ES2864677T3 - Desbloqueo ortogonal de nucleótidos - Google Patents

Abstract

Un método para secuenciar moldes de ácido nucleico, que comprende (a) proporcionar una matriz que comprende una pluralidad de sitios, en donde cada sitio comprende un primer molde de ácido nucleico y un segundo molde de ácido nucleico, en donde el primer molde de ácido nucleico tiene una secuencia que es diferente de la secuencia del segundo molde de ácido nucleico, en donde un primer cebador se une al primer molde de ácido nucleico, un resto de bloqueo reversible se une al primer cebador, en donde un segundo cebador se une al segundo molde de ácido nucleico, un resto de bloqueo reversible se une al segundo cebador, y en donde el resto de bloqueo reversible que se une al primer cebador es diferente del resto de bloqueo reversible que se une al segundo cebador; (b) eliminar selectivamente el resto de bloqueo reversible que se une al primer cebador mientras se mantiene el resto de bloqueo reversible que se une al segundo cebador; (c) extender el primer cebador mediante la adición de un primer análogo de nucleótido que comprende un resto de bloqueo reversible; (d) eliminar selectivamente el resto de bloqueo reversible que se une al segundo cebador mientras se mantiene el resto de bloqueo reversible que se une al análogo de nucleótido que se añade al primer cebador; (e) extender el segundo cebador mediante la adición de un segundo análogo de nucleótido que comprende un resto de bloqueo reversible, en donde el resto de bloqueo reversible del primer análogo de nucleótido es diferente del resto de bloqueo reversible del segundo análogo de nucleótido; y (f) detectar el análogo de nucleótido que se añade al primer cebador y el análogo de nucleótido que se añade al segundo cebador, en cada uno de los sitios, determinando así las diferentes secuencias del primer molde y el segundo molde en cada uno de los sitios de manera ortogonal empleando un desbloqueo selectivo de nucleótidos.

Description

DESCRIPCIÓN

Desbloqueo ortogonal de nucleótidos

Antecedentes

Esta divulgación se refiere en general al análisis de ácidos nucleicos y, más específicamente, a la secuenciación de ácidos nucleicos.

Las plataformas comerciales disponibles actualmente para secuenciar el ADN son relativamente costosas. Estas plataformas utilizan un enfoque de "secuenciación por síntesis", llamado así porque los polímeros de ADN se sintetizan mientras se detecta la adición de cada monómero (es decir, nucleótido) a la estructura del polímero en crecimiento. Debido a que una cadena de ADN molde dirige estrictamente la síntesis de un nuevo polímero de ADN, se puede inferir la secuencia del ADN molde a partir de la serie de monómeros de nucleótidos que se añadieron a la hebra en crecimiento durante la síntesis. La capacidad para detectar adiciones de monómeros se ve facilitada por variantes diseñadas especialmente de los componentes bioquímicos que normalmente llevan a cabo la síntesis de ADN en sistemas biológicos. Estos componentes diseñados mediante ingeniería genética son relativamente costosos de fabricar y se consumen en cantidades relativamente grandes durante la secuenciación por síntesis. Además, la monitorización de la reacción utiliza un equipo relativamente caro, tal como láseres, sistemas ópticos de detección y sistemas complejos de suministro de fluidos. Las plataformas comerciales más exitosas hasta la fecha también requieren reactivos y equipos costosos para amplificar los moldes de ADN antes de que pueda comenzar la secuenciación por síntesis. La complejidad y el costo de estas plataformas han dificultado su uso en algunos contextos clínicos y de investigación donde existe una clara necesidad de la tecnología.

Por tanto, existe la necesidad de mejorar las plataformas de secuenciación por síntesis para hacerlas más rentables, rápidas y convenientes. La presente divulgación aborda esta necesidad y proporciona también otras ventajas.

Breve compendio

La presente divulgación proporciona un método para identificar moldes de ácido nucleico. El método puede incluir las etapas de (a) proporcionar una serie de sitios, en donde cada sitio comprende una mezcla de al menos dos moldes de ácido nucleico diferentes; (b) extender cebadores hibridados con diferentes moldes de ácido nucleico en cada uno de los sitios con diferentes análogos de nucleótidos que tienen diferentes restos de bloqueo reversibles, respectivamente, produciendo de ese modo diferentes productos de extensión de cebadores en cada sitio; (c) detectar los diferentes productos de extensión del cebador para distinguir los diferentes análogos de nucleótidos en cada sitio; y (d) eliminar los diferentes restos de bloqueo reversibles de los productos de extensión del cebador en cada uno de los sitios empleando un primer tratamiento que es selectivo para un primer de los diferentes restos de bloqueo reversibles y un segundo tratamiento que es selectivo para un segundo de los diferentes restos de bloqueo reversibles. Opcionalmente, el método puede incluir además (e) repetir las etapas (b) a (d) para determinar la secuencia de diferentes análogos de nucleótidos añadidos a cada uno de los diferentes productos de extensión en cada uno de los sitios.

También se proporciona un método para secuenciar moldes de ácido nucleico que puede incluir las etapas de (a) proporcionar una serie de sitios, en donde cada sitio incluye un primer molde de ácido nucleico y un segundo molde de ácido nucleico, en donde el primer molde de ácido nucleico tiene una secuencia que es diferente de la secuencia del segundo molde de ácido nucleico, en donde un primer cebador se une al primer molde de ácido nucleico, y en donde un segundo cebador se une al segundo molde de ácido nucleico, un resto de bloqueo reversible se une al segundo cebador; (b) extender el primer cebador mediante la adición de un primer análogo de nucleótido que se une a un resto de bloqueo reversible, en donde el resto de bloqueo reversible que se une al primer nucleótido es diferente del resto de bloqueo reversible que se une al segundo cebador; (c) eliminar selectivamente el resto de bloqueo reversible que se une al segundo cebador mientras se mantiene el resto de bloqueo reversible que se une al análogo de nucleótido que se añade al primer cebador; (d) extender el segundo cebador mediante la adición de un segundo análogo de nucleótido que se une a un resto de bloqueo reversible, en donde el resto de bloqueo reversible que se une al primer análogo de nucleótido es diferente del resto de bloqueo reversible que se une al segundo análogo de nucleótido; y (e) detectar el análogo de nucleótido que se añade al primer cebador y el análogo de nucleótido que se añade al segundo cebador, en cada uno de los sitios, determinando de esta manera las diferentes secuencias del primer molde y el segundo molde en cada uno de los sitios. Opcionalmente, el método puede incluir además las etapas de (f) eliminar selectivamente el resto de bloqueo reversible que se une al primer análogo de nucleótido que se añade al primer cebador mientras se mantiene el resto de bloqueo reversible que se une al segundo análogo de nucleótido que se añade al segundo cebador; (g) extender el primer cebador, después de (f), mediante la adición de un tercer análogo de nucleótido que se une a un resto de bloqueo reversible; (h) eliminar selectivamente el resto de bloqueo reversible que se une al segundo análogo de nucleótido que se añade al segundo cebador mientras se mantiene el resto de bloqueo reversible que se une al primer análogo de nucleótido que se añade al primer cebador; (i) extender el segundo cebador, después de (h), mediante la adición de un cuarto análogo de nucleótido que se une a un resto de bloqueo reversible, en donde el resto de bloqueo reversible que se une al tercer análogo de nucleótido es diferente del resto de bloqueo reversible que se une al cuarto análogo de nucleótido; y (h) detectar el análogo de nucleótido que se añade al primer cebador en (g) y el análogo de nucleótido que se añade al segundo cebador en (i), en cada uno de los sitios, determinando así las diferentes secuencias del primer molde y el segundo molde en cada uno de los sitios. Opcionalmente, se pueden repetir las etapas (f) a (h). Se proporciona también un método para secuenciar moldes de ácido nucleico que puede incluir las etapas de (a) proporcionar una serie de sitios, en donde cada sitio incluye un primer molde de ácido nucleico y un segundo molde de ácido nucleico, en donde el primer molde de ácido nucleico tiene una secuencia que es diferente de la secuencia del segundo molde de ácido nucleico, en donde un primer cebador se une al primer molde de ácido nucleico, un resto de bloqueo reversible se une al primer cebador, en donde un segundo cebador se une al segundo molde de ácido nucleico, un resto de bloqueo reversible se une al segundo cebador, y en donde el resto de bloqueo reversible que se une al primer cebador es diferente del resto de bloqueo reversible que se une al segundo cebador; (b) eliminar selectivamente el resto de bloqueo reversible que se une al primer cebador mientras se mantiene el resto de bloqueo reversible que se une al segundo cebador; (c) extender el primer cebador mediante la adición de un primer análogo de nucleótido que se une a un resto de bloqueo reversible; (d) eliminar selectivamente el resto de bloqueo reversible que se une al segundo cebador mientras se mantiene el resto de bloqueo reversible que se une al análogo de nucleótido que se añade al primer cebador; (e) extender el segundo cebador mediante la adición de un segundo análogo de nucleótido que se une a un resto de bloqueo reversible, en donde el resto de bloqueo reversible que se une al primer análogo de nucleótido es diferente del resto de bloqueo reversible que se une al segundo análogo de nucleótido; y (f) detectar el análogo de nucleótido que se añade al primer cebador y el análogo de nucleótido que se añade al segundo cebador, en cada uno de los sitios, determinando así las diferentes secuencias del primer molde y del segundo molde en cada uno de los sitios.

La presente divulgación proporciona además una matriz de ácido nucleico que incluye una pluralidad de sitios en un soporte sólido, en donde cada sitio incluye un primer molde de ácido nucleico y un segundo molde de ácido nucleico, en donde el primer molde de ácido nucleico tiene una secuencia que es diferente de la secuencia del segundo molde de ácido nucleico, en donde un primer cebador se une al primer molde de ácido nucleico, un primer resto de bloqueo reversible se une al primer cebador, en donde un segundo cebador se une al segundo molde de ácido nucleico, un segundo resto de bloqueo reversible se une al segundo cebador, y en donde el primer resto de bloqueo reversible es diferente del segundo resto de bloqueo reversible.

Breve descripción de los dibujos

La Figura. 1 muestra un diagrama de ciclo para la secuenciación por síntesis llevada a cabo simultáneamente para una mezcla de dos moldes en un sitio de una matriz, en donde subconjuntos de restos de marcaje y restos de desbloqueo que se presentan en los mismos productos de extensión se escinden simultáneamente.

La Figura. 2 muestra un diagrama de ciclo para la secuenciación mediante síntesis llevada a cabo simultáneamente para una mezcla de dos moldes en un sitio de una matriz, en donde los restos de marcaje que se presentan en diferentes productos de extensión (es decir, producidos en ambas reacciones R1 y R2) se escinden simultáneamente.

Descripción detallada

Esta divulgación proporciona un método para la detección de ácidos nucleicos de alta densidad. Realizaciones particulares de los métodos de la presente divulgación aprovechan técnicas conocidas para manipular y detectar ácidos nucleicos. Sin embargo, las mejoras que se exponen a continuación proporcionan un procesamiento ortogonal de tal manera que aumenta la densidad de la información obtenida mediante el empleo de estas técnicas. El ejemplo de una técnica de detección basada en la extensión del cebador es ilustrativo del aumento de la densidad de información que se puede obtener. Específicamente, una secuencia diana de un ácido nucleico se puede hibridar con un cebador y el cebador se extiende mediante una ADN polimerasa para añadir un análogo de nucleótido marcado. Se puede emplear un formato de matriz con múltiples sitios, teniendo cada sitio una única secuencia diana que difiere de las secuencias diana presentes en otros sitios. Opcionalmente, se emplean también varias especies de análogos de nucleótidos diferentes, cada una con un marcador distinguible. La extensión del cebador da como resultado el reclutamiento del análogo de nucleótido marcado al ácido nucleico que tiene la secuencia diana. En un formato de matriz, donde se emplean diferentes análogos de nucleótidos marcados, se puede distinguir el marcador que se recluta en cada sitio, y utilizar esta información para identificar el ácido nucleico diana en ese sitio. La densidad de información obtenida de este formato de matriz es una secuencia diana identificada por sitio.

En un formato ortogonal de la presente divulgación, cada sitio de la matriz puede contener una mezcla de dos o más secuencias diana diferentes que se tratan simultáneamente (por ejemplo, con reactivos químicos o manipulaciones físicas) y se observan simultáneamente (por ejemplo, con un detector que tiene una resolución que es demasiado baja para resolver espacialmente los ácidos nucleicos en la mezcla). No obstante, los tratamientos ortogonales establecidos en la presente memoria producen efectos diferenciales que permiten distinguir entre sí las diferentes secuencias diana. En este caso, la información derivada de la matriz se puede al menos duplicar. Se pueden administrar dos cebadores diferentes a una matriz y, debido a la complementariedad diferencial, se hibridarán con las dos secuencias de molde diferentes, respectivamente, en cada sitio individual. El primer cebador puede tener un primer resto de bloqueo reversible que evita que se extienda hasta que se aplique un primer tratamiento de desbloqueo, y el segundo cebador puede tener un segundo resto de bloqueo reversible que evita que se extienda hasta que se aplique un segundo tratamiento de desbloqueo. En este ejemplo, el primer tratamiento de desbloqueo es selectivo para el primer resto de bloqueo reversible en comparación con un segundo resto de bloqueo reversible y el segundo tratamiento de desbloqueo es selectivo para el segundo resto de bloqueo reversible en comparación con el primer resto de bloqueo reversible. Esta capacidad de desbloqueo selectivo proporciona una ortogonalidad tal que los cebadores, aunque están expuestos a cada tratamiento de desbloqueo, pueden modificarse individualmente para su extensión y detección. Por tanto, los dos cebadores, y más significativamente los moldes que dirigen su extensión, se pueden distinguir por este cambio químico aunque las propias moléculas no estén lo suficientemente separadas como para permitir la distinción espacial empleando el sistema de detección en uso.

Los conceptos de ortogonalidad ejemplificados anteriormente para una técnica de detección basada en la extensión del cebador se pueden aplicar fácilmente a una técnica de secuenciación por síntesis (SBS, de sus siglas en inglés). En la Figura 1 se muestra un diagrama de ciclo ejemplar para SBS ortogonal para dos moldes (R1 y R2) en un sitio. La primera columna en el diagrama representa un tratamiento al que está expuesto la matriz (es decir, ambos moldes se exponen al tratamiento). La segunda y tercera columnas indican el efecto del tratamiento en el primer molde y en el segundo molde, respectivamente. En la primera etapa del primer ciclo, una mezcla de cebadores se pone en contacto con la matriz, lo que da como resultado la hibridación con los respectivos sitios de unión del cebador. Después de la etapa 1, el cebador R1 que se hibrida con el molde R1 se bloquea por el bloque 1 y el cebador R2 carece de un grupo de bloqueo (opcionalmente, el cebador R2 puede bloquearse mediante un resto de bloqueo ortogonal, bloque 2). Como tal, los dos cebadores se pueden extender por separado. Por ejemplo, en la segunda etapa del primer ciclo, se administra a la matriz un nucleótido que tiene un bloque 2 y un marcador 2, lo que da como resultado la extensión selectiva del cebador R2 desbloqueado (es decir, el cebador R1 no se extiende).Después, en la tercera etapa del primer ciclo, la matriz se puede exponer a un tratamiento que desbloquea selectivamente el cebador R1, por ejemplo, mediante escisión del bloque 1 (es decir, el bloque 2 no se escinde). En la cuarta etapa del primer ciclo, se administra a la matriz un nucleótido que tiene el bloque 1 y el marcador 1, lo que da como resultado la extensión selectiva del cebador R1 no bloqueado (es decir, el cebador R2 no se extiende). A continuación, la matriz se puede observar utilizando un dispositivo de detección de tal manera que los dos marcadores se puedan distinguir en cada sitio. Como se ejemplifica en la FIG. 1, los ciclos de administración de nucleótidos que están bloqueados y marcados, escindiendo grupos de bloqueo y marcadores y detección se pueden repetir cíclicamente.

Como se ejemplificó anteriormente y en la FIG. 1, los análogos de nucleótidos que se emplean para extender los cebadores pueden incluir restos de bloqueo reversibles que se pueden escindir selectivamente para proporcionar un control ortogonal a través de múltiples ciclos de secuenciación por proceso de síntesis. Por lo tanto, los análogos de nucleótidos se pueden proporcionar en dos conjuntos: un primer conjunto que tiene un primer resto de bloqueo reversible (por ejemplo, el mismo que el resto de bloqueo reversible en el primer cebador, bloque 1) y un segundo conjunto que tiene un segundo resto de bloqueo reversible (por ejemplo, bloque 2). En algunas realizaciones, los análogos de nucleótidos en el primer conjunto pueden tener marcadores que se distinguen de los marcadores de los análogos de nucleótidos en el segundo conjunto (por ejemplo, un primer conjunto se indica como el marcador 1 y un segundo conjunto se indica como marcador 2 en la Figura 1). La ortogonalidad resultante en la reactividad bioquímica y la gestión de marcadores permite que los dos eventos de extensión del cebador se distingan entre sí en cada sitio de una matriz. Por tanto, las dos secuencias diana se pueden detectar de forma distinguible.

Se entenderá que otros métodos también se pueden beneficiar de la manipulación y detección ortogonales como se expone con más detalle a continuación. Por tanto, las composiciones, aparatos y métodos establecidos en la presente memoria no necesitan limitarse a aplicaciones de secuenciación.

La ortogonalidad se puede aprovechar para aumentar la densidad de adquisición de información al doble o más. Por ejemplo, se puede obtener un aumento de más del doble en la densidad de información utilizando más de dos conjuntos de reactivos ortogonales. Como ejemplo, se pueden emplear 3 conjuntos de reactivos, que incluyen 3 tratamientos de desbloqueo diferentes, cada uno de los cuales es selectivo para los cebadores y/o análogos de nucleótidos en uno de los conjuntos de reactivos.

Como se demostró anteriormente y como se expondrá con más detalle a continuación, la presente divulgación proporciona la ventaja de la toma de imágenes de super-resolución de una matriz, en la que el número de secuencias diana que se pueden resolver simultáneamente en un sitio dado es mayor que uno. Las imágenes de super-resolución pueden proporcionar la ventaja de distinguir simultáneamente un número de ácidos nucleicos diana diferentes que es mayor que el número de sitios en la matriz. De manera similar, se proporciona una superresolución porque se pueden distinguir dos secuencias diana diferentes en un sustrato de fase sólida empleando un detector que tiene una resolución que es menor que la resolución espacial que de otro modo se requeriría para distinguir las dos secuencias diana en el sustrato.

En realizaciones particulares, esta divulgación proporciona reactivos y configuraciones de hardware para una detección eficaz de ácidos nucleicos. Una configuración ejemplar emplea menos marcadores que el número de especies de análogos de nucleótidos que se van a distinguir en una etapa de extensión del cebador. Por ejemplo, se pueden distinguir cuatro especies de análogos de nucleótidos basándose en la detección de una única especie de marcador. Como se establece con más detalle a continuación, esto se puede conseguir empleando un primer conjunto de análogos de nucleótidos que incluyen las siguientes cuatro especies: (1) una especie que tiene un primer marcador, (2) una especie que tiene un ligando, (3) una especie que tiene un enlace escindible con el primer marcador, y (4) una especie que carece de cualquier marcador o ligando empleado en una etapa posterior, en donde las cuatro especies tienen un resto de bloqueo que se desbloquea selectivamente mediante un primer tratamiento. Un conjunto ortogonal de análogos de nucleótidos puede incluir las siguientes cuatro especies (5) una especie que tiene un segundo marcador (6) una especie que tiene una mezcla del primer y el segundo marcadores, (7) una especie que tiene un enlace escindible para el segundo marcador, y (8) una especie que carece de cualquier marcador o ligando empleado en una etapa posterior en donde las cuatro especies tienen un resto de bloqueo que se desbloquea selectivamente mediante un segundo tratamiento. Específicamente, el primer tratamiento no provoca un desbloqueo sustancial del primer conjunto de análogos de nucleótidos y el segundo tratamiento no provoca un desbloqueo sustancial del conjunto ortogonal de análogos de nucleótidos.

Las especies dentro de cada uno de los conjuntos anteriores se pueden distinguir entre sí basándose en una contabilidad adecuada de qué marcadores aparecen o desaparecen después de etapas fluídicas específicas y los dos conjuntos ortogonales de análogos de nucleótidos se pueden distinguir basándose en los dos marcadores diferentes. Más específicamente, las especies (1) y (5) se pueden distinguir entre sí basándose en diferentes marcadores y de todas las demás especies debido a su aparición después de una etapa de marcaje inicial y su resistencia al agente de escisión respectivo; la especie (2) se puede distinguir basándose en la aparición del marcador después de la incubación con un receptor marcado; las especies (3) y (7) se pueden distinguir entre sí basándose en los diferentes marcadores y se distinguen de todas las demás especies basándose en la aparición inicial del marcador y después en la desaparición después del tratamiento con un reactivo de escisión respectivo; la especie (6) se puede distinguir de todas las demás especies basándose en la presencia de ambos marcadores a una intensidad que es la mitad de la intensidad de las especies marcadas completamente; y las especies (4) y (8) se pueden distinguir basándose en la inferencia de la ausencia de cualquier otra especie en los conjuntos respectivos que se hayan detectado. Son posibles muchas otras configuraciones para alterar el número de marcadores, el número de manipulaciones fluídicas durante una fase de detección y/o la complejidad del dispositivo de detección para distinguir un determinado número de marcadores. Como tal, la configuración se puede adaptar para ajustarse a un enfoque o aplicación en particular.

Se entenderá que los términos empleados en la presente memoria adquieren su significado habitual a menos que se especifique lo contrario. A continuación se exponen ejemplos de varios términos empleados en la presente memoria y sus definiciones.

Como se emplea en la presente memoria, el término "amplicón", cuando se emplea en referencia a un ácido nucleico, significa el producto de la duplicación del ácido nucleico, en donde el producto tiene una secuencia de nucleótidos que es igual o complementaria a al menos una parte de la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico. Un amplicón se puede producir mediante una variedad de métodos de amplificación que utilizan el ácido nucleico, o un amplicón del mismo, como un molde que incluye, por ejemplo, la extensión de polimerasa, la reacción en cadena de polimerasa (PCR), la amplificación por círculo rodante (ACR), la extensión por ligación o la reacción en cadena de ligación. Un amplicón puede ser una molécula de ácido nucleico que tiene una única copia de una secuencia de nucleótidos particular (por ejemplo, un producto de PCR) o múltiples copias de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, un producto concatamérico de ACR). Un primer amplicón de un ácido nucleico diana es normalmente una copia complementaria. Los amplicones posteriores son copias que se crean, después de la generación del primer amplicón, a partir del ácido nucleico diana o de otro amplicón. Un amplicón posterior puede tener una secuencia que es sustancialmente complementaria al ácido nucleico diana o sustancialmente idéntica al ácido nucleico diana.

Como se emplea en la presente memoria, el término "matriz" se refiere a una población de sitios que se pueden diferenciar entre sí según la ubicación relativa. Las diferentes moléculas que se encuentran en diferentes sitios de una matriz se pueden diferenciar entre sí según las ubicaciones de los sitios en la matriz. Un sitio individual de una matriz puede incluir una o más moléculas de un tipo particular. Por ejemplo, un sitio puede incluir una única molécula de ácido nucleico diana que tiene una secuencia particular o un sitio puede incluir varias moléculas de ácido nucleico que tienen la misma secuencia (y/o secuencia complementaria, de la misma). Alternativamente, un sitio puede incluir una mezcla de secuencias de ácido nucleico diana, por ejemplo, de modo que las moléculas individuales contienen dos o más moléculas diferentes cada una o de manera que dos o más moléculas contienen cada una una única secuencia diana de la mezcla. Los sitios de una matriz pueden tener características diferentes ubicados en el mismo sustrato. Ejemplos de características incluyen, sin limitación, pocillos en un sustrato, perlas (u otras partículas) en o sobre un sustrato, proyecciones de un sustrato, crestas en un sustrato o canales en un sustrato. Los sitios de una matriz pueden ser sustratos separados, cada uno en una molécula diferente. Se pueden identificar diferentes moléculas unidas a sustratos separados según las ubicaciones de los sustratos en una superficie a la que están asociados los sustratos o según las ubicaciones de los sustratos en un líquido o gel. Ejemplos de matrices en las que se ubican sustratos separados en una superficie incluyen, sin limitación, aquellas que tienen perlas en los pocillos.

Como se emplea en la presente memoria, el término "unido" se refiere al estado de dos cosas que se juntan, sujetan, adhieren, conectan o unen entre sí. Por ejemplo, un analito, tal como un ácido nucleico, se puede unir a un material, tal como un gel o un soporte sólido, mediante un enlace covalente o no covalente. Un enlace covalente se caracteriza por compartir pares de electrones entre átomos. Un enlace no covalente es un enlace químico que no implica compartir pares de electrones y puede incluir, por ejemplo, enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, fuerzas de van der Waals, interacciones hidrofílicas e interacciones hidrofóbicas. Un ácido nucleico se puede unir a un soporte sólido mediante un recubrimiento de gel sobre el soporte sólido.

Como se emplea en la presente memoria, el término "resto de bloqueo", cuando se emplea en referencia a un análogo de nucleótido, significa una parte del análogo de nucleótido que inhibe o evita que el análogo de nucleótido forme un enlace covalente con un segundo análogo de nucleótido. Por ejemplo, en el caso de análogos de nucleótidos que tienen un resto de pentosa, un resto de bloqueo puede prevenir la formación de un enlace fosfodiéster entre el oxígeno 3' del análogo de nucleótido y el fosfato 5' del segundo análogo de nucleótido. El resto de bloqueo puede ser parte de un análogo de nucleótido que es una unidad monomérica presente en un polímero de ácido nucleico o el resto de bloqueo puede ser una parte de un análogo de nucleótido libre (por ejemplo, un trifosfato de nucleótido). El resto de bloqueo que es parte de un análogo de nucleótido puede ser reversible, tal que el resto de bloqueo se puede eliminar o modificar para hacer que el análogo de nucleótido sea capaz de formar un enlace covalente con un segundo análogo de nucleótido. Los restos de bloqueo reversibles particularmente útiles son los fosfatos, fosfoésteres, alquil azidas, acetales, ésteres, éteres, o similares. A continuación se exponen más ejemplos de restos de bloqueo reversibles que se pueden emplear. En realizaciones particulares, un resto de bloqueo, tal como un resto de bloqueo reversible, se puede unir a la posición 3' o la posición 2' de un resto pentosa de un análogo de nucleótido.

Como se emplea en la presente memoria, el término "grupo", cuando se emplea en referencia a ácidos nucleicos, se refiere a una población de ácidos nucleicos que se une a un soporte sólido para formar una característica o sitio. Los ácidos nucleicos son generalmente de una sola especie, formando así un grupo homogéneo. Sin embargo, en algunas realizaciones, los ácidos nucleicos pueden ser heterogéneos, tal que moléculas individuales que tienen secuencias diferentes están presentes en el sitio o característica. Los ácidos nucleicos se unen por lo general de manera covalente al soporte sólido, por ejemplo, a través de sus extremos 5', pero en algunos casos son posibles otros medios de unión. Los ácidos nucleicos de un grupo pueden ser monocatenarios o bicatenarios. En algunas realizaciones, pero no en todas, las agrupaciones se forman mediante un método de amplificación en fase sólida conocido como amplificación en puente. Ejemplos de configuraciones para grupos y métodos para su producción se establecen, por ejemplo, en la Patente U.S. N° 5.641.658; la Publicación de Patente U.S.. N° 2002/0055100; la Patente U.S. N° 7.115.400; la Publicación de Patente U.S. N° 2004/0096853; la Publicación de Patente U.S. N° 2004/0002090; la Publicación de Patente U.S. .N° 2007/0128624; y la Publicación de Patente U.S. N° 2008/0009420.

Como se emplea en la presente memoria, el término "agente de desbloqueo" significa un catalizador, enzima, reactivo u otra sustancia que es capaz de modificar o eliminar un resto de bloqueo. En realizaciones particulares, un agente de desbloqueo puede tener especificidad por un resto de bloqueo particular. Como tal, el agente de desbloqueo puede eliminar selectivamente un resto de bloqueo particular de un análogo de nucleótido en comparación con otro resto de bloqueo. Ejemplos de agentes de desbloqueo incluyen, pero no se limitan a, una enzima, tal como una fosfoesterasa, esterasa, alquil transferasa o metil transferasa; o un reactivo químico, tal como fosfina, protón, o catalizador químico, tal como catalizador de paladio, o similares. A continuación, se exponen con más detalle ejemplos adicionales de agentes de desbloqueo.

Como se emplea en la presente memoria, el término "diferente", cuando se emplea en referencia a ácidos nucleicos, significa que los ácidos nucleicos tienen secuencias de nucleótidos que no son iguales entre sí. Dos o más ácidos nucleicos pueden tener secuencias de nucleótidos que son diferentes a lo largo de toda su longitud. Alternativamente, dos o más ácidos nucleicos pueden tener secuencias de nucleótidos que son diferentes a lo largo de una parte sustancial de su longitud. Por ejemplo, dos o más ácidos nucleicos pueden tener partes de secuencia de nucleótidos diana que son diferentes entre sí mientras que también tienen una región de secuencia universal que es la misma para ambos. Generalmente, cuando en la presente memoria se hace referencia a dos especies como "diferentes", una de las especies tendrá una propiedad estructural que no es la misma que las propiedades estructurales de la segunda especie. Por ejemplo, dos especies poliméricas diferentes (tal como dos proteínas) pueden tener diferentes secuencias de subunidades monoméricas (tal como diferentes secuencias de aminoácidos para dos proteínas diferentes).

Como se emplea en la presente memoria, el término "cada uno", cuando se emplea en referencia a una colección de artículos, se dirige a identificar un artículo individual en la colección, pero no se refiere necesariamente a todos los artículos de la colección. Pueden ocurrir excepciones si la divulgación explícita o el contexto dictan claramente lo contrario.

Como se emplea en la presente memoria, el término "ácido nucleico" pretende ser coherente con su empleo en la técnica e incluye ácidos nucleicos de origen natural o análogos funcionales de los mismos. Los análogos funcionales particularmente útiles son capaces de hibridar con un ácido nucleico de una manera específica de secuencia o se pueden emplear como molde para la replicación de una secuencia de nucleótidos particular. Los ácidos nucleicos de origen natural generalmente tienen una cadena principal que contiene enlaces fosfodiéster. Una estructura análoga puede tener un enlace principal alternativo que incluye cualquiera de los conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos de origen natural generalmente tienen un azúcar desoxirribosa (por ejemplo, que se encuentra en el ácido desoxirribonucleico (ADN)) o un azúcar ribosa (por ejemplo, que se encuentra en el ácido ribonucleico (ARN)). Un ácido nucleico puede contener cualquiera de una variedad de análogos de estos restos de azúcar que se conocen en la técnica. Un ácido nucleico puede incluir bases nativas o no nativas. A este respecto, un ácido desoxirribonucleico nativo puede tener una o más bases seleccionadas del grupo que consiste en adenina, timina, citosina o guanina y un ácido ribonucleico puede tener una o más bases seleccionadas del grupo que consiste en uracilo, adenina, citosina o guanina. Las bases no nativas útiles que se pueden incluir en un ácido nucleico se conocen en la técnica. El término "diana", cuando se emplea en referencia a un ácido nucleico, pretende ser un identificador semántico para el ácido nucleico en el contexto de un método o composición establecido en la presente memoria y no necesariamente limita la estructura o función del ácido nucleico más allá de lo que se indique explícitamente de otro modo.

Como se emplea en la presente memoria, el término "molde de ácido nucleico" se refiere a un ácido nucleico o una parte del mismo que es capaz de emplearse como guía para la replicación catalizada por polimerasa. Una molécula de ácido nucleico puede incluir múltiples moldes a lo largo de su longitud o, alternativamente, se puede emplear sólo un único molde por molécula en una realización particular de la presente memoria. Un molde de ácido nucleico también puede funcionar como guía para la extensión del cebador catalizada por ligasa.

Como se emplea en la presente memoria, el término "nucleótido" o "análogo de nucleótido" pretende incluir nucleótidos naturales, nucleótidos no naturales, ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, didesoxirribonucleótidos y otras moléculas conocidas como nucleótidos. Por ejemplo, los términos se emplean en la presente memoria para referirse generalmente a un resto nucleósido (ya sea ribosa, desoxirribosa, o un análogo del mismo) que incluye un resto base y unido opcionalmente a uno o más restos fosfato. El término se puede emplear para referirse a una unidad monomérica que está presente en un polímero, por ejemplo, para identificar una subunidad presente en una cadena de ADN o ^a Rⁿ . El término también se puede emplear para referirse a una molécula monomérica que no está necesariamente presente en un polímero, por ejemplo, una molécula que es capaz de incorporarse en un polinucleótido de una manera dependiente del molde mediante una polimerasa.

Ejemplos de análogos de nucleótidos incluyen, pero no se limitan a, ribonucleótido monofosfato (a veces referido como ribonucleósido monofosfato), ribonucleótido difosfato (a veces referido como ribonucleósido difosfato), ribonucleótido trifosfato (a veces denominado ribonucleósido trifosfato), desoxinucleótido monofosfato(a veces referido como desoxinucleósido monofosfato), desoxinucleótido difosfato (a veces referido como desoxinucleósido difosfato) y desoxinucleótido trifosfato (a veces referido como desoxinucleósido trifosfato). Para mayor claridad cuando se desea distinguir componentes de ARN de componentes de ADN, el término "ribonucleótido" se puede emplear para especificar nucleótidos de ARN, tales como trifosfato de ribouridina, trifosfato de riboguanidina, trifosfato de ribocitidina o trifosfato de riboadenosina; y el término "desoxinucleótido" se puede emplear para especificar nucleótidos de ADN, tales como desoxitimidina trifosfato, desoxiguanidina trifosfato, desoxicitidina trifosfato y desoxiadenosina trifosfato. En realizaciones particulares, los nucleótidos son "extensibles", por ejemplo, carecen de un resto de bloqueo de la extensión en el hidroxilo 3' o en cualquier otra posición del nucleótido. En otras realizaciones, los nucleótidos están "bloqueados", y tienen un resto que evita que la posición 3' participe en la extensión mediante la adición de otro nucleótido u oligonucleótido.

Como se emplea en la presente memoria, el término "campo" se refiere a la distancia de centro a centro para dos sitios en una matriz. Un patrón de sitios puede ser regular tal que el coeficiente de variación alrededor del campo promedio sea pequeño o el patrón puede ser no regular, en cuyo caso el coeficiente de variación puede ser relativamente grande. En cualquier caso, el campo medio puede ser, por ejemplo, al menos 10 nm, 0,1 gm, 0,5 gm, 1 gm, 5 gm, 10 gm, 100 gm o más. Alternativa o adicionalmente, el campo medio puede ser, por ejemplo, como máximo 100 gm, 10 gm, 5 gm, 1 gm, 0,5 gm, 0,1 gm o menos. Por supuesto, el campo promedio para un patrón particular de sitios puede estar entre uno de los valores más bajos y uno de los valores más altos seleccionados de los intervalos anteriores.

Como se emplea en la presente memoria, el término "cebador" significa un ácido nucleico que tiene una secuencia que se une a un sitio de unión del cebador en o cerca de una secuencia molde. Generalmente, el cebador se une en una configuración que permite la replicación del molde, por ejemplo, mediante la extensión de polimerasa del cebador. El cebador puede ser una primera parte de una molécula de ácido nucleico que se une a una segunda parte de la molécula de ácido nucleico, siendo la primera parte una secuencia de cebador y la segunda parte una secuencia de unión del cebador (por ejemplo, un cebador en horquilla). Alternativamente, el cebador puede ser una primera molécula de ácido nucleico que se une a una segunda molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia molde. Un cebador puede consistir en ADN, ARN o análogos de los mismos.

Como se emplea en la presente memoria, el término "producto de extensión del cebador" significa un cebador que se ha modificado mediante la adición de al menos un análogo de nucleótido. Por ejemplo, un cebador se puede modificar mediante la adición de uno o más análogos de nucleótidos a su extremo 3' (por ejemplo, mediante catálisis de polimerasa), formando así un producto de extensión del cebador. Alternativamente, un producto de extensión del cebador se puede producir mediante ligación de un oligonucleótido al extremo 3' o 5' de un cebador. En este caso, el producto de extensión del cebador se extiende en una longitud equivalente a la longitud del oligonucleótido. Un producto de extensión del cebador puede ser al menos 1, 2, 5, 10, 500, 1000 o más nucleótidos más largo que el cebador. Alternativa o adicionalmente, un producto de extensión del cebador no puede tener más de 1,2, 5, 10, 500 0 1000 nucleótidos más largo que el cebador. Por ejemplo, el empleo de un análogo de nucleótido bloqueado proporciona un producto de extensión que es al menos 1 nucleótido más largo que el cebador y también no más de 1 nucleótido más largo que el cebador.

Como se emplea en la presente memoria, la referencia a la manipulación de forma "selectiva" (o manipulación "selectiva") de un primer aspecto en comparación con un segundo aspecto tiene la intención de significar que la manipulación tiene un mayor efecto sobre el primer aspecto en comparación con el efecto sobre el segundo aspecto. La manipulación no necesita tener ningún efecto sobre el segundo aspecto. La manipulación puede tener un efecto sobre el primer aspecto que es al menos 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95% o 99% mayor que el efecto sobre el segundo aspecto. La manipulación puede tener un efecto sobre el primer aspecto que es al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 100 veces, 1x103 veces, 1x104 veces o 1x106 veces más alto que el efecto sobre el segundo aspecto. La manipulación puede incluir, por ejemplo, modificar, poner en contacto, tratar, cambiar, escindir (por ejemplo, de un enlace químico), escindir de manera fotoquímica (por ejemplo, de un enlace químico), formar (por ejemplo, un enlace químico), formar de manera fotoquímica (por ejemplo, un enlace químico), modificar de manera covalente, modificar de manera no covalente, destruir, realizar foto-ablación, eliminar, sintetizar, polimerizar, realizar fotopolimerización, amplificar (por ejemplo, un ácido nucleico), copiar (por ejemplo, un ácido nucleico), extender (por ejemplo, un ácido nucleico), ligar (por ejemplo, un ácido nucleico), u otra manipulación establecida en la presente memoria o conocida de otro modo en la técnica.

Como se emplea en la presente memoria, el término "secuencia", cuando se emplea en referencia a un ácido nucleico, se refiere al orden de nucleótidos (o bases) en los ácidos nucleicos. En los casos en los que están presentes diferentes especies de nucleótidos en el ácido nucleico, la secuencia incluye una identificación de las especies de nucleótido (o base) en las posiciones respectivas del ácido nucleico. Una secuencia es una propiedad de la totalidad o parte de una molécula de ácido nucleico. El término se puede emplear de manera similar para describir el orden y la identidad posicional de las unidades monoméricas en otros polímeros, tales como las unidades monoméricas de aminoácidos de los polímeros proteicos.

Como se emplea en la presente memoria, el término "sitio" significa una ubicación en una matriz donde está presente al menos una molécula de analito. Un sitio puede contener una única molécula de analito o puede contener una población de varias moléculas de analito de la misma especie. En algunas realizaciones, un sitio puede incluir múltiples especies de moléculas de analito diferentes, estando cada especie presente en una o más copias. Los sitios de una matriz suelen ser discretos. Los sitios discretos pueden ser contiguos o pueden tener espacios entre sí.

Como se emplea en la presente memoria, el término "especie" o "tipo" se emplea para identificar moléculas que comparten la misma estructura química. Por ejemplo, una mezcla de análogos de nucleótidos puede incluir varias moléculas de dCTP. Se entenderá que las moléculas de dCTP son de la misma especie, o tipo, entre sí, pero de una especie o tipo diferente, en comparación con dATP, dGTP, dTTP, etc. De manera similar, las moléculas de ADN individuales que tienen la misma secuencia de nucleótidos son las misma especie, o tipo, mientras que las moléculas de ADN con secuencias diferentes son especies o tipos diferentes. Como otro ejemplo, una ADN polimerasa es una especie, o tipo, de polimerasa diferente en comparación con una ARN polimerasa (incluso si las dos polimerasas se derivan del mismo organismo).

Como se emplea en la presente memoria, el término "secuencia universal" se refiere a una secuencia que es común a dos o más moléculas de ácido nucleico, incluso cuando las moléculas tienen también otras regiones de secuencia que difieren entre sí. Una secuencia universal que está presente en diferentes miembros de una colección de moléculas puede permitir la captura de múltiples ácidos nucleicos diferentes empleando una población de ácidos nucleicos de captura universal que son complementarios a la secuencia universal. De manera similar, una secuencia universal presente en diferentes miembros de una colección de moléculas puede permitir la replicación o amplificación de múltiples ácidos nucleicos diferentes empleando una población de cebadores universales que son complementarios a la secuencia universal. Por tanto, un ácido nucleico de captura universal o un cebador universal incluye una secuencia que puede hibridar específicamente con una secuencia universal. Las moléculas de ácido nucleico diana se pueden modificar para unir adaptadores universales, por ejemplo, en uno o ambos extremos de las diferentes secuencias diana.

Las realizaciones expuestas a continuación y enumeradas en las reivindicaciones se pueden entender a la vista de las definiciones anteriores.

La presente divulgación proporciona un método para secuenciar moldes de ácido nucleico. El método puede incluir las etapas de (a) proporcionar una serie de sitios, en donde cada sitio comprende una mezcla de al menos dos moldes de ácido nucleico diferentes; (b) extender cebadores hibridados con diferentes moldes de ácido nucleico en cada uno de los sitios con diferentes análogos de nucleótidos que tienen diferentes restos de bloqueo reversibles, respectivamente, produciendo de ese modo diferentes productos de extensión de cebadores en cada sitio; (c) detectar los diferentes productos de extensión del cebador para distinguir los diferentes análogos de nucleótidos en cada sitio; (d) eliminar los diferentes restos de bloqueo reversibles de los productos de extensión del cebador en cada uno de los sitios empleando un primer tratamiento que es selectivo para el primero de los diferentes restos de bloqueo reversibles y un segundo tratamiento que es selectivo para el segundo de los diferentes restos de bloqueo reversibles.; y (e) repetir de la etapa (b) a la (d) para determinar la secuencia de diferentes análogos de nucleótidos añadidos a cada uno de los diferentes productos de extensión en cada uno de los sitios.

Como se establece anteriormente, un método de la presente divulgación puede incluir una etapa de proporcionar un primer y un segundo molde de ácido nucleico, en donde las secuencias para los dos moldes son diferentes. Las dos secuencias molde pueden ser partes de una única molécula de ácido nucleico o, alternativamente, las dos secuencias molde se pueden ubicar en moléculas separadas. Como se expone con más detalle en otra parte de la presente memoria, las dos secuencias molde pueden estar en una proximidad demasiado cercana para resolverse espacialmente con el sistema de detección empleado. Sin embargo, los métodos de detección ortogonales de la presente divulgación permiten distinguir estas secuencias molde. El esquema de detección ortogonal se ejemplifica para dos secuencias molde, pero se puede emplear con dos o más secuencias molde. Por consiguiente, un sistema o método establecido en la presente memoria puede incluir al menos 2, 3, 4, 5, 10 o más secuencias molde que están muy próximas, por ejemplo, en una única molécula de ácido nucleico, en un único sitio de una matriz, o por el contrario, en una proximidad demasiado cercana para resolverse espacialmente con el sistema de detección empleado.

Los ácidos nucleicos diana empleados en la presente memoria pueden estar compuestos de ADN, ARN o análogos de los mismos. La fuente de los ácidos nucleicos diana puede ser ADN genómico, ARN mensajer,o u otros ácidos nucleicos de fuentes nativas. En algunos casos, los ácidos nucleicos diana que se derivan de tales fuentes se pueden amplificar antes de su uso en un método o composición de la presente memoria.

Ejemplos de muestras biológicas de las que se pueden derivar ácidos nucleicos diana incluyen, por ejemplo, las de un mamífero, tal como un roedor, ratón, rata, conejo, cobaya, ungulado, caballo, oveja, cerdo, cabra, vaca, gato, perro, primate, primate, ser humano o primate no humano; una planta, tal como Arabidopsis thaliana, maíz, sorgo, avena, trigo, arroz, colza, o soja; un alga, tal como Chlamydomonas reinhardtii; un nematodo, tal como Caenorhabditis elegans; un insecto, tal como Drosophila melanogaster, mosquito, mosca de la fruta, abeja melífera o araña; un pez, tal como el pez cebra; un reptil; un anfibio, tal como una rana o Xenopus laevis; un dictyostelium discoideum; un hongo, tal como pneumocystis carinii, Takifugu rubripes, levadura, Saccharamoyces cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe; o un Plasmodium falciparum. Los ácidos nucleicos diana se pueden derivar también de un procariota, tal como una bacteria, Escherichia coli, estafilococos o mycoplasma pneumoniae; una arquea; un virus, tal como el virus de la hepatitis C o el virus de la inmunodeficiencia humana; o un viroide. Los ácidos nucleicos diana pueden derivar también de un cultivo o población homogénea de los organismos anteriores o, alternativamente, de una colección de varios organismos diferentes, por ejemplo, en una comunidad o ecosistema. Los ácidos nucleicos se pueden aislar empleando métodos conocidos en la técnica que incluyen, por ejemplo, los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (2001) o en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Hijos, Baltimore, Maryland (1998).

En realizaciones particulares, una muestra de ácido nucleico se puede modificar o preparar para su uso en uno o más de los métodos expuestos en la presente memoria. En algunos casos, se desea añadir uno o más sitios de unión del cebador a un ácido nucleico. Se pueden emplear técnicas de biología molecular conocidas para introducir sitios de unión del cebador descendente de las respectivas secuencias molde, por ejemplo, mediante la inserción de un adaptador que tiene el sitio de unión del cebador, mediante mutación para crear el sitio de unión del cebador, ligación de un adaptador que tiene el sitio de unión del cebador, etc. Los métodos útiles se describen en Sambrook et al., supra y Ausubel et al., supra. La publicación de solicitud de Patente US N° 2015/0031560 A1 proporciona una ilustración de una técnica basada en el marcaje para introducir sitios de unión de cebadores. El marcaje es particularmente útil para introducir uno o más sitios de unión de cebadores y se puede llevar a cabo, por ejemplo, empleando técnicas establecidas en las Patentes US . Nos 6.294.385 y 8.383.345, y en la Publicación PCT N° WO 2012/106546. Se entenderá que, en algunos casos, las regiones de secuencia de origen natural que residen en la cadena ascendente de las respectivas secuencias molde pueden explotarse como sitios de unión de cebadores en un método establecido en la presente memoria. Se pueden emplear métodos similares a los ejemplificados anteriormente para sitios de unión de cebadores para introducir otros elementos de secuencia deseados, tales como elementos promotores para secuencias de marcaje o extensión basadas en ARN polimerasa.

Los sitios de cebado universales son particularmente útiles para aplicaciones múltiples de los métodos establecidos en la presente memoria. Los sitios de cebado universales proporcionan una región de secuencia que es común a dos o más moléculas de ácido nucleico donde las moléculas tienen también regiones molde o diana con secuencias diferentes. Una secuencia de cebado universal presente en diferentes miembros de una colección de moléculas puede permitir la replicación, amplificación o detección de múltiples secuencias diferentes empleando una única especie de cebador universal que es complementaria a la secuencia de cebado universal. Por tanto, un cebador universal incluye una secuencia que puede hibridar específicamente con una secuencia de cebado universal. Se pueden encontrar ejemplos de métodos para unir secuencias universales a una colección de ácidos nucleicos diana en la publicación de solicitud de Patente US N° 2007/0128624 A1.

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos diana se pueden obtener como fragmentos de uno o más ácidos nucleicos más grandes. La fragmentación se puede llevar a cabo empleando cualquier técnica de una variedad de técnicas conocidas en la técnica que incluyen, por ejemplo, nebulización, sonicación, escisión química, escisión enzimática, o cizallamiento físico. La fragmentación también puede resultar del empleo de una técnica de amplificación particular que produce amplicones copiando sólo una parte de un ácido nucleico más grande. Por ejemplo, la amplificación por PCR produce fragmentos que tienen un tamaño definido por la longitud del fragmento entre los cebadores flanqueantes empleados para la amplificación.

Una población de ácidos nucleicos diana, o amplicones de los mismos, puede tener una longitud de cadena media que se desee o sea apropiada para una aplicación particular de los métodos o composiciones establecidos en la presente memoria. Por ejemplo, la longitud media de la cadena puede ser inferior a aproximadamente 100.000 nucleótidos, 50.000 nucleótidos, 10.000 nucleótidos, 5.000 nucleótidos, 1.000 nucleótidos, 500 nucleótidos, 100 nucleótidos, o 50 nucleótidos. Alternativa o adicionalmente, la longitud media de la cadena puede ser superior a aproximadamente 10 nucleótidos, 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 500 nucleótidos, 1.000 nucleótidos, 5.000 nucleótidos, 10.000 nucleótidos, 50.000 nucleótidos, o 100.000 nucleótidos. La longitud media de la cadena para una población de ácidos nucleicos diana, o amplicones de los mismos, puede estar en un intervalo entre un valor máximo y mínimo establecido anteriormente. Se entenderá que los amplicones generados en un sitio de amplificación (o producidos o empleados de otro modo en la presente memoria) pueden tener una longitud media de la cadena que esté en un intervalo entre un límite superior e inferior seleccionado de los ejemplificados anteriormente.

En algunos casos, se puede producir una población de ácidos nucleicos diana o configurar de otro modo para que tenga una longitud máxima para sus miembros. Por ejemplo, la longitud máxima de los miembros que se producen o emplean como se establece en la presente memoria puede ser menor de aproximadamente 100.000 nucleótidos, 50.000 nucleótidos, 10.000 nucleótidos, 5.000 nucleótidos, 1.000 nucleótidos, 500 nucleótidos, 100 nucleótidos o 50 nucleótidos. Alternativa o adicionalmente, una población de ácidos nucleicos diana, o amplicones de los mismos, se puede producir en condiciones o configurar de otro modo para que tenga una longitud mínima para sus miembros. Por ejemplo, la longitud mínima de los miembros que se emplean en una o más etapas de un método establecido en la presente memoria o que se presentan en una composición particular puede ser más de aproximadamente 10 nucleótidos, 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 500 nucleótidos, 1.000 nucleótidos, 5.000 nucleótidos, 10.000 nucleótidos, 50.000 nucleótidos, o 100.000 nucleótidos. La longitud de cadena máxima y mínima para los ácidos nucleicos diana en una población puede estar en un intervalo entre un valor máximo y mínimo establecido anteriormente. Se entenderá que los amplicones generados en un sitio de amplificación (o producidos o empleados de otro modo en la presente memoria) pueden tener longitudes de cadena máxima y/o mínima en un intervalo entre los límites superior e inferior ejemplificados anteriormente.

Se puede emplear cualquiera de una variedad de técnicas de amplificación conocidas para aumentar la cantidad de secuencias molde presentes para su uso en un método establecido en la presente memoria. Ejemplos de técnicas incluyen, pero no se limitan a, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación por círculo rodante (ACR), amplificación por desplazamiento múltiple (MDA), o amplificación por cebadores aleatorios (RPA) de moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias molde. Se entenderá que la amplificación de ácidos nucleicos diana antes de su uso en un método o composición establecidos en la presente memoria, es opcional. Como tal, los ácidos nucleicos diana no se amplificarán antes de su uso en algunas realizaciones de los métodos y composiciones establecidos en la presente memoria. Los ácidos nucleicos diana se pueden derivar opcionalmente de bibliotecas sintéticas. Los ácidos nucleicos sintéticos pueden tener composiciones de ADN o ARN nativas o pueden ser análogos de los mismos. Se pueden emplear también métodos de amplificación en fase sólida, que incluyen, por ejemplo, amplificación de grupos, amplificación en puente u otros métodos que se establecen a continuación en el contexto de métodos basados en matrices.

Un ácido nucleico empleado en un método establecido en la presente memoria puede estar en fase de disolución o en fase sólida. El ácido nucleico cuando está en fase de disolución es generalmente soluble, pero también puede estar en una forma suspendida que es capaz de precipitarse, como es el caso de algunas especies grandes de ácido nucleico, tales como los cromosomas o nanobolas de ácido nucleico (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de Patente US N° 2007/0099208 A1). Un ácido nucleico que está en fase sólida puede aparecer en o sobre un soporte de fase sólida. Ejemplos de soportes de fase sólida incluyen aquellos hechos de vidrio, nitrocelulosa, sílice, metal, plástico y otros materiales establecidos en otra parte de la presente memoria, por ejemplo, con respecto a formatos de matriz y células de flujo. De manera similar, un ácido nucleico puede aparecer en o sobre un soporte semisólido, tal como un gel. Ejemplos de geles que son útiles incluyen, pero no se limitan a, aquellos que tienen una estructura coloidal, tales como agarosa; estructura de malla polimérica, tal como la gelatina; o estructura de polímero reticulado, tal como la poliacrilamida. Los hidrogeles son particularmente útiles, tales como los establecidos en la publicación de Patente US N° 2011/0059865 A1 y la solicitud de Patente US N° 9.012.022.

La unión de un ácido nucleico a un soporte, ya sea rígido o semirrígido, puede ocurrir a través de una unión o uniones covalentes o no covalentes. Ejemplos de uniones se establecen en las Patentes US Nos 6.737.236; 7.259.258; 7.375.234 y 7.427.678; y la publicación de solicitud de Patente US N22011/0059865 A1. En algunas realizaciones, se puede unir un ácido nucleico u otro componente de reacción a un gel u otro soporte semisólido que a su vez se une o adhiere a un soporte en fase sólida. En tales realizaciones, se entenderá que el ácido nucleico u otro componente de reacción está en fase sólida.

Una reacción múltiple puede emplear un soporte en fase sólida (también conocido como un soporte sólido). Un soporte en fase sólida puede ser útil para separar reacciones individuales de modo que cada una se pueda investigar por separado o individualmente. Por ejemplo, varios ácidos nucleicos diferentes en una mezcla se pueden unir al soporte en fase sólida .Los ácidos nucleicos se pueden unir al soporte en fase sólida en un formato de matriz.

En algunas realizaciones, se proporciona una serie de sitios, en donde cada sitio incluye un primer molde de ácido nucleico y un segundo molde de ácido nucleico y en donde el primer molde de ácido nucleico tiene una secuencia que es diferente de la secuencia del segundo molde de ácido nucleico. Puede haber más de dos moldes diferentes por sitio en algunas realizaciones. Ejemplos de materiales de matriz y métodos de fabricación que se pueden modificar para su empleo en la presente memoria incluyen, sin limitación, una matriz BeadChip disponible de Illumina®, Inc. (San Diego, CA) o matrices como las que se describen en las Patentes U.S. Nos 6.266.459, 6.355.431,6.770.441,6.859.570 o 7.622.294; o en la publicación PCT N2 WO 00/63437. Otros ejemplos de matrices disponibles comercialmente que se pueden emplear incluyen, por ejemplo, una matriz Affymetrix® GeneChip® u otra matriz sintetizada de acuerdo con técnicas denominadas a veces como tecnologías VLSIPS™ (síntesis de polímeros inmovilizados a gran escala, de sus siglas en inglés). También se puede emplear una matriz de puntos de acuerdo con algunas realizaciones. Un ejemplo de matriz de puntos es una matriz CodeLink™ disponible de Amersham Biosciences. Otra matriz que es útil es una que se produce empleando métodos de impresión por inyección de tinta, tales como la tecnología SurePrint™ disponible en Agilent Technologies.

Otras matrices útiles que se pueden emplear, por ejemplo, modificando los sitios para incluir múltiples secuencias de ácido nucleico molde diferentes, incluyen aquellas que se emplean en aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos. Por ejemplo, las matrices que tienen amplicones de fragmentos genómicos (a menudo denominadas agrupaciones) son particularmente útiles, tales como las que se describen en Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008), publicación PCT Nos WO 04/018497, WO 91/06678, o WO 07/123744; las Patentes US Nos.7.057.026, 7.329.492, 7.211.414, 7.315.019, o 7.405.281; o la publicación de solicitud de Patente US N2 2008/0108082 A1.

Los grupos de ácidos nucleicos se pueden crear mediante métodos de amplificación en fase sólida. Por ejemplo, un ácido nucleico que tiene una o más secuencias molde a detectar se puede unir a una superficie y amplificarse empleando amplificación en puente. Métodos de amplificación en puente útiles se describen, por ejemplo, en las Patentes U.S.. Nos 5.641.658 o 7.115.400; o en la publicación de solicitud de Patente ^uS Nos 2002/0055100 A1,2004/0096853 A1,2004/0002090 A1,2007/0128624 A1 o 2008/0009420 A1.

Otro método útil para amplificar ácidos nucleicos en una superficie es la amplificación por círculo rodante (ACR), por ejemplo, como se describe en Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998) y en la publicación de solicitud de Patente US N22007/0099208 A1.

Otro tipo de matriz que es útil es una matriz de partículas producida a partir de una técnica de amplificación por PCR en emulsión. Se describen ejemplos en Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 100:8817-8822 (2003), la solicitud PCT Pub. N° w O 05/010145, o la publicación de solicitud de Patente US N° 2005/0130173 A1 o 2005/0064460 A1. Aunque las matrices anteriores se han descrito en el contexto de aplicaciones de secuenciación, se entenderá que las matrices se pueden emplear en otras realizaciones que incluyen, por ejemplo, aquellas que emplean una técnica de extensión de cebadores no cíclicos.

La detección se puede llevar a cabo a nivel de conjunto o de una sola molécula en una matriz. La detección a nivel de conjunto es la detección que se produce de manera que se detectan varias copias de una única secuencia molde (por ejemplo, varios amplicones de un molde) en cada sitio individual y las copias individuales en el sitio no se distinguen entre sí. Por lo tanto, la detección de conjuntos proporciona una señal media de muchas copias de una secuencia molde particular en el sitio. Por ejemplo, el sitio puede contener al menos 10, 100, 1000 o más copias de una secuencia molde particular. Por supuesto, un sitio puede contener múltiples secuencias molde diferentes, cada una de las cuales se presenta como un conjunto. Alternativamente, la detección a nivel de una sola molécula incluye la detección que ocurre de manera que las secuencias molde individuales se resuelven individualmente en la matriz, cada una en un sitio diferente. Por tanto, la detección de una sola molécula proporciona una señal de una molécula individual que se distingue de una o más señales que pueden surgir de una población de moléculas dentro de las cuales se presenta la molécula individual. Por supuesto, incluso en una matriz de una sola molécula, un sitio puede contener varias secuencias molde diferentes (por ejemplo, dos o más regiones de secuencia molde localizadas a lo largo de una única molécula de ácido nucleico).

Una matriz de sitios puede aparecer como una cuadrícula de puntos o parches. Los sitios se pueden localizar en un patrón repetitivo o en un patrón no repetitivo irregular. Patrones particularmente útiles son los patrones hexagonales, patrones rectilíneos, patrones de cuadrícula, patrones que tienen simetría reflectante, patrones que tienen simetría rotacional, o similares. Los patrones asimétricos también pueden ser útiles.

El tamaño de los sitios y/o el espacio entre los sitios en una matriz puede variar para conseguir una densidad alta, una densidad media o una densidad baja. Las matrices de alta densidad se caracterizan por tener sitios con un espacio de menos de aproximadamente 15 gm. Las matrices de densidad media tienen sitios con un espacio de aproximadamente 15 a 30 gm, mientras que las matrices de baja densidad tienen un espacio que es mayor de 30 gm. Una matriz útil en algunas realizaciones puede tener sitios con un espacio de menos de 100 gm, 50 gm, 10 gm, 5 gm, 1 gm, o 0,5 gm. Se puede emplear una realización de los métodos establecidos en la presente memoria para obtener imágenes de una matriz con una resolución suficiente como para distinguir sitios en las densidades o intervalos de densidad anteriores. Sin embargo, la etapa de detección empleará normalmente un detector que tiene una resolución espacial que es demasiado baja como para resolver puntos a una distancia equivalente al espacio entre un primer molde (o primer producto de extensión del cebador hibridado con el mismo) y un segundo molde (o segundo producto de extensión del cebador hibridado con el mismo) en un sitio individual. En realizaciones particulares, los sitios de una matriz pueden tener cada uno un área que es mayor de aproximadamente 100 nm2, 250 nm2, 500 nm2, 1 gm2, 2,5 gm2, 5 gm2, 10 gm2, 100 gm2, o 500 gm2. Alternativa o adicionalmente, los sitios de una matriz pueden tener cada uno un área que es menor de aproximadamente 1 mm2, 500 |um2, 100 |um2, 25 |um2, 10 |um2, 5 |um2, 1 gm2, 500 nm2, o 100 nm2. De hecho, un sitio puede tener un tamaño que está en un intervalo entre un límite superior e inferior seleccionado de los ejemplificados anteriormente.

Los métodos establecidos en la presente memoria pueden emplear matrices que tienen sitios en cualquiera de una variedad de densidades que incluyen, por ejemplo, al menos aproximadamente 10 sitios/cm2, 100 sitios/cm2, 500 sitios/cm2, 1.000 sitios/cm2, 5.000 sitios/cm2, 10.000 sitios/cm2, 50.000 sitios/cm2, 100.000 sitios/cm2, 1.000.000 sitios/cm2, 5.000.000 sitios/cm2, o más.

Generalmente, una matriz tendrá sitios con diferente contenido de secuencia de ácido nucleico. Por consiguiente, cada uno de los sitios en una matriz puede contener una secuencia de ácido nucleico que es única en comparación con las secuencias de ácido nucleico en los otros sitios de la matriz. Sin embargo, en algunos casos, una matriz puede tener redundancia, tal que dos o más sitios tienen el mismo contenido de ácido nucleico.

Se entenderá que las etapas de los métodos establecidos en la presente memoria se pueden llevar a cabo de manera que exponga un sitio completo o una pluralidad de sitios de una matriz con el tratamiento. Por ejemplo, una etapa que implica la extensión de un cebador se puede llevar a cabo mediante la administración de reactivos de extensión del cebador a una matriz, de manera que múltiples ácidos nucleicos (por ejemplo, diferentes ácidos nucleicos en una mezcla) en cada uno de uno o más sitios de la matriz se ponen en contacto con los reactivos de extensión del cebador. De manera similar, se puede llevar a cabo una etapa de desbloqueo de un producto de extensión del cebador bloqueado exponiendo una matriz con un tratamiento de desbloqueo, de manera que múltiples ácidos nucleicos (por ejemplo, diferentes ácidos nucleicos en una mezcla) en cada uno de uno o más sitios de la matriz se ponen en contacto con tratamiento.

En cualquier punto dado de una secuenciación por síntesis, u otra reacción de extensión del cebador, la especie de nucleótido que está presente en un primer molde en la posición que complementa el sitio de extensión del cebador puede ser la misma que la especie de nucleótido que está presente en un segundo molde en la posición que complementa el sitio de extensión del cebador. En otras palabras, el primer molde de ácido nucleico en un sitio particular de una matriz puede incluir al menos un resto de base que es de la misma especie que un resto de base en el segundo molde de ácido nucleico en ese sitio en particular, y se puede añadir un análogo de nucleótido complementario a cada uno de los cebadores en las posiciones de los moldes donde residen esos restos de base. Este puede ser el caso independientemente de que las secuencias molde con las que se hibridan los cebadores sean iguales o diferentes. Las técnicas que se establecen con más detalle a continuación se pueden emplear para distinguir los dos moldes, por ejemplo, el uso de diferentes conjuntos de análogos de nucleótidos que tienen marcadores mutuamente distinguibles.

Se puede emplear cualquiera de una variedad de polimerasas en un método o composición establecidos en la presente memoria que incluyen, por ejemplo, enzimas basadas en proteínas aisladas de sistemas biológicos y variantes funcionales de las mismas. Se entenderá que la referencia a una polimerasa particular, tal como las que se ejemplifican a continuación, incluye variantes funcionales de la misma a menos que se indique lo contrario. Una función particularmente útil de una polimerasa es catalizar la polimerización de una cadena de ácido nucleico empleando como molde un ácido nucleico existente. Otras funciones que son útiles se describen en otra parte de la presente memoria. Ejemplos de polimerasas útiles incluyen ADN polimerasas, transcriptasas inversas y ARN polimerasas.

Una polimerasa que tiene una actividad exonucleasa de corrección intrínseca de 3' a 5' puede ser útil para algunas realizaciones. Las polimerasas que carecen sustancialmente de actividad exonucleasa de corrección de 3 'a 5' también son útiles en algunas realizaciones, por ejemplo, en la mayoría de las realizaciones de secuenciación. La ausencia de actividad exonucleasa puede ser una característica de tipo salvaje o una característica impartida por una estructura de polimerasa variante o modificada genéticamente. Por ejemplo, el fragmento de Klenow exo menos es una versión mutada del fragmento de Klenow que carece de actividad exonucleasa de corrección de 3 'a 5'.

Dependiendo de la realización que se vaya a emplear, una polimerasa puede ser tanto termófila como inactivable por calor. Las polimerasas termofílicas normalmente son útiles para condiciones a altas temperaturas o en condiciones de termociclado, tales como las empleadas para técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Ejemplos de polimerasas termófilas incluyen, pero no se limitan a, ADN polimerasa 9°N ADN polimerasa, Taq ADN polimerasa, ADN polimerasa Phusion®, ADN polimerasas Pfu, ADN polimerasa RB69, ADN polimerasa KOD, y ADN polimerasa VentR®. La mayoría de las polimerasas aisladas de organismos no termófilos son inactivables por calor. Algunos ejemplos son las ADN polimerasas de fagos. Se entenderá que las polimerasas de cualquiera de una variedad de fuentes se pueden modificar para aumentar o disminuir su tolerancia a condiciones de alta temperatura. Las polimerasas particularmente útiles para incorporar análogos de nucleótidos que tienen marcadores y/o restos terminales reversibles se describen en la Patente US 2006/0281109 A1.

En realizaciones particulares de los métodos y composiciones establecidos en la presente memoria, sólo se empleará una única especie de polimerasa. En tales ejemplos, cada sitio de una matriz interactuará con una única especie de polimerasa en un momento dado, aunque en el sitio pueden presentarse múltiples polimerasas y unirse a múltiples moldes de cebadores en cada sitio. Por ejemplo, todos los sitios de una matriz pueden interaccionar con una especie particular de ADN polimerasa y otras polimerasas (tales como ARN polimerasas) estarán ausentes de la matriz.

Otra técnica de extensión que se puede modificar para su uso en un método o composición establecidos en la presente memoria es un sistema basado en ligasa que es selectivo para la incorporación de oligonucleótidos en lugar de nucleótidos monoméricos que se incorporan mediante los sistemas de extensión basados en polimerasa descritos anteriormente. Un sistema reactivo de ADN ligasa que emplea un primer conjunto de oligonucleótidos que tienen un resto de bloqueo reversible que se desbloquea selectivamente mediante un primer tratamiento de desbloqueo es ortogonal con un sistema de reactivos que emplea un segundo conjunto de oligonucleótidos que tienen un resto de bloqueo reversible que se desbloquea selectivamente mediante un segundo tratamiento de desbloqueo. El desbloqueo de cebadores extendidos con oligonucleótidos bloqueados reversiblemente se puede llevar a cabo de una manera ortogonal muy similar a la ejemplificada en la presente memoria para el desbloqueo de cebadores extendidos con análogos de nucleótidos bloqueados reversiblemente. La extensión por ligación se puede llevar a cabo en una aplicación de secuenciación empleando una población de oligonucleótidos de sonda parcialmente aleatorios que tienen un esquema de codificación de una o dos bases. Las técnicas de extensión basadas en ligación que se pueden modificar para su uso en la presente memoria, tal como en un contexto de secuenciación, se establecen en McKernan et al., Genome Research 19 (9):1527-41 (2009); Shendure et al., Science 309:1728-1732 (2005); o las Patentes US Nos 5.599.675 o 5.750.341.

Una reacción de extensión de ácido nucleico, u otra reacción cíclica, que se lleva a cabo empleando los métodos establecidos en la presente memoria se puede desarrollar durante uno o más ciclos. En realizaciones particulares, una reacción multicíclica puede incluir al menos 2 ciclos, 5 ciclos, 10 ciclos, 50 ciclos, 100 ciclos, 500 ciclos, 1.000 ciclos, 5.000 ciclos, 10.000 ciclos o más.

Alternativa o adicionalmente, una reacción puede tener un límite superior en el que no se produzcan más de 1 ciclo, 2 ciclos, 5 ciclos, 10 ciclos, 50 ciclos, 100 ciclos, 500 ciclos, 1.000 ciclos, 5.000 ciclos, o 10.000 ciclos. En algunas realizaciones, cada ciclo dará como resultado la incorporación de un único análogo de nucleótido en un cebador extendido. En este caso, se puede entender que el número mínimo o máximo de ciclos ejemplificados anteriormente ejemplifica el número mínimo o máximo de nucleótidos incorporados en un producto de extensión en una reacción catalizada por polimerasa.

Algunas realizaciones pueden emplear reacciones de extensión no cíclicas, tales como reacciones de extensión de base única (SBE) o extensión de cebador específico de alelo (ASPE). Se pueden emplear restos de terminación reversibles para conseguir la extensión ortogonal de dos cebadores diferentes en un formato de extensión no cíclico. Dado que no es necesaria una etapa de desbloqueo para la continuación de estas reacciones no cíclicas (es decir, una vez que se han extendido los cebadores), los análogos de nucleótidos empleados en la etapa de extensión pueden, en cambio, terminar de forma no reversible. Por ejemplo, se pueden emplear didesoxinucleótidos. Ejemplos de reactivos y técnicas relacionadas para SBE, ASPE y otras técnicas de extensión no cíclicas útiles se describen, por ejemplo, en la Patente US N° 7.670.810 o en la publicación de Solicitud de Patente US. Nos 2003/0108867; 2003/0108900; 2003/0170684; 2003/0207295; o 2005/0181394.

Un ejemplo de un producto disponible comercialmente que emplea una técnica de extensión no cíclica y que se puede modificar para aumentar el contenido de información a través de los métodos de detección ortogonal establecidos en la presente memoria es el producto de genotipado Infinium® disponible en Illumina, Inc. (San Diego, CA).

Las reacciones cíclicas y no cíclicas pueden incluir etapas donde los componentes de la reacción se separan entre sí o se eliminan del medio de reacción. Se pueden separar uno o más componentes de reacción, por ejemplo, mediante la separación de componentes en fase sólida de los componentes en fase líquida. Se pueden incluir opcionalmente etapas de lavado con el fin de eliminar más completamente el componente o componentes en fase líquida no deseados del componente o componentes en fase sólida. Un recipiente de reacción particularmente útil para tales separaciones es una celda de flujo, tales como las que se emplean normalmente en los procedimientos de secuenciación cíclica. Ejemplos de celdas de flujo, métodos para su producción y métodos para su uso se describen en la publicación de solicitud de Patente US Nos.2010/0111768 A1 o 2012/0270305 A1; o en la publicación de solicitud PCT N° WO 05/065814. Ya sea que se empleen o no métodos de separación en fase sólida, los componentes de reacción se pueden eliminar mediante cualquiera de una variedad de otras técnicas conocidas en la técnica, que incluyen, extracción líquido-líquido, extracción en fase sólida, cromatografía, filtración, centrifugación, o similares.

Los restos de terminación reversibles proporcionan una manera conveniente de controlar una reacción de extensión para añadir sólo un nucleótido a un cebador hasta que se lleve a cabo una etapa de desbloqueo posterior. Como se establece en la presente memoria, el empleo de restos de bloqueo ortogonales y de tratamientos de desbloqueo proporcionan una detección de super-resolución, por lo que se puede controlar y detectar una mayor complejidad de moldes de lo que se permitiría de otro modo empleando una técnica no ortogonal. Ejemplos de restos de bloqueo reversibles y sus condiciones de desbloqueo incluyen, pero no se limitan a, restos que se pueden eliminar de forma fotoescindible desde la posición 3', tales como o-nitrobenciléteres y alquil o-nitrobencil carbonato; restos de éster que se pueden eliminar mediante hidrólisis básica; restos alilo que se pueden eliminar con Nal, clorotrimetilsilano y Na2S2Oa o con Hg(ll) en acetona/agua; -azidometilo (-CH2-N3) que se puede escindir con fosfinas, tales como tris (2-carboxietil)fosfina (TCEP) o tri(hidroxipropil)fosfina (THP); acetales, tales como terc-butoxi-etoxilo que se pueden escindir en condiciones ácidas; restos MOM (Metoximetilo) (-CH2OCH3) que se pueden escindir con LiBF4 y CH3CN/H2O; 2,4-dinitrobencenosulfenilo que se puede escindir con nucleófilos, tales como tiofenol y tiosulfato; éter de tetrahidrofuranilo que se puede escindir con Ag(I) o Hg(II); y fosfato 3' que se puede escindir mediante enzimas fosfatasa (por ejemplo, polinucleótido quinasa). Otros restos reversibles útiles incluyen éteres, -F, -NH2, -OCH3, -N3, -NHCOCH3, y carbonato de 2-nitrobenceno. Los tratamientos de desbloqueo útiles incluyen irradiación con luz (por ejemplo, para inducir la fotoescisión), calentamiento, exposición a reactivos químicos, exposición a catalizadores, exposición a corriente eléctrica (por ejemplo, para inducir electrólisis), o similares.

Realizaciones particulares de los métodos de la presente memoria pueden emplear cebadores bloqueados reversiblemente y análogos de nucleótidos bloqueados reversiblemente, por ejemplo, en un proceso multicíclico, tal como secuenciación por síntesis. Como se ejemplificó anteriormente en la presente memoria, un cebador bloqueado reversiblemente particular y un conjunto particular de análogos de nucleótidos bloqueados reversiblemente pueden ser susceptibles a las mismas condiciones de desbloqueo. Esto puede deberse a que la misma especie del resto de bloqueo reversible está presente en el cebador y en los análogos de nucleótidos del conjunto. Sin embargo, también es posible emplear diferentes restos de bloqueo que, no obstante, son susceptibles al mismo tratamiento de desbloqueo. Un resto de bloqueo reversible se puede unir al nucleótido 3' de un cebador. Generalmente, el resto de bloqueo reversible se une en la posición 3' del resto de azúcar ribosa. Sin embargo, en su lugar, se puede unir un resto de bloqueo a posiciones alternativas, que incluyen, por ejemplo, la posición 2' de la ribosa o el resto de la base. También se puede unir un resto de bloqueo en el extremo 5' de un cebador, por ejemplo, en la posición 5' de la ribosa del nucleótido terminal o en el resto del fosfato 5'. Los cebadores que están bloqueados en el extremo 5' pueden ser útiles para realizaciones que emplean técnicas de ligación.

El extremo 3' o 5' de un cebador se puede unir a un resto de marcado, tal como un marcador óptico. El marcador puede estar presente tanto si un resto de bloqueo reversible en el cebador está presente o no. En algunos casos, un resto particular puede funcionar tanto como marcador, como bloque reversible para la extensión del cebador.

Los mismos puntos de unión para un marcador y/o resto de bloqueo reversible que se ejemplificaron anteriormente para los cebadores, pueden ser útiles para nucleótidos individuales.

Otras guías ejemplares con respecto a restos de bloqueo y tratamientos de desbloqueo se describen, por ejemplo, en Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008), publicación de solicitud PCT Nos WO 04/018497, WO 91/06678 o WO 07/123744; Patentes US Nos 7.057.026, 7.329.492. 7.211.414, 7.315.019, 8.088.575 o 7.405.281; o la publicación de solicitud de Patente US N° 2008/0108082 A1.

La manipulación ortogonal y la detección de acuerdo con la presente divulgación no requiere que dos secuencias molde difieran en cada posición a lo largo de su longitud. Más bien, el mismo resto de base puede estar presente en posiciones que se detectan en un primer molde y en un segundo molde, respectivamente. Las dos posiciones se pueden distinguir basándose en las características distinguibles de los marcadores presentes en los sistemas de reactivos ortogonales y la especificidad de los sistemas de reactivos para extender el cebador desbloqueado apropiadamente. Esta información, se puede emplear a su vez para detectar de manera distinguible las dos secuencias molde diferentes, incluso si las dos posiciones se detectan simultáneamente empleando un detector que tiene una resolución que es demasiado baja para resolver puntos a una distancia equivalente al espaciado de las dos secuencias molde.

Se puede emplear cualquiera de una variedad de marcadores. Un resto marcador que es particularmente útil cuando se emplea para la detección de un análogo de nucleótido, puede ser cualquier parte del análogo de nucleótido que proporcione una característica distinguible en comparación con otras moléculas presentes en su entorno. La característica distinguible puede ser, por ejemplo, una señal óptica, tal como la absorbancia de radiación, la emisión de fluorescencia, la emisión de luminiscencia, la duración de la fluorescencia, la polarización de la fluorescencia, o similares; afinidad de unión por un ligando o receptor; propiedades magnéticas; propiedades eléctricas; carga; masa; radiactividad, o similares. Ejemplos de restos de marcadores ejemplares incluyen, sin limitación, un fluoróforo, luminóforo, cromóforo, isótopo radiactivo, marcador de masa, marcador de carga, marcador de rotación, receptor, ligando, o similares. El resto marcador puede ser parte de un nucleótido que es una unidad monomérica presente en un polímero de ácido nucleico o el resto marcador puede ser parte de un análogo de nucleótido libre (por ejemplo, un nucleótido trifosfato).

Los fluoróforos son particularmente útiles e incluyen, por ejemplo, nanocristales fluorescentes; puntos cuánticos, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metilcumarinas, pireno, verde malaquita, Cy3, Cy5, estilbeno, amarillo Lucifer, azul cascada, rojo Texas, tintes Alexa, tintes SETA, tintes Atto, ficoeritina, bodipy, y análogos de los mismos. Las sondas ópticas útiles se describen en Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3a Ed. Springer (2006)); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Products 9a edición, Molecular Probes, Inc, (2002); Shapiro, Practical Flow Citometry, 4a ed., John Wiley e Hijos (2003); publicación de solicitud de Patente PCT Nos WO 98/59066 o WO 91/06678; o publicación de solicitud de Patente US N° 2010/0092957 A1.

Se pueden emplear otros marcadores, algunos de los cuales son marcadores no ópticos, en diversas realizaciones de los métodos y composiciones establecidos en la presente memoria. Ejemplos incluyen, sin limitación, un marcador isotópico, tal como un isótopo pesado o radiactivo no abundante de forma natural; sustancia magnética; material rico en electrones, tal como un metal; marcador electroquimioluminiscente, tal como Ru(bpy)32+; o un resto que se puede detectar en base a una característica nuclear magnética, paramagnética, eléctrica, de carga para la masa, o térmica. Los marcadores también pueden incluir partículas magnéticas o nanopartículas codificadas ópticamente. Dichos marcadores se pueden detectar empleando métodos apropiados conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un marcador cargado se puede detectar empleando un detector eléctrico, tales como los que se emplean en los sistemas de secuenciación disponibles comercialmente de Ion Torrent (Guilford, CT, una subsidiaria de Life Technologies) o los sistemas de detección descritos en la publicación de solicitud de Patente US Nos 2009/0026082 A1; 2009/0127589 A1; 2010/0137143 A1; o 2010/0282617 A1. Se entenderá que para algunas realizaciones, un análogo de nucleótido puede estar desprovisto de uno o más de los marcadores expuestos en la presente memoria.

Se puede unir un resto de marcador a un análogo de nucleótido de diversas formas. Ejemplos de uniones y composiciones marcadoras que son útiles para análogos de nucleótidos se exponen en Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008), publicación de solicitud PCT Nos WO 04/018497, WO 91/06678 o WO 07/123744; Patentes US Nos 7.057.026, 7.329.492, 7.211.414, 7.315.019, 8.088.575 o 7.405.281; o en la publicación de solicitud de Patente US N22008/0108082 A1.

Una etapa de detección de un método establecido en la presente memoria, se puede llevar a cabo en un método de la presente divulgación empleando un aparato adecuado para el marcador particular en uso. Por ejemplo, se puede utilizar un detector óptico, tal como un detector de fluorescencia, un detector de absorbancia, un detector de luminiscencia, o similares, para detectar marcadores ópticos apropiados. Los sistemas diseñados para la detección basada en matrices son particularmente útiles. Por ejemplo, los sistemas ópticos para emplear con los métodos establecidos en la presente memoria se pueden construir para incluir varios componentes y ensamblajes como se describe en las Patentes US Nos 8.241.573; 7.329.860 o 8.039.817; o en la publicación de solicitud de Patente US Nos 2009/0272914 A1 o 2012/0270305 A1.

Un sistema de detección ortogonal, tal como un sistema empleado para secuenciación por síntesis, puede emplear diferentes marcadores para distinguir diferentes nucleótidos que se añaden a cada cebador. En una realización, cada especie de nucleótido tendrá un marcador óptico único que produce una señal única para distinguir esa especie de nucleótido. Un ejemplo es un enfoque de 8 tintes. En este ejemplo, un primer conjunto de 4 análogos de nucleótidos diferentes tiene cada uno un tinte fluorescente diferente que distingue a cada uno de los 4 análogos de nucleótidos diferentes entre sí, en donde los 4 nucleótidos diferentes del primer conjunto tienen restos de bloqueo que se pueden desbloquear selectivamente mediante un primer tratamiento. Un segundo conjunto de 4 análogos de nucleótidos diferentes tiene cada uno un tinte fluorescente diferente que distingue cada uno de los 4 análogos de nucleótidos diferentes entre sí, en donde los 4 nucleótidos diferentes en el segundo conjunto tienen restos de bloqueo que pueden desbloquearse selectivamente mediante un segundo tratamiento. En este caso, el primer tratamiento es selectivo para los restos de bloqueo en el primer conjunto de nucleótidos, y el segundo tratamiento es selectivo para los restos de bloqueo en el segundo conjunto de nucleótidos. Los dos conjuntos de tintes son únicos de modo que los 8 tintes producen 8 señales distinguibles, respectivamente.

En realizaciones en las que todos los análogos de nucleótidos están marcados de forma distinguible, tal como el enfoque de 8 tintes descrito anteriormente, se puede poner en contacto un par de secuencias molde con todos los análogos de nucleótidos y después se puede realizar la detección posteriormente. En este caso, la capacidad de distinguir todos los análogos de nucleótidos debido a marcadores ópticos únicos proporciona el beneficio de manipulaciones fluídicas relativamente simples, por lo que todos los análogos de nucleótidos se pueden administrar a las secuencias molde de manera que estén presentes simultáneamente. En una realización preferida y relativamente sencilla, los 8 análogos de nucleótidos se administran simultáneamente; sin embargo, se pueden administrar uno o más subconjuntos secuencialmente si se desea. La detección puede ocurrir durante o después de la administración de análogos de nucleótidos. Este proceso fluídico relativamente simple se acomoda mediante un dispositivo de detección relativamente complejo que tiene la capacidad de distinguir todas las diferentes señales. Por ejemplo, un sistema de detección de fluorescencia capaz de distinguir 8 señales fluorescentes diferentes se puede emplear para el enfoque de 8 tintes. Los expertos en la técnica sabrán o serán capaces de determinar un aparato de detección de fluorescencia apropiado para conseguir este tipo de diferenciación de señales. Por ejemplo, las propiedades de excitación y emisión de los marcadores fluorescentes se pueden combinar adecuadamente con una combinación de longitudes de onda de excitación producidas y longitudes de onda de emisión detectadas por un fluorómetro. Se proporcionan ejemplos de guías para marcadores ópticos y marcadores útiles para la detección de fluorescencia de longitud de onda múltiple en Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3a Ed. Springer (2006)); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Products 9a edición, Molecular Probes, Inc, (2002); y Shapiro, Practical Flow Cytometry, 4a ed., John Wiley e Hijos (2003).

Los principios ejemplificados anteriormente para un sistema en el que todos los nucleótidos están marcados de manera distinguible, se pueden extender fácilmente a un formato de matriz. Se esperará que una matriz que tenga un número suficiente y una variedad de secuencias molde diferentes incorpore todos los nucleótidos marcados cuando se trate con sistemas de reacción de extensión de cebadores. Más específicamente, en un enfoque basado en matriz, que tiene una amplia variedad de ácidos nucleicos en los sitios de la matriz y tiene dos moldes diferentes por sitio, se esperará que todas las posibles combinaciones de tinción de 2 tintes aparezcan en la matriz después de un ciclo de extensión del cebador en el que se administraron los 8 nucleótidos a la matriz. Los sitios se pueden distinguir espacialmente empleando dispositivos ópticos conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en las Patentes US Nos 8.241.573; 7.329.860 o 8.039.817; o en las Solicitudes de Patente US Nos 2009/0272914 A1 o 2012/0270305 A1.

Dichos sistemas de detección se pueden modificar fácilmente para adaptarse a la detección fluorescente de 8 tintes como se establece anteriormente. Un sistema de detección que se modifique de esta manera será capaz de realizar una detección ortogonal múltiple de modo que se distingan dos moldes diferentes (por ejemplo, mediante secuenciación) en múltiples sitios, cada uno de los cuales tiene una composición de secuencia diferente.

En algunas realizaciones, el número de señales diferentes que se distinguen en un método particular es menor que el número de especies análogas de nucleótidos diferentes empleadas en ese método. Por ejemplo, múltiples especies de análogos de nucleótidos diferentes pueden tener el mismo marcador y/o un subconjunto de especies de nucleótidos puede no estar marcado. Un ejemplo de una configuración que emplea el mismo marcador para múltiples especies de nucleótidos diferentes es el caso de un método de extensión del cebador ortogonal donde un primer conjunto de 4 análogos de nucleótidos diferentes comparten un primer marcador en común y son susceptibles a un primer tratamiento de desbloqueo selectivo, mientras que un segundo conjunto de 4 análogos de nucleótidos diferentes comparten un segundo marcador en común y son susceptibles de un segundo tratamiento de desbloqueo. En este ejemplo, el primer marcador se distingue ópticamente del segundo marcador, el primer tratamiento es selectivo para el primer conjunto de análogos de nucleótidos y el segundo tratamiento es selectivo para el segundo conjunto de análogos de nucleótidos. En esta configuración, los 4 nucleótidos diferentes del primer conjunto se pueden distinguir entre sí mediante ciclos secuenciales de administración y detección (es decir, un ciclo separado para cada uno de los diferentes análogos de nucleótidos). Siempre que el primer marcador y el segundo marcador en este ejemplo sean distinguibles, los miembros de los dos conjuntos de nucleótidos se pueden administrar en pares (uno de cada una de una especie de nucleótidos del primer conjunto y uno de la especie de nucleótidos del segundo conjunto), en 4 ciclos de administración y detección. Por lo tanto, los miembros de un primer conjunto de análogos de nucleótidos empleados en una reacción de extensión de cebadores pueden incluir sólo un tipo de marcador óptico que se detecta y un segundo conjunto de análogos de nucleótidos, que es ortogonal al primer conjunto, también puede incluir sólo un tipo de marcador óptico que se detecta, en donde el marcador empleado en el primer conjunto es ópticamente distinguible del marcador empleado en el segundo conjunto.

La escala de grises permite el empleo de múltiples especies de análogos de nucleótidos diferentes que tienen el mismo marcador.En este caso, se pueden distinguir diferentes especies de análogos de nucleótidos en base a la intensidad de la señal del marcador detectada. Por ejemplo, cada especie de análogo de nucleótido se puede administrar como una mezcla de proporción única de esa especie en forma marcada y no marcada. La variación en la proporción del análogo de nucleótido marcado: no marcado para cada especie dará como resultado una salida de señal en la escala de grises única para cada mezcla. A modo de ejemplo más específico, un primer análogo de nucleótido se puede marcar completamente (sin mezclar el primer análogo de nucleótido marcado y no marcado), un segundo análogo de nucleótido se puede marcar al 75% (una mezcla de un segundo análogo de nucleótido marcado al 75% y no marcado al 25%), un tercer análogo de nucleótido se puede marcar al 50% (una mezcla de un tercer análogo de nucleótido marcado al 50% y al 50% sin marcar), y un cuarto análogo de nucleótido se puede marcar al 25% (una mezcla del cuarto nucleótido marcado al 25% y al 75% sin marcar). Estas 4 especies de análogos de nucleótidos se pueden distinguir en base a las diferencias resultantes en la intensidad de la señal, por lo que una población de cebadores desbloqueados de manera apropiada (por ejemplo, en un sitio de la matriz) producirá una señal completa debido a la incorporación del primer análogo de nucleótidos; 75% de la señal debido a la incorporación del segundo análogo de nucleótido, 50% de la señal debido a la incorporación del tercer análogo de nucleótido y 25% de la señal debido a la incorporación del cuarto análogo de nucleótido.

En realizaciones particulares, al menos una de las especies de análogos de nucleótidos puede estar completamente sin marcar. Por tanto, en un caso en el que estén presentes marcadores ópticos en los otros análogos de nucleótidos en un conjunto de análogos de nucleótidos, también puede haber un análogo de nucleótidos "oscuro". La extensión de un cebador para incorporar un análogo de nucleótido oscuro, o, de otra manera, sin marcar, se puede determinar por inferencia en base a la ausencia de un marcador que se esperaría si los otros análogos de nucleótidos del conjunto se hubieran incorporado mediante la reacción de extensión. Por tanto, en algunas realizaciones sólo un subconjunto de los análogos de nucleótidos empleados en una reacción de extensión de cebadores establecida en la presente memoria necesita tener un marcador.

El uso de especies de análogos de nucleótidos sin marcar completamente se puede combinar con la escala de grises. Por ejemplo, tres de las cuatro especies de análogos de nucleótidos diferentes en un conjunto (es decir, un conjunto que se puede desbloquear mediante un tratamiento común) pueden tener cantidades distintas de cero de un marcador en particular (por ejemplo, proporciones de análogos de nucleótidos marcados y no marcados en una mezcla) y la cuarta especie de análogos de nucleótidos puede carecer de ese marcador. Alternativa o adicionalmente, la escala de grises se puede combinar con el empleo de varios marcadores distinguibles ópticamente. Por ejemplo, algunas especies de análogos de nucleótidos se pueden representar en una reacción de extensión como una mezcla de nucleótidos del mismo tipo pero que tienen diferentes marcadores. Tal configuración se ejemplifica en la publicación de solicitud de Patente US N° 2013/0079232 A1 o 2015/0031560 A1.

Alternativa o adicionalmente al empleo de múltiples marcadores diferentes, escala de grises y/o especies no marcadas, una realización establecida en la presente memoria puede usar un análogo de nucleótido que tenga un ligando, un enlazador escindible u otro resto que proporcione la ganancia o pérdida de un marcador debido a un tratamiento definido. Los sistemas de reactivos de este tipo se ilustran en la publicación de solicitud de Patente US Nos 2013/0079232 A1 o 2015/0031560 A1 donde algunas especies de análogos de nucleótidos tienen un ligando, tal que se pueden distinguir de otros análogos de nucleótidos en base a la ausencia inicial de una señal detectable seguida de la aparición de una señal después del tratamiento con un receptor marcado de manera adecuada. Estas referencias también ilustran el empleo de un análogo de nucleótido que se puede distinguir en base a una señal detectable inicial que posteriormente se pierde, o al menos se reduce, debido al tratamiento con un reactivo que modifica el marcador (por ejemplo, mediante la escisión química de un enlazador entre el marcador y los restos de nucleótidos). En este caso, las otras especies de análogos de nucleótidos del conjunto no son susceptibles a la modificación (por ejemplo, carecen del enlazador escindible) y se distinguen en base a la persistencia de la generación de señales después del tratamiento.

Como se ejemplificó anteriormente, en algunas realizaciones, se puede unir un marcador a un análogo de nucleótido a través de un enlazador escindible. En realizaciones particulares, se pueden emplear enlazadores fotoescindibles en lugar del enlazador escindible químicamente ejemplificado anteriormente. En algunas realizaciones, el enlazador se selecciona de enlazadores lábiles ácidos (que incluyen enlazadores de dialcoxibencilo, enlazadores de Sieber, enlazadores de indol, enlazadores de Sieber t-butilo), enlazadores escindibles electrofílicamente, enlazadores escindibles nucleofílicamente, enlazadores fotoescindibles, enlazadores que se escinden bajo condiciones reductoras o bajo condiciones oxidativas, enlazadores de captura de seguridad, y enlazadores que se escinden mediante mecanismos de eliminación. En algunas de tales realizaciones, el enlazador se selecciona de un enlazador disulfuro (-S-S-), éster, nitrobenceno, imina, péptido y polinucleótido escindible enzimática o químicamente, tal como ADN.

En algunas realizaciones, los miembros de un primer conjunto de análogos de nucleótidos (por ejemplo, análogos de nucleótidos que se desbloquean selectivamente mediante un primer tratamiento común) empleados en una reacción de extensión del cebador incluirán sólo un tipo de marcador óptico que se detecta y un segundo conjunto de análogos de nucleótidos (por ejemplo, análogos de nucleótidos que se desbloquean selectivamente mediante un segundo tratamiento común), que es ortogonal al primer conjunto, también incluirá sólo un tipo de marcador óptico que se detecta, en donde el marcador empleado en el primer conjunto se puede distinguir ópticamente del marcador empleado en el segundo conjunto. En esta realización, el tipo de marcador óptico se puede unir a sustancialmente todos los análogos de nucleótidos de una primera especie en el primer conjunto, el tipo de marcador óptico se puede unir a un subconjunto de los análogos de nucleótidos de una segunda especie en el primer conjunto, sustancialmente todos los análogos de nucleótidos de una tercera especie en el primer conjunto se pueden unir a un ligando, y sustancialmente todos los análogos de nucleótidos de una cuarta especie en el primer conjunto no se unen a un tipo de marcador óptico o al ligando.

En otra realización, los miembros de un primer conjunto de análogos de nucleótidos (por ejemplo, análogos de nucleótidos que se desbloquean selectivamente mediante un primer tratamiento común) empleados en una reacción de extensión del cebador incluirán sólo dos tipos de marcadores ópticos que se detectan y un segundo conjunto de análogos de nucleótidos (por ejemplo, los análogos de nucleótidos que se desbloquean selectivamente mediante un segundo tratamiento común), que es ortogonal al primer conjunto, también incluirán sólo dos tipos de marcadores ópticos que se detecten. En esta realización, se puede unir un primero de los dos tipos de marcadores ópticos a sustancialmente todos los análogos de nucleótidos de una primera especie en el primer conjunto, un segundo de los dos tipos de marcadores ópticos se puede unir a sustancialmente todos los análogos de nucleótidos de una segunda especie en el primer conjunto, el primero de los dos tipos de marcadores ópticos y el segundo de los dos tipos de marcadores ópticos se pueden unir a los análogos de nucleótidos de una tercera especie en el primer conjunto, y sustancialmente todos los análogos de nucleótidos de una cuarta especie del primer conjunto no se unen a uno de los dos tipos de marcadores ópticos o al segundo de los dos tipos de marcadores ópticos.

Se entenderá a partir de los ejemplos anteriores que reducir el número de marcadores diferentes en un sistema de detección ortogonal puede proporcionar la ventaja de reducir la complejidad del dispositivo de detección necesario para distinguir la adición de diferentes nucleótidos a un cebador unido a un molde. Sin embargo, en muchas realizaciones esto se consigue aumentando la complejidad de las etapas fluídicas, de manera que el número de manipulaciones fluídicas empleado durante las etapas de detección aumenta en comparación con las etapas fluídicas empleadas cuando cada una de las especies de nucleótidos tiene un marcador único. Una ventaja general de los presentes métodos es que un experto en la técnica puede seleccionar una combinación apropiada de marcadores, etapas fluídicas y dispositivos de detección para adaptarse a una aplicación o circunstancia particular.

Como se ejemplifica por las realizaciones establecidas anteriormente, en algunos casos dos o más cebadores que se hibridan con dos o más moldes de ácido nucleico diferentes, respectivamente, en un sitio se pueden presentar simultáneamente durante una etapa de extensión del cebador. Alternativamente, el primero de dos cebadores que se hibridan con dos o más moldes diferentes en un sitio se puede eliminar del sitio antes de extender un segundo de los dos o más cebadores que se hibridan con los dos o más moldes diferentes en el sitio.

Además, dos o más productos de extensión de cebadores diferentes que resultan de las etapas anteriores se pueden presentar simultáneamente en un sitio durante una etapa de detección. Alternativamente, se puede eliminar un primero de dos o más productos de extensión de cebadores diferentes de un sitio antes de detectar un segundo de los dos o más productos de extensión de cebadores diferentes en el sitio.

Además, dos o más productos de extensión de cebadores, cada uno con diferentes restos de bloqueo reversibles, se pueden presentar simultáneamente durante una etapa de desbloqueo. La etapa de desbloqueo se puede configurar para eliminar selectivamente (o modificar de otra manera) uno o sólo un subconjunto de los diferentes restos de bloqueo reversibles, tal que al menos otro resto de bloqueo reversible se mantiene (o no se modifica) después del tratamiento. Alternativamente, se pueden eliminar todos los restos de bloqueo reversibles diferentes que se presentan simultáneamente, por ejemplo, empleando una combinación de tratamientos de desbloqueo o un tratamiento de desbloqueo universal. Como alternativa adicional, se puede eliminar un primero de dos o más productos de extensión de cebador diferentes de un sitio antes de someter un segundo de los dos o más productos de extensión de cebador a un tratamiento de desbloqueo.

La presente divulgación proporciona mezclas de reacción (también denominadas en la presente memoria como sistemas de reactivos) que incluyen varias combinaciones de componentes. En varios casos, los componentes de reacción y varias combinaciones de los componentes se describen en el contexto de métodos ejemplares, tal como los establecidos en los párrafos anteriores. Se entenderá que las mezclas de reacción y los componentes de las mismas no necesitan limitarse al uso en los métodos ejemplificados en la presente memoria. También se contemplan otros usos. Por consiguiente, los componentes se pueden ensamblar, en una variedad de combinaciones útiles, por ejemplo, para crear kits. Los kits pueden ser útiles para el almacenamiento, transporte o transacción comercial de los componentes establecidos en la presente memoria. Los kits pueden incluir opcionalmente instrucciones para llevar a cabo uno o más de los métodos establecidos en la presente memoria.

En realizaciones particulares, esta divulgación proporciona un método para secuenciar moldes de ácido nucleico que puede incluir las etapas de (a) proporcionar una serie de sitios, en donde cada sitio incluye un primer molde de ácido nucleico y un segundo molde de ácido nucleico, en donde el primer molde de ácido nucleico tiene una secuencia que es diferente de la secuencia del segundo molde de ácido nucleico, en donde un primer cebador se une al primer molde de ácido nucleico, un resto de bloqueo reversible se une al primer cebador, en donde un segundo cebador se une al segundo molde de ácido nucleico, un resto de bloqueo reversible se une al segundo cebador, y en donde el resto de bloqueo reversible que está unido al primer cebador es diferente del resto de bloqueo reversible que se une al segundo cebador; (b) eliminar selectivamente el resto de bloqueo reversible que se une al primer cebador mientras se mantiene el resto de bloqueo reversible que se une al segundo cebador; (c) extender el primer cebador mediante la adición de un primer análogo de nucleótido que se une a un resto de bloqueo reversible; (d) eliminar selectivamente el resto de bloqueo reversible que se une al segundo cebador mientras se mantiene el resto de bloqueo reversible que se une al análogo de nucleótido que se añade al primer cebador; (e) extender el segundo cebador mediante la adición de un segundo análogo de nucleótido que se une a un resto de bloqueo reversible, en donde el resto de bloqueo reversible que se une al primer análogo de nucleótido es diferente del resto de bloqueo reversible que se une al segundo análogo de nucleótido; y (f) detectar el análogo de nucleótido que se añade al primer cebador y el análogo de nucleótido que se añade al segundo cebador, en cada uno de los sitios, determinando así las diferentes secuencias del primer molde y el segundo molde en cada uno de los sitios.

En algunas realizaciones, el método anterior puede incluir además las etapas de (g) eliminar selectivamente el resto de bloqueo reversible que se une al primer análogo de nucleótido que se añade al primer cebador mientras se mantiene el resto de bloqueo reversible que se une al segundo análogo de nucleótido que se añade al segundo cebador; (h) extender el primer cebador, después de (g), mediante la adición de un tercer análogo de nucleótido que se une a un resto de bloqueo reversible; (i) eliminar selectivamente el resto de bloqueo reversible que se une al segundo análogo de nucleótido que se añade al segundo cebador mientras se mantiene el resto de bloqueo reversible que se une al primer análogo de nucleótido que se añade al primer cebador; (j) extender el segundo cebador, después de (i), mediante la adición de un cuarto análogo de nucleótido que se une a un resto de bloqueo reversible, en donde el resto de bloqueo reversible que se une al tercer análogo de nucleótido es diferente del resto de bloqueo reversible que se une al cuarto análogo de nucleótido; y (k) detectar el análogo de nucleótido que se añade al primer cebador en (h) y el análogo de nucleótido que se añade al segundo cebador en (j), en cada uno de los sitios, determinando así las diferentes secuencias del primer molde y el segundo molde en cada uno de los sitios. Opcionalmente, se pueden repetir las etapas de la (g) a la(k).

Se entenderá que las etapas establecidas en la realización anterior y otras realizaciones de la presente divulgación, no necesitan seguir el orden ejemplificado. Tomando como ejemplo la realización de los párrafos anteriores, la etapa (f), que indica una actividad de detección, no tiene que ocurrir después de la etapa (e). Más bien, un primer cebador que se extiende en la etapa (c) se puede detectar antes de extender un segundo cebador en la etapa (d). Generalmente, una etapa de detección puede ocurrir antes o después de que se eliminen uno o más restos de bloqueo reversibles diferentes.

El orden de las otras etapas se puede cambiar para adaptarse a aplicaciones particulares de los métodos. Un ejemplo de dos métodos que pueden emplear etapas similares, pero en diferentes órdenes, se demuestra mediante la comparación de los diagramas de ciclo en la FIG. 1 y FIG. 2. En el diagrama de ciclo de la FIG. 1 los marcadores en los productos de extensión de cebadores se detectan antes del desbloqueo y escisión de los marcadores. Se muestra que el desbloqueo y la escisión del marcador para los nucleótidos dentro de cada conjunto ocurren simultáneamente, lo que puede ser conveniente, por ejemplo, cuando ambos son susceptibles al mismo tratamiento o debido a tratamientos compatibles. Sin embargo, es posible que el desbloqueo y la escisión del marcador se produzcan por separado. Como se ejemplifica en el diagrama de ciclo de la FIG. 2, la escisión y el desbloqueo del marcador se producen por separado. En este ejemplo, los diferentes marcadores que se presentan en las dos reacciones diferentes (es decir, R1 y R2) se escinden simultáneamente. Esto es conveniente, por ejemplo, cuando ambos tipos de marcadores se pueden escindir empleando el mismo tratamiento o empleando tratamientos compatibles. La comparación de los diagramas de ciclos en la FIG. 1 y FIG. 2 ilustran también otras diferencias. Por ejemplo, en la FIG. 1, el desbloqueo de los productos de extensión de ambas reacciones (R1 y R2) se produce después de la etapa de detección del ciclo anterior, mientras que en la FIG. 2, el producto de extensión R2 se desbloquea antes de la etapa de detección del ciclo anterior y el producto de extensión R1 se desbloquea después de la etapa de detección del ciclo anterior. Hay una variedad de disposiciones y órdenes de etapas diferentes que se pueden emplear en un método establecido en la presente memoria. Los expertos en la técnica serán capaces de determinar fácilmente una disposición y un orden deseables en base a las enseñanzas establecidas en la presente memoria y en las características reactivas conocidas de los reactivos empleados.

Además, como se ejemplificó anteriormente en la presente memoria, las etapas de los métodos establecidos en la presente memoria se pueden llevar a cabo de forma secuencial o simultánea. Por ejemplo, la eliminación selectiva de diferentes restos de bloqueo reversibles (por ejemplo, las etapas (b) y (d) en los párrafos anteriores) se puede llevar a cabo de forma simultánea o secuencial. De manera similar, la extensión de diferentes cebadores (por ejemplo, las etapas (c) y (e) en los párrafos anteriores), que se han desbloqueado empleando respectivos tratamientos de desbloqueo diferentes, puede ocurrir simultánea o secuencialmente.

Los sitios de cebado universales son particularmente útiles para aplicaciones múltiples de los métodos establecidos en la presente memoria. Un sitio de cebado universal proporciona una región de secuencia que es común a dos o más moléculas de ácido nucleico donde las moléculas también tienen secuencias diferentes en sus regiones molde. Una secuencia de cebado universal presente en diferentes miembros de una colección de moléculas puede permitir la replicación, amplificación o detección de múltiples secuencias diferentes empleando una única especie de cebador universal que es complementaria a la secuencia universal. Se pueden encontrar ejemplos de métodos para unir secuencias universales a una colección de ácidos nucleicos diana en la publicación de solicitud de Patente US N2.2007/0128624 A1.

En realizaciones de la presente divulgación, un primer cebador puede tener una primera secuencia del cebador universal que es complementaria a un primer sitio de cebado universal para un primer molde en un sitio. El mismo sitio de cebado universal se puede presentar para una variedad de primeros moldes diferentes en diferentes sitios de una matriz. Por tanto, se puede emplear una única especie de primer cebador universal para amplificar o extender los diferentes primeros moldes en los sitios. Continuando con este ejemplo, un segundo cebador puede tener una segunda secuencia de cebador universal que es complementaria a un segundo sitio de cebado universal para un segundo molde en el sitio donde también se encuentra el primer molde. El mismo segundo sitio de cebado universal se puede presentar para una variedad de segundos moldes diferentes en los diferentes sitios de la matriz. Por tanto, se puede emplear una única especie de segundo cebador universal para amplificar o extender los diferentes segundos moldes en los sitios.

Un método de secuenciación ortogonal establecido en la presente memoria se puede emplear en un enfoque de secuenciación de extremos emparejados. Generalmente, la secuenciación de extremos emparejados implica determinar las secuencias en dos extremos de una región de secuencia de molde, en donde se conoce la longitud de la región de secuencia molde. Los métodos para fragmentar una muestra de ácido nucleico diana (por ejemplo, muestra de ADN genómico), unir cebadores para acomodar lecturas finales emparejadas y leer la secuencia de los extremos de los fragmentos, son conocidos y se pueden llevar a cabo como se describe, por ejemplo, en las Patentes US Nos 7.754.429; 8.017.335 o 8.192,930.

En el caso de una realización de secuenciación por síntesis, se pueden construir fragmentos de ácido nucleico para que tengan dos secuencias molde y se pueden obtener lecturas emparejadas de cada uno de los dos moldes para obtener 4 lecturas de un único fragmento. Una construcción ejemplar para obtener 4 lecturas de un único fragmento y los métodos para realizar la construcción se establecen en la publicación de Solicitud de Patente US N° 2015/0031560 A1.

La presente divulgación proporciona además una matriz de ácido nucleico que incluye una pluralidad de sitios en un soporte sólido, en donde cada sitio incluye un primer molde de ácido nucleico y un segundo molde de ácido nucleico, en donde el primer molde de ácido nucleico tiene una secuencia que es diferente de la secuencia del segundo molde de ácido nucleico, en donde un primer cebador se une al primer molde de ácido nucleico, un primer resto de bloqueo reversible se une al primer cebador, en donde un segundo cebador se une al segundo molde de ácido nucleico, un segundo resto de bloqueo reversible se une al segundo cebador, y en donde el primer resto de bloqueo reversible es diferente del segundo resto de bloqueo reversible. La matriz de ácidos nucleicos puede incluir además uno o más de los componentes descritos en el contexto de los métodos de la presente divulgación. Los productos que resultan inherentemente de los métodos establecidos en la presente memoria también están destinados a ser considerados como componentes de un ácido nucleico en algunas realizaciones.

En realizaciones particulares, una matriz de ácido nucleico incluirá una primera polimerasa que se une al primer cebador y al primer molde de ácido nucleico en un sitio. Además, se puede unir una segunda polimerasa al segundo cebador y al segundo molde de ácido nucleico en el sitio. En algunos casos, la primera polimerasa y la segunda polimerasa son la misma especie de polimerasa. Sin embargo, también puede ser útil en algunas realizaciones que la primera y segunda polimerasas sean especies diferentes (por ejemplo, una ADN polimerasa y una ARN polimerasa). Una matriz de ácidos nucleicos de la presente divulgación se puede presentar en un aparato de detección, tal como un aparato de secuenciación de ácidos nucleicos. Ejemplos de aparatos de detección ejemplares se describen en la presente memoria y en las referencias. Generalmente, un aparato de detección puede incluir una matriz de ácido nucleico y un detector que está posicionado para detectar uno o más sitios en la matriz. Normalmente, el detector tendrá una resolución espacial que es demasiado baja para resolver puntos a una distancia equivalente al espacio entre el primer cebador y el segundo cebador en cada uno de los sitios. Sin embargo, el empleo del desbloqueo y de la extensión de cebadores ortogonales permite resolver los dos cebadores. El detector se puede configurar para observar cualquiera de una variedad de señales como se ejemplifica en la presente memoria. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el detector es un detector óptico. Los sitios de la matriz pueden tener marcadores ópticos que son detectables por el detector óptico. Se pueden extender diferentes cebadores en cada sitio para incorporar diferentes marcadores ópticos y el detector óptico se puede configurar para distinguir ópticamente los diferentes marcadores (por ejemplo, debido a diferencias en la longitud de onda de absorción de luz, longitud de onda de excitación de luminiscencia o longitud de onda de emisión de luminiscencia). En algunas configuraciones, un píxel del detector está configurado para adquirir simultáneamente señales del primer cebador y del segundo cebador. A lo largo de esta solicitud se ha hecho referencia a diversas publicaciones, patentes o solicitudes de patentes. En la presente memoria, se pretende que el término que comprende sea de un extremo abierto, que incluye no sólo los elementos enumerados, sino que abarca además cualquier elemento adicional.

Se han descrito varias realizaciones. No obstante, se entenderá que se pueden realizar varias modificaciones.

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Un método para secuenciar moldes de ácido nucleico, que comprende

(a) proporcionar una matriz que comprende una pluralidad de sitios, en donde cada sitio comprende un primer molde de ácido nucleico y un segundo molde de ácido nucleico,

en donde el primer molde de ácido nucleico tiene una secuencia que es diferente de la secuencia del segundo molde de ácido nucleico,

en donde un primer cebador se une al primer molde de ácido nucleico, un resto de bloqueo reversible se une al primer cebador,

en donde un segundo cebador se une al segundo molde de ácido nucleico, un resto de bloqueo reversible se une al segundo cebador, y

en donde el resto de bloqueo reversible que se une al primer cebador es diferente del resto de bloqueo reversible que se une al segundo cebador;

(b) eliminar selectivamente el resto de bloqueo reversible que se une al primer cebador mientras se mantiene el resto de bloqueo reversible que se une al segundo cebador;

(c) extender el primer cebador mediante la adición de un primer análogo de nucleótido que comprende un resto de bloqueo reversible;

(d) eliminar selectivamente el resto de bloqueo reversible que se une al segundo cebador mientras se mantiene el resto de bloqueo reversible que se une al análogo de nucleótido que se añade al primer cebador;

(e) extender el segundo cebador mediante la adición de un segundo análogo de nucleótido que comprende un resto de bloqueo reversible, en donde el resto de bloqueo reversible del primer análogo de nucleótido es diferente del resto de bloqueo reversible del segundo análogo de nucleótido; y

(f) detectar el análogo de nucleótido que se añade al primer cebador y el análogo de nucleótido que se añade al segundo cebador, en cada uno de los sitios, determinando así las diferentes secuencias del primer molde y el segundo molde en cada uno de los sitios de manera ortogonal empleando un desbloqueo selectivo de nucleótidos.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además

(g) eliminar selectivamente el resto de bloqueo reversible del primer análogo de nucleótido que se añade al primer cebador mientras se mantiene el resto de bloqueo reversible del segundo análogo de nucleótido que se añade al segundo cebador;

(h) extender el primer cebador, después de (g), mediante la adición de un tercer análogo de nucleótido que comprende un resto de bloqueo reversible;

(i) eliminar selectivamente el resto de bloqueo reversible del segundo análogo de nucleótido que se añade al segundo cebador mientras se mantiene el resto de bloqueo reversible del tercer análogo de nucleótido que se añade al primer cebador;

(j) extender el segundo cebador, después de (i), mediante la adición de un cuarto análogo de nucleótido que comprende un resto de bloqueo reversible, en donde el resto de bloqueo reversible del tercer análogo de nucleótido es diferente del resto de bloqueo reversible del cuarto análogo de nucleótido; y

(k) detectar el análogo de nucleótido que se añade al primer cebador en (h) y el análogo de nucleótido que se añade al segundo cebador en (j), en cada uno de los sitios, determinando así las diferentes secuencias del primer molde y del segundo molde en cada uno de los sitios de una manera ortogonal empleando un desbloqueo selectivo de nucleótidos, y;

en donde el método puede comprender además repetir las etapas de (g) a (k).

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la detección emplea un detector que tiene una resolución espacial que es demasiado baja para resolver puntos a una distancia equivalente al espacio entre el primer cebador y el segundo cebador en cada uno de los sitios.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el detector es un detector óptico y los análogos de nucleótidos comprenden marcadores ópticos, en donde el primer análogo de nucleótidos es de un primer conjunto de análogos de nucleótidos, en donde el segundo análogo de nucleótidos es de un segundo conjunto de análogos de nucleótidos, y en donde los marcadores ópticos del primer conjunto de análogos de nucleótidos son diferentes de los marcadores ópticos del segundo conjunto de análogos de nucleótidos.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el primer análogo de nucleótidos es de un primer conjunto de análogos de nucleótidos, en donde el segundo análogo de nucleótidos es de un segundo conjunto de análogos de nucleótidos, y en donde un subconjunto de los análogos de nucleótidos en el primer conjunto de análogos de nucleótidos comprende marcadores ópticos,

en donde un subconjunto de los análogos de nucleótidos en el segundo conjunto de análogos de nucleótidos comprende marcadores ópticos y en donde el subconjunto de análogos de nucleótidos en el primer conjunto de análogos de nucleótidos comprende marcadores ópticos que son diferentes de los marcadores ópticos del subconjunto de análogos de nucleótidos en el segundo conjunto de análogos de nucleótidos.

6. El método de la reivindicación 5, en donde el primer análogo de nucleótidos es de un primer conjunto de análogos de nucleótidos, en donde el segundo análogo de nucleótidos es de un segundo conjunto de análogos de nucleótidos, en donde el primer conjunto de análogos de nucleótidos comprende sólo un tipo de marcador óptico que se detecta en la etapa (f) y el segundo conjunto de análogos de nucleótidos comprende sólo un tipo de marcador óptico que se detecta en la etapa (f);

en donde el tipo de marcador óptico está unido a sustancialmente todos los análogos de nucleótidos de una primera especie en el primer conjunto,

el único tipo de marcador óptico se une a un subconjunto de los análogos de nucleótidos de una segunda especie en el primer conjunto,

sustancialmente todos los análogos de nucleótidos de una tercera especie en el primer conjunto se unen a un ligando, y

sustancialmente todos los análogos de nucleótidos de una cuarta especie en el primer conjunto no se unen al único tipo de marcador óptico o al ligando.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el primer análogo de nucleótidos es de un primer conjunto de análogos de nucleótidos, en donde el segundo análogo de nucleótidos es de un segundo conjunto de análogos de nucleótidos, en donde el primer conjunto de análogos de nucleótidos comprende sólo dos tipos de marcadores ópticos que se detectan en la etapa (f) y el segundo conjunto de análogos de nucleótidos comprende sólo dos tipos de marcadores ópticos que se detectan en la etapa (f);

en donde sólo uno de los dos tipos de marcadores ópticos se une a sustancialmente todos los análogos de nucleótidos de una primera especie en el primer conjunto,

sólo un segundo de los dos tipos de marcadores ópticos se une a sustancialmente todos los análogos de nucleótidos de una segunda especie en el primer conjunto,

uno de los dos tipos de marcadores ópticos y el segundo de los dos tipos de marcadores ópticos se unen a análogos de nucleótidos de una tercera especie en el primer conjunto, y

sustancialmente todos los análogos de nucleótidos de una cuarta especie en el primer conjunto no se unen a uno de los dos tipos de marcadores ópticos o al segundo de los dos tipos de marcadores ópticos.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde un píxel del detector adquiere simultáneamente señales tanto del primer cebador como del segundo cebador.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el primer molde de ácido nucleico comprende al menos un resto de base que es la misma especie que un resto de base en el segundo molde de ácido nucleico.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde las etapas (b) y (d) se llevan a cabo bien simultánea o secuencialmente.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde las etapas (c) y (e) se llevan a cabo bien simultánea o secuencialmente.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde una única molécula de ácido nucleico contiene el primer molde de ácido nucleico y el segundo molde de ácido nucleico o en donde el primer molde de ácido nucleico y el segundo molde de ácido nucleico están en moléculas de ácido nucleico diferentes.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde:

(i) los sitios tienen un área de 100 gm2 o menos; o

(ii) los sitios comprenden múltiples amplicones del primer molde de ácido nucleico y múltiples amplicones del segundo molde de ácido nucleico.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde

(i) al menos uno de (a) la pluralidad de sitios tiene un paso de 10 pm o menos; y/o

(ii) la pluralidad de sitios comprende al menos 1 x 106 sitios; y/o

(iii) cada uno de los sitios comprende una secuencia de ácido nucleico que es única en comparación con las secuencias de ácido nucleico en los otros sitios de la pluralidad; y/o

(iv) el primer cebador comprende una primera secuencia de cebador universal y el primer molde de ácido nucleico en cada sitio en la pluralidad de sitios comprende una primera secuencia de unión al cebador universal que es complementaria a la primera secuencia de cebador universal; en donde el segundo cebador comprende una segunda secuencia de cebador universal y el segundo molde de ácido nucleico en cada sitio en la pluralidad de sitios comprende una segunda secuencia de unión de cebador universal que es complementaria a la segunda secuencia de cebador universal, en donde la primera secuencia de unión de cebador universal es diferente de la segunda secuencia de unión del cebador universal; y/o

(v) las etapas (c) y (e) se llevan a cabo por la misma polimerasa o la misma especie de polimerasas; y/o (vi) (A) se emplean azidometilo y tert-butoxi-etoxilo como restos de bloqueo reversibles; en donde el azidometilo se elimina selectivamente mediante tratamiento con fosfina y el tert-butoxi-etoxilo se elimina selectivamente mediante tratamiento con ácido, o [B] la eliminación selectiva de los restos de bloqueo reversibles comprende tratamiento químico, tratamiento térmico, irradiación o tratamiento eléctrico; y/o (vii) el resto de bloqueo reversible que se une al primer cebador es de la misma especie que el resto de bloqueo reversible que se une al primer análogo de nucleótido; y el resto de bloqueo reversible que se une al segundo cebador es la misma especie que el resto de bloqueo reversible quese une al segundo análogo de nucleótido.

15. Un método para secuenciar moldes de ácido nucleico, que comprende

(a) proporcionar una serie de sitios, en donde cada sitio comprende una mezcla de al menos dos moldes de ácido nucleico diferentes;

(b) extender cebadores hibridados con diferentes moldes de ácido nucleico en cada uno de los sitios con diferentes análogos de nucleótidos que comprenden diferentes restos de bloqueo reversibles, respectivamente, produciendo de ese modo diferentes productos de extensión del cebador en cada sitio;

(c) detectar los diferentes productos de extensión del cebador para distinguir los diferentes análogos de nucleótidos en cada sitio;

(d) eliminar los diferentes restos de bloqueo reversibles de los productos de extensión del cebador en cada uno de los sitios empleando un primer tratamiento que es selectivo para el primero de los diferentes restos de bloqueo reversibles y un segundo tratamiento que es selectivo para un segundo de los diferentes restos bloqueadores reversibles; y

(e) repetir de (b) a (d) para determinar la secuencia de diferentes análogos de nucleótidos añadidos a cada uno de los diferentes productos de extensión en cada uno de los sitios de una manera ortogonal.

16. El método de la reivindicación 15, en donde:

(i) los cebadores que se hibridan con los diferentes moldes de ácido nucleico se presentan simultáneamente durante la extensión en (b), y/o

(ii) los diferentes productos de extensión del cebador se presentan simultáneamente durante la detección en (c) , y/o

(iii) el primero de los diferentes restos de bloqueo reversible y el segundo de los diferentes restos de bloqueo reversible se presentan simultáneamente en los productos de extensión del cebador durante la eliminación en (d) .

17. El método de la reivindicación 15, en donde:

(i) un primero de los cebadores que se hibrida con un primero de los diferentes moldes de ácido nucleico se elimina de la matriz de sitios antes de extender un segundo de los cebadores que se hibrida con un segundo de los diferentes moldes de ácido nucleico; o

(ii) se elimina un primero de los diferentes productos de extensión del cebador de la matriz de sitios antes de detectar un segundo de los diferentes productos de extensión del cebador, o

(iii) un primero de los diferentes productos de extensión del cebador se elimina de la matriz de sitios antes del segundo tratamiento.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde

(i) (c) se lleva a cabo después de (d); y/o

(ii) la detección emplea un detector que tiene una resolución espacial que es demasiado baja para resolver puntos a una distancia equivalente al espacio entre los diferentes productos de extensión del cebador en cada uno de los sitios; y/o

(iii) el detector es un detector óptico; y/o

(iv) los análogos de nucleótidos comprenden marcadores ópticos; y/o

(v) se añade un primer conjunto de análogos de nucleótidos al primero de los diferentes productos de extensión del cebador y se añade un segundo conjunto de análogos de nucleótidos a un segundo de los diferentes productos de extensión del cebador, en donde el primer conjunto de análogos de nucleótidos comprende marcadores ópticos que son diferentes de los marcadores ópticos del segundo conjunto de análogos de nucleótidos; y/o

(vi) un píxel de un detector adquiere simultáneamente señales tanto del primer producto de extensión del cebador como del segundo producto de extensión del cebador; y/o

(vii) el primer molde de ácido nucleico comprende al menos un resto de base que es de la misma especie que un resto de base en el segundo molde de ácido nucleico; y/o

(viii) (A) una única molécula de ácido nucleico contiene al menos dos moldes de ácido nucleico diferentes, o (B) un primer molde de ácido nucleico y un segundo molde de ácido nucleico de los al menos dos moldes de ácido nucleico diferentes están en diferentes moléculas de ácidos nucleicos; y/o

(ix) los sitios tienen un área de 100 |um2 o menos; y/o

(x) los sitios comprenden múltiples amplicones de cada uno de los al menos dos moldes de ácido nucleico diferentes; y/o

(xi) la pluralidad de sitios tiene un paso de 10 |um o menos; y/o

(xii) la pluralidad de sitios comprende al menos 1 x 106 sitios; y/o

(xiii) cada uno de los sitios comprende una secuencia de ácido nucleico que es única en comparación con las secuencias de ácido nucleico en los otros sitios de la pluralidad; y/o

(xiv) la misma polimerasa o la misma especie de polimerasa realiza la extensión de los cebadores hibridados con los diferentes moldes de ácido nucleico en cada uno de los sitios; y/o

(xv) (A) los tratamientos selectivos comprenden eliminar selectivamente un resto de bloqueo reversible que comprende azidometilo empleando un tratamiento con fosfina y eliminar selectivamente un resto de bloqueo reversible que comprende tert-butoxi-etoxilo empleando un tratamiento ácido o (B) la eliminación selectiva de los restos de bloqueo reversible comprenden tratamiento químico, tratamiento térmico, irradiación o tratamiento eléctrico.

19. Una matriz de ácido nucleico, que comprende

una pluralidad de sitios en un soporte sólido, en donde cada sitio comprende un primer molde de ácido nucleico y una segundo molde de ácido nucleico,

en donde el primer molde de ácido nucleico tiene una secuencia que es diferente de la secuencia del segundo molde de ácido nucleico,

en donde un primer cebador se une al primer molde de ácido nucleico, un primer resto de bloqueo reversible se une al primer cebador,

en donde un segundo cebador se une al segundo molde de ácido nucleico, un segundo resto de bloqueo reversible se une al segundo cebador; y

en donde el primer resto de bloqueo reversible es diferente del segundo resto de bloqueo reversible,

en donde las diferentes secuencias del primer molde y del segundo molde en cada uno de los sitios se pueden determinar de una manera ortogonal empleando un desbloqueo selectivo de nucleótidos.

20. La matriz de ácidos nucleicos de la reivindicación 19, en donde:

(i) cada sitio ocupa un área en el soporte sólido de 100 gm2 o menos; y/o

(ii) la pluralidad de sitios tiene un paso de 10 gm o menos; y/o

(iii) la pluralidad de sitios comprende al menos 1 x 106 sitios; y/o

(iv) el primer resto de bloqueo reversible se une al nucleótido 3' del primer cebador; y/o

(v) el segundo resto de bloqueo reversible se une al nucleótido 3' del segundo cebador, y/o

(vi) el primero y segundo de los marcadores ópticos comprenden fluoróforos; y/o

(vii) el primer molde de ácido nucleico y el segundo molde de ácido nucleico comprenden ADN, y/o

(viii) (A) una única molécula de ácido nucleico contiene el primer molde de ácido nucleico y el segundo molde de ácido nucleico, o (B) el primer molde de ácido nucleico y el segundo molde de ácido nucleico están en moléculas de ácido nucleico diferentes; y/o

(ix) los sitios comprenden múltiples amplicones del primer molde de ácido nucleico y múltiples amplicones del segundo molde de ácido nucleico; y/o

(x) el primer cebador comprende una primera secuencia de cebador universal y el primer molde de ácido nucleico en cada sitio de la pluralidad de sitios comprende una primera secuencia de unión al cebador universal que es complementaria a la primera secuencia de cebador universal; y/o

(xi) una primera polimerasa se une al primer cebador y al primer molde de ácido nucleico en donde una segunda polimerasa se une al segundo cebador y al segundo molde de ácido nucleico, y en donde la primera polimerasa y la segunda polimerasa son la misma especie de polimerasa; y/o

(xii) el primer resto de bloqueo reversible comprende azidometilo y en donde el segundo resto de bloqueo reversible comprende tert-butoxi-etoxilo.

21. Un aparato de detección, que comprende la matriz de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 20, y un detector colocado para detectar la pluralidad de sitios.

22. El aparato de detección según la reivindicación 21, en donde:

(i) el detector tiene una resolución espacial que es demasiado baja para resolver puntos a una distancia equivalente al espacio entre el primer cebador y el segundo cebador en cada uno de los sitios; o

(ii) en donde un píxel del detector se configura para adquirir simultáneamente señales del primer cebador y del segundo cebador.