ES2711841T3

ES2711841T3 - Péptido para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2 y sus complicaciones

Info

Publication number: ES2711841T3
Application number: ES15778713T
Authority: ES
Inventors: Mikhail Ivanovich Titov; Ivan Ivanovich Eliseev; Valery Gennadyevich Makarov; Marina Nikolaevna Makarova; Elena Vasilyevna Shekunova; Vladimir Aleksandrovich Kashkin
Original assignee: Cryno LLC
Current assignee: Cryno LLC
Priority date: 2014-08-21
Filing date: 2015-08-04
Publication date: 2019-05-07
Anticipated expiration: 2035-08-04
Also published as: US9868773B2; AU2015304934A1; CA2958795A1; US20170240610A1; JP2017525764A; JP6442729B2; IL250666A0; CA2958795C; KR20170041914A; RU2573933C1; KR102003619B1; EP3183265A1; IL250666B; CN106574233A; WO2016027157A1; AU2015304934B2; EA201700097A1; EP3183265B1

Abstract

Un compuesto representado por la siguiente fórmula: H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln- Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg- D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH.

Description

DESCRIPCION

Peptido para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2 y sus complicaciones

La invencion se refiere al nuevo analogo de exenatida con la siguiente formula

H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg' D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH,

que se puede utilizar para el tratamiento y la prevencion de la diabetes mellitus, asf como para el tratamiento y la prevencion de las complicaciones de la diabetes tipo 2 tales como la neuropatia diabetica, la distrofia muscular y la endoteliopatia.

La invencion se refiere a la medicina y la farmacia y se puede utilizar como el producto farmaceutico para la prevencion y el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2, asf como sus complicaciones tales como la neuropatfa diabetica, la distrofia muscular y la endoteliopatia.

La diabetes mellitus tipo 2 (DM 2 o diabetes mellitus no dependiente de insulina) es una enfermedad cronica, multisistemica, que se manifiesta principalmente en la alteracion del metabolismo de los carbohidratos. La hiperglucemia se desarrolla como resultado de cambios anormales. Ademas, aparece una disfuncion de las celulas especializadas de la glandula pancreatica responsables de la generacion de insulina. La principal causa de letalidad de pacientes con diabetes mellitus tipo 2 es, en primer lugar, el desarrollo de complicaciones macrovasculares (lesion de las arterias coronarias, cerebrales y perifericas). Asimismo, la DM 2 es uno de los componentes principales para el desarrollo del smdrome metabolico (resistencia a la insulina o smdrome X) [1]. En los ultimos tiempos, el numero de observaciones que indican que la DM 2 es un marcador patologico del desarrollo de la demencia por Alzheimer esta creciendo cada vez mas [2].

Segun los datos de la OMS a finales de 2013, hay 347 millones de personas que padecen diabetes en el mundo [3].

3,4 millones de personas murieron debido al alto contenido de azucar en sangre en 2004 [4]. El numero de casos fatales causados por complicaciones de la diabetes se mantuvo en el mismo nivel en 2010 [5]. Segun los pronosticos de la OMS, la diabetes se habra convertido en la septima causa significativa de letalidad en 2030 [4]. Se cree que la DM tipo 1 puede encontrarse entre el 10-15 % de los pacientes en los pafses desarrollados, y la DM tipo 2, entre el 85-90 %. Pero en los ultimos anos la frecuencia de la DM tipo 2 en los pafses desarrollados crece muy rapidamente, mientras que el numero de pacientes con DM tipo 1 no ha cambiado significativamente. Segun los ultimos datos de la OMS, la proporcion de DM tipo 1 y 2 en el mundo ha cambiado hacia el aumento de la frecuencia de DM tipo 2 [5].

La complicacion mas temprana y mas frecuente de la diabetes mellitus es la neuropatfa diabetica [6], que se caracteriza por un trastorno del sistema nervioso asociado con lesiones de pequenos vasos sangumeos (vasa vasorum, vasa nervorum). No solo esta complicacion produce una disminucion en el trabajo, sino que a menudo tambien causa el desarrollo de lesiones incapacitantes graves y la muerte de pacientes. El proceso patologico afecta a todas las fibras nerviosas: sensoriales, motoras y vegetales. Segun datos de diferentes autores, la neuropatfa diabetica se puede observar entre el 90-100 % de los pacientes con diabetes mellitus. La frecuencia de lesiones del sistema nervioso debido a la diabetes mellitus es directamente proporcional a la duracion de la enfermedad y, en algunos casos, precede a la aparicion de los principales signos clmicos de la diabetes. Por lo tanto, el 5 % de los pacientes con diabetes mellitus ya tienen smtomas de lesion del sistema nervioso que crecen en el curso de la enfermedad que alcanzan hasta el 60 % en 25 anos de duracion de la diabetes.

Todas las partes del sistema nervioso se ven afectadas por la diabetes mellitus: sistema nervioso central (encefalopatfa, mielopatfa), sistema nervioso periferico (poli y mononeuropatfa) y sistema nervioso vegetal periferico (neuropatfa autonomica).

Teniendo en consideracion lo mencionado anteriormente, es obvio que el desarrollo y la implementacion de un medicamento para el tratamiento de la diabetes tipo 2 en sf y sus complicaciones en la practica diaria son prometedores.

El tratamiento farmacologico de la diabetes mellitus tipo 2 y sus complicaciones actualmente se basa en farmacos antihiperglucemicos que se combinan en varios grupos:

- El primer grupo incluye dos tipos de medicamentos: tiazolidinedionas (rosiglitazona y pioglitazona), PPAR^y-agonistas, estimuladores de receptores gamma nucleares y biguanidas (Metformina, Siofor, Avandamet, Bagomet, Glucophage, Metfogamma). Los medicamentos de este grupo aumentan la sensibilidad de las celulas a la insulina, reducen la resistencia a la insulina y la capacidad de absorcion de la glucosa por parte de las celulas del tracto intestinal, y es por eso que a menudo se prescriben para personas con sobrepeso.

- El segundo grupo de farmacos antihiperglucemicos tambien comprende dos tipos de medicamentos - las sulfonilureas secundarias (Maninil, Diabeton, Amaril, Glurenorm, Glibinese-retard) que estimulan la generacion de insulina propia, lo que aumenta su eficacia y las meglitinidas (Repaglinida (Novonorm) y Nateglinida (Starlix)) que mejoran la smtesis de insulina por parte de la glandula pancreatica y tambien reduce los picos postprandiales (aumento del nivel de azucar despues de las comidas).

- El tercer grupo de farmacos antihiperglucemicos incluye Acarbosa (Glucobay) que reduce la capacidad de absorcion de la glucosa por las celulas del tracto intestinal mediante el bloqueo de la enzima alfaglucosidasa que divide los polisacaridos que se reciben con la comida.

Los nuevos desarrollos en el tratamiento y la prevencion de las complicaciones de la DM 2 incluyen los mimeticos directos de incretina, los agonistas de los receptores del peptido 1 similar al glucagon (GLP-1, de sus siglas en ingles) y los agentes bloqueantes indirectos de la dipeptidil peptidasa de tipo 4. Los mimeticos directos de incretina incluyen medicamentos tales como exenatida (Byetta), liraglutida (Viktoza), albiglutida y dulaglutida. Los indirectos incluyen Sitagliptina (Januvia), Saxagliptina (Onglyza), Linagliptina (Trajenta) y Vildagliptina (Galvus).

El grupo de medicamentos similares a la incretina es especialmente interesante.

Incretinas como el GLP-1 mejoran el funcionamiento de las celulas beta, inhiben el aumento inadecuado de la secrecion de glucagon y provocan un aumento en la secrecion de insulina dependiente de glucosa. La exenatida (exendina-4), que es un mimetico de los receptores de incretina (GLP-1R), es uno de los medicamentos cuya eficacia y tratamiento preventivo de la diabetes mellitus no dependiente de insulina y sus complicaciones se ha demostrado mediante ensayos clmicos en personas.

La exenatida es un polipeptido inicialmente conocido como exendina-4, cuyo procedimiento de extraccion del veneno del lagarto Heloderma suspectum y cuya secuencia de aminoacidos (HGEGTFTSDLSKQEEAVRLFIEWLKNGG-PSSGAPPPS-NH2) se publicaron por primera vez en abril de 1992 [7]. Como representante de los peptidos de incretina, la exendina-4 tiene un amplio intervalo de potencia, como el aumento de la secrecion de insulina dependiente de glucosa, la mejora en el procesamiento de la glucosa, el descenso de la orexia, la desaceleracion del movimiento de la comida desde el estomago, etc.

La utilizacion de exenatida en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 con hiperglucemia suprime la secrecion excesiva de glucagon, pero la exenatida no afecta la respuesta regular del glucagon a la hipoglucemia.

El tratamiento con exenatida en combinacion con Metformina y/o medicamentos a base de sulfonilurea produce una disminucion del contenido de glucosa en sangre en estado de ayuno, el contenido de glucosa postprandial en sangre, y el valor de hemoglobina glucosilada (HbA^{i c}), mejorando el control glucemico de estos pacientes.

Se conocen campos de uso de exenatida: por lo tanto, la patente de EE.UU. [8] desvela la utilizacion de exenatida para la estimulacion de la generacion de insulina con una eficacia superior a la de la hormona endogena GLP-1. Los ejemplos proporcionados en la descripcion de la invencion demuestran que la exenatida es eficaz para el tratamiento de la diabetes mellitus.

Otros efectos terapeuticos de la exenatida se revelaron mas adelante: reduccion de peso [9], reduccion de la actividad motora gastrica y desaceleracion del vaciamiento gastrico [10, 11], asf como los efectos inotropicos y diureticos de la exenatida [12, 13, 14]. Se describe la utilizacion de exenatida para el tratamiento del ovario poliqmstico [15, 16, 17], el tratamiento y la prevencion de la nefropatfa [18, 19], la prevencion y el tratamiento de la arritmia cardfaca [20], para la diferenciacion de las celulas de la medula osea [21], el tratamiento de la diabetes mellitus de la gestante [22, 23], la modulacion del nivel de trigliceridos y el tratamiento de la dislipidemia [24, 25], la supresion de la secrecion de glucagon [26, 27], para la diferenciacion de celulas que no producen insulina a la produccion de insulina [28]. La solicitud [29] describe la utilizacion de exenatida, sus agonistas y antagonistas para afectar el sistema nervioso central. Las patentes [30, 31] describen la utilizacion de exenatida y otros antagonistas de los receptores de incretina para la reduccion de la ingesta de alimentos. La solicitud [32] describe composiciones de exenatida estabilizadas. Las patentes [33, 34] describen nuevas solicitudes de exenatida (exendina y sus agonistas).

Todos los aspectos mencionados anteriormente indican una alta eficacia de exenatida para la prevencion y el tratamiento de la DM 2. Sin embargo, las complicaciones que se producen en la diabetes mellitus tipo 2, tal como la neuropatfa diabetica, la distrofia muscular y la endoteliopatfa, no se resuelven durante el tratamiento con exenatida ni todos los otros farmacos antihiperglucemicos mencionados anteriormente.

Es por eso que existe la tarea de crear nuevos analogos de exenatida que sean eficaces en el tratamiento de las complicaciones que se producen en el curso de la diabetes mellitus tipo 2, tal como la neuropatfa diabetica, la distrofia muscular y la endoteliopatfa.

El analogo mas cercano de la invencion reivindicada es la patente de EE.UU. 5424286 [8] seleccionada como prototipo, en la cual la utilizacion de mimeticos de incretina para la estimulacion de la generacion de insulina es similar a la invencion reivindicada.

La principal desventaja de la invencion conocida es la ausencia de efectos terapeuticos de los mimeticos de incretina (exenatidas) que permiten la prevencion y el tratamiento de dichas complicaciones de la diabetes mellitus como la neuropatia diabetica, la distrofia muscular y la endoteliopatia.

Por lo tanto, el resultado tecnico de la invencion reivindicada sera la prevencion y el tratamiento de dichas complicaciones de la diabetes como la neuropatia diabetica, la distrofia muscular y la endoteliopatfa.

El resultado tecnico en la invencion reivindicada se logra mediante la utilizacion de la composicion de acuerdo con la formula:

H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH

que tiene un efecto terapeutico que permite la prevencion y el tratamiento de la neuropatfa diabetica, la distrofia muscular y la endoteliopatfa.

La invencion se materializa en las siguientes figuras.

La Figura 1 es la concentracion de glucosa en sangre periferica bajo la influencia de productos de prueba, M ± m, mmol/l. La primera columna es el punto antes del inicio de la inyeccion de productos, la segunda columna es el ultimo dfa de tratamiento (80° dfa).

* - diferencias estadfsticamente significativas en los grupos a los que se administro los productos de prueba y el grupo de control, prueba de Bonferroni con p < 0,05;

# - diferencias estadfsticamente significativas en los grupos entre el valor inicial y el ultimo dfa de tratamiento (80° dfa de inyeccion de productos), prueba t con p < 0,05.

La Figura 2 es el impacto del peptido D en la dosis de 10 ppb en la alodinia tactil en ratas con neuropatfa alcoholica. Se inyectaron animales con peptido D durante 100 dfas de acuerdo con el plan de estudio. Se evaluo la alodinia tactil antes de modelar la neuropatfa por alcohol en el 1er dfa de inyeccion del producto y en el 50° y 100° dfa de la inyeccion diaria. Los datos se proporcionan como un valor umbral medio de la retirada de la pata (g) (M ± m).

La Figura 3 es el grosor de la mtima de la arteria mesenterica despues de la inyeccion durante 80 dfas de productos de prueba, pm.

# - diferencia con el grupo sano (p < 0,05);

* - diferencia con el grupo de control (p < 0,05, prueba de Bonferroni);

** - diferencia con el grupo de control (p < 0,001, prueba de Bonferroni).

La smtesis del compuesto reivindicado se describe en los ejemplos 1-5.

Ejemplo 1.

Smtesis de Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-OH

Se suspendieron 6,0 g de resina de 2-clorotritilo (1,5 mM/g de capacidad) en 45 ml de DCM en el reactor de smtesis en fase solida, mantenido durante 5 minutos; la resina se filtro y se lavo con 2x30 ml de DCM. Se anadieron una solucion de 2,95 g (9,9 mM) de Fmoc-Gly-OH y 6 ml (36 mM) de DIPEA disuelta en 30 ml de DCM a la resina y se agito durante 60 minutos a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 2x30 ml de DCM, se trato con 2x30 ml de la mezcla DCM/metanol/DlPEA (17:2:1) durante 10 min, y se lavo con 2x30 ml de DCM y 3x30 ml de DMF. Se anadieron al reactor 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x30 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 7,67 g (20,0 mM) de Fmoc-Ser(tBu)-OH, 2,98 g (22,0 mM) de HOBt y 3,42 ml (22,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x30 ml de DMF, se anadieron a DMF 30 ml de solucion de dietilamina al 20 %, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x30 ml de DMF, se anadieron a DMF 30 ml de solucion de dietilamina al 20 %, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x30 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 6,75 g (20,0 mM) de Fmoc-Pro-OH, 2,98 g (22,0 mM) de HOBt y 3,42 ml (22,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x30 ml de DMF, se anadieron a DMF 30 ml de solucion de dietilamina al 20 %, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x30 ml de DMF, se anadieron a DMF 30 ml de solucion de dietilamina al 20 %, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x30 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 3,50 g (20,0 mM) de Fmoc-Gly-OH, 2,98 g (22,0 mM) de HOBt y 3,42 ml (22,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x30 ml de DMF y 3x30 ml de DCM. Despues de que la resina se trato con 10x30 ml de solucion al 1 % de acido trifluoroacetico disuelto en DCM, las soluciones resultantes se combinaron en un matraz que contema 30 ml de solucion al 10 % de piridina en metanol. La mezcla se redujo a ~ 50 ml, y se anadieron 200 ml de agua al residuo. El sedimento obtenido se filtro, se lavo con agua y se seco. Se obtuvieron 6,4 g (91 %) de producto puro al 97 % de acuerdo con HELC.

Ejemplo 2.

Smtesis de Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(CF3COOH)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-OH

Se suspendieron 6,0 g de resina de 2-clorotritilo (1,5 mM/g de capacidad) en 45 ml de DCM en el reactor de smtesis en fase solida, mantenido durante 5 minutos; la resina se filtro y se lavo con 2x30 ml de DCM. Se anadieron una solucion de 2,95 g (9,9 mM) de Fmoc-Gly-OH y 6 ml (36 mM) de DIPEA disuelta en 30 ml de DCM a la resina y se agito durante 60 minutos a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 2x30 ml de DCM, se trato con 2x30 ml de la mezcla DCM/metanol/DlPEA (17:2:1) durante 10 min, y se lavo con 2x30 ml de DCM y 3x30 ml de DMF. Se cargo en el reactor 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 minutos, se filtro, se lavo con 3x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x30 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 11,93 g (20,0 mM) de Fmoc-Asn(Trt)-OH, 2,98 g (22,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x30 ml de DMF, se anadieron a DMF 30 ml de solucion de dietilamina al 20 %, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro, se lavo con 5x30 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 9,37 g (20,0 mM) de Fmoc-Lys(Boc)-OH, 2,98 g (22,0 mM) de HOBt y 3,42 ml (22,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x30 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 7,07 g (20,0 mM) de Fmoc-Leu-OH, 2,98 g (22,0 mM) de HOBt y 3,42 ml (22,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x30 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 10,53 g (20,0 mM) de Fmoc-Trp(Boc)-OH, 2,98 g (22,0 mM) de HOBt y 3,42 ml (22,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x30 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 8,51 g (20,0 mM) de Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 2,98 g (22,0 mM) de HOBt y 3,42 ml (22,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x30 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 7,07 g (20,0 mM) de Fmoc-Ile-OH, 2,98 g (22,0 mM) de HOBt y 3,42 ml (22,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x30 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 7,75 g (20,0 mM) de Fmoc-Phe-OH, 2,98 g (22,0 mM) de HOBt y 3,42 ml (22,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x30 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 8,66 g (20,0 mM) de Fmoc-Arg-OH.HCl, 2,98 g (22,0 mM) de HOBt y 3,42 ml (22,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x30 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 6,79 g (20,0 mM) de Fmoc-Val-OH, 2,98 g (22,0 mM) de HOBt y 3,42 ml (22,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x30 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 6,23 g (20,0 mM) de Fmoc-Ala-OH, 2,98 g (22,0 mM) de HOBt y 3,42 ml (22,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x30 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 8,51 g (20,0 mM) de Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 2,98 g (22,0 mM) de HOBt y 3,42 ml (22,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x30 ml de DMF y 3x30 ml de DCM. Despues de que la resina se trato con 10x30 ml de solucion al 1 % de acido trifluoroacetico disuelto en DCM, las soluciones resultantes se combinaron en un matraz que contema 30 ml de solucion al 10 % de piridina en metanol. La mezcla se redujo a ~ 50 ml, y se anadieron 200 ml de agua al residuo. El sedimento obtenido se filtro, se lavo con agua y se seco. Se obtuvieron 21,8 g (80%) de producto puro al 95 % de acuerdo con HELC.

Ejemplo 3.

Smtesis de Boc-His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Gly-OH

Se suspendieron 6,0 g de resina de 2-clorotritilo (1,5 mM/g de capacidad) en 45 ml de DCM en el reactor de smtesis en fase solida, mantenido durante 5 minutos; la resina se filtro y se lavo con 2x30 ml de DCM. Se anadio una solucion con 2,95 g (9,9 mM) de Fmoc-Gly-OH y 6 ml (36 mM) de DIPEA disuelta en 30 ml de DCM a la resina y se agito durante 60 minutos a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 2x30 ml de DCM, se trato con 2x30 ml de la mezcla DCM/metanol/DIPEA (17:2:1) durante 10 min, y se lavo con 2x30 ml de DCM y 3x30 ml de DMF. Se cargaron en el reactor 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 minutos, se filtro, se lavo con 3x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x30 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 12,21 g (20,0 mM) de Fmoc-Gln(Trt)-OH, 2,98 g (22,0 mM) de HOBt y 3,42 ml (22,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x30 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 7,67 g (20,0 mM) de Fmoc-Ser(tBu)-OH, 2,98 g (22,0 mM) de HOBt y 3,42 ml (22,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x30 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 8,23 g (20,0 mM) de Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 2,98 g (22,0 mM) de HOBt y 3,42 ml (22,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x30 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 7,95 g (20,0 mM) de Fmoc-Thr(tBu)-OH, 2,98 g (22,0 mM) de HOBt y 3,42 ml (22,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x30 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 5,95 g (20,0 mM) de Fmoc-Gly-OH, 2,98 g (22,0 mM) de HOBt y 3,42 ml (22,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x30 ml de DMF, se anadieron 30 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x30 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 9,95 g (20,0 mM) de Boc-His(Trt)-OH, 2,98 g (22,0 mM) de HOBt y 3,42 ml (22,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x30 ml de DMF y 3x30 ml de DCM. Despues de que la resina se trato con 10x30 ml de solucion al 1 % de acido trifluoroacetico disuelto en DCM, las soluciones resultantes se combinaron en un matraz que contema 30 ml de solucion al 10 % de piridina en metanol. La mezcla se redujo a ~ 50 ml, y se anadieron 200 ml de agua al residuo. El sedimento obtenido se filtro, se lavo con agua y se seco. Se obtuvieron 20,9 g (85 %) de producto puro al 95 % de acuerdo con HELC.

Ejemplo 4.

Srntesis de la 14-glicina-exendina-4 (Heloderma suspecfum)-(1-39)-peptidil-octa-D-arginil-glicina

H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Ghi-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH

Se suspendieron 2,0 g de resina de 2-clorotritilo (1,5 mM/g de capacidad) en 15 ml de DCM en el reactor de srntesis en fase solida, mantenido durante 5 minutos; la resina se filtro y se lavo con 2x10 ml de DCM. Se anadio una solucion con 0,98 g (3,3 mM) de Fmoc-Gly-OH y 2 ml (12 mM) de DIPEA disuelta en 10 ml de DCM a la resina y se agito durante 60 minutos a temperature ambiente. La resina se filtro, se lavo con 2x30 ml de DCM, se trato con 2x10 ml de la mezcla DCM/metanol/DlPEA (17:2:1) durante 10 min, y se lavo con 2x10 ml de DCM y 3x10 ml de DMF. Se anadieron al reactor 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 minutos, se filtro, se lavo con 3x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion al 20 % de DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x10 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 2,60 g (6,0 mM) de Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 0,98 g (7,2 mM) de HOBt y 1,12 ml (7,2 mM) de DIC disuelto en 10 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x10 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 2,60 g (6,0 mM) de Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 0,98 g (7,2 mM) de HOBt y 1,12 ml (7,2 mM) de DIC disuelto en 10 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 4 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x10 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 3,46 g (8,0 mM) de Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 1,35 g (10,0 mM) de HOBt y 1,56 ml (10,0 mM) de DIC disuelto en 10 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 3 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x10 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 3,46 g (8,0 mM) de Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 1,35 g (10,0 mM) de HOBt y 1,56 ml (10,0 mM) de DIC disuelto en 10 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 4 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x10 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 3,46 g (8,0 mM) de Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 1,35 g (10,0 mM) de HOBt y 1,56 ml (10,0 mM) de DIC disuelto en 10 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 10 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x10 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 4,33 g (10,0 mM) de Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 1,62 g (12,0 mM) de HOBt y 1,88 ml (12,0 mM) de DIC disuelto en 10 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 12 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x10 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 4,33 g (10,0 mM) de Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 1,62 g (12,0 mM) de HOBt y 1,88 ml (12,0 mM) de DIC disuelto en 10 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 16 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x10 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 3,07 g (8,0 mM) de Fmoc-Ser(tBu)-OH, 1,35 g (10,0 mM) de HOBt y 1,56 ml (10,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 12 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x10 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 2,70 g (8,0 mM) de Fmoc-Pro-OH, 1,35 g (10,0 mM) de HOBt y 1,56 ml (10,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 12 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x10 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 2,49 g (8,0 mM) de Fmoc-Ala-OH, 1,35 g (10,0 mM) de HOBt y 1,56 ml (10,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 12 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x10 ml de DMF.

Una solucion enfriada (4 °C) de 5,90 g (8,0 mM) de Fmoc-GlyProSer(tBu)Ser(tBu)Gly-OH (producto del Ejemplo 1), 1,62 g (12,0 mM) de HOBt y 1,88 ml (12,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 12 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x10 ml de DMF.

Solucion enfriada (4 °C) de 11,35 g (4,0 mM) de Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)Glu(OtBu)AlaValArg (HCl)LeuPheIleGlu(OtBu)Trp(Boc)LeuLys(Boc)Asn(Trt)Gly-OH (producto del Ejemplo 2), 0,81 g (6,0 mM) de HOBt y 0,95 ml (6,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 24 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se agito durante 5 min, se filtro, se lavo con 3x10 ml de DMF, se anadieron 10 ml de solucion de dietilamina al 20 % disuelta en DMF, se mantuvo durante 20 min, se filtro y se lavo con 5x10 ml de DMF.

Solucion enfriada (4 °C) de 9,94 g (4,0 mM) de Boc-His(Trt)Gly-Glu(OtBu)GlyThr(tBu)PheThr(tBu)Ser(tBu)Asp(Ot-Bu)LeuSer(tBu)Lys(Boc)Gln(Trt)Gly-OH (producto del Ejemplo 3), 0,81 g (6,0 mM) de HOBt y 0,95 ml (6,0 mM) de DIC disuelto en 30 ml de DMF se cargo en el reactor y se agito durante 24 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con 6x20 ml de DMF, 4x20 ml de D^cM, se seco, se anadio 50 ml de la mezcla de TFA/TIS/EDT/H2O (97:1:1:1), se mantuvo durante 4 horas a temperatura ambiente, se filtro y se lavo con 3x20 ml de acido trifluoroacetico, los filtrados combinados se redujeron hasta -20 ml, se anadieron 60 ml de eter seco al residuo. El sedimento obtenido se filtro, se lavo con eter sobre un filtro y se seco. El producto obtenido se disolvio con 50 ml de agua y la mezcla se congelo y se liofilizo. El liofilizado se disolvio con 40 ml de agua y se aplico a la columna de resina de intercambio ionico Amberlite IRA-400 (forma Cl). La columna se lavo con agua, las fracciones que conteman el producto se redujeron hasta ~ 50 ml y se aplicaron a la columna de fase inversa C18 Water X-Bridge, 10 pm, 127A, 50x250 mm. La elucion se realizo a un flujo de eluyente de 50 ml/min. Fase A: HCl/H2O al 0,1 %, B: acetonitrilo. Gradiente: 0 % (B)-70 %(B) durante 70 min. Las fracciones que conteman el producto principal se combinaron, se redujeron a -50 ml, se congelaron y se liofilizaron. Se obtuvieron 3,9 g (20 %) de producto puro al 97,5% (HELC). Espectro de masas: calculado para C231H374N82O70 MH+ 5420,98, se obtuvo MH+ 5420,80. Analisis de aminoacidos: alanina 2,02 (2), arginina 9,0 (9), acido aspartico asparagina 2,05 (2), acido glutamico glutamina 5,80 (6), glicina 7,25 (7), histidina 1,02 (1), isoleucina 1,03 (1), leucina 2,96 (3), lisina 2,07 (2), fenilalanina 2,05 (2), prolina 4,10 (4), serina 4,85 (5), treonina 1,90 (2) y valina 1,02 (1).

Ejemplo 5.

Smtesis de H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-ArgGly-OH utilizando la cepa de Corynebacterium acetoacidophilum.

1.1. Diseno del vector pBSACg10278 para la eliminacion del gen Cg10278 que codifica PBP1a

Se conocen la secuencia genomica de ATCC 13032 de C. acetoacidophilum y la secuencia de nucleotidos del gen Cg1278 que codifica la protema de union a penicilina PBPla (GenBank, numero de inventario BA000036 (version BA000036.3 GI: 42602314, locus_tag=«NCg10274»)). Los cebadores P1, P2, P3 y P4 se sintetizaron con referencia a esta secuencia. Con la ayuda de la PCR, se utilizo el ADN del cromosoma como matriz de la cepa ATCC 13869 de C. acetoacidophilum preparada en un procedimiento convencional (Saito H. y Miura K.I., Biochim. Biophys. Acta, 1963, 72:619-629) y los cebadores P1, P2, P3 y P4, se obtuvo un fragmento (aproximadamente 1 tpn) del lado 5' y un fragmento (aproximadamente 1 tpn) del lado 3' del Cg10278 que codifica PBPla respectivamente. Despues, con la ayuda de la PCR y utilizando ambos fragmentos de ADN como matriz y los cebadores P1 y P4, se obtuvo un fragmento de ADN (aproximadamente 2 tpn) que consiste en ambos fragmentos combinados entre sf. Se aplicaron sitios de reconocimiento de enzimas de restriccion BamH I y Xba I respectivamente. Se utilizo la ADN polimerasa Pyrobest (fabricada por Takara Bio) y las condiciones recomendadas por el fabricante para la PCR. Este fragmento de ADN se trato con las enzimas de restriccion BamH I y Xba I y, con el fin de adquirir el vector pBSACg10278 para la eliminacion del gen Cg0278, se agrego al sitio pBS4 de BamH I-Xba I descrito en el documento WO 2005/113744. Se utilizaron para la ligadura el kit Ver de ligadura de ADN 2.1 (fabricado por Takara Bio) y las condiciones recomendadas por el fabricante.

1.2. Diseno de la cepa PBPla-less

La cepa YDK010 de C. acetoacidophilum descrita en el documento WO 2004/029254 se transformo con el vector pBSACg10278 disenado. La cepa YDK010 de C. acetoacidophilum es una cepa que carece de una protema de la capa superior de celulas PS2 de la AJ12036 de C. acetoacidophilum (^fE^rM BP-734) (documento WO 2004/029254). La cepa se eligio entre los transformantes obtenidos de acuerdo con la descripcion de los documentos W^o2005/113744 y WO 2006/057450 con el fin de obtener la cepa YDK010APBP1a que carece del gen Cg1278.

Los ejemplos que se muestran a continuacion se refieren a pruebas farmacologicas del peptido obtenido.

El fin del estudio es la revelacion de la actividad antihiperglucemica y los efectos preventivos y terapeuticos del compuesto reivindicado (en lo sucesivo, "peptido D") en las complicaciones sobre la base del modelo de diabetes experimental qmmica inducida por una inyeccion unica de estreptozocina (STZ) y nicotinamida en ratas macho [35]. Los siguientes medicamentos fueron utilizados para la comparacion:

1. Byetta® (como medicamento de referencia para la prevencion y el tratamiento de las complicaciones de la DM 2) es una solucion transparente para inyeccion subcutanea, 250 pg/l ml: jeringas precargadas de 1,2 ml de BAXTER Pharmaceutical Solutions.

2. Sustancia exenatida sintetica

3. Metformina (Siofor® 500) (como producto antihiperglucemico convencional de las biguanidas).

REACTIVOS Y MATERIALES APLICADOS

Un kit de reactivos para la determinacion del nivel de hemoglobina glucosilada ("Phosphosorb" LLC, Rusia).

EQUIPO APLICADO

1. Dispositivo de dosificacion medica de laboratorio, 10-100 pl.

2. Dispositivo de dosificacion medica de laboratorio, 100-1.000 pl.

3. Microcentnfuga Z 216 MK (Hermle Labortechnik GmbH, Alemania).

4. Medidor de glucosa OneTouch UltraEasy® (LifeScan, EE.UU.).

5. Tiras reactivas OneTouch Ultra® (LifeScan, EE.UU.).

6. Filamentos de Von Frey (Stoelting, EE.UU).

ANIMALES

ADAPTACION Y SELECCION DE ANIMALES

Antes del comienzo del estudio, los animales de laboratorio se mantuvieron durante 7 d^as para la adaptacion con el manejo grupal en jaulas. Durante este penodo, los animales se controlaron diariamente para la afeccion clmica mediante un examen visual. Los animales con anomalfas detectadas en el examen no se incluyeron en grupos experimentales. Antes de comenzar el estudio, se agruparon los animales que cumplfan con los criterios de inclusion en el experimento.

AGRUPACION

La seleccion de los animales se realizo mediante el procedimiento de aleatorizacion por bloques modificada [36]. Para este fin, todos los animales suministrados de la granja se colocaron aleatoriamente en celdas de bloques de aleatorizacion (la cantidad de celdas del bloque de aleatorizacion es divisible por la cantidad de grupos en el experimento). Despues, utilizando el generador de numeros aleatorios (programa estadfstico Stadistica 6.0), se obtuvo la lista de datos que contienen numeros de las celdas con animales y sus numeros de grupo correspondientes, en las que los animales se colocaron posteriormente [36].

IDENTIFICACION DE ANIMALES

Las etiquetas de la jaula inclrnan sexo, cantidad de animales, fecha de inicio del experimento y nombre del grupo. A cada animal seleccionado para el estudio se le asigno un numero individual aplicando una marca en la cola.

Los animales se mantuvieron bajo condiciones estandar de acuerdo con las reglas establecidas por el Ministerio de Salud de la URSS con fecha 06.07.1973 en cuanto a la disposicion, equipamiento y manejo de clmicas experimentales y biologicas (terrarios) y GOST R 53434-2009.

Los animales se mantuvieron en jaulas de plastico transparente estandar en grupos de 5 individuos en lechos de paja; las jaulas se cubrieron con pantallas de acero con una cavidad de alimentacion. La superficie de suelo para un animal comprendfa 440 cm2 (el area minima permitida es de 250 cm2).

Se agrego ad libitum "alimento para el manejo de animales" nK-120-1 preparado por GOST R 50258-92 de acuerdo con las regulaciones aprobadas por la Orden del Ministerio de Salud de la URSS N.° 755 con fecha 12.08.1977 a la cavidad de alimentacion de la pantalla de la jaula de acero (al medir el nivel de glucosa, los animales fueron privados de alimento durante 18 horas). El certificado veterinario N.° 247 N.° 0294922 ("Aller Petfood" LLC, Rusia), asf como el certificado de conformidad N.° P0CRU.nP98.H00093/0051289, penodo de validez desde el 17.05.2011 hasta el 16.05.2014.

Los animales se suministraron con agua purificada de acuerdo con el SOP O^-OC-4 y se racionaron por sus propiedades organolepticas, valores de pH, residuos secos, sustancias reductoras, dioxido de carbono, nitratos y nitritos, amomaco, cloruros, sulfatos, calcio y metales pesados de acuerdo con el SOP AB-38 sobre la base de GOST 51232-98 "Drinking water. General requirements for organization and quality control methods". Se suministro ad libitum agua en los bebederos estandar con tapa de acero de elevacion manual.

Se utilizaron como lecho pellets de madera de 6 mm ("ZooSPb" LLC, Rusia). Los animales se mantuvieron bajo condiciones ambientales controladas (temperatura de 19,5-21 °C y humedad relativa del 61-75 %). El regimen de luz comprendfa 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Se ajusto el regimen de ventilacion que proporciona aproximadamente 15 volumenes de los locales por hora, concentracion de CO2 de no mas de 0,15 % del vol., amomaco de no mas de 0,001 mg/l. La temperatura del aire y la humedad se registraron diariamente. No se observaron desviaciones significativas de estos parametros durante el penodo de mantenimiento y en el curso del experimento.

DISENO DEL ESTUDIO

Caractensticas de los grupos de estudio, ruta y duracion de la administracion de sustancias de prueba

De acuerdo con el programa de experimented, los animales se sometieron a la induccion de diabetes mellitus experimental utilizando una inyeccion unica de estreptozotocina (STZ) abdominal en la dosis de 65 ppm previamente diluida en tampon de citrato (pH = 6,5) el dfa 0. Todos los animales se inyectaron abdominalmente con nicotinomida en la dosis de 230 ppm (solucion al 5 %) 2 horas antes de la dosis [35, 37].

El nivel de glucosa en sangre periferica se midio en ratas en ayunas (los animales fueron privados de alimento durante una noche) antes de la induccion de la patologfa, luego 1, 3 y 9 dfas despues de la induccion de la patologfa. Despues del comienzo de la inyeccion de sustancias de prueba, el nivel de glucosa se midio cada 10 dfas y el dfa de la eutanasia. El registro del peso corporal se realizo los mismos dfas que la medicion del nivel de glucosa. La prueba de alodinia se realizo en el 6o°, 70° y 80° dfa de la inyeccion de medicamentos durante el experimento. En caso de neuropatfa alcoholica, la prueba de sensibilidad tactil se realizo el 1er, 50° y 100° dfa de la inyeccion de medicamentos.

Se tomo una muestra de sangre venosa para determinar el nivel de hemoglobina glucosilada de los animales el dfa de la eutanasia. Los siguientes organos tambien se tomaron para estudio patomorfologico: nervio ciatico, parte de la arteria mesenterica, parte de la arteria de la retina, parte del musculo gastrocnemio y glandula pancreatica.

EXPERIMENTO Y CALENDARIO DE OPERACIONES

Ejemplo 6. Determinacion de glucosa en sangre de animales de experimentacion.

La medicion del nivel de glucosa en sangre periferica de ratas se llevo a cabo utilizando el medidor de glucosa OneTouch® y las tiras reactivas OneTouch® mediante la prueba de la glucosa oxidasa. Se privaron a las ratas de alimento, pero no de agua por una noche antes de la medicion del nivel de glucosa. El procedimiento de medicion fue el siguiente: un animal con una marca requerida se retiro de la jaula, su cola se trato con un agente bactericida, se perforo una vena con una aguja de jeringa y se coloco el medidor de glucosa con una tira reactiva cuando se realizo la extraccion de sangre. Los datos obtenidos se introdujeron en la placa inicial.

Se puede ver en la figura 1 que la tendencia general a la reduccion de la concentracion de glucosa se observo en el contexto de la aplicacion de los productos de prueba. El analisis de varianza bidireccional (ANOVA) con mediciones repetidas revelo un impacto estadfsticamente significativo de los productos de prueba sobre la concentracion de glucosa en sangre periferica (F⁴.²⁵= 3,49, p = 0,02). La comparacion intergrupal adicional mostro una diferencia significativa entre el grupo inyectado con Metformina a partir del 20^°dfa de la inyeccion del producto (p < 0,05, prueba de Bonferroni), asf como los grupos inyectados con el peptido reivindicado (peptido D) a partir del 40^°dfa de la inyeccion del producto (p < 0,05, prueba de Bonferroni) en comparacion con el grupo de control.

La comparacion pareada entre el valor inicial de glucosa antes del tratamiento (punto "0") y el ultimo dfa de tratamineto (dfa 80) mostro una diferencia estadfsticamente significativa en los grupos que recibieron inyeccion de Metformina (p = 0,017, prueba t) y D-peptido (p = 0,011, prueba t) (figure 1).

Finalmente, se puede concluir que el peptido D reivindicado tuvo un efecto antihiperglucemico durante el tratamiento con una duracion de 80 dfas a partir del 40^°dfa de la inyeccion. El producto similar a la incretina, la exenatida, tambien mostro un efecto antihiperglucemico a partir del 50^°dfa de la inyeccion, aunque su intensidad fue menor que la del D-peptido. La inyeccion de Byetta® no mostro impacto en el nivel de glucosa en sangre periferica, pero el producto de referencia Metformina mostro propiedades antihiperglucemicas a partir del 20^°dfa de tratamiento como se esperaba.

Ejemplo 7. Determinacion de hemoglobina glucosilada en sangre periferica.

La determinacion de la hemoglobina glucosilada en sangre venosa se realizo utilizando el kit de reactivos "Diabetes Test, HbA-ic" ("Phosphosorb" LLC, Rusia) mediante el procedimiento de cromatograffa de afinidad de las fracciones de hemoglobina glucosilada y no glucosilada en hemolisado de sangre de rata.

Las muestras de sangre para la determinacion de hemoglobina glucosilada en hemolisado de globulos rojos animales se tomaron de la vena de la cola de animales experimentales en el dfa 81° de la inyeccion diaria de los productos de prueba. Los datos obtenidos se dan en la tabla 1.

Tabla 1 - Contenido de hemoglobina glucosilada en sangre animal, %, M ± m

Se puede observar en los datos de la tabla 1 que se observo un aumento estadfsticamente significativo de la concentracion de HbA-ic en 4 veces en los animales del grupo de control en comparacion con el grupo sano (p = 0,0002, prueba t). Los datos de medicion caracterizan el desarrollo aparente de la patologfa experimental.

Se establecio una reduccion estadfsticamente significativa de la concentracion de HbA-ic en el contexto de la aplicacion de los productos de prueba (F4,17 = 11,83, p < 0,0001). La comparacion intergrupal adicional revelo el efecto maximo del tratamiento en los grupos a los que se administro el peptido D reivindicado (p < 0,0001) y Metformina (p < 0,0001), mientras que este efecto no fue tan evidente en los grupos que recibieron tratamiento con Byetta® y Exenatida (p = 0,0018 y p = 0,0015 respectivamente).

Ejemplo 8. Evaluacion de la alodinia tactil en ratas con neuropatia diabetica

Se coloco una rata en una jaula de plastico con un suelo de rejilla de alambre metalico y se dejo en esta jaula durante 5 minutos para extinguir la respuesta de orientacion. La determinacion del umbral medio eficaz de respuesta tactil se realizo mediante el procedimiento de Chaplan y col. [38] utilizando el kit que consta de 8 filamentos de von Frey estandar (Stoelting, EE.UU.). La tosquedad del filamento expresada como fuerza minima que se requiere para la flexion del filamento aumento logantmicamente con valores absolutos de 0,692 a 28,840 g.

El umbral de cada rata se determino inicialmente en la pata izquierda y luego en la pata derecha. Un extremo del filamento toco el centro de la superficie plantar en la pata con la fuerza necesaria para doblar el filamento, y se dejo en esta posicion durante 6-8 segundos. Se registro una respuesta positiva si el animal retiraba su pata de forma abrupta durante el contacto, o si la retirada de un filamento era seguida de una flexion aguda de la pata.

La prueba se inicio a partir de la aplicacion de un filamento correspondiente a la fuerza de 3,630 g. Luego se utilizaron estfmulos (filamentos) en la secuencia creciente y decreciente. El filamento con la menor tosquedad se utilizo en caso de respuesta positiva, mientras que el filamento con la mayor tosquedad se utilizo en caso de respuesta negativa. Se utilizaron 4 filamentos mas de acuerdo con el mismo principio despues de la determinacion inicial del umbral de sensibilidad.

El umbral eficaz medio psicofisiologico de la capacidad de respuesta tactil se calculo mediante el procedimiento descrito por Dixon [39].

La Tabla 2 presenta los resultados de los experimentos en el estudio del impacto de la inyeccion durante 80 dfas de productos de prueba en el grado de desarrollo de la alodinia tactil.

En los experimentos completados para el dfa 60 de inyeccion de medicamentos, la manifestacion de alodinia tactil en el grupo de control fue maxima (F1;14 = 669,8, p < 0,0001), lo que indica el modelo establecido de neuropatia diabetica con smdrome de dolor aparente.

El procesamiento estadfstico mediante analisis de varianza bidireccional con mediciones repetidas que permitieron determinar la importancia del factor "inyeccion de medicamentos" en la expresion de la alodinia tactil se llevo a cabo para una evaluacion adicional de los resultados obtenidos (F4,43 = 10,93; p < 0,0001). La comparacion intergrupal adicional (prueba de Bonferroni) mostro una disminucion en la intensidad de la alodinia tactil en el grupo al que se administro el peptido D a partir del dfa 60° de la inyeccion. La Tabla 3 presenta los valores del criterio F para todas las sustancias utilizadas. Las comparaciones intergrupales posteriores (prueba de Bonferroni) confirmaron un impacto significativo solo en el grupo al que se administro el peptido D reivindicado.

Tabla 2 - Impacto de los productos de prueba en la alodinia tactil de ratas. La alodinia tactil se evaluo antes de la inyeccion de los productos de prueba. Los datos se proporcionan como un valor medio del umbral de retirada de la pata (g) (M ± m).

Tabla 3 - Resultados del procesamiento de datos estadfsticos mediante la expresion de alodinia tactil en el contexto de la inyeccion de productos de prueba

Por lo tanto, el estudio de los efectos de los productos de prueba mostro lo siguiente: Byetta®, exenatida y Metformina disminuyeron ligeramente la intensidad de la manifestacion de la alodinia en la comparacion individual de los indicadores, sin embargo, la comparacion intergrupal adicional no confirmo el impacto estadfsticamente significativo. La inyeccion del peptido D reivindicado a partir del dfa 60o de inyeccion disminuyo significativamente las manifestaciones de alodinia tactil en ratas que padedan neuropatia diabetica (tablas 2-3). Esta observacion permite concluir que en el caso de un tratamiento a largo plazo (a partir del dfa 60o de inyeccion) existe un cierto efecto terapeutico en relacion con una de las complicaciones mas extendidas de la DM 2, la neuropatia diabetica periferica que probablemente este condicionada por la accion neuroprotectora del peptido D reivindicado.

Ejemplo 9. Evaluacion de la alodinia tactil en ratas que padecen neuropatia alcoholica.

La evaluacion de la alodinia tactil se realizo de la misma manera que en el ejemplo 7. Los smtomas de la neuropatia alcoholica (alodinia tactil) se observaron a partir de la 8' semana (56-60 dfas) de consumo de alcohol al 30 % por ratas de acuerdo con el procedimiento de consumo forzado [40] (F1;12 = 26,25; p = 0,0003; figura 2), que indica el modelo establecido de neuropatia alcoholica con smdrome de dolor aparente.

El procesamiento estadfstico mediante analisis de varianza bidireccional con mediciones repetidas que permitieron determinar la importancia del factor "inyeccion de medicamentos" en el grado de desarrollo de la alodinia tactil se llevo a cabo para una evaluacion adicional de los resultados obtenidos (Fi,io = 8,79; p < 0,014). La comparacion intergrupal adicional (post hoc) mostro una disminucion en la intensidad de la alodinia tactil en el grupo que se trato con el peptido D reivindicado en el dfa 100° de la inyeccion, en comparacion con el grupo de control en el punto de medicion correspondiente (p < 0,05; prueba de Bonferroni; figura 2).

Resumiendo todo lo anterior, se puede concluir que el peptido D reivindicado tiene propiedades neuroprotectoras en relacion con los procesos neurodegenerativos desarrollados durante la neuropatfa periferica diabetica y alcoholica. ESTUDIO PATOMORFOLOGICO

Todos los animales experimentales se sometieron a un estudio patomorfologico al final del estudio.

El estudio patomorfologico que comprende necropsia, examen macroscopico, examen histologico de los siguientes organos internos: porcion central del nervio ciatico, arteria de la retina, parte de la arteria mesenterica, parte del musculo gastrocnemio, glandula pancreatica. La necropsia se llevo a cabo bajo la supervision directa de un patologo. Se cortaron muestras de tejidos espedficos y se pusieron en una solucion al 10 % de formalina neutra, mientras que un bulbo ocular se fijo con un fijador Davidson durante 24 horas, luego el material se sometio a un tratamiento estandar para la produccion de muestras histologicas e histoqmmicas con grosor de secciones de parafina seriadas de 5-7 pm. Las secciones de tejidos y organos para examen microscopico se tineron con hematoxilina y eosina. Las muestras de tejido nervioso se tineron con hematoxilina y eosina, azul de toluidina mediante el procedimiento de Nissl y picro-fucsina mediante el procedimiento de van Gieson. Para revelar las fibras de mielina y los productos de descomposicion de la mielina, las secciones transversales y longitudinales de los nervios obtenidos en el microtomo de congelacion se tineron con negro de Sudan mediante el procedimiento de Lieson [41, 42, 43]. Los nucleos se contrastaron con hemalum. Las muestras de musculo gastrocnemio se tineron con hematoxilina, eosina y picro-fucsina mediante el procedimiento de van Gieson.

El examen morfologico de las muestras histologicas se llevo a cabo con el microscopio optico de luz Carl Zeiss (Alemania) con un aumento de 100, 200 y 400. La microfotograffa se realizo con la camara digital Axio Scope A1 (Alemania). La morfometna se llevo a cabo de forma semiautomatica y manual utilizando el software AxioVision Rel.

4,8 y el editor de imagenes PhotoM 1.21.

Para evaluar la accion de las sustancias de prueba, se realizo una evaluacion histologica comparativa de su impacto en:

1. aparato insular de la glandula pancreatica en el que se realizo la medicion del area de los islotes;

2. arteria de tipo muscular y torrente sangumeo microcirculatorio (arteriolas y capilares) de la retina, arteria mesenterica en la que se realizo la medicion morfometrica del diametro capilar y el grosor de la mtima de la arteria;

3. afeccion del nervio ciatico;

4. afeccion de la musculatura somatica.

Ejemplo 10. Evaluacion de la afeccion de la mtima de la arteria mesenterica de ratas

La Figura 3 presenta datos sobre el impacto de las sustancias de prueba en la afeccion de la mtima de la arteria mesenterica de ratas. En la comparacion pareada de los grupos sanos y control se demostro que se produce un aumento significativo en el grosor de la mtima del vaso en el grupo de control (p < 0,0001, prueba t). Este aumento de grosor y la inflamacion de la mtima del vaso atestiguan el desarrollo de procesos de endoteliopatia. Un analisis de varianza unidireccional adicional (ANOVA) mostro que la inyeccion a largo plazo de sustancias de prueba evita el aumento del grosor de la mtima de los vasos de la arteria mesenterica de ratas (F4,25 = 12,87; p = 0,0001). La comparacion intergrupal mostro una disminucion significativa del grosor de la mtima del vaso en todos los grupos en comparacion con el grupo de control (p < 0,05, prueba de Bonferroni). El efecto maximo se observo en el grupo al que se administro el peptido D reivindicado (p < 0,0001, prueba de Bonferroni).

Ejemplo 11. Evaluacion de la afeccion del tejido del nervio ciatico

Se puede concluir que, segun los cambios patomorfologicos establecidos en el tejido nervioso, el modelado de la diabetes mellitus tipo 2 inducida por STZ se acompano de una afeccion aparente de neuropatfa diabetica que se caracterizo por una disminucion del grosor y diametro de los tallos nerviosos, deformacion e hinchazon de las vainas de mielina, fibras nerviosas afectadas, edema del tejido intersticial, acumulacion anormal de lfpidos en epineuro y perineuro, asf como crecimiento de tejido conectivo endoneural.

Las fibras individuales estaban en la afeccion de degeneracion hidropica. En los focos de desmielinizacion se observaron agregados de pequenos granulos sudanofilos que indicaban una desintegracion continua de la mielina. La inyeccion de Metformina no tuvo un efecto terapeutico en el tejido nervioso. Se observaron en muestras de tejido de este grupo lesiones severas de tallos y fibras nerviosas, perineuro y epineuro se manifestaron en una aparente infiltracion polimorfonuclear con degeneracion focal de vainas de mielina, as ^como hinchazon y deformacion de las fibras, presencia de productos de desintegracion de la mielina como granulos sudanofilos adyacentes a la membrana basal de fibras de mielina no afectadas.

Cuando se inyectaron Byetta® y exenatida, solo se observo una acumulacion insignificante de lfpidos en el perineuro y el epineuro. Es obvio que los fenomenos degenerativos en este grupo fueron sustancialmente mas bajos o no ocurrieron en absoluto. Por el contrario, la inyeccion del peptido D reivindicado tuvo un efecto terapeutico positivo, mientras que no se revelaron diferencias morfologicas aparentes en la estructura de los nervios ciaticos del grupo de animales sanos.

Se determino durante el analisis patomorfologico de los indicadores del tejido nervioso que el grosor del tallo nervioso habfa disminuido significativamente en el grupo de control en comparacion con los animales sanos (p < 0,0001; prueba t) que pueden indicar cambios degenerativos en el tejido y se comprueba mediante una afeccion patomorfologica del desarrollo de la patologfa (tabla 4).

Tabla 4 - Indicadores morfometricos de tejido nervioso bajo la accion de sustancias de prueba

Como se ha observado anteriormente, la afeccion patomorfologica de las muestras de tejido nervioso en el grupo que administro Metformina indica un edema del tallo nervioso y un aumento excesivo de su grosor, lo que implica un aumento de la patologfa, pero no un efecto terapeutico. El analisis estadfstico sin la inclusion del grupo mencionado anteriormente se llevo a cabo a este respecto. El analisis de varianza unidireccional (ANOVA) revelo un impacto significativo de la inyeccion de sustancias de prueba en el grosor del tallo nervioso (F3,34= 4,83; p = 0,007). La comparacion adicional intergrupal (post hoc) confirmo un aumento significativo en el grosor del tallo nervioso en el grupo al que se administro el peptido D reivindicado (p < 0,01; prueba de Bonferroni) en comparacion con el grupo de control.

Se establecio en el analisis de dicho indicador patomorfometrico como area del tejido conjuntivo endoneurium que se produjo un crecimiento significativo del tejido conectivo endoneural en el modelado patologico (p < 0,0018; prueba t), que puede indicar un predominio de las manifestaciones degenerativas sobre las reparadoras [Karpova y Krishtop, 2013]. El rendimiento del analisis de varianza unidireccional (ANOVA) mostro un impacto significativo de la inyeccion de sustancias de prueba en el area del tejido conectivo endoneural (F4,25= 8,58; p = 0,0002). La comparacion intergrupal adicional (post hoc) confirmo una disminucion significativa del area del tejido conectivo endoneural en todos los grupos (p < 0,01; prueba de Bonferroni). El efecto maximo se registro en los grupos a los que se administro el peptido D reivindicado (p = 0,0002; prueba de Bonferroni) (tabla 4) que puede tratarse como una mejora de los procesos reparativos en el tejido nervioso.

Ejemplo 12. Evaluacion de la afeccion del tejido muscular (musculo gastrocnemio)

Se puede concluir, sobre la base de los cambios patomorfologicos establecidos en el tejido muscular estriado de los musculos gastrocnemios, que la progresion experimental de la DM 2 estuvo acompanada por una afeccion aparente de distrofia muscular que se caracterizo por adelgazamiento y deformacion de las fibras musculares, crecimiento moderado del tejido conectivo circundante, en algunos casos con sustitucion de fibras atrofiadas por tejido conjuntivo colageno, asf como aumento en la cantidad de nucleos de celulas musculares (mionucleos). Se encontro una infiltracion inflamatoria moderada en el tejido conjuntivo de endomisio y perimisio en animales con atrofia de fibra. Se observo crecimiento focal del tejido conectivo con la sustitucion de fibras musculares afectadas e infiltracion linfocftica moderada en el grupo al que se administro Byetta® y exenatida. Se observo una infiltracion inflamatoria focal minima de las fibras y el tejido intersticial en el grupo al que se administro Metformina en el contexto del aumento de la proporcion mionuclear.

En el contexto de la patologfa establecida, la inyeccion del peptido D reivindicado tema una accion terapeutica aparente en el tejido muscular. Se encontraron cambios patologicos en estos grupos en casos individuales y fueron menores en comparacion con el grupo de control.

Al analizar el area de la seccion transversal de las fibras musculares, se establecio que la progresion de la DM de tipo 2 experimental estaba acompanada por una disminucion significativa en el area de la seccion transversal de fibras del tejido muscular (p < 0,0001; prueba t) con una disminucion simultanea en la cantidad de mionucleos en fibras (alrededor del 70 %) que pueden tratarse como signos de distrofia muscular. El rendimiento del analisis de varianza unidireccional (ANOVA) mostro un impacto significativo de la inyeccion de sustancias de prueba en el area de la seccion transversal de fibras musculares (F4,22= 13,67; p = 0,0001). La comparacion intergrupal adicional (post hoc) confirmo una disminucion significativa del area de la seccion transversal de fibras musculares en todos los grupos (p < 0,01; prueba de Bonferroni), a excepcion del grupo al que se administro Byetta® (p = 0,051; prueba de Bonferroni). El efecto maximo se registro en los grupos a los que se administro exenatida (p < 0,0001; prueba de Bonferroni) y el peptido D reivindicado (p = 0,0004; prueba de Bonferroni) (tabla 5).

Tabla 5 - Area de la seccion transversal de fibras musculares del musculo gastrocnemio bajo la accion de sustancias de prueba, (M ± m)

Ejemplo 13. Aparato insular de la glandula pancreatica

La Tabla 6 presenta datos resumidos sobre el impacto de las sustancias de prueba en el aparato insular de las glandulas pancreaticas de animales experimentales. En la comparacion pareada del grupo sano y control se demostro que se produce una disminucion significativa de los islotes de Langerhans en el grupo de control (p < 0,0001, prueba t). Esta disminucion en el area del aparato insular implica el desarrollo de una patologfa que tambien se correlaciona con el aumento del nivel de glucosa en sangre periferica. La comparacion pareada del grupo de control con los experimentales revelo un impacto estadfsticamente significativo de la inyeccion de todas las sustancias de prueba en el area de los islotes de las glandulas pancreaticas (tabla 7). Esta observacion indica que la inyeccion a largo plazo de sustancias de prueba provoca un aumento del area de los islotes y, por lo tanto, facilita los procesos de reparacion del aparato insular de la glandula pancreatica.

Tabla 6 - Indicadores morfometricos de la afeccion del aparato insular de la glandula pancreatica despues de la inyeccion durante 80 dfas de productos de prueba.

(continuacion)

Tabla 7. Resultados del procesamiento estadfstico de los datos en el area de los islotes de las glandulas pancreaticas despues de multiples inyecciones de productos de prueba (prueba de Student)

Por lo tanto, se revelo en el analisis patomorfologico de organos y tejidos que el modelado de la diabetes mellitus tipo 2 inducida por estreptozotocina se acompano de endoteliopatia, disminucion del area del aparato insular de la glandula pancreatica, asf como la aparente afeccion de desarrollo de neuropatfa periferica diabetica y alteraciones distroficas en los musculos estriados del muslo.

Se observo un efecto terapeutico maximo y aparente despues de la inyeccion durante 80 dfas del peptido D reivindicado. La inyeccion de este compuesto tuvo una accion curativa positiva con respecto a las complicaciones de la diabetes mellitus tipo 2, tal como la neuropatfa diabetica, la distrofia muscular, la endoteliopatfa, y tuvo un impacto favorable en los procesos de reparacion en el aparato insular de la glandula pancreatica. El analisis de las muestras histologicas se correlaciona con los datos clmicos. En particular, se observo un efecto curativo aparente en la manifestacion de los signos de alodinia y en la disminucion del contenido de hemoglobina glucosilada en los globulos rojos de los animales experimentales. Tambien se observo una accion antihiperglucemica aparente de este compuesto que era comparable con la de la Metformina.

En vista de lo anteriormente dicho, se puede concluir que el peptido D reivindicado es un agente altamente eficaz para el tratamiento y la prevencion de las complicaciones de la diabetes mellitus tipo 2, especialmente la neuropatfa diabetica, y tiene una accion neuroprotectora en relacion con la neuropatfa alcoholica.

Lista de referencias:

1. Stern, M.P., Williams, K., Gonzalez-Villalpando, C., Hunt, K.J., Haffner, S.M., 2004. Does the metabolic syndrome improve identification of individuals at risk of type 2 diabetes and/or cardiovascular disease? Diabetes Care 27, 2676-2681.

2. Fu, W., Patel, A., Jhamandas, J.H., 2013. Amylin receptor: a common pathophysiological target in Alzheimer's disease and diabetes mellitus. Front Aging Neurosci. 5, 42.

3. Danaei, G., Finucane, M.M., Lu, Y., Singh, G.M., Cowan, M.J., Paciorek C.J., Lin, J.K., Farzadfar, F., Khang, Y.H., Stevens, G.A., Rao, M., Ali, M.K., Riley, L.M., Robinson, C.A., Ezzati, M., 2011. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants. Lancet 378, 31-40.

4. Global health risks. Mortality and burden of disease attributable to selected major risks. Ginebra, World Health Organization, 2009.

5. Mathers, C.D., Loncar, D., 2006. Projections of global mortality and burden of disease from 2002 to 2030. PLoS. Med. 3, e442.

6. Nedosugova, L.V. Pathogenesis, clinical aspects, approaches to treatment of diabetic polyneuropathy // Meditsinsky Sovet, 12. 2013. pags. 43-49.

7. Eng., J. y col., Isolation and Characterization of Exendin-4, an Exendin-3 Analogue, from Heloderma suspectum Venom. J. Biol. Chem., Vol. 267, Issue 11, 7402-7405, abril, 1992.

8. Documento US 5424286 Exendin-3 and exendin-4 polypeptides, and pharmaceutical compositions comprising same

9. Documento US 2005043238 Exendin formulations for weight reduction

10. Documento US 6858576 Method for regulating gastrointestinal motility

11. Documento US 9800449 Use of exendins and agonists thereof for the reduction of food intake

12. Documento US 2005037958 Inotropic and diuretic effects of GLP-1 and GLP-1 agonists

13. Documento US 6703359 Inotropic and diuretic effects of exendin

14. Documento JP 2002509078 Inotropic and diuretic effects of exendin and GLP-1

15. Documento US 2004266678 Methods and compositions for treating polycystic ovary syndrome

16. Documento MX 2008015640 Compounds for treatment of metabolic disorders

17. Documento US 2009291100 Therapeutic agent for polycystic ovary syndrome (PCOS)

18. Documento JP 2006520747 Methods and compositions for treating polycystic ovary syndrome

19. Documento US 2004209803 Compositions for the treatment and prevention of nephropathy

20. Documento AU 2003297356 Prevention and treatment of cardiac arrhythmias

21. Documento AU 2003262628 Bone marrow cell differentiation

22. Documento US 2004092443 Long-acting exendins and exendin agonists

23. Documento US 2004023871 Use of exendins and agonists thereof for the treatment of gestational diabetes mellitus

24. Documento JP 2003519667 Use of exendins and agonists thereof for modulation of triglyceride levels and treatment of dyslipidemia

25. Documento U^s2003036504 Use of exendins and agonists thereof for modulation of triglyceride levels and treatment of dyslipidemia

26. Documento US 9410225 Method for regulating gastrointestinal motility

27. Documento RU 2247575 Method for inhibiting glucagon

28. Docuemento US 2007041951 Differentiation of non-insulin producing cells into insulin producing cells by GLP-1 or exendin-4 and uses thereof

29. Documento PT 1019077 Novel exendin agonist compounds

30. Documento LU 91342 Use of exendins and agonists thereof for the reduction of food intake

31. Documento US 2002137666 Use of exendins and agonists thereof for the reduction of food intake

32. Docuemento US 2006194719 Stabilized exendin-4 compounds

33. Documento US 2003087821 Exendins, exendin agonists, and methods for their use

34. Documento EP 1419783 Use of a composition comprising an exendin or a compound derived therefrom and a pharmaceutical carrier

35. Szkudelski T. Streptozotocin-nicotinamide-induced diabetes in the rat //Characteristics of the experimental model. Exp Biol Med (Maywood). 2012; 237(5):481-90.

36. Altman D.G. Bland J.M. How to randomize // BMJ. 1999. Vol. 11. pag. 319 (7211)

37. Guidance on non-clinical studies of drug products //Federal State Budgetary Institution "Scientific Center for Evaluation of Medical Products". Bajo la direccion editorial de A.N. Mironov. Vol. 1,2012. 695 p.

38. Chaplan, S.R., y col. "Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw". // J.Neurosci.Methods 53.1 (1994): 55-63.

39. Dixon W.J. Efficient analysis of experimental observations // Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. - 1980. -Vol. 20. -pags. 441-462.

40. Weiss, F., y Koob, G.F. The neuropharmacology of ethanol self-administration. //In: Meyer, R.E.; Koob, G.F.; Lewis, M.J.; y Paul, S.M., eds. Neuropharmacology of Ethanol: New Approaches. / Boston: Birkhauser, 1991. pags.125-162.

41. Kozyrev, K.M., Marzaganova, Z.A., Dzitstsoeva, P.A. Comparative clinicopathologic characteristics of Pick's disease and Alzheimer's disease // Boletm de New Medical Technologies. 2013. N.° 1, 7 p.

42. Makhmutov, O.K. Reactive changes in nerves at early stages of conduction anesthesia // Veterinarny Doktor, 2007. pags. 23-25.

43. Chumasov, E.I. Methodological developments on diagnosis of human and animal demyelinating diseases.

1993. pags. 1-16

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto representado por la siguiente formula: H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH.

2. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, para su uso en el tratamiento y prevencion de la diabetes mellitus tipo 2 y sus complicaciones.

3. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que las complicaciones se seleccionan de neuropatia diabetica, distrofia muscular y endoteliopatfa.