ES2690943T3

ES2690943T3 - Anticuerpos monoclonales contra la progastrina y sus utilizaciones

Info

Publication number: ES2690943T3
Application number: ES10768878.0T
Authority: ES
Inventors: Julie Pannequin; Laure Boudier; Dominique Joubert; Frédéric HOLLANDE
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Progastrine et Cancers SARL
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Progastrine et Cancers SARL
Priority date: 2009-10-16
Filing date: 2010-10-15
Publication date: 2018-11-23
Anticipated expiration: 2030-10-15
Also published as: GT201200114A; EP3421493C0; HN2012000708A; KR20150082672A; TW201119675A; JP6272793B2; JP2017212992A; GEP201706604B; JP5985987B2; US20170306012A1; PT2488551T; CN102791735A; SMT201800628T1; CU24196B1; LT2488551T; HK1178183A1; IL254004A0; EP2488551B1; US20200002413A1; PH12012500711B1

Abstract

Anticuerpo monoclonal anti-hPG que se une específicamente a una región C-terminal de la progastrina humana (hPG), que comprende las CDR de VH y VL siguientes: VH CDR1 de SEC ID nº: 37, VH CDR2 de SEC ID nº: 41, VH CDR3 de SEC ID nº: 45, VL CDR1 de SEC ID nº: 49, VL CDR2 de SEC ID nº: 52, y VL CDR3 de SEC ID nº: 55.

Description

Anticuerpos monoclonales contra la progastrina y sus utilizaciones.

1. Campo de la invención

La presente divulgación se refiere, entre otras cosas, a anticuerpos monoclonales contra la progastrina, a composiciones y métodos para preparar dichos anticuerpos y a métodos para utilizar dichos anticuerpos, por ejemplo en el diagnóstico y/o el tratamiento del cáncer colorrectal.

2. Antecedentes

El cáncer colorrectal (CRC) es un problema de salud pública importante, que afecta a más de 1000000 de personas cada año y que es responsable de más de 500000 muertes cada año. El CRC es la segunda causa principal de muerte debida al cáncer. En los Estados Unidos sólo, para 2009, se indicaron aproximadamente 147000 nuevos casos y más de 49900 muertes debidas a CRC. Existen tres formas de CRC: CRC esporádico; cáncer de colon hereditario no poliposo (HNPCC), causado por mutaciones en la estirpe germinal en genes de reparación de emparejamientos erróneos de ADN y poliposis adenomatosa familiar (FAP), debida a mutaciones en la estirpe germinal en el gen APC. El CRC esporádico representa aproximadamente 85% de los casos, mientras que HNPCC representa aproximadamente 5% y FAP representa aproximadamente 1% (Heyer et al., 1999, Oncogene 18: 5325-5333).

La gestión clínica de CRC implica típicamente la resección quirúrgica de tumores acompañada frecuentemente de quimioterapia. Actualmente, aproximadamente 50% de los pacientes con CRC mueren en los cinco años después del diagnóstico. La ausencia de ensayos de cribado fiables y la ineficacia de las terapias disponibles actualmente son las causas principales de la alta proporción de mortalidad. Existe una necesidad urgente de nuevas estrategias clínicas para diagnosticar el CRC, así como de tratamientos eficaces frente a los tumores de cáncer colorrectal que tengan efectos adversos mínimos en, por otra parte, el tejido sano.

3. Sumario

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal antiprogastrina como se define en las reivindicaciones.

La presente solicitud proporciona composiciones y métodos útiles para diagnosticar y/o tratar el cáncer colorrectal (CRC) en animales, incluyendo seres humanos. Las diferentes invenciones descritas en la solicitud se basan, en parte, en el descubrimiento de los solicitantes de anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a la progastrina (PG), por ejemplo, progastrina humana (hPG), un polipéptido producido por las células de tumor de CRC y que presenta propiedades antiproliferativas en modelos de CRC in vitro.

La progastrina es producida por las células de tumor colorrectal y se cree que estimula la proliferación de estas células desencadenando una ruta de transducción de la señal que bloquea los procesos de diferenciación normales de las células, incluyendo los procesos que dan lugar a la muerte celular. La disminución del transcrito del gen de la gastrina que codifica la progastrina induce la diferenciación celular y la muerte celular programada en células tumorales en modelos de CRC in vitro e in vivo, reduciendo la proliferación de las células tumorales. Aunque no se pretende la vinculación a ninguna teoría de operación, a través de la unión de PG, se cree que los anticuerpos anti-hPG bloquean o inhiben su capacidad de interaccionar con su o sus pares de señalización. Esto, a su vez, inhibe una ruta de transducción de la señal en células de tumor colorrectal que de otra manera daría lugar a la proliferación.

De acuerdo con esto, en un aspecto, la presente descripción proporciona anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a PG, por ejemplo hPG, pero no a otros productos del gen de la gastrina. Respecto a la figura 1, el gen de la gastrina se traduce en un polipéptido de 101 aminoácidos, denominado preprogastrina, que contiene una secuencia señal (subrayada) que se escinde, dando lugar a la progastrina, un polipéptido de 80 aminoácidos. La progastrina, a su vez, se escinde para generar un producto de 34 aminoácidos, correspondiente a los residuos 38 a 71 de la progastrina, que se extiende en su extremo carboxi con un residuo de glicina, generando G34 extendido con glicina (“G34-Gly”). Un subproducto de esta escisión es un péptido de 5 aminoácidos, denominado el péptido flanqueante C-terminal, o CTFP, que incluye los residuos 75 a 80 de la progastrina. Se escinde G34-Gly adicionalmente para generar un polipéptido de 17 residuos correspondiente en secuencia a los residuos 55 a 71 de la progastrina y al que se hace referencia como G17-Gly. La eliminación de las glicinas C-terminales de G34-Gly y G17-Gly, seguida de la amidación C-terminal, da lugar a G34 y G17, respectivamente, estando los dos amidados en el extremo C-terminal. Así, mientras los primeros 37 residuos de la progastrina son únicos a la misma (es decir, no están presentes en sus productos de procesamiento, tales como G34, G34-Gly, G17, G17-Gly, o CFTP), los residuos 38 a 80 también están presentes en los productos posteriores a la traducción del gen de la gastrina.

En el contexto de la presente invención se ha descubierto que, aunque pueden generarse anticuerpos

monoclonales anti-PG usando métodos conocidos para los expertos en la materia, la selección del antígeno es importante. No todos los antígenos derivados de hPG estimulan la producción de anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a hPG bajo condiciones fisiológicas. Como se describe a continuación, varios antígenos usados para generar anticuerpos policlonales frente a hPG, tales como progastrina humana recombinante de longitud completa (ver, por ejemplo, Singh WO 08/076454) y péptidos correspondientes a los últimos diez aminoácidos en el extremo C-terminal de hPG (ver, por ejemplo, Hollande WO 07/135542), fracasaron en la generación de anticuerpos monoclonales anti-hPG. Los anticuerpos monoclonales contra la progastrina se han obtenido supuestamente utilizando péptidos en el extremo N o C de la proteína (documento WO 2006/032980), pero estos anticuerpos no se unen de hecho a la progastrina. En el contexto de la presente invención, sin embargo, se han descubierto secuencias N-y C-terminales antigénicas en la secuencia de hPG que pueden usarse para generar anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a hPG. Bastante sorprendentemente, en el contexto de la presente invención se ha descubierto que no es necesario limitar las secuencias del antígeno a cadenas de la secuencia de PG que son únicas a la misma para obtener anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a PG y no a otros productos derivados del gen de la gastrina. Los antígenos peptídicos que presentan secuencias en común con otros productos del gen de la gastrina, por ejemplo G17, G34, y CTFP, proporcionaron anticuerpos monoclonales que no sólo se unen a hPG, sino que se unen a ella específicamente.

En el contexto de la presente invención se han generado anticuerpos monoclonales usando antígenos derivados de diferentes regiones de la molécula de hPG. Los anticuerpos monoclonales anti-PG que se pueden obtener usando un antígeno peptídico que presenta una secuencia correspondiente a una región N-terminal de hPG, y/o que se unen a una región N-terminal de hPG, se refieren en la presente memoria como “anticuerpos monoclonales anti-hPG N-terminales.” Una región antigénica ejemplificativa específica que puede usarse para concebir un inmunógeno útil para obtener anticuerpos monoclonales anti-PG N-terminales corresponde a los residuos 1 a 14 de hPG: SWKPRSQQPDAPLG (SEC ID nº: 25). Los inmunógenos ejemplificativos que incluyen este antígeno útiles para obtener anticuerpos monoclonales anti-PG N-terminales se describen en la tabla 1A y en la sección de los Ejemplos.

Se hace referencia en la presente memoria a los anticuerpos monoclonales anti-PG que se pueden obtener usando un antígeno peptídico que presenta una secuencia correspondiente a una región C-terminal de hPG, y/o que se unen a una región C-terminal de hPG, como “anticuerpos monoclonales anti-hPG C-terminales.” Una región antigénica ejemplificativa específica que puede usarse para construir un inmunógeno útil para obtener anticuerpos monoclonales anti-PG C-terminales corresponde a los residuos 55 a 80 de hPG: QGPWLEEEEEAYGWMDFG RRSAEDEN (SEC ID nº: 27). Los inmunógenos ejemplificativas que incluyen este antígeno útiles para obtener anticuerpos monoclonales anti-PG C-terminales se describen en la tabla 1B y en la sección de los Ejemplos.

Para algunas utilizaciones, es deseable presentar anticuerpos monoclonales anti-hPG con alta afinidad para hPG. Para determinadas utilizaciones, tales como utilizaciones terapéuticas, es deseable una afinidad de por lo menos aproximadamente 100 nM, aunque los anticuerpos que presentan unas afinidades mayores, por ejemplo afinidades de por lo menos aproximadamente 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM, o incluso mayores, pueden ser deseables. Los distintos anticuerpos monoclonales anti-PG ejemplificativos específicos descritos en la presente memoria presentan afinidades comprendidas entre 10-6 y 10-12 M (ver la tabla 6). Un anticuerpo monoclonal anti-PG que presenta una afinidad especialmente adecuada para una aplicación particular deseada puede seleccionarse fácilmente de entre los mismos, o generarse o diseñarse usando los diferentes inmunógenos, secuencias de la región determinante de la complementariedad (CDR), secuencias variables de la cadena pesada VH y variables de la cadena ligera VL y métodos descritos en la presente memoria. La afinidad de cualquier anticuerpo monoclonal anti-PG particular puede determinarse usando técnicas muy conocidas en la técnica o descritas en la presente memoria, tales como por ejemplo, ELISA, calorimetría isotérmica de titulación (ITC), BIAcore, o ensayo de polarización fluorescente.

El hPG es un polipéptido relativamente pequeño, que presenta una longitud de únicamente 80 aminoácidos. Se esperaría que cualquier anticuerpo monoclonal que se una específicamente a hPG con una afinidad relativamente alta (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 10 nM) interfiera en la capacidad de PG de interaccionar con su o sus pares de señalización y, como resultado, inhiba la proliferación de las células de CRC. Sin embargo, en el contexto de la presente invención se ha descubierto que no todos los anticuerpos monoclonales anti-PG son neutralizantes (es decir, no todos los anticuerpos monoclonales que se unen a PG interfieren en o inhiben su actividad de señalización biológica). De hecho, como se expone con mayor detalle en la sección de los Ejemplos, en el contexto de la presente invención se ha descubierto que algunos de los anticuerpos monoclonales anti-PG, a pesar de presentar una especificidad alta y una afinidad alta para PG, no neutralizan PG. Por ejemplo, el MAb14 anti-hPG se une a hPG con una KD de aproximadamente 6 pM pero no inhibe el crecimiento de las células de CRC in vitro como se detalla en la sección de los Ejemplos a continuación. Aunque los anticuerpos monoclonales no neutralizantes que se unen específicamente a hPG son útiles para propósitos de diagnóstico, los anticuerpos monoclonales anti-hPG que neutralizan PG son particularmente adecuados para las aplicaciones terapéuticas para tratar CRC.

Tal y como se usa en la presente memoria, un “anticuerpo monoclonal anti-hPG neutralizante” es un anticuerpo monoclonal anti-hPG que da lugar a una reducción estadísticamente significativa del número de células de CRC vivas en una muestra de ensayo tratada con el anticuerpo monoclonal anti-hPG comparado con una muestra control tratada con un anticuerpo monoclonal no específico. Un ensayo específico para evaluar la capacidad de cualquier anticuerpo monoclonal anti-hPG particular para neutralizar hPG se describe en la sección de la Descripción Detallada a continuación. Se cree que los anticuerpos monoclonales anti-hPG que presentan por lo menos aproximadamente 50% de reducción del número de células vivas en este ensayo son especialmente útiles para tratar CRC, aunque se espera que los anticuerpos monoclonales anti-hPG que presentan niveles menores de actividad neutralizante, por ejemplo, una reducción estadísticamente significativa de 40%, 30%, 20%, 15%, o incluso 10% del número de células vivas en este ensayo proporcionen beneficios terapéuticos.

De acuerdo con esto, en algunas formas de realización, los anticuerpos monoclonales anti-PG son anticuerpos monoclonales anti-PG neutralizantes. Se ha descubierto que la capacidad de un anticuerpo monoclonal anti-PG para neutralizar PG no es dependiente de epítopo. Como se ejemplifica en la sección de los Ejemplos, tanto los anticuerpos anti-PG N-terminales como C-terminales tienen actividad neutralizante. Así, en algunas formas de realización, los anticuerpos monoclonales anti-PG neutralizantes son anticuerpos neutralizantes N-terminales, en otras formas de realización, los anticuerpos monoclonales anti-PG son anticuerpos neutralizantes C-terminales.

El mapeo de epítopos revela que los anticuerpos monoclonales anti-PG N-terminales no se unen todos al mismo epítopo, incluso cuando se generan frente al mismo inmunógeno. Lo mismo es cierto para los anticuerpos monoclonales anti-hPG C-terminales. Los epítopos unidos por los anticuerpos monoclonales anti-hPG N-terminales y C-terminales ejemplificativos, según se identifica mediante escaneo de alanina y técnica SPOT, se proporcionan en la sección de los Ejemplos, en las tablas 8 y 9.

En algunas formas de realización, los anticuerpos monoclonales anti-hPG se unen a un epítopo que incluye una secuencia de aminoácidos correspondiente a una parte N-terminal de hPG. En formas de realización específicas, los anticuerpos monoclonales anti-hPG N-terminales se unen a un epítopo que incluye los residuos 10 a 14 de hPG (SEC ID nº: 28), residuos 9 a 14 de hPG (SEC ID nº: 29), residuos 4 a 10 de hPG (SEC ID nº: 30), residuos 2 a 10 de hPG (SEC ID nº: 31), o residuos 2 a 14 de hPG (SEC ID nº: 32).

En algunas formas de realización, los anticuerpos monoclonales anti-hPG se unen a un epítopo que incluye una secuencia de aminoácidos correspondiente a una parte de una región C-terminal de hPG. En las formas de realización específicas, los anticuerpos monoclonales anti-hPG C-terminales se unen a un epítopo que incluye los residuos 71 a 74 de hPG (SEC ID nº: 33), residuos 69 a 73 de hPG (SEC ID nº: 34), residuos 76 a 80 de hPG (SEC ID nº: 35), o residuos 67 a 74 de hPG (SEC ID nº: 36).

Se espera que las CDR y/o cadenas VH y VL correspondientes de los anticuerpos monoclonales anti-hPG que se unen aproximadamente a los mismos epítopos puedan intercambiarse para dar lugar a nuevos anticuerpos monoclonales anti-hPG. Por ejemplo, como se indica en la Tabla 9, los anticuerpos monoclonales anti-hPG ejemplificativos MAb 5 y MAb 6 se unen al mismo epítopo. Puede diseñarse un anticuerpo monoclonal anti-hPG que incluya, en su cadena VL, varias combinaciones de las CDR de VL de estos dos anticuerpos, y/o en su cadena VH varias combinaciones de las CDR de VH de estos dos anticuerpos. Como un ejemplo específico, para ilustrar las varias combinaciones posibles, dicho anticuerpo podría incluir en su cadena VL, las CDR 1 y 2 de MAb 5 (VL CDR1.5 y VL CDR2.5, respectivamente) y CDR 3 de MAb 6 (VL CDR3.6), y en su cadena VH, la CDR 1 de MAb 6 (VH CDR1.6) y las CDR 2 y 3 de MAb 5 (VH CDR2.5 y VH CDR3.5, respectivamente).

Se han identificado varios anticuerpos monoclonales anti-hPG que tienen una alta especificidad y afinidad para hPG y que presentan una buena actividad antitumoral en ensayos in vitro, y en algunos casos se han determinado las secuencias de sus CDR, secuencias de sus cadenas VH y VL, y/o secuencias de cadenas VH y VL propuestas para las versiones humanizadas. También se han depositado varios hibridomas. Todos estos anticuerpos monoclonales anti-hPG ejemplificativos, así como otras formas de realización específicas de anticuerpos monoclonales anti-hPG útiles en los diferentes kits y métodos descritos en la presente memoria, por ejemplo anticuerpos monoclonales que compiten para la unión a PG con un anticuerpo de referencia, se describen con mayor detalle en la sección de la Descripción Detallada.

Los anticuerpos monoclonales anti-hPG de la descripción incluyen anticuerpos que compiten con un anticuerpo monoclonal anti-hPG de referencia para la unión a hPG. El anticuerpo monoclonal anti-hPG de referencia puede ser cualquiera de los anticuerpos monoclonales anti-hPG descritos en la presente memoria. Los ejemplos no limitativos incluyen: anticuerpos que comprenden tres CDR de VL y tres CDR de VH como se describe en la presente memoria; anticuerpos que comprenden una cadena VH y una cadena VL que presentan secuencias de aminoácidos como se muestra en la presente memoria; anticuerpos que comprenden polipéptidos de cadena pesada y ligera humanizados como se muestra en la presente memoria; anticuerpos producidos por uno cualquiera de los hibridomas descritos en la presente memoria; anticuerpos que se unen a un epítopo en hPG como se describe en la presente memoria.

Los anticuerpos monoclonales anti-PG descritos en la presente memoria pueden estar en forma de anticuerpos de longitud completa, anticuerpos de múltiples cadenas o de cadena única, fragmentos de dichos anticuerpos

que se unen selectivamente a PG (incluyendo pero no limitado a Fab, Fab', (Fab')2, Fv, y scFv), surrobodies (incluyendo construcción de cadena ligera sucedánea), anticuerpos de un único dominio, anticuerpos humanizados, anticuerpos camelizados y similares. También pueden ser de, o derivados de, cualquier isotipo incluyendo, por ejemplo, IgA (por ejemplo, IgA1 o IgA2), IgD, IgE, IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), o IgM. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-PG es una IgG (por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4).

Los anticuerpos monoclonales anti-PG pueden tener un origen humano o no humano. Los ejemplos de anticuerpos anti-PG con un origen no humano incluyen, pero no están limitados a, los de origen de mamíferos (por ejemplo, simios, roedores, cabras y conejos). Los anticuerpos monoclonales anti-PG para uso terapéutico en seres humanos están preferentemente humanizados.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona ácidos nucleicos aptos para ser usados para producir anticuerpos monoclonales anti-PG. Se proporcionan ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de cadena ligera y de cadena pesada de inmunoglobulinas para los anticuerpos monoclonales anti-hPG descritos en la presente memoria, y los vectores que comprenden los ácidos nucleicos. Además, en la presente memoria se proporcionan células hospedadoras procariotas y eucariotas transformadas con dichos vectores, así como células hospedadoras eucariotas, por ejemplo, de mamíferos, modificadas por ingeniería para expresar los polipéptidos de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos monoclonales anti-hPG. También se proporcionan células hospedadorases aptas para expresar tanto la cadena ligera como pesada y secretar los anticuerpos monoclonales descritos en la presente memoria en el medio en el que se cultivan las células hospedadoras. En algunas formas de realización, la célula hospedadora es un hibridoma. También se proporcionan métodos para producir anticuerpos monoclonales anti-hPG cultivando las células hospedadoras.

Los anticuerpos monoclonales anti-PG neutralizantes, tales como anticuerpos monoclonales anti-hPG, se unen a PG y bloquean la señalización dependiente de PG, lo que da como resultado la inhibición de las respuestas inducidas por PG en las células de tumor de CRC. De acuerdo con esto, también se proporcionan métodos para inhibir las respuestas inducidas por PG de células de CRC, lo que incluye la represión de la diferenciación celular, represión de la muerte celular y/o estimulación de la proliferación celular. Generalmente, el método comprende poner en contacto una célula de CRC con, o exponer una población de células a, un anticuerpo monoclonal anti-PG neutralizante en una cantidad eficaz para inhibir una o más de las respuestas inducidas por PG en células de CRC. El método puede realizarse in vitro o in vivo, por la administración de un anticuerpo monoclonal anti-hPG neutralizante al entorno que contiene células de CRC, que podría ser un cultivo celular o en un tumor.

Los anticuerpos monoclonales anti-PG neutralizantes descritos en la presente memoria inhiben la proliferación dependiente de PG de las células de tumor de CRC, convirtiéndose así en agentes terapéuticos útiles para el tratamiento de cáncer colorrectal. De acuerdo con esto, también se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo monoclonal anti-PG neutralizante y métodos para usar los anticuerpos monoclonales anti-PG neutralizantes y/o composiciones farmacéuticas para tratar CRC. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para cualquier ruta conveniente de administración, incluyendo por ejemplo inyección parenteral, subcutánea o intravenosa e incluirá típicamente un anticuerpo monoclonal anti-hPG neutralizante y uno o más vehículos, excipientes y/o diluyentes aceptables, adecuados para el modo deseado de administración y pueden incluir otros componentes opcionales como se describirá con mayor detalle en la sección de la Descripción Detallada. Para usos terapéuticos, las composiciones pueden envasarse en forma de dosificación unitaria para facilitar su uso.

Los métodos de tratamiento comprenden generalmente administrar a un sujeto que necesita tratamiento, por ejemplo un sujeto diagnosticado de CRC, una cantidad de un anticuerpo monoclonal anti-PG neutralizante y/o composición farmacéutica de éste eficaz para proporcionar un beneficio terapéutico. El beneficio terapéutico, descrito a continuación con mayor detalle, incluye cualquier mejora de CRC, por ejemplo, ralentizar o parar la progresión de CRC, reducir la gravedad de CRC, inhibir el crecimiento de tumores de CRC o la proliferación de células de CRC, reducir el tamaño de los tumores de CRC y/o reducir los niveles séricos de PG en pacientes con CRC. El sujeto puede ser un ser humano o no humano, incluyendo un animal doméstico (por ejemplo, gato, perro, vaca, cerdo, caballo) o un animal no doméstico. Preferentemente, el anticuerpo monoclonal anti-PG es específico para la PG de la especie que se trata. Por ejemplo, un anticuerpo anti-hPG se administra a un paciente humano, un anticuerpo anti-PG de perro se administra a un paciente canino, y similares. Los sujetos en los que la terapia con anticuerpo monoclonal anti-hPG es útil pueden: ser pacientes en cualquier estadio de la progresión de la enfermedad (por ejemplo, CRC Estadio 0, I, II, III, o IV), pacientes que han recibido terapia para CRC (por ejemplo, quimioterapia, terapia de radiación, resección quirúrgica) o pacientes que están recibiendo otra terapia para CRC.

El tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-PG como se describe en la presente memoria puede combinarse con, o ser adyuvante de, otra terapia. Los ejemplos no limitativos de otra terapia para CRC incluyen tratamiento quimioterápico, terapia de radiación, resección quirúrgica y terapia de anticuerpos, como se describe en la presente memoria. En un ejemplo específico, los anticuerpos monoclonales anti-hPG se administran en combinación con agentes quimioterápicos. En otro ejemplo específico, los anticuerpos monoclonales anti-hPG se administran como adyuvante con resección quirúrgica. Los anticuerpos monoclonales anti-PG también pueden

usarse en combinación uno con otro.

Los individuos con tumores de CRC tienen frecuentemente niveles elevados de PG circulante (por ejemplo, en suero o plasma). De acuerdo con esto, los anticuerpos monoclonales anti-hPG pueden usarse para detectar niveles de PG para el diagnóstico de CRC. Además, en los pacientes ya diagnosticados con CRC, los anticuerpos monoclonales anti-hPG pueden usarse para seleccionar sujetos adecuados para recibir terapia anti-PG, o para monitorizar la eficacia del tratamiento. Como se describe en la presente memoria, un método para diagnosticar cáncer colorrectal en un sujeto comprende determinar si la cantidad de progastrina en una muestra del sujeto, por ejemplo una muestra de sangre o una muestra de suero, medida usando un anticuerpo monoclonal anti-hPG según la presente descripción, está por encima de un nivel umbral. En una forma de realización específica, el nivel umbral es 50 pM. En algunas formas de realización, se usan dos anticuerpos anti-PG, uno que reconoce una región C-terminal de PG y el otro que reconoce una región N-terminal de PG. En esta forma de realización, uno o los dos de los anticuerpos N-terminal o C-terminal es un anticuerpo monoclonal anti-PG como se describe en la presente memoria. Preferentemente, se usan anticuerpos monoclonales anti-PG N-terminales y C-terminales. Los anticuerpos pueden ser, pero no necesitan ser, neutralizantes.

Para monitorizar la eficacia del tratamiento, los anticuerpos monoclonales anti-PG pueden usarse para determinar si el nivel de progastrina disminuye con el tiempo en muestras de un sujeto que se ha tratado o se está tratando para CRC comparando la cantidad de PG en muestras tomadas en momentos diferentes. Las formas de realización específicas de anticuerpos anti-PG descritas en el párrafo anterior también pueden usarse en este ensayo.

También se proporcionan unos kits adecuados para realizar los diferentes métodos de diagnóstico, monitorización y otros descritos en la presente memoria. Dichos kits comprenderán típicamente un anticuerpo monoclonal anti-PG como se describe en la presente memoria y, opcionalmente anticuerpos anti-PG adicionales y/o reactivos adecuados para llevar a cabo el ensayo específico. En algunas formas de realización, uno o más anticuerpos anti-PG incluidos en el kit están marcados con un marcaje detectable, tal como un fluoróforo. En una forma de realización específica, el kit incluye un anticuerpo anti-PG que se une específicamente a una región N-terminal de PG, un anticuerpo anti-PG que se une específicamente a una región C-terminal de PG y, opcionalmente, reactivos adecuados para llevar a cabo un ensayo de diagnóstico, en el que el anticuerpo N-terminal específico es un anticuerpo monoclonal anti-PG N-terminal como se describe en la presente memoria y/o el anticuerpo C-terminal específico es un anticuerpo monoclonal anti-PG C-terminal como se describe en la presente memoria.

4. Breve descripción de las figuras

La figura 1 proporciona las secuencias de aminoácidos de preprogastrina, progastrina y productos de tratamiento de la progastrina incluyendo G34, G34-Gly, G17, G17-Gly, y el péptido flanqueante C-terminal, CTFP.

La figura 2 proporciona las secuencias de polipéptido, y el polinucleótido correspondiente, de las cadenas VH y VL para anticuerpos monoclonales anti-hPG murinos ejemplificativos: anti-hPG MAb 3 (SEC ID nº 16, 12, 17 y 13, respectivamente, en orden de aparición) (figura 2A, 2B), anti-hPG MAb 4 (SEC ID nº 18, 14, 19 y 15, respectivamente, en orden de aparición) (figura 2C, 2D), anti-hPG MAb 8 (SEC ID nº 67, 59, 71 y 63, respectivamente, en orden de aparición) (figura 2E, 2F), anti-hPG Mab 13 (SEC ID nº 68, 60, 72 y 64, respectivamente, en orden de aparición) (figura 2G, 2H), anti-hPG MAb 16 (SEC ID nº 69, 61, 73 y 65, respectivamente, en orden de aparición) (figura 2I, 2J), y anti-hPG MAb 19 (SEC ID nº 70, 62, 74 y 66, respectivamente, en orden de aparición) (figura 2K, 2L), en los que las tres CDR de cada cadena están subrayadas.

Las figuras 3A-C proporcionan gráficos que ilustran las afinidades relativas de unión (medidas como absorbancia a 492 nm) a concentraciones crecientes de anticuerpo (µg/ml) de anticuerpos monoclonales antihPG murinos ejemplificativos, MAbs 1-4 (figura 3A); MAbs 5-14 y 20-23 (figura 3B); y MAbs 3 y 15-19 (figura 3C).

La figura 4 proporciona un gráfico que ilustra la proporción de absorbancia (densidad óptica) a 280 nm y 330 nm para cuatro anticuerpos monoclonales anti-hPG murinos ejemplificativos diferentes comparados con una muestra control de albúmina de suero bovino (unidades arbitrarias).

Las figuras 5A-C proporcionan gráficos que ilustran la unión de 23 anticuerpos monoclonales anti-hPG murinos ejemplificativos diferentes a 25 o 50 ng de hPG comparado con: amortiguador solo (control negativo), 250 ng de KLH (control negativo), y péptidos derivados del gen de la gastrina (50 y 250 ng de CTFP, G17, o G17-Gly (al que se hace referencia en la figura como “G-Gly”)), como se indica. La figura 5A muestra la unión de anti-hPG MAbs 1-4, la figura 5B representa la unión de anti-hPG MAbs 5-14 y 21-23, y la figura 5C representa la unión de anti-hPG MAbs 3 y 15-20,

La figura 6 proporciona un gráfico que ilustra la unión de un anticuerpo policlonal anti-hPG N-terminal a hPG

a concentraciones crecientes de anti-hPG MAb3.

La figura 7 proporciona gráficos que ilustran la proliferación de estirpes celulares de CRC representativas tratadas con anticuerpos monoclonales anti-hPG como se expone a continuación: SW480, HCT-116, LS174T, como se indica, tratadas con anticuerpos monoclonales anti-hPG ejemplificativos MAb 3 y MAb 4 (figuras 7A, 7B, 7C, respectivamente, mostrando el cambio en el número de células vivas al final del tratamiento respecto al comienzo del tratamiento (T0) con anticuerpo), o un anticuerpo policlonal anti-hPG (figuras 7D, 7E, 7F, respectivamente, mostrando el cambio en el número de células vivas al final del tratamiento respecto al comienzo del tratamiento (T0) con anticuerpo); proliferación de la estirpe celular de CRC SW620 tratada con anti-hPG MAb 5 a MAb 23 (figura 7G, mostrando células vivas tratadas con anti-hPG como porcentaje del número de células tratadas con anticuerpo control al final del tratamiento respecto al comienzo del tratamiento (T0)); proliferación de células LS174T tratadas con anti-hPG MAb 8, 13, 14, 16, y 19 (figura 7H, mostrando células vivas tratadas con anti-hPG como porcentaje del número de células tratadas con anticuerpo control al final del tratamiento respecto al comienzo del tratamiento (T0)); y proliferación de células HCT-116 tratadas con anticuerpos monoclonales anti-hPG MAb 8, 13, 14, 16, 19 (figura 7I, mostrando células vivas tratadas con anti-hPG como porcentaje del número de células tratadas con anticuerpo control al final del tratamiento respecto al comienzo del tratamiento (T0)).

La figura 8 proporciona un gráfico que ilustra el número de células LS174T vivas a las 48 horas después de 4 tratamientos con un anticuerpo monoclonal control, anti-hPG MAb 8 (5 µg/ml), anti-hPG MAb 8 preincubado con hPG, el anticuerpo control preincubado con hPG, o hPG solo.

La figura 9 proporciona gráficos que ilustran el número de tumores por ratón (figura 9A) y la longitud y altura medias del tumor (figura 9B) en ratones tratados con anticuerpos anti-hPG comparado con un anticuerpo policlonal control.

5. Descripción detallada de las formas de realización ejemplificativas

5.1 Descripción detallada

La progastrina (PG) se identificó por primera vez como el precursor de la gastrina, una hormona peptídica intestinal que estimula la secreción de ácido gástrico. La gastrina existe en varias formas moleculares diferentes (G17, G34, G17 extendido con glicina, G34 extendido con glicina) derivadas de la progastrina. Ver la figura 1. El gen de la gastrina codifica un producto de 101 aminoácidos, la preprogastrina. Una primera escisión elimina un péptido señal de 21 residuos de aminoácidos (subrayado en la figura 1) y resulta en PG, un péptido de 80 aminoácidos. La secuencia entendida conocida de la secuencia polipeptídica de la PG humana (hPG) se proporciona en SEC ID nº: 20, Como se ilustra en la figura 1, los residuos de aminoácidos de hPG están numerados de 1 a 80, siendo el residuo más amino la posición 1. Se hace referencia a las secuencias en los primeros 40 aminoácidos de la progastrina como “N-terminales,” mientras que se hace referencia a las secuencias que están en el residuo 41 a 80 como “C-terminales.”

Estudios recientes han mostrado que los niveles de progastrina están elevados en pacientes con CRC. Bajo condiciones fisiológicas normales, la progastrina representa menos de 10% del péptido total secretado en los seres humanos. En el cáncer colorrectal, los niveles de progastrina están significativamente elevados tanto en plasma como en tejido tumoral, posiblemente como resultado de una expresión incrementada del gen de la gastrina acoplado con un procesamiento incompleto del producto génico. Un estudio mostró niveles significativamente altos en suero de progastrina en pacientes con CRC comparado con pacientes control pero no una diferencia tal para las formas más procesadas de la gastrina (Siddheshwar et al., 2001, Gut 48: 47-52). En muestras de tumor de CRC sometidas a prueba, el 80-100% de las muestras mostró niveles incrementados de PG. Ver, por ejemplo, Ciccotosto et al., 1995, Gastroenterology 109: 1142-1153; Baldwin et al., 1998, Gut 42: 581-584; Van Solinge, 1993, Gastroenterology 104: 1099-1107. El papel de PG en CRC se ha sustanciado además por experimentos que muestran que los ratones que expresan PG humana recombinante tratados con el carcinógeno azoximetano tenían números significativamente mayores de focos de criptas aberrantes, adenomas, y adenocarcinomas en el colon comparado con ratones de tipo salvaje o ratones que expresan gastrinas amidadas (Singh et al. 2000, Gastroenterology 119: 162-171).

Recientemente, Hollande et al., demostraron que la progastrina estimula la ruta beta-catenina/Tcf4 reprimiendo ICAT, un regulador negativo de la señalización beta-catenina/Tcf4 y que el bloqueo de la progastrina da lugar a la expresión de novo de ICAT. Ver el documento WO 2007/135542. Aunque no se pretende la vinculación a ninguna teoría de funcionamiento, se cree que el bloqueo de la señalización de la progastrina da lugar a la represión de la proliferación inducida por beta-catenina/Tcf4 como resultado de una expresión incrementada de ICAT. En ausencia de señalización continuada dependiente de PG, la proliferación celular se inhibe y se desencadena la diferenciación celular y/o muerte celular (incluyendo la apoptosis).

A pesar de la necesidad urgente de nuevas estrategias clínicas para el tratamiento y diagnóstico de CRC, la evidencia de que PG estimula la proliferación de células de tumor de CRC, y a pesar de la atención incrementada en terapias de anticuerpos monoclonales en el tratamiento del cáncer, hasta la fecha, no existen

publicaciones que demuestren que ningún anticuerpo monoclonal resulte apto para bloquear la proliferación de células tumorales dependiente de PG o incluso la unión de PG. Dichos anticuerpos, presentados en la presente memoria por primera vez, se han mostrado difíciles de desarrollar. Como un primer reto, en el contexto de la presente invención se descubre que la progastrina humana recombinante, que puede usarse para generar anticuerpos policlonales anti-hPG, no resulta apta para inducir una respuesta inmunógena monoclonal en ratones de ensayo. Por lo tanto, fue necesario diseñar inmunógenos usando sólo fragmentos peptídicos de PG para generar anticuerpos específicos para progastrina y no para otros productos del gen de la gastrina. Incluso una vez que los clones de hibridoma proporcinaron anticuerpos que se unían al péptido antigénico, se encontró que la unión al péptido no era predictiva de la capacidad para unirse a PG, específicamente o ni siquiera la unión. Como se muestra con mayor detalle en los ejemplos a continuación, muchos hibridomas proporcionaron anticuerpos que se unían al péptido antigénico de PG usado en el inmunógeno pero no se unieron a PG. La presente descripción proporciona anticuerpos monoclonales anti-hPG que se unen no sólo al antígeno peptídico frente al que se generaron sino que también se unen a hPG específicamente. Bastante sorprendentemente, se obtuvieron anticuerpos monoclonales altamente específicos para hPG respecto a sus productos de procesamiento (por ejemplo, G34, G34-Gly, G17, G17-Gly, CTFP) con antígenos que en algunos casos no eran únicos para hPG, sino que incluían regiones con secuencia de aminoácidos común a uno o más de los productos de procesamiento de la progastrina. Además, también se descubrió sorprendentemente que a pesar del tamaño relativamente pequeño de hPG (80 aminoácidos) no todos los anticuerpos monoclonales anti-hPG, incluso aquellos que presentan un alto grado de afinidad y especificidad para hPG, neutralizan su actividad biológica.

Anticuerpos monoclonales anti-hPG

En el contexto de la presente invención se han descubierto antígenos peptídicos útiles para generar anticuerpos monoclonales anti-hPG. Los péptidos útiles para generar anticuerpos anti-hPG de la presente descripción comprenden secuencias específicas de la progastrina no encontradas en las formas más procesadas del polipéptido, tales como gastrinas extendidas con glicina o amidadas o CTFP, pero también pueden comprender secuencias que se encuentran en las formas procesadas de hPG. En algunas formas de realización, los anticuerpos monoclonales anti-hPG se generan frente a un antígeno peptídico que presenta una secuencia de aminoácidos correspondiente a una región N-terminal de hPG y se designan anticuerpos monoclonales anti-hPG N-terminales. Una región antigénica ejemplificativa específica que puede usarse para construir un inmunógeno útil para obtener anticuerpos monoclonales anti-PG N-terminales corresponde a los residuos 1 a 14 de hPG (SWKPRSQQPDAPLG (SEC ID nº: 25)) acoplado con una secuencia conectora. En otras formas de realización, los anticuerpos monoclonales anti-hPG se generan frente a un antígeno peptídico que presenta una secuencia de aminoácidos correspondiente a una región C-terminal de hPG y se designan anticuerpos monoclonales antihPG C-terminales. Una región antigénica ejemplificativa específica que puede usarse para construir un inmunógeno útil para obtener anticuerpos monoclonales anti-PG C-terminales corresponde a los residuos 55 a 80 de hPG (SEC ID nº: 27) acoplado a una secuencia conectora. Ver la tabla 1.

Los anticuerpos monoclonales anti-PG de la presente descripción se unen a PG y son útiles para detectar y aislar PG de mezclas complejas. Además, los anticuerpos monoclonales anti-PG de la descripción son excepcionalmente adecuados para aplicaciones terapéuticas y/o de diagnóstico para cáncer colorrectal. En varias formas de realización, los anticuerpos monoclonales anti-hPG (1) se unen específicamente a PG frente a otros productos del gen de la gastrina, (2) presentan una alta afinidad para hPG, (3) inhiben la proliferación de células de cáncer colorrectal in vitro e in vivo, (4) reducen el tamaño y número de los tumores in vivo, (5) detectan PG en mezclas complejas que contienen otros productos derivados del gen de la gastrina.

El gen de la gastrina se expresa y procesa extensamente, para proporcionar varios productos proteicos que presentan unas funciones en la homeostasis normal. La progastrina, por otra parte, típicamente no es detectable en la circulación de los sujetos sanos. Los anticuerpos monoclonales de la presente descripción se pretende que estén dirigidos a la progastrina pero no a otros péptidos derivados del gen de la gastrina. De acuerdo con esto, los anticuerpos monoclonales anti-hPG se unen específicamente a la progastrina, de seres humanos y otros animales, pero no a otros productos del gen de la gastrina, tales como, pero no limitados a, gastrinas extendidas con glicina o amidadas o péptido flanqueante C-terminal (CTFP).

La especificidad de los anticuerpos monoclonales anti-hPG puede determinarse usando un ELISA como se expone a continuación. Se incuban placas de 96 pocillos toda la noche a 4°C con la concentración o concentraciones apropiadas del polipéptido de ensayo (por ejemplo, 25 y 50 ng de PG humana recombinante, y 50 y 250 ng de CTFP u otros productos derivados del gen de la gastrina) en disolución salina amortiguada con fosfato (PBS), después de lo cual los pocillos se lavan tres veces con disolución de lavado (PBS y 0,1% Tween20), y se incuban durante 2 horas a 22°C con 100 µl de disolución de bloqueo (PBS, 0,1% Tween-20, 0,1% albúmina de suero bovino o hidrolizado de caseína) por pocillo. Después del bloqueo, los pocillos se lavan tres veces y se añade el anticuerpo que se va a someter a prueba (anticuerpo de ensayo). Se añaden a cada pocillo 100 µl del anticuerpo de ensayo (a 0,3 a 1 ng/ml) en PBS y 0,1% Tween-20, Las placas se incuban durante 2 horas a 22°C, después de lo cual la disolución del anticuerpo de ensayo se desecha y se reemplaza, después de una etapa de lavado (3X 100 µl de disolución de lavado, como se ha indicado anteriormente), con disolución de bloqueo que contiene un anticuerpo secundario, un anticuerpo IgG (Fc) de cabra antirratón acoplado a peroxidasa de rábano. Después de 1 hora de incubación con el anticuerpo secundario, se añaden 100 µl de

disolución de sustrato (por ejemplo Fast OPD, o dihidrocloruro de O-fenilendiamina, disponible en Sigma-Aldrich Co., preparado según las instrucciones del fabricante) a cada pocillo y se incuba en oscuridad durante 20 minutos a 22°C. La reacción se interrumpe por la adición de 50 µl de 4N ácido sulfúrico y se determina la cantidad de sustrato catalizada midiendo la densidad óptica (D.O.) a 492 nm. La conversión del sustrato es proporcional a la cantidad de anticuerpo primario (de ensayo) unido al antígeno. Los experimentos se hacen en duplicado y las medidas de DO se representan como una función de la concentración de antígeno. Los anticuerpos de ensayo se clasifican como específicos para PG si la D.O. medida es entre 0,2 y 1,5 para hPG y no existe una señal estadísticamente significativa por encima del fondo con CTFP o ninguno de los demás péptidos derivados del gen de la gastrina, en el que el fondo es la señal media de los pocillos control que únicamente contienen PBS.

Se descubrió que varios anticuerpos monoclonales anti-hPG de la presente descripción eran altamente específicos. En algunas formas de realización, los anticuerpos monoclonales anti-hPG presentan una especificidad 100 veces mayor para la progastrina comparado con los demás productos del gen de la gastrina. En dichas formas de realización, se requiere 100 veces más de antígeno (por ejemplo, gastrina extendida con glicina o amidada) para proporcionar la misma unión que la observada cuando el antígeno es la progastrina.

Otros métodos para determinar la unión incluyen, pero no están limitados a, un método inmunofluorescente, un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), un inmunoensayo con material marcado radiactivamente (RIA), un ELISA sandwich (Monoclonal Antibody Experiment Manual (publicado por Kodansha Scientific, 1987), Second Series Biochemical Experiment Course, Vol. 5, Immunobiochemistry Research Method, publicado por Tokyo Kagaku Dojin (1986)).

Los anticuerpos monoclonales anti-hPG con alta afinidad para PG son deseables tanto para usos terapéuticos como de diagnóstico. Para determinados usos, tales como usos terapéuticos, es deseable una afinidad de por lo menos aproximadamente 100 nM, aunque pueden ser deseables los anticuerpos que tienen afinidades mayores, por ejemplo afinidades de por lo menos aproximadamente 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM, 10 pM, 1 pM, o incluso mayores. En algunas formas de realización, los anticuerpos monoclonales se unen específicamente a hPG con una afinidad en el intervalo de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 nM, o una afinidad en el intervalo entre cualquiera de los valores anteriores.

La afinidad de los anticuerpos monoclonales anti-hPG para hPG puede determinarse usando técnicas muy conocidas en la técnica o descritas en la presente memoria, tales como a título de ejemplo no limitativo ELISA, calorimetría isotérmica de titulación (ITC), BIAcore, Proteon, o ensayo de polarización fluorescente.

Usando antígenos de las regiones N-o C-terminales de hPG, pueden generarse anticuerpos que reconozcan diferentes epítopos de hPG. El epítopo reconocido por un anticuerpo monoclonal dependerá del antígeno particular usado para generar el anticuerpo y puede mapearse usando técnicas conocidas para el experto en la materia, tales como escaneo de alanina y análisis SPOT (ver la sección de ejemplos a continuación). Por ejemplo, el mapeo de epítopos revela que anti-hPG MAb 2 y MAb 4 se unen al mismo epítopo; anti-hPG MAb 1 y MAb 3 se unen aproximadamente al mismo epítopo; MAb 17, MAb 18, MAb 19, y MAb 20 se unen aproximadamente al mismo epítopo; MAb 15 y MAb 16 se unen aproximadamente al mismo epítopo; anti-hPG MAb 5, MAb 6, MAb 7, MAb 9, y MAb 12 se unen al mismo epítopo y se unen aproximadamente al mismo epítopo que anti-hPG MAb 10; y anti-hPG MAb 11 y MAb 14 se unen aproximadamente al mismo epítopo.

Si un anticuerpo monoclonal anti-hPG reconoce o no un epítopo particular puede determinarse usando un ensayo de competición como se describe en la presente memoria, en el que se conoce el epítopo unido por el anticuerpo de referencia. En algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal anti-hPG compite con un anticuerpo de referencia que se une a un epítopo que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una región N-terminal de hPG. En formas de realización específicas, los anticuerpos monoclonales anti-hPG compiten con un anticuerpo de referencia que se une a un epítopo que incluye los residuos 10 a 14 de hPG (SEC ID nº: 28), residuos 9 a 14 de hPG (SEC ID nº: 29), residuos 4 a 10 de hPG (SEC ID nº: 30), residuos 2 a 10 de hPG (SEC ID nº: 31), o residuos 2 a 14 de hPG (SEC ID nº: 32). En algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal anti-hPG compite con un anticuerpo de referencia que se une a un epítopo que presenta una secuencia de aminoácidos correspondiente a una región C-terminal de hPG. En formas de realización específicas, los anticuerpos monoclonales anti-hPG compiten con un anticuerpo de referencia que se une a un epítopo que incluye los residuos 71 a 74 de hPG (SEC ID nº: 33), residuos 69 a 73 de hPG (SEC ID nº: 34), residuos 76 a 80 de hPG (SEC ID nº: 35), o residuos 67 a 74 de hPG (SEC ID nº: 36).

Los anticuerpos monoclonales anti-PG pueden ser neutralizantes. Aunque no se pretende la vinculación a ninguna teoría de funcionamiento, se cree que, a través de la unión a PG, los anticuerpos monoclonales antihPG neutralizantes bloquean o inhiben su capacidad de interaccionar con su o sus pares de señalización. Esto, a su vez, inhibe una ruta de transducción de la señal en células de tumor colorrectal que de otra manera daría lugar a la proliferación, diferenciación celular reducida y muerte celular. En algunas formas de realización, los anticuerpos monoclonales anti-PG neutralizantes se unen a una región N-terminal de hPG. En formas de realización específicas, los anticuerpos monoclonales anti-PG neutralizantes compiten por la unión a PG con

anti-hPG MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, MAb15, MAb 16, MAb 17, MAb 18, MAb 19, o MAb 20, En otras formas de realización, los anticuerpos monoclonales anti-PG neutralizantes se unen a una región C-terminal de hPG. En formas de realización específicas, los anticuerpos monoclonales anti-PG neutralizantes compiten por la unión a PG con anti-hPG MAb 5, MAb 6, MAb 7, MAb8, MAb9, MAb10, MAb11, MAb12, MAb13, MAb21, MAb 22, o MAb23.

Un ensayo específico para comprobar si un anticuerpo monoclonal anti-PG es neutralizante puede llevarse a cabo como se expone a continuación. Se siembran células CRC LS174T en una placa de 6 pocillos, como se describe en el Ejemplo 7 a continuación, a aproximadamente 50000 células por pocillo. Las células se tratan a intervalos de 12 horas durante 48 horas con el anticuerpo monoclonal anti-PG de ensayo o un anticuerpo monoclonal control como se indica en el Ejemplo 7, a concentraciones de anticuerpo de aproximadamente 5 µg/ml. Un anticuerpo de ensayo se define como neutralizante en el ensayo, si el número de células de cáncer CRC tratadas con el anticuerpo de ensayo muestra una reducción estadísticamente significativa de por lo menos 10% en el número de células supervivientes comparado con el número de células tratadas con un anticuerpo control, no específico, usando un ensayo de dos colas de Mann-Whitney (con las diferencias consideradas como significativas cuando p<0,05). Los números de células totales se corrigen por el número de células al comienzo del periodo de tratamiento, al que se hace referencia como T0.

Tal y como se usa en la presente memoria, un anticuerpo (Ab) se refiere a una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a, o es inmunológicamente reactiva con, un antígeno particular, e incluye anticuerpos policlonales, monoclonales, modificados por ingeniería genética y formas modificadas de otra manera de anticuerpos, incluyendo pero de manera no limitativa anticuerpos híbridos, anticuerpos humanizados y fragmentos de unión a antígenos de anticuerpos, incluyendo por ejemplo, fragmentos Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG, y scFv. En varias formas de realización, los anticuerpos monoclonales anti-hPG comprenden toda o una parte de una región constante de un anticuerpo. En algunas formas de realización, la región constante es un isotipo seleccionado de entre: IgA (por ejemplo, IgA1 o IgA2), IgD, IgE, IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), e IgM.

El término “anticuerpo monoclonal” tal y como se usa en la presente memoria no está limitado a anticuerpos producidos mediante la tecnología del hibridoma. Un anticuerpo monoclonal deriva de un único clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota o de fago, por cualquier medio disponible o conocido en la técnica. Los anticuerpos monoclonales útiles con la presente descripción pueden prepararse usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica incluyendo el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes y de exposición en fagos, o una combinación de éstas. En muchos usos de la presente descripción, incluyendo el uso in vivo de los anticuerpos monoclonales anti-hPG en seres humanos y los ensayos de detección in vitro, pueden usarse adecuadamente anticuerpos híbridos, primatizados, humanizados o humanos.

El término “scFv” se refiere a un anticuerpo de única cadena Fv en el que los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo tradicional se han unido para formar una cadena.

Las referencias a “VH” se refieren a la región variable de la cadena pesada de una inmunoglobulina de un anticuerpo, incluyendo la cadena pesada de un Fv, scFv, o Fab. Las referencias a “VL” se refieren a la región variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina, incluyendo la cadena ligera de un Fv, scFv, dsFv o Fab. Los anticuerpos (Abs) e inmunoglobulinas (Igs) son glucoproteínas que presentan las mismas características estructurales. Mientras los anticuerpos presentan especificidad de unión para una diana específica, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que carecen de especificidad de diana. Los anticuerpos y las inmunoglobulinas nativas son habitualmente glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena pesada presenta en un extremo un dominio variable (VH) seguido de un número de dominios constantes. Cada cadena ligera presenta un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo.

Los anticuerpos monoclonales anti-hPG de la descripción comprenden regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Las CDR también se conocen como regiones hipervariables tanto en los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada. Las partes más altamente conservadas de los dominios variables se denominan el marco (FR). Como se conoce en la técnica, la posición/límite de aminoácidos que delinea una región hipervariable de un anticuerpo puede variar, dependiendo del contexto y de varias definiciones conocidas en la técnica. Algunas posiciones en un dominio variable pueden apreciarse como posiciones hipervariables híbridas ya que puede considerarse que estas posiciones están en una región hipervariable bajo un conjunto de criterios mientras que puede considerarse que están fuera de una región hipervariable bajo un conjunto diferente de criterios. Una o más de estas posiciones también pueden encontrarse en regiones hipervariables extendidas. La descripción proporciona anticuerpos que comprenden modificaciones en estas posiciones hipervariables híbridas. Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, sobre todo adoptando una configuración de lámina β, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina β. Las CDR de cada cadena se mantienen muy cerca por las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a la diana de los anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of

Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987).

Varios anticuerpos monoclonales anti-hPG que tienen una alta especificidad y afinidad para hPG y una buena actividad antitumoral se han identificado y sus CDR y cadenas variables pesada y ligera se han secuenciado. Se hace referencia a los dominios variables de la cadena pesada y ligera murinos en la presente memoria como mVH y mVL seguido del número del anticuerpo monoclonal correspondiente, por ejemplo mVH.3 y mVL.3 para antihPG MAb3. Los anticuerpos monoclonales anti-hPG presentan tres CDR variables de cadena ligera y tres CDR variables de cadena pesada, a las que se hace referencia como VH CDR1, 2, o 3, y VL CDR1, 2, o 3, respectivamente, seguido del número del anticuerpo monoclonal anti-hPG ejemplificativo. Por ejemplo, VL CDR1 de MAb 3 se indica como VL CDR1.3 y VH CDR1 de MAb 3 se indica como VH CDR1.3. De manera similar, se hace referencia a los dominios variables de cadena pesada y ligera humanos en la presente memoria como hVH y hVL seguido del número del anticuerpo monoclonal correspondiente.

En algunas formas de realización, los anticuerpos monoclonales anti-hPG generados frente a una parte N-terminal de hPG presentan tres CDR variables de cadena ligera y tres CDR variables de cadena pesada, en los que VL CDR1 se selecciona de entre QSIVHSNGNTY (“VL CDR 1.3”; SEC ID nº: 4), QSLVHSSGVTY (“VL CDR 1.4”; SEC ID nº: 10), QSLLDSDGKTY (“VL CDR 1.16”; SEC ID nº: 50), y SQHRTYT (“VL CDR 1.19”; SEC ID nº: 51); VL CDR2 se selecciona de entre KVS (“VL CDR 2.3” y (“VL CDR 2.4”; SEC ID nº: 5), LVS (“VL CDR 2.16”; SEC ID nº: 53), y VKKDGSH (“VL CDR 2.19”; SEC ID nº: 54); VL CDR3 se selecciona de entre FQGSHVPFT (“VL CDR 3.3”; SEC ID nº: 6), SQSTHVPPT (“VL CDR 3.4”; SEC ID nº: 11), WQGTHSPYT (“VL CDR 3.16”; SEC ID nº: 57), y GVGDAIKGQSVFV (“VL CDR 3.19”; SEC ID nº: 58); VH CDR1 se selecciona de entre GYIFTSYW (“VH CDR 1.3”; SEC ID nº: 1), GYTFSSSW (“VH CDR 1.4”; SEC ID nº: 7), GYTFTSYY (“VH CDR 1.16”; SEC ID nº: 39), y GYSITSDYA (“VH CDR 1.19”; SEC ID nº: 40); VH CDR2 se selecciona de entre FYPGNSDS (“VH CDR 2.3”; SEC ID nº: 2), FLPGSGST (“VH CDR 2.4”; SEC ID nº: 8), INPSNGGT (“VH CDR 2.16”; SEC ID nº: 43), y ISFSGYT (“VH CDR 2.19”; SEC ID nº: 44); y VH CDR3 se selecciona de entre TRRDSPQY (“VH CDR 3.3”; SEC ID nº: 3), ATDGNYDWFAY (“VH CDR 3.4” SEC ID nº: 9), TRGGYYPFDY (“VH CDR 3.16”; SEC ID nº: 47), y AREVNYGDSYHFDY (“VH CDR 3.19”; SEC ID nº: 48). Ver la tabla 1A.

En algunas formas de realización, los anticuerpos monoclonales anti-hPG generados frente a una parte C-terminal de hPG presentan tres CDR variables de cadena ligera y tres CDR variables de cadena pesada, en los que VL CDR1 se selecciona de entre KSLRHTKGITF (“VL CDR 1.8”; SEC ID nº: 49) y QSLLDSDGKTY (“VL CDR 1.13”; SEC ID nº: 50); VL CDR2 se selecciona de entre QMS (“VL CDR 2.8”; SEC ID nº: 52) y LVS (“VL CDR 2.13”; SEC ID nº: 53); VL CDR3 se selecciona de entre AQNLELPLT (“VL CDR 3.8”; SEC ID nº: 55) y WQGTHFPQT (“VL CDR 3.13”; SEC ID nº: 56); VH CDR1 se selecciona de entre GFTFTTYA (“VH CDR 1.8”; SEC ID nº: 37) y GFIFSSYG (“VH CDR 1.13”; SEC ID nº: 38); VH CDR2 se selecciona de entre ISSGGTYT (“VH CDR 2.8”; SEC ID nº: 41) y INTFGDRT (“VH CDR 2.13”; SEC ID nº: 42); y VH CDR3 se selecciona de entre ATQGNYSLDF (“VH CDR 3.8”; SEC ID nº: 45) y ARGTGTY (“VH CDR 3.13”; SEC ID nº: 46). Ver la tabla 1B.

Tabla 1A

Anticuerpos monoclonales anti-hPG N-terminales

Inmunógeno: Hibridoma (Depósito #) MAb Secuencias CDR murinas Secuencias VH y VL murinas Secuencias VH y VL humanizadas (proyectado)

N1: 43B9G11 MAb1

N1: WE5H2G7 MAb2

N2: 6B5B11C 10 MAb3 VH CDR 1.3 GYIFTSY W (SEC ID nº 1) mVH 3 (SEC ID nº .12) hVH 3 (SEC ID nº: 21)

VH CDR 2.3: FYPGNSD S (SEC ID nº 2)

VH CDR 3.3: TRRDSP QY (SEC ID nº 3)

VL CDR 1.3: QSIVHSN GNTY (SEC ID nº 4) mVL 3 (SEC ID nº 13) hVL 3 (SEC ID nº: 22)

VL CDR 2.3: KVS (SEC ID nº 5)

VL CDR 3.3: FQGSHV PFT (SEC ID nº 6)

N2: 20D2C3G 2 MAb4 VH CDR 1.4 GYTFSSS W (SEC ID nº 7) mVH 4 (SEC ID nº 14) hVH 4 (SEC ID nº: 23)

VH CDR 2.4: FLPGSGS T (SEC ID nº 8)

VH CDR 3.4: ATDGNY DWFAY (SEC ID nº 9)

VL CDR 1.4: QSLVHSS GVTY (SEC ID nº 10) mVL 4 (SEC ID nº 15) hVL 4 (SEC ID nº: 24)

Anticuerpos monoclonales anti-hPG N-terminales

VL CDR 2.4: KVS (SEC ID nº 5)

VL CDR 3.4: SQSTHVP PT (SEC ID nº 11)

N2: 1E9A4A4 (I-4376) MAb1 5

N2: 1E9D9B6 MAb1 6 VH CDR 1.16 GYTFTSY Y (SEC ID nº 39) mVH 16 (SEC ID nº 61) hVH 16a (SEC ID nº: 84)

VH CDR 2.16: INPSNGG T (SEC ID nº 43) hVH 16b (SEC ID nº: 86)

VH CDR 3.16: TRGGYY PFDY (SEC ID nº 47) hVH 16c (SEC ID nº: 88)

VL CDR 1.16: QSLLDSD GKTY (SEC ID nº 50) mVL 16 (SEC ID nº 65) hVL 16a (SEC ID nº: 85)

VL CDR 2.16: LVS (SEC ID nº 53) hVL 16b (SEC ID nº: 87)

VL CDR 3.16: WQGTHS PYT (SEC ID nº 57) hVL 16c (SEC ID nº: 89)

N2: 1C8D10F 5 MAb1 7

N2: 1A7C3F11 MAb1 8

N2: 1B3B4F11 MAb1 9 VH CDR 1.19 GYSITSD YA (SEC ID nº 40) mVH 19 (SEC ID nº 62) hVH 19a (SEC ID nº: 90)

VH CDR 2.19: ISFSGYT (SEC ID nº 44) hVH 19b (SEC ID nº: 92)

VH CDR 3.19: AREVNY GDSYHF DY (SEC ID nº 48) hVH 19c (SEC ID nº: 94)

VL CDR 1.19: SQHRTYT (SEC ID nº 51) mVL 19 (SEC ID nº 66) hVL 19a (SEC ID nº: 91)

VL CDR 2.19: VKKDGS H (SEC ID nº 54) hVL 19b (SEC ID nº: 93)

VL CDR 3.19: GVGDAIK GQSVFV (SEC ID nº 58) hVL 19c (SEC ID nº: 95)

N2: 1C11F5E8 MAb2 0

Inmunógeno N1 = SWKPRSQQPDAPLG Ahx Cys BSA, también representado como (SEC ID nº 25) Ahx Cys BSA Inmunógeno N2 = SWKPRSQQPDAPLG Ahx Cys KLH, también representado como (SEC ID nº 25) Ahx Cys KLH

En la tabla 1A, todas las secuencias de aminoácidos están representadas usando la orientación convencional N→C. Para cada inmunógeno, el péptido progastrina se sintetizó con un conector de un residuo de ácido aminohexanoico (Ahx) seguido de una cisteína, que se conjugó con un vehículo de albúmina de suero bovino (“BSA”) o hemocianina de lapa (“KLH”).

Tabla 1B

Anticuerpos monoclonales anti-hPG C-terminales

C1: 1B4A11D11 (I-4371) MAb5

C1: 1B6A11F2 (I-4372) MAb6

C1: 1B11E4B11 (I-4373) MAb7

C1: 1C10D3B9 MAb8 VH CDR 1.8 GFTFTT YA (SEC ID nº 37) mV H.8 (SEC ID nº 59) hVH 8a (SEC ID nº 75)

VH CDR: ISSGGT YT (SEC ID nº 41) hVH 8b (SEC ID nº 77)

Anticuerpos monoclonales anti-hPG C-terminales

2.8

VH CDR 3.8: ATQGNY SLDF (SEC ID nº 45) hVH 8c (SEC ID nº 79)

VL CDR 1.8: KSLRHT KGITF (SEC ID nº 49) mVL .8 (SEC ID nº 63) hVL 8a (SEC ID nº 76)

VL CDR 2.8: QMS (SEC ID nº 52) hVL 8b (SEC ID nº 78)

VL CDR 3.8: AQNLEL PLT (SEC ID nº 55) hVL 8c (SEC ID nº 76)

C1: 1D8F5B3 MAb9

C1: 1E1C7B4 MAb1 0

C1: 2B4C8C8 (I-4374) MAb1 1

C1: 2B11E6G4 (I-4375) MAb1 2

C1: 2C6C3C7 MAb1 3 VH CDR 1.13 GFIFSSY G (SEC ID nº 38) mV H.13 (SEC ID nº 60) hVH.1 3a (SEC ID nº 80)

VH CDR 2.13: INTFGD RT (SEC ID nº 42) hVH.1 3b (SEC ID nº 82)

VH CDR 3.13: ARGTGT Y (SEC ID nº 46)

VL CDR 1.13: QSLLDS DGKTY (SEC ID nº 50) mVL .13 (SEC ID nº 64) hVL 13a (SEC ID nº 81)

VL CDR 2.13: LVS (SEC ID nº 53) hVL 13b (SEC ID nº 83)

VL CDR 3.13: WQGTH FPQT (SEC ID nº 56)

C1: 2H9F4B7 MAb1 4

C2: 1F11F5E10 MAb2 1

C2: 1F11F5G9 MAb2 2

C2: 1A11F2C9 MAb2 3

Inmunógeno C1 = KLH Cys Ahx Ahx QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN, también representado como KLH Cys Ahx Ahx (SEC ID nº 27) Inmunógeno C2 = DT Cys Ahx Ahx QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN, también representado como DT Cys Ahx Ahx (SEC ID nº 27)

En la Tabla 1B, todas las secuencias de aminoácidos están representadas usando la orientación convencional N→C. Para cada inmunógeno, el péptido progastrina se sintetizó con un conector de dos residuos de ácido aminohexanoico (Ahx) seguido de una cisteína, que se conjugó con un vehículo de hemocianina de lapa (“KLH”)

5 o toxina de difteria (“DT”).

En algunas formas de realización, las CDR de la cadena pesada VH del anticuerpo monoclonal anti-hPG son VHCDR1.3, VHCDR2.3 y VHCDR3.3. En una forma de realización específica, la cadena VH del anticuerpo monoclonal anti-hPG presenta una secuencia de aminoácidos correspondiente a mVH.3 (SEC ID nº: 12). Ver la

10 figura 2A.

En algunas formas de realización, las CDR de la cadena VL del anticuerpo monoclonal anti-hPG son VLCDR1.3, VLCDR2.3 y VLCDR3.3. En una forma de realización específica, la cadena VL del anticuerpo monoclonal antihPG presenta una secuencia de aminoácidos correspondiente a mVL.3 (SEC ID nº: 13). Ver la figura 2B.

15 En algunas formas de realización, las CDR de la cadena VH del anticuerpo monoclonal anti-hPG son VHCDR1.4, VHCDR2.4 y VHCDR3.4. En una forma de realización específica, la cadena VH del anticuerpo monoclonal antihPG presenta una secuencia correspondiente a mVH.4 (SEC ID nº: 14). Ver la figura 2C.

En algunas formas de realización, las CDR de la cadena VL del anticuerpo monoclonal anti-hPG son VLCDR1.4, VLCDR2.4 y VLCDR3.4 En una forma de realización específica, la cadena VL del anticuerpo monoclonal anti-hPG tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a mVL.4 (SEC ID nº: 15). Ver la figura 2D.

En algunas formas de realización, las CDR de la cadena VH del anticuerpo monoclonal anti-hPG son VHCDR1.8, VHCDR2.8 y VHCDR3.8. En una forma de realización específica, la cadena VH del anticuerpo monoclonal antihPG tiene una secuencia correspondiente a mVH.8 (SEC ID nº: 59). Ver la figura 2E.

En algunas formas de realización, las CDR de la cadena VL del anticuerpo monoclonal anti-hPG son VL CDR1.8, VL CDR2.8 y VL CDR3.8. En una forma de realización específica, la cadena VL del anticuerpo monoclonal antihPG tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a mVL .8 (SEC ID nº: 63). Ver la figura 2F.

En algunas formas de realización, las CDR de la cadena VH del anticuerpo monoclonal anti-hPG son VHCDR1.13, VHCDR2.13 y VHCDR3.13. En una forma de realización específica, la cadena VH del anticuerpo monoclonal anti-hPG tiene una secuencia correspondiente a mVH.13 (SEC ID nº: 60). Ver la figura 2G.

En algunas formas de realización, las CDR de la cadena VL del anticuerpo monoclonal anti-hPG son VL CDR1.13, VL CDR2.13 y VL CDR3.13. En una forma de realización específica, la cadena VL del anticuerpo monoclonal antihPG tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a mVL.13 (SEC ID nº: 64). Ver la figura 2H.

En algunas formas de realización, las CDR de la cadena VH del anticuerpo monoclonal anti-hPG son VHCDR1.16, VHCDR2.16 y VHCDR3.16. En una forma de realización específica, la cadena VH del anticuerpo monoclonal anti-hPG tiene una secuencia correspondiente a mVH.16 (SEC ID nº: 61). Ver la figura 2I.

En algunas formas de realización, las CDR de la cadena VL del anticuerpo monoclonal anti-hPG son VL CDR1.16, VL CDR2.16 y VL CDR3.16. En una forma de realización específica, la cadena VL del anticuerpo monoclonal antihPG tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a mVL.16 (SEC ID nº: 65). Ver la figura 2J.

En algunas formas de realización, las CDR de la cadena VH del anticuerpo monoclonal anti-hPG son VHCDR1.19, VHCDR2.19 y VHCDR3.19. En una forma de realización específica, la cadena VH del anticuerpo monoclonal anti-hPG tiene una secuencia correspondiente a mVH.19 (SEC ID nº: 62). Ver la figura 2K.

En algunas formas de realización, las CDR de la cadena VL del anticuerpo monoclonal anti-hPG son VL CDR1.19, VL CDR2.19 y VL CDR3.19. En una forma de realización específica, la cadena VL del anticuerpo monoclonal antihPG tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente mVL.19 (SEC ID nº: 66). Ver la figura 2L.

En algunas formas de realización, las CDR de la cadena VH del anticuerpo monoclonal anti-hPG son VHCDR1.3, VHCDR2.3 y VHCDR3.3 y las CDR de la cadena VL son VLCDR1.3, VLCDR2.3 y VLCDR3.3. En una forma de realización específica, la cadena VH del anticuerpo monoclonal anti-PG tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a mVH.3 (SEC ID nº: 12) y la cadena VL tiene una secuencia correspondiente a mVL.3 (SEC ID nº: 13).

En algunas formas de realización, las CDR de la cadena VH del anticuerpo monoclonal anti-hPG son VHCDR1.4, VHCDR2.4 y VHCDR3.4 y las CDR de la cadena VL son VLCDR1.4, VLCDR2.4 y VLCDR3.4. En una forma de realización específica, la cadena VH del anticuerpo monoclonal anti-hPG tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a mVH.4 (SEC ID nº: 14) y una cadena VL tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a mVL.4 (SEC ID nº: 15).

En algunas formas de realización, las CDR de la cadena VH del anticuerpo monoclonal anti-hPG son VHCDR1.8, VHCDR2.8 y VHCDR3.8 y las CDR de la cadena VL son VLCDR1.8, VLCDR2.8 y VLCDR3.8. En una forma de realización específica, el anticuerpo monoclonal anti-hPG es anti-hPG MAb 8 descrito en la presente memoria y comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a mVH.8 (SEC ID nº: 59) y una secuencia de aminoácidos correspondiente a mVL.8 (SEC ID nº: 63).

En algunas formas de realización, las CDR de la cadena VH del anticuerpo monoclonal anti-hPG son VHCDR1.3, VHCDR2.13 y VHCDR3.13 y las CDR de la cadena VL son VLCDR1.13, VLCDR2.13 y VLCDR3.13. En una forma de realización específica, el anticuerpo monoclonal anti-hPG es anti-hPG MAb 13 descrito en la presente memoria y comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a mVH.13 (SEC ID nº: 60) y una secuencia de aminoácidos correspondiente a mVL.13 (SEC ID nº: 64).

En algunas formas de realización, las CDR de la cadena VH del anticuerpo monoclonal anti-hPG son VHCDR1.16, VHCDR2.16 y VHCDR3.16 y las CDR de la cadena VL son VLCDR1.16, VLCDR2.16 y VLCDR3.16. En una forma de realización específica, el anticuerpo monoclonal anti-hPG es anti-hPG MAb 16 descrito en la presente memoria y comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a mVH.16 (SEC ID nº: 61) y una secuencia de aminoácidos correspondiente a mVL.16 (SEC ID nº: 65).

En algunas formas de realización, las CDR de la cadena VH del anticuerpo monoclonal anti-hPG son VHCDR1.19, VHCDR2.19 y VHCDR3.19 y las CDR de la cadena VL son VLCDR1.19, VLCDR2.19 y VLCDR3.19. En una forma de realización específica, el anticuerpo monoclonal anti-hPG es anti-hPG MAb 19 descrito en la presente memoria y comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a mVH.19 (SEC ID nº: 62) y una secuencia de aminoácidos correspondiente a mVL.19 (SEC ID nº: 66).

Los anticuerpos monoclonales anti-hPG de la descripción incluyen tanto moléculas intactas como fragmentos de anticuerpo (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F (ab')2) que resultan aptos para unirse específicamente a hPG. Los fragmentos Fab y F (ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se aclaran más rápidamente de la circulación del animal o planta y pueden tener menos unión inespecífica a tejido que un anticuerpo intacto (Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24: 316). Los fragmentos de anticuerpo son útiles por lo tanto en aplicaciones terapéuticas entre otras aplicaciones.

El término “fragmento de anticuerpo” se refiere a una parte de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la región de unión a la diana o variable. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab', F (ab')2 y Fv. Un fragmento “Fv” es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento y unión a la diana. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y una cadena ligera en una asociación firme, no covalente (dímero VH-VL). Es en esta configuración en la que las tres CDR de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a la diana en la superficie del dímero VH-VL. Frecuentemente, las seis CDR confieren especificidad de unión a la diana al anticuerpo. Sin embargo, en algunos casos incluso un único dominio variable (o mitad de un Fv que comprende sólo tres CDR específico para una diana) puede tener la capacidad de reconocer y unirse a la diana, aunque con una afinidad más baja que el sitio de unión completo. Los fragmentos de anticuerpo “Fv de cadena única” o “scFv” comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, en el que estos dominios están presentes en una única cadena de polipéptido. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite a scFv formar la estructura deseada para la unión a la diana. Los “anticuerpos de dominio único” están compuestos por un único dominio VH o VL que presenta suficiente afinidad para hPG. En una forma de realización específica, el anticuerpo de dominio único es un anticuerpo camelizado (ver, por ejemplo, Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231: 25-38).

El fragmento Fab contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxilo del dominio CHl de la cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Los fragmentos F (ab') se producen por la escisión del puente disulfuro de las cisteínas bisagra del producto de digestión con pepsina F (ab')2. Los acoplamientos químicos adicionales de los fragmentos de anticuerpo son conocidos por los expertos en la materia.

Los anticuerpos monoclonales anti-hPG de la descripción pueden ser anticuerpos híbridos. El término anticuerpo “híbrido” tal y como se usa en la presente memoria se refiere a un anticuerpo que tiene secuencias variables derivadas de una inmunoglobulina no humana, tal como anticuerpo de rata o ratón, y regiones constantes de inmunoglobulinas humanas, seleccionadas típicamente de un molde de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos híbridos se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Morrison, 1985, Science 229(4719): 1202-7; Oi et al. 1986, BioTechniques 4: 214-221; Gillies et al. 1985, J. Immunol. Methods 125: 191202; US nº 5.807.715; nº 4.816.567; y nº 4.816.397.

Los anticuerpos monoclonales anti-hPG de la descripción pueden ser humanizados. Las formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de éstas (tales como Fv, Fab, Fab', F (ab')2 u otras subsecuencias de unión a la diana de anticuerpos) que contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulinas no humanas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo o por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de una inmunoglobulina humana, y pueden denominarse “injertadas con CDR.” El anticuerpo humanizado también puede comprender por lo menos una parte de una región constante de una inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una secuencia consenso de una inmunoglobulina humana. Los métodos para la humanización de anticuerpos, incluyendo los métodos para diseñar anticuerpos humanizados, se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Lefranc et al. 2003, Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77; Lefranc et al. 2009, Nucl. Acids Res. 37: D1006-1012; Lefranc, 2008, Mol. Biotechnol. 40: 101-111; Riechmann et al., 1988, Nature

332: 323-7; patentes US nº 5.530.101; nº 5.585.089; nº 5.693.761; nº 5.693.762; y nº 6.180.370 de Queen et al.; documento EP 239 400; publicación PCT WO 91/09967; patente US nº 5.225.539; documentos EP 592 106; EP 519 596; Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28: 489-498; Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7: 805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 969-973; y patente US nº 5.565.332.

Las secuencias para anticuerpos monoclonales anti-hPG humanizados se diseñaron a partir de anticuerpos monoclonales anti-hPG murinos de la presente descripción como se describe en los Ejemplos a continuación. Las formas de realización específicas de anticuerpos humanizados incluyen anticuerpos que comprenden: (1) cualquiera de tres VL CDR y cualquiera de tres VH CDR descritas en la presente memoria; (2) una región

variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEC ID nº: 21 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEC ID nº: 22; (3) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEC ID nº: 23 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEC ID nº: 24; (4) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID nº: 75, 77, y 79 y una región variables de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID nº: 76 y 78; (5) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID nº: 80 y 82 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID nº: 81 y 83;

(6) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID nº: 84, 86, y 88 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID nº: 85, 87, y 89; (7) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID nº: 90, 92, y 94 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID nº: 91, 93, y 95.

Los anticuerpos monoclonales anti-hPG de la descripción pueden ser primatizados. El término “anticuerpo primatizado” se refiere a un anticuerpo que comprende regiones variables de mono y regiones constantes humanas. Los métodos para producir anticuerpos primatizados son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, las patentes US nº 5.658.570; nº 5.681.722; y nº 5.693.780.

Incluidos en los anticuerpos monoclonales anti-hPG están los anticuerpos que compiten con un anticuerpo de referencia, tal como, por ejemplo, un anticuerpo policlonal anti-hPG o cualquiera de los anticuerpos monoclonales anti-hPG descritos en la presente memoria. Los anticuerpos que compiten con los anticuerpos monoclonales anti-hPG de la descripción son útiles para varias aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas. Las formas de realización específicas de anticuerpos monoclonales anti-hPG de referencia adecuados incluyen los anticuerpos descritos en la presente memoria, a título de ejemplo no limitativo, anticuerpos que comprenden cualesquiera tres VL CDR y cualesquiera tres VH CDR descritas en la presente memoria; anticuerpos en los que la cadena VH tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEC ID nº: 12 (mVH.3) y la cadena VL tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEC ID nº: 13 (mVL.3); y anticuerpos en los que la cadena VH tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEC ID nº: 14 (mVH.4) y la cadena VL tiene una secuencia correspondiente a SEC ID nº: 15 (mVL.4), anticuerpos en los que la cadena VH tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEC ID nº: 59 (mVH.8) y la cadena VL tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEC ID nº: 63 (mVL.8); anticuerpos en los que la cadena VH tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEC ID nº: 60 (mVH.13) y la cadena VL tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEC ID nº: 64 (mVL.13); anticuerpos en los que la cadena VH tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEC ID nº: 61 (mVH.16) y la cadena VL tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEC ID nº: 65 (mVL.16); anticuerpos en los que la cadena VH tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEC ID nº: 62 (mVH.19) y la cadena VL tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEC ID nº: 66 (mVL.19) o cualquier combinación de cadenas VH y VL divulgadas en la presente memoria.

Los anticuerpos de referencia adecuados también incluyen anticuerpos producidos por un hibridoma seleccionado de entre el grupo que consiste en 43B9G11, WE5H2G7, 6B5B11C10, 20D2C3G2, 1B4A11D11, 1B6A11F2, 1B11E4B11, 1C10D3B9, 1D8F5B3, 1E1C7B4, 2B4C8C8, 2B11E6G4, 2C6C3C7, 2H9F4B7, 1E9A4A4, 1E9D9B6, 1C8D10F5, 1A7C3F11, 1B3B4F11, 1C11F5E8, 1F11F5E10, 1F11F5G9, y 1A11F2C9; anticuerpos que se unen a un epítopo que incluye los residuos 10 a 14 de hPG (SEC ID nº: 28), residuos 9 a 14 de hPG (SEC ID nº: 29), residuos 4 a 10 de hPG (SEC ID nº: 30), residuos 2 a 10 de hPG (SEC ID nº: 31), o residuos 2 a 14 de hPG (SEC ID nº: 32); y anticuerpos que se unen a un epítopo que incluye los residuos 71 a 74 de hPG (SEC ID nº: 33), residuos 69 a 73 de hPG (SEC ID nº: 34), residuos 76 a 80 de hPG (SEC ID nº: 35), o residuos 67 a 74 de hPG (SEC ID nº: 36).

La capacidad para competir con un anticuerpo monoclonal de la presente descripción para unirse a PG, por ejemplo hPG, puede ensayarse usando un ensayo de competición como sigue. Se recubren placas de 96 pocillos con un anticuerpo de captura (anticuerpo policlonal o monoclonal que reconoce una región N o C terminal de la progastrina que difiere del epítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal de referencia), a una concentración que se debe seleccionar en el intervalo de 1-10 µg/ml, toda la noche a 4°C (0,1 a 1 µg/pocillo). Después de bloquear con 0,1% Tween-20/0,1% BSA en PBS (amortiguador de bloqueo) durante 2h a 22°C, se añade progastrina humana recombinante a una concentración de 10 pM a 1 nM (10 a 1000 pg/pocillo) y se incuba durante 2h a 22°C. Posteriormente, el anticuerpo monoclonal anti-hPG biotinilado de referencia o una mezcla que contiene el anticuerpo monoclonal de referencia se añade junto con concentraciones crecientes de anticuerpos de ensayo no marcados y se incuba durante 1 horas a 22°C. Después de lavar, la detección se lleva a cabo incubando durante 1h a 22°C con un sustrato fluorogénico para peroxidasa de rábano, seguido de la cuantificación de las unidades relativas de luz (RLU) en un luminómetro. Los ensayos se llevan a cabo en duplicado. Los anticuerpos que compiten con un anticuerpo monoclonal anti-hPG de referencia de la presente descripción inhiben la unión del anticuerpo de referencia a hPG. Un anticuerpo que se une al mismo epítopo que

los anticuerpos control resulta apto para competir eficazmente para la unión y así reducirá significativamente (por ejemplo, por lo menos un 50%) la unión del anticuerpo de referencia, como se manifiesta por una reducción en el marcaje unido. La reactividad de los anticuerpos de referencia (marcados) en ausencia de un anticuerpo completamente irrelevante será el valor alto de control. El valor bajo de control se obtendrá incubando los anticuerpos de ensayo no marcados con células que expresan la progastrina e incubando la mezcla célula/anticuerpo con anticuerpos control marcados de exactamente el mismo tipo, en el que ocurrirá la competición y la unión reducida de los anticuerpos marcados. En un ensayo de ensayo, una reducción significativa de la reactividad del anticuerpo marcado en presencia de un anticuerpo de ensayo es indicativa de un anticuerpo de ensayo que reconoce sustancialmente el mismo epítopo.

La inhibición de la unión puede expresarse como una constante de inhibición, o Ki, que se calcula según la fórmula siguiente:

Ki = CI50/(1 + [Concentración de Ab de referencia]/Kd)

En la que CI50 del anticuerpo de ensayo es la concentración del anticuerpo de ensayo que proporciona un 50% de reducción en la unión del anticuerpo de referencia y Kd es la constante de disociación del anticuerpo de referencia, una medida de su afinidad por la progastrina. Los anticuerpos que compiten con los anticuerpos monoclonales anti-hPG descritos en la presente memoria pueden tener una Ki de 10 pM a 10 nM bajo las condiciones de ensayo descritas en la presente memoria.

En varias formas de realización, un anticuerpo monoclonal anti-hPG no marcado de la descripción reduce la unión del anticuerpo de referencia marcado por lo menos un 40%, por lo menos un 50%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos un 80%, por lo menos un 90%, un 100%, o un porcentaje en el intervalo entre cualquiera de los valores anteriores (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-hPG de la descripción reduce la unión del anticuerpo de referencia marcado un 50% a 70%) cuando el anticuerpo monoclonal anti-hPG se usa a una concentración de 0,01 μg/ml, 0,08 μg/ml, 0,4 μg/ml, 2 μg/ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml o a una concentración en el intervalo entre cualquiera de los valores anteriores (por ejemplo, a una concentración en el intervalo de 2 μg/ml a 10 μg/ml).

En la realización de un estudio de competición de anticuerpos entre un anticuerpo de referencia y cualquier anticuerpo de ensayo (independientemente de especie o isotipo), se puede marcar en primer lugar la referencia con un marcaje detectable, tal como biotina o un marcaje enzimático (o incluso radiactivo) para permitir la identificación posterior. En este caso, el anticuerpo de referencia marcado (en concentraciones fijas o crecientes) se incuba con una cantidad conocida de progastrina. El anticuerpo de ensayo no marcado se añade al complejo preunido de progastrina y el anticuerpo marcado. Se mide la intensidad del marcaje unido. Si el anticuerpo de ensayo compite con el anticuerpo marcado para la unión a un epítopo superpuesto, la intensidad disminuirá respecto a la unión del anticuerpo control marcado en ausencia del anticuerpo de ensayo.

Los ensayos de competición son conocidos y pueden adaptarse para proporcionar unos resultados comparables con el ensayo descrito anteriormente. El ensayo puede ser uno cualquiera de un intervalo de ensayos inmunológicos basados en la competición de anticuerpos, y los anticuerpos de referencia se detectarán mediante la detección de su marcaje, por ejemplo, usando estreptavidina en el caso de anticuerpos biotinilados o usando un sustrato cromogénico respecto a un marcaje enzimático (tal como sustrato 3,3'5,5'-tetrametilbencidina (TMB) con la enzima peroxidasa) o simplemente detectando un marcaje radiactivo o un marcaje fluorescente.

También se incluyen en la presente memoria anticuerpos monoclonales anti-hPG que son derivados, modificados covalentemente, o conjugados con otras moléculas, para usarse en aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas. A título de ejemplo no limitativo, los anticuerpos derivados incluyen anticuerpos que han sido modificados, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivación con grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de numerosas modificaciones químicas puede realizarse por técnicas conocidas, incluyendo, pero no limitadas a, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

En otro ejemplo, los anticuerpos de la presente descripción pueden unirse a restos de poli (etilenglicol) (PEG). En una forma de realización específica, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y los restos PEG están unidos mediante cualquier cadena lateral de aminoácido disponible o grupo funcional terminal de aminoácidos localizado en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo cualquier grupo amino libre, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo. Dichos aminoácidos pueden estar presentes de forma natural en el fragmento de anticuerpo o pueden modificarse por ingeniería en el fragmento usando métodos de ADN recombinante. Ver, por ejemplo la patente US nº 5.219.996. Pueden usarse múltiples sitios para unir dos o más moléculas de PEG. Los restos PEG pueden unirse covalentemente mediante un grupo tiol de por lo menos un residuo de cisteína localizado en el fragmento de anticuerpo. Cuando se usa un grupo tiol como el punto de unión, pueden usarse restos efectores apropiadamente activados, por ejemplo derivados selectivos de tiol tales como maleimidas y derivados de cisteína.

En un ejemplo específico, un conjugado de un anticuerpo monoclonal anti-hPG es un fragmento Fab' modificado que está PEGilado, es decir, tiene PEG (poli (etilenglicol)) unido covalentemente a él, por ejemplo, según el método descrito en EP0948544. Ver también Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, (J. Milton Harris (ed.), Plenum Press, Nueva York, 1992); Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, (J. Milton Harris y S. Zalipsky, eds., American Chemical Society, Washington D.C., 1997); y Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, (M. Aslam y A. Dent, eds., Grove Publishers, Nueva York, 1998); y Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54: 531-545. El PEG puede estar unido a un cisteína en la región bisagra. En un ejemplo, un fragmento Fab' modificado con PEG tiene un grupo maleimida unido covalentemente a un único grupo tiol en una región bisagra modificada. Un residuo de lisina puede unirse covalentemente al grupo maleimida y a cada uno de los grupos amino del residuo de lisina puede unirse un polímero metoxipoli (etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20000 Da. El peso molecular total del PEG unido al fragmento Fab' puede ser por lo tanto aproximadamente 40000 Da.

Los anticuerpos monoclonales anti-hPG incluyen anticuerpos marcados, útiles en aplicaciones de diagnóstico. Los anticuerpos pueden usarse para el diagnóstico, por ejemplo, para detectar la expresión de una diana de interés en células específicas, tejidos o suero; o para monitorizar el desarrollo o progresión de una respuesta inmunológica como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse por acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable o “marcaje.” Un marcaje puede conjugarse directamente o indirectamente con un anticuerpo monoclonal anti-hPG de la descripción. El marcaje puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcajes con radioisótopos, marcajes isotópicos, o marcajes fluorescentes) o, en el caso de un marcaje enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que es detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales que emiten positrones usando varias tomografías de emisión de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. La sustancia detectable puede acoplarse o conjugarse directamente al anticuerpo (o fragmento de éste) o indirectamente, mediante un intermediario (tal como, por ejemplo, un conector conocido en la técnica) usando técnicas conocidas en la técnica. Los ejemplos de marcajes enzimáticos incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; patente US nº 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano (HRPO), fosfatasa alcalina, β-galactosidasa, acetilcolinesterasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa, y semejantes. Los ejemplos de complejos de grupo prostético adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbelliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriacinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo, cloruro de dimetilamina-1-nafalensulfonilo, o ficoeritrina y similares, un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol, los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y aecuorina, los ejemplos de materiales isotópicos adecuados incluyen 13C, 15N, y deuterio, y los ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 111In o 99Tc.

Los anticuerpos monoclonales anti-hPG de todas las especies de origen están incluidos en la presente invención. Los anticuerpos naturales ejemplificativos no limitativos incluyen anticuerpos derivados de seres humanos, simios, pollo, cabras, conejos y roedores (por ejemplo, ratas, ratones y hámsteres) (Ver, por ejemplo, Lonberg et al., documento WO93/12227; patente US nº 5.545.806; y Kucherlapati, et al., documento WO 91/10741; patente US nº 6.150.584). Los anticuerpos naturales son anticuerpos producidos por un animal hospedante después de haber sido inmunizado con un antígeno, tal como un polipéptido.

Ácidos nucleicos y sistemas de expresión

La presente divulgación comprende moléculas de ácido nucleico que codifican genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulinas para anticuerpos monoclonales anti-hPG, vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos y células hospedadoras que pueden producir los anticuerpos monoclonales anti-hPG de la divulgación.

Un anticuerpo monoclonal anti-hPG de la descripción puede prepararse por la expresión recombinante de genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulinas en una célula hospedadora. Para expresar un anticuerpo de forma recombinante, una célula hospedadora se transfecta con uno o más vectores de expresión recombinantes que portan fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina del anticuerpo de manera que las cadenas ligera y pesada se expresan en la célula hospedadora y, opcionalmente, se secretan en el medio en el que se cultivan las células hospedadoras, medio del cual pueden recuperarse los anticuerpos. Las metodologías de ADN recombinante estándar se usan para obtener genes de cadena pesada y ligera de anticuerpos, incorporar estos genes en vectores de expresión recombinantes e introducir los vectores en células hospedadoras, tales como las descritas en Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición (Sambrook, Fritsch y Maniatis (eds), Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds., Greene Publishing Associates, 1989) y en la patente US nº 4.816.397.

Para generar ácidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos monoclonales anti-hPG, se obtienen en primer lugar fragmentos de ADN que codifican las regiones variables de la cadena ligera y pesada. Estos ADN pueden

obtenerse por amplificación y modificación de ADN de estirpe germinal o ADNc que codifica secuencias variables de cadena ligera y pesada, por ejemplo usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las secuencias de ADN de estirpe germinal para los genes de la región variable de la cadena pesada y ligera se conocen en la técnica (Véanse, por ejemplo, Lefranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77; Lefranc et al. 2009, Nucl. Acids Res. 37: D1006-1012; Lefranc, 2008, Mol. Biotechnol. 40: 101-111; la base de datos de secuencias de la estirpe germinal humana “VBASE”; ver también Kabat, E. A. et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication nº 91-3242; Tomlinson et al. 1992, J. Mol. Biol. 22T: 116-198; y Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24: 827-836).

Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican los segmentos VH y VL relacionados con el anticuerpo monoclonal anti-hPG, estos fragmentos de ADN pueden manipularse adicionalmente por técnicas de ADN recombinante estándar, por ejemplo para convertir los genes de la región variable en genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, en genes de fragmento Fab o en un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH se une de manera funcional a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un conector flexible. El término “unido de manera funcional,” tal y como se usa en este contexto, se pretende que signifique que los dos fragmentos de ADN se unen de manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en marco.

El ADN aislado que codifica la región VH puede convertirse en un gen de cadena pesada de longitud completa por unión de manera funcional del ADN que codifica VH con otra molécula de ADN que codifica las regiones constantes de cadena pesada (CHl, CH2, CH3 y, opcionalmente, CH4). Las secuencias de los genes de la región constante de cadena pesada humana se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Kabat, E.A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication nº 91-3242) y los fragmentos de ADN que comprenden estas regiones pueden obtenerse por amplificación por PCR estándar. La región constante de cadena pesada puede ser una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero en determinadas formas de realización es una región constante de IgG1 o IgG4. Para un gen de cadena pesada de fragmento Fab, el ADN que codifica VH puede unirse de manera funcional con otra molécula de ADN que codifica únicamente la región constante CH1 de cadena pesada.

El ADN aislado que codifica la región VL puede convertirse en un gen de cadena ligera de longitud completa (así como un gen de cadena ligera de Fab) por la unión de manera funcional del ADN que codifica VL con otra molécula de ADN que codifica la región constante de la cadena ligera, CL. Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena ligera humana se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición (U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication nº 91-3242)) y los fragmentos de ADN que comprenden estas regiones pueden obtenerse por amplificación por PCR estándar. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda, pero en determinadas formas de realización es una región constante kappa. Para crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL se unen de manera funcional con otro fragmento que codifica un conector flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4~Ser)3 (SEC ID nº: 99), de manera que las secuencias de VH y VL pueden expresarse como una proteína de cadena única contigua, con las regiones VL y VH unidas por el conector flexible (Ver, por ejemplo, Bird et al., 1988, Science 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., 1990, Nature 348: 552-554).

Para expresar los anticuerpos monoclonales anti-hPG de la descripción, los ADN que codifican cadenas ligeras y pesadas parciales o de longitud completa, obtenidos como se ha descrito anteriormente, se insertan en vectores de expresión de manera que los genes están unidos de manera funcional con secuencias de control de la transcripción y la traducción. En este contexto, el término “unido de manera funcional” se pretende que signifique que un gen de anticuerpo está ligado en un vector de manera que las secuencias de control de la transcripción y la traducción en el vector cumplen su función pretendida de regular la transcripción y la traducción del gen de anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se seleccionan para ser compatibles con la célula hospedadora de expresión usada. El gen de la cadena ligera de anticuerpo y el gen de la cadena pesada de anticuerpo pueden insertarse en vectores separados o, más típicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión.

Los genes de anticuerpo se insertan en el vector de expresión por métodos estándares (por ejemplo, ligadura de sitios de restricción complementarios en el fragmento del gen de anticuerpo y el vector, o ligadura de extremos romos si no están presentes sitios de restricción). Antes de la inserción de las secuencias de la cadena ligera o pesada relacionada con el anticuerpo monoclonal anti-hPG, el vector de expresión puede portar ya secuencias de región constante de anticuerpo. Por ejemplo, una estrategia para convertir las secuencias VH y VL relacionadas con el anticuerpo monoclonal anti-hPG en genes de anticuerpo de longitud completa es insertarlas en vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de cadena pesada y constantes de cadena ligera, respectivamente, de manera que el segmento VH está unido de manera funcional al o a los segmentos CH en el vector y el segmento VL está unido de manera funcional al segmento CL en el vector. Además o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción

de la cadena de anticuerpo de una célula hospedadora. El gen de la cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector de manera que el péptido señal está unido en marco con el extremo amino del gen de la cadena de anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína que no es una inmunoglobulina).

Además de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la descripción portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de la cadena de anticuerpo en una célula hospedadora. El término “secuencia reguladora” se pretende que incluya promotores, amplificadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de cadena de anticuerpo. Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990). Los expertos en la materia apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora que se va a transformar, el nivel de expresión de proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras adecuadas para la expresión en células hospedadoras de mamíferos incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteínas en células de mamífero, tales como promotores y/o amplificadores derivados de citomegalovirus (CMV) (tales como el promotor/amplificador CMV), Virus de Simio 40 (SV40) (tal como el promotor/amplificador SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Para una mayor descripción de los elementos reguladores virales, y secuencias de éstos, ver, por ejemplo, las patentes US nº 5.168.062 por Stinski, US nº 4.510.245 por Bell et al., y US nº 4.968.615 por Schaffner et al.

Además de los genes de cadena de anticuerpo y de las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la descripción pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células hospedadoras (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes de marcadores seleccionables. El gen de marcador seleccionable facilita la selección de células hospedadoras en las que el vector se ha introducido (Véanse, por ejemplo, patentes US nº 4.399.216, nº 4.634.665 y nº 5.179.017, todas por Axel et al.). Por ejemplo, típicamente el gen de marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedadora en la que se ha introducido el vector. Los genes de marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para usarse en células hospedadoras DHFR-con selección/amplificación con metotrexato) y el gen neo (para selección con G418). Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, el o los vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera se transfectan en una célula hospedadora por técnicas estándares. Las distintas formas del término “transfección” se pretende que comprendan una amplia variedad de técnicas usadas comúnmente para la introducción de ADN exógeno en unas células hospedadoras procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, lipofección, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano y similares.

Es posible expresar los anticuerpos de la descripción en células hospedadoras procariotas o eucariotas. En determinadas formas de realización, la expresión de los anticuerpos se realiza en células eucariotas, por ejemplo, células hospedadoras de mamíferos, para la secreción óptima de un anticuerpo plegado apropiadamente e inmunológicamente activo. Las células hospedadoras de mamíferos ejemplificativas para la expresión de los anticuerpos recombinantes de la descripción incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo células CHO DHFR-, descritas en Urlaub y Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA

77: 4216-4220, usadas con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp, 1982, Mol. Biol. 159: 601-621), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. Cuando los vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpo se introducen en células hospedadoras de mamíferos, los anticuerpos se producen cultivando las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permtir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que crecen las células hospedadoras. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas estándares. Las células hospedadoras también pueden usarse para producir partes de anticuerpos intactos, tales como fragmentos Fab o moléculas scFv. Debe apreciarse que las variaciones del procedimiento anterior están en el alcance de la presente descripción. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula hospedadora con ADN que codifica la cadena ligera o la cadena pesada (pero no ambas) de un anticuerpo monoclonal anti-hPG de la presente divulgación.

La tecnología de ADN recombinante también puede usarse para eliminar parte o todo el ADN que codifica una o las dos cadenas ligera y pesada que no es necesaria para la unión a hPG. Las moléculas expresadas a partir de dichas moléculas truncadas de ADN también están comprendidas por los anticuerpos de la divulgación.

Para la expresión recombinante de un anticuerpo monoclonal anti-hPG de la descripción, la célula hospedadora puede cotransfectarse con dos vectores de expresión de la divulgación, un primer vector que codifica un polipéptido derivado de cadena pesada y el segundo vector que codifica un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos o cada uno puede contener un marcador seleccionable separado. Alternativamente, puede usarse un único vector que codifica ambos polipéptidos de cadena pesada y ligera.

Una vez que un ácido nucleico codifica una o más partes de un anticuerpo monoclonal anti-hPG, pueden introducirse alteraciones o mutaciones adicionales en la secuencia codificadora, por ejemplo para generar ácidos nucleicos que codifican anticuerpos con diferentes secuencias CDR, anticuerpos con una afinidad reducida para el receptor Fc o anticuerpos de diferentes subclases.

Los anticuerpos monoclonales anti-hPG de la descripción también pueden producirse por síntesis química (por ejemplo, por los métodos descritos en Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.). Los anticuerpos variantes también pueden generarse usando una plataforma sin células (ver, por ejemplo, Chu et al., Biochemia nº 2, 2001 (Roche Molecular Biologicals).

Una vez que se ha producido un anticuerpo monoclonal anti-hPG de la descripción por expresión recombinante, puede purificarse por cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, cromatografía de columna de intercambio iónico, de afinidad y de tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos monoclonales anti-hPG de la presente descripción o fragmentos de éstos pueden fusionarse con secuencias polipeptídicas heterólogas descritas en la presente memoria o conocidas de otra manera en la técnica para facilitar la purificación.

Una vez aislado, el anticuerpo monoclonal anti-hPG puede, si se desea, purificarse adicionalmente, por ejemplo, por cromatografía líquida de alto rendimiento (ver, por ejemplo, Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology (Work and Burdon, eds., Elsevier, 1980), o por cromatografía de filtración en gel en una columna SuperdexTM 75 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia).

La presente divulgación proporciona células hospedadoras que pueden producir anticuerpos monoclonales antihPG. Las células hospedadoras pueden ser células modificadas por ingeniería usando técnicas de ADN recombinante para expresar genes que codifican genes de cadena pesada y ligera o hibridomas derivados de un organismo adecuado y seleccionados por la capacidad de producir los anticuerpos deseados.

Las células hospedadoras aptas para producir anticuerpos monoclonales anti-PG pueden ser hibridomas. Los métodos para generar hibridomas son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Kohler y Milstein, 1975, Nature

256: 495) y un ejemplo se proporciona a continuación. Generalmente, un animal hospedador, tal como un ratón se inmuniza con un inmunógeno, tal como un péptido de interés, para inducir el desarrollo de linfocitos, por ejemplo células del bazo, que producen anticuerpos aptos para unirse específicamente al inmunógeno. Alternativamente, los linfocitos aislados, incluyendo células del bazo, células de ganglios linfáticos o linfocitos de sangre periférica, pueden inmunizarse in vitro. Los linfocitos se fusionan con una estirpe celular inmortalizada, tal como una estirpe celular de mieloma, usando un agente de fusión adecuado (por ejemplo, polietilenglicol), para formar una estirpe celular de hibridoma. Las estirpes celulares inmortalizadas adecuadas pueden ser de origen mamífero, tal como murino, bovino o humano. Las células de hibridoma se cultivan en cualquier medio adecuado que contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células no inmortalizadas, no fusionadas. Por ejemplo, cuando se usan las células parentales que carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), las fusiones pueden crecer en un medio que contiene hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio “HAT”) que inhibe el crecimiento de las células parentales, no fusionadas.

En algunas formas de realización, los anticuerpos monoclonales anti-hPG N-terminales tienen CDR de cadena ligera variable (VL) que corresponden a la VL del anticuerpo monoclonal que se puede obtener de los hibridomas 43B9G11 (que producen anti-hPG MAb 1), WE5H2G7 (que producen anti-hPG MAb 2), 6B5B11C10 (que producen anti-hPG MAb 3), 20D2C3G2 (que producen anti-hPG MAb 4), 1E9A4A4 (que producen anti-hPG MAb 15), 1E9D9B6 (que producen anti-hPG MAb 16), 1C8D10F5 (que producen anti-hPG MAb 17), 1A7C3F11 (que producen anti-hPG MAb 18), 1B3B4F11 (que producen anti-hPG MAb 19), y 1C11F5E8 (que producen anti-hPG MAb 20).

En algunas formas de realización, los anticuerpos monoclonales anti-hPG N-terminales tienen CDR de VL y VH que corresponden a las CDR de VL y VH de los anticuerpos monoclonales que se pueden obtener de los hibridomas anteriores.

En algunas formas de realización, los anticuerpos monoclonales anti-hPG C-terminales tienen CDR de VL que corresponden a la VL del anticuerpo monoclonal que se puede obtener de los hibridomas 1B4A11D11 (que producen anti-hPG MAb 5), 1B6A11F2 (que producen anti-hPG MAb 6), 1B11E4B11 (que producen anti-hPG MAb 7), 1C10D3B9 (que producen anti-hPG MAb 8), 1D8F5B3 (que producen anti-hPG MAb 9), 1E1C7B4 (que producen anti-hPG MAb 10), 2B4C8C8 (que producen anti-hPG MAb 11), 2B11E6G4 (que producen anti-hPG MAb 12), 2C6C3C7 (que producen anti-hPG MAb 13), 2H9F4B7 (que producen anti-hPG MAb 14), 1F11F5E10 (que producen anti-hPG MAb 21), 1F11F5G9 (que producen anti-hPG MAb 22), y 1A11F2C9 (que producen antihPG MAb 23).

El algunas formas de realización, los anticuerpos monoclonales anti-hPG C-terminales tienen CDR de VL y VH que corresponden a las CDR de VL y VH de los anticuerpos monoclonales que se pueden obtener de los

hibridomas anteriores.

En una forma de realización, se proporciona una célula hospedadora apta para producir un anticuerpo anti-hPG que comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEC ID nº: 12 y una región variable de cadena ligera que comprende SEC ID nº: 13. En una forma de realización, se proporciona una célula hospedadora apta para producir un anticuerpo anti-hPG que comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEC ID nº: 14 y una región variable de cadena ligera que comprende SEC ID nº: 15. En una forma de realización, se proporciona una célula hospedadora apta para producir un anticuerpo anti-hPG que comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEC ID nº: 59 y una región variable de cadena ligera que comprende SEC ID nº: 63. En una forma de realización, se proporciona una célula hospedadora apta producir un anticuerpo anti-hPG que comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEC ID nº: 60 y una región variable de cadena ligera que comprende SEC ID nº: 64. En una forma de realización, se proporciona una célula hospedadora apta para producir un anticuerpo anti-hPG que comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEC ID nº: 61 y una región variable de cadena ligera que comprende SEC ID nº: 65. En una forma de realización, se proporciona una célula hospedadora apta para producir un anticuerpo anti-hPG que comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEC ID nº: 62 y una región variable de cadena ligera que comprende SEC ID nº: 66.

En algunas formas de realización, se proporciona una célula hospedadora de la descripción que comprende un ácido nucleico seleccionado de entre: una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la región variable de cadena pesada de SEC ID nº: 12, 14, 59, 60, 61, y 62; y un ácido nucleico seleccionado de entre: una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la región variable de cadena ligera de SEC ID nº: 13, 15, 63, 64, 65, y 66. En algunas formas de realización, la región variable de cadena pesada está codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre: SEC ID nº: 16, 18, 67, 68, 69 y 70, En algunas formas de realización, la región variable de cadena ligera está codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre: SEC ID nº: 17, 19, 71, 72, 73, y 74.

En algunas formas de realización, se proporcionan secuencias polinucleotídicas que codifican una región variable de cadena pesada de un anticuerpo monoclonal anti-hPG humanizado. Las formas de realización específicas incluyen polinucleótidos que codifican un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID nº: 21, 23, 75, 77, 79, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, y 94. En algunas formas de realización, se proporcionan secuencias polinucleotídicas que codifican una región variable de cadena ligera de un anticuerpo monoclonal anti-hPG humanizado. Las formas de realización específicas incluyen polinucleótidos que codifican un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID nº: 22, 24, 76, 78, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, y 95.

Actividades biológicas de los anticuerpos monoclonales anti-hPG

Se ha implicado a PG en la supervivencia y/o proliferación de células de tumor de CRC. Aunque no se pretende la vinculación a ninguna teoría de operación, se piensa que, a través de la unión a PG, los anticuerpos monoclonales anti-PG neutralizantes bloquean o inhiben la capacidad de PG de interaccionar con su o sus parejas de señalización. Esto, a su vez, bloquea o inhibe las respuestas celulares a la progastrina, tal como proliferación celular, diferenciación celular reducida y/o muerte celular reducida, y/o crecimiento tumoral. Como consecuencia de estas actividades, los anticuerpos monoclonales anti-hPG neutralizantes de la descripción pueden usarse en una variedad de contextos in vitro, in vivo, y ex vivo para unirse a PG y bloquear la señalización dependiente de PG.

De acuerdo con esto, la divulgación proporciona métodos para inhibir las respuestas dependientes de PG en células de CRC. Generalmente, los métodos comprenden poner en contacto una célula de CRC con, o exponer una población de células a, un anticuerpo monoclonal anti-PG neutralizante en una cantidad eficaz para inhibir una o más de las respuestas inducidas por PG de células de CRC, por ejemplo proliferación y/o supervivencia de células de CRC. La proliferación, o inhibición de ésta, in vitro e in vivo puede determinarse según los ensayos para medir incrementos en el número de células, número de tumores o tamaño de los tumores en el tiempo. Los ensayos para la inhibición de la proliferación de células y tumores son muy conocidos en la técnica.

El bloqueo de la señalización dependiente de PG puede inhibir la supervivencia de las células de CRC mediante el incremento de la muerte celular. La inhibición de la supervivencia de las células de CRC in vitro o in vivo puede determinarse midiendo la reducción del número de células de cáncer de hígado en el tiempo (por ejemplo, 24 o 48 horas). Los ensayos para muerte celular son muy conocidos en la técnica. Además, un ejemplo de un ensayo de supervivencia celular se proporciona en la presente memoria.

Los estudios sugieren además que la inhibición de la señalización dependiente de PG en células de tumor de CRC puede inhibir la supervivencia de las células de CRC desencadenando la muerte celular programada, o apoptosis. La inducción de la apoptosis puede determinarse por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo de manera no limitativa medir cambios en la expresión de genes que tienen actividad pro-o antiapoptótica. Por ejemplo, un incremento de la expresión en el tiempo (por ejemplo, 48 horas) de un gen proapoptótico, tal como, por ejemplo, Bax, es indicativo de un incremento de la apoptosis. De manera similar,

una disminución de la expresión en el tiempo (por ejemplo, 72 o 96 horas) de un gen antiapoptótico, tal como a título de ejemplo no limitativo, Bcl-2, es indicativa de un incremento de la apoptosis. Las técnicas para medir cambios en la expresión génica, tal como PCR cuantitativa en tiempo real, son muy conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Hollande et al., documento WO 2007/135542.

La inhibición de la señalización dependiente de progastrina también estimula la diferenciación celular. De acuerdo con esto, los métodos para inhibir la proliferación y/o supervivencia de las células de CRC comprende administrar una cantidad de un anticuerpo monoclonal anti-PG neutralizante eficaz para inducir la diferenciación de las células de CRC in vitro o in vivo. La diferenciación de las células de CRC puede determinarse midiendo incrementos en el tiempo (por ejemplo, 24 o 48 horas) de la expresión de marcadores genéticos para la diferenciación celular, tales como, a título de ejemplo no limitativo, Muc-2 u otros marcadores para células intestinales diferenciadas (por ejemplo, células caliciformes). Los cambios en la expresión génica pueden medirse por cualquier medio conocido en la técnica. Ver, por ejemplo, Hollande et al., documento WO 2007/135542. También pueden ensayarse otros genes cuya expresión o represión sea dependiente de PG, tales como ICAT, usando métodos estándares. ver id.

Composiciones farmacéuticas

Los anticuerpos monoclonales anti-PG pueden formularse en composiciones. Opcionalmente, las composiciones que pueden comprender uno o más agentes terapéuticos adicionales, tales como los segundos agentes terapéuticos descritos a continuación, se proporcionan en la presente memoria. Las composiciones se suministrarán habitualmente como parte de una composición farmacéutica estéril que incluirá normalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición puede estar en cualquier forma adecuada (dependiendo del método deseado para administrarla a un paciente).

Los anticuerpos monoclonales anti-hPG de la descripción pueden administrarse a un paciente por una variedad de rutas tales como ruta oral, transdérmica, subcutánea, intranasal, intravenosa, intramuscular, intraocular, tópica, intratecal e intracerebroventricular. La ruta más adecuada para la administración en cualquier caso dado dependerá del anticuerpo particular, del sujeto y de la naturaleza y gravedad de la enfermedad y del estado físico del sujeto. El anticuerpo puede formularse como una disolución acuosa y administrarse por inyección subcutánea.

Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse convenientemente en formas de dosis unitarias que contiene una cantidad predeterminada de un anticuerpo monoclonal anti-hPG de la descripción por dosis. Dicha unidad puede contener a título de ejemplo no limitativo 5 mg a 5 g, por ejemplo 10 mg a 1 g, o 20 a 50 mg. Los vehículos farmacéuticamente aceptables para su utilización en la descripción pueden adoptar una amplia variedad de formas dependiendo, por ejemplo, de la afección que se va a tratar o de la ruta de administración.

Las composiciones farmacéuticas de la descripción pueden prepararse para almacenamiento como formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas mezclando el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales típicamente utilizados en la técnica (todos los cuales se refieren en la presente memoria como “vehículos”), es decir, agentes de amortiguación, agentes estabilizadores, conservantes, isotonificadores, detergentes no iónicos, antioxidantes y otros aditivos misceláneos. Ver, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edición (Osol, ed. 1980). Dichos aditivos no deben ser tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones utilizadas.

Los agentes de amortiguación ayudan a mantener el pH en el intervalo que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Pueden estar presentes en una concentración que varía de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM. Los agentes de amortiguación adecuados para su utilización en la presente descripción incluyen ácidos orgánicos e inorgánicos y sales de los mismos tales como amortiguadores citrato (por ejemplo, mezcla de citrato de monosodio-citrato de disodio, mezcla de ácido cítrico-citrato de trisodio, mezcla de ácido cítrico-citrato de monosodio, etc.), amortiguadores succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico-succinato de monosodio, mezcla de ácido succínico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido succínicosucinato de disodio, etc.), amortiguadores tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico-tartrato de sodio, mezcla de ácido tartárico-tartrato de potasio, mezcla de ácido tartárico-hidróxido de sodio, etc.), amortiguadores fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico-fumarato de monosodio, mezcla de ácido fumárico-fumarato de disodio, mezcla de fumarato de monosodio-fumarato de disodio, etc.), amortiguadores gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico-gliconato de sodio, mezcla de ácido glucónico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido glucónico-gliconato de potasio, etc.), amortiguador oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico-oxalato de sodio, mezcla de ácido oxálico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido oxálico-oxalato de potasio, etc.), amortiguadores lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico-lactato de sodio, mezcla de ácido láctico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido láctico-lactato de potasio, etc.) y amortiguadores acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato de sodio, mezcla de ácido acético-hidróxido de sodio, etc.). Además, pueden usarse amortiguadores fosfato, amortiguadores histidina y sales de trimetilamina tales como Tris.

Pueden añadirse conservantes para retrasar el crecimiento microbiano y pueden añadirse en cantidades comprendidas entre 0,2% y 1% (p/v). Los conservantes adecuados para su utilización con la presente

descripción incluyen fenol, alcohol bencílico, meta-cresol, metil parabeno, propil parabeno, cloruro de octadecildimetilbencil amonio, haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro y yoduro), cloruro de hexametonio, y alquil parabenos tales como metil o propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, y 3pentanol. Los isotonificantes conocidos algunas veces como “estabilizadores” pueden añadirse para asegurar la isotonicidad de las composiciones líquidas de la presente descripción e incluyen alcoholes de azúcar polihídricos, por ejemplo alcoholes de azúcar trihídricos o mayores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los estabilizadores se refieren a una amplia categoría de excipientes que pueden variar en función desde un agente de volumen hasta un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda en la prevención de la desnaturalización o adherencia a la pared del contenedor. Los estabilizadores típicos pueden ser alcoholes de azúcar polihídricos (mencionados anteriormente); aminoácidos tales como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc., azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar, tales como lactosa, trealosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol y similares, incluyendo ciclitoles tales como inositol, polietilenglicol; polímeros de aminoácidos, agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tioctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, α-monotioglicerol y tiosulfato de sodio, polipéptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, péptidos de 10 residuos o menos), proteínas tales como albúmina de suero humano, albúmina de suero bovino, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona, monosacáridos, tales como xilosa, manosa, fructosa, glucosa, disacáridos tales como lactosa, maltosa, sacarosa y trisacáridos tales como rafinosa; y polisacáridos tales como dextrano. Los estabilizadores pueden estar presentes en el intervalo de 0,1 a 10000 partes en peso del peso de la proteína activa.

Los tensioactivos o detergentes no iónicos (también conocidos como “agentes de humectación”) pueden añadirse para ayudar a solubilizar el agente terapéutico así como para proteger la proteína terapéutica frente a la agregación inducida por la agitación, lo que también permite que la formulación pueda exponerse a estrés de cizalla superficial sin causar la desnaturalización de la proteína. Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 80, etc.), polioxámeros (184, 188, etc.), polioles plurónicos, monoéteres de polioxietilen sorbitán (TWEEN®-20, TWEEN®-80, etc.). Los tensioactivos no iónicos pueden estar presentes en un intervalo de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, por ejemplo aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml.

Los excipientes misceláneos adicionales incluyen agentes de volumen (por ejemplo, almidón), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metionina, vitamina E), y codisolventes.

Los anticuerpos monoclonales anti-PG pueden administrarse individualmente, como mezclas de uno o más anticuerpos monoclonales anti-PG, mezclados o en combinación con otros agentes útiles para tratar CRC, o como adyuvantes de otra terapia para CRC. Los ejemplos de terapias de combinación y adyuvantes adecuadas se proporcionan a continuación.

La presente descripción comprende kits farmacéuticos que contienen anticuerpos monoclonales anti-hPG neutralizantes (incluyendo conjugados de anticuerpo) de la descripción. El kit farmacéutico es un envase que comprende un anticuerpo monoclonal anti-hPG neutralizante (por ejemplo, bien en forma liofilizada o como una disolución acuosa) y uno o más de los siguientes:

 un segundo agente terapéutico, por ejemplo como se describe a continuación,

 un dispositivo para administrar el anticuerpo monoclonal anti-hPG, por ejemplo una pluma, aguja y/o jeringa; y

 agua o amortiguador de grado farmacéutico para resuspender el anticuerpo si el anticuerpo está en forma liofilizada.

Cada dosis unitaria del anticuerpo monoclonal anti-hPG puede estar envasada separadamente y un kit puede contener una o más dosis unitarias (por ejemplo, dos dosis unitarias, tres dosis unitarias, cuatro dosis unitarias, cinco dosis unitarias, ocho dosis unitarias, diez dosis unitarias o más). En una forma de realización específica, las unas o más dosis unitarias están contenidas cada una en una jeringa o pluma.

Dosificaciones eficaces

Los anticuerpos monoclonales anti-PG neutralizantes, las composiciones de los mismos, se usarán generalmente en una cantidad eficaz para conseguir el resultado pretendido, por ejemplo una cantidad eficaz para tratar CRC en un sujeto que lo necesite. Las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos monoclonales anti-PG neutralizantes pueden administrarse a pacientes (por ejemplo, sujetos humanos) a dosificaciones terapéuticamente eficaces. Tal y como se usa en la presente memoria, una dosificación “terapéuticamente eficaz” es una cantidad que confiere un beneficio terapéutico. En el contexto de la terapia de CRC, un beneficio terapéutico significa cualquier mejoría de CRC, incluyendo una cualquiera de, o combinación de, parar o retrasar la progresión de CRC (por ejemplo, de un estadio del cáncer colorrectal al siguiente), parar o retardar el empeoramiento o deterioro de los síntomas o signos de CRC, reducir la gravedad de CRC, inducir la

remisión de CRC, inhibir la proliferación de células de tumor de CRC, el tamaño del tumor de CRC o el número de tumores de CRC o reducir los niveles séricos de PG.

La cantidad de anticuerpo monoclonal anti-PG neutralizante administrada dependerá de una variedad de factores, incluyendo la naturaleza y estadio del CRC que se está tratando, la forma, ruta y sitio de administración, el régimen terapéutico (por ejemplo, si se usa un segundo agente terapéutico), la edad y el estado del sujeto particular que se está tratando, la sensibilidad del paciente que se está tratando a anticuerpos monoclonales anti-PG. La dosificación apropiada puede ser determinada fácilmente por un experto en la materia. Finalmente, un médico determinará las dosificaciones apropiadas que se van a usar. Esta dosificación puede repetirse tan frecuentemente como sea apropiado. Si se desarrollan efectos secundarios la cantidad y/o frecuencia de la dosificación puede alterarse o reducirse, según la práctica clínica normal. La dosificación y el régimen de tratamiento adecuados pueden establecerse monitorizando el progreso de la terapia usando técnicas convencionales conocidas para los expertos en la materia.

Las dosificaciones eficaces pueden estimarse inicialmente a partir de ensayos in vitro. Por ejemplo, una dosis inicial para su utilización en animales puede formularse para conseguir una concentración circulante en sangre o suero de anticuerpo monoclonal anti-PG que está en o por encima de la afinidad de unión del anticuerpo para la progastrina como se mide in vitro. El cálculo de las dosificaciones para conseguir dichas concentraciones circulantes en sangre o suero teniendo en cuenta la biodisponibilidad del anticuerpo particular está dentro de las capacidades de los expertos en la materia. Como guía, el lector se refiere a Fingl & Woodbury, “General Principles” en Goodman and Gilman’s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Capítulo 1, última edición, Pagamonon Press, y las referencias citadas en el mismo.

Las dosificaciones iniciales pueden estimarse a partir de datos in vivo, tales como modelos animales. Los modelos animales útiles para someter a ensayo la eficacia de los compuestos para tratar CRC son muy conocidos en la técnica. Además, en los ejemplos a continuación se describen modelos animales de CRC. Los expertos en la materia pueden adaptar rutinariamente dicha información para determinar las dosificaciones adecuadas para la administración a seres humanos.

La dosis eficaz de un anticuerpo monoclonal anti-hPG neutralizante de la descripción puede estar comprendida entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 75 mg/kg por administración única (por ejemplo, bolo), múltiples administraciones o administración continua o para conseguir una concentración en suero de 0,015000 μg/ml concentración en suero por administración única (por ejemplo, bolo), múltiples administraciones o administración continua o cualquier intervalo eficaz o valor en éste dependiendo de la afección que se está tratando, la ruta de administración y la edad, peso y estado del sujeto. En una determinada forma de realización, cada dosis puede estar comprendida entre aproximadamente 0,5 μg y aproximadamente 50 μg por kilogramo de peso corporal, por ejemplo entre aproximadamente 3 μg y aproximadamente 30 μg por kilogramo de peso corporal.

La cantidad, frecuencia y duración de la administración dependerán de una variedad de factores, tales como la edad, peso y afección patológica del paciente. Un régimen terapéutico para la administración puede continuar durante 2 semanas hasta indefinidamente, durante 2 semanas hasta 6 meses, de 3 meses a 5 años, de 6 meses a 1 o 2 años, de 8 meses a 18 meses, o similares. Opcionalmente, el régimen terapéutico proporciona una administración repetida, por ejemplo, una vez al día, dos veces al día, cada dos días, tres días, cinco días, una semana, dos semanas, o un mes. La administración repetida puede ser a la misma dosis o a una dosis diferente. La administración puede repetirse una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, diez veces o más. Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal anti-hPG puede administrarse como una dosis única o durante el curso de un régimen terapéutico, por ejemplo, durante el curso de una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, tres meses, seis meses, un año o más.

Métodos terapéuticos

La capacidad de los anticuerpos monoclonales anti-hPG neutralizantes de la presente descripción para bloquear las respuestas dependientes de PG, incluyendo la proliferación celular, los hace útiles para tratar cáncer colorrectal. De acuerdo con esto, en otro aspecto, la presente descripción proporciona métodos para tratar CRC en un paciente que lo necesita. Generalmente, los métodos comprenden administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal anti-hPG neutralizante de la descripción.

Un “sujeto” o “paciente” al que se administra un anticuerpo monoclonal anti-hPG de la descripción es preferentemente un mamífero tal como un no primate (por ejemplo, vaca, cerdo, caballo, gato, perro, rata, etc.) o un primate (por ejemplo, mono o ser humano). El sujeto o paciente puede ser un ser humano, tal como un paciente adulto o un paciente pediátrico.

Los pacientes adecuados para la terapia con un anticuerpo monoclonal anti-hPG son pacientes diagnosticados con CRC. El CRC puede ser de cualquier tipo y estar en cualquier estadio o manifestación. Los sujetos adecuados incluyen pacientes con tumores de CRC (operables o inoperables), pacientes cuyos tumores se han

eliminado o reseccionado quirúrgicamente, pacientes con un tumor de CRC que comprende células portadoras de una mutación en un oncogén, tal como, por ejemplo, RAS o APC, pacientes que han recibido otra terapia para CRC en combinación con o adyuvante a la terapia con anticuerpo monoclonal anti-hPG. Otra terapia para CRC incluye, pero no está limitada a, tratamiento quimioterápico, terapia de radiación, resección quirúrgica y tratamiento con uno o más antibióticos terapéuticos adicionales, como se detalla a continuación.

La terapia con anticuerpo anti-hPG puede combinarse con, o ser adyuvante de, uno o más tratamientos distintos. Otros tratamientos incluyen de manera no limitativa tratamiento quimioterápico, terapia de radiación, resección quirúrgica y terapia con anticuerpo como se describe en la presente memoria.

La terapia con anticuerpo monoclonal anti-hPG puede ser adyuvante a otro tratamiento, incluyendo resección quirúrgica.

La terapia de combinación como se proporciona en la presente memoria implica la administración de por lo menos dos agentes a un paciente, el primero de los cuales es un anticuerpo monoclonal anti-hPG neutralizante de la descripción y el segundo de los cuales es un segundo agente terapéutico. El anticuerpo monoclonal antihPG neutralizante y el segundo agente terapéutico pueden administrarse simultáneamente, sucesivamente o separadamente.

Tal y como se usa en la presente memoria, el anticuerpo monoclonal anti-hPG neutralizante y el segundo agente terapéutico se dice que se administran sucesivamente si se administran al paciente el mismo día, por ejemplo durante la misma visita del paciente. La administración sucesiva puede ocurrir con una separación de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 horas. Por el contrario, el anticuerpo monoclonal anti-hPG de la descripción y el segundo agente terapéutico se dice que se administran separadamente si se administran al paciente en días diferentes, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-hPG de la descripción y el segundo agente terapéutico pueden administrarse en intervalos de 1 día, 2 días o 3 días, una semana, 2 semanas o mensualmente. En los métodos de la presente descripción, la administración del anticuerpo monoclonal anti-hPG de la descripción pede preceder o seguir a la administración del segundo agente terapéutico.

Como ejemplo no limitativo, el anticuerpo monoclonal anti-hPG neutralizante y el segundo agente terapéutico pueden administrarse simultáneamente durante un periodo de tiempo, seguido de un segundo periodo de tiempo en el que la administración del anticuerpo monoclonal anti-hPG de la descripción y del segundo agente terapéutico se alterna.

Las terapias de combinación de la presente descripción pueden resultar en un efecto más que aditivo, o sinérgico, proporcionando beneficios terapéuticos en el que ni el anticuerpo monoclonal anti-hPG neutralizante ni el segundo agente terapéutico se administra en una cantidad que, sola, es terapéuticamente eficaz. Así, dichos agentes pueden administrarse en cantidades menores, reduciendo la posibilidad y/o gravedad de los efectos adversos.

Un segundo agente terapéutico puede ser un agente quimioterápico. Los agentes quimioterápicos incluyen de manera no limitativa moléculas radiactivas, toxinas, a las que se hace referencia asimismo como citotoxinas o agentes citotóxicos, que incluyen cualquier agente que es perjudicial para la viabilidad de las células, agentes, y liposomas u otras vesículas que contienen compuestos quimioterápicos. Los ejemplos de agentes quimioterápicos adecuados incluyen de manera no limitativa 1-dehidrotestosterona, 5-fluorouracil decarbazina, 6mercaptopurina, 6-tioguanina, actinomicina D, adriamicina, aldesleuquina, agentes alquilantes, alopurinol sodio, altretamina, amifostina, anastrozol, antramicina (AMC)), agentes antimitóticos, cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), diamino dicloro platino, antraciclinas, antibióticos, antimetabolitos, asparaginasa, BCG vivo (intravesical), fosfato de betametasona sodio y acetato de betametasona, bicalutamida, sulfato de bleomicina, busulfán, calcio leucouorina, caliqueamicina, capecitabina, carboplatino, lomustina (CCNU), carmustina (BSNU), clorambucilo, cisplatino, cladribina, colchicina, estrógenos conjugados, ciclofosfamida, ciclotosfamida, citarabina, citarabina, citocalasina B, citoxán, dacarbazina, dactinomicina, dactinomicina (anteriormente actinomicina), daunirrubicina HCL, daunorrucbicina citrato, denileuquina diftitox, dexrazoxano, dibromomanitol, dihidroxi antracin diona, docetaxel, dolasetrón mesilato, doxorrubicina HCL, dronabinol, L-asparaginasa de E. coli, emetina, epoetina-α, L-asparaginasa de Erwinia, estrógenos esterificados, estradiol, fosfato de estramustina sodio, bromuro de etidio, etinil estradiol, etidronato, factor etopósido citrororum, fosfato de etopósido, filgrastim, floxuridina, fluconazol, fosfato de fludarabina, fluorouracilo, flutamida, ácido folínico, gemcitabina HCL, glucocorticoides, acetato de goserelina, gramicidina D, granisetrón HCL, hidroxiurea, idarrubicina HCL, ifosfamida, interferón α-2b, irinotacán HCL, letrozol, leucovorina calcio, acetato de leuprolida, levamisol HCL, lidocaína, lomustina, maitansinoide, mecloretamina HCL, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, melfalán HCL, mercaptipurina, mesna, metotrexato, metiltestosterona, mitramicina, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, nilutamida, acetato de octreótido, ondansetrona HCL, oxaliplatino, paclitaxel, pamidronato disodio, pentostatina, pilocarpina HCL, plimicina, polifeprosán 20 con implante de carmustina, porfimer sodio, procaína, procarbazina HCL, propranolol, rituximab, sargramostim, estreptozotocina, tamoxifeno, taxol, tegafur, tenipósido, tenopósido, testolactona, tetracaína, tioepa clorambucilo, tioguanina, tiotepa, topotecán HCL, citrato de toremifeno, trastuzumab, tretinoína, valrrubicina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina y tartrato de vinorelbina

Los anticuerpos monoclonales anti-hPG neutralizantes descritos en la presente memoria pueden administrarse a un paciente que necesita tratamiento para cáncer colorrectal recibiendo una combinación de agentes quimioterápicos. Las combinaciones ejemplificativas de agentes quimioterápicos incluyen 5-fluorouracilo (5FU) en combinación con leucovorina (ácido folínico o LV); capecitabina, en combinación con uracilo (UFT) y leucovorina; tegafur en combinación con uracilo (UFT) y leucovorina; oxaliplatino en combinación con 5FU, o en combinación con capecitabina; irinotacán en combinación con capecitabina, mitomicina C en combinación con 5FU, irinotacán o capecitabina. El uso de otras combinaciones de agentes quimioterápicos descritos en la presente memoria también es posible.

Como se conoce en la técnica relevante, los regímenes de quimioterapia para cáncer colorrectal que usan combinaciones de diferentes agentes quimioterápicos se han estandarizado en ensayos clínicos. Dichos regímenes se conocen frecuentemente por acrónimos e incluyen 5FU Mayo, 5FU Roswell Park, LVFU2, FOLFOX, FOLFOX4, FOLFOX6, bFOL, FUFOX, FOLFIRI, IFL, XELOX, CAPOX, XELIRI, CAPIRI, FOLFOXIRI. Véanse, por ejemplo, Chau, I., et al., 2009, Br. J. Cancer 100: 1704-19 y Field, K., et al., 2007, World J. Gastroenterol. 13: 3806-15.

Los anticuerpos monoclonales anti-hPG neutralizantes también pueden combinarse con otros anticuerpos terapéuticos. De acuerdo con esto, la terapia con anticuerpo monoclonal anti-hPG puede combinarse con, o administrarse como adyuvante con un anticuerpo monoclonal diferente tal como, a título de ejemplo no limitativo un anticuerpo monoclonal anti-EGFR (receptor de EGF) o un anticuerpo monoclonal anti-VEGF. Los ejemplos específicos de anticuerpos anti-EGFR incluyen cetuximab y panitumumab. Un ejemplo específico de un anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab.

Detección de progastrina usando anticuerpos anti-hPG

Los anticuerpos monoclonales anti-PG, ya sean neutralizantes o no neutralizantes, también son útiles para aplicaciones que dependen de la detección de la PG tales como diagnóstico de CRC o monitorización del tratamiento en el CRC de un sujeto. De acuerdo con esto, la presente descripción proporciona un método para diagnosticar cáncer colorrectal en un paciente, que comprende determinar la cantidad de progastrina en una muestra del paciente usando un anticuerpo monoclonal anti-hPG según la presente descripción. Generalmente, los métodos para diagnosticar cáncer colorrectal en un paciente comprenden medir la progastrina en una muestra obtenida de un paciente usando los anticuerpos monoclonales anti-hPG de la descripción, en el que la medida de 20 pM a 400 pM de progastrina en la muestra es indicativa de cáncer colorrectal. La progastrina puede medirse en muestras, por ejemplo, de sangre, suero, plasma, tejido y/o células. La detección de hPG puede realizarse usando ensayos conocidos en la técnica y/o descritos en la presente memoria, tales como, ELISA, ELISA sándwich, inmunotransferencia (transferencia Western), inmunoprecipitación, tecnología BIACORE y similares.

Como se indica en la presente memoria, la progastrina no es sino uno de varios polipéptidos diferentes que resultan del procesamiento posterior a la traducción del producto del gen de la gastrina. El diagnóstico, la monitorización y otros métodos descritos en la presente memoria detectan específicamente hPG a diferencia de otros productos del gen de la gastrina, incluyendo productos de degradación. De acuerdo con esto, en unas formas de realización específicas, hPG se detecta usando un ELISA como se describe en la presente memoria, en el que se usan dos anticuerpos frente a hPG, dirigidos al extremo N y C terminal de hPG respectivamente. En algunas formas de realización, uno de los dos anticuerpos usados para la detección es un anticuerpo monoclonal anti-hPG como se describe en la presente memoria. Los niveles de hPG comprendidos entre 20 pM y 400 pM son indicativos de cáncer colorrectal.

En general, el procedimiento para determinar los niveles de hPG usando los anticuerpos monoclonales anti-hPG es como se expone a continuación. Se prepara una superficie, tal como los pocillos de una placa de 96 pocillos, a la que se une una cantidad conocida de un primer anticuerpo, “de captura”, frente a hPG. El anticuerpo de captura puede ser, por ejemplo, un anticuerpo anti-hPG que se une al extremo C o N terminal de hPG. Después de bloquear, se aplica una muestra de ensayo a la superficie seguido de un periodo de incubación. La superficie se lava para eliminar el antígeno no unido y se aplica una disolución que contiene un segundo anticuerpo, “de detección”, frente a hPG. El anticuerpo de detección puede ser cualquiera de los anticuerpos monoclonales antihPG descritos en la presente memoria, siempre que el anticuerpo de detección se una a un epítopo diferente que el del anticuerpo de captura. Por ejemplo, si el anticuerpo de captura se une a una región peptídica C-terminal de hPG, un anticuerpo de detección adecuado será uno que se una a una región peptídica N-terminal de hPG. Los niveles de progastrina pueden detectarse bien directamente (si, por ejemplo, el anticuerpo de detección está conjugado con un marcaje detectable) o indirectamente (mediante un anticuerpo secundario marcado que se une al anticuerpo de detección anti-hPG).

En una forma de realización específica, los niveles de hPG se miden como se expone a continuación en una muestra de ensayo. Se recubren placas de 96 pocillos con entre 0,5 y 10 µg/ml de un anticuerpo policlonal antihPG C-terminal de conejo y se incuba toda la noche. Las placas se lavan tres veces en PBS-Tween (0,05%) y se bloquean con 2% (p/v) de leche seca desnatada en PBS-Tween (0,05%). Separadamente, las muestras de

ensayo, muestras control (blanco o muestras de plasma o suero negativas para PG), y entre aproximadamente 5 pM (0,5 x 10-11 M) y aproximadamente 0,1 nM (1x10-10 M) de un estándar de referencia de hPG (hPG liofilizada diluida en plasma o suero negativo para PG) se preparan en un diluyente apropiado (por ejemplo, PBS-Tween 0,05%). Las muestras se incuban en las placas recubiertas durante entre 2 y 4 horas a 37°C, o alternativamente entre 12 y 16 horas a 21°C. Después de la incubación, las placas se lavan tres veces con PBS-Tween (0,05%) y se incuban con entre 0,001 y 0,1 µg/ml de un anticuerpo monoclonal anti-hPG N-terminal como se describe en la presente memoria, acoplado a peroxidasa de rábano (HRP) (Nakane et al., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22(12): 1084-1091) durante 30 minutos a 21°C. Las placas se lavan tres veces en PBS-Tween (0,05%) y se añade el sustrato de HRP durante 15 minutos a 21°C. La reacción se interrumpe añadiendo 100 µl de 0,5M ácido sulfúrico y se toma una medida de densidad óptica a 405 nm. Los niveles de hPG de la muestra de ensayo se determinan por comparación con una curva estándar construida a partir de las medidas derivadas del estándar de referencia de hPG.

Típicamente, los pacientes se diagnostican tomando como base procedimientos invasivos tales como evaluación histológica de tejido de biopsia así como otros procedimientos invasivos tales como colonoscopia. El CRC se divide en 5 estadios desglosados en estadio 0 (cáncer limitado al recubrimiento más interno del colon o recto), estadio 1 (cáncer en la pared interna del colon o recto), estadio 2 (cáncer extendido a través de la pared del colon pero no encontrado en los ganglios linfáticos adyacentes), estadio 3 (cáncer encontrado en los ganglios linfáticos y tejido que rodea al colon o recto), y estadio 4 (el cáncer se ha diseminado a otras partes del cuerpo). Desde una perspectiva histológica, los tumores colorrectales presentan un amplio espectro de neoplasmas, comprendidos entre crecimientos benignos y cáncer invasivo y son predominantemente tumores derivados del epitelio (es decir, adenomas o adenocarcinomas). Las lesiones pueden clasificarse en tres grupos: pólipos no neoplásicos, pólipos neoplásicos (pólipos adenomatosos, adenomas), y cánceres. Los pólipos adenomatosos son tumores benignos que pueden sufrir transformación maligna y se han clasificado en tres tipos histológicos, con potencial maligno creciente: tubular, tubulovelloso y velloso. Los adenocarcinomas también se han categorizado según su histología en adenocarcinoma mucinoso (coloide); adenocarcinoma en anillo de sello; tumores escirro; y neuroendocrino.

A diferencia de los medios actuales para diagnosticar CRC, la presente descripción proporciona métodos para diagnosticar a sujetos con CRC en ausencia de análisis histológico o estadio de la enfermedad, tomando como base la medida de los niveles de hPG que pueden determinarse a partir de una muestra de sangre. Además, los métodos de la presente descripción son útiles para seleccionar pacientes con CRC adecuados para terapia monoclonal anti-hPG independientemente de cómo se ha diagnosticado a un paciente.

Los niveles séricos de PG también son útiles para evaluar la eficacia del tratamiento de CRC. De acuerdo con esto, la presente descripción proporciona un método para monitorizar la eficacia de la terapia de cáncer colorrectal que comprende determinar los niveles de PG en un paciente que se está tratando para CRC. Los métodos para monitorizar la eficacia de la terapia de cáncer colorrectal comprenden determinar repetidamente los niveles de hPG usando un anticuerpo monoclonal anti-PG de la presente descripción en un paciente con cáncer colorrectal que se está sometiendo a tratamiento para cáncer colorrectal, en el que una disminución en los niveles circulantes de hPG del paciente durante un intervalo de tratamiento es indicativa de la eficacia del tratamiento. Por ejemplo, puede tomarse una primera medida de los niveles circulantes de hPG de un paciente seguido de una segunda medida mientras o después de que el paciente recibe tratamiento para cáncer colorrectal. Las dos medidas se comparan y una disminución en los niveles de hPG es indicativa de beneficio terapéutico.

En un aspecto, la divulgación proporciona kits de diagnóstico que contienen los anticuerpos monoclonales antihPG (incluyendo conjugados de anticuerpo). El kit de diagnóstico es un envase que comprende por lo menos un anticuerpo monoclonal anti-hPG de la descripción (por ejemplo, bien en forma liofilizada o como una disolución acuosa) y uno o más reactivos útiles para llevar a cabo un ensayo de diagnóstico (por ejemplo, diluyentes, un anticuerpo marcado que se une a un anticuerpo monoclonal anti-hPG, un sustrato apropiado para el anticuerpo marcado, hPG en una forma apropiada para usarse como un control positivo y estándar de referencia, un control negativo). En unas formas de realización específicas, un kit comprende dos anticuerpos anti-hPG, en el que por lo menos uno de los anticuerpos es un anticuerpo monoclonal anti-hPG. Opcionalmente, el segundo anticuerpo es un anticuerpo policlonal anti-hPG. En algunas formas de realización, el kit de la presente descripción comprende un anticuerpo monoclonal anti-hPG N-terminal como se describe en la presente memoria.

Los anticuerpos anti-hPG pueden estar marcados, como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, el kit puede incluir un anticuerpo marcado que se une a un anticuerpo monoclonal anti-hPG y se conjuga con una enzima. Cuando el anticuerpo monoclonal anti-hPG u otro anticuerpo se conjuga con una enzima para detección, el kit puede incluir sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un sustrato precursor que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, pueden incluirse otros aditivos, tales como estabilizadores, amortiguadores (por ejemplo, un amortiguador de bloqueo o amortiguador de lisis) y semejantes. Los anticuerpos monoclonales anti-hPG incluidos en un kit de diagnóstico pueden inmovilizarse en una superficie sólida o, alternativamente, una superficie sólida (por ejemplo, un portaobjetos) en la que puede inmovilizarse el anticuerpo se incluye en el kit. Las cantidades relativas de los diferentes reactivos pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones en disolución de los reactivos que optimizan sustancialmente la sensibilidad

del ensayo. Los anticuerpos y los demás reactivos pueden proporcionarse (individualmente o combinados) como polvos secos, habitualmente liofilizados, que incluyen excipientes que, en disolución, proporcionarán una disolución de reactivo que tiene la concentración apropiada.

5 Los kits pueden incluir materiales de instrucción que contienen instrucciones (por ejemplo, protocolos) para la práctica de los métodos de diagnóstico. Aunque los materiales de instrucción comprenden típicamente materiales escritos o impresos, no están limitados a a los mismos. La presente invención comprende un medio apto para almacenar dichas instrucciones y comunicarlas al usuario final. Dichos medios incluyen de manera no limitativa medios de almacenamiento electrónico (por ejemplo, discos magnéticos, cintas, cartuchos, chips), medios

10 ópticos (por ejemplo, CD ROM), y similares. Dichos medios pueden incluir direcciones de sitios de internet que proporcionan dichos materiales de instrucción.

6. Ejemplos

15 Los ejemplos siguientes son ilustrativos y no limitativos.

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos monoclonales frente a progastrina

Inmunógenos para progastrina humana

20 Se generaron varios inmunógenos para desarrollar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales frente a la progastrina humana. Los antígenos usados previamente para generar anticuerpos policlonales, tales como progastrina humana de longitud completa e inmunógenos basados en los residuos 70 a 80 de hPG, no dieron lugar a una respuesta inmunitaria monoclonal ni dieron lugar a anticuerpos monoclonales específicos de PG.

25 Como se describe con mayor detalle a continuación, los antígenos de 14 aminoácidos y más largos, que incluían secuencias únicas de hPG en el extremo N-terminal y C-terminal de la proteína, fueron aptos para inducir una respuesta inmunitaria adecuada en animales y se usaron para generar hibridomas que producen más de 20 anticuerpos monoclonales diferentes frente a hPG. Sorprendentemente, varios inmunógenos que incluían los residuos 55 a 80 de hPG, algunos de los cuales también se encuentran en otros péptidos derivados del gen de la

30 gastrina, se usaron con éxito para generar anticuerpos monoclonales que eran específicos para hPG. La tabla siguiente resume los inmunógenos ensayados.

Tabla 2

Experimento: Inmunógeno nº de clones positivos

1: Progastrina humana (SEC ID nº: 20) 0*

1: (SEC ID nº: 26)-Ahx-Cys-BSA 2

2: (SEC ID nº: 26)-Ahx-Cys-KLH
2

3: (SEC ID nº: 26)-Ahx-Cys-KLH 8

1: BSA-Cys-Ahx-Ahx-(SEC ID nº: 97) 0

2: KLH-Cys-Ahx-Ahx-(SEC ID nº: 97) 0

3: KLH-Cys-Ahx-Ahx-(SEC ID nº: 96) 10

DT-Cys-Ahx-Ahx-(SEC ID nº: 96): 3

* Los ratones inmunizados no presentaron ninguna respuesta inmunitaria.

35 Los inmunógenos presentados en la tabla 2 se prepararon según las técnicas conocidas en la técnica, usando síntesis química de la secuencia peptídica y el conector, seguido de entrecruzamiento con el vehículo albúmina de suero bovino (BSA), hemocianina de lapa (KLH), o toxina de la difteria (DT) usando un agente de entrecruzamiento apropiado (por ejemplo, MBS (éster de m-Maleimidobenzoil-N-hidrosuccinimida),

40 glutaraldehído o Sulfo-SMCC (Sulfosuccinimidil 4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato). (Coligan JE et al., Current protocols in Immunology, Vol. 2, Nueva York: John Wiley and Sons; 1996, p 9.0, 1-9.0,15; Harlow DL. Antibodies: A Laboratory Manual. Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory; 1998, p72-87). Los conectores usados fueron uno o dos residuos de ácido aminohexanoico (Ahx) acoplados a un residuo de cisteína.

45 En cada uno de tres experimentos, se inyectaron a los ratones Balb/c 4 a 5 veces inmunógenos N-terminales, y 2 a 4 veces inmunógenos C-terminales. Cada inyección administró 10 µg del inmunógeno con Ribi, Alun o de adyuvante de Freund.

Fusiones celulares y cribado de hibridomas

50 El suero de cada ratón se ensayó por ELISA frente al inmunógeno y se recogieron los esplenocitos de los ratones con la respuesta inmunitaria más fuerte. Los esplenocitos se fusionaron con células de mieloma Sp2 usando polietilenglicol y se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 15000 a 35000 células por pocillo. Las células fusionadas se seleccionaron, usando un medio que contiene hipoxantina, aminopterina, y

55 timidina (medio HAT).

Los sobrenadantes de los hibridomas se cribaron por ELISA respecto a la capacidad de unirse al inmunógeno y a la progastrina de longitud completa. Se realizaron tres ciclos de cribado para asegurar que únicamente se seleccionaron los hibridomas que producen de manera estable anticuerpos que reconocen hPG de longitud completa y el inmunógeno.

El cribado de los hibridomas y anticuerpos monoclonales para determinar la unión a diferentes péptidos PG se realizó usando una técnica ELISA como se describe a continuación. Este protocolo se usó para cribar para unión a PG de los esplenocitos fusionados, subclones del primer y segundo ciclo, así como para verificar la especificidad de los anticuerpos frente a PG, comparado con otros péptidos derivados del gen de la gastrina.

Brevemente, se incubaron placas de 96 pocillos toda la noche a 4°C con la concentración o concentraciones apropiadas de un péptido de ensayo en disolución salina amortiguada con fosfato (PBS), después de lo cual los pocillos se lavaron tres veces con disolución de lavado (PBS y 0,1% Tween-20), y se incubaron durante 2 horas a 22°C con 100 µl de disolución de bloqueo (PBS, 0,1% Tween-20, 0,1% albúmina de suero bovino o hidrolizado de caseína) por pocillo. Después del bloqueo, los pocillos se lavaron tres veces y se añadió el anticuerpo primario -el anticuerpo que se va a ensayar-. Para el cribado inicial de los esplenocitos fusionados, se añadieron 50 µl del sobrenadante de cultivo de cada cultivo que se va a ensayar a cada pocillo de la placa. En los ensayos realizados en anticuerpos monoclonales, se añadieron 100 µl del anticuerpo de ensayo en PBS y 0,1% Tween20 a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 2 horas a 22°C, después de lo cual la disolución de anticuerpo primario se desechó y se reemplazó, después de una etapa de lavado (3X 100 µl de disolución de lavado, como se ha indicado anteriormente), por disolución de bloqueo que contiene el anticuerpo secundario, que se une al anticuerpo primario y está acoplado a una enzima. El anticuerpo secundario fue un anticuerpo IgG (Fc) antirratón de cabra acoplado a peroxidasa de rábano. Después de 1 hora de incubación con el anticuerpo secundario, se añadieron 100 µl de disolución de sustrato (por ejemplo, Fast OPD, o dihidrocloruro de O-Fenilendiamina, disponible en Sigma-Aldrich Co., preparado según las direcciones del fabricante) a cada pocillo y se incubó en oscuridad durante 20 minutos a 22°C. La reacción se interrumpió añadiendo 50 µl de 4N ácido sulfúrico y se determinó la cantidad de sustrato catalizado midiendo la densidad óptica (D.O.) a 492 nm. La conversión del sustrato es proporcional a la cantidad de anticuerpo primario (de ensayo) unido al antígeno. Los experimentos se hicieron en duplicado y las medidas de DO se representaron como una función de la concentración de antígeno o anticuerpo dependiendo del objetivo del experimento. Las muestras se clasificaron como positivas para anticuerpos anti-PG si la D.O. medida estaba entre 0,2 y 1,5. El mismo intervalo de D.O. se usó para identificar los anticuerpos que se unieron al péptido inmunógeno usado para inocular a los animales de ensayo.

Los materiales y reactivos ejemplificativos usados en el ensayo son los siguientes:

Producto: Fuente Referencia

Placas de 96 pocillos Greiner Microlon: Dutscher # 655092

10X DPBS: Dutscher # P04-53500

Tween-20: Sigma # 63158

BSA (para bloqueo): Euromedex # 04-100-810-C

Caseína hidrolizada (cuando se usa en lugar de BSA): Sigma 22090

Sobrenadantes de hibridoma o anticuerpos monoclonales N-terminales o C-terminales: BioRéalités Como se describen en la presente memoria

IgG (Fc) antirratón de cabra, acoplada con peroxidasa: Thermo # 31439

Fast OPD: Sigma # P9187

95-97% Ácido Sulfúrico: Sigma # 30743

Los péptidos ejemplificativos usados en el cribado de hibridomas y anticuerpos monoclonales fueron los siguientes:

Péptidos de cribado: Fuente Referencia

BSA: Euromedex # 04-100-810-C

Progastrina humana recombinante: BioRéalités McQueen et al., 2002, J. Protein Chem., 21(7): 465-471.

Gastrina humana I (G-17): Sigma # 53673

Gastrina extendida con glicina 17 (G-Gly): Auspep # S10082

KLH: Pierce (Perbio) # 77653

Péptido flanqueante C-terminal (CTFP): Auspep # R41345

La progastrina humana recombinante se produjo como se describe en McQueen et al, 2002, J. Protein Chem. 21: 465-471) con pequeñas modificaciones. Brevemente, células bacterianas BL21 DE3 Star (InVitrogen) se transformaron con un vector que contiene la secuencia de la progastrina humana de longitud completa en un núcleo PGEX-GST-TEV (GE Healthcare). Las bacterias se hicieron crecer en medio LB que contiene 0,5 mM IPTG durante 3 horas a 37°C. Los sedimentos bacterianos se rompieron usando una Prensa French, y las

fracciones tanto solubles como no solubles se separaron por centrifugación. Posteriormente, se aisló hPG etiquetada con GST usando una columna de afinidad de glutatión y PG se escindió de GST con la proteasa del virus del mosaico del tabaco NIa (TEV). Finalmente, PG se dializó frente al amortiguador final (10mM Hepes, 0,5 % BSA, pH 7,4).

Los hibridomas se clonaron en primer lugar, después se subclonaron y se amplificaron. Los hibridomas positivos se seleccionaron tomando como base los criterios siguientes: (1) especificidad de PG e inmunógeno, (2) afinidad relativa de los anticuerpos, (3) crecimiento de las células del hibridoma, (4) secreción de anticuerpos, y (5) monoclonalidad de los hibridomas. Los ensayos y los criterios de selección fueron como se expone a continuación.

Para especificidad, los sobrenadantes de los hibridomas de ensayo se ensayaron por ELISA como se ha descrito anteriormente (50 µl de una dilución 1 en 2 del sobrenadante en el medio de ensayo PBS). Los hibridomas se clasificaron como positivos si la medida de D.O. estaba ente 0,2 y 1,5 en un ensayo con hPG o el inmunógeno usado para inocular los ratones de ensayo. Como criterio adicional para la especificidad, los clones se seleccionaron tomando como base la ausencia de unión a otros péptidos derivados del gen de la gastrina. La ausencia de unión se midió como una diferencia no estadísticamente significativamente diferente entre la señal de los pocillos de ensayo y la señal media de los pocillos control que contienen sólo PBS.

Para la caracterización de la afinidad, se ensayaron diluciones seriadas de los anticuerpos por ELISA para unión a hPG, como se ha descrito anteriormente. Las diluciones estándar usadas en los ensayos de los anticuerpos N-terminales fueron 0, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 ng/ml. Las diluciones estándar usadas en ensayos de anticuerpos C-terminales fueron 0, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 ng/ml.

El crecimiento de las células de hibridoma a través de múltiples ciclos de cultivo seriado se evaluó por observación microscópica dos días después de la siembra. Se espera que las células proliferen y llenen el pocillo unas 48 horas después de la siembra. Se realizó la dilución seriada (típicamente, una primera dilución a 1:5, seguido de por lo menos 2 diluciones más a 1:10), seguido de observación microscópica a las 48 horas para confirmar un crecimiento adecuado. Las células de los hibridomas que cumplen este criterio se diluyeron y sembraron de nuevo, para observarse con el microcopio 48 horas más tarde. Dichos ciclos de “dilución-siembraobservación” se repitieron 3 veces antes de que clasificar un hibridoma como que cumple los criterios de “crecimiento”.

La secreción de anticuerpos se ensayó realizando ELISA usando hPG como se ha descrito anteriormente en diluciones seriadas (1/2, 1/20, 1/200, 1/500, 1/1000, 1/2000) de los sobrenadantes sin células.

La monoclonalidad se determinó sembrando un clon o hibridoma en una placa de 96 pocillos a una densidad de 0,6 células/pocillo e incubando durante dos semanas. A las dos semanas, los sobrenadantes se ensayaron para unión a hPG por ELISA y la naturaleza clonal de la población se determinó tomando como base presentar un valor DO consistente en por lo menos el 90% de los pocillos que contienen células vivas.

Anticuerpos monoclonales frente a progastrina de longitud completa

Cada uno de tres ratones se inoculó con progastrina humana recombinante (descrito anteriormente). El inmunógeno no indujo ninguna respuesta inmunitaria detectable en los ratones: no pudo detectarse ninguna unión a PG usando un ELISA como se ha descrito anteriormente. No se realizaron fusiones.

Anticuerpos monoclonales N-terminales frente a la progastrina

Como se ha indicado anteriormente, los anticuerpos monoclonales N-terminales se generaron frente a un antígeno que contiene los residuos 1 a 14 de hPG unido a albúmina de suero bovino (BSA) o hemocianina de lapa (KLH) mediante un conector Ahx-Cys en el extremo C-terminal del antígeno de 14 residuos (SWKPRSQQPDAPLG-Ahx-Cys (SEC ID nº: 26)).

En un primer experimento, tres ratones se inocularon con un péptido N-terminal unido a BSA. De las tres fusiones, realizadas con esplenocitos de dos de los tres ratones, una fusión no proporciona clones que mostraran unión a PG o al inmunógeno. De las otras dos fusiones sembradas en placas de 96 pocillos, una generó 4 hibridomas que se unen a PG y específicos de PG, de los cuales se recuperó un único subclón estable que produce IgG. La segunda fusión también resultó en un subclón de hibridoma único estable que produce IgG1, unión a PG y específico para PG. Globalmente, de los tres ratones, 17 hibridomas en el primer ciclo, o 0,74% de los hibridomas cribados) fueron positivos para unión a PG e inmunógeno, de los cuales se subclonaron 9 estirpes celulares positivas, de las cuales dos fueron estirpes celulares positivas, que producen IgG. Así, el primer experimento generó dos clones después de un par de ciclos de subclonación que retuvieron una señal positiva fuerte frente al inmunógeno y hPG (positivo para “unión a PG”) y no se unieron a otros péptidos derivados del gen de la gastrina (positivo para “específico para PG”): los hibridomas 43B9G11 y WE5H2G7, que producen antihPG MAb1 y anti-hPG MAb 2, respectivamente.

En un segundo experimento, los ratones se inocularon con un péptido N-terminal unido a KLH. Se realizaron dos fusiones con células de mieloma Sp2. De éstas, sólo una fusión generó clones positivos para PG e inmunógeno, que también fueron específicos para PG. De ésta, se sembraron 1920 hibridomas. Muchos hibridomas fueron positivos en el ensayo con los péptidos inmunizantes pero no progastrina, o no fueron específicos para PG. Específicamente, 297 hibridomas mostraron una señal positiva fuerte para el péptido inmunizante (aproximadamente 15,5% de 1920), de los cuales 124 también fueron positivos para unión a progastrina (6,5%). Hubo 36 hibridomas, o 1,8%, que fueron positivos para progastrina pero no el inmunógeno usado. Sólo 12 hibridomas de los 1920 sembrados proporcionaron anticuerpos que se unen específicamente a progastrina pero no a otros productos del gen de la gastrina (0,6% del total de hibridomas, 3,6% de los clones que fueron positivos para el péptido y/o progastrina en el primer cribado). De los 12 clones seleccionados, sólo 2 fueron lo suficientemente estables como para establecerse como clones permanentes y congelarse durante un almacenamiento a largo plazo. Así, en este segundo experimento, de los casi 2000 hibridomas que se sembraron, únicamente se recuperaron 2 clones, 6B5B11C10 (que produce anti-hPG MAb 3) y 20D2C3G2 (que produce anti-hPG MAb4), que producen anti-hPG MAb3 y MAb4 respectivamente, que expresan anticuerpos monoclonales aptos para unirse a hPG y al péptido inmunizante y que tienen especificidad para la progastrina sobre otros productos del gen de la gastrina y alta afinidad para hPG. Ambos anticuerpos ejemplificativos son del isotipo IgG1.

En un tercer experimento, los ratones se inocularon con el mismo inmunógeno que en el segundo experimento. Las fusiones con células de mieloma Sp2 se realizaron con esplenocitos de dos ratones con la respuesta inmunitaria más fuerte. Los hibridomas se sembraron a partir de las fusiones (3840 hibridomas de una fusión cada uno, por ratón) y los sobrenadantes se sometieron a ensayo para unión a PG e inmunógeno, así como especificidad para PG. De cada fusión, 6 hibridomas mostraron especificidad para PG, de los cuales se seleccionaron 3 subclones que cumplían la selección adicional para crecimiento, monoclonalidad, secreción de anticuerpos, afinidad relativa. Así, en total, 2,9% de los hibridomas ensayados después de sembrar (220/7680) fueron positivos para PG e inmunógeno, de los cuales 0,15% fueron clones positivos (12/7680), constituyendo los subclones finales recuperados 0,15% de los hibridomas originales sembrados (6/7680). Este experimento generó los hibridomas 1E9A4A4 (que producen anti-hPG MAb 15), 1E9D9B6 (que producen anti-hPG MAb 16), 1C8D10F5 (que producen anti-hPG MAb 17), 1A7C3F11 (que producen anti-hPG MAb 18), 1B3B4F11 (que producen anti-hPG MAb 19), y 1C11F5E8 (que producen anti-hPG MAb 20).

La tabla siguiente representa el número de clones sembrados para cada experimento, el inmunógeno usado y el número y porcentaje de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales que reconocieron tanto el inmunógeno como la progastrina de longitud completa.

Tabla 3

Expt: Inmunógeno Clones sembrados Sobrenadantes de hibridoma PG+ Clones específicos de PG Subclones específicos para PG, que producen IgG

1: (SEC ID nº: Ahx-Cys-BSA 26) 2304 17 (0,74%) 9 (0,39%) 2 (0,087%)

2: (SEC ID nº: Ahx-Cys-KLH 26) 1920 124 (6,5%) 12 (0,6%) 2 (0,1%)

3: (SEC ID nº: Ahx-Cys-KLH 26) 7680 220 (2,9%) 12 (0,15%) 6 (0,1%)

Anticuerpos monoclonales C-terminales frente a progastrina

Se generaron anticuerpos monoclonales C-terminales frente a un antígeno que contiene los residuos 55 a 80 de hPG unidos bien a KLH o a DT mediante un conector Cys-Ahx-Ahx en el extremo N-terminal del antígeno de 26 residuos (Cys-Ahx-Ahx-QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN (SEC ID nº: 96)). Los intentos de generar hibridomas con un antígeno más pequeño que únicamente contiene los residuos 70 a 80 de hPG, Cys-Ahx-Ahx-FGRRSAEDEN (SEC ID nº: 97), conjugado bien con BSA o KLH, fracasaron en la generación de clones.

Se realizaron tres experimentos. En los dos primeros experimentos, en los que se usó el péptido más corto, se recuperaron cero subclones. Específicamente, en un primer experimento se inyectó a 4 ratones un péptido C-terminal correspondiente a SEC ID nº: 97, unido a BSA. Ninguna de las fusiones generó ningún hibridoma que produce IgG. En un segundo experimento, se inyectó a 6 ratones, 3 a cada uno, un péptido correspondiente a SEC ID nº: 97, unido a KLH en su extremo N-terminal, o un péptido correspondiente a SEC ID nº: 97, unido a KLH en su extremo C-terminal. Para el primer inmunógeno, se realizaron fusiones y se recuperaron los hibridomas, pero no se aislaron subclones positivos para unión a PG y especificidad para PG. Para el segundo inmunógeno, ninguno de los ratones desarrolló una respuesta inmunitaria y no se realizaron fusiones.

En un tercer experimento, se usó un péptido de 26 aminoácidos que incluye las secuencias C-terminales no únicas de hPG. El inmunógeno, que incluía un péptido correspondiente a SEC ID nº: 96 unido a KLH o DT, se

inyectó a los ratones. Las fusiones con células de mieloma Sp2 se realizaron con esplenocitos de los dos ratones que tuvieron la respuesta más fuerte. Se sembraron 3840 hibridomas a partir de una fusión por ratón. Globalmente, de los 7680 hibridomas cribados, de los cuales 382 (5%) fueron positivos para PG y específicos para PG, se recuperaron 13 (0,17%) subclones estables, positivos: 1B4A11D11 (que produce anti-hPG MAb 5),

5 1B6A11F2 (que produce anti-hPG MAb 6), 1B11E4B11 (que produce anti-hPG MAb 7), 1C10D3B9 (que produce anti-hPG MAb 8), D8F5B3 (que produce anti-hPG MAb 9), 1E1C7B4 (que produce anti-hPG MAb 10), 2B4C8C8 (que produce anti-hPG MAb 11), 2B11E6G4 (que produce anti-hPG MAb 12), 2C6C3C7 (que produce anti-hPG MAb 13), 2H9F4B7 (que produce anti-hPG MAb 14), 1F11F5E10 (que produce anti-hPG MAb 21), 1F11F5G9 (que produce anti-hPG MAb 22), y 1A11F2C9 (que produce anti-hPG MAb 23).

10 La tabla siguiente muestra el número de clones sembrados para cada experimento, el inmunógeno usado, el número de hibridomas cribado, el número y porcentaje de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales que se unen a PG y el inmunógeno, que son específicos para PG y que cumplen los criterios de selección (crecimiento, monoclonalidad, afinidad relativa, etc.) después de tres ciclos de subclonación.

15 Tabla 4

Expt: Inmunógeno Clones sembrados Sobrenadantes de hibridoma PG+ Clones específicos para PG Subclones específicos para PG, que producen IgG

1: BSA-conector-(SEC ID nº: 97) 3072 10 (0,32%) 9 (0,29%) 0

2: KLHconector-(SEC ID nº: 97) (SEC ID nº: 97)conector-KLH 1920 27 (0,47%) 0 4 (0,07%) 0 0 0

3: KLH-conector-(SEC ID nº: 96) DT-conector-(SEC ID nº: 96) 3840 3840 192 (5%) 190 (4,95%) 17 (0,44%) 13 (0,34%) 10 (0,26%) 3 (0,08%)

Los anticuerpos monoclonales y los hibridomas estables a partir de los que se producen se presentan en la tabla 20 siguiente:

Tabla 5

Anticuerpo monoclonal: Hibridoma Ig de Ratón

MAb 1: 43B9G11 IgG1

MAb 2: WE5H2G7 IgG1

MAb 3: 6B5B11C10 IgG1

MAb 4: 20D2C3G2 IgG1

MAb 5: 1B4A11D11 IgG1

MAb 6: 1B6A11F2 IgG1

MAb 7: 1B11E4B11 IgG1

MAb 8: 1C10D3B9 IgG1

MAb 9: 1D8F5B3 IgG1

MAb 10: 1E1C7B4 IgG1

MAb 11: 2B4C8C8 IgG1

MAb 12: 2B11E6G4 IgG1

MAb 13: 2C6C3C7 IgG1

MAb 14: 2H9F4B7 IgG1

MAb 15: 1E9A4A4 IgG1

MAb 16: 1E9D9B6 IgG1

MAb 17: 1C8D10F5 N.D.

MAb 18: 1A7C3F11 IgG2

MAb 19: 1B3B4F11 IgG2

MAb 20: 1C11F5E8 IgG2

MAb 21: 1F11F5E10 IgG2

MAb 22: 1F11F5G9 IgG2

MAb 23: 1A11F2C9 IgG2

25 Las estirpes celulares de hibridoma 1B4A11D11 (MAb 5, no. de registro CNCM I-4371), 1B6A11F2 (MAb 6, no. de registro CNCM I-4372), 1B11E4B11 (MAb 7, no. de registro CNCM I-4373), 2B4C8C8 (MAb 11, no. de registro CNCM I-4374), 2B11E6G4 (MAb 12, no. de registro CNCM I-4375), y 1E9A4A4 (MAb 15, no. de registro y NCM I-4376) se depositaron según el Tratado de Budapest y se recibieron el 6 de octubre, 2010 por la

Collection Nationale de Cultures de Microorganisms (CNCM), Instituto Pasteur, París, Francia.

Clonación y secuenciación de los anticuerpos monoclonales anti-hPG

Los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas pueden clonarse y secuenciarse usando técnicas conocidas por los expertos en la materia. Los anticuerpos monoclonales de los hibridomas presentados en la Tabla 5 anterior se secuenciaron como se describe a continuación.

Las secuencias que codifican los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas 6B5B11C10 y 20D2C3G2 se clonaron y secuenciaron usando técnicas estándares. Brevemente, se aisló el ARN total a partir de sedimentos celulares congelados usando reactivo RNABee, AMSBio no. de catálogo CS-104B, usado según las instrucciones del fabricante. El ADNc para las regiones V se preparó a partir de ARNm usando la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), seguido de una amplificación rápida 5’ de los extremos del ADNc (RACE). La síntesis de ADNc se realizó usando cebadores específicos de la región constante, después de lo cual el producto de la primera cadena se purificó y se usó desoxinucleótido transferasa terminal para añadir colas homopoliméricas a los extremos 3’ del ADNc. Las secuencias de ADNc “con cola” se amplificaron por PCR usando parejas de cebadores, cada uno de los cebadores para la cola homopolimérica y bien la región VH o VL, respectivamente. Los productos de PCR de la región variable de cadena pesada y ligera se clonaron en un vector de clonación “TA” (p-GEM-T easy, Promega no. de cat. A 1360) y se secuenciaron usando procedimientos estándar. Ver la figura 2A-B (MAb 3), figura 2C-D (MAb 4).

Las secuencias que codifican los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas 1C10D3B9, 2C6C3C7, 1B3B4F1, y 1E9D9B61 se determinaron como se expone a continuación. Se aisló el ARN total de los sedimentos celulares congelados usando el kit RNAqueous®-4PCR (Ambion nº de cat. AM1914) usado según las instrucciones del fabricante. El ARNm de la región V de la cadena pesada se amplificó usando un conjunto de seis grupos de cebadores degenerados (HA a HF) y el ARNm de la región V de la cadena ligera se amplificó usando un conjunto de ocho grupos de cebadores degenerados, siete para el grupo κ (KA a KG) y uno para el grupo λ (LA). El ADNc para las regiones variables se preparó a partir de ARNm usando RT-PCR. La síntesis de ADNc se realizó usando cebadores específicos para la región constante, seguido de PCR usando grupos de cebadores degenerados para las secuencias señal murinas 5’ y cebadores para las regiones constantes 3’ para cada una de IgGVH, IgκVL e IgλVL. (Jones et al., 1991, Rapid PCR cloning of full-length mouse immunoglobulin variable regions, Bio/Technology 9: 88-89). Los productos de PCR de la región variable de la cadena pesada y ligera se clonaron en un vector de clonación “TA” (p-GEM-T easy, Promega no. de cat. A 1360) y se secuenciaron usando procedimientos estándar. Ver las figuras 2E-F (MAb 8), 2G-H (MAb 13), 2I-J (Mab 16), y 2K-L (Mab 19).

Ejemplo 2: Afinidad de unión de los anticuerpos anti-hPG

A. Afinidad Relativa

La afinidad relativa de los anticuerpos monoclonales ejemplificativos se midió usando el método ELISA descrito anteriormente, en el que los pocillos se recubrieron con una disolución de péptido que contiene 50ng de progastrina y se incubó en presencia de concentraciones crecientes de cada anticuerpo monoclonal como se expone a continuación:

Anticuerpo monoclonal: Intervalo de concentración ensayado

Anticuerpos monoclonales anti-hPG N-terminales MAbs 1-4: 0,001-1 µg/ml

Anticuerpos monoclonales anti-hPG N-terminales MAbs 3, 15-20: 0,1-100 ng/ml

Anticuerpos monoclonales anti-hPG C-terminales MAbs 5-14, 21-23: 0,03-30 ng/ml

La figura 3A muestra la afinidad relativa de cuatro anticuerpos monoclonales anti-hPG, MAbs 1-4 ensayados a concentraciones de 1 ng/ml a 1 µg/ml. La figura 3B muestra la afinidad relativa de los anticuerpos monoclonales anti-hPG N-terminales MAbs 3 y 15-20 ensayado a concentraciones de anticuerpo de 0,1-100 ng/ml. La figura 3C muestra la afinidad relativa de los anticuerpos monoclonales anti-hPG C-terminales MAbs 5-14 y 21-23 ensayado a concentraciones de anticuerpo de 0,03-30 ng/ml.

B. Medidas de la constante de afinidad

Para proporcionar una cuantificación más absoluta de la afinidad para los anticuerpos monoclonales, las constantes de afinidad se midieron usando la técnica Proteon (BioRad), según Nahshol et al., 2008, Analytical Biochemistry 383: 52-60. Brevemente, un anticuerpo IgG anti-ratón (50 µg/ml) se utilizó para recubrir un chip sensor en primer lugar, asegurando que la señal detectada por el chip después de la inyección del anticuerpo está entre 10000 y 11500 RU (unidades de respuesta). El anticuerpo monoclonal murino que se va a ensayar se inyectó (concentraciones típicas: 30 µg/ml). La unión suficiente del anticuerpo que se va a ensayar se determinó tomando como base una señal adicional de por lo menos 500 RU en el chip sensor. Se midió un curso de tiempo de la interacción entre los anticuerpos monoclonales antiprogastrina y la progastrina inyectando varias concentraciones de progastrina, por ejemplo 200, 100, 50, 25, y 12,5 nM, y se detectó el nivel de asociación.

Típicamente, están disponibles varios canales para ensayar múltiples anticuerpos en paralelo en un único experimento, haciendo posible ensayar la unión de los anticuerpos de ensayo a varias concentraciones de PG en paralelo. Típicamente, un canal se reserva para un anticuerpo monoclonal murino que no es específico para PG, como un control para unión no específica, y en otro canal se inyecta amortiguador de dilución solo como una línea base para la señal de fondo. Generalmente, no es detectable ninguna unión en los canales en los que se ha inyectado anticuerpo murino no específico. Los anticuerpos que presentan un alto nivel de asociación en este entorno, que puede resultar en la saturación del anticuerpo monoclonal atrapado por progastrina, pueden ensayarse frente a concentraciones menores de progastrina (50, 25, 12,5, 6,25 y 3,125 nM), lo que permite una medida más refinada.

Las constantes de afinidad (KD) se calcularon como la relación entre la constante de disociación (kd) y la constante de asociación (ka). Los valores experimentales se validaron analizando la similitud estadísticamente relevante entre las curvas experimentales tomando como base las medidas de unión y los perfiles teóricos. El modelo matemático usado en los experimentos Proteon para seleccionar si las curvas experimentales se ajustan al modelo teórico fue el modelo de Langmuir, basado en una interacción 1: 1 entre las moléculas de progastrina y los anticuerpos monoclonales antiprogastrina.

Tabla 6

Anticuerpo monoclonal: Constante de afinidad medida KD (M)

Anti-hPG MAb 1: 2,5 µM (2,5 x10-6M)

Anti-hPG MAb 2: 185 nM (1,85 x10-7M)

Anti-hPG MAb 3: 6,4 nM (6,4 x10-9M)

Anti-hPG MAb 4: 3,5 nM (3,5 x10-9M)

Anti-hPG MAb 5: 13 pM (1,30 x10-11M)

Anti-hPG MAb 6: 0,6 nM (6,38 x10-10M)

Anti-hPG MAb 7: 58 pM (5,84 x10-11M)

Anti-hPG MAb 8: 0,1 nM (1,08 x10-10M)

Anti-hPG MAb 10: 3,6 nM (3,62 x10-9M)

Anti-hPG MAb 11: 0,3 nM (3,12 x10-10M)

Anti-hPG MAb 12: 0,4 nM (4,43 x10-10M)

Anti-hPG MAb 13: 0,6 nM (6,12 x10-10M)

Anti-hPG MAb 14: 6,8 pM (6,86 x10-12M)

Anti-hPG MAb 15: 0,2 nM (2,11 x10-10M)

Anti-hPG MAb 16: 0,2 nM (2,78 x10-10M)

Anti-hPG MAb 17: 8,3 nM (8,29 x10-9M)

Anti-hPG MAb 18: 1,2 nM (1,24 x10-9M)

Anti-hPG MAb 19: 0,7 nM (7,79 x10-10M)

Anti-hPG MAb 20: 0,2 nM (2,47 x10-10M)

Anti-hPG MAb 21: 3,9 nM (3,90 x10-9M)

Anti-hPG MAb 22: 5 nM (4,94 x10-9M)

Anti-hPG MAb 23: 0,4 µM (3,99 x10-7M)

Ejemplo 3: Agregación de anticuerpos anti-hPG

La agregación de los anticuerpos puede reducir la eficacia terapéutica reduciendo la cantidad de anticuerpo disponible para unirse a la proteína diana. Los anticuerpos con niveles muy bajos de agregación resultan preferidos para aplicaciones terapéuticas. Cada lote de anticuerpo variará comparado con otros lotes del mismo anticuerpo monoclonal. Generalmente, es deseable usar lotes con agregación baja. Para cuantificar la agregación del anticuerpo, se pusieron disoluciones de anticuerpo en un espectrofluorímetro (Photon Technology International), y se irradiaron a 280 nm. La difusión se midió a 280 nm, mientras que la emisión debida a los aminoácidos aromáticos (principalmente triptófanos) se midió a 330 nm. El nivel de agregación se cuantificó calculando la relación entre los valores de medida de DO a 280 nm frente a 330 nm, como se describe en Nominé et al., 2003, Biochemistry 42: 4909-4917. Una relación 280/330 nm alta indica una mayor cantidad de agregación. La concentración de anticuerpo usada fue 15 µg/ml, 5 a 15 veces por encima de la usada para los tratamientos in vitro.

Los resultados se muestran en la Tabla 7 siguiente y en la figura 4.

Tabla 7

Muestra: Relación 280/330 nm

Albúmina de Suero Bovino (n=1): 6,4

Anti-hPG MAb 1 (n=1): 15,42

Anti-hPG MAb 2 (n=2): 9,81

Anti-hPG MAb 3 (n=2): 3,08

Ejemplo 4: Especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales anti-hPG

La PG es sólo uno de los productos peptídicos del gen de la gastrina. Otros productos del gen de la gastrina tienen funciones en la homeostasis normal, pero es la función de PG en CRC lo que la hace una diana útil para propósitos terapéuticos y de diagnóstico. Los anticuerpos monoclonales descritos en la presente memoria son específicos para la progastrina de longitud completa por encima de todos los demás péptidos que resultan de la expresión y procesamiento del gen de la gastrina, tales como gastrinas extendidas con glicina (G17-gly), amidadas (Gastrina17) y el péptido flanqueante C-terminal (CTFP). Estos péptidos están presentes en la circulación. La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales anti-hPG se determinó ensayando los anticuerpos frente a la progastrina humana y otros péptidos derivados del gen de la gastrina, usando el ensayo ELISA descrito anteriormente en el Ejemplo 1.

Específicamente, se recubrieron pocillos con una disolución que contiene uno de los péptidos siguientes a las cantidades indicadas: progastrina, hemocianina de lapa (KLH), gastrina-17 amidada (G17), gastrina 17 extendida con glicina (Ggly), o péptido flanqueante C-terminal (CTFP):

Péptidos de cribado: Cantidad de ensayo

Progastrina recombinante: 50 ng (expt 1) 25 ng (expt 2)

Gastrina I humana amidada (G-17): 50 y 250 ng

Gastrina 17 extendida con glicina (G17-Gly): 50 y 250 ng

KLH: 50 y 250 ng

Péptido flanqueante C-terminal (CTFP): 50 y 250 ng

En un primer experimento, se usaron 3 ng/ml (0,3 ng) de anti-hPG MAb 3 y 1 g/ml (0,1 g) de cada uno de los anti-hPG MAbs 1, 2, y 4. Ver la figura 5A. En un segundo experimento, se ensayó la especificidad de unión de los anti-hPG MAbs 5 a 14 y 21-23 a 0,3 ng/ml, ver la figura 5B, y la especificidad de unión de los anti-hPG MAbs 3, 15-20 se ensayó a 1 ng/ml, ver la figura 5C.

Los anticuerpos presentaron una reacción débil a cantidades elevadas de KLH que estaba acoplada al péptido antigénico usado en algunos de los inmunógenos para inmunizar los ratones en el Ejemplo 1 anterior. No hubo un efecto detectable de BSA en la unión a PG de ningún anticuerpo, incluyendo los generados frente a inmunógenos que incluían BSA como vehículo.

Todos los anticuerpos presentaron una alta especificidad para la unión a hPG de longitud completa (ensayado a 50 y después a 25 ng) comparado con otros péptidos derivados del gen de la gastrina, tales como gastrina-17 amidada, gastrina 17 extendida con glicina y el péptido flanqueante C-terminal, un péptido de 5 aminoácidos que se escinde de la progastrina durante el procesamiento normal del polipéptido para formar gastrina. Los anticuerpos ejemplificativos no mostraron una unión detectable (señal por encima del fondo de “PBS solo”) frente a ninguno de los péptidos derivados del gen de la gastrina aparte de hPG.

Ejemplo 5: Ensayo de competición

La capacidad de un anticuerpo monoclonal anti-hPG para competir con un anticuerpo policlonal anti-hPG para unirse a la progastrina se determinó usando un ELISA con un anticuerpo anti-hPG “de captura” y un anticuerpo anti-hPG “de detección”. El Anti-hPG MAb 3 se ensayó como se expone a continuación: se prerrecubrieron placas de 96 pocillos con anticuerpos policlonales progastrina C-terminales generados frente a un péptido que consiste en los residuos 71 a 80 de hPG. Las placas se incubaron con 100 pM progastrina, seguido de la adición de 10 µg/ml de anticuerpo policlonal anti-hPG N-terminal biotinilado, generado frente a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 25, y concentraciones crecientes de anticuerpo monoclonal antihPG MAb 3. La unión del anticuerpo policlonal anti-hPG N-terminal biotinilado se detectó incubando las placas con estreptavidina-HRP seguido de OPD, según protocolos estándares. La unión se midió cuantificando la luminiscencia.

Los resultados muestran que concentraciones crecientes (µg/ml) de Anti-hPG MAb 3 disminuyen la capacidad de anticuerpos policlonales anti-hPG de unirse a la progastrina, mostrando que el anticuerpo monoclonal compite con el anticuerpo policlonal. Ver la figura 6.

Ejemplo 6: Mapeo de epítopos

Los epítopos específicos unidos por los anticuerpos monoclonales ejemplificativos se mapearon usando la técnica SPOT y escaneo de alanina, como se describe en Laune, D., et al., 2002, J. Immunol. Methods 267: 5370 y Laune, D., 1997, J. Biol. Chem. 272: 30937-30944, respectivamente. En la técnica SPOT, se generan 15 secuencias peptídicas de 15 aminoácidos que comprenden un epítopo putativo y se distribuyen en una membrana de nitrocelulosa que se ensaya con el anticuerpo de ensayo para determinar la mínima secuencia de

epítopo reconocida por el anticuerpo. El escaneo de alanina se usa para determinar los residuos en un epítopo que son críticos para la unión del anticuerpo: cada residuo en un epítopo putativo se muta uno a uno a una alanina, y los péptidos que contiene alanina se ensayan con el anticuerpo de ensayo.

5 Se identificaron familias de epítopos para anticuerpos ejemplificativos de la presente descripción. Para los anticuerpos monoclonales N-terminales frente a hPG MAbs 1-4 y 15-20, los epítopos comprenden por lo menos las secuencias siguientes: DAPLG (SEC ID nº: 28), PDAPLG (SEC ID nº: 29), PRSQQPD (SEC ID nº: 30), WKPRSQQPD (SEC ID nº: 31), o WKPRSQQPDAPLG (SEC ID nº: 32), como se muestra en la tabla 8 siguiente.

10 Tabla 8

MAb: Antígeno peptídico PG: SWKPRSQQPDAPLG SEC ID nº

MAb 2: WKPRSQQPDAPLG 32

MAb 4: WKPRSQQPDAPLG 32

MAb 1: PDAPLG 29

MAb 3: DAPLG 28

MAb 17: WKPRSQQPD 31

MAb 18: WKPRSQQPD 31

MAb 19: WKPRSQQPD 31

MAb 20: WKPRSQQPD 31

MAb 15: PRSQQPD 30

MAb 16: PRSQQPD 30

Para los anticuerpos monoclonales C-terminales frente a hPG MAbs 5-7, 9-12, 14 y 21-23, los epítopos comprenden por lo menos las secuencias siguientes: FGRR (SEC ID nº: 33), MDFGR (SEC ID nº: 34), AEDEN 15 (SEC ID nº: 35), y GWMDFGRR (SEC ID nº: 36), como se muestra en la tabla 9 siguiente.

Tabla 9

MAb: Antígeno peptídico PG: QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN SEC ID nº

MAb 14: GWMDFGRR 36

MAb 11: MDFGR 34

MAb 5: FGRR 33

MAb 6: FGRR 33

MAb 7: FGRR 33

MAb 9: FGRR 33

MAb 10: FGRR.E 33

MAb 12: FGRR 33

MAb 23: AEDEN 35

20 Ejemplo 7: Actividad neutralizante de los anticuerpos anti-hPG en estirpes celulares de cáncer

(A) Actividad neutralizante de los anticuerpos monoclonales anti-hPG

Los anticuerpos monoclonales anti-hPG disminuyen la supervivencia celular en estirpes celulares de cáncer 25 colorrectal representativas. Las estirpes celulares de cáncer colorrectal adecuadas son conocidas en la técnica. Por ejemplo, HCT116, LS174T, SW480, y SW620 son estirpes celulares que se usan comúnmente para estudiar cáncer de colon, que producen y secretan progastrina. Los anticuerpos monoclonales frente a PG se ensayaron para su capacidad para inhibir la proliferación en estas diferentes estirpes celulares. La supervivencia de las células de cada una de HCT116, LST174T, SW480, y SW620 se ensayó usando diferentes anticuerpos 30 monoclonales anti-hPG.

Para cada experimento, se sembraron 50000 células en placas de 6 pocillos en medio que contiene suero fetal de ternera y se incubaron durante 8 horas. Se extrajo el suero a las células toda la noche y empezando 24 horas después de la siembra (tiempo “T0”), las células se trataron en duplicado cada 12h durante 48 horas, en 35 ausencia de suero fetal de ternera, con 1 µg/ml de anticuerpos monoclonales control (anti-IgG1 humana de ratón, Calbiochem, Ref #411451) (CT mAb), o con 1 µg/ml de anti-hPG MAb 1-4 como se indica. Después de la cuantificación adicional de los anticuerpos monoclonales, se determinó que los anticuerpos se habían usado a aproximadamente 3 a 5 µg/ml. Se contó el número de células a T0 en un pocillo control, para cada experimento. Para las células HCT116, los experimentos se realizaron en presencia de 0,5% de suero fetal de ternera. 40 Después de 48h del inicio del experimento, se contaron el número de células supervivientes en cada pocillo tres veces en un experimento ciego. La reducción en la proliferación o supervivencia de células de CRC se determinó calculando las células supervivientes tratadas con anti-hPG MAB como porcentaje de las células tratadas con MAb control. Los recuentos celulares al inicio del tratamiento (T0) se restaron de los recuentos celulares de ensayo y control medidos a las 48 horas. Específicamente, el número de células vivas tanto en los pocillos 45 control como tratados con anti-hPG MAb se contó a las 48 horas, después se calculó la diferencia entre cada

recuento celular y el recuento celular determinado a T0, El número de células tratadas con anti-hPG MAB resultante se expresó como porcentaje del número de células tratadas con MAb control.

Las figuras 7A-C representan el efecto de anti-hPG MAb 3 y anti-hPG MAb 4 en la supervivencia de las células SW480, células LS174T, y células HCT116 a partir de experimentos representativos. Los resultados son la media +/-S.E. de 4 pocillos de dos experimentos independientes. El tratamiento con anticuerpos monoclonales antihPG redujo significativamente el número de células comparado con el tratamiento con el anticuerpo control. La significancia estadística se determinó usando un ensayo de la T de Student: * = p<0,05, ** = p<0,01, y *** = p<0,001. En cada estirpe celular, los anticuerpos anti-hPG redujeron la supervivencia celular. En una estirpe celular, LST174T, los números de células al final de las 48 horas de tratamiento con anticuerpos anti-hPG fueron menores que los números de células al inicio del experimento, lo que sugiere que los anticuerpos producen la muerte celular, además de inhibir la proliferación celular.

La tabla 10 muestra el porcentaje de células de cáncer colorrectal SW480 supervivientes tratadas con cada uno de cuatro anticuerpos monoclonales anti-hPG comparado con un anticuerpo monoclonal control (anti-IgG1 humana de ratón, Calbiochem, Ref #411451) (CT mAb).

Tabla 10

SW480 (T0 = 26 667): Número de células-T0 % del control p (Tratado frente a Control) Mann Whitney, dos colas

mAb Control: 36050 +/-3228

Anti-hPG MAb 1: 30425 +/-3098 84,4 0,3556

Anti-hPG MAb 2: 28925 +/-2757 80,2 0,0476

Anti-hPG MAb 3: 6050 +/-1788 16,8 < 0,0001

Anti-hPG MAb 4: 17560 +/-3439 48,7 0,0002

Comparado con el control, el tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-hPG redujo la supervivencia de las células de cáncer un 83,2% (Anti-hPG MAb 3), 51,3% (Anti-hPG MAb 4), 19,8% (Anti-hPG MAb 2), y 15,6% (Anti-hPG MAb 1).

Las tablas siguientes muestran el porcentaje de células LS174T y HCT-116 supervivientes tratadas con anti-hPG MAb 3 y 4 comparado con el anticuerpo monoclonal control. Los datos se representan gráficamente en los paneles correspondientes de la figura 7.

Tabla 11

HCT-116 (T0 = 42,750): Número de células-T0 % del control P (Tratado frente a Control) Mann Whitney, Dos colas

MAb Control: 151250 +/-9071

MAb3: 62750 +/-9194 41,5 % < 0,0001

MAb4: 82250 +/-7435 54,4 % <0,0001

Tabla 12

LS 174T (T0 = 51,666): Número de células -T0 % del control P (Tratado frente a Control) Mann Whitney, Dos colas

MAb Control: 85334 +/-7520

MAb3: -6666 +/-5000 -8 % 0,0084

MAb4: +8334 +/-2500 7 % 0,0085

Bajo condiciones de ensayo in vitro, no se espera la inhibición completa del crecimiento celular. En cultivo celular, la progastrina es secretada continuamente por las células de cáncer y se acumula en el medio del cultivo celular. Se espera que los niveles de progastrina se incrementen en el tiempo más de lo que ocurriría en la circulación en el cuerpo, incrementando la relación de proteína diana a anticuerpo y diluyendo el efecto neutralizante de los anticuerpos. Así, se espera que el efecto neutralizante observado con los anticuerpos in vitro sea más fuerte in vivo, cuando la progastrina secretada por las células de tumor sea transportada por la corriente sanguínea, disminuyendo su acumulación in situ.

La inhibición de la proliferación celular por los anti-hPG MAbs 5 a 23 se determinó en una o más de las estirpes celulares de CRC SW620, HCT116, y LS47T. Los ensayos se realizaron en placas de 6 pocillos como se ha descrito anteriormente usando 5 µg/ml de anticuerpos monoclonales control o de ensayo (anti-hPG). Se sembraron 50000 células por pocillo para las células HCT116 y LS174T, y 100000 para las células SW620, Las tablas siguientes proporcionan el porcentaje de células tratadas supervivientes respecto al tratamiento control de experimentos representativos. Los resultados medios se representan en las figuras 7G-I para las estirpes celulares SW620, LS174T, y HCT-116 respectivamente.

Tabla 13

Número de células-T0: % del control P (Tratado frente a Control) Mann Whitney, dos colas

Experimento 1

SW 620 (T0 = 103,067)

MAb Control: 82100 +/-15489 -

MAb 5: 54511 +/-8292 66 % < 0,0001

MAb 6: 44367 +/-9321 54 % < 0,0001

MAb 7: 49279 +/-8009 60 % < 0,0001

MAb 8: 32673 +/-4680 40 % < 0,0001

MAb 9: 73283 +/-3835 89% 0,1305

MAb 10: 70178 +/-4173 85 % 0,0618

Experimento 2

SW 620 (T0 = 118,553)

MAb Control: 81347 +/-6062

MAb 11: 46974 +/-7422 58 % 0,0003

MAb 12: 52980 +/-10529 65 % 0,0002

MAb 13: 38933 +/-5284 48 % 0,0003

MAb 14: 83767 +/-9484 103 % 0,21

MAb 21: 59497 +/-2828 73 % 0,0002

MAb 22: 64227 +/-7123 79 % 0,0013

MAb 23: 83914 +/-5629 103 % 0,82

Experimento 3

SW 620 (T0 = 116,283)

MAb Control: 101333 +/-17626 -

MAb 15: 66052 +/-7739 65 % < 0,0001

MAb 16: 58883 +/-9950 58 % < 0,0001

MAb 17: 76688 +/-5578 75,5 % 0,0014

MAb 18: 75874 +/-10129 75 % 0,0005

MAb 19: 70242 +/-10851 69 % < 0,0001

MAb 20: 66470 +/-7557 66 % < 0,0001

Tabla 14

Experimento 1

LS 174T (T0 = 60,944)

MAb Control: 107956 +/-5859

MAb 13: 62341 +/-10683 58 % 0,0003

MAb 16: 65389 +/-8185 61 % 0,0002

Experimento 2

LS 174T (T0 = 86,389)

Mab Control: 241711 +/-11620

MAb 14: 246444 +/-19563 102 % ns

MAb 19: 204433 +/-8946 84,5 % 0,0005

Experimento 3

LS 174T (T0 = 79,667)

MAb Control: 135800 +/-18338

MAb 8: 57333 +/-12657 42 % < 0,001

Tabla 15

Experimento 1

HCT-116 (T0 = 49,286)

MAb Control: 78214 +/-6230

MAb 13: 28805 +/-3477 36 % < 0,0001

MAb 16: 56484 +/-8333 72 % < 0,0001

MAb 19: 68945 +/-8795 88 % 0,0302

Experimento 2

HCT-116 (T0 = 60,944)

MAb Control: 122456 +/-1697

MAb 8: 75867 +/-15627 62 % < 0,0001

MAb 16: 87011 +/-5091 71 % < 0,0001

(B) Actividad neutralizante de anticuerpos policlonales anti-hPG

Los ensayos se realizaron como se ha descrito anteriormente, con las modificaciones siguientes. Se usó un

5 anticuerpo policlonal anti-hPG N-terminal como se ha descrito en el Ejemplo 5. Como control, se usaron 3 µg/ml de policlonal (Policlonal anti-IgG humana de Conejo, Affinity BioReagents, Ref #SA1-600) (CT pAB). Para los tratamientos anti-PG, se usaron 3 µg/ml de anticuerpos policlonales anti-hPG para todas las estirpes celulares. SW480 y LS174T se trataron con anticuerpos policlonales anti-hPG control o N-terminales durante 24 a 48h en DMEM sin FCS, mientras que HCT116 se trataron con anticuerpos policlonales anti-hPG durante 48h en DMEM

10 con 0,5% FCS. Las células supervivientes se tripsinizaron y contaron, en comparación con células tratadas con una concentración equivalente de anticuerpo policlonal control (anti IgG humana).

Los resultados de experimentos representativos se muestran en las tablas siguientes y en las figuras 7D-F. El tratamiento con anticuerpos policlonales anti-hPG redujo significativamente el número de células comparado con 15 el tratamiento con anticuerpo control. La significancia estadística se determinó usando un ensayo de la T de Student: * = p<0,05, ** = p<0,01, y *** = p<0,001. Los números de células se expresan respecto al número de células en cultivo al inicio del experimento (T0). Para cada experimento, las células en cada uno de 4 pocillos se contaron tres veces. Como con los anticuerpos monoclonales anti-hPG, la proliferación de las células de cáncer colorrectal se inhibe por los anticuerpos policlonales anti-hPG, demostrando que los efectos antitumorales

20 observados con los anticuerpos policlonales frente a progastrina son predictivos de manera razonable de la actividad de los anticuerpos monoclonales en el bloqueo del efecto de la progastrina en células de cáncer.

Tabla 16

Experimento 1

SW 480 (T0 = 26,667)

PAb Control: 37580 +/-4233

PG PAb: 7833 +/-3660 21 % 0,0001

Experimento 2

HCT-116 (T0 = 58,750)

PAb Control: 105350 +/-8660

PG PAb: 7833 +/-3660 21 % < 0,05

Experimento 3

LS174T (T0 = 112,500)

PAb Control: 207500 +/-10,000

PG PAb: 102500 +/-5000 495 % < 0,01

25 Ejemplo 8: El efecto neutralizante de los anticuerpos monoclonales anti-hPG se elimina cuando los anticuerpos se preincuban con hPG purificada

Para demostrar que el efecto neutralizante de los anticuerpos monoclonales anti-hPG está mediado por la unión

30 a hPG, las células LS174T se cultivaron en presencia de un anticuerpo ejemplificativo -anti-hPG MAb 8 -que se había preincubado con y sin hPG. Como controles positivo y negativo, las células se cultivaron con hPG sola, un anticuerpo control solo, y el anticuerpo control preincubado con hPG.

Específicamente, se preincubó 33,3 nM (5 µg/ml) anti-hPG MAb 8 durante 1 hora a temperatura ambiente con un 35 exceso molar de 20 veces de hPG recombinante, o 667 nM (6,67 µg/ml). Se usó progastrina humana

recombinante, preparada como se ha descrito en el Ejemplo 1. En paralelo, se preincubó de manera similar 33,3 nM (5 µg/ml) de anti-IgG1 humana murina (General BioScience, no. de referencia AB23420) con y sin hPG.

Se sembraron 5000 células LS174T en cada pocillo de placas de 96 pocillos en medio que contiene 10% suero fetal de ternera y se incubaron durante 8 horas, después de lo cual las células se cambiaron a medio sin suero y crecieron durante 12 horas más. Después de crecer en medio sin suero durante 12 horas, las células se trataron con uno de los siguientes cada 12 horas: anticuerpo control, anticuerpo control preincubado con hPG, anti-hPG MAb 8 solo, anti-hPG MAb 8 preincubado con hPG, y hPG sola. Después de 48 horas del primer tratamiento, se cuantificaron las células viables remanentes incubando las placas con Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution y registrando la absorbancia a 490 nM. La absorbancia medida para las células tratadas con el anticuerpo monoclonal control (“MAb control”) se ajustó a 100%, y las demás condiciones experimentales se midieron frente a la absorbancia de las células tratadas con el MAb control. Los resultados se muestran en la tabla siguiente y en la figura 8.

Tabla 17

Absorbancia: % del control p (Tratado frente a Control) Mann Whitney, dos colas

Tratamiento con PG solo: 0,244 +/-0,088 132,5% 0,099 (n.s.)

MAb Control: 0,184 +/-0,084 100% N.A.

Anti-hPG MAb 8: 0,057 +/-0,06 31% 0,001

MAb Control +hPG: 0,321 +/-0,079 174,5% 0,002

Anti-hPG MAb8 + hPG: 0,271 +/-0,076 147,6% 0,0229

La adición de, o la incubación de los anticuerpos con, hPG incrementa el número de células vivas en cultivo. Por el contrario, el tratamiento de las células con anti-hPG MAb 8 solo causa una reducción significativa en el número de células viables. Así, la capacidad de los anticuerpos monoclonales anti-hPG para neutralizar la actividad de PG se suprime por la adición de hPG, que se cree que se une a y satura el anticuerpo. Este resultado confirma la especificidad de la actividad neutralizante de los anticuerpos monoclonales anti-hPG.

Ejemplo 9: Actividad anti-tumoral in vivo de los anticuerpos anti-hPG

Se han desarrollado varios modelos experimentales in vivo para el estudio de cáncer colorrectal. Se han desarrollado estudios con xenoinjerto en ratón, en los que tejido o células tumorales de estirpes celulares de cáncer humano se trasplantan en un ratón inmunodeficiente (denominado “desnudo”). Pocard M., et al., In vivo (1996) 10(5): 463-469. También se han desarrollado varios modelos de ratón transgénico. Los modelos murinos incluyen mutaciones heterocigóticas en el gen de poliposis adenomatosa cólica (APC), tal como ApcMin, Apc1638N, Apc716, o ApcΔ14. El gen supresor de tumores APC codifica una proteína citosólica, APC, que, cuando está intacta, se une a y secuestra -catenina en el citosol en un complejo multiproteico que dirige la catenina al proteasoma para degradación, evitando de esta manera que -catenina active el factor de transcripción Tcf-4 en el núcleo. Heyer et al., Oncogene 18: 5325-5333 (1999). Los ratones APCΔ14 portan una eliminación heterocigótica del exón 14 en el gen de poliposis adenomatosa cólica (APC). De manera similar a lo que ocurre en más del 70% de los pacientes con cáncer colorrectal esporádico, la pérdida somática de heterocigosidad (LOH) en el segundo alelo Apc ocurre en las células intestinales, lo que da lugar a una activación constitutiva del complejo transcripcional -catenina/Tcf-4 y al desarrollo espontáneo de tumores intestinales en estos animales. El origen molecular de estos adenomas y carcinomas, así como la morfología tumoral (incluyendo la vascularización, respuesta inflamatoria y presencia de células inmunitarias) con una gran similitud con la de los tumores humanos comparado con los modelos de xenoinjerto en ratón, hace de APC∆14 un modelo altamente relevante para los estudios de terapia de cáncer colorrectal humano. Colnot et al., 2004, Lab. Invest. 84: 1619-1630, Otros modelos de ratón transgénico se basan en mutaciones en genes tales como MSH2, MSH6, CDX2, K-RAS, así como estirpes que combinan mutaciones en APC con mutaciones en otros oncogenes. Heyer et al., 1999, Oncogene 18: 5325-5333, Janssen KP et al., 2002, Gastroenterology 123: 492

504. Estos modelos se usan ampliamente para estudiar el cáncer colorrectal y para ensayar hipótesis respecto al tratamiento del cáncer colorrectal.

Los ratones transgénicos portadores de una eliminación heterocigótica del exón 14 con el gen de poliposis adenomatosa cólica (APCΔ14) sirven como modelo para cáncer colorrectal, desarrollando tumores similares a los encontrados en cánceres de colon humanos. En un primer experimento, se trataron ratones APCΔ14 con una preparación que contiene cantidades iguales de anticuerpos policlonales anti-hPG generados frente a (1) un péptido correspondiente a SEC ID nº: 25 y (2) un péptido C-terminal como se describe en Hollande et al., documento WO 07/135542. Se trataron ratones de 3,5 meses de edad durante 5 semanas con anticuerpo policlonal control o anticuerpo policlonal anti-hPG (dos ratones por tratamiento). Los anticuerpos se administraron por inyección intraperitoneal dos veces a la semana a una dosis de 10 mg/kg (150 µl volumen de inyección). Al final del tratamiento, los ratones se sacrificaron y los intestinos se lavaron con PBS, se diseccionaron para formación de imágenes digital y se fijaron en 4% paraformaldehído para análisis inmunohistoquímico. Se registró el número de tumores y las imágenes de tejido colorrectal.

La evaluación morfológica del tejido intestinal mostró que los anticuerpos anti-hPG no afectaban la renovación del epitelio intestinal murino sano. Se contaron los tumores en los grupos de tratamiento y control. El número total de tumores para los ratones tratados con anticuerpos control fue 27, comparado con 4 en los ratones tratados con anticuerpos anti-hPG. Así, los anticuerpos anti-hPG reducen el recuento de tumores más de 6,5 veces comparado con los anticuerpos control mientras que no afectan la renovación del epitelio sano en el intestino del ratón.

En un segundo experimento, se examinó el efecto de los anticuerpos anti-hPG en ratones APCΔ14 y ratones normales (control) (C57BL6J). Se trataron ratones de 4 meses de edad dos veces a la semana durante 6 semanas con anticuerpo policlonal control -un antisuero anti-IgG humana de conejo (Jackson ImmunoResearch (no. de referencia 309-005-0089)-o anticuerpo policlonal anti-hPG, por inyección intraperitoneal dos veces a la semana a una dosis de 9 mg/kg (150 µl volumen de inyección). Después de seis semanas de tratamiento, dos horas antes del sacrificio, se inyectó a los ratones Bromo-desoxi-uridina (BrdU) (2 mg por ratón, inyección intraperitoneal). Se trataron 6 ratones APCΔ14 con policlonal anti-hPG y 4 con anticuerpos policlonales control. Los anticuerpos control y anti-hPG se administraron a 6 ratones normales (C57BL6J) cada uno. No se detectaron anormalidades intestinales en ninguno de los ratones de ningún grupo, lo que demuestra adicionalmente la seguridad y ausencia de efectos adversos de los anticuerpos anti-hPG en tejido intestinal normal.

El número y tamaño de los tumores (altura y longitud) se examinaron en los grupos tratados frente a control de ratones APCΔ14. El tamaño de los tumores se determinó por medidas de las imágenes tomadas de los intestinos de cada animal, preparado como se expone a continuación. Los intestinos se lavaron como se ha descrito anteriormente, se diseccionaron longitudinalmente, se incluyeron en parafina y se procesaron para inmunohistoquímica usando la técnica Swiss roll. Las medidas de la longitud y altura tumorales se realizaron usando el programa informático Image J.

Los resultados se muestras en la tabla 18 y en las figuras 8A y B. Los resultados del tamaño tumoral muestran una diferencia estadísticamente significativa entre los grupos tratados control y tratados con anti-hPG. La significancia estadística se determinó usando un ensayo de Mann Whitney: * = p<0,05, ** = p<0,01, y *** = p<0,001. Los ratones tratados con el anticuerpo control presentaron un total de 125 tumores, con 31,25 tumores de media por ratón. Los ratones tratados con anti-hPG presentaron 46 tumores o una media de 7,6 tumores por ratón. Esta diferencia es estadísticamente significativa (ensayo de Mann-Whitney, P= 0,0095) mostrando que los anticuerpos anti-hPG reducen significativamente el número de tumores de cáncer colorrectal in vivo.

Tabla 18

Tratamiento (no. de ratones): Número de tumores por ratón

PAb Control (4): 23 48 28 26

Anti-hPG PAb (6): 2 16 15 9 2 2

Los anticuerpos anti-hPG reducen significativamente los tumores de cáncer colorrectal in vivo según se mide por la reducción tanto en el número de tumores como en el tamaño de los tumores en un modelo murino de cáncer colorrectal, sin ningún efecto adverso aparente en el epitelio colorrectal normal. Así, el tratamiento de tumores de cáncer colorrectal con anti-hPG proporciona un beneficio terapéutico in vivo.

Ejemplo 10: Diseño de anticuerpos anti-hPG humanizados

Se diseñaron anticuerpos humanizados in silico a partir de los anticuerpos monoclonales anti-hPG murinos MAbs 3, 4, 8, 13, 16, y 19. El diseño de los anticuerpos humanizados se realizó según la metodología descrita en Lefranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77; Lefranc et al. 2009, Nucl. Acids Res. 37: D1006-1012; Lefranc, 2008, Mol. Biotechnol. 40: 101-111. Para cada uno de los anticuerpos monoclonales murinos, a las secuencias peptídicas de VH y VL humanizadas correspondientes se determinaron: identificando las regiones CDR y marco de las secuencias murinas usando la base de datos IMGT-ONTOLOGY (Duroux et al., 2008, Biochimie, 90: 570-583; Giudicelli y Lefranc, 1999, Bioinformatics, 15: 1047-1054) y las bases de datos y herramientas IMGT (Ehrenmann et al., 2010, Nucl.Acids. Res., 38: D301-307; Brochet et al., 2008, Nucl.Acids. Res., 36: W503-508) seguido de la identificación de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de la región marco humanas más próximas en IMGT/GENE-DB (Giudicelli et al., 2005, Nucl.Acids. Res., 33: D256-261), e injertando las secuencias CDR murinas en las regiones marco humanas. Más particularmente, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de los dominios VH y VL murinos se analizaron usando IMGT/V-QUEST e IMGT/DomainGapAlign para delimitar las regiones CDR y marco murinas, definir las longitudes de CDR e identificar los aminoácidos de anclaje. Los aminoácidos de anclaje son los residuos en la posición 26, 39, 55, 66, 104 y 118 de IMGT “Collier de Perles” que apoyan CDR1-IMGT, CDR2-IMGT, CDR3-IMGT (Kaas y Lefranc, 2007, Current Bioinformatics, 2: 21-30; Kaas et al., Brief. Funct. Genomic Proteomic, 2007, 6: 253-264). Se identificaron los genes V (variable) y J (de unión) humanos más próximos a las secuencias murinas y se seleccionaron los genes más adecuados. Los aminoácidos individuales en la región marco murina se mantuvieron si se consideró que posiblemente contribuían a la especificidad del anticuerpo en comparación con estructuras 3D conocidas (Kaas et al., 2004, Nucl. Acids. Res. 32: 208-210) usando IMGT Collier de Perles en dos capas.

Se determinó que las CDR de VH para MAb 3 tenían una longitud de 8, 8, y 8 aminoácidos para CDR 1, 2, y 3 respectivamente. El gen de la estirpe germinal de ratón más próximo a la secuencia de MAb 3 VH murina, IGHV15*01, se diferenciaba en 10 residuos, 3 de los cuales se mapearon en las CDR y se mantuvieron en el diseño de los anticuerpos monoclonales anti-hPG humanizados (I29 en CDR1, F56 y S65 en CDR2). Además, se consideró que V39, G55, y R66 eran potencialmente importantes para mantener la especificidad y se mantuvieron en el diseño. El gen de la estirpe germinal humano más próximo fue IGHV1-3*01 (63,3% idéntico a nivel de aminoácidos tomando como base IGMT/DomainGapAlign). Se encontraron 27 diferencias en la secuencia en las regiones marco 1 a 3 entre los genes de la estirpe germinal murina y humana. En la región marco 4, se cambiaron la Treonina-123 y la Leucina-124 por Leucina-123 y Valina-124, para equiparar con el gen IGHJ1*01 humano. Globalmente, la VH humanizada para MAb 3 es 87,8% idéntica a la región variable para IGHV1-46*03 y 88 de los 91 aminoácidos en las cuatro regiones marco son idénticos.

Se determinó que las CDR de VL para MAb 3 tenían una longitud de 11, 3, y 9 aminoácidos para CDR 1, 2, y 3 respectivamente. El gen de la estirpe germinal de ratón más próximo a la secuencia de MAb 3 VL murina, IGKV1117*01, se diferenciaba en un único residuo mapeado en una región marco. El gen de la estirpe germinal humana más próximo fue IGKV2-30*02 (81% idéntico a nivel de aminoácidos tomando como base IGMT/DomainGapAlign). Se encontraron 14 diferencias en la secuencia en las regiones marco 1 a 3 entre los genes de la estirpe germinal murina y humana. Los residuos E40 y F68 se han mantenido en la secuencia humanizada proyectada. En la región marco 4, se cambió la Leucina-124 por Valina-124, para equiparar con el gen IGKJ4*01 humano. Globalmente, la secuencia Vκ humanizada para MAb 3 es 93% idéntica a IGKV2D-29*02 y 87 de los 89 aminoácidos en las cuatro regiones marco son idénticos.

Las secuencias de VH y Vκ proyectadas se proporcionan en la tabla siguiente.

Tabla 19

SEC ID nº:: Secuencia de aminoácidos Cadena V

21: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYWVHWVRQAPGQRLEWMGGF YPGNSDSRYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRRDSPQY WGQGTLVTVSS hVH3

22: DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGGGT KVEIK hVκ3

Se determinó que las CDR de VH para MAb 4 tenían una longitud de 8, 8, y 11 aminoácidos para CDR 1, 2, y 3 respectivamente. El gen de la estirpe germinal de ratón más próximo a la secuencia de MAb 4 VH murina, IGHV19*01, se diferenciaba en 11 residuos, 4 de los cuales se mapearon en las CDR y se mantuvieron en el diseño de los anticuerpos monoclonales anti-hPG humanizados (S35, S36, y S37 en CDR1, F56 en CDR2). Además, se consideró que D66 era potencialmente importante para mantener la especificidad y se mantuvo en el diseño. El gen de la estirpe germinal humana más próximo fue IGHV1-46*03 (64,9% idéntico a nivel de aminoácidos tomando como base IGMT/DomainGapAlign). Se encontraron 27 diferencias en la secuencia en las regiones marco 1 a 3 entre los genes de la estirpe germinal murina y humana. En la región marco 4, se cambió la Alanina128 por Serina-128, para equiparar con el gen IGHJ5*01 humano. Globalmente, la VH humanizada para MAb 4 es 91,8% idéntica a la región variable para IGHV1-46*03 y 90 de los 91 aminoácidos en las cuatro regiones marco son idénticos.

Se determinó que las CDR de VL para MAb 4 tenían una longitud de 11, 3, y 9 aminoácidos para CDR 1, 2, y 3 respectivamente. El gen de la estirpe germinal de ratón más próximo a la secuencia de MAb 4 VL murina, IGKV1110*01, se diferenciaba en 3 residuos, 2 de los cuales se mapearon en CDR1 (serina-34 y valina-36) y se mantuvieron en el diseño de los anticuerpos monoclonales anti-hPG humanizados. El gen de la estirpe germinal humana más próximo fue IGKV2D-29*02 (81% idéntico a nivel de aminoácidos tomando como base IGMT/DomainGapAlign). Se encontraron 11 diferencias en la secuencia en las regiones marco 1 a 3 entre los genes de la estirpe germinal murina y humana. En la región marco 4, se cambió la serina-120 por glutamina-120, para equiparar con el gen IGKJ2*01 humano. Globalmente, la secuencia Vκ humanizada para MAb 4 es 92% idéntica a IGKV2D-29*02 y 100% idéntica para las cuatro regiones marco.

Las secuencias de VH y Vκ proyectadas se proporcionan en la tabla siguiente.

Tabla 20

SEC ID nº:: Secuencia de aminoácidos Cadena V

23: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSSSWMHWVRQAPGQGLEWMGIFLPG SGSTDYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCATDGNYDWFAYW GQGTLVTVSS hVH4

24: DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHSSGVTYLYWYLQKPGQSPQLLIYKVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPPTFGQGTKLEIK hVκ4

Se determinó que las CDR de VH para MAb 8 tenían una longitud de 8, 8, y 10 aminoácidos para CDR 1, 2, y 3 respectivamente. El gen de la estirpe germinal de ratón más próximo a la secuencia de MAb8 VH murina, IGHV59-3*01, se diferenciaba en 5 residuos, 4 de los cuales se mapearon en las CDR y se mantuvieron en el diseño de los anticuerpos monoclonales anti-hPG humanizados. Los genes de la estirpe germinal humana más próximos fueron IGHV3-21*01 y *02 (80,4% idéntico a nivel de aminoácidos tomando como base IGMT/DomainGapAlign). Se encontraron 12 diferencias en la secuencia en las regiones marco 1 a 3 entre los genes de la estirpe germinal murina y humana. En la región marco 4, se cambiaron la serina-123 y la leucina-124 por treonina-123 y valina124, respectivamente, para equiparar con el gen IGHJ6*01 humano. Globalmente, la VH humanizada para MAb 8 es 92,8% idéntica a la región variable para IGHV3-21*01 y *02 y 100% idéntica para las cuatro regiones marco. Existe un sitio potencial de N-glicosilación en la VH CDR3 murina para MAb8.

Se determinó que las CDR de VL para MAb 8 tenían una longitud de 11, 3, y 9 aminoácidos para CDR 1, 2, y 3 respectivamente. El gen de la estirpe germinal de ratón más próximo a la secuencia de MAb 8 VL murina, IGKV2109*01, se diferenciaba en 6 residuos, 4 de los cuales se mapearon en CDR1 y se mantuvieron en el diseño de los anticuerpos monoclonales anti-hPG humanizados. Los genes de la estirpe germinal humana más próximos fueron IGKV2-28*01 y IGKV2D-28*01 (75% idénticos a nivel de aminoácidos tomando como base IGMT/DomainGapAlign). Se encontraron 12 diferencias en la secuencia en las regiones marco 1 a 3 entre los genes de la estirpe germinal murina y humana. En la región marco 4, se cambiaron la alanina-120, leucina-124, y leucina 126 por glicina-120, valina-124, e isoleucina-126, respectivamente, para equiparar con el gen IGKJ4*01 humano. Globalmente, la secuencia Vκ humanizada para MAb 8 es 87% idéntica a IGKV2-28*01 y IGKV2D28*01 y 100% idéntica para las cuatro regiones marco.

Las secuencias de VH y Vκ proyectadas se proporcionan en la tabla siguiente.

Tabla 21

SEC ID nº:: Secuencia de aminoácidos Cadena V

75: EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTTYAMNWVRQAPGKGLEWVSSISSGGTYT YYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATQGNYSLDFWGQGTTVTVS S hVH8a

76: DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLRHTKGITFLDWYLQKPGQSPQLLIYQMSNRA SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPLTFGGGTKVEIK hVκ8a

77: EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTTYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISSGGTYT YYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATQGNYSLDFWGQGTTVTVS S hVH8b

78: DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLRHTKGITFLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNRA SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPLTFGGGTKVEIK hVκ8b

79: EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTTYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYT YYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATQGNYSLDFWGQGTTVTVS S hVH8b

Se determinó que las CDR de VH para MAb 13 tenían una longitud de 8, 8, y 7 aminoácidos para CDR 1, 2, y 3 respectivamente. El gen de la estirpe germinal de ratón más próximo a la secuencia de MAb 13 VH murina, IGHV5-6-3*01, se diferenciaba en 10 residuos, 5 de los cuales se mapearon en las CDR y se mantuvieron en el diseño de los anticuerpos monoclonales anti-hPG humanizados. Los genes de la estirpe germinal humana más próximos fueron IGHV3-7*01 y *02 (78,6% idénticos a nivel de aminoácidos tomando como base IGMT/DomainGapAlign). Se encontraron 13 diferencias en la secuencia en las regiones marco 1 a 3 entre los genes de la estirpe germinal murina y humana. En la región marco 4, se cambiaron la treonina-123 y la leucina124 por leucina-123 y valina-124, respectivamente, para equiparar con el gen IGHJ4*01 humano. Globalmente, la VH humanizada para MAb 13 es 91,8% idéntica a la región variable para IGHV3-7*01 y *02 y 100% idéntica para las cuatro regiones marco.

Se determinó que las CDR de VL para MAb 13 tenían una longitud de 11, 3, y 9 aminoácidos para CDR 1, 2, y 3 respectivamente. El gen de la estirpe germinal de ratón más próximo a la secuencia de MAb 13 VL murina, IGKV1-135*01, se diferenciaba en un único residuo localizado en una región marco. Los genes de la estirpe germinal humana más próximos fueron IGKV2-30*01 y *02 (81% idénticos a nivel de aminoácidos tomando como base IGMT/DomainGapAlign). Se encontraron 13 diferencias en la secuencia en las regiones marco 1 a 3 entre los genes de la estirpe germinal murina y humana. En la región marco 4, se cambió la leucina-124 por valina124, para equiparar con el gen IGKJ4*01 humano. Globalmente, la secuencia de Vκ humanizada para MAb 13 es 94% idéntica a IGKV2-30*01 y *02 y 100% idéntica para las cuatro regiones marco.

Las secuencias de VH y Vκ proyectadas se proporcionan en la tabla siguiente.

Tabla 22

80: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFSSYGMSWVRQAPGKGLEWVANINTFG DRTYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGTGTYWGQGTLV TVSS hVH.13a

81: DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLDSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLV SNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKVEI K hVκ13a

82: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFSSYGMSWVRQAPGKGLEWVASINTFG DRTYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGTGTYWGQGTLV TVSS hVH13b

83: DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLDSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLV SKRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKVEI K hVκ13b

Se determinó que las CDR de VH para MAb 16 tenían una longitud de 8, 8, y 10 aminoácidos para CDR 1, 2, y 3 respectivamente. El gen de la estirpe germinal de ratón más próximo a la secuencia de MAb 16, VH murina, IGHV1-53*01, se diferenciaba en 7 residuos, 2 de los cuales se mapearon en las CDR y se mantuvieron en el diseño de los anticuerpos monoclonales anti-hPG humanizados. Los genes de la estirpe germinal humana más próximos fueron IGHV1-46*01 y *03 (71,4% idénticos a nivel de aminoácidos tomando como base IGMT/DomainGapAlign). Se encontraron 25 diferencias en la secuencia en las regiones marco 1 a 3 entre los genes de la estirpe germinal murina y humana. En la región marco 4, se cambió la Leucina-124 por Valina-124, para equiparar con el gen IGHJ6*01 humano. Globalmente, la VH humanizada para MAb 16 es 96,9% idéntica a la región variable para IGHV1-46*01 y *03 y 100% idéntica para las cuatro regiones marco.

Se determinó que las CDR de VL para MAb 16 tenían una longitud de 11, 3, y 9 aminoácidos para CDR 1, 2, y 3 respectivamente. El gen de la estirpe germinal de ratón más próximo a la secuencia de MAb 16, VL murina, IGKV1-135*01, se diferenciaba en 4 residuos localizados en una región marco. Los genes de la estirpe germinal humana más próximos fueron IGKV2-30*01 y *02 (79% idénticos a nivel de aminoácidos tomando como base IGMT/DomainGapAlign), que se diferenciaban en un aminoácido en CDR1. Se encontraron 15 diferencias en la secuencia en las regiones marco 1 a 3 entre los genes de la estirpe germinal murina y humana. En la región marco 4, se cambió la glicina-120 por glutamina-120, para equiparar el gen IGKJ2*01 humano. Globalmente, la secuencia de Vκ humanizada para MAb 16 es 94% idéntica a IGKV2-30*01 y *02 y 100% idéntica para las cuatro regiones marco.

Las secuencias de VH y Vκ proyectadas se proporcionan en la tabla siguiente.

Tabla 23

SEC ID nº:: Secuencia de aminoácidos Cadena V

84: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPS NGGTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTRGGYYPFDYWG QGTTVTVSS hVH16a

85: DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLDSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLV SNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHSPYTFGQGTKLEI K hVκ16a

86: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMYWVRQAPGQGLEWMGIINPS NGGTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTRGGYYPFDYWG QGTTVTVSS hVH16b

87: DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLDSDGKTYLYWFQQRPGQSPRRLIYLV SNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHSPYTFGQGTKLEI K hVκ16b

88: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMYWVRQAPGQGLEWMGEINP SNGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTRGGYYPFDYW GQGTTVTVSS hVH16c

89: DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLDSDGKTYLYWFQQRPGQSPRRLIYLV SERDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHSPYTFGQGTKLEI K hVκ16c

Se determinó que las CDR de VH para MAb 19 tenían una longitud de 9, 7, y 14 aminoácidos para CDR 1, 2, y 3 respectivamente. El gen de la estirpe germinal de ratón más próximo a la secuencia de MAb 19 VH murina, IGHV3-2*01, se diferenciaba en 5 residuos, 2 de los cuales se mapearon en las CDR y se mantuvieron en el diseño de los anticuerpos monoclonales anti-hPG humanizados. El gen de la estirpe germinal humana más próximo fue IGHV4-30-4*01 (72,4% idéntico a nivel de aminoácidos tomando como base IGMT/DomainGapAlign). Sin embargo, como este gen es polimórfico, se seleccionaron IGHV4-31*02 y *03 (71,4% idénticos a nivel de aminoácidos tomando como base IGMT/DomainGapAlign). Se encontraron 21 diferencias en la secuencia en las regiones marco 1 a 3 entre los genes de la estirpe germinal murina y humana. En la región marco 4, se cambió la isoleucina-123 por leucina-123, para equiparar con el gen IGHJ4*01 humano. Globalmente, la VH humanizada para MAb 19 es 91,9% idéntica a la región variable para IGHV4-31*02 y *03 y

100% idéntica para las cuatro regiones marco.

Se determinó que las CDR de VL para MAb 19 tenían una longitud de 7, 7, y 13 aminoácidos para CDR 1, 2, y 3

respectivamente. El gen de la estirpe germinal de ratón más próximo a la secuencia de MAb 19 VL murina,

5 IGLV3*01, se diferenciaba en 8 residuos, 5 de los cuales se localizaron en una CDR. Los genes de la estirpe

germinal humana más próximos fueron IGLV4-69*01 y *02 (69,9% idénticos a nivel de aminoácidos tomando

como base IGMT/DomainGapAlign). Se encontraron 23 diferencias en la secuencia en las regiones marco 1 a 3

entre los genes de la estirpe germinal murina y humana. En la región marco 4, se cambió la valina-124 por

leucina-124, para equiparar con el gen IGLJ3*01 humano. Alternativamente, el gen IGJK4*01 puede usarse para 10 la región marco 4. Globalmente, la secuencia de Vκ humanizada para MAb 19 es 92,4% idéntica para IGLV4

69*01 y *02 y 100% idéntica para las cuatro regiones marco.

Las secuencias de VH y Vκ proyectadas se proporcionan en la tabla siguiente.

15 Tabla 24

SEC ID nº:: Secuencia de aminoácidos Cadena V

90: QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSDYAWSWIRQHPGKGLEWIGYISFS GYTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREVNYGDSYHFDY WGQGTLVTVSS VH19a

91: QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSQHRTYTIAWHQQQPEKGPRYLMKVKKDG SHSKGDGIPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGVGDAIKGQSVFVFGGG TKVEIK Vκ19a

92: QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSDYAWNWIRQHPGKGLEWIGYISFS GYTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREVNYGDSYHFDY WGQGTLVTVSS VH19b

93: QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSQHRTYTIEWHQQQPEKGPRYLMKVKKDG SHSKGDGIPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGVGDAIKGQSVFVFGGG TKVEIK Vκ19b

94: QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSDYAWNWIRQHPGKGLEWIGYISFS GYTSYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREVNYGDSYHFDY WGQGTLVTVSS VH19c

95: QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSQHRTYTIEWHQQQPEKGPRYLMEVKKDG SHSKGDGIPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGVGDAIKGQSVFVFGGG TKVEIK Vκ19c

Listado de secuencias

20 <110> BIOREALITES, S.A.S. CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM)

<120> ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA LA PROGASTRINA Y SUS UTILIZACIONES 25 <130> N111981

<150> 61/252.625

<151> 2009-10-16 30 <160> 99

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1 35 <211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

40 <221> fuente <223>/nota=" Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético "

<400> 1

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente <223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"

<400> 2

<210> 3

<211> 8 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 3

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

35 <400> 4

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

45 <221> fuente <223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"

<400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT 55 <213> Secuencia artificial

<220>

<400> 6

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 7

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 8

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 9

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 10

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<400> 11

<210> 12

<211> 115 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente 10 <223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: polipéptido sintético"

<400> 12

<210> 13

<211> 112

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 20

<220>

<221> fuente <223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: polipéptido sintético"

25 <400> 13

<210> 14

<211> 118

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<400> 14 10

<210> 15

<211> 112 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente 20 <223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: polipéptido sintético"

<400> 15

<210> 16

<211> 345

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: polinucleótido sintético" 5

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(345)

10 <400> 16

15 <210> 17

<211> 336

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<221> fuente <223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: polinucleótido sintético"

<220> 25 <221> CDS

<222> (1)..(336)

<400> 17

<210> 18

<211> 354 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente 10 <223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: polinucleótido sintético"

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(354) 15

<400> 18

<210> 19

<211> 336

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 25

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(336)

<400> 19

<210> 20 10 <211> 80

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20 15

<210> 21 20 <211> 115

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

25 <221> fuente <223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: polipéptido sintético"

<400> 21

<210> 22

<211> 112 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 22

<210> 23

<211> 118

<212> PRT 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: Polipéptido sintético" 25

<400> 23

<210> 24

<211> 112 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 24

<210> 25

<211> 14 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> MOD_RES

<222> (15) .. (15)

<223> Ahx

<400> 26

<210> 27

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

25 <210> 28

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

<210> 29 35 <211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29

<210> 30

<211> 7 45 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

<210> 31

<211> 9

<212> PRT 55 <213> Homo sapiens

<400> 31

<210> 32

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

<210> 33

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

<210> 34

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 35

<210> 36

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

<210> 37

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 37

<210> 38

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 38

<210> 39

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 15

<220>

20 <400> 39

<210> 40 25 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

30 <221> fuente <223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"

<400> 40

<210> 41

<211> 8

<212> PRT 40 <213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético" 45

<400> 41

50 <210> 42

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

55 <220>

<400> 42

<210> 43

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 43

<210> 44 15 <211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 44

<210> 45

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 45

<210> 46

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

45 <220>

<400> 46

<210> 47

<211> 10 55 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 47

<210> 48

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 48

<210> 49

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

25 <400> 49

<210> 50

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

35 <221> fuente <223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"

<400> 50

<210> 51

<211> 7

<212> PRT 45 <213> Secuencia artificial

<220>

<400> 51

55 <210> 52

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 52

<210> 53

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

15 <400> 53

<210> 54

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

25 <221> fuente <223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"

<400> 54

<210> 55

<211> 9

<212> PRT 35 <213> Secuencia artificial

<220>

<400> 55

45 <210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 56 55

<210> 57

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 57

<210> 58

<211> 13 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente 15 <223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"

<400> 58

<210> 59

<211> 117

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 25

<220>

30 <400> 59

<210> 60 35 <211> 114

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

40 <221> fuente <223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: Polipéptido sintético"

<400> 60 <210> 61

<211> 117 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 61

<210> 62

<211> 121

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 20

<220>

<221> fuente

<223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: Polipéptido sintético" 25 <400> 62

<210> 63

<211> 112 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 63

<210> 64

<211> 112

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 20

<220>

<221> fuente

<223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: Polipéptido sintético" 25 <400> 64

<210> 65

<211> 112 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 65

<210> 66

<211> 115

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 20

<220>

25 <400> 66 <210> 67

<211> 351 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(351) 15

<400> 67

20

<210> 68

<211> 342

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

25

<220>

<221> fuente

<223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: Polinucleótido sintético"

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(342)

<400> 68

<210> 69

<211> 351

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15

<220>

20 <220>

<221> CDS

<222> (1) .. (351)

<400> 69 25

<210> 70

<211> 363

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: Polinucleótido sintético" 10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(363)

15 <400> 70

<210> 71 20 <211> 336

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

25 <221> fuente <223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: Polinucleótido sintético"

<220>

<221> CDS 30 <222> (1)..(336)

<400> 71 <210> 72

<211> 336 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(336) 15

<400> 72

<210> 73

<211> 336

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 25

<220>

30 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(336)

<400> 73

<210> 74

<211> 345

<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: Polinucleótido sintético" 15

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(345)

20 <400> 74

25 <210> 75

<211> 117

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 75

<210> 76

<211> 112

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 15

<220>

20 <400> 76

<210> 77 25 <211> 117

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <221> fuente

<223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: Polipéptido sintético"

<400> 77

<210> 78

<211> 112

<212> PRT 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: Polipéptido sintético" 15

<400> 78

20 <210> 79

<211> 117

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<400> 79 30 <210> 80

<211> 114 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 80

<210> 81

<211> 112

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 20

<220>

<221> fuente

<223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: Polipéptido sintético" 25 <400> 81

<210> 82

<211> 114 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 82

<210> 83

<211> 112

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 20

<220>

<221> fuente

<223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: Polipéptido sintético" 25 <400> 83

<210> 84

<211> 117 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 84

<210> 85

<211> 112

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 20

<220>

<221> fuente

<223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: Polipéptido sintético" 25 <400> 85

5 <210> 86

<211> 117

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<400> 86 15

<210> 87

<211> 112 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

25 <223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: Polipéptido sintético"

<400> 87 5 <210> 88

<211> 117

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<400> 88 15

<210> 89

<211> 112 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<400> 89 5 <210> 90

<211> 121

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<400> 90 15

<210> 91

<211> 115 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<400> 91

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

10 <221> fuente <223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: Polipéptido sintético"

<400> 92

<210> 93

<211> 115

<212> PRT 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: Polipéptido sintético"

<400> 93 5 <210> 94

<211> 121

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<400> 94 15

<210> 95

<211> 115 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<400> 95

<210> 96

<211> 29 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente 10 <223>/nota="Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2) .. (3) 15 <223> Ahx

<400> 96

<210> 97

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 25

<220>

30 <220>

<221> MOD_RES

<222> (2) .. (3)

<223> Ahx

35 <400> 97

<210> 98 40 <211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11) .. (12)

<223> Ahx

<400> 98

<210> 99

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 99

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Anticuerpo monoclonal anti-hPG que se une específicamente a una región C-terminal de la progastrina humana (hPG), que comprende las CDR de VH y VL siguientes:

VH CDR1 de SEC ID nº: 37, VH CDR2 de SEC ID nº: 41, VH CDR3 de SEC ID nº: 45, VL CDR1 de SEC ID nº: 49, VL CDR2 de SEC ID nº: 52, y VL CDR3 de SEC ID nº: 55.
2.

Anticuerpo monoclonal anti-hPG según la reivindicación 1, que proporciona una reducción significativa estadísticamente en el número de células de cáncer colorrectal vivas tras el tratamiento in vitro de una muestra de ensayo en comparación con una muestra de control tratada con un anticuerpo monoclonal no específico.
3.

Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2, en el que dichas células de cáncer colorrectal son las células de LS174T.
4.

Anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo es seleccionado de entre el grupo que consiste en: anticuerpos híbridos, primatizados y humanizados.
5.

Anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende las cadenas VH y VL que presentan unas secuencias representadas por SEC ID nº 59 y SEC ID nº 63, respectivamente.
6.

Anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que está humanizado.
7.

Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 6 que comprende unas cadenas VH y VL que presentan unas secuencias seleccionadas de entre uno de los grupos de secuencias de VH y VL siguientes:

(i)

VHde SEC ID nº: 75 y VLde SEC ID nº: 76;

(ii)

VHde SEC ID nº: 77 y VLde SEC ID nº: 78; y,

(iii) VH de SEC ID nº: 79 y VL de SEC ID nº: 76.
8.

Anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que presenta una afinidad en el intervalo de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 7 nM.
9.

Anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, estando dicho anticuerpo conjugado a una fracción.
10.

Composición que comprende un anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un excipiente, vehículo y/o diluyente.
11.

Composición según la reivindicación 10 que se formula para una utilización farmacéutica.
12.

Primer polinucleótido que codifica una cadena ligera variable (VL) y segundo polinucleótido que codifica una cadena pesada variable (VH) o polinucleótido único que codifica tanto las cadenas ligera como la pesada variables (VL y VH), para expresar un anticuerpo monoclonal anti-hPG según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
13.

Vector de expresión que comprende un primer polinucleótido que codifica una cadena ligera variable (VL) y un segundo polinucleótido que codifica una cadena pesada variable (VH) o un polinucleótido único que codifica las cadenas ligera y pesada variables (VL y VH), para expresar un anticuerpo monoclonal anti-hPG según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
14.

Célula hospedadora transformada con un primer polinucleótido que codifica una cadena ligera variable (VL) y un segundo polinucleótido que codifica una cadena pesada variable (VH) o un polinucleótido único que codifica las cadenas ligera y pesada variables (VL y VH), para expresar un anticuerpo monoclonal anti-hPG según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
15.

Hibridoma apto para secretar un anticuerpo monoclonal anti-hPG según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
16.

Anticuerpo monoclonal anti-hPG según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su utilización en el tratamiento del cáncer colorrectal.
17.

Anticuerpo para la utilización según la reivindicación 16, en el que tratar el cáncer colorrectal implica administrar dicho anticuerpo en combinación con un segundo agente terapéutico.
18.

Anticuerpo para la utilización según la reivindicación 17, en el que dicho anticuerpo y dicho segundo agente terapéutico son administrados simultánea, sucesiva o separadamente.
19.

Anticuerpo para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 17 o 18, en el que dicho segundo agente terapéutico es un agente quimioterápico o un anticuerpo terapéutico.
20.

Anticuerpo para la utilización según la reivindicación 19, en el que dicho segundo anticuerpo terapéutico es un anticuerpo monoclonal anti-EGFR o un anticuerpo monoclonal anti-VEGF.