ES2688978T3

ES2688978T3 - Anticuerpo monomérico Fc

Info

Publication number: ES2688978T3
Application number: ES10832331.2T
Authority: ES
Inventors: Hongxing Zhou; Gunasekaran Kannan; Nancy Sun
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2009-11-23
Filing date: 2010-11-22
Publication date: 2018-11-07
Anticipated expiration: 2030-11-22
Also published as: EP2504360A1; JP6329585B2; JP2013511281A; WO2011063348A1; MX340971B; MX2012005731A; AU2010321720B2; JP2016190844A; US20120244578A1; EP2504360A4; EP2504360B1; US9200060B2; AU2010321720A1; CA2781539A1; CA2781539C

Abstract

Un polipéptido Fc monomérico que comprende un dominio CH2 y CH3, en el que dicho dominio CH3 es un dominio CH3 de IgG y comprende: (a) dos o más aminoácidos cargados que son electrostáticamente desfavorables para la formación de homodímeros de CH3, en el que los aminoácidos cargados son K392D y K409D; y (b) una sustitución de aminoácido de uno o más restos de la superficie de contacto hidrófoba con un resto de aminoácido polar, en el que la sustitución del resto de la superficie de contacto hidrófoba se selecciona del grupo que consiste en Y349T, L351T, L368T y F405T.

Description

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DESCRIPCION

Anticuerpo monomérico Fc Antecedentes de la invención

Los anticuerpos desempeñan un papel central en la defensa frente a la invasión de moléculas no propias. La capacidad de los anticuerpos para interaccionar con el receptor Fc neonatal (FcRn) de una manera dependiente del pH les confiere una prolongada semivida en suero (Ghetie y Ward 2000). Esta característica única de los anticuerpos permite prolongar la semivida de la proteína o del péptido terapéutico en el suero mediante la modificación por ingeniería genética de moléculas de fusión Fc. Los anticuerpos IgG de origen natural y las moléculas de fusión Fc modificadas por ingeniería genética son bivalentes y monoespecíficos. Esto se debe a la naturaleza homodimérica de Fc. Para determinadas aplicaciones terapéuticas, sería deseable conservar todos los atributos positivos conferidos por el anticuerpo o el fragmento Fc del anticuerpo, pero alcanzar la especificidad monovalente mediante la modificación por ingeniería genética de Fc monomérico.

Los anticuerpos pertenecen a la clase de proteínas inmunoglobulinas, que incluye IgG, IgA, IgE, IgM y IgD. La clase de inmunoglobulina más abundante en el suero humano es IgG, cuya estructura esquemática se muestra en la Figura 1 (Deisenhofer 1981; Huber 1984; Roux 1999). La estructura de IgG tiene cuatro cadenas, dos cadenas ligeras y dos pesadas; cada cadena ligera tiene dos dominios y cada cadena pesada tiene cuatro dominios. El sitio de unión al antígeno está ubicado en la región Fab (fragmento de unión al antígeno) que contiene un dominio de cadena ligera variable (VL) y un dominio de cadena pesada variable (VH), así como dominios de cadena ligera constante (LC) y de cadena pesada constante (CH1). El fragmento Fc (Fragmento cristalizable) del anticuerpo contiene la región del dominio CH2 y CH3 de la cadena pesada. La molécula de IgG puede considerarse un heterotetrámero que tiene dos cadenas pesadas que se mantienen unidas por enlaces disulfuro (-S-S-) en la región bisagra y dos cadenas ligeras. El número de enlaces disulfuro de la bisagra varía entre las subclases de inmunoglobulina (Papadea y Check, 1989). El sitio de unión a FcRn está ubicado en la región Fc del anticuerpo (Martin, West et al., 2001) y, por lo tanto, se mantiene la propiedad de semivida en suero prolongada del anticuerpo en el fragmento Fc. La región Fc sola puede considerarse un homodímero de cadenas pesadas que comprende los dominios CH2 y CH3. El documento WO2009/089004 describe métodos de fabricación de moléculas heterodiméricas de anticuerpo Fc usando efectos de dirección electrostática.

Sumario de la invención

En el presente documento, se proporcionan polipéptidos Fc que contienen alteraciones en el dominio de superficie de contacto de CH3 que reducen significativamente la capacidad del polipéptido para formar homodímeros. En realizaciones preferidas, la reducción en la dimerización es de aproximadamente el 100 %. Los polipéptidos Fc incluyen dos o más aminoácidos cargados que son electrostáticamente desfavorables para la formación de homodímeros de CH3 y una sustitución de aminoácidos de uno o más restos de la superficie de contacto de CH3 hidrófoba con un resto de aminoácido polar, , treonina.

En ciertas realizaciones, el dominio CH3 es un dominio CH3 de IgG humana que tiene alteraciones que son electrostáticamente desfavorables para la formación de homodímeros de CH3, incluyendo un aminoácido cargado negativamente, el ácido aspártico, en la posición 392 y/o la posición 409, y uno o más restos de la superficie de contacto hidrófoba sustituidos seleccionados del grupo que consiste en Y349, L351, L368, V397, L398, F405 y Y407, sustituidos con treonina.

El polipéptido Fc monomérico puede comprender además un dominio CH1 de anticuerpo o estar comprendido dentro de una cadena pesada de anticuerpo. En determinadas realizaciones, un anticuerpo monomérico comprende la cadena pesada monomérica y una cadena ligera, creando esencialmente un semianticuerpo.

La cadena pesada monomérica puede tener uno o más restos de cisteína mutados para evitar la formación de enlaces disulfuro. Las mutaciones de cisteína particularmente útiles son las de la región bisagra de la cadena pesada.

Otros aspectos de la invención son ácidos nucleicos que codifican polipéptidos Fc monoméricos, vectores de expresión que comprenden dichos ácidos nucleicos, y células hospedadoras que contienen dichos vectores de expresión.

Las realizaciones de la invención incluyen además métodos de preparación de un polipéptido Fc monomérico. En realizaciones preferidas, dichos métodos comprenden cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido Fc monomérico en condiciones en las que se exprese el polipéptido Fc monomérico, y luego recuperar el polipéptido Fc monomérico del cultivo de la célula hospedadora.

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Breve descripción de los dibujos

Figura 1. (a) Diagrama esquemático del anticuerpo IgG1 con los dominios indicados. El anticuerpo IgG1 es un tetrámero en forma de Y con dos cadenas pesadas (longitud mayor) y dos cadenas ligeras (longitud menor). Las dos cadenas pesadas están unidas mediante enlaces disulfuro (-S-S-) en la región bisagra. Fab - fragmento de unión al antígeno, Fc - fragmento cristalizable, VL - dominio de cadena ligera variable, VH - dominio de cadena pesada variable, CL - dominio de cadena ligera constante (sin variación de secuencia), CH1 - dominio de cadena pesada constante 1, CH2 - dominio de cadena pesada constante 2, CH3 - dominio de cadena pesada constante 3. (b) Diagrama esquemático del anticuerpo monovalente - Fab fusionado a Fc monomérico. En este caso, la superficie de contacto del dominio CH3 se modifica a través de mutaciones de aminoácidos.

Figura 2. La Figura representa algunas de las realizaciones que incluyen Fc monomérico (o monovalente). Estas incluyen la fusión tanto al extremo N como al C del Fc monomérico. El Fc conserva su capacidad para interaccionar con el receptor FcRn, incluso sin dimerización ni los dominios Fab, lo que conduce a una semivida en suero más prolongada para las proteínas/los dominios que están fusionados con el Fc monomérico. scFv - dominio variable de fragmento monocatenario.

Figura 3. Estructura de la superficie de contacto del dominio CH3 con restos implicados en la interacción dominio-dominio mostrada. Los restos de la superficie de contacto se identificaron usando un método de corte de distancia. Los restos estructuralmente conservados y enterrados (área de superficie accesible al disolvente <10 %) se muestran en el modelo de barras y esferas. Los restos expuestos al disolvente o estructuralmente no conservados se muestran en la representación de las barras. El análisis se basa en la estructura cristalina de IgG1 (código PDB: 1L6X), que se determina en alta resolución (1,65 A) (Idusogie, Presta et al., 2000).

Figura 4. (a) Lista de construcciones diseñadas con mutaciones en la superficie de contacto del dominio CH3 de Fc y (b) gel de Coomassie de SDS-PAGE teñido con reactivo de tinción azul GELCODE™ para ocho proteínas Fc mutantes purificadas. El mutante n.° 4 de la Tabla 2 no se incluyó debido a la cantidad insuficiente de proteína. Las construcciones migran de forma similar en el gel reducido y no reducido debido al hecho de que estas construcciones de Fc carecen de bisulfuro de bisagra. En otras palabras, a diferencia de las moléculas de IgG, no hay disulfuros entre las cadenas pesadas que conecten las dos cadenas pesadas, ya que el objetivo en este caso es lograr la cadena pesada de Fc monomérico.

Figura 5A-5E. Perfiles de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) para las 9 construcciones enumeradas en la Tabla 2. Las construcciones que muestran un perfil de SEC monomérico ilustrativo están marcadas como “Monómero”.

Figura 6. Análisis BIACORE de la unión de FcRn humano y de ratón a construcciones de Fc de tipo silvestre y mutante.

Figura 7. Análisis del tamaño de proteína usando ultracentrifugación analítica (AUC).

Figura 8. Comparación de secuencias del dominio CH3 de las subclases de IgG humana y de ratón. Los restos identificados de la superficie de contacto del dominio CH3 (24, Tabla 1; indicados por "*") están muy conservados. Por lo tanto, las mutaciones que conducen a la monomerización en Fc de IgG1 humana pueden extenderse a otras subclases de IgG humanas, así como a especies distintas de las humanas. En (a), las secuencias derivadas de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas corresponden a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente. En (b), las secuencias derivadas de IgG1 humana, IgG1 de ratón, IgG2a de ratón, IgG2b de ratón e IgG3 de ratón corresponden a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9, respectivamente.

Figura 9. Farmacocinética de diversas moléculas de fusión Fc en ratones como se describe en el Ejemplo 2. Descripción detallada de las realizaciones preferidas

El Fc silvestre es de naturaleza homodimérica, y esta característica es impulsada por la fuerte interacción de alta afinidad que existe entre los dos dominios CH3. En el presente documento, se describen moléculas de Fc monomérico, y métodos para fabricación y uso de dichas moléculas. Aunque el término "Fc" se considera normalmente un homodímero de polipéptidos, el término como se usa en el presente documento, debido a las propiedades únicas de los polipéptidos de la invención, también incluirá polipéptidos monoméricos que comprenden una secuencia de aminoácidos correspondiente a la parte Fc de la cadena pesada, por ejemplo, que contiene un dominio CH2 y CH3.

Los métodos descritos en el presente documento demuestran que, mediante la sustitución de restos de la superficie de contacto del dominio CH3, es posible interrumpir por completo la asociación de CH3/CH3, pero mantener la estabilidad de la molécula, logrando así un Fc monomérico. La naturaleza monomérica del Fc modificado puede evaluarse mediante, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y ultracentrifugación analítica (AUC). Las sustituciones logran dos cosas: una es obstaculizar la formación de homodímeros del dominio CH3 y la otra es estabilizar la forma monomérica de Fc.

La metodología para identificar los aminoácidos que forman una superficie de contacto de CH3-CH3 se desvela en el documento WO2009089004. Se identificó un total de 48 estructuras cristalinas de anticuerpos que tenían coordenadas correspondientes a la región Fc a partir del banco de datos de proteínas (PDB) (Bernstein, Koetzle et al. 1977) usando un algoritmo de búsqueda basado en la estructura (Ye y Godzik 2004). El examen de las estructuras cristalinas de Fc identificadas reveló que la estructura determinada a la resolución más alta corresponde

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al fragmento Fc de RITUXIMAB unido a una versión minimizada del dominio B de la proteína A denominada Z34C (código PDB: 1L6X). La estructura biológica del homodímero Fc para 1L6X se generó usando las coordenadas del monómero Fc depositadas y la simetría del cristal. Se usaron dos métodos para identificar los restos implicados en la interacción del dominio CH3-CH3: (i) el contacto según lo determinado por el criterio del límite de distancia y (ii) el análisis del área de superficie accesible para al disolvente.

De acuerdo con el método basado en el contacto, los restos de la superficie de contacto se definen como los restos cuyos átomos pesados de cadena lateral están situados más cerca que un límite especificado de los átomos pesados de cualquier resto de la segunda cadena. Aunque se prefiere un límite de distancia de 4,5 A, también se podría usar un límite de distancia mayor (por ejemplo, 5,5 A) para identificar los restos de la superficie de contacto (Bahar y Jernigan, 1997).

La Tabla 1 enumera veinticuatro restos de superficie de contacto identificados en función del método del criterio del contacto, usando el límite de distancia de 4,5 A. Estos restos se examinaron más a fondo para la conservación estructural. Para este fin, se superpusieron las 48 estructuras cristalinas de Fc identificadas del PDB, y se analizaron calculando la desviación cuadrática media de la raíz para los átomos pesados de la cadena lateral. La Figura 3 muestra la superficie de contacto del dominio CH3 junto con las posiciones estructuralmente conservadas, enterradas (% de ASA < 10) y al descubierto (% de aSa > 10) (refiriéndose el % de ASA a la relación de ASA observado con el ASA patrón de aminoácidos; (Lee y Richards 1971)). También se examinó la conservación de los restos de la superficie de contacto entre las subclases de IgG humanas y de ratón, así como entre otras clases de Ig mediante comparaciones de secuencias (Figura 8).

En el presente documento, se describen diversas sustituciones o mutaciones de la parte Fc de un anticuerpo. Dichas variaciones se designan por el aminoácido en esa posición de la cadena pesada de anticuerpo de tipo silvestre basándose en el esquema de numeración de Kabat de la UE, seguido del aminoácido sustituido en esa posición. Por ejemplo, cuando la tirosina de la posición EU 349 se sustituye con treonina, se designa "Y349T". Por "secuencia de tipo silvestre" se entiende una secuencia de aminoácidos que se produce de manera natural dentro de una especie de animales, por ejemplo, seres humanos. La secuencia de tipo silvestre puede variar ligeramente entre los individuos dentro de una población, por ejemplo, se conocen en la técnica alelos diferentes para las diversas cadenas de inmunoglobulina.

Para desalentar la formación de homodímeros, se reemplazan uno o más restos que constituyen la superficie de contacto de CH3-CH3 por un aminoácido cargado de manera que la interacción se vuelve electrostáticamente desfavorable. En realizaciones preferidas, un aminoácido cargado positivamente en la superficie de contacto, tal como lisina, arginina o histidina, se reemplaza por un aminoácido cargado negativamente, tal como ácido aspártico o ácido glutámico, y/o un aminoácido cargado negativamente de la superficie de contacto se reemplaza por un aminoácido con carga positiva. Usando IgG humana como ejemplo, los restos cargados de dentro de la superficie de contacto que pueden cambiarse a la carga opuesta incluyen R355, D356, E357, K370, K392, D399, K409 y K439. En determinadas realizaciones preferidas, se cambian dos o más restos cargados de dentro de la superficie de contacto a una carga opuesta. Las moléculas ilustrativas incluyen aquellas que comprenden mutaciones K392D y K409D. Se describen las que comprenden mutaciones D399K y D356K.

Con el fin de mantener la estabilidad del polipéptido en forma monomérica, se reemplazan uno o más restos hidrófobos grandes que constituyen la superficie de contacto de CH3-CH3 por un aminoácido polar pequeño. Usando IgG humana como ejemplo, los restos hidrófobos grandes de la superficie de contacto de CH3-CH3 incluyen Y349, L351, L368, L398, V397, F405 y Y407. Los restos de aminoácidos polares pequeños incluyen asparagina, cisteína, glutamina, serina y treonina.

En los ejemplos, dos de los restos de Lys cargados positivamente que están ubicados cerca en la superficie de contacto del dominio CH3 se mutaron a Asp. A continuación, se llevó a cabo la mutagénesis por exploración de treonina en los restos hidrófobos grandes estructuralmente conservados en el fondo de estas dos mutaciones de Lys a Asp. Las moléculas de Fc que comprenden las mutaciones de K392D K409D junto con las diversas sustituciones con treonina se analizaron para determinar la formación de monómeros. Los ejemplos de moléculas de Fc monoméricas incluyen las que tienen sustituciones K392D K409D Y349T y las que tienen sustituciones K392D K409D F405T.

Debido a la naturaleza de semimolécula del monómero Fc, su estabilidad térmica es inferior a la del dímero Fc, que tiene una interacción con el dominio CH3-CH3 de alta afinidad. Para aumentar la estabilidad térmica, se pueden introducir uno o más enlaces disulfuro dentro de los dominios CH2 y CH3. Los enlaces disulfuro pueden introducirse mutando uno o más de los siguientes pares de aminoácidos

LYS246 - ASP249 SER267 - GLU269 THR393 - SER408 PR0245 - PR0257 PR0247 - ASP376

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ASP249 - PR0257 VAL266 - TYR300 ASP270-LYS326 LEU309-ASP312 ALA339 - PR0374 PR0343 - ALA431 ARG344 - TYR373 THR350-LEU441 TRP381 - GLU388 PR0396 - PHE404 PHE241 -VAL262 LEU242 - LYS334 PHE243 - THR260 PR0245 - ASP249 LYS248 - ALA378 ASP249 - ARG255 THR250 - PR0257 LEU251- HIS435 MET252 - ARG255 VAL259 - LEU306 CYS261 - SER304 VAL263 - VAL302 VAL264 - ASP265 LYS274 - SER324 ASN276-LYS322 TYR278 - LYS320 ALA287 - LEU306 LYS290 - VAL303 ARG292 - VAL302 ASP312-LYS317 SER324 - PR0331 GLU345 - ALA431 PR0346 - PHE372 VAL348 - LYS439 TYR349 - LEU368 LEU351 - THR366 PR0353 - GLU357 PR0353 - VAL363 SER354 - ASP356 LEU365-LEU410 CYS367 - SER408 LYS370 - PHE405 SER375 - PR0396 SER375 - PHE404 ALA378 - MET428 GLU380 - SER426 TYR391 -LEU410 VAL422 - SER442 ASN434 - TYR436.

La capacidad de los anticuerpos para interaccionar con el receptor Fc neonatal (FcRn) de una manera dependiente del pH les confiere una prolongada semivida en suero. Las moléculas de Fc monoméricas de la presente invención pueden conservar la capacidad de unirse a FcRn de forma similar, si no superior, a los polipéptidos de Fc de tipo silvestre (FIG. 6). Como se muestra en el Ejemplo 2, las moléculas de Fc monoméricas de la presente invención pueden conservar la semivida en suero prolongada presentada por los anticuerpos y, por lo tanto, son útiles para prolongar la semivida en suero de los polipéptidos unidos covalentemente al, por ejemplo, fusionado al, polipéptido Fc monomérico. Se contempla además que el Fc monomérico se puede modificar por ingeniería genética para que contenga una o más mutaciones adicionales que aumenten la afinidad hacia FcRn, aumentando así aún más la semivida de la molécula en circulación. Dichas mutaciones adicionales incluyen, pero sin limitación, M252Y/S254T/T256E, M428L/N434S, T250Q/M428L, N434H, T307Q/N434A, T307Q/N434S, T307Q/E380A/N434S y V308P/N434S.

Las composiciones y los métodos de la presente invención pueden no estar limitados a las variantes de los alelos

ilustrativos desvelados en el presente documento, sino que pueden incluir aquellos que tienen al menos el 70 %, al

menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 81 %, al menos el 82 %, al menos el 83 %, al menos el 84 %, al

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Se contempla que la creación de moléculas que contienen Fc monomérico no se limita a las basadas en Fc de IgG, sino que también se aplica a la región Fc de otras subclases de inmunoglobulina incluyendo IgA, IgE, IgD e IgM.

Casi cualquier molécula que contenga un dominio Fc puede comprender un dominio Fc monomérico de la presente invención. Los ejemplos de dichas moléculas se muestran en la FIG. 2. Como se ve en la FIG. 2, se pueden fusionar o conjugar diversos péptidos al extremo N o al extremo C del Fc. La molécula que contiene Fc se fusiona a un Fab para crear un semianticuerpo. Dicho semianticuerpo puede crearse expresando una cadena pesada que comprenda un Fc monomérico y una cadena ligera de manera recombinante en una célula, por ejemplo, una célula cHo. La cadena pesada puede contener una o más mutaciones adicionales. La cadena pesada puede comprender además la mutación de uno o más restos de cisteína en la región bisagra (Allen et al., Biochemistry. 5 de mayo de 2009;48(17):3755-66).

Los polipéptidos Fc de la presente invención demuestran una dimerización reducida en comparación con las moléculas de Fc de tipo silvestre. La invención puede incluir composiciones que comprenden un anticuerpo o una molécula de fusión Fc, en las que la cantidad de dimerización Fc-Fc mostrada por dicho anticuerpo o molécula de fusión Fc es inferior al 15 %, inferior al 14 %, inferior al 13 %, inferior al 12 %, inferior al 11 %, inferior al 10 %, inferior al 9 %, inferior al 8 %, inferior al 7 %, inferior al 6 %, inferior al 5 %, inferior al 4 %, inferior al 3 %, inferior al 2 % o inferior al 1 %. La dimerización se puede medir mediante varias técnicas conocidas en la materia. Los métodos preferidos para medir la dimerización incluyen la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), ultracentrifugación analítica (AUC), dispersión de luz dinámica (DLS) y PAGE nativa.

Las moléculas de monómero Fc descritas en el presente documento son útiles para prolongar la semivida de proteínas o dominios terapéuticos. Las enfermedades que pueden tratarse con un agente terapéutico de monómero Fc pueden incluir inflamación, cáncer, trastornos metabólicos y otros. Las posibles dianas de fusión incluyen dominios de unión a proteínas naturales (tales como IL-IRa, TIMP3, péptido SHK, EPO, G-CSF), fragmentos de anticuerpos (tales como Fab, scFv, diacuerpo, aglutinantes derivados de dominios variables), dominios de unión a proteínas derivadas de armazones alternativos (tales como variantes de Fn3, variantes de repetición de anquirina, variantes de centirina, avímeros) y péptidos que reconocen antígenos específicos. Las proteínas de fusión de monómero Fc tienen la ventaja de tener un tamaño pequeño, por lo tanto, una capacidad potencialmente mejor de penetrar en los tejidos. Las proteínas de fusión de monómero Fc pueden ser especialmente útiles cuando se prefiere la monovalencia de la unión a la diana. A menudo, se prefiere dicha monovalencia cuando la dirección es hacia moléculas de la superficie celular que son susceptibles al agonismo cuando son dianas usando anticuerpos multivalentes.

Definiciones

A menos que se defina lo contrario en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados comúnmente entendidos por los expertos en la materia. Además, a no ser que el contexto requiera otra cosa, los términos en singular incluirán las pluralidades, y los términos en plural incluirán el singular. En general, las nomenclaturas usadas en conexión con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética, y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación que se describen en el presente documento son las bien conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Los métodos y las técnicas de la presente invención, en general, se realizan de acuerdo con métodos convencionales muy conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) y Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lane, “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se realizan comúnmente en la técnica o como se describe en el presente documento. La terminología usada en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética, y química médica y farmacéutica que se describen en el presente documento son los conocidos y comúnmente usados en la técnica. Se pueden usar las técnicas convencionales para las síntesis químicas, los análisis químicos, la preparación, formulación y administración de productos farmacéuticos, y el tratamiento de pacientes.

Los siguientes términos y expresiones, a menos que se indique otra cosa, se entenderán como que tienen los siguientes significados: La expresión "molécula aislada" (en la que la molécula es, por ejemplo, un polipéptido, un polinucleótido o un anticuerpo) es una molécula que en virtud de su origen o fuente de derivación (1) no está asociada con componentes asociados de manera natural que la acompañan en su estado nativo; (2) está

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sustancialmente exenta de otras moléculas de la misma especie; (3) es expresada por una célula de una especie diferente; o (4) no se da en la naturaleza. Por lo tanto, una molécula que se sintetiza químicamente, o se expresa en un sistema celular diferente de la célula a partir de la que se origina de forma natural, se "aislará" de sus componentes asociados de manera natural. Una molécula también puede volverse esencialmente libre de componentes asociados de manera natural mediante el aislamiento, usando técnicas de purificación bien conocidas en la materia. La pureza u homogeneidad de la molécula se puede ensayar mediante una serie de medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la pureza de una muestra polipeptídica puede ensayarse usando electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción del gel para visualizar el polipéptido usando técnicas bien conocidas en la materia. Para ciertos fines, se puede proporcionar una resolución más alta usando HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica para la purificación.

Las secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas se indican usando abreviaturas convencionales de una o tres letras. A menos que se indique otra cosa, las secuencias polipeptídicas tienen sus extremos amino a la izquierda y sus extremos carboxi a la derecha, y las secuencias de ácido nucleico monocatenario, y la cadena superior de las secuencias de ácido nucleico bicatenario, tienen sus extremos 5' a la izquierda y sus extremos 3' a la derecha. También se puede describir una determinada secuencia polipeptídica o polinucleotídica explicando cómo difiere de una secuencia de referencia.

Los términos “péptido”, "polipéptido" y "proteína" se refieren cada uno a una molécula que comprende dos o más restos de aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos. Estos términos abarcan, por ejemplo, proteínas nativas y artificiales, fragmentos de proteína y análogos polipeptídicos (tales como muteínas, variantes y proteínas de fusión) de una secuencia de proteína, así como proteínas modificadas después de la traducción, o si no, covalente o no covalentemente. Un péptido, un polipéptido o una proteína puede ser monomérico o polimérico.

La expresión "fragmento polipeptídico", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que tiene una eliminación amino-terminal y/o carboxi-terminal en comparación con una proteína de longitud completa correspondiente. Los fragmentos pueden ser, por ejemplo, de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 50, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos de longitud. Los fragmentos también pueden ser, por ejemplo, de al menos 1.000, 750, 500, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 14, 13, 12, 11 o 10 aminoácidos de longitud. Un fragmento puede comprender además, en uno o ambos de sus extremos, uno o más aminoácidos adicionales, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de una proteína natural diferente o una secuencia de aminoácidos artificial.

Los polipéptidos de la invención incluyen polipéptidos que se han modificado de cualquier manera y por cualquier motivo, por ejemplo, para: (1) reducir la susceptibilidad a la proteólisis; (2) reducir la susceptibilidad a la oxidación; (3) alterar la afinidad de unión para formar complejos proteicos (4) alterar las afinidades de unión; y (4) conferir o modificar otras propiedades fisicoquímicas o funcionales. Los análogos incluyen muteínas de un polipéptido. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de uno o varios aminoácidos (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia de origen natural (por ejemplo, en la parte del polipéptido de fuera del/de los dominio/s que forma/n contactos intermoleculares). Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es aquella que no cambia sustancialmente las características estructurales de la secuencia original (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debe tender a romper una hélice que se produzca en la secuencia original, ni interrumpir otros tipos de estructura secundaria que caractericen la secuencia precursora o que sean necesarios para su funcionalidad). Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias polipeptídicas reconocidas en la técnica se describen en “Proteins, “Structures and Molecular Principles” (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); “Introduction to Protein Structure” (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N. Y. (1991)).

Una "variante" de un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o más restos de aminoácidos se insertan, eliminan y/o sustituyen en la secuencia de aminoácidos en relación con otra secuencia polipeptídica. Las variantes de la invención incluyen aquellas que comprenden una variante de dominio CH2 o CH3. Una variante puede comprender una o más mutaciones que, cuando están presentes en una molécula de Fc, aumentan la afinidad hacia el polipéptido a uno o más FcyR. Dichas variantes demuestran una citotoxicidad mediada por células dependiente de los anticuerpos potenciada. Los ejemplos de variantes que la proporcionan se describen en la patente de EE.UU. n.° 7.317.091.

Otras variantes incluyen aquellas que disminuyen la capacidad de los polipéptidos que contienen dominios CH3 para homodimerizarse. Los ejemplos de dichas variantes de Fc se describen en las patentes de EE.UU. n.° 5.731.168 y 7.183.076. Se describen más ejemplos en las solicitudes provisionales de EE.UU. en copropiedad U.S. 61/019.569, presentada el 07/01/2008, y 61/120.305, presentada el 05/12/2008.

Un "derivado" de un polipéptido es un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) que se ha modificado químicamente, por ejemplo, mediante conjugación a otra fracción química tal como, por ejemplo, polietilenglicol, un agente citotóxico, albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humano), fosforilación y glicosilación. A menos que se indique otra cosa, El término “anticuerpo” incluye, además de anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, derivados, variantes, fragmentos y muteínas de los mismos, cuyos ejemplos se describen en el presente documento.

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La expresión "anticuerpo humano" incluye todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Todos los dominios variables y constantes pueden derivar de secuencias de inmunoglobulina humana (un anticuerpo completamente humano). Estos anticuerpos pueden prepararse de una variedad de formas, cuyos ejemplos se describen a continuación, que incluyen la inmunización con un antígeno de interés de un ratón genéticamente modificado para expresar anticuerpos derivados de genes que codifican cadenas pesadas y/o ligeras humanas. La cadena pesada de un anticuerpo humano se modifica en el dominio CH3 para reducir la capacidad de dimerización de la cadena pesada.

Un anticuerpo humanizado tiene una secuencia que difiere de la secuencia de un anticuerpo derivado de una especie no humana en una o más sustituciones, eliminaciones y/o adiciones de aminoácidos, de modo que es menos probable que el anticuerpo humanizado induzca una respuesta inmune y/o induzca una respuesta inmune menos grave, en comparación con el anticuerpo de especies no humanas, cuando se administra a un sujeto humano. Determinados aminoácidos de los dominios marco conservados y dominios constantes de las cadenas pesada y/o ligera del anticuerpo de la especie no humana pueden mutarse para producir el anticuerpo humanizado. El/los dominio/s constante/s de un anticuerpo humano pueden fusionarse al/ a los dominio/s variable/s de una especie no humana. Los ejemplos de cómo fabricar anticuerpos humanizados se pueden encontrar en las patentes de EE.UU. n.° 6.054.297, 5.886.152 y 5.877.293.

La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo, y una o más regiones de uno o más anticuerpos diferentes. En un ejemplo de un anticuerpo quimérico, una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a, homóloga a o derivada de un anticuerpo de una determinada especie, o perteneciente a una determinada clase o subclase de anticuerpo, mientras que el resto de la/s cadena/s es idéntico a, homólogo a o se deriva de uno o varios anticuerpos de otra especie, o perteneciente a otra clase o subclase de anticuerpos. También se incluyen fragmentos de dichos anticuerpos que presentan la actividad biológica deseada.

Los expertos en la materia pueden preparar fácilmente fragmentos o análogos de anticuerpos siguiendo las enseñanzas de la presente memoria descriptiva y usando técnicas bien conocidas en la materia. Los extremos amino y carboxi preferidos de los fragmentos o análogos se producen cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse mediante la comparación de los datos de la secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos con las bases de datos de secuencias públicas o patentadas. Se pueden usar métodos de comparación informatizados para identificar motivos de secuencia o dominios de configuración de proteínas predichos que se produzcan en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Se conocen métodos para identificar secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Véase, por ejemplo, Bowie et al., 1991, Science 253:164.

Un "anticuerpo injertado con CDR" es un anticuerpo que comprende una o más CDR derivadas de un anticuerpo de una especie o isotipo en particular y el marco de otro anticuerpo de la misma o diferente especie o isotipo.

El "porcentaje de identidad" de dos secuencias de polinucleótidos o de dos secuencias de polipéptidos se determina comparando las secuencias usando el programa informático GAP (una parte del paquete GCG Wisconsin, versión 10.3 (Accelrys, San Diego, CA)) usando sus parámetros por defecto.

Los términos "polinucleótido", "oligonucleótido" y "ácido nucleico" se usan indistintamente e incluyen moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico), moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm), análogos del ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos y análogos de nucleótidos no naturales) e híbridos de los mismos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria. Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden comprender un marco de lectura abierto contiguo que codifique un anticuerpo o una fusión de Fc, y un derivado, muteína o variante de los mismos.

Dos polinucleótidos monocatenarios son "el complemento" entre sí si sus secuencias pueden alinearse en una orientación antiparalela de modo que cada nucleótido de un polinucleótido sea opuesto a su nucleótido complementario del otro polinucleótido, sin la introducción de espacios, y sin nucleótidos no emparejados en el extremo 5' o en el extremo 3' de cualquiera de las secuencias. Un polinucleótido es "complementario" a otro polinucleótido si los dos polinucleótidos pueden hibridarse entre sí en condiciones moderadamente rigurosas. Por lo tanto, un polinucleótido puede ser complementario a otro polinucleótido sin ser su complemento.

Un "vector" es un ácido nucleico que puede usarse para introducir otro ácido nucleico unido al mismo en una célula. Un "plásmido" es un tipo de vector, que se refiere a una molécula de ADN bicatenaria lineal o circular en la que se pueden ligar segmentos de ácido nucleico adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico (por ejemplo, retrovirus defectuosos para la replicación, adenovirus y virus adenoasociados), en el que se pueden introducir segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Determinados vectores son capaces de replicarse de manera autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que comprenden un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamífero) se integran en el genoma de una célula hospedadora tras su introducción en la célula hospedadora y, de este modo, se replican junto con el genoma del hospedador. Un "vector de expresión" es un tipo de vector que puede dirigir la expresión de un polinucleótido seleccionado.

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Una secuencia de nucleótidos está "operativamente unida" a una secuencia reguladora si la secuencia reguladora afecta a la expresión (por ejemplo, al nivel, al tiempo o a la ubicación de la expresión) de la secuencia de nucleótidos. Una "secuencia reguladora" es un ácido nucleico que afecta a la expresión (por ejemplo, al nivel, al tiempo o a la ubicación de la expresión) de un ácido nucleico al que está operativamente unido. La secuencia reguladora puede, por ejemplo, ejercer sus efectos directamente sobre el ácido nucleico regulado, o mediante la acción de una o más moléculas diferentes (por ejemplo, polipéptidos que se unen a la secuencia reguladora y/o al ácido nucleico). Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Se describen ejemplos adicionales de secuencias reguladoras en, por ejemplo, Goeddel, 1990, GeneExpression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA y Baron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06.

Una "célula hospedadora" es una célula que puede usarse para expresar un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico de la invención. Una célula hospedadora puede ser procariota, por ejemplo, E. coli, o puede ser eucariota, por ejemplo, eucariota unicelular (por ejemplo, una levadura u otro hongo), una célula vegetal (por ejemplo, una célula vegetal de tabaco o de tomate), una célula animal (por ejemplo, una célula humana, una célula de mono, una célula de hámster, una célula de rata, una célula de ratón o una célula de insecto) o un hibridoma. Las células hospedadoras ilustrativas incluyen estirpes celulares de ovario de hámster chino (CHO) o sus derivados que incluyen la cepa DXB-11 de cHo, que es deficiente en DHFR (véase Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 77:4216-20), estirpes celulares CHO que crecen en medios libres de suero (véase Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31), células CS-9, un derivado de células CHO DXB-11 y células AM-1/D (descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.210.924). Otras estirpes de células CHO incluyen CHO-K1 (ATCC n.° CCL-61), EM9 (ATCC n.° CRL-1861) y UV20(ATCC n.° CRL-1862). Los ejemplos de otras células hospedadoras incluyen la estirpe COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (véase Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células HeLa, estirpes celulares BHK (ATCC CRL 10), la estirpe celular CV1/EBNA derivada de la estirpe celular de riñón de mono verde africano CV1 (ATCC CCL 70) (véase McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821), células de riñón embrionario humano tales como 293, 293 EBNA o MSR 293, células epidérmicas A431 humanas, células Colo205 humanas, otras estirpes celulares de primate transformadas, células diploides normales, cepas celulares derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, HL-60, U937, células HaK o Jurkat. Por lo general, una célula hospedadora es una célula cultivada que puede transformarse o transfectarse con un ácido nucleico que codifica un polipéptido, que luego puede expresarse en la célula hospedadora.

La expresión "célula hospedadora recombinante" puede usarse para indicar una célula hospedadora que se ha transformado o transfectado con un ácido nucleico que se va a expresar. Una célula hospedadora también puede ser una célula que comprende el ácido nucleico, pero que no lo expresa a un nivel deseado a menos que se introduzca una secuencia reguladora en la célula hospedadora de manera que se una operativamente al ácido nucleico. Se entiende que la expresión célula hospedadora no solo se refiere a la célula objeto en particular, sino a la progenie o a la posible progenie de dicha célula. Debido a que se pueden producir ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a, por ejemplo, mutación o influencia ambiental, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula parental, pero aun así se incluyen dentro del alcance de la expresión como se usa en el presente documento.

Composiciones farmacéuticas

Los polipéptidos de la invención son particularmente útiles para la formulación en composiciones farmacéuticas. Dichas composiciones comprenden uno o más componentes adicionales tales como un vehículo, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable. Opcionalmente, la composición comprende además uno o más agentes fisiológicamente activos, por ejemplo, como se describe más adelante. la composición comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis agentes fisiológicamente activos además de uno o más anticuerpos monoméricos y/o proteínas de fusión Fc de la presente invención.

La composición farmacéutica puede comprender un anticuerpo monomérico y/o una proteína de fusión Fc de la invención junto con una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste en un tampón, un antioxidante tal como ácido ascórbico, un polipéptido de bajo peso molecular (tal como aquellos que tienen menos de 10 aminoácidos), una proteína, un aminoácido, un hidrato de carbono tal como glucosa, sacarosa o dextrinas, un agente quelante tal como EDTA, glutatión, un estabilizador y un excipiente. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con albúmina de suero coespecífica son ejemplos de diluyentes apropiados. De acuerdo con los estándares apropiados de la industria, también se pueden añadir conservantes tales como el alcohol bencílico. La composición se puede formular como un liofilizado usando soluciones de excipientes apropiadas (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes. Los componentes adecuados no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas. Otros ejemplos de componentes que pueden emplearse en formulaciones farmacéuticas se presentan en “Remington's Pharmaceutical Sciences”, 16a edición. (1980) y 20a Ed. (2000), Mack Publishing Company, Easton, PA.

Se proporcionan kits para su uso por parte de médicos que incluyen uno o más anticuerpos monoméricos y/o proteínas de fusión Fc de la invención y una etiqueta u otras instrucciones para su uso en el tratamiento de

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cualquiera de las afecciones analizadas en el presente documento. El kit puede incluir un preparado estéril de uno o más anticuerpos monoméricos y/o una proteína de fusión Fc, que puede estar en forma de una composición como se ha desvelado anteriormente, y puede estar en uno o más viales.

Las dosis y la frecuencia de administración pueden variar de acuerdo con factores tales como la vía de administración, el anticuerpo monomérico y/o la proteína de fusión Fc empleados en particular, la naturaleza y la gravedad de la enfermedad que se vaya a tratar, si la afección es aguda o crónica, y el tamaño y el estado general del sujeto. Las dosis apropiadas se pueden determinar mediante procedimientos conocidos en la técnica pertinente, por ejemplo, en ensayos clínicos que pueden implicar estudios de aumento de la dosis.

Se puede administrar un anticuerpo monomérico y/o una proteína de fusión Fc de la invención, por ejemplo, una vez o más de una vez, por ejemplo, a intervalos regulares durante un período de tiempo. Un anticuerpo monomérico y/o una proteína de fusión Fc se pueden administrar durante un período de al menos una vez al mes o más, por ejemplo, durante uno, dos o tres meses, o incluso indefinidamente. Para tratar afecciones crónicas, en general, es más eficaz el tratamiento a largo plazo.

Sin embargo, para tratar afecciones agudas, la administración durante períodos más cortos, por ejemplo, de una a seis semanas, puede ser suficiente. En general, el anticuerpo monomérico y/o la proteína de fusión Fc se administran hasta que el paciente manifieste un grado de mejora médicamente relevante con respecto al momento inicial para el indicador o los indicadores escogidos.

Como se entiende en el campo pertinente, las composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo monomérico y/o la proteína de fusión Fc de la invención se administran a un sujeto de una manera apropiada para la indicación. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar mediante cualquier técnica adecuada, incluyendo, pero sin limitación, por vía parenteral, vía tópica o por inhalación. Si se inyectan, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar, por ejemplo, por vía intraarticular, intravenosa, intramuscular, intralesional, intraperitoneal o subcutánea, mediante inyección de bolo o infusión continua. Se contempla la administración localizada, por ejemplo, en un sitio de enfermedad o lesión, como la administración transdérmica y la liberación sostenida desde implantes. La administración por inhalación incluye, por ejemplo, la inhalación nasal u oral, el uso de un nebulizador, la inhalación del anticuerpo monomérico y/o la proteína de fusión Fc en forma de aerosol y similares.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1

Los restos implicados en la interacción del dominio CH3-CH3 se identificaron usando un criterio de límite de distancia. Había veinticuatro restos ubicados en la superficie de contacto del dominio CH3 (Tabla 1). Se examinaron estos veinticuatro restos para determinar la conservación estructural de la cadena lateral usando las estructuras cristalinas de anticuerpos Fc conocidos disponibles (Figura 3). El análisis reveló una alta conservación estructural para algunos de los restos hidrófobos. También se calculó la energía de asociación libre entre los dos dominios CH3 usando un método informatizado (Pokala y Handel 2005) mutando las 24 posiciones de la superficie de contacto y L398 (un resto en contacto con el resto de superficie de contacto K392) con Alanina, un resto cada la vez. El cálculo y el análisis de conservación estructural revelaron que 6 de los 24 restos contribuyeron significativamente a la formación del dímero del dominio CH3. Estas 6 posiciones se analizaron para determinar el efecto de la sustitución.

Tabla 1: Lista de restos de la superficie de contacto del dominio CH3 de la primera cadena (A) y sus restos en ________________________contacto con la cadena lateral de la segunda cadena (B)a________________________

Restos de la superf. de contacto de la cadena A: Restos en contacto con la cadena lateral de la cadena B

GLN A 347: LYS B 360'

TYR A 349: SER B 354' ASP B 356' GLU B 357' LYS B 360'

THR A 350: SER B 354' ARG B 355'

LEU A 351: LEU B 35 1 ' PRO B 352' PRO B 353' SER B 354' THR B 366

SERA 354: TYR B 349' THR B 350' LEU B 351'

ARG A 355: THR B 350'

ASP A 356: TYR B 349' LYS B 439'

GLUA 357: TYR B 349' LYS B 370'

LYS A 360: GLN B 347' TYR B 349'

SER A 364: LEU B 368' LYS B 370'

THR A 366: LEU B 351' TYR B 407'

LEU A 368: SER B 364' LYS B 409'

LYS A 370: GLU B 357' SER B 364'

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Restos de la superf. de contacto de la cadena A

Restos en contacto con la cadena lateral de la cadena B

ASN A 390: SER B 400

LYS A 392: LEU B 398'

THR A 394: THR B 394

PRO A 395: VAL B 397'

VAL A 397: THR B 393

ASP A 399: LYS B 392'

SER A 400: ASN B 390’

PHE A 405: LYS B 392'

TYR A 407: THR B 366

LYS A 409: LEU B 368'

LYS A 439: ASP B 356'

ASP B 399' SER B 400' PHE B 405'

VAL B 397' PHE B 405' TYR B 407'

THR B 394' PRO B 395'

LYS B 409'

LYS B 392'

THR B 394' LYS B 409'

THR B 394' TYR B 407' SER B 408' LYS B 409' ASP B 399' PHE B 405' TYR B 407'

aDebido a la doble simetría presente en la interacción del dominio CH3-CH3, cada interacción por pares se representa dos veces en la estructura (por ejemplo, Ser A 364 - Leu B 368' y Leu A 439 - Ser B 364'). Sin embargo, los pares Leu A 351 - Pro B 352', Leu A 351 - Pro B 353', Lys A 392 - Leu B 398', Val A 397 - Thr B 393' y Tyr A 407 - Ser B 408' implican contactos de la cadena lateral y la cadena principal, por lo que están representados una sola vez.

Se generaron proteínas mutantes Fc correspondientes a la sustitución de treonina en cada una de las 6 posiciones (Tabla 2). Además, también se generaron mutantes Fc F405T Y407R y Y407R. Para aumentar la probabilidad de formación de Fc monomérico completo, se generaron mutaciones en las 6 posiciones en el fondo de una variante Fc de debilitamiento de CH3/CH3, en la que la Lisina 392 y la Lisina 409 están mutadas en ácido aspártico ( Fc K392D K409D).

Tabla 2

construcción: mutaciones en huIgG1Fc PM según SEC ABC

1: K392D-K409D 59.000 Dímero/Monómero

2: K392DK409D-Y349T 36.600 Monómero

3: K392DK409D-L351T 38.000 ND

4: K392DK409D-L368T 33.600 ND

5: K392DK409D-L398T 57.800 ND

6: K392DK409DF405T 38.800 Dímero/Monómero

7: K392DK409D-Y407T 48.200; 41.100 ND

8: K392DK409D-F405T-Y407R 57.800; 41.200 ND

9: K392DK409D-Y407R 65.400 ND

ND; no determinado.

Las mutaciones enumeradas en la Tabla 2 (n.° 2 a n.° 9) en Fc de IgG1 humana K392D K409D se generaron usando la mutagénesis dirigida Multi-QuikChange (Strategene). Los cebadores Oligo usados son los siguientes:

n.° 2: 5'-gaaccacaggtgactaccctgcccccatc (SEQ ID NO: 10)

n.° 3: 5'-caggtgtacaccactcccccatcccggg (SEQ ID NO: 11)

n.° 4: 5'-cagcctgacctgcactgtcaaaggcttctatc (SEQ ID NO: 12)

n.° 5: 5'-cacgcctcccgtgactgactccgacggctc (SEQ ID NO: 13)

n.° 6: 5'-gacggctccttcactctctatagcgac (SEQ ID NO: 14)

n.° 7: 5'-ctccttcttcctcactagcgacctcacc (SEQ ID NO: 15)

n.° 8: 5'-gacggctccttcactctccgaagcgacctcacc (SEQ ID NO: 16)

n.° 9: 5'-ctccttcttcctccgaagcgacctcacc (SEQ ID NO: 17)

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Las mutaciones esperadas se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Las proteínas Fc precursoras (hu IgG1 Fc K409D K392D) y las mutantes se expresaron en células 293E usando un vector de expresión transitoria de mamífero pTT5. Las proteínas Fc se purificaron usando cromatografía de proteína A convencional (columna de 5 ml, Pierce). El análisis de homogeneidad de proteínas Fc (SEC) se realizó usando una columna TOSO46mm SW3000 (TOSO Biosciences LLC, PA). Las concentraciones de proteína se determinaron midiendo la absorción a 280 nm y el cálculo usando 1 mg/ml = DO280 de 1,74.

En cada caso de muestra, se tratan 5 ug de proteína con tampón de muestra de SDS no reductor o de SDS reductor (Invitrogen), se procesaron en gel TG al 4-20 % (Invitrogen) y se tiñeron con reactivo de código de gel (Pirece).

Análisis BIAcore de la unión de FcRn humano y de ratón al Fc mutante n.° 1 (Fc K392D- K409D, dímero), n.° 2 (Fc K392D-K409D-Y349T, perfil de SEC monomérico) y n.° 6 (Fc K392D-K409D-Y349T, perfil de SEC monomérico) usando un instrumento BIAcore3000. Se inmovilizó el huFc producido en células CHO en la célula 2 siguiente (Fc2) en un chip CM5. Fc1 se usó como control de fondo. Se incubaron 2 nM de FcRn humano con 1, 10, 100 nM de las variantes de Fc indicadas durante una hora antes de inyectarse en la superficie de huFc de CHO. La reducción de la unión de FcRn a huFc inmovilizado en CHO indica la unión de FcRn a las variantes de Fc en solución. Se incubaron 2 nM de FcRn de ratón con 0,1, 1, 10 nM de variantes de Fc durante una hora antes de inyectarse en la superficie de huFc de CHO.

Las concentraciones de proteína para Fc mutante fueron de 0,4 y 0,6 mg/ml, respectivamente. Las muestras en PBS se analizaron mediante un instrumento ProteomeLab XL-1 de Beckmann Coulter. Los experimentos de velocidad de sedimentación se realizaron a 50.000 rpm, seguidos de la absorbancia a 280 nm en ensambles de celdas centrales de sector doble con ventanas de cuarzo. Las exploraciones se recogieron a 20 °C sin demora entre las mismas. Los datos de AUC-SV se analizaron usando SEDFIT versión 9.4. En el análisis de AUC-SV, la ración de fricción, el ruido invariante en el tiempo y los valores del menisco se dejaron flotar durante el ajuste no lineal de mínimos cuadrados.

EJEMPLO 2

Este ejemplo demuestra los parámetros farmacocinéticos de las construcciones de monómero Fc de diversos pesos moleculares en ratones normales. El Fc monomérico comprendía las mutaciones K392D-K409D-Y349T. El Fc monomérico N297A comprendía el Fc monomérico que tenía una mutación adicional en N297 para eliminar un sitio de glicosilación. La semi-IgG comprendía un Fab fusionado al Fc monomérico. Fab FnFn comprendía el Fab fusionado a un dímero de fibronectina. Fab His era el Fab fusionado a un marcador de histidina. huFc WT deltaH comprendía un dímero de Fc de tipo silvestre menos la región bisagra. Se asignaron cincuenta y cuatro ratones SCID a los siguientes grupos de tratamiento. Todos los ratones recibieron una dosis de 10 mg/kg IV, y se recogió el suero a las 0,25; 2, 4, 8, 20 y 32 horas.

Tabla 3

Grupo: Subgrupo Ratón Compuesto Rou Dosis Recogida de suero

1: A 1-3 Fc monomérico IV 10 mg/kg 0,25 h, 8 h

: B 4-6 2 h, 20 h

: C 7-9 4 h, 32 h

2: A 10-12 huFc WT deltaH IV 10 mg/kg 0,25 h, 8 h

: B 13-14 2 h, 20 h

: C 16-18 4 h, 32 h

3: A 19-21 semi-IgG IV 10 mg/kg 0,25 h, 8 h

: B 22-24 2 h, 20 h

: C 25-27 4 h, 32 h

4: A 28-30 Fab FnFn IV 10 mg/kg 0,25 h, 8 h

: B 31-33 2 h, 20 h

: C 34-36 4 h, 32 h

5: A 37-39 Fab-His IV 10 mg/kg 0,25 h, 8 h

: B 40-42 2 h, 20 h

: C 43-45 4 h, 32 h

6: A 46-48 Fc monomérico N297A IV 10 mg/kg 0,25 h, 8 h

: B 49-51 2 h, 20 h

: C 52-54 4 h, 32 h

Resumen del método analítico:

Para la cuantificación de las construcciones de Fc monomérico, se recubrió una placa de microtitulación (Maxisorp, Nunc) bien con Fcy anti-IgG humana de cabra específico (Cat. de Jackson n.° 109-005-098) de los Grupos 1, 2 y 6 o 5 F(ab')2 anti-IgG humana de cabra específico (Cat. de Jackson n.° 109-005-097) de los Grupos 3, 4 y 5. Tras el

bloqueo con NFDM al 10 % (leche desnatada en polvo) en PBST, se incubaron patrones, muestras de control de calidad (QC) y muestras de ensayo tras un tratamiento previo a un factor de dilución de 50 en NFDM/PBST. Las construcciones no unidas se eliminaron mediante lavado con tampón PBST. A continuación, se añadió Fcy anti-IgG humana de cabra marcado con peroxidasa de rábano picante (Cat. de Jackson n.° 109-035-098) para detectar las 10 construcciones de Fc capturadas en los Grupos 1, 2 y 6, mientras que se usó F(ab')2 anti-IgG humana de cabra (Jackson Cat n.° 109-036-097) específico para detectar las construcciones de F(ab')2 capturadas en los Grupos 3, 4 y 5. Después de una etapa de lavado final, se añadió solución de sustrato de TMB (tetrametilbencidina y peróxido 1: 1, Kirkegaard & Perry Laboratories) y se inactivó con ácido fosfórico. Las densidades ópticas (DO) se determinaron a una longitud de onda de 450 - 650 nm. La conversión de los valores de DO en concentraciones para las muestras de 15 QC y las muestras desconocidas se logró a través de la comparación mediada por el software de Watson con una curva patrón analizada concurrentemente, que se sometió a regresión de acuerdo con un modelo logístico de cuatro parámetros.

Tabla 4 - Datos para muestras de suero

GRUPO: TRATAMIENTO HORAS Subgrupo A ng/ml Subgrupo B ng/ml Subgrupo C ng/ml

1: MONFC 0,25 15.200 24.300 20.300

1: MONFC 2 2.170 2.630 1.880

1: MONFC 4 1.160 862 748

1: MONFC 8 282 360 382

1: MONFC 20 131 142 121

1: MONFC 32 98,6 89,2 82,1

2: HUFCWT 0,25 126.000 243.000 71.200

2: HUFCWT 2 60.000 54.100 63.900

2: HUFCWT 4 44.700 67.200 43.900

2: HUFCWT 8 30.500 34.300 24.400

2: HUFCWT 20 25.600 25.200 19.900

2: HUFCWT 32 18.600 18.900 15.900

3: SEMI-IgG 0,25 89.200 103.000 98.400

3: SEMI-IgG 2 42.600 39.200 41.400

3: SEMI-IgG 4 24.900 28.200 21.900

3: SEMI-IgG 8 11.400 9.880 11.500

3: SEMI-IgG 20 2.290 1.930 2.090

3: SEMI-IgG 32 1.070 1.060 1.270

4: FNFN 0,25 95.400 89.900 101.000

4: FNFN 2 7.300 5.460 9.600

4: FNFN 4 3.060 3.490 3.440

4: FNFN 8 1.010 1.010 1.070

4: FNFN 20 172 171 181

4: FNFN 32 43,6 50,3 54,6

5: FAB-HIS 0,25 55.300 70.000 87.900

5: FAB-HIS 2 3.190 3.240 3.250

5: FAB-HIS 4 1.380 1.480 1.520

5: FAB-HIS 8 502 575 604

5: FAB-HIS 20 72,5 71,1 82,6

5: FAB-HIS 32 0 0 0

6: N297A 0,25 51.200 52.800 59.400

6: N297A 2 784 1.010 911

6: N297A 4 368 392 397

6: N297A 8 213 250 222

6: N297A 20 118 105 104

6: N297A 32 78,5 77,4 64,3

AQL > 125.000 ng/ml BQL < 50 ng/ml

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Tabla 5

: Fc monomérico huFc WT delta H semi-IgG Dímero de FabFn Fab-His Fc monomérico N297A

ABC (ug*h/ml): 25,9 983 342 97,4 58,4 35,1

T 1/2. (h): 9 21 6,3 4,8 3,8 12,1

CL (ml/min/kg): 6,16 0,109 0,473 1,71 2,83 4,58

Peso molecular (aprox.): 25 kDa 50 kDa 70 kDa 70 kDa 50 kDa 25 kDa

Este ejemplo demuestra los parámetros farmacocinéticos de ratón normales, es decir, el alcance de las interacciones de FcRn, de las construcciones de Fc monomérico de diversos pesos moleculares por encima o por debajo del umbral de eliminación del riñón de ~60 kDa. La construcción huFC WT delta H que consiste en un dominio de dímero CH2-CH3 demostró la mayor exposición/ABC en comparación con todas las otras construcciones a pesar de su peso molecular por debajo del umbral de aclaramiento. La molécula de semi-IgG, que consiste en un Fc monomérico de Fab, demostró un 35 % de la exposición del dímero Fc, pero resultó tener una ABC 3,5 veces superior en comparación con el dímero Fab Fn del mismo tamaño, que consiste en un dímero de Fab-fibronectina, un resultado que demostró el papel de Fc en el aumento de la semivida y, en última instancia, de la exposición. Las construcciones de Fab solo y de Fc monomérico, ya sea la variante WT o N297A que carece de glicosilación debido a la eliminación del sitio de adición enlazado a N, todas demostraron la eliminación rápida y valores de ABC mínimos de 17 a 38 veces inferiores a los de la construcción huFC WT delta H.

Referencias

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Claims

5

10

15

20

25

30

35

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido Fc monomérico que comprende un dominio CH2 y CH3, en el que dicho dominio CH3 es un dominio CH3 de IgG y comprende:

(a) dos o más aminoácidos cargados que son electrostáticamente desfavorables para la formación de homodímeros de CH3, en el que los aminoácidos cargados son K392D y K409D; y

(b) una sustitución de aminoácido de uno o más restos de la superficie de contacto hidrófoba con un resto de aminoácido polar, en el que la sustitución del resto de la superficie de contacto hidrófoba se selecciona del grupo que consiste en Y349T, L351T, L368T y F405T.
2. El polipéptido Fc monomérico de la reivindicación 1, comprendiendo dicho polipéptido un dominio variable de anticuerpo.
3. El polipéptido Fc monomérico de la reivindicación 2, comprendiendo dicho polipéptido un dominio CH1.
4. El polipéptido Fc monomérico de la reivindicación 3, comprendiendo dicho polipéptido una cadena pesada de anticuerpo.
5. Un anticuerpo monomérico que comprende el polipéptido Fc monomérico de la reivindicación 4 y una cadena ligera de anticuerpo.
6. Un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido Fc monomérico de la reivindicación 1.
7. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido Fc monomérico de la reivindicación 1.
8. Una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido Fc monomérico de la reivindicación 1.
9. Un método de preparación de un polipéptido Fc monomérico, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido Fc monomérico de la reivindicación 1 en condiciones en las que se expresa dicho polipéptido Fc monomérico; y

(b) recuperar el polipéptido Fc monomérico del cultivo de célula hospedadora.