CN119931997B - 天冬氨酸蛋白酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种天冬氨酸蛋白酶突变体及其应用。该天冬氨酸蛋白酶突变体包括：1)具有在SEQ ID NO：4的如下至少一个位点：R110、S38、S51、Q134、N169、V182、A183、V250、R322、N101、T113或Q239位点发生突变的氨基酸序列，且具有天冬氨酸蛋白酶活性的蛋白；或2）与1）中的蛋白具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%以上同源性的氨基酸序列，且具有天冬氨酸蛋白酶活性的蛋白。相较于野生型天冬氨酸蛋白酶，本发明的天冬氨酸蛋白酶突变体具有比活力高和热稳定性强的优势，有助于其在食品、医药、饲料和皮革等领域广泛应用。

Description

天冬氨酸蛋白酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及天冬氨酸蛋白酶技术领域，具体而言，涉及一种天冬氨酸蛋白酶突变体及其应用。

背景技术

天冬氨酸蛋白酶是一种能在酸性条件下降解蛋白的酶类，又称酸性蛋白酶，其最适作用pH为2-4，相对分子质量为30000-40000，等电点为3.0-5.0。酸性蛋白酶广泛运用在饲料、酿造、皮革等领域，具有广阔的应用前景。例如，在白酒酿造发酵过程中加入一定量的酸性蛋白酶，有助于玉米原料中的蛋白质降解，加快糖化酶的利用及酵母的生长繁殖，缩短发酵时间，降低成本。此外在饲料中添加蛋白酶可以有效的将难以利用的大分子蛋白转化成利于动物吸收的氨基酸或寡肽，提高饲料转化效率。

天冬氨酸蛋白酶的来源非常广泛，包括植物来源、动物来源和微生物来源。市场上已经成熟应用的天冬氨酸蛋白酶主要以黑曲霉和里氏木霉的来源为主。与动物来源及植物来源的天冬氨酸蛋白酶相比，微生物酸来源的蛋白酶具有多样性和复杂性的特点，通常一株菌株可以分泌一种或多种天冬氨酸蛋白酶。

酶分子定向进化是模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），先在体外进行酶基因的人工随机突变建立突变基因文库，后在人工控制条件的特殊环境下定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术。

天冬氨酸蛋白酶已经实现了规模化的生产运用，但其酶比活力与热稳定性仍有待提升，因此，迫切需要获得酶比活力提高与耐热性能提升的天冬氨酸蛋白酶突变体，实现该酶在更广泛领域的运用。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种天冬氨酸蛋白酶突变体及其应用，以解决现有技术中天冬氨酸蛋白酶的比活力和热稳定性差的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种天冬氨酸蛋白酶突变体，上述天冬氨酸蛋白酶突变体包括：1) 具有在SEQ ID NO：4的如下至少一个位点：R110、S38、S51、Q134、N169、V182、A183、V250、R322、N101、T102、T113或Q239位点发生突变的氨基酸序列，且具有天冬氨酸蛋白酶活性的蛋白；或2）与1）中的蛋白具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%以上同源性的氨基酸序列，且具有天冬氨酸蛋白酶活性的蛋白。

进一步地，上述1）中，发生突变的位点包括R110S、S38A、S51T、Q134T、N169G、V182I、A183N、V250Y、R322S、N101T+T102S、T113S或Q239S；其中，数字前字母代表野生型氨基酸，数字后字母代表突变氨基酸。

为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种基因，上述基因编码上述的天冬氨酸蛋白酶突变体。

进一步地，上述基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种质粒，上述质粒包含上述的基因。

进一步地，上述质粒包括pPICZαA、pPIC9K或pPIC3.5K。

为了实现上述目的，根据本发明的四个方面，提供了一种非动植物细胞，上述非动植物细胞包括上述的基因或上述的质粒。

进一步地，上述非动植物细胞选自如下任意一种：大肠杆菌、毕赤酵母或里氏木霉。

进一步地，上述毕赤酵母包括X33；上述里氏木霉包括QM6a；上述大肠杆菌包括DH5α。

为了实现上述目的，根据本发明的五个方面，提供了一种上述的天冬氨酸蛋白酶突变体、上述的基因、上述的质粒或上述的非动植物细胞在制备饲料添加剂、制备食品添加剂、酿造、医药和/或皮革行业中的应用。

应用本发明的技术方案，即本发明的天冬氨酸蛋白酶突变体包括：1) 具有在SEQID NO：4的如下至少一个位点： R110、S38、S51、Q134、N169、V182、A183、V250、R322、N101、T102、T113或Q239位点发生突变的氨基酸序列，且具有天冬氨酸蛋白酶活性的蛋白；或2）与1）中的蛋白具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%以上同源性的氨基酸序列，且具有天冬氨酸蛋白酶活性的蛋白。

较野生型天冬氨酸蛋白酶，本发明的天冬氨酸蛋白酶突变体具有比活力高以及热稳定强的优势，能够在食品添加剂和饲料添加剂等要求天冬氨酸蛋白酶的比活力和热稳定性高的领域得到广泛应用，具有较高的经济价值。此外，天冬氨酸蛋白酶的热稳定性提升，其耐温性也提升。这使得天冬氨酸蛋白酶在高温等极端环境中也能保持活性，拓宽了天冬氨酸蛋白酶的应用领域。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了根据本发明的实施例的平板法初步筛选天冬氨酸蛋白酶pap1易错PCR转化子。

图2示出了根据本发明的实施例的检测纯化后的天冬氨酸蛋白酶突变体的SDS-PAGE图。

图3示出了根据本发明实施例中野生型的天冬氨酸蛋白酶pap1的耐温性。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面结合实施例来详细说明本发明。

术语解释：

蛋白酶的热稳定性：蛋白酶在高温下能够保持其结构和功能稳定的能力。

蛋白酶的耐温性：蛋白酶在高温环境下能够保持活性的能力。蛋白酶的热稳定性直接影响了其耐温性。如果蛋白酶具有很好的热稳定性，那么在高温环境下也能够保持其活性，即具有较高的耐温性。

比活力：单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用U/mg蛋白质来表示。比活力计算公式：比活力（U/mg）=酶活（U/mL）/蛋白含量（mg/mL）。

如背景技术所提到的，现有技术中天冬氨酸蛋白酶存在比活力低和热稳定性差的问题，本发明中发明人尝试通过易错PCR对里氏木霉QM6a（保藏号：ATCC13631）来源的酸性蛋白酶PAP1基因（编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示）进行随机突变，获得多种比活力提高和/或热稳定性提高的天冬氨酸蛋白酶突变体，因而提出了本发明的一系列保护方案。

在本发明第一种典型的实施方式中，提供了一种天冬氨酸蛋白酶突变体，上述天冬氨酸蛋白酶突变体包括：1)具有在SEQ ID NO：4的如下至少一个位点：R110、S38、S51、Q134、N169、V182、A183、V250、R322、N101、T102、T113或Q239位点发生突变的氨基酸序列，且具有天冬氨酸蛋白酶活性的蛋白；或2）与1）中的蛋白具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%以上同源性的氨基酸序列，且具有天冬氨酸蛋白酶活性的蛋白。

本发明的天冬氨酸蛋白酶突变体较野生型天冬氨酸蛋白酶比活力高且热稳定性强，能够适应工业化生产的极端环境（高温），广泛应用于饲料添加剂或食品添加剂等领域。此外，提高天冬氨酸蛋白酶的热稳定性，能够有助于延长其货架期以及使酶蛋白造粒等后处理过程中比活力损失少，有利于天冬氨酸蛋白酶在多领域的广泛应用。

基于此应用，在保留上述位点突变的基础上，对其余位点进行突变，即可获得与1)中蛋白具有一定同源性且具有相同的天冬氨酸蛋白酶活性的蛋白。

需要说明的是，本发明中的同源性指两个氨基酸序列之间的“序列同一性（identity）”，即序列之间相同氨基酸的百分比。评估氨基酸或核苷酸之间序列同一性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列同一度通常用序列分析软件测量。例如，可以通过NCBI数据库的BLAST程序来确定。关于序列同一性的测定，参见例如：分子生物学中的序列分析，von Heinje，G.，Academic Press，1987和序列分析引物，Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991。

上述与1）所示的突变体具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%以上（比如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%以上，甚至99.9%以上）同源性且具有天冬氨酸蛋白酶活性的蛋白质，其活性位点、活性口袋、活性机制、蛋白结构等均与相应蛋白的1）中提供的蛋白质大概率相同。

氨基酸残基可以根据本领域公知和约定的标准三个字母或一个字母的氨基酸编码来表示。本文中，氨基酸残基缩写如下：丙氨酸(Ala；A)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、精氨酸(Arg；R)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、蛋氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)，丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。

保守氨基酸取代或替换在本领域是公知的，例如，保守的氨基酸取代优选如下组（1）-（5）中的一个氨基酸残基被同一组中的另一个氨基酸取代：（1）较小的脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；（2）带极性负电荷的残基及其（不带电荷的）酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；（3）带极性正电荷的残基：His、Arg和Lys；（4）较大的脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；和（5）芳族残基：Phe、Tyr和Trp。特别优选的保守氨基酸取代如下：Ala被Gly或Ser取代；Arg被Lys取代；Asn被Gln或His取代；Asp被Glu取代；Cys被Ser取代；Gln被Asn取代；Glu被Asp取代；Gly被Ala或Pro取代；His被Asn或Gln取代；Ile被Leu或Val取代；Leu被Ile或Val取代；Lys被Arg、Gln或Glu取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Phe被Met、Leu或Tyr取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Trp或Phe取代；并且Val被Ile或Leu取代。

本领域技术人员也可以根据现有技术中的“blosum62评分矩阵”等本领域技术人员熟知的氨基酸替换规则对氨基酸进行保守替换。

在本发明一种优选的实施例中，上述1）中，发生突变的位点包括R110S、S38A、S51T、Q134T、N169G、V182I、A183N、V250Y、R322S、N101T+T102S、T113S或Q239S；其中，数字前字母代表野生型氨基酸，数字后字母代表突变氨基酸。发生该突变的天冬氨酸蛋白酶突变体具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。根据上述天冬氨酸蛋白酶突变体的氨基酸序列，按照本领域的公知常识，能够获知其编码基因的核苷酸序列。在本发明一种优选的实施例中，该基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

其中，SEQ ID NO：1的序列为：

TGSAPNHPSDSADSEYITSVSIGTPAQVLPLDFDTGSSDLWVFSSETPKSSATGHAIYTPSKSSTSKKVSGASWSISYGDGSSSSGDVYTDKVTIGGFSVNTQGVESATSVSTEFVQDTVISGLVGLAFDSGNQVRPHPQKTWFSNAASSLAEPLFTADLRHGQNGSYNFGYIDTSVAKGPVAYTPVDNSQGFWEFTASGYSVGGGKLNRNSIDGIADTGTTLLLLDDNVVDAYYANVQSAQYDNQQEGVVFDCDEDLPSFSFGVGSSTITIPGDLLNLTPLEEGSSTCFGGLQSSSGIGINIFGDVALKAALVVFDLGNERLGWAQK。

SEQ ID NO：2的序列为：

ACCGGCTCGGCGCCCAACCACCCCAGTGACAGCGCCGATTCGGAGTACATCACCTCCGTCTCCATCGGCACTCCGGCTCAGGTCCTCCCCCTGGACTTTGACACCGGCTCCTCCGACCTGTGGGTCTTTAGCTCCGAGACGCCCAAGTCTTCGGCCACCGGCCACGCCATCTACACGCCCTCCAAGTCGTCCACCTCCAAGAAGGTGTCTGGCGCCAGCTGGTCCATCAGCTACGGCGACGGCAGCAGCTCCAGCGGCGATGTCTACACCGACAAGGTCACCATCGGAGGCTTCAGCGTCAACACCCAGGGCGTCGAGTCTGCCACCAGCGTGTCCACCGAGTTCGTCCAGGACACGGTCATCTCTGGCCTCGTCGGCCTTGCCTTTGACAGCGGCAACCAGGTCAGGCCGCACCCGCAGAAGACGTGGTTCTCCAACGCCGCCAGCAGCCTGGCTGAGCCCCTTTTCACTGCCGACCTGAGGCACGGACAGAACGGCAGCTACAACTTTGGCTACATCGACACCAGCGTCGCCAAGGGCCCCGTTGCCTACACCCCCGTTGACAACAGCCAGGGCTTCTGGGAGTTCACTGCCTCGGGCTACTCTGTCGGCGGCGGCAAGCTCAACCGCAACTCCATCGACGGCATTGCCGACACCGGCACCACCCTGCTCCTCCTCGACGACAACGTCGTCGATGCCTACTACGCCAACGTCCAGTCGGCCCAGTACGACAACCAGCAGGAGGGTGTCGTCTTCGACTGCGACGAGGACCTCCCTTCGTTCAGCTTCGGTGTTGGAAGCTCCACCATCACCATCCCTGGCGATCTGCTGAACCTGACTCCCCTCGAGGAGGGCAGCTCCACCTGCTTCGGTGGCCTCCAGAGCAGCTCCGGCATTGGCATCAACATCTTTGGTGACGTTGCCCTCAAGGCTGCCCTGGTTGTCTTTGACCTCGGCAACGAGCGCCTGGGCTGGGCTCAGAAATAA。

在本发明第二种典型的实施方式中，提供了一种基因，上述基因编码上述的天冬氨酸蛋白酶突变体。编码上述天冬氨酸蛋白酶突变体的基因，表达出的天冬氨酸蛋白酶相较于野生型天冬氨酸蛋白酶，不仅比活力更高，其热稳定性也提高，可应用于食品添加剂和饲料添加剂等领域。

在本发明第三种典型的实施方式中，提供了一种质粒，上述质粒包含上述的基因。包含上述基因的质粒，转入特定宿主细胞中时，能够在宿主细胞中表达出较野生型天冬氨酸蛋白酶比活力和热稳定性均提高的天冬氨酸蛋白酶。在本发明一种优选的实施例中，上述质粒包括：pPICZαA、pPIC9K或pPIC3.5K。上述三种质粒均是本领域常见的用于表达外源蛋白的质粒。

在本发明第四种典型的实施方式中，提供了一种非动植物细胞，上述非动植物细胞包括上述的质粒或上述基因。上述非动植物细胞经诱导表达后能够产生天冬氨酸蛋白酶，且该天冬氨酸蛋白酶的酶比活力和热稳定性较野生型天冬氨酸蛋白酶高。

在本发明一种优选的实施例中，上述非动植物细胞选自如下任意一种：大肠杆菌、毕赤酵母或里氏木霉。在本发明一种优选的实施例中，上述毕赤酵母包括X33；上述里氏木霉包括QM6a；上述大肠杆菌包括DH5α。本发明以大肠杆菌为例，构建了多种可以产生天冬氨酸的蛋白酶的基因工程菌。

在本发明第五种典型的实施方式中，提供了一种应用。该应用包括上述的天冬氨酸蛋白酶突变体、上述的基因、上述的质粒或上述的非动植物细胞在制备饲料添加剂、制备食品添加剂、酿造、医药和/或皮革行业中的应用。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本发明所要求保护的范围。

1．实验材料

（1）菌株和载体：大肠杆菌Top10，毕赤酵母X33和毕赤酵母表达载体pPICZαA购自Invitrogen公司。

（2）酶与试剂盒 ：Sal I、Not I、Cpo I限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶购自TaKaRa 公司；DNA聚合酶、质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒购自诺唯赞生物科技股份有限公司。

（3）试剂：酵母粉、蛋白胨购自OXOID公司；福林酚试剂、碳酸钠、三氯乙酸、乳酸、乳酸钠、NaCl、葡萄糖、甘油等均购自国药集团。

大肠杆菌培养基为LB（1%蛋白胨，0 .5%酵母提取物，1%NaCl，pH 7.0）。

酵母培养基YPD（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖）。

酵母培养基BMGY（1%酵母提取物、2%蛋白胨、1.34%YNB、1%甘油（V/V）、1% 1M磷酸钾盐缓冲液（pH6.0）。

酵母甲醇诱导培养基BMMY（1%酵母提取物、2%蛋白胨、1.34%YNB、1%1M磷酸钾盐缓冲液（pH6.0）。

脱脂牛奶筛选培养基：

A液：将6 g脱脂奶粉（BD）溶于100 ml pH 3.0柠檬酸缓冲液中，并调整pH至3.0，于108℃高温高压灭菌30 min；

B液：将4 g琼脂溶于100 ml水溶液中，121℃高温高压灭菌20 min；

C液：配制含有2%琼脂的BMMY固体培养基

将A液与B液按1：1比例混合，配置成3%的固体牛奶培养基(pH 3.0)，取适量倒入无菌培养皿中，待牛奶培养基凝固；在牛奶培养基上层倒入适量含0.5%甲醇的BMMY固体诱导培养基，待诱导培养基凝固，即完成牛奶筛选培养基的配制。

实施例1 构建野生型天冬氨酸蛋白酶表达质粒

按照毕赤酵母密码子进行优化，通过全基因合成技术（武汉奥科鼎盛生物科技有限公司）获得SEQ ID NO：3所示的野生型的里氏木霉天冬氨酸蛋白酶成熟肽编码基因pap1（编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示），得到重组质粒pUC-pap1。图3示出了上述野生型的天冬氨酸蛋白酶pap1的耐温性。实验结果显示，野生型天冬氨酸蛋白酶pap1在60℃时失去酶活。

其中，SEQ ID NO：3的序列为：

ACCGGCTCGGCGCCCAACCACCCCAGTGACAGCGCCGATTCGGAGTACATCACCTCCGTCTCCATCGGCACTCCGGCTCAGGTCCTCCCCCTGGACTTTGACACCGGCTCCTCCGACCTGTGGGTCTTTAGCTCCGAGACGCCCAAGTCTTCGGCCACCGGCCACGCCATCTACACGCCCTCCAAGTCGTCCACCTCCAAGAAGGTGTCTGGCGCCAGCTGGTCCATCAGCTACGGCGACGGCAGCAGCTCCAGCGGCGATGTCTACACCGACAAGGTCACCATCGGAGGCTTCAGCGTCAACACCCAGGGCGTCGAGTCTGCCACCCGCGTGTCCACCGAGTTCGTCCAGGACACGGTCATCTCTGGCCTCGTCGGCCTTGCCTTTGACAGCGGCAACCAGGTCAGGCCGCACCCGCAGAAGACGTGGTTCTCCAACGCCGCCAGCAGCCTGGCTGAGCCCCTTTTCACTGCCGACCTGAGGCACGGACAGAACGGCAGCTACAACTTTGGCTACATCGACACCAGCGTCGCCAAGGGCCCCGTTGCCTACACCCCCGTTGACAACAGCCAGGGCTTCTGGGAGTTCACTGCCTCGGGCTACTCTGTCGGCGGCGGCAAGCTCAACCGCAACTCCATCGACGGCATTGCCGACACCGGCACCACCCTGCTCCTCCTCGACGACAACGTCGTCGATGCCTACTACGCCAACGTCCAGTCGGCCCAGTACGACAACCAGCAGGAGGGTGTCGTCTTCGACTGCGACGAGGACCTCCCTTCGTTCAGCTTCGGTGTTGGAAGCTCCACCATCACCATCCCTGGCGATCTGCTGAACCTGACTCCCCTCGAGGAGGGCAGCTCCACCTGCTTCGGTGGCCTCCAGAGCAGCTCCGGCATTGGCATCAACATCTTTGGTGACGTTGCCCTCAAGGCTGCCCTGGTTGTCTTTGACCTCGGCAACGAGCGCCTGGGCTGGGCTCAGAAATAA。

SEQ ID NO：4的序列为：

TGSAPNHPSDSADSEYITSVSIGTPAQVLPLDFDTGSSDLWVFSSETPKSSATGHAIYTPSKSSTSKKVSGASWSISYGDGSSSSGDVYTDKVTIGGFSVNTQGVESATRVSTEFVQDTVISGLVGLAFDSGNQVRPHPQKTWFSNAASSLAEPLFTADLRHGQNGSYNFGYIDTSVAKGPVAYTPVDNSQGFWEFTASGYSVGGGKLNRNSIDGIADTGTTLLLLDDNVVDAYYANVQSAQYDNQQEGVVFDCDEDLPSFSFGVGSSTITIPGDLLNLTPLEEGSSTCFGGLQSSSGIGINIFGDVALKAALVVFDLGNERLGWAQK。

以重组质粒pUC-pap1为模板，以P1/P2为引物（引物序列参考表1），PCR扩增获得pap1基因片段，在基因3’端加入6xhis标签编码序列，克隆至质粒pPICZαA（带有起始密码子ATG，货号：V19020，厂家：Invitrogen），转化至大肠杆菌Top10感受态细胞，转化菌液涂布于SLB（含Zeocin 25 μg/mL）。过夜培养后挑取转化子进行菌落PCR验证，提取阳性转化子质粒外送测序，得到重组表达质粒pPICZαA-pap1。

表1 所用引物序列

实施例 2 易错PCR突变

本发明以野生型里氏木霉天冬氨酸蛋白酶pap1的SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列作为模板，对pap1进行易错PCR突变，PCR体系如表2所示。

表2 易错PCR反应体系

扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，反应30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳，用DNA胶回收试剂盒回收目标PCR产物，得到带有随机突变的天冬氨酸蛋白酶基因片段。

将天冬氨酸蛋白酶随机突变体基因片段与表达载体pPICZαA连接后转化至大肠杆菌TOP10中，随机挑取20个转化子对天冬氨酸蛋白酶编码区进行测序以验证易错PCR质量（表3）。提取验证后的文库转化子混合质粒即得重组质粒pPICZαA-pap1m，再将重组质粒pPICZαA- pap1m转化至毕赤酵母X33（一种常用的真核表达系统菌株，广泛用于重组蛋白的工业化生产）中，获得重组菌株毕赤酵母X33/pPICZαA- pap1m。

表3 易错PCR转化子测序验证

实施例 3 天冬氨酸蛋白酶突变体的筛选

将转化子挑接至脱脂奶粉培养基，在30℃培养，间隔24h在培养皿盖子上滴加200μL甲醇，培养4d后，测量水解圈与菌落直径，以水解圈直径/菌落直径的比值对转化子进行初筛（见图1）。

实施例 4 天冬氨酸蛋白酶突变体的表达与纯化

将实施例3初筛得到的转化子和野生型天冬氨酸蛋白酶毕赤酵母X22重组菌株，划线于含有100μg/mL Zeocin的YPD平板，挑取菌落生长状态良好的单菌落接种至YPD试管培养基，过夜培养后按照1%的比列接种至BMGY培养基，30℃培养24h后接种至30 mL BMMY培养基，28℃低温诱导发酵，每隔24h按照0.5% v/v补加纯甲醇，诱导4d后结束发酵。离心收菌，获取上清。

通过Ni柱亲和层析纯化上清中的天冬氨酸蛋白酶突变体，主要流程为：

1）使用Binding buffer（乳酸钠缓冲液pH3.0，10mM 咪唑，0.5M NaCl）对Ni柱进行平衡，约2个柱体积；

2）将发酵上清加入到纯化柱中，孵育10min后，通过重力柱去掉流穿柱子；

3）使用Washing buffer（乳酸钠缓冲液pH3.0，25mM 咪唑，0.5M NaCl）洗掉未与Ni²⁺结合的杂蛋白，约5个柱体积；

4）用分别含50、100、300 mM咪唑的Elution buffer进行梯度洗脱（乳酸钠缓冲液pH3.0，不同浓度咪唑，0.5M NaCl），收集各阶段洗脱峰，每个浓度咪唑缓冲液流过1个柱体积。

5）收集得到蛋白样品用SDS-PAGE 检测融合蛋白的分子量大小和纯度。

部分纯化后的天冬氨酸蛋白酶突变体SDS-PAGE检测结果如图2所示。

实施例5 天冬氨酸蛋白酶突变体酶比活力检测和热稳定性检测

本发明采用的天冬氨酸蛋白酶酶活检测方法为《GB1886.174-2016食品安全国家标准食品添加剂食品工业用酶制剂》。酶活定义为1mL酶，在一定温度（40℃）和pH （pH为3）条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/mL表示。

蛋白浓度采用BCA蛋白浓度测定试剂盒（型号：P0011，厂家：碧云天）进行测定。

检测所用主要试剂为：

（1）福林使用溶液：一份福林酚试剂与二份水混合，摇匀；

（2）碳酸钠溶液(42.4g/L)：称取无水碳酸钠(Na₂CO₃)42.4g，用水溶解并定容至1000mL；

（3）三氯乙酸(65.4g/L)：称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL。

（4）乳酸钠缓冲液(pH=3.0)：取乳酸(80%~90%)4.71g和乳酸钠(70%)0.89g，加水至900mL，搅拌至均匀。用乳酸或乳酸钠调整 pH 到3.0±0.05，定容至1000mL。

（5）酪蛋白溶液(10.0g/L)：称取标准酪蛋白(NICPBP国家药品标准物质)1.000g，精确到0.001g，用少量浓乳酸湿润后，加入相应的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中加热煮沸30min，并不时搅拌至酪蛋白全部溶解。冷却到室温后转入100mL容量瓶中，用适宜的pH 缓冲溶液稀释至刻度。定容前检查并调整pH 至相应缓冲液的规定值。此溶液在冰箱内贮存，有效期为3天。

上述酶活检测方法步骤为：用乳酸钠缓冲溶液将纯化后的天冬氨酸蛋白酶突变体样品进行稀释，取1mL稀释酶液至40℃水浴预热2min，加入经40℃水浴预热5min的酪蛋白溶液，混匀后于40℃水浴条件下反应10min。反应完成后取出加入2mL三氯乙酸溶液，混匀后静置10min，利用慢速定性滤纸过滤。取1mL滤液加入5mL碳酸钠溶液混匀，加入1mL福林酚溶液，40℃水浴显色20min后于680nm波长处测定吸光值。根据标准曲线计算天冬氨酸蛋白酶的酶活。

将酶比活力较野生型天冬氨酸蛋白酶PAP1提高的突变体进行测序，最终得到如下酶比活力提高的突变体（见表4）。

将所得野生型及突变体酶液上清稀释至相同的蛋白质含量后，分别置于50℃水浴条件下处理10min后检测酶的酶活和蛋白浓度，计算酶比活力。实验结果见表4。需要说明的是，由于野生型天冬氨酸蛋白酶pap1在60℃时就已经失去酶活。因而，本发明选择50℃探究蛋白酶的热稳定性试验。

其中，蛋白酶的比活力变化程度（较野生型）的计算公式为：（突变体的蛋白酶比活力-野生型的蛋白酶比活力）/野生型的蛋白酶比活力*100%。

蛋白酶的剩余酶比活力的计算公式为：水浴加热后的蛋白酶的酶比活力/水浴加热前的蛋白酶的酶比活力*100%。

蛋白酶的剩余比活力的变化程度（较野生型）的计算公式为：突变体蛋白酶的剩余酶比活力-野生型蛋白酶的剩余酶比活力。

表4

需要注意的是，表4中的“蛋白酶的比活力变化程度（较野生型）”一列中的负值表示该突变体较野生型蛋白酶的比活力降低，正值表示该突变体较野生型蛋白酶的比活力升高。“蛋白酶的剩余酶比活力的变化程度（较野生型）”一列中的正值表示该突变体较野生型蛋白酶的热稳定性提高，0表示该突变体蛋白酶和野生型蛋白酶的热稳定性差不多。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明通过易错PCR对里氏木霉来源的天冬氨酸蛋白酶进行定向进化改造，巧妙地设计了脱脂牛奶平板法对突变体文库进行高通量筛选，得到了系列酶比活力和热稳定性提高的突变体，推动里氏木霉来源天冬氨酸蛋白酶更广泛的应用，这一特性对于饲料和食品等工业领域具有重要的经济意义。此外，本发明所使用的定向进化和筛选方法能为其他类型酶蛋白尤其是天冬氨酸蛋白酶的改造提供指导。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种天冬氨酸蛋白酶突变体，其特征在于，所述天冬氨酸蛋白酶突变体为：将SEQ IDNO：4的第110位的精氨酸突变为丝氨酸。

2.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的天冬氨酸蛋白酶突变体。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

4.一种质粒，其特征在于，所述质粒包含权利要求2或3所述的基因。

5.根据权利要求4所述的质粒，其特征在于，所述质粒包括pPICZαA、pPIC9K或pPIC3.5K。

6.一种非动植物细胞，其特征在于，所述非动植物细胞包括权利要求2或3所述的基因或权利要求4或5所述的质粒。

7.根据权利要求6所述的非动植物细胞，其特征在于，所述非动植物细胞选自如下任意一种：大肠杆菌、毕赤酵母或里氏木霉。

8.根据权利要求7所述的非动植物细胞，其特征在于，所述毕赤酵母包括X33；所述里氏木霉包括QM6a；所述大肠杆菌包括DH5α。

9.权利要求1所述的天冬氨酸蛋白酶突变体、权利要求2或3所述的基因、权利要求4或5所述的质粒或权利要求6-8中任一项所述的非动植物细胞在制备饲料添加剂和酿造行业中的应用。