂。在一些方面，细胞毒素剂选自毒素、化学治疗剂、抗生素、放射性同位素、螯合的放射性同位素和溶核酶。在一些方面，D是奥瑞斯他汀(auristatin)；多拉司他汀(dolostatin)；或西马多丁(cemadotin)。在一些方面，D是MMAE或MMAF。在一些方面，D是喜树碱。在一些方面，喜树碱是SN-38。在一些方面，D是美登木素生物碱。在一些方面，美登木素生物碱是DM1、DM3或DM4。在一些方面，D是吡咯并苯二氮卓(PBD)。在一些方面，D是烯二炔。在一些方面，D是加利车霉素。在一些方面，D是天赐米星。在某些方面，D是阿霉素。在某些方面，D是MMDX。在某些方面，D是PNU-159682。
本发明的方面包括具有式Ig-(L-D)n的免疫缀合物，其中：Ig是双重可变结构域免疫球蛋白分子或其抗原结合片段，其中所述双重可变结构域免疫球蛋白分子包含与结合靶标结合的第一可变结构域和包含反应性残基的第二可变结构域；L是与Ig的第二可变结构域的反应性残基共价缀合的接头；D是药物部分；并且n是选自1至12的整数。本发明的另外的方面包括具有式Ig-(L-D)n的免疫缀合物，其中：Ig是双重可变结构域免疫球蛋白分子或其抗原结合片段，其中所述双重可变结构域免疫球蛋白分子包含与结合靶标结合的第一可变结构域和包含反应性赖氨酸残基的第二可变结构域；L是与Ig的第二可变结构域的反应性赖氨酸残基共价缀合的接头；D是药物部分；并且n是1或2。在一些方面，L是可逆接头。在一些方面，L是不可逆接头。在一些方面，L是可裂解的接头。在一些方面，L是不可裂解的接头。在一些方面，L是分支接头。在一些方面，L是线性接头。
本发明的方面包含用于治疗癌症的药物组合物，其中所述药物组合物包含有效量的免疫缀合物和药学上可接受的载体。
本发明的方面包括免疫缀合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。在一些方面，癌症是血液癌症、癌瘤、肉瘤、黑素瘤或中枢神经系统癌症。在一些方面，血液癌症是白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或骨髓增生异常综合征。在一些方面，白血病是急性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞源性白血病或慢性淋巴细胞性白血病。在一些方面，淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。在一些方面，癌症是皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、肺癌、鼻咽癌、结直肠癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、前列腺癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、肾癌、或乳腺癌。在一些方面，肉瘤是血管肉瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、纤维肉瘤、胃肠道间质瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、恶性外周神经鞘瘤、骨肉瘤、多形性肉瘤、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤或滑膜肉瘤。在一些方面，中枢神经系统癌症是神经胶质瘤、脑膜瘤或神经瘤。
在一些方面，药物还包含有效量的第二治疗剂。在一些方面，第二种治疗剂是抗体、抗肿瘤剂、细胞毒性剂、抗血管生成剂或免疫抑制剂。在一些方面，第二治疗剂选自：顺铂、卡铂、奥沙利铂、二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、阿霉素、柔红霉素、戊柔比星、伊达比星、表柔比星、放线菌素、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、贝伐单抗、伊马替尼、厄洛替尼、吉非替尼、依鲁替尼、艾德拉尼、来那度胺、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛、紫杉醇和多西他赛。
本发明的方面包含具有式Ig-(L-D)n的免疫缀合物，其中：Ig包含SEQ ID NO:5和6的氨基酸序列并且第一可变结构域的结合靶标是HER2；L是与Ig的反应性赖氨酸残基共价结合的线性不可逆接头；D是MMAF；并且n是2。
本发明的方面包含具有式Ig-(L-D)n的免疫缀合物，其中：Ig包含SEQ ID NO:7和8的氨基酸序列并且第一可变结构域的结合靶标是HER2；L是与Ig的反应性赖氨酸残基共价结合的线性不可逆接头；D是MMAF；并且n是2。
本发明的方面包含具有式Ig-(L-D)n的免疫缀合物，其中：Ig包含SEQ ID NO:9和10的氨基酸序列并且第一可变结构域的结合靶标是FOLR1；L是与Ig的反应性赖氨酸残基共价结合的线性不可逆接头；D是MMAF；并且n是2。
本发明的方面包含具有式Ig-(L-D)n的免疫缀合物，其中：Ig包含SEQ ID NO:11和12的氨基酸序列并且第一可变结构域的结合靶标是FOLR1；L是与Ig的反应性赖氨酸残基共价结合的线性不可逆接头；D是MMAF；并且n是2。
本发明的方面包含具有式Ig-(L-D)n的免疫缀合物，其中：Ig包含SEQ ID NO:13和14的氨基酸序列并且第一可变结构域的结合靶标是FOLR1；L是与Ig的反应性赖氨酸残基共价结合的线性不可逆接头；D是MMAF；并且n是2。
本发明的方面包含具有式Ig-(L-D)n的免疫缀合物，其中：Ig包含SEQ ID NO:15和16的氨基酸序列并且第一可变结构域的结合靶标是FOLR1；L是与Ig的反应性赖氨酸残基共价结合的线性不可逆接头；D是MMAF；并且n是2。
本发明的方面包含具有式Ig-(L-D)n的免疫缀合物，其中：Ig包含SEQ ID NO:17和18的氨基酸序列并且第一可变结构域的结合靶标是CD138；L是与Ig的反应性赖氨酸残基共价结合的线性不可逆接头；D是MMAF；并且n是2。
本发明的方面包含具有式Ig-(L-D)n的免疫缀合物，其中：Ig包含SEQ ID NO:19和20的氨基酸序列并且第一可变结构域的结合靶标是CD138；L是与Ig的反应性赖氨酸残基共价结合的线性不可逆接头；D是MMAF；并且n是2。
在一些方面，免疫球蛋白包含两个相同的轻链和两个相同的重链。在一个方面，免疫球蛋白轻链包含κ轻链。在一个方面，免疫球蛋白轻链包含λ轻链。在一个方面，免疫球蛋白是IgA免疫球蛋白，其具有α重链。在一个方面，免疫球蛋白是IgA1免疫球蛋白。在一个方面，免疫球蛋白是IgA2免疫球蛋白。在一个方面，免疫球蛋白是具有δ重链的IgD免疫球蛋白。在一个方面，免疫球蛋白是具有ε重链的IgE免疫球蛋白。在一个方面，免疫球蛋白是具有γ重链的IgG免疫球蛋白。在一个方面，免疫球蛋白是IgG1免疫球蛋白。在一个方面，免疫球蛋白是IgG2免疫球蛋白。在一个方面，免疫球蛋白是IgG3免疫球蛋白。在一个方面，免疫球蛋白是IgG4免疫球蛋白。在一个方面，免疫球蛋白是具有μ重链的IgM免疫球蛋白。
在一个方面，免疫球蛋白包含至少一个可变区。在一个方面，免疫球蛋白是完整的免疫球蛋白。在一个方面，免疫球蛋白是裸免疫球蛋白。在一个方面，免疫球蛋白是免疫球蛋白片段。在一个方面，免疫球蛋白片段选自由：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和scFv组成的组。
在一些方面，免疫球蛋白是双重可变结构域免疫球蛋白。在一些方面，免疫球蛋白包含天然多肽序列。在一些方面，免疫球蛋白包含非天然多肽序列。在一些方面，免疫球蛋白包含多肽。在一些方面，免疫球蛋白是单克隆免疫球蛋白。在一些方面，免疫球蛋白包含嵌合免疫球蛋白。在一些方面，免疫球蛋白包含人源化免疫球蛋白。在一些方面，免疫球蛋白包含人免疫球蛋白。在一些方面，免疫球蛋白是分离的免疫球蛋白。在一些方面，免疫球蛋白包含多肽序列，该多肽序列是两个或更多个多肽序列的融合物。在一些方面，免疫球蛋白是缀合的免疫球蛋白。
在一些方面，免疫球蛋白与结合靶标特异性结合或特异于结合靶标。在一些方面，免疫球蛋白具有结合亲和力。在一些方面，免疫球蛋白具有Kd值。在一些方面，免疫球蛋白与表位结合。在一些方面，免疫球蛋白与靶标或结合靶标结合。在一些方面，结合靶标包含与免疫球蛋白结合的结合区。在一些方面，免疫球蛋白结合抗原。在一些方面，免疫球蛋白包含抗原结合位点或抗原结合区。
在一些方面，免疫球蛋白在宿主细胞中产生。在一些方面，免疫球蛋白通过细胞系或细胞培养物产生。在一些方面，免疫球蛋白由与另一核酸序列可操作地连接的核酸序列产生。
在一些方面，免疫球蛋白氨基酸序列与另一氨基酸序列具有百分比氨基酸序列同一性。
在一些方面，免疫缀合物用于治疗受试者或哺乳动物。
提供以下实施例、序列和附图以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求书中阐述。应当理解，可以在不背离本发明精神的情况下对所述程序进行修改。
实施例
实施例1：β-内酰胺-Cit-Val-MMAF的化学合成
参考在图11中标记为1-6的化合物。向332mg化合物1(Gervay-Hague，J.etal.JACS.2011,133(10)，3230-3233)中加入107mg NHS(1当量)和3ml无水THF。将反应物冷却至0℃，然后加入0.143ml(1当量)DIC。将反应物经24小时温热至室温，通过硅藻土过滤，并在真空中除去溶剂。然后向350毫克(1当量)的Val-Cit-PAB(Trail，P.A.etal.Bioconjugate Chem.2002,13,855-869)加入5.6毫升无水DMF，将反应物搅拌16小时。在16小时后通过LC/MS确认产物形成。真空除去溶剂，粗物质用CH2Cl2研磨，然后过滤并用己烷漂洗。通过柱层析(9:1CH2Cl2:MeOH，Rf＝0.2)纯化粗棕色固体(61％收率)。
将312mg化合物2、505mg双-硝基碳酸酯(3当量)、0.193ml DIPEA(2当量)和7ml无水DMF合并，并且搅拌16小时。真空除去溶剂，并将粗物质通过反相HPLC纯化(收率35％)。
将38mg化合物3、22mg化合物4(Barbas,C.F.et al.ACS Med.Chem.Lett.,2014,5(2),133-137)、6mg CuSO4·5H2O，0.5ml DMF和0.25ml H2O合并，并且脱气30分钟。然后加入12μl的1M抗坏血酸钠，并将反应物搅拌1.5小时，然后通过反相HPLC纯化(60％收率)。
将2.0mg MMAF、4.8mg化合物5(1.5当量)、0.2mg Oxyma(0.5当量)，0.77μl DIPEA(1.6当量)和70μl无水DMF在火焰干燥的微波小瓶中合并。72小时后，加入额外的0.2mgOxyma(0.5当量)和0.48μl DIPEA(1当量)。24小时后，通过反相HPLC纯化反应物，得到1.9mg化合物6(40％收率)。
实施例2：β-内酰胺-PEG接头-MMAF的化学合成
参考在图12中标记为1-5的化学化合物。将332mg化合物1(Okoth,R.etal.J.Org.Chem.,2013,9,608-612)溶于1.6ml MeCN中。经30分钟将173毫克戊二酸酐(1当量)溶于1毫升MeCN中，并加入到化合物1中。18小时后，真空除去溶剂。将粗产物溶于CH2Cl2中并通过柱色谱法(95:5，CH2Cl2:MeOH)纯化(88％收率)。
将18mg化合物2、22mg化合物3(Barbas,C.F.et al.ACS Med.Chem.Lett,2014,5(2),133-137)、6mg CuSO4·5H2O(0.5当量)、0.25毫升DMF和0.25毫升水合并，并且脱气30分钟。然后加入12μl的1M抗坏血酸钠，并将反应物搅拌1.5小时，然后通过反相HPLC纯化(收率43％)。
将3mg化合物4、7mg 4埃的分子筛、1.5mg HATU(1当量)、1.5μl DIPEA(2当量)和33μl无水DMF在火焰干燥小瓶中合并。1小时后，将1.4mg MMAF与40μl无水DMF一起加入。1.5小时后，使用反相HPLC纯化以获得化合物5(82％收率)。
实施例3：β-内酰胺-烃接头-MMAF的固相化学合成
参考在图44中标记为1-7的化学化合物。将溶解于4ml无水CH2Cl2和0.5ml DIPEA的Fmoc-Phe-OH(15当量)加入到预溶胀的氯三苯甲基树脂中。将混合物搅拌4小时，然后除去溶剂并用MeOH搅拌20分钟以获得树脂1。然后将混合物用在DMF中的20％哌啶脱保护(2mL×20分钟×2次)，用DMF洗涤，在室温下与新制备的Fmoc-Dap-OH(3当量)、HATU(3当量)和DIPEA(10当量)在DMF(1.5mL)中的溶液搅拌(过夜)，然后排干并用DMF洗涤以获得树脂2。然后将混合物用在DMF中的20％哌啶进行Fmoc脱保护(2mL×20分钟×2次)，在室温下与新制备的Fmoc-Dil-OH(2.5当量)、HATU(2.5当量)和DIPEA(5当量)在DMF(2.5mL)中的溶液搅拌(过夜)，并用DMF洗涤以获得树脂3。在室温下将未官能化的树脂用乙酸酐(10:10:80v/vAc2O：DIEA：DMF)封端(30分钟)。将树脂3用在DMF中的20％哌啶进行Fmoc脱保护(2mL×20分钟×2次)，在室温下与新制备的Fmoc-Val-OH(6.0当量)、HATU(6.0当量)和DIEA(12当量)在DMF(4.2mL)中的溶液搅拌(过夜)，并且接着用DMF洗涤。然后在室温下将未官能化的树脂用乙酸酐(10:10:80v/v Ac2O：DIPEA：DMF)封端(30分钟)并用DMF洗涤以获得树脂4。将树脂4用在DMF中的20％哌啶进行Fmoc脱保护(2mL×20分钟×2次)，在室温下与新制备的Fmoc-N-甲基-Val-OH(5当量)、HATU(5当量)和DIPEA(10当量)在DMF(4.2mL)中的溶液搅拌(3小时)，并且接着用DMF洗涤。然后在室温下将未官能化的树脂用乙酸酐(10:10:80v/v Ac2O：DIPEA：DMF)溶液封端(30分钟)并用DMF洗涤以获得树脂5。将树脂5用在DMF中的20％哌啶进行Fmoc脱保护(2mL×20分钟×2次)，在室温下与新制备的Fmoc-己酸(6当量)、HATU(6当量)和DIEA(12当量)在DMF(2.5mL)中的溶液搅拌(过夜)，并且接着用DMF洗涤。然后在室温下将未官能化的树脂用乙酸酐(10:10:80v/v Ac2O：DIPEA：DMF)封端(30分钟)，并用DMF洗涤以获得树脂6。将树脂6用在DMF中的20％哌啶进行Fmoc脱保护(2mL×20分钟×2次)，并且用DMF洗涤，并且接着在室温下与新制备的β-内酰胺pfp酯(Magano,J.Org.ProcessRes.Dev.,2014,18(1),142-151)(3当量)和DIPEA(3当量)在DMF(1.5ml)中的溶液中搅拌(1小时)。然后用DMF和DCM依次洗涤树脂。然后用稀释的AcOH溶液(1:1:8v/v AcOH:TFE:DCM；2.5mL×30分钟×2次)处理树脂以裂解肽产物，真空浓缩并使用反相HPLC纯化，得到化合物7。
实施例4：HER2-h38C2-DVD1和DVD2克隆、表达和纯化
抗HER2的可变结构域序列与h38C2的可变结构域序列融合的DNA被定制合成作为gBlocks Gene Fragments(Integrated DNA Technologies)或通过PCR制备。具有不同肽接头序列(DVD1的ASTKGP(SEQ ID NO:1)，或DVD2的TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:2))的两种形式分离可变结构域序列。所有抗体使用来自人类IgG1的恒定结构域。DNA通过PCR扩增并用NheI/XhoI连接克隆到pCEP4(Invitrogen)中。通过DNA测序验证DNA，并用QIAGEN PlasmidMaxi试剂盒纯化所有质粒以用于转染。
在37℃，将人胚胎肾(HEK)293细胞(ATCC)维持在潮湿的5％CO2气氛中，在含有10％(v/v)胎牛血清(FBS；Life Technologies)和1％(v/v)青霉素链霉素(Pen Strep；LifeTechnologies)的DMEM(达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium)与GlutaMAX；Life Technologies)中。使用聚乙烯亚胺(PEI；Polysciences)将上述哺乳动物细胞表达载体瞬时转染至HEK293细胞中。在转染12-16小时后，将培养基替换为不含FBS的新鲜DMEM。培养上清液在转染后第3天、第6天和第9天收集，并使用0.45-μmStericup过滤器单元(Millipore)过滤。将上清液加载到连接至纯化系统(GEHealthcare)的1mL重组蛋白A柱(HiTrap；GE Healthcare)上。PBS用于柱平衡和洗涤，0.5M乙酸(pH3.0)用于洗脱，1M Tris-HCl(pH8.0)用于立即中和。中和的洗脱液被缓冲液交换到PBS中并使用30-kDa截止离心过滤设备(Millipore)同时浓缩。通过SDS-PAGE确定所有免疫球蛋白的纯度>95％。
实施例5：FOLR1-h38C2-DVD1和DVD2克隆、表达和纯化
抗FOLRl的可变结构域序列与h38C2的可变结构域序列融合的DNA被定制合成作为gBlocks Gene Fragments(Integrated DNA Technologies)或通过PCR制备。具有不同肽接头序列(DVD1的ASTKGP(SEQ ID NO:1)，或DVD2的TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:2))的两种形式分离可变结构域序列。所有抗体使用来自人类IgG1的恒定结构域。DNA通过PCR扩增并用NheI/XhoI连接克隆到pCEP4(Invitrogen)中。通过DNA测序验证DNA，并用QIAGEN PlasmidMaxi试剂盒纯化所有质粒以用于转染。
在37℃，将人胚胎肾(HEK)293细胞(ATCC)维持在潮湿的5％CO2气氛中，在含有10％(v/v)胎牛血清(FBS；Life Technologies)和1％(v/v)青霉素链霉素(Pen Strep；LifeTechnologies)的DMEM(达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium)与GlutaMAX；Life Technologies)中。使用聚乙烯亚胺(PEI；Polysciences)将上述哺乳动物细胞表达载体瞬时转染至HEK 293细胞中。在转染12-16小时后，将培养基替换为不含FBS的新鲜DMEM。培养上清液在转染后第3天、第6天和第9天收集，并使用0.45-μmStericup过滤器单元(Millipore)过滤。将上清液加载到连接至纯化系统(GEHealthcare)的1mL重组蛋白A柱(HiTrap；GE Healthcare)上。PBS用于柱平衡和洗涤，0.5M乙酸(pH3.0)用于洗脱，1M Tris-HCl(pH8.0)用于立即中和。中和的洗脱液被缓冲液交换到PBS中并使用30-kDa截止离心过滤设备(Millipore)同时浓缩。通过SDS-PAGE确定所有免疫球蛋白的纯度>95％。
实施例6：CD138-h38C2-DVD1和DVD2克隆、表达和纯化
抗-CDl38的可变结构域序列与h38C2的可变结构域序列融合的DNA被定制合成作为gBlocks Gene Fragments(Integrated DNA Technologies)或通过PCR制备。具有不同肽接头序列(DVD1的ASTKGP(SEQ ID NO:1)，或DVD2的TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:2))的两种形式分离可变结构域序列。所有抗体使用来自人类IgG1的恒定结构域。DNA通过PCR扩增并用NheI/XhoI连接克隆到pCEP4(Invitrogen)中。通过DNA测序验证DNA，并用QIAGEN PlasmidMaxi试剂盒纯化所有质粒以用于转染。
在37℃，将人胚胎肾(HEK)293细胞(ATCC)维持在潮湿的5％CO2气氛中，在含有10％(v/v)胎牛血清(FBS；Life Technologies)和1％(v/v)青霉素链霉素(Pen Strep；LifeTechnologies)的DMEM(达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium)与GlutaMAX；Life Technologies)中。使用聚乙烯亚胺(PEI；Polysciences)将上述哺乳动物细胞表达载体瞬时转染至HEK293细胞中。在转染12-16小时后，将培养基替换为不含FBS的新鲜DMEM。培养上清液在转染后第3天、第6天和第9天收集，并使用0.45-μmStericup过滤器单元(Millipore)过滤。将上清液加载到连接至纯化系统(GEHealthcare)的1mL重组蛋白A柱(HiTrap；GE Healthcare)上。PBS用于柱平衡和洗涤，0.5M乙酸(pH3.0)用于洗脱，1M Tris-HCl(pH8.0)用于立即中和。中和的洗脱液被缓冲液交换到PBS中并使用30-kDa截止离心过滤设备(Millipore)同时浓缩。通过SDS-PAGE确定所有免疫球蛋白的纯度>95％。
实施例7：β-内酰胺-MMAF与DVD免疫球蛋白的缀合
向300μg的在270μl PBS中的包含h38C2可变结构域的双重可变结构域免疫球蛋白(各自具有单一的唯一反应性赖氨酸)加入1.2μl DMSO，加入1.5μl(在DMSO中的10mM储液，10当量)β-内酰胺-MMAF并涡旋，然后在室温下孵育2小时。将抗体-药物缀合物溶液加载到用PBS平衡的G-25预包装的葡聚糖凝胶柱(GE Healthcare)上。用PBS洗脱抗体-药物缀合物。
实施例8：抗HER2免疫缀合物与HER+和HER-细胞的结合分析
如图17所示，人乳腺癌细胞系SK-BR-3和MDA-MB-468购自ATCC。两种细胞系都保持在37℃，在湿润的5％CO2气氛中，在完整的(completed)具有10％FBS和1％Pen Strep的DMEM中。使用TrypLE(Life Technologies)收获细胞，并将其转移至V形96孔微量滴定板上，且用200μl FACS缓冲液(PBS中的1％FBS)洗涤。将1μg在100μl PBS中的DVD加入到每个孔中并在冰上孵育30分钟。用200μl FACS缓冲液洗涤细胞，然后在冰上用647-缀合的山羊抗人Fcg(Jackson ImmunoResearch)(10μl，在FACs缓冲液中以1:100稀释)染色20分钟。细胞用200μl FACS缓冲液(×2)洗涤，重悬于200μl FACS缓冲液中，并通过流式细胞术(BD FacsCanto II)测量荧光。使用FlowJo软件(Tree Star，Inc.)分析数据。
实施例9：使用抗-HER2免疫缀合物的细胞毒性测定
人乳腺癌细胞系SK-BR-3和MDA-MB-468保持在37℃，在湿润的5％CO2气氛中，在完整的(completed)具有10％FBS和1％Pen Strep的DMEM中。使用TrypLE(LifeTechnologies)收集细胞，并在处理前24小时将其转移至平底96孔组织培养板(5000个细胞/孔)。在完整的(completed)具有10％FBS和1％Pen Strep的DMEM中制备系列稀释液。除去原始细胞培养基并加入100μl处理溶液(一式三份进行)，并将培养板保持在37℃，在潮湿的5％CO2气氛中持续72小时。将20μl CellTiterAqueous One Solution(Promega)加入到每个孔中，并将该板在37℃，在潮湿的5％CO2气氛中发育。然后将细胞与免疫缀合物或几种对照组合物中的一种接触。
参照图18中描绘的图表，DVD1是指裸HER2-h38C2-DVD1免疫球蛋白(即，没有与其缀合的接头/药物部分组合物)；DVD1 ADC是指其上连接有β-内酰胺-烃接头-MMAF的DVD1免疫球蛋白；trast是指裸抗HER2抗体(曲妥珠单抗)；trast pro是指已经与β-内酰胺-烃接头-MMAF组合物混合的裸抗HER2抗体；h38C2 pro是指已经与β-内酰胺-烃接头-MMAF组合物缀合但不包含HER2可变区结合结构域的h38C2抗体；而游离药物是指β-内酰胺-烃接头-MMAF组合物。
参照图19中描绘的图表，h38C2 pro是指已经与β-内酰胺-烃接头-MMAF组合物缀合但不包含HER2可变区结合结构域的h38C2抗体；trast pro是指已经与β-内酰胺-烃接头-MMAF组合物混合的裸抗HER2抗体；trast是指裸抗HER2抗体(曲妥珠单抗)；DVD1是指裸HER2-短肽接头-h38C2-DVD1免疫球蛋白(即，没有与其缀合的接头/药物部分组合物)；DVD2是指裸HER2-长肽接头-h38C2-DVD2免疫球蛋白(即，没有与其缀合的接头/药物部分组合物)；DVD1 ADC是指其上附着有β-内酰胺-烃接头-MMAF的DVD1免疫球蛋白；而DVD2 ADC是指其上附着有β-内酰胺-烃接头-MMAF的DVD2免疫球蛋白。
参照图20中描绘的图表，DVD1是指裸HER2-短肽接头-h38C2-DVD1免疫球蛋白(即，没有与其缀合的接头/药物部分组合物)；DVD2是指裸HER2-长肽接头-h38C2-DVD2免疫球蛋白(即，没有与其缀合的接头/药物部分组合物)；DVD1 ADC是指其上附着有β-内酰胺-烃接头-MMAF的DVD1免疫球蛋白；DVD2 ADC是指其上附着有β-内酰胺-烃接头-MMAF的DVD2免疫球蛋白；trast是指裸抗HER2抗体(曲妥珠单抗)；trast ADC是指已经与β-内酰胺-烃接头-MMAF组合物混合的裸抗HER2抗体；并且h38C2 ADC是指已经与β-内酰胺-烃接头-MMAF组合物缀合但不包含HER2可变区结合结构域的h38C2抗体。
使用平板读数器(Spectramax M5)在490nM处基于荧光评估细胞毒性，结果提供于图18、图19和图20。
实施例10：DVD组合物的分子量分析
使用考马斯染色的SDS-PAGE在DVD1和DVD2的还原(尺寸＝200kDa)和非还原条件(重链＝70kDa，轻链＝40kDa)下证实DVD组合物的纯度。结果提供于图21和图25。
实施例11：通过流式细胞术证实的DVD组合物的选择性结合
在冰上将DVD1和DVD2用SKBR3(HER2+)或MDA-MB-468(HER2-)孵育30分钟，然后用AlexaFluor 647缀合的F(ab')2山羊抗人(Jackson ImmunoResearch)染色。结果提供在图22中。结果表明DVD1和DVD2组合物选择性结合SKBR3(HER+)细胞。
为了检查生物素β-内酰胺的非特异性结合，将DVD1和DVD2用3当量的生物素β-内酰胺(在图中称为“化合物”)在室温下孵育2小时，然后用SKBR3(HER2+)或MDA-MB-468(HER2-)在冰上孵育30分钟，并用PE缀合的链霉抗生物素蛋白(BioLegend)染色。结果提供在图23中。结果表明DVD1和DVD2组合物选择性结合SKBR3(HER+)细胞，而生物素β-内酰胺化合物不以非特异性方式与HER2+细胞结合。
实施例12：ADC对于SKBR3(HER2+)、BT474(HER2+)、KPL4(HER2+)、DYT2(HER2+)和MDA-MB-468(HER2-)细胞的细胞毒性
将指示的细胞类型以每孔5×103个细胞接种在96孔板中。使细胞粘附过夜。将连续稀释的ADC以0至10nM的浓度添加至细胞。孵育72小时后，使用CellTiter 96AQueous OneSolution Cell Proliferation Assay(Promega)按照制造商的说明测量细胞活力。细胞活力计算为未经处理的细胞的百分比(≡100％)。结果提供在图24和图29中。结果表明ADC对HER2+细胞具有细胞毒活性。
实施例13：ADC对IGROV1(FOLR1+)和H929(CD138+)细胞的细胞毒性
将人癌细胞系IGROV1(FOLR1+)和H929(CD138+)维持在37℃，在湿润的5％CO2气氛中，在具有10％FBS和1％PenStrep的完整的DMEM或RPMI中。使用TrypLE(LifeTechnologies)收获IGROV细胞并在处理前24小时将其转移至平底96孔组织培养板(5000个细胞/孔)。立即处理H929细胞。在具有10％FBS和1％PenStrep的完整的DMEM或RPMI中制备系列稀释液。对于IGROV1细胞，除去原始细胞培养基并加入100μl处理溶液(一式三份进行)，并将培养板在37℃，在潮湿的5％CO2气氛中保持72小时。对于H929，加入100μl处理溶液。然后使细胞与免疫缀合物接触或与几种对照组合物中的一种接触。向每个孔中加入20μl的Cell TiterAqueous One Solution(Promega)，并将板在37℃，在潮湿的5％CO2气氛中发育。结果提供在图26和图27中。结果表明免疫缀合物对靶细胞类型具有细胞毒活性。
实施例14：DVD组合物的催化活性
将98μl抗体(在PBS中，1μM)分配在96孔板中。然后加入2μl方法醛(Methodol)(在EtOH中，10mM)，并使用分光荧光计每5分钟记录激发(λext＝330nM)和发射(λem＝452nM)。向548μl DVD1(10.33mg/ml，51.7μM)中加入11.3μl(在DMSO中，10mM)β-内酰胺MMAF(相对于抗体为4当量)。将溶液涡旋，在室温下孵育4小时，并使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)纯化。将在PBS中的缀合物在4℃下储存以用于短期使用，并且在-80℃下等分储存以用于长期使用。基于280nM处的吸光度确定抗体浓度。使用相同的缀合条件将h38C2IgG1用作阳性对照。催化活性使用已知的测定法评估，如Sinha，SC.Nature Protocols 2,449-456(2007)所述的，其公开内容通过引用全部并入本文。使用未缀合的DVD1和h38C2IgG1作为阳性对照。将曲妥珠单抗IgG1用作阴性对照。各种DVD组合物的示意图提供在图34中。催化活性测定的结果提供在图28、图32和图35中。结果表明每种组合物的催化活性与可用的反应性赖氨酸残基的数量相关。例如，如图35中所提供的，h38C2-IgG1(其具有各自含有1个反应性赖氨酸残基的2个可变结构域)显示出DVD1-Fab(其具有1个包含1个反应性赖氨酸残基的可变结构域)的催化活性的大致两倍。当与Fab、scFab、IgG及其相应的DVD形式组合物相比，某些组合物(例如，如图34所示的scFv和DART形式的组合物)的催化活性显示出降低的催化活性。没有反应性赖氨酸残基的组合物(例如曲妥珠单抗)没有显示出催化活性。
实施例15：DVD组合物的质谱分析
将未缀合的DVD1和抗体-药物缀合物(ADC)使用PNGase F(New England Biolabs)根据制造商的说明脱糖基化，使用DTT(终浓度为50mM DTT)还原，并使用MALDI-TOF质谱法分析。ADC重链的质量对应于1药物/重链，从而证明了每DVD确定数量的药物分子的精确缀合。结果提供在图33中。
实施例16：DVD组合物的体内细胞毒性
将PBS和BD Matrigel(BD Bioscience)的1:1混合物中的KPL-4(HER2+)细胞通过皮下接种到7周龄雌性NSG小鼠(Jackson Laboratory)的乳房脂肪垫中(每只小鼠5×106)。当肿瘤达到约200mm3时，将小鼠随机分配成7组，每组2只小鼠，并按2.5mg/kg、5.0mg/kg、10mg/kg或20mg/kg用抗HER2DVD1ADC处理，或按10mg/kg用未缀合的抗HER2 DVD1处理，或单独用载体(PBS)处理，或按10mg/kg用曲妥珠单抗-美坦新偶联物(ado-trastuzumabemtansine)生物仿制药(Levena Biopharma)处理，所述处理通过i.v.(尾静脉)注射进行，每4天共4个周期(*注：20mg/kg ADC组仅为1周期)。在2/4注射前1天将小鼠预先给药250μl无菌大鼠血清。每4天通过卡尺测量来监测肿瘤尺寸。所有程序均由斯克里普斯研究所的机构动物护理和使用委员会(the Institutional Animal Care and Use Committee of TheScripps Research Institute)批准，并根据美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南(the NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)进行。结果提供在图30中。结果表明，与载体对照(例如PBS)相比，ADC能够减少肿瘤体积。
将PBS和BD Matrigel(BD Bioscience)的1:1混合物中的KPL-4(HER2+)细胞通过皮下接种到7周龄雌性NSG小鼠(Jackson Laboratory)的乳房脂肪垫中(每只小鼠6×106)。当肿瘤达到约200mm3时，将小鼠随机分配到5组，每组7或8只小鼠，并按5mg/kg或10mg/kg用抗HER2 DVD1ADC处理，或按10mg/kg用未缀合的抗HER2 DVD1处理，或单独用载体(PBS)处理，或按5mg/kg用曲妥珠单抗-美坦新偶联物(ado-trastuzumab emtansine)生物仿制药(Levena Biopharma)处理，所述处理通过i.v.(尾静脉)注射进行，每7天共4个周期。在每次注射前1天将小鼠预先给药250μl无菌人血清(Sigma Aldrich)。每4天通过卡尺测量来监测肿瘤尺寸。所有程序均由斯克里普斯研究所的机构动物护理和使用委员会(theInstitutional Animal Care and Use Committee of The Scripps ResearchInstitute)批准，并根据美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南(the NIH Guidefor the Care and Use of Laboratory Animals)进行。结果提供在图31中。结果表明，与载体对照(例如PBS)相比，ADC能够减少肿瘤体积。
实施例17：DVD1-Fab克隆、表达、纯化、催化活性和细胞毒性
通过Nhel-HF/Xho1连接将PCR片段克隆到哺乳动物表达载体pCEP4(Invitrogen)中。重链在C-端包含人IgG1(CH1)的第一恒定结构域。轻链在C-端包含人Cκ(Ck)的第一恒定结构域。用聚乙烯亚胺(PEI)将哺乳动物细胞表达载体瞬时共转染(轻链和重链)到人胚胎肾(HEK)293细胞(Life Technologies)中。使用HiTrap蛋白A HP柱(GE Healthcare)纯化DVD1-Fab组合物。典型的产量是10毫克/升。使用SDS-PAGE确认纯度，并如实施例14中所述评估催化活性。将h38C2 IgG1用作阳性对照，曲妥珠单抗IgG1用作阴性对照。如实施例12中所述评估细胞毒性。结果提供于图32中。如预期的那样，DVD1-Fab组合物具有h38C2-IgG1组合物的约1/2的催化活性。细胞毒性数据表明DVD1-ADC和DVD1-Fab-ADC对HER2+细胞都具有细胞毒活性。如预期的那样，由于DVD1-Fab-ADC上的药物量与DVD1-ADC组合物相比较低，因此，DVD1-Fab-ADC的细胞毒活性低于DVD1-ADC组合物的细胞毒活性。
实施例18：DVD2-Fab克隆、表达、纯化和催化活性
针对DVD1和DVD2，通过分别经由短(ASTKGP)接头或长(TVAAPSVFIFPP)接头将曲妥珠单抗的VH和VL与h38C2的VH和VL连接来制备抗HER2 DVD。使用短(ASTKGP)接头表达抗CD138和抗CD79b DVD。所需序列合成为gBlocks(Integrated DNA Technologies)并用人IgG1重链或k轻链恒定结构域表达。将DVD表达盒NheI/XhoI克隆到哺乳动物表达载体pCEP4中并瞬时转染到HEK293细胞中进行生产。在9天时间内收集上清液3次，随后使用1mLHiTrap蛋白A HP柱(GE Healthcare Life Sciences)结合FPLC仪器(GEHealthcare Life Sciences)进行过滤和纯化。产量通常为10毫克/升。通过SDS-PAGE和考马斯染色证实DVD的纯度，通过测量280nm处的吸光度确定浓度。为了确保h38C2的Lys反应性在DVD式中保留，使用依赖于其催化醛缩酶活性的测定法直接评估其活性，以通过逆向Aldol反应将methodol转化为其母体醛。使用荧光计定量荧光醛的形成。
具体而言，将DVD或IgG1在PBS(pH7.4)中稀释至1μM，并将98μ1等分试样一式三份分配到96孔板中。然后，加入2μl的10mM在乙醇中的methodol，并在以下条件下立即评估荧光性：使用SpectraMax M5仪器(Molecular Devices)，用SoftMax Pro软件，激发波长(λext)设置为330nm，发射波长(λem)设置为452nm，并且从0分钟开始，使用5分钟时间点。信号通过归一化至98μL的PBS(其中添加2μL的methodol制剂)来确定。
图36显示直接使用methodol作为底物测量的h38C2赖氨酸的活性，将其转化为荧光醛并检测。DVD1具有与亲本h38C2IgG1相同的活性，DVD2具有降低的活性。曲妥珠单抗IgG1用作阴性对照。
实施例19：基于DVD的药物缀合物的产生和其对HER2+乳腺癌细胞系体外活性的评估
为了制备期望的ADC，合成具有不可裂解的接头的β-内酰胺官能化的单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF)化合物(图37A)。β-内酰胺柄用于缀合，因为它通过形成稳定的酰胺键而不可逆地与h38C2的Lys反应，从而防止药物过早释放的可能性。选择MMAF时，使用不可裂解的接头，因为这种有效载荷已被用于制备针对多种靶标的强效ADC，并且已报道不可裂解的接头具有更高的最大耐受剂量。通过将DVDl与4当量的β-内酰胺MMAF(相对于每种Lys残基，2当量)在PBS中孵育4小时来制备ADC(图37B)。图44提供了β-内酰胺MMAF的固相合成方案。由于Lys与β-内酰胺部分反应形成酰胺键，因此Lys不再具有催化活性，因此通过丧失催化活性证实了完全的缀合(图37C)。
使用30-kDa截止离心过滤装置将抗体浓缩至50μM(10.0mg/mL)后，在PBS(pH7.4)中进行所有缀合。将6.0μl的β-内酰胺-MMAF(1mM的10％DMSO的PBS溶液，4当量)加入到300μg抗体中，使最终反应体积为36μl。该溶液在室温下孵育4小时。使用methodol测定法，使用通过使用PBS将粗反应物的一部分稀释至1μM，通过丧失催化活性来认为所有缀合均完成。完成后，通过使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)除去未反应的化合物。为了更大规模地制备ADC，将11.3μl的β-内酰胺-MMAF(10mM，在100％DMSO中)加入到5.7mg抗体中，使最终反应体积为560μl。如前所述将该溶液在室温下孵育4小时并纯化。将PBS中的缀合物储存在4℃下以供短期使用，并且以等分试样储存在-80℃下以供长期使用。使用已知浓度的未缀合抗体作为标准，用Bio-Rad蛋白测定法测定抗体浓度。
除KPL-4(每孔3×103个细胞)外，将细胞以每孔5×103个细胞铺于96孔板中用于所有BC细胞。对于MM或Ramos细胞，每孔2.0×104个细胞。使BC细胞能粘附过夜并立即处理悬浮细胞。将未缀合的抗体和ADC的连续稀释液以0至10nM的浓度加入细胞。在孵育72小时后，使用CellTiter 96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega)按照制造商的说明测量细胞活力。细胞活力按未处理细胞的百分比计算(≡100％)。
针对HER2+(SK-BR-3)和HER2-(MDA-MB-468)BC细胞评估缀合物的体外细胞毒性。ADC对抗目标表达细胞(IC50＝双数皮摩尔)具有高效力，在HER2-细胞系中没有观察到细胞毒性(图29：SKBR3(HER2+)组)。作为阴性对照，将h38C2IgG1与β-内酰胺MMAF平行孵育并针对这些细胞系进行测试。由于h38C2缺乏额外的抗HER2靶向结构域，因此没有观察到细胞毒性，如所预期的。还发现ADC对几种其他HER2+细胞系高度有效(图38)。参考图38，描绘了抗HER2 DVD1/MMAF在用HER2+BC细胞系MDA-MB-361、BT-474和KPL-4在37℃孵育72小时(平均值±SD，一式三份)孵育后的体外细胞毒性。为了证明该策略的实用性，还通过用HER2靶向可变结构域取代CD138和CD79b靶向结构域来制备另外两种ADC。这两种抗原都是临床上建立的用于治疗多发性骨髓瘤(MM)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)的ADC靶标。两种ADC针对靶向表达细胞都高度有效(IC50＝双倍皮摩尔)(图39)。参考图39A，描绘了在37℃下与CD138+MM细胞系U-266和NCI-H929孵育72小时(平均值±SD，一式三份)后抗CD138 DVD1/MMAF缀合物的细胞毒性。参考图39B，描绘了在37℃与CD79b+Burkitt's淋巴瘤细胞系(Ramos)孵育72小时(平均值±SD，一式三份)后抗CD79b DVD1/MMAF缀合物的细胞毒性。使用抗HER2 DVD1/MMAF和h38C2 IgG1/MMAF作为阴性对照。
实施例20：抗-HER2 DVD1/MMAF药物缀合物的分析表征
为了证实该ADC平台的药物负荷，使用质谱来确定重链和轻链的质量。在还原条件下(在PBS中，50mM DTT)，所有样品用PNGase F(New England Biolabs)在37℃下糖基化过夜。根据制造商的说明，使用蛋白G HP SpinTrap(GE Healthcare)除去PNGase F。在样品分析之前再次还原样品(在PBS中，10mM DTT)。数据通过安捷伦电喷雾电离飞行时间(ESI-TOF)质谱仪获得。使用安捷伦BioConfirm软件获得解卷积质量。由于预期与β-内酰胺MMAF药物化合物反应的唯一赖氨酸位于重链上，应该重链的质量应该仅通过加入一种药物化合物而增加，并且不应在轻链上观察到修饰。当将未缀合的抗HER2 DVD1的质量与抗-HER2DVD1/MMAF进行比较时，质量增加对应于单个药物分子的添加，轻链检测到的质量没有变化(图40)。参考图40，未缀合的抗HER2 DVD1(图40A)和缀合的抗HER2 DVD1/MMAF(图40B)首先用PNGase F去糖基化，并在分析前用10mM DTT还原。在轻链上没有检测到缀合，并且重链质量的增加(约1160Da)对应于β-内酰胺MMAF的添加。未检测到未缀合的或更高的载药物种。因此，对于完整的抗HER2 DVD1/MMAF，药物比抗体的比例(DAR)为2。没有检测到更高的载药物种。此外，当Lys突变为丙氨酸(Ala)并且与β-内酰胺MMAF平行缀合时，未检测到修饰(图41)。参考图41，使用实施例19中的条件使抗HER2 DVD1突变以用丙氨酸置换h38C2的赖氨酸并用β-内酰胺MMAF孵育。在图41中，在分析之前，首先用PNGase F将未缀合的抗HER2 DVD1Ala突变体(图41A)和缀合的抗HER2 DVD1/MMAF Ala突变体(图41B)去糖基化并用10mM DTT还原。在与β-内酰胺MMAF孵育后，在轻链或重链上未检测到缀合，从而表明h38C2的赖氨酸作为药物附着位点。这些数据结合ADC不再具有催化活性的事实强烈表明Lys残基是唯一的缀合点。由于基于DVD的ADC由两条重链和轻链组成，因此DAR是2。
实施例21：在人乳腺癌异种移植小鼠模型中评估抗HER2 DVD1/MMAF
参考图43A，考马斯染色的SDS-PAGE证实在非还原(预期＝约200kDa)和还原条件(预期重链＝约63kDa，轻链＝约36kDa)下抗CD138 DVD1和抗CD79b DVD1的纯度。预染蛋白质梯子的分子量显示在左边。参考图43B，如针对制备抗HER2 DVD1/MMAF所述，将抗CD138DVD1和抗CD79b DVD1与4当量的β-内酰胺MMAF一起孵育。在未缀合的抗HER2 DVD1作为阳性对照，并且曲妥珠单抗IgG1作为阴性对照的条件下，通过评估所得抗CD138 DVD1/MMAF和抗CD79b DVD1/MMAF的催化活性来证实完全缀合。催化活性的完全丧失证实了完全缀合。
体内评估抗HER2 DVD1/MMAF。使用KPL-4细胞与雌性NSG小鼠进行BC异种移植研究。将PBS和BD Matrigel(BD Bioscience)的1：1混合物中的KPL-4细胞(6×106/只小鼠)皮下接种到7周龄雌性NSG小鼠(The Jackson Laboratory)的乳房脂肪垫中。当肿瘤达到约150mm3时，将小鼠随机分为5组，每组7-8只小鼠，并按5mg/kg或10mg/kg用抗HER2 DVD1/MMAF处理，或按10mg/kg用未缀合的抗HER2 DVD1处理，或按5mg/kg用曲妥珠单抗-美坦新偶联物(ado-trastuzumab emtansine)生物仿制药(Levena Biopharma)处理，或单独用载体(PBS)处理，所述处理通过i.v.(尾静脉)注射进行，每4天共4个周期。在通过i.p.注射的每个周期前24小时将小鼠预先给药250μl无菌过滤的人血清(Sigma Aldrich)。每4天使用卡尺测量来监测肿瘤尺寸。所有程序均由斯克里普斯研究所的机构动物护理和使用委员会(the Institutional Animal Care and Use Committee of The Scripps ResearchInstitute)批准，并根据美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南(the NIH Guidefor the Care and Use of Laboratory Animals)进行。
每4天通过静脉内(i.v.)注射5mg/kg或10mg/kg的抗HER2 DVD1/MMAF，10mg/kg未缀合的抗HER2 DVD1，5mg/kg的基准ADC曲妥珠单抗-美坦新偶联物或载体治疗小鼠携带的已形成肿瘤(约150mm3)，总共四次治疗。由于NSG小鼠缺乏血清IgG，因此每只动物预先给药250μl人血清以防止注射的抗体经由结合恒定结构域的巨噬细胞清除。对于两种抗-HER2DVD1/MMAF剂量，观察到显著的肿瘤消退和生长抑制(图42A)。参考图42A，将人BC细胞系KPL-4异种移植入雌性NSG小鼠的乳房脂肪垫中，生长至约150mm3，随机分为5组，每组7或8只小鼠，并且在指定的剂量下每四天四次用i.v.(尾静脉)注射指定的ADC和对照进行治疗。每次注射前24小时i.p.(腹膜)注射250μl人血清。绘制平均值±SD值。对于抗-HER2 DVD1/MMAF剂量和未缀合的抗-HER2 DVD组，存活率与载体相比也显著更长(图42B)。此外，在第100天，在实验结束时，10mg/kg的抗HER2 DVD ADC组中，8只动物中有5只治愈，其中7/8只动物存活。在该剂量下，肿瘤消退和存活均优于在5mg/kg下的曲妥珠单抗-美坦新偶联物。将ADC平台与曲妥珠单抗-美坦新偶联物比较时，两个重要考虑因素是抗体尺寸和载药量。ADC平台比曲妥珠单抗-美坦新偶联物(150kDa)大25％(200kDa)，每个抗体(2份药物/抗体)附着的药物比曲妥珠单抗-美坦新偶联物少(平均3.5份药物/抗体)。当考虑这些因子并标准化为纳摩尔细胞毒性剂/剂量时，与5mg/kg曲妥珠单抗-美坦新偶联物(约114纳摩尔美登素)相比，10mg/kg抗-HER2 DVD ADC的有效剂量是较低的(约98纳摩尔MMAF)。尽管有较高剂量的活性药物，但在研究过程中使用5mg/kg曲妥珠单抗-美坦新偶联物治疗没有动物治愈，总体存活较低，只有2/8只动物在研究结束时存活。
实施例22：比较跨越不同DVD的催化活性
使用以上实施例18中提供的催化活性比较CD138 DVD、CD79b DVD、h38C2 IgG1和HER2 DVD2上的催化活性。参考图45，所有测试的DVD对亲本h38C2 IgG1具有基本相同的催化活性。这表明h38C2 Fv部分是用于位点特异性药物缀合的通用接头，与上游靶向Fv部分无关。
还针对靶标表达细胞，测试这些DVD的结合活性。使用TrypLE(LifeTechnologies)收获SK-BR-3、MDA-MB-468、H929、U266和Ramos细胞并将其分配在V底96孔板(Corning)中。细胞用200μL流式细胞术缓冲液(PBS，2％(w/v)FBS，pH7.4)洗涤，在冰上与DVD1或DVD2孵育30分钟，用200μL流式细胞术缓冲液洗涤，并用647缀合的多克隆(Fab')2驴抗人Fc(Jackson ImmunoResearch Laboratories)在冰上染色20分钟。用200μL冰冷的流式细胞术缓冲液洗涤两次后，使用Canto II流式细胞仪(Becton-Dickinson)分析细胞。使用FlowJo软件(Tree Star)分析数据。参考图46，流式细胞术数据表明所有DVD针对靶向表达细胞的结合。
虽然为了清楚理解的目的通过说明和实施例相当详细地描述了前述发明，但是根据本发明的教导，本领域普通技术人员将容易明白，在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下可以对其进行一些修改和改变。
因此，前面仅仅说明了本发明的原理。应该理解的是，本领域技术人员将能够设计各种布置，尽管这里没有明确地描述或示出，但它们体现了本发明的原理并且是包含在本发明的精神和范围内。此外，在此叙述的所有示例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为推进现有技术而贡献的构思，并且应被解释为不受限于这些具体描述的示例和条件。此外，在此叙述本发明的原理和方面以及其具体示例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能的等同方案。此外，意图是这样的等同方案包括当前已知的等同方案和将来开发的等同方案，即，开发出的执行相同功能的任何元件，而不管结构如何。因此，本发明的范围不意指受限于在此示出和描述的示例性方面。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求来体现。
序列表
<110> 斯克利普斯研究院(THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE)
<120> 双重可变结构域免疫缀合物及其用途
<130> P34344WO00
<150> 62/327,849
<151> 2016-04-26
<150> 62/220,148
<151> 2015-09-17
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Ser Thr Lys Gly Pro
1 5
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
1 5 10
<210> 3
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Thr
20 25 30
Tyr Gly Ser Pro Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Ser Gln Gly
85 90 95
Thr His Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 4
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Arg Leu Arg Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Lys Thr Tyr Phe Tyr Ser Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 332
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ser Thr Lys Gly
100 105 110
Pro Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
115 120 125
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His
130 135 140
Thr Tyr Gly Ser Pro Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
145 150 155 160
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val
165 170 175
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
180 185 190
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Ser Gln
195 200 205
Gly Thr His Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
210 215 220
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
225 230 235 240
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
245 250 255
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
260 265 270
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
275 280 285
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
290 295 300
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
305 310 315 320
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
325 330
<210> 6
<211> 574
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met
145 150 155 160
Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Glu
165 170 175
Ile Arg Leu Arg Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys
210 215 220
Lys Thr Tyr Phe Tyr Ser Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
245 250 255
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
260 265 270
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
275 280 285
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
290 295 300
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
305 310 315 320
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
325 330 335
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
340 345 350
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
370 375 380
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
385 390 395 400
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
405 410 415
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
420 425 430
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
435 440 445
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
450 455 460
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
465 470 475 480
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
485 490 495
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
500 505 510
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
515 520 525
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
530 535 540
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
545 550 555 560
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
565 570
<210> 7
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
115 120 125
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser
130 135 140
Ser Gln Ser Leu Leu His Thr Tyr Gly Ser Pro Tyr Leu Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
165 170 175
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
180 185 190
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
195 200 205
Val Tyr Phe Cys Ser Gln Gly Thr His Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
210 215 220
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
245 250 255
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
260 265 270
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
275 280 285
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
290 295 300
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
305 310 315 320
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
325 330 335
Glu Cys
<210> 8
<211> 580
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
115 120 125
Ile Phe Pro Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
130 135 140
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
145 150 155 160
Phe Ser Asn Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Val Ser Glu Ile Arg Leu Arg Ser Asp Asn Tyr Ala Thr
180 185 190
His Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
195 200 205
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
210 215 220
Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Lys Thr Tyr Phe Tyr Ser Phe Ser Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
245 250 255
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
260 265 270
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
275 280 285
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
290 295 300
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
305 310 315 320
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
325 330 335
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
340 345 350
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
355 360 365
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
370 375 380
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
385 390 395 400
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
405 410 415
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
420 425 430
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
435 440 445
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
450 455 460
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
465 470 475 480
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
485 490 495
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
500 505 510
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
515 520 525
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
530 535 540
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
545 550 555 560
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
565 570 575
Ser Pro Gly Lys
580
<210> 9
<211> 337
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Ser
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
115 120 125
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser
130 135 140
Gln Ser Leu Leu His Thr Tyr Gly Ser Pro Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu
145 150 155 160
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn
165 170 175
Arg Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
180 185 190
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val
195 200 205
Tyr Phe Cys Ser Gln Gly Thr His Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly
210 215 220
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
225 230 235 240
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
245 250 255
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
260 265 270
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
275 280 285
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
290 295 300
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
305 310 315 320
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
325 330 335
Cys
<210> 10
<211> 572
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gln Leu
115 120 125
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
130 135 140
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Ser Trp
145 150 155 160
Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Glu Ile Arg
165 170 175
Leu Arg Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Lys Thr
210 215 220
Tyr Phe Tyr Ser Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
245 250 255
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
260 265 270
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
275 280 285
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
290 295 300
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
305 310 315 320
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
325 330 335
Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
340 345 350
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
355 360 365
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
370 375 380
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
385 390 395 400
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
405 410 415
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
420 425 430
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
435 440 445
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
450 455 460
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
465 470 475 480
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
485 490 495
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
500 505 510
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
515 520 525
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
530 535 540
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
545 550 555 560
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
565 570
<210> 11
<211> 343
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Ser
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Glu Leu Gln Met
115 120 125
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
130 135 140
Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Thr Tyr Gly Ser Pro
145 150 155 160
Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
165 170 175
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
180 185 190
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
195 200 205
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Ser Gln Gly Thr His Leu Pro
210 215 220
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
225 230 235 240
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
245 250 255
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
260 265 270
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
275 280 285
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
290 295 300
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
305 310 315 320
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
325 330 335
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
340
<210> 12
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
115 120 125
Pro Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
145 150 155 160
Asn Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ser Glu Ile Arg Leu Arg Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr
180 185 190
Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
195 200 205
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly
210 215 220
Ile Tyr Tyr Cys Lys Thr Tyr Phe Tyr Ser Phe Ser Tyr Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
245 250 255
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
260 265 270
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
275 280 285
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
290 295 300
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
305 310 315 320
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
325 330 335
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
340 345 350
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
355 360 365
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
370 375 380
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
385 390 395 400
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
405 410 415
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
420 425 430
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
435 440 445
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
450 455 460
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
465 470 475 480
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
485 490 495
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
500 505 510
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
515 520 525
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
530 535 540
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
545 550 555 560
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
565 570 575
Gly Lys
<210> 13
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp
35 40 45
Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro
85 90 95
Tyr Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ser
100 105 110
Thr Lys Gly Pro Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
115 120 125
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser
130 135 140
Leu Leu His Thr Tyr Gly Ser Pro Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys
145 150 155 160
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe
165 170 175
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
180 185 190
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe
195 200 205
Cys Ser Gln Gly Thr His Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
210 215 220
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
225 230 235 240
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
245 250 255
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
260 265 270
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
275 280 285
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
290 295 300
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
305 310 315 320
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
325 330 335
<210> 14
<211> 572
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Trp Gln Pro Gly Arg Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Gly
20 25 30
Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
35 40 45
Met Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg His Gly Asp Asp Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gln Leu
115 120 125
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
130 135 140
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Ser Trp
145 150 155 160
Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Glu Ile Arg
165 170 175
Leu Arg Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Lys Thr
210 215 220
Tyr Phe Tyr Ser Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
245 250 255
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
260 265 270
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
275 280 285
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
290 295 300
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
305 310 315 320
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
325 330 335
Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
340 345 350
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
355 360 365
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
370 375 380
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
385 390 395 400
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
405 410 415
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
420 425 430
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
435 440 445
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
450 455 460
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
465 470 475 480
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
485 490 495
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
500 505 510
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
515 520 525
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
530 535 540
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
545 550 555 560
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
565 570
<210> 15
<211> 341
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp
35 40 45
Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro
85 90 95
Tyr Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Glu Leu Gln Met Thr Gln
115 120 125
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
130 135 140
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Thr Tyr Gly Ser Pro Tyr Leu
145 150 155 160
Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
165 170 175
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
180 185 190
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
195 200 205
Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Ser Gln Gly Thr His Leu Pro Tyr Thr
210 215 220
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
245 250 255
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
260 265 270
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
275 280 285
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
290 295 300
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
305 310 315 320
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
325 330 335
Asn Arg Gly Glu Cys
340
<210> 16
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Trp Gln Pro Gly Arg Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Gly
20 25 30
Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
35 40 45
Met Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg His Gly Asp Asp Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Pro Val Thr Val Ser Ser Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
115 120 125
Pro Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
145 150 155 160
Asn Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ser Glu Ile Arg Leu Arg Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr
180 185 190
Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
195 200 205
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly
210 215 220
Ile Tyr Tyr Cys Lys Thr Tyr Phe Tyr Ser Phe Ser Tyr Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
245 250 255
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
260 265 270
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
275 280 285
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
290 295 300
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
305 310 315 320
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
325 330 335
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
340 345 350
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
355 360 365
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
370 375 380
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
385 390 395 400
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
405 410 415
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
420 425 430
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
435 440 445
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
450 455 460
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
465 470 475 480
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
485 490 495
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
500 505 510
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
515 520 525
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
530 535 540
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
545 550 555 560
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
565 570 575
Gly Lys
<210> 17
<211> 332
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ala Ser Thr Lys Gly
100 105 110
Pro Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
115 120 125
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His
130 135 140
Thr Tyr Gly Ser Pro Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
145 150 155 160
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val
165 170 175
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
180 185 190
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Ser Gln
195 200 205
Gly Thr His Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
210 215 220
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
225 230 235 240
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
245 250 255
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
260 265 270
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
275 280 285
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
290 295 300
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
305 310 315 320
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
325 330
<210> 18
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Met Met Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Ile Ser Ser Asn Thr Val Gln
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Tyr Gly Asn Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
145 150 155 160
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ser Glu Ile Arg Leu Arg Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
180 185 190
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
195 200 205
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
210 215 220
Tyr Cys Lys Thr Tyr Phe Tyr Ser Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
245 250 255
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
260 265 270
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
275 280 285
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
290 295 300
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
305 310 315 320
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
325 330 335
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
340 345 350
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
355 360 365
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
370 375 380
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
385 390 395 400
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
405 410 415
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
420 425 430
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
435 440 445
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
450 455 460
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
465 470 475 480
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
485 490 495
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
500 505 510
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
515 520 525
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
530 535 540
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
545 550 555 560
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
565 570 575
<210> 19
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
115 120 125
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser
130 135 140
Ser Gln Ser Leu Leu His Thr Tyr Gly Ser Pro Tyr Leu Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
165 170 175
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
180 185 190
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
195 200 205
Val Tyr Phe Cys Ser Gln Gly Thr His Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
210 215 220
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
245 250 255
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
260 265 270
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
275 280 285
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
290 295 300
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
305 310 315 320
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
325 330 335
Glu Cys
<210> 20
<211> 582
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Met Met Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Ile Ser Ser Asn Thr Val Gln
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Tyr Gly Asn Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Val Ala Ala Pro Ser
115 120 125
Val Phe Ile Phe Pro Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
145 150 155 160
Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu
165 170 175
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Glu Ile Arg Leu Arg Ser Asp Asn Tyr
180 185 190
Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
195 200 205
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
210 215 220
Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Lys Thr Tyr Phe Tyr Ser Phe Ser
225 230 235 240
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
260 265 270
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
275 280 285
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
290 295 300
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
305 310 315 320
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
325 330 335
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
340 345 350
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
355 360 365
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
370 375 380
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
385 390 395 400
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
405 410 415
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
420 425 430
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
435 440 445
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
450 455 460
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
465 470 475 480
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
485 490 495
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
500 505 510
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
515 520 525
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
530 535 540
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
545 550 555 560
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
565 570 575
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580
<210> 21
<211> 337
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Glu
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
115 120 125
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser
130 135 140
Gln Ser Leu Leu His Thr Tyr Gly Ser Pro Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu
145 150 155 160
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn
165 170 175
Arg Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
180 185 190
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val
195 200 205
Tyr Phe Cys Ser Gln Gly Thr His Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly
210 215 220
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
225 230 235 240
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
245 250 255
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
260 265 270
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
275 280 285
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
290 295 300
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
305 310 315 320
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
325 330 335
Cys
<210> 22
<211> 571
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Ile Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Phe Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Val Pro Ile Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gln Leu Val
115 120 125
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
130 135 140
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Ser Trp Val
145 150 155 160
Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Glu Ile Arg Leu
165 170 175
Arg Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg
180 185 190
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
195 200 205
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Lys Thr Tyr
210 215 220
Phe Tyr Ser Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
245 250 255
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
260 265 270
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
275 280 285
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
290 295 300
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
305 310 315 320
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
325 330 335
Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
340 345 350
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
355 360 365
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
370 375 380
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
385 390 395 400
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
405 410 415
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
420 425 430
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
435 440 445
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
450 455 460
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
465 470 475 480
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
485 490 495
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
500 505 510
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
515 520 525
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
530 535 540
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
545 550 555 560
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
565 570
<210> 23
<211> 343
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Glu
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Glu Leu Gln Met
115 120 125
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
130 135 140
Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Thr Tyr Gly Ser Pro
145 150 155 160
Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
165 170 175
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
180 185 190
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
195 200 205
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Ser Gln Gly Thr His Leu Pro
210 215 220
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
225 230 235 240
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
245 250 255
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
260 265 270
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
275 280 285
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
290 295 300
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
305 310 315 320
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
325 330 335
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
340
<210> 24
<211> 577
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Ile Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Phe Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Val Pro Ile Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
115 120 125
Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
130 135 140
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn
145 150 155 160
Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp
165 170 175
Val Ser Glu Ile Arg Leu Arg Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala
180 185 190
Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
195 200 205
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile
210 215 220
Tyr Tyr Cys Lys Thr Tyr Phe Tyr Ser Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
245 250 255
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
260 265 270
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
275 280 285
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
290 295 300
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
305 310 315 320
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
325 330 335
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
340 345 350
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
355 360 365
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
370 375 380
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
385 390 395 400
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
405 410 415
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
420 425 430
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
435 440 445
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
450 455 460
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
465 470 475 480
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
485 490 495
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
500 505 510
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
515 520 525
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
530 535 540
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
545 550 555 560
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565 570 575
Lys

Claims (66)

1.一种具有式Ig-(L-D)n的免疫缀合物，其中：
(a)Ig为双重可变结构域免疫球蛋白分子或其抗原结合片段，其中所述双重可变结构域免疫球蛋白分子包含：
(i)第一可变结构域，其与结合靶标结合；和
(ii)第二可变结构域，其包含反应性残基；
(b)L是与所述Ig的第二可变结构域的所述反应性残基共价缀合的接头；
(c)D是药物部分；以及
(d)n选自1至12中的整数。
2.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中所述反应性残基是赖氨酸。
3.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中n是1或2。
4.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中所述Ig的第一可变结构域比所述第二可变结构域位于更靠近N-端的位置。
5.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中Ig是双特异性免疫球蛋白分子。
6.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中D包含相同或不同的药物部分中的2个或更多个。
7.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合片段包含所述Ig的所述第一可变结构域和所述第二可变结构域，并且选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。
8.根据权利要求7所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合片段包含Fab。
9.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中Ig包含嵌合免疫球蛋白序列。
10.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中Ig包含人源化免疫球蛋白序列。
11.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中Ig包含人免疫球蛋白序列。
12.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中所述Ig的第二可变结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
13.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中所述Ig的第二可变结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
14.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中所述结合靶标是肿瘤细胞表面抗原。
15.根据权利要求14所述的免疫缀合物，其中所述肿瘤细胞表面抗原选自HER2、FOLR1、CD138和CD79b。
16.根据权利要求15所述的免疫缀合物，其中所述Ig的第一可变结构域与HER2结合。
17.根据权利要求15所述的免疫缀合物，其中所述Ig的第一可变结构域与FOLR1结合。
18.根据权利要求15所述的免疫缀合物，其中所述Ig的第一可变结构域与CD138结合。
19.根据权利要求15所述的免疫缀合物，其中所述Ig的第一可变结构域与CD79b结合。
20.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中所述药物部分是细胞毒性剂。
21.根据权利要求20所述的免疫缀合物，其中所述细胞毒素剂选自毒素、化学治疗剂、抗生素、放射性同位素、螯合的放射性同位素和溶核酶。
22.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中D是奥瑞斯他汀、多拉司他汀或西马多丁。
23.根据权利要求22所述的免疫缀合物，其中D是MMAE或MMAF。
24.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中D是喜树碱。
25.根据权利要求24所述的免疫缀合物，其中所述喜树碱是SN-38。
26.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中D是美登木素生物碱。
27.根据权利要求26所述的免疫缀合物，其中所述美登木素生物碱是DM1、DM3或DM4。
28.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中D是吡咯并苯并二氮卓(PBD)。
29.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中D是烯二炔。
30.根据权利要求29所述的免疫缀合物，其中D是加利车霉素。
31.根据权利要求29所述的免疫缀合物，其中D是天赐米星。
32.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中D是阿霉素。
33.根据权利要求32所述的免疫缀合物，其中D是MMDX。
34.根据权利要求33所述的免疫缀合物，其中D是PNU-159682。
35.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中D是siRNA。
36.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中L是可逆接头。
37.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中L是不可逆接头。
38.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中L是可裂解的接头。
39.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中L是不可裂解的接头。
40.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中L是支链接头。
41.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中L是直链接头。
42.一种用于治疗癌症的药物组合物，其中所述药物组合物包含有效量的根据权利要求1-41中任一项所述的免疫缀合物和药学可接受的载体。
43.根据权利要求1-41中任一项所述的免疫缀合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
44.根据权利要求43所述的用途，其中所述癌症是血液癌症、癌瘤、肉瘤、黑素瘤或中枢神经系统癌症。
45.根据权利要求44所述的用途，其中所述血液癌症是白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或骨髓增生异常综合征。
46.根据权利要求45所述的用途，其中所述白血病是急性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞源性白血病或慢性淋巴细胞性白血病。
47.根据权利要求45所述的用途，其中所述淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
48.根据权利要求44所述的用途，其中所述癌症是皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、肺癌、鼻咽癌、结直肠癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、前列腺癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、肾癌、或乳腺癌。
49.根据权利要求44所述的用途，其中所述肉瘤为血管肉瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、纤维肉瘤、胃肠道间质瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、恶性外周神经鞘瘤、骨肉瘤、多形性肉瘤、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤或滑膜肉瘤。
50.根据权利要求44所述的用途，其中所述中枢神经系统癌症为神经胶质瘤、脑膜瘤或神经瘤。
51.根据权利要求43所述的用途，其中所述药物还包含有效量的第二治疗剂。
52.根据权利要求51所述的用途，其中所述第二治疗剂是抗体、抗肿瘤剂、细胞毒性剂、抗血管生成剂或免疫抑制剂。
53.根据权利要求52所述的用途，其中所述第二治疗剂选自顺铂、卡铂、奥沙利铂、二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、阿霉素、柔红霉素、戊柔比星、伊达比星、表柔比星、放线菌素、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、贝伐单抗、伊马替尼、厄洛替尼、吉非替尼、依鲁替尼、艾德拉尼、来那度胺、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛、紫杉醇和多西他赛。
54.根据权利要求2所述的免疫缀合物，其中：
(a)Ig包含SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列，并且所述第一可变结构域的所述结合靶标是HER2；
(b)L是与所述Ig的反应性赖氨酸残基共价缀合的线性不可逆接头；
(c)D是MMAF；并且
(d)n是1至12。
55.根据权利要求2所述的免疫缀合物，其中：
(a)Ig包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列，并且所述第一可变结构域的所述结合靶标是HER2；
(b)L是与所述Ig的反应性赖氨酸残基共价缀合的线性不可逆接头；
(c)D是MMAF；并且
(d)n是1至12。
56.根据权利要求2所述的免疫缀合物，其中：
(a)Ig包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的氨基酸序列，并且所述第一可变结构域的所述结合靶标是FOLR1；
(b)L是与所述Ig的反应性赖氨酸残基共价缀合的线性不可逆接头；
(c)D是MMAF；并且
(d)n是1至12。
57.根据权利要求2所述的免疫缀合物，其中：
(a)Ig包含SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的氨基酸序列，并且所述第一可变结构域的所述结合靶标是FOLR1；
(b)L是与所述Ig的反应性赖氨酸残基共价缀合的线性不可逆接头；
(c)D是MMAF；并且
(d)n是1至12。
58.根据权利要求2所述的免疫缀合物，其中：
(a)Ig包含SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的氨基酸序列，并且所述第一可变结构域的所述结合靶标是FOLR1；
(b)L是与所述Ig的反应性赖氨酸残基共价缀合的线性不可逆接头；
(c)D是MMAF；并且
(d)n是1至12。
59.根据权利要求2所述的免疫缀合物，其中：
(a)Ig包含SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且所述第一可变结构域的结合靶标是FOLR1；
(b)L是与所述Ig的反应性赖氨酸残基共价缀合的线性不可逆接头；
(c)D是MMAF；并且
(d)n是1至12。
60.根据权利要求2所述的免疫缀合物，其中：
(a)Ig包含SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且所述第一可变结构域的所述结合靶标是CD138；
(b)L是与所述Ig的反应性赖氨酸残基共价缀合的线性不可逆接头；
(c)D是MMAF；并且
(d)n是1至12。
61.根据权利要求2所述的免疫缀合物，其中：
(a)Ig包含SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的氨基酸序列，并且所述第一可变结构域的所述结合靶标是CD138；
(b)L是与所述Ig的反应性赖氨酸残基共价缀合的线性不可逆接头；
(c)D是MMAF；并且
(d)n是1至12。
62.根据权利要求2所述的免疫缀合物，其中：
(a)Ig包含SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的氨基酸序列，并且所述第一可变结构域的所述结合靶标是CD79b；
(b)L是与所述Ig的反应性赖氨酸残基共价缀合的线性不可逆接头；
(c)D是MMAF；并且
(d)n是1至12。
63.根据权利要求2所述的免疫缀合物，其中：
(a)Ig包含SEQ ID NO:23和24的氨基酸序列，并且所述第一可变结构域的所述结合靶标是CD79b；
(b)L是与所述Ig的反应性赖氨酸残基共价缀合的线性不可逆接头；
(c)D是MMAF；并且
(d)n是1至12。
64.根据权利要求54-63中任一项所述的免疫缀合物，其中n是1或2。
65.一种具有式Ig-(L-D)n所述的免疫缀合物，其中：
(a)Ig为双重可变结构域免疫球蛋白分子或其抗原结合片段，其中所述双重可变结构域免疫球蛋白分子包含：
(i)第一可变结构域，其与结合靶标结合；和
(ii)第二可变结构域，其包含反应性赖氨酸残基；
(b)L是与所述Ig的第二可变结构域的所述反应性赖氨酸残基共价缀合的接头；
(c)D是药物部分；并且
(d)n是1至12。
66.根据权利要求65所述的免疫缀合物，其中n是1或2。
CN201680054340.XA 2015-09-17 2016-09-16 双重可变结构域免疫缀合物及其用途 Active CN108025071B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562220148P 2015-09-17 2015-09-17
US62/220,148 2015-09-17
US201662327849P 2016-04-26 2016-04-26
US62/327,849 2016-04-26
PCT/US2016/052214 WO2017049139A2 (en) 2015-09-17 2016-09-16 Dual variable domain immunoconjugates and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108025071A true CN108025071A (zh) 2018-05-11
CN108025071B CN108025071B (zh) 2022-11-01

Family

ID=58289691

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680054340.XA Active CN108025071B (zh) 2015-09-17 2016-09-16 双重可变结构域免疫缀合物及其用途

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11197934B2 (zh)
EP (1) EP3349795B1 (zh)
JP (2) JP6990650B2 (zh)
CN (1) CN108025071B (zh)
CA (1) CA2998740A1 (zh)
ES (1) ES2878008T3 (zh)
HK (1) HK1258524A1 (zh)
WO (1) WO2017049139A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113329769A (zh) * 2018-10-11 2021-08-31 斯克里普斯研究学院 具有反应性精氨酸的抗体化合物及相关的抗体药物缀合物

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210108421A (ko) 2018-12-24 2021-09-02 사노피 돌연변이 Fab 도메인을 포함하는 다중특이성 결합 단백질
AU2020206269A1 (en) * 2019-01-11 2021-08-05 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Multimerization of IL-15/IL-15R-alpha-Fc complexes to enhance immunotherapy
AU2020295485A1 (en) * 2019-06-21 2021-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Structurally defined siRNA-dual variable domain immunoglobulin conjugates
AU2020369479A1 (en) * 2019-10-23 2022-05-26 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Novel conjugation chemistry for catalytic antibody 38C2

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1606454A (zh) * 2001-10-22 2005-04-13 斯克里普斯研究学院 抗体靶向化合物
WO2007038868A2 (en) * 2005-10-03 2007-04-12 The University Of British Columbia Novel enediyne compound and uses thereof
CN101287485A (zh) * 2005-03-03 2008-10-15 爱尔兰考夫克斯科技有限公司 抗血管生成化合物
CN101437536A (zh) * 2006-03-23 2009-05-20 诺华有限公司 抗肿瘤细胞抗原抗体治疗
US20090215992A1 (en) * 2005-08-19 2009-08-27 Chengbin Wu Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
CN102448494A (zh) * 2009-02-13 2012-05-09 免疫医疗公司 具有胞内可裂解的键的免疫共轭物
CN102458471A (zh) * 2009-05-28 2012-05-16 葛兰素集团有限公司 用于治疗或预防眼病的TNFα拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合
US20130323234A1 (en) * 2012-01-09 2013-12-05 Covx Technologies Ireland Limited Mutant antibodies and conjugation thereof
US20140127241A1 (en) * 2012-10-30 2014-05-08 Esperance Pharmaceuticals, Inc. Antibody/drug conjugates and methods of use
US20140161817A1 (en) * 2012-11-01 2014-06-12 Michael Siedler Stable dual variable domain immunoglobulin protein formulations
US20140220047A1 (en) * 2003-11-06 2014-08-07 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
WO2015044386A1 (en) * 2013-09-26 2015-04-02 Ablynx Nv Bispecific nanobodies
CN104540526A (zh) * 2012-07-09 2015-04-22 基因泰克公司 包含抗cd79b抗体的免疫偶联物
CN104650235A (zh) * 2007-11-30 2015-05-27 葛兰素集团有限公司 抗原结合构建体

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006094269A2 (en) * 2005-03-03 2006-09-08 Covx Technologies Ireland Limited Anti-angiogenic compounds
WO2007024715A2 (en) 2005-08-19 2007-03-01 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
CN102076355B (zh) 2008-04-29 2014-05-07 Abbvie公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
KR20140015139A (ko) * 2009-10-15 2014-02-06 애브비 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
UY32979A (es) * 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
RU2012157167A (ru) * 2010-07-12 2014-08-20 КовЭкс Текнолоджиз Айэлэнд Лимитед Полифункциональные антительные конъюгаты
RU2013109275A (ru) * 2010-08-03 2014-09-10 Эббви Инк. Иммуноглобулины с двумя вариабельными доменами и их применение
JP2015535212A (ja) * 2012-08-17 2015-12-10 ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・コロラド、ア・ボデイー・コーポレイト 補体活性化を検出するための組成物および方法
US20140219913A1 (en) * 2012-12-28 2014-08-07 Abbvie, Inc. Dual Specific Binding Proteins Having a Receptor Sequence
MX2016004420A (es) * 2013-10-06 2017-03-31 Abbvie Inc Proteinas de union especificas duales dirigidas contra los receptores de células inmunes y autoantígenos de señalización de tlr.

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1606454A (zh) * 2001-10-22 2005-04-13 斯克里普斯研究学院 抗体靶向化合物
US20140220047A1 (en) * 2003-11-06 2014-08-07 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
CN101287485A (zh) * 2005-03-03 2008-10-15 爱尔兰考夫克斯科技有限公司 抗血管生成化合物
US20090215992A1 (en) * 2005-08-19 2009-08-27 Chengbin Wu Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
WO2007038868A2 (en) * 2005-10-03 2007-04-12 The University Of British Columbia Novel enediyne compound and uses thereof
CN101437536A (zh) * 2006-03-23 2009-05-20 诺华有限公司 抗肿瘤细胞抗原抗体治疗
CN104650235A (zh) * 2007-11-30 2015-05-27 葛兰素集团有限公司 抗原结合构建体
CN102448494A (zh) * 2009-02-13 2012-05-09 免疫医疗公司 具有胞内可裂解的键的免疫共轭物
CN102458471A (zh) * 2009-05-28 2012-05-16 葛兰素集团有限公司 用于治疗或预防眼病的TNFα拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合
US20130323234A1 (en) * 2012-01-09 2013-12-05 Covx Technologies Ireland Limited Mutant antibodies and conjugation thereof
CN104540526A (zh) * 2012-07-09 2015-04-22 基因泰克公司 包含抗cd79b抗体的免疫偶联物
US20140127241A1 (en) * 2012-10-30 2014-05-08 Esperance Pharmaceuticals, Inc. Antibody/drug conjugates and methods of use
US20140161817A1 (en) * 2012-11-01 2014-06-12 Michael Siedler Stable dual variable domain immunoglobulin protein formulations
WO2015044386A1 (en) * 2013-09-26 2015-04-02 Ablynx Nv Bispecific nanobodies

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HERVÉBOUCHARD 等: "Antibody–drug conjugates—A new wave of cancer drugs", 《BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS》 *
LUIGI,QUINTIERI 等: "Formation and antitumor activity of PNU-159682, a major metabolite of nemorubicin in human liver microsomes", 《CLINICAL CANCER RESEARCH : AN OFFICIAL JOURNAL OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH》 *
STEVEN G VAN LANEN 等: "Biosynthesis of enediyne antitumor antibiotics", 《CURR TOP MED CHEM.》 *
TIANMIN LIN 等: "The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity", 《CANCER BIOLOGY & THERAPY》 *
刘昌孝 等: "抗体药物偶联物(ADC)药动学研究的认识", 《DRUG EVALUATION RESEARCH》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113329769A (zh) * 2018-10-11 2021-08-31 斯克里普斯研究学院 具有反应性精氨酸的抗体化合物及相关的抗体药物缀合物

Also Published As

Publication number Publication date
ES2878008T3 (es) 2021-11-18
WO2017049139A2 (en) 2017-03-23
EP3349795B1 (en) 2021-03-17
US20180250415A1 (en) 2018-09-06
CA2998740A1 (en) 2017-03-23
HK1258524A1 (zh) 2019-11-15
EP3349795A2 (en) 2018-07-25
EP3349795A4 (en) 2019-05-08
US11197934B2 (en) 2021-12-14
JP2018528963A (ja) 2018-10-04
JP6990650B2 (ja) 2022-03-04
CN108025071B (zh) 2022-11-01
JP2021176915A (ja) 2021-11-11
WO2017049139A3 (en) 2017-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230061715A1 (en) Binding fusion proteins, binding fusion protein-drug conjugates, xten-drug conjugates and methods of making and using same
US10870874B2 (en) Binding fusion proteins, binding fusion protein-drug conjugates, XTEN-drug conjugates and methods of making and using same
JP7025388B2 (ja) 新規異種二量体タンパク質
CN111138543B (zh) 异二聚体蛋白
JP2021176915A (ja) 二重可変ドメインイムノコンジュゲートおよびその用途
JP2020184996A (ja) 多特異性抗原結合タンパク質
CN111601824A (zh) 针对肿瘤相关抗原的三特异性结合分子及其用途
JP2022513708A (ja) 多重特異性抗原結合分子
CN116249549A (zh) 用于治疗增殖性疾病和自身免疫病症的双特异性组合疗法
US20210340277A1 (en) Antibody compounds with reactive arginine and related antibody drug conjugates
JP2024527020A (ja) 抗原結合分子の組合せ
WO2023212725A2 (en) Antibody compounds with reactive cysteine and related antibody drug conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant