ES2754203T3

ES2754203T3 - Proceso de extracción de aceite a partir de vinaza diluida

Info

Publication number: ES2754203T3
Application number: ES14817743T
Authority: ES
Inventors: Nathanial Kreel; Joseph Jump
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2013-06-24
Filing date: 2014-06-20
Publication date: 2020-04-16
Anticipated expiration: 2034-06-20
Also published as: CN105339501A; CA2915063A1; EP3013968A1; US20180237726A1; CN116334149A; EP3013968A4; CA2915065C; PL3013967T3; EP3013968B1; US11505765B2; EP3013967B1; US10731104B2; EP3013967A1; US20190256799A1; US20190338217A1; WO2014209800A1; WO2014209789A1; US20160152922A1; US10035973B2; CA2915065A1

Abstract

Proceso de recuperación de aceite, que comprende (a) la conversión de un material que contiene almidón en dextrinas con una alfa-amilasa (b) la sacarificación de las dextrinas usando una enzima generadora de fuentes de carbohidratos para formar un azúcar; (c) la fermentación del azúcar en un medio de fermentación en un producto de fermentación usando un organismo fermentador; (d) la recuperación del producto de fermentación para formar una vinaza entera; (e) la separación de la vinaza entera en vinaza diluida y torta húmeda; (e') la concentración opcional de la vinaza diluida en jarabe; (f) la recuperación de aceite de la vinaza diluida y/o el jarabe, donde una proteasa que tiene al menos un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 4 y tiene un valor de termoestabilidad de más del 50% determinado como actividad relativa a 80°C/70°C está presente y/o se añade durante las etapas (d)-(e').

Description

DESCRIPCIÓN

Proceso de extracción de aceite a partir de vinaza diluida

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a procesos de extracción/recuperación de aceite a partir de vinaza diluida y/o jarabe en la etapa final de un proceso de producción de productos de fermentación basado en material que contiene almidón.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Los productos de fermentación, tal como el etanol, se producen típicamente moliendo primero material que contiene almidón en un proceso de molienda seca o de molienda húmeda, degradando luego el material en azúcares fermentables usando enzimas y finalmente convirtiendo los azúcares directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado usando un organismo fermentador. Los productos de fermentación líquidos se recuperan del mosto fermentado (a menudo conocido como "mosto de cerveza"), por ejemplo, por destilación, que separa el producto de fermentación deseado de otros líquidos y/o sólidos. La fracción restante se conoce como "vinaza entera". La vinaza entera se deshidrata y se separa en un sólido y una fase líquida, por ejemplo, por centrifugación. La fase sólida se conoce como "torta húmeda" (o "granos húmedos") y la fase líquida (sobrenadante) se conoce como "vinaza diluida". La torta húmeda y la vinaza diluida contienen aproximadamente un 35 y un 7% de sólidos, respectivamente. La torta húmeda deshidratada se seca para proporcionar "residuo seco de destilería" (DDG) usado como nutriente en pienso para animales. La vinaza diluida se evapora típicamente para proporcionar producto de condensación y jarabe o puede alternativamente reciclarse directamente al tanque de lodo como "agua de proceso". El producto de condensación puede o enviarse a un metanizador antes de ser descargado o puede reciclarse al tanque de lodo. El jarabe se puede mezclar con el DDG o añadirse a la torta húmeda antes del secado para producir DDGS (residuo seco de destilería con solubles). Un número en aumento de plantas de etanol extraen aceite de la vinaza diluida y/o jarabe/fase central evaporada como un subproducto para usar en la producción de biodiésel u otros productos biorrenovables.

[0003] Mucho del trabajo en la recuperación/extracción de aceite de procesos de producción de productos de fermentación se ha enfocado en la mejora de la extractibilidad del aceite de la vinaza diluida. La eliminación eficaz de aceite se realiza a menudo por extracción con hexano. Sin embargo, la utilización de extracción con hexano no ha tenido aplicación general debido a la alta inversión de capital requerida. Por lo tanto, se han explorado otros procesos que mejoran la extracción de aceite a partir de procesos de producción de productos de fermentación.

[0004] WO 2011/126897 (Novozymes) describe procesos de recuperación de aceite convirtiendo materiales que contienen almidón en dextrinas con alfa-amilasa; sacarificando con una enzima generadora de fuentes de carbohidratos para formar azúcares; fermentando los azúcares usando un organismo fermentador; donde el medio de fermentación comprende una hemicelulasa; destilando el producto de fermentación para formar vinaza entera; separando la vinaza entera en vinaza diluida y torta húmeda; y recuperando aceite de la vinaza diluida. El medio de fermentación puede comprender además una proteasa.

[0005] WO 2012/088303 (Novozymes) describe procesos para producir productos de fermentación, tal como el etanol, incluida la licuefacción de material que contiene almidón con una alfa-amilasa termoestable y opcionalmente una proteasa, por ejemplo, una derivada de Pyrococcus furiosus.

[0006] Es un objeto de la presente invención proporcionar procesos mejorados para aumentar la cantidad de aceite recuperable de procesos de producción de productos de fermentación.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0007] El objeto de la presente invención es proporcionar procesos mejorados de extracción o recuperación de aceite en la etapa final de un proceso de producción de productos de fermentación, tal como especialmente un proceso de producción de etanol.

[0008] Por lo tanto, en el primer aspecto, la invención se refiere a procesos de recuperación de aceite, que comprenden

(a) la conversión de un material que contiene almidón en dextrinas con una alfa-amilasa;

(b) la sacarificación de las dextrinas usando una enzima generadora de fuentes de carbohidratos para formar un azúcar;

(c) la fermentación del azúcar en un medio de fermentación en un producto de fermentación usando un organismo fermentador;

(d) la recuperación del producto de fermentación para formar una vinaza entera;

(e) la separación de la vinaza entera en vinaza diluida y torta húmeda;

(e') la concentración opcional de la vinaza diluida en jarabe;

(f) la recuperación de aceite de la vinaza diluida y/u opcionalmente el jarabe, donde una proteasa que tiene al menos un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 4 y tiene un valor de termoestabilidad superior al 50% determinado como actividad relativa a 80°C/70°C está presente y/o se añade durante las etapas (d)-(e').

[0009] En una forma de realización, la temperatura en la etapa (a) está por encima de la temperatura de gelatinización inicial, tal como entre 80-90°C, tal como alrededor de 85°C. Las etapas (b) y (c) se pueden realizar simultánea o secuencialmente. En una forma de realización, las etapas (a), (b) y (c) se realizan simultánea o secuencialmente. Cuando las etapas (a), (b) y (c) se realizan simultáneamente, la temperatura está por debajo de la temperatura de gelatinización inicial, tal como entre 25-40°C, preferiblemente alrededor de 32°C en caso de la producción de productos de fermentación tales como el etanol.

[0010] En una forma de realización preferida, la proteasa está presente en o se añade a la vinaza entera en la etapa (d) y/o a la vinaza diluida después de separar la vinaza entera en vinaza diluida y torta húmeda en la etapa (e), y/o al jarabe en la etapa (e'). En tales ejemplos de realización, la etapa (a) se puede realizar a temperaturas a o sobre la temperatura de gelatinización inicial, tal como entre 80-90°C, o por debajo de la temperatura de gelatinización inicial, tal como entre 25-40°C. En una forma de realización preferida, el aceite se recupera de la vinaza diluida y/o jarabe/fase central evaporada, por ejemplo, por extracción, tal como extracción con hexano o usando otra tecnología de recuperación de aceite bien conocida en la técnica.

[0011] La proteasa puede ser cualquier proteasa con al menos un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 4 y con un valor de termoestabilidad, tal y como se define en la presente, de más del 50% determinado como actividad relativa. La determinación de la "actividad relativa" y la "actividad residual" se determina como se describe en el ejemplo 1. En una forma de realización, la proteasa tiene un valor de termoestabilidad de más del 60%, más del 70%, más del 80%, más del 90%, más del 100%, tal como más del 105%, tal como más del 110%, tal como más del 115%, tal como más del 120% determinado como actividad relativa a 80°C/70°C.

[0012] En otra forma de realización preferida, la proteasa usada en un proceso de la invención es una proteasa termoestable derivada de la bacteria, por ejemplo, clasificada como EC 3.4.21.62, tal como Pyrococcus furiosus, como la proteasa mostrada en la SEQ ID NO: 4 o una con una identidad de secuencia con la misma de al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%.

[0013] Según la invención, la proteasa usada en un proceso de la invención tiene un valor de termoestabilidad de más del 60%, más del 70%, más del 80%, más del 90%, más del 100%, tal como más del 105%, tal como más del 110%, tal como más del 115%, tal como más del 120% determinado como actividad relativa a 80°C/70°C para la recuperación de aceite a partir de vinaza diluida y/o jarabe en la etapa final de un proceso de producción de productos de fermentación basado en material que contiene almidón.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO

[0014]

La figura 1 muestra esquemáticamente un proceso de producción de etanol. El aceite puede recuperarse/extraerse durante y/o después de la licuefacción (etapa (a)), de la vinaza diluida y/o el jarabe/fase central. Las cajas en la figura indican donde se puede recuperar/extraer el aceite.

La figura 2 muestra el % de aceite extraído de la vinaza entera para el control (sin proteasa), la proteasa PF, la proteasa RH, la proteasa TA y la proteasa TA 196, la proteasa TF.

La figura 3 muestra el % de aceite extraído de mosto de maíz licuado para el control y la proteasa PF.

La figura 4 muestra el % de extracción de aceite de jarabe para el control (sin proteasa), la proteasa PF, la proteasa RH, la proteasa TA y la proteasa TA 196, la proteasa TF.

La figura 5 muestra el % de aceite en el mosto de maíz licuado (licor) para el control (sin proteasa), la proteasa PF, la proteasa RH, la proteasa TA, la proteasa TA196 y la proteasa TF.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0015] El objeto de la presente invención es proporcionar procesos mejorados de extracción o recuperación de aceite en la etapa final de un proceso de producción de productos de fermentación, tal como especialmente un proceso de producción de etanol.

[0016] Por lo tanto, en el primer aspecto, la invención se refiere a procesos de recuperación de aceite, que comprende

(e) la separación de la vinaza entera en vinaza diluida y torta húmeda;

(e') la concentración opcional de la vinaza diluida en jarabe;

[0017] En una forma de realización, la temperatura en la etapa (a) está por encima de la temperatura de gelatinización inicial, tal como entre 80-90°C, tal como alrededor de 85°C. En una forma de realización, la etapa (a) se realiza como una etapa de licuefacción seguida de las etapas (b) y (c) realizadas o simultánea o secuencialmente. En una forma de realización preferida, las etapas (b) y (c) se realizan como una etapa de sacarificación y fermentación simultáneas (es decir, SSF).

[0018] En una forma de realización, las etapas (a), (b), y (c) se realizan simultáneamente. Esto se hace típicamente a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial, es decir, un proceso de hidrólisis de almidón crudo (RSH). Sin embargo, las etapas (a), (b), y (c) también se pueden realizar secuencialmente. En tales ejemplos de realización, la etapa (a) se puede realizar a temperaturas a o por encima de la temperatura de gelatinización inicial, tal como entre 80-90°C, o por debajo de la temperatura de gelatinización inicial, tal como entre 25-40°C, tal como alrededor de 32°C.

[0019] El término "temperatura de gelatinización inicial" significa la temperatura más baja a la cual comienza la gelatinización del almidón. El almidón calentado en agua empieza a gelatinizar entre 50°C y 75°C; la temperatura exacta de gelatinización depende del almidón específico, y la puede determinar fácilmente la persona experta en la materia. Así, la temperatura de gelatinización inicial puede variar según la especie de planta, la variedad particular de la especie de planta, así como con las condiciones de crecimiento. En el contexto de esta invención, la temperatura de gelatinización inicial de un material que contiene almidón dado es la temperatura a la cual la birrefringencia se pierde en el 5% de los gránulos de almidón usando el método descrito por Gorinstein. S. y Lii. C., Starch/Starke, Vol. 44 (12) págs. 461-466 (1992).

[0020] Según la invención, la proteasa está presente y/o se añade en la etapa final de un proceso de producción de productos de fermentación, tal como un proceso de producción de etanol, preferiblemente a la vinaza entera y/o jarabe/fase central evaporada, incluido un proceso de producción de producto de etanol convencional, que incluía una etapa de licuefacción, por ejemplo, la etapa (a) realizada a altas temperaturas, tal como a temperaturas a o por encima de las temperaturas de gelatinización inicial, tal como a temperaturas entre 80-90°C, a un pH entre 4,5 y 6,0, seguido de una sacarificación y fermentación simultáneas (por ejemplo, las etapas (b) y (c)) realizadas a una temperatura entre 25-40°C, tal como alrededor de 32°C, si el producto de fermentación es etanol o similar.

[0021] En otra forma de realización, la proteasa está presente y/o se añade en la etapa final de un proceso de producción de productos de fermentación, tal como un proceso de producción de etanol, preferiblemente a la vinaza entera y/o jarabe, donde se sacarifica y fermenta simultáneamente almidón granulado a temperaturas inferiores a las temperaturas de gelatinización inicial, tal como a temperaturas entre 25-40°C, a un pH entre 4,5 y 6,0, es decir, las etapas (a), (b) y (c) se realizan simultáneamente.

[0022] En una forma de realización preferida, la proteasa está presente en o se añade a la vinaza entera en la etapa (d) y/o a la vinaza diluida después de la separación de la vinaza entera en vinaza diluida y torta húmeda en la etapa (e) , y/o al jarabe en la etapa (e'). En una forma de realización preferida, el aceite se recupera de la vinaza diluida y/o el jarabe/fase central evaporada, por ejemplo, por extracción, tal como extracción con hexano o usando otra tecnología de recuperación de aceite bien conocida en la técnica.

[0023] Según la invención, la proteasa tiene un valor de termoestabilidad de más del 50%, más del 60%, más del 70%, más del 80%, más del 90%, más del 100%, tal como más del 105%, tal como más del 110%, tal como más del 115%, tal como más del 120% determinado como actividad relativa a 80°C/70°C.

[0024] Según la invención, la proteasa es una proteasa termoestable derivada de la bacteria Pyrococcus furiosus, como la proteasa mostrada en la SEQ ID NO: 4, o una con una identidad de secuencia con la misma de al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%.

[0025] La proteasa de Pyrococcus furiosus mostrada en la SEQ ID NO: 4 es en la presente una proteasa bacteriana termoestable. Se ha descubierto que un producto de proteasa de Pyrococcus furiosus comercial (Pfu S) de Takara Bio Inc. (Japón) tiene un valor de termoestabilidad del 110% (80°C/70°C) y el 103% (90°C/70°C) a pH 4,5 determinado como se describe en el ejemplo 1 en la presente.

[0026] En una forma de realización, la proteasa es una proteasa termoestable derivada de la bacteria Pyrococcus furiosus, como la proteasa mostrada en la SEQ ID NO: 4 en la presente, o una con una identidad de secuencia con la misma de al menos un 90%, y donde la proteasa tiene un valor de termoestabilidad de más del 30%, más del 40%, más del 50%, más del 60%, más del 70%, más del 80%, más del 90%, más del 100%, tal como más del 105%, tal como más del 110%, tal como más del 115%, tal como más del 120% determinado como actividad relativa a 80°C/70.

[0027] En una forma de realización, la proteasa es una proteasa termoestable derivada de la bacteria Pyrococcus furiosus, como la proteasa mostrada en la SEQ ID NO: 4 en la presente, o una con una identidad de secuencia con la misma de al menos un 95%, y donde la proteasa tiene un valor de termoestabilidad de más del 30%, más del 40%, más del 50%, más del 60%, más del 70%, más del 80%, más del 90%, más del 100%, tal como más del 105%, tal como más del 110%, tal como más del 115%, tal como más del 120% determinado como actividad relativa a 80°C/70.

[0028] En una forma de realización la proteasa es una proteasa termoestable derivada de la bacteria Pyrococcus furiosus, como la proteasa mostrada en la SEQ ID NO: 4 en la presente, o una con una identidad de secuencia con la misma de al menos un 99%, y donde la proteasa tiene un valor de termoestabilidad de más del 30%, más del 40%, más del 50%, más del 60%, más del 70%, más del 80%, más del 90%, más del 100%, tal como más del 105%, tal como más del 110%, tal como más del 115%, tal como más del 120% determinado como actividad relativa a 80°C/70.

[0029] Cuando la etapa (a) se realiza como una etapa de licuefacción a altas temperaturas, es decir, por encima de la temperatura de gelatinización inicial, tal como a temperaturas entre 80-90°C, tal como alrededor de 85°C, la alfaamilasa puede ser una alfa-amilasa bacteriana. En una forma de realización, el pH en la etapa (a) es de 4-7, preferiblemente 4,5-6.

[0030] En una forma de realización, una etapa de cocción por chorro se realiza antes en la etapa (a). La cocción por chorro se puede realizar a una temperatura entre 95-140°C durante aproximadamente 1-15 minutos, preferiblemente durante aproximadamente 3-10 minutos, especialmente alrededor de aproximadamente 5 minutos.

[0031] En una forma de realización preferida, un proceso de la invención comprende, además, antes de la etapa (a), las etapas de:

i) reducción del tamaño de partícula del material que contiene almidón, preferiblemente por molienda seca; ii) formación de un lodo que comprende el material que contiene almidón y agua.

[0032] En una forma de realización preferida, la alfa-amilasa bacteriana deriva del género Bacillus, tal como una cepa de Bacillus stearothermophilus, en particular una variante de una alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, tal como la mostrada en la SEQ ID NO: 3 en WO 99/019467 o la SEQ ID NO: 1 en la presente, en particular una alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus truncada para tener de 485 a 495 aminoácidos, tal como alrededor de 491 aminoácidos.

[0033] En una forma de realización preferida, la alfa-amilasa bacteriana se selecciona del grupo de variantes de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus que comprenden una deleción doble, tal como I181*+G182*, o I181*+G182*+N193F (usando la SEQ iD NO: 1 para la numeración).

[0034] En una forma de realización preferida, la alfa-amilasa bacteriana se selecciona del grupo de variantes de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus:

- I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E;

- 181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S;

- I181*+G182*+N193F V59A Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; y

- I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando la SEQ ID NO: 1 para la numeración).

[0035] La alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus parental puede ser la mostrada en la SEQ ID NO: 1 o puede ser una con una identidad de secuencia con la misma de al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%.

[0036] Una variante de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus puede ser una variante de la mostrada en la SEQ ID NO: 1 o puede ser una con una identidad de secuencia con la misma de al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, pero menos del 100%. En una forma de realización, la variante de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus tiene de 1 a 12 mutaciones, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 mutaciones, en comparación con la alfa-amilasa parental, especialmente la alfa-amilasa parental mostrada en la SEQ ID NO: 1.

[0037] La etapa (a) es seguida de la sacarificación de dextrinas en la etapa (b). Sin embargo, un proceso de la invención puede comprender además una etapa de presacarificación, es decir, después de la etapa (a), pero antes de la etapa de sacarificación (b), realizada durante 40-90 minutos a una temperatura de entre 30-65°C.

[0038] Según la invención, la sacarificación se realiza a una temperatura de 20-75°C, preferiblemente de 40-70°C, tal como alrededor de 60°C, y a un pH entre 4 y 5.

[0039] En una forma de realización preferida, la etapa de fermentación (c) o sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) (es decir, las etapas combinadas (b) y (c)) se realiza a una temperatura de 25°C a 40°C, tal como a partir de 28°C a 35°C, tal como a partir de 30°C a 34°C, preferiblemente alrededor de aproximadamente 32°C. En una forma de realización, la etapa de fermentación (c) o sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) (es decir, las etapas combinadas (b) y (c)) están en curso durante 6 a 120 horas, en particular de 24 a 96 horas. En una forma de realización, la etapa de conversión de material que contiene almidón (a), la etapa de sacarificación (b) y la etapa de fermentación (c) se realizan simultánea o secuencialmente. En una forma de realización, la etapa de conversión de material que contiene almidón (a) se realiza a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial, preferiblemente de 20 a 60°C, tal como 25-40°C, tal como alrededor de 30-34°C, tal como alrededor de 32°C. En una forma de realización, el material que contiene almidón se convierte a dextrinas y las dextrinas se sacarifican a un azúcar tratando el material que contiene almidón con una alfa-amilasa y una glucoamilasa por debajo de la temperatura de gelatinización inicial del material que contiene almidón. En una forma de realización, la conversión del material que contiene almidón a dextrinas, la sacarificación de las dextrinas a azúcares y la fermentación de los azúcares se realizan en una única etapa (es decir, una etapa de hidrólisis de almidón crudo). Cuando el proceso de la invención se realiza como un proceso de hidrólisis de almidón crudo (es decir, un proceso de etapa única o proceso sin cocción), la glucoamilasa puede derivar preferiblemente de una cepa de Trametes, tal como una cepa de Trametes cingulata, o una cepa de Althelia, tal como una cepa de Athelia rolfsii. Las alfa-amilasas preferidas usadas en un proceso de hidrólisis de almidón crudo incluyen alfa-amilasas derivadas de una cepa Rhizomucor, tal como una cepa de Rhizomucor pusillus, tal como una alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con un dominio de unión al almidón (SBD), tal como una alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con un conector y un SBD de la glucoamilasa de Aspergillus niger. Generalmente, el material que contiene almidón en los procesos de hidrólisis de almidón crudo (es decir, procesos sin cocción) es almidón granulado. Se puede reducir el tamaño de partícula de dicho almidón granulado, preferiblemente por molienda, de 0,05 a 3.0 mm, preferiblemente 0,1-0,5 mm. Además, el nivel de azúcar, tal como el nivel de glucosa, se puede mantener por debajo del 6 % en peso, preferiblemente por debajo de aproximadamente el 3 % en peso, preferiblemente por debajo de aproximadamente el 2 % en peso, más preferiblemente por debajo de aproximadamente el 1 % en peso, aún más preferiblemente por debajo de aproximadamente el 0,5%, o aún más preferiblemente del 0,25 % en peso, tal como por debajo de aproximadamente el 0,1 % en peso. El pH puede ser de 4-7, preferiblemente 4,5-6,0, cuando la conversión del material que contiene almidón a dextrinas, la sacarificación de las dextrinas a un azúcar y la fermentación del azúcar se realizan en una etapa única.

[0040] Si el proceso de la invención se realiza como un proceso convencional (es decir, la etapa (a) se realiza como una etapa de licuefacción a una temperatura sobre la temperatura de gelatinización), la enzima generadora de fuentes de carbohidratos usada en la etapa (b) es preferiblemente una glucoamilasa derivada de Aspergillus, preferiblemente A. niger, A. awamori o A. oryzae; o una cepa de Trichoderma, preferiblemente Trichoderma reesei; o una cepa de Talaromyces, preferiblemente Talaromyces emersonii, o una cepa de Pycnoporus, o una cepa de Gloephyllum.

[0041] Ejemplos de otras glucoamilasas adecuadas se pueden encontrar debajo en la sección de "glucoamilasas" a continuación.

[0042] Generalmente, el material que contiene almidón en la etapa (a), incluido el almidón granulado, contiene un 20-55 % en peso de sólidos secos, preferiblemente un 25-40 % en peso de sólidos secos, más preferiblemente un 30-35% de sólidos secos.

[0043] En una forma de realización de la invención, la proteasa está presente en o se añade a la vinaza entera en la etapa (d) y/o la vinaza diluida, en la etapa (e) o después de la separación en la etapa (e), y/o el jarabe en la etapa (e'). La separación (es decir, la deshidratación) en la etapa (e) se puede realizar por centrifugación, preferiblemente usando un decantador centrífugo, filtración, usando preferiblemente un filtro prensa, una prensa de tornillo, una prensa de placas y marcos, un espesador o mesa de espesamiento por gravedad o cualquier otra tecnología de separación conocida en la técnica. En una forma de realización, el material que contiene almidón es un cereal. En una forma de realización, el material que contiene almidón se selecciona del grupo que consiste en maíz, trigo, cebada, mandioca, sorgo, centeno, patata, judías, sorgo, guisantes, arroz, sagú, boniatos, tapioca o cualquier combinación de los mismos.

[0044] El producto de fermentación (deseado) puede, en una forma de realización, seleccionarse del grupo que consiste en alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol, 1,3-propanodiol); ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico, gluconato, ácido láctico, ácido succínico, ácido 2,5-diceto-D-glucónico); cetonas (por ejemplo, acetona); aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico); gases (por ejemplo, H²y CO²), y compuestos más complejos, incluyendo, por ejemplo, antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); y hormonas. En una forma de realización preferida, el producto de fermentación (deseado) es etanol.

[0045] Según la invención, el producto de fermentación deseado se puede recuperar por destilación. Según la invención, se puede recuperar aceite de la vinaza diluida y/o jarabe/fase central evaporada, por ejemplo, por extracción, tal como extracción con hexano.

[0046] En una forma de realización preferida, la proteasa deriva de una cepa de Pyrococcus, preferiblemente una cepa de Pyrococcus furiosus, tal como la mostrada en la SEQ ID NO: 1 en US 6,258,726 o la SEQ ID NO: 4 en la presente. En una forma de realización, la proteasa tiene al menos un 80%, tal como al menos un 85%, tal como al menos un 90%, tal como al menos un 95%, tal como al menos un 96%, tal como al menos un 97%, tal como al menos un 98%, tal como al menos un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4 en la presente.

Separación (deshidratación) de vinaza entera en vinaza diluida y torta húmeda en la etapa (e)

[0047] La separación de vinaza entera en vinaza diluida y torta húmeda en la etapa (e), para eliminar una porción significativa del líquido/agua, se puede realizar usando cualquier técnica de separación adecuada, incluidas la centrifugación, el prensado y la filtración. En una forma de realización preferida, la separación/deshidratación se realiza por centrifugación. Las centrifugadoras preferidas en la industria son las centrifugadoras de tipo decantador, preferiblemente las centrifugadoras de tipo decantador de alta velocidad. Un ejemplo de una centrifugadora adecuada es la serie de cono inclinado nX 400 de Alfa Laval que es un decantador de alto rendimiento. En otra forma de realización preferida, la separación se realiza usando otro equipo de separación convencional tal como unas prensas filtro de placas/marcos, prensas filtro de correa, prensas de tornillo, espesadores y mesas de espesamiento por gravedad, o equipos similares.

Secado de la torta húmeda

[0048] Después de que la torta húmeda, que contiene aproximadamente un 30-35 % en peso de sólidos secos, se haya separado de la vinaza diluida (por ejemplo, deshidratado) se puede secar en un secador de tambor, secador por atomización, secador de anillo, secador de lecho fluido o similar para producir "residuo seco de destilería" (DDG). El DDG es un ingrediente de pienso valioso para el ganado, las aves y los peces. Se prefiere proporcionar DDG con un contenido inferior a aproximadamente un 10-12 % en peso de humedad para evitar el moho y la descomposición microbiana y aumentar el tiempo de conservación. Además, el alto contenido de humedad también hace más costoso transportar el DDG. La torta húmeda se seca preferiblemente bajo condiciones que no desnaturalizan las proteínas en la torta húmeda. La torta húmeda se puede mezclar con jarabe separado de la vinaza diluida y secar en DDG con solubles (DDGS).

Organismos termentadores

[0049] Los ejemplos de organismos termentadores usados en la etapa (c) para fermentar azúcares en un medio de fermentación en un producto de fermentación deseado incluyen organismos fúngicos, tal como especialmente levadura. La levadura preferida incluye cepas de Saccharomyces spp., en particular, Saccharomyces cerevisiae.

[0050] En una forma de realización, el organismo fermentador se añade al medio de fermentación, de modo que el recuento por ml de organismo fermentador viable, tal como levadura, del medio de fermentación está en el rango de 105 a 1012, preferiblemente de 107 a 1010, especialmente aproximadamente 5x107.

[0051] La levadura disponible comercialmente incluye, por ejemplo, levadura RED STAR™ y ETHANOL RED^ (disponibles de Fermentis/Lesaffre, EE.UU.), FALI (disponible de Fleischmann's Yeast, EE.UU.), levadura fresca SUPERSTART y THERMOSACC™ (disponibles de Ethanol Technology, WI, EE.UU.), BIOFERM AFT y XR (disponibles de NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, EE.UU.), GERT STRAND (disponible de Gert Strand AB, Suecia), y FERMIOL (disponible de DSM Specialties).

Materiales que contienen almidón

[0052] Cualquier material que contiene almidón adecuado se puede usar según la presente invención. El material de partida se selecciona generalmente en función del producto de fermentación deseado. Ejemplos de materiales que contienen almidón, adecuados para usar en un proceso de la invención, incluyen granos enteros, maíz, trigo, cebada, centeno, sorgo, sagú, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, guisantes, judías, o boniatos, o mezclas de los mismos o almidones derivados de los mismos, o cereales. También se contemplan tipos cerosos y no cerosos de maíz y cebada.

Productos de fermentación

[0053] El término "producto de fermentación" significa un producto producido por un proceso que incluye una etapa de fermentación usando un organismo fermentador. Los productos de fermentación contemplados según la invención incluyen alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol); ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido succínico, ácido glucónico); cetonas (por ejemplo, acetona); aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico); gases (por ejemplo, H²y CO²); antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); y hormonas. En una forma de realización preferida, el producto de fermentación es etanol, por ejemplo, etanol combustible; etanol potable, es decir, bebidas espirituosas neutras potables; o etanol industrial o productos usados en la industria del alcohol consumible (por ejemplo, cerveza y vino), la industria láctea (por ejemplo, productos lácteos fermentados), la industria del cuero y la industria del tabaco. Los tipos de cerveza preferidos incluyen cervezas ale, cervezas stout, cervezas porter, cervezas lager, bíteres, licores de malta, cervezas happoushu, cerveza con alto contenido de alcohol, cerveza baja en alcohol, cerveza baja en calorías o cerveza ligera. Los procesos de fermentación preferidos usados incluyen procesos de fermentación alcohólica. El producto de fermentación, tal como el etanol, obtenido según la invención, puede preferiblemente usarse como combustible, que se mezcla típicamente con gasolina. Sin embargo, en el caso del etanol también se puede usar como etanol potable.

Recuperación

[0054] Después de la fermentación, el producto de fermentación, tal como el etanol, se puede separar del medio de fermentación, por ejemplo, por destilación. Alternativamente, el producto de fermentación deseado puede extraerse del medio de fermentación por técnicas de microfiltración o filtración con membrana. El producto de fermentación también se puede recuperar por arrastre con vapor u otro método bien conocido en la técnica.

ENZIMAS

[0055] Una o más de las siguientes actividades enzimáticas se pueden usar según la invención.

Proteasas

[0056] Según la invención, una proteasa termoestable (como se define en la presente) puede estar presente o añadirse durante las etapas (d)-(e').

[0057] La proteasa puede ser de cualquier origen siempre y cuando tenga un valor de termoestabilidad tal y como se define en la presente de más del 20% y el ejemplo 1. En una forma de realización, la proteasa es de origen fúngico. En otra forma de realización, la proteasa es de origen bacteriano. Según la invención, la proteasa tiene una termoestabilidad de más del 50%, más del 60%, más del 70%, más del 80%, más del 90%, más del 100%, tal como más del 105%, tal como más del 110%, tal como más del 115%, tal como más del 120% determinada como actividad relativa a 80°C/70°C.

[0058] En otra forma de realización, la proteasa tiene un valor de termoestabilidad entre 50 y 115%, tal como entre 50 y 70%, tal como entre 50 y 60%, tal como entre 100 y 120%, tal como entre 105 y 115%, determinado como actividad relativa a 80°C/70°C.

Proteasas bacterianas

[0059] En una forma de realización, la proteasa es de origen bacteriano.

[0060] En una forma de realización preferida, la proteasa deriva de una cepa de Pyrococcus, preferiblemente una cepa de Pyrococcus furiosus.

[0061] En una forma de realización preferida, la proteasa es la mostrada en la SEQ ID NO: 1 en US 6,258,726 o la SEQ ID NO: 4 en la presente.

[0062] Según la invención, la proteasa tiene al menos un 80%, tal como al menos un 85%, tal como al menos un 90%, tal como al menos un 95%, tal como al menos un 96%, tal como al menos un 97%, tal como al menos un 98%, tal como al menos un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 en US 6,258,726 o la SEQ ID NO:

4 en la presente.

[0063] En una forma de realización, la proteasa está presente y/o se añade en una cantidad eficaz en la etapa (a) o cualquiera de las etapas (d)-(e'). En una forma de realización de la invención, la proteasa se añade en una concentración de 0,01-100, tal como 0,1-10 micro g/g DS.

Alfa-amilasas

[0064] El método de la invención, incluida la etapa (a), se puede realizar usando cualquier alfa-amilasa adecuada.

En una forma de realización preferida, se puede usar una alfa-amilasa bacteriana y/o una alfa-amilasa fúngica.

[0065] En una forma de realización, la alfa-amilasa es bacteriana cuando la etapa (a) se realiza como una etapa de licuefacción a altas temperaturas, es decir, por encima de la temperatura de gelatinización inicial,

[0066] En una forma de realización, la alfa-amilasa es fúngica cuando la etapa (a) se realiza a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial, tal como cuando las etapas (a), (b) y (c) se realizan como una hidrólisis de almidón crudo (proceso de etapa única o proceso sin cocción) como se ha descrito anteriormente.

Alfa-amilasas bacterianas

[0067] Ejemplos de alfa-amilasas bacterianas adecuadas incluyen las mencionadas a continuación. Las alfaamilasas bacterianas preferidas usadas en la etapa (a) pueden derivar de una cepa el género Bacillus (a veces denominado Geobacillus), incluida una cepa de Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus stearothermophilus o Bacillus subtilis. Otras alfa-amilasas bacterianas incluyen una alfa-amilasa derivada de una cepa de las Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 o DSM 9375, todas las cuales se describen en detalle en WO 95/26397, y la alfa-amilasa descrita por Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), págs. 25-31.

[0068] La alfa-amilasa de Bacillus también puede ser una variante y/o un híbrido, especialmente una descrita en cualquiera de WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO 99/19467, WO 00/60059 y WO 02/10355. Se describen variantes de alfa-amilasa específicamente contempladas en las patentes de EE.UU. Nos. 6,093,562, 6,297,038 o la patente de EE.UU. n.° 6,187,576 e incluyen variantes de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus (alfa-amilasa BSG) con una deleción de uno o dos aminoácidos en las posiciones R179 a G182, preferiblemente una deleción doble descrita en WO 1996/023873 -véase, por ejemplo, la página 20, líneas 1-10, preferiblemente correspondiente a delta(181 -182) en comparación con la secuencia de aminoácidos de la alfaamilasa BSG de tipo salvaje expuesta en la SEQ ID NO: 3 descrita en WO 99/19467 o la deleción de los aminoácidos R179 y G180 usando la SEQ ID NO: 3 en WO 99/19467 para la numeración. Aún más preferidas son las alfa-amilasas de Bacillus, especialmente la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, que tienen una deleción doble correspondiente a delta(181-182) y además comprenden una sustitución N193F (también denominada I181* G182* N193F) en comparación con la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa BSG de tipo salvaje expuesta en la Se Q ID NO: 3 descrita en WO 99/19467.

[0069] En una forma de realización, la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus es una descrita en WO 2011/082425, tal como una seleccionada del grupo de:

- I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E;

- I181*+G182*+N 193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S;

- 1181 *+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V; y

- I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando la SEQ ID NO: 1 en la presente para la numeración).

[0070] En una forma de realización, la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus tiene las mutaciones siguientes: 181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V (SEQ ID NO: 1).

[0071] La alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus truncada se trunca por lo general naturalmente para tener aproximadamente 491 aminoácidos de largo, tal como de 485 a 495 aminoácidos de largo.

[0072] Una alfa-amilasa híbrida específicamente contemplada comprende 445 residuos de aminoácidos C-terminales de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (mostrada en la SEQ ID NO: 4 de WO 99/19467) y los 37 residuos de aminoácidos N-terminales de la alfa-amilasa derivada de Bacillus amyloliquefaciens (mostrada en la SEQ ID NO: 5 de WO 99/19467), con la siguiente sustitución: G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S (usando la numeración de la SEQ ID NO: 4 en WO 99/19467). Especialmente preferidas son las variantes que tienen una o más de las mutaciones H154Y, A181T, N190F, A209V y Q264S y/o una deleción de dos residuos entre las posiciones 176 y 179, preferiblemente la deleción de E178 y G179 (usando la numeración de la SEQ ID NO: 5 de WO 99/19467).

[0073] Los productos de alfa-amilasa bacteriana disponibles comercialmente y los productos que contienen alfaamilasas incluyen TERMAMYL™ SC, LIQUOZYME™ SC, BAN (Novozymes A/S, Dinamarca) DEX-LO™, SPEZYME™ XTRA, SPEZYME™ AA, SPEZYME FRED-L, SPEZYME™ ALPHA, GC358, SPEZYME RSL, SPEZYME HPA y SPEZYME™ DELTA AA (de DuPont, EE.UU.), FUELZYME™ (Verenium, EE.UU.).

[0074] Una alfa-amilasa bacteriana se puede añadir en la etapa (a) en cantidades bien conocidas en la técnica. Cuando se mide en unidades KNU (descritas abajo en la sección "materiales y métodos"), la actividad de alfaamilasa está preferiblemente presente en una cantidad de 0,5-5.000 NU/g DS, en una cantidad de 1-500 NU/g DS, o más preferiblemente en una cantidad de 5-1.000 NU/g DS, tal como 10-100 NU/g DS.

Alfa-amilasas fúngicas

[0075] Las alfa-amilasas fúngicas (EC 3.2.1.1) son preferiblemente de origen de hongo filamentoso. La alfa-amilasa fúngica puede ser una alfa-amilasa fúngica ácida.

[0076] Las alfa-amilasas fúngicas ácidas incluyen alfa-amilasas ácidas derivadas de una cepa del género Aspergillus, tal como alfa-amilasas de Aspergillus oryzae y Aspergillus niger.

[0077] Una alfa-amilasa fúngica preferida es una alfa-amilasa similar a Fungamyl que deriva preferiblemente de una cepa de Aspergillus oryzae. En la presente descripción, el término "alfa-amilasa similar a Fungamyl" indica una alfa-amilasa que presenta una alta identidad, es decir, más del 70%, más del 75%, más del 80%, más del 85% más del 90%, más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98%, más del 99% o incluso el 100% de identidad con la parte madura de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 10 en WO 96/23874.

[0078] Otra alfa-amilasa ácida preferida deriva de una cepa de Aspergillus niger. En una forma de realización preferida, la alfa-amilasa fúngica ácida es la de A. niger divulgada como "AMYA_ASPNG" en la base de datos Swiss-prot/TeEMBL bajo el n.° de acceso primario P56271 y descrita con más detalle en WO 89/01969 (ejemplo 3). La alfa-amilasa ácida de Aspergillus niger se muestra también como la SEQ ID NO: 1 en WO 2004/080923 (Novozymes). Además, se contemplan las variantes de dicha amilasa fúngica ácida con al menos un 70% de identidad, tal como al menos un 80% o incluso al menos un 90% de identidad, tal como al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad con la SEQ ID NO: 1 en WO 2004/080923. Una alfa-amilasa fúngica ácida adecuada disponible comercialmente derivada de Aspergillus niger es SP288 (disponible de Novozymes A/S, Dinamarca).

[0079] La alfa-amilasa fúngica ácida también puede ser una enzima de tipo salvaje que comprende un módulo de unión a carbohidratos (CBM) y un dominio catalítico de alfa-amilasa (es decir, una no híbrida), o una variante de la misma. En una forma de realización, la alfa-amilasa fúngica ácida de tipo salvaje deriva de una cepa de Aspergillus kawachii.

[0080] Composiciones disponibles comerciales que comprenden alfa-amilasa fúngica incluyen FUNGAMYL™ y la alfa-amilasa fúngica ácida vendida bajo el nombre comercial SP288 (disponible de Novozymes A/S, Dinamarca).

[0081] En una forma de realización, la alfa-amilasa ácida fúngica es una alfa-amilasa híbrida. Ejemplos preferidos de alfa-amilasas fúngicas híbridas incluyen aquellas descritas en WO 2005/003311 o la publicación de patente de EE.UU. n.° 2005/0054071 (Novozymes) o la publicación de patente de EE.UU. n.° 2006/0148054 o la solicitud de patente de EE.UU. n.° 60/638,614 (Novozymes). Una alfa-amilasa híbrida puede comprender un dominio catalítico (CD) de alfa-amilasa y un dominio/módulo de unión a carbohidratos (CBM), tal como un dominio de unión al almidón, y opcionalmente un conector.

[0082] Ejemplos específicos de alfa-amilasas híbridas contempladas incluyen aquellas descritas en la tabla 1 a 5 de los ejemplos en la solicitud de patente de EE.UU. también pendiente n.° 60/638,614, incluyendo la variante de Fungamyl con el dominio catalítico JA118 y el SBD de Athelia rolfsii (SEQ ID NO: 2 en la presente y SEQ ID NO: 100 en US 60/638,614), la alfa-amilasa de Rhizomucorpusillus con el conector y el SBD de la AMG de Athelia rolfsii (SEQ ID NO: 3 en la presente y SEQ ID NO: 101 en u S 60/638,614), la alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con el conector y el SBD de la glucoamilasa de Aspergillus niger (que se describe en la tabla 5 como una combinación de las secuencias de aminoácidos SEQ ID n O: 20, SEQ ID No : 72 y SEQ ID NO:96 en la solicitud de EE.UU. n.° 11/316,535 y además como la SEQ ID NO: 13 en la presente), y la alfa-amilasa de Meripilus giganteus con el conector y el SBD de la glucoamilasa de Athelia rolfsii (SEQ ID No : 4 en la presente y s Eq ID NO: 102 en US 60/638,614). Otras alfa-amilasas híbridas específicamente contempladas son cualquiera de aquellas enumeradas en las tablas 3, 4, 5 y 6 en el ejemplo 4 en la solicitud de EE.UU. n.° 11/316,535 o (WO 2006/069290). Otros ejemplos específicos de alfa-amilasas híbridas contempladas incluyen aquellas descritas en la publicación de patente de EE.UU. n.° 2005/0054071, incluyendo aquellas descritas en la tabla 3 en la página 15, tal como la alfaamilasa de Aspergillus niger con un conector y un dominio de unión al almidón de Aspergillus kawachii. Se pueden añadir alfa-amilasas ácidas según la invención en una cantidad de 0,1 a 10 AFAU/g DS, preferiblemente de 0,10 a 5 AFAU/g DS, especialmente de 0,3 a 2 AFAU/g DS.

[0083] Se pueden añadir alfa-amilasas fúngicas a la etapa (a) en una cantidad eficaz bien conocida, preferiblemente en el rango de 0,001-1 mg de proteína enzimática por g de DS (en la vinaza entera), preferiblemente 0,01-0,5 mg de proteína enzimática por g de DS.

Enzima generadora de fuentes de carbohidratos

[0084] Según la invención, una enzima generadora de fuentes de carbohidratos, preferiblemente una glucoamilasa, puede estar presente y/o se puede añadir durante la etapa de sacarificación (b) o la sacarificación y fermentación simultáneas.

[0085] El término "enzima generadora de fuentes de carbohidratos" incluye cualquier enzima generadora de azúcares fermentables. Una enzima generadora de fuentes de carbohidratos es capaz de producir un carbohidrato que puede ser usada como una fuente de energía por el organismo fermentador/los organismos fermentadores en cuestión, por ejemplo, cuando se usa en un proceso de la invención para producir un producto de fermentación, tal como el etanol. Los carbohidratos generados se pueden convertir directa o indirectamente al producto de fermentación deseado, preferiblemente etanol. Según la invención, puede usarse una mezcla de enzimas generadoras de fuentes de carbohidratos. Los ejemplos específicos incluyen glucoamilasa (que son generadoras de glucosa), beta-amilasa y amilasa maltogénica (que son generadoras de maltosa).

[0086] En una forma de realización preferida, la enzima generadora de fuentes de carbohidratos es una glucoamilasa.

Glucoamilasas

[0087] El proceso de la invención, incluyendo la etapa (b), se puede realizar usando cualquier glucoamilasa adecuada. En una forma de realización preferida, la glucoamilasa es de origen bacteriano o fúngico.

[0088] Las glucoamilasas contempladas incluyen aquellas del grupo que consiste en glucoamilasas de Aspergillus, en particular la glucoamilasa G1 o G2 de A. niger (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102), o variantes de las mismas, tal como las descritas en WO 92/00381, WO 00/04136 y WO 01/04273 (de Novozymes, Dinamarca); la glucoamilasa de A. awamori descrita en WO 84/02921, la glucoamilasa de A. oryzae (Agrie. Biol. Chem. (1991), 55 (4), p. 941-949), o variantes o fragmentos de las mismas. Otras variantes de glucoamilasa de Aspergillus incluyen variantes con una termoestabilidad mejorada: G137A y G139A (Chen et al. (1996), Prot. Eng. 9, 499-505); D257E y D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Eng. 8, 575-582); N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301,275-281); enlaces de disulfuro, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35, 8698-8704; y la introducción de residuos de Pro en la posición A435 y S436 (Li et al. (1997), Protein Eng. 10, 1199-1204.

[0089] Otras glucoamilasas contempladas incluyen la glucoamilasa derivada de una cepa de Athelia, preferiblemente una glucoamilasa de una cepa de Athelia rolfsii (previamente denominada Corticium rolfsii) (véase la patente de EE.UU. n.° 4,727,026 y (Nagasaka, Y. et al. (1998) "Purification and properties of the raw-starchdegrading glucoamylases from Corticium rolfsii", Appl Microbiol Biotechnol 50: 323-330), glucoamilasas de Talaromyces, en particular derivadas de Talaromyces emersonii (WO 99/28448), Talaromyces leycettanus (patente de EE.UU. n.° Re. 32,153), Talaromyces duponti, Talaromyces thermophilus (patente de EE.UU. n.° 4,587,215). También contempladas son las glucoamilasas de Trichoderma reesei divulgadas como la SEQ ID NO: 4 en WO 2006/060062 y glucoamilasas que son al menos un 80% o al menos un 90% idénticas a las mismas y además la glucoamilasa derivada de Humicola grisea divulgada como la SEQ ID NO: 3 en US 10/992,187 o secuencias que tienen al menos un 80% o al menos un 90% de identidad con la misma.

[0090] En una forma de realización preferida, la glucoamilasa deriva de una cepa de Aspergillus, preferiblemente A. niger, A. awamori o A. oryzae; o una cepa de Trichoderma, preferiblemente T. reesei; o una cepa de Talaromyces, preferiblemente T. emersonii.

[0091] En una forma de realización, la glucoamilasa presente y/o añadida durante la sacarificación y/o la fermentación es de origen fúngico, preferiblemente de una cepa de Pycnoporus, o una cepa de Gloephyllum.

[0092] En una forma de realización, la glucoamilasa deriva de una cepa del género Pycnoporus, en particular una cepa de Pycnoporus sanguineus descrita en WO 2011/066576 (SEQ ID NO 2, 4 o 6), tal como la mostrada como SEQ ID NO: 4 en WO 2011/066576 o SEQ ID NO: 18 en la presente.

[0093] En una forma de realización, la glucoamilasa deriva de una cepa del género Gloeophyllum, tal como una cepa de Gloeophyllum sepiarium o Gloeophyllum trabeum, en particular una cepa de Gloeophyllum como se describe en w O 2011/068803 (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16). En una forma de realización preferida, la glucoamilasa es la Gloeophyllum sepiarium mostrada en la SEQ ID n O: 2 en WO 2011/068803 o la Se Q ID NO: 15 en la presente.

[0094] Otras glucoamilasas contempladas incluyen la glucoamilasa derivada de una cepa de Trametes, preferiblemente una cepa de Trametes cingulata descrita en WO 2006/069289. Además, se contemplan glucoamilasas híbridas según la invención. Ejemplos son las glucoamilasas híbridas descritas en WO 2005/045018. Los ejemplos específicos incluyen la glucoamilasa híbrida divulgada en las tablas 1 y 4 del ejemplo 1.

[0095] Las glucoamilasas bacterianas contempladas incluyen glucoamilasas del género Clostridium, en particular C. thermoamylolyticum (EP 135,138) y C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831).

[0096] Composiciones disponibles comercialmente que comprenden glucoamilasa incluyen AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U y AMG™ E (de Novozymes A/S); OPTIDEX™ 300 (de Genencor Int ); AMIGASE™ y AMIGASE™ PLUS (de DSM); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ y G990 ZR (de Genencor Int ).

[0097] Pueden añadirse glucoamilasas, en una forma de realización, en una cantidad de 0,02-20 AGU/g DS, preferiblemente 0,05-5 AGU/g DS (en la vinaza entera), especialmente entre 0,1-2 AGU/g DS.

[0098] La glucoamilasa se puede añadir en una cantidad eficaz, preferiblemente en el rango de 0,001-1 mg de proteína enzimática por g de DS, preferiblemente 0,01-0,5 mg de proteína enzimática por g de sustrato seco.

MATERIALES Y MÉTODOS

Enzimas:

[0099] Alfa-amilasa LSCDS ("LSCDS"): alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus con las mutaciones: I181*+G182*+N193F truncada en 491 aminoácidos (SEQ ID NO: 1 en la presente).

[0100] Alfa-amilasa 369: (AA369): alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus con las mutaciones: I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V truncada en 491 aminoácidos (SEQ ID NO: 1 en la presente).

[0101] Proteasa TA ("TA"): metaloproteasa derivada de Termoascus aurantiacus CGMCC n.° 0670 divulgada como los aminoácidos 1-177 en la SEQ ID NO: 3 en la presente

[0102] Proteasa 196 ("TA 196"): metaloproteasa derivada de Termoascus aurantiacus CGMCC n.° 0670 divulgada como los aminoácidos 1-177 en la SEQ ID NO: 3 en la presente con las mutaciones siguientes: A27K+D79L Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L.

[0103] Proteasa PF ("PF"): proteasa derivada de la bacteria Pyrococcus furiosus mostrada en la SEQ ID NO: 4 en la presente.

[0104] Proteasa RH ("RH"): proteasa derivada de un hongo filamentoso Rhizomucor miehei mostrada en la SEQ ID NO: 9 en la presente.

[0105] Proteasa TF ("TF"): proteasa derivada de un hongo filamentoso Thermobifida fusca mostrada en la SEQ ID NO: 10 en la presente.

[0106] La glucoamilasa SF es una glucoamilasa derivada de una cepa de Talaromyces emersonii y se divulga en WO9928448 y está disponible de Novozymes A/S.

[0107] La glucoamilasa TC es una glucoamilasa derivada de Trametes cingulata divulgada en la SEQ ID NO: 2 de WO 2006/069289 y disponible de Novozymes A/S.

[0108] La alfa-amilasa JA es una alfa-amilasa derivada de Rhizomucor pusillus y divulgada como V039 en la tabla 5 en WO 2006/069290.

Determinación de la actividad de alfa-amilasa

1. Ensayo de Phadebas™

[0109] La actividad de la alfa-amilasa se determina por un método utilizando comprimidos de Phadebas® como sustrato. Los comprimidos de Phadebas (prueba de amilasa de Phadebas®, suministrada por Pharmacia Diagnostic) contienen un polímero reticulado de almidón de color azul insoluble, que se ha mezclado con albúmina de suero bovino y una sustancia tamponadora y en comprimidos.

[0110] Para cada medición se suspende un comprimido en un tubo que contiene 5 ml de 50 mM de tampón Britton-Robinson (50 mM de ácido acético, 50 mM de ácido fosfórico, 50 mM de ácido bórico, 0,1 mM de CaCl², pH ajustado al valor de interés con NaOH). La prueba se realiza en un baño maría a la temperatura de interés. La alfa-amilasa que se va a evaluar se diluye en x ml de 50 mM de tampón Britton-Robinson. Se añade 1 ml de esta solución de alfa-amilasa a 5 ml de 50 mM de tampón Britton-Robinson. El almidón es hidrolizado por la alfa-amilasa dando fragmentos azules solubles. La absorbancia de la solución azul resultante, medida espectrofotométricamente a 620 nm, es una función de la actividad de alfa-amilasa.

[0111] Es importante que la absorbancia medida a 620 nm después de 10 o 15 minutos de incubación (tiempo de prueba) esté en el rango de 0,2 a 2,0 unidades de absorbancia. En este rango de absorbancia hay linealidad entre la actividad y la absorbancia (ley de Lambert-Beer). La dilución de la enzima debe por lo tanto ajustarse para cumplir este criterio. Bajo un conjunto específico de condiciones (temperatura, pH, tiempo de reacción, condiciones de tampón), 1 mg de una alfa-amilasa dada hidrolizará una cierta cantidad de sustrato y se producirá un color azul. La absorbancia medida es directamente proporcional a la actividad específica (actividad/mg de proteína de alfaamilasa pura) de la alfa-amilasa en cuestión bajo el conjunto dado de condiciones.

2. Método alternativo

[0112] La actividad de alfa-amilasa se determina alternativamente por un método que utiliza el sustrato PNP-G7. El PNP-G7, que es una abreviatura para p-nitrofenil-alfa,D-maltoheptaósido, es un oligosacárido bloqueado que puede ser escindido por una endoamilasa. Después de la escisión, la alfa-glucosidasa incluida en el kit digiere el sustrato para liberar una molécula de PNP libre que tiene un color amarillo y así se puede medir por espectrofotometría visible a longitud de onda Lambda = 405 nm (400-420 nm). Los kits que contienen el sustrato PNP-G7 y alfaglucosidasa son fabricados por Bohringer-Mannheim (n.° cat. 1054635).

[0113] Para preparar el sustrato, se añade una botella de sustrato (BM 1442309) a 5 ml de tampón (BM1442309). Para preparar la alfa-glucosidasa, se añade una botella de alfa-glucosidasa (BM 1462309) a 45 ml de tampón (BM1442309). La solución de trabajo se hace mezclando 5 ml de solución de alfa-glucosidasa con 0,5 ml de sustrato.

[0114] El ensayo se realiza transformando 20 microL de solución enzimática en una placa de microtitulación de 96 pocillos e incubando a 25°C. Se añaden 200 microL de solución de trabajo, 25°C. La solución se mezcla y se preincuba 1 minuto y se mide la absorción cada 15 segundos a lo largo de 3 minutos a DO 405 nm.

[0115] La pendiente de la curva de absorción dependiente del tiempo es directamente proporcional a la actividad específica (actividad por mg de enzima) de la alfa-amilasa en cuestión bajo el conjunto dado de condiciones.

Determinación de la actividad amilolítica ácida (FAU)

[0116] Una unidad de alfa-amilasa fúngica (1 FAU) se define como la cantidad de enzima que descompone 5,26 g de almidón (Merck Amylum solubile Erg. B.6, lote 9947275) por hora con el método estándar de Novozymes para la determinación de alfa-amilasa en base a las condiciones estándar siguientes:

Sustrato Almidón soluble

Temperatura 37°C

pH 4,7

Tiempo de reacción 7-20 minutos

[0117] Una descripción detallada del método de Novozymes para la determinación de KNU y FAU está disponible previa solicitud como método estándar EB-SM-0009.02/01.

Determinación de la actividad de alfa-amilasa ácida (AFAU)

[0118] La actividad de alfa-amilasa ácida se mide en AFAU (unidades de alfa-amilasa fúngica ácida), que se determinan con respecto a un patrón de enzima.

[0119] El patrón usado es AMG 300 L (AMG G1 de A. niger de tipo salvaje vendida por Novozymes A/S). La alfaamilasa neutra en esta AMG disminuye después del almacenamiento a temperatura ambiente durante 3 semanas de aprox. 1 FAU/ml a por debajo de 0,05 FAU/ml.

[0120] La actividad de alfa-amilasa ácida en este patrón de AMG se determina de acuerdo al AF 9 1/3 (método Novo para la determinación de alfa-amilasa fúngica). En este método, 1 AFAU se define como la cantidad de enzima que degrada 5,260 mg de materia seca de almidón por hora bajo condiciones estándar.

[0121] El yodo forma un complejo azul con el almidón, pero no con sus productos de degradación. La intensidad de color es por lo tanto directamente proporcional a la concentración de almidón. La actividad de amilasa se determina usando colorimetría inversa como una reducción en la concentración de almidón bajo condiciones analíticas específicas.

Alfa-amilasa

Almidón Yodo -» Dextrinas Oligosacáridos

40°C, pH 2,5

Azul/violeta t = 23 s. Decoloración

Condiciones estándar/condiciones de reacción: (por minuto)

Sustrato: almidón, aprox. 0,17 g/l

Tampón: Citrato, aprox.0,03 M

Yodo (I²): 0,03 g/l

CaCl²: 1,85 mM

pH: 2,50 ± 0,05

Temperatura de incubación: 40°C

Tiempo de reacción: 23 segundos

Longitud de onda: Lambda = 590 nm

Concentración de enzima: 0,025 AFAU/ml

Rango de trabajo de la enzima: 0,01-0,04 AFAU/ml

[0122] Se pueden encontrar detalles adicionales en el documento del método estándar EB-SM-0259.02/01 disponible previa solicitud de Novozymes A/S.

Determinación de FAU-F

[0123] Las unidades de alfa-amilasa fúngica FAU-F (Fungamyl) se miden con respecto a un patrón de enzima de una fuerza declarada.

[0124] Una carpeta (EB-SM-0216.02) que describe este método estándar con más detalle está disponible previa solicitud de Novozymes A/S, Dinamarca.

Actividad de alfa-amilasa (KNU)

[0125] La actividad de alfa-amilasa puede determinarse usando almidón de patata como sustrato. Este método se basa en la descomposición de almidón de patata modificado por la enzima, y la reacción es seguida de la mezcla de las muestras de la solución de almidón/enzima con una solución de yodo. Inicialmente, se forma un color azul negruzco, pero durante la descomposición del almidón, el color azul se debilita y se vuelve gradualmente de un marrón rojizo, que se compara con un patrón de vidrio coloreado.

[0126] Una unidad kilo Novo de alfa amilasa (KNU) se define como la cantidad de enzima que, bajo condiciones estándar (es decir, a 37°C /- 0,05; 0,0003 M de Ca2+; y pH 5,6) dextriniza 5260 mg de sustancia seca de almidón Merck Amylum soluble.

[0127] Una carpeta EB-SM-0009.02/01 que describe este método analítico con más detalle está disponible previa solicitud a Novozymes A/S, Dinamarca.

Actividad de glucoamilasa y alfa-glucosidasa (AGU)

[0128] La unidad Novo de glucoamilasa (AGU) se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto bajo las condiciones estándar 37°C, pH 4,3, sustrato: maltosa 23,2 mM, tampón: acetato 0,1 M, tiempo de reacción 5 minutos.

[0129] Se puede usar un sistema autoanalizador. Se añade mutarrotasa al reactivo de glucosa deshidrogenasa de modo que cualquier alfa-D-glucosa presente se convierta en beta-D-glucosa. La glucosa deshidrogenasa reacciona específicamente con la beta-D-glucosa en la reacción mencionada antes, formando NADH que se determina usando un fotómetro a 340 nm como una medida de la concentración de glucosa original.

Incubación de AMG:

Reacción de color:

[0130] Una carpeta (EB-SM-0131.02/01) que describe este método analítico con más detalle está disponible previa solicitud a Novozymes A/S, Dinamarca.

Determinación de la actividad de proteasa (AU)

[0131] La dimetilcaseína (DMC) es hidrolizada por la enzima proteolítica en pequeños péptidos. Los grupos amino primarios formados en este proceso reaccionan con el ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) formando un complejo coloreado. Este desarrollo de color se monitorea in situ para poder calcular el cambio en la absorción por unidad de tiempo. Esta figura es una medida de la velocidad de reacción y, por tanto, de la actividad enzimática.

La actividad se determina con respecto a un patrón de enzima.

[0132] El ensayo se describe posteriormente en el documento del método estándar EB-SM-0218.02/02 disponible previa solicitud de Novozymes A/S, Dinamarca.

Actividad relativa y actividad residual

[0133] La "actividad relativa" y la "actividad residual" se determinan como se describe en el ejemplo 1.

Termoestabilidad

[0134] La termoestabilidad en el ejemplo 2 se determina usando el ensayo de zeína-BCA.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Preparación de variantes de proteasa y prueba de termoestabilidad

[0135] Los productos químicos usados fueron productos comerciales de al menos calidad reactiva.

Cepas y plásmidos:

[0136] Se usó E. coli DH12S (disponible de Gibco BRL) para el rescate de plásmido de levadura. pJTP000 es un vector transportador de S. cerevisiae y E. coli bajo control del promotor TPI, construido a partir de pJC039 descrito en WO 01/92502, donde se ha insertado el gen de la proteasa M35 de Thermoascus aurantiacus (WO 03/048353).

[0137] Se usaron células competentes de Saccharomyces cerevisiae YNG318: MATa Dpep4[cir+] ura3-52, leu2-D2, his 4-539 para la expresión de variantes de proteasa. Se describe en J. Biol. Chem. 272(15): 9720-9727 (1997).

Medios y sustratos

[0138] 10X solución basal: base nitrogenada de levadura sin aminoácidos (DIFCO) 66,8 g/L, succinato 100 g/l, NaOH 60 g/l.

[0139] SC-glucosa: 100 ml/l de glucosa al 20% (es decir, una concentración final del 2% = 2 g/100 ml)), 4 ml/l de treonina al 5%, 10 ml/l triptófano al 1%, 25 ml/l de casaminoácidos al 20%, 100 ml/l de solución basal 10 X. La solución se esteriliza usando un filtro de un tamaño de poro de 0,20 micrómetros. Agar (al 2%) y H²O (aprox. 761 ml) se autoclavan juntos, y la solución de SC-glucosa esterilizada por separado se añade a la solución de agar.

[0140] YPD: 20 g/l de peptona Bacto, 10 g/l de extracto de levadura, 100 ml/l de glucosa al 20 %.

[0141] YPD+Zn: YPD 0,25 mM de ZnSO4

[0142] Solución de PEG/LiAc: 50 ml de PEG4000 al 40 %, 1 ml de 5 M de acetato de litio.

Placa de microtitulación de 96 pocillos de zeína:

[0143] Cada pocillo contiene 200 microL de 0,05-0,1 % de zeína (Sigma), 0,25 mM de ZnSO4 y 1 % de agar en 20 mM de tampón de acetato sódico, pH 4,5.

Manipulaciones de ADN

[0144] A menos que se indique lo contrario, las manipulaciones y transformaciones de ADN se realizaron usando métodos estándar de biología molecular como se describe en Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab. Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R. y Cutting, S. M. (eds.).

Transformación de levadura

[0145] La transformación de levadura se realizó usando el método del acetato de litio. Se mezclan 0,5 microL de vector (digerido por endonucleasas de restricción) y 1 microL de fragmentos de la PCR. La mezcla de ADN, 100 microL de células competentes YNG318 y 10 microL de ADN portador YEAST MAKER (Clontech) se añaden a un tubo de polipropileno de 12 ml (Falcon 2059). Añadir 0,6 ml de solución de PEG/LiAc y mezclar suavemente. Incubar durante 30 min a 30°C y 200 r.p.m. seguido de 30 min a 42°C (choque térmico). Transferir a un tubo de Eppendorf y centrifugar durante 5 s. Eliminar el sobrenadante y redisolver en 3 ml de YPD. Incubar la suspensión celular durante 45 min a 200 r.p.m. a 30°C. Echar la suspensión a placas de SC-glucosa e incubar a 30°C durante 3 días para que crezcan colonias. El ADN total de levadura se extrae con el kit Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep (ZYMO research).

Secuenciación del ADN

[0146] La transformación de E. coli para la secuenciación del ADN se efectuó por electroporación (BIO-RAD Gene Pulser). Los plásmidos de ADN se prepararon por el método alcalino (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor) o con el kit Qiagen® Plasmid. Los fragmentos de a Dn se recuperaron del gel de agarosa por el kit de extracción de gel Qiagen. La PCR se realizó usando un PTC-200 DNA Engine. El analizador genético ABI PRISMTM 310 se usó para la determinación de todas las secuencias de ADN.

Construcción del vector de expresión de proteasa

[0147] El gen de la proteasa M35 de Themoascus se amplificó con el par de cebadores Prot F (SEQ ID NO: 5) y Prot R (SEQ ID NO: 6). Los fragmentos de la PCR resultantes se introdujeron en S. cerevisiae YNG318 junto con el vector pJC039 (descritos en WO 2001/92502) digeridos con enzimas de restricción para eliminar el gen de la cutinasa de Humicola insolens.

[0148] El plásmido en los clones de levadura en placas de SC-glucosa se recuperó para confirmar la secuencia interna y se denominó pJTP001.

Construcción de genoteca de levadura y variantes dirigidas al sitio

[0149] Se construyeron una genoteca en levadura y variantes dirigidas al sitio por el método de PCR SOE (Splicing by Overlap Extension, véase "PCR: A practical approach", p. 207-209, Oxford University Press, eds. McPherson, Quirke, Taylor), seguido por la recombinación in vivo de levadura.

Cebadores generales para la amplificación y la secuenciación

[0150] Los cebadores AM34 (SEQ ID NO: 7) y AM35 (SEQ ID NO: 8) se usaron para hacer fragmentos de ADN que contienen cualquier fragmento mutado por el método SOE junto con cebadores degenerados (AM34 cebador inverso y AM35 cebador directo) o solo para amplificar un gen de proteasa entero (AM34 AM35).

Sistema de reacción de PCR: Condiciones:

48,5 microL de H²O 1 94°C 2 min

2 microesferas puRe Taq Ready-To-Go PCR (Amersham Biosciences) 2 94°C 30 s

0,5 microL X 2100 pmol/microL de cebadores 3 55°C 30 s

0,5 microL de ADN molde 4 72°C 90 s

2-4 25 ciclos

5 72°C 10 min

[0151] Se recuperaron fragmentos de ADN de un gel de agarosa mediante el kit de extracción de gel Qiagen. Los fragmentos purificados resultantes se mezclaron con los productos de la digestión del vector. La solución mezclada se introdujo en Saccharomyces cerevisiae para construir genotecas o variantes dirigidas al sitio por recombinación in vivo.

Ensayo de la actividad relativa

[0152] Se inocularon clones de levadura en SC-glucosa en un pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos que contenía medio YPD+Zn y se cultivaron a 28°C durante 3 días. Los sobrenadantes de los cultivos se aplicaron a una placa de microtitulación de zeína de 96 pocillos y se incubaron a al menos 2 temperaturas (p. ej., 70°C y 80°C) durante más de 4 horas o durante toda la noche. La turbidez de la zeína en la placa se midió como A630 y la actividad relativa (temperaturas superiores/inferiores) se determinó como un indicador de una mejora de la termoactividad. Se seleccionaron los clones con una actividad relativa más alta que la variante parental y se determinó la secuencia.

Ensayo de la actividad residual

[0153] Se inocularon clones de levadura en SC-glucosa en un pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos y se cultivaron a 28°C durante 3 días. Se midió la actividad de proteasa a 65°C usando azocaseína (Megazyme) después de incubar el sobrenadante de los cultivos en 20 mM de tampón de acetato sódico, pH 4,5, durante 10 min a una cierta temperatura (80°C o 84°C con 4°C como una referencia) para determinar la actividad residual. Se seleccionaron los clones con una actividad residual más alta que la variante parental y se determinó la secuencia.

Ensayo de azocaseína

[0154] Se mezclaron 20 microL de muestras con 150 microL de solución de sustrato (4 ml de azocaseína al 12,5% en etanol en 96 ml de 20 mM de acetato sódico, pH 4,5, que contenía 0,01 % de Triton-100 y 0,25 mM de ZnSO4) y se incubaron durante 4 horas o más.

[0155] Después de añadir 20 microL/pocillo de solución de ácido tricloroacético (TCA) al 100 %, la placa se centrifugó y se extrajeron con pipeta 100 microL de los sobrenadantes para medir la A440.

Expresión de variantes de proteasa en Aspergillus oryzae

[0156] Las construcciones que comprendían los genes de las variantes de proteasa se usaron para construir vectores de expresión para Aspergillus. Los vectores de expresión de Aspergillus consisten en un casete de expresión basado en el promotor de la amilasa neutra II de Aspergillus niger fusionado con la secuencia líder no traducida de la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans (Pna2/tpi) y el terminador de la amiloglucosidasa de Aspergillus niger (Tamg). También estaba presente en el plásmido el marcador selectivo de Aspergillus amdS de Aspergillus nidulans que permite el crecimiento en acetamida como única fuente de nitrógeno. Los plásmidos de expresión para variantes de proteasa se transformaron en Aspergillus como se describe en Lassen et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 4701-4707. Para cada una de las construcciones, se aislaron, purificaron y cultivaron 10-20 cepas en matraces de agitación.

Purificación de las variantes expresadas

[0157]

1. Ajustar a 4,0 el pH de la muestra de fermentación filtrada con filtro de 0,22 pm.

2. Poner la muestra en un baño de hielo con agitación magnética. Añadir (NH4)2SO4 en partes alícuotas pequeñas (correspondientes a aprox. 2,0-2,2 M de (NH4)2SO4 sin tener en cuenta el aumento de volumen al añadir el compuesto).

3. Después de la adición final de (NH4)2SO4, incubar la muestra en el baño de hielo con agitación magnética suave durante mín. 45 min.

4. Centrifugación: centrifugadora refrigerada de alta velocidad Hitachi Himac CR20G equipada con una cabeza de rotor R20A2, 5°C, 20.000 r.p.m., 30 min.

5. Disolver el precipitado formado en 200 ml de 50 mM de Na-acetato pH 4,0.

6. Filtrar la muestra por succión a vacío usando una membrana de 0,22 micro m PES PLUS (IWAKI).

7. Desalar/cambiar el tampón de la muestra a 50 mM de Na-acetato pH 4,0 usando ultrafiltración (Vivacell 250 de Vivascience equipada con una membrana de 5 kDa MWCO PES) durante toda la noche en una cámara fría. Diluir la muestra de fracción retenida a 200 ml usando 50 mM de Na-acetato pH 4,0. La conductividad de la muestra es preferiblemente menor de 5 mS/cm.

8. Cargar la muestra en una columna de intercambio de cationes equilibrada con 50 mM de Na-acetato pH 4,0. Lavar la muestra no unida fuera de la columna usando 3 volúmenes de columna de tampón de unión (50 mM de Na-acetato pH 4,0) y eluir la muestra usando un gradiente lineal, tampón de elución (50 mM de Naacetato 1 M de NaCl pH 4,0) al 0-100% en 10 volúmenes de columna.

9. Las fracciones recogidas se evaluaron mediante un ensayo de endoproteasa (cf. a continuación) seguido de una SDS-PAGE estándar (condiciones reductoras) en fracciones seleccionadas. Las fracciones se agrupan en función del ensayo de endoproteasa y la SDS-PAGE.

Ensayo de endoproteasa

[0158]

1. Un comprimido Protazyme OL/5 ml de 250 mM de Na-acetato pH 5,0 se disuelve por agitación magnética (sustrato: comprimido de endoproteasa Protazyme AK de Megazyme - n.° cat. PRAK 11/08).

2. Con agitación, se transfieren 250 microL de solución de sustrato a un tubo de Eppendorf de 1,5 ml.

3. Se añaden 25 microL de muestra a cada tubo (el blanco es tampón de muestra).

cuban en un termomezclador con agitación (1000 r.p.m.) a 50°C durante 15 minutos.

microL de 1 M de NaOH a cada tubo, seguido de agitación en vórtex.

durante 3 min. a 16.100 x G y 25°C.

00 microL del sobrenadante a una PMT, y se registra la absorbancia a 590 nm.

Ejemplo 2

Perfil de temperatura de las variantes de proteasa seleccionadas usando enzimas purificadas

[0159] Se purificaron las variantes de proteasa seleccionadas que mostraron una buena termoestabilidad y las enzimas purificadas se usaron en un ensayo de zeína-BCA como se describe abajo. La actividad de proteasa residual se determinó a 60°C después de la incubación de la enzima a temperaturas elevadas como se indica durante 60 min.

Ensayo de zeína-BCA:

[0160] Se realizó un ensayo de zeína-BCA para detectar una cuantificación de proteína soluble liberada de zeína por proteasas variantes a varias temperaturas.

Protocolo:

[0161]

1) Mezclar 10 microL de 10 micro g/ml de soluciones de enzima y 100 microL de solución de zeína al 0,025% en una placa de microtitulación (PMT).

2) Incubar a varias temperaturas durante 60 min.

3) Añadir 10 microL de solución de ácido tricloroacético (TCA) al 100%.

4) Centrifugar la PMT a 3500 r.p.m. durante 5 min.

5) Transferir 15 microL a una nueva PMT que contenga 100 microL de solución de ensayo BCA (n.° cat. de Pierce: 23225, BCA Protein Assay Kit).

6) Incubar durante 30 min. a 60°C.

7) Medir la A562.

[0162] Los resultados se muestran en la tabla 4. Todas las variantes de proteasa evaluadas mostraron una termoestabilidad mejorada en comparación con la proteasa de tipo salvaje (WT).

Ejemplo 3

Determinación de la actividad relativa para proteasas usando el ensayo de azocaseína

[0163] Se mezclaron 20 microL de muestras que contenían aprox. 0,01 mg/ml con 150 microL de solución de sustrato (4 ml de azocaseína al 12,5% en etanol en 96 ml de 20 mM de acetato sódico, pH 4,5, con Triton-100 al 0,01 % y 0,25 mM de ZnSO4) y se incubó durante 5 horas a 70°C y 80 °C.

[0164] Después de añadir 20 microL/pocillo de solución de ácido tricloroacético (TCA) al 100 %, la placa se centrifugó y se extrajeron con pipeta 80 microL de sobrenadantes para medir la A440.

Ejemplo 4

Extracción de aceite después del tratamiento con proteasa de vinaza entera

[0165] La vinaza entera producida industrialmente recogida de una planta de etanol de maíz de molienda seca de primera generación (12-13% DS) se calentó a 85°C, pH 4, al baño maría (Fisher Scientific IsoTemp 220) durante dos horas. Aproximadamente 25 gramos de vinaza entera se dividieron luego en partes alícuotas en tubos cónicos de 50 ml (VWR 89039-660) pesados previamente y se incubaron dos horas adicionales al baño maría. Las enzimas se dosificaron según las especificaciones de la tabla 5 y el volumen de solución madre para añadir a la fermentación se halló usando la ecuación:

Dosis fina l enz. (m g EP /g DS) x Peso de m osto (g) x Contenido só lido (% DS) Dosis enz. (m l) = ■ Conc. enzima (m g E P /m l)

Tabla 5. Dosis de enzima

[0166] Se dosificó el agua en cada muestra de modo que el volumen añadido total de enzima y agua fuera -80 jl/25 g de muestra. Los tubos se taparon y se colocaron en un horno de hibridación con espetones (modelo #230402 de Boekel Big Shot III) ajustado a 85°C con rotación (ajuste #14) durante 2 horas. Tras la incubación, se enfriaron los tubos a temperatura ambiente y luego se pesaron antes de la extracción de aceite. Se añadió hexano a cada muestra a una dosis de 0,125 ml de hexano/1 g de material de vinaza entera. Cada tubo se cubrió con Dura-seal para evitar la fuga de las muestras y se mezcló minuciosamente. Los tubos se centrifugaron a 3.000 x g durante 10 minutos en una centrifugadora Avanti JE Series con un rotor JS-5.3 (Beckmann Coulter). Después de la centrifugación, la capa de aceite/hexano (sobrenadante) se eliminó usando una pipeta de desplazamiento positivo (Ranin MR-250 y m R-1000), se transfirió a un tubo de 5 ml pesado previamente de tapa abatible (Fisherbrand 03-338-1C) y se volvió a pesar. La densidad de la muestra se midió usando un medidor de densidad Rudolph Research Analytical (DDM 2911). La densidad del sobrenadante se insertó entonces en la ecuación de la curva estándar derivada de varios porcentajes de aceite en mezclas de hexano medidas en el densitómetro para determinar el porcentaje de aceite en el sobrenadante.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Proceso de recuperación de aceite, que comprende

(a) la conversión de un material que contiene almidón en dextrinas con una alfa-amilasa

(e) la separación de la vinaza entera en vinaza diluida y torta húmeda;

(e') la concentración opcional de la vinaza diluida en jarabe;

(f) la recuperación de aceite de la vinaza diluida y/o el jarabe, donde una proteasa que tiene al menos un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 4 y tiene un valor de termoestabilidad de más del 50% determinado como actividad relativa a 80°C/70°C está presente y/o se añade durante las etapas (d)-(e').

2. Proceso según la reivindicación 1, donde la temperatura en la etapa (a) está por encima de la temperatura de gelatinización inicial, tal como a una temperatura entre 80-90°C, tal como alrededor de 85°C.

3. Proceso según la reivindicación 1 o 2, donde la proteasa tiene una termoestabilidad de más del 60%, más del 70%, más del 80%, más del 90%, más del 100%, tal como más del 105%, tal como más del 110%, tal como más del 115%, tal como más del 120% determinada como actividad relativa a 80°C/70°C.

4. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la proteasa deriva de una cepa de Pyrococcus, preferiblemente una cepa de Pyrococcus furiosus.

5. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la proteasa es la mostrada en la SEQ ID NO: 4 en la presente, o donde la proteasa tiene al menos un 85%, tal como al menos un 90%, tal como al menos un 95%, tal como al menos un 96%, tal como al menos un 97%, tal como al menos un 98%, tal como al menos un 99% de identidad con la SEQ ID NO: 4 en la presente.

6. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la alfa-amilasa deriva del género Bacillus, tal como una cepa de Bacillus stearothermophilus, en particular una variante de una alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, tal como la mostrada en la SEQ Id N.°: 1 en la presente, en particular la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus está truncada, preferiblemente para tener de 485 a 495 aminoácidos, tal como alrededor de 491 aminoácidos.