ES2277676T3 - Antagonistas de los peptidos glp-2 intestinotroficos. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido análogo de un péptido de GLP-2 de mamífero, en donde el análogo inhiba la actividad intestino-trófica del péptido de GLP-2, comprendiendo una secuencia de amino ácidos que consista en un GLP-2 de mamífero de referencia e incorpore, en relación al péptido de GLP-2, una o más mutaciones estructurales seleccionadas entre (i) la eliminación de uno a cuatro de cualquiera de los primeros cuatro residuos N-terminales del péptido de GLP-2, (ii) sustitución de al menos un amino ácido que se encuentre en el péptido de GLP-2 en una posición seleccionada entre Asp 15 , Thr 29 y Thr 32 con un amino ácido que no se encuentre de forma natural en la posición en el GLP-2 de referencia; y (iii) sustitución del Ala 2 en el péptido de GLP-2 con un amino ácido seleccionado entre el grupo que consiste en Cys, Trp, y PO3-Tyr 2 .
Description
Antagonistas de los péptidos
GLP-2 intestinotróficos.
Esta invención se refiere a péptidos
relacionados con el glucagón que son antagonistas funcionales de los
péptidos-2 de tipo glucagón y a su uso terapéutico
para contrarrestar la hiperplasia o inducir hipoplasia de forma
particular en el tejido intestinal.
La expresión de los genes del glucagón da lugar
a una variedad de productos de tipo péptido determinados por el
tejido que son procesados a partir de los 160 residuos del producto
proglucagón. La organización de estos péptidos en el precursor de
proglucagón fue dilucidada mediante la clonación molecular de los
cDNAs del preglucagón de páncreas de rape, rata, hámster y bovino.
Estos análisis revelaron que el preproglucagón contiene no sólo la
secuencia de glucagón y glicentina, sino también dos péptidos de
tipo glucagón adicionales (GLP-1 y
GLP-2) separados del glucagón y entre sí por dos
péptidos espaciadores o intermedios (IP-I y
IP-II). Estos péptidos son flanqueados por pares de
amino ácidos básicos, característicos de los sitios clásicos de
rotura de las prohormonas, sugiriendo que pueden ser liberados
después del procesamiento post-traduccional del
proglucagón (Drucker, Páncreas, 1990, 5(4): 484). El
análisis de los péptidos liberados del proglucagón en los islotes
pancreáticos de Langerhans, por ejemplo, sugiere que el péptido
pancreático principal liberado es el 29-mer
glucagón, mientras que la glicentina, la oxintomodulina, el
IP-II y los péptidos de tipo glucagón son más
frecuentes en el intestino delgado y el grueso. Esta demostración de
que los péptidos de tipo glucagón se encuentran en el intestino ha
provocado la investigación sobre la estructura precisa y la
función(es) putativa(s) de estos péptidos del
intestino recién descubiertos. La mayoría de los estudios se han
focalizado en el GLP-1, debido a que varias líneas
de evidencia sugieren que el GLP-1 puede ser un
importante nuevo péptido regulador. Efectivamente, se ha
determinado que el GLP-1 es el estímulo peptidérgico
conocido más potente para la liberación de la insulina, una acción
mediada de un modo dependiente de la glucosa a través de la
interacción con receptores en las células \beta pancreáticas. El
GLP-1 y sus derivados se encuentran en desarrollo
para uso en el tratamiento de los diabéticos.
Con respecto al papel biológico del
GLP-2, las solicitudes de patente en trámite U.S.
No. de serie de la solicitud 08/422.540 (publicación de la
solicitud PCT No. WO 96/32414), que se incorporan por referencia en
su totalidad a la presente memoria, describen que el
GLP-2 de mamífero actúa como un agente trófico, para
favorecer el crecimiento del tejido intestinal. El efecto del
GLP-2 es particularmente marcado por un crecimiento
incrementado del intestino delgado. Además, las solicitudes de
patente en trámite U.S. No. de serie de la solicitud 08/631.273 y
solicitud de patente PCT No. PCT/CA 97/00252, incorporándose ambas
en su totalidad por referencia a la presente memoria, describen que
los análogos del GLP-2 de vertebrado pueden tener
una actividad intestinotrófica intensificada.
Ahora se ha descubierto que la alteración de la
estructura del péptido GLP-2 puede dar lugar a
péptidos capaces de inhibir la actividad intestinotrófica del
GLP-2. De forma más particular, y de acuerdo con un
aspecto de la invención, se proporcionan antagonistas que
comprenden una secuencia de amino ácidos que corresponde a la de un
primer GLP-2 de mamífero de referencia que ha sido
mutada de modo que se han suprimido entre uno y cuatro de
cualquiera de los primeros cuatro residuos
N-terminales. En otro aspecto de la invención, los
antagonistas que corresponden a un GLP-2 de mamífero
de referencia que han sido mutados de modo que al menos un amino
ácido seleccionado entre las posiciones de amino ácidos
correspondientes a las posiciones de amino ácidos del
GLP-2 humano en Asp ^{25}, Thr^{25} y Thr^{32}
esté sustituido con un amino ácido que no se encuentre de forma
natural en dicha posición en el GLP-2 de referencia.
En otro aspecto de la invención, la posición Ala^{2} está
sustituida con un amino ácido seleccionado entre el grupo que
consiste en Cys, Trp, y PO_{3}-Tyr^{2}. En
todavía otro aspecto de la invención, el antagonista corresponde a
un polipéptido con cualquier combinación de las sustituciones y
eliminaciones anteriores mutadas en relación con el
GLP-2 de mamífero de referencia.
También se proporciona como un aspecto de la
invención métodos de producir y de identificar antagonistas del
GLP-2.
Para uso en el tratamiento médico o veterinario,
se proporcionan de forma adicional por la presente invención una
composición farmacéutica o veterinaria que comprende una cantidad de
un antagonista del GLP-2 efectiva para antagonizar
la actividad del GLP-2 in vivo, y un soporte
farmacéuticamente o veterinariamente aceptable.
La actividad antagonista del
GLP-2 de los antagonistas de GLP-2
presentes es manifiesta in vivo como una reducción en la
masa del tejido del intestino delgado o como una capacidad para
inhibir la actividad intestinotrófica del GLP-2 o
de los análogos intestinotróficos del mismo.
La presente invención proporciona el uso de
péptidos de acuerdo con la invención para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de enfermedades tal como se define
en las reivindicaciones añadidas.
La presente invención se refiere a usos
terapéuticos y relacionados de una nueva clase de antagonistas del
GLP-2, de forma particular para la disminución de la
velocidad de crecimiento del tejido gastrointestinal, de forma más
particular del intestino delgado. El efecto biológico de los
antagonistas del GLP-2 presentes se manifiesta como
una disminución en el peso del intestino delgado, en relación con un
control tratado de forma simulada o como una capacidad para inhibir
la actividad intestinotrófica del GLP-2 o de un
análogo intestinotrófico del GLP-2 en relación con
un animal de control dando tanto GLP-2 como un
análogo intestinotrófico de solo GLP-2.
Los presentes antagonistas de
GLP-2 son análogos estructurales de los péptidos de
GLP-2 intestinotróficos. Los péptidos del
GLP-2 hacen referencia de forma colectiva a varias
formas vertebradas del GLP-2 y a formas modificadas
(caracterizadas por al menos una adición, eliminación, sustitución,
y/o incorporación de un residuo de amino ácido con un grupo
bloqueante) de los análogos del GLP-2 que todavía
retienen la actividad intestinotrófica. Sin embargo, tal como se ha
descrito en la presente memoria, ciertas alteraciones específicas
del sitio de estos péptidos de GLP-2 pueden
conferir actividad antagonista al análogo alterado específicamente
en el sitio.
Sin estar limitado por la siguiente explicación,
se cree que las alteraciones específicas del sitio que confieren
actividad antagonista interfieren con una de las actividades
funcionales del péptido de la hormona de GLP-2,
pero no todas las actividades funcionales. Por ejemplo, una
alteración que confiere actividad antagonista al análogo del
GLP-2 puede ser una que no inhiba la unión de la
hormona a su receptor cognado, pero que prevenga la subsiguiente
transducción de señal a través del receptor de unión. Por ejemplo,
la alteración específica del sitio de la hormona puede prevenir la
dimerización del receptor de hormona que es necesario para
transmitir una señal al interior de la célula. Dicho mecanismo para
la actividad antagonística ha sido observado con otras hormonas
tales como, por ejemplo, la hormona del crecimiento humano (ver Fuh
y col., Science, 1992, 256: 1677-1680).
De forma general, los sitios que son altamente
conservados entre los GLP-2's de mamífero son
candidatos para modificación con el fin de obtener un antagonista.
Entre los mamíferos, al menos los residuos 1-5, 7,
15, y 22, 29 y 32-33 son altamente conservados. Por
consiguiente, la supresión o sustitución de los residuos en estos
sitios puede dar lugar a un antagonista de GLP-2. De
forma adicional, ciertas modificaciones de los sitios próximos a
estos sitios conservados también pueden causar actividad antagonista
por interrupción de la estructura de amino ácido terciario o
colocación de los residuos adyacentes conservados.
Los antagonistas de GLP-2 de la
invención incluyen derivados de péptidos con una secuencia derivada
de un GLP-2 de vertebrado en la que se haya
eliminado uno o más de cualquiera de los primeros cuatro amino
ácidos N-terminales (relativos a la secuencia del
GLP-2 humano). Estos análogos son referidos en la
presente invención como la clase de eliminación de los antagonistas
de GLP-2. A partir de la clase de eliminación de los
antagonistas de GLP-2, será apreciado que el
antagonismo de GLP-2 puede resultar de la
interrupción de la estructura N-terminal del
GLP-2 en los primeros cuatro amino ácidos. De este
modo, la clase de eliminación de los antagonistas de
GLP-2 comprende:
GLP-2(2-33),
GLP-2(3-33),
GLP-2(4-33) y
GLP-2(5-33),
[desAla^{2}]GLP-2,
[desAsp^{3}]GLP-2 y
[desGly^{0}]GLP-2.
De forma adicional, los antagonistas de
GLP-2 de la invención incluyen derivados de
sustitución de GLP-2'2 de vertebrados. La clase de
sustitución de antagonistas de GLP-2 incluye
aquellos antagonistas que sustituyen uno de los siguientes amino
ácidos a las siguientes posiciones (relativas a la secuencia del
GLP-2 humano) con otro amino ácido: residuos 15, 29
y 32. También se incluyen en la clase de sustitución aquellos que
incorporan ciertas sustituciones
Ala^{2}.
Ala^{2}.
Se deberá entender que, en las realizaciones de
la invención, los antagonistas de GLP-2 pueden
incorporar cualquier combinación de una eliminación y una
sustitución, o pueden incorporar dos o más sustituciones en los
sitios señalados.
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Los antagonistas de GLP-2
pueden, de acuerdo con ello, ser análogos del GLP-2
humano, que tiene la secuencia siguiente:
A no ser que se especifique de otro modo, el
término "GLP-2" hace referencia a la secuencia
del GLP-2 humano.
Los antagonistas de la invención son
polipéptidos que comprenden secuencias de amino ácidos que
corresponden a la de un primer GLP-2 de mamífero de
referencia que ha sido mutado de modo que:
- (i)
- se haya eliminado de uno a cuatro de cualquiera de los primeros cuatro residuos N-terminales; o
- (ii)
- al menos un amino ácido seleccionado entre las posiciones de amino ácidos que corresponden a las posiciones de amino ácidos del GLP-2 humano a Asp^{15}, Thr^{29} y Thr^{32} sea sustituido con un amino ácido que no se encuentre de forma natural en dicha posición en el GLP-2 de referencia; o
- (iii)
- la posición Ala^{2} esté sustituida con un amino ácido seleccionado entre el grupo que consiste en Cys, Trp, y PO_{3}-Tyr^{2}; o
- (iv)
- se mute una combinación de (i) y (ii), o (ii) y (iii).
En realizaciones específicas de la invención,
por ejemplo, los antagonistas de GLP-2 de la
invención que son alterados en las posiciones del residuo 1, 2, 3,
4, 22, 29, 32, y/o 33 pueden ser derivados del GLP-2
de rata que es una variante de Ala^{15} del GLP-2
humano; degu GLP-2, ox GLP-2,
GLP-2 de porcino, GLP-2 de cobaya y
GLP-2 de hámster, cuyas secuencias han sido
descritas por varios autores incluyendo Buhl y col. en J. Biol.
Chem., 1988, 263(18): 8621.
Los residuos de GLP-2 que se
producen en una posición específica son determinados por la
alineación de secuencias de los GLP-2's aislados de
diferentes especies de vertebrados y comprenden la secuencia para la
secuencia humana, que se ha reproducido anteriormente.
Además, los antagonistas de
GLP-2 de la invención que son alterados en las
posiciones de los residuos 1, 2, 3, 4, 22, 29, 32, y/o 33 pueden
ser derivados de los agonistas de GLP-2 tales como
los descritos en la solicitudes de patentes U. S. en trámite Nos.
08/632.533 y 08/631.273, y la publicaciones de patentes PCT No. WO
96/32414 y la solicitud de patente PCT No. PCT/CA 97/00252.
Las sustituciones de amino ácidos apropiadas en
estos sitios para rendir un antagonista pueden ser fácilmente
determinadas utilizando el modelo de antagonismo de
GLP-2 de murino descrito en la presente memoria. Es
decir, se obtiene un compuesto de GLP-2 que
incorpora una alteración estructural y a continuación es valorado en
el modelo de murino ejemplificado en la presente memoria para la
actividad del antagonismo del GLP-2. Aquellos
compuestos de GLP-2 que obtienen una disminución en
el crecimiento del intestino y/o inhiben la actividad
intestinotrófica del GLP-2 o de un agonista de
GLP-2, son identificados en esta selección como
antagonistas del GLP-2.
Los antagonistas de GLP-2 de la
presente invención son considerados como antagonistas funcionales
del GLP-2 si, cuando se valoran en el modelo de
murino ejemplificado en la presente invención, el antagonista: (1)
media de forma consistente una disminución medible en el peso
relativo del intestino delgado respecto a un animal de control que
recibe sólo el vehículo; y/o (2) cuando se valoró por
co-administración en dicho modelo de murino con
GLP-2 o un agonista de GLP-2 (en una
relación de exceso molar de preferiblemente 10:1, y más
preferiblemente de 4:1 respecto al agonista) dio lugar de forma
consistente a una inhibición medible del efecto intestinotrófico
del GLP-2 o del agonista de GLP-2,
tal como se reveló por una reducción en el incremento en el peso del
intestino delgado inducido por GLP-2 administrado
solo.
Son particularmente adecuados para el uso
terapéutico aquellos antagonistas funcionales de
GLP-2 que median una disminución del peso del
intestino de al menos aproximadamente un 10% en relación con un
animal control que reciba vehículo solo; son preferidos para uso
terapéutico aquellos que median una disminución en el peso del
intestino delgado de al menos un 15% o más.
La masa del intestino delgado que reduce la
actividad de los antagonistas del GLP-2 presentes es
notablemente más significativa en relación con el yeyuno, y de
forma particular el yeyuno próximo, y también es notable en el
ileon distal. De forma adicional, la actividad de los antagonistas
de GLP-2 también es notable como una reducción en
el peso de cripta/vellosidad del intestino delgado.
De forma alternativa, los antagonistas de
GLP-2 pueden ser valorados utilizando el modelo de
co-administración detallado anteriormente. En este
caso, los antagonistas son considerados como antagonistas útiles del
GLP-2 si, cuando se co-administran
con GLP-2, o un análogo intestinotrófico del mismo,
a una relación molar de aproximadamente 10:1, o más preferiblemente
a una relación molar de aproximadamente 4:1, disminuyen la actividad
del GLP-2 o de un análogo intestinotrófico del
mismo en al menos un 10%, tal como se manifiesta por una reducción
en el incremento en el peso del intestino delgado relativo a un
animal control tratado tanto con GLP-2 como con el
agonista de GLP-2 solo.
En otro aspecto de la invención, se proporciona
un método útil para identificar antagonistas del
GLP-2, tales como los descritos anteriormente, que
comprenden las etapas de:
- 1)
- obtener un análogo de GLP-2 que incorpora una alteración en la secuencia del péptido:
- 2)
- tratar un mamífero con dicho análogo utilizando un régimen capaz de obtener una pérdida medible de la masa del intestino; y
- 3)
- determinar el efecto de dicho análogo en el peso del intestino delgado en relación con un animal control tratado de forma simulada, con lo que se identifica un antagonista del GLP-2 funcional como un análogo del GLP-2 que obtiene una disminución en dicho peso.
En un aspecto relacionado de la invención, se
proporciona un método de identificar un antagonista de
GLP-2 que comprende las etapas de:
- (1)
- obtener un análogo de GLP-2 que difiere de un GLP-2 de un mamífero de referencia por tener una alteración estructural seleccionada entre (i) una eliminación de al menos un amino ácido, y (ii) una sustitución de al menos una posición de amino ácido con un amino ácido que no se presenta de forma natural en dicha posición, y (iii) una combinación de (i) y (ii);
- (2)
- tratar un mamífero con dicho análogo co-administrado con GLP-2 o un análogo intestinotrófico de GLP-2, utilizando un régimen capaz de obtener una reducción en el incremento de peso del intestino delgado observado cuando el GLP-2 es administrado solo, y
- (3)
- determinar el efecto de dicho análogo en el peso de intestino delgado relativo a un animal control, recibiendo GLP-2 solo o un análogo intestinotrópico de GLP-2 sólo, en donde dicho antagonista funcional es identificado como un análogo que observa una reducción en el incremento en dicho peso del intestino.
En una versión preferida de los métodos
descritos anteriormente útiles para identificar antagonistas de
GLP-2 funcionales, el análogo de
GLP-2 es seleccionado a partir de los antagonistas
de GLP-2 que se describen en la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Los amino ácidos sustituyentes pueden ser
seleccionados entre la amplia variedad de amino ácidos disponibles
para los químicos especialistas en péptidos, e incluyen los
D-amino ácidos así como los L-amino
ácidos y sus numerosos derivados. De manera más práctica, los amino
ácidos seleccionados serán susceptibles de incorporación por fase
sólida o síntesis en fase solución, o por medios de producción de
DNA recombinante.
En una primera selección, los análogos que son
candidatos para la actividad antagonista son identificados por
mutagénesis de selección de alanina u otros métodos de mutagénesis
sistemáticos. Estas sustituciones de alanina son analizadas para
determinar la actividad antagonista utilizando los métodos descritos
en detalle en la presente memoria.
En otro aspecto de la invención, los
antagonistas de GLP-2 más efectivos pueden entonces
cambiar de forma drástica el carácter del residuo de amino ácido
que se presenta de forma natural que es importante en la formación
de interacciones estructurales (unión de hidrógeno, puentes de sal,
interacciones hidrofóbicas, posiciones de residuos) de la hormona
del GLP-2 que es la molécula objetivo (por ej.,
receptor). Con este objetivo en mente, normalmente no es necesario
seleccionar cada sitio con sustituciones para todos los otros 18
residuos que se obtienen de forma natural. En su lugar, son
seleccionados los miembros representativos de los grupos residuo.
Generalmente, estos grupos son:
- a.
- residuos cargados positivamente: His, Arg y Lys
- b.
- residuos cargados negativamente: Asp y Glu
- c.
- amidas: Asn y Gln
- d.
- residuos aromáticos: Phe, Tyr, Trp
- e.
- residuos hidrofóbicos: Ala, Pro, Gly, Val, Leu, Ile, y Met
- f.
- residuos hidrofílicos no cargados: Ser y Thr.
Cuando se preparan estos candidatos
antagonistas, se debería seleccionar un residuo a partir de un grupo
diferente del tipo de residuo que se presenta de forma natural en
dicha posición. Las sustituciones de extremos son generadas por
selección de un residuo a partir de un grupo con combinaciones
opuestas de características. Por ejemplo, un residuo cargado
negativamente puede estar sustituido por un residuo cargado
positivamente.
En el caso de las sustituciones de Ala^{2},
los amino ácidos sustituyentes son seleccionados cuidadosamente de
modo que den lugar a antagonistas de la actividad del
GLP-2. Debe hacerse notar que las sustituciones en
la posición 2 pueden tener el efecto de intensificar la actividad
intestinotrófica del GLP-2. Por ejemplo, cuando se
sustituye el Ala^{2} por Gly, el resultado intensifica de forma
dramática la actividad intestinotrófica así como la resistencia a
la digestión del péptido de GLP-2 por la enzima
DPP-IV. Los antagonistas de GLP-2
de la presente invención son también generados de forma sorprendente
por sustitución de Ala^{2}. En realizaciones de la invención, los
amino ácidos sustituyentes en la posición 2 que son útiles para
generar los antagonistas del GLP-2 están
seleccionados entre Cys, Trp y PO_{3}-Tyr. Los
antagonistas de GLP-2 que incorporan estas
sustituciones tienen la ventaja añadida de que dan lugar al péptido
resistente a la digestión por la enzima DPP-IV. De
forma preferible, el amino ácido sustituyente de Ala^{2} es
Cys.
Los amino ácidos sustituyentes para Asp^{15},
Thr^{29} y Thr^{32} son seleccionados de forma deseable entre
aquellos que incorporan una pequeña cadena lateral hidrofóbica, tal
como Ala, Gly y Val.
En realizaciones de la invención, la clase de
sustitución de los antagonistas de GLP-2 incluye:
[Gly^{2}, Ala^{33}]GLP-2,
[Ala^{11}]GLP-2,
[Ala^{15}]GLP-2(2-33),
[Ala^{35}]GLP-2(3-33),
[Ala^{35}]GLP-2(4-33),
[Ala^{25}]GLP-2(5-33),
[Gly^{2}, Ala^{22}]GLP-2, [Gly^{2},
Ala^{32}]GLP-2,
[Trp^{2}]GLP-2,
[PO_{3}-Tyr^{2}]GLP-2,
[Cys^{2}]GLP-2,
[Ala^{25}]GLP-2,
[Ala^{29}]GLP-2,
[Ala^{32}]GLP-2.
\vskip1.000000\baselineskip
Los presentes antagonistas del
GLP-2, aunque incorporan una alteración estructural
del tipo señalado, pueden tener varias secuencias de amino ácidos
consistentes con las secuencias de GLP-2 per
se o de los agonistas de GLP-2. Los
antagonistas de GLP-2 también pueden ser análogos de
agonistas de GLP-2 de vertebrados, en los que se
han hecho modificaciones colaterales para intensificar otras
propiedades bioquímicas, biológicas o fisiológicas del péptido.
Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo (en aquellos péptidos
para los que se confiere antagonismo por sustitución distinta de la
posición 2, la sustitución de Ala^{2} originario por un amino
ácido que da lugar al antagonista de GLP-2
resistente a la digestión por la enzima DPP-IV. Un
amino ácido adecuado para este objetivo incluye de forma particular
la Gly. También, el residuo de Met^{10} puede ser sustituido por
un amino ácido oxidativamente más estable, tal como Leu, Nle, Ile o
Ala. Dichos análogos sustituidos de Met^{10} son de acuerdo con
ello más estables durante la síntesis, aislamiento, y
almacenamiento. Otra modificación en este contexto es la
sustitución del amino ácido en la posición 20 por un amino ácido
distinto de Arg. En ciertas aplicaciones, particularmente para la
generación sintética de péptidos farmacéuticamente o
veterinariamente aceptables, esta modificación es deseable para
evitar la retención por el residuo de Arg de contrapones a partir
de disolventes tales como el TFA.
Dentro del alcance de la presente invención
también se encuentran moléculas en las que el N- o el C- terminal
han sido modificados para incorporar un grupo bloqueante del tipo
utilizado de forma convencional en el estado de la técnica de la
química de péptidos para proteger las terminaciones de péptidos de
un ataque bioquímico y de la degradación in vivo no
deseada.
Grupos protectores de
N-terminales adecuados incluyen, por ejemplo, grupos
alcanoilo de C_{1-5} tales como acetilo. También
son adecuados como grupos protectores de
N-terminales los análogos de amino ácidos a los que
les falta la función amino. Grupos protectores de
C-terminales adecuados incluyen grupos que forman
cetonas o amidas en el átomo de carbono del carboxilo del
C-terminal, o grupos que forman ésteres en el átomo
de oxígeno del carboxilo. Los grupos cetona y formadores de ésteres
incluyen grupos alquilo, particularmente grupos alquilo de
C_{1-5} ramificados o no ramificados, por ej.,
grupos metilo, etilo o propilo, mientras que los grupos formadores
de amida incluyen funciones amino tales como aminas primarias, o
funciones alquilamino, por ej., grupos
mono-alquilamino de C_{1-5} y
di-alquilamino de C_{1-5} tales
como metilamino, etilamina, dimetilamino, dietilamino,
metiletilamino y similares. Los análogos de amino ácidos son también
adecuados para la protección de la terminación del
C-terminal de los presentes compuestos, por ejemplo,
análogos de amino ácidos descarboxilados tales como agmatina.
Las realizaciones de la invención incluyen de
forma específica dichos análogos en los que el grupo bloqueador del
N-terminal es acetilo; y análogos en los que el
grupo bloqueador del C-terminal es una amina, por
ej., -NH_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Los presentes antagonistas de
GLP-2 pueden ser sintetizados utilizando técnicas
estándar de la química de péptidos y pueden ser valorados para
determinar la actividad antagonista del GLP-2, todo
ello de acuerdo con la guía que se proporciona en la presente
invención. Aquellos antagonistas de GLP-2 que
incorporan sólo L-amino ácidos pueden ser
producidos en cantidades comerciales por aplicación de tecnología de
DNA recombinante. Para este objetivo, la codificación de DNA para
el antagonista de GLP-2 deseado es incorporada en un
vector de expresión y transformada en un microbio, por ej.,
levadura, u otro huésped celular, que a continuación es cultivado
bajo condiciones apropiadas para la expresión del antagonista de
GLP-2. Se han adaptado una variedad de sistemas de
expresión de genes para este objetivo, y dirigido de forma típica la
expresión del gen deseado para la expresión de elementos
reguladores utilizados de forma natural para el huésped
seleccionado. Debido a que el GLP-2 no requiere
glicosilación post traduccional para su actividad, su producción
puede conseguirse de forma conveniente en los huéspedes bacterianos
tales como E. coli. Para dicha producción, la codificación
de DNA para el antagonista de GLP-2 seleccionado
puede situarse de forma útil bajo controles de expresión de los
genes del lac, trp o PL de la E. coli. como una alternativa a
la expresión de la codificación de DNA para el antagonista de
GLP-2 per se, el huésped puede ser adaptado
para expresar el antagonista de GLP-2 como una
proteína de fusión en la que el antagonista de GLP-2
está unido de forma liberable a una proteína de soporte que
facilita el aislamiento del producto de expresión.
En una aproximación universalmente aplicable a
la producción de antagonistas de GLP-2, y una
utilizada de forma necesaria para producir formas antagonistas del
GLP-2 que incorporan amino ácidos
no-genéticamente codificados y formas derivatizadas
N- y C- terminalmente, se utilizan técnicas bien establecidas de
síntesis de péptidos automatizadas, descripciones de las cuales
aparecen, por ejemplo, en J. M. Stewart y J. D. Young, Solid
Phase Peptide Synthesis, 2ª Edición, 1984, Pierce Chemical
Company, Rockford, Illinois; y en M. Bodanszky y A. Bodanszky,
The Practice of Peptide Synthesis, 1984,
Springer-Verlag, New York; Applied Biosystems 430A
Users Manual, 1987, ABI Inc., Foster City, California. En estas
técnicas, el antagonista de GLP-2 se hace crecer a
partir de su C-terminal, residuo conjugado de
resina por la adición secuencial de amino ácidos protegidos de forma
apropiada, utilizando tanto los protocolos Fmoc como tBoc, tal como
se ha descrito por ejemplo por Orskov y col., 1989,
supra.
Para la incorporación de grupos protectores de
N- y/o C- también pueden aplicarse protocolos convencionales para
la síntesis de péptidos en fase sólida. Para la incorporación de
grupos protectores de C-terminal, por ejemplo, se
lleva a cabo de forma típica la síntesis del péptido deseado
utilizando, como fase sólida, una resina de soporte que ha sido
químicamente modificada de modo que la rotura a partir de la resina
da lugar a un péptido que tiene el grupo protector
C-terminal deseado. Para proporcionar péptidos en
los que el C-terminal soporta un grupo protector de
amino primario, por ejemplo, la síntesis se lleva a cabo utilizando
una resina de p-metilbencilhidrilamina (MBHA) de
modo que, cuando la síntesis del péptido está completada, el
tratamiento con ácido fluorhídrico libera el péptido aminado en el
C-terminal deseado. De forma similar, la
incorporación de un grupo protector de N-metilamina
en el C-terminal se consigue utilizando resina de
DVB N-metilaminoetil-derivatizada,
que con el tratamiento con HF libera el péptido que soporta un
C-terminal N-metilamidado. La
protección del C-terminal por esterificación
también puede conseguirse utilizando procedimientos convencionales.
Esto supone el uso de la combinación del grupo bloqueador/resina
que permite la liberación del péptido con la cadena lateral
protegida a partir de la resina, para permitir la subsiguiente
reacción con el alcohol deseado, para formar la función éster. Los
grupos protectores FMOC, en combinación con la resina de DVB
derivatizada con alcohol metoxialcoxibencilo o un grupo de unión
equivalente, pueden ser utilizados para este objetivo, siendo
efectuada la rotura del soporte por TFA en diclorometano. La
esterificación de la función carboxilo activada, por ej., con DCC,
puede proceder entonces por adición del alcohol deseado, seguido por
desprotección y aislamiento del producto péptido esterificado.
La incorporación de los grupos protectores de
N-terminales puede ser conseguida aunque el péptido
sintetizado esté todavía unido a la resina, por ejemplo por
tratamiento con anhídrido y nitrilo adecuado. Para incorporar un
grupo protector de acetilo en el N-terminal, por
ejemplo, puede tratarse el péptido acoplado a la resina con
anhídrido acético al 20% en acetonitrilo. El producto péptido
protegido puede entonces ser separado de la resina, desprotegido y
aislado de forma subsiguiente.
Una vez se ha sintetizado la secuencia de
péptido, separada de la resina y completamente desprotegida, el
péptido es entonces purificado para asegurar la recuperación de un
simple oligopéptido teniendo la secuencia de amino ácidos
seleccionada. La purificación puede conseguirse utilizando
cualquiera de las aproximaciones estándar, que incluyen
cromatografía líquida de alta presión en fase reversa
(RP-HPLC) en columnas de gel de sílice alquilada,
por ej., gel de sílice de C_{4}-, C_{6}- o C_{16}. Dicho
fraccionamiento de columna está generalmente acompañado por
gradientes lineales de elusión, por ej., 10-90% de
un disolvente orgánico de % incrementado, por ej., acetonitrilo, en
tampón acuoso, conteniendo normalmente una pequeña cantidad (por
ej., 0,1%) de un agente de emparejamiento tal como TFA o TEA. De
forma alternativa, puede utilizarse la HPLC de intercambio iónico
para separar especies de péptidos sobre la base de sus
características de carga. Se recogen las fracciones de la columna,
y opcionalmente se agrupan aquellas que contienen el péptido de la
pureza deseada/requerida. En una realización de la invención, a
continuación se trata el péptido del modo establecido para
intercambiar el ácido liberado (por ej. TFA) con un ácido
farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, tal como acético,
clorhídrico, fosfórico, maleico, tartárico, succínico o similares,
para proporcionar una sal del péptido soluble en agua.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la presente invención, se tiene
la intención de administrar antagonistas de GLP-2
para tratar sujetos, incluyendo animales y humanos, que se
beneficiarían de una disminución de la velocidad de crecimiento del
tejido gastrointestinal. En un aspecto, los sujetos candidatos son
aquellos que se beneficiarían de una masa disminuida del tejido del
intestino delgado. Los efectos de los antagonistas de
GLP-2 en este tejido, tal como se ha evidenciado
por los resultados ejemplificados en la presente memoria, es
dramático y beneficiaría de forma clara a aquellos sujetos que
sufren de enfermedades o estados marcados por la hiperplasia en la
mucosa del intestino delgado, que incluye GLP-2 que
produce tumores. Otro grupo de sujetos que claramente se
beneficiarían de los efectos de los antagonistas de
GLP-2 son aquellos en los que sería útil inducir
hipoplasia del tejido del intestino delgado, por ejemplo, sujetos
que en un futuro próximo recibirían radioterapia o quimioterapia o
sujetos que están recibiendo radioterapia o quimioterapia. Las
células epiteliales del intestino delgado están caracterizadas por
una rápida división celular y de este modo son particularmente
susceptibles al daño por radioterapia o quimioterapia.
Efectivamente, el daño celular a las células epiteliales del
intestino delgado es la causa de una mortalidad y morbosidad
significativa en sujetos con cáncer sometidos a terapia. De este
modo, sería deseable disminuir la velocidad de crecimiento de estas
células inmediatamente antes de la iniciación de estas terapias y
durante el curso del tratamiento. La capacidad para disminuir la
velocidad de crecimiento de las células del intestino delgado en
estos sujetos, y conseguir así el descanso del intestino antes del
tratamiento con quimioterapia o radioterapia, tendría el beneficio
adicional de permitir dosis mayores de agentes radioterapéuticos y
quimioterapéuticos.
Otra situación clínica en donde un antagonista
funcional de GLP-2 sería de utilidad clínica es el
tratamiento de un sujeto, incluyendo un animal o un humano, el cual
ha sido sobre dosificado de forma crónica o aguda con
GLP-2 o un agonista de GLP-2.
Todavía otra aplicación potencial de los antagonistas funcionales de
GLP-2 es el bloquear el transporte de toxinas u
otros fármacos a través de la capa de la mucosa. Los efectos
patogénicos en algunas enfermedades surgen como un resultado de la
absorción de toxinas o fármacos a través del epitelio del
intestino. Puede ser beneficiosa la eliminación de la capacidad de
absorción del intestino delgado por reducción del epitelio
intestinal. Por ejemplo, algunas enfermedades tales como el cólera
son letales debido a que la toxina del cólera se une a receptores
en el propio epitelio intestinal, conduciendo a la deshidratación y
a la muerte. Los antagonistas del GLP-2 pueden
producir reposo del intestino, eliminado el tejido objetivo para la
toxina (epitelio intestinal) y con ello la respuesta patológica al
cólera.
Otro grupo de sujetos que también se
beneficiarían de una disminución en la masa del intestino delgado
son aquellos que sufren de obesidad, como una alternativa a la
intervención quirúrgica tal como la resección del intestino
delgado.
La eficacia terapéutica del tratamiento del
antagonista de GLP-2 puede ser monitorizada por
biopsia entérica para examinar la morfología de la vellosidad o por
valoración bioquímica de la absorción del nutriente. De forma
adicional, la eficacia puede ser valorada utilizando un relevante
punto final a la situación particular tratada, por ejemplo, pérdida
de peso. A los sujetos con cáncer de intestino delgado puede
administrarse antagonista de GLP-2 para disminuir
el tamaño del tumor. De forma alternativa, los sujetos con
trastornos de motilidad en el intestino, intestino irritable, y
diarrea crónica pueden beneficiarse del antagonista de
GLP-2 para incrementar la motilidad y/o reducir la
diarrea.
La invención abarca tanto la
co-administración del antagonista de
GLP-2 con un agente radioterapéutico o un agente
quimioterapéutico o la administración alternativa del antagonista de
GLP-2 de modo que se reduzca el crecimiento del
tejido del intestino delgado antes de la iniciación de la
radioterapia o la quimioterapia. Pueden determinarse los regímenes
de dosificación apropiada para los antagonistas de
GLP-2 por monitorización de la reducción
subsiguiente en el daño intestinal y/o el tiempo de recuperación
después de la radioterapia o la quimioterapia.
Otro uso para los antagonistas del
GLP-2 es como una terapia para la corrección de un
desequilibrio de fluidos debido a un problema de mala absorción a
través del intestino delgado. La eficacia del tratamiento del
antagonista de GLP-2 es monitorizada por valoración
del volumen de deposición, del volumen ICF y ECF, del volumen
urinario y de la osmolaridad, de la presión sanguínea, y de los
electrolitos en plasma.
Tal como se utiliza en la presente invención, el
término "sujeto" incluye un humano u otro mamífero, incluyendo
ganado y mascotas.
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Para la administración a sujetos, incluyendo
humanos y animales, se proporcionan antagonistas de
GLP-2, en un aspecto de la invención, en forma
farmacéuticamente o veterinariamente aceptable (por ej., como una
preparación que es filtrada de forma estéril, por ej., a través de
un filtro de 0,22 \mu) y sustancialmente libre de pirógenos. De
forma deseable, el antagonista de GLP-2 a formular
migra como un pico único o individualizado en HPLC, muestra con su
análisis una composición y secuencia de amino ácidos uniforme y
auténtica, y de otro modo cumple con los estándares establecidos
para los diferentes cuerpos nacionales que regulan la calidad de
los productos farmacéuticos o veterinarios.
Para uso terapéutico, el antagonista de
GLP-2 seleccionado es formulado con un soporte que
sea farmacéuticamente o veterinariamente aceptable y sea apropiado
para la liberación del péptido por la vía de administración
seleccionada. Los soportes farmacéuticamente o veterinariamente
adecuados son aquellos que son utilizados de forma convencional con
los fármacos basados en péptidos, tales como diluyentes, excipientes
y similares. Puede hacerse referencia al "Remington's
Pharmaceutical Sciences", 17ª Ed., Mack Publishing Company,
Easton, Penn., 1985, para guía sobre formulaciones de fármacos en
general. En una realización de la invención, los compuestos son
formulados para la administración por infusión o por inyección,
tanto de forma sub-cutánea como intravenosa, y son
utilizados de acuerdo con ello como soluciones acuosas en forma
estéril y libre de pirógenos y opcionalmente tamponados hasta una
ligera acidez o pH fisiológico. De este modo, los compuestos pueden
ser administrados en agua destilada o, de forma más deseable, en
solución salina, solución salina tamponada o solución de dextrosa al
5%. La solubilidad en agua puede ser intensificada, en el caso en
que se desee, por incorporación de un intensificador de solubilidad,
tal como ácido acético.
El soporte acuoso o vehículo puede ser
suplementado para uso como inyectables con una cantidad de gelatina
que sirve para depositar el antagonista de GLP-2 en
o cerca del sitio de la inyección, para su liberación lenta al
sitio de acción deseado. Las concentraciones de gelatina efectivas
para conseguir el efecto de deposición se espera que se encuentren
situadas en el intervalo de entre 10-20%. También
pueden ser útiles, como agentes de deposición, agentes gelificantes
alternativos, tales como ácido hialurónico.
Los antagonistas de GLP-2 de la
invención también pueden ser formulados como un dispositivo de
implantación de liberación lenta para la administración extendida y
sostenida del antagonista de GLP-2. Ejemplos de
dichas formulaciones de liberación sostenida incluyen composiciones
de polímeros biocompatibles, tales como poli(ácido láctico),
poli(ácido láctico-co-glicólico),
metilcelulosa, ácido hialurónico, colágeno, y similares. La
estructura, selección y uso de polímeros degradables en los
vehículos de liberación de fármaco han sido revisados en varias
publicaciones, incluyendo, A. Domb y col., Polymers for Advanced
Technologies 3: 279-292 (1992). Puede
encontrarse una guía adicional en la selección y utilización de
polímeros en las formulaciones farmacéuticas o veterinarias en el
texto de M. Chasin y R. Langer (eds.), "Biodegradable Polymers as
Drug Delivery Sciences", M. Dekker, New York, 1990. Los
liposomas también pueden ser utilizados para proporcionar la
liberación sostenida de un antagonista de GLP-2.
Los detalles referentes a cómo utilizar y preparar formulaciones en
liposomas de fármacos de interés puede encontrarse en, entre otros,
en las patentes U. S. No. 4.944.948; U. S. No. 5.008.050; U. S. No.
4.921.706; U. S. No. 4.927.637; U. S. No. 4.452.747; U. S. No.
4.016.100; U. S. No. 4.311.712; U. S. No. 4.370.349; U. S. No.
4.372.949; U. S. No. 4.529.561; U. S. No. 5.009.956; U. S. No.
4.725.442; U. S. No. 4.737.323; U. S. No. 4.920.016. Las
formulaciones de liberación sostenida son de particular interés
cuando es deseable proporcionar una elevada concentración de un
antagonista de GLP-2 o unos niveles de circulación
prolongados.
El antagonista de GLP-2 puede
ser utilizado en la forma de un vial o ampolla llenados de forma
estéril, que contenga una cantidad del péptido efectiva para
antagonizar la actividad del GLP-2 endógena, tanto
en dosis unitarias como en cantidades multi-dosis.
El vial o la ampolla pueden contener el antagonista de
GLP-2 y el soporte deseado, como una formulación
lista para la administración. De forma alternativa, el vial o
ampolla puede contener el péptido de GLP-2 en una
forma, tal como una forma liofilizada, adecuada para la
reconstitución en un soporte adecuado, tal como solución salina
tamponada con fosfato.
Como formulaciones inyectables alternativas, el
antagonista de GLP-2 puede ser formulado para
administración por otras vías. Las formas de dosis orales, tales
como comprimidos, cápsulas y similares, pueden ser formuladas de
acuerdo con la práctica farmacéutica y veterinaria estándar.
Finalmente, la liberación crónica del
antagonista de GLP-2 para la pérdida de peso y otras
indicaciones terapéuticas puede conseguirse mediante técnicas de
terapia génica. Por ejemplo, las células pueden ser modificadas por
ingeniería genética ex vivo para expresar altos niveles del
antagonista de GLP-2, y a continuación dichas
células pueden ser implantadas en el animal o humano objeto para
determinar la eficacia terapéutica.
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El régimen y las dosis terapéuticas más
apropiadas para el tratamiento, variarán, naturalmente, con la
enfermedad o estado a tratar, y de acuerdo con el peso del sujeto y
otros parámetros. Los resultados presentados en la presente memoria
a continuación demuestran que una dosis del antagonista de
GLP-2 equivalente a aproximadamente entre 1 mg/kg y
100 \mug/kg (o menos) administrada dos veces al día durante 10
días puede generar una disminución muy significativa en la masa del
intestino delgado. Es de esperar que dosis mucho menores, por ej.,
del orden del \mug/kg, y una menor o mayor duración o frecuencia
del tratamiento, también producirán resultados terapéuticamente
útiles, es decir, una disminución estadísticamente significativa en
la masa del intestino delgado. Los tamaños de las dosis y del
régimen de dosificación más apropiados para uso humano están guiados
por los resultados presentados en la presente memoria, y pueden ser
confirmados en ensayos clínicos diseñados de forma adecuada.
Puede determinarse una dosis y un protocolo de
tratamiento efectivo por los medios convencionales, empezando con
una dosis baja en animales de laboratorio e incrementando a
continuación la dosis mientras se monitorizan los efectos, y
variando también de forma sistemática el régimen de dosis. Pueden
tenerse en cuenta numerosos factores por un clínico cuando se
determina una dosis óptima para un sujeto dado. Entre éstas está la
cantidad de GLP-2 que normalmente circula en
plasma, que es del orden de 151 pmol/ml en el estado de reposo,
aumentando hasta 225 pmol/ml después de la ingestión de nutrientes
para humanos adultos sanos (C. Orskov y J. J. Holst, 1987, Scand.
J. Clin. Lav. Invest. 47: 165). Factores adicionales incluyen el
tamaño del sujeto, la edad del sujeto, el estado general del
sujeto, la enfermedad particular a tratar, la severidad de la
enfermedad, la presencia de otros fármacos en el sujeto, la
actividad in vivo del antagonista de GLP-2 y
similares. Las dosis de ensayo se seleccionarán después de tener en
cuenta los resultados de los estudios en animales y la literatura
clínica. Será bien apreciado por el experto en la materia que
información tal como las constantes de unión y la Ki derivada de
los ensayos de competencia de unión del GLP-2 in
vitro también pueden ser utilizados en el cálculo de las dosis,
así como la vida media calculada del antagonista de
GLP-2 in vivo.
Una dosis para humano típica de un antagonista
de GLP-2 estaría comprendida entre aproximadamente
10 \mug/kg de peso corporal/día hasta aproximadamente 10
mg/kg/día, preferiblemente entre aproximadamente 50 \mug/kg/día
hasta aproximadamente 5 mg/kg/día, y más preferiblemente
aproximadamente 100 \mug/kg/día hasta 1 mg/kg/día. Tal como es de
esperar los antagonistas de GLP-2 de la invención
podrían ser entre 10 e incluso 100 veces más potentes que el
GLP-2, una dosis típica de dicho antagonista de
GLP-2 puede ser menor, por ejemplo, entre
aproximadamente 100 ng/kg peso corporal/día y 1 mg/kg/día
preferiblemente 1 \mug/kg/día hasta 500 \mug/kg/día, e incluso
más preferiblemente 1 \mug/kg/día hasta 100 \mug/kg/día.
Los siguientes ejemplos describen péptidos de
acuerdo con la presente invención y otros péptidos para objetivos
de referencia.
Ejemplo
1
Se sintetizaron los siguientes péptidos
antagonistas de GLP-2:
[Gly^{2},
Ala^{15}]GLP-2; [Gly^{2},
Ala^{22}]GLP-2; [Gly^{2},
Ala^{29}]GLP-2; [Gly^{2},
Ala^{32}]GLP-2; [Gly^{2},
Ala^{33}]GLP-2;
ratGLP-2(2-33);
ratGLP-2(3-33);
ratGLP-2(4-33);
ratGLP-2(5-3);
[Leu^{2}]GLP-2;
[Glu^{2}]GLP-2;
[Arg^{2}]GLP-2;
[Trp^{2}]GLP-2;
[Cys^{2}]GLP-2;
[PO_{3}-Tyr^{2}]GLP-2; y
[Phg^{2}]GLP-2.
Se llevó a cabo la síntesis de péptidos en fase
sólida (SPPS) de forma manual en un recipiente de 300 mililitros
(ml) en una escala 3 milimolar (mmol) utilizando 6 gramos (g) de
resina de clorometilo (Merrifield) (para los péptidos de ácido
libre del C-terminal) con una sustitución de 0,5
miliequivalentes (meq) por gramo. Se protegieron los amino ácidos
con el grupo t-butiloxicarbonilo (tBoc). Se
protegieron las cadenas laterales de los amino ácidos
trifuncionalizados con los grupos bencilo (Bz, para la serina y la
treonina), benciloximetilo (BOM, para la histidina),
2-bromobenciloxicarbonilo (2-BrZ,
para la tirosina), 2-clorobenciloxicarbonilo
(2-ClZ, para la lisina), ciclohexilo (cHex, para
los ácidos aspártico y glutámico), y tosilo (Tos, para arginina).
El primer amino ácido se acopló a la resina de clorometilo mediante
esterificación del amino ácido protegido en presencia de fluoruro
de potasio (KF). Se sintetizaron los péptidos con amida en el
C-terminal en una resina de
4-metilbencilhidrilamina (MBHA) en una escala de 3
mmol utilizando 6 g de resina con una sustitución de 0,5 meg/g. El
primer amino ácido se acopló a la resina de MBHA de acuerdo con el
procedimiento descrito para la elongación de péptidos.
La desprotección del grupo amino se llevó a cabo
utilizando ácido trifluoroacético al 50% (TFA) en diclorometano
(CH_{2}Cl_{2}), seguido por neutralización utilizando dos
lavados del 10% de trietilamina (Et_{3}N) en CH_{2}Cl_{2}. Se
llevó a cabo la elongación de péptidos utilizando la activación de
N,N-diciclohexilcarbodiimida/1-hidroxibenzotriazol
(DCC/HOBt) en CH_{2}Cl_{2}/dimetilformamida (DMF). La cadena de
péptido en crecimiento fue acabada después de cada etapa de
elongación con Ac_{2}O del 20% en CH_{2}Cl_{2}. Se lavó la
resina con el péptido después de cada etapa de elongación,
terminación y desprotección con isopropanol (iPrOH) y metanol
(MeOH). Se repitieron los lavados una vez. Se prepararon los
péptidos con acetil en el N-terminal por acetilación
del grupo amino terminal con Ac_{2}O del 20% en
CH_{2}Cl_{2}.después de desprotección y neutralización tal como
se ha descrito. Se separaron los productos unidos a la resina de
forma rutinaria mediante un procedimiento bajo-alto
utilizando fluoruro de hidrógeno (HF) conteniendo dimetilsulfóxido
(DMS) y p-cresol como captadores.
Los péptidos en forma de crudo se purificaron
por cromatografía líquida de alta presión (HPLC) utilizando una
columna de gel de sílice de fase reversa Vydac de C18, de un tamaño
de poro de 15-20 \mum, 2 pulgadas x 12 pulgadas,
utilizando una elusión de gradiente con TFA del 0,1% en agua
modificada con acetonitrilo. Se monitorizó la elusión a 220
nanómetros (nm). Se analizó cada fracción recogida para determinar
la pureza por HPLC analítica utilizando una columna de gel de
sílice de fase reversa Vydac de C18, de 5 \mum, 4,6 x 254
milímetros (mm), utilizando una elusión de gradiente con TFA del
0,1% en agua modificada con acetonitrilo, y monitorizada a 215 nm.
Las fracciones que demostraron una pureza mayor del 95% se
combinaron y liofilizaron. Se prepararon las sales de acetato de
los péptidos a partir de las sales de TFA por disolución del polvo
liofilizado en agua, con adición de acetonitrilo para ayudar a la
disolución en el caso en que fuera necesario. Se pasó la solución a
través de una resina de intercambio catiónico protonada
Bio-Rex-70. Se lavó la resina con 5
volúmenes de agua, y se eluyó el péptido unido a la resina con ácido
acético al 50% en agua. Se diluyó el eluyente con agua y se
liofilizó.
Se analizó el polvo liofilizado final para
determinar la pureza por dos métodos analíticos de HPLC de fase
reversa utilizando una columna de gel de sílice de fase reversa
Vydac de C18, columna de gel de sílice de fase reversa Vydac de
C18, de 5 \mum, 4,6 x 254 milímetros (mm). Se utilizaron dos
sistemas de disolventes: un gradiente de agua ajustada a pH 2,25
con fosfato de trietilamina, modificado con acetonitrilo; y un
gradiente de TFA al 0,1% en agua, modificado con acetonitrilo. Se
monitorizó el eluyente de la columna a 215 nm. Se confirmó la
identidad de cada producto por análisis de amino ácidos y por
espectroscopia de electrocopia de masas.
A continuación se los antagonistas de
GLP-2 fueron formulados tal como se describe a
continuación en el Ejemplo 2. Cada uno de los antagonistas del
GLP-2 fue totalmente soluble en agua a temperatura
ambiente a no ser que se indicara de otro modo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se formularon los antagonistas de
GLP-2 para inyección tanto en solución salina
tamponada con fosfato como en forma de una formulación depot
conteniendo gelatina. Para las preparaciones de antagonistas de
GLP-2 formuladas con PBS, se preparó en primer
lugar una solución de PBS de reserva 10 x, utilizando 80 g de NaCl
(BDH ACS 783), 2 g de KCl (BDH ACS 645), 11,5 g de
Na_{2}HPO_{4} (Anachemia AC-8460), y 2 g de
KH_{2}PO_{4} (Malinckrodt AR7100), que se llevó a un volumen
total de un litro con agua destilada estéril. La solución de
trabajo final se obtuvo por dilución 10:1 de la solución de reserva
con agua destilada estéril y se ajustó a un pH de
7,3-7,4 en el caso en que fuera necesario,
utilizando volúmenes suficientes de NaOH 10N. A continuación se
trató en autoclave la solución de trabajo durante 30 minutos. En la
solución de PBS de trabajo final, las concentraciones fueron 137 mM
de NaCl, 2,7 mM de KCl, 4,3 mM de Na_{2}HPO_{4}. 7H_{2}O, y
1,4 mM de KH_{2}PO_{4}.
Se añadieron a la solución de PBS de trabajo los
antagonistas de GLP-2, e forma de un péptido en
polvo, tal como era necesario para generar formulaciones que
tuvieran las concentraciones de péptidos necesarias. Por ejemplo,
para generar una solución de PBS del antagonista de
GLP-2 a 130 mg/l, se disolvieron 5,2 mg del
antagonista de GLP-2 en 40 ml de PBS para dar lugar
a una concentración de antagonista de GLP-2 de 130
\mug/ml, y se filtro de forma esterilizada. Se inyectaron 0,5 ml
de la solución del antagonista de GLP-2 dos veces al
día.
Para generar las formulaciones de antagonista de
GLP-2 con una base de gelatina, se preparó en primer
lugar una solución de gelatina por disolución de 12 gramos de
gelatina (Sigma, G-8150 Lote #54H07241 de Tipo A de
piel de porcino [9000-70-8] \sim
300 Bloom) en 100 ml de agua destilada. A continuación se trató en
el autoclave la solución de gelatina, se calentó a 37ºC, y se
añadió el antagonista de GLP-2 previamente disuelto
en solución salina tamponada con fosfato tal como se ha descrito
anteriormente para conseguir las concentraciones de péptido
específicas, deseadas. Por ejemplo, para generar una solución de PBS
con una base de gelatina del antagonista de GLP-2 a
una concentración de 130 mg/l, se diluyó 10 ml de una solución de
PBS preparado con 5,2 mg del antagonista de GLP-2
con 30 ml de la solución de gelatina de trabajo al 20% tal como se
ha descrito anteriormente. Se mezcló la solución con un suave
pipeteo, para rendir una solución final de 130 mg/l del antagonista
de GLP-2 en PBS/gelatina al 15%.
Ejemplo
3
Se ensayaron los siguientes péptidos para
determinar la resistencia a la dipeptidil peptidasa IV
(DPP-IV): un péptido control,
ratGLP-2; el agonista de
[D-Ala^{2}ratGLP-2; y el agonista
[Gly^{2}]ratGLP-2. de forma adicional,
también se ensayaron los siguientes péptidos para determinar la
resistencia a la DPP-IV: [Gly^{2},
Ala^{15}]GLP-2, [Gly^{2},
Ala^{22}]GLP-2, [Gly^{2},
Ala^{29}]GLP-2, [Gly^{2},
Ala^{32}]GLP-2, [Gly^{2},
Ala^{33}]GLP-2,
[Leu^{2}]GLP-2,
[Glu^{2}]GLP-2,
[Arg^{2}]GLP-2,
[Trp^{2}]GLP-2,
[PO_{3}-Tyr^{2}]GLP-2, y
[Cys^{2}]GLP-2. Para realizar el ensayo, se
añadieron 2,5 microlitros (\mul) de una solución de
DPP-IV de placenta humana (Calbiochem, La Jolla,
CA, cat. # 317624) conteniendo 0,125 miliunidades (mU) de enzima en
glicerol al 50%, 10 mM de Tris, pH 7,8, EDTA y 0,02% de NaN_{3}
sobre 50 \mul de una solución del péptido de ensayo preparado a
una concentración de 0,2 mg/ml en PBS a pH 7,4. Se incubó la mezcla
a 37ºC en un baño de agua circulante durante 24 horas. Se finalizó
la incubación por adición de 50 \mul de una solución del péptido
del ensayo preparado a una concentración de 0,2 mg/ml en PBS a pH
7,4. Se incubó la mezcla a 37ºC en un baño de agua circulante
durante 24 horas. Se finalizó la incubación mediante la adición de
50 \mul de una solución de diprotina A preparada a una
concentración de 4 mg/ml en PBS. Se ensayó cada péptido por
duplicado.
Se analizó cada muestra por HPLC de fase reversa
(RP) del modo siguiente: se inyectaron 90 \mul de la mezcla de
incubación finalizada en una columna Rainin Dynamax de 300
\ring{A}, de C18, de 5 micras, de 4,6 x 250 milímetros. Se
eluyeron las muestras con ácido trifluoroacético del 0,1% (TFA) en
agua modificada con acetonitrilo al 0,1% utilizando un gradiente
lineal y una velocidad de flujo de 1 ml por minuto. Se detectaron
los componentes de la muestra a 214 nm (nm). Se midió la extensión
de la separación por la integración relativa del pico
correspondiente al producto separado en comparación con la restante
del péptido de referencia no digerido. Se confirmó que el producto
separado del péptido control,
ratGLP-2(1-33), que debería
ser ratGLP-2(3-33) era el
resultado de la rotura entre los residuos Ala^{2} y Asp^{2} por
comparación del tiempo de retención de este componente con respecto
al del péptido sintético estándar,
ratGLP-2(3-33), y por
recogida del producto de la HPLC y análisis por espectrometría de
masas.
Después de 24 horas de incubación, se separaron
un 22% del péptido control, ratGLP-2. No se
detectaron productos de no separación para los péptidos
[D-Ala^{22}]ratGLP-2,
[Gly^{2}]ratGLP-2, [Gly^{2},
Ala^{15}]GLP-2, [Gly^{2},
Ala^{22}]GLP-2, [Gly^{2},
Ala^{29}]GLP-2, [Gly^{2},
Ala^{32}]GLP-2, [Gly^{2},
Ala^{33}]GLP-2,
[Leu^{2}]GLP-2,
[Glu^{2}]GLP-2,
[Arg^{2}]GLP-2,
[Trp^{2}]GLP-2,
[PO_{3}-Tyr^{2}]GLP-2, y
[Cys^{2}]GLP-2 después de 24 horas.
Ejemplo
4
Los receptores fueron ratones CD1 obtenidos de
Charles River Laboratory (Ontario, Canadá). Los ratones CD1 fueron
hembras de edades adecuadas en el momento de la inyección (n =
3-4 por grupo), de 6 semanas de edad, a no ser que
se especifique de otro modo. Se dejaron los animales un mínimo de 24
horas para que se aclimataran a las instalaciones del laboratorio
antes del inicio de cada experimento. Los animales se identificaron
por pinzas en las orejas. No se restringió ni la dieta ni la
actividad a los ratones durante los experimentos. El ciclo de
luz/oscuridad fue de 12 horas, entre las 6 pm y las 6 am. Los
animales controles fueron de la misma edad y sexo (n =
3-4 animales). Se inyectó a los ratones de forma
subcutánea, dos veces al día (b.i.d.) con 2,5 \mug de péptido en
un volumen total de 0,5 cc de PBS y se monitorizó de forma diaria en
las instalaciones del laboratorio. Se sacrificaron los animales
entre 10 y 14 días después de la inyección, y se mantuvieron en
ayunas al menos 20 horas antes de su sacrificio.
Se anestesiaron los ratones con CO_{2} y se
ex-sanguinaron por punción cardiaca. Se recogió la
sangre en 75 \mul de TED (Trasysol; EDTA (5000 KIU/ml: 1,2 mg/ml;
Diprotin-A), y se centrifugó la sangre a 14 k x g
durante 5 minutos y se almacenó el plasma a -70 antes del análisis.
Se separó el intestino delgado de la cavidad peritoneal, desde el
piloro hasta el ceco, se limpió, se pesó y se midió. Para el
objetivo comparativo, se obtuvieron secciones de cada animal a
partir de la posición anatómica idéntica. Se obtuvieron los
fragmentos con una medida cada uno de ellos de 1,5- 2,0 cm de
longitud de 8 \pm 2 cm, 18 \pm 2 cm, 32 \pm 2 cm desde el
piloro par histomorfometría representando el yeyuno próximo, el
yeyuno distal y el íleo distal. Cada fragmento del intestino
delgado se abrió de forma longitudinal en su borde antimesentérico
en un bloque de tejido y a continuación se colocó en formalina al
10% (vol./vol.) toda la noche, y a continuación se transfirió a EtOH
al 70%.
Se calculó el cambio de porcentaje en el peso
del intestino delgado por división del cambio promedio en el peso
de intestino del ratón tratado con el antagonista, en relación con
el ratón tratado con sólo vehículo, por el peso promedio del
intestino del ratón tratado con sólo vehículo, y multiplicando este
número por 100.
Estos resultados establecen que los antagonistas
del GLP-2 humano que contienen sustituciones de los
residuos conservados en las posiciones 15, 29, 32 o 33 con un
residuo de alanina causarán realmente una disminución en el
peso del intestino delgado cuando se inyecten en ratones. En
contraste, los análogos del GLP-2 humano que
contienen un residuo de tipo salvaje en estas posiciones (pero que
contienen la sustitución Gly^{2}) incrementarán en peso
del intestino delgado cuando se inyecten en ratones utilizando un
protocolo experimental idéntico (los datos no se muestran). Por
consiguiente, concluimos que la sustitución de los residuos en las
posiciones 15, 29, 32, o 33 interrumpen parcialmente la actividad
funcional del GLP-2 y dan lugar a un antagonista de
GLP-2.
De forma adicional, estos datos también muestran
el resultado extremadamente sorprendente de que las sustituciones
de la posición Ala^{2} con un residuo amino ácido diferente de
Gly, de forma específica Leu, Glu, Arg, Trp, Cys,
PO_{3}-Tyr, y Phg, dará lugar a la actividad
antagonística.
Ejemplo
5
Se disolvieron el antagonista del péptido
candidato y rat GLP-2 en PBS para dar una relación
final de 25 \mug de antagonista/2,5 \mug de
GLP-2 por 0,5 ml de solución salina tamponada con
fosfato (para una relación 10:1), o 12,5 \mug de antagonista/2,5
\mug de GLP-2 por 0,5 ml de solución salina
tamponada con fosfato (para una relación 4:1), tal como se ha
indicado. Se administró la mezcla antagonista/GLP-2
a ratones hembras CD1 de 6-8 semanas de edad, de
forma subcutánea, siendo la cantidad de péptido inyectada de 25
\mug de antagonista/ 2,5 \mug de GLP-2 en 0,5
ml dos veces al día, o de 12,5 \mug de antagonista/ 2,5 \mug de
GLP-2 en 0,5 ml dos veces al día. Después de
10-14 días, se sacrificaron los ratones a los que se
inyectó el péptido y los ratones control (a los que se inyectó
solución salina), y se determinaron los pesos de los intestinos
delgados.
Estos resultados ilustran que las eliminaciones
de los primeros uno a cuatro residuos de GLP-2 dan
lugar a un antagonista que antagonizará la actividad
intestinotrófica del rat GLP-2 cuando se
co-inyecte en ratones experimentales. Estos
resultados son significativos por al menos dos razones. Primero,
estos datos revelan que el terminal del extremo amino de los
péptidos de GLP-2 está implicado en el efecto
intestinotrófico del GLP-2. Por consiguiente, otras
alteraciones que interrumpan este terminal, por ejemplo, las
sustituciones de amino ácidos con propiedades opuestas, en lugar de
eliminaciones, probablemente también transmitirán actividad
antagonística al análogo resultante. En segundo lugar, la
co-administración del antagonista y del
GLP-2 servirá para disminuir o incluso eliminar el
efecto intestinotrófico del GLP-2. Por consiguiente,
los antagonistas de GLP-2 pueden ser administrados
a un sujeto en situaciones en las que se produzca el exceso de
producción de GLP-2, por ejemplo, un sujeto con un
tumor que segregue GLP-2 y/o responda de forma
trófica al péptido de GLP-2.
Claims (22)
1. Un polipéptido análogo de un péptido de
GLP-2 de mamífero, en donde el análogo inhiba la
actividad intestinotrófica del péptido de GLP-2,
comprendiendo una secuencia de amino ácidos que consista en un
GLP-2 de mamífero de referencia e incorpore, en
relación al péptido de GLP-2, una o más mutaciones
estructurales seleccionadas entre (i) la eliminación de uno a
cuatro de cualquiera de los primeros cuatro residuos
N-terminales del péptido de GLP-2,
(ii) sustitución de al menos un amino ácido que se encuentre en el
péptido de GLP-2 en una posición seleccionada entre
Asp^{15}, Thr^{29} y Thr^{32} con un amino ácido que no se
encuentre de forma natural en la posición en el
GLP-2 de referencia; y (iii) sustitución del
Ala^{2} en el péptido de GLP-2 con un amino
ácido seleccionado entre el grupo que consiste en Cys, Trp, y
PO_{3}-Tyr^{2}.
2. El polipéptido tal como se ha definido en la
reivindicación 1, en donde el GLP-2 de mamífero de
referencia esté seleccionado entre el grupo que consiste en
GLP-2 humano, degu GLP-2, ox
GLP-2, GLP-2 de porcino,
GLP-2 de cobaya y GLP-2 de
hámster.
3. El polipéptido tal como se ha definido en la
reivindicación 1 o 2, en donde el GLP-2 de mamífero
de referencia es el GLP-2 humano.
4. El polipéptido tal como se ha definido en
cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3, de modo que dicho
péptido tenga una sustitución en una posición seleccionada entre el
grupo que consiste en Asp^{15}, Thr^{29} y Thr^{32}, con un
amino ácido que no se encuentre de forma natural en dicha posición
en el GLP-2 de referencia.
5. El polipéptido tal como se ha definido en
cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3, de modo que dicho
péptido esté seleccionado entre el grupo que consiste en
[Trp^{2}]GLP-2,
[PO_{3}-Tyr^{2}]GLP-2, y
[Cys^{2}]GLP-2.
6. El polipéptido tal como se ha definido en
cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3 que es
GLP-2 (2-33).
7. El polipéptido tal como se ha definido en
cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3 que es
GLP-2 (3-33).
8. El polipéptido tal como se ha definido en
cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3 que es
GLP-2 (4-33).
9. El polipéptido tal como se ha definido en
cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3 que es
GLP-2 (5-33).
10. El polipéptido tal como se ha definido en
cualquiera de las reivindicaciones 1-4, cuyo péptido
comprende además una o más sustituciones seleccionadas entre el
grupo que consiste en: (i) sustitución de Ala^{2} con Val, Gly, o
D-Ala; (ii) sustitución de Met^{10} con Leu, Ile,
Nle, o Ala; (iii) un grupo del bloqueo del amino terminal; y (iv)
un grupo de bloqueo del terminal carboxi.
11. El polipéptido tal como se ha definido en la
reivindicación 10, seleccionado entre el grupo que consiste en:
[Gly^{2}, Ala^{15}]GLP-2; [Gly^{2},
Ala^{22}]GLP-2; [Gly^{2},
Ala^{29}]GLP-2; [Gly^{2},
Ala^{32}]GLP-2; y [Gly^{2},
Ala^{33}]GLP-2.
12. Una composición farmacéutica que comprende
una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, y un
soporte farmacéuticamente aceptable.
13. Uso del polipéptido de cualquiera de las
reivindicaciones 1-11 en la fabricación de un
medicamento para el tratamiento del cáncer del intestino delgado,
un trastorno de motilidad del intestino, síndrome del intestino
irritable, diarrea crónica, u obesidad clínica en un sujeto.
14. uso del polipéptido de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-11 en la
fabricación de un medicamento para la reducción de la hiperplasia o
la inducción de la hipoplasia del intestino delgado en un
sujeto.
15. Uso de acuerdo con la reivindicación 14 en
donde el sujeto está sufriendo de obesidad o un sujeto que requiera
reposo del intestino antes del tratamiento con quimioterapia o
radioterapia.
16. Uso del polipéptido de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-11 en la
fabricación de un medicamento para la mejora de un efecto
patológico o síndrome de una enfermedad gastrointestinal.
17. Uso de acuerdo con la reivindicación 16 en
donde la enfermedad gastrointestinal está seleccionada entre el
grupo que consiste en cáncer del intestino delgado, cólera,
intestino irritable, trastornos de motilidad del intestino y
diarrea crónica.
18. Un método de identificar un antagonista de
GLP-2 que comprende las etapas de:
- (1)
- obtener un análogo de GLP-2 que difiera de un GLP-2 de mamífero de referencia por tener una alteración estructural seleccionada entre (i) una eliminación de al menos un amino ácido, y (ii) una sustitución de al menos una posición de amino ácido con un amino ácido que no se encuentre de forma natural en dicha posición, y (iii) una combinación de (i) y (ii);
- (2)
- tratar un mamífero con dicho análogo utilizando un régimen capaz de obtener una disminución en el peso del intestino delgado; y
- (3)
- determinar el efecto de dicho análogo en el peso del intestino delgado en relación a un mamífero de control que reciba sólo vehículo, en donde dicho antagonista funcional de GLP-2 esté identificado como un análogo que obtenga una disminución en dicho peso del intestino delgado.
19. Un método de identificar un antagonista de
GLP-2 que comprenda las etapas de:
- (1)
- obtener un análogo de GLP-2 que difiera de un GLP-2 de mamífero de referencia por tener una alteración estructural seleccionada entre (i) una eliminación de al menos un amino ácido, y (ii) una sustitución de al menos una posición de amino ácido con un amino ácido que no se encuentre de forma natural en dicha posición, y (iii) una combinación de (i) y (ii);
- (2)
- tratar un mamífero con dicho análogo utilizando co-administrado con GLP-2 o un análogo intestinotrófico de GLP-2, utilizando un régimen capaz de obtener una reducción en el incremento de peso del intestino delgado observado cuando el GLP-2 es administrado solo; y
- (3)
- determinar el efecto de dicho análogo en el peso del intestino delgado en relación a un animal de control, que reciba sólo GLP-2 o un análogo intestinotrófico de GLP-2 solo, en donde dicho antagonista funcional esté identificado como un análogo que obtenga una reducción en el incremento en dicho peso del intestino.
20. El método tal como se ha definido en la
reivindicación 18 o 19, en donde la alteración estructural del
análogo de GLP-2 sea una eliminación de entre uno y
cuatro de cualquiera de los primeros cuatro residuos
N-terminales.
21. El método tal como se ha definido en la
reivindicación 18 o 19, en donde la alteración estructural del
análogo de GLP-2 sea una sustitución en una posición
seleccionada entre Asp^{15}, Phe^{22}, Thr^{29}, Thr^{32} y
Asp^{33}.
22. Una célula huésped transformada con una
construcción de expresión de polinucleótido que codifique un
polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1-11.
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2002
- 2002-11-18 US US10/295,820 patent/US20030109449A1/en not_active Abandoned
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