ES2626115T3 - Péptidos inmunogénicos y su uso en trasplante - Google Patents

Abstract

Un péptido inmunogénico aislado que comprende (i) un epítopo de célula T de una proteína aloantigénica de un aloinjerto y que comprende (ii) un motivo C-(X)2- [CST] o [CST]-(X)2-C para su uso en la prevención o el tratamiento en un receptor de rechazo de un aloinjerto de mamífero, caracterizado por que dicho motivo C-(X)2- [CST] o [CST]- (X)2-C es adyacente a dicho epítopo de célula T, o está separado de dicho epítopo de célula T por un enlazador.

Description

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DESCRIPCION

Peptidos inmunogenicos y su uso en trasplante Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a peptidos inmunogenicos y a su uso en la supresion y/o el tratamiento de rechazo de un aloinjerto.

Antecedentes de la invencion

El trasplante de organos o de medula osea es una practica clmica habitual para la curacion de una disfuncion organica terminal o para la recuperacion despues de disfuncion o agotamiento de medula osea, respectivamente. Los organos que pueden trasplantarse incluyen piel, rinon, fngado, corazon, pulmon, pancreas, intestino, cornea, e incluso manos o partes de la cara. El trasplante celular incluye celulas de medula osea y de sangre del cordon umbilical, pero tambien celulas tales como las celulas beta de los islotes pancreaticos de Langerhans, hepatocitos y mioblastos. La nueva tecnologfa ha hecho recientemente posible injertar celulas madre que se han transformado in vitro por reprogramacion de genes para adoptar el patron de diferenciacion de practicamente cualquier celula. Esta enorme diversidad de situaciones en las que el trasplante es obligatorio probablemente aumente en los anos venideros, debido tanto a los avances tecnologicos como al envejecimiento de las poblaciones.

Un trasplante de celulas y de organos realizado entre diferentes individuos que pertenecen a la misma especie se denomina aloinjerto o alotrasplante. La alorreactividad describe una respuesta inmunitaria al trasplante de aloinjerto que se dirige hacia diferencias alelicas entre un hospedador (receptor) y un donante.

El mecanismo del rechazo de aloinjerto se basa en el reconocimiento de aloantfgenos. Estos pueden dividirse en 3 categonas principales, en concreto, antfgenos del complejo principal de histocompatibilidad (CMH, siglas del ingles major histocompatibility complex), antfgenos de histocompatibilidad secundarios y aloantfgenos organo espedficos. El rechazo de aloinjerto implica el reconocimiento por linfocitos T del receptor del aloinjerto de dichos aloantfgenos presentados en el contexto de determinantes del CMH, que estan presentes en la superficie de las celulas presentadoras de antfgeno (CPA) junto con peptidos procedentes del procesamiento de aloantfgenos.

Los CMH se dividen en dos categonas, clase I y clase II, codificados por diferentes locus genicos. En el hombre, tres locus codifican antfgenos de clase I, denominados clase A, B y C, y tres locus codifican antfgenos de clase II, denominados DP, DQ y DR. El polimorfismo de los antfgenos del CMH es muy alto, dando como resultado una probabilidad extremadamente baja de encontrar 2 individuos no relacionados compartiendo antfgenos del CMH.

La funcion de los antfgenos del CMH es presentar peptidos a celulas T. Clasicamente se considera que los antfgenos de clase I presentan peptidos principalmente procedentes de antfgenos endogenos de celulas, mientras que los antfgenos de clase II presentan peptidos generados por el procesamiento de antfgenos desde el exterior. Se han descrito distintas rutas de procesamiento y presentacion en la superficie celular para la presentacion de antfgenos de clase I en comparacion con los de la clase II. Sin embargo, datos recientes indican claramente que los antfgenos producidos de un modo endogeno pueden presentarse de un modo eficaz a traves de la ruta del CMH de clase II, mientras que los antfgenos exogenos pueden procesarse a traves de la ruta de clase I. Por tanto, cualquier protema, ya sea de origen intracelular como extracelular, se procesa en peptidos que se presentan a celulas T por determinantes de MCH tanto de clase I como de clase II.

Los peptidos presentados por determinantes del CMH de clase II se reconocen por celulas T que llevan la molecula CD4 (celulas CD4+), mientras que los peptidos presentados por determinantes del CMH de clase I son reconocidos por celulas T CD8+. El mecanismo mediante el cual las celulas T reconocen peptidos incluye 3 posibilidades. Las celulas T pueden reconocer al propio peptido, a los determinantes del CMH o tanto al peptido como a los determinantes del CMH. Las estructuras cristalinas de diversos complejos peptido - CMH -TCR han mostrado que en el alorreconocimiento, puede observarse cada uno de estos modos de reconocimiento. Sin embargo, el reconocimiento de determinantes del CMH no excluye la presencia de un peptido, necesario para la estabilizacion de la molecula del CMH en la superficie celular. Sin embargo, en dicho caso, el peptido no difiere necesariamente en su secuencia de aminoacidos de la del peptido correspondiente del receptor del injerto.

Las CPA presentan en su superficie una gran cantidad de antfgenos procedentes del procesamiento de antfgenos endogenos, incluyendo antfgenos de los CMH. Por tanto, los antfgenos de clase II presentan peptidos de moleculas del CMH tanto de clase I como de clase II, que pueden reconocerse por celulas T aloespedficas. Se sabe los antfgenos de clase I y clase II se liberan de las celulas u organos donantes, que se captan, se procesan y se presentan por las CPA del receptor para el reconocimiento de celulas T.

Ademas de los antfgenos del CMH principales, se han definido antfgenos de histocompatibilidad secundarios en cuanto a su capacidad para provocar rechazo de injerto mediado por celulas, pero carecen de las caractensticas estructurales de los antfgenos del CMH. Estos antfgenos secundarios se procesan en peptidos y se presentan por

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antigenos del CMH. El rechazo mediante antigenos de histocompatibilidad secundarios del donante, depende del polimorfismo de ese antfgeno observado entre individuos pertenecientes a la misma especie, ya que, por definicion, dichos individuos son tolerantes a sus propios antigenos de histocompatibilidad secundarios. Dichos antigenos pueden expresarse de manera ubicua o de una manera selectiva en un tejido o celula. Estos incluyen glucoprotemas de superficie, pero principalmente antigenos intracelulares tales como factores de transcripcion nuclear. Uno de los mejores ejemplos de antigenos de histocompatibilidad secundarios es el proporcionado por antigenos codificados por el cromosoma Y.

En el hombre, la importancia de los antigenos de histocompatibilidad secundarios para el rechazo se ha observado principalmente en la aceptacion de medula osea y en reacciones de injerto frente a huesped (GVH graft versus host) donde las celulas inmunocompetentes del injerto estan activadas contra antfgenos del receptor. Esto se debe a que la inmensa mayona de los trasplantes de medula osea se realizan con una coincidencia completa de antigenos del CMH.

La tercera categona de antigenos son los antigenos espedficos de tejido. Dichos antigenos pueden presentar variaciones alelicas (es decir, polimorfismo) entre el donante y el receptor. Los alopeptidos procedentes de antigenos espedficos de tejido pueden presentarse por antfgenos del CMH tanto de clase II como de clase I para el reconocimiento por celulas T aloespedficas.

El mecanismo subyacente del rechazo de injerto se clasifica normalmente en dos categonas, alorreconocimiento directo o indirecto. La ruta directa implica el reconocimiento de antfgenos donantes presentados por CPA donantes. La ruta indirecta implica el reconocimiento de antigenos donantes presentados por CPA del receptor. Esta distincion se aplica para los tres tipos de aloantfgenos descritos anteriormente y es importante tenerlo en cuenta por dos razones principales, en particular el sitio en el que estas rutas estan activas y la cinetica del proceso de rechazo.

El sitio en el que estas rutas estan activas es diferente. Las CPA donantes contenidas en el injerto migran a los ganglios linfaticos regionales del receptor donde estimulan a celulas T receptoras. Por el contrario, las CPA del receptor infiltran el injerto donde reemplazan progresivamente CPA donantes. El tipo de celulas que presentan el antigeno no es necesariamente el mismo. Por ejemplo, en la piel, la celula presentadora principal es la celula de Langerhans, mientras que en los ganglios linfaticos estas son principalmente celulas dendnticas convencionales.

La distincion entre las rutas directa e indirecta tambien es importante en cuanto a la cinetica de rechazo. Por tanto, el rechazo agudo es principalmente el resultado de la ruta directa, en la que las celulas T receptoras estan activadas por CPA donantes. Las celulas T del receptor reconocen directamente discrepancias alelicas resultantes del polimorfismo de moleculas del CMH. El peptido presentado por la molecula del CMH puede presentar variaciones alelicas y por lo tanto puede contribuir al reconocimiento de celulas T, pero este no es necesariamente el caso. De hecho, todas las moleculas del CMH contienen cientos de peptidos, solo algunos de los cuales presentan variaciones alelicas con peptidos correspondientes del receptor.

El tamano del repertorio de las celulas T es tal que una proporcion significativamente elevada de todas las celulas T (hasta 1 celula T de 10.000) puede reaccionar contra variaciones alelicas del CMH, de tal manera que este mecanismo predomina en la fase de rechazo agudo. En receptores presensibilizados con aloantfgenos por exposicion previa, por ejemplo, mediante infusion sangumea o gestacion, los anticuerpos aloespedficos tambien pueden participar en el proceso de rechazo agudo. En algunos casos, los determinantes de histocompatibilidad menor tambien pueden desempenar una funcion en el rechazo agudo mediante la ruta directa.

El rechazo agudo se reduce en el entorno clmico emparejando antfgenos del CMH entre el donante y el receptor, identificando receptores presensibilizados y, en una gran mayona de casos, suprimiendo la capacidad del receptor de rechazar el injerto con farmacos inmunosupresores.

Los mecanismos basicos del rechazo cronico de injerto son multiples, pero tambien pueden diferenciarse en mecanismos directos e indirectos. Sin embargo, en muchas situaciones, predomina la ruta indirecta. Esto se debe a la desaparicion progresiva de las CPA donantes que han migrado fuera del injerto y al hecho de que las celulas del injerto que expresan moleculas del CMH de clase I inducen insensibilidad de las celulas T del receptor. Una excepcion son las celulas del endotelio vascular y las celulas epiteliales que, en condiciones inflamatorias, pueden expresar moleculas del CMH de clase II y por lo tanto tener la capacidad de activar celulas T aloespedficas del receptor.

La ruta indirecta se genera por aloantfgenos que se liberan del injerto y son captados por las CPA receptoras para su presentacion a celulas receptoras. Estos antfgenos generan peptidos que se presentan en antfgenos de CMH de clase II o de clase I. Experimentos recientes ponen de manifiesto que la presentacion en antfgenos de CMH de clase II es mas importante. Ratones deficientes en antfgenos de CMH de clase II no pueden rechazar un injerto de un donante de antfgeno de histocompatibilidad secundario distinto. En el hombre, la eliminacion de CPA donantes del injerto no impide el rechazo cronico, mientras que la supresion de la activacion de celulas T CD4+ con inmunosupresores, tales como ciclosporina, reduce significativamente la incidencia del rechazo cronico.

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Una explicacion probable para la predominancia de la presentacion del CMH de clase II en la ruta indirecta del rechazo cronico de injerto, es que las celulas T CD8+ no se activan facilmente por reconocimiento de alopeptidos presentados por determinates del CMH de clase I, a menos las celulas T CD4+ proporcionen ayuda. Esto depende, mas probablemente, de la produccion de interleucina 2 (IL-2) por celulas T cD4+, necesaria para la maduracion completa de celulas T CD8+.

Por lo tanto, las celulas T del subtipo CD4+ que reconocen peptidos dentro del concepto de determinates del CMH de clase II tienen diferentes funciones: la produccion de IL-2 para la maduracion de celulas T CD8+ en celulas T efectoras, la produccion de celulas B ayudantes de citocinas para madurar en celulas formadoras de antfgeno y la infiltracion del injerto en el que mantienen un estado de inflamacion.

El rechazo de injerto, y en particular el rechazo cronico de injerto, actualmente representa el mayor reto en el ambito clrnico. Produce una morbilidad significativa y requiere mantener a los receptores del injerto con una terapia inmunosupresora con muchos efectos secundarios negativos. Hay una necesidad de identificar metodos para disminuir la tasa de rechazo de injerto. Esto no solo sena un beneficio para los pacientes que van a recibir un injerto, sino tambien para la sociedad en su conjunto, ya que la proporcion entre coste y beneficio, para mantener sana a una poblacion, se reducina.

Joffre O. et al. (2004) Blood 103, 4216-4221 desvelan una poblacion de celulas T reguladoras (CD4+CD25+) activadas con celulas presentadoras de antigenos alogenicos que inducen tolerancia espedfica prolongada a diferentes injertos de medula osea para antigenos de histocompatibilidad principales y secundarios. Este artmulo desvela el uso de dichas celulas T reguladoras espedficas de aloantfgeno para inducir tolerancia perdurable a medula osea alogenica.

Gross D.A. et al. (2006) Blood, 108(6), 1841-1848 desvelan una composicion de celulas T reguladoras (CD4+CD25+) espedficas para el antfgeno de histocompatibilidad secundario Dby y desvelan la implantacion de medula osea masculina exogena.

Roopenian D. et al. (2002) Immunol. Rev. 190, 86-94, es una revision de la funcion de los antfgenos de histocompatibilidad secundarios y su funcion como aloantfgenos en trasplante alogenico. Este artmulo desvela secuencias de antfgenos H secundarios (H3 y SMYC) que comprenden un motivo redox dentro de la secuencia del epftopo.

Chen T.-C. et al. (2004) J. Clinical Invest. 113(12), 1754-1762 desvelan la alteracion de un ligando peptfdico dentro de la secuencia epitopica del antfgeno masculino Dby para la induccion de tolerancia en trasplante alogenico.

Wood K.J. et al. (2003) Nature Revs. Immunol. 3(1), 199-210, es una revision sobre celulas T reguladoras en trasplante y desvela que las T Regs, CD4+CD25+, tienen una actividad supresora contra las CPA.

El documento WO9958552 desvela peptidos que comprenden una secuencia motivo CHGC dentro del epftopo para inducir inmunidad de celulas T como un metodo de vacunacion.

El documento WO2007104715, de los autores Gross et al., desvela celulas T reguladoras, CD4+ CD25+, espedficas para, entre otros, peptidos del antfgeno Dby.

Sumario de la invencion

El primer aspecto de la invencion se refiere a peptidos inmunogenicos aislados que comprenden (i) un epftopo de celula T procedente de una protema aloantigenica de un aloinjerto y que comprende (ii) un motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C, para su uso en la prevencion o tratamiento en un receptor del rechazo de un aloinjerto de mairftfero, caracterizado por que el motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C es adyacente al epftopo de celulas T, o esta separado del epftopo de celulas T mediante un enlazador.

En realizaciones espedficas, el aloinjerto es un injerto de organo solido, tal como rinon, pulmon, corazon, tgado, pancreas, hueso o piel.

En otras realizaciones espedficas, el aloinjerto es un injerto celular, tal como de medula osea, un injerto de celulas de sangre del cordon umbilical, un injerto de celulas madre, o un injerto de celulas de islote pancreatico.

Son ejemplos de protemas aloantigenicas los antfgenos de histocompatibilidad secundarios, los antfgenos de histocompatibilidad principales y antfgenos espedficos de tejido.

En realizaciones particulares, el motivo anterior no se produce de manera natural dentro de una region de 11 aminoacidos en posicion N o C terminal adyacente al epftopo de celula T en la protema aloantigenica.

En realizaciones particulares, el peptido tiene la longitud entre 12 y 50 aminoacidos.

En determinadas realizaciones, el motivo anterior esta en posicion N terminal del epftopo de celula T.

En determinadas realizaciones al menos una X en el motivo anterior es Gly, Ala, Ser o Thr.

En determinadas realizaciones al menos una X en el motivo anterior es His o Pro.

En determinadas realizaciones al menos una C en el motivo anterior esta metilada.

Otro aspecto de la invencion se refiere a metodos para obtener una poblacion de celulas T citotoxicas espedficas de antfgeno de aloinjerto. Los metodos comprenden las etapas de proporcionar celulas de sangre periferica; poner en contacto estas celulas con un peptido inmunogenico que comprende (i) un epftopo de celula T procedente de una

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protema antigenica de aloinjerto, una protema aloantigenica de un aloinjerto y (ii) un motivo C-(X)2-[CST] o [CST]- (X)2-C y expandir estas celulas en presencia de IL-2.

Otro aspecto de la invencion se refiere a metodos no terapeuticos para la obtencion de una poblacion de celulas T citotoxicas espedficas de antigeno de aloinjerto. Estos metodos comprenden las etapas de

a) proporcionar un peptido inmunogenico que comprende (i) un epftopo de celula T procedente de una protema antigenica de aloinjerto, una protema aloantigenica de un aloinjerto y (ii) un motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C;

y

b) administrar el peptido inmunogenico a un sujeto para un fin no terapeutico; y c) obtener del sujeto la poblacion de celulas T espedficas de antigeno de aloinjerto

Un aspecto adicional de la invencion se refiere a poblaciones de celulas T citotoxicas espedficas de antigeno de aloinjerto, que suprimen las respuestas inmunitarias a aloantigenos, que se obtienen por los metodos de obtencion de celulas mencionados anteriormente.

Un aspecto adicional se refiere a poblaciones de celulas T citotoxicas espedficas para un aloantigeno de un aloinjerto como se describe anteriormente, para su uso en la prevencion o el tratamiento en un receptor del rechazo del aloinjerto.

En realizaciones de los diversos aspectos mencionados anteriormente, la protema aloantigenica o el antigeno de aloinjerto es el antigeno Dby codificado por el cromosoma H-Y.

Un aspecto adicional de la invencion se refiere a peptidos inmunogenicos aislados que comprenden (1) un epftopo de celula T del antigeno Dby y (2) el motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C; estando el motivo adyacente al epftopo de celula T o separado del epftopo de celula T mediante un enlazador.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a metodos de produccion de peptidos inmunogenicos aislados que comprenden las etapas de identificar un epftopo de celula T en una secuencia de protema de una protema del CMH, de un antigeno de histocompatibilidad secundario o de un antigeno espedfico de tejido, y producir un peptido en el que una secuencia con un motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C es adyacente a la secuencia del epftopo de celula T, o esta separada del epftopo de celula T mediante un enlazador.

Descripcion detallada de la invencion

Definiciones

El termino “peptido”, cuando se usa en el presente documento, se refiere a una molecula que comprende una secuencia de aminoacido de entre 2 y 200 aminoacidos, conectada por enlaces peptidicos, pero que puede, en realizaciones particulares, comprender estructuras no aminoaddicas (como por ejemplo un compuesto de union organico). Los peptidos segun la invencion pueden contener cualquiera de los 20 aminoacidos convencionales o versiones modificadas de los mismos, o pueden contener aminoacidos de origen no natural incorporados por smtesis peptidica qmmica o por modificacion qmmica o enzimatica.

El termino “epftopo”, cuando se usa en el presente documento, se refiere a una o a varias partes (que pueden definir un epftopo conformacional) de una o mas protemas que se reconocen espedficamente y se unen mediante un anticuerpo o una parte del mismo (Fab', Fab2l, etc.) o un receptor presentado en la superficie celular de un linfocito de celula B o T, y que es capaz, mediante esta union, de inducir una respuesta inmunitaria.

El termino “antigeno”, cuando se usa en el presente documento, se refiere a una estructura de una macromolecula que comprende uno o mas haptenos (que provocan una respuesta inmunitaria solamente cuando se unen a un transportador) y/o que comprende uno mas epftopos de celulas T.

Tfpicamente, la macromolecula es una protema o un peptido (con o sin polisacaridos) o una molecula de composicion proteica y que comprende uno o mas epftopos; en el presente documento, como alternativa, la macromolecula puede denominarse “protema antigenica” o “peptido antigenico”.

Las expresiones “aloantigeno” o “antigeno de aloinjerto”, cuando se usan en el presente documento, se refiere a un antigeno procedente (liberado de y/o presentado en) una celula o tejido, que cuando se transfiere de un donante a un receptor, puede reconocerse y unirse mediante un anticuerpo o receptor de celulas B o T del receptor. Los alogenos son tipicamente productos de genes polimorficos. Un aloantigeno es una protema o un peptido que, cuando se compara entre un donante y un receptor (pertenecientes a la misma especie), muestra ligeras diferencias estructurales. La presencia de dicho antigeno donante en el organismo de un receptor puede provocar una respuesta inmunitaria en el receptor. Dicha respuesta inmunitaria alorreactiva es espedfica para el aloantigeno.

La expresion aloantigeno tambien incluye antigenos procedentes (liberados de y/o presentados en) un injerto transferido de un donante a un receptor, cuyos antigenos estan ausentes en el receptor.

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El termino “alorreactividad”, cuando se usa en el presente documento, se refiere a una respuesta inmunitaria que se dirige contra diferencias alelicas entre el receptor y el donante del injerto. La alorreactividad se aplica a anticuerpos y a celulas T.

La presente invencion se basa en la alorreactividad de celulas T, que esta basada en el reconocimiento de celulas T de aloantigenos presentados en el contexto de determinates de MHC como complejos peptido-MHC.

El termino “aloinjerto”, cuando se usa en el presente documento, se refiere a cualquier celula o grupo de celulas, que se organiza o no en un organo o parte de un organo, que se extrae de un donante y se transfiere, se injerta o trasplanta a/en un receptor perteneciente a la misma especie que la del donante.

Los terminos “donante” y “receptor” se refieren respectivamente al individuo que proporciona un injerto y al individuo que recibe este mismo injerto. Estos individuos son mairnferos, en particular primates o seres humanos. Tfpicamente los donantes y los receptores son individuos diferentes que pertenecen a la misma especie.

La expresion “rechazo de aloinjerto”, cuando se usa en el presente documento, se refiere a cualquier mecanismo mediante el cual el sistema inmunitario del receptor reacciona contra el aloinjerto (es decir, es alorreactivo) y por lo tanto destruye gradualmente la integridad y/o funcionalidad del aloinjerto.

La expresion “epftopo de celula T”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a un epftopo de celula T dominante, subdominante o secundario, es decir, una parte de una protema antigenica que esta reconocida espedficamente y unida mediante un receptor en la superficie celular de un linfocito T.

El que un epftopo sea dominante, subdominante o secundario depende de la reaccion inmunitaria provocada contra el epftopo. La dominancia depende de la frecuencia a la cual dichos epftopos son reconocidos por celulas T y que tienen la capacidad de activarlos, entre todos los posibles epftopos de celulas T de una protema. En particular, un epftopo de celula T es un epftopo unido por moleculas de MHC de clase I o de MHC de clase II.

El termino el termino “MHC” se refiere a “complejo principal de histocompatibilidad”. En seres humanos, los genes de MHC se conocen como genes de HLA (“antfgeno leucocitario humano”).

Aunque no hay una convencion seguida sistematicamente, alguna bibliograffa utiliza “HLA” para referirse a moleculas de protemas HLA, y “MHC” para referirse a los genes que codifican las protemas HLA. Como tales, los terminos “MHC” y “HLA” son equivalentes cuando se usan en el presente documento. El sistema HLA en el hombre tiene sus equivalentes en el raton, es decir, el sistema H2. Los genes de HLA mas intensamente estudiados son los nueve genes de MHC clasicos denominados: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA1, HLADPB1, HLA-DQA1, HLA- DQB1, HLA-DRA y HLA-DRB1. En seres humanos, el MHC se divide en tres regiones: clase I, II y III. Los genes A, B y C pertenecen al MHC de clase I, mientras que los seis genes D pertenecen a la clase II. Las moleculas de MHC de clase I estan constituidas por una sola cadena polimorfica que contiene 3 dominios (alfa 1, 2 y 3), que se asocia a la beta 2 microglobulina en la superficie celular. Las moleculas de clase II estan constituidas por dos cadenas polimorficas, conteniendo cada una de ellas 2 cadenas (alfa 1 y 2, y beta 1 y 2).

Las moleculas de MHC de clase I se expresan practicamente en todas las celulas nucleadas. Los fragmentos peptfdicos presentados en el contexto de las moleculas de MHC de clase I se reconocen por linfocitos T CD8+ (linfocitos T citotoxicos o CTL). Los linfocitos T CD8+ frecuentemente maduran en efectores citotoxicos que pueden lisar celulas portadoras del antfgeno estimulador. Las moleculas de MHC de clase II se expresan principalmente en linfocitos activados y en celulas presentadoras de antfgeno. Los linfocitos T CD4+ (linfocitos T auxiliares o HTL, helper T lymphocytes) se activan con el reconocimiento de un unico fragmento peptfdico presentado por una molecula de MHC de clase II, normalmente encontrada en una celula presentadora de antfgeno como un macrofago o celula dendrftica. Los linfocitos T CD4+ proliferan y secretan citocinas que dan soporte a una respuesta mediada por anticuerpos a traves de la produccion de IL-4 e L-10 o dan soporte a una respuesta mediada por celulas a traves de la produccion de IL-2 e IFN-gamma.

Los HLA (antfgenos leucocitarios humanos) funcionales se caracterizan por un surco de union profundo al cual se unen peptidos antigenicos, posiblemente endogenos asf como extranos. El surco se caracteriza adicionalmente por una forma bien definida y por propiedades ffsico-qmmicas. Los sitios de union al HLA de clase I estan cerrados, ya que las partes terminales del peptido estan inmovilizadas en los extremos del surco. Estos tambien estan implicados en una red de enlaces de hidrogeno con restos de HLA conservados. A la vista de estas restricciones, la longitud de los peptidos unidos esta limitada a 8-10 restos. Sin embargo, se ha demostrado que tambien pueden unirse peptidos de hasta 12 restos de aminoacido al HLA de clase I. La superposicion de las estructuras de diferentes complejos de HLA confirmo un modo de union general en el que los peptidos adoptan una conformacion extendida, relativamente lineal.

A diferencia de los sitios de union del HLA de clase I, los sitios de la clase II estan abiertos en ambos extremos. Esto permite a los peptidos extenderse desde la region real de union, por lo tanto “colgando” en ambos extremos. Los HLA de clase II pueden, por tanto, unir ligandos peptfdicos de longitud variable, que vana de 9 a mas de 25 restos de aminoacido. Similar al HLA de clase I, la afinidad de un ligando de clase II, se determina por un componente “constante” y uno “variable”. La parte constante de nuevo resulta de una red de enlaces de hidrogeno formada entre restos conservados en el surco de HLA de clase II y la cadena principal de un peptido unido. Sin embargo, este

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patron de enlace de hidrogeno no esta confinado a los restos N y C terminales del peptido sino que esta distribuido en toda la cadena. Esto ultimo es importante porque restringe la conformacion de peptidos formando complejo a un modo de union estrictamente lineal. Esto es habitual en todos los alotipos de clase II. El segundo componente determinante de la afinidad de union de un peptido es variable debido a determinadas posiciones de polimorfismo dentro de sitios de union de clase II. Diferentes alotipos forman diferentes bolsillos complementarios dentro del surco, representando por tanto una seleccion de peptidos dependientes de subtipo, o de especificidad. Cabe destacar que, las limitaciones en los restos de aminoacidos mantenidas dentro de bolsillos de clase II son en general mas “flexibles” que las de la clase I. Hay mucha mas reactividad cruzada de peptidos entre diferentes alotipos de HLA de clase II. La secuencia de los +/- 9 aminoacidos de un epftopo de celula T del MHC de clase II que encaja en el surco de la molecula de MHC II normalmente se numera de P1 a P9. Los aminoacidos N terminales adicionales del epftopo se numeran P-1, P-2 y asf sucesivamente, los aminoacidos C terminales del epftopo se enumeran P+1, P+2 y asf sucesivamente.

La expresion “antigeno de histocompatibilidad secundario” se refiere a peptidos que proceden de protemas celulares normales y que estan presentados por el MHC que pertenece a los complejos de clase I y/o de clase II. Cualquier polimorfismo genetico que afecte cualitativa o cuantitativamente a la presentacion de dichos peptidos en la superficie celular puede dar lugar a un antigeno de histocompatibilidad secundario.

La expresion “compuesto organico que tiene una actividad reductora” cuando se usa en el presente documento, se refiere a compuestos, mas en particular a secuencias de aminoacidos, capaces de reducir enlaces disulfuro en protemas. Un termino alternativamente utilizado paras estas secuencias de aminoacidos es “motivo redox”.

La expresion “cantidad terapeuticamente eficaz” se refiere a una cantidad del peptido de la invencion o derivado del mismo, que produce el efecto terapeutico o preventivo deseado en un paciente.

Por ejemplo, en referencia a una enfermedad o a un trastorno, esta es la cantidad que reduce a algun grado uno o mas smtomas de la enfermedad o del trastorno, y mas particularmente retorna a parametros fisiologicos o bioqmmicos normales, bien parcial o completamente, asociados con o causantes de la enfermedad o trastorno. Segun una realizacion particular de la presente invencion, la cantidad terapeuticamente eficaz es la cantidad del peptido de la invencion o derivado del mismo, que conducina a una mejora o restablecimiento de la situacion fisiologica normal. Por ejemplo, cuando se usa para tratar terapeuticamente a un mairtifero que padece un trastorno inmunitario, esta es una cantidad diaria de peptido/kg de peso corporal de dicho mamfero. Como alternativa, cuando la administracion es mediante terapia genica, la cantidad de aDn desnudo o de vectores vfticos se ajusta para garantizar la produccion local de la dosificacion del peptido de la invencion, derivado u homologo del mismo en cuestion.

El termino “natural”, cuando se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia relacionada con el hecho de que la secuencia es identica a una secuencia de origen natural.

A diferencia de este el termino “artificial” se refiere a una secuencia que, como tal, no se produce en la naturaleza. A menos que se especifique de otra manera, los terminos natural y artificial por tanto se refieren exclusivamente a una secuencia de aminoacidos (o de nucleotidos) particular (por ejemplo, la secuencia del peptido inmunogenico, una secuencia comprendida dentro del peptido inmunogenico, una secuencia epitopica) y no se refieren a la naturaleza del peptido inmunogenico como tal.

Opcionalmente, una secuencia artificial se obtiene a partir de una secuencia natural mediante modificaciones limitadas tales como cambiando uno o mas aminoacidos dentro de la secuencia de origen natural o anadiendo aminoacidos N o C terminales de una secuencia de origen natural. En el presente documento los aminoacidos se denominan con su nombre completo, con su abreviatura de tres letras o de una sola letra.

En el presente documento, los motivos de las secuencias de aminoacidos se escriben segun el formato de Prosite. El sfmbolo X se utiliza para una posicion en la que se acepta cualquier aminoacido.

Las alternativas se indican listando los aminoacidos aceptables para una determinada posicion entre corchetes ('[ ]'). Por ejemplo: [CST] representa un aminoacido seleccionado de Cys, Ser o Thr. Los aminoacidos que se excluyen como alternativas se indican listandolos entre llaves ('{ }'). Por ejemplo: {AM} representa cualquier aminoacido excepto Ala y Met. Los diferentes elementos en un motivo estan separados entre sf por un guion -. La repeticion de un elemento identico dentro de un motivo puede indicarse colocando detras de ese elemento un valor numerico o un intervalo numerico entre parentesis. Por ejemplo: X(2) corresponde a X-X, X(2,4) corresponde a X-X o X- X-X o X-X- X-X, A(3) corresponde a A-A-A.

El termino “homologo”, cuando se usa en el presente documento con referencia a los epftopos usados en el contexto de la invencion, se refiere a moleculas que tiene al menos 50 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % de identidad de secuencia de aminoacidos con el epftopo de origen natural, manteniendo por lo tanto la capacidad del epftopo para unirse a un anticuerpo o a un receptor de superficie celular de una celula B y/o T. Las realizaciones particulares de homologos de un epftopo corresponden al epftopo natural modificado en, a lo sumo tres, mas particularmente en, a lo sumo dos, mas particularmente, en un aminoacido.

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El termino “derivado”, cuando se usa en el presente documento con referencia a los peptidos de la invencion, se refiere a moleculas que contienen al menos la parte activa del peptido (es decir, capaz de provocar actividad de celulas T CD4+ citolftica) y, ademas de esto, comprende una parte complementaria que puede tener diferentes fines, tales como estabilizar los peptidos o alterar las propiedades farmacocineticas o farmacodinamicas del peptido.

La expresion “identidad de secuencia” de dos secuencias, cuando se usa en el presente documento, se refiere al numero de posiciones con identicos nucleotidos o aminoacidos dividido entre el numero de nucleotidos o aminoacidos en la mas corta de las secuencias, cuando las dos secuencias se alinean. En realizaciones particulares, dicha identidad de secuencia es de 70 % a 80 %, de 81 % a 85 %, de 86 % a 90 %, de 91 % a 95 %, de 96% a 100%, o de 100%.

Las expresiones “polinucleotido que codifica un peptido (o acido nucleico)” y “peptido que codifica un polinucleotido (o acido nucleico)”, cuando se usan en el presente documento, se refieren a una secuencia de nucleotidos que, cuando se expresa en un entorno apropiado, da como resultado la generacion de la secuencia peptfdica relevante o un derivado u homologo de la misma. Dichos polinucleotidos o acidos nucleicos incluyen las secuencias normales que codifican el peptido, asf como derivados y fragmentos de estos acidos nucleicos capaces de expresar un peptido con la actividad requerida. Un acido nucleico que codifica los peptidos segun la invencion o fragmentos del mismo es una secuencia que codifica el peptido o fragmento del mismo que se origina de un mairnfero o que corresponde a un mairnfero, mas particularmente un fragmento peptfdico humano.

Descripcion detallada

En el trabajo que conduce a la presente invencion, inicialmente se observo que, en uno de los modelos mas estudiados de rechazo de injerto, dicho rechazo podna prevenirse inmunizando previamente al individuo receptor (singenico con el individuo donante), con un peptido inmunogenico, sin requerir inmunosupresion. El peptido inmunogenico capaz de garantizar este efecto es un peptido que comprende un solo epftopo de celula T procedente de una protema antigenica de aloinjerto, ligado a un motivo redox tal como C-(X)2-C. Claramente esta observacion abre una nueva via de posibilidades para prevenir y/o tratar el rechazo de aloinjerto en un receptor y/o para acondicionar el sistema inmunitario del receptor de tal manera que el riesgo o la probabilidad del rechazo de aloinjerto se reduzca o disminuya significativamente, o incluso se elimine por completo.

En el presente documento se desvela el uso de al menos un peptido inmunogenico aislado segun la invencion para prevenir o tratar en un receptor mairnfero, el rechazo de un aloinjerto. Mas particularmente la invencion se refiere al uso de un peptido inmunogenico que comprende (i) un epftopo de celula T procedente de una protema aloantigenica de un aloinjerto de un mairnfero y (ii) un motivo C-(X)2-[CST] o [CSI]-(X)2-C, para la preparacion de un medicamento para la prevencion o el tratamiento en un receptor de mairnfero, del rechazo del aloinjerto. Por tanto, el peptido inmunogenico o el medicamento que lo comprende puede utilizarse para tratamiento previo o profilactico o inmunizacion de un receptor de un aloinjerto para suprimir, evitar, reducir parcial o totalmente, o eliminar (parcial o totalmente) el rechazo (agudo o cronico) del aloinjerto posteriormente transferido. Del mismo modo, el peptido inmunogenico o el medicamento que lo comprende puede utilizarse para el tratamiento terapeutico o inmunizacion de un receptor de un aloinjerto para suprimir, reducir parcial o totalmente, o eliminar (parcial o totalmente) el avance del rechazo, tal como rechazo cronico, de dicho aloinjerto.

Adicionalmente se observo que las celulas T CD4+, en particular celulas T efectoras CD4+ y celulas T CD8+ del individuo pretratado o preinmunizado con el peptido inmunogenico que comprende el epftopo de celula T de aloinjerto modificado como se describe anteriormente, no se activaban tras recibir el aloinjerto efectivo. En contra de ello, se indujo una poblacion de celulas T reguladoras (Tregs) CD4+ que presentaba citotoxicidad contra celulas presentadoras de anrtgeno (CPA) que presentan un aloanrtgeno procedente del aloinjerto.

Por tanto, se desvela el uso de al menos un peptido inmunogenico aislado segun la invencion para prevenir la activacion de celulas T efectoras CD4+ de un receptor de un aloinjerto causada por una protema aloantigenica procedente del aloinjerto. Por consiguiente, la invencion se refiere al uso de peptidos inmunogenicos que comprenden (i) un epftopo de celula T procedente de una protema aloantigenica de un aloinjerto y (ii) un motivo C- (X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C para la preparacion de un medicamento para la prevencion de la activacion de celulas T efectoras Cd4+ de un receptor mediante una protema aloantigenica procedente de dicho aloinjerto.

Adicionalmente se desvela el uso de al menos un peptido inmunogenico aislado para inducir en un receptor de un aloinjerto celulas T reguladoras CD4+ que son citotoxicas a celulas que presentan una protema aloantigenica procedente del aloinjerto. Mas particularmente se desvela el uso de un peptido inmunogenico segun la invencion que comprende (i) un epftopo de celula T procedente de una protema aloantigenica de un aloinjerto y (ii) un motivo C- (X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C, para la preparacion de un medicamento para inducir en un receptor celulas T reguladoras cD4+ que son citotoxicas a celulas que presentan una protema aloantigenica procedente del aloinjerto.

Adicionalmente la divulgacion incluye el uso de al menos un peptido inmunogenico aislado segun la invencion que comprende (i) un epftopo de celula T procedente de una protema aloantigenica de un aloinjerto y (ii) el motivo C- (X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C para la preparacion de un medicamento para la prevencion de la activacion de celulas T

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efectoras CD8+ de un receptor mediante una protema aloantigenica procedente de dicho aloinjerto.

En lo anterior, el peptido inmunogenico o el medicamento que lo comprende, puede utilizarse para el tratamiento previo o profilactico o inmunizacion de un receptor de un aloinjerto para suprimir, prevenir, reducir parcial o totalmente o eliminar (parcial o totalmente) una activacion normalmente esperada en el receptor de celulas T efectoras CD4+ y/o celulas T CD8+ despues de, o posterior a, la transferencia efectiva del aloinjerto. Probablemente, dicho peptido inmunogenico o el medicamento que lo comprende puede utilizarse para el tratamiento terapeutico o inmunizacion de un receptor de un aloinjerto para suprimir, reducir parcial o totalmente, o eliminar (parcial o totalmente) la activacion en el receptor de celulas T efectoras CD4+ y/o celulas T CD8+ simultaneamente con o despues de la transferencia efectiva del aloinjerto. Como alternativa, o simultaneamente con cualquiera de lo anterior, dicho peptido inmunogenico o medicamento que lo comprende puede utilizarse para el tratamiento previo o profilactico o inmunizacion de un receptor de un aloinjerto para inducir una activacion normalmente inesperada en el receptor de celulas T reguladoras CD4+ espedficas de aloinjerto capaces de destruir celulas que presentan uno o mas aloantfgenos despues de, o posterior a, la transferencia efectiva del aloinjerto. Del mismo modo, dicho peptido inmunogenico o medicamento que lo comprende puede utilizarse para el tratamiento terapeutico o inmunizacion de un receptor de un aloinjerto para inducir activacion en el receptor de celulas T

reguladoras CD4+ espedficas de aloinjerto capaces de destruir celulas que presentan uno o mas aloantfgenos.

Dicha induccion puede ocurrir de manera simultanea con, o despues de, la transferencia efectiva del aloinjerto.

En cualquiera de los usos descritos anteriormente en el presente documento, el receptor es un mairnfero, en particular un primate (no humano) o un ser humano.

En realizaciones particulares con respecto a lo anterior, el aloinjerto es un injerto de organo solido o un injerto celular. Los injertos de organos solidos incluyen rinones, pulmones, corazones, hugado, pancreas, huesos, piel o tejidos blandos. Los injertos celulares incluyen, por ejemplo, un injerto de medula osea, injerto de celulas sangumeas del cordon umbilical, injerto de celulas madre, injerto de celulas de islote pancreatico, o trasfusion de celulas sangumeas (en particular en vista de posibles reacciones inmunitarias hacia granulocitos).

En otras realizaciones particulares de cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, dicha protema aloantigenica se selecciona del grupo de antfgenos de histocompatibilidad secundarios, antfgenos de histocompatibilidad principales o antfgenos espedficos de tejido. Cuando la protema aloantigenica es un antfgeno de histocompatibilidad principal, este es bien un antfgeno de MHC de clase I o un antfgeno de MHC de clase II. Un importante punto a tener en cuenta es la variabilidad de los mecanismos mediante los cuales las celulas T

espedficas de aloantfgeno reconocen peptidos afines en la superficie de CPA. Como se ha indicado anteriormente

(vease Antecedentes de la invencion), las celulas T aloreactivas pueden reconocer bien determinantes aloantigenicos de la propia molecula de MHC, un peptido aloantigenico unido a una molecula de MHC de cualquier fuente autogenica o alogenica, o una combinacion de restos localizados dentro del peptido procedente del aloantfgeno y la molecula de MHC, siendo la ultima de origen autogenico o alogenico. Esto contrasta con la situacion encontrada con respuestas inmunitarias hacia antfgenos nominales, en la que las celulas T estan activadas uniendose a determinantes localizados dentro tanto del peptido de fuente alogenica como de la propia molecula de MHC (respuestas convencionales) o uniendose a determinantes que estan localizados tanto en un peptido autoderivado como en una propia molecula de MHC (como se observa en las respuestas autoinmunitarias).

Segun la presente invencion, los peptidos aloantigenicos acoplados a un motivo redox se utilizan para reducir el rechazo de aloinjerto. Estos peptidos son peptidos que pueden presentarse bien por determinantes alogenicos de MHC (denominados ruta directa de alorreconocimiento) o mediante propias moleculas de MHC (denominados ruta indirecta de alorreconocimiento). Los mecanismos subyacentes de la presente invencion implican peptidos aloantigenicos (incluyendo peptidos aloantigenicos procedentes de moleculas de MHC de clase I y de clase II) que se presentan por determinantes de MHC de clase II de fuente alogenica o autogenica. Por consiguiente, dado que esto no requiere necesariamente que las celulas T alorreactivas reconozcan determinantes localizados tanto en el peptido aloantigenico como en la molecula de MHC, los peptidos aloantigenicos pueden seleccionarse independientemente.

Segun realizaciones particulares, los peptidos alogenicos son peptidos obtenidos de antfgenos de histocompatibilidad secundarios.

En la tecnica se conocen metodos para identificar peptidos alogenicos adecuados a partir de antfgenos de histocompatibilidad secundarios. Por ejemplo estos pueden obtenerse directamente por elucion de CPA y ensayando su capacidad para activar celulas T CD4+. La fuente de dichas celulas T es de donantes que se han sensibilizado a los antfgenos de histocompatibilidad secundarios bien por trasfusion de sangre o celulas, gestacion o por exposicion a injertos tisulares que expresan los antfgenos de histocompatibilidad secundarios. Las celulas T espedficas pueden ser policlonales, oligoclonales o monoclonales y pueden utilizarse en un ensayo de proliferacion de celulas T adecuado descrito mas adelante.

Son ejemplos de antfgenos de histocompatibilidad secundarios los procedentes de protemas codificadas por el cromosoma HY (antfgenos H-Y). Otros ejemplos pueden encontrarse, por ejemplo, en Goulmy E, Current Opinion in

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Immunology, vol 8, 75-81, 1996 (vease, en particular, la Tabla 3 del mismo); Ha de observarse que, en el hombre, muchos antigenos de histocompatibilidad principales se han detectado a traves de su presentacion en determinates de MHC de clase I utilizando celulas T CD8+ citolfticas. Sin embargo, dichos peptidos se obtienen del procesamiento de protemas que tambien contienen epftopos de celulas T restringidos al MHC de clase II, proporcionando de este modo la posibilidad de disenar los peptidos de la presente invencion.

En otras realizaciones particulares, el peptido alogenico es un aloantigeno espedfico de tejido. Los aloantfgenos espedficos de tejido pueden identificarse utilizando el mismo procedimiento. Un ejemplo de esto es el epftopo restringido a MHC de clase I procedente de una protema expresada en rinones pero no en bazo y capaz de provocar celulas T CD8+ con actividad citotoxica sobre las celulas renales (Poindexter et al, Journal of Immunology, 154: 3880-3887, 1995).

En otras realizaciones particulares, el peptido alogenico es un aloantfgeno de MHC. Se encuentran ejemplos de peptidos que incluyen epftopos de celulas T de MHC de clase II procedentes de antigenos de MHC de clase II en Benichou et al, Journal of Experimental Medicine, 175: 305-308, 1192 y en Liu et al, Journal of Immunology, 150: 3180-3186, 1993. En Tam et al, Journal of Immunology, 156: 3765-3771, 1996 se describen peptidos procedentes de antfgenos de MHC de clase I y presentados por antfgenos de MHC de clase II

Las celulas T reguladoras citotoxicas provocadas por los peptidos inmunogenicos de la presente invencion pueden suprimir respuestas inmunitarias incluso contra aloantfgenos complejos. Un requisito mmimo para que dichas celulas se activen es reconocer un peptido afrn presentado por determinantes de MHC de clase II, lo que conduce a la apoptosis de la CPA, por lo tanto suprimiendo las respuestas de celulas T (celulas T tanto CD4+ como CD8+) en todos los epftopos de celulas T presentados por la CPA. Un mecanismo adicional mediante el cual celulas T reguladoras citotoxicas pueden suprimir la respuesta inmunitaria global hacia antfgenos complejos es suprimiendo la activacion de celulas T espectadoras.

En algunas situaciones, en el proceso de rechazo participa mas de un aloantfgeno. En dichas circunstancias, la misma CPA puede no presentar todos los aloantfgenos relevantes, ya que algunos de dichos aloantfgenos se liberan del injerto y son captados por CPA posiblemente diferentes. Por lo tanto se espera que la combinacion de dos o mas peptidos inmunogenicos procedentes del mismo aloantfgeno o de diferentes aloantfgenos pueda utilizarse para la prevencion y el tratamiento del rechazo de injerto.

Un aspecto adicional de la invencion se refiere a usos y a metodos, como se describe anteriormente en el presente documento, en el que el peptido inmunogenico se reemplaza por celulas T reguladoras CD4+ sensibilizadas con el peptido inmunogenico, o por una secuencia de nucleotidos que codifica el peptido inmunogenico (por ejemplo, en forma de ADN desnudo o de un vector vftico que va a administrarse a un individuo en lugar del peptido inmunogenico). Ademas, en cualquiera de lo anterior, puede utilizarse una combinacion de multiples peptidos inmunogenicos, es decir, mas de 1 (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas). Estos aspectos de la invencion, asf como la modificacion adicional del peptido inmunogenico, se describen con detalle en lo sucesivo el presente documento.

La presente invencion se basa en el hallazgo de que un peptido inmunogenico, que comprende un epftopo de celula T procedente de un aloantfgeno y una secuencia peptfdica que tiene actividad reductora, puede generar una poblacion de celulas T reguladoras CD4+, que tiene un efecto citotoxico sobre celulas presentadoras de antfgeno. Esta se basa adicionalmente en el hallazgo de que dicho peptido inmunogenico es capaz de prevenir la activacion de celulas T CD8+ espedficas de aloantfgeno y/o de celulas T efectoras CD4+.

Por consiguiente, se desvelan peptidos inmunogenicos que comprende al menos un epftopo de celula T de un aloantfgeno con un potencial para desencadenar una respuesta inmunitaria, acoplado a un compuesto organico que tiene una actividad reductora, tal como un peptido con un motivo de secuencia tiorreductasa. El epftopo de celula T y el compuesto organico estan, opcionalmente, separador mediante un enlazador (por ejemplo, una molecula espaciadora organica o una secuencia peptfdica). En realizaciones opcionales adicionales, el peptido inmunogenico comprende adicionalmente una secuencia de direccionamiento a endosoma (por ejemplo, secuencia de direccionamiento a endosoma tardfo) y/o secuencias “flanqueantes” adicionales.

Estos peptidos inmunogenicos pueden representarse esquematicamente como A-L B o B-L-A, donde A representa un epftopo de celula T de un (auto o no auto) antfgeno, con potencial para desencadenar una reaccion inmunitaria, L representa un enlazador y B representa un compuesto organico que tiene una actividad reductora.

La actividad reductora de un compuesto organico puede ensayarse con respecto a su capacidad para reducir un grupo sulfhidrilo tal como en el ensayo de solubilidad de insulina conocido en la tecnica, en el que la solubilidad de la insulina se altera despues de la reduccion, o con una insulina marcada con fluorescencia. El compuesto organico reductor puede acoplarse en el lado amino terminal del epftopo de celula T o en el carboxilo terminal del epftopo de celula T.

Generalmente, el compuesto organico con actividad reductora es un peptido. Los fragmentos peptfdicos con

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actividad reductora se encuentran en tiorreductasas que son pequenas enzimas reductoras de disulfuro que incluyen glutarredoxinas, nucleorredoxinas, tiorredoxinas y otras oxidorreductasas de tiol/disulfuro. Estos ejercen actividad reductora para enlaces disulfuro en protemas (tales como enzimas) a traves de cistemas activas redox dentro de secuencias consenso de dominio activo conservadas: X(2)-C, C-X(2)-S, C-X(2)-T, S-X(2)-C, T-X(2)-C (Fomenko et al. (2003) Biochemistry 42, 11214-11225), en las que X representa cualquier aminoacido. Dichos dominios tambien se encuentran en protemas mas grandes tales como disulfuro isomerasa protema (PDI) y fosfolipasa C espedfica de fosfoinositida.

Por consiguiente, en realizaciones particulares, los peptidos inmunogenicos para su uso segun la presente invencion comprenden como motivo redox el motivo de secuencia de tiorreductasa C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C. En una realizacion adicional el motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C se posiciona en el extremo N del epftopo de celula T. En la presente solicitud, dicho tetrapeptido se denominara “el motivo”. En realizaciones particulares, los peptidos de la invencion contienen el motivo de secuencia C-X(2)-[CS] o [CS]-X(2)-C. En realizaciones mas particulares los peptidos contienen el motivo de secuencia X(2)-S, SX(2)-C o C-X(2)-C.

Como se explica con detalle mas adelante, los peptidos inmunogenicos de la presente invencion pueden prepararse mediante smtesis qmmica, lo que permite la incorporacion de aminoacidos no naturales. Por consiguiente, en el motivo de compuestos reductores segun realizaciones particulares de la presente invencion, C representa cistema u otros aminoacidos con un grupo tiol tal como mercaptovalina, homocistema u otros aminoacidos naturales o no naturales con una funcion tiol. Para tener actividad reductora, las cistemas presentes en el motivo no deben aparecer como parte de un puente disulfuro de cistema. No obstante, el motivo puede comprender cistemas modificadas, tal como cistema metilada, que se transforma en cistema con grupos tiol libres in vivo.

Cada uno de los aminoacidos X en el motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C de realizaciones particulares de los compuestos reductores de la invencion puede ser cualquier aminoacido natural, incluyendo S, C o T o puede ser un aminoacido no natural, por lo cual los dos aminoacidos X son iguales o diferentes. En realizaciones particulares X es un aminoacido con una cadena lateral pequena tal como Gly, Ala, Ser o Thr. En realizaciones particulares adicionales X no es un aminoacido con una cadena lateral voluminosa tal como Tyr. En realizaciones particulares adicionales al menos una X en el motivo [CST]-X(2)-[CST] que es His o Pro.

Por consiguiente, en los peptidos inmunogenicos de la presente invencion que comprenden el motivo (redox) descrito anteriormente, el motivo se localiza de tal manera que, cuando el epftopo se aloja en el surco del MHC, el motivo permanece fuera del surco de union del MCH. El motivo se coloca bien inmediatamente adyacente a la secuencia epitopica dentro del peptido, o esta separado del epftopo de celula T mediante un enlazador. Mas particularmente, el enlazador comprende una secuencia de aminoacidos de 7 aminoacidos o menor. Mas particularmente, el enlazador comprende 1,2, 3 o 4 aminoacidos. Como alternativa, un enlazador puede comprender 6, 8 o 10 aminoacidos. Los aminoacidos tfpicos utilizados en enlazadores son serina y treonina. Son ejemplos de peptidos con enlazadores segun la presente invencion CXXC-G-epftopo, CXXC-GG- epftopo CXXC-SSS- epftopo CXXC-SGSG- epftopo y similares.

En aquellas realizaciones particulares de los peptidos de la presente invencion, en las que la secuencia motivo sea adyacente a la secuencia epitopica, esto se indica como posicion P-4 a P-1 o P+1 a P+4 en comparacion con la secuencia epitopica. Aparte de un enlazador peptfdico pueden utilizarse otros compuestos organicos como enlazadores para enlazar entre sf las partes del peptido inmunogenico.

Los peptidos inmunogenicos de la presente invencion pueden comprender ademas secuencias de aminoacidos cortas adicionales en el extremo N o C terminal de la secuencia (artificial) que comprende el epftopo de celula T y el compuesto reductor (motivo). Dicha secuencia de aminoacidos generalmente se denomina en el presente documento “secuencia flanqueante”. Una secuencia flanqueante puede colocarse en el extremo N y/o C terminal del motivo redox y/o del epftopo de celula T en el peptido inmunogenico. Cuando el peptido inmunogenico comprende una secuencia de direccionamiento a endosoma, puede haber una secuencia flanqueante entre el epftopo y una secuencia de direccionamiento a endosoma y/o entre el compuesto reductor (por ejemplo, motivo) y una secuencia de direccionamiento a endosoma. Mas particularmente, una secuencia flanqueante es una secuencia de hasta 10 aminoacidos, o de entre 1 y 7 aminoacidos, tal como una secuencia de 2 aminoacidos.

En realizaciones particulares de la invencion, el motivo redox en el peptido inmunogenico se localiza en el extremo N terminal del epftopo.

En realizaciones particulares adicionales, cuando el motivo redox presente en el peptido inmunogenico contiene una cistema, esta cistema esta presente en el motivo en la posicion mas remota desde el epftopo, por tanto el motivo se aparece como CX(2)-[ST] o C-X(2)-S en el extremo N terminal del epftopo o aparece como [ST]-X(2)-C o S-X(2)-C en el extremo C carboxilo del epftopo.

En determinadas realizaciones de la presente invencion, se proporcionan peptidos inmunogenicos que comprenden una secuencia epitopica y una secuencia motivo. En realizaciones particulares adicionales, el motivo aparece varias veces (1, 2, 3, 4, 5 o incluso mas veces) en el peptido, por ejemplo como repeticiones del motivo que pueden

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separarse entre sf por uno o mas aminoacidos (por ejemplo, CXXC X CXXC X CXXC [SEQ ID NO: 1]), como repeticiones que son adyacentes entre sf CXXC CXXC CXXC [SEQ ID NO: 2]) o como repeticiones que se solapan entre sf CXXCXXCXXC [SEQ ID NO: 3] o CXCCXCCXCC [SeQ ID NO: 4]). Como alternativa, se proporcionan uno o mas motivos en ambos extremos N y C de la secuencia epitopica de celula T. Otras variaciones contempladas para los peptidos inmunogenicos de la presente invencion incluyen peptidos que comprenden repeticiones de una secuencia epitopica de celula T o epftopos de celulas T multiples diferentes, en las que cada epftopo esta precedido y/o seguido por el motivo (por ejemplo repeticiones de “motivo-epftopo” o repeticiones de “motivo-epftopo-motivo”). En el presente documento, todos los motivos pueden tener la misma secuencia pero esto no es obligatorio. Debe observarse que secuencias repetitivas de peptidos que comprenden un epftopo que en sf mismo comprende el motivo tambien daran como resultado una secuencia que comprende tanto el ‘epftopo’ como un 'motivo'. En dichos peptidos el motivo dentro de una secuencia epitopica funciona como un motivo fuera de una segunda secuencia epitopica. Sin embargo, en realizaciones particulares, los peptidos inmunogenicos de la presente invencion comprenden solo un epftopo de celula T.

Como se describe anteriormente, los peptidos inmunogenicos segun la invencion comprenden, ademas de un compuesto/motivo reductor, un epftopo de celula T procedente de un aloantigeno. Un epftopo de celula T en una secuencia de protema puede identificarse mediante ensayos funcionales y/o mediante uno o mas ensayos de prediccion por ordenador. Los aminoacidos en una secuencia epitopica de celula T se numeran segun su posicion en el surco de union de las protemas del MHC. En realizaciones particulares, el epftopo de celula T presente dentro de los peptidos de la invencion consta de entre 8 y 25 aminoacidos, incluso mas particularmente de entre 8 y 16 aminoacidos, incluso mas particularmente consta de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 aminoacidos. En una realizacion mas particular, el epftopo de celula T consta de una secuencia de 9 aminoacidos. En una realizacion particular adicional, el epftopo de celula T es un epftopo, que esta presentado a celulas T mediante moleculas de MHC de clase II. En realizaciones particulares de la presente invencion, la secuencia epitopica de celula T es una secuencia epitopica que se aloja en la hendidura de una protema de MHC II, mas particularmente un nonapeptido que se aloja en la hendidura del MHC II. El epftopo de celula T de los peptidos inmunogenicos de la invencion puede corresponder bien a una secuencia epitopica natural de una protema o puede ser una version modificada de la misma, siempre que el epftopo de celula T modificado conserve su capacidad para unirse dentro de la hendidura del MHC, similar a la secuencia epitopica de celula T natural.

El epftopo de celula T modificado puede tener la misma afinidad de union por la protema del MHC que el epftopo natural, pero tambien puede tener una afinidad mas baja. En realizaciones particulares la afinidad de union del peptido modificado no es menor que 10 veces menos que la del peptido original, mas particularmente no es menor que 5 veces menos. Es un descubrimiento de la presente invencion que los peptidos de la misma tengan un efecto estabilizador sobre complejos de protema. Por consiguiente, el efecto estabilizador del complejo peptido-MHC compensa la afinidad reducida del epftopo modificado por la molecula de MHC.

En realizaciones particulares, los peptidos inmunogenicos de la invencion comprenden adicionalmente una secuencia de aminoacidos (u otro compuesto organico) que facilita la captacion del peptido en endosomas (tardfos) para el procesamiento y presentacion dentro de determinantes de MHC de clase II. El direccionamiento a endosomas tardms esta mediado por senales presentes en la cola citoplasmatica de protemas y corresponde a motivos peptfdicos bien identificados tales como el motivo [DE]XXXL[LI] o DXXLL basado en dileucina (por ejemplo, DXXXLL), el motivo YXX0 basado en tirosina o el motivo denominado de agrupamiento acido. El sfmbolo 0 representa restos de aminoacido con cadenas laterales hidrofobas voluminosas, tales como Phe, Tyr y Trp. Las secuencias de direccionamiento a endosomas tardms permiten el procesamiento y la presentacion eficiente del epftopo de celula T procedente de antfgeno por moleculas de MHC de clase II. Dichas secuencias de direccionamiento a endosomas estan incluidas, por ejemplo, dentro de la protema gp75 (Vijayasaradhi et al. (1995) J Cell Biol 130, 807-820), la protema CD3 gamma humana) la HLA-BM p (Copier et al. (1996) J. Immunol. 157, 10171027), la cola citoplasmatica del receptor de DEC205 (Mahnke et al. (2000) J Cell Biol 151, 673-683). Otros ejemplos de peptidos que funcionan como senales de clasificacion en el endosoma se desvelan en la revision de Bonifacio y Traub (2003) Annu. Rev. Biochem. 72, 395-447. Como alternativa, la secuencia puede ser la de un epftopo de celula T subdominante o secundario de una protema, que facilita la captacion en el endosoma tardm sin superar la respuesta de la celula T hacia el epftopo de celula T procedente de aloantfgeno.

Los peptidos inmunogenicos de la invencion pueden generarse por acoplamiento a un motivo reductor como se describe en el presente documento, en el extremo N o C terminal a un epftopo de celula T de una protema aloantigenica (bien directamente adyacente a la misma o separada por un enlazador). Ademas, la secuencia epitopica de celula T del peptido inmunogenico y/o el motivo redox pueden modificarse y/o una o mas secuencias flanqueantes y/o una secuencia de direccionamiento pueden introducirse (o modificarse) en comparacion con la secuencia epitopica de celula T de origen natural. Por consiguiente, la secuencia resultante del peptido inmunogenico diferira en la mayona de los casos de la secuencia de la protema aloantigenica de interes. En este caso los peptidos inmunogenicos de la invencion son peptidos con una secuencia de origen no natural, “artificial”.

Los peptidos inmunogenicos de la invencion pueden variar sustancialmente en longitud, por ejemplo, de aproximadamente 12-13 aminoacidos (un epftopo de celula T de 8-9 aminoacidos y el motivo redox de 4 aminoacidos) hasta 50 o mas aminoacidos. Por ejemplo, un peptido inmunogenico segun la invencion puede comprender una secuencia de direccionamiento a endosoma de 40 aminoacidos, una secuencia flanqueante de

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aproximadamente 2 aminoacidos, un motivo como se describe en el presente documento de 4 aminoacidos, un enlazador de 4 aminoacidos y un peptido de epftopo de celula T de 9 aminoacidos. En realizaciones particulares, los peptidos inmunogenicos de la invencion constan de entre 12 aminoacidos y de 20 hasta 25, 30, 50, 75, 100 o 200 aminoacidos. En una realizacion mas particular, los peptidos constan de entre 10 y 20 aminoacidos. Mas particularmente, cuando el compuesto reductor es un motivo redox como se describe en el presente documento, la longitud del peptido inmunogenico que comprende el epftopo y el motivo opcionalmente conectado por un enlazador tiene una longitud de 19 aminoacidos o menor, por ejemplo, de 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 aminoacidos.

Como se ha detallado anteriormente, los peptidos inmunogenicos para su uso en la reduccion o prevencion de rechazo de aloinjerto segun la invencion, comprenden un motivo reductor como se describe en el presente documento, enlazado a una secuencia epitopica de celula T. Segun realizaciones particulares, los epftopos de celula T proceden de aloanrtgenos que no comprenden de manera natural una secuencia de aminoacidos con propiedades redox dentro de una secuencia de 11 aminoacidos en el extremo N o C terminal adyacente al epftopo de celula T de interes. Mas particularmente, la invencion incluye la generacion de peptidos inmunogenicos a partir de protemas aloantigenicas que no comprenden una secuencia seleccionada de C-X(2)-S, S-X(2)-C, C-X(2)-C, S-X(2)-S, C-X(2)- T, T-X(2)-C dentro de una secuencia de 11 aminoacidos en el extremo N o C terminal de la secuencia epitopica. En realizaciones particulares adicionales, la presente invencion proporciona peptidos inmunogenicos de protemas aloantigenicas para su uso en el tratamiento de rechazo de aloinjerto y para la generacion de celulas T reguladoras espedficas de anrtgeno de aloinjerto, mediante lo cual las protemas aloantigenicas no comprenden las secuencias de aminoacidos descritas anteriormente con propiedades redox dentro de su secuencia.

En realizaciones particulares adicionales, los peptidos inmunogenicos de la invencion son peptidos que comprenden epftopos de celula T que no comprenden una secuencia de aminoacidos con propiedades redox dentro de su secuencia natural. Sin embargo, en realizaciones alternativas, un epftopo de celula T que se une a la hendidura del MHC puede comprender un motivo redox tal como se describe en el presente documento dentro de su secuencia epitopica; los peptidos inmunogenicos para su uso segun la invencion que comprenden dicho epftopo de celula T deben comprender adicionalmente otro motivo redox acoplado (adyacente o separado mediante un enlazador) en el extremo N o C terminal al epftopo, de tal manera que el motivo unido pueda garantizar la actividad reductora (contrario al motivo presente en el epftopo, que se oculta dentro de la hendidura).

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a metodos para generar peptidos inmunogenicos de la presente invencion descritos en el presente documento. Dichos metodos incluyen la identificacion de epftopos de celula T en una protema aloantigenica de interes. En la tecnica se conocen sobradamente formas para la identificacion in vitro y por ordenador de epftopos de celulas T y en lo sucesivo se elaboran algunos aspectos en el presente documento. Los peptidos inmunogenicos generados se evaluan opcionalmente con respecto a su capacidad para inducir celulas T reguladoras CD4+ espedficas de aloanrtgeno que son citotoxicas para celulas que presentan (partes de) la protema aloantigenica de interes.

Los peptidos inmunogenicos segun la invencion se generan utilizando epftopos de celulas T de las protemas alogenicas de interes. Los aloanrtgenos que pueden utilizarse para la seleccion de epftopos de celula T son rtpicamente aloantigenicos, que se seleccionan del grupo que consiste en anrtgenos de MHC de clase I, anrtgenos de MHC de clase II, anrtgenos de histocompatibilidad secundarios o aloanrtgenos espedficos de tejido. En realizaciones particulares, el epftopo de celula T utilizado es un epftopo de celula T dominante.

La identificacion y seleccion de un epftopo de celula T a partir de aloanrtgenos, para su uso en el contexto de la presente invencion, implica opcionalmente uno o mas de los siguientes metodos. Por ejemplo, secuencias peprtdicas aisladas de una protema aloantigenica se someten a ensayo, por ejemplo, mediante tecnicas de biologfa de celulas T, para determinar si las secuencias peprtdicas provocan una respuesta de celula T. Aquellas secuencias peprtdicas en las que se encuentra que provocan una respuesta de celula T se definen como que tienen actividad estimuladora de celula T. La actividad estimuladora de celula T humana puede ensayarse adicionalmente cultivando celulas T obtenidas de un individuo sensibilizado contra un aloanrtgeno con un peptido/epftopo procedente del aloanrtgeno y determinando si se produce la proliferacion de celulas T en respuesta al peptido/epftopo. Esto puede medirse, por ejemplo, por captacion celular de timidina marcada con tritio. Los indices de estimulacion para respuestas por celulas T contra peptidos/epftopos pueden calcularse como la CPM maxima en respuesta a un peptido/epftopo dividido entre la CPM control. Un mdice de estimulacion (I.E.) de celulas T igual a o mayor que dos veces el nivel de fondo se considera “positivo”. Los resultados positivos se usan para calcular el mdice de estimulacion medio para cada peptido/epftopo para el grupo de peptidos/epftopos ensayado. Los epftopos de celulas T no naturales (o modificados) tambien pueden, opcionalmente, ensayarse con respecto a su capacidad de union a moleculas de MHC de clase II. La union de epftopos de celulas T no naturales (o modificados) con moleculas de MHC de clase II puede realizarse de diferentes maneras. Por ejemplo, se obtienen moleculas solubles de HLA de clase II por lisis de celulas homocigotas para una molecula de clase II determinada. Esta ultima se purifica por cromatograffa de afinidad. Las moleculas solubles de clase II se incuban con un peptido de referencia marcado con biotina producido segun su fuerte afinidad de union por esa molecula de clase II. Los peptidos a evaluar con respecto a la union a la molecula de clase II se incuban despues a diferentes concentraciones y su capacidad para desplazar el peptido de referencia de su union con la molecula de clase II se calcula anadiendo neutravidina. Pueden encontrarse metodos, por ejemplo, en Texier et al., (2000) J. Immunology 164, 3177-3184).

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Los peptidos inmunogenicos de la invencion tienen un mdice de estimulacion de celula T medio mayor que o igual a 2,0. Un peptido inmunogenico que tenga un mdice de estimulacion de celula T mayor que o igual a 2,0 se considera util como un agente profilactico o terapeutico. Mas particularmente, los peptidos inmunogenicos segun la invencion tienen un mdice de estimulacion de celula T medio de al menos 2,5, de al menos 3,5, de al menos 4,0, o incluso de al menos 5,0. Ademas, dichos peptidos tienen tfpicamente un mdice de positividad (I.P.) de al menos aproximadamente 100, de al menos 150, de al menos 200 o de al menos aproximadamente 250. El mdice de positividad de un peptido se determina multiplicando el mdice de estimulacion de celula T medio por el porcentaje de individuos, en una poblacion de individuos sensibles a un aloantfgeno (por ejemplo, al menos 9 individuos, al menos 16 individuos o al menos 20 o 30 o incluso mas), que tienen celulas T que responden al peptido (por tanto que corresponde al IE multiplicado por la naturaleza promiscua del peptido/epftopo). Por tanto, el mdice de positividad representa tanto la fuerza de una respuesta de celula T contra un peptido (I. E) como la frecuencia de una respuesta de celula T a un peptido en una poblacion de individuos sensibles a un aloantigeno. Para determinar los epftopos de celulas T optimos, por ejemplo, mediante tecnicas de mapeo adecuadas, un peptido que tenga actividad estimuladora de celula T, y por tanto que comprenda al menos un epftopo de celula T, determinado por tecnicas de biologfa de celulas T, se modifica por adicion o delecion de restos de aminoacido en el extremo N o C del peptido y se ensaya para determinar un cambio en la reactividad de la celula T con respecto al peptido modificado. Si se encuentra que dos o mas peptidos que comparten un area de solapamiento en la secuencia de protema nativa tienen actividad estimuladora de celula T humana, determino mediante tecnicas de biologfa de celulas T, pueden producirse peptidos adicionales que comprendan toda o una parte de dichos peptidos y dichos peptidos adicionales pueden ensayarse mediante un procedimiento similar. Siguiendo esta tecnica, se seleccionan peptidos y se producen de manera recombinante o sintetica. Los epftopos de celulas T o peptidos se seleccionan basandose en varios factores, incluyendo la fuerza de la respuesta de celula T contra el peptido/epftopo (es decir, mdice de estimulacion) y la frecuencia de la respuesta de celula T contra el peptido en una poblacion de individuos.

En la tecnica se conocen metodos utilizados para la identificacion de antfgenos de histocompatiblidad secundarios. Por tanto, pueden utilizarse estrategias de clonacion posicional o de clonacion de expresion para identificar antfgenos de histocompotabilidad secundarios candidatos. Para una descripcion completa de la metodologfa, vease por ejemplo Mendoza et al, Immunity, 7: 461-472, 1997. Como alternativa, los peptidos realmente presentados por CPA en moleculas bien de MHC de clase I o de clase II, pueden eluirse y separarse mediante diversos metodos de cromatograffa. Una descripcion completa de dicha metodologfa se encontrara en Scott et al, Immunity, 12: 711-720, 2000.

Los antfgenos candidatos pueden explorarse mediante uno o mas algoritmos in vitro para identificar una secuencia epitopica de celula T dentro de una protema antigenica. Los algoritmos adecuados incluyen, pero sin limitacion, los encontrados en las siguientes paginas web:

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http://antigen.i2r.a-star.edu.sg/predBalbc/:

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http://antigen.i2r.a-star.edu.sg/predBalbc/:

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http://www.imtech.res.in/raghava/mhcbn/:

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http://www.syfueithi.de/home.htm:

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http://www-bs.informatik.uni-tuebingen.de/SVMHC:

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http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/anti.genic.html:

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http://www.jenner.ac.uk/MHCPred/.

Mas particularmente, dichos algoritmos permiten la prediccion dentro de una protema antigenica de una o mas secuencias nanopeptfdicas que se alojaran en el surco de una molecula MHC II.

Los peptidos inmunogenicos de la invencion pueden producirse por expresion recombinante, por ejemplo, en celulas bacterianas (por ejemplo Escherichia coli), en celulas de levadura (por ejemplo, especies de Pichia, especies de Hansenula, especies de Saccharomyces o especies de Schizosaccharomyces), en celulas de insecto (por ejemplo de Spodoptera frugiperda o Trichoplusia ni), en celulas de plantas o de mamferos (por ejemplo, celulas CHO, celulas COS). En consecuencia, la construccion de los vectores de expresion adecuados requeridos (incluyendo informacion adicional tal como secuencias promotoras y de terminacion) implica, en otro orden de cosas, tecnicas de ADN recombinantes convencionales. Los peptidos inmunogenicos de la invencion producidos de manera recombinante pueden proceder de una protema precursora mas grande, por ejemplo, mediante escision enzimatica de sitios de escision enzimatica insertados adyacentes al extremo N y/o C del peptido inmunogenico, seguido de purificacion adecuada.

En vista de la longitud limitada de los peptidos inmunogenicos de la invencion, estos pueden prepararse por smtesis peptfdica qmmica, en la que los peptidos se preparan acoplando los diferentes aminoacidos entre sf. La smtesis qmmica es particularmente adecuada para la inclusion, por ejemplo, de D aminoacidos, aminoacidos con cadenas laterales de origen no natural o aminoacidos con cadenas laterales modificadas tales como cistema metilada. Los metodos de smtesis peptfdica qmmica se describen bien y los peptidos pueden encargarse a companfas tales como Applied Biosystems y a otras companfas. La smtesis peptfdica puede realizarse bien como smtesis peptfdica en fase solida (SPFS) o por el contrario como smtesis peptfdica en fase en solucion. Los metodos de SPFS que mejor se conocen son la smtesis qmmica en fase solida con t-Boc y Fmoc bien conocida por el experto en la materia.

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Ademas, los peptidos pueden unirse entre s^ para formar peptidos mas largos utilizando una tecnica de ligamiento (acoplamiento quimioselectivo de dos fragmentos peptidicos desprotegidos) como originalmente describe Kent (Schnolzer & Kent (1992) Int. J Pept. Protein Res. 40, 180-193) y revisan, por ejemplo, Tam et al. (2001) Biopolymers 60, 194-205. Esto proporciona el tremendo potencial para conseguir la smtesis de protemas que se encuentra mas alla del alcance de la SPFS. Muchas protemas con un tamano de 100-300 restos se han sintetizado satisfactoriamente mediante este metodo. Los peptidos sinteticos han seguido desempenando un papel crucial, incluso cada vez mayor, en los campos de investigacion de bioqmmica, farmacologfa, neurobiologfa, enzimologfa y biologfa molecular debido a los enormes avances en la SPFS.

Las propiedades ffsicas y qmmicas de un peptido inmunogenico de interes (por ejemplo solubilidad, estabilidad) se examinan para determinar si el peptido es/debe ser adecuado para su uso en composiciones terapeuticas. Tfpicamente esto se optimiza ajustando la secuencia del peptido. Opcionalmente, el peptido puede modificarse despues de su smtesis (modificaciones qmmicas por ejemplo anadiendo/delecionando grupos funcionales) utilizando tecnicas conocidas en la materia.

Por consiguiente, en un aspecto adicional mas, la presente invencion proporciona metodos para la generacion de celulas T citotoxicas espedficas de antfgeno de aloinjerto (celulas Tregs o celulas T reguladoras CD4+) in vivo o in vitro (ex vivo). En particular, se proporcionan celulas T que son citotoxicas contra cualquier celula que presente un antfgeno de aloinjerto y pueden obtenerse como una poblacion de celulas. Por consiguiente la invencion se extiende a (poblaciones de) Tregs citotoxicas espedficas de antfgeno de aloinjerto, mediante los metodos descritos en el presente documento.

En realizaciones particulares, se proporcionan metodos que comprenden el aislamiento de celulas de sangre periferica, la estimulacion de la poblacion de celulas in vitro poniendo en contacto un peptido inmunogenico segun la invencion (es decir que comprende un epttopo de celula T procedente de una protema aloantigenica) con las celulas de sangre periferica aisladas, y la expansion de la poblacion celular estimulada, mas particularmente en presencia de IL-2. Los metodos segun la invencion tienen la ventaja de que se producen cantidades mas elevadas de Tregs y que pueden generarse Tregs que son espedficas para la protema antigenica de aloinjerto (utilizando un peptido que comprenda un epftopo espedfico de antfgeno). Como alternativa, las celulas T citotoxicas espedficas de protema antigenica de aloinjerto pueden obtenerse por incubacion en presencia de CPA que presentan un peptido inmunogenico espedfico de protema antigenica de aloinjerto segun la invencion despues de transduccion o transfeccion de las CPA con una construccion genetica capaz de dirigir la expresion de dicho peptido inmunogenico. De hecho, las propias CPA pueden administrarse a un sujeto que necesite desencadenar in vivo la induccion del subconjunto beneficioso de celulas T CD4+ citotoxicas.

En una realizacion alternativa, las Tregs pueden generarse in vivo, es decir, administrando a un sujeto un peptido inmunogenico proporcionado en el presente documento, y recogiendo las Tregs generadas in vivo.

Las celulas T reguladoras espedficas de antfgeno de aloinjerto obtenibles por los metodos anteriores son de particular interes para su uso en (la preparacion de un medicamento para) la prevencion o el tratamiento en un receptor del rechazo de un aloinjerto. Para cualquiera de los usos de los peptidos inmunogenicos de la invencion descritos anteriormente, dichos peptidos pueden reemplazarse por Tregs espedficas de antfgeno de aloinjerto. Se contempla el uso de celulas tanto alogenicas como autogenicas. Cualquier metodo que comprenda administrar a un sujeto que lo necesite, las Tregs espedficas de antfgeno de aloinjerto (es decir, para la prevencion o el tratamiento de rechazo de aloinjerto) tambien se denomina en la tecnica “terapia celular adoptiva”. Dicha terapia es de interes particular en caso del tratamiento cronico de reacciones inmunitarias espedficas de aloinjerto y para la recafda de dichas reacciones. Las Tregs son cruciales en la inmunorregulacion y tienen un enorme potencial terapeutico. La eficacia de la inmunoterapia basada en Tregs depende de la especificidad Ag de las celulas T reguladoras. Ademas, el uso de Treg espedficas de Ag en oposicion a Treg expandida policlonal reduce el numero total de Treg necesario para la terapia.

se desvelan secuencias de acido nucleico que codifican los peptidos inmunogenicos de la presente invencion y metodos para su uso, por ejemplo, para expresion recombinante o en terapia genica. En particular, dichas secuencias de acido nucleico pueden expresar un peptido inmunogenico de la invencion.

Los peptidos inmunogenicos de la invencion pueden de hecho administrarse a un sujeto que lo necesite utilizando cualquier metodo de terapia genica adecuado. En cualquier uso o metodo de la invencion para el tratamiento y/o la prevencion de rechazo de aloinjerto, la inmunizacion con un peptido inmunogenico de la presente invencion puede combinarse con transferencia de celula adoptiva de (una poblacion de) Tregs espedficas para dicho peptido inmunogenico y/o con terapia genica. Cuando dicha inmunizacion, transferencia de celula adoptiva y terapia genica, se combina, puede utilizarse de manera simultanea o secuencial en cualquier combinacion posible.

En terapia genica, las moleculas de acido nucleico recombinante que codifican los peptidos inmunogenicos pueden utilizarse como ADN desnudo o en liposomas o en otros sistemas de lfpidos para el suministro a celulas diana. Otros metodos para la transferencia de aDn plasmfdico en celulas son muy conocidos por los expertos en la tecnica para su uso en terapia genica humana e implican el direccionamiento del ADN a receptores en celulas formando complejos del ADN plasirndico con protemas. En su forma mas simple, la transferencia genica puede realizarse

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inyectando simplemente pequenas cantidades de ADN en el nucleo de una celula, a traves de un proceso de microinyeccion. Una vez que se introducen los genes recombinantes en una celula, estos pueden reconocerse por los mecanismos normales de la celula para la transcripcion y traduccion, y se expresara un producto genico. Tambien se han descrito otros metodos para la introduccion de ADN en mayores cantidades de celulas. Estos metodos incluyen: transfeccion, en la que el ADN se precipita con fosfato de calcio y las celulas lo absorben por pinocitosis; electroporacion, en la que las celulas se exponen a grandes pulsos de tension para introducir orificios en la membrana); lipofeccion/fusion de liposomas, en la que el ADN se empaqueta en vesmulas lipofilas que se fusionan con una celula diana; y bombardeo con partmulas utilizando ADN unido a pequenos proyectiles. Otro metodo para la introduccion de ADN en las celulas es acoplar el ADN a protemas qmmicamente modificadas. Las protemas de adenovirus pueden desestabilizar endosomas y potenciar la captacion de ADN en las celulas. La mezcla de adenovirus con soluciones que contienen complejos de ADN, o la union de ADN con polilisina unida por enlace covalente a adenovirus utilizando agentes de reticulacion de protemas, mejora sustancialmente la captacion y expresion del gen recombinante. Tambien pueden utilizarse vectores de virus adenoasociados para el suministro de genes en celulas vasculares. Como se usa en el presente documento, “transferencia genica” significa el proceso de introducir una molecula de acido nucleico exogena en una celula, que normalmente se realiza para permitir la expresion de un producto particular codificado por el gen. Dicho producto puede incluir una protema, un polipeptido, aDn o ARN antisentido, o ARN enzimaticamente activo. La transferencia genica puede realizarse en celulas cultivadas o por administracion directa en mairnferos. Tambien se proporciona un vector que comprende una secuencia de una molecula de acido nucleico que codifica un peptido inmunogenico segun la invencion. En particular el vector se genera de tal manera que la secuencia de la molecula de acido nucleico se expresa unicamente en un tejido espedfico. En la tecnica se conocen bien metodos para conseguir expresion genica espedfica de tejido, por ejemplo, colocando la secuencia que codifica un peptido inmunogenico de la invencion bajo el control de un promotor, que dirige la expresion del peptido espedficamente en uno o mas tejidos u organos. Los vectores de expresion procedentes de virus, tales como retrovirus, virus de la vacuna, adenovirus, virus adenoasociados, herpes virus, virus de ARN o virus de papiloma bovino, pueden utilizarse para el suministro de peptidos que codifican secuencias de nucleotidos (por ejemplo, ADNc), homologos o sus derivados en la poblacion de celulas o tejidos diana. Los expertos en la tecnica conocen bien metodos que pueden utilizarse para construir vectores de virus recombinantes que contengan dichas secuencias codificantes. Como alternativa, en terapia genica, pueden utilizarse celulas modificadas tecnicamente que contienen una molecula de acido nucleico que codifica un peptido inmunogenico segun la invencion.

Cuando la administracion de uno o mas peptidos segun la invencion se garantiza a traves de transferencia genica (es decir la administracion de un acido nucleico que garantice la expresion de los peptidos segun la invencion in vivo despues de la administracion), la dosificacion apropiada del acido nucleico puede determinarse basandose en la cantidad del peptido expresado como resultado del acido nucleico introducido.

Segun la presente invencion se contemplan medicamentos para su uso en el tratamiento y/o prevencion de rechazo de aloinjerto. El medicamento de la invencion es normalmente, aunque no necesariamente, una formulacion (farmaceutica) que comprende, como principio activo, al menos uno de los peptidos inmunogenicos de la invencion, una (poblacion de) Tregs espedfica para dicho peptido inmunogenico o un vector terapeutico genico capaz de expresar dicho peptido inmunogenico. Aparte del principio (o principios) activo, dicha formulacion comprendera al menos uno de un diluyente, transportador o adyuvante (farmaceuticamente aceptable). Tfpicamente, los compuestos farmaceuticamente aceptables (tales como diluyentes, transportadores y adyuvantes) pueden encontrarse, por ejemplo, en un manual de Farmacopea (por ejemplo, Farmacopea de Estados Unidos, Europea o Internacional). El medicamento o la composicion farmaceutica de la invencion normalmente comprenden una cantidad (profilactica o terapeuticamente) eficaz del principio (o principios) activo, en el que la eficacia es con respecto a la afeccion o trastorno a prevenir o tratar. En particular, las composiciones farmaceuticas de la invencion son vacunas para aplicacion profilactica o terapeutica.

Puede ser necesario que el medicamento o la composicion farmaceutica de la invencion se administren a un sujeto que lo necesite como parte de un regimen profilactico o terapeutico que comprende multiples administraciones de dicho medicamento o composicion. Dichas administraciones multiples normalmente se producen de una manera secuencial y el intervalo de tiempo entre dos administraciones puede variar y se ajustara a la naturaleza del principio activo y a la naturaleza de la afeccion a prevenir o tratar. La cantidad de principio activo proporcionada a un sujeto que lo necesite, en una sola administracion, tambien puede variar y dependera de factores tales como el estado ffsico del sujeto (por ejemplo, el peso, la edad), el estado de la afeccion que vaya a prevenirse o a tratarse y la experiencia del medico, del especialista o del personal de enfermena que este tratando al paciente.

El termino “diluyentes” se refiere, por ejemplo, a soluciones salinas fisiologicas. El termino “adyuvante” normalmente se refiere a un agente farmacologico o inmunologico que modifica (preferentemente aumenta) el efecto de otros agentes (por ejemplo, farmacos, vacunas) aunque tiene escasos, si tuviese algunos, efectos directos cuando se proporcionan por sf mismos. Como un ejemplo de un adyuvante se da el hidroxido de aluminio (alumbre), al cual puede adsorberse un peptido inmunogenico de la invencion. Adicionalmente, en la tecnica se conocen muchos otros adyuvantes y pueden utilizarse siempre que faciliten la presentacion del peptido en la presentacion de MHC de clase II y activacion de celulas T. La expresion “transportador farmaceuticamente aceptable” significa cualquier material o sustancia con el que se formula el principio activo para facilitar su aplicacion o diseminacion en el lugar a tratar, por

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ejemplo disolviendo, dispersando o difundiendo dicha composicion, y/o para facilitar su conservacion, transporte o manipulacion sin influir en su eficacia. Estos incluyen cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos (por ejemplo, fenol, acido sorbico, clorobutanol), agentes isotonicos (tales como azucares o cloruro de sodio) y similares. Pueden incluirse principios adicionales para controlar la duracion de la accion del principio activo en la composicion. El transportador farmaceuticamente aceptable puede ser un solido o un ftquido o un gas que se ha comprimido para formar un ftquido, es decir, las composiciones de la presente invencion pueden utilizarse adecuadamente como concentrados, emulsiones, soluciones, granulados, polvos medicinales, pulverizaciones, aerosoles, suspensiones, pomadas, cremas, comprimidos, granulos o polvos. Los transportadores farmaceuticos adecuados para su uso en dichas composiciones farmaceuticas y su formulacion es bien conocida por los expertos en la tecnica y no hay ninguna restriccion particular para su seleccion con la presente invencion. Tambien pueden incluirse aditivos tales como agentes humectantes, agentes dispersantes, pegamentos, adhesivos, agentes emulsionantes, disolventes, recubrimientos, agentes antibacterianos antifungicos (por ejemplo, fenol, acido sorbico, clorobutanol), agentes isotonicos (tales como azucares o cloruro de sodio) y similar, siempre que los mismos sean coherentes con la practica farmaceutica, es decir, transportadores y aditivos que no creen un dano permanente a los mairnferos. Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden prepararse de cualquier manera conocida, por ejemplo, mezclando homogeneamente, recubriendo y/o moliendo los principios activos, en un procedimiento de una etapa o de multiples etapas, con el material transportador seleccionado y, cuando sea apropiado, los otros aditivos tales como agentes tensioactivos. Tambien pueden prepararse por micronizacion, por ejemplo, en vista de obtenerlos en forma de microesferas que normalmente tienen un diametro de aproximadamente 1 a 10 |im, en concreto para la fabricacion de microcapsulas para la liberacion controlada o sostenida de los principios activos.

Los peptidos inmunogenicos, homologos o derivados de los mismos (y sus sales fisiologicamente aceptables o composiciones farmaceuticas, todos ellos incluidos en la expresion “principios activos”) pueden administrarse mediante cualquier via apropiada para la afeccion a prevenir o tratar y que sea apropiada para los compuestos, en este caso las protemas inmunogenicas a administrar. Las vfas posibles incluyen la via regional, sistemica, oral (en forma solida o para inhalacion), rectal, nasal, topica (incluyendo ocular, bucal y sublingual), vaginal y parenteral (incluyendo subcutanea, intramuscular, intravenosa, intradermica, intraarterial, intratecal y epidural). La via de administracion preferida puede variar, por ejemplo, con la afeccion del receptor o con la afeccion a prevenir o a tratar.

Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificacion unitaria y pueden prepararse mediante cualquiera de los metodos bien conocidos en la tecnica de farmacia. Las formulaciones de la presente invencion, adecuadas para administracion oral, pueden presentarse como unidades individuales, tales como capsulas, obleas o comprimidos, conteniendo cada uno de ellos una cantidad predeterminada del principio activo; como polvos o granulos; como una solucion o suspension en un ftquido acuoso o en un ftquido no acuoso; o como una emulsion ftquida de aceite en agua o una emulsion ftquida de agua en aceite. El principio activo tambien puede presentarse como un bollo, un pesario o una pasta. Un comprimido puede prepararse por compresion o moldeo, opcionalmente con uno o mas principios accesorios. Los comprimidos fabricados por compresion pueden prepararse comprimiendo en una maquina adecuada el principio activo en una forma fluida tal como un polvo o granulos, opcionalmente mezclarse con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, conservante, tensioactivo o agente dispersante. Los comprimidos moldeados pueden prepararse moldeando en una maquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente ftquido inerte. Los comprimidos pueden opcionalmente recubrirse o ranurarse y pueden formularse para proporcionar una liberacion lenta o controlada del principio activo en su interior.

Un aspecto adicional de la presente invencion proporciona inmunopeptidos aislados que comprenden un epftopo de celula T de un MCH, un antfgeno de histocompatibilidad secundario o un antfgeno espedfico de tejido y un motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C, estando el motivo adyacente al epftopo de celula T o separado del epftopo de celula T por un enlazador, mas particularmente un enlazador de a lo sumo 7 aminoacidos. En realizaciones particulares adicionales el epftopo de celula T procede de una protema que es un aloantfgeno establecido. En realizaciones particulares, el epftopo de celula T es de un MCH, de un antfgeno de histocompatibilidad secundario o de un antfgeno espedfico de tejido en el que el motivo no aparece de manera natural dentro de una region de 11 aminoacidos en el extremo N o C terminal del epftopo de celula T.

En todos los metodos y aplicaciones descritos en el presente documento, un antfgeno de aloinjerto particular se ilustra mediante el antfgeno Dby codificado por el cromosoma H-Y. Por lo tanto, la invencion tambien se refiere a un peptido inmunogenico que comprende un epftopo de celula T del antfgeno Dby y, adyacente a dicho epftopo de celula T o separado de dicho epftopo de celula T mediante un enlazador, un motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C. En particular, el epftopo de celula T se caracteriza por FNSNRANSS (SEQ ID NO: 5) o CHGCFNSNRAnSS (SEQ ID NO: 6), y los peptidos inmunogenicos ejemplares de la invencion que los comprenden se caracterizan por LVLAPTREL (SEQ ID NO: 7) o CGHCLVLAPTREL (SEQ ID NO: 8). La invencion se refiere adicionalmente a los usos de/metodos de uso de estos peptidos inmunogenicos descritos en el presente documento, asf como a las composiciones/medicamentos descritos en el presente documento, basandose en estos peptidos inmunogenicos.

La presente invencion se ilustrara ahora mediante los siguientes ejemplos, que se proporcionan sin ninguna

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intencion limitativa. Ademas, todas las referencias descritas en el presente documento se incluyen expftcitamente en el mismo por referencia.

Ejemplos

Ejemplo 1. Provocacion de celulas T reguladoras citotoxicas por inmunizacion con un peptido modificado

La secuencia del antigeno Dby murino, que esta codificado por el cromosoma H-Y, se introdujo en algoritmos utilizados para identificar epftopos de celulas T para ratones de la cepa C57B1/6. Se identifico un supuesto epftopo de secuencia FNSNRANSS (SEQ ID NO: 5) y se utilizo como una base para la produccion de un peptido inmunogenico segun la presente invencion, que incluye una secuencia consenso que engloba una actividad tiorreductasa, en concreto CHGC (SEQ ID NO: 9). Por lo tanto se sintetizo un nuevo peptido con la secuencia CHGCFNSNRANSS (SEQ ID. NO: 6; la secuencia consenso tiorreductasa se indica subrayada).

Grupos de ratones hembra C57B1/6 se inmunizaron con 10 |ig de peptido de SEQ ID NO: 6 emulsionado en CFA (adyuvante completo de Freund) para la primera inyeccion SC (subcutanea) y en IFA (adyuvante incompleto de Freund) para las dos inmunizaciones posteriores. El bazo de dichos ratones se recupero 10 dfas despues de la ultima inmunizacion y se obtuvieron celulas T CD4+ mediante clasificacion celular utilizando perlas magneticas.

Estas celulas T CD4+ se evaluaron in vitro con respecto a su capacidad para inducir apoptosis de CPA (celulas presentadoras de antigeno). Por tanto, celulas de bazo de ratones C57B1/6 no expuestos previamente (naive) se privaron de celulas T CD4+ por clasificacion con perlas magneticas y se utilizaron como CPA. Dichas CPA se cargaron con peptidos de cualquiera de SEQ ID NO: 5 o de SEQ ID NO: 6 por incubacion durante 16 h a temperatura ambiente. Despues, las celulas se lavaron para eliminar los peptidos libres residuales.

Despues de la adicion de celulas T CD4+ obtenidas de ratones inmunizados con el peptido modificado, las CPA cargadas con la secuencia natural (SEQ ID NO: 5) o su homologo modificado (SEQ ID NO: 6) se indujeron en apoptosis como se observa mediante union a la superficie de Anexina V. Las celulas T CD4+ de control, bien de ratones inmunizados con un antfgeno simulado o de ratones inmunizados con el peptido natural de SEQ ID NO: 5 no indujeron ningun grado significativo de apoptosis de CPA.

Estos experimentos demuestran que un epftopo de celula T de un antfgeno de histocompatibilidad secundario puede, por inmunizacion directa en el raton y despues de modificacion segun la presente invencion anadiendo una fraccion de tiorreductasa, provocar celulas Tregs citotoxicas. Adicionalmente se demuestra que las Tregs citotoxicas pueden activarse y ejercer sus propiedades inmunosupresoras cuando se activan con la secuencia natural del epftopo T. En su conjunto, esto proporciona pruebas de que las Tregs citotoxicas espedficas de antfgenos de histocompatibilidad secundarios pueden generarse por inmunizacion directa.

Ejemplo 2: Modelo preclinico para la prevencion de rechazo de injerto (ratones no expuestos previamente)

Uno de los modelos mas estudiados de rechazo de injerto es el injerto de piel entre animales singenicos de diferente sexo. Por tanto, el cromosoma H-Y contiene diversos genes, en particular en gen Dby, que codifica un antfgeno de histocompatibilidad secundario que provoca una fuerte activacion de celulas T CD4+ y rechazo cronico en hembras. Se ha demostrado que el rechazo se debe principalmente a la presentacion del antfgeno Dby por las CPA de hembras, normalmente a traves de la ruta indirecta (vease Braun et al, Journal of Immunology, 166: 4879-4883, 2001).

Se considera que este modelo es directamente aplicable a la situacion en seres humanos, dado que los antfgenos derivados de H-Y tambien se expresan en el ser humano. Ademas, se sabe que los injertos de medula osea o de organos solidos de donantes masculinos son mas frecuentemente rechazados por receptores femeninos que cuando el injerto es de origen femenino.

Los epftopos de celulas T del antfgeno Dby se han descrito y seleccionado como se muestra en el Ejemplo 1

(peptido de SEQ ID NO: 5). Se preparo un peptido sintetico de SEQ ID NO: 6. Se crearon grupos de 3 ratones

hembra C57B1/6 (haplotipo H-2b) para ensayar la capacidad de los peptidos modificados de SEQ ID NO: 1 para provocar tolerancia al aloinjerto de piel. Cuando sea aplicable, la preinmunizacion se realizo mediante 3 inyecciones subcutaneas de peptidos que conteman bien el epftopo natural o su homologo modificado. Las inyecciones se realizaron a intervalos quincenales en CFA/IFA o alumbre. Por lo tanto los grupos fueron los siguientes:

Grupo 1: aloinjerto de piel sin preinmunizacion Grupo 2: autoinjerto de piel

Grupo 3: preinmunizacion con peptido de SEQ ID NO: 6 emulsionado en CFA (primera inmunizacion) e IFA para la segunda y tercera inmunizacion)

Grupo 4: igual que en el Grupo 3, pero con alumbre como adyuvante

Grupo 5: igual que en el Grupo 3, pero utilizando el peptido natural de SEQ ID NO: 5

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Todos estos ratones, excepto los ratones del Grupo 2, recibieron un aloinjerto de piel de machos C57B1/6 de 1 cm2, bien directamente (Grupo 1) o 2 semanas despues de la ultima inmunizacion para los Grupos 3, 4 y 5. El grupo de ratones 2 recibio un autoinjerto. La tasa de rechazo se evaluo el dfa 10 y 20 y se considero eficaz si mas del 50 % de la superficie del injerto era necrotica. La Tabla I resume los resultados.

Tabla 1. Resumen de la tasa de rechazo de un experimento en el que ratones hembra C57B1/6 se injertaron con piel de machos singenicos que se hicieron tolerantes al aloinjerto por preinmunizacion con un peptido que contema un epftopo de celula T CD4+ unido a una secuencia consenso de tiorreductasa

Grupos de 3 ratones a menos que se indique

Dfa 10 Dfa 20

Grupo 1 aloinjerto

3/3 2/3*

Grupo 2 autoinjerto (n=6)

1/6 1/6

Grupo 3 preinmunizacion en CFA/IFA

0/3 0/3

Grupo 3 preinmunizacion en alumbre con SEQ ID NO: 6

0/3 0/3

Grupo 3 preinmunizacion en alumbre con SEQ ID NO: 5

2/3 2/3**

* 1 muerte accidental **proceso de rechazo acelerado

Estos experimentos indican que la preinmunizacion con el peptido modificado de SEQ ID NO: 6 en CFA/IFA o alumbre impide completamente el rechazo de injerto, mientras que la pre-sensibilizacion con el peptido natural de SEQ ID NO: 5 acelera el rechazo.

Estos experimentos pueden realizarse utilizando ratones hembra C57B1/6 de tipo silvestre, que llevan un repertorio de celulas T del linaje CD4+ que puede activarse mediante todos los epftopos de celulas T restringidos de MHC clase II procedentes del cromosoma H-Y. Ademas, dichos ratones tienen un repertorio de celula T CD8+ normal, que puede activarse mediante epftopos de celula T restringidos de MHC de clase I. Como se sabe que las celulas T CD8+ citotoxicas son suficientes para el rechazo de injerto, se puede llegar a la conclusion de que un peptido modificado de SEQ ID NO: 6 no se le impide el rechazo mediante la activacion de celulas T CD4+, sino que tambien suprime el rechazo mediante celulas T CD8+.

Los antigenos H-Y tambien estan presentes en el ser humano, donde desempenan la funcion de antigenos de histocompatibilidad secundarios, muy similar en el raton. El antigeno Dby es reconocido como uno de los principales de dichos antigenos. La secuencia de uno del epftopo de celulas T principal de Dby es LVLAPTREL (sEq ID. NO: 7). Este epftopo de celula T puede modificarse segun la presente invencion anadiendo una secuencia consenso que contiene una actividad tiorreductasa, por ejemplo, dando como resultado un peptido inmunogenico CGHCLVLAPTREL (SEQ ID. NO: 8).

Ejemplo 3: Modelo preclinico para la prevencion del rechazo de injerto (ratones sensibilizados)

Los experimentos anteriores se realizaron en ratones no expuestos previamente, inmunizados directamente con un peptido modificado segun la presente invencion. Dado que los pacientes clrnicos que esperan un injerto a menudo ya estan sensibilizados contra aloantigenos, debido, por ejemplo, a una infusion de sangre previa o a una gestacion, se diseno un experimento para evaluar el efecto de los peptidos modificados administrados a ratones que ya estaban sensibilizados con el antigeno Dby.

Por tanto, grupos de ratones hembra C57B1/6 se transfirieron de forma adoptiva con esplenocitos de ratones macho singenicos. Esto se realizo inyectando 20.106 celulas por via intraperitoneal o subcutanea. Diez dfas despues, el bazo de dichos ratones se extrajo para confirmar que se generaron celulas T efectoras CD4+ contra el antigeno Dby.

Los ratones presensibilizados por transferencia adoptiva de celulas se injertaron despues con piel macho como se describe en el Ejemplo 2. Posteriormente se evaluo la tolerancia al injerto de piel en dichos ratones pre-inmunizados.

Estos experimentos demuestran que la administracion in vivo de un peptido inmunogenico de la invencion elimina o neutraliza la funcion de celulas T CD4+ efectoras existentes contra el antigeno Dby.

Ejemplo 4. Las Tregs citotoxicas espeaficas para el antigeno Dby suprimen la capacidad de celulas CD4+ efectoras para activar celulas T citoliticas CD8+ contra el antigeno Uty y por lo tanto prevenir el rechazo de injerto mediado por CD8+

Los ratones Mata-Hari son ratones Ragl-/- que expresan un receptor de celula T que reconoce un epftopo H2b restringido a la clase I del antigeno Uty, un antigeno alternativo codificado por el cromosoma H-Y. Dichos ratones pueden rechazar el injerto de piel de ratones H2b macho singenicos a traves de activacion de celulas T CD8+.

Se utilizaron celulas T transgenicas CD8+ de ratones Mata-Hari para reconstituir de forma adoptiva ratones H2b Rag2-/- utilizando un numero de celulas que era suficiente para mediar el rechazo solo cuando se proporcionaba ayuda mediante celulas T CD4+ efectoras.

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Para proporcionar dicha ayuda, se prepararon celulas T CD4+ efectoras, asf como celulas T reguladoras CD4+ citotoxicas, en ratones H2k no expuestos previamente, mediante inmunizacion con los peptidos correspondientes de SEQ ID NO: 5 y 6, respectivamente, como se describe en el Ejemplo 1.

Las celulas T CD4+ restringidas a H2k citotoxicas o efectoras, se transfirieron a ratones Rag2-/- ya reconstituidos con celulas T CD8+ restringidas a H2b transgenicas. Para garantizar que las celulas T CD4+, bien efectoras o celulas T citotoxicas, se activaban in vivo, los ratones Rag2-/- tambien recibieron un trasplante de esplenocitos H2k de un raton macho.

Los ratones Rag2-/- reconstituidos se injertaron despues con la piel de un macho H2b y se hizo un seguimiento del rechazo del injerto durante 3 semanas. En dicho sistema, el numero limitante de celulas T CD8+ rechazara el injerto H2b unicamente si reciben ayuda de celulas T CD4+ efectoras, que estan activadas por esplenocitos restringidos a H2k, para impedir el rechazo de injerto por celulas T efectoras.

La co-reconstitucion con celulas citotoxicas CD4+ y efectoras CD4+ anula la capacidad de las celulas T CD4+ efectoras para proporcionar ayuda al rechazo de injerto mediado por CD8+.

La inyeccion de celulas T CD4+ citotoxicas que reconocen un peptido de MHC de clase II de un antigeno (Dby) regula negativamente el rechazo de injerto mediado por CD8+ a traves del reconocimiento de otro antigeno (Uty) codificado por el cromosoma H-Y.

Ejemplo 5. El rechazo de injerto causado por antigenos de MHC de clase II divergentes se previene con celulas T reguladoras CD4+ citotoxicas

Los ratones Bml2 constituyen una variante de los ratones C57B1/6 en los que se ha producido una mutacion espontanea en el locus I-Ab. Esta mutacion consiste en 3 sustituciones de aminoacidos en un tramo de 5 aminoacidos y por tanto genera un emparejamiento erroneo limitado del MHC de clase II entre ratones Bm12 y ratones C57B1/6 de tipo silvestre. No obstante, este emparejamiento erroneo es suficiente como para provocar el rechazo del aloinjerto de piel en ratones Bm12.

Los 3 aminoacidos sustituidos son Ile67Phe, Arg70Gln y Thr71Lys localizados en la tercera region hiper variable de la cadena beta. Se preparo un peptido sintetico que inclrna estos restos y que tema la secuencia: PEFLEQKRA (SEQ ID. NO: 10). Este peptido se modifico segun la invencion incorporando una secuencia consenso tiorreductasa, dando como resultado el peptido inmunogenico ejemplar CGHCPEfLeQKRA (SEQ ID. NO: 11).

Se provocaron celulas T reguladoras CD4+ citotoxicas contra el peptido modificado de SEQ ID NO: 11 en ratones C57B1/6 mediante 3 administraciones subcutaneas del peptido en CFA/IFA dadas a intervalos quincenales. Despues, dichos ratones se injertaron con la piel de ratones Bm12.

Se observo que los ratones C57B1/6 rechazaban rapidamente el injerto de B12m a menos que se preinmunizasen con el peptido de SEQ ID NO: 11, pero no cuando se utilizaba el peptido natural de SEQ ID NO: 10 para la preinmunizacion. Estos experimentos demuestran que los peptidos inmunogenicos de la invencion pueden provocar celulas T reguladoras citotoxicas CD4+ y por lo tanto conceden tolerancia de un aloinjerto con emparejamiento erroneo de MHC de clase II.

Ejemplo 6: Las celulas T CD4+ reguladoras citotoxicas se provocan por inmunizacion in vivo con un peptido que comprende un epftopo de celula T del antigeno de histocompatibilidad secundario HA-1, al cual se anade una secuencia consenso de tiorreductasa.

Ratones BALB/c (grupo 1) se inmunizaron con 25 |ig de un peptido que contema un epftopo de celula T (natural) del antigeno de histocompatibilidad secundario HA-1 mediante 3 inyecciones en la almohadilla plantar en CFA/IFA realizadas a intervalos quincenales. La secuencia del peptido corresponde a los aminoacidos 302 a 310 de HA-1, en concreto: ARLQVAKAE (SEQ ID NO: 12).

Un segundo grupo de ratones BALB/c (grupo 2) se inmunizo utilizando el mismo protocolo con el peptido de SEQ ID NO: 12 al cual se anadio un motivo consenso que presentaba actividad tiorreductasa (o abreviado: motivo redox) en el extremo amino terminal, dando como resultado CHGCARLQVAKAE (SEQ ID NO: 13; el motivo redox se indica subrayado) denominado epftopo de celula T modificado).

Diez dfas despues de la ultima inmunizacion, se extrajeron los bazos de todos los ratones y se prepararon celulas T CD4+ por separacion en perlas magneticas.

Las celulas adherentes al bazo, preparadas de ratones BALB/c no expuestos previamente, se utilizaron como celulas presentadoras de antigeno (CPA). Dichas CPA (2x107) se cargaron con el peptido de SEQ ID NO: 12 o con el peptido de SEQ ID NO: 13 (5 |ig/ml) mediante una incubacion de 1 h seguido de un lavado.

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Las celulas T CD4+ obtenidas de ratones bien del grupo 1 o del grupo 2 se anadieron a la poblacion de las CPA y se co-cultivaron durante 24 h a 37 °C. Despues, las celulas se recuperaron y se incubaron con un anticuerpo anti- CD11c marcado con fluorescencia y con anexina V marcada con FITC como un marcador de apoptosis. Finalmente, las celulas se analizaron por analisis Facs (separation de celulas activadas por fluorescencia, del ingles Fluorescence Activated Cell Sorting)

Estos experimentos demuestran que un peptido de SEQ ID NO: 13 puede provocar celulas T CD4+ con propiedades citotoxicas frente las CPA que presentan bien el epttopo de celula T del antfgeno de histocompatibilidad secundario HA-1 natural (SEQ ID NO: l2) o el epftopo de celula T del antfgeno de histocompatibilidad secundario HA-1 modificado (SEQ ID NO: 13).

Ejemplo 7. Modelo preclinico para la prevencion del rechazo de injerto de organos vascularizados (ratones no expuestos previamente)

El producto del gen Dby, como se describe en el Ejemplo 2, se presenta por determinantes del MHC tanto de clase I como de clase II. En injertos de organos vascularizados, tales como el corazon, ademas de la presentation del MHC de clase I, las celulas del endotelio pueden expresar moleculas de MHC de clase II asf como moleculas co- estimuladoras tales como B7. Esto proporciona celulas endoteliales con la capacidad de activar celulas T tanto CD8+ como CD4+ espedficas para aloantfgenos en el contexto de MHC de clase I o clase II, respectivamente.

Sin embargo, las celulas T CD4+ desempenan un papel principal en el rechazo de injerto, ya que el empobrecimiento de celulas T CD4+, pero no el de celulas T CD8+, del receptor, previene por completo el rechazo (Szeto WY et al, Transplantation (2002) 73: 1116-1122). Ademas, la production de citocinas proinflamatorias por celulas T CD4+ efectoras potencia la inflamacion local, principalmente a nivel del endotelio del injerto, lo que da como resultado endotelitis aumentada con expresion aumentada de determinantes de MHC. Por lo tanto, un metodo mediante el cual se eliminan dichas celulas T CD4+ espedficas de aloantfgeno, permitina la induction de tolerancia contra el injerto.

En la tecnica se sabe que la ruta indirecta de reconocimiento aloantigenico es predominante, en concreto la presentacion de CPA del receptor de antfgenos liberados por el injerto en celulas T CD4+ del receptor. Por lo tanto, la prevencion de la expansion y de la activation de celulas T CD4+ efectoras mediante la ruta indirecta sena muy deseable.

Para estabilizar la prueba de concepto de que las celulas T CD4+ reguladoras citolfticas de la presente invention pueden prevenir del rechazo de un organo vascularizado, se utilizo el modelo de trasplante de corazon heterotopico. Este metodo es muy conocido en la tecnica, como se describe, por ejemplo, en Kadner A et al, European Journal of Cardio-thoracic Surgery (2000) 17: 474-481. En resumen, el metodo consiste en un implante abdominal del corazon en un entorno no operativo, concretamente el corazon esta vascularizado pero no da soporte a la circulation. Esto permite realizar un seguimiento prolongado del injerto y multiples biopsias sin producir la muerte del animal experimental.

Utilizando dicha tecnica, se injertaron corazones de machos C57BL/6 en el abdomen de hembras singenicas. El proceso del rechazo, que esta mediado por la expresion de antfgenos procedentes de H-Y en determinantes de MHC tanto de clase I como clase II, se debe principalmente a la circulacion de celulas T CD4+ espedficas del receptor que estan activadas mediante el reconocimiento de peptidos procedentes de aloantfgeno mediante celulas endoteliales injertadas. Dichas celulas T CD4+ producen IL-2 e IFN-gamma, lo que conduce a mas inflamacion y proporciona ayuda para la maduracion de celulas T CD8+ espedficas.

Ratones hembra C57Bl/6 se pre-inmunizaron antes de recibir el aloinjerto de machos con peptidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o un peptido simulado. Esto se realiza mediante 3 inyecciones subcutaneas de peptidos realizadas a intervalos quincenales en CFA/IFA. Despues de esto, todos los ratones recibieron un trasplante de corazon de macho heterotopico.

Se observa que los ratones hembra pre-inmunizados con el peptido SEQ ID NO: 6 (en concreto el peptido modificado de Dby que contiene el motivo de tiorreductasa) toleran el injerto, como se ilustra mediante un latido ininterrumpido, y la demostracion de ausencia de infiltration celular, de smtomas de endotelitis y de lesiones vasculares cronicas. En cambio, los ratones pre-inmunizados con peptido simulado o con peptido de SEQ ID NO: 5 muestran rechazo del corazon trasplantado.

Estos experimentos demuestran que la prevencion de la expansion de celulas T CD4+ y CD8+ espedficas para los productos codificados por el cromosoma H-Y mediante provocation de celulas T CD4+ reguladoras citolfticas contra uno de los epftopos del aloantfgeno Dby, segun la presente invencion, es suficiente para prevenir el rechazo de organos vascularizados.

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Life Sciences Research Partners vzw Saint-Remy, Jean-Marie <120> Peptidos inmunogenicos y su uso en trasplante <130> L4683-PCT <160> 13

<170> Patenln version 3.3

<210> 1 <211> 14 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Peptido <220>

<221> misc_feature <222> (2)..(3)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <220>

<221> misc_feature <222> (5)..(5)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <220>

<221> misc_feature <222> (7)..(8)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <220>

<221> misc_feature <222> (10)..(10)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <220>

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<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <400> 1

Cys Xaa Xaa Cys Cys Xaa Xaa Cys Cys Xaa Xaa Cys 15 10

<210>2 <211> 12 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

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<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <220>

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<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <220>

<221> misc_feature <222> (10)..(11)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <400>2

Cys Xaa Xaa Cys Cys Xaa Xaa Cys Cys Xaa Xaa Cys 15 10

<210>3 <211> 10 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Peptido <220>

<221> misc_feature <222> (2)..(3)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <220>

<221> misc_feature <222> (5)..(6)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <220>

<221> misc_feature <222> (8)..(9)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <400>3

Cys Xaa Xaa 1

<210>4 <211> 10 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Peptido <220>

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<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <220>

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30

35

40

45

50

<400>4

Cys Xaa Cys Cys Xaa Cys Cys Xaa Cys Cys 15 10

<210>5 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Peptido <400> 5

Phe Asn Ser Asn Arg Ala Asn Ser Ser 1 5

<210>6 <211> 13 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Peptido <400>6

Cys His Gly Cys Phe Asn Ser Asn Arg Ala Asn Ser Ser 15 10

<210>7 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Peptido <400>7

Leu Val Leu Ala Pro Thr Arg Glu Leu 1 5

<210>8 <211> 13 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Peptido <400> 8

Cys Gly His Cys Leu Val Leu Ala Pro Thr Arg Glu Leu 15 10

<210>9 <211>4 <212> PRT

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Peptido <400>9

Cys His Gly Cys 1

<210> 10 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Peptido <400> 10

Pro Glu Phe Leu Glu Gin Lys Arg Ala 1 5

<210> 11 <211> 13 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Peptido <400> 11

Cys Gly His Cys Pro Glu Phe Leu Glu Gin Lys Arg Ala 15 10

<210> 12 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Peptido <400> 12

Ala Arg Leu Gin Val Ala Lys Ala Glu 1 5

<210> 13 <211> 13 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Peptido <400> 13

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   REIVINDICACIONES

   1. Un peptido inmunogenico aislado que comprende (i) un epftopo de celula T de una protema aloantigenica de un aloinjerto y que comprende (ii) un motivo C-(X)2- [CST] o [CST]-(X)2-C para su uso en la prevencion o el tratamiento en un receptor de rechazo de un aloinjerto de mamftero, caracterizado por que dicho motivo C-(X)2- [CST] o [CST]- (X)2-C es adyacente a dicho epftopo de celula T, o esta separado de dicho epftopo de celula T por un enlazador.
2. 2. El peptido segun la reivindicacion 1, para su uso segun la reivindicacion 1, en el que dicho aloinjerto es un injerto de organo solido, tal como rinon, pulmon, corazon, Idgado, pancreas, hueso o piel, o en el que dicho aloinjerto es un injerto celular, tal como de medula osea, un injerto de celula de sangre del cordon umbilical, un injerto de celula madre o un injerto de celula de islote pancreatico.
3. 3. El peptido segun la reivindicacion 1 o 2, para su uso segun la reivindicacion 1, en el que dicha protema aloantigenica se selecciona del grupo de antigenos de histocompatibilidad secundarios, de antigenos de histocompatibilidad principales o de antigenos espedficos de tejido.
4. 4. El peptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso segun la reivindicacion 1, en el que dicho motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C no se produce de manera natural dentro de una region de 11 aminoacidos en el extremo N o C terminal adyacente al epftopo de celula T en dicha protema aloantigenica.
5. 5. El peptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso segun la reivindicacion 1, que tiene una longitud entre 12 y 50 aminoacidos.
6. 6. El peptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso segun la reivindicacion 1, en el que:

   - dicho motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C esta posicionado en el extremo N terminal del epftopo de celula T, o

   - en el que al menos una X en dicho motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C es Gly, Ala, Ser o Thr, o

   - en el que al menos una X en dicho motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C es His o Pro, o

   - en el que al menos una C en dicho motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C esta metilado.
7. 7. Un metodo para obtener una poblacion de celulas T citotoxicas espedficas de antfgeno de aloinjerto,

   comprendiendo el metodo las etapas de:

   - proporcionar celulas de sangre periferica;

   - poner en contacto dichas celulas con un peptido inmunogenico que comprenda (i) un epftopo de celula T de una protema aloantigenica de un aloinjerto y (ii) un motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C, estando el motivo adyacente al epftopo de celula T separado del epftopo de celula T por un enlazador;

   y

   - expandir dichas celulas en presencia de IL-2.
8. 8. Un metodo no terapeutico para obtener una poblacion de celulas T citotoxicas espedficas de antfgeno de aloinjerto, comprendiendo el metodo las etapas de:

   - a) proporcionar un peptido inmunogenico que comprenda (i) un epftopo de celula T de una protema aloantigenica de un aloinjerto y (ii) un motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C, estando el motivo adyacente al epftopo de celula T o separado del epftopo de celula T por un enlazador;

   - b) administrar dicho peptido inmunogenico a un sujeto con un proposito no terapeutico; y

   - c) obtener de dicho sujeto dicha poblacion de celulas T espedficas de antfgeno de aloinjerto.
9. 9. Una poblacion de celulas T citotoxicas espedficas de antfgeno de aloinjerto, con supresion de respuestas inmunitarias a aloantfgenos, obtenida por el metodo segun la reivindicacion 7 u 8.
10. 10. Una poblacion de celulas T citotoxicas espedficas para un aloantfgeno de un aloinjerto segun la reivindicacion 9 para su uso en la prevencion o el tratamiento en un receptor del rechazo de dicho aloinjerto.
11. 11. El peptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso segun la reivindicacion 1 o el metodo segun la reivindicacion 7 u 8, en el que dicha protema aloantigenica o el antfgeno de aloinjerto es el antfgeno Dby codificado por el cromosoma H-Y.
12. 12. Un peptido inmunogenico aislado que comprende:

    (1) un epftopo de celula T del antfgeno Dby, y

    (2) un motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C, estando el motivo adyacente al epftopo de celula T o separado del epftopo de celula T por un enlazador.