ES2739280T3

ES2739280T3 - Células fúngicas filamentosas deficientes en O-manosiltransferasa y métodos de uso de las mismas

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Publication number: ES2739280T3
Application number: ES14734515T
Authority: ES
Inventors: Jari Natunen; Jukka Hiltunen; Anne Huuskonen; Markku Saloheimo; Christian Ostermeier; Benjamin Patrick Sommer; Ramon Wahl
Original assignee: Glykos Finland Ltd
Current assignee: Glykos Finland Ltd
Priority date: 2013-07-04
Filing date: 2014-07-03
Publication date: 2020-01-30
Anticipated expiration: 2034-07-03
Also published as: CN105492457A; US20220213451A1; CA2916594A1; US10724013B2; MX364532B; EP3016970A1; DK3016970T3; RU2016103373A3; KR20160030127A; RU2016103373A; SI3016970T1; KR102111078B1; SG11201510814YA; US20160376570A1; WO2015001049A1; HRP20191069T1; CA2916594C; US20200362319A1; PL3016970T3; EP3016970B1

Abstract

Una célula fúngica filamentosa deficiente en PMT que comprende a) una primera mutación en un gen que codifica una proteasa endógena que reduce o elimina una actividad de proteasa endógena en comparación con una célula fúngica filamentosa precursora que no tiene dicha primera mutación, seleccionándose dichas proteasas endógenas entre proteasas aspárticas, serina proteasas de tipo tripsina, subtilisina proteasas, proteasas glutámicas y sedolisina proteasas, y b) una segunda mutación en un gen PMT que reduce la actividad de O-manosiltransferasa endógena en comparación con una célula fúngica filamentosa precursora que no tiene dicha segunda mutación, en la que dicha célula fúngica filamentosa se selecciona entre el grupo que consiste en célula de Trichoderma, Neurospora, Myceliophthora y Chrysosporium.

Description

DESCRIPCIÓN

Células fúngicas filamentosas deficientes en O-manosiltransferasa y métodos de uso de las mismas

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a composiciones y métodos útiles para la producción de proteínas heterólogas en células fúngicas filamentosas.

Antecedentes

La modificación posterior a la traducción de proteínas eucariotas, en particular proteínas terapéuticas tales como inmunoglobulinas, a menudo es necesaria para el correcto plegamiento y función de la proteína. Dado que los sistemas de expresión procarióticos convencionales carecen de la maquinaria adecuada necesaria para modificaciones de ese tipo, se tienen que usar sistemas de expresión alternativos en la producción de estas proteínas terapéuticas. Incluso cuando las proteínas eucariotas no tienen modificaciones posteriores a la traducción, los sistemas de expresión procariotas a menudo carecen de las proteínas chaperonas necesarias para un plegamiento adecuado. Las levaduras y los hongos son opciones atractivas para expresar proteínas, ya que se pueden cultivar fácilmente a gran escala en medios simples, lo que permite bajos costes de producción, y las levaduras y los hongos tienen maquinaria posterior a la traducción y chaperonas que realizan funciones similares a las de las células de mamíferos. Además, existen herramientas para manipular la estructura genética relativamente simple de las células de levadura y hongos, así como de las células eucariotas más complejas, tales como células de mamíferos o insectos (De Pourcq et al., Appl Microbiol Biotechnol, 87 (5): 1617-31).

Sin embargo, las modificaciones posteriores a la traducción que se producen en levaduras y hongos aún pueden ser una preocupación para la producción de proteínas terapéuticas recombinantes. En particular, la O-manosilación es uno de los mayores obstáculos a superar en la producción de productos biofarmacéuticos para aplicaciones humanas en hongos. Más específicamente, las levaduras tales como Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae tienden a hipermanosilar los productos biofarmacéuticos expresados de manera heteróloga, lo que desencadena efectos adversos cuando se aplican en seres humanos.

La O-manosilación para restos de serina y treonina incluye en mamíferos oligosacáridos a base de GalNAc u GlcNAc/N-acetillactosamina que comprenden glicanos de manosa unidos a O. En hongos, la O-manosilación se produce como monómeros u oligómeros de hexosa. En las levaduras, por lo general hay varias O-manosiltransferasas proteínicas (/polipeptídicas), que a menudo funcionan como complejos. Parte de las desactivaciones genéticas son perjudiciales, al menos para las estructuras celulares y la estabilidad, y no todas las desactivaciones genéticas o combinaciones de levaduras son tolerados (para una revisión, véase Goto 2007, Biosci. Biotechnol. Biochem. 71 (6), 1415-1427).

Ha habido informes de desactivaciones de genes de O-manosiltransferasa de levadura, con el objetivo de reducir los niveles de O-manosilación, e incluso mutantes con múltiples desactivaciones genéticas que involucran dos o tres genes pmt en S. cerevisiae (documento WO/1994/004687). La desactivación genética de Pmt1 o pmt2 de S. cerevisiae redujo el nivel de O-manosilación de la glicoproteína III anticongelación para aproximadamente un 30 % de las proteínas y la proteína manosilada residual contiene numerosos restos de manosa por proteína, aparentemente también oligosacáridos (documento WO/2004/057007).

El documento WO/2010/034708 no informa de ningún nivel significativo de O-manosilación de la proteína de Trichoderma de hidrofobina recombinante cuando se expresa en la desactivación genética de pmtl de la célula hospedadora de S. cerevisiae. Parece que dicha O-manosilación es una glicosilación de levadura artificial de la proteína fúngica filamentosa original no manosilada.

El documento WO/2010/128143 informa además de una construcción de fusión de anticuerpo de cadena individualalbúmina en cepas con desactivación genética de pmtl y/o pmt4 de la levadura S. cerevisiae.

Las desactivaciones de un solo gen, dobles y triples de pmt1, pmt2, y pmt3 de las especies de Aspergillus (Aspergillus nidulans, Aspergillus fumigatus, y/o Aspergillus awamori) se describen en Goto et al., 2009 (Eukaryotic cell 2009, 8 (10): 1465); Mouyna et al., 2010 (Molecular Microbiology 2010, 76 (5), 1205-1221); Zhou et al., 2007 (Eukaryotic cell 2007, 6(12): 2260); Oka et al., 2004 (Microbiology 2004, 150, 1973-1982); Kriangkripipat et al., 2009; Fang et al., 2010 (Glycobiology, 2010, vol. 20 pp 542-552); y Oka et al., 2005 (Microbiology 2005, 151, 3657-3667). A pesar de los numerosos informes sobre la supresión genética de homólogos de pmt en hongos filamentosos, no hay una descripción de una célula fúngica filamentosa con reducción de la O-manosilación y útil como célula hospedadora para la producción de glicoproteína recombinante.

En particular, Gorka-Niec et al., (2008, Acta Biochimica Polonica, Vol. 55 N.° 2/2008, 251-259) informaron de la deleción del gen pmt1 en Trichoderma reesei. La proteína PMT1 mostró la identidad más elevada con Pmt4p de S.

cerevisiae (51 %) pero complementa funcionalmente al mutante de pmt2A de S. cerevisiae (Gorka-Niec et al., 2007, Biochimica et Biophysica Acta 1770, 2007, 774-780). Sin embargo, los autores informaron que la interrupción del gen pmt1 causó una disminución de la secreción de proteínas, pero no alteró la O- y N-glicosilación de la proteína secretada.

Zakrzewska et al., (Curr Genet 2003 43: 11-16) informaron además que el gen pmtl de Trichoderma reesei no complementaba funcionalmente al mutante pmt4A de S. cerevisiae.

De hecho, parece que las deleciones de los genes PMT en levaduras u hongos filamentosos no producen ningún fenotipo o letalidad o funciones vitales de las células gravemente dañadas, que no serían adecuadas para la producción recombinante de proteínas heterólogas, especialmente glicoproteínas de mamíferos. Por este motivo, se han propuesto métodos alternativos, tales como el uso de inhibidores de pmt, como alternativa a las cepas con desactivación genética de pmt (documento WO2009/143041).

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de células fúngicas filamentosas mejoradas, tales como células del hongo Trichoderma, que pueden producir de manera estable proteínas heterólogas sin O-manosilación o con esta reducida, tal como inmunoglobulinas, preferentemente a altos niveles de expresión.

SUMARIO

La presente invención se refiere a métodos mejorados para producir proteínas sin O-manosilación o con ella reducida en sistemas de expresión de hongos filamentosos y, más específicamente, glicoproteínas, tales como anticuerpos o inmunoglobulinas relacionadas o proteínas de fusión que se pueden O-manosilar cuando se producen en sistemas de expresión de hongos filamentosos.

La presente invención se basa en parte en el sorprendente descubrimiento de que las células fúngicas filamentosas, tales como las células Trichoderma, se pueden modificar genéticamente para reducir o suprimir la actividad de O-manosilación, sin afectar de manera adversa a la viabilidad y el rendimiento de las glicoproteínas producidas.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención se refiere a una célula fúngica filamentosa deficiente en PMT que comprende

a) una primera mutación que reduce o elimina una actividad de proteasa endógena en comparación con una célula fúngica filamentosa precursora que no tiene dicha primera mutación, siendo dichas proteasas endógenas seleccionadas entre proteasas aspárticas, serina proteasas de tipo tripsina, subtilisina proteasas, proteasas glutámicas, y sedolisina proteasas, y,

b) una segunda mutación en un gen PMT que reduce la actividad de O-manosiltransferasa endógena en comparación con una célula fúngica filamentosa precursora que no tiene dicha segunda mutación,

en la que dicha célula fúngica filamentosa se selecciona entre el grupo que consiste en una célula de Trichoderma, Neurospora, Myceliophthora y Chrysosporium.

En una realización, dicha célula deficiente en PMT expresa además una proteína heteróloga que contiene restos de serina y/o treonina. La proteína heteróloga expresada con restos de serina y/o treonina redujo la O-manosilación debido a dicha mutación en dicho gen PMT. Por ejemplo, el nivel de O-manosilación de la proteína heteróloga expresada en una célula deficiente en PMT de la invención es al menos un 10 %, un 20 %, un 30 %, un 40 %, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 % o al menos un % más bajo que en comparación con el nivel de O-manosilación de la proteína heteróloga cuando se expresa en la célula fúngica filamentosa precursora que no tiene dicha segunda mutación deficiente en PMT.

En otra realización, dicha segunda mutación que reduce la actividad de O-manosiltransferasa endógena es una deleción o una alteración de un gen PMT que codifica una actividad de proteína O-manosiltransferasa endógena. En otra realización, dicha segunda mutación deficiente en PMT en un gen PMT puede ser una mutación (tal como una deleción o una alteración) en cualquiera de:

a) gen PMT1 que comprende el polinucleótido de la SEQ ID NO: 1,

b) un gen homólogo del gen PMT1, gen homólogo que es capaz de restablecer el nivel de O-manosilación precursora mediante complementación funcional cuando se introduce en una cepa de T. reesei que tiene una alteración en dicho gen ^pMT1, o,

c) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70%, al menos un 90%, o al menos un 95% con la SEQ ID NO: 2, teniendo dicho polipéptido actividad de O-manosiltransferasa.

En otra realización que se puede combinar con las realizaciones precedentes, dicha célula deficiente en PMT has una tercera mutación que reduce o elimina el nivel de expresión de un gen ALG3 en comparación con el nivel de expresión en una célula precursora que no tiene dicha tercera mutación. En una realización específica, dicha célula deficiente en PMT además comprende un primer polinucleótido que codifica un dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa I y un segundo polinucleótido que codifica un dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa II.

En otra realización que se puede combinar con las realizaciones precedentes, dicha célula deficiente en PMT además comprende uno o más polinucleótidos que codifican un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en:

a) a1,2 manosidasa,

b) dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa I,

c) a manosidasa II, y

d) dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa II.

En otra realización que se puede combinar con las realizaciones precedentes, dicha célula deficiente en PMT además comprende uno o más polinucleótidos que codifican una (31,4 galactosiltransferasa y/o una fucosiltransferasa.

En una realización específica, dicha célula deficiente en PMT es una célula de Trichoderma que comprende al menos una mutación que reduce o elimina la actividad de proteína O-manosiltransferasa de pmtl de Trichoderma, y, opcionalmente, que además comprende mutaciones en al menos uno u otros genes p Mt más que reducen o eliminan la actividad de proteína O-manosiltransferasa seleccionadas entre el grupo que consiste en pmt2 y pmt3. En una realización que se puede combinar con las realizaciones precedentes, las células deficientes en PMT comprenden mutaciones que reducen o eliminan la actividad de al menos dos, o al menos tres proteasas endógenas. Por lo general, dicha célula puede ser una célula de Trichoderma y puede comprender mutaciones que reducen o eliminan la actividad de

a) las tres proteasas endógenas pepl, tspl y slpl,

b) las tres proteasas endógenas gapl, slpl y pepl,

c) tres proteasas endógenas seleccionadas entre el grupo que consiste en pepl, pep2, pep3, pep4, pep5, pep8, pep11, pep12, tspl, slpl, slp2, slp3, slp7, gapl y gap2,

d) de tres a seis proteasas seleccionadas entre el grupo que consiste en pepl, pep2, pep3, pep4, pep5, tspl, slpl, slp2, slp3, gapl y gap2, o,

e) de siete a diez proteasas seleccionadas entre el grupo que consiste en pepl, pep2, pep3, pep4, pep5, pep7, pep8, tspl, slpl, slp2, slp3, slp5, slp6, slp7, slp8, tppl, gapl y gap2.

En una realización que se puede combinar con las realizaciones precedentes, la célula fúngica filamentosa de la invención no comprende una deleción o alteración de un gen endógeno que codifica una proteína chaperona. En particular, dicha célula fúngica filamentosa de la invención expresa una proteína chaperona endógena funcional, tal como la Proteína Disulfuro Isomerasa (PDI).

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para producir una proteína que tiene O-manosilación reducida, que comprende:

a) proporcionar una célula fúngica filamentosa deficiente en PMT como se ha descrito anteriormente, y que además comprende un polinucleótido que codifica una proteína con un resto de serina o treonina,

b) cultivar dicha célula fúngica filamentosa deficiente en PMT para producir dicha proteína con O-manosilación reducida,

en el que dicha célula fúngica filamentosa se selecciona entre el grupo que consiste en una célula de Trichoderma, Neurospora, Myceliophthora y Chrysosporium.

De acuerdo con una realización específica del método, dicha mutación en un gen PMT es una mutación, tal como una deleción o alteración, en cualquiera de:

a) gen PMT1 que comprende el polinucleótido de la SEQ ID NO: 1,

b) un gen homólogo funcional del gen PMT1, cuyo gen homólogo funcional es capaz de restablecer el nivel de O-manosilación precursora mediante complementación funcional cuando se introduce en una cepa de T. reesei que tiene una alteración en dicho gen PMT1, o,

c) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70%, al menos un 90%, o al menos un 95% con la SEQ ID NO: 2, teniendo dicho polipéptido actividad de proteína O-manosiltransferasa.

En una realización particular del método de acuerdo con la invención, dicha célula fúngica filamentosa expresa una proteína chaperona endógena funcional, tal como PDI.

En otra realización del método, dicha célula deficiente en PMT es una célula de Trichoderma reesei y dicha mutación es una deleción o una alteración del gen PMT1 de T. reesei.

En otras realizaciones del método, dicha célula deficiente en PMT es una célula deficiente en PMT de la invención como se ha descrito anteriormente.

En una realización específica de la invención, dicho polinucleótido que codifica una proteína es un polinucleótido recombinante que codifica una proteína heteróloga. Generalmente, dicha proteína producida es una proteína de mamífero heteróloga seleccionada entre el grupo que consiste en

a) una inmunoglobulina, tal como IgG,

b) una cadena ligera o una cadena pesada de una inmunoglobulina,

c) una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo,

d) un anticuerpo de cadena individual,

e) un anticuerpo camélido,

f) un anticuerpo de dominio individual monomérico o multimérico,

g) un fragmento FAb, un fragmento FAb2, y,

h) sus fragmentos de unión a antígeno.

En una realización del método, que se puede combinar con las realizaciones precedentes, dicho polinucleótido que codifica dicha proteína además comprende un polinucleótido que codifica el dominio catalítico CBH1 y un conector como una proteína vehículo y/o el promotor cbhl.

En otra realización, dicho polinucleótido codifica una proteína con serina o treonina, que puede estar O-manosilada en una cepa precursora funcional de PMT, y que además comprende al menos un N-glicano.

La presente solicitud también desvela un método para producir un anticuerpo que tiene O-manosilación reducida, que comprende:

a) proporcionar una célula fúngica filamentosa deficiente en PMT que tiene

i. una mutación que reduce la actividad de la proteína O-manosiltransferasa endógena en comparación con la cepa precursora que no tiene una mutación de ese tipo y

ii. un polinucleótido que codifica un anticuerpo de cadena ligera y un polinucleótido que codifica un anticuerpo de cadena pesada,

b) cultivar la célula para producir dicho anticuerpo, que consiste en cadenas pesadas y ligeras, que tiene O-manosilación reducida,

En un método específico para producir anticuerpos, dicha célula deficiente en PMT es una célula de Trichoderma reesei y dicha mutación es una deleción o una alteración del gen PMT1 de T. reesei.

En una realización del método para producir anticuerpos, al menos un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 %, o un 100 % del anticuerpo producido no está O-manosilado.

La presente solicitud también desvela una composición de proteína o composición de anticuerpo que se puede obtener o que se obtiene con los métodos de la invención como se ha descrito anteriormente. En una realización, al menos un 70%, un 80%, un 90%, un 95%, o un 100% de los anticuerpos tal como se obtienen o se pueden obtener con los métodos de la invención no están O-manosilados.

En una realización específica, una composición de proteína (por ejemplo, una glicoproteína) o de anticuerpo de ese tipo con O-manosilación reducida comprende, como una glicoforma principal, cualquiera de,

• Mana3[Mana6(Mana3)Mana6]Manp4GlcNAp4GlcNAc (glicoforma Man5);

• Mana6(Mana3)Manp4GlcNAp4GlcNAc (glicoforma Man3);

• N-glicanos de tipo híbrido o complejo tales como las glicoformas seleccionadas entre el subgrupo que consiste en GlcNAcMan3, G0, glicano híbrido, o GIcNAcMan5, o derivados galactosilados, tales como GaIGIcNAcMan3, G1, G2; o, glicoforma GalGlcNAcMan5.

En una realización específica, cuando el núcleo del glicano consiste en Man3, entonces la composición carece esencialmente de glicoformas Man5.

En una realización que se puede combinar con una o más de las realizaciones precedentes menos de un 0,1 %, un 0,01 %, un 0,001 %, o un 0% de los N-glicanos y/o O-glicanos de la composición de proteína comprende una estructura de Neu5Gc y/o Gala-. En una realización que se puede combinar con las realizaciones precedentes, menos de un 0,1 %, un 0,01 %, un 0,001 %, o un 0% de los N-glicanos y/o O-glicanos de la composición de anticuerpo comprende una estructura de Neu5Gc y/o Gala-.

En una realización que se puede combinar con una o más de las realizaciones precedentes, menos de un 0,1 %, un 0,01 %, un 0,001 %, o un 0 % del N-glicano de la composición de glicoproteína comprende estructuras de núcleo de fucosa. En una realización que se puede combinar con las realizaciones precedentes, menos de un 0,1 %, un 0,01 %, un 0,001 %, o un 0 % del N-glicano de la composición de anticuerpo comprende estructuras de núcleo de fucosa.

En una realización que se puede combinar con una o más de las realizaciones precedentes, menos de un 0,1 %, un 0,01 %, un 0,001 %, o un 0 % del N-glicano de la composición de glicoproteína comprende epítopos de galactosa terminales Galp3/4GlcNAc. En una realización que se puede combinar con las realizaciones precedentes, menos de un 0,1 %, un 0,01 %, un 0,001 %, o un 0% del N-glicano de la composición de anticuerpo comprende epítopos de galactosa terminales Galp3/4GlcNAc.

En una realización que se puede combinar con una o más de las realizaciones precedentes, menos de un 1,0 %, un 0,5%, un 0,1 %, un 0,01 %, un 0,001 %, o un 0% de la composición de glicoproteína comprende estructuras de glicación. En una realización que se puede combinar con las realizaciones precedentes, menos de un 1,0%, un 0,5%, un 0,1 %, un 0,01 %, un 0,001 %, o un 0% de la composición de anticuerpo comprende estructuras de glicación.

En otra realización que se puede combinar con una o más de las realizaciones precedentes, la composición de glicoproteína, tal como un anticuerpo, está desprovista de una, dos, tres, cuatro, cinco, o seis de las estructuras seleccionadas entre el grupo de Neu5Gc, Gala3Galp4GlcNAc terminal, Galp4GlcNAc terminal, Galp3GlcNAc terminal, fucosa unida al núcleo y estructuras de glicación.

La presente solicitud también desvela a un método para reducir el nivel de O-manosilación de una composición de glicoproteína recombinante producida en una célula fúngica filamentosa, por ejemplo, célula de Trichoderma, generalmente, Trichoderma reesei, consistiendo dicho método en el uso de una célula fúngica filamentosa que tiene una mutación en un gen PMT en la que dicho gen PMT es cualquiera de:

i. gen PMT1 que comprende el polinucleótido de la SEQ ID NO: 1,

ii. un gen homólogo funcional del gen PMT1, cuyo gen homólogo funcional es capaz de restablecer el nivel de O-manosilación precursora mediante complementación funcional cuando se introduce en una cepa de T. reesei que tiene una alteración en dicho gen PMT1, o,

iii. un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70%, al menos un 90%, o al menos un 95% con la SEQ ID NO: 2, teniendo dicho polipéptido actividad de proteína O-manosiltransferasa.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 representa resultados de análisis de Southern de cepas con deleción de pmtl de Trichoderma reesei expresan el anticuerpo MAB01. A) Se espera una señal de 5,7 kb de las cepas precursoras M124 y M304 con la sonda pmtl ORF después de digestión con SpeI Xbal. No se espera señal de cepas puras con deleción de pmtl. B) Se espera una señal de 3,5 kb para la sonda de flanqueo en la posición 5' de pmtl a partir de cepas de deleción después de digestión con SpeI ^scI. C) Se espera una señal de 1,7 kb para la sonda de flanqueo en la posición 3' de pmtl a partir de cepas de deleción después de digestiones con ^scI XbaI. ^scI no corta el locus de pmtl intacto en las proximidades, por lo tanto se espera señales de aproximadamente 16 kb (B) y 10 kb (C) de las cepas precursoras M124 o M304. Se espera una señal de 4,1 kb del plásmido pTTv185 digerido con PmeI usado como un control inhibirá acciones con ambas sondas de flanqueo (B, C).

La Figura 2 representa un espectro de la cadena ligera de la cepa M317 (pyr4‘ de M304) de T. reesei precursora cultivada en matraz (A) y el clon 26-8A de alteración de Apmt1 (B), día 7.

La Figura 3 representa resultados para análisis de Western de la cepa M403 con deleción de pmtl de Trichoderma reesei a partir de fermentación en cultivo semicontinuo. Panel superior: cadena ligera de MAB01, panel inferior: cadena pesada de MAB01. En cada calle se cargaron 0,1 pl de sobrenadante.

La Figura 4 representa un espectro de cadena ligera de la cepa M403 de T. reesei cultivada en fermentador (cepa con deleción de pmt1 de anticuerpo MAB01 productor de cepa, clon 26-8A), día 7.

La Figura 5 representa una filogenia de los PMT de hongos filamentos seleccionados.

La Figura 6 representa un alineamiento de secuencia parcial de los resultados de las búsquedas de PMT con BLAST.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Definiciones

Como se usa en el presente documento, un "sistema de expresión" o una "célula hospedadora" se refiere a la célula que está modificada genéticamente para permitir la transcripción, la traducción y el plegamiento adecuado de un polipéptido o una proteína de interés, generalmente de proteínas de mamíferos.

El término "polinucleótido" u "oligonucleótido" o "ácido nucleico", como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a un polímero de al menos dos nucleótidos unidos mediante un enlace fosfodiéster y puede consistir en ribonucleótidos o desoxinucleótidos o sus derivados que se pueden introducir en una célula hospedadora para la modificación genética de dicha célula hospedadora. Por ejemplo, un polinucleótido puede codificar una secuencia de codificación de una proteína, y/o comprender secuencias de control o reguladoras de una secuencia de codificación de una proteína, tales como secuencias potenciadoras o promotoras o terminadoras. Un polinucleótido puede, por ejemplo, comprender la secuencia de codificación nativa de un gen o sus fragmentos, o secuencias variantes que se han optimizado para la expresión génica óptima en una célula hospedadora específica (por ejemplo, para tener en cuenta el sesgo del codón).

Como se usa en el presente documento, el término "optimizado" con referencia a un polinucleótido se refiere a que un polinucleótido se ha alterado para codificar una secuencia de aminoácidos usando codones que son preferentes en la producción de una célula u organismo, por ejemplo, una célula fúngica filamentosa tal como una célula de Trichoderma. Las secuencias de nucleótidos heterólogas que se transfectan en una célula hospedadora se optimizan generalmente para retener completamente o lo más posible la secuencia de aminoácidos codificada originalmente por la secuencia de nucleótidos original (no optimizada). Las secuencias optimizadas en el presente documento se han modificado mediante ingeniería para que tengan codones que son preferentes en la célula u organismo de producción correspondiente, por ejemplo la célula fúngica filamentosa.

Las secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de nucleótidos optimizadas también se pueden denominar optimizadas.

Como se usa en el presente documento, un "péptido" o un "polipéptido" es una secuencia de aminoácidos que incluye una pluralidad de restos de aminoácido polimerizados consecutivos. El péptido o polipéptido puede incluir restos de aminoácido modificados, restos de aminoácido de origen natural no codificados por un codón y restos de aminoácido de origen no natural. Como se usa en el presente documento, una "proteína" puede hacer referencia a un péptido o un polipéptido o una combinación de más de un péptido o polipéptido ensamblados juntos mediante enlaces covalentes o no covalentes. A menos que se especifique, el término "proteína" puede incluir una o más secuencias de aminoácidos con sus modificaciones posteriores a la traducción y, en particular, con modificaciones de O-manosilación o N-glicano.

Como se usa en el presente documento, el término "glicoproteína" se refiere a una proteína que comprende al menos un glicano unido a N unido a al menos un resto de asparagina de una proteína, o al menos una manosa unida a al menos una serina o treonina dando como resultado O-manosilación.

Los términos "O-manosilación" o "actividad de O-manosiltransferasa" se usan en el presente documento para hacer referencia al enlace covalente de al menos una manosa a un aminoácido específico a través de un oxígeno (generalmente de serina o treonina). La proteína O-manosiltransferasa generalmente añade manosa a los grupos hidroxilo, tal como el hidroxilo de restos de serina o treonina.

En particular, la actividad de O-manosiltransferasa puede hacer referencia a la especificidad de la actividad de O-manosiltransferasa del gen PMT fúngico que codifica enzimas, y más específicamente con la misma especificidad de PMT1 de T. reesei.

Como se usa en el presente documento, "glicano" se refiere a una cadena de oligosacáridos que se puede unir a un vehículo tal como un aminoácido, péptido, polipéptido, lípido o un conjugado de extremo reductor. En ciertas realizaciones, la invención se refiere a glicanos unidos a N ("N-glicano") conjugados con un sitio de N-glicosilación de polipéptidos, tal como -Asn-Xaa-Ser/Thr- por enlace N a nitrógeno de amida de cadena lateral de resto de asparagina (Asn), en la que Xaa es cualquier resto de aminoácido excepto Pro. La invención además se puede relacionar con glicanos como parte de estructuras lipídicas precursoras de dolicol-fosfo-oligosacárido (Dol-P-P-OS), que son precursores de glicanos unidos a N en el retículo endoplásmico de células eucariotas. Los oligosacáridos precursores están unidos desde su extremo reductor a dos restos de fosfato en el lípido dolicol. Por ejemplo, la a3-manosiltransferasa Alg3 modifica el precursor Dol-P-P-P-oligosacárido de los N-glicanos. En general, las estructuras de glicano que se describen en el presente documento son estructuras de glicano terminales, en las que los restos no reductores no son modificados por otro resto hubo restos de monosacárido.

Como se usa a lo largo de la presente divulgación, la nomenclatura de glucolípidos y carbohidratos está básicamente de acuerdo con las recomendaciones de la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB (por ejemplo, Carbohydrate Res. 1998, 312, 167; Carbohydrate Res. 1997, 297, 1; Eur. J. Biochem. 1998, 257, 29). Se supone que Gal (galactosa), Glc (glucosa), GlcNAc (N-acetilglucosamina), GalNAc (N-acetilgalactosamina), Man (manosa), y Neu5Ac tienen la configuración D, Fuc tiene la configuración L, y todas las unidades de monosacárido están en forma de piranosa (D-Galp, D-Glcp, D-GlcpNAc, D-GalpNAc, D-Manp, L-Fucp, D-Neup5Ac). El grupo amino es tal como se define para la galactosa natural y glucosaminas en la posición 2 de GalNAc o GlcNAc. Los enlaces glicosídicos se muestran en parte en la nomenclatura más corta y en parte en la más larga, los enlaces de los restos del ácido siálico SA/Neu5X en a3 y a6 significan lo mismo que a2-3 y a2-6, respectivamente, y para los restos de los monosacáridos de hexosa a1-3, a1-6, (31-2, (31-3, (31-4, y (31 -6 se pueden acortar como a3, a6, p2, p3, p4, y p6, respectivamente. Lactosamina se refiere a N-acetillactosamina de tipo II, Galp4GlcNAc, y/o N-acetillactosamina de tipo I. Galp3GlcNAc y ácido siálico (SA) se refieren al ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac), ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc), o cualquier otro ácido siálico natural que incluya derivados de Neu5X. El ácido siálico se conoce como NeuNX o Neu5X, en los que X es preferentemente Ac o Gc. Ocasionalmente Neu5Ac/Gc/X se puede denominar NeuNAc/NeuNGc/NeuNX.

Los azúcares que generalmente constituyen los N-glicanos encontrados en glicoproteína de mamíferos, incluyen, pero no se limitan a, N-acetilglucosamina (en lo sucesivo en el presente documento abreviado como "GlcNAc"), manosa (en lo sucesivo en el presente documento abreviado como "Man"), glucosa (en lo sucesivo en el presente documento abreviado como "Glc"), galactosa (en lo sucesivo en el presente documento abreviado como "Gal"), y ácido siálico (en lo sucesivo en el presente documento abreviado como "Neu5Ac"). Los N-glicanos comparten un pentasacárido común denominado estructura "núcleo" de Man3GlcNAc2 (Mana6(Mana3)Manp4GlcNAp4GlcNAc, denominado Man3). En algunas realizaciones el glicano Man3 o sus derivado Mana6(GlcNAca2Mana3)Manp4GlcNAp4GlcNAc es la glicoforma principal. Cuando una fucosa se une a la estructura de núcleo, se une preferentemente en a6 para reducir el extremo de GlcNAc, el N-glicano por el núcleo del N-glicano, se puede representar como Man3GlcNAc2(Fuc). En una realización el N-glicano principal es Mana3[Mana6(Mana3)Mana6]Manp4GlcNAp4GlcNAc (Man5).

Los N-glicanos de tipo híbrido preferentes comprenden GlcNAcp2Mana3[Mana6(Mana3)Mana6]Manp4GlcNAp4GlcNAc ("GlcNAcMan5"), o derivados b4-galactosilados de los mismos Galp4GlcNAcMan3, G1, G2, o la glicoforma GalGlcNAcMan5.

Un "N-glicano complejo" se refiere a un N-glicano que tiene al menos un resto de GlcNAc, opcionalmente el resto de GlcNAcp2, en la rama terminal de 1,3 manosa de la estructura de núcleo y al menos un resto de GlcNAc, opcionalmente el resto de GlcNAcp2 , en la rama terminal de 1,6 manosa de la estructura de núcleo.

Los N-glicanos complejos de ese tipo incluyen, pero no se limitan a, GlcNAc2Man3GlcNAc2 (también conocido como glicoforma G0), GahGlcNAc2Man3GlcNAc2 (también conocido como glicoforma G1), y Gâ GlcNAc2Man3GlcNAc2 (también conocido como glicoforma G2), y sus glicoformas fucosiladas de núcleo FG0, FG1 y FG2, respectivamente GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), GahGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), y Gâ GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc).

"Actividad aumentada" o "reducida de una enzima endógena": La célula fúngica filamentosa puede haber aumentado o reducido los niveles de actividad de varias enzimas endógenas. Se puede proporcionar un nivel de actividad reducido inhibiendo la actividad de la enzima endógena con un inhibidor, un anticuerpo o similar. En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa se modifica genéticamente para aumentar o reducir la actividad de varias enzimas endógenas. "Genéticamente modificado" se refiere a cualquier método de ADN o ARN recombinante usado para crear una célula hospedadora procariota o eucariota que expresa un polipéptido a niveles elevados, a niveles más bajos o en una forma mutada. En otras palabras, la célula hospedadora se ha transfectado, transformado o transducido con una molécula de polinucleótido recombinante, y por lo tanto se ha alterado para que la célula altere la expresión de una proteína deseada.

Las "modificaciones genéticas" que dan como resultado una disminución o deficiencia de la expresión génica, en la función del gen, o en la función del producto génico (es decir, la proteína codificada por el gen) se puede denominar inactivación (completa o parcial), desactivación, deleción, alteración, interrupción, bloqueo, silenciamiento o regulación de forma negativa, o atenuación de la expresión de un gen. Por ejemplo, una modificación genética en un gen que da como resultado una disminución de la función de la proteína codificada por dicho gen, puede ser el resultado de una eliminación completa del gen (es decir, el gen no existe, y por lo tanto la proteína no existe), una mutación en el gen que da como resultado una traducción incompleta (interrupción) o nula de la proteína (por ejemplo, la proteína no se expresa), o una mutación en el gen que disminuye o anula la función natural de la proteína (por ejemplo, se expresa una proteína que tiene una actividad o acción enzimática reducida o nula). Más específicamente, la referencia a la disminución de la acción de las proteínas analizadas en el presente documento generalmente se refiere a cualquier modificación genética en la célula hospedadora en cuestión, lo que da como resultado una disminución de la expresión y/o funcionalidad (actividad biológica) de las proteínas e incluye una menor actividad de las proteínas (por ejemplo, disminución de la catálisis), aumento de la inhibición o degradación de las proteínas, así como una reducción o eliminación de la expresión de las proteínas. Por ejemplo, la acción o actividad de una proteína se puede disminuir bloqueando o reduciendo la producción de la proteína, reduciendo la acción de la proteína o inhibiendo la acción de la proteína. También son posibles combinaciones de algunas de estas modificaciones. El bloqueo o la reducción de la producción de una proteína pueden incluir la colocación del gen que codifica la proteína bajo el control de un promotor que requiere la presencia de un compuesto inductor en el medio de crecimiento. Al establecer condiciones tales que el inductor se agote del medio, la expresión del gen que codifica la proteína (y, por lo tanto, de la síntesis de proteínas) se podría desactivar. El bloqueo o la reducción de la acción de una proteína también podría incluir el uso de un enfoque de tecnología de escisión similar al que se describe en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 4.743.546. Para usar este enfoque, el gen que codifica la proteína de interés se clona entre secuencias genéticas específicas que permiten la escisión controlada y específica del gen del genoma. La escisión podría ser provocada, por ejemplo, por un cambio en la temperatura de cultivo del cultivo, tal como en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 4.743.546, o por alguna otra señal física o nutricional.

En general, de acuerdo con la presente invención, un aumento o una disminución en una característica dada de una proteína mutante o modificada (por ejemplo, actividad enzimática) se realiza con referencia a la misma característica de una proteína precursora (es decir, normal, no modificada) que se obtiene a partir del mismo organismo (de la misma fuente o secuencia precursora), que se mide o establece en las mismas condiciones o equivalentes. De manera similar, un aumento o disminución en una característica de una célula hospedadora modificada genéticamente (por ejemplo, expresión y/o actividad biológica de una proteína, o producción de un producto) se hace con referencia a la misma característica de una célula hospedadora de tipo silvestre de la misma especie, y preferentemente de la misma cepa, en las mismas condiciones o equivalentes. Las condiciones de ese tipo incluyen el ensayo o las condiciones de cultivo (por ejemplo, componentes del medio, temperatura, pH, etc.) bajo los cuales se mide la actividad de la proteína (por ejemplo, expresión o actividad biológica) u otra característica de la célula hospedadora, tal como el tipo de ensayo usado, la célula hospedadora que se evalúa, etc. Como se ha discutido anteriormente, las condiciones equivalentes son condiciones (por ejemplo, condiciones de cultivo) que son similares, pero no necesariamente idénticas (por ejemplo, se pueden tolerar algunos cambios conservadores en las condiciones), y que no cambian sustancialmente el efecto sobre el crecimiento celular o la expresión enzimática o la actividad biológica comparándolo con una comparación realizada en las mismas condiciones.

Preferentemente, una célula hospedadora modificada genéticamente y que tienen una modificación genética que aumenta o disminuye (reduce) la actividad de una proteína dada (por ejemplo, una O-manosiltransferasa o proteasa) tiene un aumento o disminución, respectivamente, en la actividad o acción (por ejemplo, expresión, producción y/o actividad biológica) de la proteína, en comparación con la actividad de la proteína en una célula hospedadora precursora (que no tiene una modificación genética de ese tipo), de al menos aproximadamente un 5 %, y más preferentemente al menos aproximadamente un 10 %, un 15 %, un 20 %, un 25 %, un 30 %, un 35 %, un 40 %, un 45 %, un 50 %, un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85%, un 90 %, un 95 %, o cualquier porcentaje, en números enteros entre un 5 % y un 100 % (por ejemplo, 6 %, 7 %, 8 %, etc.).

En otro aspecto de la invención, una célula hospedadora modificada genéticamente y que tienen una modificación genética que aumenta o disminuye (reduce) la actividad de una proteína dada (por ejemplo, una O-manosiltransferasa o proteasa) tiene un aumento o disminución, respectivamente, en la actividad o acción (por ejemplo, expresión, producción y/o actividad biológica) de la proteína, en comparación con la actividad de la proteína de tipo silvestre en una célula hospedadora precursora, de al menos aproximadamente 2 veces, y más preferentemente al menos aproximadamente 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, 125 veces, 150 veces, o cualquier incremento de número entero comenzando desde al menos aproximadamente 2 veces (por ejemplo, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, etc.).

Como se usa en el presente documento, los términos "idéntico" o "identidad porcentual", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Dos secuencias son "básicamente idénticas" si dos secuencias tienen un porcentaje específico de restos de aminoácido o nucleótido que son iguales (es decir, un 29 % de identidad, opcionalmente un 30 %, un 40 %, un 45 %, un 50 %, un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 99 % o un 100 % de identidad con respecto a una región especificada, o, cuando no se especifica, con respecto a toda la secuencia), cuando se compara y alinea para una correspondencia máxima con respecto a una ventana de comparación, o una región designada de acuerdo con lo medido usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o por alineamiento manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad existe sobre una región que tiene al menos aproximadamente 50 nucleótidos (o 10 aminoácidos) de longitud, o más preferentemente con respecto a una región que tiene una longitud de 100 a 500 o 1000 o más nucleótidos (o 20, 50, 200 o más) aminoácidos).

Para la comparación de secuencias, generalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, las coordenadas de la subsecuencia se diseñan, si fuera necesario, y se diseñan los parámetros del programa de algoritmos de secuencia. Se pueden usar parámetros del programa por defecto, o se pueden diseñar parámetros alternativos. A continuación el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, en función de los parámetros del programa. Al comparar dos secuencias para la identidad, no es necesario que las secuencias sean contiguas, pero cualquier hueco podría conllevar a una penalización que podría reducir el porcentaje de identidad general. Para blastn, los parámetros por defecto son penalización de apertura de hueco = 5 y penalización de extensión de espacio = 2. Para blastp, los parámetros por defecto son penalización de apertura de hueco = 11 y penalización de extensión de hueco = 1.

Una "ventana de comparación", como se usa en el presente documento, incluye una referencia a un segmento de una cualquiera de las posiciones contiguas que incluyen, entre otras, de 20 a 600, generalmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más generalmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en una secuencia en la que la secuencia se puede comparar con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias estén alineadas de manera óptima. En la técnica se conocen bien los métodos de alineamiento de secuencias para comparación. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación se puede realizar, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (1970) J Mol Biol 48 (3): 443 453, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85 (8): 2444-2448, by mediante implementaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineamiento manual e inspección visual [véase, por ejemplo, Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou Ed)].

Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al,. (1997) Nucleic Acids Res 25 (17): 3389-3402 y Altschul et al,. (1990) J. Mol Biol 215 (3)-403-410, respectivamente. El software para realizar los análisis de BLAST está disponible al público a través del National Center for Biotechnology Information. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como defectos una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) o 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como valor predeterminado una longitud de palabra de 3, y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 [véase Henikoff y Henikoff, (1992) Proc NatI Acad Sci USA 89 (22): 10915-10919] alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras.

El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90 (12): 5873-5877). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos se podría producir por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0,2, más preferentemente menor que aproximadamente 0,01, y lo más preferentemente menos de aproximadamente 0,001.

"Variante funcional" o "gen homólogo funcional" como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de codificación o una proteína que tiene una similitud de secuencia con una secuencia de referencia, generalmente, una identidad de al menos un 30 %, un 40 %, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 % o un 95 % con la secuencia de codificación o proteína de referencia, y conservando básicamente la misma función que dicha secuencia de codificación o proteína de referencia. Una variante funcional puede conservar la misma función pero con actividad reducida o aumentada. Las variantes funcionales incluyen variantes naturales, por ejemplo, homólogos de diferentes especies o variantes artificiales, resultantes de la introducción de una mutación en la secuencia de codificación. La variante funcional puede ser una variante con solo mutaciones modificadas de manera conservativa. Las "mutaciones modificadas de manera conservativa" como se usan en el presente documento incluyen sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de aminoácidos codificada que dan como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares se conocen bien en la técnica. Las variantes modificadas de manera conservativa de ese tipo son, además y no excluyen, variantes polimórficas, homólogos interespecies y alelos de la divulgación. Los siguientes ocho grupos contienen aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).

Células fúngicas filamentosas

Como se usa en el presente documento, "células fúngicas filamentosas" incluye células de todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (de acuerdo con lo definido por Hawksworth et al., En, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido). Las células fúngicas filamentosas se caracterizan generalmente por una pared micelial formada por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo se produce por elongación de hifas y el catabolismo del carbono es necesariamente aeróbico. Por el contrario, el crecimiento vegetativo de las levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae se debe al brote de un talo unicelular y el catabolismo del carbono puede ser fermentativo.

Preferentemente, la célula fúngica filamentosa no se ve afectada de forma adversa por la transducción de las secuencias de ácido nucleico necesarias, la expresión posterior de las proteínas (por ejemplo, proteínas de mamíferos) o los productos intermedios resultantes. Los métodos generales para alterar genes y cultivar células fúngicas filamentosas se desvelan, por ejemplo, para Penicillium, en Kopke et al,. (2010) Appl Environ Microbiol. 76 (14): 4664-74. doi: 10.1128/AEM.00670-10, para Aspergillus, en Maruyama y Kitamoto (2011), Methods in Molecular Biology, vol. 765, DOI10.1007/978-1-61779-197-0_27; para Neurospora, en Collopy et al,. (2010) Methods Mol Biol.

2010; 638:33-40. doi: 10.1007/978-1-60761-611-5_3; y para Myceliophthora o Chrysosporium en los documentos PCT/NL2010/000045 y PCT/EP98/06496.

Los ejemplos de células fúngicas filamentosas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células de una cepa de Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Scytalidium, Thielavia, Tolypocladium, o Trichoderma/Hypocrea.

En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa es de una cepa de Trichoderma sp., Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Chrysosporium, Chrysosporium lucknowense, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Myrothecium, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, o Tolypocladium.

En algunas realizaciones, la célula fúngica filamentosa es una cepa de Myceliophthora o Chrysosporium, Neurospora o Trichoderma.

Las células fúngicas de Aspergillus de la presente divulgación pueden incluir, pero no se limitan a, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus clavatus, Aspergillus flavus, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, o Aspergillus terreus.

Las células fúngicas de Neurospora de la presente divulgación pueden incluir, pero no se limitan a, Neurospora crassa.

Las células fúngicas de Myceliophthora de la presente divulgación pueden incluir, pero no se limitan a, Myceliophthora thermophila.

En una realización preferente, la célula fúngica filamentosa es una célula fúngica de Trichoderma. Las células fúngicas de Trichoderma de la presente divulgación se pueden obtener a partir de una cepa de Trichoderma de tipo silvestre o un mutante de la misma. Los ejemplos de células fúngicas de Trichoderma incluyen, pero no se limitan a, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma atroviride, Trichoderma virens, Trichoderma viride; y formas sexuales alternativas de las mismas (es decir, Hypocrea).

En una realización más preferente, la célula fúngica filamentosa es una célula de Trichoderma reesei, y por ejemplo, cepas obtenidas a partir de ATCC 13631 (QM 6a), ATCC 24449 (mutante de radiación 207 de QM 6a), A^tCC 26921 (QM 9414; mutante de ATCC 24449), VTT-D-00775 (Selinheimo et al., FEBS J., 2006, 273: 4322-4335), Rut-C30 (ATCC 56765), RL-P37 (NRRL 15709) o aislado T3 de T. harzianum (Wolffhechel, H., 1989).

La presente divulgación también se refiere a una célula fúngica filamentosa deficiente en PMT, por ejemplo seleccionada entre células de Trichoderma, Neurospora, Myceliophthora o una célula de Chrysosporium, tal como célula fúngica de Trichoderma reesei, que comprende:

a. al menos una primera mutación que reduce o elimina una actividad de proteasa endógena en comparación con la célula fúngica filamentosa precursora que no tiene dicha primera mutación (es decir, una mutación con deficiencia de proteasa), y,

b. al menos una segunda mutación en un gen PMT que reduce o elimina una actividad de O-manosiltransferasa endógena en comparación con una célula fúngica filamentosa precursora que no tiene dicha segunda mutación (es decir, una mutación con deficiencia de PMT).

Proteasas con actividad reducida

Se ha encontrado que la reducción de la actividad de la proteasa permite aumentar básicamente la producción de proteína de mamífero heteróloga. De hecho, tales proteasas encontradas en células fúngicas filamentosas que expresan una proteína heteróloga normalmente catalizan una degradación significativa de la proteína recombinante expresada. Por lo tanto, al reducir la actividad de las proteasas en las células fúngicas filamentosas que expresan una proteína heteróloga, la estabilidad de la proteína expresada aumenta, lo que da como resultado un mayor nivel de producción de la proteína y, en algunas circunstancias, mejora la calidad de la proteína producida (por ejemplo, de longitud completa en lugar de degradada).

Las proteasas incluyen, pero no se limitan a, proteasas aspárticas, serina proteasas de tipo tripsina, subtilisina proteasas, proteasas glutámicas, y sedolisina proteasas. Las proteasas de ese tipo se pueden identificar y aislar de las células fúngicas filamentosas y analizarse para determinar si la reducción de su actividad afecta a la producción de un polipéptido recombinante de la célula fúngica filamentosa. En la técnica se conocen bien los métodos para identificar y aislar proteasas, e incluyen, pero no se limitan a, cromatografía por afinidad, ensayos de zimograma y electroforesis en gel. Una proteasa identificada a continuación se puede someter a ensayo mediante deleción del gen que codifica la proteasa identificada a partir de una célula fúngica filamentosa que expresa un polipéptido recombinantes, tal como un polipéptido heterólogo o de mamífero, y determinando si la deleción da como resultado una disminución de la actividad de la proteasa total de la célula, y un aumento del nivel de producción del polipéptido recombinante expresado. Los métodos para eliminar producir deleción de genes, medir la actividad de proteasa total y medir los niveles de proteína producida se conocen bien en la técnica e incluyen los métodos que se describen en el presente documento.

Proteasas Aspárticas

Las proteasas aspárticas son enzimas que usan un resto de aspartato para la hidrólisis de los enlaces peptídicos en polipéptidos y proteínas. Por lo general, las proteasas aspárticas contienen dos restos de aspartato altamente conservados en su sitio activo que son óptimamente activos a pH ácido. Las proteasas aspárticas de organismos eucariotas tales como los hongos Trichoderma incluyen pepsinas, catepsinas y reninas. Estas proteasas aspárticas tienen una estructura de dos dominios, que se cree que surge de la duplicación de genes ancestrales. Coherente con un suceso de duplicación de ese tipo, el plegamiento total de cada dominio es similar, aunque las secuencias de los dos dominios han comenzado a divergir. Cada dominio contribuye con uno de los restos de aspartato catalíticos. El sitio activo se encuentra en una hendidura formada por los dos dominios de las proteasas aspárticas. Las proteasas aspárticas eucariotas incluyen además puentes disulfuro conservados, que pueden ayudar en la identificación de los polipéptidos como proteasas de ácido aspártico.

Se han identificado nueve proteasas aspárticas en células fúngicas de Trichoderma: pepl (tre74156); pep2 (tre53961); pep3 (tre121133); pep4 (tre77579), pep5 (tre81004), y pep7 (tre58669), pep8 (tre122076), pep11 (121306), y pep12 (tre119876).

Los ejemplos de proteasas aspárticas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, pep1 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 22), pep2 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 18), pep3 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 19); pep4 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 20), pep5 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 21) y pep7 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 23), EGR48424 pep8 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 134), EGR49498 pep11 de Trichoderma reesei (SEQ ID ^{N o :}135), EGR52517 pep12 de Trichoderma reesei (SEQ ID ^{N o :}35), y homólogos de las mismas. Los ejemplos de homólogos de proteasas pep1, pep2, pep3, pep4, pep5, pep7, pep8, pep11 y pep12 identificados en otros organismos también se describen en el documento PCT/EP/2013/050186, cuyo contenido se incorpora por referencia.

Serina Proteasas de Tipo Tripsina

Las serina proteasas de tipo tripsina son enzimas con una especificidad de sustrato similar a la de la tripsina. Las serina proteasas de tipo tripsina usan un resto de serina para la hidrólisis de los enlaces peptídicos en polipéptidos y proteínas. Normalmente, las serina proteasas de tipo tripsina escinden los enlaces peptídicos después de un resto de aminoácido con carga positiva. Las serina proteasas de tipo tripsina de organismos eucariotas tales como los hongos Trichoderma incluyen la tripsina 1, la tripsina 2 y la mesotripsina. Estas serinas proteasas de tipo tripsina generalmente contienen una tríada catalítica de tres restos de aminoácido (tales como histidina, aspartato y serina) que forman un relevo de carga que sirve para hacer que el sitio activo sea nucleófilo. Las serina proteasas de tipo tripsina eucariotas incluyen además un "orificio de oxianión" formado por los átomos de hidrógeno de la amida de la estructura principal de la glicina y la serina, que pueden ayudar en la identificación de los polipéptidos que son serina proteasas de tipo tripsina.

Se ha identificado una serina proteasa de tipo tripsina en células fúngicas de Trichoderma: tsp1 (tre73897). Como se ha discutido en el documento PCT/EP/2013/050186, se ha demostrado que tsp1 tiene un impacto significativo en la expresión de glicoproteínas recombinantes, tales como las inmunoglobulinas.

Los ejemplos de proteasas tsp1 adecuadas incluyen, pero no se limitan a, tsp1 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 24) y homólogos de las mismas. Los ejemplos de homólogos de proteasas tsp1 identificados en otros organismos se describen en el documento PCT/EP/2013/050186.

Subtilisina Proteasas

Las subtilisina proteasas son enzimas con especificidad de sustrato similar a la de la subtilisina. Las subtilisina proteasas usan un resto de serina para la hidrólisis de los enlaces peptídicos en polipéptidos y proteínas. En general, las subtilisina proteasas son serina proteasas que contienen una tríada catalítica de los tres aminoácidos aspartato, histidina y serina. La disposición de estos restos catalíticos se comparte con la subtilisina prototípica de Bacillus licheniformis. Las subtilisina proteasas de organismos eucariotas tales como los hongos Trichoderma incluyen furina, MBTPS1 y TPP2. La serina proteasas de tipo tripsina eucariotas incluyen además un resto de ácido aspártico en el orificio de oxianión.

Se han encontrado siete subtilisina proteasas en células fúngicas de Trichoderma: slp1 (tre51365); slp2 (tre123244); slp3 (tre123234); slp5 (tre64719), slp6 (tre121495), slp7 (tre123865), y slp8 (tre58698). La subtilisina proteasa slp7 también se parece a la sedolisina proteasa tppl.

Los ejemplos de proteasas slp adecuadas incluyen, pero no se limitan a, slp1 (SEQ ID NO: 25), slp2 (SEQ ID NO: 26); slp3 (SEQ ID NO: 27); slp5 (SEQ ID NO: 28), slp6 (SEQ ID NO: 29), slp7 (SEQ ID NO: 30), y slp8 (SEQ ID NO: 31), de Trichoderma reesei, y homólogos de las mismas. Los ejemplos de homólogos de proteasas slp identificadas en otros organismos se describen en el documento PCT/EP/2013/050186.

Proteasas Glutámicas

Las proteasas glutámicas son enzimas que hidrolizan los enlaces etílicos en polipéptidos y proteínas. Las proteasas glutámicas son insensibles a la pepstatina A, y por lo tanto en ocasiones se denominan proteasas ácidas insensibles a pepstatina. Aunque las proteasas glutámicas previamente se agruparon con las proteasas aspárticas y a menudo se denominan de forma conjunta proteasas ácidas, recientemente se ha encontrado que las proteasas glutámicas tienen restos de sitio activo muy diferentes a dos de las proteasas aspárticas.

Se han identificado dos proteasas glutámicas en células fúngicas de Trichoderma: gap1 (tre69555) y gap2 (tre106661).

Los ejemplos de proteasas gap adecuadas incluyen, pero no se limitan a, gap1 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 32), gap2 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 33), y homólogos de las mismas. Los ejemplos de homólogos de proteasas gap identificados otros organismos se describen en el documento PCT/EP/2013/050186.

Sedolisina Proteasas y homólogos de proteasas

Las sedolisina proteasas son enzimas que usan un resto de serina para la hidrólisis de los enlaces peptídicos en polipéptidos y proteínas. Las sedolisina proteasas generalmente contienen una tríada catalítica única de serina, glutamato y aspartato. Las sedolisina proteasas también contienen un resto de aspartato en el orificio de oxianión. Las sedolisina proteasas de organismos eucariotas tales como los hongos Trichoderma incluyen la tripeptidil peptidasa.

Los ejemplos de proteasas tpp1 adecuadas incluyen, pero no se limitan a, tpp1 tre82623 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 34) y homólogos de las mismas. Los ejemplos de homólogos de proteasas tpp1 identificados en otros organismos se describen en el documento PCT/EP/2013/050186.

Como se usa en referencia a la proteasa, el término "homólogo" se refiere a una proteína que tiene actividad proteasa y presenta una similitud de secuencia con una secuencia de proteasa conocida (referencia). Los homólogos se pueden identificar mediante cualquier método conocido en la técnica, preferentemente, usando la herramienta BLAST para comparar una secuencia de referencia con una segunda secuencia o fragmento de una secuencia o con una base de datos de secuencias. Como se describe en la sección "Definiciones", BLAST comparará secuencias basadas en el porcentaje de identidad y similitud.

Preferentemente, una proteasa homóloga tiene una identidad de al menos un 30 % con (opcionalmente un 30 %, un 40 %, un 45 %, un 50 %, un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 99% o un 100% con respecto a la región especificada, o, cuando no se especifica, con respecto a toda la secuencia), cuando se compara con una de las secuencias de proteasas que se han enumerado anteriormente, incluyendo pep1, pep2, pep3, pep4, pep5, pep7, pep8, pep11, pep12, tsp1, slp1, slp2, slp3, slp5, slp6, slp7, slp8, tpp1, gap1 y gap2 de T. reesei. Las proteasas homólogas correspondientes de N. crassa y M. thermophila se muestran en la SEQ ID NO: 136-169.

Reducción de la actividad de proteasas en la célula fúngica filamentosa de la invención

Las células fúngicas filamentosas de acuerdo con la invención tienen una actividad reducida de al menos una proteasa endógena, por lo general 2, 3, 4, 5 o más, para mejorar la estabilidad y la producción de la proteína con O-manosilación reducida en dicha célula fúngica filamentosa, preferentemente en una célula de Trichoderma deficiente en PMT.

La actividad de las proteasas encontradas en las células fúngicas filamentosas se puede reducir mediante cualquier método conocido por los expertos en la materia. En algunas realizaciones, la actividad reducida de las proteasas se consigue reduciendo la expresión de la proteasa, por ejemplo, mediante la modificación del promotor o ARNi.

En otras realizaciones, la expresión reducida o eliminada de las proteasas es el resultado de polinucleótidos no codificantes o construcciones de ARNi que son específicas para cada uno de los genes que codifican cada una de las proteasas. En una realización, una construcción de ARNi es específica para un gen que codifica una proteasa aspártica como una proteasa de tipo pep, una serina proteasa de tipo tripsina tal como una tsp1, una proteasa glutámica tal como una proteasa de tipo gap, una subtilisina proteasa tal como una proteasa de tipo sip, o una sedolisina proteasa tal como una proteasa tpp1 o slp7. En una realización, una construcción de ARNi es específica para el gen que codifica una proteasa de tipo slp. En una realización, una construcción de ARNi es específica para el gen que codifica slp2, slp3, slp5 o slp6. En una realización, una construcción de ARNi es específica para dos o más proteasas. En una realización, dos o más proteasas son una cualquiera de las proteasas de tipo pep, una cualquiera de las serina proteasas de tipo tripsina, una cualquiera de las proteasas de tipo slp, una cualquiera de las proteasas de tipo gap y/o una cualquiera de las sedolisina proteasas. En una realización, dos o más proteasas son slp2, slp3, slp5 y/o slp6. En una realización, la construcción de ARNi comprende una cualquiera de las siguientes secuencias de ácido nucleico (véase también el documento PCT/EP/2013/050186).

En otras realizaciones, la actividad reducida de las proteasas se consigue modificando el gen que codifica la proteasa. Los ejemplos de modificaciones de ese tipo incluyen, pero no se limitan a, una mutación, tal como una deleción o alteración del gen que codifica dicha actividad de proteasa endógena.

Por consiguiente, la invención se refiere a una célula de Trichoderma deficiente en PMT, que tiene una primera mutación que reduce o elimina al menos una actividad de proteasa endógena en comparación con una célula fúngica filamentosa precursora que no tiene una mutación deficiente en proteasa de ese tipo, siendo dichas proteasas endógenas seleccionadas entre proteasas aspárticas, serina proteasas de tipo tripsina, subtilisina proteasas, proteasas glutámicas, y sedolisina proteasas, comprendiendo dicha célula fúngica filamentosa además al menos una segunda mutación en un gen PMT que reduce la actividad de proteína O-manosiltransferasa endógena en comparación con una célula precursora de Trichoderma que no tiene dicha segunda mutación deficiente en PMT.

La mutación de deleción o alteración incluye, pero no se limita a, una mutación de desactivación genética, una mutación de truncamiento, una mutación puntual, una mutación de sentido erróneo, una mutación de sustitución, una mutación de desplazamiento de marco, una mutación de inserción, una mutación de duplicación, una mutación de amplificación, una mutación de translocación o una mutación de inversión, y que da como resultado una reducción de la actividad de proteasa correspondiente. Los métodos para generar al menos una mutación en un gen que codifica una proteasa de interés son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis aleatoria e identificación sistemática, mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis por PCR, mutagénesis por inserción, mutagénesis química e irradiación.

En ciertas realizaciones, una parte del gen que codifica la proteasa se modifica, tal como la región que codifica el dominio catalítico, la región de codificación o una secuencia de control requerida para la expresión de la región de codificación. Una secuencia de control del gen de ese tipo puede ser una secuencia promotora o una parte funcional de la misma, es decir, una parte que es suficiente para afectar la expresión del gen. Por ejemplo, una secuencia promotora se puede inactivar dando como resultado que no haya expresión o un promotor más débil se puede sustituir por la secuencia promotora nativa para reducir la expresión de la secuencia de codificación. Otras secuencias de control para la posible modificación incluyen, pero no se limitan a, una secuencia líder, una secuencia propeptídica, una secuencia señal, un terminador de transcripción y un activador de la transcripción.

Los genes que codifican proteasas que están presentes en las células fúngicas filamentosas también se pueden modificar usando técnicas de deleción genética para eliminar o reducir la expresión del gen. Las técnicas de deleción genética permiten la eliminación parcial o completa del gen, eliminando de ese modo su expresión. En tales métodos, la deleción del gen se puede conseguir mediante recombinación homóloga usando un plásmido que se ha construido para que contenga contiguamente las regiones en las posiciones 5' y 3' que flanquean el gen.

La proteasa que codifica los genes que están presentes en las células fúngicas filamentosas también se puede modificar introduciendo, sustituyendo y/o eliminando uno o más nucleótidos en el gen, o una secuencia de control de la misma requerida para la transcripción o traducción del gen. Por ejemplo, los nucleótidos se pueden insertar o eliminar para la introducción de un codón de parada, la eliminación del codón de inicio o un desplazamiento del marco en el marco de lectura abierto. Una modificación de ese tipo se puede conseguir mediante métodos conocidos en la técnica, que incluyen sin limitación, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis generada por peR (véase, por ejemplo, Botstein y Shortie, 1985, Science 229: 4719; Lo et al., 1985, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 2285; Higuchi et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 7351; Shimada, 1996, Meth. Mol. Bioi. 57: 157; Ho et al., 1989, Gene 77: 61; Horton et al., 1989, Gene 77: 61; y Sarkar y Sommer, 1990, BioTechniques 8: 404).

Además, los genes que codifican proteasas que están presentes en las células fúngicas filamentosas se pueden modificar mediante técnicas de alteración génica insertando en el gen una construcción de alteración de ácido nucleico que contiene un fragmento de ácido nucleico homólogo al gen que creará una duplicación de la región de homología e incorporará una construcción de ácido nucleico entre las regiones duplicadas. Una interrupción del gen de ese tipo puede eliminar la expresión del gen si la construcción insertada separa el promotor del gen de la región de codificación o interrumpe la secuencia de codificación de tal manera que se produzca un producto génico no funcional. Una construcción de alteración puede ser simplemente un gen marcador seleccionable acompañado por las regiones en las posiciones 5' y 3' homólogas al gen. El marcador seleccionable permite la identificación de transformantes que contienen el gen alterado.

La proteasa que codifica los genes que están presentes en las células fúngicas filamentosas también se puede modificar mediante el proceso de conversión génica (véase, por ejemplo, Iglesias y Trautner, 1983, Molecular General Genetics 189: 5 73-76). Por ejemplo, en la conversión del gen, una secuencia de nucleótidos correspondiente al gen se somete a mutagénesis in vitro para producir una secuencia de nucleótidos defectuosa, que a continuación se transforma en una cepa de Trichoderma para producir un gen defectuoso. Por recombinación homóloga, la secuencia de nucleótidos defectuosa reemplaza al gen endógeno. Puede ser deseable que la secuencia de nucleótidos defectuosa también contenga un marcador para la selección de transformantes que contienen el gen defectuoso.

Los genes que codifican de proteasas de la presente divulgación que están presentes en células fúngicas filamentosas que expresan un polipéptido recombinante también se pueden modificar mediante técnicas no codificantes establecidas usando una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos del gen (véase, por ejemplo, Parish y Stoker , 1997, FEMS Microbiology Letters 154: 151-157). En particular, la expresión del gen por células filamentosas fúngicas se puede reducir o inactivar introduciendo una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos del gen, que se puede transcribir en la cepa y es capaz de hibridarse con el ARNm producido en las células. En condiciones que permiten que la secuencia de nucleótidos no codificantes complementaria se hibride con el ARNm, la cantidad de proteína traducida se reduce o elimina.

Los genes que codifican proteasas que están presentes en las células fúngicas filamentosas también se pueden modificar por mutagénesis aleatoria o específica usando métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo sin limitación, mutagénesis química (véase, por ejemplo, Hopwood, The Isolation of Mutants in Methods in Microbiology (J.R. Norris y D.W. Ribbons, eds.) pp. 363-433, Academic Press, New York, 25 1970). La modificación del gen se puede realizar sometiendo las células fúngicas filamentosas a mutagénesis y seleccionando las células mutantes en las que la expresión del gen se ha reducido o inactivado. La mutagénesis, que puede ser específica o aleatoria, se puede realizar, por ejemplo, mediante el uso de un agente de mutagénesis físico o químico adecuado, el uso de un oligonucleótido adecuado, sometiendo la secuencia de ADN a mutagénesis generada por peR, o cualquier combinación de las mismas. Los ejemplos de agentes mutagénicos físicos y químicos incluyen, pero no se limitan a, irradiación ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), N-metil-N'-nitrosoguanidina (NTG) O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil metano sulfonato (EMS), bisulfito sódico, ácido fórmico y análogos de nucleótidos. Cuando se usan agentes de ese tipo, la mutagénesis se realiza generalmente mediante la incubación de las células fúngicas filamentosas, tales como células de Trichoderma, para que experimenten mutagénesis en presencia del agente de mutagénesis de elección en condiciones adecuadas, y a continuación seleccionando mutantes que muestran una expresión reducida o nula del gen.

En ciertas realizaciones, la al menos una mutación o modificación en un gen que codifica proteasa de la presente divulgación da como resultado una proteasa modificada que no tiene actividad proteasa detectable. En otras realizaciones, la al menos una modificación en un gen que codifica la proteasa de la presente divulgación da como resultado una proteasa modificada que tiene al menos un 25 % menos, al menos un 50 % menos, al menos un 75 % menos, al menos un 90 %, al menos un 95 %, o un porcentaje más elevado de menos actividad de proteasa en comparación con una proteasa no modificada correspondiente.

Las células fúngicas filamentosas o células fúngicas de Trichoderma de la presente divulgación pueden tener una actividad proteasa reducida o no detectable de al menos tres, o al menos cuatro proteasas seleccionadas entre el grupo que consiste en pep1, pep2, pep3, pep4, pep5, pep8, pep11, pep12, tsp1, slp1, slp2, slp3, slp5, slp6, slp7, gap1 y gap2. En una realización preferente, una célula fúngica filamentosa de acuerdo con la invención es una célula fúngica filamentosa deficiente en PMT que tiene una deleción o alteración en al menos 3 o 4 proteasas endógenas, dando como resultado una actividad no detectable para tales proteasas endógenas eliminadas o interrumpidas y que además comprende otra mutación en un gen PMT que reduce actividad de proteína O-manosiltransferasa endógena en comparación con una célula precursora de Trichoderma que no tiene dicha mutación.

En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa deficiente en PMT o célula de Trichoderma, tiene una actividad de proteasa reducida o no detectable en pep1, tsp1, y slp1. En otras realizaciones, la célula fúngica filamentosa deficiente en PMT o célula de Trichoderma, tiene una actividad de proteasa reducida o no detectable en gap1, slp1, y pep1. En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa deficiente en PMT o célula de Trichoderma, tiene una actividad de proteasa reducida o no detectable en slp2, pep1 y gap1. En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa deficiente en PMT o célula de Trichoderma, tiene una actividad de proteasa reducida o no detectable en slp2, pep1, gap1 y pep4. En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa deficiente en PMT o célula de Trichoderma, tiene una actividad de proteasa reducida o no detectable en slp2, pep1, gap1, pep4 y slp1. En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa deficiente en PMT o célula de Trichoderma, tiene una actividad de proteasa reducida o no detectable en slp2, pep1, gap1, pep4, slp1, y slp3. En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa deficiente en PMT o célula de Trichoderma, tiene una actividad de proteasa reducida o no detectable en slp2, pep1, gap1, pep4, slp1, slp3, y pep3. En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa deficiente en PMT o célula de Trichoderma, tiene una actividad de proteasa reducida o no detectable en slp2, pep1, gap1, pep4, slp1, slp3, pep3 y pep2. En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa deficiente en ^pM^to célula de Trichoderma, tiene una actividad de proteasa reducida o no detectable en slp2, pep1, gap1, pep4, slp1, slp3, pep3, pep2 y pep5. En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa deficiente en PMT o célula de Trichoderma, tiene una actividad de proteasa reducida o no detectable en slp2, pep1, gap1, pep4, slp1, slp3, pep3, pep2, pep5 y tsp1. En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa deficiente en PMT o célula de Trichoderma, tiene una actividad de proteasa reducida o no detectable en slp2, pep1, gap1, pep4, slp1, slp3, pep3, pep2, pep5, tsp1 y slp7. En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa deficiente en PMT o célula de Trichoderma, tiene una actividad de proteasa reducida o no detectable en slp2, pep1, gap1, pep4, slp1, slp3, pep3, pep2, pep5, tsp1, slp7 y slp8. En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa deficiente en ^pM^to célula de Trichoderma, tiene una actividad de proteasa reducida o no detectable en slp2, pep1, gap1, pep4, slp1, slp3, pep3, pep2, pep5, tsp1, slp7, slp8 y gap2. En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa deficiente en PMT o célula de Trichoderma, tiene una actividad de proteasa reducida o no detectable en al menos tres proteasas endógenas seleccionadas entre el grupo que consiste en pep1, pep2, pep3, pep4, pep5, pep8, pep11, pep12, tsp1, slp2, slp3, slp7, gap1 y gap2. En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa deficiente en PMT o célula de Trichoderma, tiene una actividad de proteasa reducida o no detectable en al menos tres a seis proteasas endógenas seleccionadas entre el grupo que consiste en pep1, pep2, pep3, pep4, pep5, tsp1, slp1, slp2, slp3, gap1 y gap2. En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa deficiente en PMT o célula de Trichoderma, tiene una actividad de proteasa reducida o no detectable en al menos siete a diez proteasas endógenas seleccionadas entre el grupo que consiste en pep1, pep2, pep3, pep4, pep5, pep7, pep8, tsp1, slp1, slp2, slp3, slp5, slp6, slp7, slp8, tpp1, gap1 y gap2.

En una realización que se puede combinar con las realizaciones precedentes, la célula fúngica filamentosa de la invención no comprende una deleción o alteración de un gen endógeno que codifica una proteína chaperona. En una realización particular de la presente invención, dicha célula fúngica filamentosa de la invención expresa una proteína chaperona endógena funcional, la Proteína Disulfuro Isomerasa (PDI).

O-manosiltransferasa endógena en células fúngicas filamentosas

Las O-manosiltransferasas están codificadas por genes pmt en levaduras y hongos filamentos, que se pueden dividir en tres subfamilias, basándose en homologías de secuencias: PMT1, PMT2 y PMT4.

Por ejemplo, en la levadura S. cerevisiae, se han caracterizado 7 PMT diferentes: ScPMT1, ScPMT5 y ScPMT7 pertenecen a la subfamilia PMT1. ScPMT2, ScPMT3 y ScPMT6 pertenecen a la subfamilia PMT2 y ScPMT4 pertenece a la subfamilia PMT4. Las O-manosiltransferasas de ese tipo y sus secuencias de codificación se pueden identificar y aislar a partir de células fúngicas filamentosas y se pueden someter a ensayo para determinar si la reducción de su actividad permite la reducción de la O-manosilación en la proteína recombinante O-manosilada secretada que preferentemente no influye en la producción de un polipéptido recombinante de ese tipo a partir de la célula fúngica filamentosa. Los métodos para identificar y aislar las PMT se conocen bien en la técnica. A continuación una O-manosiltransferasa identificada se puede someter a ensayo mediante deleción del gen que codifica la O-manosiltransferasa identificada a partir de una célula fúngica filamentosa que expresa una proteína O-manosilada recombinante, tal como una proteína O-manosilada heteróloga o de mamífero, y determinando si la the deleción da como resultado una disminución de la actividad de O-manosiltransferasa total de la célula, no influyendo preferentemente en el nivel de producción de la proteína recombinante expresada. Los métodos para producir una deleción de genes y medir los niveles de proteína producida se conocen bien la técnica que incluyen los métodos que se describen en el presente documento.

Se han identificado tres O-manosiltransferasas en células fúngicas de Trichoderma: pmtl, pmt2 y pmt3, que pertenecen respectivamente, basándose en homologías de secuencias, a la subfamilia PMT4, PMT1 y PMT2.

Los ejemplos de O-manosiltransferasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, pmtl de Trichoderma reesei (SEQ ID nO: 2), pmt2 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 3), pmt3 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 4) y homólogos de las mismas. La Figura 5 muestra la filogenia de homólogos de pmt en hongos filamentosos seleccionados y la figura 6 muestra un alineamiento de dominios conservados de pmt1 entre diferentes especies.

En una realización preferente, dicha célula fúngica filamentosa deficiente en PMT, por ejemplo, una célula de Trichoderma, tiene al menos una mutación en un gen PMT seleccionada entre el grupo que consiste en:

a) gen PMT1 que comprende el polinucleótido de la SEQ ID NO: 1,

b) un gen homólogo funcional del gen PMT1, cuyo gen homólogo funcional es capaz de restablecer el nivel de O-manosilación precursora mediante complementación funcional cuando se introduce en una cepa de T. reesei que tiene una alteración en dicho gen PMT1, y,

Más preferentemente, dicha célula fúngica filamentosa deficiente en PMT, por ejemplo, una célula de Trichoderma, tiene al menos una mutación en un gen PMT que

a) tiene un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % con la SEQ ID NO: 2, y,

b) es capaz de restablecer, al menos un 50%, preferentemente aproximadamente un 100% del nivel de O-manosilación precursora mediante complementación funcional cuando se introduce en una cepa de T. reesei que tiene una alteración en un gen PMT1 de T. reesei.

En los ejemplos que siguen a continuación se desvelan métodos para alterar el gen PMT1 en T. reesei.

Las secuencias de homólogos de pmt1 en hongos filamentos se pueden encontrar en las bases de datos usando herramientas de búsqueda de alineamiento de secuencias, tales como el algoritmo BLAST. Incluyen, pero no se limitan a, gi391865791 de A oryzae, EIT75070.1 (SEQ ID NO: 5), gi317036343, XP_001398147.2 de A niger (SEQ ID NO: 6), gi67522004, XP_659063.1 de A nidulans (SEQ ID NO: 7), gi358379774, EHK17453.1 (de T. virens SEQ ID NO: 8), gi358400594, EHK49920.1 de T. atroviride (SEQ ID NO: 9), gi342879728, EGU80965.1 de F. oxysporum (SEQ ID NO: 10), gi46107450, XP_380784.1 de G. zeae (SEQ ID NO: 11), gi367020262, XP_003659416.1 de M. thermophila (SEQ ID NO: 12), gi164423013, XP_963926.2 de N. crassa (SEQ ID NO: 13), y gi255953619, XP_002567562.1 de P. chrysogenum (SEQ ID NO: 14).

Reducción de la actividad de proteína O-manosiltransferasa endógena en la célula fúngica filamentosa de la invención

Las células fúngicas filamentosas deficientes en PMT de acuerdo con la invención tienen una actividad reducida de al menos una actividad de O-manosiltransferasa, para reducir o disminuir la O-manosilación en dicha célula fúngica filamentosa, preferentemente célula de Trichoderma.

La actividad de dichas O-manosiltransferasas encontradas en células fúngicas filamentosas se puede reducir mediante cualquier método conocido por las personas con experiencia en la materia. En algunas realizaciones la actividad reducida de las O-manosiltransferasas se consigue reduciendo la expresión de las O-manosiltransferasas, por ejemplo, mediante modificación del promotor o ARNi.

En otras realizaciones, la actividad reducida de las O-manosiltransferasas se consigue modificando el gen que codifica la O-manosiltransferasa. Los ejemplos de modificaciones de ese tipo incluyen, pero no se limitan a, una mutación, tal como una deleción o alteración del gen que codifica dicha actividad de O-manosiltransferasa endógena.

La mutación por deleción o alteración se puede llevar a cabo tal como se ha descrito en las secciones mencionadas anteriormente, en particular en relación a la deleción o alteración de genes que codifican proteasas. Estas incluyen, pero no se limitan a, mutación de desactivación genética, una mutación de truncamiento, una mutación puntual, una mutación de sentido erróneo, una mutación de sustitución, una mutación de desplazamiento de marco, una mutación de inserción, una mutación de duplicación, una mutación de amplificación, una mutación de translocación o una mutación de inversión, y que da como resultado una reducción de la actividad de O-manosiltransferasa correspondiente.

En ciertas realizaciones, la mutación o modificación en un gen que codifica la O-manosiltransferasa (PMT) de la presente divulgación da como resultado una O-manosiltransferasa modificada que no tiene actividad de O-manosiltransferasa detectable. En otras realizaciones, la al menos una modificación en un gen que codifica la O-manosiltransferasa de la presente divulgación da como resultado una O-manosiltransferasa modificada que tiene Al menos un 25 % menos, al menos un 50 % menos, al menos un 75 % menos, al menos un 90 %, al menos un 95 %, o Un porcentaje más elevado menos de actividad de O-manosiltransferasa en comparación con una O-manosiltransferasa no modifica la correspondiente.

En una realización preferente, una mutación que reduce la actividad de proteína O-manosiltransferasa endógena en una célula fúngica filamentosa deficiente en PMT, por ejemplo, una célula de Trichoderma, es una célula deficiente en PMT que tiene una deleción o alteración de un gen PMT que codifica dicha actividad de O-manosiltransferasa, dando como resultado una expresión no detectable para dicho gen PMT con deleción o alteración.

Una realización específica de la presente invención es una célula de Trichoderma reesei deficiente en PMT, que comprende

a. al menos una primera mutación que reduce una actividad de proteasa endógena en comparación con una célula precursora de Trichoderma que no tiene dicha primera mutación, y,

b. al menos una alteración o deleción del gen PMT1 de T. reesei.

c. opcionalmente, dicha célula expresa además una proteína heteróloga con serina o treonina, que ha reducido la O-manosilación debido a dicha mutación en dicho gen PMT.

La reducción (o disminución) de la actividad de O-manosiltransferasa se puede determinar comparando el nivel de O-manosilación de una proteína heteróloga en la célula fúngica filamentosa deficiente en PMT de acuerdo con la invención, con el nivel de O-manosilación de una proteína heteróloga en la célula precursora que no tiene dicha mutación deficiente en PMT.

En realizaciones específicas, la célula fúngica filamentosa deficiente en PMT de acuerdo con la invención expresa una proteína heteróloga que ha reducido la O-manosilación debida a dicha mutación en dicho gen PMT y el nivel de O-manosilación en la proteína heteróloga expresada es al menos un 20 %, un 40 %, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, o un 90 % más bajo que el nivel de O-manosilación de la proteína heteróloga cuando se expresa en la célula fúngica filamentosa precursora que no tiene dicha segunda mutación deficiente de PMT.

El nivel de O-manosilación también se puede determinar como el % en moles de polipéptido O-manosilado por polipéptido total producido por la célula hospedadora de la invención. Los métodos analíticos, tales como análisis MALDI TOF MS, se pueden usar para determinar el nivel de O-manosilación como se describe en detalle en el Ejemplo 1 que sigue a continuación, en la sección titulada "Análisis de las cepas M403, M404, M406 y M407 de Dpmt1". En resumen, un polipéptido tal como se produce por la célula fúngica filamentosa deficiente en PMT se purifica para determinar su nivel de O-manosilación. La estructura no O-manosilada, y la estructura O-manosilada del polipéptido se separan y cuantifican por análisis MALDI-TOF MS. Por ejemplo, la cuantificación del nivel de O-manosilación se puede llevar a cabo determinando los valores del área o la intensidad de los diferentes picos del espectro de MALDI-TOF MS. Un nivel de O-manosilación de un 5 % tal como se determina con dicho método, usando valores de área o intensidad, refleja que aproximadamente un 95 % (% en moles) de los polipéptidos analizados en la composición no son realizaciones específicas O-manosiladas, la célula fúngica filamentosa deficiente en PMT expresa una proteína heteróloga que ha reducido la O-manosilación debido a dicha mutación en dicho gen PMT, y el nivel de O-manosilación en la proteína heteróloga expresada (por ejemplo, tal como se ha definido anteriormente determinando los valores del área o intensidad de los picos del espectro MALDI TOF MS) se reduce a menos de un 25 %, un 20 %, un 17 %, un 15 %, un 13 %, un 12 %, un 11 %, un 10 %, un 9 %, un 8 %, un 7 %, un 6 %, un 5 %, un 4 %, un 3 %, un 2 %, o un 1 %, o un 0,5 % (como % en moldes de restos de manosa por cadena polipeptídica).

En una realización, la proteína heteróloga con una reducción de la O-manosilación se selecciona entre el grupo que consiste en:

a) una inmunoglobulina, tal como IgG,

b) una cadena ligera o una cadena pesada de una inmunoglobulina,

c) una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo,

d) un anticuerpo de cadena individual,

e) un anticuerpo camélido,

f) un anticuerpo de dominio individual monomérico o multimérico,

g) un fragmento FAb, un fragmento FAb2, y,

h) sus fragmentos de unión a antígeno.

En una realización específica, una mutación que reduce la actividad de O-manosiltransferasa endógena es una deleción o una alteración de un gen PMT que codifica dicha actividad de proteína O-manosiltransferasa endógena. Por ejemplo, en la célula de Trichoderma, una mutación que reduce la actividad de O-manosiltransferasa endógena es una deleción o una alteración de un gen PMT1.

Célula fúngica filamentosa para producir glicoproteínas con O-manosilación reducida y N-glicanos de tipo mamífero

Las células fúngicas filamentosas de acuerdo con la presente invención pueden ser útiles en particular para producir glicoproteínas heterólogas con O-manosilación reducida y N-glicanos de tipo mamífero, tal tales N-glicanos complejos.

Por consiguiente, en un aspecto, la célula fúngica filamentosa además se modifica genéticamente para producir un N-glicano de tipo mamífero, permitiendo de ese modo la producción de la glicoproteína in vivo sin O-manosilación o con ella reducida y con N-glicano de tipo mamífero como glicoformas principales.

En ciertas realizaciones, este aspecto incluye métodos para producir glicoproteínas con N-glicanos de tipo mamífero en una célula de Trichoderma.

En cierta realización, la glicoproteína comprende, como glicoforma principal, el N-glicano de tipo mamífero que tiene la fórmula [(Galp4)xGlcNAcp2]zMana3([(Galp4)yGlcNAcp2]wMana6)Man{p4GlcNAcpGlcNAc, en la que ( ) define una ramificación en la estructura, en la que [ ] o { } definen una parte de la estructura de glicano ya sea presente o ausente en una secuencia lineal, y en la que x, y, z y w son 0 o 1, independientemente. En una realización w y z son 1.

En ciertas realizaciones, la glicoproteína comprende, como glicoforma principal, N-glicano de tipo mamífero seleccionado entre el grupo que consiste en:

i. Mana3[Mana6(Mana3)Mana6]Manp4GlcNAp4GlcNAc (glicoforma Man5);

ii. GlcNAcp2Mana3[Mana6(Mana3)Mana6]Manp4GlcNAp4GlcNAc (glicoforma GlcNAcMan5);

iii. Mana6(Mana3)Manp4GlcNAp4GlcNAc (glicoforma Man3);

iv. Mana6(GlcNAcp2Mana3)Manp4GlcNAp4GlcNAc (GlcNAcMan3) o,

v. N-glicanos de tipo complejo seleccionados entre la glicoforma G0, G1, o G2.

En una realización, la composición de glicoproteína con N-glicanos de tipo mamífero, producida preferentemente con una cepa con desactivación del gen alg3, incluye glicoformas que básicamente carecen o están desprovistas de glicanos Mana3[Mana6(Mana3)Mana6]Manp4GlcNAp4GlcNAc (Man5). En realizaciones específicas, la célula fúngica filamentosa produce glicoproteínas con, como glicoforma principal, la estructura de trimanosil N-glicano Mana3[Mana6]Manp4GlcNAcp4GlcNAc. En otras realizaciones, la célula fúngica filamentosa produce glicoproteínas con, como glicoforma principal, la estructura de N-glicano G0 GlcNAcp2Mana3[GlcNAcp2Mana6]Manp4GlcNAcp4GlcNAc.

En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa deficiente en PMT una composición de glicoproteínas con una mezcla de diferentes N-glicanos.

En algunas realizaciones, el N-glicano Man3GlcNAc2 (es decir, Mana3[Mana6]Manp4GlcNAcp4GlcNAc) representa al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o más de N-glicanos neutros totales (% en moles) de una proteína heteróloga con O-manosilación reducida, como se expresa en las células fúngicas filamentosas de la invención.

En otras realizaciones, el N-glicano GlcNAc2Man3 (por ejemplo G0 GlcNAcp2Mana3[GlcNAcp2Mana6]Manp4GlcNAcp4GlcNAc) representa al menos un l0% , al menos un 20%, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o más de N-glicanos neutros totales (% en moles) de una proteína heteróloga con O-manosilación reducida, como se expresa en las células fúngicas filamentosas de la invención.

En otras realizaciones, el N-glicano GalGlcNAc2Man3GlcNAc2 (por ejemplo N-glicano G1) representa al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o más de N-glicanos neutros totales (% en moles) de una proteína heteróloga con O-manosilación reducida, como se expresa en las células fúngicas filamentosas de la invención.

En otras realizaciones, el N-glicano Gal2GIcNAc2Man3GIcNAc2 (por ejemplo N-glicano G2) representa al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o más de N-glicanos neutros totales (% en moles) de una proteína heteróloga con O-manosilación reducida, como se expresa en las células fúngicas filamentosas de la invención.

En otras realizaciones, el N-glicano de tipo complejo representa al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o más de N-glicanos neutros totales (% en moles) de una proteína heteróloga con O-manosilación reducida, como se expresa en las células fúngicas filamentosas de la invención.

En otras realizaciones, el N-glicano de tipo híbrido representa al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o más de N-glicanos neutros totales (% en moles) de una proteína heteróloga con O-manosilación reducida, como se expresa en las células fúngicas filamentosas de la invención.

En otras realizaciones, menos de un 0,5%, un 0,1 %, un 0,05%, o menos de un 0,01 % del N-glicano de la composición de glicoproteína producido por la célula hospedadora de la invención, comprende galactosa. En ciertas realizaciones, ninguno de los N-glicanos comprende galactosa.

Las estructuras de Neu5Gc y Gala-(Gala3Galp4GlcNAc terminal de extremo no reductor) son modificaciones de anticuerpos xenoantigénicas (obtenidas a partir de animales) conocidas que son producidas en células animales tales como células CHO. Las estructuras pueden ser antigénicas y, por lo tanto, perjudiciales incluso a bajas concentraciones. Los hongos filamentosos de la presente invención carecen de rutas de biosíntesis para producir las estructuras de Neu5Gc y Gala- terminales. En una realización que se puede combinar con las realizaciones precedentes menos de un 0,1 %, un 0,01 %, un 0,001 %, o un 0% de los N-glicanos y/o O-glicanos de la composición de glicoproteína comprende una estructura de Neu5Gc y/o Gala-. En una realización que se puede combinar con las realizaciones precedentes, menos de un 0,1 %, un 0,01 %, un 0,001 %, o un 0 % de los N-glicanos y/o O-glicanos de la composición de anticuerpo comprende una estructura de Neu5Gc y/o Gala-.

Las células fúngicas filamentosas de la presente invención carecen de genes para producir proteínas heterólogas fucosiladas. En una realización que se puede combinar con las realizaciones precedentes, menos de un 0,1 %, un 0,01 %, un 0,001 %, o un 0 % del N-glicano de la composición de glicoproteína comprende estructuras de núcleo de fucosa. En una realización que se puede combinar con las realizaciones precedentes, menos de un 0,1 %, un 0,01 %, un 0,001 %, o un 0 % del N-glicano de la composición de anticuerpo comprende estructuras de núcleo de fucosa.

La estructura de Galp4GlcNAc terminal del N-glicano de glicanos producidos por células de mamífero influye en la bioactividad de los anticuerpos y Galp3GlcNAc puede ser una estructura xenoantigénica de proteínas producidas a partir de células vegetales. En una realización que se puede combinar con una o más de las realizaciones precedentes, menos de un 0,1 %, un 0,01 %, un 0,001 %, o un 0 % del N-glicano de la composición de glicoproteína comprende epítopos de galactosa terminales Galp3/4GlcNAc. En una realización que se puede combinar con una o más de las realizaciones precedentes, menos de un 0,1 %, un 0,01 %, un 0,001 %, o un 0% del N-glicano de la composición de anticuerpo comprende epítopos de galactosa terminales Galp3/4GlcNAc.

La glicación es una modificación de proteínas posterior a la producción común, que resulta de la reacción química entre azúcares reductores tales como glucosa y los grupos amino primario en la proteína. La glicación se produce generalmente a pH neutro o ligeramente alcalino en condiciones de cultivos celulares, por ejemplo, cuando se producen anticuerpos en células CHO y analizándolos (véase, por ejemplo, Zhang et al,. (2008) Unveiling a glycation hot spot in a recombinant humanized monoclonal antibody. Anal Chem. 80 (7): 2379-2390). Dado que los hongos filamentosos de la presente invención generalmente se cultivan en pH ácido, la aparición de glicación se reduce. En una realización que se puede combinar con las realizaciones precedentes, menos de un 1,0 %, un 0,5 %, un 0,1 %, un 0,01 %, un 0,001 %, o un 0 % de la composición de glicoproteína comprende estructuras de glicación. En una realización que se puede combinar con las realizaciones precedentes, menos de un 1,0 %, un 0,5 %, un 0,1 %, un 0,01 %, un 0,001 %, o un 0 % de la composición de anticuerpo comprende estructuras de glicación.

En una realización, la composición de glicoproteína, tal como un anticuerpo, está desprovista de uno, dos, tres, cuatro, cinco, o seis de las estructuras seleccionadas entre el grupo de Neu5Gc, Gala3Galp4GlcNAc terminal, Galp4GlcNAc terminal, Galp3GlcNAc terminal, fucosa unida a núcleo y estructuras de glicación.

En ciertas realizaciones, una proteína de tipo glicoproteínas con N-glicano de tipo mamífero y O-manosilación reducida, tal como se produce en la célula fúngica filamentosa de la invención, es una proteína terapéutica. Las proteínas terapéuticas pueden incluir inmunoglobulina, o una proteína de fusión que comprende un fragmento Fc u otras glicoproteínas terapéuticas, tales como anticuerpos, eritropoyetinas, interferones, hormonas de crecimiento, albúminas o albúmina de suero, enzimas, o factores de coagulación sanguínea y pueden ser útiles en el tratamiento de seres humanos o animales. Por ejemplo, las glicoproteínas con N-glicano de tipo mamífero y O-manosilación reducida tal como se producen mediante la célula fúngica filamentosa de acuerdo con la invención pueden ser glicoproteínas terapéuticas tales como rituximab.

Los métodos para producir glicoproteínas con N-glicanos de tipo mamífero en células fúngicas filamentosas también se describen por ejemplo en el documento WO2012/069593.

En un aspecto, la célula fúngica filamentosa de acuerdo con la invención como se ha descrito anteriormente, se modifica además genéticamente para imitar la ruta tradicional de las células de mamíferos, a partir de N-glicanos Man5 como sustrato aceptor para GnTI, y seguida de forma secuencial por GnT1, y etapas de reacción de manosidasa II y GnTII (en lo sucesivo denominada "ruta tradicional" para producir glicoformas G0). En una variante, se usa una única enzima recombinante que comprende los dominios catalíticos de GnTI y GnTII.

Alternativamente, en un segundo aspecto, la célula fúngica filamentosa de acuerdo con la invención como se ha descrito anteriormente se modifica genéticamente para que tenga una expresión reducida de alg3, permitiendo la producción del núcleo de N-glicanos Man3GlcNAc2, como sustrato aceptor para las reacciones posteriores de GnTI y GnTII y evitando la necesidad de manosidasa a1,2 o enzimas manosidasa II (la ruta reducida de "alg3"). En una variante, se usa una única enzima recombinante que comprende los dominios catalíticos de GnTI y GnTII.

En dichas realizaciones para imitar la ruta tradicional para producir glicoproteínas con N-glicanos de tipo mamífero, una célula fúngica filamentosa que expresa Man5, tal como cepa de T. reesei, se puede transformar con una GnTI o una enzima de fusión GnTII/GnTI usando integración aleatoria o por integración dirigida a un sitio conocido que no influye en la glicosilación de Man5. Se seleccionan cepas que sintetizan N-glicano GlcNAcMan5 para la producción de proteínas con glicano o glicanos de tipo híbrido. Las cepas seleccionadas se transforman adicionalmente con un dominio catalítico de una manosidasa de tipo manosidasa II capaz de escindir las estructuras de Man5 para generar GlcNAcMan3 para la producción de proteínas que tienen la glicoforma GlcNAcMan3 correspondiente o su(s) derivado(s). En ciertas realizaciones, las enzimas de tipo manosidasa II pertenecen a la familia 38 de glicósido hidrolasa (cazy.org/GH38_all.html). Las enzimas caracterizadas incluyen las enzimas enumeradas en cazy.org/GH38_characterized.html. Las enzimas especialmente útiles son las enzimas de tipo Golgi que escinden glicoproteínas, tales como las de la subfamilia a-manosidasa II a-manosidasa II (Man2A1; ManA2). Los ejemplos de enzimas de ese tipo incluyen la enzima humana AAC50302, enzima de D. melanogaster (Van den Elsen J.M. et al., (2001) EMBO J. 20: 3008-3017), las que tienen la estructura 3D de acuerdo con 1HTY de referencia PDB, y otras que se mencionan con el dominio catalítico en PDB. Para la expresión citoplásmica, el dominio catalítico de la manosidasa se fusiona generalmente con un péptido de direccionamiento N-terminal (por ejemplo, como se ha desvelado en la Sección mencionada anteriormente) o se expresa con estructuras de direccionamiento de Golgi de animales o plantas endógenas de enzimas manosidasa II de animales o plantas. Después de la transformación con el dominio catalítico de una manosidasa de tipo II, se seleccionan cepas que producen GlcNAcMan3 (si se expresa GnTI) o cepas que producen GlcNAc2Man3 de manera eficaz (si se expresa una fusión de GnTI y GnTII). Para las cepas que producen GlcNAcMan3, las cepas de serotipo se transforman además con un polinucleótido que codifica un dominio catalítico de GnTII y se seleccionan cepas transformantes que son capaces de producir GlcNAc2Man3GlcNAc2.

En una realización de ese tipo para imitar la ruta tradicional, la célula fúngica filamentosa es una célula fúngica filamentosa deficiente en PMT como se ha definido en las secciones anteriores, y que además comprende uno o más polinucleótidos que codifican un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en:

i) a1,2 manosidasa,

ii) dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa I,

iii) a manosidasa II,

iv) dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa II,

v) (31,4 galactosiltransferasa, y,

vi) fucosiltransferasa.

En realizaciones que usan la ruta de alg3 reducida, la célula fúngica filamentosa, tal como una célula de Trichoderma, tiene un nivel de actividad reducido de una doliquil-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-doliquil manosiltransferasa en comparación con el nivel de actividad en una célula hospedadora precursora. La doliquil-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-doliquil manosiltransferasa (EC 2.4.1.130) transfiere un resto de alfa-D-manosilo de doliquil-fosfato D-manosa en un oligosacárido unido a lípidos de membrana. Por lo general, la enzima doliquil-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-doliquil manosiltransferasa está codificada por un gen alg3. En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa para producir glicoproteínas con N-glicanos de tipo mamífero tiene un nivel reducido de expresión de un gen alg3 en comparación con el nivel de expresión en una cepa precursora.

Más preferentemente, la célula fúngica filamentosa comprende una mutación de alg3. El gen ALG3 se puede mutar por cualquier medio conocido en la técnica, tal como mutaciones puntuales o deleción de todo el gen alg3. Por ejemplo, la función de la proteína alg3 se reduce o elimina mediante la mutación de alg3. En ciertas realizaciones, el gen alg3 se altera o sufre deleción de la célula fúngica filamentosa, tal como célula de Trichoderma. En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa es una célula de T. reesei cell. Las SEQ ID NOs: 36 y 37 proporcionan las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos del gen alg3 en T. reesei, respectivamente. En una realización la célula fúngica filamentosa se usa para la producción de una glicoproteína, en la que el glicano o glicanos comprenden o consisten en Mana3[Mana6]Manp4GlcNAcp4GlcNAc, y/o una variante no reductora y alargada del mismo.

En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa tiene un nivel reducido de actividad de una alfa-1,6-manosiltransferasa en comparación con el nivel de actividad en una cepa precursora. La alfa-1,6-manosiltransferasa (EC 2.4.1.232) transfiere un resto de alfa-D-manosilo de GDP-manosa en un oligosacárido unido a proteína, formando una elongación que inicia el enlace alfa-(1->6)-D-manosil-D-manosa en el aparato de Golgi. Normalmente, la enzima alfa-1,6-manosiltransferasa está codificada por un gen ochl. En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa h tiene un nivel reducido de expresión de un gen ochl en comparación con el nivel de expresión en una célula filamentosa fúngica precursora. En ciertas realizaciones, el gen ochl sufre deleción de la célula fúngica filamentosa.

Las células fúngicas filamentosas usadas en los métodos de producción de glicoproteína con N-glicanos de tipo mamífero pueden contener además un polinucleótido que codifica un dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa I (GnTI) que cataliza la transferencia de N-acetilglucosamina a una Mana3 terminal y un polinucleótido que codifica un dominio del catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa (GnTII), que cataliza la N-acetilglucosamina a un resto de Mana6 terminal de un glicano aceptor para producir un N-glicano complejo. En una realización, dichos polinucleótidos que codifican GnTI y GnTII se unen para producir una fusión de proteína única que comprende ambos dominios catalíticos de GnTI y GnTII.

Como se desvela en el presente documento, la N-acetilglucosaminiltransferasa I (GlcNAc-TI; GnTI; EC 2.4.1.101) cataliza la reacción UDP-N-acetil-D-glucosamina 3-(alfa-D-manosil)-beta-D-manosil-R <=> UDP 3-(2-(N-acetilbeta-D-glucosaminil)-alfa-D-manosil)-beta-D-manosil-R, en la que R representa el resto del oligosacárido unido a N en el aceptor de glicano. Un dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa I es cualquier parte de una enzima N-acetilglucosaminiltransferasa I que es capaz de catalizar esta reacción. Las enzimas GnTI se enumeran en la base de datos CAZy en la familia 13 de glicosiltransferasa (cazy.org/GT13_all). Las especies caracterizadas enzimáticamente incluyen AAR78757.1 de A. thaliana (US6653459), AAD03023.1 de C. elegans (Chen S. et al., J. Biol. Chem 1999; 274 (1): 288-97), AAF57454.1 de D. melanogaster (Sarkar y Schachter Biol Chem. Feb de 2001; 382 (2): 209-17); AAC52872.1 de C. griseus (Puthalakath H. et al., J. Biol. Chem 1996 271 (44): 27818-22); AAA52563.1 de H. sapiens (Kumar R. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. Dic de1990; 87 (24): 9948-52); AAD04130.1 de M. auratus (Opat As et al., Biochem J. 15 de Dic de 1998; 336 (Pt 3): 593-8), (incluyendo un ejemplo de mutante desactivante), Conejo, AAA31493.1 de O. cuniculus (Sarkar M et al,. Proc Natl Acad Sci U S A. 1 de Ene 1991; 88 (1): 234-8). Las secuencias de aminoácidos para las enzimas N-acetilglucosaminiltransferasa I de diversos organismos se describen por ejemplo en el documento PCT/EP2011/070956. Los ejemplos adicionales de enzimas activas caracterizadas se pueden encontrar en cazy.org/GT13_characterized. La estructura 3D del dominio catalítico de GnTI de conejo se definió mediante cristalografía de rayos X en Unligil UM et al,. EMBO J. 16 de Oct de 2000; 19 (20): 5269-80. Las estructuras del Protein Data Bank (PDB) para GnTI son 1FO8, 1FO9, 1FOA, 2AM3, 2AM4, 2AM5, y 2APC. En ciertas realizaciones, el dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa I es de la enzima N-acetilglucosaminiltransferasa I humana (SEQ ID NO: 38) o variantes de la misma. En ciertas realizaciones, el dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa I contiene una secuencia que es al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % idéntica a los restos de aminoácido 84-445 de la SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones, como dominio catalítico se puede usar una secuencia más corta (por ejemplo, los restos de aminoácido 105-445 de la enzima humana o los restos de aminoácido 107-447 de la enzima de conejo; Sarkar et al,. (1998) Glycoconjugate J 15: 193-197). Las secuencias adicionales que se pueden usar como el dominio catalítico GnTI incluyen restos de aminoácido desde aproximadamente el aminoácido 30 a 445 de la enzima humana o cualquier dominio del tallo C-terminal que comienza entre el resto de aminoácido 30 a 105 y continúa hasta aproximadamente el aminoácido 445 de la enzima humana, o secuencia homóloga correspondiente de otra GnTI o una variante catalíticamente activa o mutante de la misma. El dominio catalítico puede incluir partes N-terminales de la enzima tales como la totalidad o parte del dominio de tallo, el dominio transmembrana o el dominio citoplásmico.

Como se desvela en el presente documento, la N-acetilglucosaminiltransferasa II (GlcNAc-TII; GnTII; EC 2.4.1.143) cataliza la reacción UDP-N-acetil-D-glucosamina 6-(alfa-D-manosil)-beta-D-manosil-R <=> UDP 6-(2-(N-acetilbeta-D-glucosaminil)-alfa-D-manosil)-beta-D-manosil-R, en la que R representa el resto del oligosacárido unido a N en el aceptor glicano. Un dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa II es cualquier parte de una enzima N-acetilglucosaminiltransferasa II que sea capaz de catalizar esta reacción. Las secuencias de aminoácidos para las enzimas N-acetilglucosaminiltransferasa II de diversos organismos se enumeran en el documento WO2012069593. En ciertas realizaciones, el dominio catalítico de la N-acetilglucosaminiltransferasa II es del enzima N-acetilglucosaminiltransferasa II humana (SEQ ID NO: 39) o variantes de la misma. Las especies adicionales de GnTII se enumeran en la base de datos CAZy en la familia 16 de glicosiltransferasa (cazy.org/GT16_all). Las especies caracterizadas enzimáticamente incluyen GnTII de C. elegans, D. melanogaster, Homo sapiens (NP_002399.1), Rattus norvegicus, Sus scrofa (cazy.org/GT16_characterized). En ciertas realizaciones, el dominio catalítico de la N-acetilglucosaminiltransferasa II contiene una secuencia que es al menos un 70%, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % idéntica a los restos de aminoácido de aproximadamente 30 a aproximadamente 447 de la SEQ ID NO: 39. El dominio catalítico puede incluir partes N-terminales de la enzima tales como todo o parte del dominio de tallo, el dominio transmembrana o el dominio citoplásmico.

En realizaciones en las que la célula fúngica filamentosa contiene una proteína de fusión de la invención, la proteína de fusión puede contener además un espaciador entre el dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa I y el dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa II. En ciertas realizaciones, el espaciador es un espaciador EGIV, un espaciador 2xG4S, un espaciador 3xG4S o un espaciador CBHI. En otras realizaciones, el espaciador contiene una secuencia de un dominio de tallo.

Para la expresión de RE/Golgi, la N-acetilglucosaminiltransferasa I y/o el dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa II se fusionan generalmente con un péptido de direccionamiento o una parte de un RE o una proteína de Golgi temprana, o se expresan con una estructura de direccionamiento a RE endógena de una enzima N-acetilglucosaminiltransferasa de animal o planta. En ciertas realizaciones preferentes, la N-acetilglucosaminiltransferasa I y/o dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa II contiene cualquiera de los péptidos de direccionamiento de la invención como se describe en la sección titulada "Secuencias de direccionamiento". Preferentemente, el péptido de direccionamiento está unido al extremo N-terminal del dominio catalítico. En algunas realizaciones, el péptido de direccionamiento contiene cualquiera de los dominios de tallo de la invención como se describe en la sección titulada "Secuencias de direccionamiento". En ciertas realizaciones preferentes, el péptido de direccionamiento es un péptido de direccionamiento Kre2/Mnt1. En otras realizaciones, el péptido de direccionamiento contiene además un dominio transmembrana unido al extremo N-terminal del dominio de tallo o un dominio citoplásmico unido al extremo N-terminal del dominio de tallo. En realizaciones en las que el péptido de direccionamiento además contiene un dominio transmembrana, el péptido de direccionamiento puede contener además un dominio citoplásmico unido al extremo N-terminal del dominio transmembrana.

Las células fúngicas filamentosas también puede contener un polinucleótido que codifica un transportador UDP-GlcNAc. El polinucleótido que codifica el transportador UDP-GlcNAc puede ser endógeno (es decir, naturalmente presente) en la célula hospedadora, o puede ser heterólogo para la célula fúngica filamentosa.

En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa puede contener además un polinucleótido que codifica una a-1,2-manosidasa. El polinucleótido que codifica la a-1,2-manosidasa puede ser endógeno en la célula hospedadora, o puede ser heterólogo para la célula hospedadora. Los polinucleótidos heterólogos son especialmente útiles para una célula hospedadora que expresa glicanos de alta manosa transferidos desde el aparato de Golgi al RE sin una escisión eficaz de exo-a-2-manosidasa. La a-1,2-manosidasa puede ser una enzima de tipo manosidasa I perteneciente a la familia 47 de las glucósido hidrolasas (cazy.org/GH47_all.html). En ciertas realizaciones la a-1,2-manosidasa es una enzima enumerada en cazy.org/GH47_characterized.html. En particular, la a-1,2-manosidasa puede ser una enzima de tipo RE que escinde glicoproteínas tales como las enzimas en la subfamilia de las enzimas EC 3.2.1.113 de RE a-manosidasa I. Los ejemplos de enzimas de ese tipo incluyen a-2-manosidasa 1B humana (AAC26169), una combinación de RE manosidasas de mamífero, o una enzima fúngica filamentosa tal como a-1,2-manosidasa (MDS1) (AAF34579 de T. reesei; Maras M et al., J Biotech. 77, 2000, 255, o Trire 45717). Para la expresión de RE, el dominio catalítico de la manosidasa por lo general se fusiona con un péptido de direccionamiento, tal como HDEL, KDEL, o parte de un RE o proteína de Golgi temprana, o se expresa con una estructura de direccionamiento de RE endógena de una enzima manosidasa I animal o vegetal.

En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa también puede contener además un polinucleótido que codifica una p-1,4-galactosiltransferasa. Generalmente, las p-1,4-galactosiltransferasas pertenecen a la familia 7 de glicosiltransferasa CAZy (cazy.org/GT7_all.html) e incluyen p-N-acetilglucosaminilglicopéptido p-1,4-galactosiltransferasa (EC 2.4.1.38), que también se conoce como N-acetillactosamina sintasa (EC 2.4.1.90). Las subfamilias útiles incluyen p4-GalT1, p4-GalT-II, -III, -IV, -V, y -VI, tales como 134-GalTI o 134GalT-II, -III, -IV, -V, y -VI de mamífero o ser humano o cualquier combinación de las mismas. 134-GalT1, 134-GalTII, o 134-GalTIII son especialmente útiles para la galactosilación de las estructuras de GlcNAcp2 terminal en N-glicanos tales como GlcNAcMan3, GlcNAc2Man3, o GlcNAcMan5 (Guo S. et al,. Glycobiology 2001, 11: 813-20). La estructura tridimensional de la región catalítica se conoce (por ejemplo, (2006) J. Mol. Biol. 357: 1619-1633), y la estructura se ha representado una base de datos de PDB con el código 2FYD. La base de datos de CAZy incluye ejemplos de ciertas enzimas. Las enzimas caracterizadas también se enumeran en la base de datos de CAZy en cazy.org/GT7_characterized.html. Los ejemplos de enzimas p4GalT útiles incluyen p4GalT1, por ejemplo la enzima AAA30534.1 bovina de Bos taurus (Shaper N.L. et al,. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83 (6), 1573-1577 (1986)), enzima humana (Guo S. et al,. Glycobiology 2001, 11: 813-20), y la enzima AAA37297 de Mus musculus (Shaper, N.L. et al,. 1998 J. Biol. Chem. 263 (21), 10420-10428); las enzimas p4GalTII tales como p4GalTII BAA75819.1 humana, AAM77195 de Cricetulus griseus de hámster chino, la enzima BAA34385 de Mus musculus, y la enzima BAH36754 de Oryzias latipes del pescado Medaka japonés; y enzimas p4GalTIII tales como p4GalTIII BAA75820.1 humana, AAM77196 de Cricetulus griseus de hámster chino y la enzima AAF22221 de Mus musculus.

La galactosiltransferasa se puede expresar en la membrana plasmática de la célula hospedadora. Se puede usar un péptido de direccionamiento heterólogo, tal como un péptido Kre2 descrito en Schwientek J. Biol. Chem 19963398. Los promotores que se pueden usar para la expresión de la galactosiltransferasa incluyen promotores constitutivos tales como gpd, promotores de enzimas de glicosilación endógenas y glicosiltransferasas tales como las manosiltransferasas que sintetizan N-glicanos en el aparato de Golgi o RE, y promotores inducibles de proteínas endógenas de alto rendimiento tales como el promotor cbh1.

En ciertas realizaciones de la invención en las que la célula fúngica filamentosa contiene un polinucleótido que codifica una p-1,4-galactosiltransferasa, la célula fúngica filamentosa también contiene un polinucleótido que codifica una UDP-Gal 4 epimerasa y/o transportador de UDP-Gal. En ciertas realizaciones de la invención en las que la célula fúngica filamentosa contiene un polinucleótido que codifica una p-1,4-galactosiltransferasa, la lactosa se puede usar como fuente de carbono en lugar de glucosa cuando se cultiva la célula hospedadora. El medio de cultivo puede estar entre pH 4,5 y 7,0 o entre 5,0 y 6,5. En ciertas realizaciones de la invención en las que la célula fúngica filamentosa contiene un polinucleótido que codifica una p-1,4-galactosiltransferasa y un polinucleótido que codifica una UDP-Gal 4 epimerasa y/o transportador de UDP-Gal, un catión divalente tal como Mn2+, Ca2+ o Mg2+ se puede añadir al medio de cultivo celular.

Por consiguiente, en ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa de la presente divulgación, por ejemplo, seleccionada entre células de Neurospora, Trichoderma, Myceliophthora o Chrysosporium, y más preferentemente una célula de Trichoderma reesei, puede comprender las siguientes características:

a) una mutación en al menos una proteasa endógena que reduce o elimina la actividad de dicha proteasa endógena, preferentemente la actividad proteasa de dos o tres o más proteasas endógenas se reduce, por ejemplo, las proteasas pepl, tspl, gapl y/o slpl, con el fin de mejorar la producción o estabilidad de una proteína heteróloga que se va a producir,

b) una mutación en un gen PMT, por ejemplo gen pmtl de T. reesei, que reduce o elimina la actividad endógena de O-manosiltransferasa en comparación con una célula precursora de Trichoderma que no tiene dicha segunda mutación,

c) un polinucleótido que codifica una proteína que tiene al menos una serina o treonina, preferentemente una glicoproteína heteróloga, tal como una inmunoglobulina, un anticuerpo o una fusión de proteínas que comprende el fragmento Fc de una inmunoglobulina.

d) opcionalmente, una deleción o alteración del gen alg3,

e) opcionalmente, un polinucleótido que codifica un dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa I y un polinucleótido que codifica un dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa II,

f) opcionalmente, un polinucleótido que codifica p1,4 galactosiltransferasa,

g) opcionalmente, un polinucleótido o polinucleótidos que codifican la epimerasa y/o transportador de UDP-Gal 4.

Secuencias de direccionamiento

En ciertas realizaciones, las enzimas recombinantes, tales como a1,2 manosidasas, GnTI u otras glicosiltransferasas introducidas en las células fúngicas filamentosas, incluyen un péptido de direccionamiento unido a los dominios catalíticos. El término "unido" como se usa en el presente documento se refiere a que dos polímeros de restos de aminoácido en el caso de un polipéptido o dos polímeros de nucleótidos en el caso de un polinucleótido están acoplados directamente adyacentes entre sí o están dentro del mismo polipéptido o polinucleótido pero están separados por restos de aminoácido o nucleótido intermedios. Un "péptido de direccionamiento", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier número de restos de aminoácidos consecutivos de la proteína recombinante que son capaces de localizar la proteína recombinante en el retículo endoplásmico (RE) o aparato de Golgi (Golgi) dentro de la célula hospedadora. El péptido de direccionamiento puede ser N-terminal o C-terminal a los dominios catalíticos. En ciertas realizaciones, el péptido de direccionamiento es N-terminal a los dominios catalíticos. En ciertas realizaciones, el péptido de direccionamiento proporciona unión a un componente del RE o de Golgi, tal como con respecto a una enzima manosidasa II. En otras realizaciones, el péptido de direccionamiento proporciona una unión directa a la membrana del RE o Golgi.

Los componentes del péptido de direccionamiento pueden provenir de una enzima que normalmente reside en el RE o el aparato de Golgi. Las enzimas de séptico incluyen manosidasas, manosiltransferasas, gicosiltransferasas, proteínas de Golgi de Tipo 2, y las enzimas MNN2, MNN4, MNN6, MNN9, MNN10, MNS1, KRE2, VAN1, y OCH1. Las enzimas de ese tipo pueden provenir de una especie de levadura o fúngica tales como las de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Chrysosporium, Chrysosporium lucknowense, Filobasidium, Fusarium, Gibberella, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Myrothecium, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, y Trichoderma. Las secuencias para las enzimas de ese tipo se pueden encontrar en la base de datos de secuencias de GenBank.

En ciertas realizaciones el péptido de direccionamiento proviene de la misma enzima y organismo que uno de los dominios catalíticos de la proteína recombinante. Por ejemplo, si la proteína recombinante incluye un dominio catalítico GnTII humano, el péptido de direccionamiento de la proteína recombinante es de la enzima GnTII humana. En otras realizaciones, el péptido de direccionamiento puede provenir de una enzima y/o urbanismo diferente como los dominios catalíticos de la proteína recombinante.

Los ejemplos de diversos péptidos de direccionamiento para su uso en proteínas de direccionamiento para el RE o aparato de Golgi que se pueden usar para direccionamiento de las enzimas recombinantes, incluyen: péptido N-terminal Kre2/Mnt1 fusionado a galactosiltransferasa (Schwientek, JBC 1996, 3398), HDEL a la localización de manosidasa para el RE de células de levadura para producir Man5 (Chiba, JBC 1998, 26298-304; Callewaert, FEBS Lett 2001, 173-178), péptido de direccionamiento OCH1 fusionado al dominio catalítico GnTI (Yoshida et al., Glycobiology 1999, 53-8), péptido N-terminal de levadura de Mns1 fusionado a a2-manosidasa (Martinet et al., Biotech Lett 1998, 1171), parte N-terminal de Kre2 unida al dominio catalítico de GnTI o p4GalT (Vervecken, Appl.

Environ Microb 2004, 2639-46), diversos enfoques revisados en Wildt y Gerngross (Nature Rev Biotech 2005, 119), GnTI de longitud completa en Aspergillus nidulans (Kalsner et al., Glycocon. J 1995, 360-370), GnTI de longitud completa en Aspergillus oryzae (Kasajima et al., Biosci Biotech Biochem 2006, 2662-8), parte de la estructura de localización de Sec12 de levadura fusionada a GnTI de C. elegans en Aspergillus (Kainz et al., 2008), parte N-terminal de Mnn9 de levadura fusionada a GnTI humana en Aspergillus (Kainz et al., 2008), parte N-terminal de Mnn10 de Aspergillus fusionada GnTI humana (Kainz et al., Appl. Environ Microb 2008, 1076-86), y GnTI humana de longitud completa en T. reesei (Maras et al., FEBS Lett 1999, 365-70).

En ciertas realizaciones el péptido de direccionamiento es una parte N-terminal del péptido de direccionamiento de Mnt1/Kre2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40 (por ejemplo codificada por el polinucleótido de la SEQ ID NO: 41). En ciertas realizaciones, el péptido de direccionamiento se seleccionan entre GNT2 humano, KRE2, de tipo KRE2, Och1, Anp1, Van1 como se muestra en la Tabla 1 que sigue a continuación:

_______ Tabla 1: Secuencia de aminoácidos de péptidos de direccionamiento

Proteína TreID Secuencia de aminoácidos

^{GNT2 humana} MRFRIYKRKVLILTLVVAACGFVLWSSNGRQR

KN EALAPPLLDAEPARGAGG RGGDH P (SEQ

ID NO:42)

^{KRE2 21576} MASTNARYVRYLLIAFFTILVFYFVSNSKYEGV

DLNKGTFTAPDSTKTTPK (SEQ ID NO:43)

tipo KRE2 69211 MAIARPVRALGGLAAILWCFFLYQLLRPSSSY

NSPGDRYINFERDPNLDPTG (SEQ ID NO:44)

^Och1

M LNPRRALIAAAFILTVFFLISRSH NSESASTS

(SEQ ID NO:45)

Anp1 82551 MMPRHHSSGFSNGYPRADTFEISPHRFQPRA

TLPPHRKRKRTAIRVGIAVWILVLVLWFGQPR SVASLISLGILSGYDDLKLE (SEQ ID NO:46)

^Van1

MLLPKGGLDWRSARAQIPPTRALWNAVTRTR

FILLVGITGLILLLWRGVSTSASE (SEQ ID

NO:47)

Los ejemplos adicionales de secuencias que se pueden usar para péptidos de direccionamiento incluyen las secuencias de direccionamiento como se describe en el documento WO2012/069593.

Las secuencias no caracterizadas se pueden someter a ensayo para su uso como péptidos de direccionamiento expresando enzimas de la ruta de glicosilación en una célula hospedadora, en la que una de las enzimas contiene la secuencia no caracterizada como el único péptido de direccionamiento y midiendo los glicanos producidos a la vista de localización citoplásmica de la biosíntesis de glicano (por ejemplo, en Schwientek JBC 19963398), o mediante la expresión de una proteína indicadora fluorescente fusionada con el péptido de direccionamiento, y el análisis de la localización de la proteína en el Golgi por inmunofluorescencia o fraccionando las membranas citoplasmáticas del aparato de Golgi y midiendo la localización de la proteína.

Métodos para producir una proteína que tiene O-manosilación reducida

Las células fúngicas filamentosas como se ha descrito anteriormente son útiles en métodos para producir una proteína que tiene O-manosilación reducida.

Por consiguiente, en otro aspecto, la invención se refiere a un método para producir una proteína que tiene O-manosilación reducida, que comprende:

a) proporcionar una célula de Trichoderma deficiente en PMT que tiene una mutación en un gen PMT que reduce la actividad de proteína O-manosiltransferasa endógena en comparación con la cepa precursora que no tiene una mutación de ese tipo, y que además comprende un polinucleótido que codifica una proteína con serina o treonina, que puede estar O-manosilada,

b) cultivar dicha célula de Trichoderma deficiente en PMT para producir dicha proteína que tiene O-manosilación reducida.

En dicho método, la proteína producida tiene una O-manosilación reducida debido a dicha mutación en dicho gen PMT como se ha descrito en las secciones anteriores. La célula de célula de Trichoderma deficiente en PMT puede haber reducido opcionalmente la actividad de proteasa endógena como se ha descrito en las secciones anteriores. Las células fúngicas filamentosas y los métodos de la invención son útiles para la producción de proteínas con serina o treonina que pueden estar O-manosiladas. Por ejemplo, es particularmente útil para la producción de proteínas que están O-manosiladas cuando se producen en una célula hospedadora fúngica filamentosa con funcionalidad de PMT precursora, por ejemplo, en al menos una célula de célula de Trichoderma que es de tipo silvestre para el gen p Mt 1, tal como la SEQ ID NO: 1.

En los métodos de la invención, ciertos medios de crecimiento incluyen, por ejemplo, medios comunes preparados en el mercado tales como caldo de cultivo de Luria-Bertani (LB), caldo de cultivo de Sabouraud Dextrosa (SD) o caldo de cultivo de medio de Levadura (YM). También se pueden usar otros medios de crecimiento definidos o sintéticos, y alguien con experiencia en el campo de la microbiología o ciencia de la fermentación conocerá el medio apropiado para el crecimiento de la célula hospedadora particular. El medio de cultivo generalmente tiene el medio mínimo de Trichoderma reesei (Penttila et al., 1987, Gene 61, 155-164) como base, suplementado con sustancias que inducen el promotor de producción tal como lactosa, celulosa, grano agotado o soforosa. En la técnica se conocen los intervalos de temperatura y otras condiciones adecuadas para el crecimiento (véase, por ejemplo, Bailey y Ollis 1986). En ciertas realizaciones el pH del cultivo celular está entre 3,5 y 7, 5, entre 4,0 y 7,0, entre 4,5 y 6,5, entre 5 y 5,5, o a 5,5. En ciertas realizaciones, para producir un anticuerpo la célula fúngica filamentosa o célula fúngica de Trichoderma se cultiva en un intervalo de pH seleccionado de 4,7 a 6,5; pH de 4,8 a 6,0; pH de 4,9 a 5,9; y pH de 5,0 a 5,8.

En algunas realizaciones, la proteína que puede estar O-manosilada es una proteína heteróloga, preferentemente una proteína de mamífero. En otras realizaciones, la proteína heteróloga es una proteína que no es de mamífero. En ciertas realizaciones, la proteína que puede estar O-manosilada es una glicoproteína con modificaciones de N-glicano posteriores a la traducción.

En ciertas realizaciones, una proteína de mamífero que puede estar O-manosilada se selecciona entre una inmunoglobulina, cadena pesada o ligera de inmunoglobulina o anticuerpo, un anticuerpo monoclonal, un fragmento Fab, un fragmento de anticuerpo F(ab')2, un anticuerpo de cadena individual, un anticuerpo de dominio individual monomérico o multimérico, un anticuerpo camélido, o sus fragmentos de unión a antígeno.

Un fragmento de una proteína, como se usa en el presente documento, consiste en al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 aminoácidos consecutivos de una proteína de referencia.

Como se usa en el presente documento, una "inmunoglobulina" se refiere a una proteína multimérica que contiene una cadena pesada y una cadena ligera unidas mediante enlace covalente y capaces de combinarse específicamente con el antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina son una gran familia de moléculas que incluyen varios tipos de moléculas tales como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE.

Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulina intactas, así como a fragmentos de las mismas que son capaces de unirse a un antígeno. Estas incluyen moléculas de anticuerpos híbridos (quiméricos) (véase, por ejemplo, Winter et al,. Nature 349: 293-99225, 1991; y documento de Patente de Estados Unidos N.° 4.816.567226); moléculas de F(ab')2; heterodímeros no covalentes; construcciones de fragmentos de anticuerpos diméricos y triméricos; moléculas de anticuerpos humanizados (véase por ejemplo, Riechmann et al,. Nature 332, 323-27, 1988; Verhoeyan et al,. Science 239, 1534-36, 1988; y documento de patente GB 2.276.169); y cualquier fragmento funcional obtenido a partir de tales moléculas, así como anticuerpos obtenidos mediante procesos no convencionales, tales como presentación de fagos o ratones transgénicos. Preferentemente, los anticuerpos son anticuerpos clásicos con región Fc. Los métodos de preparación de anticuerpos se conocen bien en la técnica.

En otras realizaciones, el rendimiento de la glicoproteína de mamífero es de al menos 0,5, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 gramos por litro.

En ciertas realizaciones, la glicoproteína de mamífero es un anticuerpo, opcionalmente, IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4. En realizaciones adicionales, el rendimiento del anticuerpo es de al menos 0,5, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 gramos por litro. En otras realizaciones, la glicoproteína de mamífero es un anticuerpo, y el anticuerpo contiene al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, o al menos un 98 % de un extremo C-terminal y N-terminal del anticuerpo natural y sin restos de aminoácido adicionales. En otras realizaciones, la glicoproteína de mamífero es un anticuerpo, y el anticuerpo contiene al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, o al menos un 98 % de un extremo C-terminal y N-terminal del anticuerpo natural que no carece de ningún resto de aminoácido C-terminal o N-terminal.

En ciertas realizaciones cuando la glicoproteína de mamífero se purifica a partir del cultivo celular, el cultivo que contiene la glicoproteína de mamífero contiene fragmentos de polipéptidos que constituyen un porcentaje de masa inferior a un 50 %, inferior a un 40 %, inferior a un 30 %, inferior a un 20 %, o inferior a un 10 % de la masa de los polipéptidos producidos. En ciertas realizaciones preferentes, la glicoproteína de mamífero es un anticuerpo, y los fragmentos de polipéptidos son fragmentos de cadena pesada y/o fragmentos de cadena ligera. En otras realizaciones, cuando la glicoproteína de mamífero es un anticuerpo y el anticuerpo se purifica a partir del cultivo celular, el cultivo que contiene el anticuerpo contiene cadenas pesadas libres y/o cadenas ligeras libres que constituyen un porcentaje de masa inferior a un 50 %, inferior a un 40 %, inferior a un 30 %, inferior a un 20 %, o inferior a un 10% de la masa del anticuerpo producido. Los métodos para determinar el porcentaje de masa de fragmentos de polipéptidos se conocen bien en la técnica e incluyen, medir la intensidad de la señal de un gel de SDS.

En ciertas realizaciones, cuando la proteína con O-manosilación reducida, por ejemplo, un anticuerpo, se purifica a partir del cultivo celular, el cultivo contiene al menos un 70%, un 80%, un 90%, un 95% o un 100% de las proteínas que no están O-manosiladas (% en moles, tal como se determina por ejemplo mediante análisis de MALDI TOF MS, y midiendo el área o intensidad de los picos como se describe en el Ejemplo 1 que sigue a continuación). En ciertas realizaciones cuando la proteína con al menos un resto de serina o treonina que puede estar O-manosilado se purifica a partir del cultivo celular, y cuando la cepa es una célula de Trichoderma modificada mediante ingeniería genética para producir N-glicanos complejos, el cultivo además comprende al menos un 5 %, un 10%, un 15%, un 20%, un 25%, un 30% de neutros complejos N-glicanos secretados (% en moles) en comparación con los N-glicanos neutros secretados totales (tal como se mide por ejemplo como se describe en el documento WO2012069593).

En otras realizaciones, la proteína heteróloga con O-manosilación reducida, por ejemplo, el anticuerpo, comprende la estructura de trimanosil N-glicano Mana3[Mana6]Manp4GlcNAcp4GlcNAc. En algunas realizaciones, la estructura Mana3[Mana6]Manp4GlcNAcp4GlcNAc representa al menos un 20 %, un 30 %; un 40 %, un 50 %; un 60 %, un 70 %, un 80 % (% en moles) o más, de los N-glicanos totales de la proteína heteróloga con O-manosilación reducida. En otras realizaciones, la proteína heteróloga con O-manosilación reducida comprende la estructura de N-glicano G0 GlcNAcp2Mana3[GlcNAcp2Mana6]Manp4GlcNAcp4GlcNAc. En otras realizaciones, la estructura de la glicoforma G0 no fucosilada representa al menos un 20 %, un 30 %; un 40 %, un 50 %; un 60 %, un 70 %, un 80 % (% en moles) o más, de los N-glicanos totales de la proteína heteróloga con O-manosilación reducida. En otras realizaciones, los N-glicanos galactosilados representan menos (% en moles) de un 0,5 %, un 0,1 %, un 0,05 %, un 0,01 % de los N-glicanos totales del cultivo, y/o de la proteína heteróloga con O-manosilación reducida, por ejemplo un anticuerpo. En ciertas realizaciones, el cultivo o la proteína heteróloga, por ejemplo un anticuerpo, no comprende N-glicanos galactosilados.

En ciertas realizaciones, la proteína heteróloga (purificada) es un anticuerpo, un anticuerpo de cadena ligera, un anticuerpo de cadena pesada o un Fab, que comprende estructura de N-glicano Man3, GIcNAcMan3, Man5, GlcNAcMan5, G0, G0 de núcleo, G1, o G2 como glicoforma principal y menos de un 35 %, un 20 %, un 17 %, un 15 %, un 13 %, un 12 %, un 11 %, un 10 %, un 9 %, un 8 %, un 7 %, un 6 %, un 5 %, un 4 %, un 3 %, un 2 %, o un 1 %, o menos de un 0,5% de nivel de O-manosilación (como % en molesta como se determina por ejemplo mediante análisis MALDI TOF MS, y midiendo el área o la intensidad de los picos como se describe en el Ejemplo 1).

La presente solicitud también se refiere a un método para producir un anticuerpo que tiene O-manosilación reducida, que comprende:

a. proporcionar una célula de Trichoderma deficiente en PMT que tiene

i. una mutación que reduce la actividad de proteína O-manosiltransferasa endógena en comparación con la cepa precursora que no tiene una mutación de ese tipo y

b. cultivar la célula para producir dicho anticuerpo, que consiste en cadenas pesadas y ligeras, que tiene O-manosilación reducida.

En realizaciones específicas de ese tipo de los métodos relacionados con la producción de anticuerpos, al menos un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % el anticuerpo producido no está O-manosilado (% en moles, tal como se determina por ejemplo mediante análisis MALDI TOF MS, inhibiendo el área o la intensidad de los picos como se describe en el Ejemplo 1).

En ciertas realizaciones de cualquiera de los métodos que se desvelan, el método incluye la etapa adicional de proporcionar uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, o cinco o más inhibidores de proteasa. En ciertas realizaciones, los inhibidores de proteasa son péptidos que se expresan de forma conjunta con el polipéptido de mamífero. En otras realizaciones, los inhibidores inhiben al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro proteasas de una familia de proteasas seleccionadas entre proteasas aspárticas, serina proteasas de tipo tripsina, subtilisina proteasas, y proteasas glutámicas.

En ciertas realizaciones de cualquiera de los métodos que se desvelan, la célula fúngica filamentosa o célula fúngica de Trichoderma también contiene una proteína vehículo. Como se usa en el presente documento, una "proteína vehículo" es una parte de una proteína que es endógena y que es secretada altamente por una célula fúngica filamentosa o célula fúngica de Trichoderma. Las proteínas vehículo adecuadas incluyen, pero no se limitan a, mananasa I de T. reesei (Man5A, o MANI), celobiohidrolasa II de T. reesei (Cel6A, o CBHII) (véase, por ejemplo, Paloheimo et al., Appl. Environ. Microbiol. Diciembre de 2003; 69 (12): 7073-7082) o celobiohidrolasa I de T. reesei (CBHI). En algunas realizaciones, la proteína vehículo es CBH1. En otras realizaciones, la proteína vehículo es una proteína CBH1 de T. reesei truncada que incluye la región núcleo de CBH1 y parte de la región conectora de CBH1. En algunas realizaciones, un vehículo tal como una celobiohidrolasa o su fragmento se fusiona a una cadena ligera de anticuerpo y/o una cadena pesada de anticuerpo. En algunas realizaciones, un polipéptido de fusión de vehículoanticuerpo comprende un sitio de escisión Kex2. En ciertas realizaciones, Kex2, u otra enzima de escisión de vehículo, es endógena para una célula fúngica filamentosa. En ciertas realizaciones, la proteasa de escisión de vehículo es heteróloga para la célula fúngica filamentosa, por ejemplo, otra proteína de Kex2 obtenida a partir de levadura o una proteasa TEV. En ciertas realizaciones, la enzima de escisión de vehículo está sobre expresada. En ciertas realizaciones, el vehículo consiste en aproximadamente 469 a 478 aminoácidos de la parte N-terminal de la proteína CBH1 de T. reesei con el de acceso en GenBank N.° EGR44817.1.

En ciertas realizaciones, la célula fúngica filamentosa de la invención sobre expresa la proteasa KEX2. En una realización la proteína heteróloga se expresa como una construcción de fusión que comprende un polipéptido fúngico endógeno, un sitio de proteasa tal como un sitio de escisión de Kex2, y la proteína heteróloga tal como una cadena pesada y/o ligera de anticuerpo antibody. Las combinaciones de 2-7 aminoácidos útiles que preceden al sitio de escisión de Kex2 se han descrito, por ejemplo, en Mikosch et al,. (1996) J. Biotechnol. 52: 97-106; Goller et al,. (1998) Appl Environ Microbiol. 64: 3202-3208; Spencer et al,. (1998) Eur. J. Biochem. 258: 107-112; Jalving et al,. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66: 363-368; Ward et al,. (2004) Appl. Environ. Microbiol. 70: 2567-2576; Ahn et al,. (2004) Appl. Microbiol. Biotechnol. 64: 833-839; Paloheimo et al,. (2007) Appl Environ Microbiol. 73: 3215-3224; Paloheimo et al,. (2003) Appl Environ Microbiol. 69: 7073-7082; y Margolles-Clark et al,. (1996) Eur J Biochem. 237: 553-560.

La presente divulgación se refiere además a la composición de proteína, por ejemplo la composición de anticuerpo, que se puede obtener o que se obtiene con el método como se ha desvelado anteriormente.

En realizaciones específicas, una composición de anticuerpo de ese tipo que se puede obtener o que se obtiene con los métodos de la divulgación, comprende al menos un 70%, un 80%, un 90%, un 95%, o un 100% de los anticuerpos que no están O-manosilados (% en moles, tal como se determina por ejemplo mediante análisis MALDI TOF MS, y midiendo el área o la intensidad de los picos como se describe en el Ejemplo 1). En otras realizaciones específicas,1 composición de anticuerpo de ese tipo además comprende un 50 %, un 60 %, un 70 % o un 80 % (% en moles de N-glicano neutro), de la siguiente glicoforma:

(i) Mana3[Mana6(Mana3)Mana6]Manp4GlcNAp4GlcNAc (glicoforma Man5);

(ii) GlcNAcp2Mana3[Mana6(Mana3)Mana6]Manp4GlcNAp4GlcNAc, o variante p4-galactosilada de la misma; (iii) Mana6(Mana3)Manp4GlcNAp4GlcNAc;

(iv) Mana6(GlcNAcp2Mana3)Manp4GlcNAp4GlcNAc, o variante p4-galactosilada de la misma: o,

(v) N-glicanos de tipo complejo seleccionados entre las glicoformas G0, G1 o G2.

En algunas realizaciones la glicoforma de N-glicano de acuerdo con iii-v comprende menos de un 15 %, un 10 %, un 7 %, un 5 %, un 3 %, un 1 % o un 0,5 % cuesta desprovista de glicano Man5 como se ha definido en i) anteriormente.

La presente divulgación también se refiere a un método para reducir el nivel de O-manosilación de una composición de glicoproteína recombinante producida en una célula de Trichoderma, consistiendo dicho método en el uso de una célula de Trichoderma que tiene una mutación en un gen PMT en la que dicho gen PMT es cualquiera de:

a. un gen PMT1 que comprende el polinucleótido de la SEQ ID NO: 1,

b. un gen homólogo funcional del gen PMT1, cuyo gen es capaz de restablecer el nivel de O-manosilación precursora mediante complementación funcional cuando se introduce en una cepa de T. reesei que tiene una alteración en dicho gen PMT1, o,

c. un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70%, al menos un 90%, o al menos un 95% con la SEQ ID NO: 2, teniendo dicho polipéptido actividad de proteína O-manosiltransferasa.

En una realización específica de un método de ese tipo, dicha célula de Trichoderma es Trichoderma reesei.

En otra realización específica de un método de ese tipo, dicha glicoproteína recombinante comprende al menos un anticuerpo de cadena ligera o sus fragmentos que comprenden al menos un resto de serina o treonina y con al menos un N-glicano.

EJEMPLOS

Como se ejemplificó más específicamente en el Ejemplo 2, después de la deleción de pmt1, casi un 95 % del mAb purificado y un 70 % de las moléculas Fab ya no contenían ningún resto de O-manosa. Por el contrario, como se ejemplifica en los Ejemplos 3 a 4, el análisis del nivel de O-manosilación realizado en las cepas de deleción pmt2 y pmt3 no mostró ninguna reducción observable en la O-manosilación. Junto con el análisis de títulos y crecimiento que se ha expuesto en el Ejemplo 2, estos resultados demuestran que las células fúngicas filamentosas, tales como las células de Trichoderma, se pueden modificar genéticamente para reducir o suprimir la actividad de O-manosilación, sin afectar adversamente la viabilidad y el rendimiento de las glicoproteínas producidas. Como tal, se identifica a pmt1 como una diana valiosa para reducir la O-manosilación de proteínas secretadas y para mejorar la calidad del producto de los productos biofarmacéuticos producidos por Trichoderma reesei.

Ejemplo 1: deleción de pmtl en una cepa de Trichoderma reesei

Este ejemplo demuestra que pmtl es una diana valiosa para reducir la O-manosilación de proteínas secretadas y para mejorar la calidad del producto de los productos biofarmacéuticos producidos por Trichoderma reesei.

Generación de plásmidos de deleción de pmtl.

Se construyeron tres plásmidos de deleción diferentes (pTTv36, pTTv124, pTTv185) para la deleción del gen pmtl de la proteína O-manosiltransferasa (TreID75421). Todos los plásmidos contienen las mismas regiones de flanqueo en las posiciones 5' y 3' para una correcta integración en el locus de pmtl. La diferencia entre los tres plásmidos es el marcador usado en la selección; pTTv36 contiene un gen que codifica acetamidasa de Aspergillus nidulans (amdS), pTTv124 contiene una versión de área circular (casete blaster) del marcador amdS y pTTv185 una versión de área circular (casete de blaster) de un gen que codifica orotidina-5'-monofosfato (OMP) descarboxilasa de T. reesei (pyr4).

La tercera construcción de deleción, pTTv185, para el gen pmt1 de la proteína O-manosiltransferasa (TreID75421) se diseñó para permitir la eliminación del marcador de selección del genoma de Trichoderma reesei después de la integración satisfactoria y de ese modo para reciclar el marcador de selección para las transformaciones posteriores. En este enfoque, el reciclaje del marcador, es decir, la eliminación del gen pyr4 de la construcción de deleción, se parece a los llamados casetes de blaster desarrollados para levaduras (Hartl, L. y Seiboth, B., 2005, Curr Genet 48: 204-211; y Alani, E. et al., 1987, Genetics 116: 541-545). También se han desarrollado casetes de blaster similares para hongos filamentosos que incluyen Hypocrea jecorina (anamorfo: T. reesei) (Hartl, L. y Seiboth, B., 2005, Curr Genet 48: 204-211).

El número TrelD se refiere al número de identificación de un gen de proteasa en particular de la base de datos del genoma del Joint Genome Institute para Trichoderma reesei v2.0. Los cebadores para la construcción de plásmidos de deleción se diseñaron manualmente o usando el software Primer3 (sitio web de Primer3, Rozen y Skaletsky (2000) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, ^{N j ,}pp 365 386).

El principio del casete desintegrador que usa pyr4 como gen marcador es el siguiente: pyr4, que codifica orotidina-5'-monofosfato (OMP) descarboxilasa de T. reesei (Smith, J.L., et al., 1991, Current Genetics 19: 27-33) es necesaria para la síntesis de uridina. Las cepas con deficiencia para la actividad de la OMP descarboxilasa no pueden crecer en un medio mínimo sin la suplementación con uridina (es decir, son auxótrofos de uridina). El uso de ácido 5-fluoroorótico (5-FOA) en la generación de cepas mutantes que carecen de actividad de OMP descarboxilasa (cepas pyr4-) se basa en la conversión de 5-FOA en un 5-fluoro-UMP intermedio tóxico por la OMP descarboxilasa. Por lo tanto, las células que tienen un gen pyr4 mutado son resistentes al 5-FOA, pero además también son auxotróficas para la uridina. En principio, la resistencia al 5-FOA también puede resultar de una mutación en otro gen (pyr2, orotato fosforribosiltransferasa), y por lo tanto los mutantes espontáneos obtenidos con esta selección se deben verificar para el genotipo pyr4- complementando el mutante con el gen pyr4. Una vez mutado, el gen pyr4 se puede usar como un marcador de selección auxotrófico en T. reesei. En el casete blaster de los investigadores pyr4 va seguido de una repetición directa de 310 pb de la región no traducida de pyr4 5' (5'UTR) y está rodeado por las regiones de flanqueo en las posiciones 5' y 3' del gen que se someterá a deleción. La integración de deleción se selecciona mediante la función de pyr4. La eliminación del marcador pyr4 a continuación se fuerza en presencia de 5-FOA por recombinación entre las dos regiones homólogas (repetición directa de 5'UTR) dando como resultado un bucle fuera del marcador de selección y que permite el uso del mismo casete blaster(versión de área circular de pyr4) en rondas sucesivas de deleciones genéticas. Después de realizar un bucle, en el locus solo permanece la secuencia de 310 pb de 5'UTR.

Por lo tanto, el marcador de selección pyr4 y el fragmento de repetición directa (DR) en la posición 5' (310 pb de 5'UTR de pyr4) se produjeron mediante PCR usando un plásmido que contenía una copia genómica de pyr4 de T.

reesei como molde. Ambos fragmentos contenían secuencias superpuestas de 40 pb necesarias para clonar el plásmido con el casete de área circular en bucle usando una recombinación homóloga en levadura (véase a continuación). Para permitió las posibles etapas de clonación adicionales, se colocó un sitio de digestión AscI entre el marcador pyr4 y los sitios de repetición directa en la posición 5' y NotI para rodear el casete blaster completo. Se seleccionaron 1100 pb de las regiones de flanqueo en la posición 5' y 1000 pb de regiones de flanqueo en la posición 3' como la base de los plásmidos de deleción de pmtl. Los fragmentos de la región de flanqueo se produjeron mediante PCR usando una cepa QM6a de tipo silvestre de T. reesei (ATCC13631) como molde. Para el sistema de recombinación homóloga de levadura usado en la clonación (véase a continuación), las secuencias solapan que es para el vector y el marcador de selección se colocaron en los cebadores de PCR apropiados. Para permitir el cambio de marcador en la construcción, se introdujeron sitios de restricción NotI entre las regiones de flanqueo y el marcador de selección. Los sitios de restricción PmeI se colocaron entre el vector y las regiones de flanqueo para la eliminación de la secuencia del vector antes de la transformación en T. reesei. La estructura principal del vector pRS426 se digirió con enzimas de restricción (EcoRI y XhoI).

El primer plásmido de deleción para pmtl (plásmido pTTv36, Tabla 2) usó amdS, un gen que codifica acetamidasa de Aspergillus nidulans, como marcador. El casete marcador se digirió a partir de un plásmido existente pHHO1 con NotI. Todos los fragmentos usados en la clonación se separaron con electroforesis en gel de agarosa y los fragmentos correctos se aislaron del gel con un kit de extracción en gel (Qiagen) usando métodos de laboratorio convencionales.

Para construir el primer plásmido de deleción pTTv36, la estructura principal del vector y el marcador apropiado y los fragmentos de las regiones de flanqueo se transformaron en Saccharomyces cerevisiae (cepa H3488/FY834). El protocolo de transformación de la levadura se basó en el método de recombinación homóloga de la levadura que se describe en el material de trabajo de desactivaciones genéticas de Neurospora de Colot y Collopy, (sitio web de protocolos del genoma de Dartmouth Neurospora), en el protocolo de laboratorio Gietz (University of Manitoba, sitio web del laboratorio Gietz). El ADN plasmídico de los transformantes de levadura se rescató mediante transformación en Escherichia coli. Se cultivaron unos pocos clones, el plásmido de ADN se aisló y se digirió para detectar la recombinación correcta usando métodos de laboratorio convencionales. Se secuenciaron y almacenaron algunos clones con tamaños de inserción correctos.

Para clonar el segundo plásmido de deleción de pmt1 (pTTv124, Tabla 2), se eliminó el marcador amdS del plásmido de eliminación pTTv36 con digestión con NotI y se reemplazó por otra variante del casete de blaster, casete de área circular amdS que contiene el gen marcador de selección amdS, seguido de sitio de restricción AscI y una repetición directa de 300 pb de 5'UTR de amdS. El casete blaster de amdS funciona de manera similar al casete blaster de pyr4. Los clones que contienen el casete blaster de amdS pueden crecer en acetamida como única fuente de nitrógeno. En un medio que contiene 5-fluoroacetamida (5-FAA), un gen funcional amdS convertirá 5-FAA en un fluoroacetato tóxico y, por lo tanto, en presencia de 5-FAA, la eliminación del gen amdS es beneficiosa para el hongo. La eliminación del casete blaster de amdS se mejora a través de los DR de 300 pb en el casete, como en el casete blaster de pyr4, lo que permite que el gen amdS se extienda a través de un solo cruce entre los dos DR. Los clones resultantes son resistentes a 5-FAA y no pueden crecer con acetamida como única fuente de nitrógeno. Los fragmentos necesarios para el casete blaster de amdS se produjeron mediante PCR usando un plásmido p3SR2 (Hynes M.J. et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 1430-1439) que contiene una copia genómica del gen c amdS como molde. Para el sistema de recombinación homóloga de levadura usado en la clonación (véase anteriormente), las secuencias solapantes se colocaron en los cebadores de PCR apropiados. Para permitir el cambio de marcador en la construcción, los sitios de restricción NotI se mantuvieron entre las regiones de flanqueo y el casete blaster. Los sitios de restricción adicionales FseI y AsiSI se introdujeron en el extremo 5' de amdS y un sitio AscI entre el 5'DR de amdS y amdS. El plásmido pTTv124 se construyó usando el sistema de recombinación de levadura que se ha descrito anteriormente. El plásmido de ADN de los transformantes de levadura se rescató mediante transformación en Escherichia coli. Se cultivaron unos pocos clones, el plásmido de ADN se aisló y se digirió para detectar la recombinación correcta usando métodos de laboratorio convencionales. Se secuenciaron y almacenaron algunos clones con tamaños de inserción correctos.

Para clonar el tercer plásmido de deleción pmt1 (pTTv185, Tabla 2), el marcador amdS se eliminó del plásmido de deleción pTTv36 con digestión con NotI y se reemplazó por el casete blaster de pyr4 que se ha descrito anteriormente. El casete blaster de pyr4 se obtuvo a partir de otro plásmido con digestión con NotI, se ligó a NotI cortado con pTTv36 y se transformó en E. coli usando métodos de laboratorio convencionales. Se cultivaron unos pocos transformantes, el ADN plasmídico se aisló y se digirió a identificar sistemáticamente la ligadura y orientación correctas del casete blaster de pyr4 usando métodos de laboratorio convencionales. Un clon con un tamaño de inserción y orientación correctos se secuenció y almacenó.

Estos plásmidos de deleción para pmt1 (pTTv36, pTTv124 y pTTv185) dan como resultado una deleción de 2465 pb en el locus de pmt1 y cubren la secuencia de codificación completa de PMT1.

Tabla 2. Cebadores para generar los plásmidos deleción pTTv36, pTTv124 y pTTv185 para proteína O _____________________________ manosiltransferasa 1 (pmt1, TreID75421)__________________________ Plásmido de deleción pTTv36 para pmtl (TreID75421), estructura principal de vector pRS426

Cebador Secuencia

CGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGGTTT

AAACGCTGCAGGGCGTACAGAACT (SEQ ID NO:48)

ATCTCTCAAAGGAAGAATCCCTTCAGGGTTGCGTTTCCAGTGCGG

CCGCGGCTCTAAAATGCTTCACAG (SEQ ID NO:49)

CGGTTCTCAT CTGGGCTT GCT CGGTCCT GGCGTAGAT CTAGCGG

CCGCACGATGATGATGACAGCCAG (SEQ ID NQ:50)

GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCGTTT

AAACCGTCCAGCTCCCGCAGCGCC (SEQ ID NO:51)

Plásmido de deleción pTTv124 para pmtl (TreID75421), estructura principal de vector pTTv36

T282_75421_amds ATCGCTAACTGCTTT CTCTTCT GT GAAGCATTTTAGAGCCGCGGC

5for CGCGGCCGGCCGCGATCGCCTAGATCTACGCCAGGACCG (SEQ

ID NO:52)

T283_amds_3rev_ CGGTCCTGGCGTAGATCTAGGGCGCGCCACTGGAAACGCAACC

loop CTGAA (SEQ ID NO:53)

T284_amds_loop_ TTCAGGGTTGCGTTTCCAGTGGCGCGCCCTAGATCTACGCCAGG

5for ACCG (SEQ ID NO:54)

T287 _75421_loop_ AGCATCATGACCGCCCCCTTCTGGCTGTCATCATCATCGTGCGG

3rev CCGCGATTATTGCACAAGCAGCGA (SEQ ID NO:55)

Plásmido de deleción pTTv185 para pmtl (TreID75421), estructura principal de vector pTTv36

Cebador Secuencia

sin nuevos cebadores, pTTv36 digerido con Notl y ligado con fragmento de bucle de pyr4 obtenido a partir de otro plásmido

Generación de cepas M403, M404, M406 y M407 de deleción de pmtl

Para generar una cepa diana negativa para pyr4 adecuada para la deleción de pmtl usando el plásmido pTTv185, la cepa M304 productora del anticuerpo MAB01 se sometió a selección en presencia de ácido 5-fluoroorótico para seleccionar cepas que contienen genes pyr4 alterados. La generación de la cepa M304 se describe en la Solicitud de Patente Internacional N.° PCT/EP2013/05012. La cepa M304 de T. reesei comprende la cadena ligera de MAB01 fusionada al vehículo de CBH1 truncado de T. reesei con la secuencia de escisión de Kex2 NVISKR, cadena pesada de MAB01 fusionada al vehículo de CBH1 truncado de T. reesei con la secuencia de escisión de Kex2 AXE1 [DGETVVKR], Apep1Atsp1Aslp1, y sobreexpresa KEX2 de T. reesei.

Las esporas de M304 se diseminaron en placas de medio mínimo que contenían 20 g/l de glucosa, 2 g/l de proteína peptona, uridina 5 mM y 1,5 g/l de 5-FOA, pH 4,8. Algunas colonias resistentes a 5-FOA se sembraron después de 5-7 días en las placas que se han descrito anteriormente con 1 ml/l de suplemento con Triton X-100. Además se purificaron algunos clones para formar clones de células individuales mediante placas de purificación consecutivas: se seleccionó un pequeño trozo de micelio para obtener NaCl al 0,8 % - Tween 20 al 0,025 % - glicerol al 20 %, se suspendió completamente mediante agitación vorticial y se filtró a través de una punta de pipeta llena de algodón. Los clones purificados se esporularon en placas que contenían 39 g/l de agarosa de dextrosa de patata. Estos clones se analizaron para determinar la auxotrofia de uridina colocando esporas en placas de medio mínimo (20 g/l de glucosa, 1 ml/l de Triton X-100, pH 4,8) con y sin suplementos de uridina 5 mM. No se observó crecimiento en las placas sin uridina, lo que indica que los clones seleccionados pyr4- supuestos. Los clones se almacenaron para un uso futuro y uno de ellos se designó con el número de cepa M317.

Pmtl se sometió a deleción de M317 (pyr4- de la cepa M304) usando el casete de deleción de pmtl del plásmido pTTv185 que se ha descrito anteriormente. Para eliminar la secuencia del vector, el plásmido pTTv185 (Apmt1-pyr4) se digirió con Pmel + Xbal y el fragmento correcto se purificó a partir de un gel de agarosa usando el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen). Aproximadamente 5 |jg del casete de deleción de pmtl se usaron para transformar la cepa M317. La preparación de protoplastos y la transformación para selección de pyr4 se llevó a cabo básicamente de acuerdo con los métodos de Penttila et al,. (1987, Gene 61:155-164) y Gruber et al,. (1990, Curr. Genet. 18:71-76).

Se seleccionaron 100 colonias como estrías selectivas. 40 transformantes se identificaron sistemáticamente por PCR usando los cebadores de la Tabla 3 para la integración correcta del casete de deleción usando métodos de laboratorio convencionales. 12 clones de deleción supuestos se purificaron a clones de células individuales. Los clones purificados se volvieron a identificar sistemáticamente para la integración y para la deleción del ORF de pmtl usando cebadores de la Tabla 5. Cuatro clones (por duplicado) eran interruptores puros (es decir, sin señal con cebadores del ORF).

Tabla 3. Cebadores para identificación sistemática de integración de casete de deleción pTTv185 y para ______________ deleción de la proteína O-manosiltransferasa 1 (pmt1, TreID75421) de M317.______________ Cebador Secuencia

T296 75421 5int TATGGCTTTAGATGGGGACA (SEQ ID NO:56) T027_Pyr4_orf_start_rev TGCGTCGCCGTCTCGCTCCT (SEQ ID NO:57) T061_pyr4_orf_screen_2F TTAGGCGACCTCTTTTCCA (SEQ ID NO:58)

T297 75421 3int CCTGTATCGTCCTGTTCC (SEQ ID NO:59) T359_pmt1_orf_for GCGCCTGTCGAGTCGGCATT (SEQ ID NO:60) T360_pmt1_orf_rev CACCGGCCATGCTCTTGCCA (SEQ ID NO:61) T756_pmt1_orf_for2 CAAGGTGCCCTATGTCGC (SEQ ID NO:62) T757_pmt1_orf_rev2 GATCGGGTCAGGACGGAA (SEQ ID NO:63)

La deleción de pmtl se verificó mediante análisis de Southern. El ADN para los análisis de Southern se extrajo con el kit Easy-DNA para el aislamiento del ADN genómico (Invitrogen) básicamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los análisis de Southern se realizaron básicamente de acuerdo con el protocolo para hibridaciones homólogas en Sambrook et al,. (1989, Molecular Cloning: A laboratory manual. 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press) usando marcado radioactivo (32P-dCTP) y el kit DecaLabel Plus (Fermentas). Los esquemas de digestión de Southern se diseñaron usando el software Geneious Pro (sitio web de Geneious). Los fragmentos para las sondas se produjeron mediante PCR usando los cebadores enumerados en la Tabla 4 usando una cepa QM6a de tipo silvestre de T. reesei (ATCC13631) como molde. Los productos de PCR se separaron con electroforesis en gel de agarosa y los fragmentos correctos se aislaron del gel con un kit de extracción en gel (Qiagen) usando métodos de laboratorio convencionales.

Tabla 4. Cebadores para producción de fragmentos de sonda usados en análisis de Southern de cepas de __________________ deleción de proteína O-manosiltransferasa 1 (pmt1, TreID75421)__________________ Cebador Secuencia

T635_pmt1_5f_for AGCCTGTCTGAGGGACGG (SEQ ID NO:64) T636_pmt1_5f_rev CAAGGTCGAGATTCGGCA (SEQ ID NO:65) T637_pmt1_3f_for CAGAAGGGGGCGGTCAT (SEQ ID NO:66) T638_pmt1_3f_rev GTCCCAGCTCCCGCTCT (SEQ ID NO:67) T359_pmt1_orf_for GCGCCTGTCGAGTCGGCATT (SEQ ID NO:68) T360_pmt1_orf_rev CACCGGCCATGCTCTTGCCA (SEQ ID NO:69)

Ninguno de los clones se hibridó con la sonda del ORF de pmtl (Figura 1A) indicando una deleción satisfactoria de pmtl. Los análisis que usaron sondas flanqueo en las posiciones 5' y 3' revelaron que cuatro de los clones eran integrantes individuales (Figura 1B y 1C; 26-8A y B, 26-21A y B). Cuatro clones dieron señales adicionales y por lo tanto esto indicó una integración múltiple del casete de deleción. Cuatro clones puros (con y sin copias adicionales del casete de deleción) se han almacenado para uso futuro (M403; 26-8A, M404; 26-19A, M406; 26-16B y M407; 26-19B).

Ejemplo 2 Análisis de las cepas M403, M404, M406 y M407 de Apmtl

El cultivo en matraz de agitación de la cepa M304 de T. reesei y ocho cepas de deleción de pmtl (26-8A (M403), 26-8B, 26-16A, 26-16B (M406), 26-19A (M404), 26-19B (M407), 26-21A, 26-21B) se llevó a cabo en un medio mínimo de Trichoderma con 40 g/l de lactosa, 20 g/l de extracto de grano agotado, PIPPS 100 mM, 9 g/l de casaminoácidos, pH 5,5 a 28 °C, 200 rpm. Las muestras se recogieron los días 3, 5, 7 y 10 mediante filtración en vacío. Las muestras de sobrenadantes se almacenaron a -20 °C (análisis de anticuerpo y glicano) o se usaron en determinaciones de pH. Los micelios para determinaciones de peso seco celular se aclararon una vez con DDIW y se secaron a 100 °C durante 20-24 h. Los micelios para extracción de ADN genómico se aclararon una vez con DDIW y se almacenaron a-20 °C.

El análisis del estado de O-manosilación se llevó a cabo para cultivos el matraz de agitación de la cepa M304 de T. reesei, ocho interruptores de pmt1 (pTTv185: 26-8A, 26-8B, 26-16A, 26-16B, 26-19A, 26-19B, 26-21A, 26-21B). Todos se cultivaron en TrMM - 40 g/l de lactosa - 20 g/l de SGE - PIPPS 100 mM - 9 g/l de casaminoácidos, pH 5,5 a 28 °C y las muestras se extrajeron en los días de los puntos temporales 3, 5, 7 y 10.

El anticuerpo MAB01 de cada muestra del día 7 se purificó a partir de los sobrenadantes usando la placa de 96 pocillos ProteT G HP MultiTrap (GE Healthcare) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El anticuerpo se eluyó con tampón citrato 0,1 M, pH 2,6 y se neutralizó con Tris 2 M, pH 9. La concentración se determinó mediante la absorbancia de UV en un espectrofotómetro frente a la curva patrón de MAB01. Para el análisis de O-manosilación, se incubaron 10 pg de proteína en HCl de Guanidinio 6 M durante 30 minutos a 60 °C, después de lo cual se añadieron 5 pl de DTT 0,1 M reciente y se incubaron nuevamente como se ha indicado anteriormente. Las muestras se purificaron usando una placa Poros R1 de 96 pocillos y las cadenas ligeras resultantes se analizaron usando MALDl-TOF MS. Todos los análisis se realizaron como duplicados.

En cultivos de matraz, el estado de O-manosilación en los interruptores de pmt1 se modificó notablemente; todos los interruptores de Apmtl parecían iguales - de O-manosilación casi completa pérdida en MAB01 LC (Figura 2: Espectros de la cadena ligera de la cepa M317 precursora de T. reesei cultivada en matraz (pyr4‘ de M304) (A) y el clon 26-8A interruptor de Apmt1 (B), día 7).

Fermentación de la cepa M403 de Apmtl

La fermentación se llevó a cabo con la cepa M403 de Apmtl (clon 26-8A; pTTv185 en M317). El medio de cultivo de fermentación contenía 30 g/l de glucosa, 60 g/l de lactosa, 60 g/l de grano agotado completo a pH 5,5. La alimentación con lactosa se inició después del agotamiento de la glucosa. La temperatura de crecimiento se desplazó de 28 °C a 22 °C después del agotamiento de la glucosa. Las muestras se recogieron mediante filtración en vacío. Las muestras de sobrenadantes se almacenaron a -20 °C.

En la Figura 3 se muestran los análisis de Western de muestras de sobrenadante. Las cadenas pesadas y ligeras de MAB01 se detectaron a partir de sobrenadante después del día tres. A pesar de la deleción de pmtl, que también podría reducir la O-manosilación del conector y por lo tanto ayudar en la escisión de KEX2, una cantidad sustancial de cadena ligera permanece unida al vehículo en los primeros días de la fermentación. En etapas posteriores, la escisión es más completa, pero el rendimiento se puede ver afectado por la degradación de la cadena pesada. Los resultados sobre los títulos de anticuerpos (Tabla 7 que sigue a continuación) indican una expresión bastante estable entre los días 7 y 10. En esta fermentación, la cepa de deleción de pmtl deleción produjo niveles de anticuerpos aproximadamente iguales a los de la cepa precursora. Se obtuvieron títulos más altos cuando la misma cepa se fermentó usando un fermentador diferente.

M403 (clon 26-8A) se cultivó en un fermentador en TrMM, 30 g/l de glucosa, 60 g/l de lactosa, 60 g/l de grano agotado, pH 5,5 con alimentación de lactosa. Las muestras se recolectaron los días 2, 3 y 5 -11. Se llevó a cabo un análisis del nivel de O-manosilación con respecto a los cultivos en matraz. El estado de O-manosilación también disminuyó considerablemente en el cultivo en fermentador (Figura 4, Tabla 5).

El nivel de O-manosilación se calculó a partir del promedio de área e intensidad (Tabla 5). El área (Tabla 6) parece dar con mayor frecuencia una tasa más alta de LC no O-glicosilado que la intensidad (Tabla 7). En todos los puntos temporales, el nivel de O-manosilación fue inferior a un 5 %.

T l . P r n v l r l r r m r r l l M4 ^ liv n f rm n r l í 7.

Tabla 7. Porcentajes de valores de intensidad de tres muestras paralelas de M403 cultivada en fermentador del día 7.

No se observaron efectos negativos de la característica del crecimiento de la cepa y capacidad de secreción. La cepa M403 creció bien y produjo un aumento de la cantidad de anticuerpo en función del tiempo en cultivo en fermentador. El mejor título se obtuvo desde el día 10 (Tabla 8). El día 11 el título disminuye.

Tabla 8: Títulos de MAB01 cultivada en fermentador que produce la cepa M403. El anticuerpo se purificó usando una laca de 96 ocillos con Proteína G.

La deleción de pmtl disminuyó drásticamente la O-manosilación de MAB01; la cantidad de LC O-manosilada fue ~ 61 % en la cepa precursora, un 3 % en el mejor clon de Apmt1 en el cultivo en matraz de agitación y prácticamente un 0 % en el cultivo en fermentador en el punto temporal el día 9.

Deleción de pmtl en un Fab que expresa la Cepa de Trichoderma reesei

El casete de interrupción de pmt1 (pmt1 amdS) se liberó de su troncal pTTv124 de la estructura principal que se ha descrito anteriormente mediante digestión de restricción y se purificó mediante extracción en gel. Usando la transformación de protoplastos, el casete de deleción se introdujo en las cepas de T. reesei, M304 (cepa de deleción de proteasa que expresa MAB01 3 veces) y M307 (cepas Apep1 Atsp1 Aslp1 Agap1 de deleción de proteasa 4 veces, también descrita en el documento PCT/EP2013/050126 que se ha transformado para expresar un Fab). Los transformantes se sembraron en placas en medio selectivo de acetamidasa (medio mínimo que contiene acetamida como única fuente de carbono).

Los transformantes se identificaron sistemáticamente por PCR para la integración homóloga del marcador de acetamidasa en el locus de pmt1 usando un cebador directo fuera del fragmento de la región de flanqueo en la posición 5' de la construcción y el cebador inverso dentro del marcador de selección AmdS (integración en 5'), así como un cebador directo dentro del marcador de selección AmdS y un cebador inverso fuera del fragmento de la región de flanqueo en la posición 3' (integración en 3'). Se seleccionaron tres transformantes independientes de cada transformación (cepas que expresaban MAB01 y Fab), que dieron resultados de PCR que mostraban la integración correcta de la construcción en el locus de pmt1 para la purificación de esporas individuales para obtener clones uninucleares. La integración adecuada del casete de alteración se volvió a confirmar mediante PCR usando las mismas combinaciones de cebadores que se han descrito anteriormente y la ausencia del gen pmt1 se verificó mediante el uso de una combinación de cebadores dirigida al marco de lectura abierto de pmt1. La integración correcta del casete de alteración también se verificó para todos los clones que aplican la hibridación de Southern. El ADN genómico digerido de los tres clones, así como la cepa precursora, se sometieron a ensayo frente de los flancos en las posiciones 5 'y 3' del gen pmtl para confirmar la modificación del locus de pmtl como se esperaba. Además, el ADN de transferencia se hibridó con una sonda específica para el marco de lectura abierto de pmtl con el fin de verificar la ausencia de pmtl.

Expresión de MAB01 y Fab para análisis de O-manosilación

Para evaluar el impacto de la deleción de pmt1 en los niveles de O-manosilación de moléculas de mAb y Fab, las cepas se cultivaron en fermentaciones discontinuas durante 7 días, en medios que contenían un 2 % de extracto de levadura, un 4 % de celulosa, un 4 % de celobiosa, un 2 % de sorbosa, 5 g/l de KH2PO4, y 5 g/l de (NH^SO4. El pH del cultivo se controló a pH 5,5 (ajustado con NH4OH). La temperatura de partida fue 30 °C, que se desplazó a 22 °C después de 48 horas. Las fermentaciones de mAb (cepas M304, M403, M406 y M407) se llevaron a cabo en 4 recipientes de reactor de vidrio de 2 l en paralelo (DASGlP) con un volumen de cultivo de 1 l y la fermentación de Fab (TR090 N.° 5) se realizó en un reactor de tanque de acero de 15 l (Infors) con un volumen de cultivo de 6 l. Las cepas de Fab (TR090 N.° 5, TR090 N.° 3, TR090 N.° 17) se cultivaron además en matraces de agitación durante 4 días a 28 °C. Los componentes principales de los medios fueron extracto de levadura al 1 %, celobiosa al 2 %, sorbosa al 1 %, 15 g/l de KH2PO4, y 5 g/l de (NH4)2SO4 y el pH no se controló (el pH disminuye de 5,5 a < 3 durante un periodo de tiempo de cultivo). Se tomaron muestras de sobrenadante de cultivo durante el transcurso de los ensayos y se almacenaron a -20 °C. Las muestras se recogieron diariamente de todo el transcurso de estos cultivos, y los niveles de producción se analizaron mediante cromatografía líquida de afinidad. Las muestras con niveles de producción máximos se sometieron a purificación y además a un análisis de O-manosilación.

Análisis de O-manosilación en Fab y mAb

La O-manosilación se analizó en moléculas de mAb y Fab expresadas a partir de la deleción de pmt1 y las cepas precursoras. El mAb y el Fab se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivo usando la resina de cromatografía de afinidad Lambda Select Sure y CaptureSelect Fab Lambda (BAC), respectivamente, aplicando las condiciones descritas por los protocolos de los fabricantes. Ambas moléculas purificadas, incluyendo el mAb y el Fab purificados, se sometieron a RP-LC-QTOF-MS como muestras intactas y/o reducidas/alquiladas.

Para análisis intactos, un equivalente de 20 |jg de proteína se inyectó en la columna. Para análisis de mAb reducidos/alquilados, un equivalente de 100 jg de proteína se desglicosiló usando la enzima PNGasa-F, que se reduce usando DTT y se alquila usando yodoacetamida antes del análisis de LC-MS. Para los análisis de Fab reducidos/alquilados, un equivalente de 100 jg de proteína se redujo con DTT y se alquiló con yodoacetamida antes del análisis de LC-MS. 6 jg de la muestra reducida/alquilada se inyectaron en la columna. La separación mediante cromatografía en fase inversa se llevó a cabo en una columna Zorbax C3 de 2,1 x 150 mm empaquetada con partículas de 5 jm , tamaño de poro de 300 A, los eluyente les fueron: eluyente A TFA al 0,1 % en agua y eluyente B TFA al 0,1 % en IPA al 70 %, ACN al 20 %, agua al 10 %. La columna se calentó a 75 °C y el caudal fue de 200 jl/min. El gradiente usado para la separación de la muestra se presenta en Tabla 9.

Tabla 9: gradiente de HPLC usado para muestras intactas y reducidas/alquiladas Tiempo % de B Flujo (ml/min)

0 10 0,1

0,1 10 0,2

2 10 0,2

4 28 0,2

30 36,4 0,2

31 100 0,2

34 100 0,2

35 10 0,2

40 10 0,2

La HPLC se acopló directamente con un espectrómetro de masas Q-TOF Ultima (Waters, Manchester, Reino Unido). El espectrómetro de masas ESI-TOF sea justo para desarrollarse en modo ion positivo. La evaluación de los datos de los análisis de muestras intactas y reducidas/alquiladas se llevó a cabo usando el software de análisis MassLynx (Waters, Manchester, Reino Unido). La deconvolución de los espectros de masas promediados a partir de las señales de UV principales se llevó a cabo usando el algoritmo MaxEnt, una parte del software de análisis MassLynx (Waters, Manchester, Reino Unido). Los parámetros de deconvolución fueron los siguientes: los "números máximos de iteraciones" son 8; la resolución es 0,1 Da/canal; Gaussiana Uniforme - el ancho a la altura media es 1 Da para las cadenas intactas y 0,5 para las cadenas reducidas y las proporciones de intensidad mínima son izquierda a un 30 % y derecha un 30 %. El nivel calculado de O-manosilación (%) se determinó usando la altura de la señal del pico después de la deconvolución. Los niveles de O-manosilación observados (%) de los mAb y los Fab de las cepas de deleción de pmt1 independientes se comparan con los de las cepas de tipo silvestre precursoras respectivas en las Tablas 10 y 11.

T l 1 : Niv l -m n il i n l F if r n

Tabla 11: Nivel de O-manosilación [%] de MAB01 de diferentes cepas M403, M406 y M407 deficientes en mt1. La ce a recursora es M304

Se encontró que el nivel de O-manosilación era de un 70 % en el Fab intacto obtenido a partir de la cepa precursora y se redujo a ~34 % en las tres cepas de deleción de pmtl. La transferencia de manosas disminuyó de manera más eficaz en las cadenas ligeras de Fab (10 % de O-manosilación residual en las cadenas ligeras obtenidas a partir de las cepas de deleción de pmtl con respecto a un 59 % para la cepa precursora), en comparación con las cadenas pesadas, para las cuales disminuyó de un 43 % a ~26 %.

Se encontró que el nivel de O-manosilación era de un 50 % en la cadena ligera del mAb obtenido a partir de las cepas precursoras y se redujo a un 5,7-5,8 % en las tres cepas de deleción de pmt1. Se encontró que el nivel de O-manosilación era de un 4,8 % en la cadena pesada del mAb obtenido a partir de las cepas y se redujo completamente (por debajo del límite de detección por LC-MS) en las tres cepas de deleción de pmt1.

En conclusión, después de la deleción de pmtl, casi un 95 % del mAb purificado y un 70 % de las moléculas de Fab ya no contenían ningún resto de O-manosa. Por lo tanto, pmtl es una diana valiosa para reducir la O-manosilación de proteínas secretadas y para mejorar la calidad del producto de los productos biofarmacéuticos producidos por Trichoderma reesei.

Ejemplo 3: deleción de pmt2 en una cepa de Trichoderma reesei

Generación de plásmidos de deleción de pmt2

Se construyeron tres plásmidos de deleción diferentes (pTTv34, pTTv122, pTTv186) para la deleción del gen pmt2 de la proteína O-manosiltransferasa (TreID22005). Todos los plásmidos contienen las mismas regiones de flanqueo en las posiciones 5' y 3' para una correcta integración en el locus de pmt2. La diferencia entre los tres plásmidos es el marcador usado en la selección; pTTv34 contiene un gen que codifica acetamidasa de Aspergillus nidulans (amdS), pTTv122 contiene una versión de bucle (casete blaster) del marcador amdS y pTTv186 una versión de bucle (casete blaster) de un gen que codifica orotidina-5'-mono-fosfato (OMP) descarboxilasa de T. reesei (pyr4). Se seleccionaron 1100 pb de las regiones de flanqueo en la posición 5' y 1000 pb en la posición 3' como la base del segundo gen de la proteína O-manosiltransferasa, pmt2 (TreID22005), plásmidos de deleción. La construcción del primer plásmido para este gen se llevó a cabo básicamente como se ha descrito para pmt1 en el Ejemplo 1. En cuanto a pmt1, el primer plásmido de deleción para pmt2 (plásmido pTTv34, Tabla 12) usó amdS, un gen que codifica acetamidasa de Aspergillus nidulans, como el marcador de selección.

Al igual que para pmt1 en el Ejemplo 1, para clonar el segundo plásmido de deleción, pTTv122 (Tabla 12), el marcador amdS se eliminó del plásmido de deleción pTTv34 con digestión con NotI y se reemplazó por el casete blaster de amdS para el cual los fragmentos se produjeron por PCR (véase el Ejemplo 1 mencionado anteriormente para detalles). El plásmido pTTv122 se construyó usando el sistema de recombinación de levadura que se ha descrito en el Ejemplo 1. El plásmido de ADN de los transformantes de levadura se rescató mediante transformación en Escherichia coli. Se cultivaron unos pocos clones, el plásmido de ADN se aisló y se digirió para identificar sistemáticamente la recombinación correcta usando métodos de laboratorio convencionales. Se secuenciaron y almacenaron algunos clones con tamaños de inserción correctos.

El tercer plásmido de deleción para pmt2, pTTv186 (Tabla 12) se clonó como el tercer plásmido para pm tl; el casete blaster de amdS se retiró del plásmido de deleción pTTv122 con digestión con NotI y se reemplazó por el casete blaster de pyr4 que se ha descrito en el Ejemplo 1. El casete blaster de pyr4 se obtuvo a partir de otro plásmido con digestión con NotI, se ligó a pTTv122 cortado con NotI y se transformó en E. coli usando métodos de laboratorio convencionales. Se cultivaron unos pocos transformantes, el plásmido de ADN se aisló y se digirió para identificar sistemáticamente la ligadura y orientación correctas del casete blaster de pyr4 usando métodos de laboratorio convencionales. Un clon con un tamaño de inserción y orientación correctos se secuenció y almacenó. Estos plásmidos de deleción para pmt2 (pTTv34, pTTv122 y pTTv186, Tabla 12) dan como resultado una deleción de 3186 pb en el locus de pmt2 y cubren la secuencia de codificación completa de PMT2.

Tabla 12. Cebadores para generar los plásmidos deleción pTTv34, pTTv122 y pTTv186 para proteína O _____________________________ manosiltransferasa 2 (pmt2, TreID22005).__________________________ Plásmido de deleción pTTv34 para pmt2 (TreID22005), estructura principal de vector pRS426

Cebador Secuencia

_{22005 5'F} CGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGGT

TTAAACGTTTCAGGTACCAACACCTG (SEQ ID NO:70)

ATCTCTCAAAGGAAGAATCCCTTCAGGGTTGCGTTTCCAGTGC

GGCCGCGGCGAAGAGTCTGGCGGGGA (SEQ ID NO:71)

CGGTTCTCAT CTGGGCTT GCT CGGTCCT GGCGTAGATCT AGCG

GCCGCAAGAGGATGGGGGTAAAGCT (SEQ ID NO:72)

GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCGT

TTAAACGAGGAGGACTCGTGAGTTAT (SEQ ID NO:73)

Plásmido de deleción pTTv122 forpmt2 (TreID22005), estructura principal de vector pTTv34

T280_22005_amds GCGCCCTTCCGCCTCGACAATCCCCGCCAGACTCTTCGCCGC

5for GGCCGCGGCCGGCCGCGATCGCCTAGATCTACGCCAGGACC

G (SEQ ID NO:74)

T283_amds_3rev_ CGGTCCTGGCGTAGATCTAGGGCGCGCCACTGGAAACGCAAC

loop CCTGAA (SEQ ID NO:75)

T284_amds_loop_ TTCAGGGTTGCGTTTCCAGTGGCGCGCCCTAGATCTACGCCAG

5for GACCG (SEQ ID NO:76)

T285_22005_loop_ GAGCTGGCCAGAAAAGACCAAGCTTTACCCCCATCCTCTTGCG

3rev GCCGCGATTATTGCACAAGCAGCGA (SEQ ID NO:77)

Plásmido de deleción pTTv186 forpmt2 (TreID22005), estructura principal de vector pTTv122

Cebador Secuencia

sin nuevos cebadores, pTTv122 digerido con Notl y ligado con fragmento de bucle de pyr4 de otro plásmido

Generación de las cepas de deleción M338, M339 y M340 de pmt2

Para eliminar la secuencia del vector, el plásmido pTTv122 (Apmt2-amdS) se digirió con Pmel+Xbal y el fragmento de 5,2 kb se purificó del gel de agarosa usando el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen). Se usaron aproximadamente 5 pg del casete de deleción de pmt2 para transformar la cepa M124 (la cepa M124 se describe en el documento WO2012/069593). La preparación y transformación de protoplastos se llevaron a cabo básicamente de acuerdo con Penttila et al., 1987, Gene 61: 155-164 y Gruber et al., 1990, Current Genetics 18: 71-76 para la selección de amdS.

Se seleccionaron 120 colonias como estrías selectivas. 10 transformantes se identificaron sistemáticamente por PCR usando los cebadores de la Tabla 13 para la integración correcta del casete de deleción usando métodos de laboratorio convencionales. Cinco clones de deleción supuestos se purificaron a clones de células individuales. Los clones purificados (dos en paralelo de cada uno) se volvieron a identificar sistemáticamente para la integración y para la deleción del ORF de pmt2 (cebadores en la Tabla 13). Cinco clones se seleccionaron para análisis de Southern.

Tabla 13. Cebadores para identificación sistemática de integración de casete de deleción pTTv122 y para ______________deleción de la proteína O-manosiltransferasa 2 (pmt2, TreID22005) de M124.____________ Cebador Secuencia

T288_22005_5int ACGAGTTGTTTCGTGTACCG (SEQ ID NO:78) T020_Amds_rev2 CTTTCCATTCATCAGGGATGG (SEQ ID NO:79) T021_amds_end_fWd

T289_22005_3int ATGTTGCAGTTGCGAAAG (SEQ ID NO:81) T290_22005_5orf

T291 22005 3orf AGCCTCCTTGGGAACCTCAG (SEQ ID NO:83)

La deleción de pmt2 se verificó mediante análisis de Southern. El ADN para los análisis de Southern se extrajo con el kit Easy-DNA para el aislamiento del ADN genómico (Invitrogen) básicamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los análisis de Southern se realizaron básicamente como se ha descrito en el Ejemplo 1. Los fragmentos para las sondas se produjeron mediante PCR usando los cebadores que se enumeran en la Tabla 14 usando una cepa M124 de T. reesei como molde para la sonda de ORF y el plásmido pTTv122 para las sondas de flanqueo en las posiciones 5' y 3'. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa y los fragmentos correctos se aislaron del gel con un kit de extracción en gel (Qiagen) usando métodos de laboratorio convencionales.

Tabla 14. Cebadores para producción de fragmentos de sonda usados en análisis de Southern de cepas de ___________________deleción de proteína O-manosiltransferasa 2 (pmt2, TreID22005).___________________ Cebador Secuencia

T639_22005 sonda de flanqueo F en CTTAGTGCGGCTGGAGGGCG (SEQ ID NO:84)

la posición 5'

T640_22005 sonda de flanqueo R en GGCCGGTTCGTGCAACTGGA (SEQ ID NO:85)

la posición 5'

T641_22005 sonda de flanqueo F en GGCCGCAAGAGGATGGGGGT (SEQ ID NO:86)

la posición 3'

T642_22005 sonda de flanqueo R en TCGGGCCAGCTGAAGCACAAC (SEQ ID NO:87)

la posición 3'

T643_22005 sonda en la posición 5’

de orf T644_22005 sonda en la posición 3’

de orf

Tres de los clones no se hibridaron con la sonda de ORF de pmt2 (los datos no se muestran) lo que indica una deleción de pmt2 satisfactoria. Los análisis que usaron sondas de flanqueo en las posiciones 5' y 3' revelaron que los mismos tres clones eran integrantes individuales (los datos no se muestran). Los otros dos clones (19-35A y 19-40B) dieron señales correspondientes a la cepa precursora M124. Tres clones puros se han almacenado para uso futuro (M338; 19-7B, M339; 19-22B y M340; 19-39B).

Análisis de las cepas M338, M339 y M340 de Apmt2

El cultivo en matraz de agitación de la cepa M124 de T. reesei y las cepas de deleción de pmt2 (19-7B/M338, 19-22B/M339 y 19-39B/M340) se llevó a cabo en medio mínimo de Trichoderma con 40 g/l de lactosa, 20 g/l de extracto de grano agotado, PIPPS 100 mM, pH 5,5 con y sin sorbitol 1 M como estabilizador osmótico a 28 °C, 200 rpm. Las muestras se recogieron los días 3, 5 y 7 mediante filtración en vacío. Las muestras de sobrenadantes se almacenaron a -20 °C (análisis de anticuerpo y glicano) o se usaron en determinaciones de pH. Los micelios para determinaciones de peso seco celular se aclararon una vez con DDIW y se secaron a 100 °C durante 20-24 h. Los micelios para extracción de ADN genómico se aclararon una vez con DDlW y se almacenaron a-20 °C.

Generación de las cepas M452, M453 y M454 de deleción de pmt2

La generación de M317 se describe en el Ejemplo 1 que se ha mencionado anteriormente.

Para eliminar la secuencia del vector, el plásmido pTTv186 (Apmt2-pyr4) se digirió con Pmel + Xbal y el fragmento de 4,1 kb se purificó a partir de gel de agarosa usando el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen). Para transformar la cepa M317 se usaron aproximadamente 5 |jg del casete de deleción de pmt2.

La preparación y transformación de protoplastos se llevaron a cabo básicamente de acuerdo con Penttila et al., 1987, Gene 61: 155-164 y Gruber et al., 1990, Current Genetics 18:71-76 para la selección de pyr4.

Se seleccionaron 100 colonias como estrías selectivas. 20 transformantes se identificaron sistemáticamente por PCR usando los cebadores de la Tabla 15 para la integración correcta del casete de deleción usando métodos de laboratorio convencionales. Nueve clones de deleción supuestos se purificaron a clones de células individuales. Los clones purificados se volvieron a identificar sistemáticamente para integración en la posición 5' y para deleción del ORF de pmt2 (cebadores en la Tabla 14). Tres clones eran agentes de deleción puros (es decir, sin señal con los cebadores de ORF).

Tabla 15. Cebadores para identificación sistemática de integración de casete de deleción pTTv186 y para ______________ deleción de la proteína O-manosiltransferasa 2 (pmt2, TreID22005) de M317.______________ Cebador Secuencia

T288 22005 5int ACGAGTTGTTTCGTGTACCG (SEQ ID NO:90) T027_Pyr4_orf_start_rev TGCGTCGCCGTCTCGCTCCT (SEQ ID NO:91) T061_pyr4_orf_screen_2 F TTAGGCGACCTCTTTTTCCA (SEQ ID NO:92)

T289 22005 3int ATGTTGCAGTTGCGAAAG (SEQ ID NO:93)

T290 22005 5orf CCCTCGTCGCAGAAAAGATG (SEQ ID NO:94)

T291 22005 3orf AGCCTCCTTGGGAACCTCAG (SEQ ID NO:95)

Los análisis de Southern se realizaron básicamente como se ha descrito en el Ejemplo 1. Los fragmentos para las sondas se produjeron mediante PCR usando los cebadores que se enumeran en la Tabla 16 usando una cepa QM6a de tipo silvestre de T. reesei (ATCC13631) como el molde para la sonda de ORF de pmt2 y el plásmido pTTv186 para las sondas de flanqueo en las posiciones 5' y 3'. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa y los fragmentos correctos se aislaron del gel con un kit de extracción en gel (Qiagen) usando métodos de laboratorio convencionales.

Tabla 16. Cebadores para producción de fragmentos de sonda usados en análisis de Southern de clones de ___________________deleción de proteína O-manosiltransferasa 2 (pmt2, TreID22005).___________________ Cebador Secuencia

T639_22005 sonda de flanqueo F en la CTTAGTGCGGCTGGAGGGCG (SEQ ID NO' 96)

posición 5’

T640_22005 sonda de flanqueo R en la GGCCGGTTCGTGCAACTGGA(SEQ ID NO' 97)

posición 5’

T641_22005 sonda de flanqueo F en la GGCCGCAAGAGGATGGGGGT(SEQ ID NO: 98)

posición 3’

T642_22005 sonda de flanqueo R en la TCGGGCCAGCTGAAGCACAAC(SEQ ID NO' 99) posición 3’

T290 22005 5orf T291 22005 3orf

Ninguno de los clones se hibridó con la sonda del ORF de pmt2 (los datos no se muestran) indicando una deleción satisfactoria de pmt2. Los análisis que usaron sondas flanqueo en las posiciones 5' y 3' revelaron que dos de los clones eran integrantes individuales (los datos no se muestran). Un clon dio una señal adicional desde la sonda de franqueo en la posición 3' (los datos no se muestran) y por lo tanto esto indicó una integración múltiple del casete de deleción. Tres clones puros (con y sin copias adicionales del casete de deleción) se han almacenado para uso futuro (M452; 27-10A, M453; 27-17A y M454: 27-18B).

Análisis de las cepas M452, M453 y M454 de Apmt2

Se llevó a cabo el cultivo en matraz de agitación de la cepa M304 de T. reesei y tres cepas de deleción de pmt2 (27-10A/M452, 27-17A/M453 y 27-18B/M454) en medio mínimo de Trichoderma con 40 g/l de lactosa, 20 g/l de extracto de grano agotado, PIPPS 100 mM, 9 g/l de casaminoácidos, pH 5,5 a 28 °C, 200 rpm. Las muestras se recogieron los días 3, 5, 7 y 10 mediante filtración en vacío. Las muestras de sobrenadantes se almacenaron a -20 °C (análisis de anticuerpo y glicano) o se usaron en determinaciones de pH. Los micelios para determinaciones de peso seco celular se aclararon una vez con DDIW y se secaron a 100 °C durante 20-24 h. Los micelios para extracción de ADN genómico se aclararon una vez con DDIW y se almacenaron a-20 °C.

El nivel de O-manosilación se llevó a cabo para cepas de deleción de pmt2 con respecto a cultivos en matraz de cepas de deleción de pmtl. No se observó diferencia en la O-manosilación en comparación con la cepa precursora M304.

Ejemplo 4: deleción de pmt3 en una cepa de Trichoderma reesei

Generación de plásmidos de deleción de pmt3

Tres plásmidos de deleción diferentes (pTTv35, pTTv123, pTTv187) se construyeron para deleción del gen pmt3 de la proteína O-manosiltransferasa (TreID22527). Todos los plásmidos contienen las mismas regiones de flanqueo en las posiciones 5' y 3' para la integración correcta al locus de pmt3. La diferencia entre los tres plásmidos es el marcador usado en la selección; pTTv35 contiene un gen que codifica acetamidasa de Aspergillus nidulans (amdS), pTTv123 contiene una versión de bucle (casete blaster) del marcador amdS y pTTv187 una versión de bucle (casete blaster) de un gen que codifica orotidina-5'-mono-fosfato (OMP) descarboxilasa de T. reesei (pyr4).

Se seleccionaron regiones de flanqueo de 1100 pb de la posición 5' y de 1000 pb de la posición 3' como la base del tercer gen, pmt3, de la proteína O-manosiltransferasa (TreID22527), plásmidos de deleción. La construcción del primer plásmido para este gen se llevó a cabo básicamente como se ha descrito para pmt1 en el Ejemplo 1. En cuanto a pmt1, el primer plásmido de deleción para pmt3 (plásmido pTTv35, Tabla 17) usó amdS, un gen que codifica acetamidasa de Aspergillus nidulans, como el marcador de selección.

Al igual que para pmt1 en el Ejemplo 1, para clonar el segundo plásmido de deleción, pTTv123 (Tabla 16), el marcador amdS se eliminó del plásmido de deleción del plásmido de deleción pTTv35 con digestión con Notl y se reemplazó por el casete blaster de amdS para el cual los fragmentos se produjeron por PCR (véase el Ejemplo 1 mencionado anteriormente para detalles). El plásmido pTTv123 se construyó usando el sistema de recombinación de levadura que se ha descrito en el Ejemplo 1. El plásmido de ADN de los transformantes de levadura se rescató mediante transformación en Escherichia coli. Se cultivaron unos pocos clones, el plásmido de ADN se aisló y se digirió para identificar sistemáticamente la recombinación correcta usando métodos de laboratorio convencionales. Se secuenciaron y almacenaron algunos clones con tamaños de inserción correctos.

El tercer plásmido de deleción para pmt3, pTTv187 (Tabla 17) se clonó como el tercer plásmido para pmtl; el casete blaster de amdS se retiró del plásmido de deleción pTTv123 con digestión con Notl y se reemplazó por el casete blaster de pyr4 que se ha descrito en el Ejemplo 1. El casete blaster de pyr4 se obtuvo a partir de otro plásmido con digestión con Notl, se ligó a pTTv123 cortado con Notl y se transformó en E. coli usando métodos de laboratorio convencionales. Se cultivaron unos pocos transformantes, el plásmido de ADN se aisló y se digirió para identificar sistemáticamente la ligadura y orientación correctas del casete blaster de pyr4 usando métodos de laboratorio convencionales. Un clon con un tamaño de inserción y orientación correctos se secuenció y almacenó. Estos plásmidos de deleción para pmt3 (pTTv35, pTTv123 y pTTv187, Tabla 17) dan como resultado una deleción de 2495 pb en el locus de pmt3 y cubren la secuencia de codificación completa de PMT3.

Tabla 17. Cebadores para generar los plásmidos deleción pTTv35, pTTv123 y pTTv187 para proteína O _____________________________ manosiltransferasa 3 (pmt3, TreID22527)._____________________________ Plásmido de deleción pTTv35 para pmt3 (TreID22527), estructura principal de vector pRS426

Cebador Secuencia CGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC GGTTTAAACGTGTTTAAATTTGATGAGGC (SEQ ID NO:102)

22527 5'R

ATCTCTCAAAGGAAGAATCCCTTCAGGGTTGCGTTTCCAGT GCGGCCGCGGTCTCAGAGACAGCCTTCT (SEQ ID NO:103)

22527 3'F CGGTTCTCATCTGGGCTTGCTCGGTCCTGGCGTAGATCTA GCGGCCGCACTCGGCTTCTTTGTCCGAG (SEQ ID NO:104)

22527 3'R

GT GG AATT GT GAGCG GAT AACAATTT CACACAG G AAACAG CGTTTAAACTCCTCGTCGGCAACAAGGCC (SEQ ID NQ:105) Plásmido de deleción pTTv123 para pmt3 (TreID22527), estructura principal de vector pTTv35 T281_22527_amds

_5for GCAG AT CTGGGGGAGGAAT CAGAAGGCT GTCT CT G AGACC GCGGCCGCGGCCGGCCGCGATCGCCTAGATCTACGCCAG GACCG (SEQ ID NO:106)

T283_amds_3rev_

loop CGGTCCTGGCGTAGATCTAGGGCGCGCCACTGGAAACGC AACCCTGAA (SEQ ID NO:107)

T284_amds_loop

5for TT CAGGGTTGCGTTT CCAGT GGCGCGCCCT AG AT CT ACGC CAGGACCG (SEQ ID NO:108)

Plásmido de deleción pTTv123 para pmt3 (TreID22527), estructura principal de vector pTTv35

Plásmido de deleción pTTv187 para pmt3 (TreID22527), estructura principal de vector pTTv123

Cebador Secuencia

sin nuevos cebadores, pTTv123 digerido con Notl y ligado con fragmento de bucle de pyr4 de otro plásmido.

Generación de las cepas M341 y M342 de deleción de pmt3

Para eliminar la secuencia del vector, el plásmido pTTv123 (Apmt3-amdS) se digirió con Pmel + Xbal y el fragmento de 5,2 kb se purificó del gel de agarosa usando el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen). Se usaron aproximadamente 5 |jg del casete de deleción de pmt3 para transformar la cepa M124. La preparación y transformación de protoplastos se llevaron a cabo básicamente de acuerdo con Penttila et al., 1987, Gene 61:155-164 y Gruber et al., 1990, Current Genetics 18:71-76 para la selección de amdS.

Se seleccionaron 120 colonias como estrías selectivas. 10 transformantes se identificaron sistemáticamente por PCR usando los cebadores de la Tabla 18 para la integración correcta del casete de deleción usando métodos de laboratorio convencionales. Tres clones de deleción supuestos se purificaron a clones de células individuales. Los clones purificados (tres en paralelo de cada uno) se volvieron a identificar sistemáticamente para la integración y para la deleción del ORF de pmt3 (cebadores en la Tabla 18). Tres clones se seleccionaron para análisis de Southern.

Tabla 18. Cebadores para identificación sistemática de integración de casete de deleción pTTv123 y para ______________ deleción de la proteína O-manosiltransferasa 3 (pmt3, TreID22527) de M124.____________ Cebador Secuencia

T292 22527 5int ACGGGAGATCTCGGAAAA (SEQ ID NO:110)

T020 Amds rev2 CTTTCCATTCATCAGGGATGG (SEQ ID NO: 111)

T021 amds end fwd GGAGACT CAGT GAAG AG AG G (SEQ ID NO: 112)

T293 22527 3int ATGAAGCTCAGCCTGTGG (SEQ ID NO:113)

T294 22527 5orf GGGGACGGCTTGAGGAAG (SEQ ID NO:114)

T295 22527 3orf

La deleción de pmt3 se verificó mediante análisis de Southern. El ADN para los análisis de Southern se extrajo con el kit Easy-DNA para el aislamiento del ADN genómico (Invitrogen) básicamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los análisis de Southern se realizaron básicamente como se ha descrito en el Ejemplo 1. Los fragmentos para las sondas se produjeron mediante PCR usando los cebadores que se enumeran en la Tabla 19 usando una cepa M124 de T. reesei como molde para la sonda de ORF y el plásmido pTTv123 para las sondas de flanqueo en las posiciones 5' y 3'. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa y los fragmentos correctos se aislaron del gel con un kit de extracción en gel (Qiagen) usando métodos de laboratorio convencionales.

Tabla 19. Cebadores para producción de fragmentos de sonda usados en análisis de Southern de cepas de ___________________deleción de proteína O-manosiltransferasa 3 (pmt3, TreID22527).___________________ Cebador Secuencia

T645_22527 sonda de flanqueo F en TGGCAGATGCCGAAAGGCGG (SEQ ID NO:116)

la posición 5'

T646_22527 sonda de flanqueo R en TGGCAACCAGCTGTGGCTCC (SEQ ID NO: 117)

la posición 5'

T647_22527 sonda de flanqueo F en CGGCCGCACTOGGCTTCTTT (SEQ ID NO: 118)

la posición 3'

T648_22527 sonda de flanqueo R en GAGTGGGCTAGGCGCAACGG (SEQ ID NO:119)

la posición 3'

T649_22527 sonda en la posición 5’

de orf T650_22527 sonda en la posición 3’

de orf

Dos de los clones no se hibridaron con la sonda del ORF de pmt3 (los datos no se muestran) indicando una deleción satisfactoria de pmt3. Los análisis que usaron sondas flanqueo en las posiciones 5' y 3' revelaron que los mismos dos clones eran integrantes individuales (los datos no se muestran). Un clon (20-32C) dio señales correspondientes a la cepa precursora M124. Dos clones se han almacenado para uso futuro (M341; 20-34C y M342; 20-35B).

Análisis de las cepas M341 y M342 de Apmt3

Se llevó a cabo el cultivo en matraz de agitación de la cepa M124 de T. reesei y cepas de deleción de pmt3 (20-34C/M341 y 20-35B/M342) en medio mínimo de Trichoderma con 40 g/l de lactosa, 20 g/l de extracto de grano agotado, PIPPS 100 mM, pH 5,5 con y sin sorbitol 1 M como estabilizador osmótico a 28 °C, 200 rpm. Las muestras se recogieron los días 3, 5 y 7 mediante filtración en vacío. Las muestras de sobrenadantes se almacenaron a -20 °C (análisis de anticuerpo y glicano) o se usaron en determinaciones de pH. Los micelios para determinaciones de peso seco celular se aclararon una vez con DDIW y se secaron a 100 °C durante 20-24 h. Los micelios para extracción de ADN genómico se aclararon una vez con DDlW y se almacenaron a-20 °C.

Generación de las cepas M522 y M523 de deleción de pmt3

Para eliminar la secuencia del vector, el plásmido pTTv187 (Apmt3-pyr4) se digirió con Pmel + Xbal y el fragmento de 4,1 kb se purificó a partir de gel de agarosa usando el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen). Se usaron aproximadamente 5 |jg del casete de deleción de pmt3 para transformar la cepa M317. La preparación y transformación de protoplastos se llevaron a cabo básicamente de acuerdo con Penttila et al., 1987, Gene 61: 155 164 y Gruber et al., 1990, Current Genetics 18: 71-76 para selección de pyr4.

Se seleccionaron 200 colonias como estrías selectivas. 59 transformantes se identificaron sistemáticamente por PCR usando los cebadores de la Tabla 20 para la integración correcta del casete de deleción usando métodos de laboratorio convencionales. Tres clones de deleción supuestos se purificaron a clones de células individuales. Los clones purificados se volvieron a identificar sistemáticamente para la integración y para la deleción del ORF de pmt3 (cebadores en la Tabla 19). Dos clones (varias paralelas) eran agentes de deleción puros (es decir, sin señal de los cebadores del ORF).

Tabla 20. Cebadores para identificación sistemática de integración de casete de deleción pTTv187 y para ______________ deleción de la proteína O-manosiltransferasa 3 (pmt3, TreID22527) de M317.____________ Cebador Secuencia

T292 22527 5int ACGGGAGATCTCGGAAAA (SEQ ID NO:122) T026_Pyr4_orf_5rev2 CCATGAGCTTGAACAGGTAA (SEQ ID NO:123) T061_pyr4_orf_screen _2F TTAGGCGACCTCTTTTTCCA (SEQ ID NO:124)

T293 22527 3int ATGAAGCTCAGCCTGTGG (SEQ ID NO:125) T649_22527 sonda en la

posición 3' de orf T650_22527 sonda en la

posición 3' de orf

Los análisis de Southern se realizaron básicamente como se ha descrito en el Ejemplo 1. Los fragmentos para las sondas se produjeron mediante PCR usando los cebadores que se enumeran en la Tabla 21 usando una cepa QM6a de tipo silvestre de T. reesei (ATCC13631) como el molde para la sonda del ORF y el plásmido pTTv187 para las sondas de flanqueo en las posiciones 5' y 3'. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa y los fragmentos correctos se aislaron del gel con un kit de extracción en gel (Qiagen) usando métodos de laboratorio convencionales.

Tabla 21. Cebadores para producción de fragmentos de sonda usados en análisis de Southern de cepas de ___________________deleción de proteína O-manosiltransferasa 3 (pmt3, TreID22527).__________________ Cebador Secuencia

T645_22527 sonda de flanqueo F en la TGGCAGATGCCGAAAGGCGG (SEQ ID NO'128) posición 5’

T646_22527 sonda de flanqueo R en la TGGCAACCAGCTGTGGCTCC (SEQ ID NO'129) posición 5’

T647_22527 sonda de flanqueo F en la CGGCCGCACTCGGCTTCTTT (SEQ ID NO'130) posición 3’

T648_22527 sonda de flanqueo R en la GAGTGGGCTAGGCGCAACGG (SEQ ID NO: 131) posición 3'

T874_pmt3_orf_f3 CTCTGCGCGTGTTGTGG (SEQ ID NO:132) T875_pmt3_orf_r3 TAAGGGTGCGGATTCGG (SEQ ID NO:133)

Ocho de los clones no se hibridaron con la sonda del ORF de pmt3 (los datos no se muestran) indicando una deleción satisfactoria de pmt3. Un clon (33-37K) se indicó con la sonda del ORF de pmt3 aún que el tamaño de la señal no correspondía con el de las cepas precursoras lo que sugiere una reordenación en el locus de pmt3. Los análisis que usaron sondas flanqueo en las posiciones 5' y 3' revelaron que los ocho clones de Apmt3 eran integrantes individuales (los datos no se muestran). Un clon (33-37K) dio señales incorrectas o adicionales lo que sugiere reordenaciones en el locus de pmt3 y múltiples interacciones del casete de deleción. Dos clones puros se han almacenado para uso futuro (M522; 33-34A y m 523; 33-188A-a).

Análisis de las cepas M522 y M523 de Apmt3

El cultivo en placa de 24 pocillos de la cepa M304 de T. reesei y ocho cepas de deleción de pmt3 (33-34S/M522, 33-34T, 33-34U, 33-340, 33-188A-a/M523, 33-188B-a, 33-188C-a y 33-188D-a) se llevó a cabo en medio mínimo de Trichoderma con 40 g/l de lactosa, 20 g/l de extracto de grano agotado, PIPPS 100 mM, 9 g/l de casaminoácidos, pH 5,5 a 28 °C, 800 rpm con control de humedad. Las muestras se recogieron los días 3, 5 y 6 mediante centrifugación. Las muestras de sobrenadantes se almacenaron a -20 °C. Los micelios para determinaciones de peso seco celular se aclararon una vez con DDIW y se secaron a 100 °C durante 20-24 h. Los micelios a la extracción del ADN genómico se aclararon dos veces con DDIW y se almacenaron a-20 °C.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula fúngica filamentosa deficiente en PMT que comprende

a) una primera mutación en un gen que codifica una proteasa endógena que reduce o elimina una actividad de proteasa endógena en comparación con una célula fúngica filamentosa precursora que no tiene dicha primera mutación, seleccionándose dichas proteasas endógenas entre proteasas aspárticas, serina proteasas de tipo tripsina, subtilisina proteasas, proteasas glutámicas y sedolisina proteasas, y

en la que dicha célula fúngica filamentosa se selecciona entre el grupo que consiste en célula de Trichoderma, Neurospora, Myceliophthora y Chrysosporium.

2. La célula fúngica filamentosa deficiente en PMT de la reivindicación 1, en la que dicha segunda mutación que reduce la actividad de O-manosiltransferasa endógena es una deleción o una alteración de un gen PMT que codifica una actividad de proteína O-manosiltransferasa endógena.

3. La célula fúngica filamentosa deficiente en PMT de la reivindicación 1 o 2, en la que dicha segunda mutación en un gen PMT es una mutación en cualquiera de:

a) gen PMT1 que comprende el polinucleótido de la SEQ ID NO: 1,

b) un gen homólogo del gen PMT1, gen homólogo que es capaz de restablecer el nivel de O-manosilación precursora mediante complementación funcional cuando se introduce en una cepa de T. reesei que tiene una alteración en dicho gen PMT1, o;

c) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 50 % con la SEQ ID NO: 2, teniendo dicho polipéptido actividad de O-manosiltransferasa.

4. La célula fúngica filamentosa deficiente en PMT de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicha célula tiene una tercera mutación que reduce o elimina el nivel de expresión de un gen ALG3 en comparación con el nivel de expresión en una célula precursora que no tiene dicha tercera mutación.

5. La célula fúngica filamentosa deficiente en PMT de la reivindicación 4, que además comprende un primer polinucleótido que codifica un dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa I y un segundo polinucleótido que codifica un dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa II.

6. La célula fúngica filamentosa deficiente en PMT de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que además comprende uno o más polinucleótidos que codifican un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en: a) a1,2 manosidasa;

b) dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa I;

c) a manosidasa II;

d) dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa II;

e) (31,4 galactosiltransferasa; y,

f) fucosiltransferasa.

7. La célula fúngica filamentosa deficiente en PMT de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que dicha célula es una célula de Trichoderma que comprende una mutación que reduce o elimina la actividad de proteína O-manosiltransferasa de pmt1 de Trichoderma.

8. La célula fúngica filamentosa deficiente en PMT de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que dicha célula es una célula de Trichoderma, por ejemplo Trichoderma reesei, y dicha célula comprende mutaciones que reducen o eliminan la actividad de

a) las tres proteasas endógenas pep1, tsp1 y slp1;

b) las tres proteasas endógenas gap1, slp1 y pep1;

c) las tres proteasas endógenas seleccionadas entre el grupo que consiste en pep1, pep2, pep3, pep4, pep5, pep8, pep11, pep12, tsp1, slp1, slp2, slp3, slp7, gap1 y gap2;

d) de tres a seis proteasas seleccionadas entre el grupo que consiste en pep1, pep2, pep3, pep4, pep5, tsp1, slp1, slp2, slp3, gap1 y gap2; o

e) de siete a diez proteasas seleccionadas entre el grupo que consiste en pep1, pep2, pep3, pep4, pep5, pep7, pep8, tsp1, slp1, slp2, slp3, slp5, slp6, slp7, slp8, tpp1, gap1 y gap2.

9. Un método para producir una proteína que tiene O-manosilación reducida, que comprende:

a) proporcionar una célula fúngica filamentosa deficiente en PMT de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, y que además comprende un polinucleótido que codifica una proteína con un resto de serina o treonina, b) cultivar dicha célula fúngica filamentosa deficiente en PMT para producir dicha proteína que tiene O-manosilación reducida.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicha célula fúngica filamentosa expresa una proteína chaperona endógena funcional, tal como Proteína Disulfuro Isomerasa (PDI).

11. El método de las reivindicaciones 9 o 10, en el que dicha proteína producida es una proteína de mamífero heteróloga seleccionada entre el grupo que consiste en

a) una inmunoglobulina, tal como IgG,

b) una cadena ligera o una cadena pesada de una inmunoglobulina,

c) una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo,

d) un anticuerpo de cadena individual,

e) un anticuerpo camélido,

f) un anticuerpo de dominio individual monomérico o multimérico,

g) un fragmento FAb, un fragmento FAb2, y,

h) sus fragmentos de unión a antígeno.