ES2874077T3

ES2874077T3 - Métodos y compuestos mejorados para eliminar respuestas inmunitarias a agentes terapéuticos

Info

Publication number: ES2874077T3
Application number: ES16778714T
Authority: ES
Inventors: Jean-Marie Saint-Remy; Elst Luc Vander; Vincent Carlier
Original assignee: Imcyse SA
Current assignee: Imcyse SA
Priority date: 2015-09-25
Filing date: 2016-09-23
Publication date: 2021-11-04
Anticipated expiration: 2036-09-23
Also published as: WO2017050966A1; EP3939606A2; EP3939606A3; CN108289941A; EP3352782B1; AU2016328582B2; CN108289941B; US20240109951A1; CA2995771A1; US20180258154A1; HK1252695A1; US11787849B2; AU2023201135A1; JP2018528237A; AU2016328582A1; JP7090335B2; EP3352782A1

Abstract

Un kit de partes de polipéptidos que comprende: a) un péptido que comprende: a1) un epítopo de células T de MHC de clase II o un epítopo de células T NK restringido a CD1d, y a2) inmediatamente adyacente a dicho epítopo o separado por como mucho 7 aminoácidos de dicho epítopo una secuencia de motivo oxidorreductasa [CST]-X(2)-C [SEQ ID NO:7] o C-X(2)-[CST] [SEQ ID NO:8] y b) un polipéptido de fusión o un vector de expresión que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica dicho polipéptido de fusión, que comprende como compañeros de fusión: b1) una proteína terapéutica o de vector vírico y b2) el epítopo definido en a1), en donde la secuencia del epítopo es una secuencia que no se produce en la secuencia sin modificar de la proteína terapéutica o del vector vírico de b1), para uso en prevenir la respuesta inmunitaria a dicha proteína terapéutica o del vector vírico en un sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y compuestos mejorados para eliminar respuestas inmunitarias a agentes terapéuticos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas modificadas para uso en terapias de sustitución, terapia génica y vacunaciones génicas.

La presente invención se refiere además a compuestos y métodos para prevenir una respuesta inmunitaria contra proteínas usadas en terapias de sustitución, terapia génica y vacunaciones génicas.

Antecedentes de la invención

Las proteínas que se usan como agentes terapéuticos con frecuencia provocan una respuesta inmunitaria que excluye su uso adicional. Los ejemplos son factor VIII en el tratamiento de pacientes de hemofilia A, y anticuerpos específicos para citoquinas (por ejemplo, anticuerpos anti-TNF-alfa) o específicos para marcadores de superficie celular (por ejemplo, anticuerpos anti-CD20). De media el 30% de los pacientes tratados por tales reactivos desarrollan anticuerpos a concentraciones detectables en sangre periférica. Además, una proporción significativa de pacientes requiere la administración de dosis de los agentes terapéuticos mayores de lo esperado, lo que sugiere que los anticuerpos a concentraciones por debajo de la detección neutralizan la actividad del agente y/o aumentan su depuración de la circulación. En todas estas situaciones, sería ventajoso prevenir estas respuestas inmunitarias.

La terapia génica y la vacunación génica se basan en vectores víricos usados para llevar a cabo transgénesis. Sin embargo, las proteínas víricas expresadas por estos vectores provocan respuestas inmunitarias, reduciendo la eficacia de la transgénesis y previniendo la readministración del transgén. Evitar tal respuesta permitiría la expresión a largo plazo del transgén, y reduciría el número de partículas víricas necesarias para alcanzar transgénesis funcional o eficacia de vacunación.

La solicitud de patente WO2008017517 describe péptidos con un epítopo de células T restringido a clase II de un antígeno y una secuencia de motivo redox y su uso en la terapia de un número de enfermedades. Se publican detalles adicionales en Carlier et al. (2012), PloS ONE 7, e45366. El uso de tales péptidos produce la generación de células T CD4+ con propiedades citolíticas que inducen apoptosis de células presentadoras de antígeno (que presentan el antígeno usado en el diseño del péptido) después de interacción afín con complejos péptido-MHC de clase II.

Solicitudes de patente adicionales del mismo inventor divulgan el uso de esta tecnología para evitar una respuesta inmunitaria contra proteínas terapéuticas o anticuerpos (documento WO2009101206) o contra proteínas codificadas por el esqueleto de un vector vírico para terapia génica de vacunación (documento WO2009101204). Estos hallazgos se resumen en Abrahimians et al. (2015), Front. Immunol., 6, 449.

Se han descrito epítopos de células T de MHC de clase II promiscuos que se unen a una pluralidad de moléculas de MHC de clase II para una variedad de antígenos.

Una proteína de fusión de VEGF y un epítopo de células T auxiliares promiscuo se divulga en el documento US2007184023 y solicitudes de patente relacionadas de la familia de patentes de WO2005042575.

Una proteína de fusión de la proteína de la zona pelúcida y un epítopo de célula T promiscuo de toxina del tétanos genera anticuerpos que se unen a la proteína de la zona pelúcida endógena y actúan como un anticonceptivo (Lou et al., (1995) J. Immunol. 155, 2715-2720). Se ha publicado un resumen de la identidad y las funciones de motivos derivados de CXXC por Fomenko et al. (2003) Biochemistry, 42, 11214-11225.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona soluciones para los siguientes problemas.

En los métodos del estado de la técnica, descritos anteriormente, la secuencia del epítopo que se usa en el péptido está definida por la secuencia del antígeno.

Cuando está aislado y fusionado a la secuencia del motivo redox, tal péptido epítopo puede estar sometido a corte proteolítico, puede ser difícil de solubilizar, o puede tender a formar puentes de cisteína internos con el motivo redox. Además, el uso de diferentes péptidos para diferentes proteínas terapéuticas hace difícil diseñar procedimientos estándar en donde los péptidos se pueden administrar a la misma concentración y en un mismo esquema de vacunación independientemente del tipo de proteína terapéutica que se usa.

El gran polimorfismo de los determinantes de MHC de clase II en seres humanos hace difícil usar un único o un pequeño número de epítopos de una proteína para coincidir con este polimorfismo.

Solo para esos antígenos que contienen un epítopo promiscuo, o para esos antígenos en donde se pueden identificar diferentes epítopos de un antígeno para evitar el polimorfismo, es posible tratar cualquier individuo independientemente de su tipo de HLA.

Si está presente en una proteína, el uso de un epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d puede soslayar el polimorfismo de HLA, sin embargo, no todas las proteínas antigénicas contienen tal secuencia peptídica.

La presente invención permite desacoplar la conexión entre un antígeno que contiene un epítopo de célula T y el uso del mismo epítopo para hacer un péptido con un epítopo y una secuencia de motivo redox.

La presente invención permite usar epítopos de células T que se unen a diferentes proteínas y alelos de MHC de clase II.

Como se puede entender fácilmente de los usos médicos descritos en la presente especificación, y descritos en más detalle posteriormente estos usos médicos requieren una primera administración del péptido que comprende el epítopo y el motivo oxidorreductasa para obtener una población de CD4+ citolítica contra células presentadoras de antígeno (CPA) que presentan el epítopo. Esto está seguido por una segunda administración de una proteína terapéutica o un vector para terapia génica con el epítopo recién introducido. En el presente documento la proteína terapéutica (o la proteína del vector vírico codificada por el vector) contiene el mismo epítopo que está presente en el péptido usado en la primera administración. Una respuesta inmunitaria eventual a la, por ejemplo, una proteína terapéutica empezaría con la presentación de epítopos de la proteína terapéutica por la CPA. La CPA no solo presentará los epítopos presentes en la proteína terapéutica misma, sino también el epítopo que se ha introducido. Como consecuencia, la CPA será destruida por las células citolíticas anteriores, previniendo la depuración del antígeno.

Los usos médicos de la presente divulgación se basan en la administración separada de los dos tipos de polipéptidos. Se denominan, en consecuencia, mediante uno de los sinónimos “combinación”, “conjunto” o “kit de partes”.

El ámbito de la invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas al presente documento.

Un aspecto de la divulgación se refiere a kits de partes de polipéptidos que comprende:

a) un péptido que comprende:

a1) un epítopo de células T de MHC de clase II o un epítopo de células T NK restringido a CD1d, y

a2) inmediatamente adyacente a dicho epítopo o separado por como mucho 7 aminoácidos de dicho epítopo una secuencia de motivo oxidorreductasa [CTS]-X(2)-C [SEQ ID NO: 7] o C-X(2)-[CTS] [SEQ ID NO: 8],

y

b) un polipéptido que comprende:

b1) una proteína terapéutica y

b2) el epítopo definido en a1), en donde la secuencia del epítopo es una secuencia que se diferencia de la secuencia de la proteína de b1).

Un aspecto de la divulgación se refiere a kits de partes que comprenden:

a) un péptido que comprende:

y

b) un vector de expresión que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido que comprende:

b1) una proteína terapéutica y

Un aspecto de la divulgación se refiere a kits de partes que comprenden:

a) un péptido que comprende:

a1) un epítopo de células T de MHC de clase II o un epítopo de células T NK restringido a CD1d, y a2) inmediatamente adyacente a dicho epítopo o separado por como mucho 7 aminoácidos de dicho epítopo una secuencia de motivo oxidorreductasa [CTS]-X(2)-C [SEQ ID NO: 7] o C-X(2)-[CTS] [SEQ ID NO: 8], y

b) un vector vírico para terapia génica o vacunación génica que comprende en el esqueleto una secuencia polinucleotídica que codifica una proteína que comprende:

b1) una proteína de vector vírico para la función y mantenimiento del vector,

Por tanto, la secuencia del epítopo, no se produce en la secuencia natural (o de tipo salvaje o nativa) de la proteína terapéutica o la proteína del vector vírico usada en la terapia del estado de la técnica. La divulgación no prevé proteínas de fusión en donde un epítopo existente en la proteína se repite como un compañero de fusión de la proteína. La divulgación no prevé proteínas en donde el epítopo anteriormente definido de a) sería un epítopo existente que se corta de la secuencia de la proteína y se inserta en otra parte de las proteínas por deleción e inserción a través de tecnología de ADN recombinante.

En ejemplos de los kits divulgados en el presente documento la proteína de b) es una proteína de fusión que comprende como compañeros de fusión:

b1) una proteína terapéutica o una proteína de vector vírico, y

En ejemplos de kits divulgados en el presente documento la secuencia del motivo oxidorreductasa es C-X(2)-C [SEQ ID NO: 2].

En ejemplos de kits divulgados en el presente documento el motivo de epítopo de células T NK restringido a CD1d tiene la secuencia [FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT] [SEQ ID NO: 1].

En ejemplos de kits divulgados en el presente documento el motivo de epítopo de células T NK restringido a CD1d tiene la secuencia [FWY]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWY] [SEQ ID NO: 28].

En ejemplos de kits divulgados en el presente documento dicho epítopo de células T de MHC de clase II es un epítopo promiscuo que se une a una o más moléculas HLA-DR1.

En ejemplos de kits divulgados en el presente documento el epítopo de células T de MHC de clase II tiene la secuencia X1X2MATX6LLM [SEQ ID NO: 29], en donde X1 y X2 se seleccionan independientemente de V, I, L, M, Y, H, F y W y X6 es R o P.

Un aspecto de la divulgación se refiere a los kits anteriores para uso como un medicamento.

Un aspecto de la divulgación se refiere a polipéptidos que comprenden:

b1) una proteína terapéutica, y

b2) un epítopo de células T de MHC de clase II o un epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d, en donde la secuencia del epítopo es una secuencia que se diferencia de la proteína de b1.

para uso como un medicamento en un individuo que ha sido tratado previamente con un péptido que comprende: a1) dicho epítopo de células T de MHC de clase II o dicho epítopo de células T NK restringido a CD1d, y a2) inmediatamente adyacente a dicho epítopo o separado por como mucho 7 aminoácidos de dicho epítopo una secuencia de motivo oxidorreductasa [CTS]-X(2)-C [SEQ ID NO: 7] o C-X(2)-[CTS] [SEQ ID NO: 8].

Un aspecto de la divulgación se refiere a vectores de expresión que codifican un polipéptido que comprende: b1) una proteína terapéutica, y

Un aspecto de la divulgación se refiere a vectores víricos para terapia génica o vacunación génica que comprenden en el esqueleto una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido que comprende:

b1) una proteína vírica para la función y mantenimiento del vector, y

b2) un epítopo de células T de MHC de clase II o un epítopo de células T NK restringido a CD1d, en donde la secuencia del epítopo es una secuencia que se diferencia de la proteína de b1,

Un aspecto de la divulgación se refiere a un péptido que comprende:

- a1) un epítopo de células T de MHC de clase II o un epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d, y - a2) inmediatamente adyacente a dicho epítopo o separado de dicho epítopo por como mucho 7 aminoácidos una secuencia de motivo oxidorreductasa [CTS]-X(2)-C [SEQ ID NO: 7] o C-X(2)-[CTS] [SEQ ID NO: 8], para prevenir una respuesta inmunitaria contra una proteína terapéutica o contra una proteína de vector vírico con dicho epítopo de células T de MHC de clase II o dicho epítopo péptido que se une a CDId,

- en donde dicho epítopo tiene una secuencia que no se produce en la secuencia de la proteína terapéutica o de la proteína del vector vírico.

Un aspecto de la divulgación se refiere a métodos para preparar kits de partes de polipéptidos, que comprenden a) preparar una proteína terapéutica modificada introduciendo en la secuencia de dicha proteína un epítopo de células T de MHC de clase II o un epítopo de células T NK restringido a CD1d, secuencia de epítopo que es una secuencia que no se produce en la proteína sin modificar,

b) preparar un péptido que comprende:

- el epítopo de células T de MHC de clase II o un epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d de a), e - inmediatamente adyacente a dicho epítopo o separado por como mucho 7 aminoácidos de dicho epítopo una secuencia de motivo oxidorreductasa [CTS]-X(2)-C [SEQ ID NO: 7] o C-X(2)-[CTS] [SEQ ID NO: 8].

Un aspecto de la divulgación se refiere a métodos para preparar kits de partes, que comprenden:

a) preparar un vector que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una proteína terapéutica modificada o una proteína de vector vírico modificada para la función y mantenimiento del vector vírico introduciendo en la secuencia de dichas proteínas un epítopo de células T de MHC de clase II o un epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d, secuencia de epítopo que es una secuencia que no se produce en la proteína sin modificar,

b) preparar un péptido que comprende:

Un aspecto de la divulgación se refiere a péptidos con una longitud de entre 12 y 100 aminoácidos que comprenden: - una secuencia CLIP modificada con el motivo X1X2MATX6LLM [SEQ ID NO: 29], en donde X1 y X2 se seleccionan independientemente de V, I, L, M, F, H, Y y W y X6 es R o P, y

- inmediatamente adyacente a dicha secuencia CLIP modificada o separada por como mucho 7 aminoácidos de dicha secuencia CLIP modificada una secuencia de motivo oxidorreductasa [CTS]-X(2)-C [SEQ ID NO: 7] o C-X(2)-[CTS] [SEQ ID NO: 8].

En ejemplos de la misma la secuencia CLIP se selecciona del grupo que consiste en FFMATRLLM [SEQ ID NO:30], WWMATRLLM [SEQ ID NO:31], WFMATRLLM [SEQ ID NO:32], FWMATRLLM [SEQ ID NO:33], FFMATPLLM [SEQ ID NO:34], WWMATPLLM [SEQ ID NO:35], WFMATPLLM [SEQ ID NO:36] y FWMATPLLM [SEQ ID NO:37].

Un aspecto de la divulgación se refiere a proteínas terapéuticas o polinucleótidos que codifican una proteína terapéutica o que codifican una proteína de vector vírico, caracterizadas en la presencia de un epítopo de células T de MHC de clase II, epítopo que tiene una secuencia que no se produce en la secuencia de la proteína terapéutica o de la proteína del vector vírico, en donde dicho epítopo de células T de MHC de clase II tiene una secuencia con el motivo X1X2MATX6LLM [SEQ ID NO: 29], en donde X1 y X2 se seleccionan independientemente de V, I, L, M, F, H, Y, y W y X6 es R o P.

Un aspecto de la divulgación se refiere a vectores de expresión que comprenden un sitio de clonación múltiple para la inserción en el mismo marco de lectura de un polinucleótido que codifica una proteína terapéutica, caracterizados en la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica un epítopo de células T de MHC de clase II promiscuo o un epítopo de células T NK restringido a CD1d, de modo que tras la inserción de dicho polinucleótido de dicha proteína terapéutica en dicho vector de expresión, una proteína de fusión se codifica y expresa que comprende dicha proteína terapéutica fusionada a dicho epítopo de células T de MHC de clase II promiscuo o dicho epítopo de células T NK restringido a CD1d.

En ejemplos de la divulgación el vector de expresión es un vector de expresión de mamíferos.

En ejemplos de la divulgación el vector de expresión comprende una secuencia que codifica una proteína terapéutica en el mismo marco de lectura con una secuencia que codifica un epítopo de células T de MHC de clase II promiscuo o un epítopo de células T NK restringido a CD1d, bajo el control de elementos de transcripción y traducción, lo que permite la expresión de una proteína de fusión que comprende dicha proteína terapéutica fusionada a dicho epítopo de células T de MHC de clase II promiscuo o dicho epítopo de células T NK restringido a CD1d, en donde dicho epítopo tiene una secuencia que se diferencia de la secuencia de la proteína terapéutica.

En ciertos ejemplos de la divulgación el epítopo de células T de MHC de clase II tiene una secuencia con el motivo X1X2MATX6LLM [SEQ ID NO: 29], en donde X1 y X2 se seleccionan independientemente de V, I, L, M, F, H, Y, y W y X6 es R o P.

En formas de realización de la misma la secuencia se selecciona del grupo que consiste en FFMATRLLM [SEQ ID NO:30], WWMATRLLM [SEQ ID NO:31], WFMATRLLM [SEQ ID NO:32], FWMATRLLM [SEQ ID NO:33], FFMATPLLM [SEQ ID NO:34], WWMATPLLM [SEQ ID NO:35], WFMATPLLM [SEQ ID NO:36] y FWMATPLLM [SEQ ID NO:37].

La divulgación se refiere a combinaciones de polipéptidos de:

a) una proteína terapéutica modificada o una proteína de vector vírico modificada caracterizada en que la modificación es la presencia de un epítopo de células T de MHC de clase II o un epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d, epítopo que tiene una secuencia que no se produce en la secuencia sin modificar de la proteína terapéutica o la proteína de vector vírico, y

b) un péptido que comprende el epítopo de células T de MHC de clase II o el epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d definido en a) e inmediatamente adyacente al epítopo o separada por como mucho 7 aminoácidos de dicho epítopo una secuencia de motivo oxidorreductasa [CTS]-X(2)-C [SEQ ID NO: 7] o C-X(2)-[CTS] [SEQ ID NO: 8].

En ejemplos de las combinaciones divulgadas en el presente documento, la proteína en a) es una proteína de fusión de la proteína terapéutica o de la proteína del vector vírico fusionada a un epítopo de células T de MHC de clase II o un epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d.

En ejemplos de las combinaciones divulgadas en el presente documento, la proteína en a) está modificada con al menos 2 epítopos diferentes, y en b) al menos 2 péptidos están presentes, cada péptido comprende un epítopo como se ha definido en a).

En ejemplos de las combinaciones divulgadas en el presente documento, la secuencia del motivo oxidorreductasa es C-X(2)-C [SEQ ID NO: 2].

En ejemplos de las combinaciones divulgadas en el presente documento, en b) el epítopo y el motivo redox están separados por como máximo 4 aminoácidos.

Los ejemplos del epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d son [FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT] [SEQ ID NO: 1] o [FWYH]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYH] [SEQ ID NO: 27] y [FWY]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWY] [SEQ ID NO: 28].

En un ejemplo típico, el epítopo de células T es un epítopo promiscuo que se une a una o más moléculas HLA-DR1, que preferiblemente se une a al menos HLA-DR1*0101, HlA-DR1*0102 y HLA-DR1*0302.

En ejemplos específicos, el epítopo de células T tiene la secuencia X¹X²MATX⁶LLM [SEQ ID NO: 29], en donde X¹y X²se seleccionan independientemente de V, I, L, M, Y, H, F y W y X6 es R o P. Ejemplos de la misma son FFMATRLLM [SEQ ID NO:30], WWMATRLLM [SEQ ID NO:31], WFMATRLLM [SEQ ID NO:32], o FWMATRLLM [SEQ ID NO:33].

La divulgación se refiere a la combinación de polipéptidos descritos en los ejemplos anteriores para uso como medicamento.

La divulgación se refiere a una proteína terapéutica modificada o una proteína de vector vírico modificada en donde la modificación es la presencia de un epítopo de células T de MHC de clase II o un epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d, epítopo que tiene una secuencia que no se produce en la secuencia sin modificar de la proteína terapéutica o la proteína de vector vírico, para uso como un medicamento en un individuo que ha sido previamente tratado con un péptido que comprende el epítopo de células T de MHC de clase II o el epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d e inmediatamente adyacente al epítopo o separada por como mucho 7 aminoácidos del epítopo una secuencia con una secuencia de motivo oxidorreductasa [Ct S]-X(2)-C [SEQ ID NO: 7] o C-X(2)-[CTS] [SEQ ID NO: 8].

La divulgación se refiere a un péptido que comprende un epítopo de células T de MHC de clase II o un epítopo péptido que se une a CDId y que comprende inmediatamente adyacente al epítopo o separada por como mucho 7 aminoácidos del epítopo una secuencia con una secuencia de motivo oxidorreductasa [CTS]-X(2)-C [SEQ ID NO: 7] o C-X(2)-[CTS] [SEQ ID NO: 8], para prevenir una respuesta inmunitaria contra la proteína terapéutica o contra la proteína del vector vírico con el epítopo de células T de MHC de clase II o el epítopo péptido que se une a CDId,

- en donde el epítopo tiene una secuencia que no se produce en la secuencia de tipo salvaje de la proteína terapéutica o la proteína del vector vírico, y opcionalmente,

- en donde la proteína no contiene una secuencia con una [CTS]-X(2)-C [SEQ ID NO: 7] o C-X(2)-[CTS] [SEQ ID NO: 8] en la secuencia 7 amino en la parte N terminal o C terminal de la secuencia del epítopo.

La divulgación se refiere a métodos para preparar una proteína terapéutica modificada o una proteína de vector vírico modificada que comprenden la etapa de introducir en la secuencia de la proteína la secuencia de un epítopo de células T de MHC de clase II o un epítopo péptido de células T NK restringido de CD1d, que es una secuencia que no se produce en la proteína sin modificar.

Típicamente, la secuencia del epítopo está unida a la proteína para obtener una proteína de fusión. La divulgación se refiere a péptidos con una longitud de entre 12 y 100 aminoácidos que comprende una secuencia CLIP modificada con el motivo X¹X²MATX⁶LLM [SEQ ID NO: 29], en donde X¹y X²se seleccionan independientemente de V, I, L, M, F, H, Y, y W y Xa es R o P. Ejemplos de la misma son FFMATRLLM [SEQ ID NO:30], WWMATRLLM [SEQ ID NO:31], WFMATRLLM [SEQ ID NO:32], FWMATRLLM [SEQ ID NO:33], FFMATPLLM [SEQ ID NO:34], WWMATPLLM [SEQ ID NO:35], WFMATPLLM [SEQ ID NO:36] y FWMATPLLM [SEQ ID NO:37].

En ejemplos específicos de la divulgación, estos péptidos comprenden además una secuencia con una secuencia de motivo redox [CTS]-X(2)-C [SEQ ID NO: 7] o C-X(2)-[CTS] [SEQ ID NO: 8], en donde la secuencia del motivo redox y la secuencia clip modificada están separadas por de 0 a 7 aminoácidos, o de 0 a 4 aminoácidos, o de 0 a 2 aminoácidos.

Un ejemplo específico del motivo es C-X(2)-C [SEQ ID NO: 2].

La divulgación se refiere a proteínas terapéuticas modificadas o proteínas de vectores víricos modificadas caracterizadas en que la modificación es la presencia de un epítopo de células T de MHC de clase II o un epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d, epítopo que tiene una secuencia que no se produce en la secuencia sin modificar de la proteína terapéutica o de la proteína del vector vírico.

Descripción detallada

Definiciones

La distinción entre el término “péptido” y “proteína” es arbitraria ya que ambos se refieren a polipéptidos conectados por enlaces peptídicos, pero que pueden comprender estructuras no aminoacídicas (como, por ejemplo, un compuesto orgánico enlazador). Los polipéptidos pueden contener cualquiera de los 20 aminoácidos convencionales o versiones modificadas de los mismos obtenidas con modificaciones postraduccionales, o pueden contener aminoácidos no naturales incorporados por síntesis química de péptidos o por modificación química o enzimática (por ejemplo, aminoácidos fisiológicos). Como se usa en el presente documento, péptido se usará para referirse a una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos de entre 2 hasta 20, 30, 50, 75 o 100 aminoácidos.

El término “antígeno” como se usa en el presente documento se refiere a una estructura de una macromolécula, típicamente una proteína (con o sin polisacáridos) o una composición proteica que comprende uno o más hapteno(s), y que comprende epítopos de células T. El término “proteína antigénica” como se usa en el presente documento se refiere a una proteína que comprende uno o más epítopos de células T. Un autoantígeno o proteína autoantigénica como se usa en el presente documento se refiere a una proteína humana o animal presente en el cuerpo, que provoca una respuesta inmunitaria en el mismo cuerpo humano o animal.

El término “proteína antigénica alimentaria o farmacéutica” se refiere a una proteína antigénica en un alimento o producto farmacéutico, tal como en una vacuna.

El término “epítopo” se refiere a una o varias porciones (que pueden definir un epítopo conformacional) de una proteína antigénica que es/son específicamente reconocido(s) y unido(s) por un anticuerpo o porción del mismo (Fab', Fab2', etc.) o un receptor presentado en la superficie celular de un linfocito B o T, y que es capaz, mediante esta unión, de inducir una respuesta inmunitaria.

El término “epítopo de células T” en el contexto de la presente divulgación se refiere a un epítopo de células T dominante, subdominante o secundario, es decir, una parte de una proteína antigénica que es específicamente reconocida y unida por un receptor en la superficie celular de un linfocito T. Si un epítopo es dominante, subdominante o secundario depende de la reacción inmunitaria provocada contra el epítopo. La dominancia depende de la frecuencia a la que tales epítopos son reconocidos por células T y son capaces de activarlas, entre todos los posibles epítopos de células T de una proteína. Un epítopo de células T es un epítopo reconocido por moléculas de MHC de clase II, que consiste en una secuencia de típicamente 9 aminoácidos que ajusta en el surco de la molécula de MHC II (la longitud del péptido que ajusta en el surco de la molécula de MHC II puede ser 8 o 10 aminoácidos para algunos complejos péptido/MHCII). En una secuencia peptídica que representa un epítopo de células T de 9 aminoácidos, los aminoácidos en el epítopo están numerados P1 a P9, los aminoácidos N-terminal del epítopo se numeran P-1, P-2 etcétera, los aminoácidos C terminal del epítopo se numeran P+1, P+2 etcétera.

Los “motivos” de secuencias de aminoácidos se escriben en el presente documento según el formato de Prosite (Sigrist et al. (2002) Brief Bioinform. 3, 265-274). El símbolo X se usa para una posición donde se acepta cualquier aminoácido. Las alternativas se indican enumerando los aminoácidos aceptables para una posición determinada, entre corchetes ('[ ]'). Por ejemplo, [CST] significa un aminoácido seleccionado de Cys, Ser o Thr. Los aminoácidos que se excluyen como alternativas se indican enumerándolos entre corchetes ('{}’). Por ejemplo: {AM} significa cualquier aminoácido excepto Ala y Met. Los diferentes elementos en un motivo están separados entre si por un guion -. La repetición de un elemento idéntico en un motivo se puede indicar colocando detrás de ese elemento un valor numérico o un intervalo numérico entre paréntesis. Por ejemplo: X(2), corresponde a X-X, X(2,3) corresponde a X-X o X-X-X, A(3) corresponde a A-A-A.

El término “epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d” o “epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d” se refiere a una parte de una proteína antigénica que se une específicamente a una molécula CDId, expresada en la superficie celular y reconocida por una célula T NK. La palabra “péptido” en esta definición se puede usar para enfatizar la diferencia con compuestos que se unen a CDId de unión del estado de la técnica tal como ceramidas.

El epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d tiene un motivo general [FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT] [SEQ ID NO: 1]. Las versiones alternativas de este motivo general tienen en la posición 1 y/o la posición 7 las alternativas [Fw Yh ].

Las versiones alternativas de este motivo general tienen en la posición 1 y/o la posición 7 las alternativas [FWYT].

Las versiones alternativas de este motivo general tienen en la posición 1 y/o la posición 7 las alternativas [FWY].

Independientemente de los aminoácidos en la posición 1 y/o 7, las versiones alternativas del motivo general tienen en la posición 4 las alternativas [ILM].

El término “homólogo” como se usa en el presente documento con referencia a epítopos usados en el contexto de la divulgación, se refiere a moléculas que tienen al menos el 50%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98% de identidad de secuencia de aminoácidos con un epítopo natural, manteniendo de esta manera la capacidad del epítopo para unirse a un anticuerpo o receptor de la superficie celular de una célula B y/o T. Los homólogos específicos de un epítopo corresponden a un epítopo natural modificado en como mucho tres, más particularmente en como mucho 2, lo más particularmente en un aminoácido.

El término “derivado” como se usa en el presente documento con referencia a péptidos de la divulgación se refiere a moléculas que contienen al menos la porción activa del péptido (es decir, capaz de detectar células T CD4+) y, además de lo mismo comprende una parte adicional que puede tener diferentes fines tal como estabilizar un péptido o alterar las propiedades farmacocinéticas o farmacodinámicas del péptido.

El término “identidad de secuencia” de dos secuencias como se usa en el presente documento se refiere al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos divididas por el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las secuencias, cuando las dos secuencias se alinean. La identidad de secuencia puede ser más del 70%, más del 80%, más del 90%, más del 95%, más del 98%, o más del 99%.

Los términos “polinucleótido (o ácido nucleico) que codifica péptido” y “polinucleótido (o ácido nucleico) codificante de péptido” como se usan en el presente documento se refiere a una secuencia de nucleótidos que, cuando se expresa en un medio apropiado, produce la generación de la secuencia peptídica relevante o un derivado u homólogo de la misma. Tales polinucleótidos o ácidos nucleicos incluyen las secuencias normales que codifican el péptido, así como derivados y fragmentos de estos ácidos nucleicos capaces de expresar un péptido con la actividad requerida. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica un fragmento peptídico del mismo es una secuencia que codifica el péptido o fragmento del mismo que se origina de un mamífero o correspondiente a un mamífero, lo más particularmente un fragmento peptídico humano.

El término “compuesto orgánico que tiene una actividad reductora” se refiere en el presente documento a compuestos, más en particular secuencias de amino ácidos, con una actividad reductora para enlaces disulfuro en proteínas.

La actividad reductora de un compuesto orgánico se puede ensayar por su capacidad de reducir un grupo sulfhidrilo tal como en el ensayo de solubilidad de insulina en donde la solubilidad de la insulina se altera tras la reducción, o con una insulina marcada con fluorescencia. El compuesto orgánico reductor se puede acoplar en el lado amino terminal del epítopo de células T o en el extremo carboxi del epítopo de células T. En general el compuesto orgánico con actividad reductora es una secuencia peptídica. Se encuentran fragmentos peptídicos con actividad reductora en tiorreductasas que son enzimas reductoras de disulfuro pequeñas incluyendo, glutarredoxinas, nucleorredoxinas, tiorredoxinas y otras tiol/disulfuro oxidorreductasas (Holmgren (2000) Anti-oxid. Redox Signal. 2, 811-820; Jacquot et al. (2002) Biochem. Pharm. 64, 1065-1069). Son multifuncionales, ubicuas y se encuentran en muchos procariotas y eucariotas. Ejercen una actividad reductora para enlaces disulfuro en proteínas (tal como enzimas) a través cisteínas activas redox en secuencias consenso de dominio activo conservado: C-X(2)-C [SEQ ID NO:2], C-X(2)-S [SEQ ID NO:3], C-X(2)-T [SEQ ID NO:4], S-X(2)-C [SEQ ID NO:5], T-X(2)-C [SEQ ID NO:6] (Fomenko et al. (2003) Biochem.

42, 11214-11225; Fomenko et al. (2002) Prot. Science 11, 2285-2296), en las que X representa cualquier aminoácido. Tales dominios también se encuentran en proteínas mayores tal como proteína disulfuro isomerasa (PDI) y fosfolipasa C específica de fosfoinosítido.

El término “natural”, “de tipo salvaje”, “nativo” cuando se hace referencia a un péptido o una secuencia en el presente documento se refiere al hecho de que la secuencia es idéntica a una secuencia natural o un fragmento de la misma. En contraste con ello, el término “artificial” se refiere a una secuencia o péptido que como tal no se produce en la naturaleza y se diferencia de la secuencia natural/de tipo salvaje/nativa anterior. Opcionalmente, una secuencia artificial se obtiene de una secuencia natural por modificaciones limitadas tal como cambiar uno o más aminoácidos de la secuencia natural o al añadir aminoácidos N o C terminalmente de una secuencia natural. En el presente documento se hace referencia a los aminoácidos con su nombre completo, su abreviatura de tres letras o su abreviatura de una letra. Una secuencia artificial también se puede obtener por modificación química de cadenas laterales de aminoácidos o por inclusión de aminoácidos no naturales.

El término “antígeno principal de histocompatibilidad” se refiere a moléculas que pertenecen al sistema HLA en el hombre (H2 en el ratón), que se dividen en dos clases principales. Las moléculas de MHC de clase I están hechas de una única cadena polimórfica que contiene 3 dominios (alfa 1, 2 y 3), que se asocia con beta 2 microglobulina en la superficie celular. Las moléculas de la clase I están codificadas por 3 loci, llamados A, B y C en seres humanos. Tales moléculas presentan péptidos a linfocitos T del subconjunto CD8+. Las moléculas de clase II están hechas de 2 cadenas polimórficas, cada una contiene 2 cadenas (alfa 1 y 2, y beta 1 y 2). Estas moléculas de clase II están codificadas por 3 loci DP, DQ y DR en el hombre. De las mismas la molécula HLA-DR es la más prevalente en seres humanos. La frecuencia de alelos en diferentes nacionalidades y etnias se puede obtener de http://www.allelefrequencies.net (Gonzalez-Galarza et al. (2015) Nucl. Acid Res. 28, D784-D788.

Se puede definir “terapia génica” como la inserción, ex vivo o in vivo, de un gen o genes en células individuales o grupos de células (tal como tejidos u órganos) con el fin de proporcionar un gen o alelo que falta o para sustituir un gen mutante o un alelo mutante con una copia funcional administrada por la terapia génica. El “gen terapéutico” se administra a través de un portador llamado un vector. El vector más común es un vector vírico. Tras la infección de células objetivo con el vector vírico que porta el gen terapéutico, el vector vírico descarga su material genético incluyendo el gen terapéutico en las células diana, seguido por la generación de la(s) proteína(s) funcional(es) codificada(s) por el gen terapéutico. Las células objetivo por terapia génica pueden ser o bien células somáticas o células germinales o líneas celulares. Además, terapia génica se refiere al uso de vectores para administrar, ya sea ex vivo o in vivo, un gen que requiere sobreexpresión o expresión ectópica en una célula o grupo de células. El vector puede facilitar la integración del nuevo gen en el núcleo o puede producir la expresión episómica de ese gen.

Se puede definir “vacunación génica” como la administración de un gen funcional (es decir, capaz de expresar la proteína codificada por el gen) a un sujeto con el fin de vacunar un sujeto. Por tanto, la vacunación génica (o vacunación de ADN) es una variante de la vacunación más clásica con péptidos, proteínas, gérmenes atenuados o inactivados, etc. La vacunación génica se puede realizar con ADN desnudo o, de interés particular en el contexto de la presente divulgación, con vectores víricos.

El término “proteína de vector vírico” cuando se usa en el presente documento se refiere a cualquier proteína o péptido derivado del esqueleto de un vector vírico como tal y que se requieren para la función y mantenimiento del vector. No se refiere al gen terapéutico que está clonado en el vector. Típicamente, tales proteínas de vector vírico son antigénicas y comprenden uno o más epítopos tal como epítopos de células T. Un ejemplo bien conocido es la proteína de la cápside. Actualmente se usan varios virus para terapia génica, tanto experimental como en el hombre, incluyendo virus ARN (gamma-retrovirus y lentivirus) y virus ADN (adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes y poxvirus).

El término “alofactor” o “aloantígeno” se refiere a una proteína, péptido o factor (es decir, cualquier molécula) que muestra polimorfismo cuando se compara entre 2 individuos de la misma especie, y, más en general, cualquier proteína, péptido o factor que induce una respuesta inmunitaria (alorreactiva) en el sujeto que recibe el alofactor.

El término “alorreactividad” se refiere a una respuesta inmunitaria que se dirige hacia diferencias alélicas entre el receptor del injerto y el donante. La alorreactividad se aplica a anticuerpos y a células T. La presente divulgación se basa por entero en la alorreactividad de células T, que se basa en reconocimiento de células T de aloantígenos presentados en el contexto de determinantes de MHC como complejos péptido-MHC.

El término “promiscuo” se refiere a epítopos que tienen la propiedad de ser capaz de unirse a diferentes moléculas de MHC de clase II con el fin de cubrir un porcentaje sustancial de la población prevista. Un porcentaje sustancial es al menos el 50%, o al menos el 60%, el 75%, al menos el 90% o incluso al menos el 95% de la población prevista. La población prevista se puede definir como individuos de uno o más países o de una o más regiones o continentes, o como miembros de un grupo étnico. Alternativamente, un epítopo promiscuo se puede definir como que se une a al menos 7, 8, 9, o 10 o los 15 alelos HLA DR más prevalentes en la población prevista. Los epítopos promiscuos pueden ser secuencias naturales como se producen en un antígeno o modificadas por sustitución de uno o más aminoácidos (2, 3 o 4) de una secuencia natural que se produce en un antígeno, o completamente artificial, incluyendo aminoácidos no fisiológicos, aminoácidos que contienen cadenas laterales modificadas, o compuestos pequeños.

El término “epítopo universal” también se produce en la técnica. Sin embargo, esto se refiere a una secuencia de epítopo que se encuentra en diferentes antígenos. Tal epítopo universal puede o no unirse a diferentes moléculas de MHC y alelos.

Un aspecto de la presente divulgación se refiere a una versión modificada de proteínas terapéuticas o de proteínas de vector vírico con un epítopo de células T de MHC de clase II añadido o con un epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d añadido. Esto se hace típicamente generando proteínas de fusión del antígeno y la secuencia del epítopo, aunque la secuencia del epítopo se puede introducir también en la proteína misma.

En el presente documento la secuencia de epítopo de células T de 9 aminoácidos o la secuencia de epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d de 7 aminoácidos no es un fragmento de la proteína terapéutica de tipo salvaje o de la proteína del vector vírico.

Esto se puede lograr mediante una modificación de una secuencia de epítopo como se produce en la proteína terapéutica/proteína del vector vírico, o mediante el uso de una secuencia de epítopo como se produce en otro antígeno (humano o no humano) o mediante el uso de una secuencia diseñada con identidad de secuencia baja o nula respecto a una secuencia de epítopo de antígeno existente.

El epítopo de células T de MHC de clase II puede ser un epítopo promiscuo. El razonamiento para esta elección se explica después en más detalle.

La proteína terapéutica/proteína del vector vírico modificada podría ella misma provocar la generación de células citotóxicas CD4+, si en esta proteína una secuencia motivo [c St ]-X(2)-C [SEQ ID NO: 7] C-X(2)-[CST] [SEQ ID NO: 8] está a 4, típicamente a 7 aminoácidos de la secuencia del epítopo de células T de clase II introducido o el epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d introducido. Esto puede suceder cuando la modificación incluye, aparte de la introducción de la secuencia del epítopo, también la introducción de una secuencia de oxidorreductasa. En algunas proteínas que contienen en su secuencia de tipo salvaje una secuencia oxidorreductasa, la proteína se puede manipular para que contenga secuencias de epítopos en la proximidad (separadas por como mucho 7 o como mucho 4 aminoácidos) de la secuencia oxidorreductasa natural.

Si tal actividad no es requerida por la proteína terapéutica/proteína del vector vírico modificada, la modificación se limita a la introducción de la secuencia del epítopo. Si la proteína terapéutica/proteína del vector vírico modificada contiene en su secuencia de tipo salvaje una secuencia oxidorreductasa, la secuencia de epítopo añadida se introduce en la proteína modificada de modo que el epítopo añadido y el motivo oxidorreductasa existente estén separados por al menos 4, o al menos 7 aminoácidos.

El epítopo se puede producir en una proteína fusión N terminal del antígeno, o C terminal del antígeno, dependiendo del impacto de la secuencia de epítopo añadida sobre la función de la proteína. En ejemplos específicos dos o más epítopos diferentes se añaden al antígeno.

Si es apropiado se puede insertar una secuencia enlazadora entre la secuencia del epítopo y la secuencia del antígeno nativo.

También se prevé generar versiones modificadas de un antígeno en donde la secuencia del epítopo se fusiona internamente en la secuencia en una región que no es crítica para la función de la proteína. En ejemplos alternativos una secuencia de epítopo exógena se genera mutando y/o añadiendo uno o más aminoácidos en la secuencia del antígeno.

La longitud de la proteína con la secuencia del epítopo introducida (añadida como una proteína de fusión, o interna) principalmente se define por el antígeno y no es una característica limitante. El antígeno puede ser muy pequeño en caso de hormonas peptídicas. El impacto de las mutaciones en una proteína es probablemente mayor en proteínas más cortas, y alienta a considerar proteínas de fusión para proteínas con una longitud de menos de 100 o menos de 250 aminoácidos.

El agente terapéutico como se describe en el presente documento incluye cualquier agente peptídico o proteico usado para compensar por la ausencia de un agente fisiológico o para alterar, modificar, parar o ralentizar un proceso de enfermedad.

Tales agentes terapéuticos incluyen:

1. agentes de sustitución para defectos de coagulación, incluyendo deficiencias en factor VIII, factor IX y factor X, administración de factor VII para corregir una deficiencia o como un agente terapéutico en traumatismo, cirugía, insuficiencia cardiaca o en el tratamiento de pacientes afectados por hemofilia y que producen anticuerpos inhibidores que impiden la administración del factor que falta (factor VIII o factor IX)

2. agentes fibrinolíticos, incluyendo estafiloquinasa o activador de plasminógeno tisular (tPA) administrados en ictus e infarto cardiaco

3. hormonas tal como hormona de crecimiento o insulina para tratar nanismo y diabetes mellitus dependiente de insulina

4. citoquinas y factores de crecimiento tal como interferón-alfa, interferón-gamma, GM-CSF y G-CSF; receptores de citoquinas tal como receptor de IL-6 y receptor de IL-1b en el tratamiento de artritis reumatoide

5. anticuerpos para la modulación de respuestas inmunitarias, incluyendo anticuerpos anti-IgE en enfermedades alérgicas, anticuerpos anti-CD3 y anti-CD4 en rechazo a injerto y una variedad de enfermedades autoinmunitarias, anticuerpos anti-CD20 en linfomas no hodgkinianos, anti-citoquinas o receptor de citoquinas (por ejemplo, anti-IL-6R).

Los anticuerpos terapéuticos humanizados son humanos excepto para el sitio de unión a epítopo (CDR), habitualmente derivados de una secuencia de ratón. La presente divulgación se dirige a eliminar la capacidad para montar una respuesta hacia la parte no humana del anticuerpo.

6. eritropoyetina en insuficiencia renal

7. terapia de sustitución con enzimas, incluyendo alfa-galactosidasa A (enfermedad de Fabry), beta-glucocerebrasa (enfermedad de Gaucher de tipo 1) y alfa-glucosidasa (enfermedad de Pompe).

Además de la sección anterior sobre proteínas con un epítopo de células T de MHC de clase II o un epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d añadido, otro aspecto de la presente divulgación se refiere a una combinación de una proteína como se ha descrito anteriormente, y otro péptido que comprende una secuencia oxidorreductasa de 4 aminoácidos y que comprende la misma secuencia de epítopo que se ha añadido a la proteína terapéutica o el vector vírico.

En este péptido, la secuencia oxidorreductasa tiene el motivo [CST]-X(2)-C [SEQ ID NO:7] o C-X(2)-[CST] [SEQ ID NO:8]. Este motivo abarca las alternativas C-X(2)-C [SEQ ID NO:2], S-X(2)-C [SEQ ID NO:5], T-X(2)-C [SEQ ID NO:6], C-X(2)-S [SEQ ID NO:3] y C-X(2)-T [SEQ ID NO:4]. Una elección particular del motivo es C-X(2)-C [SEQ ID NO:2].

En el motivo de compuestos reductores, C representa o bien cisteína u otro aminoácido con un grupo tiol tal como mercaptovalina, homocisteína u otros aminoácidos naturales o no naturales con una función tiol. Con el fin de tener actividad reductora, las cisteínas presentes en el motivo no se deben producir como parte de un puente disulfuro de cisteína. El aminoácido X en el redox puede ser cualquier aminoácido natural, o puede ser un aminoácido no natural. X puede ser un aminoácido con una cadena lateral pequeña tal como Gly, Ala, Ser o Thr. En versiones particulares al menos un X en el motivo redox es His, Pro o Tyr. En versiones particulares X no es Cys, en otras versiones particulares X no es W, F o Y.

En condiciones particulares, se proporcionan péptidos que comprenden una secuencia de epítopo y una secuencia motivo. El motivo se puede producir una vez o varias veces (2, 3, 4 o incluso más veces) en el péptido, por ejemplo, como repeticiones del motivo que pueden estar separados entre sí por uno o más aminoácidos, como repeticiones que están adyacentes una respecto a otra, o como repeticiones que solapan entre sí.

La secuencia de epítopo y la secuencia oxidorreductasa de 4 aminoácidos no solapan y están separadas por una secuencia enlazadora de 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácido, o están inmediatamente adyacentes entre sí (por tanto, sin secuencia enlazadora o enlazador de 0 aminoácidos). Los intervalos típicos son un enlazador de 0 a 2 aminoácidos, un enlazador de 0 a 4 aminoácidos, o un enlazador de 0-7 aminoácidos.

Cuando la secuencia de epítopo en el péptido es un fragmento de un antígeno, los aminoácidos en el enlazador son típicamente el/los aminoácido(s) que flanquean el epítopo en el antígeno. Alternativamente, los aminoácidos en el enlazador son Gly y/o Ser.

El motivo redox puede estar también en el extremo N o en el extremo C de la secuencia del epítopo.

El péptido con la secuencia del motivo redox y la secuencia de epítopo puede ser tan corto como 12 o 13 aminoácidos para péptidos con un epítopo de células T de MHC de clase II o 11 aminoácidos para péptidos con una epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d, hasta 20, 30, 40, 50, 75 o 100 aminoácidos, dependiendo del número de aminoácidos entre el epítopo y el motivo oxidorreductasa, y el número de aminoácidos flanqueantes en el extremo N y/o C de la secuencia “epítopo enlazador motivo redox” o la secuencia “motivo redox enlazador epítopo”.

Por tanto, dependiendo de la forma de realización de elección el epítopo es un epítopo de MHC de clase II o un epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d. Se pueden usar epítopos péptidos de células T NK restringidos a CD1d para generar células T CD4+ a través de células T NK. Los epítopos péptidos de células T NK restringidos a CD1d tienen la ventaja de que se unirán en todos los individuos a la unión CDId ya que no hay polimorfismo para esta proteína.

El uso de proteínas con un epítopo de células T de MHC de clase II o epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d añadido en combinación con un péptido que comprende este epítopo y un motivo redox permite desacoplar la secuencia del epítopo usado para obtener la población de células T CD4+ citolíticas a partir de las secuencias de epítopo en el antígeno mismo.

Esto es especialmente el caso para proteínas de fusión de una proteína fusionada a un epítopo, ya que esto no requiere modificación a la secuencia de la proteína misma. Modificar la proteína terapéutica para que contenga la nueva secuencia del epítopo es una tarea que se tiene que optimizar para cada proteína.

Desacoplar la secuencia del epítopo de la secuencia del antígeno permite diseñar una secuencia de epítopo hecha a medida. Esta secuencia se puede optimizar para mejorar la solubilidad y estabilidad, disminuir la degradación, y similares. Aparte de la elección de ciertos aminoácidos en la secuencia, se pueden prever otras alteraciones tal como la incorporación de aminoácidos no naturales o D-aminoácidos durante la síntesis de péptidos, o modificaciones postraduccionales tal como citrulinación, acetilación y sulfatación.

Una secuencia de epítopo también se puede optimizar para asegurar que el epítopo de células T de MHC de clase II se unirá a diferentes proteínas HLA de modo que será reconocido por células T CD4+ en una gran proporción de sujetos. Tales epítopos se conocen en la técnica como epítopos promiscuos.

Se pueden encontrar ejemplos de tales epítopos promiscuos en agentes víricos tal como sarampión o hepatitis C, micobacterias, antígenos víricos relacionados con tumores o incluso en proteínas autólogas. Los algoritmos para determinar la unión de una secuencia de epítopo con una molécula o alelo HLA, y para identificar epítopos promiscuos en una secuencia de proteína son conocidos. Los epítopos promiscuos candidatos se pueden ensayar en diferentes moléculas de MHC.

Como una alternativa o además del uso de un epítopo de células T de MHC de clase II promiscuo, se pueden mezclar dos o más péptidos para vacunación, cada uno contiene un motivo tiorreductasa y epítopo de células T de MHC de clase II, de modo que cubra el mayor número posible de determinantes de MHC de clase II. En este caso el antígeno también tendrá las dos o más secuencias de epítopo usadas en la mezcla de péptidos (típicamente en forma de una proteína de fusión).

En una forma de realización específica se usa una combinación de un epítopo de células T de MHC de clase II y un epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d.

En una forma de realización específica, el epítopo promiscuo deriva de la secuencia CLIP (Péptido de cadena invariable asociado a la clase II) (KM¹R²MATP⁶LLMQAL) [SEQ ID NO:9] obtenida por corte proteolítico de la cadena invariable. CLIP protege el surco de unión a péptido hidrofóbico de la molécula de MHC de clase II hasta que es desplazado por competición con un péptido de mayor afinidad. CLIP protege todas las moléculas de MHC de clase II nacientes de la familia DR, DP o DQ, y como tal es el ejemplo más ilustrativo de un epítopo promiscuo. Sin embargo, la afinidad de CLIP por moléculas de clase II es débil, de modo que no hay presentación de moléculas de MHC de clase II con CLIP en la superficie de una célula presentadora de antígeno. La proteína DM cataliza la sustitución de CLIP por péptidos alternativos para presentación en superficie (Pos et al. (2012) Cell 151, 1557-1568).

Es un aspecto de la divulgación que la sustitución del primer residuo de aminoácido de CLIP localizado en el bolsillo P1 de la molécula de MHC de clase II por un residuo hidrofóbico tal como F, W, H o V, I, L o M es suficiente para prevenir la sustitución completa por un péptido alternativo y permitir la presentación de CLIP modificado en la superficie de una célula presentadora de antígeno. Esto produce la inactivación de células T CD4+. En una versión alternativa, también el segundo residuo de aminoácido del fragmento de unión a MHC de CLIP se sustituye por un residuo hidrofóbico.

Además, el residuo de prolina localizado en la posición 6 se puede mutar de P a R para aumentar más su afinidad de unión.

Según esto, la presente divulgación proporciona péptidos que comprenden una versión modificada de la región de unión a MHC de clase II del péptido Clip representado por el motivo de secuencia general [VILMFWYH]1[RVILMFWYH]2MAT[PR]aLLM [SEQ ID NO:10].

En tales péptidos Clip modificados, independientemente entre si P1 también puede ser [FWHY] [FWH] o [FW], P2 puede ser [RfWHY], RFW o R, P6 puede ser P.

En formas de realización específicas, P1 y P6 se modifican con una de las posibilidades anteriores y la arginina de P2 no está modificada.

Se pueden hacer péptidos artificialmente por entero usando secuencias que se ajusten estrechamente en una mayoría de moléculas de MHC de clase II. Un ejemplo de esto está proporcionado por el péptido PADRE (aKXVAAWTLKAAaZC (a= D-Alanina, X = I-ciclohexilalanina, Z = ácido aminocaproico) [SEQ ID NO:11] (Alexander et al. (2000) J. Immunol. 64, 1625-1633). Tales péptidos promiscuos artificiales se pueden hacer a partir de algoritmos informáticos considerando las propiedades de los residuos de aminoácidos y las de las moléculas de MHC de clase II para obtener el mejor ajuste. Un ejemplo de tales algoritmos está proporcionado por ProPred (Sigh y Raghava (2001), Bioinformatics 17, 1236-1237). Se dan otros ejemplos de algoritmos a continuación.

También se encuentran epítopos promiscuos en el péptido toxoide tetánico (830-843) o hemaglutinina de gripe HA(307-319).

Se describen métodos para la detección de epítopos promiscuos por ensayos in silico y celulares en Mustafa et al. (2014) PLoS One 9, e103679; Grzybowskakowalczyk (2015) Thorax 69, 335-345; Grabowska et al. (2014) Int. J. Cancer 224, 1-13; Fraser et al. (2014). Vaccine 32, 2896-2903.

Se pueden ensayar además opcionalmente epítopos de células T no naturales (o modificados) sobre su afinidad de unión a moléculas de MHC de clase II. Esto se puede realizar de diferentes maneras. Por ejemplo, se obtienen moléculas de HLA de clase II solubles por lisis de células homocigotas para una molécula de clase II determinada. La última se purifica por cromatografía de afinidad. Las moléculas de clase II solubles se incuban con un péptido de referencia marcado con biotina producido según su fuerte afinidad de unión para esa molécula de clase II. Los péptidos que se van a evaluar para unión a clase II se incuban después a diferentes concentraciones y su capacidad para desplazar el péptido de referencia de esta unión de clase II se calcula por adición de neutravidina. Se pueden encontrar métodos en, por ejemplo, Texier et al. (2000) J. Immunol. 164, 3177-3184.

Además y/o alternativamente, se pueden usar uno o más algoritmos in silico para identificar una secuencia de epítopo de células T en una proteína. Los algoritmos adecuados incluyen, pero no están limitados a los encontrados en los siguientes sitios web:

- http://cvc.dfci.harvard.edu/balbc/

- http://www.syfpeithi.de/

- http://abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/SVMHC

- http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.html;

- http://www.ddg-pharmfac.net/mhcpred/MHCPred/

- http://www.immunax.dfci.harvard.edu (PEPVAC)

- http://www.epivax.com/epimatrix/

Más en particular, tales algoritmos permiten la predicción en una proteína antigénica de una o más secuencias de nonapéptidos que ajustarán en el surco de una molécula de MHC de clase II.

Un ejemplo de determinar la naturaleza promiscua de péptido de MHC de clase II se describe en el documento WO2015/033140 usando el método desarrollado por Stumiolo et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17, 555-561) disponible en www.iedb.org. En el presente documento los alelos de HLA de clase II considerados para el análisis son HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01, DRA*01:01/HLA-DRB1*03:01, DRA*01:01/HLA-DRB1*04:01, DRA*01:01/HLA-DRB1*07:01, DRA*01:01/HLA-DRB1*08:02, DRA*01:01/HLA-DRB1*11:01, DRA*01:01/HLA-DRB1*13:01 y DRA*01:01/HLA-DRBI*15:01 respectivamente considerados como miembros representativos de los grupos de antígeno de HLA-DR1, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DR8, HLA-DR11, HLA-DR13 y HLA-DR15.

Es un aspecto adicional de la presente divulgación que epítopos restringidos a clase II, sean naturales o artificiales, se puedan usar como una vacuna para obtener células T CD4+ citolíticas. La administración posterior de una proteína terapéutica a la que se añade el mismo epítopo, pero sin motivo tiorreductasa, produce la activación de células T CD4+ citolíticas obtenidas por vacunación. Esto produce la prevención de una respuesta inmunitaria al agente terapéutico.

Los métodos de la presente divulgación se refieren a terapias de combinación en donde un péptido con un motivo redox y un epítopo de células T o un epítopo péptido de células T NK restringido a CD1d se usa para generar una población de células T CD4+ citotóxicas o células T NK CD4+ citotóxicas, respectivamente, que destruyen células presentadoras de antígeno que presentan un antígeno que contiene la secuencia del epítopo usada en el péptido con motivo redox.

De esta manera un sujeto se vacuna y se previene una respuesta inmunitaria contra una proteína antigénica con el epítopo administrada después.

El uso de epítopos de células T restringidos a clase II promiscuos y epítopos péptidos de unión a CDId para la vacunación antes de la administración de agentes terapéuticos es, por tanto, un aspecto de la presente divulgación. El uso de agentes terapéuticos que contienen el mismo epítopo que el usado para la vacunación, pero sin motivo tioredox es parte de esta divulgación.

Se usan péptidos y agentes terapéuticos para tratar sujetos en necesidad del agente terapéutico. Por tanto, en una aplicación de la divulgación el sujeto se inmuniza con un péptido que abarca un epítopo promiscuo y un motivo tiorreductasa. Típicamente, tal inmunización se lleva a cabo por administración subcutánea de un péptido adsorbido o disuelto en un adyuvante. El sujeto inmunizado se trata después con el agente terapéutico para el que está en necesidad, el agente contiene el mismo epítopo promiscuo que el incluido en el péptido usado para la vacunación, pero sin el motivo tiorreductasa. La respuesta inmunitaria hacia el agente terapéutico se previene debido al procedimiento de vacunación a través de que se han obtenido células T CD4+ citolíticas para el epítopo promiscuo.

La administración del péptido que contiene un motivo tiorredox se puede llevar a cabo por inmunización directa. Alternativamente, la administración puede consistir en células obtenidas del sujeto en necesidad para un agente terapéutico, exposición de las células al péptido in vitro para obtener y expandir células T CD4+ citolíticas y readministración a un sujeto.

Se piensa que los epítopos de células T de la presente divulgación ejercen sus propiedades aumentando la potencia de la formación de sinapsis al crear un punto disulfuro entre el motivo tiorreductasa y la molécula CD4. Este mecanismo de acción está sustanciado por datos experimentales (véase los ejemplos posteriores), pero no hay intención de restringir la presente divulgación a este mecanismo de acción específico.

Debe ser obvio para los expertos en la materia que se pueden delinear múltiples variaciones de esta secuencia de eventos, dependiendo del tipo y frecuencia a la que el agente terapéutico se tiene que administrar y el estado clínico del sujeto en necesidad para un agente terapéutico.

En una de estas variaciones podría ser más apropiado tratar el sujeto primero mediante una infusión de sus propias células después de la exposición de tales células al epítopo que contiene el motivo tiorreductasa en un cultivo celular in vitro. Esto podría ser un método preferido en sujetos en tratamiento inmunosupresor, que prevendría el desarrollo de una respuesta inmunitaria al péptido administrado con un adyuvante.

Se puede prever la administración de péptidos por cualquier vía, siendo una vía preferida la subcutánea.

Los péptidos se pueden hacer por síntesis química, lo que permite la incorporación de aminoácidos no naturales y/o aminoácidos químicamente modificados. Los ejemplos de aminoácidos químicamente modificados se encuentran en estados patológicos, por ejemplo, glucosilación y citrulinación de epítopos en artritis reumatoide, desamidación en enfermedad celiaca y formación de un puente disulfuro intraepítopo en diabetes mellitus dependiente de insulina. Sin embargo, hay numerosas posibilidades de modificar las cadenas laterales de los aminoácidos y no se pretende que los ejemplos anteriores sean exhaustivos.

Se pueden generar polipéptidos usando técnicas de ADN recombinante, en bacterias, levadura, células de insecto, células vegetales o células de mamífero. Se pueden preparar péptidos de una longitud más corta por síntesis química de péptidos, en donde los péptidos se preparan por acoplamiento de los diferentes aminoácidos uno a otro. La síntesis química es particularmente adecuada para la inclusión de, por ejemplo, D-aminoácidos, aminoácidos con cadenas laterales no naturales o aminoácidos naturales con cadenas laterales modificadas tal como cisteína metilada.

Los métodos de síntesis química de péptidos están bien descritos y los péptidos se pueden pedir de empresas tal como Applied Biosystems y otras empresas. La síntesis de péptidos se puede realizar o bien como síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) o al contrario a síntesis de péptidos en fase solución. Los mejores métodos conocidos de SPPS son química en fase sólida de t-Boc y Fmoc. Durante la síntesis de péptidos se usan varios grupos protectores. Por ejemplo, las funcionalidades hidroxilo y carboxilo se protegen por grupo t-butilo, lisina y triptófano se protegen por grupo t-Boc, y asparagina, glutamina, cisteína e histidina se protegen por grupo tritilo, y arginina se protege por el grupo pbf. En ciertas situaciones, tales grupos protectores se pueden dejar en el péptido después de la síntesis.

Alternativamente, los péptidos se pueden sintetizar usando moléculas de ácido nucleico que codifican los péptidos de esta divulgación en un vector de expresión apropiado que incluye las secuencias de nucleótidos codificantes. Tales moléculas de ADN se pueden preparar fácilmente usando un sintetizador de ADN automatizado y la relación bien conocida codón-aminoácido del código genético. Tal molécula de ADN también se puede obtener como ADN genómico o como ADNc usando sondas de oligonucleótidos y metodologías de hibridación convencionales. Tales moléculas de ADN se pueden incorporar a vectores de expresión, incluyendo plásmidos, que se adaptan para la expresión del ADN y producción del polipéptido en un huésped adecuado tal como bacteria, por ejemplo, Escherichia coli, célula de levadura, célula animal o célula vegetal.

En formas de realización de la presente divulgación, se proporcionan vectores de expresión en donde un epítopo de MHC de clase II o un péptido de células T NK restringido a CD1d se clona en el vector, típicamente antes o después del sitio de clonación múltiple de un vector de expresión comercialmente disponible. La inserción en el mismo marco de lectura del ADN que codifica una proteína terapéutica permite la expresión de una proteína etiquetada con epítopo, comparable a, por ejemplo, una proteína etiquetada con His o una proteína etiquetada con HA. Tales vectores de expresión modificados se pueden generar usando técnicas de biología molecular estándar.

La unión de la etiqueta epítopo produce una proteína de fusión del epítopo con una proteína terapéutica de elección para terapia de sustitución. Se puede usar un único vector para cualquier proteína terapéutica.

Con el fin de administrar la proteína a un paciente, la proteína se puede expresar usando un vector bacteriano, de levadura, vegetal o de mamífero. La elección del tipo de sistema de expresión depende de proteína a proteína es conocida para la mayoría de las proteínas terapéuticas. La proteína aislada es en consecuencia inyección.

Alternativa, el ADN que codifica la proteína terapéutica fusionada al epítopo se clona en un vector de expresión de mamíferos adecuado para terapia génica en seres humanos.

Las propiedades físicas y químicas de un péptido de interés (por ejemplo, solubilidad, estabilidad) se examinan para determinar si el péptido es/sería adecuado para uso para aplicaciones como se definen para la presente divulgación. Típicamente, esto se optimiza ajustando la secuencia del péptido. Opcionalmente, el péptido se puede modificar después de la síntesis (modificaciones químicas, por ejemplo, añadir/delecionar grupos funcionales) usando técnicas conocidas en la técnica. Opcionalmente, los péptidos se pueden modificar por alteración postraduccional. Los ejemplos de esto son acetilación, sulfatación, citrulinación o fosforilación de residuos de aminoácidos individuales o múltiples.

La invención se ilustra ahora mediante los siguientes ejemplos, sin intención de restringir la invención a estos ejemplos.

Ejemplo 1: Anticuerpo terapéutico

Muchos virus contienen epítopos de células T restringidos a clase II universales, un ejemplo es el virus de la hepatitis C. Las secuencias peptídicas 1247 a 1261 (QGYK VLVLNPSVAA T) [SEQ ID NO:12] y 1535 a 1550 (TTVRLRA YMNTPGLPV) [SEQ iD NO:13], cubren juntas más de 12 de los 15 haplotipos DRB, representativos de más del 85% de la población general.

Por tanto, se establece una estrategia de vacunación que hace uso de una mezcla de dos péptidos que abarcan la secuencia de unión mínima de epítopos restringidos a clase II y un motivo tiorreductasa.

El péptido 1247-1261 contiene una secuencia de unión a MHC de clase II en la posición 1251-1260 (subrayado en SEQ ID NO: 12].

El péptido 1535-1550 contiene una secuencia de unión a MHC de clase II mínima en las posiciones 1542-1550 (subrayado en SEQ ID NO: 13].

Se preparan dos péptidos para vacunación en donde el motivo redox y la secuencia del epítopo están separados por un enlazador dipéptido VR:

CPYC-VR-VLVLNPSVAA [SEQ ID NO:14], y

CPYC-VR-YMNTPGLPV [SEQ ID NO:15].

La administración de una mezcla de estos dos péptidos adsorbidos en hidróxido de aluminio produce células T CD4+ específicas con propiedades citolíticas.

Los anticuerpos contra CD20 son un tratamiento reconocido para linfoma no hodgkiniano. Sin embargo, en un porcentaje significativo de pacientes, esta administración provoca anticuerpos específicos que o bien excluyen administración adicional o minimizan la eficacia.

La presente divulgación proporciona una estrategia de vacunación para prevenir tal inmunización indeseada.

Las 2 secuencias anteriores del virus de la hepatitis C, es decir, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13, se producen en línea con el anticuerpo anti-CD20 y se colocan en el extremo amino terminal de la cadena pesada [SEQ ID NO: 16]. Tras la administración de este anticuerpo anti-CD20, las células T CD4+ citolíticas obtenidas previamente por vacunación se activan y eliminan por apoptosis la presentación de determinantes del anticuerpo terapéutico, previniendo de esta manera la inmunización hacia anti-CD20.

Ejemplo 2: Eritropoyetina

La eritropoyetina (EPO) es un polipéptido de 166 aminoácidos de longitud, que es el mediador principal de inducción hipóxica de eritropoyesis, que en la edad adulta está producida por el riñón (± 80%). La hipoxia induce un aumento en la producción de e Po , que entonces circula en el plasma y se une a receptores expresados en células progenitoras eritroides, lo que produce diferenciación terminal de tales precursores y aumenta en masa de glóbulos rojos.

Aunque la EPO recombinante humana es un inmunógeno débil, su uso repetitivo en, por ejemplo, insuficiencia renal, diferencias sutiles en glucosilación o en el procedimiento de preparación puede producir el desarrollo de anticuerpos neutralizantes específicos. Como la EPO es el único mediador de eritropoyesis debido a hipoxia, la presencia de una respuesta inmunitaria neutralizante se considera un suceso drástico.

Una manera de prevenir la aparición de tal respuesta inmunitaria indeseada es vacunar individuos en necesidad para EPO con un epítopo de células T restringido a clase II promiscuo unido a un motivo tiorreductasa localizado en la región que flanquea el epítopo. Esto produce células T CD4+ específicas de epítopo con propiedades citolíticas. La administración de una molécula de e Po acoplada al mismo epítopo promiscuo activa células T CD4+ citolíticas, que elimina por apoptosis las células presentadoras de antígeno que presentan EPO y mediante ello la capacidad de montar una respuesta inmunitaria a EPO.

La cadena invariable contiene una secuencia CLIP que es un epítopo de células T promiscuo, que se une a moléculas de MHC de clase II nacientes con una afinidad relativamente baja. CLIP se libera de su unión a clase II por competición con péptidos que muestran mayor afinidad. Durante este intercambio de epítopos, la molécula DM protege el primer bolsillo de anclaje de moléculas de clase II en un estado transitorio entre CLIP y el nuevo péptido.

Una versión mutada de CLIP en el que los primeros 2 aminoácidos, que muestran afinidad débil para unión a clase II, se sustituyen por dos residuos hidrofóbicos mantendrán su promiscuidad al tiempo que aumentan la afinidad para moléculas de clase II. Además, el residuo localizado en la posición 6 se puede mutar de P a R para aumentar más su afinidad de unión.

Por tanto, la secuencia KM¹R²MATP⁶LLMQAL [SEQ ID NO:9], en la que el segundo y tercer aminoácidos (M y R, respectivamente) están localizados en posición 1 y 2, respectivamente, se mutan, así como P en posición 6 para dar KFi F2MATR6LLMQAL [SEQ ID NO:17].

Se genera un péptido por adición de un motivo tiorreductasa y una secuencia enlazadora Val Arg en el extremo N, que da la secuencia completa: CPYC-VR-FFMATRLLMQAL [SEQ ID NO: 18].

Los pacientes en necesidad para inyección de EPO se vacunan por administración del péptido [SEQ ID NO: 18] usando un procedimiento estándar de péptido adsorbido sobre hidróxido de aluminio y administrado por inyección SC. Se sabe que este procedimiento produce células T CD4+ citolíticas específicas de epítopo, como se describe en la solicitud de patente WO200817517.

La secuencia KFFMATRLLMQAL [SEQ ID NO: 17] se añade en el extremo terminal de EPO, separada por dos glicinas de la secuencia de EPO, lo que hace un total de 181 aminoácidos. Esta EPO modificada [SEQ ID NO: 19] retiene su actividad completa tras la administración y activa las células T CD4+ citolíticas obtenidas por vacunación excluyendo de esta manera cualquier respuesta inmunitaria dañina.

La naturaleza promiscua del epítopo CLIP modificado hace posible usar la misma vacuna y la misma molécula de EPO para cualquier paciente en necesidad de tal terapia.

Ejemplo 3: Alfa-galactosidasa

La enfermedad de Fabry es la enfermedad de almacenamiento lisosómico con acumulación de glucoesfingolípidos en varios tejidos debido a la ausencia de alfa-galactosidasa, una hidrolasa lisosómica. Es una enfermedad de defecto genético ligado al cromosoma X que afecta a ± 1 de 100.000 individuos. La terapia actual de la enfermedad de Fabry incluye infusión regular de alfa-galactosidasa. Sin embargo, más del 25% de pacientes en tal terapia desarrollan una respuesta inmunitaria a la enzima, lo que previene cualquier uso adicional de tal enzima y precipita a los pacientes a riesgos de arias complicaciones, incluyendo ictus.

La alfa-galactosidasa recombinante se puede modificar para que contenga la secuencia de un epítopo de células T promiscuo restringido a clase II añadido en el extremo animo terminal de la molécula. La administración de esta molécula de alfa-galactosidasa modificada a individuos previamente vacunados para este epítopo promiscuo que contiene un motivo tiorreductasa, provocando de esta manera la producción de células T CD4+ citolíticas específicas de péptido, no provoca una respuesta inmunitaria a alfa-galactosidasa.

Un epítopo promiscuo de apolipoproteína B-100 de secuencia LFLKSDGRVKYTLN [SEQ ID NO:20] correspondiente a los aminoácidos 1277 a 1290, en el que P1 está ocupado por L1279 (subrayado) se produce por síntesis química junto con un motivo tiorreductasa, que lleva a la secuencia CpYc -LF-LKSDGRVKYt Ln [SEQ ID NO:21]. Tal secuencia contiene 1 arginina (R) en la posición P6. Este residuo de R se sustituye con citrulina, un aminoácido obtenido por la acción de peptidil arginina desiminasa. Esta modificación produce la pérdida de una carga positiva lo que lleva a una mayor interacción con residuos de anclaje a MHC de clase II en P6.

La secuencia final del péptido usado para vacunación es, por tanto, CPYC-LF-LKSDG-citrulina-VKYTLN [SEQ ID NO:22]. Los pacientes afectados por la enfermedad de Fabry se inmunizan con el péptido de SEQ ID NO: 21, usando un procedimiento estándar de péptido adsorbido en hidróxido de aluminio y administrado por inyección SC. Se producen después células T CD4+ citolíticas específicas de epítopo.

A tales pacientes vacunados se les puede administrar después alfa-galactosidasa recombinante modificada para contener la secuencia LFLKSDGRVk Yt LN [SEQ ID NO:20] del epítopo promiscuo [SEQ ID NO: 23].

Ejemplo 4: Terapia celular

Los pacientes en terapia inmunosupresora se podrían beneficiar de la administración de un anticuerpo terapéutico, con todo, la vacunación activa usando péptidos que abarcan epítopos restringidos a clase II podría ser difícil en tales circunstancias.

Sin embargo, es posible recoger células de sangre periférica de tales pacientes, preparar células T CD4+ indiferenciadas para transformación in vitro a células citolíticas, que después se pueden readministrar al paciente de una manera estrictamente autóloga. Haciendo eso, el paciente está inmediatamente protegido hacia respuestas inmunitarias indeseadas hacia el agente terapéutico considerado. Un ejemplo representativo de tal situación es esclerosis múltiple, con pacientes en terapia inmunosupresora, que podrían beneficiarse de la administración de anticuerpos tal como el anticuerpo específico anti-CD52 (Campath-1H Alemtuzumab).

Una muestra de cincuenta ml de sangre periférica se recoge de tales pacientes y se preparan células T CD4+ indiferenciadas por adsorción a bolas magnéticas. Se derivan células dendríticas de los monocitos obtenidos de la misma muestra de sangre, usando métodos conocidos en la técnica.

Se eligió un epítopo restringido a clase II promiscuo de proteína de entrada en la célula de micobacteria, Mce2, DPIELNATLSAVA [SEQ ID NO:24] (aminoácidos 163 a 175) (Panigada (2002) Infect. Immun. 70, 79-85).

Se añadió un motivo tiorreductasa al extremo animo terminal de este péptido para generar la secuencia CPYC-DP-IELNATLSAVA [SEQ ID NO:25].

Se cargan las células dendríticas con el péptido de SEQ ID NO: 25 y células T CD4+ indiferenciadas se estimulan cuatro veces durante 7 días con estas células dendríticas para generar células T CD4+ citolíticas.

Se administran 5x106 células citolíticas por la vía IV al donante de células.

Se obtuvo un anticuerpo anti-CD52 específico por ingeniería genética, que contiene la secuencia DPIELNATLSAVA [SEQ ID NO:24] añadida al extremo animo terminal de la molécula con dos residuos de glicina como enlazador [SEQ ID NO: 26].

La administración de tal anticuerpo anti-CD52 modificado a un individuo que ha recibido células T CD4+ autólogas activadas in vitro con el péptido de SEQ ID NO: 25 produce la activación de células T CD4+ citolíticas al péptido DPIELNATLSAVA [SEQ ID NO:24], previniendo de esta manera cualquier posibilidad de provocar una respuesta inmunitaria hacia el anticuerpo terapéutico.

Ejemplo 5: Vector para la expresión de proteína en fusión con el epítopo promiscuo CLIP modificado

El vector de expresión de mamíferos pCMV con el promotor del citomegalovirus se manipula para permitir la expresión en células CHO (ovario de hámster chino) de cualquier proteína para terapia de sustitución, en fusión con el epítopo derivado de CLIP promiscuo descrito en el ejemplo 2 [s Eq ID NO: 17]. Los pacientes en necesidad de inyección con una proteína para terapia de sustitución se vacunan primero por administración de un péptido que comprende un motivo tiorreductasa y el epítopo derivado de CLIP modificado descrito en el ejemplo 2 [SEq ID NO: 18]. Se sabe que esta inmunización produce células T CD4+ citolíticas específicas de epítopo, como se describe en la solicitud de patente WO200817517.

La proteína terapéutica de interés, en forma de una proteína de fusión, flanqueada por la secuencia CLIP retiene su actividad completa tras la administración y activa las células T CD4+ citolíticas obtenidas por vacunación, excluyendo de esta manera cualquier respuesta inmunitaria dañina. La naturaleza promiscua del epítopo CLIP modificado hace posible usar la misma vacuna y la misma molécula de EPO para cualquier paciente en necesidad de tal terapia, independientemente de su perfil HLA.

Para obtener este vector de expresión, se manipuló un adaptador que consiste en el epítopo derivado de CLIP precedido por un enlazador hecho de 2 glicinas y rodeado por secuencias específicas de enzimas de restricción XhoI/NheI como se muestra a continuación:

Xhol (*)

GCA CGG CTC GAG GGC GGA AAG TTT TTC ATG GCC ACC

G G K F F M A T

CGT GCC GAG CTC CCG CCT TTC AAA AAG TAC CGG TGG

10 20 30

Nhel (*)

AGA CTG CTG ATG CAG GCG CTG AGC TAG CTA GTT C SEQ ID NO:38

R L L M Q A L S * SEQ ID NO:39

TCT GAC GAC TAC GTC CGC GAC TCG ATC GAT CAA G

40 50 60

Al clonar el adaptador en el vector de expresión comercialmente disponible pCMV, se crea pCMV-CLIP de expresión modificada con un sitio de clonación múltiple para la inserción del ADNc de eritropoyetina (EPO). Para este fin, la secuencia que codifica EPO se amplificó por PCR con un cebador directo que consiste en la secuencia específica de EPO y la secuencia específica de Age-I precedida por una secuencia KOZAK, y un cebador inverso hecho de secuencia específica de EPO y secuencia específica de Sal-I. Después de digestión Age-I/Sal-I, la construcción de EPO se inserta en pCMV-CLIP, predigerido por Age-I y XhoI. El plásmido se transforma y amplifica en E. coli DH5-alfa. Después de la purificación y linealización, el vector de expresión para la proteína de fusión EPO-CLIP se transfecta en células CHO. Las células CHO transfectadas se seleccionaron en ampicilina y el clon que producía el mayor nivel de EPO-CLIP se seleccionó para producción en masa de la proteína de fusión recombinante con SEQ ID NO: 40 (secuencia CLIP modificada subrayada)

MGVHECPAWL WLLLSLLSLP LGLPVLGAPP RLICDSRVLE RYLLEAKEAE NITTGCAEHC

SLNENITVPD TKVNFYAWKR MEVGQQAVEV WQGLALLSEA VLRGQALLVN SSQPWEPLQL

HVDKAVSGLR SLTTLLRALR AQKEAISPPD AASAAPLRTI TADTFRKLFR VYSNFLRGKL

KLYTGEACRT GDRVEGGKFF MATRLLMQAL S [SEQ ID NO: 40]

Ejemplo 6: secuencias divulgadas en la especificación:

Claims

REIVINDICACIONES

i . Un kit de partes de polipéptidos que comprende:

a) un péptido que comprende:

a1) un epítopo de células T de MHC de clase II o un epítopo de células T NK restringido a CD1d, y a2) inmediatamente adyacente a dicho epítopo o separado por como mucho 7 aminoácidos de dicho epítopo una secuencia de motivo oxidorreductasa [c St ]-X(2)-C [SEQ ID NO:7] o C-X(2)-[CST] [SEQ ID NO:8]

y

b) un polipéptido de fusión o un vector de expresión que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica dicho polipéptido de fusión, que comprende como compañeros de fusión:

b1) una proteína terapéutica o de vector vírico y

b2) el epítopo definido en a i), en donde la secuencia del epítopo es una secuencia que no se produce en la secuencia sin modificar de la proteína terapéutica o del vector vírico de b1),

para uso en prevenir la respuesta inmunitaria a dicha proteína terapéutica o del vector vírico en un sujeto.
2. El kit de partes para uso según la reivindicación 1, en donde la secuencia del motivo oxidorreductasa es C-X(2)-C [SEQ ID NO:2].
3. El kit de partes para uso según la reivindicación 1 o 2, en donde el motivo del epítopo de células T NK restringido a CD1d tiene la secuencia [FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT] [SEQ ID NO: 1].
4. El kit de partes para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el motivo del epítopo de células T NK restringido a CD1d tiene la secuencia [FWY]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWY] [SEQ ID NO:28].
5. El kit de partes para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho epítopo de células T de MHC de clase II es un epítopo promiscuo que se une a una o más moléculas HLA-DR1.
6. El kit de partes para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho epítopo de células T de MHC de clase II tiene la secuencia X¹X²MATX⁶LLM [SEQ ID NO:29] en donde X¹y X²se seleccionan independientemente de V, I, L, M, Y, H, F y W y X6 es R o P.
7. Un polipéptido de fusión, o un vector de expresión que codifica dicho polipéptido de fusión que comprende como compañeros de fusión:

b1) una proteína terapéutica o de vector vírico y

b2) un epítopo de células T de MHC de clase II o un epítopo de péptido de células T NK restringido a CD1d, en donde la secuencia del epítopo es una secuencia que no se produce en la secuencia sin modificar de la proteína terapéutica o del vector vírico de b1) para uso como un medicamento en un individuo previamente tratado con un péptido que comprende:

a1) dicho epítopo de células T de MHC de clase II o dicho epítopo de células T NK restringido a CD1d y a2) inmediatamente adyacente a dicho epítopo o separado por como mucho 7 aminoácidos de dicho epítopo una secuencia de motivo oxidorreductasa [CST]-X(2)-C [SEQ ID NO:7] o C-X(2)-[CST] [SEQ ID NO:8].
8. Un péptido que comprende:

- a1) un epítopo de células T de MHC de clase II o un epítopo de péptido de células T NK restringido a CD1d, y

- a2) inmediatamente adyacente a dicho epítopo o separado por como mucho 7 aminoácidos de dicho epítopo una secuencia de motivo oxidorreductasa [c St ]-X(2)-C [SEQ ID NO:7] o C-X(2)-[CST] [SEQ ID NO:8],

para uso en prevenir una respuesta inmunitaria contra una proteína terapéutica de fusión o contra una proteína de vector vírico de fusión con dicho epítopo de células T de MHC de clase II o dicho epítopo de péptido de células T NK restringido a CD1d

- en donde dicho epítopo tiene una secuencia que no se produce en la secuencia sin modificar de la proteína terapéutica o de la proteína del vector vírico, en donde dicha proteína terapéutica de fusión o dicha proteína del vector vírico de fusión comprende como compañeros de fusión:

b1) una proteína terapéutica o de vector vírico y

b2) el epítopo definido en a1), en donde la secuencia del epítopo es una secuencia que no se produce en la secuencia sin modificar de la proteína terapéutica o del vector vírico de b1).
9. Un método para preparar un kit de partes que comprende:

a) preparar una proteína terapéutica de fusión o una proteína de vector vírico de fusión introduciendo en la secuencia de dicha proteína la secuencia de un epítopo de células T de MHC de clase II o un epítopo de células T NK restringido a CD1d, secuencia de epítopo que es una secuencia que no se produce en la secuencia sin modificar de la proteína terapéutica, o un vector que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica tal proteína de fusión definida en a),

b) preparar un péptido que comprende:

- el epítopo de células T de MHC de clase II o un epítopo de péptido de células T NK restringido a CD1d de a) y

- inmediatamente adyacente a dicho epítopo o separado por como mucho 7 aminoácidos de dicho epítopo una secuencia de motivo oxidorreductasa [CST]-X(2)-C [SEQ ID NO:7] o C-X(2)-[CST] [SEQ ID NO:8],

en donde dicho kit de partes es adecuado para el uso en prevenir una respuesta inmunitaria a dicha proteína terapéutica o de vector vírico en un sujeto.