EA029831B1

EA029831B1 - Пептид, индуцирующий цитотоксические т-лимфоциты и стимулирующий антиопухолевые иммунные ответы

Info

Publication number: EA029831B1
Application number: EA201000209A
Authority: EA
Inventors: Оливер Шор; Норберт Хильф; Тони Вайншенк; Клаудиа Траутвайн; Штеффен Вальтер; Харпрет Сингх
Original assignee: Имматикс Байотекнолоджиз Гмбх
Priority date: 2007-07-27
Filing date: 2008-07-25
Publication date: 2018-05-31
Also published as: PT2183361E; CA2863010C; NZ582824A; US20190076477A1; DK2660248T3; ES2546610T3; NZ592261A; JP2013226145A; MX2010001086A; US20160175357A1; CN103911358B; HRP20150852T1; CY1117115T1; US9175040B2; DK2183361T3; KR20120025014A; US20190321405A1; EP2183361A1; US10434120B2; PL2660248T3

Abstract

Изобретение относится к пептиду длиной 9-30 аминокислотных остатков, который индуцирует цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) и стимулирует антиопухолевые иммунные ответы, а также к кодирующим его нуклеиновым кислотам; к векторам, экспрессирующим указанные нуклеиновые кислоты; к антигенпрезентирующим клеткам (АПК), содержащим указанные нуклеиновые кислоты или векторы; к способам получения указанного пептида; к активированным ЦТЛ и способам их получения; к способам уничтожения клеток, экспрессирующих указанный пептид; к применению указанного пептида, нуклеиновой кислоты, вектора, АПК, активированного ЦТЛ для изготовления лекарственного средства для лечения рака.

Description

029831

Область техники

Изобретение относится к пептидам, нуклеиновым кислотам и клеткам для применения в иммунотерапевтических методах. В частности, настоящее изобретение относится к иммунотерапии рака. Настоящее изобретение относится в дальнейшем к опухолеассоциированным пептидным эпитопам цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ), в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует антиопухолевые иммунные ответы.

Уровень техники

Глиомы являются опухолями головного мозга, возникающими из глиальных клеток нервной системы. Глиальные клетки, называемые обычно нейроглия или просто глия, являются не-нейрональными клетками, которые обеспечивают поддержку и питание, поддерживают гомеостаз, формируют миелин и участвуют в передаче сигналов в нервной системе. Две наиболее важные подгруппы глиом - это астроцитомы и олигодендроглиомы, называемые в соответствии с видами нормальных глиальных клеток, из которых они образуются (астроциты или олигодендроциты, соответственно). Относящаяся к подгруппе астроцитом, мультиформная глиобластома (называемая далее глиобластомой) является наиболее распространенной злокачественной опухолью головного мозга взрослых людей и на ее счет приходится прибл. 40% всех злокачественных опухолей головного мозга и приблизительно 50% глиом (СВТКИ8, 2006). Она агрессивно поражает центральную нервную системы и имеет наивысший уровень злокачественности (степень IV) среди всех глиом. Хотя наблюдается постоянный прогресс в их лечении благодаря усовершенствованию нейровизуализации, микрохирургии, различным возможностям лечения, таким как Темозоломид и облучение, глиобластомы остаются неизлечимыми (Масбопа1б, 2001; Вийоп аиб Ргабок, 2000; Ргабок апб Ьеуш, 2000). Процент летальных исходов при этой опухоли головного мозга очень высок: средняя ожидаемая продолжительность жизни после постановки первого диагноза составляет 9-12 месяцев, 5-летний срок выживаемости с 1986 по 1990 составил 8,0%. На данный момент пятилетний срок выживаемости вследствие агрессивной терапии, включая макроскопическое удаление опухоли, все еще ниже 10% (Вийоп апб Ргабок, 2000; №ебег е! а1., 2000; ЫароШапо е! а1., 1999; Όηζζί е! а1., 2000). Соответственно, существует высокая потребность медицины в альтернативном и эффективном методе лечения.

Опухолевые клетки глиобластомы являются наиболее недифференцированными среди опухолей головного мозга, так что опухолевые клетки имеют высокий потенциал для миграции и пролиферации и являются высокоинвазивными, приводя к очень неутешительному прогнозу. Глиобластомы приводят к смерти из-за быстрого, агрессивного и инфильтрирующего роста в головном мозге. Паттерны инфильтрирующего роста ответственны за нерезектабельую природу этих опухолей. Глиобластомы также относительно резистентны к облучению и химиотерапии, и, поэтому, высок процент рецидивов после лечения. Кроме того, иммунный ответ на неопластические клетки довольно неэффективен для полного устранения всех неопластических клеток после резекции и лучевой терапии (Кок апб ^Уе11ег. 1999; Όίχ е! а1., 1999; 8аЫоЩ1б е! а1., 2000).

Глиобластома подразделяется на первичную глиобластому (бе поуо) и вторичную глиобластому в зависимости от различий в генном механизме во время злокачественной трансформации недифференцированных астроцитов или глиальных клеток-предшественников. Вторичная глиобластома возникает в более молодом возрасте, до 45 лет. В течение 4-5 лет, в среднем, вторичная глиобластома развивается из астроцитомы низкой степени, проходя стадию недифференцированной астроцитомы. Первичная глиобластома, напротив, возникает в более пожилом возрасте, в среднем это 55 лет. В целом, первичная глиобластома возникает как молниеносная глиобластома, характеризуясь прогрессированием опухоли в течение 3 месяцев, начиная с состояния без клинических или патологических отклонений (Ра!йо1оду апб Оепебск о! !1е Ыегуоик 8ук!етк. 29-39 (1АКС Ргекк, Ьуоп, Ргапее, 2000)).

Глиобластома мигрирует вдоль миелинизированных нервов и широко распространяется по центральной нервной системе. В большинстве случаев хирургическое вмешательство дает лишь ограниченно устойчивый терапевтический эффект (№иго1. Меб. СЫг. (Токуо) 34, 91-94, 1994; №иго1. Меб СЫг. (Токуо) 33, 425-458, 1993; №игорако1оду 17, 186-188, 1997) (Масбопа1б, 2001; Ргабок апб Ьеуш, 2000).

Злокачественные клетки глиомы ускользают от обнаружения иммунной системой хозяина за счет выработки иммуноподавляющих веществ, которые наносят вред пролиферации Т-клеток и выработке иммуностимулирующего цитокина ИЛ-2 (Όίχ е! а1., 1999).

Внутричерепные неоплазмы могут возникнуть из любых структур или видов клеток, присутствующих в ЦНС, включая головной мозг, мягкие мозговые оболочки, мозговой придаток, череп и даже остаточную эмбриональную ткань. Общая ежегодная частота заболеваемости первичными опухолями головного мозга в Соединенных Штатах составляет 14 случаев на 100000. Наиболее распространенные первичные опухоли головного мозга - менингиомы, составляющие 27% всех первичных опухолей головного мозга, и глиобластомы, составляющие 23% всех первичных опухолей головного мозга (причем на счет глиобластомы приходятся 40% случаев злокачественных опухолей головного мозга взрослого населения). Многие из этих опухолей агрессивны и имеют высокую степень злокачественности. Первичные опухоли головного мозга являются наиболее распространенными солидными опухолями у детей и второй по частоте причиной смерти от рака после лейкемии у детей.

- 1 029831

Поиск эффективного лечения пациентов от глиобластом продолжается и сейчас. Была изучена иммунотерапия, или лечение посредством стимуляции иммунной системы, в целях борьбы с данными неопластическими клетками. Первые обнадеживающие результаты были получены из иммунотерапевтических исследований на человеческих пациентах, в которых могли быть индуцированы антигенспецифические ответы ЦТЛ, приводившие к увеличению средних сроков выживаемости в сравнении с теми, что были получены с применением стандартного лечения, сопровождаемого минимальной токсичностью (НешЪегдег е! а1., 2006).

Проблемой, решенной предлагаемой заявкой, была, таким образом, разработка новой эффективной и безопасной возможности лечения опухолей головного мозга и улучшение самочувствия пациентов без применения химиотерапевтических веществ или же других веществ, которые могут вызывать серьезные побочные эффекты.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к пептиду длиной 9-30 аминокислотных остатков, включающему непрерывную последовательность 5>ЕС ГО № 3, который индуцирует цитотоксические Т-клетки и стимулирует антиопухолевые иммунные ответы.

В одном из вариантов изобретения указанный пептид сохраняет способность связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I и способный индуцировать Тклетки СЭ8. В одном из вариантов изобретения указанный пептид состоит из аминокислотной последовательности 5>ЕС ГО № 3.

В одном из вариантов изобретения указанный пептид включает непептидные связи, выбранные из -СН2-ИН, -СН28-, -СН2СН2-, -СН=СН-, -СОСН2-, -СН(ОН)СН2- и -СН28О-.

В одном из вариантов изобретения указанный пептид является частью белка слияния, в частности, включающий Ν-терминальные аминокислоты антиген-ассоциированной инвариантной цепи (Б) НЬАΌΚ.

Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей указанный выше пептид.

Настоящее изобретение также относится к вектору экспрессии, способному экспрессировать указанную нуклеиновую кислоту.

Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей указанные нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии, являющейся антигенпрезентирующей клеткой.

Настоящее изобретение также относится к способу получения указанного выше пептида, включающему культивирование клетки-хозяина, которая экспрессирует указанную выше нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии, и выделение пептида из клетки-хозяина или его культуральной среды.

Настоящее изобретение также относится к способу получения активированных цитотоксических Тлимфоцитов (ЦТЛ) ίη νίίτο, включающему обеспечение контактирования ίη νίίτο ЦТЛ с нагруженными антигеном молекулами МНС I человека, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки или искусственной конструкции, имитирующей антигенпрезентирующую клетку, в течение периода времени, достаточного для активации указанных ЦТЛ антиген-специфическим образом, где указанный антиген является указанным выше пептидом.

Настоящее изобретение также относится к активированному цитотоксическому Т-лимфоциту (ЦТЛ), полученному с помощью указанного выше способа, который селективно распознает клетку, аберрантно экспрессирующую указанный полипептид.

Настоящее изобретение также относится к способу уничтожения клеток-мишеней у пациента, которые аберрантно экспрессируют указанный полипептид, включающий введение пациенту эффективного числа указанных выше цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ).

Настоящее изобретение также относится к применению указанного пептида, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки, или активированного цитотоксического Т-лимфоцита для изготовления лекарственного средства для лечения рака, где указанный рак выбирается из следующего: астроцитома, пилоидная астроцитома, дисэмбриопластическая нейроэпителиальная опухоль, олигодендроглиомы, эпендимома, мультиформная глиобластома, смешанные глиомы, олигоастроцитомы, медуллобластома, ретинобластома, нейробластома, герминома, тератома, ганглиоглиомы, ганглиоцитома, центральная ганглиоцитома, примитивные нейроэктодермальные опухоли, опухоли паренхимы шишковидной железы, опухоли, развивающиеся из эпендимных клеток, опухоли хориоидного сплетения, нейроэпителиальные опухоли неопределенного происхождения или глиобластома, рак легких или аденосквамозная карцинома. При этом в одном из вариантов изобретения лекарственное средство представляет собой вакцину. Настоящее изобретение также относится к применению указанного выше пептида для генерации и разработки специфических антител к комплексам МНС/пептид.

Все термины, используемые здесь, если не указано иное, имеют значения, данные ниже. Термин "пептид" используется здесь для обозначения серий аминокислотных остатков, связанных друг с другом типично пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Пептиды типично обладают длиной в 9 аминокислот, но могут быть короче - 8 аминокислот в длину, и длиннее - 14 аминокислот в длину.

- 2 029831

Термин "олигопептид" используется здесь для обозначения серий аминокислотных остатков, связанных один с другим типично пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Длина олигопептида не особенно важна для изобретения до тех пор, пока в нём сохраняются надлежащие эпитоп или эпитопы. Олигопептиды типично бывают менее чем около 30 аминокислотных остатков в длину и более чем около 14 аминокислот в длину.

Термин "полипептид" обозначает серии аминокислотных остатков, связанных один с другим типично пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Длина полипептида не особенно важна для изобретения до тех пор, пока сохраняются надлежащие эпитопы. В отличие от терминов "пептид" или "олигопептид", термин "полипептид" введён для обозначения белковых молекул, имеющих в длину более приблизительно 30 остатков.

Пептид, олигопептид, белок или полинуклеотид, кодирующий для такой молекулы, является "иммуногенным" (и, таким образом, "иммуногеном" в рамках настоящего изобретения), если он способен индуцировать иммунный ответ. В случае настоящего изобретения иммуногенность получает более специфическое определение как способность индуцировать опосредованную ЦТЛ реакцию. Таким образом, "иммуноген" должен представлять собой молекулу, которая способна индуцировать иммунный ответ, и, в случае настоящего изобретения, молекулу, способную индуцировать ответ ЦТЛ.

Т-клеточный "эпитоп" - это короткая пептидная молекула, которая связывается с молекулой МНС I или II класса и которая впоследствии распознаётся Т-клеткой. Т-клеточные эпитопы, которые связываются с молекулами МНС I класса, типично имеют длину в 8-14 аминокислот и, особенно типично, длину в 9 аминокислот. Т-клеточные эпитопы, которые связываются с молекулами МНС II класса, типично имеют длину в 12-30 аминокислот. В случае эпитопов, которые связываются с молекулами МНС II класса, одинаковые Т-клеточные эпитопы могут иметь общий центральный сегмент, но различаться по длине карбокси- и аминотерминальных примыкающих последовательностей вследствие того факта, что концы пептидной молекулы не углублены в структуру пептидсвязывающей бороздки молекулы МНС II класса, как то имеет место быть с пептидсвязывающей бороздкой молекулы МНС I класса.

Существуют три различных генетических локуса, которые кодируют для молекул МНС I класса: НЬА-А, НЬА-В и НЬА-С. НЬА-А1, НЬА-А2 и НЬА-А11 являются примерами различных молекул МНС I класса, которые могут экспрессироваться из этих локусов.

Используемая здесь ссылка на последовательность ДНК включает как однонитевую, так и двухнитевую ДНК. Таким образом, специфическая последовательность, если в контексте не указано иное, относится к однонитевой ДНК такой последовательности, дуплексу такой последовательности с его комплементом (двухнитевая ДНК) и комплементу такой последовательности. Термин "кодирующая область" относится к тому участку гена, который естественно или нормально кодирует для экспрессионного продукта того гена в его естественном геномном окружении, т.е., участку, кодирующему ίη νίνο для нативного продукта экспрессии гена.

Кодирующая область может быть из нормального, мутировавшего или измененного гена или может даже быть из последовательности ДНК, или же гена, целиком синтезированного в лаборатории с использованием методов, хорошо известных специалистам из области синтеза ДНК.

Термин "нуклеотидная последовательность" относится к гетерополимеру дезоксирибонуклеотидов.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая для конкретного пептида, олигопептида или полипептида, может быть встречающейся в природе или может быть получена синтетически. В целом, фрагменты ДНК, кодирующие пептиды, полипептиды и белки данного изобретения, собраны из фрагментов кДНК и коротких олигонуклеотидных линкеров или же из серий олигонуклеотидов для обеспечения синтетического гена, который способен экспрессироваться в рекомбинантной транскрипционной единице, включающей регуляторные элементы, образованные из микробиального или вирусного оперона.

Термин "продукт экспрессии" означает полипептид или белок, являющийся естественным продуктом трансляции гена и кодирующих эквивалентов любой последовательности нуклеиновой кислоты, образующихся в результате вырожденности генетического кода и, таким образом, кодирующих для той/тех же самой(ых) нуклеиновой(ых) кислот(ы).

Термин "фрагмент", если относится к кодирующей последовательности, означает участок нуклеиновой кислоты, включающий меньше, чем полную кодирующую область, продукт экспрессии которого обязательно сохраняет ту же самую биологическую функцию или активность что и продукт экспрессии полной кодирующей области.

Термин "фрагмент ДНК" относится к полимеру ДНК в виде отдельного фрагмента или в качестве компонента более крупной конструкции ДНК, которая была образована из ДНК, изолированной, по крайней мере, один раз в существенно чистой форме, т.е., без контаминирующих эндогенных материалов и в количестве или с концентрацией, позволяющей идентификацию, манипуляцию и получение фрагмента и его составных нуклеотидных последовательностей стандартными биохимическими методами, например, с использованием вектора для клонирования. Такие фрагменты обеспечиваются в форме открытой рамки считывания, не прерываемой внутренними не-транслированными последовательностями или нитронами, которые типично присутствуют в эукариотических генах. Последовательности нетранслированной ДНК могут быть представлены по ходу транскрипции из открытой рамки считывания,

- 3 029831

где она не интерферирует с манипуляцией или экспрессией кодирующих областей.

Термин "праймер" означает короткую последовательность нуклеиновой кислоты, которая может быть спарена с одной нитью ДНК и обеспечивает свободный конец 3'ОН, на котором ДНК-полимераза начинает синтезировать дезоксирибонуклеотидную цепь.

Термин "промотор" означает участок ДНК, задействованный в связывании РНК-полимеразы для инициации транскрипции.

Понятие "изолированный" означает, что материал удален из его исходного окружения (к примеру, естественное окружение, если он встречается в природе). Например, встречающийся в природе полинуклеотид или полипептид, представленный в живых организмах, не является изолированным, но тот же самый полинуклеотид или полипептид, выделенный из некоторых или всех сосуществующих материалов природной системы, является изолированным. Такие полинуклеотиды могли быть частью вектора и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могли быть частью композиции и все-таки могли быть изолированы, так что такой вектор или композиция не является частью своего естественного окружения.

Полинуклеотиды и рекомбинантные или иммуногенные полипептиды, раскрытые в соответствии с настоящим изобретением могут также быть в "очищенной" форме. Термин "очищенный" не требует абсолютной чистоты; скорее он предназначен для дачи относительного определения и может включать препараты с высокой очисткой или препараты только с частичной очисткой, в соответствии с тем, как эти термины понимаются специалистами соответствующей области. Например, отдельные клоны, изолированные из библиотеки кДНК, обычно очищались до электрофоретической чистоты. Очистка исходного материала или природного материала до, по крайней мере, одного порядка величины, предпочтительно двух или трех порядков, и, более предпочтительно, четырех или пяти порядков величины определенно рассматривается. Более того, определенно рассматривается заявленный полипептид, чистота которого составляет, предпочтительным образом, 99,999% или по крайней мере 99,99% или 99,9%; и еще более желательно 99% по весу или более.

Нуклеиновые кислоты и продукты экспрессии полипептида, раскрываемые в соответствии с настоящим изобретением, в равной степени, как и векторы экспрессии, содержащие такие нуклеиновые кислоты и/или такие полипептиды, могут быть в "обогащенной форме". Используемый здесь термин "обогащенный" означает, что концентрация материала, по крайней мере, в прибл. 2, 5, 10, 100 или 1000 раз выше его естественной концентрации (например), преимущественно 0,01 вес.%, предпочтительно по крайней мере около 0,1 вес.%. Рассматриваются также препараты с около 0,5, 1, 5, 10 и 20 вес.%. Последовательности, конструкции, векторы, клоны и другие материалы, включенные в настоящее изобретение, могут предпочтительно быть в обогащенной или изолированной форме.

Термин "активный фрагмент" означает фрагмент, который дает иммунный ответ (т.е. обладает иммуногенной активностью), если он введен отдельно или опционально с подходящим адъювантом животному, такому как млекопитающее, например, кролику или мыши, также включая человека; таковой иммунный ответ, принимающий форму стимуляции ответа ЦТЛ у животного-реципиента, такого как человек. Альтернативно "активный фрагмент" может также быть использован для инициации ответа ЦТЛ ίη νίίτο.

Используемые здесь термины "участок", "сегмент" и "фрагмент", если они использованы по отношению к полипептидам, относятся к непрерывной последовательности остатков, таких как аминокислотные остатки, последовательность которых формирует подкласс более крупной последовательности. Например, если полипептид был подвергнут обработке любой из известных эндопептидаз, таких как трипсин или химотрипсин, то полученные в результате такой обработки олигопептиды будут представлять участки, сегменты или фрагменты исходного полипептида. Это означает, что любой таковой фрагмент будет обязательно содержать как часть его аминокислотной последовательности сегмент, фрагмент или участок, который в значительной степени идентичен, если не в точности идентичен последовательности с 5>ЕО ГО № 1 по 11, которая соответствует встречающимся в природе или "материнским" белкам последовательностей с 5>ЕО ГО № 1 по 11. При использовании по отношению к полинуклеотидам такие термины относятся к продуктам, полученным при обработке указанных полинуклеотидов любой из известных эндонуклеаз.

В соответствии с настоящим изобретением термин "процентная доля идентичности" или "идентичный с процентной долей", если он относится к последовательности, означает, что последовательность сравнивается с заявленной или описанной последовательностью после противопоставления сравниваемой последовательности ("Сравниваемая последовательность") описанной или заявленной последовательностью ("Контрольная последовательность"). Процентная доля идентичности определяется затем по следующей формуле:

Процентная доля идентичности = 100 |1-(С/Р)|.

где "С" является числом различий между Контрольной последовательностью и Сравниваемой последовательностью по длине противопоставления между Контрольной последовательностью и Сравниваемой последовательностью, где

(ί) каждое основание или аминокислота в Контрольной последовательности, которые не имеют соответствующего противопоставленного основания или аминокислоты в Сравниваемой последовательно- 4 029831

сти, и

(ίί) каждая брешь в Контрольной последовательности и

(ίίί) каждое противопоставленное основание или аминокислота в Контрольной последовательности, которые отличаются от противопоставленного основания или аминокислоты в Сравниваемой последовательности, представляют собой различие;

и "К" - это число оснований или аминокислот в Контрольной последовательности по длине противопоставления Сравниваемой последовательности с любой брешью, образующейся в Контрольной последовательности, считающейся также за основание или аминокислоту.

Если существует противопоставление между Сравниваемой последовательностью и Контрольной последовательностью, для которых процентная доля идентичности, по расчётам выше, имеет значение приблизительного равенства или "более чем" установленной минимальной Процентной доли идентичности, тогда Сравниваемая последовательность имеет установленную минимальную процентную долю идентичности с Контрольной последовательностью, если даже могут существовать противопоставления, в которых подсчитанная здесь выше Процентная доля идентичности меньше, чем установленная Процентная доля идентичности.

Исходные пептиды, раскрываемые здесь, могут быть модифицированы путём замещения одного или нескольких остатков в различных, по возможности отобранных, местах по длине пептидной цепи, если не заявлено иное. Такие замещения могут носить консервативный характер, например, где одна аминокислота заменяется аминокислотой с похожей структурой и характеристиками, так же как при замене гидрофобной аминокислоты на другую гидрофобную аминокислоту. Ещё более консервативным будет замещение аминокислот одинакового или похожего размера и химического характера, такое как при замене лейцина на изолейцин. В исследованиях вариаций последовательностей внутри семейств встречающихся в природе гомологичных белков определённые замещения аминокислот переносятся гораздо чаще, чем другие, и они часто проявляют взаимосвязь со сходствами по размеру, заряду, полярности и гидрофобности между исходной аминокислотой и её заменой; и таковой является основа определения "консервативных замещений".

Консервативные замещения определены здесь как обмены внутри одной из последующих пяти групп: группа 1 - малые, алифатические, неполярные или слабо полярные остатки (А1а, §ет, ТЬт, Рго, С1у); группа 2 - полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды (Акр, Акп, С1и, С1п); группа 3 полярные, положительно заряженные остатки (Ηίκ, Агд, Ьук); группа 4 - крупные, алифатические, неполярные остатки (Ме1. Ьеи, 11е, Уа1, Сук); и группа 5 - крупные, ароматические остатки (РЬе, Туг, Тгр).

Менее консервативные замещения могут охватывать замещение одной аминокислоты другой, имеющей похожие характеристики, но отличающейся в какой-то степени по размеру, как в случае замещения аланина остатком изолейцина. Высоко неконсервативные замещения могут охватывать замещение кислой аминокислоты другой, которая имеет полярность, или даже такой, которая имеет щелочной характер. Такие "радикальные" замещения не могут, однако, быть отвергнуты как потенциально неэффективные из-за того, что химические эффекты не полностью предсказуемы, и радикальные замещения могут привести к увеличению случайных эффектов, в противном случае не предсказуемых, исходя из обычных химических принципов.

Разумеется, в таких замещениях могут участвовать другие структуры, отличающиеся от обычных Ь-аминокислот. Таким образом, Ό-аминокислоты могут быть замещены Ь-аминокислотами, обычно встречающимися в антигенных пептидах по изобретению и также охватываемые настоящим раскрытием сущности изобретения. Кроме того, аминокислоты, содержащие нестандартные К-группы (т.е. К-группы, отличающиеся от обнаруженных в распространённых 20 аминокислотах природных белков) могут быть также использованы в целях замещения для получения иммуногена и иммуногенных полипептидов в соответствии с настоящим изобретением.

Если были произведены замещения на более чем одной позиции для получения пептида с практически эквивалентной или большей антигенной активностью, чем та, что определена ниже, то комбинации таких замещений будут проанализированы для определения того, приведут ли эти комбинации замещений к дополнительным или синергетическим эффектам по отношению к антигенности пептида. По большей части не более 4 позиций внутри пептида должны замещаться одновременно.

Термин "Т-клеточный ответ" означает специфическую пролиферацию и активацию эффекторных функций, индуцированных пептидом ίη νίΐτο или ίη νίνο. Для ЦТЛ, рестриктированных по МНС класса I, эффекторными функциями может быть лизис клеток-мишеней с введенным импульсным способом пептидом, с введенным импульсным способом предшественником пептида или клеток-мишеней, естественно презентирующих пептид, секреция цитокинов, предпочтительно интерферона-гамма, ΤΝΡ-альфа или ИЛ-2, индуцированная пептидом, секреция эффекторных молекул, предпочтительно гранзимов или перфоринов, индуцированная пептидом, или дегрануляция. Для Т-хелперных клеток, рестриктированных по МНС класса II, эффекторными функциями может быть индуцированная пептидом секреция цитокинов, предпочтительно, ΙΡΝ-гамма, ΤΝΡ-альфа, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10 или ИЛ-2, или индуцированная пептидом дегрануляция. Возможные эффекторные функции ЦТЛ и Т-хелперных клеток не ограничиваются данным списком.

- 5 029831

Основываясь на цитотоксических анализах, эпитоп считается по существу идентичным контрольному пептиду, если он имеет, по крайней мере, 10% антигенной активности контрольного пептида, как то определено способностью замещенного пептида восстанавливать эпитоп, распознанный ЦТЛ, в сравнении со контрольным пептидом. Таким образом, при сравнении лизирующей активности на линейном участке кривой эффектор/мишень с эквимолярными концентрациями сравниваемого и замещенного пептидов наблюдаемое процентное соотношение специфического уничтожения клеток-мишеней, инкубированных с замещенным пептидом, должно быть равным показателю контрольного пептида в соотношении эффектор/мишень, который не выше, чем в 10 раз, чем соотношение эффектор/мишень контрольного пептида, по которому было произведено сравнение.

Предпочтительно, если ЦТЛ, специфичные для пептида с 5>ЕО ГО № 1 по 5>ЕО ГО № 11, протестированы на замещённые пептиды; концентрация пептида, при которой замещённые пептиды достигают половины максимального роста лизиса относительно фона, составляет не более чем около 1 мМ, предпочтительно, не более чем около 1 мкМ, более предпочтительно, не более чем около 1 нМ, и ещё более предпочтительно не более чем около 100 пМ и, наиболее предпочтительно, не более чем около 10 пМ. Также предпочтительно, чтобы замещённый пептид распознавался ЦТЛ более чем одного индивида, по крайней мере, двух и, более предпочтительно, трёх индивидов.

Таким образом, эпитопы настоящего изобретения могут быть идентичны встречающимся в природе опухолеассоциированным или опухолеспецифическим эпитопам или могут включать эпитопы, отличающиеся не более чем 4 остатками от контрольного пептида, при условии, что они имеют, по существу, идентичную антигенную активность.

Стимуляция иммунных ответов зависит от присутствия антигенов, распознающихся иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов сейчас улучшило возможности для использования иммунной системы хозяина для способствования иммунному ответу, специфическому для антигенов-мишеней, экспрессированных на поверхности опухолевых клеток, который благодаря данному механизму действия способен вызывать регрессию, задержку или замедление роста опухоли. Различные механизмы объединения обеих ветвей иммунной системы, как гуморальной, так и клеточной, исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака.

Специфические элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Изоляция цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухоль-инфильтрирующих клеточных популяций или из периферической крови предполагает, что такие клетки играют важную роль в естественной иммунной защите против рака (СНссусг е! а1., 1993; Ζοΐι. III е! а1., 1999). Основываясь на 415 тканевых препаратах пациентов, страдающих от колоректального рака, Оа1ои и соавторы были в состоянии продемонстрировать, что вид, плотность и местонахождение иммунных клеток в опухолевой ткани являются действительно лучшим прогностическим фактором выживаемости пациентов, чем широко используемая классификация опухолей по ΤΝΜ (Оа1ои е! а1., 2006). В частности, СЭ8-положительные Т-клетки (ΤΟΟ8+), которые распознают молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС) с пептидами, имеющими обычно 8-10 аминокислотных остатков, образованных из белков, дефектных рибосомных продуктов (ИРГОк) (§сНиЬег1 е! а1., 2000), играют важную роль в этом ответе. Пептиды, образованные из сплайсированных форм белков, также описаны в литературе. Молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (ИЬА).

Существуют два класса молекул МНС: молекулы МНС I класса, встречающиеся на большинстве клеток, имеющих ядро. Молекулы МНС состоят из альфа-тяжелой цепи и бета-2-микроглобулина (рецепторы МНС класса I) или альфа- и бета-цепи (рецепторы МНС класса II), соответственно. Их трехмерная форма образует связывающую бороздку, которая используется для нековалентного взаимодействия с пептидами. МНС класса I презентируют пептиды, образующиеся из протеолитического расщепления преимущественно эндогенных белков, ИРГРк и более крупных пептидов. Молекулы МНС II класса могут встречаться преимущественно на профессиональных антигенпрезентирующих клетках (АПК) и, в первую очередь, презентировать пептиды экзогенных или трансмембранных белков, которые поглощаются АПК в период эндоцитоза и впоследствии процессируются (Сге88№е11, 1994). Комплексы из пептида и молекул МНС класса I распознаются СЭ8-положительными цитотоксическими Т-лимфоцитами, несущими подходящий ТКР (Т-клеточный рецептор), а комплексы из пептида и молекул МНС класса II распознаются СЭ4-положительными хелперными Т-клетками, несущими подходящий ТКР. Хорошо известно, что ТКР, пептид и МНС часто встречаются в стехиометрическом соотношении 1:1:1.

СЭ4-положительные хелперные Т-клетки играют важную роль в индуцировании и поддержании эффективных ответов СЭ8-положительных цитотоксических Т-клеток (\Уапд апб Ыушд8!оие, 2003; §ии апб Веуаи, 2003; §Неб1оск апб §Неи, 2003). Для этой цели идентификация СИ4-положительных Тклеточных эпитопов, образованных из опухолеассоциированных антигенов (ТАА), может быть чрезвычайно важна для разработки фармацевтических препаратов для инициации противоопухолевых иммунных ответов (КоЬауакЫ е! а1., 2002; Οίπ е! а1., 2003; Ои)абс е! а1., 2003).

При отсутствии воспаления экспрессия молекул МНС II класса преимущественно рестриктирована по клеткам иммунной системы, в особенности профессиональным антигенпрезентирующим клеткам (АПК), например, моноцитам, образованным из моноцитов клеткам, макрофагам, дендритным клеткам.

- 6 029831

Неожиданно было обнаружено, что опухолевые клетки раковых пациентов экспрессируют молекулы МНС класса II (Эепд)е1 е! а1., 2006).

На моделях млекопитающих животных, например, мышах, было показано, что даже при отсутствии эффекторных клеток (т.е. СЭ8-положительных Т-лимфоцитов), СЭ4-положительных Т-клеток достаточно для ингибирующего проявления опухолей посредством ингибирования ангиогенеза при секреции интерферон-гамма (ΙΡΝγ) (Οίη апб В1апкеп81еш, 2000). К тому же было показано, что СЭ4-положнтельные Т-клетки, распознающие пептиды из опухолеассоциированных антигенов, презентированные молекулами НЬЛ класса II, могут препятствовать опухолевой прогрессии посредством индукции ответов антител (ЛЬ) (Кеппебу е! а1., 2003). В отличие от опухолеассоциированных пептидов, связывающихся с молекулами НЬЛ класса I, до сих пор было описано лишь небольшое число опухолеассоциированных лигандов класса II (ууу.сапсебттипНу.огд, \у\у\у.5уГреШи.бе).

Так как конститутивная экспрессия молекул НЬЛ класса II обычно ограничена клетками иммунной системы (Масй е! а1., 1996), то возможность изоляции пептидов класса II напрямую из первичных опухолей считалась невозможной. Тем не менее, Эепд|е1 с соавторами недавно удалось идентифицировать ряд эпитопов МНС класса II напрямую из опухолей (\УО 2007/028574, ЕР 1 760 088 В1; (Эепд)е1 е! а1., 2006).

Для того чтобы пептид инициировал (вызывал) клеточный иммунный ответ, он должен связываться с молекулой МНС. Этот процесс зависит от аллеля молекулы МНС и специфических полиморфизмов аминокислотной последовательности пептида. Пептиды, связывающиеся с МНС класса I, имеют обычно 8-10 аминокислотных остатков в длину и обычно содержат два консервативных остатка ("якори") в их последовательности, которые взаимодействуют с соответствующей связывающей бороздкой молекулы МНС. Таким способом каждый аллель МНС имеет "соединительный элемент", определяющий, какие пептиды могут специфически связываться со связывающей бороздкой (Каттепкее е! а1., 1997).

В зависящей от МНС класса I иммунной реакции пептиды не только должны быть в состоянии связываться с конкретными молекулами МНС класса I, экспрессируемыми опухолевыми клетками, но они также должны распознаваться Т-клетками, несущими специфические Т-клеточные рецепторы (ТКР).

Антигены, которые распознаются опухолевыми специфическими цитотоксическими Тлимфоцитами, то есть их эпитопами, могут быть молекулами, образованными из любого класса белков, таких как ферменты, рецепторы, факторы транскрипции и т.д., которые экспрессированы и по сравнению с неизмененными клетками того же происхождения находятся в повышенном количестве в клетках соответствующей опухоли.

Актуальная классификация опухолеассоциированных антигенов включает следующие основные группы (Νο\ό11ηιο е! а1., 2005):

1. Раковые антигены семенника: первые в истории идентифицированные ТАА, которые могут распознаваться Т-клетками (уап бег Вгиддеп е! а1., 1991), принадлежат к этому классу, называвшемуся первоначально "антиген ракового семенника" (СТ), так как его члены экспрессируются в отличных по гистологической структуре опухолях человека, а среди нормальных тканей - только в сперматоцитах/сперматогониях семенника и, изредка, в плаценте. Так как клетки семенника не экспрессируют молекулы НЬА I и II класса, то эти антигены не могут быть распознаны Т-клетками в нормальных тканях и, поэтому, могут рассматриваться как иммунологически опухолеспецифические. Хорошо известными примерами антигенов СТ являются члены семейства МАСЕ или ΝΥ-ΕδΟ-1.

2. Дифференциационные антигены: данные ТАА встречаются в опухолевых и нормальных тканях, из которых образуется опухоль; большинство из них имеется в меланомах и нормальных меланоцитах. Многие из этих линиеспецифических белков меланоцитов участвуют в биосинтезе меланина и, поэтому, не являются опухолеспецифическими, однако, несмотря на это, они широко применяются в противораковой терапии. Примеры включают, но не ограничиваются, тирозиназой и Ме1ап-А/МАКТ-1 для меланомы или Р8А для рака простаты.

3. Гиперэкспрессированные ТАА: гены, кодирующие широко экспрессированные ТАА, были обнаружены в отличных по гистологической структуре опухолях, а также во многих нормальных тканях, в основном, с более низким уровнем экспрессии. Возможно, что многие эпитопы, процессируемые и потенциально презентируемые нормальными тканями, находятся ниже порогового уровня для распознавания Т-клетками, в то время как их гиперэкспрессия в опухолевых клетках может инициировать противораковый ответ, нарушая установившуюся ранее толерантность. Известными примерами ТАА этого класса являются Нег-2/пеи, сурвивин, теломераза или \УТ1.

4. Опухолеспецифические антигены: данные уникальные ТАА образуются из мутаций нормальных генов (таких как β-катенин, СЭК4 и т.д.). Некоторые из этих молекулярных изменений ассоциированы с неопластической трансформацией и/или прогрессией. Опухолеспецифические антигены, в основном, способны индуцировать сильные иммунные ответы, не заключая в себе риска аутоиммунных реакций по отношению к нормальным тканям. С другой стороны, данные ТАА в большинстве случаев релевантны только для определенной опухоли, на которой они были идентифицированы, и обычно не являются общими для многих отдельных опухолей.

5. ТАА, образующиеся из абнормальных посттрансляционных модификаций: такие ТАА могут об- 7 029831

разоваться из белков, которые не являются ни специфическими, ни гиперэкспрессированными в опухолях, однако, несмотря на это, становятся опухолеассоциированными в ходе посттрансляционных процессов, происходящих первоначально в опухолях. Примеры для этого класса берут свое начало в измененных паттернах гликозилирования, приводящих к новым эпитопам в опухолях, как в случае МиС1, или таких процессах как белковый сплайсинг во время деградации, который может или не может быть опухолеспецифическим (Наиаба с1 а1., 2004; Ущпсгоп с1 а1., 2004).

6. Онковирусные белки: данные ТАА являются вирусными белками и могут играть ведущую роль в онкогенном процессе, и, так как они являются чужеродными (не человеческого происхождения), они могут провоцировать Т-клеточный ответ. Примерами таких белков являются вирусные белки человеческой папилломы типа 16, Е6 и Е7, которые экспрессированы в карциноме шейки матки.

Для того чтобы белки были узнаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифического или -ассоциированного антигена, и в целях применения в терапии должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен экспрессироваться преимущественно опухолевыми клетками, а не здоровыми тканями или в сравнительно малом объеме. В дальнейшем желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в каком-либо виде опухоли, но и также имел высокую концентрацию (т.е. число копий соответствующего пептида на клетку). Опухолеспецифические и опухолеассоциированные антигены часто образованы из белков, напрямую задействованных в трансформации нормальной клетки в опухолевую, в связи с функцией, например, при контроле клеточного цикла или подавлении апоптоза. Кроме того, мишени нисходящего пути белков, напрямую являющихся причиной трансформации, могут быть также представлены в повышенном количестве и, таким образом, косвенно опухолеассоциированными. Такие косвенно опухолеассоциированные антигены могут также быть мишенями вакцинационного подхода (81идЬ-1а8И)а с1 а1., 2004). В обоих случаях необходимо, чтобы эпитопы присутствовали в аминокислотной последовательности антигена, поскольку такой пептид ("иммуногенный пептид"), который образован из опухолеассоциированного антигена, должен вести ίη νίίτο или ίη νίνο к Т-клеточному ответу.

В основном, любой пептид, способный связываться с молекулой МНС может выполнять функцию Т-клеточного эпитопа. Предварительным условием для индукции Т-клеточного ответа ίη νίίτο или ίη νίνο является присутствие Т-клетки с соответствующим ТКР и отсутствие иммунологической толерантности к данному конкретному эпитопу.

Поэтому, опухолеассоциированные антигены (ТАА) являются отправным пунктом для разработки противораковой вакцины. Методы идентификации и характеристики ТАА основаны на использовании ЦТЛ, которые могут быть изолированы у пациентов или здоровых субъектов, или же они основаны на генерировании дифференциальных транскрипционных профилей или дифференциальных паттернов пептидной экспрессии между опухолевыми и нормальными тканями (Ьетте1 с1 а1., 2004; \νοίη5α1ιοη1< с1 а1., 2002).

Однако идентификация генов, гиперэкспрессированных в опухолевых тканях или человеческих опухолевых клеточных линиях или же селективно экспрессированных в таких тканях или клеточных линиях, не обеспечивает точной информацией относительно использования антигенов, транскрибированных с данных генов, в иммунотерапии. Причиной тому то, что только отдельная субпопуляция эпитопов этих антигенов подходит для такого применения, так как Т-клетка с соответствующим ТКР должна быть в наличии, и необходимо, чтобы отсутствовала или была минимальной иммунологическая толерантность к этому конкретному эпитопу. Поэтому важно выбрать лишь те пептиды из гиперэкспрессированных или селективно экспрессированных белков, которые презентируются в соединении с молекулами МНС, против которых может быть обнаружена функциональная Т-клетка. Такая функциональная Т-клетка определяется как Т-клетка, которая при стимуляции специфическим антигеном может быть распространена клонально и способна к выполнению эффекторных функций ("эффекторная Т-клетка"). В типичные функции Т-клеток входят секреция интерферон-гамма, перфорина и гранзимов.

Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных клеток типа Т_Н1, поддерживают эффекторные функции СЭЗ-положительных киллерных Т-клеток, которые включают цитотоксические функции, направленные против опухолевых клеток, проявляющих опухолеассоциированные пептиды/МНС-комплексы на их клеточной поверхности. Таким образом, опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, одни или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы.

Так как оба вида ответов, зависящие от СЭ8 и от СЭ4, вносят свой вклад в противоопухолевый эффект сообща и усиливая друг друга, то идентификация и характеристика опухолеассоциированных антигенов, распознаваемых как ί'.Ό8+ ЦТЛ (лиганд: молекула МНС I класса + пептидный эпитоп), так и СЭ4положительными хелперными Т-клетками (лиганд: молекула МНС II класса + пептидный эпитоп) являются важными при разработке противоопухолевых вакцин.

Поэтому целью настоящего изобретения является обеспечение новых аминокислотных последовательностей для пептидов, которые способны связываться с комплексами МНС любого класса.

- 8 029831

Краткое описание чертежей

На фиг. 1а и Ь представлены масс-спектры ΕδΙ-жидкостной хроматографии, идентифицирующие опухолеассоциированные пептиды (ТИМАРк) РТР-001 из пробы глиобластомы ОБ 1006 и РТР-002 из пробы глиобластомы ОВ6003, которые презентируются как рестриктированные по МНС класса I.

На фиг. 2 показан профиль экспрессии мРНК гена ΡΤΡΚΖ1, кодирующего пептиды, ассоциированные с глиобластомой, представленные в табл. 1. Экспрессия этого гена отсутствует или находится на низком уровне в нормальных тканях, в то время как она сильно увеличена в пробах глиобластомы (ОВ1006Т по ОВ1011Т; ЫСН359Т и ЫСН361Т).

На фиг. 3 представлен репрезентативный пример для РТР-002-специфических СЭ8+ Т-клеток одного здорового донора с НЬЛ-Л*0201 после стимуляции ίη νΐίτο РТР-002, как было определено проточным цитометрическим анализом. СЭ8+ Т-клетки были изолированы из человеческих МПК здорового донора и примированы ίη νΐίτο с использованием молекулярно дефинированных "искусственных антигенпрезентирующих клеток" (аАПК), нагруженных ко-стимулирующими молекулами и А*0201/РТР-002 (левая диаграмма) или нерелевантным пептидом А*0201 (правая диаграмма) (\Уа11сг οί а1., 2003). После трех циклов стимуляции детекция пептид-реактивных клеток производилась окрашиванием РТР-002- и нерелевантными пептид-тетрамерами. Клетки высаживали в популяцию лимфоцитов СЭ8+. и процентные доли показывают частотность тетрамер-положительных клеток внутри этой популяции.

На фиг. 4 представлены аффинности пептидов по изобретению к НЬЛ-Л*0201. константы диссоциации (К_с) пептидов НЬЛ класса I и пептида вирусного маркера НВУ-001 были измерены основанным на методике ΕΜδΆ анализом (см. пример 4).

Подробное описание изобретения

Данным изобретением обеспечиваются пептиды, полезные для лечения глиобластомы. Как непосредственно показал масс-спектрометрический анализ, эти пептиды естественно презентировались молекулами НЬЛ на пробах первичной глиобластомы человека (см. пример 1 и фиг. 1). Исходный ген, из которого образованы десять этих пептидов -РТР^1 - был представлен в гиперэкспрессированном состоянии в глиобластоме в сравнении с нормальными тканями (см. пример 2 и фиг. 2), демонстрируя высокую степень ассоциации данных пептидов с опухолью, т. е. эти пептиды в большом количестве презентируются на опухолевой ткани, но не на нормальных тканях. Исходный ген, из которого образован одиннадцатый пептид - СН13Ь2 - был первоначально идентифицирован из хондроцитов. Связанные с НЬЛ пептиды могут распознаваться иммунной системой, специально Т-лимфоцитами/Т-клетками. Т-клетки могут разрушать клетки, презентирующие распознанный комплекс НЬЛ/пептид; к примеру, опухолевые клетки глиобластомы, презентирующие образованные из РТР^1- или СН13Ь2 пептиды. Как было показано, некоторые пептиды настоящего изобретения в состоянии стимулировать Т-клеточные ответы (см. Пример 3 и фиг. 3). Таким образом, пептиды полезны для генерирования иммунного ответа у пациента, который может уничтожать опухолевые клетки. Иммунный ответ у пациента может быть индуцирован при непосредственном введении описанных пептидов или подходящих веществ-предшественников (к примеру, удлиненных пептидов, белков или нуклеиновых кислот, кодирующих эти пептиды) пациенту, в идеальном случае в комбинации с веществом, усиливающим иммуногенность (т.е. адъювантом). От иммунного ответа, вызванного такой терапевтической вакцинацией, может ожидаться, что он будет высоко специфическим против опухолевых клеток, так как целевые пептиды настоящего изобретения не презентируются на нормальных тканях, предотвращая тем самым риск нежелательных аутоиммунных реакций против нормальных клеток у пациента.

Кроме того, пептиды настоящего изобретения полезны не только для лечения рака, но и также в качестве диагностических средств. Так как пептиды были получены из глиобластомы, и так как было определено, что данные пептиды не присутствуют в нормальных тканях, то эти пептиды могут быть использованы для постановки диагноза о наличии рака.

Присутствие заявленных ТИМАРк на тканевых биоптатах может помочь патологу в постановке диагноза рака. Детекция конкретных ТИМАРк с помощью антител, масс-спектрометрии или других методов, известных из уровня техники, могут дать знать патологу, что ткань поражена злокачественным или воспалительным или же заболеванием общего порядка. Присутствие групп пептидов ТИМАР может позволить классифицировать или выделить подклассы пораженных тканей.

Детекция пептидов ТИМАР на образцах пораженной заболеванием ткани может позволить принять решение о преимуществах от терапии, воздействующей на иммунную систему, в особенности, если Тлимфоциты, как известно или ожидается, задействованы в механизме действия. Отсутствие экспрессии МНС является хорошо описанным механизмом, при котором инфицированные или злокачественные клетки уклоняются от иммунного надзора. Таким образом, присутствие пептидов ТИМАР показывает, что этот механизм не используется проанализированными клетками.

ТИМАР могут использоваться в анализе ответов лимфоцитов против этих пептидов, таких как Тклеточные ответы или ответы антител против ТИМАР или ТИМАР в комплексе с молекулами МНС. Данные иммунные ответы лимфоцитов могут использоваться в качестве прогностических маркеров для принятия решения о дальнейших этапах терапии. Данные иммунные ответы могут также использоваться в качестве суррогатных маркеров в иммунотерапевтических подходах, направленных на индуцирование

- 9 029831

ответов лимфоцитов с помощью различных средств, как, например, вакцинации белком, нуклеиновыми кислотами, аутологичными материалами, адоптивного переноса лимфоцитов. При генной терапии ответы лимфоцитов на пептиды ΤϋΜΆΡ могут быть рассмотрены в рамках оценки побочных эффектов. Мониторинг ответов лимфоцитов может также быть ценным инструментом для последующих обследований в случае трансплантации, к примеру, для детекции реакций "хозяин против трансплантата" и "трансплантат против хозяина".

ΤϋΜΑΡ могут использоваться для генерации и разработки специфических антител к комплексам МНС/ΤϋΜΑΡ. Они могут быть использованы в терапии, нацеливающей токсины или радиоактивные вещества на пораженную ткань. Другим видом использования данных антител может быть "нацеливание" радионуклидов на пораженную ткань в целях визуализации, такой как ΡΕΤ (позитронноэмиссионная томография). Это может помочь в обнаружении небольших метастазов или в определении размера и точного расположения пораженных тканей.

Кроме того, пептиды могут быть использованы для верификации диагноза патолога, поставленного на основании биоптата.

В табл. 1 показаны пептиды в соответствии с настоящим изобретением, соответствующие им номера последовательностей 9179 II) №, аллели НБА, с которыми связываются соответствующие пептиды и исходные белки, из которых могут быть образованы данные пептиды.

Таблица 1. Пептиды настоящего изобретения

5ΕΩ ГО №	Код пептида	Последовательность	Аллели ньа	Исходный белок (белки)
1	РТР-001	ΑΙ.ΤΤΙ.ΜΗΟΙ.	Α*0205	ΡΤΡΡΖ1
2	РТР-002	ΡΙ ΥΚνΐΙ 3Ι	Α*02	ΡΤΡΡΖ1
3	РТР-003	ΑΙΙΌΟνΕδν	Α*02	ΡΤΡΡΖ1
4	РТР-004	ΡΙ_Ι_ΡϋΤϋΟΙ_	Α*02	ΡΤΡΡΖ1
5	РТР-005	ΚνΡΑΟΙΡΤν	Α*02	ΡΤΡΡΖ1
6	РТР-006	ΟΟ3ΌΥ3ΑΑΙ.	Α*02#	ΡΤΡΡΖ1
7	РТР-007	ΤΟΌΌΥνί-Εν	Α*02#	ΡΤΡΡΖ1, РТРРС
8	РТР-008	ΟΗΕΟΤνΝΙΡ	Β*38	ΡΤΡΡΖ1
9	РТР-009	5νΡΟΟΌΝΚΑΙ_5Κ	Не определено	ΡΤΡΡΖ1
10	РТР-010	ΕΙ<3νν5ΥΤΟΑΙ ΝΟΚΝ	ΗΙ Α-ΌΡ	ΡΤΡΡΖ1
11	СН1-001	5Ι\Λ/ΑΟ\ΛΛ/Ι	Α*02	СН131.2

# вероятно, подвид А*205.

Неожиданным образом, было обнаружено, что 9179 ГО № 2 презентируется в первичной аденосквамозной карциноме (форма рака легких) и может, поэтому использоваться для лечения названной формы рака в соответствии с описанным выше.

Белковая тирозин-фосфатаза, рецепторного типа, Ζοίαΐ (ΡΤΡΚΖ1, РТР-ξ)

ΡΤΡΚΖ1 является членом семейства белковых тирозинфосфатаз рецепторного типа и кодирует проходящий через мембрану только один раз мембранный белок I типа с двумя цитоплазматическими тирозин-белковыми фосфатазными доменами, одним альфа-углеродным ангидразным доменом и фибронектиновым доменом III типа. ('и е! а1., 2006), при раке груди (Ιϋκ'ζ-Ριικτπ е! а1., 2007), при повторной миелинизации олигодендроцитов при поражении множественным склерозом (Наггоей е! а1., 2002) и в эмбриональных клетках почек человека в условиях гипоксии ('апд е! а1., 2005).

Как белок, так и транскрипт гиперэкспрессированы в клетках глиобластомы, способствуя их гаптотактической миграции (йи е! а1., 2005). Кроме того, ΡΤΚΡΖ1 часто амплифицирован на уровне геномной ДНК в глиобластоме (Ми1йо11апй е! а1., 2006).

Кар1ап и соавторы клонировали 3 гена человеческих рецепторов РТР, включая РТР-γ (Кар1ап е! а1., 1990). Было показано, что один аллель ΡΤΡΟ был потерян в 3 из 5 клеточных линий почечной карциномы и в 5 из 10 опухолевых проб карциномы легких, которые были исследованы. РТР-γ мРНК был экспрессирован в клеточных линиях почек и легких, но не в нескольких исследованных клеточных линиях кроветворной системы. Таким образом, ген РТР-γ проявил характеристики, позволяющие предположить, что он может быть геном-супрессором опухоли в карциноме почек и легкого. ОеЪЪтк и соавторы изолировали мышиный кДНК 5,7 кЪ, кодирующий "новый" член семейства белковых тирозинфосфатаз рецепторного типа, названный ΚΡΤΡμ (ОеЪЪтк е! а1., 1991). кДНК прогнозировала белок из 1.432 аминокислот (не включая сигнальный пептид) с рассчитанной молекулярной массой в 161,636 Да. Кроме того, они клонировали человеческий гомолог, который проявил аминокислотную гомологию в 98,7% с мышиным белком. Спрогнозированный мышиный белок состоял из внеклеточного региона с 722 аминокислотами, содержащего 13 потенциальных сайтов Ν-гликозилирования, одиночного трансмембранного домена, и внутриклеточной части с 688 аминокислотами, содержащей два тандемных повтора, гомологичных с каталитическими доменами других тирозинфосфатаз. Блот-анализ РНК показал единственный транскрипт, который был наиболее широко распространен в легких, но присутствует также в намного меньшем количестве в головном мозге и сердце. Человеческий ген РТРμ был соотнесен с 18р£ег-ц11 с помощью Саузерн блот-анализа клонов гибридов соматических клеток человека/грызунов.

- 10 029831

ΡΤΡ-ε кДНК была изолирована Кгиедег с соавторами (Кгиедег с1 а1., 1990). Белок из 700 аминокислот имеет короткий внеклеточный домен и два внутриклеточных домена белковой тирозинфосфатазы с тандемным повтором. Высокие уровни транскрипции РТР-е были зафиксированы в головном мозге и семенниках мышей. Обе изоформы РТР- ε -трансмембранная изоформа рецепторного типа и более короткая, цитоплазматическая - видимо, образованы из одного гена посредством использования альтернативного промотора и 5-прайм экзонов.

Вагпеа и соавторы (Вагпеа е1 а1., 1993) клонировали кДНК для генов РТР-γ человека и мыши (называемые РТР-γ в этой группе) из библиотек кДНК головного мозга и анализировали спрогнозированные ими полипептидные последовательности. Человеческие (1.445 аминокислот) и мышиные (1.442 аминокислот) последовательности идентичны на 95% на аминокислотном уровне и прогнозируют предполагаемый внеклеточный домен, отдельный трансмембранный домен и цитоплазматический участок с 2 тандемными каталитическими доменами тирозинфосфатазы. Внеклеточный домен содержит фрагмент из 266 аминокислот, которые сильно сходны с цинк-содержащей ферментной карбоангидразой (ΜΙΜ 114800), позволяя предположить, что РТР-γ и РТР-ξ (ΡΤΡΚΖ1) представляют подсемейство 25 рецепторных тирозинфосфатаз. Ген для РТР-γ имеет 30 экзонов и размер в приблизительно 780 кЬ. Он намного крупнее других рецепторных генов РТР, среди которых ген ΟΌ45 (МТМ 151460) размером в 100 кЬ и других, еще более мелких.

Другая тирозинфосфатаза рецепторного типа, белковая тирозинфосфатаза зета (ΡΤΡΚΖ1) [также известная как ΡΤΡ-ξ, ΗΡΤΡ-ΖΕΤΑ, ΗΡΤΡΖ, ΡΡΤΡ-ΒΕΤΑ(β) или ΡΡΤΡΒ] была изолирована как последовательность кДНК двумя группами в начале девяностых. Ьеуу и соавторы (Ьеуу е1 а1., 1993) изолировали клоны кДНК из экспрессионной библиотеки мРНК ствола детского головного мозга человека и получили полную аминокислотную последовательность крупной белковой тирозинфосфатазы рецепторного типа, содержащей 2.307 аминокислот.

Ьеуу обнаружил, что белок, называемый РТР() (ΡΤΡΚΖ1), является трансмембранным белком с двумя цитоплазматическими доменами РТР-азы и внеклеточным доменом в 1.616 аминокислот. Как в РТР-γ (ΜΙΜ 176886), 266 Ν-терминальных остатков внеклеточного домена имеют высокую степень сходности с углеродными ангидразами (см. ΜΙΜ 114880). Человеческий ген, кодирующий ΡΤΡΚΖ1, был картирован на хромосому 7ц31.3-ц32 при хромосомной гибридизации ίη 8Йи (Апуаша е1 а1., 1995). Анализ методом нозерн-блоттинга показал, что РТР-зета экспрессирована только в центральной нервной системе человека. При гибридизации ίη δίΐιι (Ьеуу е1 а1., 1993) локализировали экспрессию на различных участках головного мозга взрослого человека, включая слой клеток Пуркинье мозжечка, зубчатых извилин и субэпендимальный слой переднего рога желудочка. Ьеуу заявил, что это была первая тирозинфосфатаза млекопитающих, экспрессия которой рестриктирована по нервной системе. Более того, высокие уровни экспрессии в эмбриональном головном мозге мышей позволяют предположить важную роль в развитии ЦНС.

Таким образом, рецепторное семейство РТР белков было охарактеризовано как справедливо отличающееся от других семейство мембраносвязанных рецепторов и не связанных с мембраной изоформ, которые имеют общую архитектуру цитозольного домена РТР-азы. Хотя их экспрессия в фетальных и эмбриональных тканях предполагала связанную с развитием биологическую роль для белков, их полная функция в нормальной биологии и в состоянии болезни до сих пор не понята полностью.

В патенте США 6,455,026 РТР-ξ (ΡΤΡΚΖ1) идентифицирована как мишень при лечении и визуализации опухолей головного мозга. В этой заявке обеспечиваются методы и реагенты для специфического нацеливания на клетки опухоли головного мозга как в терапевтических, так и визуализационных целях. Обеспечиваются основанные на аффинности РТР-ξ соединения и композиции, полезные для лечения опухоли головного мозга у пациента, где композиции и соединения подразделяются, в основном, на две группы: связывающиеся с РТР-ξ конъюгатные соединения, которые включают цитотоксическое составляющее, ингибирующее рост опухолевых клеток; и связывающиеся с РТР- ξ композиции, в которых связующее составляющее РТР-ξ изменяет нормальную функцию РТР-ξ в опухолевой клетке, тем самым, ингибируя рост клетки.

В первой группе обеспечиваются связывающиеся с РТР-ξ терапевтические конъюгатные соединения. Данные соединения имеют общую формулу α(Ρ_ζ)Ο, где α(Ρ_ζ) являются одним или более составляющих, которые специфически связываются с человеческой белковой тирозинфосфатазой-ξ, и С является одним или более цитотоксическим составляющим. В предпочтительных воплощениях (что было раскрыто для всех групп) α(Ρ_ζ) раскрывается как антитело или фрагмент антитела. Во второй группе обеспечиваются связывающиеся с РТР-ξ терапевтические соединения, которые изменяют нормальную функцию РТР-ξ в клетках опухоли головного мозга и ингибируют рост опухолевых клеток головного мозга. Данные связывающиеся с ΡΤΡΚΖ1 терапевтические соединения имеют общую формулу α(Ρ_ζ), где α(Ρ_ζ) является одним или более составляющих, которые специфически связываются с человеческой белковой тирозинфосфатазой-ξ, и где связывание α(Ρ_ζ) изменяет функцию белковой тирозинфосфатазы-ξ.

Патент США № 7,060,275 В2 раскрывает сплайсинговые варианты ΡΤΡΚΖ1, векторы, включающие

- 11 029831

эти варианты, и антигены против различных вариантов.

Хитиназа-3-подобный белок 2 (СШ3Ь2)

СШ3Ь2 был первоначально идентифицирован в хондроцитах. Его часто описывали как антигенмишень при ревматическом артрите. Релевантной взаимосвязи СШ3Ь2 с раком установлено не было. Имелось подозрение, что хитиназа-3-подобные белки стимулируют пролиферацию человеческих клеток соединительной ткани, например, фибробластов, посредством активирования внеклеточной сигналрегулируемой киназы и опосредованных РКВ (протеинкиназа) сигнальных путей (КескИез АО, \У1Шс С, Ппд Н; Тке сЫкпазе 3-Нке рго1еш китап сагШаде д1усорго1с1п 39 (НС-др39) зктикИсз ргокГегакоп οί китам соппссШ'с-кззис се11з апй асШШсз Ьо1к ех1гасе11и1аг З1дпа1-геди1а1ей ктазе- апй рго1ет ктазе ВтсШа1сй з1дпаШпд раИ^ауз; Вюскет ί. 2002; 365:119-126). У мышей был обнаружен сильно повышенный уровень хитиназа-3-подобных белков в моделях индуцированного хеликобактериями рака желудка (Така18Ы §, \Уапд ТС; Оепе ехргеззюп ргойкпд ш а тоизе тойе1 оГ НеИсоЪас1ег-тйисей даз1г1с сапсег; Сапсег δοΐ. 2007 (3): 284-293).

Нигде в известном уровне техники не рассматривалось применение связывающихся с МНС пептидов, образованных из ΡΤΡΡΖ1 или СНЕ3Е2, в качестве активных фармацевтических ингредиентов для лечения опухолей головного мозга.

В первом своем аспекте изобретение обеспечивает, таким образом, пептид, включающий последовательность, которая выбирается из группы 8ЕО ГО № 1 по 8ЕО ГО № 11 или их вариант, который на 80% гомологичен 8ЕО ГО № 1 по 8ЕО ГО № 11, или их вариант, который будет индуцировать Тклеточную перекрестную реакцию с указанным пептидом.

Пептиды изобретения обладают способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I или II.

В настоящем изобретении термин "гомологичный" относится к степени идентичности между последовательностями двух аминокислотных последовательностей, т. е. пептидных или полипептидных последовательностей. Упомянутая ранее "гомология" определяется при сравнении двух последовательностей, сопоставляемых в оптимальных условиях со сравниваемыми последовательностями. Сравниваемые последовательности могут иметь дополнение или делецию (например, разрыв и т.п.) в оптимальном противопоставлении двух последовательностей. Такая гомология последовательности может быть подсчитана с помощью создания противопоставления, например, по алгоритму С1из1а1^У (Хискк АсИ Кез., 1994, 22(22): 4673-4680). Также может быть использовано широко распространенное программное обеспечение для анализа последовательностей, в частности, УесГОг ΝΤΊ, ΟΕΝΕΤΥΧ или аналитические инструменты, предоставляемые общественными банками данных, такие как, например, представленные на сайте кйр://йгадоп.Ъю.ршйие.ейи/ЪюшГокпкз/.

Специалист данной области будет в состоянии оценить, будут ли Т-клетки, индуцированные вариантом специфического пептида, способны к перекрестной реакции с самим пептидом (Ропд с1 а1., 2001Ъ); ЕагетЪа с1 а1., 1997; Со1отЪей1 с1 а1., 2006; Аррау с1 а1., 2006).

"Вариантом" данной аминокислотной последовательности изобретатели обозначают, что боковые цепи, например, одного или двух аминокислотных остатков изменены (например, при их замещении боковой цепью другого встречающегося в природе аминокислотного остатка или какой-либо другой боковой цепью), так что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой НЬА по существу таким же путем, как и пептид, состоящий из данной аминокислотной последовательности с 8ЕО ГО № 1 по 11. Например, пептид может быть модифицирован таким образом, что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность взаимодействовать и связываться со связывающей бороздкой подходящей молекулы МНС, такой как НЬА-А*02 или -ЭК, и, таким образом, он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность связываться с ТКР активированных ЦТЛ. Данные ЦТЛ могут впоследствии вступать в перекрестную реакцию с клетками и уничтожать клетки, которые экспрессируют полипептид, который содержит естественную аминокислотную последовательность родственного пептида, как определено в аспектах этого изобретения. По информации из научной литературы (Каттепзее с1 а1., 1997) и банков данных (Каттепзее с1 а1., 1999) конкретные позиции связывающихся с НЬА пептидов являются типичными якорными остатками, формирующими центральную последовательность, подходящую к соединительному элементу рецептора НЬА, который определяется полярными, электрофизическими, гидрофобными и пространственными свойствами полипептидных цепей, образующих связывающую бороздку. Так, специалист данной области будет в состоянии модифицировать аминокислотные последовательности, предложенные в 8ЕО ГО № 1 по 11, сохраняя известные якорные остатки, и будет в состоянии определить, сохранят ли такие варианты способность связываться с молекулами МНС класса I или П. Варианты настоящего изобретения сохраняют способность связываться с ТКР активированных ЦТЛ, которые могут впоследствии вступать в перекрестную реакцию с и уничтожать клетки, экспрессирующие полипептид, который содержит естественную аминокислотную последовательность родственного пептида, как определено в аспектах этого изобретения.

Те аминокислотные остатки, которые не обязательно вносят вклад во взаимодействие с Тклеточным рецептором, могут быть модифицированы при замещении другой аминокислотой, чье включение, по существу, не влияет на реактивность Т-клетки и не устраняет связь с релевантным МНС. Таким

- 12 029831

образом, помимо данного условия, пептид по изобретению может быть любым пептидом (в обозначение которого изобретатели включают олигопептиды или полипептиды), который включает аминокислотные последовательности или их участок или их вариант, как дано.

Таблица 2. Варианты . и участок пептидов в соответствии с 8ЕЦ. , ГО № 1 по 10

РТР-001	\| Позиция	1	2	3	4	5	6	7	8	9
	Код пептида	А	ь	т	т	ί	м	Н	Ω	Ь
	Варианты		V		Р	Е	V	I	Н	Υ
			Υ		г	ϋ	ί	V	V
					I	К	I	Е
					м	N		А
						Р

		Позиция	1	2	3	4	5	6	7	8	9
РТР-002	Код пептида	г	ь	Υ	К	V	I	ί	8	Ь
	Варианты			м							ί
						Е				К
			I		А	О	I	I	А	Е
			г		Υ	Р	к	ί	Υ	8
			г		г	ϋ	Υ	Т	Н
			к		Р	Т	N
			м		м		О
			Υ		8		Р
			V		К		V
						К	н

РТР-003		Позиция	1	2	3	4	5	6	7	8	9
	Код пептида	А	I	I	ϋ	О	V	Е	8	V
	Варианты			м							ί
				г							Е
						Е				К
			I		А	О	I	I	А	Е
			г		Υ	Р	к	ί	Υ
			г		г	Т	Υ	Т	Н
			к		Р		N
			м		м		Р
			Υ		8		V
			V		К

РТР-004		Позиция	1	2	3	4	5	6	7	8	9
	Код пептида	г	ь	г	Р	ϋ	т	ϋ	О	Ь
	Варианты			м							ί
						Е				К
			I		А	О	I	I	А	Е
			г		Υ	ϋ	к	ί	Υ	8
			к		г	Т	Υ		Н
			м		Р		N
			Υ		м		О
			V		8		Р
					К		V
						К	н

РТР-005		Позиция	1	2	3	4	5	6	7	8	9
	Код пептида	к	V	г	А	О	I	Р	Т	V
	Варианты			м							ί
				г							ί
						Е				К
			I		А	О	I		А	Е
			г		Υ	Р	к	ί	Υ
			г		Р	Т	Υ	Т	Н
			м		м		N
			Υ		8		Р
							V
РТР-006		Позиция	1	2	3	4	5	6	7	8	9
	Код пептида	Ω	0	8	ϋ	Υ	8	А	А	Ь
	Варианты		V		Р	Е	V	I	Н	Υ
			Υ		г	К	ί	V	V
					I	N	I	ί
					м	Р		А

РТР-007		Позиция	1	2	3	4	5	6	7	8	9
	Код пептида	т	ц	ϋ	ϋ	Υ	V	ί	Е	V

- 13 029831

	Варианты		V		Р	Е	V	I	н	Υ	ь
			Υ		Р	К	ь	V	V
					I	N	I	ь
					м	Р		А

РТР-008		Позиция	1	2	3	4	5	6	7	8	9
	Код пептида	Р	Η	Е	О	т	V	N	I	Р
	Варианты				ϋ
			I			Е	м	V	Υ	К
						Р	V	I	V	Υ
						Е	А	т	N	N
						Е	К	к		К
						О	N
						Ь	Н
						К
						8

В дальнейшем известно, что пептиды, презентированные МНС класса II, образованы "коровой последовательностью", имеющей аминокислотную последовательность, подходящую к конкретному ИЬЛаллель-специфическому фрагменту и, факультативно, Ν- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты, которые не препятствуют функции коровой последовательности (т.е. считаются нерелевантными для взаимодействия пептида и всех или подклассов клонов Т-клетки, распознающих естественную копию). Ν- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты могут иметь длину, например, от 1 до 10 аминокислот, соответственно. Эти пептиды могут быть использованы как непосредственно для погрузки на молекулы МНС класса II, так и последовательность может быть клонирована на векторы в соответствии с описанным ниже. Так как эти пептиды образуют конечный продукт процессинга более длинных пептидов внутри клетки, то более длинные пептиды могут использоваться в равной степени. Пептиды по изобретению могут быть любого размера, но, в основном, они могут иметь молекулярный вес меньше, чем 100 000, предпочтительно меньше, чем 50 000, более предпочтительно меньше, чем 10 000, и типично около 5 000. В отношении числа аминокислотных остатков пептиды по изобретению могут иметь менее чем 1 000 остатков, предпочтительно менее чем 500 остатков, более предпочтительно менее чем 100 остатков и, наиболее предпочтительно, между 30 и 8 остатками. Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает также пептиды и их варианты, в которых указанный пептид или вариант имеет общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30, и наиболее предпочтительно между 8 и 16, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот.

В соответствии с этим, встречающиеся в природе или искусственные варианты, которые индуцируют Т-клеточную перекрестную реакцию с пептидом по изобретению, часто являются вариантами по длине.

Если пептид, который длиннее, чем около 12 аминокислотных остатков, непосредственно используется для связывания с молекулой МНС II класса, предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к центральному ИЕЛ-связывающему региону, по существу, не влияли на способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой молекулы МНС II класса или презентировать пептид Т(хелперной) клетке. Тем не менее, как уже было указано выше, следует понимать, что могут быть использованы более крупные пептиды, например, если они закодированы полинуклеотидом, потому что такие крупные пептиды могут быть разделены на фрагменты подходящими антигенпрезентирующими клетками.

Также возможно, чтобы эпитопы МНС I класса, хотя они обычно имеют длину между 8-10 аминокислотами, генерировались при процессинге пептидов из более длинных пептидов или белков, включающих истинный эпитоп. Предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к истинному эпитопу, по существу, не влияли на протеолитическое расщепление, необходимое для выявления истинного эпитопа во время процессинга.

Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает также пептиды и варианты эпитопов МНС класса I, в которых указанный пептид или вариант имеет общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30, и, наиболее предпочтительно, между 8 и 16, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 аминокислот.

Разумеется, пептид или вариант в соответствии с настоящим изобретением будет обладать способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I или II класса. Связывание пептида или варианта с комплексом МНС может быть проверено методами, известными из уровня техники, например, теми, что описываются в литературе для различных аллелей МНС II класса (к примеру, (Уод! е! а1., 1994; Ма1сЕегек е! а1., 1994; Машс1 е! а1., 1999; Иашшег е! а1., 1995; Тошркшз е! а1., 1993; Воу!оп е! а1., 1998)).

В особенно предпочтительном воплощении изобретения пептид состоит или преимущественно состоит из аминокислотной последовательности в соответствии с 8Ер ГО № 1 по 8Ер ГО № 11.

- 14 029831

"Состоящий преимущественно из" подразумевает, что пептид в соответствии с настоящим изобретением, помимо последовательности в соответствии с любой из 8Н) ГО № 1 по 8Н) ГО № 11 или одним из их вариантов, содержит дополнительные находящиеся на Ν- и/или С-конце фрагменты аминокислот, которые не являются обязательно формирующими часть пептида, которая функционирует как эпитоп для эпитопа молекул МНС.

Тем не менее, эти фрагменты могут быть важны в целях обеспечения эффективного введения пептида в соответствии с настоящим изобретением в клетки. В одном воплощении настоящего изобретения пептид является белком слияния, который включает, например, 80 Ν-терминальных аминокислот НЕАϋΚ антиген-ассоциированной инвариантной цепи (р33, в дальнейшем "И"), как взятый из ЖЫ, инвентарный номер -ОепВапк Ассеззюп-пишЪег Х00497 (81гиЫп, М. е! а1 1984).

Примеры для дальнейших предпочтительных пептидов таковы, что пептид выбирается из пептида, имеющего специфический подвид НЕА, и способен стимулировать клетки СО8, и где указанный пептид включает специфический якорный аминокислотный фрагмент, как приведено в последующей табл. 2а.

Таблица 2а. Подвиды НЕА и якорные фрагменты предпочтительных пептидов

Пептид

Подвид НБА

Позиция

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1

А*0205

Код пептида

А

Ь

т

Т

Е

М

Н

Ω

Ь

Якорный фрагмент

X

е

X

Е

2

А*02

Код пептида

Р

ь

Υ

К

V

I

Б

8

Ь

Якорный фрагмент

X

ь

X

Е

3

А*02

Код пептида

А

I

ϋ

О

V

Е

8

V

Якорный фрагмент

X

I

X

V

4

А*02

Код пептида

Р

ь

Б

Р

ϋ

Т

ϋ

О

ь

Якорный фрагмент

X

ь

X

Б

5

А*02

Код пептида

К

V

Р

А

О

I

Р

Т

V

Якорный фрагмент

X

V

X

V

А*02

(ргоЬаЫу зиЫуре

6

А*205)

Код пептида

Ω

о

8

ϋ

Υ

8

А

ь

Якорный фрагмент

X

Ω

X

Е

А*02 (ргоЬаЫу зиЫуре

7

А*205)

Код пептида

Т

О

Ό

Υ

V

Б

Е

V

Якорный фрагмент

X

Ω

X

V

8

В*38

Код пептида

Ω

н

Е

О

Т

V

N

I

Р

Якорный фрагмент

X

н

Е

X

Р

Общий якорный фрагмент для

X

А*02

пептидов

X

Ь/1/ν

X

Б/У

Кроме того, пептид или вариант может быть модифицирован в дальнейшем для улучшения стабильности и/или связывания с молекулами МНС в целях получения более сильного иммунного ответа. Методы для такой оптимизации пептидной последовательности хорошо известны из уровня техники и включают, например, введение обратных пептидных или непептидных связей.

В пептидах с обратной связью аминокислотные остатки присоединены не пептидными связями (-СО-ΝΙ Ι-), но пептидная связь является обратной. Такие ретрообратные пептидомиметики могут быть получены методами, известными из уровня техники, например, такими, как описано в работе Ме/1еге и соавторов (1997) I. 1ттипо1. 159-3237, включенной сюда путем ссылки. Этот принцип охватывает получение псевдопептидов, содержащих изменения, которые охватывают остов, но не ориентацию боковых цепей. Ме/1еге и соавторы (1997) показывают, что эти псевдопептиды пригодны для связывания с МНС и ответов Т-хелперных клеток. Ретро-обратные пептиды, которые содержат связи NН-СО вместо пептидных связей СО-ΝΑ намного более устойчивы к протеолизу.

Непептидной связью, является, например, -СН₂-НН, -СН₂8-, -СН₂СН₂-, -СН=СН-, -СОСН₂-, -СН(ОН)СН₂-, и -СН₂8О-. Патент США № 4,897,445 обеспечивает метод твердофазного синтеза непептидных связей (-СН₂-ИН) в полипептидных цепях, что включает полипептиды, синтезированные с использованием стандартной методики, и непептидную связь, синтезированную при реакции аминоальдегида и аминокислоты в присутствии NаСNВН₃.

- 15 029831

Пептиды, включающие последовательности, описанные выше, могут быть синтезированы с дополнительными химическими группами, находящимися на их аминном и/или карбоксильном концах, так что, например, улучшается стабильность, биологическая доступность и/или аффинность пептидов. Например, гидрофобные группы, такие как карбобензоксильные, данзильные или трет-бутилоксикарбонильные группы, могут быть добавлены к аминным окончаниям пептидов. Подобным образом, ацетильная группа или 9-фторенилметокси-карбонильная группа может быть введена в аминные окончания пептидов. Кроме того, гидрофобная группа, трет-бутилоксикарбонильная или амидная группа может быть добавлена к карбоксильным окончаниям пептидов.

Далее, все пептиды по изобретению могут быть синтезированы, так что будет изменена их пространственная конфигурация. Например, Ό-изомер одного или более аминокислотных остатков пептида может быть использован скорее, чем обычный Ь-изомер. Более того, по крайней мере, один из аминокислотных остатков пептидов по изобретению может быть замещен одним из хорошо известных не встречающихся в природе аминокислотных остатков. Изменения, такие как данные, могут служить для повышения стабильности, биологической доступности и/или связывающих свойств пептидов по изобретению.

Подобным образом, пептид или вариант по изобретению может быть модифицирован химическим способом посредством реакции специфических аминокислот как до, так и после синтеза пептида. Примеры таких модификаций хорошо известны из уровня техники и обобщаются, например, в работе К. ЬипБЫай, Сйетюа1 РеадеШз Γογ Рго!еш ΜοάίΓίοαΙίοη. 3гй ей. СКС Ргезз, 20 05, которая включена сюда путем ссылки. Химическая модификация аминокислот включает, но не ограничивается, модификацией с помощью ацилирования, амидирования, пиридоксилирования лизина, восстановительного алкилирования, тринитробензилирования аминных групп 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (ΤΝΒδ), амидной модификацией карбоксильных групп и сульфгидрильной модификацией с помощью окисления надмуравьиной кислотой цистеина до цистеиновой кислоты, образованием ртутных производных, образованием смешанных дисульфидов с другими тиоловыми соединениями, реакцией с малеимидом, карбоксиметилированием йодоуксусной кислотой или йодацетамидом и карбамоилированием цианатом при щелочном уровне рН, хотя не ограничиваясь ими. В этой связи специалист данной области может проконсультироваться с главой 15 раздела "Сиггеп! ΡΐΌΐο0δ" в журнале "Рго!еш §с1епсе", Ейз. СоИдаи е! а1. (Ιοίιη \УПеу & δοηδ ΝΥ 1995-2000) для получения более обширной информации о методах, связанных с химической модификацией белков.

Вкратце, модификация, например, остатков аргинила в белках часто основана на реакции вицинальных дикарбонильных соединений, таких как фенилглиоксаль, 2,3-бутандион и 1,2-циклогександион для формирования аддукта. Другим примером является реакция метилглиоксаля с остатками аргинина. Цистеин может быть модифицирован без сопутствующей модификации других нуклеофильных сайтов, таких как лизин и гистидин. В результате для модификации цистеина доступно большое число реагентов. Веб-сайты компаний, таких как "§1дта-А1йпсЬ" (1Шρ://\γ\γ\γ.δ^8та-а1ύπс11.сοт). предоставляют информацию по специфическим веществам.

Также распространена селективная редукция дисульфидных связей в белках. Дисульфидные связи могут быть образованы и оксидированы во время тепловой обработки биофармацевтических средств.

К-реагент Вудворда может использоваться для модификации специфических остатков глютаминовой кислоты. ^(3-(диметиламинопропил)-№-этилкарбодиимид может использоваться для формирования внутримолекулярных поперечных связей между остатком лизина и остатком глютаминовой кислоты.

Например, диэтилпирокарбонат является реагентом для модификации остатков гистидила в белках. Гистидин может также быть модифицирован при использовании 4-гидрокси-2-ноненала.

Реакция остатков лизина и других а-аминных групп полезна, например, при связывании пептидов с поверхностями или перекрестном связывании (кросс-линкинг) белков/пептидов. Лизин является сайтом присоединения поли(этилен)гликоля и основным сайтом модификации при гликировании белков.

Остатки метионина в белках могут быть модифицированы с помощью, например, йодацетамида, бромэтиламин и хлорамина Т.

Тетранитрометан и Ν-ацетилимидазол могут быть использованы для модификации остатков тирозила. Кросс-линкинг через образование дитирозина может быть произведен с ионами перекиси водорода/меди.

В последних исследованиях по модификации триптофана используются Ν-бромсукцинимид, 2гидрокси-5-нитробензилбромид или 3-бром-3-метил-2-(2-нитрофенилмеркапто)-3Н-индол (ΒΡΝδскатол).

Успешная модификация терапевтических белков и пептидов с РЕС-полиэтиленгликолем часто ассоциируется с увеличением циркуляторного полураспада, в то время как кросс-линкинг белков с глутаральдегидом, полиэтиленгликоль-диакрилатом и формальдегидом используется для приготовления гидрогелей. Химическая модификация аллергенов для иммунотерапии часто достигается при карбамоилировании цианатом калия.

Пептид или вариант, в котором пептид модифицирован или включает непептидные связи, является предпочтительным воплощением изобретения. В целом, пептиды и варианты (по крайней мере, те, что содержат пептидные связи между аминокислотными остатками) могут быть синтезированы Ρтοс- 16 029831

полиамидным способом твердофазного пептидного синтеза, как раскрыто у Ьц и соавторов (1981), и в прилагающихся ссылках. Временная защита Ν-аминогруппы предусмотрена группой 9-флуоренилметилоксикарбонил (Ртос). Повторное расщепление этой высоко щелоче-лабильной защитной группы осуществляется при использовании 20% пиперидина в Ν,Ν-диметилформамиде. Функциональности боковой цепи могут быть защищены как их бутиловые эфиры (в случае серинтреонина и тирозина), бутиловые сложные эфиры (в случае глютаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты), бутилоксикарбониловое производное (в случае лизина и гистидина), тритиловое производное (в случае цистеина) и производное 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонила (в случае аргинина). Где глютамин или аспарагин являются С-терминальными остатками, для защиты боковой цепи амидо-функциональностей используется 4,4'-диметоксибензгидрильная группа. Твердофазный носитель основан на полимере полидиметилакриламида, состоящем из трех мономеров: диметилакриламида (остов-мономер), бис-акрилоилэтилендиамина (кросс-линкер) и метилового эфира акрилоилсаркозина (функционализирующий агент). Использованным агентом с расщепляемым соединением пептид-смола является кислотно-лабильное производное 4-гидроксиметилфеноксиуксусной кислоты. Все аминокислотные производные добавляются как их преформированные симметричные ангидридные производные за исключением аспарагина и глютамина, которые добавляются с применением метода обратного соединения, опосредованного Нкдициклогексилкарбодиимид/1-гидроксибензотриазолом. Все реакции сочетания и снятия защитных групп отслеживались с помощью нингидрина, тринитробензолсульфоновой кислоты или технологии контроля изотином. После завершения синтеза пептиды отщепляются от смолы-носителя сопутствующим удалением защитных групп боковой цепи при обработке 95% трифторуксусной кислотой, содержащей 50% поглотителя примесей. Обычно используемые поглотители - это этандитиол, фенол, анизол и вода, окончательный выбор зависит от составляющих аминокислот синтезированного пептида. Также возможна комбинация твердофазных и жидкофазных методов для синтеза пептидов (см., например, ВгискбогГег с1 а1. 2004 и прилагающиеся ссылки).

Трифторуксусная кислота удаляется выпариванием в вакууме с последующим измельчением с диэтиловым эфиром для получения сырого пептида. Любые представленные поглотители удаляются простой технологией экстракции, которая при лиофилизации водной фазы позволяет получить сырой пептид без поглотителей. Реагенты для синтеза пептидов, как правило, имеются в наличии, например, в Са1Ъюскет-ШуаЪюскет (Великобритания) Ыб, ШШпдкат N07 201. Великобритания.

Очистка может быть произведена любой техникой или комбинацией таких техник как рекристаллизация, эксклюзивная хроматография, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и (обычно) обратнофазная высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием, к примеру, градиентного разделения ацетонитрил/вода.

Анализ пептидов может быть произведен при использовании тонкослойной хроматографии, электрофореза, в частности капиллярного электрофореза, твердофазной экстракции (ТФЭ), обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа после кислотного гидролиза и масс-спектрометрического анализа при быстрой бомбардировке атомами (РАВ), а также масс-спектрометрический анализ ΜΑΓΌΙ и Е81-Ц-ТОР.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает нуклеиновую кислоту (например, полинуклеотид), кодирующую пептид или вариант по изобретению. Полинуклеотид может быть, например, ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК, РНК или их комбинациями, как одно-, так и/или двухнитевыми; натуральными или стабилизированными формами полинуклеотидов, таких как, например, полинуклеотиды с фосфоротиоатным остовом, и может или не может содержать интроны в период времени кодирования для пептида. Конечно, это только пептиды, которые содержат встречающиеся в природе аминокислотные остатки, присоединенные природными пептидными связями, которые могут кодироваться полинуклеотидом. Еще один дальнейший аспект изобретения обеспечивает вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид в соответствии с изобретением.

Был разработан ряд методов для связывания полинуклеотидов, в особенности ДНК, с векторами, например, с помощью дополнительных липких концов. К примеру, в сегмент ДНК могут быть добавлены дополнительные гомополимерные участки для внесения в вектор ДНК. Вектор и сегмент ДНК в таком случае соединены водородной связью между дополнительными гомополимерными концевыми участками, образуя рекомбинантные молекулы ДНК.

Синтетические сшивающие агенты, содержащие один или несколько сайтов рестрикции, обеспечивают альтернативный способ присоединения сегмента ДНК к векторам. Синтетические сшивающие агенты, содержащие ряд сайтов рестрикционной эндонуклеазы, имеются в продаже в различных источниках, включая 1п1егпайопа1 Вю1есЬпо1од1е8 1пс, Νον Науеп, СН США.

Желаемый способ модификации ДНК, кодирующей полипептид по изобретению, это использование цепной реакции полимеразы, как раскрыто в работе (δί·ιί1<ί е1 а1 (1988)). Этот метод может быть использован для введения ДНК в подходящий вектор, например, при инженерии в подходящих сайтах рестрикции, или же он может быть использован для модификации ДНК другими пригодными путями, известными из уровня техники. Если используются векторы, то предпочтительными являются оспенные или аденовирусные векторы.

- 17 029831

Затем ДНК (или в случае ретровирусных векторов РНК) может экспрессироваться в подходящего хозяина для получения полипептида, включающего пептид или вариант по изобретению. Таким образом, ДНК, кодирующая пептид или вариант по изобретению, может быть использована в соответствии с известными техниками, модифицированная соответствующим образом с учетом приведенных здесь идей, для создания вектора экспрессии, который затем используется для трансформации подходящей клеткихозяина для экспрессии и получения полипептида по изобретению. Такие техники включают также те, что раскрыты в патентах США №: 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 и 4,810,648, которые все вводятся в описание посредством отсылки.

ДНК (или в случае ретровирусных векторов - РНК), кодирующая полипептид, представляющий собой соединение по изобретению, может быть присоединена к обширному ряду других последовательностей ДНК для введения в адекватного хозяина. ДНК-спутник будет зависеть от природы хозяина, способа введения ДНК хозяину и от того, желательно ли эписомальное поддержание или интеграция.

Как правило, ДНК вводится в вектор экспрессии, такой как плазмида, с правильной ориентацией и корректной рамкой считывания экспрессии. Если необходимо, то ДНК может быть сцеплена с адекватными транскрипционными и трансляционными регулирующими контрольными нуклеотидными последовательностями, распознающимися желательным хозяином, хотя такой контроль обычно имеется в векторе экспрессии. Вектор вводится затем хозяину стандартными способами. Как правило, не все хозяева трансформируются вектором. Поэтому будет необходимо выбрать трансформированные клетки-хозяева. Одна из техник отбора включает введение в вектор экспрессии последовательности ДНК с любыми необходимыми элементами контроля, кодирующей выбранный признак в трансформированной клетке, такой как невосприимчивость к антибиотикам.

Альтернативно ген для такого выбираемого признака может быть на другом векторе, который используется для котрансформации желаемой клетки-хозяина.

Клетки-хозяева, которые были трансформированы рекомбинантной ДНК по изобретению, культивируются затем в течение достаточного времени и при адекватных условиях, известных специалистам данной области, с учетом раскрытых здесь идей, что ведет к экспрессии полипептида, который после этого может быть получен.

Известно множество систем экспрессии, включающих бактерии (например, Е. сой и ВасШик киЪййк), дрожжи (например, Зассйатотусек сетеу151ае), мицелиальные грибы (например, АкретдШик крес), растительные клетки, клетки животных и насекомых.

Предпочтительно, чтобы система была клетками млекопитающих, такими как клетки СНО, имеющимися в наличии в АТСС Се11 Вю1оду Сойесйоп.

Типичная клеточная векторная плазмида млекопитающих для конститутивной экспрессии включает промотор СМУ или §У40 с подходящим концевым участком поли А и маркером устойчивости, таким как неомицин. Одним примером является р§УЪ, имеющимся в наличии в Рйатташа, Р15са1а\уау. N1, США. Примером индуцируемого вектора экспрессии млекопитающих является рМ§С, имеющийся также в наличии в Рйатташа. Пригодными плазмидными векторами дрожжей являются рР§403-406 и рР§413416, и они, как правило, имеются в наличии в §1та1адепе С1ошп§ §у51етк, Ьа 1о11а, СА 92037, США. Плазмиды рР§403, рР§404, рР§405 и рР§406 являются дрожжевыми интегрирующими плазмидами (У1рк) и включают дрожжевые селектируемые маркеры ΗΙ83, ТРР1, ЬЕи2 и ИРА3. Плазмиды рР§413416 являются дрожжевыми центромерными плазмидами (Усрк). Основанные на промоторе векторы СМУ (например, из 81дта-А1Штсй) обеспечивают кратковременную или устойчивую экспрессию, цитоплазмическую экспрессию или секрецию и Ν-терминальную или С-терминальную маркировку в различных комбинациях РЬАС, 3хРЬАС, с-тус или МАТ. Данные белки слияния позволяют детекцию, очистку и анализ рекомбинантного белка. Слияния с двойной меткой обеспечивают гибкость при детекции.

Сильный промоторный регуляторный участок цитомегаловируса человека (СМУ) возбуждает конститутивные уровни белковой экспрессии, достигающие 1 мг/л в клетках СО8. Для менее активных клеточных линий белковые уровни типично составляют ~0,1 мг/л. Присутствие точки начала репликации §У40 будет приводить к высоким уровням репликации ДНК в терпящих репликацию 8У40 клетках СО8. Векторы СМУ, например, могут содержать точку начала для репликации рМВ1 (производное рВР322) в бактериальных клетках, ген Ъ-лактамазы для отбора устойчивости к ампициллину у бактерий, ЙСН ро1уА и точку начала й. Векторы, содержащие лидерную последовательность пре-про-трипсина (РРТ), могут направлять секрецию белков слияния РЬАС в культуральную среду для очистки с использованием антител ΛΝΤΙ-ΡΡ-Λυ смол и планшетов. Другие векторы и системы экспрессии для применения с различными клетками-хозяевами хорошо известны из уровня техники.

Настоящее изобретение относится также к клетке-хозяину, трансформированной с помощью полинуклеотидной векторной модели настоящего изобретения. Клетка-хозяин может быть как прокариотической, так и эукариотической. Бактериальные клетки могут быть, предпочтительно, прокариотическими клетками-хозяевами в некоторых случаях и типично являются штаммом Е. сой, таким как, например, Е. сой штамма ΌΗ5, имеющимся в наличии в ВеШекйа Рекеагсй БаЪогаЮпек 1пс., ВеШекйа, МО, США, и РРТ, имеющимся в наличии в Американской коллекции типов культур Атепсап Туре СиЙнге СойесОоп (АТСС) о£ РоскуШе, МО, США (№ АТСС 31343). Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева

- 18 029831

включают дрожжи, клетки насекомых и млекопитающих, предпочтительно клетки позвоночных, таких как мышь, крыса, обезьяна или человеческие фибробластные клетки и клеточные линии толстого кишечника. Дрожжевые клетки-хозяева включают ΥΡΗ499, ΥΡΗ500 и ΥΡΗ501, которые, как правило, имеются в наличии в §1га1адепе С1ошпд §ук1етк, Ьа 1о11а, СА 92037, США. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (СНО), имеющиеся в наличии в АТСС как ССЬ61, ΝΤΗ эмбриональные клетки швейцарской мыши ΝΙΗ/3Τ3, имеющиеся в наличии в АТСС как СКЬ 1658, почечные клетки обезьяны СО8-1, имеющиеся в наличии в АТСС как СКЬ 1650 и клетки 293, являющиеся эмбриональными клетками печени человека. Предпочтительными клетками насекомых являются клетки δ£9, которые могут трансфецироваться с помощью бакуловирусных векторов экспрессии. Обзор в отношении выбора подходящих клеток-хозяев для экспрессии представлен, например, в пособии авторов РаиНпа Ва1Ьак и АгдеПа Ьотепсе "МеПюбк ш Мо1еси1аг Вю1оду КесотЬшай Сепе Ехртеккюп, КеОе\ук апб Рто1осо1к", часть первая, второе издание, Ι8ΒΝ 978-1-58829-262-9, и другой литературе, известной специалисту данной области.

Трансформация адекватных клеток-хозяев с помощью модели ДНК настоящего изобретения совершается при помощи хорошо известных способов, которые обычно зависят от типа используемого вектора. Относительно трансформации прокариотических клеток-хозяев см., например, СоЬеп и соавторы (1972) Ргос. Ν;·ιΐ1. Асаб. δα. ^А 69, 2110 и δатЬ^οοк и соавторы (1989) Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, Со1б δρτί^ ИагЬог ЬаЬота1огу, Со1б δρτί^ ИагЬог Нью-Йорк. Трансформация дрожжевых клеток описывается у δЬе^таη и соавторов (1986) МеПюбк 1п Υеакΐ СепеЬск, А ЬаЬота1оту Мапиа1, Со1б δίΓΓΗИагЬог Нью-Йорк. Также подходит метод Бигса (Веддк) (1978) №йиге 275,104-109. Что касается клеток позвоночных, то подходящие для трансфекции таких клеток реагенты, например, фосфат кальция и ΌΕАЕ-декстран или липосомальные составы, имеются в наличии в δΐ^аΐадеηе С1ошпд δукΐетк или Ше ТесЬпо1од1ек 1пс., СаЬЬеткЬшд, ΜΌ 20877, США. Электропорация также подходит для трансформации и/или трансфекции клеток и хорошо известна из уровня техники для трансформации дрожжевых клеток, бактериальных клеток, клеток насекомых и клеток позвоночных.

Успешно трансформированные клетки, т.е. клетки, которые содержат конструкцию ДНК настоящего изобретения, могут быть идентифицированы хорошо известными способами, такими как ПЦР. Альтернативно наличие белка в супернатанте может выявляться применением антител.

Следует понимать, что некоторые клетки-хозяева по изобретению подходят для получения пептидов по изобретению, например, бактериальные, дрожжевые клетки и клетки насекомых. Тем не менее, другие клетки-хозяева могут быть пригодны в конкретных терапевтических методах. Например, антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, могут с пользой быть использованы для экспрессии пептидов по изобретению так, что их можно будет нагружать на адекватные молекулы МНС. Таким образом, актуальное изобретение обеспечивает клетку-хозяина, включающую нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии в соответствии с изобретением.

В предпочтительном воплощении клетка-хозяин является антигенпрезентирующей клеткой, в частности, дендритной клеткой или антигенпрезентирующей клеткой. АПК, нагруженные рекомбинантным белком слияния, содержащим простатическую кислую фосфатазу (РАР), на данный момент проходят исследования в целях лечения рака простаты (Ыри1еисе1-Т) (διικι11 Е1 е1 а1 2006; Шш е1 а1 2006).

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает способ получения пептида или его варианта; способ, включающий культивацию клетки-хозяина и изоляцию пептида из клетки-хозяина или его культуральной среды.

В другом воплощении пептид, нуклеиновая кислота или вектор экспрессии по изобретению используются в медицине. Например, пептид или его вариант может приготавливаться для внутривенной (ί. ν.) инъекции, подкожной (к. с.) инъекции, внутрикожной (ί. б.) инъекции, внутрибрюшной (ί. р.) инъекции, внутримышечной (ί. т.) инъекции. Предпочтительные способы пептидной инъекции включают к.с, 1.б., 1.р., 1.т. и ί.ν. Предпочтительные способы инъекции ДНК включают 1.б., 1.т., к.с, 1.р. и ί.ν. Вводиться могут дозы, к примеру, между 50 мкг и 1,5 мг, предпочтительно от 125 мкг до 500 мкг пептида или ДНК и будут зависеть от соответствующего пептида или ДНК. Дозы в данных пределах успешно использовались в предыдущих клинических исследованиях (ВгипкОд е1 а1 2006; δΑίιΕΓ е1 а1 2007).

Другой аспект настоящего изобретения включает способ получения активированных Т-клеток ш νί1го; способ, включающий контактирование Т-клеток ш νίίΐΌ с нагруженными антигеном молекулами МНС I или II класса человека, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки на период времени, достаточного для активации антиген-специфическим образом Т-клетки, где антиген является пептидом в соответствии с изобретением. Предпочтительным образом, достаточное количество антигена используется с антигенпрезентирующей клеткой.

В случае эпитопа МНС класса II, используемого в качестве антигена, Т-клетки являются СЭ4положительными хелперными клетками, предпочтительным образом, типа Т_И1 Молекулы МНС класса II могут быть экспрессированы на поверхности любой подходящей клетки. Предпочтительно, если клетка в естественных условиях не экспрессирует молекулы МНС класса II (в этом случае клетка трансфецирована для экспрессии такой молекулы). Альтернативно, если клетка в естественных условиях экспрессирует молекулы МНС класса II, то предпочтительно, чтобы клетка была дефектной для сигнальных путей про- 19 029831

цессинга или презентации антигена. Тогда на клетку, экспрессирующую молекулы МНС класса II, возможна полная погрузка выбранного пептидного антигена до активации Т-клетки.

Антигенпрезентирующая клетка (или клетка-стимулятор) типично имеет молекулы МНС класса II на своей поверхности и предпочтительно обычно является не способной самостоятельно нагружать на указанную молекулу МНС класса II выбранный антиген. Молекула МНС II класса может быть легко нагружена выбранным антигеном ίη νίίτο.

Предпочтительно, если в клетке млекопитающих не хватает или имеется пониженный уровень или пониженная функция пептидного транспортера ТАР. Подходящие клетки, в которых не хватает пептидного транспортера ТАР, включают Т2, РМА-8 и клетки дрозофилы. ТАР - это транспортер, ассоциированный с процессингом антигена.

Нагружающая пептидом дефектная клеточная линия Т2 человека имеется в наличии в Атепсап Туре Си11ите Со11есНоп„ 12301 Рагк1а\уп Итке, РоскуШе, Мату1апб 20852, США под каталоговым № СКЬ 1992; клеточная линия дрозофилы линия §сЬпеМег 2 имеется в наличии в АТСС под каталоговым № СРТ 19863; клеточная линия мыши КМА-8 описывается у Кагге и соавторов 1985.

Обычно указанная клетка-хозяин до трансфекции, в основном, не экспрессирует молекулы МНС I класса. Также предпочтительно, если клетка-стимулятор экспрессирует молекулу, важную для обеспечения сигнала ко-стимуляции для Т-клеток, такую как любая из В7.1, В7.2, ЮАМ-1 и ЬРА 3. Последовательности нуклеиновой кислоты многочисленных молекул МНС II класса и ко-стимулирующих молекул общедоступны в банках данных ОепВапк и ЕМВЬ.

Аналогично, в случае использования эпитопа МНС класса I в качестве антигена, Т-клетки являются СО8-положительными ЦТЛ.

Если антигенпрезентирующая клетка трансфецирована для экспрессии такого эпитопа, то предпочтительно, чтобы клетка включала вектор экспрессии, способный экспрессировать пептид, содержащий 8ЕО ГО № 1 по 8ЕО ГО № 11 или их вариантную аминокислотную последовательность.

Для генерации ЦТЛ ш νίίτο могут быть использованы многие другие способы. Например, в методах, описанных у Реор1е8 и соавторов (1995) и 1<а\уакапи и соавторов (1992), используются аутологичные опухоль-инфильтрующие лимфоциты при генерации ЦТЛ. Для приготовления ЦТЛ Р1еЬап8к1 и соавторы (1995) используют аутологичные лимфоциты периферической крови (ЛПК). 1осйти8 и соавторы (1997) описывают получение аутологичных ЦТЛ посредством импульсного введения пептида или полипептида в дендритные клетки или посредством инфицирования рекомбинантным вирусом. НШ и соавторы (1995) и 1етоте и соавторы (1993) для получения аутологичных ЦТЛ используют В-клетки. Кроме того, для получения аутологичных ЦТЛ могут быть использованы макрофаги с введенным импульсным методом пептидом или полипептидом или инфицированные рекомбинантным вирусом. 8. \Уа11ег и соавторы 2003 описывают прайминг Т-клеток щ νίΙΐΌ с использованием искусственных антигенпрезентирующих (аАПК) клеток, что является также подходящим способом генерации Т-клеток против выбранного пептида. В данном исследовании, аАПК были генерированы при соединении преформированных комплексов МНС/пептид с поверхностью полистироловых частиц (микрошарики) с помощью биохимического способа с биотином/стрептавидином. Данная система допускает точный контроль плотности МНС на аАПК, который позволяет селективно вызвать высоко- или низкоавидные антигенспецифические Тклеточные ответы с высокой эффективностью из проб крови. Кроме комплексов МНС/пептид аАПК должны нести другие белки с ко-стимулирующей активностью, такие как антитела анти-СН28, соединенные с их поверхностью. Кроме того, такая основанная на аАПК система часто требует добавления адекватных растворимых факторов, к примеру, цитокинов, таких как интерлейкин-12.

При получении Т-клеток могут быть также использованы аллогенные клетки, и метод детально описывается в патенте \УО 97/26328, включенном сюда путем ссылки. Например, кроме клеток дрозофилы и Т2-клеток, для презентации антигенов могут использоваться другие клетки, такие как клетки яичника китайского хомяка (СНО), бакуловирус-инфицированные клетки насекомых, бактерии, дрожжи, инфицированные осповакциной клетки-мишени. Кроме того, могут быть использованы растительные вирусы (см., например, работу Рока е! а1 (1994)), которая описывает развитие мозаичного вируса китайской вигны как высокопродуктивную систему для презентации чужеродных пептидов.

Активированные Т-клетки, которые направлены против пептидов изобретения, полезны в терапии. Таким образом, дальнейший аспект изобретения обеспечивает активированные Т-клетки, получаемые вышеупомянутыми методами по изобретению.

Активированные Т-клетки, полученные с помощью приведенного выше способа будут селективно распознавать клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность с 8ЕО ГО № 1 по 8ЕО ГО № 11.

Предпочтительно, чтобы Т-клетка распознавала клетку при взаимодействии посредством ее ТКР с комплексом НЬА/пептид (например, соединение). Т-клетки полезны в способе уничтожения клетокмишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, где пациенту вводится эффективное число активированных Т-клеток. Т-клетки, которые введены пациенту, могут быть получены от пациента и активироваться, как описывалось выше (т.е. они являются аутологичными Т-клетками). Альтернативно Т- 20 029831

клетки получают не от пациента, а от другого индивида. Разумеется, предпочтительно, если индивид является здоровым индивидом. "Здоровым индивидом" изобретатели обозначают, что индивид имеет, в общем, хорошее здоровье, предпочтительно, он имеет компетентную иммунную систему и, более предпочтительно, не страдает ни одним заболеванием, которые можно легко проконтролировать и выявить.

Клетками-мишенями для СО4-положительных Т-клеток ш у1уо в соответствии с настоящим изобретением могут быть клетки опухоли (которые иногда экспрессируют МНС класса II) и/или стромальные клетки, окружающие опухоль (опухолевые клетки) (которые иногда также экспрессируют МНС класса II); (1)епу|е1 е! а1., 2006)).

Т-клетки настоящего изобретения могут быть использованы в качестве активных ингредиентов в терапевтической композиции. Таким образом, изобретение обеспечивает также способ уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению; способ, включающий введение пациенту эффективного числа Т-клеток, как определено выше.

Под понятием "аберрантно экспрессированный" изобретатели понимают, что полипептид гиперэкспрессирован по сравнению с нормальными уровнями экспрессии, или что ген является "молчащим" в ткани, из которой образовалась опухоль, однако он экспрессирован в опухоли. Под понятием "гиперэкспрессирован" изобретатели понимают, что полипептид представлен на уровне, который, по крайней мере, в 1,2 раза выше уровня, представленного в нормальной ткани; предпочтительно, по крайней мере, в 2 раза и, более предпочтительно, по крайней мере, в 5 или 10 раз выше уровня, представленного в нормальной ткани.

Т-клетки могут быть получены способами, известными из уровня техники, к примеру, теми, что описаны выше.

Протоколы для этого т.н. адоптивного переноса Т-клеток хорошо известны из уровня техники, и с ними можно ознакомиться, например, в работах (КокепЬегд е! а1., 1987; КокепЬегд е! а1., 1988; Оиб1еу е! а1., 2002; Уее е! а1., 2002; Эиб1еу е! а1., 2005); обобщение (Оайшош е! а1., 2006) и (Могдап е! а1., 2006).

Любая молекула по изобретению, т. е. пептид, нуклеиновая кислота, вектор экспрессии, клетка, активированные ЦТЛ, Т-клеточный рецептор или нуклеиновая кислота, кодирующая его, полезна для лечения нарушений, характеризующихся ускользанием клеток от иммунного ответа. Поэтому любая молекула настоящего изобретения может применяться в качестве лекарственного средства или при изготовлении лекарственного средства. Молекула может быть использована сама по себе или в комбинации с другой(ими) молекулой(ами) по изобретению или известной(ыми) молекулой(ами).

Предпочтительно, если лекарственное средство настоящего изобретения является вакциной, она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично 1.б., 1.т., к.с, ί.ρ. и ί.ν. или вноситься ех у1уо в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться ш ν Нго для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Если нуклеиновая кислота введена в клетки ш νίΙΐΌ. то может быть полезно, чтобы клетки были трансфецированными, чтобы ко-экспрессировать иммуностимулирующие цитокины, такие как интерлейкин-2. Пептид может быть, по существу, чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъювантом (см. ниже) или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например, липосомами. Пептид может быть также конъюгирован с подходящим носителем, таким как гемоцианин лимфы улитки (КЬН) или маннан (см. XVО 95/18145 и Ьопдепескег е! а1 (1993)). Пептид может быть также меченым или может быть белком слияния или гибридной молекулой. Пептиды, последовательность которых дана в настоящем изобретении, как ожидается, стимулируют Тклетки ί'.Ό4 или СЭ8. Тем не менее, стимуляция СЭ8 ЦТЛ более эффективна в присутствии помощи, производимой ί'.Ό4 хелперными Т-клетками. Таким образом, для эпитопов МНС I класса, которые стимулируют ί'.Ό8 ЦТЛ, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют СО4-положительные Т-клетки. СЭ4- и СЭ8-стимулирующие эпитопы хорошо известны из уровня техники и включают те, что были идентифицированы в настоящем изобретении.

В одном аспекте вакцина включает, по крайней мере, один пептид, предпочтительно от двух до 50, более предпочтительно от двух до 25, еще более предпочтительно от двух до 15 и, наиболее предпочтительно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать или тринадцать пептидов. Пептид(ы) может(могут) быть образован(ы) из одного или более специфических ТАА и может(могут) связываться с молекулами МНС класса I и/или класса II.

Полинуклеотид может быть, по существу, чистым или содержаться в подходящем векторе или системе доставки. Нуклеиновая кислота может быть ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК (циклогексанилнуклеиновая кислота), РНК или их комбинацией. Методы конструирования и введения такой нуклеиновой кислоты хорошо известны из уровня техники. Обзор представлен, к примеру, в работах Раксо1о 8. 2006; §!ап К. 2006, или А Майбау1 2006. Полинуклеотидные вакцины легки в приготовлении, однако способ действия этих векторов по индуцированию иммунного ответа понят не полностью. Подходящие векторы и системы доставки включают вирусные ДНК и/или РНК, такие как системы, которые основаны на аденовирусе,

- 21 029831

вирусе осповакцины, ретровирусах, вирусе герпеса, аденоассоциированном вирусе или гибридах, содержащих элементы более чем одного вируса. Невирусные системы доставки включают катионные липиды и катионные полимеры и хорошо известны из уровня техники в области доставки ДНК. Также может быть использована физическая доставка, такая как посредством "ген-пистолета". Пептид или пептиды, закодированные нуклеиновой кислотой, могут быть белком слияния, например, с эпитопом, который стимулирует Т-клетки для соответствующего противоположного гипервариабельного участка (СЭР), как описывается выше.

Лекарственное средство по изобретению может также включать один или более адъювант. Адъюванты - это вещества, которые неспецифически усиливают или потенцируют иммунный ответ (например, иммунные ответы, опосредованные ЦТЛ или хелперными Т-клетками (Т_н) на антиген, и могут, таким образом, рассматриваться как полезные в лекарственном средстве настоящего изобретения. Подходящие адъюванты включают, но не ограничиваются, 1018 Ι88, соли алюминия, АтрБуах, А815, ВСС, СР870,893, СрС7909, СуаА, 6§ЫМ, флагеллин или лиганды ТЬК5, полученные из флагеллина, лиганд РЬТЗ, ГМ-КСФ, 1С30, 1С31, Имиквимод (АЬПАРА), 1шиРас1 ΙΜΡ321, интерферон-альфа или бета или их пегилированные производные, Ι8 Ра1с1г Ι88, 18СОМАТР1Х, КСОМк, 1иу1ттипе, ЫроУас, МАЬР2, МР59, монофосфорил липид А, Монтанид 1М8 1312, Монтанид 18А 206, Монтанид 18А 50У, Монтанид 18А-51, эмульсии "вода в масле" и "масло в воде", ОК-432, ОМ-174, ОМ-197-МР-ЕС, ОЫТАК, ОкрА, векторная система РерТе1®, микрочастицы РЬС и декстрана, резиквимод, 8РЬ172, вирусомы и другие вирусоподобные частицы, ΎΕ-17Ό, УЕОР 1гар, Р848, Бета-глюкан, Рат3Сук, стимулон Ацийа 0821, который получают из сапонина, микобактериальные экстракты и синтетические имитации бактериальных клеточных стенок и другие запатентованные адъюванты, такие как РгЫ'к ЭеЮх, Ош1 или 8ирегГок. Предпочтительными адъювантами являются такие как адъювант Фрейнда или ГМ-КСФ. Несколько иммунологических адъювантов (например, МР59), специфических для дендритных клеток, и их приготовление были описаны ранее (Оиршк М. е1 а1 1998; АШкоп 1998). Также могут использоваться цитокины. Несколько цитокинов были присоединены напрямую для оказания влияния на миграцию дендритных клеток к лимфоидным тканям (например, ТЛР-а), ускоряя созревание дендритных клеток до эффективных, презентирующих антиген Т-лимфоцитам, клеток (например, ГМ-КСФ, ИЛ-1 и ИЛ-4) (патент США № 5,849,589, специфически включённый сюда в его целостности путём ссылки) и действуя как иммуноадъюванты (например, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-23, ИЛ-7, ΙΡΝ-альфа, ΙΡΝ-бета) (ОаЪгйоуюй е1 а1 1996).

Об иммуностимулирующих олигонуклеотидах СрО также сообщалось, что они усиливают эффекты адъювантов в составе вакцин. Теоретически не связанные, СрО-олигонуклеотиды при активации врождённой (неадаптивной) иммунной системы действуют с помощью То11-подобных рецепторов (ТЬР), в основном ТЬР9. Вызванная СрО активация ТЬР9 усиливает антиген-специфические гуморальные и клеточные ответы на широкий спектр антигенов, включая пептидные или белковые антигены, живые или убитые вирусы, вакцины из дендритных клеток, аутологичные клеточные вакцины и полисахаридные конъюгаты как в профилактических, так и терапевтических вакцинах. Более важно то, что улучшается созревание и дифференциация дендритных клеток, приводя к улучшенной активации Тщ-клеток и интенсивной генерации цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) даже при отсутствии помощи СЭ4 Тклеток. Отклонение в сторону Т_н1, вызванное стимуляцией ТЬК9, сохраняется даже в присутствии вакцинных адъювантов, таких как квасцы или неполный адъювант Фрейнда (ТРА), который обычно способствует отклонению в сторону Тт. СрО-олигонуклеотиды проявляют даже большую адъювантную активность, если они входят в состав или вводятся вместе с другими адъювантами или в таких составах как микрочастицы, наночастицы, липидные эмульсии или подобных составах, которые в особенности необходимы для инициации сильного ответа, если антиген относительно слаб. Они также ускоряют иммунную реакцию и позволяют снизить дозы антигена на приблизительно два порядка величины с ответами антитела, сравнимыми с полной дозой вакцины без СрО в некоторых экспериментах (Кпед е1 а1 2006). В патенте США № 6,406,705 В1 описывается комбинированное применение СрО-олигонуклеотидов, адъювантов, не включающих нуклеиновые кислоты, и антигена для вызывания антиген-специфического иммунного ответа. Антагонистом СрО ТБР9 является 68ЫМ (контурный иммуномодулятор двойного действия) компании "Мо1одеп" (Берлин, Германия), который является предпочтительным компонентом фармацевтической композиции настоящего изобретения. Также могут быть использованы другие молекулы, связывающиеся с ТБР, такие как РНК, связывающаяся с ТБР 7, ТБР 8 и/или ТБР 9.

Другие примеры полезных адъювантов включают, но не ограничиваются химически модифицированными СрО (например, СрР, Иега), аналогами 4кРНК, такими как Ро1у(НС) и АтрйОеп, не-СрО бактериальной ДНК или РНК, а также иммуноактивными малыми молекулами и антителами, такими как циклофосфамид, сунитиниб, бевацизумаб, целебрекс, ^Х-4016, силденафил, тадалафил, варденафил, сорафениб, темозоломид, темсиролимус, ХЬ-999, СР-547632, пазопаниб, УЕОР Тгар, ΖΌ2171, ΑΖ^2171, анти-СТЬА4 и 8С58175, которые могут действовать терапевтически и/или как адъювант. Количества и концентрации адъювантов и вспомогательных веществ, полезных в контексте настоящего изобретения, могут быть легко определены опытным специалистом без проведения излишних экспериментов. Предпочтительными адъювантами являются 48Б!М, интерферон-альфа, -бета, СрО7909, ΙΟ31, АБЭАРА

- 22 029831

(Имиквимод), Ре+Тег Κ.ΝΛ, тадалафил, темозоломид и Лъ'кпишпе.

Настоящее изобретение обеспечивает лекарственное средство, которое полезно в лечении рака, в частности, рака, связанного с нейронами, в частности, рака головного мозга. Рак может быть неметастатическим или метастатическим, в частности, он может быть астроцитомой, пилоидной астроцитомой, дисэмбриопластической нейроэпителиальной опухолью, олигодендроглиомой, эпендимомой, мультиформной глиобластомой, смешанными глиомами, олигоастроцитомами, медуллобластомой, ретинобластомой, нейробластомой, герминомой, тератомой, ганглиоглиомой, ганглиоцитомой, центральной ганглиоцитомой, примитивными нейроэктодермальными опухолями (Р№)Т, к примеру, медуллобластома, медуллоэпителиома, нейробластома, ретинобластома, эпендимобластома), опухолями паренхимы шишковидной железы (к примеру, пинеоцитома, пинеобластома), опухолями, развивающимися из эпендимных клеток, опухолями хориоидного сплетения, нейроэпителиальными опухолями неопределенного происхождения (к примеру, глиоматоз мозга, астробластома), глиобластомой, раком легких или аденосквамозной карциномой.

Так как пептиды по изобретению были изолированы из глиобластомы и в случае δΕΟ ΙΌ № 2 также из аденосквамозной карциномы, то лекарственное средство по изобретению предпочтительно применяется для лечения глиобластомы или аденосквамозной карциномы.

Настоящее изобретение включает вспомогательное оборудование, включающее: (а) контейнер, содержащий фармацевтическую композицию, описанную выше, в виде раствора или в лиофилизованной форме; (Ь) опционально - второй контейнер, содержащий разбавитель или восстанавливающий раствор для лиофилизованного состава; и (с) опционально - инструкции по (ί) применению раствора или (ίί) восстановителя и/или по применению лиофилизованного состава. В дальнейшем оборудование может включать один или более (ίίί) буфер, (ιν) разбавитель, (ν) фильтр, (νΐ) иглу или (νίί) шприц. Контейнер является, предпочтительно, флаконом, ампулой, шприцем или пробиркой; и он также может быть контейнером многоразового использования. Фармацевтическая композиция предпочтительно лиофилизована.

Вспомогательное оборудование настоящего изобретения предпочтительно включает лиофилизованный состав настоящего изобретения в подходящем контейнере и инструкции для ее восстановления и/или по ее применению. Подходящие контейнеры включают, например, флаконы, ампулы (например, двухкамерные ампулы), шприцы (такие как двухкамерные шприцы) и пробирки. Контейнер может быть сделан из разнообразных материалов, таких как стекло или пластик. Предпочтительным образом, вспомогательное оборудование и/или контейнер содержит инструкции для, или связанные с контейнером, которые дают указания для восстановления и/или применения. Например, на этикетке может быть указано, что лиофилизованный состав должен восстанавливаться до пептидных концентраций, как те, что описаны выше. На этикетке в дальнейшем может быть указано, что состав применяется или предназначается для подкожного введения.

Контейнер с составом может быть ампулой многоразового использования, которая позволяет повторное введение (например, от 2-6 введений) восстановленного состава. Вспомогательное оборудование может включать в дальнейшем второй контейнер, включающий подходящий разбавитель (например, раствор бикарбоната натрия).

При смешивании разбавителя и лиофилизованного состава окончательная концентрация пептида в восстановленном составе составляет, предпочтительно, по крайней мере, 0,15 мг/мл/пептид (=75 мкг) и, предпочтительно, не более чем 3 мг/мл/пептид (=1500 мкг). Вспомогательное оборудование может в дальнейшем включать другие материалы, желательные с коммерческой и с точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и упаковочные вкладыши с инструкциями по применению.

Вспомогательное оборудование настоящего изобретения может иметь один контейнер, который содержит состав фармацевтических композиций в соответствии с настоящим изобретением с или без других компонентов (например, других соединений или фармацевтических композиций этих других соединений) или может иметь отдельные контейнеры для каждого компонента.

Вспомогательное оборудование по изобретению предпочтительно включает состав по изобретению, укомплектованный для применения в комбинации с ко-введением второго соединения (такого как адъюванты (например, ГМ-КСФ), химиотерапевтического средства, натурального продукта, гормона или антагониста, средства против ангиогенеза или ингибитора; апоптоз-индуцирующего средства или хелатора) или их фармацевтической композиции. Компоненты вспомогательного оборудования до введения пациенту могут предварительно быть организованы в комплекс, или же каждый компонент может находиться в отдельном отличном контейнере. Компоненты вспомогательного оборудования могут обеспечиваться одним или несколькими жидкостными растворами, предпочтительно, водным раствором, более предпочтительно, стерильным водным раствором. Компоненты вспомогательного оборудования могут также обеспечиваться твердой формой, которая может быть превращена в жидкости при добавлении подходящих растворителей, которые, предпочтительным образом, предоставляются в другом, отличном, контейнере.

Контейнер терапевтического оборудования может быть ампулой, пробиркой, колбой, флаконом, шприцем или любыми другими средствами, заключающими в себе твердое вещество или жидкость.

- 23 029831

Обычно, если имеются более одного компонента, оборудование содержит вторую ампулу или другой контейнер, который позволяет отдельную дозировку. Оборудование может также содержать другой контейнер для фармацевтически приемлемой жидкости. Терапевтическое оборудование будет предпочтительно содержать приспособление (например, одну или более иглу, шприцы, пипетки для глаз, пипетки и т.д.), которое позволяет введение веществ по изобретению, которые являются компонентами настоящего оборудования.

Настоящий состав подходит для введения пептидов любым приемлемым способом, таким как оральный (энтеральный), назальный, офтальный, подкожный, внутрикожный, внутримышечный, внутривенный или трансдермальный. Предпочтительно, чтобы введение было 8.с, и, наиболее предпочтительно, 1.б. Введение может производиться инфузионным насосом.

Теперь настоящее изобретение будет описано с помощью последующих примеров, которые описывают его предпочтительные воплощения, тем не менее, не ограничивая ими изобретение. В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности путем ссылки.

Примеры

Пример 1. Идентификация опухолеассоциированных пептидов (ТиМАРк), презентируемых на поверхности клетки.

Пробы тканей

Опухолевые и здоровые ткани пациентов были предоставлены клиниками НорНа1 Саи!оиа1 ишуега!аие бе Оеиеуе, г. Женева (Меб1са1 Оисо1оду ЬаЬога!огу о£ Титог Ептипо^ду) и №игосЫгигд18сНе Итуег8Йа!8-КНтк г. Гейдельберг, Германия (молекулярно-биологическая лаборатория). Перед проведением хирургического вмешательства было получено информированное согласие всех пациентов в письменной форме. Сразу же после операции ткани были подвергнуты шоковой заморозке в жидком азоте и хранились до изоляции ТиМАРк при -80°С.

Изоляция пептидов НЬА из проб тканей

Пептидные пулы НЬА из подвергнутых шоковой заморозке проб тканей были получены методом иммунопреципитации из плотных тканей в соответствии с незначительно измененным протоколом (Еа1к, К. е! а1 1991; §еедег, Е.Н. е! а1. Т 1999) при использовании НЬА-А*02-специфического антитела ВВ7.2 или НЬА-А, -В, -С-специфического антитела ν6/32, СЖг-активированной сефарозы, кислотной обработки и ультрафильтрации.

Детекция пептидов ТИМАРк масс-спектрометрическим анализом с ЕМ-жидкостной хроматографией (ЕМ-ЬСМЗ)

Метод первый.

Полученные пулы пептидов НЬА были разделены в соответствии с гидрофобностью обратнофазной хроматографией (СарЬС, ^а!ег8), и элюированные пептиды анализировали на гибридном квадрупольном время-пролётном тандемном масс-спектрометре с ортогональным ускорением ионов (О-ТОЕ ИШта, \Уа!ег8), снабженном источником ЕМ. Пептидные пулы наносили на предколонку С18 для концентрирования и опреснения. После нанесения предколонку помещали в линию для разделения с помощью микрокапиллярной колонки из плавленого кварца (75 мкм 1.б. х 250 мм) с обратнофазным материалом С18 в 5 мкм (Эюпех). Растворителем А был ацетат аммония/вода, 4 мМ. Растворителем В были 2 мМ ацетата аммония в 80% ацетонитрил/вода. В обоих растворителях был установлен уровень рН в 3,0 муравьиной кислотой. Был сформирован бинарный градиент от 15% до 60% В в течение 90 мин, с применением скорости потока в 5 мкл/мин, сниженного до приблизительно 200 нл/мин с помощью распределительной системы. Позолоченный стеклянный капилляр (Р1соТ1р, Νον ОЬ|есЕуе) использовали для введения в источник микро-ЕМ. Временем интеграции для ТОЕ-анализатора было 1,9 с с временем задержки между измерениями в 0,1 с. Затем, определяли последовательности пептидов анализом индуцированного столкновением (СГО) масс-спектра (ЕМ-ЬСМММ§). Идентифицированную последовательность пептида ТИМАР подтверждали сравнением генерированного фрагментационного образца естественного пептида ТИМАР с фрагментационным образцом синтетического сравниваемого пептида с идентичной последовательностью.

Метод второй.

Полученные пулы пептидов НЬА были разделены в соответствии с их гидрофобностью обратнофазной хроматографией (АссщПу ИРЬС 8у8!ет, \Ма1ег8) и элюированные пептиды анализировали на гибридном масс-спектрометре БТО- ОгЬйгар (ТНегтоЕ1ес!гои), снабженном источником ЕМ. Пулы пептидов наносили непосредственно на аналитическую микрокапиллярную колонку из плавленого кварца (75 мкм 1.б. х 250 мм) с обратнофазным материалом 1,7 мкм С18 (\Уа1ег8) с применением скорости потока в 400 нл в минуту. Затем, пептиды разделяли с использованием двухэтапного 180-минутного бинарного градиента от 10 до 33% В при скорости потока в 300 нл в минуту. Градиент был составлен из растворителя А (0,1% муравьиной кислоты в воде) и растворителя В (0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле). Позолоченный стеклянный капилляр (Р1соТ1р, Νν ОЬ|ес11уе) использовали для введения в источник микроЕМ. Масс-спектрометр ЕТО-ОгЬПгар работал в зависимом от данных режиме с применением стратегии ТОР5. Вкратце, цикл сканирования начинался с полного сканирования с высокой точностью масс на

- 24 029831

спектрометре ОгЬбгар (К = 30 000), за чем следовало сканирование М8/М8 на ОгЬйгар (К = 7500) на 5 особенно многочисленных ионах-предшественниках с динамическим исключением отобранных ранее ионов. Тандемные масс-спектры интерпретировали на 8ЕОИЕ8Т с дополнительным ручным управлением. Идентифицированную последовательность пептида ТИМАР подтверждали сравнением генерированного фрагментационного образца естественного пептида ТИМАР с фрагментационным образцом синтетического контрольного пептида с идентичной последовательностью. На фиг. 1а и Ь представлены отдельные масс-спектры, полученные для опухолевой ткани для ассоциированных с МНС класса I пептидов ТИМАРк.

Пример 2. Определение профиля экспрессии генов, кодирующих пептиды по изобретению.

Не все пептиды, идентифицированные как презентируемые на поверхности опухолевых клеток молекулами МНС, подходят для иммунотерапии, потому что большинство этих пептидов образованы из нормальных клеточных белков, экспрессируемых многими видами клеток. Только немногие из этих пептидов являются опухолеассоциированными и, скорее всего, способны индуцировать Т-клетки с высокой специфичностью распознавания опухоли, из которой они были образованы. В целях идентификации таких пептидов и минимизации риска аутоиммунности, вызванной при вакцинации, изобретатели фокусировали свое внимание на тех пептидах, которые образованы из белков, гиперэкспрессированных на опухолевых клетках в сравнении с большинством нормальных тканей.

Идеальный пептид будет образован из белка, являющимся уникальным для опухоли и не присутствующим ни в одной другой ткани. Для идентификации пептидов, которые образованы из генов с профилем экспрессии, похожим на идеальный, идентифицированные пептиды соотносили с белками и генами, из которых они были образованы и генерировали экспрессионные профили этих генов.

Источники РНК и приготовление

Хирургически удаленные тканевые препараты были предоставлены двумя различными клиническими центрами (см. табл. 1) после получения формы информированного согласия от каждого пациента. Препараты опухолевой ткани были мгновенно заморожены в жидком азоте после операции и впоследствии гомогенизированы с помощью ступки и пестика в жидком азоте. Суммарная РНК была приготовлена из данных проб с использованием ТР!/о1 Дпубгодеп, Каг1кгцЬе, Германия) с последующей очисткой на К№аку (ОШСЕН Нйбеп, Германия); оба метода осуществлялись в соответствии с указаниями производителей.

Суммарная РНК здоровых человеческих тканей была куплена (АтЫоп, Нипйпдбоп, Великобритания; С1оп!есЫ, Не1бе1Ьегд, Германия; 8!га!адепе, Атк!егбат, Нидерланды; ВюСНапг Наууагб, СА, США). РНК нескольких индивидов (от двух до 123 индивидов) была смешана таким образом, что РНК каждого индивида имела равный вес. Лейкоциты были изолированы из проб крови 4 здоровых добровольцев.

Качество и количество проб суммарной РНК было подтверждено на биоанализаторе Адйеп! 2100 (Адйеп!, ^а1бЬгопп, Германия) с использованием лабораторного оборудования КNА 6000 Рко ЬаЬСЫр Κί! (Адйеп!).

Эксперименты с микрочипами

Анализ экспрессии генов всех проб РНК из опухолевой и нормальной ткани был произведен с помощью олигонуклеотидных микрочипов АГГутеЫх Нитап Сепоте (НС) И133А или НС-И133 Р1ик 2.0 (Айутейгх, 8ап!а С1ага, СА, США). Все этапы были выполнены в соответствии с руководством АГГушейгх (Ы!!р://ууу. аГГуте1г1х.сот/киррог1/1есНп1са1/тапиа1/ехргекк1оп_тапиа1. аГГх). Вкратце, двухнитевую кДНК синтезировали из 5-8 мкг суммарной РНК с использованием 8ирегкспр! КТИ ОпуЦгодеп) и олиго-бТ-Т7 праймера (М\УС Вю!есй, ЕЬегкЬегд, Германия), как описывается в руководстве. Транскрипцию ш уйго производили на ВюАггау Шдй У1е1б КNА Тгапкспр! ЬаЬеШпд Κί! (ΈΝΖΟ И1адпок!юк, Ыс., Рагтшдба1е, ΝΥ, США) Гог !Ые И133А аггаук ог χνίΐΗ Не СепеСЫр ГУТ ЬаЬеШпд Κί! (Айутейгх) для микрочипов И133 Р1ик 2.0 с последующей фрагментацией, гибридизацией кРНК и окрашиванием стрептавидин-фикоэритрином и биотинилированным антистрептавидиновым антителом (Мо1еси1аг РгоЬек, Ье1беп, Нидерланды). Изображения сканировали на Адйеп! 2500А СепеАггау 8саппег (И133А) или АГГутеЫх Сепе-СЫр 8саппег 3000 (И133 Р1ик 2.0), а данные анализировали в программе ССО8 (Айутейгх) с использованием настроек по умолчанию для всех параметров. Для нормализации использовали 100 генов "домашнего хозяйства", предоставленных Айушейгх (1Шр://\у\у\у.аГГуте1пх.сот/киррог1/1ес1пнса1/такк_ Ыек.айх). Относительные значения экспрессии были подсчитаны с показаний сигнальной программы, и значение нормальной пробы было произвольно задано значением 1,0.

Экспрессионный профиль исходного гена всех пептидов настоящего изобретения (РТР^1) свидетельствует о высокой экспрессии в опухолевой ткани глиобластомы, в то время как ген не экспрессирован или экспрессирован на очень низких уровнях в нормальных тканях (фиг. 2).

Пример 3. Иммуногенность ш νίΙΐΌ для пептидов, презентируемых МНС I класса.

Прайминг ш νίΙΐΌ СИ8+ Т-клеток

В целях проведения стимуляций ш νίΙΐΌ искусственных антигенпрезентирующих клеток (аАПК), нагруженных комплексом пептид-МНС (рМНС) и антителом анти-СИ28, изобретатели сначала изолировали МПК (моноциты периферической крови) из свежей лейкоцитарной пленки НЬА-А*02+ с использованием стандартной среды для градиентного разделения (РАА, Со1Ье, Германия). Лейкоцитарные пленки

- 25 029831

были получены из госпиталя "КаШаппепЬозрДаГ' г. Штутгарта. Изолированные МПК инкубировали в течение ночи в Т-клеточной среде (ТСМ) для прайминга человеческого материала ш νΐΐΓΟ, состоящей из ΚΡΜI-Ο1иΐатаx (ПтИ'оре'п, КагИгиЬе, Германия) с добавлением 10% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки АВ (РАА, Со1Ье, Германия), 100 и/мл пенициллина / 100 мкг/мл стрептомицина (СатЬгех, Т'ететз, Бельгия), 1 мМ пирувата натрия (СС Ργο, №^абТ Германия) и 20 мкг/мл гентамицина (СатЬгех). Лимфоциты СИ8+ были изолированы с использованием СИ8+ У1АС8 - оборудования для положительного отбора (Μϊ^^ϊ, ВеттсИ О1абЬасЬ, Германия) в соответствии с указаниями производителя. Полученные СИ8+ Т-клетки инкубировали до использования в ТСМ с добавлением 2,5 нг/мл ИЛ-7 (ГготоСеП, Не1бе1Ьегд, Германия) и 10 и/мл ИЛ-2 (СЫгоп, УкнисИ, Германия). Получение покрытых гранул рМНС/анти-СИ28, Т-клеточные стимуляции и считывание производили, как описывалось ранее (УаНет еΐ а1., 2003), с минимальными модификациями. Вкратце, биотинилированные рекомбинантные молекулы НЬА-А*0201, в которых не хватает трансмембранного домена, и которые были биотинилированы на карбоксильном конце тяжелой цепи, были получены в соответствии с методом, описанным в работе (А1гтап еΐ а1., 1996). Очищенный костимулированный мышиный 1дО2а к антителам человека СИ28 АЬ 9.3 (1ип§ еΐ а1., 1987) был химически биотинилирован с использованием сульфо-Νгидроксисукцинимидобиотина, как рекомендуется изготовителем (ГегЬю, Вопп, Германия). Использованные гранулы были покрытыми стрептавидином полистироловыми частицами величиной 5,60 мкм (Вап§5 ЬаЬогаЮпез, ППпоУСШЛ). рМНС, использованные в качестве положительных и отрицательных контролей, были Α*0201/ΜϋΑ-001 (пептид ΕϋΑΟΙΟΙΕΤν из модифицированного Μе1аη-Α/ΜΑΚΤ-1) и Α*0201/ΌΌΧ5-001 (ΥΊ,Ι.ΡΑΙΥΊ II из ΌΌΧ5), соответственно.

800.000 гранул / 200 мкл были покрыты в 96-луночном планшете в присутствии 600 нг биотина анти-С1)28 и 200 нг релевантного биотин-рМНС (высокоплотные гранулы) или 2 нг релевантного и 200 нг нерелевантного (библиотека рМНС) МНС (низкоплотные гранулы). Стимуляции были инициированы в 96-луночных планшетах при ко-инкубации 1х10⁶ СИ8+ Т-клеток с 2х10⁵ промытых покрытых гранул в 200 мкл ТСМ с добавлением 5 нг/мл ИЛ-12 (ТготоСеП) в течение 3-4 дней при 37°С. Половина среды была заменена на свежую ТСМ с добавлением 80 и/мл ИЛ-2, и инкубация была продолжена в течение 34 дней при 37°С. Данный цикл стимуляций проводили всего три раза. В заключение проводили тетрамерные анализы с флуоресцирующими тетрамерами МНС (полученными, как описывается в работе (Α1ΐа^аη еΐ а1., 1996)) с антителом С^8-ΡIΤС клона 8К1 (ВИ, Не1бе1Ьег§, Германия) на четырехцветном цитометре 17\.С8СаП1л11' или проточном цитометре Ь8К II (ВИ). Пептид-специфические клетки были подсчитаны как процентная доля всех СИ8+ Т-клеток. Оценку тетрамерного анализа проводили с помощью программы ТС8 Ехргезз (19е Νονο 8ой^аге). Прайминг ш νΐΐΓΟ специфических лимфоцитов тетрамер+ СИ8+ детектировался установкой подходящего гейта и при сравнении со стимуляциями негативного контроля. Иммуногенность для заданного антигена была детектирована, если было обнаружено, что, по крайней мере, в одной подлежащей оценке простимулированной ш νΐΐΓΟ лунке одного здорового донора содержалась специфическая СИ8+ Т-клеточная линия после стимуляции ш νΐϊτο (т.е. данная лунка содержала, по крайней мере, 1% специфического тетрамера+ среди СИ8+ Т-клеток, и процентная доля специфических клеток тетрамера+ была, по крайней мере, в 10 раз выше среднего значения стимуляций с негативным контролем).

Репрезентативное окрашивание, выявляющее образование Т-клеточных линий, специфических для РТР-002 и РТР-001, представлено на фиг. 3. Результаты обобщены в табл. 3, ниже, вместе с похожим результатом для СН1-001.

Таблица 3. Иммуногенность ш νΐϊτο пептидов по , изобретению

Антиген	Иммуногенность обнаружена	Положительн. доноры / проанализированные	Положительн. лунки / проанализированные
		доноры	лунки
РТР-001	Да	6/6(100%)	33 / 96 (34 %)
РТР-002	Да	3 / 4 (50%)	9/48(17%)
РТР-003	Да	2 / 4 (50%)	8/48(17%)
РТР-004	Да	2 / 4 (50%)	2 / 48 (4%)
РТР-005	Да	4/4(100%)	24 / 48 (50%)
СН1-001	Да	4/4(100%)	39 / 62 (63%)

Результаты экспериментов по иммуногенности ш νΐΐΓΟ, проведенных изобретателями и заявителем, фирмой Лттайсз", показывающие процентную долю доноров и лунок с положительными результатами, также обобщены здесь. Приводимые результаты были получены при стимуляции клеток СИ8+ высокоплотными гранулами. Так как различные партии человеческой сыворотки могут сильно влиять на ре- 26 029831

зультаты по иммуногенности, то вместе оценивались только те анализы, в которых была использована одна и та же партия сыворотки.

Пример 4. Связывание пептидов, рестриктированных по НЬЛ класса I, с НЬЛ-Л*0201.

Целью данного анализа была оценка аффинности пептидов НЬЛ класса I РТР-001, РТР-002, РТР003, РТР-004 и РТР-005 по отношению к молекуле МНС, закодированной аллелем НЬЛ-Л*0201. Аффинности для всех пептидов к НЬЛ-Л*0201 были соотносимы с хорошо известным контрольным пептидом НВУ-001, константы диссоциации (КО) находились в диапазоне от 0,02 до 1,6 нМ.

Принципы теста

Стабильные комплексы НЬЛ/пептид состоят из трех молекул: тяжелой цепи НЬЛ, бета-2 микроглобулина (Ь2т) и пептидного лиганда. Активность денатурированных рекомбинантных молекул НЬЛА*0201 с тяжелой цепью сама по себе может быть сохранена, делая их функциональными эквивалентами "пустых молекул НЬЛ-Л*0201". Если они растворены в водном буфере, содержащем Ь2т и подходящий пептид, то данные молекулы быстро и эффективно сворачиваются в полной зависимости от пептида. Наличие данных молекул использовалось в анализе, основанном на методике ЕЫ8Л, для измерения аффинности взаимодействия между пептидом и молекулой НБЛ класса I (8у1уе8!ег-Ну1к е! а1., 2002).

Очищенные рекомбинантные молекулы НБЛ-А*0201 инкубировали вместе с Ь2т и ступенчатыми дозами интересующего пептида. Количество новообразовавшихся комплексов НБЛ/пептид определялось количественным методом ЕБКЛ. Константы диссоциации (значения К_о) вычислялись с использованием стандартной калибровочной кривой, записанной с титров комплекса калибровки НБЛ/пептид.

Результаты представлены на фиг. 4. Более низкое значение К_о отражает более высокую аффинность к НЕЛ-Л*0201. Аффинности для всех пептидов к НЕЛ-Л*0201 были соотносимы с хорошо известным контрольным пептидом НБУ-001, константы диссоциации (К_о) находились в диапазоне от 0,02 до 1,6 нМ.

Список цитируемой литературы

А1Пзои АС 1998; Тке шоке о£аскоп о!4ттипо1од1са1 ак]иуап!з; ϋεν ΒίοΙ 8!апк.; 92:3-11

Акт ап ГО, Мо88 РА, ОоиИег Р1, Вагоиск ОН, Неугег-ХУППатз МО, Век Л, МсМ1скае1 ΑΙ,

Оау18 ММ (1996). Ркепо!урш аиа1уз18 о£ аикдеи-зресШс Т 1утркосу1е8. ЗОепсе 274, 94-96.

Аррау V, Зре18ег ΌΕ, Иькег Ν, Кеупагк 8, ВагЬеу С, СегоШш ]С, Беуугаг 8, РтШа С,

Котего Р (2006). Оесгеазек зретйс СО8+ Т сеП сгозз-геаскуку о£ аикдеи гесодшкоп ГоПолутд уасстакоп ν/ϊίΐι Ме1ап-А реркке. Еиг. 11ттипо1. 36, 1805-1814.

Апуата Т, Назедахуа К, 1иагахуа 1, Μίζιιηο К, Од1то!о М, Ка1адт Т, Уакига Н (1995).

Азз1дптеп1 о£ !ке китаи рго!ет !угозте ркозрка!азе, гесер!ог-1уре, ге!а (ΡΤΡΚΖ) депе 1о скготозоте Ьапк 7ς31.3. Су1одепе1. СеП Оепе!. 70, 52-54.

Ватеа О, ЗПуеппотеп О, Зкаапап В, Ноиеддег АМ, СапоП РО, О'Еиз!аскю Р, Могзе В,

Беуу ЛЗ, Еа!бгд1а 8, Ниекиег К, . (1993). Иепкйсакоп о£ а сагкошс апкукгазе-Пке котат ΐη !ке ех!гасе11и1аг гедюп оГКРТР датта кейпез а пе\у зиМатПу о£ гесер!ог !угозте ркозрка!азез. Мок СеП ΒίοΙ. 13, 1497-1506.

Воу!оп КГ, Еоктапп Τ, Εοηάεΐ М, Ка1каскег Н, НаИег Т, Ега!ег ΑΙ, Ооиек ОС, БезНе ϋθ,

Е1ауе11 КА, АНшаии ϋΜ (1998). О1и!аппс атП кесагкохукзе Т 1ушркосу!е гезроизез аззос1а!еП ν/ϊΐΠ зизсерккПку ог гез1з!аисе !о !уре I <каке!ез: аиа1уз18 ΐη скзеазе скзсогПап! китаи Цутз, поп-окезе скаЪекс иксе апк ΗΕΑ-Οζ) каиздешс иксе. кк. 1ттипо1. 10, 17651776.

Втсккокег Т, Магкег О, А1кепсю Е.(2004) Егот ргокискои о£рерккез ΐη тПкдгат атошкз Еог гезеагск !о ти1к-!оп диапккез Еог кшдз о£!ке ккиге Сигг Ркагт Вю!ескпо1. Рек; 5(1):2943

Вшизу1д РР, Аатка1 8, О]екзеи МК, Куа1ке1т О, МагкохузЫ-Оптзшк С], 8νε I, Оугкаид М, Тгаскзе1 8, МоПег М, Епкзеп ΙΑ, Оаикетаск О (2006); Те1отегазе реркке уасстакоп: а рказе ЕЛ з!ику ΐη ракеп!з хукк поп-зтаП сеП 1иид сапсег; Сапсег 1ттипо11ттипо!кег.; 55(12):1553-1564

Викой ЕС, Ргакоз МО (2000). МаПдпап! дкотаз. Сигг. Тгеак Оркопз. Опсо! 1, 459-468.

- 27 029831

СВТКиЗ. Рптагу Вгат Титогз ΐη Ше Цпйей 81а1ез, 81аНзНса1 Керой. 2006.

КеГТуре: 1п1ете1 Соттишсайоп

СЬеехег МА, СЬеп XV, ϋΪ5Ϊ3 А1Р, ТакаЬазЫ М, Реасе Ό1 (1993). Т-се111ттиш1у ΐο опсодетс ргсйетз 1пс1иШп§ ти!а!ей газ апй сЫтепс Ьсг-аЫ. Αηη Ν. Υ. Асай. δει. 690, 101-112.

Со1отЬеШ 8, Ваззо V, Мие11ег ОЙ, Мопйто А (2006). Рго1опдей ТСК/СО28 епдадетеп! йпуез 1й-2-тйерепйеп1 Т сей с1опа1 ехрапзюп ШгоидЬ 81дпа1тд теШа!ей Ьу Ше таттаНап 1агде1 оГ гаратуст. 11ттипо1. 176, 2730-2738.

СгеззлуеП Р (1994). АззетЫу, 1гапзрог1, апй Гипсйоп оГМНС с1азз II то1еси1ез. Аппи. Κεν. 1ттипо1. 72, 259-293.

Όάζζϊ С, Сапе11о А, СИапшш Μ, ϋεΐ ΌΜ, Спохашз Р, РюгепНш О, Ьеот М, КозН О, Тига ϋ, ТлепдЫ А, Уейодеп В, гитадНш Ρ, ϋε ОЦ Магапдо1о М (2000). А зедиепНа! сЬетогаШоШегареийс 1геа1теп1Гог раЬеШз ννΐίΗ таНдпап! дНотаз: а рЬазе II ρίΐοΐ з1ийу. АпНсапсег Кез. 20, 515-518.

Оепд]е11, ЫазШе ΜΌ, ОоийеГапдеаз С, ОйзюиШз О, ЗсЬоог О, АНепЬегепй Р, Ми11ег М, Кгатег В, АНззюи А, Заи1ег М, Неппеп1о11ег 1, ХУегпе! ϋ, δΐεηζΐ А, Каттепзее НО, К1тде1 К, 31еуапоу1с δ (2006). Цпехрес1ей АЬипйапсе оГ НРА С1азз II РгезеШей РерНйез ΐη Рптагу Кепа1 СеН Сагстотаз. СНп Сапсег Кез. 72, 4163-4170.

ϋΐχ АК, Вгоокз ХУН, Козгтап ТЬ, МогГогй РА (1999). Ьптипе йеГес!з оЬзегуей ΐη раЬеШз адШ рптагу таНдпап! Ьгат Штогз. 1 №игсйттипо1.100, 216-232.

ОисНеу МЕ, ХУипйегНсЬ Ж, КоЪЪтз РР, Уапд ГС, Ηχνιι Р, ЗсЫуайгеШгиЬег Ό1, ТораНап ЗР, ЗЬеггу К, КезНГо ΝΡ, НиЫсЫ АМ, КоЬтзоп МК, КаГГе1й М, Оигау Ρ, δεΐρρ СА, КодегзРгеегег Р, МоПоп КЕ, МаугоикаЫз ЗА, ХУННе ϋΕ, КозепЬегд ЗА (2002). Сапсег гедгеззюп апй аШЫттипйу ΐη раЬеШз айег с1опа1 герорЫаНоп ννΐίΗ апШитог 1утрЬосу1ез. 5с1епсе 298, 850-854.

Оий1еу МЕ, ХУипйегНсЬ Ж, Уапд ГС, ЗЬеггу КМ, ТораНап ЗР, КезЫо ΝΡ, Коуа1 КЕ, КаттЫа и, ХУЫРе ОЕ, МаугоикаЫз ЗА, Кодегз Е1, Огас1а ΟΙ, 1опез ЗА, Мапд1атеН ϋΡ, РеПеНег ММ, Оеа-Вапас1осЬе 1, КоЬтзоп МК, Вегтап ΌΜ, РШе АС, АЬаН А, КозепЬегд ЗА (2005). АйорНуе се11 йапзГег Шегару ГоНолутд поп-туе1оаЫайуе Ьи11утрЬойер1еНпд сЬетоШегару Гог Ше 1геа1теп1 оГ раЬеШз луйН гейасЮгу те1аз1аНс те1апота. 1. СНп. ОпсоР 23, 2346-2357.

Оиршз М, МигрЬу ΤΙ, ЕПддтз ϋ, ЦдоггоН М, уап Νεδΐ О, Οΐΐ О, МсОопаШ ϋΜ (1998); ОепйпНс сеПз т1етаНге уассте айщуап! айег т1гатизси1аг 1П]есНоп; СеН ЬптипоР; 186(1):18-27

Еа1к,К., Ко1гзсЬке,О., 51еуапоу1с,5., 1ипд,О. & Каттепзее,Н.О. А11е1е-зрес1Йс тоЫз геуеакй Ьу зедиепстд оГ зей-рерНйез е1и!ей йот МНС то1еси1ез. НаШге 351, 290-296 (1991)

Еопд Г, Вгоскз1еШ ϋ, Ветке С, ХУи Р, Епд1етап ЕО (2001а). ОепйпНс сеПз 1П]ес1ей У1а Шйегеп! гоШез тйисе 1ттипйу ΐη сапсег раЬеШз. 1. ЬптипоР 166, 4254-4259.

Еопд Р, Нои У, КЫаз А, Ветке С, Уиеп Α, ΡΐδΗεΓ ОА, Оау18 ММ, Епдктап ЕО (2001Ь). АЙегей рерййе Ндапй уасстайоп ν/ΐΐΡι РЙЗ Ндапй ехрапйей йепйпйс сеПз Гог Штог 1ттипоШегару. Ргос. №Ш Асай. δοΐ. и. 8. А 98, 8809-8814.

- 28 029831

ОаЬгИоукИ ϋΐ, СипшпдНат НТ, СагЬопе ΌΡ; ГС-12 апд ти!ап! Р53 рерНде-рикед депдпНс се118 Гог ке 5рес1Гс 1ттипо1Негару о£сапсег; I 1ттипо1Нег ЕтрИаз13 Титог 1ттипо1. 1996 (6):414-418

Оакп I, Созкз А, ЗапсНег-СаЬо Р, Кткузку А, Мксшк В, Ьадогсе-Радез С, Τοδοίΐηΐ М, Сатиз М, Вегдег Α, \Утд Ρ, Ζΐηζίηάοΐιουε Р, Вгипеуа1 Р, Сидпепс РН, Тга)апозк1 Ζ, Рпдтап ΧΥΗ, Радез Р (2006). Туре, депзку, апд ксаНоп оПттипе сеПз ν/ϊΐΗίη Нитап со1огес!а1 1итог8 ргедк! сНшса1 оикоте. 8с1епсе 313, 1960-1964.

Оакпош Ь, ΡοχνεΙΙ ϋΐ, к., КозепЬегд 8А, КезНГо ΝΡ (2006). АдорНуе 1ттипо1Негару Гог сапсег: ЪиПдтд оп зиссезз. Иак Кеу. Ьптипок 6, 383-393.

ОеЬЫпк МР, уап Ε, I, На1еЬоег О, ЗиукегЬиук К, ВеуегзЬегдеп КЕ, ОеиПз уап КА, Моокпааг XV Н (1991). Скшпд, ехргеззюп апд сНгото8ота1 ксаНгаЬоп о£ а пе\у ри!аНуе гесеркг-Нке ргокт 1уго8те рНо8рНа1а8е. РЕВ8 Ее1к 290, 123-130.

СНуаЕс 8, А1апаскоу1с ϋ, 1адег Е, Ма1зио М, Зекакитаг А, АНогЫ ΝΚ, МаЫ КО, Оироп! В,

Τ?ιΡΡί^·τ ГХ ΑΛΤ ΤΧηιιΡΕ Δ ГЭ1А Τ Τ ΟίιίΓναν гсР поГпгоПи поонгптг Г^ГЭ/1-1- Т γΎΙ

А VI ΙΛνΐ ₅ У_/11 νΐΐ А А , АVIIиШ 2 А_? \_ΖΧ V* А_/и у А* У/ У/ «У У . кУ (АХ V '-'У УУА ХХХХХУХХ (АХХ у УУ ννίΛΙ X ХХХ£^ У/ХУШ ' А У>У/ХХ

гезропзез адатз! ΝΥ-Ε8Ο-1 ΐη сапсег райеШз: соггекПоп \уНИ апНЬоду гезропзез. Ргос ИаГС Асад. Зек и. 8. А 100, 8862-8867.

Наттег I, ОаПагг! Ρ, Βοηο Е, Кагг К\У, Оиепо! 3, Уаказшш Р, №ду ΖΑ, 8т1дадНа Р (1995). РерНде Ьтдтд зресЫсНу о£НЕА-Е)К4 токсикз: соггекПоп \νίίΗ гНеитакнд акНпНз а88ОС1аНоп. 1 Ехр. Мед 181, 1847-1855.

Напада К, УелудеП Р\У, Уапд ГС (2004). кптипе гесодшдоп о£ а Нитап гепа1 сапсег апНдеп тгоидН роз1-1гапз1аНопа1 ргокт зристд. Нашге 427, 252-256.

НаггосН 8, РиНадо ОС, Вгиеск XV, КозепЫиГС I, ЕаГаШе I, СНао М, ВихЬаит ГО, ЗсЫеззтдег I (2002). А спНса1 гок Гог 1Не ргокт 1уго8те рНозрНа1а8е гесеркг 1уре Ζ ΐη ГипсНопа1 гесоуегу Ггот детуеНпаНпд кзюпз. Иак Оепек 32, 411-414.

Не1тНегдег АВ, Низзат 8Р, А1даре К, Захуауа К, АгсНег ОА, Рпедтап Н, Кеагдоп Ό, Рпедтап А, В1дпег ϋϋ, Затрзоп ГН. Титог-зресШс рерНде уасстаНоп ΐη пе\у1у-д1адпо8ед раНеп18 ν/ΐίΗ ОВМ. 1оита1 оГ СНшса1 Опсокду, 2006 А8СО Аппиа1 МееНпд Ргосеедтдз Рак I Уо1 24, Νο. 188 (кте 20 Зиррктеп!), 2006: 2529. 6-20-2006.

И11 е! а1 (1995) к Ехр. Мед. 181, 2221-2228

кготе е! а1 (1993) I. Ьптипок 151, 1654-1662

ГСсНтиз е! а1 (1997) к Оеп. Уток 78, 1689-1695

кпд О, ЕедЬеИег 1А, Ми11ег-ЕЬегНагд Щ (1987). 1пдисНоп оГ суккхкЩ ΐη гездпд Нитап Т 1утрЬосук8 Ьоипд 1о 1итог сеПз Ьу апНЬоду Некгосопщдакз. Ргос ИаН Асад 80 и 8 А 84, 4611-4615.

Кар1ап К, Могзе В, НиеЬпег К, Сгосе С, Нолук К, Кауега М, Ккса О, .Гауе М, ЗсЫеззтдег I (1990). Скшпд оГ 1Нгее Нитап 1уго8те рНо8рНа1азе8 геуеак а тикдепе ГатПу оГ гесеркгНпкед ргок1п-1уго81пе-рНо8рНа1а8е8 ехргеззед ΐη Ъгат. Ргос ИаН. Асад. Зек и. 8. А 87, 70007004.

Кагге апд Ципддгеп (1985) I. Ехр. Мед. 162, 1745

- 29 029831

Кахуакагт е! а1 (1992) 1. Ьпшипок 148, 638-643

Кеппейу КС, ЗЬеагег МН, \Уайз АМ, ВпдЬ! КК (2003). СО4+ Т 1утрЬосу1ез р1ау а спйса1 го1е ίη апЬЬойу ргойисЬоп апс! 1шпог 1шшип11у адат Л з1гтап νΐηΐδ 40 1агде 1итог апЬдеп. Сапсег Кез. 63, 1040-1045.

КоЬауазЫ Н, Огтуа К, Κιιίζ М, НиаНе Е, ЗагоЬе Р, ЬазаПе Л, Неггаг М, Запдго В, Ρπεΐο I, Воггаз-Сиез1а Р, СеЬз Е (2002). ИепЬйсаЬоп оГ ап апйдешс ерйоре Гог Ье1рег Т 1утр1юсу1е8 Ггот сагстоетЬгуотс апйдеп. Сйп Сапсег Кез. 8, 3219-3225.

Агйшг М. Кпед, ТЬегареийс ро!епйа1 оГТоП-йке гесер!ог 9 асйуайоп 2006, Ыа1иге Κενίεχγδ, Огид О1зсоуегу, 5, ЛЕНЕ, 471-484

Кгиедег ΝΧ, 81геий М, Зайо Н (1990). §1гис1ига1 сйуегзйу апс! ενοίιιίίοη оГ Ьитап гесер!огЙке ρΐΌΐείη 1угозте рЬозрЬа1азе8. ЕМВО I 9, 3241-3252.

Еетте1 С, \Уей< 8, ЕЬег1е и, Оепд]е11, Кгай Т, Вескег НО, Каттепзее НО, 81еуапоу1с 8 (2004). О1ГГегепйа1 диапйайуе апа1уз1з оГМНС йдапйз Ьу тазз зрес1готе1гу изтд з!аЫе ίδοΐορε 1аЬеНп§. Лак Вю1есЬпо1. 22, 450-454.

Ееуу 1В, Сапо11 Ρϋ, δΐΐνεηηοΐηεη О, Вагпеа О, Могзе В, Нопеддег АМ, Ниапд Л, Сапшггаго ЕА, Рагк ЗН, Отек Т, . (1993). ТЬе с1отпд оГ а гесер!ог-1уре рго1ет 1угозте рЬозрЬа1азе ехргеззей ίη 1Ье сеп!га1 пегуоиз зуз1ет. I ΒίοΙ. СЬет. 268, 10573-10581.

Еопдепескег е! а1 (1993) Αηη. ΝΥ Асай. 5ск 690,276-291

Ей е! а1 (1981) Е Огд. СЬет. 46, 3433

Ей КУ, кпд КА, Ют ΟΥ, ЗтдЬ 1, О1а ЕД, УозЫто1о К, XVапд ΜΥ, С1оидЬезу ТЕ, Νείδοη ЗР, М1зсЬе1 РЗ (2005). Ой'Гегепйа! тйисйоп оГдЬоЫаз1ота гтдгайоп апс! дгоМЬ Ьу йуо Гогтз оГр1ею1горЫп. I ΒίοΙ СЬет. 280, 26953-26964.

МасйопаШ ϋΚ (2001). Тетого1опййе Гог гесиггеп! ЫдЬ-дгайе дЬота. 5етт. Опсо1 28, 3-12.

МасЬ В, δΐείηύε V, Магйпег-Зопа Е, КейЬ XV (1996). Кедикйоп оГМНС с1азз II депез: 1еззопз Ггот а сйзеазе. Аппи. Кеу. ЬптипоГ 14, 301-331.

А МаЬ4ау1 апй В1 Мопк Еесеп! айуапсез ίη Ьитап рарШотау1гиз уасстез Сигг Опсо1 Кер 2006, 6, 465-472.

Ма1сЬегек О, Опаи V, 51еуапоу1с 8, Каттепзее НО, Дипд О, Ме1тз А (1994). Апа1уз1з оГ аПек-зресШс соп1ас! зкез оГ па!ига1 ΗΕΑΌΚ17 Ьдапйз. I ЬптипоГ 153, 1141-1149.

Матс1 8, 5йтйо1о Т, 1тго МА, Наттег I, 81тдадЬа Ρ, Νορρεη С, ЗрадпоЬ О, ΑΗζζί В, ВеПопе М, ОеПаЬопа Р, Рго№ МР (1999). Ме1апота сеПз ргезеп! а МАОЕ-3 ерйоре 1о СО4(+) су!о1ох1с Т сеНз ίη аззос1айоп \уйЬ Ыз1осотрайЫ1йу 1еикосу1е апйдеп ϋΚΙ 1.1 Ехр. Мей 189, 871-876.

Могдап КА, ОисНеу МЕ, \Уипс1егНсЬ Ж, НидЬез М3, Υаηд ГС, ЗЬеггу КМ, Коуа1 КЕ,

ТораЬап ЗЕ, Катти1а ЕГ8, КезйГо ΝΡ, гЬепд Ζ, №Ηνί А, Йе Упез СК, Кодегз-Ргеегег ЕЙ, МаугоикаЫз 8А, КозепЬегд 8А (2006). Сапсег Кедгеззюп ίη Райеп1з АГ1ег ТгапзГег оГ ОепейсаПу Епдтеегей ЕутрЬосу1ез. 8с1епсе.

- 30 029831

МиШоПапд Р1, Педкг Н, Маггапй С, Оогтап Р, За81еш Р, Ас1атз 1,1опез ТА, Ваккаде Т\У, Уаккеуа К, 1сЫтига К, Баз! Р, РоиШказ С, СоШпз УР, Сайег ΝΡ, Тоткпзоп ΙΡ, Зкеег ϋ (2006). Оепоппс ргойкпд кепкйез сИзсгек декйопз а88ос1акд \укк капзксайопз ίη §НоЫа81ота ти1кГогте. Сек Сус1е 5, 783-791.

ЗКиЫп, М., Маек, В. апс! Ьоп§, Е.О. (1984) Тке сотр1е!е зециепсе оГ 1ке ιηΚΝΑ Гог 1ке ЕШАОК-а880С1а1е0 туайап! скат геуеак а ро!уреркс1е лукк ап ипизиа! ПапзтетЬгапе ро1ап!у ЕМВО I. 3 (4), 869-872.

№ро!капо М, Ке1те-Ошкей Р, Могуоиг А, Еайке С, Атеп А, Согпи Р, В гое! Р, Ое1аПге 1Υ (1999). Тгеакпеп! оГ 8иргакп1опа1 дНоЫаз1ота тиккогте \укк гаско!кегару апс! а сотктакоп оГВСИи апс! 1атохИеп: а рказе II з!ис1у. I ΝειίΓοοηοοΙ. 45, 229-235.

Νίεάεί С, Огози АЕ, Мо11з М (2000). А сотрапзоп оГ 1геа1теп1 гезикз Гог гесиггеп! такдпап! дкотаз. Сапсег ТгеаГ Кеу. 26, 397-409.

Νονείΐΐηο С, Саз1еШ С, Ратпаш О (2005). А кзкпд оГкитап 1итог апкдепз гесодшгед ку Т се11з; Магск 2004 ирдак. Сапсег 1ттипо1.1ттипо1кег. 54, 187-207.

Разсо1о 8. 2006: Уасстакоп \укк теззепдег ΚΝΑ Ме1кос1з Μοί Мед, 127; 23-40 Реоркз е! а1 (1995) Ргос. Иак. Асад. δοΐ. иЗА 92,432-436

Регег-Ртега Р, Оагсла-Зиагег О, Мепепдег-Кодпдиег Р, Могктег 1, Скапд Υ, АзШсИПо А, Оеие! ТЕ (2007). Тке гесеркг ргокт 1угозте ркозрка1азе (КРТР)ке1а/ге1а Ϊ8 ехргеззед ίη скГГегеп! зиЫурез оГкитап Ьгеаз! сапсег. Вюскет. Вюркуз. Кез. Соттип. 362, 5-10. РккапзЫ е! а1 (1995) Еиг. I. 1ттипо1. 25, 1783-1787

Ройа е! а1 (1994) Укокду 202, 449-955

Ргаскз ΜΌ, Ьеут V (2000). Вюкду апс! 1геа1теп1 оГтакдпап! дкота. Зетт. Опсо1 27, 1-10.

ζ)ίη Ζ, В1апкепзкт Т (2000). С 04+ Т се11—тесНакд 1итог гдеейоп ΐηνοίνεδ тЫккюп оГ апдюдепе8181ка1 Ϊ8 дерепдеп! оп ΙΕΝ датта гесеркг ехргеззюп ку попкетакроккс сеПз. кптипку. 72, 677-686.

(()ίη Ζ, ЗскхуайгкорГГ I, Ргакега Р, Каттейоепз Т, ЗеНдег В, Ртскег Н, Вкпкепзкт Т (2003). А спкса1 гедшгетеп! оГ т1егГегоп датта-тескакс! апдю81а818 Гог 1итог ге)ескоп ку СО8+ Т секз. Сапсег Кез. 63, 4095-4100.

Каттепзее НО, Васктапп I, ЕттепскИР, Васког ОА, Зкуапоук 8 (1999). 8ΥΡΡΕΙΤΗΙ: с!а1аЬазе Гог МНС Ндапск апс! реркде тойГз. Ьптиподепейсз 50, 213-219.

Каттеп8ее,Н.О., Васктапп,Е, апс! Зкуапоук,3. (1997). МНС Е1дап08 апс! Реркде МокГз. Зрппдег-Уейад, Некекегд, Оегтапу).

Κΐηΐ ΒΙ, \Уеткегд V, Ропд С, Сопгу 8, НегзкЬегд КМ, Зта11 Е1 (2006); Сотктакоп 1ттипо1кегару ν/ϊΐΗ рго81акс аск рко8рка1а8е рикед апйдеп-ргезепйпд секз (Ргоуепде) р1из ЬеуаслгитаЬ ίη ракеп18 \укк зегокдк ргодгеззкп оГ рго81ак сапсег айег скйшкуе 1оса1 1кегару; Сапсег.; 107(1):67-74)

Козепкегд ЗА, Йо1ге МТ, Мии1 ЬМ, Скапд АЕ, Ανίδ РР, йектап 8, Етекап XV М, Кокейзоп ΟΝ, Еее КЕ, КиЫп ΙΤ, . (1987). А ргодгезз герой оп 1ке кеакпеп! оГ 157 райепГз ν/ϊΐΗ

- 31 029831

айуапсей сапсег изтд 1утрЬок1пе-асйуайей кШег сейз апй тйег1еикт-2 ог ЫдЬ-йозе тйег1еикт-2 а1опе. Ν. Епдк й. Мей. 316, 889-897.

КозепЬегд 8А, Раскагй В8, АеЬегео1й РМ, 8о1отоп Ό, Торайап ЗЬ, Тоу ЗТ, δίπιοη Р, Бойге МТ, Уапд ЙС, δεΐρρ СА, . (1988). изе окЙишог-1пй1йгайпд 1ушрЬосуйе8 апй тйег1еикт-2 ΐη йЬе 1ттипойЬегару ок рай επί 8 ν/ϊΐΗ те1а81айс те1апота. А ргейттагу герой. Ν. Епдк й Мей 319, 1676-1680.

КойЬ XV, ХУеПег М (1999). СЬетойЬегару апй 1ттипойЬегару оГ тайдпапй дйота: то1еси1аг тесЬашзтз апй сйшса1 регзресйуез. СеП Мок ЬНё Зек 56, 481-506.

ЗаЫойгЫ А, ЕЬе1 Н, Миййпд й, ОеЬпе МО, Νορεηδ Н, О1е88е1тапп Н, Нетре1тапп О (2000). ОузгедЫайоп оййттипе гезропзе коИошпд пеиго8игд1са1 орегайопз. Ас1а АпаезйЬезюк Зсапй. 44, 82-87.

8аПй ей а1 (1988) Зшепсе 239,487-491

Зта11 Ей, ЗсйеПйаттег РР, ЕЙдапо СЗ, Кейкет СН, ИетипаШз йй, Уа1опе РН, Уецее 88, йопез БА, НегзЬЬегд КМ. (2006); Р1асеЬо-соп1го11ей рЬазе 3 йпа1 оГ 1ттипо1од1с Легару ν/ΐΐΡι 81ри1еисе1-Т (АРС8015) ΐη райепйз χνίίΗ тейазйайс, азутрйотайс йогтопе гекгаейогу ргозйайе сапсег; й Сйп Опсок; 24(19):3089-3094

ЗсйиЬегй и, Апйоп БС, ОЛЬз й, ΝοΛιπγ СС, УелуйеП ЙХУ, Вепшпк ЙК (2000). КарЫ йедгайайоп ок а 1агде кгаейоп ок пе\у1у 8упйЬе81гей ргойетз Ьу ргойеазотез. Ыайиге 404, ΊΊ0ΊΊ4.

8еедег,Р.Н. ей ак 1999 ТЬе НБА-А*6601 рерййе тойк: ргеЛсйоп Ьу роскей зйгиейиге апй уепйсайоп Ьу рерййе апа1у818.1ттиподепейс8 49, 571-576.

8Ьей1оск Ой, ЗЬеп Н (2003). Кедшгетепй ког СО4 Т сей Ье1р ΐη депегайпд кипсйопа1 СО8 Т сеП тетогу. δοΐεηοε 300, 337-339.

ЗтдЬ-йазща Н, ЕттепсЬ ΝΡ, Каттепзее НО (2004). ТЬе ТиЪтдеп арргоасЬ: Иепййсайоп, зекейоп, апй уаййайоп ок йитог-а88ос1айей НБА рерййез ког сапсег йЬегару. Сапсег йттипок йттипойЬег. 53, 187-195.

М. ЗйаеЫег, Α. δίεηζΐ, Р. У. О1еййсЬ, Τ. Εΐδεη, А. Накегкатр, й. Веек, А. Мауег, 8. ХУаЬег, Н. ЗтдЬ, й. РЙ8сЬ, С. О. Зйек (2008); Ап ореп 1аЬе1 зйийу йо е\а1иайе йЬе закейу апй 1ттиподешс1йу ок йЬе рерййе Ьазей сапсег уассте ΙΜΑ901, А8СО теейпд 2007; АЬзйгасй Νο 3017

К. Зйап, ЙО ХУокЬок апй АО СоЬеп ΟΝΑ уасстез адатзй сапсег Нетайо1 Опсо1 Сйп ЫогйЬ Ат 2006, 3; 613-636

Зип ЙС, Ве\ап Мй (2003). Оекесйке СО8 Т сеП тетогу коПохутд асийе ткеейоп луйЬоий СО4 Т сеП Ье1р. δοΐεηοε 300, 339-342.

Зуке8йег-Ну1Й С, Кпзйепзеп Ν, ВйсЬег Т, Регге Н, БаиешоПег ЗБ, ХУо1кХА, БашЬегйЬ К, Νΐδδεη МН, Рейегзеп БО, Вииз 8 (2002). ЕзйаЬНзЬшепй ок а диапййайке ЕБ18А сараЫе ок йейегпйшпд рерййе - МНС с1а88 I тйегаейоп. Т188ие Апйдепз 59, 251-258.

Тотрктз 8М, Койа РА, Мооге ЙС, йепзеп РЕ (1993). А еигоршт йиопйттипоаззау ког теазиппд Ътйтд ок апйдеп йо с1а88 II МНС д1усоргойет8. й йттипок МейЬойз 163, 209-216.

- 32 029831

уап с!ег Вгиддеп Р, Тгауегзап С, СЬотег Р, йищшп С, ϋε РЕ, Уап с!еп ЕВ, КпиШ А, Вооп Т (1991). А депе епсосНпд ап апйдеп гесодшгей Ьу су!о1уйс Т 1утрЬосуГез оп а Ьитап те1апота. 8с1епсе 254, 1643-1647.

'дпегоп Ν, ЗйооЬап! V, СЬарЬо 1, Оотз А, Оедюуапш О, Моге1 8, уап с!ег ВР, Вооп Т, Уап ϋεη Еупс1е ЕВ (2004). Ап апйдешс рерййе ргойисей Ьу рерййе зрНстд ΐη 1Ье рго1еазоте. ЗОепсе 304, 587-590.

лп и и ιχοίκ,,,· \,τ оиг: τη о

ν νίί,ι гых χχ.ι νροιινχ νΐ хх, χχαιυανηνι хх, ххспииэ ±νχ, Ахсииш νιιον ν χχνι, ν/ν/ιΐ££,αχι ли, ινιαιιιιι хх.

(1994). Й1дап4 тойГз οΓΕΕΕΑ-ϋΚΒ5*0101 апс! ϋΚΒ1*1501 то1еси1ез 4еЬпеа1е4 Ггот зе1Грерййез. Лттипо!. 753, 1665-1673.

'аЬег 8, Неггдеп Ь, ЗсЬоог О, Лтд О, 'ете! ϋ, ВиЬппд Щ, Каттепзее НО, 81еуапоу1с 8 (2003). СиГйпд е4де: рге4е1егттес1 ау1<1Ьу оГ Ьитап СО8 Т сеПз ехрапс!ес1 оп саЬЬга!е4 МНС/апй-С028-соа1ес1 гшсгозрЬегез. Л 1ттипо1. 171, 4974-4978.

'апд ]С, Е1У1пд81опе АМ (2003). СиШпд е4де: СО4+ Т сеП Ье1р сап Ье е88епЬа1 Гог рптагу СО8+ Т сеП гезропзез ΐη νίνο. 11ттипо1. 171, 6339-6343.

'апд V, Оау18 ϋΑ, Нацие М, Ниапд ЬЕ, УагсЬоап К (2005). О1ГГегепйа1 депе ир-геди1аЬоп Ьу Ьурох1а-т<1ис1Ые Гас1ог-1а1рЬа апс! Ьурох1а-т<1ис1Ые Гас1ог-2а1рЬа ΐη НЕК293Т сеПз. Сапсег Кез. 65, 3299-3306.

'етзсЬепк Т, ОоийеГапдеаз С, ЗсЬЫе М, ОЬегтауг Р, 'аЬег 8, ЗсЬоог О, Кигек К, Ьоезег ', В1сЫег КН, 'етеГ ϋ, 81еуапоу1с 8, Каттепзее НО (2002). 1п1едга1ес1 ГипсЬопа1 депогтсз арргоасЬ ГогГЬе 4ез1дп оГ райеп!-тсНу1с1иа1 апШитог уасстез. Сапсег Кез. 62, 5818-5827.

'и С', Ъоз! Оа1а, Л АЕ, СЫ С', Ьт 'С (2006). Ρτοίεΐη 1угозте-рЬозрЬа1азе ехргеззюп ргойЬпд ΐη дазйгс сапсег Ьззиез. Сапсег Лей. 242, 95-103.

Уее С, ТЬотрзоп 1А, Вугс! ϋ, ΚΐάάεΙΙ ЗК, КосЬе Р, СеЬз Е, ОгеепЬегд ΡΌ (2002). Αάορΐίνε Т сеП Ыегару изтд апйдеп-зресШс СО8+ Т сеП с1опез Гог 1Ье 1геа1теп1 оГ райеЫз луЬЬ те1аз1аЬс те1апота: ΐη νίνο регз1з1епсе, гшдгайоп, апс! апйГитог еГГес! оГ РапзГеггес! Т сеПз. Ргос. Ναΐΐ. АсасЕ 80. и. 8. А 99, 16168-16173.

2агетЬа 8, Ваггада Е, 2Ьи М, Зоагез Ν, Тзапд КУ, ЗсЫот I (1997). Иепййсайоп оГ ап епЬапсег адотз! су!о1ох1с Т 1утрЬосу1е рерНОе Ггот Ьитап сагстоетЬгуотс апйдеп. Сапсег Кез. 57, 4570-4577.

ΖεΗ Ш, III, Реггу-ЬаПеу ϋ, Ои41еу МЕ, КозепЬегд 8А, Уапд ГС (1999). ИдЬ а\тсН1у СТЬз Гог Руо зе1Г-апйдепз с1етопз1га1е зирепог ΐη νίίτο апс! ΐη νίνο апШитог еГйсасу. 11ттипо1. 162, 989-994.

- 33 029831

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ИММАТИКС БАЙОТЕКНОЛОДЖИЗ ГМБХ

<120> Пептид, индуцирующий цитотоксические Т-лимфоциты и стимулирующий тиопухолевые иммунные ответы

<130> 131238РСТ

<160> 11

<170> РаЬепЫп чегзФоп 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> РКТ

<213> Ното зарФепз

<400> 1

анА1а Беи ТИг ТИг Ьеи МеЕ Нтз О1п Ьеи

<210> 2

<211> 9

<212> РКТ

<213> Ното зартепз

<400> 2

РИе Ьеи Туг Ьуз Уа1 11е Ьеи Бег Ьеи 1 5

<210> 3

<211> 9

<212> РКТ

<213> Ното зартепз

<400> 3

А1а 11е 11е Азр О1у Уа1 О1и Бег Уа1

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> РКТ

<213> Ното зартепз

<400> 4

РИе Ьеи Ьеи Рго Азр ТИг Азр О1у Ьеи 1 5

<210> 5

<211> 9

<212> РКТ

<213> Ното зартепз

<400> 5

- 34 029831

Ьуз Уа1 1	РЬе	А1а	О1у 5	11е	Рго
<210>	6
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното	зартепз
<400>	6
О1п С1п	. Зег	Азр	Туг	Зег	А1а
1			5
<210>	7
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното	зартепз
<400>	7
ТЬг О1п	. Азр	Азр	Туг	Уа1	Ьеи
1			5
<210>	8
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното	зартепз
<400>	8
О1п Н1з	О1и	О1у	ТЬг	Уа1	Азп
1			5
<210>	9
<211>	12
<212>	РКТ
<213>	Ното	зартепз
<400>	9
Зег Уа1	РЬе	О1у Азр	Азр	Азп
1			5
<210>	10
<211>	14
<212>	РКТ
<213>	Ното	зартепз
<400>	10
О1и 11е	О1у	Тгр	Зег	Туг	ТЬг
1			5

тЬг ναι

А1а Ьеи

О1и Уа1

11е РЬе

Ьуз А1а Ьеи Зег Ьуз 10

О1у А1а Ьеи Азп О1п Ьуз Азп 10

<210> 11 <211> 9

<212> РКТ

- 35 029831

<213> Ното зарьепз

<400> 11

Зег Ьеи Тгр А1а О1у Уа1 Уа1 Уа1 Ьеи 1 5

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Пептид длиной 9-30 аминокислотных остатков, включающий непрерывную последовательность 8Е0 ГО № 3, который индуцирует цитотоксические Т-лимфоциты и стимулирует антиопухолевые иммунные ответы.
2. Пептид по п.1, способный связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I и способный индуцировать Т-лимфоциты СИ8.
3. Пептид по п.1, состоящий из аминокислотной последовательности 8ЕО ГО № 3.
4. Пептид по любому из пп.1-3, включающий непептидные связи, выбранные из -СН₂-ИН, -СН₂8-, -СН2СН2-, -СН=СН-, -СОСН2-, -СН(ОН)СН2- и - СН28О-.
5. Пептид по любому из пп.1-4, являющийся частью белка слияния, в частности, включающий Ν’терминальные аминокислоты антигенассоциированной инвариантной цепи (Б) НЬА-ИК.
6. Нуклеиновая кислота, кодирующая пептид по любому из пп.1-5.
7. Вектор, способный экспрессировать нуклеиновую кислоту по п.6.
8. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.6 или вектор по п.7, являющаяся антигенпрезентирующей клеткой.
9. Способ получения пептида по любому из пп.1-5, включающий культивирование клетки-хозяина по п.8, которая экспрессирует нуклеиновую кислоту по п.6 или вектор по п.7, и выделение пептида из клетки-хозяина или его культуральной среды.
10. Способ получения активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) ίη νίίτο, включающий обеспечение контактирования ίη νίίτο ЦТЛ с нагруженными антигеном молекулами МНС класса I человека, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки или искусственной конструкции, имитирующей антигенпрезентирующую клетку, в течение периода времени, достаточного для активации указанных ЦТЛ антигенспецифическим образом, где указанный антиген является пептидом по любому из пп.1-3.
11. Активированный цитотоксический Т-лимфоцит (ЦТЛ), полученный с помощью способа по п.10, который селективно распознает клетку, аберрантно экспрессирующую пептид по любому из пп.1-3.
12. Способ уничтожения клеток-мишеней у пациента, которые аберрантно экспрессируют пептид по любому из пп. 1-4, включающий введение пациенту эффективного числа активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) по п.11.
13. Применение пептида по любому из пп.1-5 для изготовления лекарственного средства для лечения рака, выбранного из астроцитомы, пилоидной астроцитомы, дисэмбриопластической нейроэпителиальной опухоли, олигодендроглиомы, эпендимомы, мультиформной глиобластомы, смешанной глиомы, олигоастроцитомы, медуллобластомы, ретинобластомы, нейробластомы, герминомы, тератомы, ганглиоглиомы, ганглиоцитомы, центральной ганглиоцитомы, примитивной нейроэктодермальной опухоли, опухоли паренхимы шишковидной железы, опухоли, развивающейся из эпендимных клеток, опухоли хориоидного сплетения, нейроэпителиальной опухоли неопределенного происхождения или глиобластомы, рака легких и аденосквамозной карциномы.
14. Применение нуклеиновой кислоты по п.6 для изготовления лекарственного средства для лечения рака, выбранного из астроцитомы, пилоидной астроцитомы, дисэмбриопластической нейроэпителиальной опухоли, олигодендроглиомы, эпендимомы, мультиформной глиобластомы, смешанной глиомы, олигоастроцитомы, медуллобластомы, ретинобластомы, нейробластомы, герминомы, тератомы, ганглиоглиомы, ганглиоцитомы, центральной ганглиоцитомы, примитивной нейроэктодермальной опухоли, опухоли паренхимы шишковидной железы, опухоли, развивающейся из эпендимных клеток, опухоли хориоидного сплетения, нейроэпителиальной опухоли неопределенного происхождения или глиобластомы, рака легких и аденосквамозной карциномы.
15. Применение вектора по п.7 для изготовления лекарственного средства для лечения рака, выбранного из астроцитомы, пилоидной астроцитомы, дисэмбриопластической нейроэпителиальной опухоли, олигодендроглиомы, эпендимомы, мультиформной глиобластомы, смешанной глиомы, олигоастроцитомы, медуллобластомы, ретинобластомы, нейробластомы, герминомы, тератомы, ганглиоглиомы, ганглиоцитомы, центральной ганглиоцитомы, примитивной нейроэктодермальной опухоли, опухоли паренхимы шишковидной железы, опухоли, развивающейся из эпендимных клеток, опухоли хориоидного сплетения, нейроэпителиальной опухоли неопределенного происхождения или глиобластомы, рака легких и аденосквамозной карциномы.

- 36 029831
16. Применение клетки по п.8 для изготовления лекарственного средства для лечения рака, выбранного из астроцитомы, пилоидной астроцитомы, дисэмбриопластической нейроэпителиальной опухоли, олигодендроглиомы, эпендимомы, мультиформной глиобластомы, смешанной глиомы, олигоастроцитомы, медуллобластомы, ретинобластомы, нейробластомы, герминомы, тератомы, ганглиоглиомы, ганглиоцитомы, центральной ганглиоцитомы, примитивной нейроэктодермальной опухоли, опухоли паренхимы шишковидной железы, опухоли, развивающейся из эпендимных клеток, опухоли хориоидного сплетения, нейроэпителиальной опухоли неопределенного происхождения или глиобластомы, рака легких и аденосквамозной карциномы.
17. Применение активированного цитотоксического Т-лимфоцита по п.11 для изготовления лекарственного средства для лечения рака, выбранного из астроцитомы, пилоидной астроцитомы, дисэмбриопластической нейроэпителиальной опухоли, олигодендроглиомы, эпендимомы, мультиформной глиобластомы, смешанной глиомы, олигоастроцитомы, медуллобластомы, ретинобластомы, нейробластомы, герминомы, тератомы, ганглиоглиомы, ганглиоцитомы, центральной ганглиоцитомы, примитивной нейроэктодермальной опухоли, опухоли паренхимы шишковидной железы, опухоли, развивающейся из эпендимных клеток, опухоли хориоидного сплетения, нейроэпителиальной опухоли неопределенного происхождения или глиобластомы, рака легких и аденосквамозной карциномы.
18. Применение по любому из пп.13-17, где лекарственное средство представляет собой вакцину.
19. Применение пептида по п.1 для генерации и разработки специфических антител к комплексам МНС/пептид по п.1.

- 37 029831

Ке1айуе ехргеззюп = относительная экспрессия 600.0 1