ES2683352T3 - Partículas de HPV y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

1.Una composición para el uso en el aporte de uno o más compuestos heterólogos a un sujeto, comprendiendo la composición una nanopartícula que comprende uno o más compuestos heterólogos y una proteína L1 de papilomavirus humano (HPV) modificada que tiene una inmunogenicidad reducida con relación a HPV16 silvestre, en donde la secuencia de aminoácidos de la proteína L1 de HPV modificada corresponde a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 que comprende las sustituciones de aminoácidos D273T, N285T y S288N.

Description

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DESCRIPCION

Particulas de HPV y usos de las mismas Campo de la invencion

La invencion se refiere a particulas similares a papilomavirus (VLPs) humanas y su uso como agentes terapeuticos. Antecedentes de la invencion

El cancer de cuello uterino es una de las principales causas de muerte por cancer en las mujeres en todo el mundo, matando a mas de 233.000 mujeres al ano. El cancer de cuello uterino fue la enfermedad maligna mas comun tanto en incidencia como en mortalidad entre las mujeres antes del siglo 20. La reduccion en la incidencia del cancer de cuello uterino es uno de los principales logros de salud publica en las naciones desarrolladas, principalmente debido a la puesta en practica de programas de cribado, deteccion y tratamiento basados en la poblacion para la enfermedad preinvasiva. Sin embargo, aunque la incidencia del cancer de cuello uterino en las naciones desarrolladas ha caido, la enfermedad continua siendo el segundo cancer mas comun en las mujeres en todo el mundo.

Los frotis de Papanicolaou (Pap) pueden detectar el cancer de cuello uterino o cambios precancerosos en el cuello uterino, muchos de los cuales estan relacionados con el HPV. Estos frotis de Pap han reducido mucho la incidencia y la mortalidad del cancer de cuello uterino en los paises desarrollados en los que se presentan procedimientos de cribado amplios. En los paises desarrollados en los que los procedimientos de cribado todavia son limitados, el cancer de cuello uterino es el cancer mas frecuentemente presentado en las mujeres, y la incidencia continua aumentando.

Todos los tratamientos actuales para las anormalidades intraepiteliales del cuello uterino, incluyendo crioterapia, ablacion laser, conizacion escisional y el procedimiento de escision electroquirurgica con asa (LEEP), son procedimientos quirurgicos invasivos que conducen a menudo a efectos secundarios significativos incluyendo descarga excesiva, infeccion, hemorragia, calambres e incompetencia del cuello uterino, que pueden conducir a aborto espontaneo, perdida de la integridad del cuello uterino e incapacidad para el embarazo. Ademas, estos procedimientos se deben realizar en un centro ambulatorio, incrementando el coste del tratamiento.

La neoplasia intraepitelial de cuello uterino (CIN) se refiere a un intermedio patologico preinvasivo para el cancer de cuello uterino. Las anormalidades observadas en un frotis citologico o una biopsia tisular del cuello uterino representan alteraciones en el grado de diferenciacion de celulas epiteliales del cuello uterino. Esta displasia celular se clasifica en tres grupos diferentes de gravedad: CIN I se refiere a displasia leve confinada al tercio basal del epitelio; CIN II se refiere a lesiones confinadas a los dos tercios basales del epitelio; y CIN III se refiere a displasia celular que abarca mas de dos tercios del espesor epitelial.

Aproximadamente 3,5 millones de mujeres en los Estados Unidos tendran pruebas de frotis de Pap anormales cada ano. Aproximadamente 1,2 millones de estas mujeres tienen una lesion intraepitelial escamosa (SIL) de las que de 200.000 a 300.000 se clasifican como de alto grado. La incidencia de CIN de alto grado en Latinoamerica es mas de 3 veces la observada en los EE. UU. La Tabla 1 proporciona un sumario de la prevalencia de infecciones por HPV y CIN en todo el mundo.

Tabla 1: Prevalencia mundial de HPV y CIN

Incidencia HPV de Alto Riesgo Incidencia CIN 2/3

EE. UU.

1.750.000 250.000

Europa

1.839.200 275.880

Latinoamerica

5.884.110 882.616

Japon

1.173.480 176.022

La infeccion por HPV es endemica entre los individuos sexualmente activos. Las mujeres que tienen multiples parejas sexuales tienen una probabilidad superior de adquirir HPV y, por consiguiente, una infeccion del cuello uterino relacionada con HPV. La infeccion con tipos de HPV de alto riesgo incrementa las posibilidades de que una mujer desarrolle cancer de cuello uterino. El cribado y el tratamiento posterior de afecciones precancerosas del cuello uterino es altamente eficaz en la prevencion del cancer de cuello uterino en mujeres infectadas con HPV. Sin embargo, los tratamientos actuales requieren a menudo una intervencion quirurgica y se necesitan opciones

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terapeuticas alternativas. El documento US 2004/146531 A1 se refiere a particulas similares a virus carentes de epitopos de anticuerpo especificos para el tipo HPV 16 como portadores de peptidos para la introduccion en celulas.

Sumario de la invencion

La presente invencion divulga composiciones para el uso segun las reivindicaciones. Aspectos de la invencion se refieren a particulas basadas en HPV y usos de las mismas para tratar enfermedades y/o aportar agentes terapeuticos. En algunas realizaciones, las composiciones de la invencion son utiles para tratar afecciones mucosas (p. ej., enfermedades y/o infecciones del tejido mucoso, por ejemplo de celulas epiteliales mucosas). En algunas realizaciones, aspectos de la invencion se refieren a particulas basadas en HPV modificadas que pueden aportar un agente terapeutico a tejido mucoso (p. ej., topicamente). En algunas realizaciones, el agente terapeutico puede ser un agente antiviral. El agente antiviral se puede usar para tratar una infeccion viral por, por ejemplo, un papilomavirus humano, un herpesvirus, u otro virus que elija como diana el tejido mucoso. En algunas realizaciones, el agente terapeutico puede ser un agente anticanceroso. El agente anticanceroso se puede usar para tratar, por ejemplo, cancer de cuello uterino o cualquier otro cancer de un tejido mucoso. En algunas realizaciones, la invencion proporciona composiciones para el uso en el tratamiento de la infeccion por papilomavirus humano (HPV) y composiciones para el uso en el tratamiento de enfermedades asociadas con HPV que incluyen, pero no se limitan a, cancer de cuello uterino, en un sujeto. Sin embargo, se debe apreciar que las particulas virales modificadas de la invencion se pueden usar para aportar otros tipos de agentes terapeuticos y/o medicos (p. ej., agentes de diagnostico por imagen o de contraste).

En algunas realizaciones, las particulas de la invencion se pueden aportar topicamente (p. ej., en la formar de una crema, una espuma, una pulverizacion, un aerosol u otra formulacion adecuada para el aporte topico) a cualquier tejido mucoso (p. ej., a tejido mucoso del cuello uterino, nasal, oral u otro). Sin embargo, aspectos de la invencion no se limitan al aporte topico y las particulas modificadas se pueden aportar subcutaneamente, intravenosamente, parenteralmente y/o a traves de cualquier otra via de aporte adecuada.

Los metodos descritos en la presente comprenden administrar al sujeto uno o mas agentes terapeuticos aportados mediante un sistema de aporte de particulas similares a virus (VLP). En ciertas realizaciones, el sistema de aporte basado en VLP comprende particulas similares a papilomavirus humano (HPV). En algunas realizaciones, las nanoparticulas de HPV comprenden proteina L1 viral. En algunas realizaciones, las nanoparticulas de HPV comprenden proteina L1 viral y proteina L2 viral. En algunas realizaciones, las proteinas L1 y/o L2 pueden ser proteinas virales silvestres. En algunas realizaciones, las proteinas L1 y/o L2 se pueden alterar mediante mutacion y/o insercion/eliminacion. En ciertas realizaciones, los aminoacidos en los bucles expuestos superficialmente de la nanoparticula de HPV que comprenden L1 y/o L2 estan mutados, insertados y/o eliminados. En ciertas realizaciones, la mutacion, la eliminacion y/o la insercion de aminoacidos en los bucles expuestos superficialmente conduce a cambios en la inmunogenicidad de la nanoparticula de HPV. En ciertas realizaciones, la inmunogenicidad se puede alterar de tal como que las nanoparticulas de HPV de un cierto serotipo ya no sean reconocidas por anticuerpos producidos contra este serotipo. En estas realizaciones, la nanoparticula de HPV alterada es inmunosilenciosa en el hospedador que aloja los anticuerpos especificos para un serotipo.

Segun esto, en algunas realizaciones, las particulas basadas en HPV de la invencion se pueden modificar para tener una inmunogenicidad reducida o alterada. Estas particulas se pueden seleccionar para el aporte a pacientes que tienen una respuesta anti-HPV neutralizadora. En algunas realizaciones, una serie de particulas basadas en HPV que tienen diferentes serotipos se administran a un sujeto con propositos terapeuticos para reducir el efecto de una respuesta inmunitaria neutralizadora contra uno cualquiera de los serotipos. Por ejemplo, se puede usar un primer serotipo para un primer grupo (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 5-10 o mas) de administraciones a un sujeto. Posteriormente, se puede usar un segundo serotipo para un segundo grupo (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 5-10 o mas) de administraciones para reducir el impacto de una respuesta inmunitaria neutralizadora que el sujeto desarrolla contra el primer serotipo. Se debe apreciar que grupos adicionales de administracion pueden implicar un tercer, cuarto, quinto, etc. serotipo. Los diferentes serotipos pueden ser serotipos presentes en la naturaleza, serotipos quimericos, otros serotipos mutantes o cualquier combinacion de los mismos. Se debe apreciar que estar aplicaciones en serie o secuenciales se pueden usar para la administracion (p. ej., tratamiento) cronica de un compuesto particular (p. ej., el mismo en cada uno de los diferentes serotipos) o una serie de compuestos diferentes, a lo largo de un periodo de meses y/o anos.

En algunas realizaciones, la mutacion, la eliminacion y/o la insercion de aminoacidos se introducen en las proteinas de la capside viral L1 y/o L2 de tal modo que la nanoparticula de HPV resultante no pierda la capacidad de aportar agentes terapeuticos a la celula diana. En algunas realizaciones, la nanoparticula de HPV no pierde la capacidad de transferir acidos nucleicos (p. ej., ARNsi o ARNsh) en celulas diana.

En algunas realizaciones, la inmunogenicidad se puede alterar de tal modo que las nanoparticulas de HPV de un cierto serotipo inducen una respuesta inmunitaria que produce anticuerpos neutralizadores especificos cruzadamente. En estas realizaciones, la nanoparticula de HPV se altera de tal modo que exhiba multiples epitopos seroespecificos sobre su superficie (por ejemplo mediante la insercion de epitopos en bucles expuestos superficialmente) o que exhiba epitopos que estan mas conservados entre serotipos (por ejemplo mediante insercion

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de porciones de la proteina L2 en bucles expuestos superficialmente, o mediante la union de epitopos conservados a la superficie de la nanoparticula de HPV). En algunas realizaciones, la produccion de anticuerpos neutralizadores especificos cruzadamente se induce en un individuo infectado con HPV que ha sido sometido a tratamiento para eliminar o reducir el numero de celulas infectadas con HPV. En algunas realizaciones, el individuo infectado con HPV ha sido sometido a tratamiento para eliminar o reducir el tamano de un tumor asociado a HPV. En estas realizaciones, se puede inducir la produccion de anticuerpos neutralizadores especificos cruzadamente para generar una respuesta inmunitaria que sea suficiente para la inmunosupervision de las celulas infectadas con HPV que puedan permanecer despues del tratamiento. La inmunosupervision resultante, en algunas realizaciones, es suficiente para prevenir una nueva infeccion de HPV o la repoblacion de celulas infectadas por HPV o la recaida de tumores infectados por HPV. En algunas realizaciones, los anticuerpos neutralizadores especificos cruzadamente son eficaces contra uno o mas serotipos de HPV.

En ciertas realizaciones, los agentes terapeuticos aportados por el sistema de aporte basado en VLP son acidos nucleicos. Agentes terapeuticos que son acidos nucleicos pueden ser, por ejemplo, moleculas de ARNsi o ARNsh o plasmidos que las codifican. Otros agentes terapeuticos pueden ser, por ejemplo, moleculas pequenas, tales como moleculas pequenas con actividad antiviral o anticancerosa.

En ciertas realizaciones, la administracion a un sujeto que tiene una infeccion por HPV o un cancer asociado a HPV, tal como un cancer de cuello uterino, o una lesion, de uno o mas agentes terapeuticos aportados por un sistema de aporte basado en VLP conduce a la destruccion y/o la depuracion de celulas infectadas por HPV. Se cree que las celulas transformadas infectadas por HPV son causantes de canceres o lesiones asociados a HPV. En algunas realizaciones, la destruccion y/o la depuracion de las celulas infectadas con HPV conduce a la remision parcial o completa del cancer asociado a HPV.

En algunas realizaciones, los metodos de tratamiento descritos en la presente se pueden combinar con la administracion de otros agentes terapeuticos (p. ej., agentes anticancerosos y/o agentes antivirales) y/o inmunomoduladores y/o radioterapia o inmunoterapia bien antes, bien simultaneamente o bien despues del tratamiento con nanoparticulas de HPV que comprende agentes terapeuticos. En algunas realizaciones, los agentes anticancerosos y/o antivirales pueden ser aportados por las nanoparticulas de HPV. En algunas realizaciones, los agentes anticancerosos y/o antivirales se pueden administrar junto con las nanoparticulas de HPV o se pueden administrar separadamente, p. ej., en un momento diferente o en una zona de administracion diferente o a traves de una via de administracion diferente.

En algunas realizaciones, la mayoria de o todas las celulas infectadas con HPV en un sujeto tratado segun los metodos descritos en la presente son destruidas y depuradas y el HPV ya no es detectable en el sujeto infectado con HPV. En otras realizaciones, algunas celulas infectadas con HPV en un sujeto son destruidas o depuradas y el HPV todavia es detectable en el sujeto infectado con HPV. En algunas realizaciones, un sujeto que tiene una lesion o un cancer asociados a HPV puede experimentar una remision parcial o completa del cancer o la lesion. En algunas realizaciones, los sujetos no experimentan una recaida de la lesion o el cancer o la infeccion viral. En otras realizaciones, los sujetos experimentan una recaida de la lesion o el cancer o la infeccion viral. En algunas realizaciones, los metodos de tratamiento descritos en la presente se combinan ademas con un tratamiento antiviral durante y/o despues del tratamiento con nanoparticulas de HPV que comprenden agentes terapeuticos. El tratamiento antiviral se puede aportar para prevenir, por ejemplo, la replicacion de HPV, la propagacion viral y/o la repoblacion de celulas con HPV que hayan sobrevivido al tratamiento inicial o que hayan entrado en el cuerpo del sujeto como una nueva infeccion.

En otras realizaciones, las nanoparticulas de HPV alteradas se administran al final del regimen de tratamiento inicial. Las nanoparticulas de HPV se alteran de tal modo que exhiban multiples epitopos seroespecificos sobre su superficie o que exhiban epitopos que estan mas conservados entre serotipos. En algunas realizaciones, la administracion de estas nanoparticulas de HPV alteradas puede inducir una respuesta inmunitaria local dirigida contra los epitopos administrados, por ejemplo induciendo un incremento en anticuerpos neutralizadores especificos cruzadamente, que sea suficiente para una inmunosupervision capaz de detectar y destruir celulas recientemente infectadas con HPV. En algunas realizaciones, la prevencion de nueva infeccion y/o propagacion o repoblacion viral es suficiente inhibe la recaida del cancer o la lesion asociados a HPV.

Los metodos descritos en la presente comprenden la administracion de nanoparticulas de HPV que comprenden uno o mas agentes terapeuticos a traves de diferentes vias. En algunas realizaciones, las nanoparticulas de HPV se administran a traves de aplicacion topica. En algunas realizaciones, la administracion topica elige como diana membranas mucosas. Por ejemplo, la nanoparticula de HPV que comprende uno o mas agentes terapeuticos se puede aplicar topicamente a o adyacente a un epitelio tal como el epitelio del cuello uterino o topicamente a o adyacente a una lesion epitelial tal como carcinoma epitelial del cuello uterino o anal.

En ciertas realizaciones, se proporcionan nanoparticulas de HPV que comprenden proteinas de la capside viral alteradas, en donde las proteinas de la capside viral son alteradas por mutaciones de aminoacidos silvestres, inserciones de aminoacidos adicionales un/o eliminacion de aminoacidos silvestres, segun se describe en la presente. En ciertas realizaciones, las nanoparticulas de HPV alteradas son mas o menos inmunogenicas en un

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sujeto o tienen una inmunogenicidad alterada. En algunas realizaciones, las nanoparticulas de HPV alteradas mantienen la capacidad de aportar o transferir agentes terapeuticos a una celula diana.

Segun esto, aspectos de la invencion se refieren a composiciones para aportar uno o mas compuestos a un sujeto. En algunas realizaciones, se usa una particula similar a papilomavirus humano (HPV) modificada, en donde la particula comprende uno o mas compuestos heterologos empaquetados en una particula similar a HPV que comprende una proteina superficial que tiene inmunogenicidad alterada. Los compuestos heterologos no son moleculas de HPV (p. ej., un compuesto que no es un genoma de HPV, ni un acido nucleico de HPV y/o ni otra molecula de HPV). Estos compuestos pueden ser compuestos terapeuticos u otros compuestos medicos. En algunas realizaciones, el compuesto puede ser uno o mas de: un agente terapeutico o medico, un acido nucleico o una molecula pequena, o un agente de diagnostico por imagen o de contraste. En algunas realizaciones, el agente terapeutico es un ARNsi, un ARNsh, un acido nucleico antisentido o un acido nucleico que codifica un ARNsi, un ARNsh un acido nucleico antisentido. En algunas realizaciones, el ARNsi, el ARNsh o el acido nucleico antisentido elige como diana HPV-E6 y/o HPV-E7. En algunas realizaciones, la molecula pequena es un agente antiviral. En algunas realizaciones, la molecula pequena es un agente anticanceroso (p. ej., gemcitabina).

Se debe apreciar que las composiciones de la invencion se pueden proporcionar junto con uno o mas de otros agentes (p. ej., un agente antiviral, un agente anticanceroso, por ejemplo gemcitabina o cualquier combinacion de los mismos).

En algunas realizaciones de las composiciones de la invencion, la particula similar a HPV comprende una proteina L1 o una proteina L1 y una proteina L2. En algunas realizaciones de las composiciones de la invencion, la proteina superficial es una proteina L1 modificada con una secuencia del bucle FG modificada. En algunas realizaciones, la proteina L1 tiene una secuencia de un serotipo HPV16, HPV31, HPV33, HPV34, HPV35, HPV52, HPV58, HPV73 o HPV91, y en donde el bucle FG de la proteina L1 tiene uno o mas cambios de aminoacido que alteran la inmunogenicidad de la proteina en un sujeto humano. En algunas realizaciones, el uno o mas cambios de aminoacido estan en una o mas de las posiciones X1 - X17 de SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, el aminoacido en la posicion X16 no esta alterado. En algunas realizaciones, una o mas de las posiciones X1, X2, X3, X5, X6, X11 y X14 de SEQ ID NO: 11 estan modificadas. En algunas realizaciones, 2-3 de las posiciones X1, X2, X3, X5, X6, X11 y X14 de SEQ ID NO: 11 estan modificadas. En algunas realizaciones, 4-7 de las posiciones X1, X2, X3, X5, X6, X11 y X14 de SEQ ID NO: 11 estan modificadas. En algunas realizaciones, 3 de las posiciones X1, X2, X3, X5, X6, X11 y X14 de SEQ ID NO: 11 estan modificadas. En algunas realizaciones, las posiciones X6, X11 y X14 de SEQ ID NO: 11 estan modificadas. En algunas realizaciones, todas las posiciones X1, X2, X3, X5, X6, X11 y X14 de SEQ ID NO: 11 estan modificadas. En algunas realizaciones, la proteina L1 tiene una secuencia de un serotipo HPV16 con las posiciones X6, X11 y X14 de SEQ ID NO: 11 cambiadas por T, T y N, respectivamente, y teniendo el resto de las posiciones de SEQ ID NO: 11 un aminoacido caracteristico de un serotipo HPV16. En algunas realizaciones, la proteina L1 tiene una secuencia de un serotipo HPV16 con las posiciones X1, X2, X3, X5, X6, X11 y X14 cambiadas por F, S, T, S, T, T y N, respectivamente, y teniendo el resto de las posiciones de SEQ ID NO: 11 un aminoacido caracteristico de un serotipo HPV16.

Se apreciara que en algunas realizaciones, una particula similar a HPV se administra a un sujeto que no tiene una respuesta inmunitaria neutralizadora contra el serotipo de la proteina superficial, por ejemplo cuando el sujeto no se ha inmunizado contra el serotipo de la proteina superficial, o cuando el sujeto se ha infectado con un HPV que tiene el mismo serotipo que el serotipo de la proteina superficial en la particula similar a HPV. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria del sujeto se evalua antes de seleccionar una particula similar a HPV para la administracion.

En algunas realizaciones, una particula similar a HPV se administra a un tejido mucoso. El tejido mucoso puede estar en cualquier zona segun se describe en la presente (p. ej., del cuello uterino, urogenital, oral, etc.). Por otra parte, en algunas realizaciones, una particula similar a HPV se administra a una zona epidermica (p. ej., para tratar un cancer o una infeccion cutaneos o epidermicos).

Se apreciara que las composiciones de la invencion se pueden administrar topicamente y/o a traves de cualquier otra via adecuada (p. ej., a traves de inyeccion, aerosol, pulverizacion u otra forma de administracion).

Las composiciones de la invencion se pueden administrar a un tejido infectado con un virus, una bacteria y/u otros microbios o parasitos. En algunas realizaciones, una zona de infeccion puede estar infectada con varios organismos diferentes (p. ej., multiples virus y/u otros microbios, por ejemplo HPV y un herpesvirus, por ejemplo HSV). Segun esto, una composicion de la invencion puede incluir un compuesto que elige como diana ampliamente varios organismos diferentes, o varios compuestos diferentes que eligen cada uno como diana un organismo diferente, o una combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, la misma particula similar a HPV puede contener diferentes compuestos terapeuticos. En algunas realizaciones, una composicion o un regimen de tratamiento puede incluir dos o mas particulas similares a HPV diferentes que contienen cada una un compuesto que es dirigido a una infeccion particular.

Las composiciones de la invencion se pueden administrar a un sujeto para tratar un cancer (p. ej., en o cerca del lugar de la administracion). En algunas realizaciones, el cancer puede estar asociado con una infeccion (p. ej., una

infeccion con HPV o HSV). En algunas realizaciones, el cancer puede no estar asociado con una infeccion. Segun esto, aspectos de la invencion se pueden usar para tratar el cancer de piel (p. ej., cancer de piel no melanomico).

En algunas realizaciones, las composiciones de la invencion se pueden administrar a un sujeto que tiene una 5 deficiencia del sistema inmunitario para tratar una afeccion (p. ej., infeccion, cancer u otra afeccion) asociada con la deficiencia del sistema inmunitario. La deficiencia del sistema inmunitario puede estar provocada por una infeccion (p. ej., una infeccion por HIV, sida) u otra afeccion (p. ej., cancer).

En algunas realizaciones, una particula similar a HPV de la invencion se puede administrar junto con una 10 composicion que promueva una respuesta inmunitaria inespecifica (p. ej., en o cerca del lugar de la administracion). La respuesta inmunitaria inespecifica puede ser util para tratar la infeccion y/o un cancer u otra afeccion. En algunas realizaciones, puede ser beneficiosa una respuesta inmunitaria incrementada en respuesta a la administracion de varias particulas similares a HPV con diferentes serotipos. Segun esto, algunas composiciones de la invencion comprenden varios serotipos diferentes.

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En algunas realizaciones, se puede efectuar una administracion cronica de una composicion al administrar una primera particula similar a HPV que comprende un compuesto a un sujeto durante un primer periodo y administrar una segunda particula similar a HPV que comprende el compuesto al sujeto durante un segundo periodo, en donde las particulas similares a HPV primera y segunda tienen diferentes serotipos. Se pueden realizar administraciones 20 adicionales usando serotipos adicionales. En algunas realizaciones, los serotipos de las particulas similares a HPV primera y segunda son independientemente serotipos presentes en la naturaleza o alterados. En algunas realizaciones, el serotipo de la particula similar a HPV primera y/o segunda es un serotipo quimerico.

En algunas realizaciones, una composicion de la invencion puede implicar administrar una particula similar a HPV 25 que tiene un serotipo quimerico al incluir una secuencia de L2 fusionada a un bucle de L1. En algunas realizaciones, la secuencia de L2 esta ligada a la superficie de una particula de L1. En algunas realizaciones, la secuencia de L2 consiste en los residuos 13 a 88 de la proteina L2 HPV31.

Estos y otros aspectos de la invencion se describen con mas detalle en los siguientes ejemplos y la descripcion.

30 Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 representa la localizacion de ARNsis sobre genes E6 y E7 genes de HPV-16.

La Figura 2 representa un grafico de barras que muestra el papel de ZnCl2 en la produccion de pseudoviriones que codifican luciferasa. La expresion del gen de luciferasa se evaluo en celulas 293FT transfectadas con pseudoviriones reensamblados sin ZnCl2 y en celulas 293FT, TC1, C33 y CaSki transfectadas mediante 35 pseudoviriones generados en presencia de ZnCl2.

La Figura 3 representa A) una fotografia de ARNm transcrito inversamente extraido de celulas CaSki que se transfectaron con ARNsh de LacZ, E6-1, E6-2, E7-1 y E7-2. El ADNc se amplifico por PCR con cebadores especificos de los genes E6 y E7 y gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control. B) una fotografia de una transferencia Western de extractos celulares procedentes de celulas CaSki (simulacion) que se 40 transfectaban con ARNshs de LacZ, E6-2, E6-1, E7-2 y E7-1. Los extractos se analizaron usando anticuerpos para p53 y p-actina.

La Figura 4 muestra un grafico de barras que representa los efectos de ARNshs de E6 y E7 sobre el crecimiento de celulas C33 (columnas grises), CaSki (columnas negras) y TC1 (columnas blancas). Las celulas (C) se transfectaron con ARNshs de LacZ, E6-1, e6-2, E7-1 y E7-2.

45 La Figura 5 representa una fotografia que muestra la inhibicion del crecimiento de tumores TC1 en ratones C57 BL6. Las celulas de TC1 se transfectaron in vitro. A) comparacion de tumores obtenidos despues de la inyeccion de celulas TC1 tratadas con VLPs solas (parte inferior) y pseudoviriones E7-1 (parte superior). B) cuantificacion en grafico de barras de la comparacion del peso de tumores despues de diferentes tratamientos con pseudoviriones de ARNsh y lentivirus de ARNsh.

50 La Figura 6 representa graficos que muestran la inhibicion del crecimiento de tumores TC1 en ratones C57 BL6 despues de la inyeccion intratumoral de pseudoviriones (Pv) de ARNsh de control y ARNsh de E7-1 (Pv). A) evolucion del tamano (diametro medio) del tumor despues de la primera inyeccion de pseudoviriones de ARNsh de control o ARNsh de E7-1. B) peso de los tumores a las 3 semanas en ratones tratados con pseudoviriones de ARNsh de control o ARNsh de E7-1.

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La Figura 7 (a) representa graficos de datos de resonancia plasmonica superficial representatives. (b) representa un mapa epitopico construido a partir de estudios de interaccion entre los 15 MAbs para HPV31 que reconocian epitopos de conformacion mediante SPR. Los anticuerpos que neutralizaban la internalizacion estan en negro y los que neutralizaban la ligazon celular estan subrayados. El anticuerpo H31.D24 era no neutralizador (recuadrado). (c) Los anticuerpos AQ5 que inhibian la union de VLP a heparina estan subrayados.

La Figura 8 representa la cartografia de los epitopos de proteina L1 de HVP31 reconocidos por un MAb no neutralizador (H31.D24) y cuatro MAbs neutralizadores (H31 .B1, H31 .F7, H31 .F16 y H31 .H12) usando el metodo de exposicion bacteriana.

La Figura 9 representa la neutralizacion con MAb de pseudoviriones antes y despues de la ligazon. (a) Inhibicion de la entrada de pseudoviriones de HPV31 por MAbs para HPV31. Los pseudoviriones de HPV31 se preincubaron con MAbs para HPV31 y a continuacion se anadieron a las celulas. (b) Inhibicion de la internalizacion de pseudoviriones de HPV31 por MAbs para HPV31. Los pseudoviriones de HPV31 se preligaron a las celulas y a continuacion se anadieron los MAbs para HPV31. Los cinco MAbs investigados usando el metodo de exposicion bacteriana se agrupan a la derecha de la figura. Columnas grises, MAbs especificos del tipo neutralizador; columna negra, MAb F7 de neutralizacion cruzada.

La Figura 10 representa VLP que se une a HS y ECM: efectos de MAbs para HPV31 y supresion C-terminal de L1. (a) Inhibicion de la union a heparina despues de la preincubacion de VLPs con MAbs. (b) Inhibicion de la union a ECM despues de la preincubacion de VLPs con MAbs. Los cinco MAbs investigados usando el metodo de exposicion bacteriana se agrupan a la derecha de la figura. Columnas grises, MAbs especificos del tipo neutralizador; columna negra, MAb de neutralizacion cruzada F7; columna abierta: MAb no neutralizador D24. Los valores son el porcentaje de inhibicion con SD. Una inhibicion mayor de 50% se consideraba positiva.

La Figura 11 representa la union a heparina de VLPs naturales (columnas negras) y VLPs desnaturalizados (columnas grises) para el tipo 16 y el tipo 31 con o sin eliminaciones C-terminales (D9 y D31).

La Figura 12 representa la localizacion de los epitopos reconocidos por cinco anticuerpos monoclonales sobre el bucle FG de HPV31. La posicion de los epitopos reconocidos sobre el bucle FG de la proteina L1 de HPV31 por cuatro MAbs.

La Figura 13 representa un alineamiento de secuencias de los bucles FG de HPV16 y HPV31, respectivamente, y mutaciones insertadas en la secuencia silvestre del bucle FG de HPV16 para generar quimeras (X e Y).

La Figura 14 representa una grafica que muestra la actividad de extractos de luciferasa (recuentos por minuto, CPM) procedentes de celulas COS-7 transfectadas con wt HPV16 y las quimeras HPV X y HPV Y.

La Figura 15 representa una tabla que muestra titulos (titulos medios geometricos, GMT) de anticuerpos especificos para HPV16, HPV31, HPV X y HPV Y medidos en un ensayo ELISA a partir de ratones inmunizados con HPV16, HPV31, HPV X o HPV Y.

La Figura 16 representa micrografias electronicas de las VLPs quimericas L1STII (A) y 31L1-16L2 (13-88) (B) (barra=200 nm).

La Figura 17 representa graficos de barras que muestran el analisis de la antigenicidad de particulas VPL HPV16 L1-STII, HPV16 L1STIIL2SA y HPV31 L1-16 L213-88 quimericas mediante ELISA. Los resultados se ajustaron a la reactividad de L1 usando el Mab CamVir-1. Los resultados se presentan como reactividad relativa, es decir, la relacion entre la OD obtenida con el antigeno considerado y la OD obtenida con el antigeno de referencia (*). Las particulas se analizaron en condiciones naturales usando anticuerpos monoclonales dirigidos contra epitopos de conformacion (C) y exposicion a StrepTagII o L2. HPV16 L1 STII y HPV16 L1STII L2SA se analizaron con H16.V5 (C), un anticuerpo monoclonal dirigido contra la secuencia StrepTagII y un antisuero de HPV 16 L2 policlonal. Se usaron como controles VLPs de HPV16 L1 y VLPs de L1L2 31. Las VLPs de HPV31 L1-16 L213-88 se analizaron usando H31.F16 (C) y un antisuero de HPV16 L2 policlonal. Los resultados son medias de duplicados.

La Figura 18 representa una fotografia de un analisis de transferencia Western de la expresion de proteina L2. 1) proteina de fusion L2SA purificada, 2) despues de la interaccion con VLPs L1STII y 3) con VLPs de L1; 4) en celulas Cos-7 transducidas con pseudoviriones de HPV58 que codifican GFP y 5) con un pseudovirion de HPV58 que codifica L2.

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La Figura 19 representa una grafica que muestra la deteccion de anticuerpos neutralizadores para HPV31, HPV58 y HPV18. Los titulos de neutralizacion de ratones individuales son las medias de la ultima dilucion reciproca mayores de 50% de inhibicion de la expresion de luciferasa. Los titulos medios geometricos se indican mediante barras.

Descripcion detallada de la invencion

Aspectos de la invencion se refieren a composiciones basadas en particulas de HPV y su uso para aplicaciones medicas y/o terapeuticas. En algunas realizaciones, las particulas basadas en HPV se usan para aportar uno o mas agentes (p. ej., agentes terapeuticos, agentes de diagnostico por imagen y/u otros agentes medicos) a una celula o tejido diana (p. ej., a tejido mucoso, por ejemplo una superficie de tejido mucoso).

En algunas realizaciones, aspectos de la invencion se refieren a una particula de HPV que contiene una o mas proteinas superficiales de HPV presentes en la naturaleza (p. ej., proteinas L1 y/o L2) y que esta cargada con uno o mas agentes medicos y/o terapeuticos, o una combinacion de dos o mas de los mismos. En algunas realizaciones, aspectos de la invencion se refieren a particulas basadas en HPV modificadas que contienen una o mas proteinas superficiales variantes (p. ej., proteinas L1 y/o L2 variantes) que tienen una inmunogenicidad reducida o modificada en un sujeto. La modificacion puede ser un cambio en la secuencia de aminoacidos que reduce o impide la neutralizacion por el sistema inmunitario del sujeto. En algunas realizaciones, una particula basada en HPV modificada es una particula que contiene una proteina de HPV recombinante (p. ej., una proteina L1 y/o L2 recombinante) que incluye uno o mas cambios de aminoacido que alteran la inmunogenicidad de la proteina en un sujeto (p. ej., en un sujeto humano). En algunas realizaciones, una particula basada en HPV modificada tiene una inmunogenicidad alterada pero retiene la capacidad para empaquetar y aportar moleculas a un sujeto. Segun esto, las particulas de HPV modificadas de la invencion se pueden cargar con uno o mas agentes (p. ej., en lugar de un acido nucleico de HPV). Estas particulas se pueden aportar a un sujeto sin inducir una respuesta inmunitaria que seria inducida por una particula de HPV presente en la naturaleza.

Ciertas realizaciones de la invencion son utiles para aportar uno o mas agentes terapeuticos a tejido enfermo (p. ej., tejido mucoso enfermo). En algunas realizaciones, un tejido enfermo (p. ej., tejido mucoso, tejido epitelial o tejido endotelial) puede ser un tejido infectado (p. ej., infectado con un virus tal como HPV o HSV). En algunas realizaciones, el tejido mucoso es tejido de cuello uterino y la enfermedad es displasia o cancer (p. ej., displasia del cuello uterino, cancer de cuello uterino, por ejemplo asociado con infeccion persistente con HPV). Sin embargo, en algunas realizaciones, las particulas basadas en HPV se pueden usar para aportar composiciones a otros tejidos (p. ej., la epidermis). En algunas realizaciones, las particulas basadas en HPV se pueden usar para tratar HPV. Sin embargo, en algunas realizaciones, las particulas basadas en HPV se pueden usar para aportar agentes terapeuticos para tratar otras enfermedades o afecciones.

Algunas realizaciones de la invencion son utiles para aportar uno o mas agentes de diagnostico por imagen o de contraste a un sujeto. Por ejemplo, se pueden aportar puntos cuanticos, metales y/u otros agentes de diagnostico por imagen. En algunas realizaciones, se pueden usar agentes para rastrear enfermedades en fase inicial (p. ej., metastasis en fase inicial). En algunas realizaciones, se pueden usar agentes radiosensibles para mejorar los efectos de la radioterapia. En algunas realizaciones, se pueden aportar agentes para inducir a que las celulas tumorales expresen diferentes receptores o azucares en su membrana. Por ejemplo, se pueden usar aspectos de la invencion para aportar un agente que promueve la expresion en una celula tumoral de una senal que mejoraria el reconocimiento del tumor por el sistema inmunitario (p. ej., un agente que hiciera que la celula tumoral pareciera una bacteria o un virus). En algunas realizaciones, se puede aportar un agente para bloquear la captacion de un azucar por una celula tumoral. Sin embargo, se apreciara que cualquier agente terapeutico y/u otro agente medico adecuado se puede aportar segun los aspectos de la invencion.

En algunas realizaciones, aspectos de la invencion se refieren a particulas basadas en HPV que estan modificadas para exponer epitopos procedentes de dos o mas variantes de HPV presentes en la naturaleza. Estas particulas modificadas se pueden usar para proporcionar inmunizacion contra la infeccion por cualquiera de dos o mas variantes de HPV presentes en la naturaleza.

En algunas realizaciones, aspectos de la invencion se refieren a protocolos para administrar una o mas particulas de HPV diferentes para aplicaciones terapeuticas. Las diferentes particulas de HPV pueden ser cualquier combinacion de diferentes variantes de HPV, particulas basadas en HPV que contienen diferentes agentes y particulas de HPV que tienen inmunogenicidad modificada.

En ciertas realizaciones, se pueden usar nanoparticulas de HPV para aportar uno o mas agentes terapeuticos a celulas mucosas (p. ej., celulas infectadas con HPV). En otras realizaciones, se pueden usar nanoparticulas de HPV alteradas para aportar el uno o mas agentes terapeuticos a celulas diana. En ciertas realizaciones, a nanoparticula de HPV alterada es inmunosilenciosa en el hospedador que aloja anticuerpos especificos para un serotipo. Por ejemplo, un sujeto infectado con un primer serotipo de HPV (p. ej., HPV-16) desarrolla anticuerpos contra ese serotipo. En este sujeto, las particulas virales que tienen el primer serotipo (p. ej., VPLs basadas en HPV 16 silvestre) pueden inducir una respuesta inmunitaria que reduce la eficacia del aporte de farmaco basado en VLP.

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En otro ejemplo, un sujeto se puede inmunizar contra HPV (p. ej., con GARDASIL y CERVARIX) y ha desarrollado anticuerpos neutralizadores contra un primer y/o segundo serotipo (p. ej., HPV-16 y HPV18). En este sujeto, las particulas virales que tienen el primer y/o serotipo (p. ej., VLPs basadas en tipo HPV16 o HPV18 silvestres) pueden inducir una respuesta inmunitaria que reduce drasticamente la eficacia del aporte de farmaco basado en VLP.

Sin embargo, las nanoparticulas de HPV se pueden alterar mediante metodos descritos en la presente de modo que la nanoparticula de HPV alterada no sea reconocida por los anticuerpos especificos para el primer serotipo en el hospedador (p. ej., loa anticuerpos especificos para el serotipo HPV-16 en el hospedador) y/o los anticuerpos especificos para el segundo serotipo en el hospedador (p. ej., los anticuerpos especificos para el serotipo HPV-18 en el hospedador). Estos HPV o nanoparticulas de HPV alterados que comprenden proteinas L1 y/o L2 de un serotipo diferente se pueden usar terapeuticamente. Por ejemplo, estas nanoparticulas de HPV alteradas o VLP basada en un serotipo diferente se pueden usar para aportar uno o mas agentes terapeuticos a un hospedador inmunizado a HPV o infectado con HPV sin inducir una respuesta inmunitaria especifica del serotipo y/o sin ser neutralizadas por una respuesta del hospedador y sin perder eficacia. Estas nanoparticulas de HPV alteradas o VLP basada en un serotipo diferente se pueden usar repetidamente (p. ej., para 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas administraciones) para aportar agentes terapeuticos. En ciertas realizaciones, el sujeto desarrollara nuevos anticuerpos que reconoceran la nanoparticula de HPV alterada o la VLP basada en un serotipo diferente. Ademas, un sujeto que no esta infectado con HPV puede desarrollar una respuesta inmunitaria contra el serotipo de una particula basada en HPV que se administra al sujeto con propositos terapeuticos. En estos casos, se puede usar una segunda nanoparticula de HPV alterada diferentemente o una segunda nanoparticula de HPV que comprende proteinas L1 y/o L2 procedente de un serotipo diferente para el aporte continuado de agentes terapeuticos a un sujeto (p. ej., a celulas infectadas con HPV o celulas dentro de un sujeto que se ha inmunizado contra HPV o se ha tratado con composiciones basadas en HPV de la invencion) sin inducir una respuesta inmunitaria (p. ej., una respuesta inmunitaria neutralizadora) especifica para el serotipo de HPV original y la segunda nanoparticula de HPV alterada. En el caso de que un sujeto desarrolle una respuesta inmunitaria (o a fin de evitar el desarrollo de una respuesta inmunitaria) contra la segunda nanoparticula de HPV alterada o la segunda VLP que contiene las segundas proteinas L1 y/o L2, se puede usar una tercera nanoparticula de HPV alterada o una tercera VLP que contienen terceras proteinas L1 y/o L2. Este procedimiento se puede repetir varias veces con una serie de diferentes nanoparticulas de HPV alteradas y/o se pueden usar diferentes VLPs que contienen una serie de diferentes proteinas L1 y/o L2. Se debe apreciar que en algunas realizaciones, el cambio de un grupo de particulas a uno diferente se puede realizar cuando el primer grupo pierde eficacia en el sujeto, cuando se detecta en el sujeto una respuesta inmunitaria al primer grupo, o en un momento predeterminado (p. ej., despues de un numero predeterminado de administraciones o un periodo predeterminado de administracion del primer grupo) despues de que se inicie el tratamiento.

En ciertas realizaciones, la VLP basada en un serotipo se elige sobre la base de la similitud de genotipo y/o serotipo del HPV. En algunas realizaciones, la VLP basada en un serotipo diferente se elige sobre la base de la reactividad cruzada neutralizadora de los anticuerpos. En algunas realizaciones, se elige una VLP basada en un serotipo diferente que sea la mas distantemente relacionada con el primer y/o el segundo serotipo contra el que el sujeto ha desarrollado anticuerpos neutralizadores. Por ejemplo, HPV 18 y HPV 45 estan estrechamente relacionados y muestran un alto grado de proteccion cruzada de anticuerpos neutralizadores. HPV 16 y HPV 31 estan estrechamente relacionados y muestran un alto grado de proteccion cruzada de anticuerpos neutralizadores. HPV 58 esta relacionado mas distantemente con HPV 16 y HPV18 y se observa poca o ninguna proteccion cruzada por anticuerpos neutralizadores.

Segun esto, una serie de tratamiento puede implicar administrar una serie de composiciones de VLP de la invencion (p. ej., que contienen uno o mas agentes terapeuticos), en donde cada composicion de VLP sucesiva se basa en una VLP procedente de un serotipo de HPV diferente, por ejemplo, de serotipos remotamente relacionados. Por ejemplo, en un sujeto inmunizado contra HPV 16 y HPV 18, una VLP adecuada basada en un serotipo diferente puede ser una particula que comprende proteinas L1 y/o L2 procedentes de HPV 58 silvestre.

En otra realizacion, la VLP relacionada distantemente con el primer y/o segundo serotipo contra el que el sujeto ha desarrollado anticuerpos neutralizadores se puede seleccionar de papilomavirus que no son HPV. En algunas realizaciones, la VLP puede comprender proteinas de la capside procedentes de un papilomavirus que infecta a un mamifero que no es humano, p. ej., papilomavirus bovino (BVP) o papilomavirus de conejo de cola de algodon (CRVP) o papilomavirus de Shope. Se debe apreciar que una serie de tratamiento puede implicar una serie de VLPs basadas en diferentes serotipos de HPV y/o diferentes papilomavirus que infectan a otros hospedadores no humanos.

La nanoparticula de HPV diferentemente alterada o la nanoparticula de HPV de un serotipo diferente se puede usar para el aporte de agentes terapeuticos hasta que el sujeto desarrolle anticuerpos para la nanoparticula de HPV diferentemente alterada o la nanoparticula de HPV de un serotipo diferente. En ciertas realizaciones, usando el metodo descrito anteriormente, alterando VLPs basadas en diferencias de serotipo y/o mutaciones que alteran la respuesta inmunitaria, los sujetos se pueden tratar durante multiples rondas con agentes terapeuticos sin la perdida de eficacia del sistema de aporte debida a respuesta inmunitarias del sujeto. En algunas realizaciones, estos

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regimenes permiten un tratamiento repetido o continuado de la infeccion por HPV y/o el cancer asociado a HPV hasta que se eliminan esencialmente todas las celulas infectadas con HPV y/o se ha producido la remision (parcial o completa) del cancer o la lesion. Sin embargo, se debe apreciar que estos regimenes se pueden usar para el tratamiento repetido o continuado de otras afecciones segun los aspectos de la invencion.

En algunas realizaciones, un sujeto se vacuna usando una vacuna para HPV (tal como una disponible comercialmente, p. ej., GARDASIL y CERVARIX). En estas realizaciones, la inmunizacion protege al sujeto de ser infectado con los virus que son elegidos como diana por la vacuna (por ejemplo, los virus para los que el sujeto ha producido una respuesta inmunitaria al vacunarse) y de desarrollar enfermedades asociadas con HPV provocadas por estos virus especificos de la vacuna. Sin embargo, se apreciara que las vacunas actualmente disponibles no protegeran contra la infeccion de todos los genotipos y/o serotipos de HPV. En algunas realizaciones, los sujetos vacunados con HPV se infectaran con un HPV (p. ej., un HPV de alto riesgo) que no es elegido como diana por la vacuna, por ejemplo, para el que el sujeto vacunado no ha desarrollado una respuesta inmunitaria. En algunas realizaciones, el sujeto vacunado encuentra multiples incidencias de infeccion con diferentes tipos de HPV. En algunas realizaciones, los sujetos se pueden infectar con uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, o mas tipos de HPV diferentes que infectan - y estan alojados en - diferentes celulas del sujeto. En algunas realizaciones, un sujeto vacunado se infecta con un HPV de alto riesgo para el que el sujeto vacunado no ha desarrollado una respuesta inmunitaria puede desarrollar una enfermedad asociada a HPV, p. ej., una displasia o cancer asociados a HPV, provocada por el HPV de alto riesgo para el que el sujeto vacunado no ha desarrollado una respuesta inmunitaria. En estas realizaciones, el sujeto se puede tratar con las VLPs descritas en la presente usando los metodos descritos en la presente.

Por ejemplo, un sujeto inmunizado con las vacunas disponibles comercialmente puede desarrollar anticuerpos neutralizadores contra HPV16 y 18 y tambien puede desarrollar anticuerpos neutralizadores contra HPV6 y 11. El sujeto inmunizado esta protegido contra el desarrollo de precanceres de cuello uterino y/o verrugas genitales provocados por estos tipos de HPV (HPV 16, 18 (cancer) y HPV 6, 11 (verrugas)). Un sujeto que haya desarrollado anticuerpos neutralizadores contra HPV 16 y 18 con la inmunizacion puede desarrollar algunos anticuerpos neutralizadores que exponen reactividad cruzada con otros tipos de HPV (tales como, p. ej., HPV 31, para anticuerpos neutralizadores que se producen contra HPV 16 y HPV 45 para anticuerpos neutralizadores que se producen contra HPV 18). Sin embargo, los sujetos inmunizados todavia seran sensibles a la infeccion con otros tipos de HPV de alto riesgo para los que no son desarrollado anticuerpos neutralizadores cruzados por el sujeto (tales como, p. ej., HPV58 u otros). Tipos de HPV de alto riesgo adicionales que pueden infectar al sujeto inmunizado pueden ser, por ejemplo, hPv-33, HPV-35, HPV-39, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-59, HPV-68 y HPV-69. Si el sujeto inmunizado no ha desarrollado anticuerpos neutralizadores cruzados o no ha desarrollado anticuerpos neutralizadores cruzados suficientemente especificos o no ha desarrollado suficientes titulos de anticuerpos neutralizadores cruzados, el sujeto inmunizado todavia esta en riesgo de desarrollar una enfermedad asociada a HPV, tal como displasia o cancer, cuando se infecta con uno o mas de los tipos de HPV de alto riesgo, para los que no ha sido desarrollada por el sujeto una proteccion suficiente.

En este sujeto, las VLPs modificadas descritas en la presente o las particulas virales de un serotipo diferente (mas distantemente relacionado) (p. ej., VLPs basadas en HPV58 silvestre) que comprenden uno o mas agentes terapeuticos (p. ej., ARNsi de E7) se pueden administrar al sujeto para tratar una enfermedad en fase inicial desarrollada por la infeccion persistente con HPV de alto riesgo de ese sujeto provocada por un HPV de alto riesgo para el que no se desarrollaba suficiente proteccion por el sujeto. En este ejemplo, el tratamiento permite la eliminacion de la displasia inicial y adicionalmente puede producir una proteccion cruzada mas amplia al sujeto contra una infeccion adicional con otros tipos de HPV adicionales.

En algunas realizaciones, las nanoparticulas de HPV comprenden proteina L1 viral. En algunas realizaciones, las nanoparticulas de HPV comprende proteina L1 viral y proteina L2 viral. Las proteinas L1 y/o L2 pueden, en algunas realizaciones, ser proteinas virales silvestres. En algunas realizaciones, las proteinas L1 y/o L2 se pueden alterar mediante mutacion y/o eliminacion de modo que las proteinas L1 y/o L2 resultantes comprendan solamente dominios 'minimos' esenciales para el ensamblaje de la nanoparticula. En algunas realizaciones, las proteinas L1 y/o L2 se pueden fusionar a otras proteinas y/o peptidos que proporcionen una funcionalidad adicional. Estas otras proteinas pueden ser virales o no virales y, en algunas realizaciones, podrian ser, por ejemplo, especificas para el hospedador o especificas para el tipo de celula. Se debe apreciar que las VLPs se pueden basar en particulas que contienen una o mas proteinas recombinantes o fragmentos de las mismas (p. ej., una o mas proteinas de la membrana y/o superficiales de HPV o fragmentos de las mismas). En algunas realizaciones, las VLPs se pueden basar en particulas presentes en la naturaleza que se procesan para incorporar uno o mas agentes como los descritos en la presente, como aspectos de la invencion no se limitan a este respecto. En ciertas realizaciones, se pueden usar particulas que comprenden uno o mas peptidos de eleccion de diana. Se pueden usar otras combinaciones de proteinas y peptidos de HPV, como aspectos de la invencion no se limitan a este respecto.

En algunas realizaciones, las proteinas de la capside silvestres virales se alteran mediante mutaciones, inserciones y eliminaciones. Todos los epitopos especificos de un tipo dependientes de la conformacion identificados hasta la fecha se encuentran en la superficie de HPV-VLP dentro de bucles hipervariables en los que la secuencia de aminoacidos es ligeramente divergente entre tipos de HPV, que se denominan bucles BC, DE, EF, FG y HI. La

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mayorfa de los anticuerpos neutralizadores se generan contra epftopos en estos bucles variables y son especfficos del tipo, con reactividad cruzada, neutralizacion cruzada y proteccion cruzada limitadas. Diferentes serotipos de HPV inducen anticuerpos dirigidos a diferentes epftopos especfficos del tipo y/o a diferentes bucles.

Se proporcionan en la presente metodos para explotar la reactividad cruzada limitada de anticuerpos generados contra serotipos de HPV especfficos para terapia. En ciertas realizaciones, las protefnas de la capside viral, HPV L1 y/o L2, se mutan en una o mas posiciones de aminoacido localizadas en uno o mas bucles hipervariables y/o expuestos superficialmente. Las mutaciones se realizan en posiciones de aminoacido dentro de los bucles que no estan conservadas entre serotipos de HPV. Estas posiciones pueden ser completamente no conservadas, esto es que cualquier aminoacido puede estar en esta posicion, o la posicion puede ser conservada, en la que solamente se pueden realizar cambios de aminoacido conservativos.

Se pueden realizar cambios de aminoacido conservativos segun consideraciones funcionales, qufmicas o estructurales. Por ejemplo, se pueden realizar cambios de aminoacido conservativos segun la similitud qufmica: acido (D/E), alifatico (A/G/I/L/V), amfdico (N/Q), aromatico (F/W/Y), basico (R/H/K), hidroxilado (S/T), imfnico (P), azufrado (C/M); o la similitud funcional: acido (D/E), basico (R/H/K), hidrofilo (A/I/L/M/F/P/W/V), polar (N/C/Q/G/S/T/Y); o la similitud en la carga: acido, basico, neutro; o la similitud estructural: ambivalente (a/C/G/P/S/T/W/Y), externo (R/N/D/Q/E/H/K), interno (I/L/M/F/v), en donde cualquier aminoacido de un grupo de aminoacidos entre parentesis se puede cambiar por otro en ese grupo y este cambio se considera un cambio conservativo segun la consideracion aplicada, p. ej., estructural, funcional o qufmica. En algunas realizaciones, se pueden considerar uno o mas factores.

En ciertas realizaciones, se introducen cambios de aminoacidos en uno o mas bucles en una o mas posiciones que alteran la secuencia de aminoacidos silvestre de un serotipo en la una o mas posiciones de aminoacido y en el uno o mas bucles hasta una secuencia de aminoacidos que se encuentra en otros serotipos de HPV. Por ejemplo, si en un bucle la secuencia de aminoacidos para el serotipo X es ABCDEFG y en el mismo bucle en un serotipo diferente Y la secuencia de aminoacidos es ABHIJG (donde ABCDEFG y ABHIJFG son secuencias de aminoacidos diferentes) entonces AB y FG se conservan y CDE se puede mutar. Se pueden introducir mutaciones en el serotipo Y en C o D o E, o se pueden introducir en CD o DE o CE, o se pueden introducir en CDE. En estas realizaciones, C se puede mutar a H, D se puede mutar a I y E se puede mutar a J. En estas realizaciones, el uno o mas bucles pueden tener la secuencia de aminoacidos de un serotipo (p. ej., Y) mientras que el resto de la protefna y el resto de los (bucles inalterados) son de un serotipo diferente (p. ej., X). En estas realizaciones, solo se muta una pequena porcion de la protefna de la capside viral.

La Tabla 2 muestra ejemplos de un alineamiento de bucles FG de diferentes tipos de HPV:

256- FVRHLFNRAGAVGENVPDDLYIKGS--GSTANLASSNYFPT-294 HPV16 (SEQ ID NO: 1)

257- FVRHFFNRSGTVGESVPTDLYIKGS--GSTATLANSTYFPT-295 HPV31 (SEQ ID NO: 2)

256-FVRHFFNRAGKLGEAVPDDLYIKGS--GTTASIQSSAFFPT-294 HPV33 (SEQ ID NO: 3)

279-FVRHLFNRAGTVGDA/PDDLMIKGT--GNTASPSSCVFYPT-317 HPV34 (SEQ ID NO: 4)

259-FVRHLFNRAGTVGETVPADLYIK----GTTGTLPSTSYFPT-295 HPV35 (SEQ ID NO: 5)

285-FVRHFFNRAGTLGDPVPGDLYIKGSNSGNTATVQSSAFFPT-325 HPV52 (SEQ ID NO: 6)

282-FVRHFFNRAGKLGEAVPDDLYIKGS--GNTAVIQSSAFFPT-320 HPV58 (SEQ ID NO: 7)

254-FVRHLFNRAGDTGGK/PMLMIKGT--GNTATPSSCVFYPT-292 HPV73 (SEQ ID NO: 8)

346-FVRHFFNRAGTTGGAVPKDLYIAGT--GNRANIAGSIYYST-384 HPV91 (SEQ ID NO: 9)

FVRHFFNRAG-VGE-VP-DLYIKGS--GNTA---SS-FFPT Consenso (SEQ ID NO: 10)

L S L D I M A TNS TRG GC YYS T S NT

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FVRHX,FNRX2GX3X4G(E/D)X5 (V/I)PX6DLX7IX8G(S/T)—GX9X,o (A/G) X„X,2X13X,4Xi5X,6 (F/Y)(F/Y)X,7T (SEQ ID NO: 11)

El ejemplo de la Tabla 2 muestra que se pueden introducir mutaciones en cualquier posicion 'X' y se pueden introducir mutaciones conservativas en cualesquiera posiciones marcadas entre parentesis, mientras que se mantienen iguales los aminoacidos conservados (negrita). Un experto normal en la especialidad, basandose en el ejemplo de la Tabla 2, puede alinear secuencias de HPV de cualquier numero de virus HPV para cualquiera de los bucles hipervariables expuestos superficialmente y derivar los aminoacidos conservados y los que no estan conservados sin experimentacion excesiva usando programas de alineamiento bien conocidos .

En ciertas realizaciones, se pueden realizar uno o mas cambios de aminoacido en uno o mas bucles, cambiando los aminoacidos silvestres no conservados de un serotipo por los aminoacidos silvestres equivalentes de otro serotipo. Por ejemplo, segun el ejemplo de la Tabla 2, el aminoacido silvestre de la posicion 260 (L) del bucle FG de HPV 16 se puede alterar hasta (F), que es el aminoacido silvestre equivalente en la posicion 261 de HPV31. Adicionalmente, el aminoacido silvestre de la posicion 264 (A) del bucle FG de HPV16 se puede alterar hasta (S), que es el aminoacido silvestre equivalente en la posicion 265 de HPV31, etc. De este modo, uno o mas bucles de la protefna de la capside viral de un serotipo (p. ej., el bucle FG de L1 de HPV16) se puede alterar para imitar mas o menos estrechamente la secuencia de aminoacidos del bucle de la misma protefna de la capside viral de otro serotipo (p. ej., bucle FG de L1 de HPV31) manteniendo silvestres todos los otros aminoacidos de la protefna de la capside (p. ej., L1 de HPV16). En algunas realizaciones, alterar los aminoacidos de uno o mas bucles que alojan los principales epftopos de un serotipo especffico hasta aminoacidos localizados en las posiciones equivalentes del mismo bucle en un serotipo diferente, del modo descrito en la presente, reduce el reconocimiento de la partfcula viral por anticuerpos especfficos para HPV del sistema inmunitario de un individuo infectado con HPV. En algunas realizaciones, la nanopartfcula de HPV alterada es inmunosilenciosa y no es reconocida por los anticuerpos especfficos de HPV desarrollados por el sujeto infectado con HPV contra HPV. Por ejemplo, un sujeto inmunizado o infectado con HPV16 desarrolla anticuerpos especfficos para HPV16. Si el sistema inmunitario encuentra VLPs que comprenden protefna L1 silvestre derivada de HPV16, se producira una respuesta inmunitaria. Sin embargo, si el sistema inmunitario encuentra VLPs que comprenden protefna L1 derivada de HPV16 que esta alterada de un modo descrito en la presente, (inicialmente) no se producira una respuesta inmunitaria especffica de HPV16. Despues de una estimulacion repetida con la VLP alterada, el sujeto que recibe la VLP alterada desarrollara una nueva respuesta inmunitaria dirigida contra la partfcula. En este caso, se puede usar una VLP diferentemente alterada y/o una VLP procedente de otro serotipo para los metodos de tratamiento descritos en la presente.

Sorprendentemente, en algunas realizaciones, en las que uno o mas bucles de la protefna de la capside viral de un serotipo se alteran para imitar la estructura epitopica de los bucles de la protefna de la capside viral de otro serotipo, la VLP que comprende la protefna de la capside alterada no es reconocida por anticuerpos neutralizadores dirigidos contra cualquier serotipo. Segun aspectos de la invencion, aunque el bucle (p. ej., el bucle FG) contenga un epftopo principal, el serotipo esta determinado por ese epftopo en el contexto del resto de la protefna de la capside viral. Cuando solo se modifica el bucle sin cambiar la secuencia del resto de la protefna de la capside viral, se obtiene un nuevo serotipo que sorprendentemente no es reconocido por contra el serotipo (o los serotipos cuando la secuencia del bucle se cambia desde la secuencia de un primer serotipo a la secuencia de un segundo serotipo) original. En algunas realizaciones, se pueden cambiar una o mas posiciones para generar un nuevo serotipo mientras se retiene la capacidad para empaquetar y aportar un agente (p. ej., un acido nucleico, por ejemplo un ARN o ADN, por ejemplo un acido nucleico recombinante, por ejemplo un acido nucleico terapeutico como el descrito en la presente).

En algunas realizaciones, una o mas de las posiciones X1, X2, X3, X5, X6, X11 y X14 del bucle FG se pueden alterar para generar un nuevo serotipo que todavfa es capaz de empaquetar y aportar un agente (p. ej., un acido nucleico heterologo que es diferente del acido nucleico de HPV (p. ej., un acido nucleico, por ejemplo un ARN o ADN, por ejemplo un acido nucleico recombinante, por ejemplo un acido nucleico terapeutico como el descrito en la presente). En algunas realizaciones, una o mas de estas posiciones en una primera protefna L1 se cambian desde el aminoacido de un primer serotipo al aminoacido de un segundo serotipo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, todas las posiciones X1, X2, X3, X5, X6, X11 y X14 se pueden cambiar desde una primera secuencia del serotipo de HPV (p. ej., una secuencia del serotipo HPV16) hasta una segunda secuencia del serotipo de HPV (p. ej., una secuencia del serotipo HPV31) en el contexto de la primera secuencia de L1 (p. ej., el HPV16). En algunas realizaciones, solo X6, X11 y X14 se cambian desde un aminoacido de una primera secuencia del serotipo de HPV (p. ej., una secuencia del serotipo HPV16) hasta una segunda secuencia del serotipo de HPV (p. ej., una secuencia del serotipo de HPV31) en el contexto de la primera secuencia de L1 (p. ej., el HPV16). En algunas realizaciones, cualquier combinacion de X1, X2, X3, X5, X6, X11 y X14 (p. ej., cualesquiera 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 de las posiciones) se puede alterar desde un aminoacido de un primer serotipo hasta el aminoacido de un segundo serotipo sin cambiar el resto de la secuencia de L1. Se debe apreciar que los serotipos primero y segundo pueden ser cualesquiera serotipos adecuados (p. ej., HPV16, HPV31, HPV33, HPV 34, HPV35, HPV52, HPV58, HPV73, HPV91, o cualquier otro serotipo con secuencias del bucle FG especfficas). Tambien se debe apreciar que, en algunas realizaciones, una cualquiera o mas de estas posiciones se puede cambiar por cualquier aminoacido conservativo o no

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conservative (independientemente de si el cambio corresponde a un aminoacido procedente de otro serotipo presente en la naturaleza) en el contexto de una secuencia de L1 por lo demas inalterada o porcion de la misma que retiene la capacidad de empaquetar y aportar un agente (p. ej., un acido nucleico que es diferente del acido nucleico de HPV natural, o cualquier otro agente como el descrito en la presente).

En algunas realizaciones, una particula de HPV modificada que todavia puede empaquetar y aportar un agente no tiene una modificacion en la posicion Xi6 de la proteina L1. Por ejemplo, un HPV16 modificado puede tener uno o mas cambios en otras posiciones pero retiene una asparagina (N) en la posicion X16.

Se debe apreciar que los principales epitopos MAbs neutralizadores se han identificado en uno o mas bucles que difieren entre serotipos de HPV. Por ejemplo, para HPV11 en el bucle DE, para HPV6 en los bucles BC y EF y para HPV33 en los bucles BC, DE y FG, para HPV16 en el bucle FG y para HPV31 en el bucle EF (como se describe, por ejemplo, en Fleury y cols. Prot. Sci. 2009). Usando la estrategia descrita en la presente, un experto normal puede alinear secuencias de otros bucles que se ha mostrado que comprenden epitopos principales para generar VLPs modificadas adicionales.

Tambien se debe apreciar que se puede realizar cualquier numero de cambios (mutaciones, eliminaciones, adiciones) de aminoacidos en cualquier posicion de aminoacido dentro de la proteina de la capside viral (en uno o mas de los bucles superficiales, en sitios que comprenden un aminoacido con grupos enfrentados internamente, o en cualquier otra posicion en la proteina de la capside) para modificar o alterar la inmunogenicidad o por cualquier otra razon (p. ej., para inducir o evitar cambios de conformacion, para incrementar o disminuir grupos de aminoacidos cargados, para alterar la eleccion de la diana, para incrementar la biodisponibilidad, para inducir modificaciones especificas para incrementar la captacion a traves de una via de administracion especifica), manteniendo la capacidad de la proteina de la capside alterada para formar VLPs y manteniendo la capacidad de las VLPs resultantes para transferir agente o agentes terapeuticos a la celula diana.

Se debe apreciar ademas que se pueden introducir modificaciones de aminoacidos guiados por los que se ensena en la presente y por lo que se conoce en la especialidad acerca de epitopos lineales y de conformacion situados dentro de los bucles. Se han identificado epitopos de conformacion que, por ejemplo, pueden ser sitios de reconocimiento para anticuerpos neutralizadores o pueden ser sitios importantes para la eleccion de dianas celulares o pueden ayudar a la entrada en la celula por la VLP (como se describe, por ejemplo, en Fleury y cols. Prot. Sci. 2009 y Sadeyen y cols. Virology, 2003, 309:32-40). La modificacion de uno o mas aminoacidos dentro de los bucles se puede disenar segun los epitopos de conformacion y puede comprender la modificacion de uno o mas aminoacidos que estan conservados ademas de los que no estan conservados.

En algunas realizaciones, se pueden insertar secuencias de aminoacidos en los bucles. Por ejemplo, se pueden insertar secuencias de aminoacidos cortas en uno o mas bucles expuestos superficialmente. Las inserciones de secuencias de aminoacidos cortas pueden tener una longitud de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 o 250 o cualquier longitud entre 4 aminoacidos y 250 aminoacidos. En ciertas realizaciones, las inserciones tienen una longitud de entre 4 y 50, 5 y 25 o 5 y 15 aminoacidos. Las inserciones se pueden insertar en cualquier lugar de los bucles. En algunas realizaciones, las inserciones se insertan aproximadamente en el medio de un bucle. Se apreciara que si se sabe que ciertos motivos son presentados por un cierto bucle y se desea mantener el motivo, la insercion se realizara fuera del motivo, bien N-terminal o bien C-terminal del motivo. Por otra parte, si se desea alterar un cierto motivo presentado en un cierto bucle, entonces la insercion se realizara dentro del motivo. El motivo puede ser lineal o estructural, esto es, se puede basar en la secuencia de aminoacidos primaria o su estructura secundaria (o terciaria). El motivo puede ser un motivo de reconocimiento celular, que puede facilitar la captacion por VLP y/o el reconocimiento de celulas diana, o puede ser un epitopo que sea reconocido por ciertos anticuerpos o que se sepa que es antigenico. En algunas realizaciones, en las que se usan inserciones para promover la eleccion de dianas o la captacion celular, las inserciones pueden comprender, por ejemplo, dominios de eleccion de diana virales. Se apreciara que estos dominios no se limitan a HPV. Los dominios de eleccion de diana virales se pueden derivar de cualquier virus para elegir como diana cualquier celula que se desee. Las inserciones tambien pueden comprender, por ejemplo, motivos de reconocimiento celular especificos del hospedador, tales como motivos de reconocimiento de receptores. En algunas realizaciones, las inserciones pueden comprender secuencias de aminoacidos que comprenden epitopos para etiquetas de afinidad, tales como, p. ej., Strep Tag™ (STII, WSHPQFEK, SEQ ID NO: 12).

En algunas realizaciones, se usan inserciones para estimular una respuesta inmunitaria. En estas realizaciones, las inserciones pueden comprender uno o mas epitopos (p. ej., un politopo) de origen viral (p. ej., de diversos serotipos de HPV). Por ejemplo, se puede construir un politopo que comprende regiones antigenicas (epitopos) de la proteina L1 de diversos serotipos de HPV, p. ej., HPV16, 18, 31, 33 y 45. En algunas realizaciones, se pueden insertar regiones de la proteina L2.

En algunas realizaciones, las inserciones de uno o mas epitopos generaran una respuesta inmunitaria en un sujeto al uno o mas epitopos. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria confiere proteccion contra la reinfeccion con un virus (p. ej., HPV) y/o la repoblacion de un virus (p. ej., originada a partir del virus restante despues del

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tratamiento antiviral) y/o la recurrencia de un cancer asociado a virus (p. ej., originado a partir de las celulas cancerosas viralmente transformadas restantes despues del tratamiento anticanceroso).

En algunas realizaciones, se pueden ligar peptidos a la superficie de VLP para inducir una respuesta inmunitaria alterada o amplificada (p. ej., si el peptido comprende uno o mas epitopos) o para alterar o amplificar la eleccion de dianas y/o la captacion celular de la VLP (p. ej., si el peptido comprende uno o mas receptores celulares). Por ejemplo, la VLP puede tener un dominio de union a albumina para potenciar su transporte a traves de los vasos sanguineos o un peptido para potenciar la transcitosis (p. ej., un motivo de union a integrina (RGD) que potencia la transcitosis basal a apical; restos de sulfato de heparano u otros restos) y/o un dominio de union especifico de un receptor para potenciar su captacion por las celulas elegidas como diana (p. ej., peptido de union a EGFR) y/o peptidos que potencian el transporte endosomico y/o nuclear.

En algunas realizaciones, los peptidos se pueden ligar a traves de reticulacion quimica usando un conector adecuado, p. ej., glutaraldehido, imidoester y BS(PEG)9, BS(PEG)5, DTSSP, EDC, SM(PEG)2, SMCC y sulfoSMCC (Thermo scientific).

En algunas realizaciones, los peptidos se pueden ligar a traves de etiquetas de afinidad, tales como StrepTag™.

En algunas realizaciones, los peptidos tienen una longitud de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 aminoacidos.

En ciertas realizaciones, la proteina L1 y la proteina L1+L2 se pueden producir recombinantemente. En ciertas realizaciones, la proteina L1 y la proteina L1+L2 producidas recombinantemente se pueden autoensamblar para formar particulas similares a virus (VLPs). La produccion recombinante se puede producir en un sistema hospedador bacteriano, de insecto, de levadura o de mamifero. La proteina L1 se puede expresar o la proteina L1+L2 se pueden coexpresar en el sistema hospedador.

Metodos para expresar y purificar proteinas virales recombinantes L1 y L2 en sistemas hospedadores, metodos para el desensamblaje y el reensamblaje de nanoparticulas de HPV o VLPs y ejemplos de modificaciones en las secuencias de aminoacidos de L1 y L2, la administracion de VLPs a sujetos y composiciones farmaceuticas que comprenden VLPs son muy conocidos en la especialidad y se ensenan en la presente. Por ejemplo, las Patentes de EE. UU. N°: 6.416.945, 6.991.795 y 7.205.126. Sin embargo, se apreciara que los metodos y los modos proporcionados en la presente no se limitan a los descritos en las susodichas patentes de EE. UU. Tambien se pueden emplear otros metodos y modos conocidos por los expertos en la especialidad.

En ciertas realizaciones, las nanoparticulas de HPV o las VLPs se cargan con uno o mas agentes terapeuticos. Las nanoparticulas de HPV se pueden cargar al desensamblar y reensamblar particulas virales L1 o L1 y L2, como se describe en la presente. Sales que son utiles para ayudar al desensamblaje/reensamblaje de proteinas de la capside viral en VLPs incluyen sales de Zn, Cu y Ni, Ru y Fe. Se pueden usar otros metodos de carga. En algunas realizaciones, las nanoparticulas de HPV se pueden cargar con uno o mas agentes terapeuticos.

En algunas realizaciones, las nanoparticulas de HPV que comprenden proteina L1, o proteina L1 y L2 comprenden ademas uno o mas agentes terapeuticos. En ciertas realizaciones, el agente terapeutico comprende una o mas moleculas de ARNsi o uno o mas acidos nucleicos (p. ej., un plasmido u otro vector) cada uno de los cuales es capaz de expresar una o mas moleculas de ARNsi. En algunas realizaciones, el agente terapeutico comprende uno o mas acidos nucleicos antisentido (p. ej., anti-E6 y/o anti-E7) uno o mas acidos nucleicos (p. ej., un plasmido u otro vector) que son capaces cada uno de expresar uno o mas acidos nucleicos antisentido. En algunas realizaciones, las nanoparticulas de HPV comprenden combinaciones de dos o mas agentes terapeuticos.

En algunas realizaciones, el agente terapeutico es un inductor de la interferencia de ARN u otro inductor del silenciamiento genico. Un inductor de la interferencia de ARN puede ser un ARNsi, un ARNsh, una molecula de acido nucleico hibrida que comprende una primera parte que comprende una molecula de acido ribonucleico (ARN) doble y una segunda parte que comprende una molecula de acido desoxirribonucleico (ADN) monocatenario, un ARN bicatenario mas largo o una construccion de ADN para la expresion de ARNsi o secuencias de ARN mas largas. Otros inductores del silenciamiento genico incluyen inductores de la metilacion de ADN, o ribozimas o aptameros. En otras realizaciones, el agente terapeutico puede ser un modulador de la expresion genica tal como un APN (acido peptidonucleico).

La interferencia de ARN la interferencia de ARN (iARN) es un procedimiento por el que la introduccion de ARN bicatenario (ARNds) en una celula inhibe la expresion genica postraduccionalmente, de un modo dependiente de la secuencia. La iARN puede estar mediada por ARNdss cortos (por ejemplo 19-25 nucleotidos) o ARNs' interferentes pequenos (ARNsi). El ARNds se escinde en la celula para crear ARNsis que estan incorporados en un complejo silenciador inducido por ARN (RISC), guiando el complejo hasta un ARNm endogeno homologo, escinden el transcrito de ARNm y dando como resultado la destruccion del ARNm.

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Para inducir la interferencia de ARN en una celula, se puede introducir ARNds en la celula como un fragmento de acido nucleico aislado o a traves de un transgen, un plasmido o un virus. En ciertas realizaciones, se usan VLPs para aportar ARNds a las celulas diana.

En algunas realizaciones, se expresa en la celula una molecula de ARN de horquilla corto (ARNsh). Un ARNsh comprende repeticiones cortas invertidas separadas por una pequena secuencia de bucle. Una repeticion invertida es complementaria a la diana genica. A continuacion, el ARNsh se procesa en un ARNsi que degrada el ARNm del gen diana. Los ARNshs se puede producir dentro de una celula con una construccion de ADN que codifica la secuencia de ARNsh bajo el control de un promotor de ARN polimerasa III, tal como el promotor HI o 7SK humano. Alternativamente, el ARNsh puede sintetizarse exogenamente e introducirse directamente en la celula, por ejemplo a traves de aporte con VLP. En ciertas realizaciones, la secuencia de ARNsh tiene una longitud de entre 40 y 100 bases o una longitud de entre 40 y 70 bases. El tallo de la horquilla, por ejemplo, tiene una longitud entre 19 y 30 pares de bases. El tallo puede contener apareamientos G-U para estabilizar la estructura de horquilla.

Las secuencias de ARNsi se seleccionan sobre la base de su homologia con el gen diana. La homologia entre dos secuencias nucleotidicas se puede determinar usando una variedad de programas incluyendo el programa BLAST (Altschul y cols. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10) o BestFit (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE. UU. de A., Wisconsin 53711). Las comparaciones de secuencias se pueden realizar usando FASTA y FASTP (vease Pearson & Lipman, 1988. Methods in Enzymology 183: 63-98). Herramientas para el diseno y la calidad de ARNsis, ARNshs y/o ARNmis se conocen en la especialidad. Un sistema de software en linea basado en Internet para disenar secuencias de ARNsi y secuencias de ARNsi desordenadas son, por ejemplo, siDirect, siSearch, SEQ2SVM, Deqor, ARNsi Wizard (InvivoGen). La especificidad se puede predecir usando, por ejemplo, SpecificityServer, miRacle. Las secuencias diana se pueden investigar, por ejemplo, en HuSiDa (base de datos de ARNsi humanos) y RNAsidb (una base de datos de secuencias de ARNsi). La comparacion de secuencias se puede realizar a lo largo de toda la longitud de la secuencia pertinente, o mas preferiblemente a lo largo de una secuencia contigua de aproximadamente o 10, 15, 20, 25 o 30 bases. En ciertas realizaciones, el grado de homologia entre el ARNsi y el gen diana es al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97% o al menos 99%, o 100%. El ARNsi puede tener una longitud entre 10 pb y 30 pb, o entre 20 pb y 25 pb, o el ARNsi tiene una longitud de 20, 21 o 22 pb.

La presencia de la iARN se puede detectar al transfectar celulas cultivadas con el ARNsi, seguido por RT-PCR del ARNm de interes. Cuando se induce iARN mediante el ARNsi, los niveles del ARNm de interes se reduciran en celulas transfectadas en comparacion con celulas de control. Una reduccion en la produccion de proteina se puede confirmar mediante la transferencia Western de lisados celulares seguida por sondeo con un anticuerpo reactivo a la proteina de interes.

En algunas realizaciones, el gen que se va a silenciar es un gen E6 o E7 de HPV. La secuencia de ARNsi puede ser cualquier secuencia contigua de 10-30 pb procedente de una cualquiera de las secuencias de los genes E6 o E7, p. ej., las de HPV16 o HPV18, que induzca iARN. Alternativamente, se pueden usar fragmentos de ARNds mas largos que comprenden secuencias contiguas procedentes de estas secuencias, ya que se escindiran para formar ARNsis dentro de la celula.

Las moleculas de ARNsi tambien se pueden sintetizar usando tecnicas de sintesis en solucion o fase solida estandar que son conocidas en la especialidad. ARNsis sinteticos contra ARNms que codifican HPV-16 E6 y HPV-18 E6, respectivamente, se pueden obtener comercialmente (por ejemplo, de Dharmacon Research, Lafayette, EE. UU. de A.).

En algunas realizaciones, el ARNsi tiene un saliente en uno o ambos extremos de una o mas bases de desoxitimidina para incrementar la estabilidad del ARNsi dentro de las celulas al reducir su sensibilidad a la degradacion por nucleasas.

En algunas realizaciones, el ARNsi es una molecula de acido nucleico hibrida que comprende una primera parte que comprende una molecula de acido ribonucleico (ARN) doble y una segunda parte que comprende una molecula de acido desoxirribonucleico (ADN) monocatenaria.

Las conexiones entre nucleotidos pueden ser enlaces fosfodiester o alternativas, por ejemplo, grupos de conexion de la formula P (O) S, (tioato) ; P (S) S, (ditioato); P (O) NR'2 ; P (O) R'; P (O) OR6; CO; o CONR'2 en donde R es H (o una sal) o alquilo (1 -12C) y R6 es alquilo (1-9C) esta enlazado a nucleotidos adyacentes a traves de -O- o -S-.

Se pueden usar bases nucleotidicas modificadas ademas de las bases presentes en la naturaleza. Por ejemplo, las bases modificadas pueden incrementar la estabilidad de la molecula de ARNsi, reduciendo de ese modo la cantidad requerida para el silenciamiento. El termino nucleotido modificado abarca nucleotidos con una base y/o un azucar covalentemente modificados. Por ejemplo, los nucleotidos modificados incluyen nucleotidos que tienen azucares que estan ligados covalentemente a grupos organicos de bajo peso molecular distintos de un grupo hidroxilo en la posicion 3' y distintos de un grupo fosfato en la posicion 5'. Asi, los nucleotidos modificados tambien pueden incluir azucares sustituidos en 2' tales como 2'-0-metil- ; 2-0-alquil; 2-0-alil; 2'-S-alquil; 2'-S-alil; 2'-fluoro-; 2'-halo o 2; azido-

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ribosa, analogos sacaricos carbociclicos azucares a-anomeros; azucares epimeros tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azucares de piranosa, azucares de furanosa y sedoheptulosa.

Los nucleotidos modificados son conocidos en la especialidad e incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas y pirimidinas aciladas y otros heterociclos. Estas clases de pirimidinas y purinas se muestran en la especialidad e incluyen pseudoisocitosina, N4, N4-etanocitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5- carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopentil-adenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1- metilguanina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7- metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, -D-manosilqueosina, 5- metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ester metilico de acido uracil-5- oxiacetico, psueouracilo, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, ester metilico de acido N-uracil-5-oxiaceetico, acido uracil-5-oxiacetico, queosina, 2-tiocitosina, 5-propiluracil, 5-propilcitosina, 5- etiluracilo, 5-etilcitosina, 5-butiluracilo, 5-peniluracilo, 5-pentilcitosina y 2,6-diaminopurina, metilpsuedouracilo, 1- metilguanina, 1-metilcitosina.

En algunas realizaciones, las moleculas de ARNsi o moleculas de ARNds mas largas se pueden elaborar recombinantemente mediante la transcripcion de una secuencia de acido nucleico, por ejemplo contenido dentro de un vector como se describe en la presente. El vector puede ser cualquier vector de ARN o ADN.

El vector puede ser un vector de expresion, en el que la secuencia nucleotidica esta conectada operativamente a un promotor compatible con la celula. Promotores adecuados para el uso en diversos sistemas de vertebrados son muy conocidos en la especialidad. Por ejemplo, promotores adecuados incluyen promotores virales tales como promotores de retrovirus de mamifero o virus de ADN, p. ej. promotores de MLV, CMV, RSV, SV40 IEP (promotor temprano inmediato) y adenovirus y promotor de metalotioneina. Tambien se pueden usar promotores de mamifero fuertes. Se apreciara que tambien se pueden usar variantes de estos promotores que retienen actividad de transcripcion sustancialmente similares.

En algunas realizaciones, el vector puede tener al menos dos promotores, uno para dirigir la expresion de la cadena de sentido y uno para dirigir la expresion de la cadena antisentido del ARNds. En otras realizaciones, se pueden usar dos vectores, uno para la cadena de sentido y uno para la cadena antisentido. Alternativamente, el vector puede codificar ARNs que forman estructuras de tallo-bucle que posteriormente son escindidas por la celula para producir ARNds.

La construccion de acido nucleico puede contener un promotor o represor de la expresion genica celular, viral u otro, especifico. El promotor o represor se puede disenar para reflejar el contexto de la celula en la que se introduce la construccion. Por ejemplo, la construccion puede contener un promotor viral de modo que la expresion a partir de la construccion dependa de la presencia de una proteina viral, de modo que la construccion se exprese solamente en celulas infectadas viralmente. De forma similar, la construccion puede tener un promotor o represor especifico para ciertos tipos de celulas o para ciertas fases de desarrollo. Por ejemplo, cuando el vector es para el uso en una celula infectada viralmente tal como celulas infectadas con HPV, se puede usar un promotor viral que coincide con el virus causante de la enfermedad. p. ej. un promotor de HPV (tal como el promotor que provoca la expresion de HPV16 E6/E7) para celulas infectadas con HPV. En estas realizaciones, el vector solo se expresara en las celulas infectadas viralmente.

En ciertas realizaciones, el agente terapeutico de ARNsi se dirige contra agentes que promueven o median en la muerte celular o la apoptosis de la celula diana. En ciertas realizaciones, el agente terapeutico de ARNsi se dirige contra proteinas virales de HPV. En algunas realizaciones, las proteinas virales que son elegidas como diana por moleculas de ARNsi son E6 y/o E7 virales. Se ha encontrado que ARNsi de E6 es potente en la supresion de la expresion de oncogenes virales y ARNsi de E6 exhibe una potente actividad inhibidora del crecimiento (Yoshinouchi y cols., 2003). El silenciamiento de E7 producido por ARNsi induce la muerte celular apoptotica. Sin querer limitarse por una teoria particular, se ha descrito que los ARNs interferentes pequenos (si) sinteticos, especificamente dirigidos contra el oncogen de E7 de HPV antiapoptotico, restauran rutas supresoras de tumores durmientes en celulas cancerosas positivas a HPV que de otro modo son inactivas en presencia de E7 conduciendo a apoptosis y muerte celular. En algunas realizaciones, el silenciamiento de E7 por ARNsi puede ser suficiente para conducir a la apoptosis de la celula hospedadora infectada, sin la necesidad de inhibir E6. (Milner y cols.). ARNsis para E6 y E7 virales se describen, por ejemplo, en Butz y cols. (Oncogene (2003) 22, 5938-5945) y Milner y cols. (Solicitudes de patente 0117359.0 y 0216929.0 y documento WO 2005/051431).

En ciertas realizaciones, E6 de HPV-16 y E6 de HPV-18 pueden ser elegidos especificamente como diana por ARNsi. En ciertas realizaciones, la secuencia diana respectiva para E6 de HPV-16 es 5'- UACAACAAACCGUUGUGUG (SEQ ID NO: 13, nucleotidos 377-395). En ciertas realizaciones, la secuencia diana respectiva para E6 de HPV-18 es 5'-CUAACUAACACUGGGUUAU (SEQ ID NO: 14, nucleotidos 381-399) (como se describe en Butz y cols.).

En otras realizaciones, las construcciones de ARNsi de E6 y E7 son:

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E6 (directo): 5' GAGGUAUAUGACUUUGCUUTT (SEQ ID NO: 15); E6 (inverso): TTCUCCAUAUACUGAAACGAA 5' (SEQ ID NO: 16) y E7 (directo): 5' AGGAGGAUGAAAUAGAUGGTT (SEQ ID NO: 17); E7 (inverso): TTUCCUCCUACUUUAUCUACC 5' (SEQ ID NO: 18)

(como se describe en Milner, documento WO 2005/051431).

En otras realizaciones, las construcciones de ARNsh de E6 y E7 son: Tabla 3

ARNsh

Secuencias de oligonucleotidos (5'-3')

Control

Directo CACCAGAGTTCAAAAGCCCTTCATCGAAATGAAGGGCTTTTGAACTC (SEQ ID NO: 19)

Inverso AAAAAGAGTTCAAAAGCCCTTCATTTCGATGAAGGGCTTTTGAACTC (SEQ ID NO: 20)

LacZ

Directo CACCGCTACACAAATCAGCGATTTCGAAAAATCGCTGATTTGTGTAG (SEQ ID NO: 21)

Inverso AAAACTACACAAATCAGCGATTTTTCGAAATCGCTGATTTGTGTAGC (SEQ ID NO: 22)

shE7-1

Directo CACCAGGAGGATGAAATAGATGGTTCGAAAACCATCTATTTCATCCTCC (SEQ ID NO: 23)

Inverso AAAAGGAGGATGAAATAGATGGTTTTCGAACCATCTATTTCATCCTCCT (SEQ ID NO: 24)

shE7-2

Directo CACCGCCCATT ACAAT ATT GT AACCCGAAGGTTACAAT ATTGTAATGGGC (SEQ ID NO: 25)

Inverso AAAAGCCCATTACAATATTGTAACCTTCGGGTTACAATATTGTAATGGGC (SEQ ID NO: 26)

shE6-1

Directo CAACGAGGTATATGACTTTGCTTTTCGAAAAAAGCAAAGTCATATACCTC (SEQ ID NO: 27)

Inverso AAAAGAGGT AT AT GACTTTGCTTTTTTCGAAAAGCAAAGTCAT AT ACCTC (SEQ ID NO: 28)

shE6-2

Directo CACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCCGAAGCAACAAGACATACATCGACC (SEQ ID NO: 29)

Inverso AAAAGGTCGATGTATGTCTTCTTGCTTCGGCAACAAGACATACATCGACC (SEQ ID NO: 30)

(como se describe en Bousarghin y cols, Mol Cancer Ther, 2009, 8:357-365).

En ciertas realizaciones, los aminoacidos de las proteinas silvestres virales, tales como L1 y/o L1+L2, que se ensamblan en las nanoparticulas de HPV estan mutados y/o sustituidos y/o eliminados. En ciertas realizaciones, estos aminoacido estan modificados para potenciar la carga positiva del interior de la VLP. En ciertas realizaciones, se introducen modificaciones para permitir una interaccion electrostatica mas fuerte de la molecula de ARNsi con uno o mas de los aminoacidos enfrentados al interior de la VLP y/o para evitar la fuga del ARNsi de la nanoparticula de HPV.

Los acidos nucleicos estan altamente cargados y no cruzan membranas celulares mediante difusion libre. Adicionalmente, el caracter hidrofilo y el esqueleto anionico de los ARNsis reduce su captacion por las celulas. En ciertas realizaciones, se puede aportar ARNsi antiviral terapeutico a un sujeto administrando nanoparticulas de HPV para incrementar la captacion celular (atravesar barreras de membrana biologica in vivo) y/o la biodisponibilidad del ARNsi.

Se debe apreciar que las composiciones de VLP que comprenden agentes que promueven la apoptosis en celulas infectadas con HPV solo son particularmente utiles en algunas realizaciones, debido a que eligen como diana celulas que estan infectadas por HPV (p. ej., los componentes superficiales de VLP eligen como diana el mismo tipo de celula que es elegido como diana por HPV naturalmente infeccioso) y aportan agentes que destruyen las celulas infectadas con HPV. Estas composiciones se pueden usar para curar infecciones por HPV en algunas realizaciones. En algunas realizaciones, no se requiere tratamiento cronico con la condicion de que se usen dosificaciones adecuadas (p. ej., dosificaciones individuales o un curso de tratamiento a lo largo de un periodo de tratamiento predeterminado, pero no cronico) para destruir las celulas infectadas con HPV. Sin embargo, en algunas realizaciones, las composiciones de la invencion pueden no ser suficientes para destruir todas las celulas infectadas con HPV y se requiere mas de un curso de tratamiento y/o tratamiento cronico. En algunas realizaciones, se pueden usar composiciones de VLP que comprenden agentes antivirales (en oposicion a agentes proapoptoticos) para tratamientos cronicos.

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En ciertas realizaciones, el agente terapeutico es un agente anticanceroso. En una realizacion preferida, el agente anticanceroso es gemcitabina.

En ciertas realizaciones, el agente terapeutico es un agente quimioterapeutico, por ejemplo, metotrexato, vincristina, adriamicina, cisplatina, cloroetilnitrosoureas que no contienen azucares, 5-fluorouracilo, mitomicina C, bleomicina, doxorrubicina, dacarbazina, taxol, fragilina, meglamina GLA, valrrubicina, carmustaina y poliferposano, MMI270, BAY 12-9566, inhibidor de famesil transferasa de RAS, inhibidor de famesil transferasa, MMP, MTA/LY231514, LY264618/lometexol, Glamolec, CI-994, TNP-470, Hycamtin/topotecano, PKC412, Valspodar/PSC833,

Novantron/mitroxantrona, Metaret/suramina, batimastat, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, Incel/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/marmistat, BB2516/marmistat, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, nemonal DP 2202, FK 317, Picibanil/OK-432, aD 32/valrrubicina, Metastron/derivado de estroncio, Temodal/temozolomida, Evacet/doxorrubicina liposomica, Yewtaxan/paclitaxel, Taxol/paclitaxel, Xeload/capecitabina, Furtulon/doxifluridina, Cyclopax/paclitaxel oral, taxoide oral, SPU-077/cisplatino, HMR 1275/flavopiridol, CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/inhibidor del oncogen RAS, BMS-182751/platino oral, UFT(tegafur/uracilo), ergamisol/levamisol, eniluracilo/776C85/potenciador de 5FU, campto/levamisol, camptosar/irinotecano, tumodex/ralitrexed, leustatina/cladribina, Paxex/paclitaxel, doxilo/doxorrubicina liposomica, caelix/doxorrubicina liposomica, Fludara/fludarabina, Pharmarubicin/epirrubicina, DepoCyt, ZD1839, LU 79553/bis- naftalimida, LU 103793/dolastaina, Caetix/doxorrubicina liposomica, Gemzar/gemcitabina, ZD 0473/Anormed, YM 116, semillas de yodo, inhibidores de CDK4 y CDK2, inhibidores de PARP, D4809/dexifosamida, Ifes/Mesnex/ifosamida, Vumon/teniposido, paraplatino/carboplatino, Plantinol/cisplatino, Vepeside/etoposido, ZD 9331, Taxotere/docetaxel, profarmaco de arabinosido de guanina, analogo de taxano, nitrosoureas, agentes alquilantes tales como melfelano y ciclofosfamida, aminoglutetimida, asparaginasa, busulfano, carboplatino, clorombucilo, HCI de citarabina, dactinomicina, HCl de daunorrubicina, fosfato sodico de estramustina, etoposido (VP16-213), floxuridina, fluorouracilo (5-FU), flutamida, hidroxiurea (hidroxicarbamida), Iifosfamida, interferon alfa-2a, alfa-2b, acetato de leuprolida (analogo de factor de liberacion de LHRH), lomustina (CCNU), HCl de mecloretamina (mostaza nitrogenada), mercaptopurina, mesna, mitotano (o.p'-DDD), HCl de mitoxantrona, octreotido, plicamicina, HCl de procarbazina, estreptozocina, citrato de tamoxifeno, tioguanina, tiotepa, sulfato de vinblastina, amsacrina (m- AMSA), azacitidina, ertropoyetina, hexametilmelamina (HMM), interleucina 2, mitoguazona (metil-GAG; bis- guanilhidrazona de metilglioxal; MGBG), pentostatina (2'-desoxicoformicina), semustina (metil-CCNU), teniposido (VM-26) o sulfato de vindesina.

En ciertas realizaciones, el agente terapeutico es un agente inmunoterapeutico, por ejemplo, Ributaxin, Herceptin, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATrAGeN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, gNi-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab o ImmuRAIT-CEA.

En ciertas realizaciones, el agente terapeutico es un agente antiviral. Ejemplos de agentes antivirales son: polisulfatos (PVAS), polisulfonatos (PVS), policarboxilatos, polioxometalatos, acido chicorico, zintevir, derivados de cosalano, biciclams (es decir, AMD3100), T-22, T-134, ALX-40-4C, CGP-64222, TAK-779, aZt (azidotimidina), ddl, ddC, d4T (dideshidrodidesoxitimidina), 3TC (3'-tiadidesoxicitidina), ABC y otros analogos de ddN (2',3'- didesoxinucleosido), nevirapina, delavirdina, efavirenz, emivirina (MKC-442), capravirina, tiocarboxanilida UC-781, aciclovir, valaciclovir, penciclovir, famciclovir, bromovinildesoxiuridina (BVDU, brivudia), cidofovir, adefovir dipivoxil, tenofovir disoproxil, ribavirina, valaciclovir, ganciclovir, formivirseno, foscarnet, EICAR (5-etinil-1 -p-D- ribofuranosilimidazol-4-carboxamida), acido micofenolico, neplanocina A, 3-desazaneplanocina A, 6'-C- metilneplanocina A, DHCeA (9-(trans-2',trans-3'-dihidroxiciclopent-4'-enil)adenina) o c3DHCeA (9-(trans-2',trans-3'- dihidroxiciclopent-4'-enil)-3-desazaadenina), como se describe, por ejemplo, en De Clercq J Pharmacol Exp Ther 2001,297: 1-10.

En algunas realizaciones, el tratamiento con ARNi que se describe en la presente comprende ademas el tratamiento con cidofovir. El cidofovir es un farmaco antiviral usado para tratar, por ejemplo, papilomatosis laringea inducida por HPV. El cidofovir tambien tiene actividad en celulas de carcinoma de cuello uterino. El cidofovir se puede administrar antes, simultaneamente o despues del tratamiento con ARNi (p. ej., ARNsi o ARNsh especificos para E6 o E7) basado en VLP. En algunas realizaciones, el cidofovir se administra simultaneamente con la molecula de ARNi y es aportado por las VLPs descritas en la presente.

Agentes terapeuticos adicionales son, por ejemplo, inhibidores de la transduccion de senales, por ejemplo, inhibidores de serina-treonina cinasas, inhibidores de Ras/MAPK, inhibidores del receptor de factor de crecimiento insulinico, inhibidores de EGFR y/o PDGFR, agentes antiangiongenicos como inhibidores de VEGF y/o VEGFR, moduladores e inhibidores de PARP, inhibidores de la ruta del erizo, agentes relacionados con la inhibicion de las rutas metabolicas, interferon beta, TDF o cPrPMEDAP.

En ciertas realizaciones, nanoparticulas de HPV que comprenden uno o mas agentes terapeuticos se administran a un sujeto infectado con HPV en una cantidad suficiente para tratar al sujeto. En ciertas realizaciones, el tratamiento de un sujeto que tiene infeccion por HPV con nanoparticulas de HPV que comprenden uno o mas agentes

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terapeuticos comprende ademas la administracion de un agente anticanceroso y/o antiviral. Estos agentes se pueden coadministrar en el mismo momento o en un momento diferente, por ejemplo antes o despues de la administracion de nanoparticulas de HPV que comprenden uno o mas agentes terapeuticos.

En ciertas realizaciones, nanoparticulas de HPV que comprenden uno o mas agentes terapeuticos se administran topicamente a un sujeto infectado con HPV. La administracion topica puede incluir administrar las nanoparticulas de HPV que comprenden uno o mas agentes terapeuticos en la forma de una composicion o formulacion farmaceutica adecuada. En ciertas realizaciones, la composicion o formulacion farmaceutica adecuada para la administracion topica puede ser un gel o una crema. El gel o la crema se pueden aplicar, en ciertas realizaciones, a membranas mocosas.

En ciertas realizaciones, nanoparticulas de HPV que comprenden uno o mas agentes terapeuticos se administran a tejidos epiteliales con superficies mucosas, por ejemplo para el tratamiento carcinomas de cuello uterino o colorrectal. En estas realizaciones, la composicion farmaceutica que comprende nanoparticulas de HPV comprende ademas una sustancia mucoadhesiva, tal como un polimero. Una sustancia mucoadhesiva es cualquier formulacion que se adhiera a una superficie mucosa que reviste una cavidad o superficie corporal incluyendo la superficie luminal del epitelio gastrointestinal, de el epitelio colorrectal y del cuello uterino. Las capas celulares epiteliales mucosas son ricas en una secrecion viscosa (moco). Los polimeros mucoadhesivos tienen la capacidad de adherirse a superficies del tejido mucoso humedas o mojadas tales como las del epitelio colorrectal o del epitelio del cuello uterino.

Se pueden utilizar muchos polimeros para formar geles, cremas u otras sustancias adhesivas, por ejemplo, un gel, tal como un hidrogel, organogel o gel termorreversible. Otros tipos de polimeros utiles incluyen, pero no se limitan a, termoplasticos y peliculas. El polimero puede ser, por ejemplo, poli(oxido de etileno), poli(etilenglicol), poli(alcohol vinilico), poli(vinilpirrolidina), poli(acido acrilico), poli(metacrilato de hidroxietilo), hidroxietiletilcelulosa, hidroxietilcelulosa y quitosano y mezclas de los mismos, polisacaridos (agar) o carboximetilcelulosa. En algunas realizaciones, los geles, las cremas u otras sustancias adhesivas pueden contener otros materiales que proporcionan un efecto mucoadhesivo. Estos materiales incluyen dioxido de titanio, dioxido de silicio y arcillas.

La composicion farmaceutica se puede aplicar directamente, por ejemplo como un gel, o puede estar comprendida dentro de un parche premontado u otro dispositivo que permite la yuxtaposicion del gel con los tejidos o las celulas que se van a elegir como diana (como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2005/051431 de Milner y cols.). Por ejemplo, se podria emplear un parche que comprende una capa bioadhesiva o una capa mucoadhesiva ligada a una capa de soporte (que comprende por ejemplo poli(cloruro de vinilo) o hidroxipropilcelulosa) de flexibilidad adecuada para ajustarse a la arquitectura tisular de la superficie del cuello uterino para el aporte terapeutico de las nanoparticulas de HPV que comprenden los agentes terapeuticos y opcionalmente agentes terapeuticos adicionales (tales como agentes anticancerosos y/o antivirales) a los tejidos del cuello uterino. Las propiedades fisicas del parche se deben retener idealmente durante de varias horas a uno o mas dias sin molestias para la paciente y sin desplazamiento del parche durante los movimientos corporales normales.

En algunas realizaciones, la nanoparticula de HPV que comprende uno o mas agentes terapeuticos se puede proporcionar en la forma de un gel tal como una preparacion de propilenglicol metilcelulosa para la aplicacion a una zona diana a la que se desea prestar atencion. Los geles se pueden proporcionar en un tubo, tal como 50 mg del ingrediente activo suspendido en el gel. Estos geles son particularmente convenientes para la aplicacion a la piel u otra superficie epitelial (por ejemplo la zona del cuello uterino o la anogenital).

En algunas realizaciones, el gel se distribuye desde un tubo aplicador alargado (tal como un aplicador rectal o vaginal), por ejemplo para aplicarlo rectalmente o intravaginalmente. Sin embargo, se debe apreciar que una composicion de la invencion se puede administrar en cualquier forma adecuada para alcanzar celulas infectadas con HPV u otras celulas diana, ya que la invencion no esta limitada a este respecto. Por ejemplo, las composiciones de la invencion se pueden proporcionar en la forma de supositorios, capsulas, cremas, geles, espumas, pulverizaciones, aerosoles y/o sobre la superficie de o impregnadas dentro de un material que se puede poner en contacto con una region diana (p. ej., oral, de la garganta, del cuello uterino, vaginal, anal, etc.) o cualquier combinacion de dos o mas de los mismos.

En algunas realizaciones, la nanoparticula de HPV que comprende uno o mas agentes terapeuticos tambien se puede aplicar como una crema o cristales simples o una pella que se puede aplicar sobre o insertada en la superficie epitelial o la piel con una aguja de trocar de calibre 16 para tratamientos a corto plazo.

Se debe apreciar que las composiciones de la invencion se pueden administrar a un sujeto infectado con HPV (p. ej., un sujeto diagnosticado o que se sabe que tiene una infeccion persistente por HPV de alto riesgo) a fin de tratar una displasia o un cancer y/o prevenir el desarrollo de una displasia o un cancer u otra afeccion asociada con una infeccion por HPV. Sin embargo, en algunas realizaciones, las composiciones de la invencion se pueden administrar (p. ej., profilacticamente) a un sujeto con una infeccion persistente por HPV de alto riesgo que se sospecha que tiene alto riesgo de ser infectado con otro serotipo de infeccion por HPV de alto riesgo.

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Cuando una composicion como la descrita en la presente se va a administrar a un individuo, la administracion es en una "cantidad profilacticamente eficaz" o una "cantidad terapeuticamente eficaz". La composicion final se administra segun sea necesario, lo que dependera de la enfermedad que se vaya a tratar y el tamano de la zona afectada. La administracion puede ser, por ejemplo, diaria, semanal o mensual.

El termino "cantidad eficaz" de una composicion se refiere a la cantidad necesaria o suficiente para que una composicion sola, o junto con dosis adicionales, consiga un efecto biologico deseado. La respuesta deseada, por supuesto, dependera de la afeccion particular que se trate. Combinado con las ensenanzas proporcionadas en la presente, al elegir entre los diversos compuestos activos y factores de ponderacion tales como la potencia, la biodisponibilidad relativa, el peso corporal del paciente, la gravedad de los efectos secundarios adversos y el modo de administracion preferido, se puede planear un regimen de tratamiento profilactico o terapeutico que no provoque una toxicidad sustancial y sin embargo sea totalmente eficaz para tratar al sujeto particular. La cantidad eficaz para cualquier aplicacion particular puede variar dependiendo de factores tales como la enfermedad o el estado adverso que se trate, el tamano del sujeto o la gravedad de la enfermedad o el estado adverso. Generalmente, se prefiere que se use una dosis maxima de los componentes individuales o las combinaciones de los mismos, esto es, la dosis segura mas alta segun el juicio medico razonable. Sin embargo, se entendera por los expertos normales en la especialidad que un paciente puede insistir en una dosis inferior o dosis tolerable por razones medicas, razones psicologicas o virtualmente por cualesquiera otras razones. Un experto normal en la especialidad puede determinar empiricamente la cantidad eficaz sin necesitar una experimentacion excesiva.

Para cualquier compuesto descrito en la presente, la cantidad terapeuticamente eficaz se puede determinar inicialmente a partir de modelos animales. Una dosis terapeuticamente eficaz tambien se puede determinar a partir de datos para compuestos que se sabe que exhiben actividades farmacologicas similares, tales como otras nanoparticulas. La dosis aplicada se puede ajustar basandose en la biodisponibilidad relativa y la potencia del compuesto administrado. Ajustar la dosis para alcanzar una eficacia maxima basandose en los metodos descritos anteriormente y otros metodos que son muy conocidos en la tecnica esta totalmente dentro de las capacidades del experto normal.

Se proporcionan composiciones para el uso en el tratamiento de un sujeto. El sujeto puede ser un mamifero. Segun se usa en la presente, los terminos "tratar", "tratado" o "tratamiento", cuando se usan con respecto a un estado adverso, tal como un trastorno o una enfermedad, por ejemplo, un cancer, displasia o neoplasma, se refiere a un tratamiento profilactico que incrementa la resistencia de un sujeto al desarrollo del estado adverso, o, en otras palabras, disminuye la probabilidad de que el sujeto desarrolle el estado adverso, asi como un tratamiento despues de que el sujeto haya desarrollado el estado adverso, a fin de combatir la enfermedad o evitar que el estado adverso empeore.

En ciertas realizaciones, las composiciones para el uso en el tratamiento descrito en la presente son adecuadas para cualesquiera sujetos infectados con HPV. En ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones para el tratamiento de verrugas genitales y/o verruga vulgar. En ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones para el tratamiento de displasia en fase inicial, CIN (II, III) y/o de carcinoma in situ. En ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones para el tratamiento de cancer de cuello uterino y todas las otras neoplasias relacionadas con HPV, tales como, por ejemplo, cancer labial, cancer de pene, carcinoma oral de celulas escamosas, cancer de cabeza y cuello o cancer de piel no melanomico. En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones para el tratamiento de infecciones concomitantes a una infeccion por HPV, por ejemplo infeccion por virus del herpes simple. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En ciertas realizaciones, el sujeto es de sexo femenino. De forma similar, aspectos de la invencion se refieren a composiciones para el uso en el tratamiento de infecciones de uno o mas de estos tejidos (p. ej., infecciones de tejido labial, del pene, oral, vaginal, del cuello uterino, cutaneo u otros).

En ciertas realizaciones, las nanoparticulas de HPV que comprenden L1 o L1 y L2 y que comprenden ademas uno o mas agentes terapeuticos pueden elegir como diana celulas infectadas con HPV en un sujeto infectado con HPV que tienen el potencial de convertirse en celulas cancerosas. En ciertas realizaciones, las nanoparticulas de HPV que comprenden L1 o L1 y L2 y que comprenden ademas uno o mas agentes terapeuticos puede elegir como diana celulas infectadas con HPV en un sujeto infectado con HPV que son celulas cancerosas.

En ciertas realizaciones, la administracion de nanoparticulas de HPV que comprenden uno o mas agentes terapeuticos a un sujeto infectado con HPV destruye celulas cancerosas infectadas con HPV en el sujeto. En ciertas realizaciones, la administracion de nanoparticulas de HPV que comprenden uno o mas agentes terapeuticos a un sujeto infectado con HPV provoca la apoptosis en las celulas cancerosas infectadas con HPV en el sujeto.

Habitualmente, el cancer de cuello uterino se desarrolla lentamente a lo largo del tiempo. Antes de que el cancer aparezca en el cuello uterino, las celulas del cuello uterino pasan a traves de cambios conocidos como displasia, en los que empiezan a aparecer celulas que no son normales en el tejido del cuello uterino. Mas tarde, las celulas cancerosas empiezan a crecer y a propagarse mas profundamente en el cuello uterino y en zonas circundantes.

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Se proporcionan composiciones para tratar a un sujeto que necesite tratamiento. Los sujetos que necesitan tratamiento son preferiblemente sujetos que tienen infeccion por HPV. En algunas realizaciones, los sujetos estan en una fase inicial de infeccion. En algunas realizaciones, los sujetos presentan displasia de cuello uterino en fase inicial. En algunas realizaciones, los sujetos presentan CIN. En algunas realizaciones, los sujetos presentan carcinoma de cuello uterino.

En algunas realizaciones, los metodos descritos comprenden administrar una nanoparticula de HPV que comprende L1 o L1 y L2 y que comprende ademas uno o mas agentes terapeuticos a un sujeto infectado con HPV en una cantidad suficiente para tratar la infeccion por HPV. En ciertas realizaciones, la nanoparticula de HPV se administra topicamente a una membrana mucosa. Los metodos comprenden ademas administrar agentes anticancerosos y/o antivirales. En algunas realizaciones, el uno o mas agentes terapeuticos son moleculas de ARNsi o moleculas que codifican ARNsi. En ciertas realizaciones el ARNsi se dirige contra E6 y/o E7 viral. En algunas realizaciones, el agente anticanceroso es gemcitabina. En algunas realizaciones, las VLPs se pueden usar para aportar agentes anticancerosos a un sujeto que tiene cancer.

En ciertas realizaciones, la nanoparticula de HPV que comprende uno o mas agentes terapeuticos se puede aplicar topicamente a o adyacente a un epitelio tal como el epitelio del cuello uterino o topicamente a o adyacente a una lesion epitelial tal como carcinoma epitelial del cuello uterino o anal. En algunas realizaciones, el uno o mas agentes terapeuticos son moleculas de ARNsi o moleculas que codifican ARNsi.

En algunas realizaciones, la nanoparticula de HPV que comprende uno o mas agentes terapeuticos se situa en una preparacion topica para la aplicacion a una superficie epitelial, por ejemplo mediante la aplicacion a un epitelio maligno, tal como un neoplasma urogenital, tal como neoplasma anal, vaginal o de cuello uterino, tal como CIN de cuello uterino.

En algunas realizaciones, la nanoparticula de HPV que comprende uno o mas agentes terapeuticos se prepara en una preparacion topica para la aplicacion a la epidermis, por ejemplo para el tratamiento de cancer de piel no melanomico.

En algunas realizaciones, el uno o mas agentes terapeuticos son moleculas de ARNsi o moleculas que codifican ARNsi.

En algunas realizaciones, se pueden usar una o mas composiciones de HPV de la invencion junto con un tratamiento actual para la infeccion por HPV y/o el cancer de cuello uterino. Por ejemplo, las composiciones de la invencion se pueden usar antes y/o despues de las tecnicas de tratamiento esbozadas en la Tabla 4.

La Tabla 4 esboza tecnicas comunes usadas actualmente para el tratamiento de CIN.

Tecnica

Descripcion Ventaja Desventaja

Crioterapia

Aplicacion de una sonda sobreenfriada (oxido nitroso o dioxido de carbono) directamente a la lesion del cuello uterino usando uno o mas ciclos de enfriamiento y descongelacion. Facilidad de uso, bajo coste y un bajo grado de complicacion. Invasiva. Provocacion de una descarga vaginal copiosa que dura semanas, falta de tejido para la histologia y el uso de una sonda que no se ajusta facilmente a las dimensiones de la lesion y el cuello uterino.

Ablacion laser con CO2

El tejido se vaporiza hasta una profundidad de al menos 7 mm para asegurar que las bases de las glandulas mas profundas se destruyan. Precisa y flexible. Invasiva. Calambres leves y descarga vaginal despues del tratamiento que dura de una a dos semanas. La tecnica es costosa, requiere un entrenamiento significativo y atencion a problemas de seguridad e impide la deteccion de la invasion oculta a traves de evaluacion histologica.

Conizacion escisional (bisturi frio)

Escision de una porcion en forma de cono del cuello uterino usando un escalpelo Da como resultado una muestra carente de artefactos termico que podrian complicar la determinacion histologica de muestras derivadas mediante Invasiva. La necesidad de anestesia general y un alto grado de complicaciones postquirurgicas (p. ej., hemorragia, infeccion,

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Tecnica

Descripcion Ventaja Desventaja

tecnicas de escision laser o electroquirurgicas. Importante para lesiones que se extienden al canal endocervical y adenocarcinoma sospechado in situ. estenosis del cuello uterino, incompetencia del cuello uterino).

Procedimiento de escision electroquirurgica con asa (LEEP)

Usa un asa de alambre a traves de la cual se hace pasar una corriente electrica a graduacion de potencia variables. La conformacion geometrica de la muestra extirpada esta determinada por la conformacion del asa, que se puede adaptar para ajustarse a la lesion. El enfoque de eleccion para tratar CIN II y III debido a su facilidad de uso y alto grado de exito. Se puede realizar facilmente en el consultorio usando anestesia local. Invasiva. Puede conducir a infeccion y hemorragia. El dano al estroma del cuello uterino puede conducir a estenosis o incompetencia del cuello uterino. La tecnica de LEEP da como resultado algun artefacto termico en todas las muestras extirpadas, aunque esto generalmente no impide la evaluacion histologica.

Estos tratamientos tienen grados de eficacia variables que van de 60-90%. Sin embargo, todos estos tratamientos son procedimientos invasivos que retiran o destruyen tejido del cuello uterino y a menudo estan asociados con complicaciones.

La patogenesis del cancer de cuello uterino esta muy relacionada con la infeccion persistente por papilomavirus humano (revisado en zur Hausen y cols 2002). Los papilomavirus son pequenos virus de ADN sin envuelta y su capside icosaedrica esta constituida por las proteinas L1 y L2, que encapsidan un ADN bicatenario circular cerrado de aproximadamente 8 kpb. La capside viral 50-60 nm de diametro contiene 72 pentameros de la proteina principal L1 y de 12 a 72 copias de la proteina secundaria de la capside L2.

Un subgrupo de 15 HPVs incluyendo los tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 y HPV-69 se ha denominado de alto riesgo. Genes de HPV de alto riesgo se encuentran casi en 100% de muestras tisulares de cancer de cuello uterino (Walboomers y cols., 1999). Se considera que la integracion del genoma viral y la posterior expresion de dos oncogenes virales principales, E6 y E7, son etapas criticas en el desarrollo de este cancer particular. E6 se une a proteina supresora de tumores p53 y la elige como diana para la degradacion mediada por ubiquitina (Munger y Howley, 2002). p53 orquesta la respuesta celular a diversos estimulos de estres, por ejemplo el dano genotoxico por radiacion ionizante o farmacos quimioterapeuticos. Dependiendo de cuan extensivo sea el dano, la activacion de p53 puede dar como resultado interrupcion del ciclo celular, activacion de la maquinaria de reparacion de ADN o apoptosis (Vousden y Lu, 2002). p53 no funcional o ausente permite una velocidad de division celular acelerada y promueve inestabilidad genetica, facilitando la transformacion maligna (Attardi, 2005). La expresion constante de ARNm de E6 y E7 por papilomavirus humanos (HPV) de alto riesgo suprime la funcion de p53 y pRb, respectivamente, y es esencial para el desarrollo del cancer de cuello uterino.

Adicionalmente, HPV 16 esta asociado con un pequeno subgrupo de tumores de cabeza y cuello, principalmente del tejido del anillo de Waldeyer. Se ha demostrado que un espectro de tipos de HPV, incluyendo tipo de HPV de bajo riesgo, esta presente en lesiones malignas de otras zonas de la cabeza y el cuello, incluyendo canceres orales asi como canceres esofagicos (de Villers y cols).

El cancer de piel no melanomico (carcinomas de celulas basales y escamosas) es con mucho el cancer mas frecuente entre la poblacion caucasiana en todo el mundo. Estos canceres se producen principalmente en zonas expuestas al sol, lo que apunta a la irradiacion UV como un factor medioambiental importante en la patogenesis de esta enfermedad. Ademas, se han asociado varios cambios geneticos, incluyendo mutaciones en el gen celular p53. Varios tipos de HPV del genero beta-papilomavirus parecen estar asociados con el carcinoma de celulas escamosas de la piel. Esto incluye tipos de HPV cutaneo (HPV 20, HPV 38 y HPV 27) que son bien activados o bien suprimidos por UV.

Segun esto, aspectos de la invencion se pueden usar para tratar afecciones distintas al cancer de cuello uterino asociadas con infeccion por HPV. Por ejemplo, se pueden usar aspectos de la invencion para tratar canceres de cabeza y cuello (p. ej., canceres orales y/o esofagicos) asociados con la infeccion con HPV. Sin embargo, se debe apreciar que las particulas basadas en HPV de la invencion se pueden usar como vehiculos de aporte general para tratar enfermedades o afecciones mucosas independientemente de que esten provocadas por infeccion con HPV. Segun esto, las composiciones de la invencion se pueden usar para tratar otras infecciones tales como infeccion por HSV o HIV y/o, por ejemplo, infecciones bacterianas tales como Gardnerella vaginalis, Neisseria gonorrhoeae; una

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infeccion fungica tal como infecciones por Candida Albicans, o infecciones parasitarias tales como el parasito Trichomonas vaginalis, u otras infecciones que son infecciones comunes en el tracto genital.

En algunas realizaciones, una nanoparticula de HPV que comprende uno o mas agentes terapeuticos se puede usar para tratar infeccion persistente por HPV de alto riesgo, displasia de cuello uterino, lesiones precancerosas CIN I, II, III (CIN2/3, VIN2/3) y/o carcinoma in situ.

En algunas realizaciones, una nanoparticula de HPV que comprende uno o mas agentes terapeuticos se puede usar para tratar verrugas genitales, cancer de piel no melanomico, cancer de cabeza y cuello, cancer orofaringeo, cancer vulvar, cancer vaginal, cancer de pene y/o cancer anal.

Las composiciones de la invencion se pueden administrar a sujetos de sexo femenino o masculino dependiendo de la zona de tratamiento.

En algunas realizaciones, las composiciones que comprenden VLP basada en HPV se pueden usar para el aporte de agentes terapeuticos a celulas epiteliales, por ejemplo a la piel. En algunas realizaciones, las composiciones se pueden administrar para tratar infecciones de la epidermis provocadas por bacterias grampositivas que incluyen, por ejemplo, Staphylococcus, Micrococcus y Corynebacterium sp., Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes, que provocan, por ejemplo, enfermedades de la piel, tales impetigo y ectima. En algunas realizaciones, las composiciones que comprenden VLP basada en HPV se pueden usar para tratar cancer de piel no melanomico.

En algunas realizaciones, las particulas de HPV modificadas, que se describen en la presente, que comprenden uno o mas agentes terapeuticos se pueden administrar sistemicamente (p. ej., i.v.) para el tratamiento de tumores, p. ej., cancer ovarico, cancer de mama, carcinoma oral de celulas escamosas, cancer de cabeza y cuello, NSCLC, SCLC, cancer de vejiga urinaria o cancer de prostata. En algunas realizaciones, las celulas cancerosas que exponen receptores para HPV VLPs y particulas de HPV modificadas, como se describe en la presente, se pueden usar para elegir como diana estas celulas cancerosas. En algunas realizaciones, las particulas de HPV modificadas se pueden alterar adicionalmente para exponer agentes de eleccion de dianas que son especificos para una celula cancerosa.

Ejemplos

Ejemplo 1: Inhibicion del crecimiento de celulas de cancer de cuello uterino mediante VLPs de HPV empaquetadas con ARNshs de oncoproteina de HPV

Los principales objetivos de este estudio eran construir un sistema de expresion de ARNsh basado en HPV y explorar la interferencia de ARN mediada por HPV para el silenciamiento eficaz de los genes E6 y E7. Los presentes inventores muestran aqui que los pseudoviriones de HPV que expresan ARNsh de E6 y E7 en celulas de cancer de cuello uterino daban como resultado el agotamiento de la expresion de E6 y E7 y la supresion del crecimiento de celulas cancerosas, sugiriendo que las VLP de HPV son valiosas para aportar plasmidos que codifican ARNsh para el tratamiento del cancer de cuello uterino.

Materiales y metodos

Lineas celulares, cultivo celular y transfeccion celular

Las lineas celulares de carcinoma de cuello uterino humano CaSki (ATCC CRL-150) y C33-A (ATCC HTB-31; American Type Culture Collection) se hicieron crecer a 37°C en una atmosfera humidificada con 5% de CO2 en DMEM complementado con 10% de FCS (Invitrogen), 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de piruvato sodico. Las celulas CaSki se infectaron mediante HPV-16 y expresan E6 y E7, mientras que las celulas C33-A eran negativas con respecto a HPV. La linea celular murina TC1 (ATCC CRL-2785) se cotransformo mediante las oncoproteinas E6/E7 de HPV-16 y c-Has-Ras. Estas celulas se hicieron crecer en RPMI 1640 con 10 mmol/l de HEPES, 1 mmol/l de piruvato sodico complementado con 2 mmol/l de aminoacidos no esenciales y 10% de FCS. Las celulas 293FT murinas (Invitrogen) se derivaron de la linea celular 293T (ATCC CRL 11268). Expresan en antigeno T grande de SV40 y se cultivaron en presencia de 500 pg/ml de geneticina (Invitrogen).

Un dia antes de la transfeccion, las celulas se tripsinizaron y se sembraron en placas de seis pocillos. A continuacion, las celulas se transfectaron con plasmidos que codifican ARNsh usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), pseudoviriones de HPV-31 o lentivirus que codifican ARNsh. Las celulas se recogieron para el analisis en diversos momentos segun se indica en los resultados.

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Diseno y produccion de plasmidos que expresan ARNsh especifico de E6 y E7

A fin de producir el clon de entrada pENTR/U6, se uso el vector de entrada BLOCK-iT U6. En primer lugar, los presentes inventores disenaron y sintetizaron oligonucleotidos de ADN complementarios (Invitrogen), que contenia cada uno cuatro salientes nucleotidicos necesarios para la clonacion direccional. Secuencias complementarias de ARNsh correspondientes a ARNsi de E6 y E7 se describen en la Fig. 1B. Las secuencias de E6-2 y E7-2 se seleccionaron usando el software "disenador de ARNsh" de Invitrogen. Las secuencias de E6-1 y E7-1 eran las descritas por Jiang y Milner (Oncogene 2002; 21:6041-8). Los presentes inventores usaron LacZ y la secuencia de ARNsh de control descritos por Jiang y Milner (Oncogene 2002; 21:6041-8) como controles. Todas las secuencias se confirmaron mediante BLAST con respecto a la especificidad.

Cantidades iguales de los oligonucleotidos de cadena directa e inversa se reasociaron para generar los oligonucleotidos bicatenarios mediante incubacion en tampon de reasociacion a 95°C durante 4 min. Despues de generar oligonucleotidos bicatenarios, se ligaron en el vector pENTER/U6 (Invitrogen). Los plasmidos se secuenciaron, se propagaron y se purificaron usando el Qiagen plasmid midi kit (Qiagen, Francia). Los clones de entrada se usaron para analisis de interferencia de ARN transitorios.

Produccion de pseudoviriones de HPV que expresan ARNsh de E6 y E7 HPV-31

Se expresaron VLPs en celulas Sf21 infectadas con un baculovirus recombinante que codifica los genes L1 y L2 de HPV-31 optimizados codonicamente (Fleury y cols., Clin Vaccine Immunol 2008; 15:172-5). Las celulas se incubaron a 27°C durante 72 h (Touze y cols., Nucleic Acids Res 1998; 26:1317-23; Bousarghin y cols., J Clin Microbiol 2004; 40:926-32). Las celulas se recogieron mediante centrifugacion, se resuspendieron en PBS que contenia 0,5% de NP40 y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 30 min. A continuacion, los lisados celulares se centrifugaron a 14.000 x g durante 15 min a 4°C. La fraccion nuclear se resuspendio adicionalmente en PBS y se trato con ultrasonidos. A continuacion, la fraccion se cargo en la parte superior de un gradiente de cloruro de cesio preformado y se centrifugo en el equilibrio en un rotor Beckman SW28 (24 h, 27.000 rpm, 4°C). Las fracciones positivas a L1 se reunieron en pBs y se centrifugaron (rotor SW28, 3 h, 28.000 rpm, 4°C). Las VLPs se resuspendieron en 0,15 mol/l de NaCl.

Se generaron pseudoviriones como se describe previamente con algunas modificaciones (Touze y cols., Nucleic Acids Res 1998; 26:1317-23). Brevemente, se incubo 1 pg de VLPs de HPV-31 en 50 mmol/l de tampon de Tris-HCl (pH 7,5) que contenia 20 mmol/l de DTT y 1 mmol/l de EGTA durante 30 min a temperatura ambiente. En esta fase, plasmidos de expresion que codifican ARNsh, luciferasa o proteina fluorescente verde (100 ng) se anadieron a las VLPs perturbadas. A continuacion, la preparacion se diluyo con concentraciones crecientes de CaCl2 hasta una concentracion final de 5 mmol/l, con o sin ZnCl2 (10 nmol/l). Se uso ZnCl2 debido a que se ha presentado que el ZnCl2 potencia el montaje de capsomeros de HPV en VLPs (Hanslip y cols., Biotechnol Prog 2006; 22:554-60). A continuacion, los pseudoviriones se dializaron contra 1 x PBS durante la noche y se almacenaron a 4°C antes del uso.

La presencia de capsomeros, VLPs y pseudoviriones se analizo mediante microscopia electronica. Con este proposito, las muestras se aplicaron a rejillas revestidas de carbono, se tineron negativamente con acetato de uranilo al 1,5% y se observaron con una ampliacion nominal de x 50.000 usando un microscopio electronico JEOL 1010.

Produccion de lentivirus que expresan ARNh de E6 y E7s

La produccion de lentivirus se realizo usando el sistema de expresion de interferencia de ARN lentiviral BLOCK-iT (Invitrogen). Brevemente, se realizo una reaccion de recombinacion LR entre el plasmido pENTR/U6 que codifica ARNsh de E7 y plenti6/BLOCK-iTDEST para generar la construccion de expresion plenti6/BLOCK-iT-DEST. El lentivirus se produjo al transfectar celulas 293FT con 9 pg de la ViraPower Packaging Mix y 3 pg de ADN del plasmido de expresion plenti6/BLOCK-iT-DEST usando LipofectAMINE 2000 (Invitrogen). Los sobrenadantes de cultivo celular se recogieron a las 48 h despues de la transfeccion. Los titulos de lentivirus que expresan ARNsh de E7 se determinaron al infectar celulas TC1 con diluciones en serie de lentivirus. El titulo de la solucion madre lentiviral era 1 x 106 TU/ml. Las celulas TC1 transducidas establemente se seleccionaron al poner las celulas bajo seleccion con blasticidina (10 pg/ml).

Analisis de niveles de ARN de E6 y E7m mediante PCR de transcripcion inversa

Celulas CaSki (106) transfectadas con pseudoviriones de ARNsh se lavaron con 1 x PBS y a continuacion el ARNm se aislo usando el Dynabeads mARN direct kit (Dynal Francia SA segun las instrucciones del fabricante. Se sintetizaron ADNcs monocatenarios a partir de ARNms mediante transcripcion inversa durante 1 h a 42°C en 1x tampon de incubacion que contenia 250 pmol/l de cada trifosfato de desoxinucleotido, 5 pmol/l de oligo(dT) 20, 25

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unidades de inhibidor de RNasa y 20 unidades de transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (Roche Diagnostics). Las muestras de ADNc se sometieron a amplificacion por PCR con cebadores directo e inverso especificos para E6, E7 de HPV-16 o gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). los cebadores usados eran E6 directo, 5' CACCAAAAGAGAACTGCAATGT 3' (SEQ ID NO: 31); e inverso, TTGCTGTTCTAATGTT GTTCCA (SEQ ID NO: 32); E7 directo, 5' GGAGATACACCTACATTGCATGA 3' (SEQ ID NO: 33); e inverso, GGGGCACACAATTCCTAGTG (SEQ ID NO: 34); gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa directo, 5' ACAGTCCATGCCATCACTG CC 3' (SEQ ID NO: 35); e inverso, 5' GCCTGCTTCACCACCTTCTTG 3' (SEQ ID NO: 36). La PCR se establecio con 200 gmol/l de trifosfato de desoxinucleotido, 2 gmol/l de cada cebador especifico y 1 unidad de polimerasa de Taq (Invitrogen) en un termociclador GeneAmp 9700 (Pekin Elmer Applied Biosystems, Francia) programado para 25 ciclos a 50°C, 55°C o 62°C para E7, E6 y GAPDH, respectivamente. Los productos de PCR se visualizaron sobre geles de agarosa al 2% y se analizaron con el sistema GelDoc (Bio-Rad).

Deteccion de p53

Las celulas (2 x 105) se lavaron con PBS 1 x, se disolvieron directamente en 50 gl de tampon de carga en gel de SDS y se incubaron durante 10 min. a 95°C. Se separaron quince microlitros de cada muestra sobre geles de SDS al 12%-PAGE. Las proteinas separadas se electrotransfirieron sobre membrana de nitrocelulosa para la deteccion de anticuerpos. Se detecto proteina p53 humana usando el anticuerpo monoclonal DO-1 (Santa Cruz Biotechnologies) y se detecto p-actina endogena usando un anticuerpo policlonal (Sigma). Los anticuerpos unidos se visualizaron usando un anticuerpo anti-IgG de raton conjugado a fosfatasa alcalina (Sigma) con nitroazul de tetrazolio y fosfato de bromocloroindolilo (Sigma) como sustratos.

Deteccion de la actividad de p-galactosidasa y luciferasa

La deteccion de p-galactosidasa en celulas CaSki,C33-A y TC1 transfectadas con plasmido de p-galactosidasa y ARNsh de LacZ se llevo a cabo en celulas lavadas con PBS 1x y fijadas con PBS que contenia 2% de formaldehido y 0,2% de glutaraldehido. Despues de 10 min a temperatura ambiente, las celulas se lavaron y se incubaron con solucion de revelacion de p-galactosidasa (2 mmol/l de MgCl2, 4 mmol/l de ferrocianuro potasico, 4 mmol/l de ferricianuro portasico y 1 mg/ml de X-gal). Las celulas azules que mostraban actividad de p-galactosidasa se contaron. La deteccion de la expresion del gen de luciferasa se midio mediante un ensayo de luminiscencia (Firefly luciferase assay kit; Interchim). La luminiscencia se integro a lo largo de 10 s (Victor2, Wallac; Perkin-Elmer) y los resultados se expresaron como recuentos por segundo (cps) por pocillo.

Ensayos de viabilidad celular

Celulas transfectadas y no transfectadas se tripsinizaron y a continuacion se sembraron en placas de 96 pocillos. Se anadio bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (0,5 mg/ml) a celulas sembradas en 100 gl de DMEM sin FCS y se incubaron a 37°C. Despues de 2 h, se anadieron 100 gl de isopropanol y 0,4 mmol/l de HCl y la y absorbancia se midio a 540 nm. La viabilidad celular se determino como la relacion entre la absorbancia obtenida en pocillos de prueba y la absorbancia obtenida en celulas no tratadas.

Ensayos de apoptosis

La apoptosis se detecto usando el anti-ssADN/APOSTAIN (Abcys). Brevemente, celulas TC1 (2 x 105) desarrolladas en placas de seis pocillos se transdujeron con 10 gg de pseudoviriones que contenian 1 gg de ARNshs de E6-1, E6- 2, E7-1, E7-2 y ARNsh de control. Despues de 2 dias de infeccion, los sobrenadantes se recogieron y las celulas se fijaron con etanol enfriado con hielo. Despues de la centrifugacion, 5 x 105 celulas fijadas se resuspendieron en 250 gl de formamida durante 5 min a temperatura ambiente y a continuacion se incubaron a 75°C durante 10 min. Despues de esta etapa, se anadieron 2 ml de PBS que contenia 1% de leche desnatada en polvo. Despues de 15 min, las celulas se centrifugaron y la pella se resuspendio en 100 gl de PBS que contenia anticuerpo monoclonal anti-ssADN F7-26. Despues de 15 min de incubacion y centrifugacion, la pella celular se resuspendio en 100 gl de PBS que contenia anti-IgM de raton conjugado por fluorescencia (20 gg/ml en PBS y 1% de leche desnatada en polvo). Despues de 15 min de incubacion, las celulas se enjuagaron, se centrifugaron y se resuspendieron en 500 gl de PBS que contenia 1 gg/ml de yoduro de propidio. Los controles negativos se trataron con IgM de raton en lugar del anticuerpo primario especifico. A continuacion, las celulas se analizaron usando un citometro de flujo Coulter XL y con el software Expo32 (Beckman Coulter, Francia).

La apoptosis tambien se investigo usando el estuche de ensayo Caspase-Glo 3/7 (Promega). Las celulas se transdujeron con diferentes ARNsh. Dos dias despues de la transduccion, 2 x 105 celulas se transfirieron a cada pocillo de una placa de 96 pocillos con paredes blancas (Perkin-Elmer) y se anadieron 100 gl de un sustrato luminogenico de caspasa. Despues de 1 h de incubacion a temperatura ambiente, se leyo la luminiscencia de las placas se leyeron en un luminometro Luminoscan Ascent (Thermo Electron).

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Evaluacion de los efectos antitumorales en un modelo de raton

Para investigar los efectos de pseudoviriones de ARNsh de E6 y E7 sobre la tumorigenicidad de celulas TC1, seis grupos (cinco ratones/grupo) de ratones C57BL6 hembra de 6 semanas de edad (CERJ, Le Genest St Isle, Francia) fueron inoculados subcutaneamente con celulas TC1 (2 x 105). Antes de la administracion a los ratones, las celulas TC1 se transfectaron con pseudoviriones (10 pg de VLP/1 pg de ARNsh de E6-1 o E7-1), con un lentivirus que codifica ARNsh de E7-1 (multiplicidad de infeccion, 50), o con 1 pg de ARNsh de E7-1 con Lipofectamine. Un grupo de control recibia celulas TC1 sin tratamiento (simulacion) y un grupo de control recibia celulas TC1 tratadas con VPLs de HPV. Despues de 3 semanas, los ratones fueron sacrificados y los tumores se extirparon y se pesaron.

La eficacia antitumoral de los pseudoviriones que codifican ARNsh de E7 tambien se investigo en ratones con tumores de celulas TC1. Dos grupos (10 ratones/grupo) de ratones C57BL6 hembra de 6 semanas de edad se inocularon s.c. con celulas TC1 (2 x 105). Siete dias despues de la inoculacion, se habian formado tumores palpables en todos los ratones y se inyectaron directamente en cada tumor pseudoviriones que contenian ARNsh a una dosis de 20 pg de VLP/ 2 pg de E7-1 o 20 pg de VLP/2 pg de ARNsh de control cada 2 dias durante 2 semanas. Despues de 3 semanas, los ratones fueron sacrificados y los tumores se extrajeron y se pesaron. Todos los estudios en animales estaban aprobados por el comite regional de etica con animales (CREEA).

Analisis estadistico

Los datos se expresaron con la media F EE. El analisis estadistico se realizo usando la prueba de la t de Student y P < 0,05 se consideraban significativas.

Resultados

Diseno de ARNshs dirigidos a las proteinas E6 y E7 de HPV-16

Se disenaron seis secuencias para promover el silenciamiento especifico. Dos de estas secuencias, es decir, siE6-1 (138-159) y siE7-1 (101-119), ya han sido descritas por Jiang y Milner (Oncogene 2002; 21:6041-8) como ARNsi, otras dos secuencias, siE6-2 (421-441) y siE7-2 (148-167), correspondientes a E6 y E7, respectivamente, se seleccionaron usando el software disenador de ARNsh de Invitrogen y dos secuencias (ARNsh de LacZ y ARNsh de control de Jiang) se usaron como controles (Fig. 1 y Tabla 3). Estas secuencias se reasociaron y se insertaron en pENTR/U6.

Para investigar la eficacia del sistema de pseudoviriones para el aporte de ARNsh, celulas TC1, CaSki y C33-A se transfectaron con un plasmido que codifica hgalactosidasa, con o sin del plasmido pENTR/U6 LacZ que codifica ARNsh de LacZ. En presencia de ARNsh de LacZ, se observaba una disminucion en la expresion de h- galactosidasa en todas las lineas celulares investigadas con 80%, 83% y 81% de inhibicion en celulas TC1, CaSki y C33-A, respectivamente.

Produccion de pseudoviriones que codifican ARNsh mediante el ensamblaje de capsomeros de L1 en VLPs en presencia de ZnCl2

Se usaron VLPs de HPV para encapsidar plasmidos que codifican ARNshs de E6 y E7. Para generar estos pseudoviriones, los presentes inventores usaron el metodo de desensamblaje-reensamblaje que se describe previamente, con la modificacion de anadir ZnCl2 durante el procedimiento de reensamblaje. Brevemente, VLPs purificadas se incubaron en un tampon que contenia EGTA y DTT y, en estas condiciones, las VLPs se desagregaron completamente en estructuras que se asemejaban a capsomeros. A continuacion, se anadio plasmido de ARNsh de E7-1 y la preparacion se diluyo en un tampon que contenia 1% de DMSO y 5 mmol/l de CaCl2 con o sin ZnCl2 (10 nmol/l) a fin de replegar las VLPs. La presencia de ZnCl2 incrementaba el reensamblaje de capsomeros en estructuras que se asemejaban a pseudoviriones. En presencia de ZnCl2, los capsomeros tambien se ensamblaban en estructuras tubulares de 24 nm de diametro con longitudes que variaban de 120 a 280 nm. El papel del ZnCl2 en la produccion de pseudoviriones que contienen un plasmido que codifica luciferasa se evaluo al comparar la capacidad de las preparaciones de pseudoviriones obtenidas con o sin ZnCl2 para transducir celulas 293FT. La actividad de luciferasa de 9,981 cps se obtuvo con pseudoviriones generados en presencia de ZnCl2, mientras que solamente era 845 cps con pseudoviriones obtenidos sin ZnCl2. Asi. se observaba un incremento de 12 veces en la actividad de luciferasa cuando los capsomeros de L1 se reensamblaban en VLPs en presencia de ZnCl2 (Fig. 2). Ademas, se investigo la capacidad de estos pseudoviriones de HPV para transducir celulas CaSki, C33-A y TC1. Estos pseudoviriones transducian las lineas celulares investigadas (Fig. 2). Sin embargo, se observaba un nivel superior de expresion de luciferasa en celulas TC1 (7.990 cps, recuentos por segundo) que en celulas CaSki (5.232 cps) o celulas C33 (4.016 cps). En ausencia de pseudoviriones, se observaba una actividad de luciferase de 57, 84, 51 y 41 cps en celulas 293FT, TC1, CaSki y C33, respectivamente.

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La transduccion de celulas CaSki mediante pseudoviriones de ARNsh de E6 y E7 inducia un incremento del silenciamiento genico y una inhibicion del crecimiento celular

La eficacia de la transferencia genica de pseudoviriones en celulas se investigo usando pseudoviriones que contenian un plasmido que codifica proteina fluorescente verde. Ochenta por ciento de las celulas TC1 expresaban proteina fluorescente verde segun se detectaba mediante citometria de flujo (datos no mostrados). Los presentes inventores evaluaron la eficacia de ARNshs de E6 y E7 al ensayar su capacidad para interferir con la expresion de proteina. Con este proposito, los presentes inventores obtuvieron en primer lugar los cADNs de longitud completa para E6 y E7 (y GAPDH como control) mediante PCR con transcripcion inversa. Los resultados mostraban que el ARNm de E7 disminuia en presencia de ARNsh dirigido contra E7, obteniendose un alto nivel de interferencia con la secuencia de Jiang, mientras que se observaba una disminucion inferior con la secuencia de E7-2 y no se observaba disminucion con ARNsh de control (Fig. 3A). Se obtuvieron resultados similares para la deteccion de mARN de E6 en celulas tratadas con ARNsh de E6. Se observo una ligera disminucion en el mARN de E6 cuando las celulas se trataban con ARNsh de E7.

Debido a que E6 se expresa en celulas CaSki a niveles demasiado bajos para ser detectados mediante analisis de transferencia Western usando los anticuerpos disponibles, segun se presenta por Gu y cols. (Cancer Gene Ther 2006; 13:1023-27) y Yamato y cols. (Cancer Gene Ther 2008; 15:140-53), la actividad de ARNsh de E6 se cribo basandose en su capacidad para restaurar la expresion de p53. Los resultados de los presentes inventores mostraban que el nivel de p53 detectado por transferencia Western se incrementaba despues de la expresion de ARNsh de E6-1 a lo largo de 24 horas (Fig. 3B) y disminuia con el tiempo. En presencia de ARNsh de E7-1, E7-2 y E6-2, el incremento en la expresion de p53 era inferior que el observado con ARNsh de E6-1. No se detecto expresion de p53 cuando las celulas se trataban con ARNsh de LacZ. Estos resultados sugieren que el nivel de proteina E6 se reducia mediante el tratamiento con ARNsh y que p53 no solo se acumulaba sino que tambien era funcionalmente activa.

Para verificar si la inhibicion de la expresion de E6 y E7 podia inducir una reduccion en la viabilidad celular, despues de 5 dias de cultivo, se uso una prueba de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, midiendo la absorbancia a 540 nm, en celulas CaSki y TC1 transfectadas y no transfectadas con ARNsh. Los hallazgos de los presentes inventores mostraban que el silenciamiento de E6 y E7 inducia una disminucion en la viabilidad celular (Fig. 4). Esta reduccion era mayor con ARNsh de E7 (70% de inhibicion del crecimiento celular). No se observaba inhibicion del crecimiento celular cuando celulas de cuello uterino negativas a HPV tales como C33-A se transfectaban con el mismo ARNsh, indicando que la inhibicion del crecimiento celular por ARNshs de E6 y E7 era especifica. La reduccion en el crecimiento celular era similar para E6-1 y E6-2 y para ARNshs de E7-1 y E7-2.

La transduccion de celulas TC1 mediante pseudoviriones de ARNsh de E6 y E7 no inducia la apoptosis

Se llevo a cabo un ensayo de apoptosis basado en el incremento de sensibilidad de ADN en celulas apoptoticas a la desnaturalizacion termica para investigar si la muerte celular se debia a apoptosis. En este ensayo, el ADN se desnaturaliza al calentar en presencia de formamida y se tine con anticuerpo monoclonal F7-26 especifico para ADNss. La citometria de flujo no revelaba un numero significativamente incrementado de celulas apoptoticas con celulas TC1 transfectadas con ARNsh de E6-1, E6-2, E7-1 y E7-2 en comparacion con celulas transfectadas con ARNsh de control. Para ensayar adicionalmente la existencia o ausencia de apoptosis, tambien se realizo un ensayo de caspasa que mide la actividad enzimatica de caspasas 3 y 7 sobre celulas TC1 transducidas mediante pseudoviriones de ARNsh de E6 y E7. No se observo un incremento en la actividad de caspasa con ARNshs ni de E6 ni de E7. Los resultados sugerian que los ARNshs de E6 y E7 inducen la reduccion en el crecimiento de celulas TC1 pero no a traves de muerte celular apoptotica.

La transfeccion de celulas de TC1 in vitro mediante pseudoviriones de ARNsh de E6 y E7 inducia la reduccion en el crecimiento tumoral en ratones

La eficacia de los pseudoviriones de ARNsh de E6 y E7 tambien se investigo in vivo usando el modelo de TC1/ratones. Se usaron pseudoviriones de HPV que codifican ARNsh de E6-1 y E7-1, VLP de HPV sola y un lentivirus que codifica ARNsh de E7-1 para transducir celulas TC1 in vitro. Despues de 24 horas, celulas TC1 no transfectadas y transfectadas se inyectaron s.c. en ratones C57BL6.

Los ratones fueron sacrificados 21 dias mas tarde y los tumores extirparon y se pesaron. En ratones de control (simulacion y VLP sola), el peso del tumor variaba de 1,09 a 2,12 g (media, 1,64 g). No se observo reduccion en el peso del tumor con celulas TC1 transfectadas con ARNsh de E7-1 y Lipofectamine (media, 1,61 g). Se observo una reduccion de 42% en el peso medio de los tumores con pseudoviriones de HPV de E6-1 (P < 0,10) y una reduccion de 70% a 87% en el tamano medio con el lentivirus los pseudoviriones de lentivirus de E7-1 y HPV de E7-1, respectivamente (P < 0,05 y P < 0,001; Fig. 5).

La transduccion intratumoral de tumores de celulas TC1 mediante pseudoviriones de ARNsh de E7 inducia una reduccion en el crecimiento tumoral en ratones

Tambien se investigo la eficacia in vivo de los pseudoviriones que codifican ARNsh de E7 con respecto a su capacidad para reducir el crecimiento tumoral en ratones con tumores de celulas TC1. Se selecciono para estos 5 estudios ARNsh de E7-1 basandose en su eficacia in vitro. Los pseudoviriones de ARNsh de E7-1 se inyectaron directamente en los tumores cada 2 dias a lo largo de 2 semanas. Despues de 1 semana, no se observo reduccion en el crecimiento tumoral en ratones tratado con ARNsh de E7-1 en comparacion con los ratones de control (Fig. 6A). A continuacion, se observo claramente una disminucion en el crecimiento tumoral durante la segunda semana de tratamiento, con un peso medio del tumor de 1,05 g en ratones tratados con ARNsh de control y 0,49 g en 10 ratones tratados con los pseudoviriones de ARNsh de E7-1 al final de la segunda semana (P = 0,045).

Ejemplo 2: Identificacion de epitopos de conformacion neutralizadores sobre proteina principal de la capside de HPV 31 e implicaciones funcionales

El principal objetivo de este estudio era caracterizar la estructura antigenica y los mecanismos de neutralizacion de pseudoviriones de HPV31. Una de las cuestiones es la localizacion exacta de los epitopos que inducen anticuerpos 15 neutralizadores de HPV y contribuyen a la proteccion contra la infeccion debido a la interaccion con la capside viral.

Esta bien establecido ahora que los epitopos de conformacion son responsables de la neutralizacion de la produccion de anticuerpos (Christensen y cols., Virology 1994; 205:329-35; Rose y cols., J Gen Virol 1994; 75:207579; White y cols., J Virol 1998; 72:959-64; White y cols. J Virol 1999; 73:4882-89; Giroglou y cols. J Virol 2001; 20 75:1565-70). Debido a que los epitopos de HPVs neutralizadores dependen de la conformacion, no se han

caracterizado completamente su composicion de aminoacidos y localizacion superficial.

Estos estudios son utiles en el diseno de vacunas y en la investigacion de interacciones virus-celula. Ademas, una comprension de la estructura antigenica del HPV es crucial para disenar vectores de terapia genica derivados de 25 HPV con inmunogenicidad reducida. Un requisito previo para generar estos vectores es una mayor comprension de los determinantes virales que provocan la neutralizacion de respuesta inmunitarias, para disenar vectores de pseudoviriones con eliminacion o mutacion con los epitopos de conformacion responsables de la produccion de anticuerpos neutralizadores. Estos vectores mutados con inmunogenicidad reducida permitiran la readministracion de estos vectores sin una perdida drastica de la eficacia transgenica debido a la induccion de anticuerpos 30 neutralizadores contra el vector.

Materiales y metodos

Anticuerpos monoclonales para HPV31

Los MAbs para HPV31 usados en este estudio eran como los previamente producidos y caracterizados (Fleury y cols., Arch Virol 2006; 151:1511 -23; Fleury y cols., Clin Vaccine Immunol 2008; 15:172-75). Los MAb para H31 .D24 35 reconocen un epitopo lineal comun que se ha identificado con el bucle FG (aminoacidos 271-279) y los MAb para H31.F7 reconocen un epitopo de neutralizacion cruzada de conformacion que se ha identificado con la parte N- terminal del bucle de FG (Fleury y cols., Arch Virol 2006; 151:1511-23). Otros trece MAbs reconocen epitopos neutralizadores de conformacion especificos. Ademas, el anticuerpo monoclonal CamVir-1 (CV), que reconoce un epitopo lineal comun sobre el bucle DE (Carpentier y cols., J Med Virol 2005; 77:558-65), se uso como control. MAbs 40 investigados usando el metodo de exposicion en la superficie de celulas bacterianas se purificaron de ascitis en bruto mediante precipitacion salina con sulfato amonico (33% final), a continuacion se dializaron contra solucion salina tamponada con fosfato (PBS) seguido por cromatografia de afinidad sobre proteina AG/Sepharose (Pierce; Immunopure IgG purification kit).

Neutralizacion de pseudovirus

45 La capacidad neutralizadora de cada anticuerpo monoclonal se determino previamente (Fleury y cols., Arch Virol 2006; 151:1511-23; Fleury y cols., Clin Vaccine Immunol 2008; 15:172-5). Ademas, los presentes inventores investigaron si la neutralizacion tenia lugar antes o despues de la union de los pseudoviriones a la superficie celular. Las pruebas se realizaron con pseudoviriones de HPV31 producidos en celulas 293FT y se realizaron ensayos de neutralizacion usando celulas Cos-7 cultivadas en medio de Eagle modificado de Dulbecco completo (Invitrogen, 50 DMEM complementado con 10% de FCS, 100 IU/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina) se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h a 37°C. Se realizaron ensayos que median la neutralizacion antes de la union de los pseudoviriones a la superficie celular al anadir los pseudoviriones de HPV31 previamente preincubados con MAbs a las celulas (100 pl) durante 1 h a 37°C. Se realizaron ensayos que median la neutralizacion despues de la union de los pseudoviriones a la superficie celular al anadir pseudoviriones de HPV31 a 55 celulas Cos-7 durante 1 h a 37°C. Despues de tres lavados para retirar pseudoviriones no unidos, los MAbs se

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anadieron a 100 pl de DMEM. Para cada ensayo, el sobrenadante se retiro despues de 3 h a 37°C y se anadieron 200 pl de DMEM completo. Despues de 48 h mas de incubacion a 37°C, la infectividad se puntuo al medir la luciferasa expresada por celulas transfectadas usando el Firefly Luciferase assay kit (Interchim, Montlucon, Francia) y la expresion de luciferasa se cuantifico usando un luminometro para microplacas Multiskan (Thermo-Fisher Scientific, Courtaboeuf, Francia). Se consideraba que los MAbs eran neutralizadores si la actividad de luciferasa se reducia en >80%. La inhibicion de pseudovirus que se unian a la celula se puntuaba si los MAbs neutralizaban la pseudoinfeccion solamente cuando se anadian antes de la union de los pseudoviriones a las celulas. Si los anticuerpos neutralizaban los pseudoviriones antes y despues de su adicion a celulas Cos-7, se consideraba que los MAbs neutralizaban los pseudoviriones a traves de un mecanismo de ligazon a las celulas posterior.

Generacion de proteinas L1 recombinantes y purificacion de VLPs

Se uso el sistema Bac-to-Bac (Invitrogen, Fisher-Scientific, Illkirch, Francia) para la expresion de las proteinas L1 de HPV en celulas de Spodoptera frugiperda (Sf21). Se generaron previamente baculovirus que codifican el gen L1 de HPV16, HPV31, HpV16 DC9 y HPV16 DC31 (con una eliminacion C-terminal de 9 o 31 aminoacidos, respectivamente) (Touze y cols., FEMS Microbiol Lett 2000; 189:121-7; Touze y cols., J Clin Microbiol 1998; 36:2046-51). Los genes truncados de HPV31 DC9 y HPV 31 DC31 se amplificaron mediante PCR a partir de un gen 65 optimizado para el codon L1 de HPV31 de longitud completa usando cebadores directo (GGATCCCACCATGAGCCTGTGGAGACCCAGC, SEQ ID NO: 37) e inverso para DC9 (GGAAGCTTATGTGGTGG TGCTGGCGCTGGGGGC, SEQ ID NO: 38) y para DC31 (GCAAGCTT AGGCCTGCAGCAGGAACTTTCTGCCC, SEQ ID NO: 39), respectivamente. Los productos de PCR se clonaron en pCR TOPO 2.1 mediante clonacion de TA. Los clones positivos se secuenciaron para verificar la ausencia de mutaciones no deseadas. A continuacion, los genes L1 de HPV se clonaron en plasmido pFastBac1 previamente digerido mediante BamHI e HindIII. Se generaron baculovirus recombinantes que codifican los diferentes genes eliminados L1 usando el sistema Bac-to- Bac (Invitrogen) segun las recomendaciones del fabricante. Celulas Sf21 mantenidas en medio de insecto de Grace (Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia) complementado con 10% de suero de ternero fetal (FCS, Invitrogen) se infectaron con los respectivos baculovirus recombinantes y se incubaron a 27°C. Tres dias despues de la infeccion, las celulas se recogieron y las VLPs se purificaron como se describe previamente. 29,40 Brevemente, las celulas se resuspendieron en PBS que contenia Nonidet P40 (0,5%), pepstatina A y leupeptina (1 pg/ml de cada uno, Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia) y se dejaron reposar durante 30 min a 4°C. A continuacion, los lisados celulares se centrifugaron y las pellas se resuspendieron en PBS enfriada con hielo que contenia pepstatina A y leupeptina y a continuacion se sometieron a ultrasonidos. A continuacion, las muestras se cargaron en un gradiente de CsCl y se centrifugaron hasta el equilibrio (22 h, 27.000 rpm en un rotor SW28, 4°C). Se investigo la densidad de las fracciones del gradiente de CsCl mediante refractometria y la presencia de proteina L1 mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sodico al 10% (SDS-PAGE) y tincion con azul de Coomassie. Las fracciones positivas se reunieron, se diluyeron en PBS y se nodulizaron en un rotor Beckman SW 28 (3 h, 28.000 rpm, 4°C). Despues de la centrifugacion, las VLPs se resuspendieron en 0,15 mol/l de NaCl y se sometieron a ultrasonidos mediante una rafaga de 5 s a 60% de potencia maximas. El contenido de proteina total se determino usando el estuche MicroBCA (Pierce, Ozyme, Francia).

Se produjeron VLPs del mutante HBc 263/264 de L1 de HPV31 en celulas 293 FT. Se obtuvo proteina L1 quimerica que codifica ADN mediante la mutagenesis de un gen L1 de HPV31 optimizado codonicamente usando un protocolo de PCR de dos etapas. Se realizaron PCRs solapadas para obtener la secuencia DPASRE de la proteina HBc en la posicion 263/264 de la proteina L1 de HPV31. En la primera etapa, se genero un fragmento usando la secuencia de ADN de L1 de HPV31 optimizada como plantilla y 5' L1 -NheI (CC GCTAGCCACCATGAGCCTGTGGAGACCC, SEQ ID NO: 40) y 3' L1-DPASRE (CTCTCTGCTGGCGGGGTCGTTGAAGAAGT GCCGCACGAA, SEQ ID NO: 41) como cebadores. Otro fragmento se amplifico usando la secuencia de ADN de L1 de HPV31 optimizada como plantilla y 3'L1-EcoRI (CGGAATTCT ATCACTTCTTGGTTTTCTTCC, SEQ ID NO: 42) y 5'L1-DPASRE

(GACCCCGCCAGCAGAGAGAGAAGCGGCACCGTGGGC GAG, SEQ ID NO: 43) como cebadores. Estos dos fragmentos solapados se usaron en la segunda etapa de PCR como plantillas de ADN usando los cebadores 5' L1- NheI y 3' L1-EcoRI. La secuencia de ADN resultante tenia una secuencia que codificaba HBc78-83 entra las bases de L1 263/264 y un sitio de restriccion NheI en 5' y un sitio de restriccion EcoRI en 3'. Para la expresion de proteina, el gen HBc 263/264 de L1 de HPV31 se clono en el vector de expresion de mamifero pIRES (BDbiosciences, Clontech). Este plasmido de ADN (HBc 263/264-pIRES de L1 de HPV31) se preparo mediante lisis alcalina clasica y extraccion con fenol/cloroformo y se uso para transfectar celulas 293 FT con Fugene6 (Roche Diagnostic, Meylan, Francia) segun las instrucciones del fabricante. Las celulas se transfectaron con un total de 0,5 pg de ADN y 1 pl de Fugene6 por cm2 de superficie de cultivo. Las celulas 293FT se recogieron 44 h despues de la transfeccion y las VLPs se purificaron segun se menciono previamente.

El autoensamblaje de las diferentes proteinas L1 de HPV expresadas en VLPs se investigo mediante microscopia electronica. Con este proposito, las preparaciones de VLP se aplicaron a rejillas revestidas con carbono, se tineron negativamente con acetato de uranilo al 1,5% y se observaron a una ampliacion nominal de 50.000 x con un microscopio electronico JEOL 1010. Todas las micrografias electronicas se tomaron a 30.000 x o 50.000 x.

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Investigacion de la competicion de union a VLP de MAbs para HPV31 mediante resonancia plasmonica superficial

Los analisis se realizaron con un Biacore 1000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) equipado con chips detectores CM3 (dextrano carboximetilado). Los chips detectores CM3 se trataron con 35 gl de 0,05 mol/l de hidrocloruro de 1 -etil-3- (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida y 0,2 mol/l de N-hidroxisuccinimida a un caudal de 5 gl/min y a continuacion las VLPs de L1 de HPV31 (32 gg/ml en 35 gl de tampon de PBS) se acoplaron covalentemente a un caudal de 5 gl/min. Los grupos carboxilo residuales se bloquearon posteriormente mediante 50 gl de HCl de etanolamina de 1 mol/l (pH 8,5) a un caudal de 10 gl/min. Las VLPs no unidas se eliminaron mediante la inyeccion de 5 gl de HCl-glicina (10 mmol/l, pH 2,2) a un caudal de 10 gl/min. Se uso un caudal de 20 gl/min para todos los analisis de interaccion efectuados a temperatura ambiente. Se obtuvo la saturacion en anticuerpos de las VLPs de L1 de HPV31 unidas para cada MAb mediante tres inyecciones de 30 gl de fluido ascitico diluido 1:10 en PBS. La saturacion en MAb se verifico mediante la inyeccion de 30 gl de sobrenadante de hibridoma del mismo MAb diluido 1:4 en PBS. A continuacion, se establecio la competicion al inyectar sucesivamente cinco sobrenadantes de hibridoma diferentes diluidos 1:4 en PBS (30 gl cada uno). A continuacion, el biosensor se regenero mediante tres inyecciones de 10 gl de HCl de 30 mmol/l y se realizo otro ciclo de saturacion-competicion sobre la misma celda de flujo acoplada a VLPs. Se investigaron varios otros tampones de regeneracion (incluyendo NaCl de 2 mol/l, NaOH de 10 mmol/l y HCl de 20, 25, 30 y 50 mmol/l). Se observo que el tampon seleccionado (HCl de 30 mmol/l) retiraba 100% de los anticuerpos unidos, no retiraba VLPs del chip detector y no afectaba a la conformacion de las VLPs, debido a que los anticuerpos dirigidos a los epitopos de conformacion todavia estaban unidos a VLPs tan eficazmente con antes de tratamiento de regeneracion.

Cartografia de epitopos usando exposicion bacteriana en la superficie celular

El metodo de exposicion bacteriana en la superficie celular usando el vector pFliTrx usa una biblioteca de peptidos 12-meros insertada en un dominio de tiorredoxina (TrxA) para constrenir los peptidos. Este dominio de tiorredoxina estan insertado el mismo en la proteina flagelar bacteriana principal (FliC) que se va a exponer sobre la superficie de E. coli (Lu y cols., Biotechnology (NY) 1995; 13:366-72; James y cols., Science 2003; 299:1362-1367). La pFliTrx Random Peptide Display Library (Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia) se obtuvo mediante la inoculacion de 1 ml de la solucion madre de biblioteca de peptidos en 50 ml de medio IMC (6 g/l de Na2HPO4, 3 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de NaCl, 1 g/l de NH4Cl, 0,2% de casaminoacido, 0,5% de glucosa, 1 mmol/l de MgCb) que contenian 100 gg/ml de ampiciina y a continuacion se removio (225-250 rpm) durante la noche a 25°C. La expresion de los peptido se indujo al anadir 100 gg/m de triptofano a 1010 bacterias procedentes del cultivo nocturno en 50 ml de medio IMC que contenia 100 gg/ml de ampicilina y a continuacion se removio a 25°C durante 6 h.

Para el cribado de la biblioteca contra anticuerpos anti-HPV31, 20 gg de MAb en 1 ml de agua esteril se revistieron sobre una placa de 60mm (Nunclon D, Nunc, ATGC, Marne-la-Valle'e, Francia) durante 1 h con agitacion suave a 50 rpm en un agitador orbital. Despues de lavar con 10 ml de agua esteril, se anadieron 10 ml de solucion de bloqueo (medio IMC que contenia 100 gg/ml de ampicilina, 1% de leche en polvo baja en grasa, 150 mmol/l de NaCl, 1% de a-metilmanosido) y se incubaron durante 1 h bajo agitacion (50 rpm). Despues de decantar las solucion de bloqueo, se anadieron 10 ml del cultivo de celulas bacterianas con 0,1 g de leche en polvo, 300 gl de NaCl de 5 mol/l, 500 gl de a-metilmanosido al 20% (concentracion final: 1% de leche desnatada en polvo, 150 mmol/l de NaCl, 1% de a- metilmanosido). Despues de la agitacion suave a 50 rpm durante 1 min y la incubacion a temperatura ambiente durante 1 h, las placas se lavaron cinco veces (50 rpm durante 5 min) con 10 ml del medio IMC que contenia 100 gg/ml de ampicilina y 1% de a-metilmanosido. A continuacion, las celulas bacterianas unidas se eluyeron en el volumen residual de solucion de lavado al someter a turbulencia las placas durante 30 s. Se transfirieron a un matraz de cultivo de 50 ml y se hicieron crecer bajo agitacion (225-250 rpm) a 25°C durante la noche. Este ciclo de tamizado se repitio cuatro veces mas y el cultivo nocturno procedente del quinto tamizado se sembro en estrias sobre placas RMG (6 g/l de Na2HPO4, 3 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de NaCl, 1 g/l de NH4Cl, 2% de casaminoacido, 0,5% de glucosa, 1 mmol/l de MgCl2, 1,5% de agar) que contenian 100 gg/ml de ampicilina y se incubaron durante la noche a 30°C. De 24 a 30 colonias procedentes de la placa de RMG/ampicilina se inocularon cada una en 2 ml de medio RM (6 g/l de Na2HPO4, 3 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de NaCl, 1 g/l de NH4Cl, 2% de casaminoacido, 1% de glicerol, 1 mmol/l de MgCb) que contenia 100 gg/ml de ampicilina. Despues de la incubacion a 30°C durante la noche con agitacion, el ADN se extrajo mediante la clasica minipreparacion de ADN en fenol/cloroformo con lisis alcalina. El analisis de las secuencias nucleotidicas se realizo usando el cebador de secuenciacion directo FliTrx. Las secuencias se hicieron pasar por un secuenciador de ADN ABI PRISM 3100 Avant (PerkinElmer, Courtaboeuf, Francia). Las secuencias se analizaron usando Dialign2 (Morgenstern y cols., Gioinformatics 1999; 15:211-18).

Deteccion de la reactividad de MAb contra VLPs silvestres y mutantes mediante ELISA

Los pocillos de las microplacas (Maxisorp, Nunc) se revistieron con VLPs. Despues de la incubacion a 4°C durante la noche y dos lavados con PBS-Tween 20 (0,1%), los pocillos se saturaron con PBS complementada con 1% de FCS durante 1 h a 37°C. Se incubaron pocillos duplicados (dos pruebas y un control) con MAbs diluidos en PBS 5X- Tween (1%)-FCS (10%) durante 1 h a 37°C. Despues de cuatro lavados, se anadio a los pocillos Fc de anti-Ig de raton caprina conjugada a peroxidasa (Sigma Aldrich) diluido 1:1.000 en PBS-Tween (1%)-FCS (10%) y se incubo

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Ensayos de inmunoabsorcion con enzimas ligadas basados en heparina y ECM

La interaccion entre VLPs y heparina se probo usando un ensayo derivado de los ensayos de union a heparina descritos por Giroglou y cols. (j Virol 2001; 75:1565-70) para VLPs de HPV33. Las placas de microvaloracion (Maxisorp, Nunc) se revistieron durante la noche a 4°C con 200 ng por pocillo de heparina-BSA (Sigma) o MatrigelVR (BD Biosciences, Le pont de Claix, Francia) Despues de cuatro lavados con PBS que contenia 0,1% de Tween 20, los sitios de union no especifica se bloquearon mediante la incubacion durante 1 h a 37°C con PBS mas 1% de FCS. Despues del lavado, se anadieron 200 ng/pocillo de VLPs diluidas en PBS. Despues de la incubacion a 37°C durante 60 min y cuatro lavados, se anadieron MAbs anti-VLP de HPV31 diluidos 1:1000 en PBS, 0,1% de Tween 20 y 10% de FCS y se incubaron a 37°C durante 60 min. Despues de 1 h de incubacion a 37°C y cuatro lavados, los anticuerpos unidos se detectaron usando anticuerpo de raton anti-IgG conectados covalentemente a peroxidasa de rabano picante. Despues de 1 h de incubacion a 37°C y cuatro lavados, se anadieron 100 gl de solucion de sustrato que contenia O-fenilendiamina y H2O2. La reaccion se detuvo despues de 30 min mediante la adicion de 100 gl de H2SO4 de 2 mol/l y la absorbancia se leyo a 492 nm con un lector de placas automatico. La absorbancia de los pocillos de control sin VLPs se sustrajo de los valores para los pocillos de prueba. Simultaneamente, una segunda placa se revistio con heparina-BSA o MatrigelVR. Despues de la incubacion y el lavado, se anadieron 200 ng/pocillo de VLPs preincubadas durante 1 h a 37°C con MAbs diluidos 1:1000 en PBS, 0,1% de Tween 20 y 10% de FCS. Los anticuerpos unidos se detectaron con anticuerpos de raton anti-IgG conectados covalentemente a peroxidasa de rabano picante como se describe anteriormente. la inhibicion de la union de VLP a heparina o Matrigel se calculo como la reduccion en la OD observada entre anadir los MAbs antes de la interaccion de VLPs con heparina y despues. Los resultados se expresan como el porcentaje de reduccion en la OD.

Ensayos de union de HS y ECM a VLP

Las placas de microvaloracion (Maxisorp, Nunc) se revistieron con heparina-BSA segun se describe previamente. Despues de una etapa de bloqueo, se anadieron VLPs diluidas en PBS. Tras la incubacion a 37°C durante 60 min y dl lavado, se anadieron MAbs Can Vir1 diluidos 1:5000 en PBS, 0,1% de Tween 20 y 10% de FCS y se incubaron a 37°C durante 60 min. Los anticuerpos unidos se detectaron despues de cuatro lavados usando anticuerpos de raton anti-IgG conectados covalentemente a peroxidasa de rabano picante y a continuacion se realizaron las pruebas como se menciona previamente en la prueba para la interaccion entre heparina y MAbs. Los resultados se expresan como el valor de OD.

Visualizacion de epitopos de HPV31 mediante modelado por homologia de proteina L1 de HPV31

La secuencia para proteina L1 de HPV31 (Genbank ID, P17388) se presento como entrada a la herramienta de modelado Swiss-Model (swissmodel.expasy.org). Una busqueda de plantilla basada en la similitud de secuencias identificaba L1 de HPV16 (codigo PDB 1DZL y 2R5H), L1 de HPV-35 (2R5J), L1 de HPV-11 (2R5K) y L1 de HPV-18 (2R5I) como posibles plantillas 3D. Debido a que la L1 de HPV31 es mas similar a las secuencias de L1 de HPV16 y HPV35, los presentes inventores seleccionaron las correspondientes plantillas 3D (1DZL, 2R5H y 2R5J) para modelar la estructura de L1 de HPV31. El modelo de L1 de HPV31 se evaluo usando ANAOLEA (swissmodel.expasy.org/anolea/) y se encontro que era correcto para un analisis estructural adicional de localizaciones epitopicas. El pentamero L1 de HPV31 se reconstruyo con SwissPDBViewer usando el modelo de L1 de HPV31 y la informacion para simetrias no cristalograficas (matrices de transformacion) de la VLP de HPV16 (1DZL) (Chen y cols., Mol Cell 2000; 5:557-67). Las coordenadas atomicas del pentamero para la VLP de L1 de HPV31 L1 se guardaron en formato PDB y se expusieron usando el programa PYMOL, una herramienta de visualizacion grafica molecular para estructuras macromoleculares (pymol.org).

Resultados

Cartografia epitopica de MAbs de L1 de HPV31 usando resonancia plasmonica superficial

La cartografia epitopica se realizo usando 15 MAbs producidos contra proteina L1 de HPV31. Se probaron todas las competiciones entre estos MAbs. Por ejemplo [Fig. 7(a)], la competicion epitopica se establecio al saturar VLPs de L1 de HPV31 acopladas con MAb H31.F16 (fluido ascitico en bruto) y la saturacion con MAb se verifico mediante la inyeccion de los mismos MAbs (sobrenadante de hibridoma). La unidad de resonancia (RU) baja que se producia despues de la adicion de MAb H31.F16 (-52 RU) probaba que se alcanzaba la saturacion. Despues de la saturacion, habia una disminucion en la RU, debido a la disociacion de MAb saturador y esta eta la razon de la RU negativa. A

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continuacion, se establecio una competicion de union a MAb al inyectar sucesivamente MAbs H31.B18, H31.D7, H31 .E16, H31 .E17 y H31 .F7 (sobrenadantes de hibridoma). Los MAbs H31 .E16 y H31 .F7 no se unian a vLps de L1 de HPV31 (-1 y -13 RU, respectivamente), sugiriendo que los epitopos reconocidos por estos dos MAbs eran similares, o muy proximos, al epitopo reconocidos por el MAb H31.F16. En contraste, se observaba una union a VLPs significativa usando los MAbs H31.B18, H31.D7 y H31.E17 (171, 523 y 69 RU, respectivamente), sugiriendo que estos anticuerpos reconocian epitopos que eran es de los reconocidos por el MAb H31.F16. A continuacion, el biodetector se regenero mediante tres inyecciones de 30 mmol/l de HCl. Este metodo se uso para todos los otros ensayos de competicion.

Cada uno de los 15 MAbs investigados competia con al menos otros tres, pero ninguno de los MAbs competia con todos los otros MAbs. Se establecio un mapa epitopico usando estos resultados [Fig. 7(b)1 y los epitopos reconocidos por MAb H31 .F7 tenian una posicion central en este mapa. El epitopo reconocidos por este MAb ya se habia identificado sobre el bucle FG de L1 (Carpentier y cols., J Med Virol 2005; 77:558-65; Fleury y cols., Arch Virol 2006; 1511-23). Los MAbs que compiten menos con los otros MAbs (H31.B18, H31.B1 y H31.H9) estaban localizados en la periferia del mapa epitopico.

Union de MAbs para HPV31 a VLPs de HPV31/HBc

La reactividad de MAbs se analizo usando el mutante de L1 de HPV31/HBc 263/264 y VLPs de L1 de HPV31 wt para identificar si algunos de los epitopos neutralizadores estaban localizados en el bucle FG. Ademas de las VLPs de L1 de HPV31 producidas previamente, los presentes inventores construyeron un mutante de L1 de HPV31 mediante la insercion del motivo del nucleo de la hepatitis B (HBc) DPASRE en la posicion 263-264. La a VLP de todos los MAbs especificos de un tipo estaba afectada por la insercion del motivo HBc en la posicion 263/264. Se debe apuntar que la reactividad del MAb H31 .D24 no neutralizador, que reconocia un epitopo lineal localizado en la posicion 271-279 (SVPTDLYIK, SEQ ID NO: 44), no estaba afectada por la insercion. La union del MAb CamVir-1 que reconocia un epitopo lineal identificado fuera del bucle FG tampoco estaba afectada por la mutacion introducida. El MAb H31.F7 neutralizador cruzadamente reaccionaba de forma similar con VLPs wt tanto de HPV16 como de HPV31, pero estaba afectado por la insercion del motivo HBc en la posicion 263/264.

Cartografia epitopica de 5 MAbs usando exposicion en la superficie bacteriana

La cartografia epitopica usando bacterias para la exposicion de bibliotecas peptidicas proporciona un nuevo enfoque para la cartografia epitopica de anticuerpos tanto monoclonales como policlonales (Rockberg y cols., Nat Methods 2008; 5:1039-45). Uno de estos sistemas, el sistema pFliTrx Bacterial Display, se uso para identificar epitopos de L1. La exposicion en la superficie de celulas bacterianas usando el vector pFliTrx usa una biblioteca de peptidos 12- meros insertada en un dominio de tiorredoxina para constrenir los peptidos, permitiendo la exposicion de epitopos de conformacion. El propio dominio de tiorredoxina se inserta en la proteina flagelar bacteriana principal de E. coli para ser expuesto sobre la superficie de bacterias. MAbs de titulo alto purificados de fluido ascitico se revistieron sobre placas Nuclon D para el cribado de la biblioteca contra anticuerpos anti-HPV31 y se realizaron rondas de seleccion in vitro sobre MAbs unidos a las placas para la seleccion de bacterias que exponen peptidos que interactuan con los MAbs. Para cada ronda la biblioteca bacteriana se anadio a un plato de cultivo celular para la seleccion positiva. Las bacterias no unidas se separaron por lavado y las bacterias unidas se recuperaron. Despues de cinco rondas, se seleccionaron clones individuales y el ADN se aislo para la secuenciacion. Las secuencias se analizaron en primer lugar usando el programa Dialign2. Los peptidos que coincidian en una alta puntuacion se seleccionaron y a continuacion se alinearon usando Dialign2 con la secuencia de la proteina L1 de HPV31 de longitud completa. Las secuencias de L1 de HPV31 que coincidian en todos los peptidos seleccionados se retuvieron. En primer lugar, los presentes inventores usaron este sistema con el MAb H31.D24, que reconocia un epitopo lineal previamente identificado en la posicion 271-279 (SVPTDLYIK, SEQ ID NO: 44) dentro del bucle FG de L1 de HPV31. Despues de la seleccion por exposicion bacteriana, 24 clones positivos se secuenciaron y se analizaron. Seis de los 24 peptidos seleccionados con MAb H31.D24 coincidian en cada F2 distinto y coincidian en la proteina L1 de HPV31 (vease la Fig. 8), estando la secuencia de consenso identificada en la posicion 275-279 (DLIYK, SEQ ID NO: 46).

Por lo tanto, la exposicion bacteriana se uso para investigar el epitopo de conformacion neutralizador reconocido por el MAb H31.F7, que es reactivo cruzadamente con HPV16, 18 y 58 y ligeramente neutralizados para los tipos 16 y 31 de HPV. Veinticuatro clones positivos se seleccionaron mediante exposicion bacteriana usando el MAb H31.F7. Cinco de los 24 peptidos seleccionados coincidian entre si y coincidian en la secuencia 259-266 de la proteina L1 de HPV31 (RHFFNRSG, SEQ ID NO: 47). Tambien se investigaron MAbs neutralizadores especificos del tipo (H31.F16, H31.H12 y H31.B1), que reconocian epitopos de conformacion. Se seleccionaron clones positivos para cada MAb. Cinco peptidos seleccionados con MAb H31.F16, cinco con MAb H31.H12 y seis peptidos seleccionados con MAb H31 .B1 coincidian entre si y coincidian en la secuencia SGTVGESVP de proteina L1 de HPV31 (265-273) (SEQ ID NO: 48) para MAb H31.F16, la secuencia RSGTVG (264-269) (SEQ ID NO: 49) para MAb H31.H12 y la secuencia RSGTVGESV (264-272) (SEQ ID NO: 50) para MAb H31 .B1.

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Neutralizacion con MAb de pseudoviriones antes y despues de la ligazon

Se ha mostrado que los anticuerpos especificos para HPV16 y HPV33 neutralizan antes o despues de la ligazon celular a celulas diana (Selinka y cols., J Virol 2003; 77:12961-67; Day y cols., J Virol 2007; 81:8784-92). El mecanismo de neutralizacion viral mediante anti-MAbs para HPV31 se determino mediante ensayos de neutralizacion, anadiendose los MAbs bien antes de la adicion de F3 los pseudoviriones a celulas COS-7 [Fig. 9(a)] o bien 1 h despues de la ligazon celular [Fig. 9(b)]. Los seis MAbs [H31 .B1, H31 .C24, H31 .G5, H31 .E16, H31 .F7 y H31.D7, Fig.9(b)] neutralizaban pseudoviriones de HPV31 al inhibir la ligazon celular debido a que se neutralizaban antes de la ligazon del virus pero no despues de la union del pseudovirus a la celula [Fig. 9(b)]. Los otros ocho MAbs neutralizaban pseudoviriones de HPV31 a traves de un mecanismo posterior a la ligazon celular debido a que neutralizaban los pseudoviriones antes y despues de la union celular. Se debe apuntar que el mapa epitopico [Fig. 7(c)] obtenido mediante analisis por resonancia plasmonica superficial sugeria una aglomeracion de cinco de estos seis MAbs que neutralizaba pseudoviriones de HPV31 mediante inhibicion de la ligazon celular.

Union de VLPs a HS y ECM: efectos de MAbs para HPV31 y eliminacion C-terminal de L1

La inhibicion de la union de VLP a heparina mediante MAbs para HPV31 se investigo usando un ELISA en el que se anadian VLPs antes de su union a heparina revestida sobre placas de ELISA. Los resultados indicaban que el MAb para H31 .D24 no neutralizador que reconocia un epitopo lineal inhibia fuertemente la union de VLPs a heparina, ya que solamente 6 de los 14 MAbs reconocian epitopos neutralizadores de confor-F4-macion [Fig. 10(a)]. El mapa epitopico obtenido mediante analisis por resonancia plasmonica superficial indicaba una aglomeracion de algunos de los MAbs que inhibian la union de VLP a heparina [Fig. 7(c)]. No habia una correlacion clara entre MAbs que neutralizaban los pseudoviriones antes de la ligazon a las celulas y los que inhibian la union a to HS. Sin embargo, tres anticuerpos neutralizadores (H31.G5, H31.E16 y H31.D7) demostraban ambas capacidades (vease la Fig. 10). La inhibicion de la union de VLP a proteinas de ECM se investigo mediante ELISA usando MatrigelVR como un sustituto de ECM. Los resultados [Fig. 10(b)] indicaban la inhibicion de la union de VLP a proteinas de ECM (>50%) por todos los anticuerpos neutralizadores, con la excepcion de H31 .C24 (37% de inhibicion). El anticuerpo no neutralizador H31 .D24 no inhibia la union de VLPs a proteinas de ECM.

Para investigar adicionalmente la interaccion de VLPs con HPSGs, los presentes inventores usaron cuatro mutantes de eliminacion C-terminal para el analisis de la union de heparina a proteinas L1. Los mutantes de HPV16 D9 y HPV16 D31 con eliminaciones C-terminales de 9 y 31 aminoacidos, respectivamente, ya se habian producido, 44 y se produjeron de forma similar mutantes de L1 de HPV31D9 y HPV31D31 para los propositos de este estudio. Estos mutantes de eliminacion de HPV31 se autoensamblaban en VLPs (vease la Fig. 7) como se observaba previamente para los correspondientes mutantes de eliminacion de HPV16 44 y estas cuatro VLPs eliminadas C-terminalmente unidas a heparina de un modo similar a VLPs wt. Sin embargo, la union a heparina se pierde cuando estas VLPs se desnaturalizan, confirmando que la heparina se une a un motivo de conformacion sobre VLPs y que este motivo no esta presente en la parte C-terminal de la proteina L1 (vease la Fig. 11). Como la infeccion de celulas diana por HPV es un proceso multifasico que implica HSPG, ECM y un receptor secundario desconocido, los presentes inventores investigaron los efectos de MAbs para HPV31 sobre la neutralizacion la union ECM- VLP de HPV.

El epitopo reconocido por H31 .D24 es un epitopo lineal y los epitopos reconocidos por los tres MAbs neutralizadores (H31.B1, H31.F16 y H31.H12) son de conformacion, mientras que el MAb H31.B1 es parcialmente neutralizador cruzadamente y reactivo cruzadamente.

El epitopo reconocido por el MAb H31.F7, un MAb reactivo cruzadamente y parcialmente neutralizador cruzadamente, se identifico en la parte N-terminal del bucle FG de la proteina L1 de HPV31 en la posicion 259-268 (RHFFNRSGTV, SEQ ID NO: 45) [Fig. 12, la estructura 3D de capsomero se reconstruyo con SwissPDBViewer usando el modelo de L1 de HPV31 y la informacion para simetrias no cristalograficas AQ6 de la VLP de HPV16 [codigo PDB: 1DZL, (Chen y cols., Mol Cell 2000; 5:557-67)]] y es principalmente F6 inaccesible procedente de la superficie del capsomero segun el modelo de HPV31. Esto esta de acuerdo con el hecho de que la region inicial del bucle FG evidenciaba estructuras identicas entre tipos de HPV y con la hipotesis de Bishop y cols. 64 sobre el analisis estructural de proteinas L1, sugiriendo que esta region del bucle FG debe ser capaz de inducir reactividad cruzada entre tipos pero es escasamente antigenica y/o inaccesible.

Para HPV16 y HPV33, se ha mostrados que diversos bucles expuestos superficialmente de la proteina L1 contribuyen a la induccion de anticuerpos neutralizadores para epitopos identificados solamente en un bucle y epitopos para los que varios bucles contribuyen a la zona de union, 15, 46, 47 y se ha sugerido que regiones no contiguas de L1 podrian contribuir a neutralizar epitopos reconocidos por MAbs. Los hallazgos de los presentes inventores estaban a favor de que los anticuerpos neutralizadores para HPV31 se dirigieran principalmente contra el bucle FG y el bucle FG solo contribuyera a la union a anticuerpos neutralizadores. El hecho de que los bucles hipervariables de L1 esten en gran proximidad entre si no descartaba la posibilidad de que mutaciones o inserciones en otros bucles afecten a los epitopos de conformacion de FG segun se observaba por Roth y cols. 47 Los presentes inventores observaron que el MAb H31.D24 reactivo cruzadamente que reconocia la secuencia DLYIK (SEQ ID NO: 44) (275-279) reducia drasticamente la capacidad de HPV31 para unirse a heparina, confirmando asi

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el papel de la Lisina 278 en la union a HS. Sin embargo, este anticuerpo no tenia efecto neutralizador sobre pseudoviriones de HPV31,41, 65 y otros tres anticuerpos neutralizadores que reconocian epitopos de conformacion conocidos por unirse a una secuencia situada en la parte N-terminal del bucle FG no tenian efecto o lo tenian limitado sobre la union a heparina. Se ha mostrado que los MAbs H16.V5 y H16.E70 no bloquean interacciones con la superficie celular. Sin embargo, estos anticuerpos neutralizadores inhiben la union del virus a ECM producida a partir de celulas HaCaT y neutralizan pseudoviriones a traves de un mecanismo de ligazon celular posterior. 43 De acuerdo con esto, los presentes inventores observaron que los tres anticuerpos neutralizadores especificos del tipo no competian con HS con respecto a la union a VLPs y que solo uno de ellos (H31.B1) neutralizaba mediante inhibicion de la union de las VLPs a las celulas. Sin embargo, todos estos anticuerpos compiten con respecto a la union a la ECM, en contraste con el MAb H31.D24 no neutralizador. Estos resultados sugieren que estos anticuerpos reconocian un epitopo en la proximidad de la aglomeracion basica de conformacion de lisina implicada en la union de VLP de HPV16 a HS35. Se debe apuntar que la lisina mas importante de la aglomeracion estaba presente dentro del epitopo reconocidos por el MAb H31.D24. Ademas, la investigacion de la neutralizacion anterior y posterior a la ligazon de pseudoviriones de HPV31 por MAbs revelaba que seis de los anticuerpos neutralizadores de HPV31 actuaban al evitar la union a la superficie celular de las particulas virales y los otros ocho MAbs neutralizadores interferian con pseudoviriones al evitar su internalizacion. Los hallazgos de los presentes inventores indican que, para todo el grupo de MAbs, no habia correlacion entre la neutralizacion y la capacidad de los MAbs para unirse a HS. Lopez y cols. 66 se presento recientemente que anticuerpos anti-HPV detectados en una infeccion natural inhiben la union de HPV16 a HS y observaron que aquellos con los titulos de neutralizacion mas altos eran los que inhibian la union a HS. En conclusion, los hallazgos de los presentes inventores mostraban que los MAbs neutralizadores de HPV31 reconocen epitopos de conformacion localizados sobre el bucle FG de la proteina L1 de HPV31 y que actuan bien mediante el bloqueo de la ligazon a celulas diana o bien mediante la neutralizacion de la union a celulas posterior. La determinacion precisa de tres epitopos neutralizadores especificos del tipo mediante exposicion en la superficie bacteriana confirmaba su localizacion en la parte central del bucle FG e identificaba un epitopo de conformacion reactivo cruzadamente y parcialmente neutralizador cruzadamente en la parte N-terminal relativamente conservada del bucle FG. Los residuos de aminoacido expuestos a disolventes del bucle FG se distribuian sobre ambas caras de una hendidura formada a lo largo de un eje definido por Pro 273 a Leu 287 [Fig. 12]. Los hallazgos de los presentes inventores mostraban que la parte derecha de la hendidura contenia un epitopo no neutralizador lineal reconocidos por el MAb H31 .D24. Este tambien es un punto clave para la union a sulfato de heparano, explicando asi por que H31.D24 y HS compiten con respecto a la union a esta region. Los epitopos neutralizadores de conformacion identificados estaban todos localizados en la cara izquierda de la hendidura del bucle FG (vease la Fig. 12). El hecho de que los anticuerpos dirigidos contra estos epitopos no compitieran fuertemente con HS se puede explicar por las diferencias en los modos de union de los MAb, como se describe previamente para MAbs dirigidos contra proteina L1 de BPV. 67 Sin embargo, algunos otros MAbs neutralizadores de HPV31 competian con la union a HS, sugiriendo que bien estos MAbs tienen una inclinacion diferente cuando se unen a sus respectivos epitopos, interfiriendo asi con la union a HS hasta un grado mayor o menor, o bien que estan dirigidos contra residuos de aminoacido de ambas caras de la hendidura. El MAb H31.D24 se unfa a las puntas de VLPs y asi apoya la hipotesis de que los epitopos no neutralizadores tambien estan presentes sobre la superficie de particulas de HPV. Los resultados obtenidos indicaban el que bucle hipervariable FG de HPV31 es denso en epitopos neutralizadores y sugerian que los MAbs para HPV31 se unen a epitopos solapados pero distintos en la parte central del bucle FG, de acuerdo con la exposicion del bucle FG sobre la superficie de VLPs de HPV y confirmando asi que los anticuerpos neutralizadores estan situados principalmente el la punta y la corona del capsomero. Los resultados tambien apoyan y conforman que el bloqueo de la ligazon del virus a la ECM es un mecanismo de neutralizacion importante pero no el bloqueo de la ligazon del virus a HS.

Ejemplo 3: Generacion de mutantes de L1 de HPV16/31

Los papilomavirus son virus de ADN pequenos sin envuelta y su capside icosaedrica esta constituida por las proteinas L1 y L2, que encapsidan un ADN bicatenario circular cerrado de aproximadamente 8 kpb. La capside viral de 50-60 nm de diametro contiene 72 pentameros de la proteina principal L1 y de 12 a 72 copies de la proteina secundaria de la capside L2. La inmunizacion con proteina L1 autoensamblada en particulas similares a virus (VLPs) induce la produccion de altos niveles de anticuerpos neutralizadores y confiere proteccion especifica para el tipo y de larga duracion, segun se demuestra en modelos en animales (Breitburd y cols., J Virol 1995; 69:3959-63; Suzich y cols., PNAS 1995; 92:11553-57; Christensen y cols., J Virol 1996; 70:960-65). Las respuestas de anticuerpos tipicamente son generadas contra epitopos encontrados en los bucles externos de la proteina L1 de la capside viral presente sobre la superficie exterior de VLP (Christensen y cols., Virology 2001; 291:324-34; Sadeyen y cols., Virology 2003; 309:32-40; Orozco y cols., J Virol 2005; 79:9503-14; Yaegashi y cols., J Virol 1991; 65:1578-83). Los epitopos de la capside neutralizadores son determinantes importantes para la proteccion inmunitaria HPVs mediada por anticuerpos y se han identificado epitopos tanto lineales como de conformacion sobre la superficie de VLPs de L1 de HPV y pseudoviriones (Yaegashi y cols., J Virol 1991; 65:1578-83; Volpers y cols., J Gen Virol 1995; 76:2661 - 67; Heino y cols., J Gen Virol 1995; 76:1141-53; Christensen y cols., Virology 1996; 224:477-86).

Se ha presentado que los residuos de L1 dentro del bucle FG de L1 de HPV16 y el bucle EF de L1 de HPV31 estan implicados en la union de anticuerpos neutralizadores (Sadeyen y cols., Virology 2003; 309:32-40; White y cols., J Virol 1999; 73:4882-89; Combita y cols., J Virol 2002; 76:6480-86; Carter y cols., J Virol 2003; 77:11625-32).

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El objetivo de este estudio era investigar la inmunogenicidad de particulas quimericas de HPV. Los presentes inventores sustituyeron el aminoacido en el bucle externo FG de la proteina de la capside L1 que aloja los epitopos principales de HPV16 (aa256-294) por aminoacidos correspondientes del bucle FG de L1 de HPV31 (aa257-295) generando nanoparticulas de HPV de L1 quimericas que mantenian la secuencia silvestre global de HPV 16 L1 con solo 3 sustituciones similares a HPV31 (HPV-VLP X) o 7 sustituciones similares a HPV31 (HPV-VLP Y) en el bucle FG (Figura 13).

Las proteinas L1 quimericas se produjeron y purificaron a partir de celulas de insecto Sf21 infectadas con baculovirus recombinantes. Las celulas de insecto Sf21 producian un buen rendimiento de las proteinas L1 quimericas (2,5-3 mg/litro). Las proteinas quimericas L1 HPV X y L1 HPV Y se ensamblaban de forma similar a L1 de HPV 16 silvestre en VLP. Las construcciones quimericas que alojaban mutaciones ademas de los 7 intercambios realizados en VLP de HPV Y no se ensamblaban en VLPs.

Para probar la infectividad de las VLPs quimericas, se ensayo su capacidad para transferir material genetico a las celulas. HPV-VLP X y HPV-VLP Y y como un control VLP silvestre de HPV16 se disociaron y un plasmido indicador de luciferasa se anadio y se empaqueto en las VLPs durante la reasociacion. Las celulas COS-7 (celulas renales de mono verde africano, ATCC CRL-1651) se pusieron en contacto con VLPs in vitro y se incubaron. Despues de la incubacion, el medio de cultivo se retiro, las celulas se lavaron y se sometieron a lisis en tampon de lisis de luciferasa. Segun se muestra en la Figura 14, las VLPs de HPV X e Y quimericas retienen las capacidades infecciosas de VLP de HPV-16 silvestre.

Para probar la inmunogenicidad de la VLP quimerica, se inmunizaron ratones (diez por grupo) con HPV16, HPV31 y los dos HPV X e Y quimericos. Segun se muestra en la Figura 15, la inmunorreactividad de la quimera HPV-VLP es del mismo orden de magnitud que la reactividad cruzada entre HPV 16 y HPV31, que es minima (al menos 2 logaritmos menor que una respuesta inmunitaria real). En ratones inmunizados con HPV16, los titulos de anticuerpo especifico para HPV 16, segun se miden mediante ELISA, son aproximadamente 2000 GMT, lo que se esperaba. Sorprendentemente, en ratones infectados con HPV-VLP X e Y, esencialmente no se encuentran anticuerpos especificos para HPV16, a pesar del hecho de que L1 HPV-VLP X e Y mantienen casi totalmente la secuencia de aminoacidos de HPV16 silvestre. Asi, estas quimeras no producen anticuerpos especificos para HPV 16. Segun se espera, en ratones infectados con HPV31, esencialmente no se pueden encontrar anticuerpos especificos para HPV16. Un hallazgo aun mas sorprendente era que en ratones infectados con HPV-VLP X e Y, no se encuentran anticuerpos especificos para HPV31, a pesar del hecho de que el bucle FG de la quimera se asemeja al de HPV31, particularmente para el bucle FG de L1 HPV Y, que difiere del bucle FG de tipo HPV31 silvestre solo en un aminoacido (HPV 31 291T-N290 HPV16). Segun se esperaba, en ratones infectados con HPV16, esencialmente no se pueden encontrar anticuerpos especificos para HPV31, aunque se observa una solida respuesta para HPV31 (alrededor de 1900 GMT). De forma interesante, tampoco son detectables anticuerpos especificos para X e Y en ratones inmunizados con HPV 16 o HPV31, sugiriendo que esencialmente ni hay reactividad cruzada. Una reactividad cruzada moderada es detectable para X e Y en ratones inmunizados con X o Y (538 frente a 857 GMT para X e Y, respectivamente).

Los datos muestran que es posible disenar vectores pseudovirionicos con mutaciones que son virtualmente no reactivas cruzadamente con las especies de las que se derivan. Esta inmunogenicidad muy reducida permitira la readministracion de estos vectores sin una perdida drastica de la eficacia del transgen debida a la induccion de anticuerpos neutralizadores contra el vector en individuos infectados con HPV.

Ejemplo 4: Induccion de anticuerpos neutralizadores contra HPV heterologo mediante inmunizacion con pseudoviriones de HPV empaquetados con el gen de L2

La inmunizacion con L1 autoensamblada en particulas similares a virus (VLPs) induce altos titulos de anticuerpos neutralizadores y confiere proteccion en animales contra una infeccion experimental homologa [Breitburd y cols., J Virol 1995; 69(6):3959-63; Suzich y cols., PNAS 1995; 92(25):11553-7]. Tambien se ha mostrado que la proteccion esta mediada por anticuerpos neutralizadores dirigidos contra epitopos de conformacion. Estos resultados han conducido al desarrollo industrial de vacunas contra tipos genitales de HPV. Estudios preclinicos han mostrado que los anticuerpos neutralizadores inducidos por VLPs de L1 son predominantemente especificos del tipo [Roden y cols., J Virol 1994; 68(11):7570-4; Roden y cols., J Virol 1996; 70(9):5875-83]. Sin embargo, se han presentado bajos niveles de neutralizacion cruzada entre HPV6 y 11 y HPV 16 y 31 [Christensen y cols., Virology 1994; 205(1):329-35; White y cols., J Virol 1998; 72(2):959-64; Giroglou y cols., Vaccine 2001; 19(13-14):1783-93; Combita y cols., J Virol 2002; 76(13):6480-6] y niveles superiores entre HPV18 y 45 [McLaughlin-Drubin y cols., Virology 2003; 312(1): 1 -7]. Los experimentos clinicos han mostrado que la respuesta inmunitaria esta asociada con la proteccion contra infecciones por HPV16 y HPV18 y lesiones asociadas [Ault y cols., Lancet 2007; 369(9876):1861- 8; Paavonen y cols., Lancet 2007; 369(9580):2161-70]. Las vacunas para HPV actuales que contienen VPLs de L1 promueven la generacion de una fuerte respuesta de anticuerpos neutralizadores principalmente especifica para el tipo. Los experimentos clinicos con vacunas para HPV16 y 18 tambien han revelado que la proteccion cruzada contra tipos de HPV se limita a tipos estrechamente relacionados. La proteccion contra HPV31 se establecia

claramente para ambas vacunas y la proteccion contra la infeccion por HPV45 solamente para una vacuna [Paavonen y cols., Lancet 2007; 369(9580):2161-70; Brown y cols., J Infect Dis 2009; 199(7):926-35]. Como las vacunas para HPV autorizada solo eligen como diana dos de los 15 tipos de HPV de alto riesgo, se requieren estrategias adicionales para evitar la infeccion de otros tipos de HPV de alto riesgo.

5 La proteina L2 ha surgido como una posible vacunas profilactica, puesto que la inmunizacion con L2 en modelos en animales de infeccion por papilomavirus induce anticuerpos neutralizadores cruzadamente que son capaces de mediar en una proteccion mas amplia que las VLPs de L1 [Roden y cols., J Virol 1994; 68(11):7570-4; Christensen y cols., Virology 1991; 181(2):572-9; Yin y cols., Virology 1992; 187(2):612-9; Chandrachud y cols., Virology 1995; 211(1):204-8; Gaukroger y cols., J Gen Virol 1996; 77(7):1577-83; Campo y cols., Virology 1997; 234(2):261-6; 10 Roden y cols., Virology 2000; 270(2):254-7; Embers y cols., J Virol 2002; 76(19):9798-805] y hallazgos preclinicos y clinicos [Gambhira y cols., Cancer Res 2006; 66(23):11120-4; Alphs y cols., PnAs 2008; 105(15):5850-5; Karanam y cols., Vaccine 2009; 27(7):1040-9] han confirmado que las vacunas de L2 inducen anticuerpos neutralizadores cruzadamente de amplio espectro. Sin embargo, la proteina L2 y los peptidos de L2 son menos inmunogenicos que las VLPs de L1 y la incorporacion de la proteina L2 en VPLs de L1 no incrementa la respuesta anti-L2 debido a la 15 inmunodominancia de L1 [Roden y cols., Virology 2000; 270(2):254-7]. Esto sugiere que nuevas estrategias de vacunacion han de investigar si esta vacuna basada en L2 es eficaz.

Los objetivos de este estudio eran investigar la posibilidad de incrementar la exposicion de proteina L2 al sistema inmunitario para generar una vacuna para HPV de amplio espectro.

20 Materiales y metodos

Anticuerpos

El anticuerpo monoclonal CamVir-1 (BD Biosciences, Le Pont de Claix, Francia) se une a un epitopo lineal que se ha cartografiado entre los aminoacidos 203 a 209 de la proteina L1 de HPV-16 [Fleury y cols., Arch Virol 2006; 151 (8):1511 -23]. El MAb H16.V5 se dirige contra un epitopo de neutralizacion de conformacion de la proteina L1 de 25 HPV16 [Christensen y cols., Virology 1996; 223(1):174-84]. El inmunosuero de conejo anti-L2 de HPV16 fue proporcionado amablemente por Richard Roden. Se uso el anticuerpo para StrepTag II (conjugado a HRP) para detectar la presencia de peptido StepTagll sobre VLPs de HPV (Novagen, VWR, Fontenay sous Bois, Francia).

Lineas celulares 30

Celulas COS-7 (celulas renales de mono verde africano, ATCC CRL-1651) se hicieron crecer en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Invitrogen, Illkirch, Francia) complementado con 10% de suero de ternero fetal (FCS) termoinactivado, 100 IU/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina y 1 mmol/l de piruvato sodico. La linea celular 293FT (Invitrogen) es una variante de crecimiento rapido de la linea celular 293 que expresa establemente TAg de 35 SV40 y el gen de resistencia a neomicina procedente del plasmido pCMVPORT6AT.neo. Las celulas 293FT se hicieron crecer en medio de Eagle modificado de Dulbecco complementado como anteriormente mas 1% de aminoacidos no esenciales y 500 pg/ml de G418. Las lineas celulares se hicieron crecer a 37°C en una atmosfera humidificada con 5% de CO2.

Produccion de VPLs de HPV18, HPV31 y HPV58 en celulas de insecto

40 Se produjeron VLPs de L1/l2 de HPV58, VLPs de L1/l2 de HPV31 y VLPs de L1/l2 de HPV18 y se purificaron de celulas de insecto Sf21 infectadas con baculovirus recombinantes que codifican el gen tanto de L1 como de L2 segun describieron previamente Touze y cols., J Clin Microbiol. 1998; 36(7):2046-51; Combita y cols., FEMS Microbiol Lett 2001; 204(1):183-8].

Produccion y purificacion de proteina de fusion de L2-estreptactina (L2SA)

45 La secuencia de la estrectactina (SA) con el codon de inicio [Voss y cols., Protein Eng 1997; 10(8):975-82] incluyendo los sitios de restriccion aguas arriba (BamHI y SalI) y aguas abajo (Hind 111) fue sintetizada por Geneart (Regensburg, Alemania) usando una utilizacion de codones adaptada para la expresion en Spodoptera frugiperda. La secuencia de SA se clono entre los sitios SalI e HindIII del vector de expresion pFastBacDual (Invitrogen) a fin de obtener el plasmido pFastBacDual SA. A continuacion, el ORF de L2 de HPV16 se fusiono al extremo 5' del ORF de 50 SA. Con este proposito, el ORF de L2ANLS de HPV16 (aminoacidos 12 a 442) se amplifico mediante PCR a partir de un plasmido que contenia una version adaptada de codones de Homo sapiens del gen de L2 silvestre (FN297862) usando HPV16 L2 F y HPV16 L2A R. Se diseno un cebador directo para introducir un sitio BamHI y una secuencia de Kozak aguas arribas desde el codon de inicio y el cebador inverso contenia un sitio de restriccion SalI. A continuacion, el producto de PCR se clono mediante clonacion TA en el vector pCR2.1 (Invitrogen). La ausencia 55 de mutagenesis inducida por PCR no deseada se verifico a continuacion mediante secuenciacion. Los plasmidos

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tanto pCR2.1-16 L2ANLS como pFastBacDual SA se sometieron a restriccion con BamHI y Sail y el gen de L2 se fusiono al gen de estreptactina a fin de generar el pFastBacDual-16 L2ANLS (L2SA).

Un baculovirus recombinante que codifica L2SA se genero usando el sistema Bac-to-Bac (Invitrogen) segun las recomendaciones del fabricante. Celulas de insecto Sf21 se hicieron crecer a 27°C en medio SF900II complementado con penicilina, estreptomicina y anfotericina B (Invitrogen). Las celulas se infectaron a una m.o.i. de diez y se hicieron crecer durante cuatro dias. Las celulas se separaron por raspado, se centrifugaron a 300xg y a continuacion se resuspendieron en PBS IX que contenia 0,5% de Nonidet P40 y un coctel antiproteasa (Roche, Meylan, Francia) y se incubaron sobre hielo durante 30 min. El lisado se centrifugo a 4°C durante 10 min a 12.000xg y el sobrenadante representaba la fraccion citoplasmica. La pella, que representaba la fraccion nuclear, se sometio a ultrasonidos (3 rafagas, 15 s, Vibracell, Fischer Scientific, Francia). La expresion de la proteina L2SA se analizo mediante transferencia Western. Con este proposito, las proteinas se separaron mediante 12,5% SDS PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Protran BA83, Schleicher y Schuell, Mantes la Ville, Francia). La membrana se saturo durante la noche a 4°C en TNT (15 mmol/l de Tris, 140 mmol/l de NaCl, 0,05% de Tween 20) que contenia 5% de leche en polvo baja en grasa y a continuacion se lavo tres veces con TNT-5% de leche. Las membranas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con anti-L2 policlonal de conejo, se diluyeron 1/1000 en TNT-5% de leche, a continuacion se lavaron tres veces y se anadio anti-(Fc de IgG de raton) caprino conjugado a fosfatasa alcalina (Sigma Aldrich) (1/2,500 en TNT-5% de leche). Despues de la incubacion durante 1 h a temperatura ambiente y tres lavados en TNT-5% de leche mas dos lavados en TNT, las inmunotransferencias se desarrollaron usando el sistema de sustrato liquido BCIP/NBT (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia). La proteina L2SA se purifico mediante afinidad sobre iminobiotina inmovilizada segun las instrucciones del fabricante (Pierce, Ozyme, Montigny le Bretonneux, Francia).

Produccion de VLPs de L1L2SA

El gen L1 16-StepTagII se construyo despues de dos etapas de PCR usando cebadores que permitian la insercion de peptido de StepTagII (STII, WSHPQfEk, SEQ ID NO: 12) [Schmidt y cols., Nat Protoc 2007; 2(6):1528-35] en la posicion 140-141 del gen de la capside de L1 de HPV 16 silvestre segun se describia previamente [Sadeyen y cols., Virology 2003; 309(1):32-40]. En la primera etapa de PCR, se usaron For L116 STII/STII inverso y STII directo/L116 STII inv con un gen de L1 de HPV16 que presentaban una utilizacion de codones humanizados como plantilla. Los dos fragmentos solapados asi obtenidos se fusionaron en una segunda etapa de PCR usando cebadores For L116 STII / L116 STII inv a fin de generar la secuencia de L1 16 StrepTagII (L1STII). El producto de PCR final se clono y se secuencio como anteriormente y finalmente se clono entre BamHI y HindIII del plasmido pFastBacDual para to generar un baculovirus recombinante.

Las VLPs se purificaron de celulas de insecto infectadas mediante ultracentrifugacion en un gradiente de CsCl. La union de proteina L2SA a VLPs de L1STII se obtuvo al mezclar VLPs de L1STII con proteinas de fusion L2SA en el tampon de interaccion (100 mmol/l de Tris HCl pH 8, Nacl 1 M, 0,25% de Triton X100). Para analizar las VLPs quimericas obtenidas (L1L2SA VLPs), las VLPs se nodulizaron mediante ultracentrifugacion (60.000 rpm, 1 h) en un rotor SW-60 (Beckman) y a continuacion se analizaron segun la presencia de L2 y Strep-Tag mediante transferencia Western como anteriormente.

Produccion de VLPs de HPV 31 con el peptido de L2 de HPV31 (13-88) insertado en el bucle DE.

El epitopo de neutralizacion cruzada (aminoacidos 13-88) de la proteina L2 de HPV31 se selecciono para la insercion con la proteina L1 [Pastrana y cols., Virology 2005; 337(2):365-72; Gambhira y cols., J Virol 2007; 81 (21):11585-92; Richards y cols., PNAS USA 2006; 103(5):1522-7]. La secuencia del gen de L1 de HPV 31 que contenia el sitio de restriccion XhoI y SmaI en la posicion 140-141 se construyo mediante dos etapas de PCR [Fleury et Clin Vaccine Immunol 2008; 15(1):172-5] a fin de insertar la secuencia del peptido L2 de HPV 31 13-88 (L213-88) usando pIRES31L1L2h. En la primera etapa de PCR, las partes 5' y 3' de HPV L1 31 se amplificaron usando L1h31 directo/L1 inverso y L1h31 inverso/L1 directo como cebadores. Estos dos fragmentos se usaron como plantilla en la segunda etapa de PCR usando L1h31 directo/L1h31 inverso como cebador. A continuacion, este producto de PCR se clono en pCR TOPO 2.1, se secuencio y se subclono en plasmido pFastBacl previamente digerido mediante BamHI y HindIII. El ADN que codifica el fragmento 13-88 del gen de L2 de HPV 31 se amplifico a partir de los cebadores directo e inverso pIRES31L1L2h y L213-88 y se clono como anteriormente. Tanto pCR 2.1 TOPO/ L213- 88 como pFastBac1/ L1 se digirieron mediante XhoI/SmaI a fin de insertar la secuencia que codifica el peptido L2 de HPV. Se genero un baculovirus recombinante que codifica la proteina L1-L213-88 y las celulas de insecto se infectaron como anteriormente.

Tabla 5. Secuencia de oligonucleotidos usada

Nombre

Cebador (5'^ 3') Sitio de restriccion

L116 STII dir

GGATCCCACCATGAGCCTGTGGAGACCCAGC (SEQ ID NO: 51) BamHI

L116 STII inv

AAGCTTTCACTTCTTGGTTTTCTTCCGCTTG (SEQ ID NO: 52) HindIII

STII inv

CTTCTCGAACTGGGGGTGGCTCCAGTTCTCGGTGTCGTCCAGCTTGTTC (SEQ ID NO: 53)

STII dir

TGGAGCCACCCCCAGTTCGAGAAGGCCAGCGCCTACGCCGCCAACGCC (SEQ ID NO: 54)

L1h31 inv

AAGCTTTCACTTCTTGGTTTTCTTCCGCTTG (SEQ ID NO: 55) HindIII

L1h31 dir

GGATCCCACCATGAGCCTGTGGAGACCCAGC (SEQ ID NO: 56) BamHI

L1 inv

CGGGTCTAGAGAATTCTCGAGAGGGCCTCCGGCGTATCTGTTGC SEQ ID NO: 57) SmaI

L1 dir

CTCGAGAATTCTCTAGACCCGGGCACCGATAACAGGGAGTGC (SEQ ID NO: 58) XhoI

L2 inv

CCCGGGGGCCAGGGTGTCGGTGGCGGT (SEQ ID NO: 59) SmaI

L2 dir

CTCGAGGCCAGCGCCACCCAGCTGTACAAG (SEQ ID NO: 60) XhoI

HPV16 L2A I

GTCGACCATGTAGTAGCTGGGGTGCAGGATG (SEQ ID NO: 61) SalI

HPV16L2D

CCGGATCCGCCACCATGGCCAGCGCCACCCAGCTG (SEQ ID NO: 62) BamHI

L231ANLS dir

CCCTCTAGAGCCACCATGGCCAGCGCCACCCAGCTGTAC (SEQ ID NO: 63) XbaI

L231ANLS inv

GCGGCCGCTATCACAGGATGTAGTAGCTGGGGTGCAG (SEQ ID NO: 64) NotI

Produccion de pseudoviriones de HPV58 y HPV31

5 Se obtuvieron pseudoviriones de HPV31 y 58 usando un sistema celular con genes de capside de HPV modificados codonicamemente [Bucki y cols., Methods Mol Med 2005; 119:445-62]. Brevemente, los genes de L1 y L2 de HPV 58 se disenaron para contener los codones mas frecuentemente usados encontrados en genes altamente expresados en Homo sapiens (FN178626 y FN178627, respectivamente). Los genes de L1 y L2 se clonaron en el vector de expresion bicistronico de mamifero pIRES (BDBiosciences, Clontech). El gen de L1 se clono entre los 10 sitios de restriccion Nhel y EcoRI de MCS A aguas abajo del promotor IE de CMV. El gen de L2 se clono

posteriormente entre los sitios de restriccion Xbal y Notl de MCS B de pIRES-L1. Plasmido de ADN que codifica luciferasa (pGL3 luc, Promega, Charbonnieres-les-Bains, Francia) o pIRES L2 ANLS usado para la produccion de pseudoviriones se preparo mediante preparacion clasica de ADN con fenol/cloroformo. El ultimo plasmido contiene la secuencia de ADN que codifica los aminoacidos 12 a 442 de la L2 de HPV31 entre los sitios de restriccion XbaI y 15 NotI. Esta secuencia se amplifico por PCR a partir de un plasmido que contiene un gen de L2 de longitud completa de HPV31 adaptado codonicamente de Homo sapiens [Fleury y cols., Clin Vaccine Immunol 2008; 15(1 ):172-5]. Para la generacion de pseudoviriones en celulas 293FT, las celulas se transfectaron con 0,5 gg de ADN (0,25 gg de plasmido pGL3-Luc, o pCMV-GFP o pIRES-L2, 0,25 gg de plasmido L1L2) y 1 gl de Fugene6 (Roche) por cm2 de la superficie de cultivo. Las celulas se recogieron dos dias despues de la transfeccion y los pseudoviriones se 20 purificaron como se describio previamente [Fleury y cols., Clin Vaccine Immunol 2008; 15(1):172-5] y se

almacenaron a -80°C hasta el uso. Las cantidades de pseudoviriones se determinaron mediante transferencia Western usando el anticuerpo CamVir-1 por comparacion con concentraciones conocidas de VLPs de tipos homologos.

Produccion de pseudoviriones de HPV 16 y 18

25 Se produjeron pseudoviriones de HPV16 y 18 mediante el metodo de desensamblaje-reensamblaje previamente publicado [Touze y cols., Nucleic Acids Res 1998; 26(5):1317-23] con algunas modificaciones [Bousarghin y cols., Mol Cancer Ther 2009; 8(2):357-65]. VLPs de L1/L2 (100 gg) se incubaron en 50 mmol/l de tampon de Tris-HCl (pH 7,5) que contenia 20 mmol/l de DTT y 1 mmol/l de EGTA durante 30 min a temperatura ambiente. En esta fase, se

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anadio pGL3 luc (10 pg) a las VLPs perturbadas. A continuacion, la preparacion se diluyo con concentraciones crecientes de CaCl2 (hasta una concentracion final de 5 mmol/l) y en presencia de ZnCl2 10 nM. A continuacion, los pseudoviriones se dializaron contra PBS IX durante la noche y se almacenaron a 4°C antes del uso.

Protocolo de inmunizacion.

Ratones BALB/c hembra de seis semanas de edad (CERJ Janvier, Le Genest St Isle, Francia) se inmunizaron intramuscularmente con las diferentes preparaciones de vacuna. Los ratones del grupo 1 recibian solucion salina, los ratones de los grupos 2 a 5 recibian 10 pg proteina L2-SA de HPV 16 (L2SA), L1STII-L2SA (VLPs de L1L2SA), HPV16 L1L2 (VLPs de L1L2) con o sin hidroxido de aluminio, respectivamente. Los ratones de los grupos 6 y 7 recibian 1 o 10 pg de plasmido pIRES-HPV31 L2ANLS (ADN L2), respectivamente. Los ratones de los grupos 8 a 10 recibian VPLs de L1 de HPV31, L1-31 L213-88 de HPV31 (L1/L2(13-88)VLPs), VLPs de L1L2 de HPV31 (31 L1L2 VLPs), respectivamente. Los ratones del grupo 11 recibian 10 pg de pseudoviriones de HPV31 que contenian plasmido de expresion de ORF2108-660 de HEV (HEV PsV). Los ratones de los grupos 12 y 13 recibian pseudoviriones de HPV58 que contenian plasmido de expresion de GFP (GFP PsV) y pseudoviriones de HPV58 empaquetados con plasmido HPV31L2ANLS (L2 PsV), respectivamente. La cantidad de proteina L1 se ajusto entre los diferentes VLPs de L1L2 VLPs y pseudoviriones mediante analisis por transferencia Western. Los ratones fueron inmunizados los dias 0, 7 y 21. Dos semanas despues de la ultima inyeccion, se recogieron muestras de suero y se almacenaron a -20°C. Todos los procedimientos con animales se realizaron segun los protocolos aprobados y segun las recomendaciones para el uso y cuidado apropiados de animales de laboratorio y los experimentos estaban aprobados por el comite regional de etica con animales (CREEA Centre Limousin).

Determinacion de titulos de suero anti-HPV mediante ELISA

Se distribuyeron doscientos nanogramos de VLPs en la mitad de los pocillos de una placa de 96 pocillos (Maxisorp, Nunc, ATGC, Marne-la-Vallee, Francia) y se incubaron a 4°C durante la noche. Despues de dos lavados con PBS- Tween (0,1%), los pocillos se saturaron con PBS complementada con 1% de FCS durante 1 h a 37°C. Pocillos duplicados (uno de prueba y uno de control) se incubaron con diluciones dobles (partiendo de 1:25) de sueros de ratones en tampon de dilucion (PBS 5X, 1% de Tween, 10% de FCS) durante 1 h a 45°C. Despues de cuatro lavados, se anadio a los pocillos anti-(IgG de raton) caprino conjugado a peroxidasa (especifico de Fc) (Sigma Aldrich) diluido 1:1.000 en PBS - Tween (1%) - FCS (10%) y se incubo durante 1 h a 45°C. Despues de cuatro lavados, se anadieron 0,4 mg/ml de o-fenilen-diamina y 0,03% de peroxido de hidrogeno en 25 mmol/l de citrato sodico y 50 mmol/l de Na2HPO4. Despues de 30 min, la reaccion se detuvo con H2SO4 4 N y la densidad optica (OD) se leyo a 492 nm. Para el analisis de datos, los valores de OD obtenidos en ausencia de L2 se sustrajeron de los valores de OD de antigenos de prueba. Un resultado se consideraba positivo cuando la diferencia en OD entre los pocillos de prueba y control era mayor de 0,2. Losa titulos individuales representaban la reciproca de la ultima dilucion de daba una diferencia de OD mayor de 0,2. Los valores para ratones individuales era las medias de duplicados. Se calcularon los titulos medios geometricos (GMTs) para cada grupo. A los animales sin titulos de anticuerpo detectables (<25) se les asigno un titulo de 1 para el calculo de los GMTs. Para la deteccion de anticuerpos anti-L2, se realizo el mismo ELISA que anteriormente con la diferencia de que se anadio proteina L2SA purificada a cada pocillo de las placas Nunc en lugar de las VLPs.

Deteccion de los motivos L1, L2 y Strep-Tag mediante ELISA.

La antigenicidad de L1 de VLPs quimericas y la presencia de motivos L2 o Strep-Tag sobre la superficie de las VLPs se analizaron mediante ELISA. Los pocillos de las placas de microvaloracion se revistieron a 4°C durante la noche con 200 ng de VLPs. Los ELISAs se realizaron como anteriormente usando un anticuerpo monoclonal anti- StrepTagII o un anticuerpo anti-L2 policlonal para la investigacion de la presencia del motivo StrepTagII y la proteina L2 sobre la superficie de las VLPs, respectivamente, o anticuerpos monoclonales H16.V5 y H31.F16 para investigar la presencia de los epitopos de conformacion de proteinas L1 de HPV 16 y HPV 31, respectivamente.

Ensayos de neutralizacion de pseudoviriones de HPV16, 18, 31 y 58

Se realizaron ensayos de neutralizacion mediante la inhibicion de la pseudoinfeccion de celulas COS-7 mediante pseudoviriones que contienen el plasmido pGL3-luc. Las celulas COS-7 (104/pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos (TPP, ATGC). Despues de 24 h de incubacion a 37°C, las celulas se lavaron dos veces antes de la adicion de mezcla de pseudoviriones/sueros diluidos. La cantidad de pseudoviriones se ajusto para obtener una actividad relativa de luciferasa de 0,2 RLU (Luminoskan Ascent, Thermo scientific, Courtaboeuf, Francia) (1:500 para HPV16, 1:50 para HPV 18, 1:800 para HPV31 y 1:10,000 para HPV 58) y 50 pl de pseudoviriones diluidos se mezclaron con 50 pl de sueros de ratones diluidos mediante dilucion doble en DMEM incompleto de 1:25 a 1:51.200. Despues de 1 h de incubacion a 37°C, la mezcla se anadio a los pocillos. Despues de 3 h a 37°C, se anadieron 100 pl de DMEM completo.

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Despues de la incubacion a 37°C durante 48 h, se midio la expresion del gen de luciferasa (Firefly luciferase 1-step assay kit, Fluoprobes, Interchim, Montlugon, Francia). Los resultados se expresaron como el porcentaje de inhibicion de actividad de luciferasa [Richards y cols., PNAS USA 2006; 103(5):1522-7]. Los datos presentados son las medias de 2 a 3 determinaciones realizadas por duplicado. Los titulos de neutralizacion se definieron como la reciproca de la dilucion mas alta de sueros de ratones que inducia al menos 50% de reduccion en la actividad de luciferasa. Se calcularon los titulos medios geometricos para cada grupo. A los animales sin anticuerpos neutralizadores detectables se les asigno un titulo de 1 para el calculo de los GMTs. Los anticuerpos neutralizadores para HPV-16 solo se investigaron en los grupos 10, 12 y 13.

Analisis estadistico

Los titulos de anticuerpos individuales y los titulos medios geometricos se compararon para evaluar ELISA y las respuestas neutralizadoras. Los resultados del grupo (10 animales por grupo) se compararon mediante la prueba de la t de Student usando el software XLStat (Addinsoft, Paris, Francia).

Resultados

Produccion de particulas quimericas de HPV31 L2 y HPV16 L2 y pseudoviriones de HPV58 que codifican L2

Los presentes inventores produjeron dos particulas de L1-L2 quimericas para investigar el potencial de vacunas de L2 para proteger contra un amplio espectro de tipos de HPV. A fin de decorar el exterior de la capside con L2, la primera se basaba en la interaccion entre una proteina de VLP modificada con L1 de HPV 16 y una proteina L2 de HPV16 fusionada a estreptactina, una version manipulada de la estreptavidina. Para conseguir esto, el peptido de StrepTagll (WSHPQFEK, SEQ ID NO: 12), una secuencia que imita el bucle de union de biotina, se inserto en el bucle DE entre las posiciones 140/141 de la proteina L1 para evitar el acoplamiento quimico de biotina a VLP de L1 con el riesgo de acoplar la biotina a epitopos neutralizadores de L1. Cuando se expresaba en celulas de insecto Sf- 21 usando baculovirus recombinantes y se purificaba sobre gradientes de CsCl, la proteina recombinante L1STII se autoensamblaba en particulas similares a virus con la misma apariencia y un rendimiento similar a la proteina L1 silvestre (Fig. 16). Los portaobjetos se tenian negativamente con acetato de uranilo y se observaban mediante microscopia electronica de transmision a una amplificacion de 50.000x (barra=200 nm).

La segunda proteina L1/L2 quimerica contenia el peptido L2 de HPV31 (aa 13-88) insertado dentro del bucle DE de la proteina L1 de HPV31. Cuando se expresaba en celulas de insecto usando baculovirus recombinantes, la proteina recombinante L1 L2(13-88) no permitia la produccion de VLPs bien conformadas, pero daba como resultado principalmente agregados de proteinas y/o capsomeros (Fig. 16).

La antigenicidad para L1 de estas dos VLPs quimericas se investigo mediante ELISA usando MAbs anti-L1 dirigidos contra epitopos de conformacion y lineales (Fig. 17). Los resultados indicaban que el epitopo de L1 de conformacion reconocidos por H16.V5 sobre VLPs de HPV16 L1STII quimericas no resultaba afectado. Sin embargo, se observaba una reduccion clara en la union del MAb H31.F16 a VLPs de HPV31 L1-L213-88 en comparacion con la observada con VLPs de L1 de HPV31. La presencia de StrepTagII o peptido de L2 (13-88) sobre la superficie de las VLPs tambien se investigo mediante ELISA usando un MAb dirigido contra la secuencia de StrepTagII o un anticuerpo anti-L2 policlonal, respectivamente. Los resultados obtenidos (Fig. 17) mostraba que las secuencias de StrepTagII y L2 estaban presentes sobre la superficie de las VLPs quimericas.

Ademas, se determino la capacidad de VLPs de L1STII para unirse a proteina L2SA al mezclar 5 gg de las VLPs con 10 gg de proteina de fusion L2SA correspondiente a una relacion de masas de 1/1 (una proteina L2SA/una proteina L1). La union de L2SA a VLPs de L1STII se analizo mediante la ultracentrifugacion de las VLPs complejadas seguida por la deteccion de proteina L2SA mediante transferencia Western. La deteccion de L2SA y VPs de L1STII en la pella de ultracentrifugacion (Fig. 18) indicaba que la proteina L2SA se unfa eficazmente a las VLPs. La union no se observaba cuando L2SA se mezclaba con VLPs de HPV16 silvestre. La presencia de proteina L2 en las VLPs de L1L2SA tambien se evidenciaba mediante ELISA (Fig. 17). Se produjeron pseudoviriones de HPV 58 empaquetados con un plasmido que codifica el gen L2ANLS de HPV--31 en celulas 293 FT. Su capacidad para transducir el gen L2 se investigo mediante infeccion de celulas COS-7. El analisis por transferencia Western de la expresion de proteina L2 indicaba que L2 se detectaba dos dias despues de la transduccion (Fig. 18). A fin de descartar la posibilidad de que la L2 detectada en celulas COS-7 se debiera a la presencia de los pseudoviriones introducidos, las celulas COS-7 se transdujeron con pseudoviriones similares empaquetados con el gen de GFP. La presencia de L2 no se evidenciaba en estas condiciones (Fig. 18).

Respuesta inmunitaria anti-HPV16-L2 en ratones inmunizados con VLPs quimericas y pseudoviriones.

No se detectaban anticuerpos anti-L2 de HPV16 en ratones no inmunizados (grupo 1). En ratones que recibian la proteina L2SA (grupo 2), se observaba un GMT anti-L2 de 348 (Tabla 6). Se observaba un incremento en los niveles

de anticuerpo anti-L2 en ratones inmunizados con las VLPs de L1L2SA HPV16 y las VLPs de L1L2 de HPV16 (grupos 3 y 4), con GMTs de 1.160 y 1.055 (p = 0,035 y p=0,05), respectivamente. La adicion de hidroxido de aluminio como adyuvante a VLPs de L1L2 de HPV16 (grupo 5) incrementaba adicionalmente el nivel de anticuerpos anti-L2 homologos de un modo no significativo (p=0,247).

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No se detectaban anti-L2 en ratones inmunizados con VLPs de L1 de HPV31 (grupo 8), pero en todos los ratones inmunizados las VLPs de L1L213-88 (grupo 9) con un GMT de 730 y un nivel superior en ratones inmunizados con las LIL2 VLPs (grupo 10) con un GMT de 1.100 (p =0,189). Se detectaban anticuerpos anti-L2 a niveles similares en ratones inmunizados con pseudoviriones de control (grupo 11 y 12) con un GMT de 855 y 1.212 (p=0,459). Mediante 10 comparacion con estos pseudoviriones de control, el GMT de anti-L2 (2.600) era superior en ratones inmunizados con pseudoviriones que codifican L2 (p=0,001 y p=0,101, respectivamente).

Tabla 6:

Lote N2

Nombre Vacunas L1 L2 Anti-L2 Titulos de neutralizacion HPV18 HPV31 HPV58

1

Solucion salina - - - - - -

_____________________________________________________________________________________

2

L2SA - 16 348 - -

3

VLPs de L1L2SA 16 16 1.600 - - -

4

VLPs de L1L2 16 16 1.055 - - -

5

VLPs de L1L2 +Ady. 16 16 2.064 - 85 -

_____________________________________________________________________________________

6

ADN L2 (1 |jg) - 31 - - - -

7

ADN L2 (10 pg) - 31 - - - -

_____________________________________________________________________________________

8

VLPsde L1 31 - - - 2,800 -

9

VLPs de L1 L2(13-88) 31 31 730 - - -

10

VLPs de L1L2 31 31 1.100 - 3,400 65

11

PsV de HEV 31 31 855 - 5,198 54

_____________________________________________________________________________________

12

PsV de GFP 58 58 1.212 - 50 4.650

13

PsV de L2 58 58/31 2.600 400 733 5.382

15

Induccion de anticuerpos neutralizadores contra HPV18, HPV31 y HPV58

Ninguno de los ratones inmunizados con proteina L2SA de HPV16 o VLPs de HPV16L1L2 (grupos 3 a 5) desarrollaba anticuerpos neutralizadores contra tipos de HPV heterologos (HPV18, HPV31 y HPV58) (Tabla 6). Solo se detectaron niveles bajos de anticuerpos neutralizadores contra HPV31 (GMT 85) cuando se anadia hidroxido de 20 aluminio a las VLPs de HPV16 obtenidas mediante autoensamblaje de proteinas L1 y L2 (grupo 5).

En ratones inmunizados con VLPs de L1 de HPV31 o L1L2 de HPV31 y PsV de HEV HPV31 (grupos 8, 10 y 11), se detectaban anticuerpos neutralizadores de HPV31 homologos, con GMTs de 2.800, 3.400 y 5.198, respectivamente (Figura 19). Solo se observaban titulos bajos de anticuerpos neutralizadores para HPV58 en ratones que recibian 25 VLPs de L1L2 de HPV31 (grupo 10) y pseudoviriones de HPV31 que contenian el gen irrelevante de ORF2 de HEV (grupo 11). No se detectaban anticuerpos neutralizadores contra HPV18 en ningunos de los ratones de los grupos 8 a 11 que recibian preparaciones de vacuna de HPV31.

Se detectaron altos niveles de anticuerpos neutralizadores homologos en ratones inmunizados con pseudoviriones 30 de HPV58 (grupos 12 y 13) con GMTs de 4.650 y 5.382, respectivamente. Se detectaron bajos niveles de anticuerpos neutralizadores para HPV31 (GMT=50) en ratones inmunizados con pseudoviriones que codifican GFP y se observaba un incremento drastico en anticuerpos neutralizadores anti-HPV31 (con un GMT de 733) en ratones inmunizados con pseudoviriones de HPV58 que codifican la proteina L2 de HPV31. Solo se detectaban anticuerpos neutralizadores contra HPV18 en ratones inmunizados con PsV de L2 de HPV58, con un GMT de 400. Los ratones 35 de los grupos 10, 12 y 13 tambien se investigaron con respecto a anticuerpos neutralizadores para HPV16. Los ratones inmunizados con VLPs de L1L2 de HPV31 desarrollaban bajos niveles anticuerpos neutralizadores para

Claims (10)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion para el uso en el aporte de uno o mas compuestos heterologos a un sujeto, comprendiendo la composicion una nanoparticula que comprende uno o mas compuestos heterologos y una proteina L1 de papilomavirus humano (HPV) modificada que tiene una inmunogenicidad reducida con relacion a HPV16 silvestre, en donde la secuencia de aminoacidos de la proteina L1 de HPV modificada corresponde a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 que comprende las sustituciones de aminoacidos D273T, N285T y S288N.
2. 2. La composicion para el uso segun la reivindicacion 1, en la que la secuencia de aminoacidos de la proteina L1 de HPV modificada comprende ademas las sustituciones de aminoacidos L260F, A264S, A266T y N270S.
3. 3. La composicion para el uso segun la reivindicacion 1, en la que el uno o mas compuestos heterologos comprenden uno o mas agentes terapeuticos y/o medicos.
4. 4. La composicion para el uso segun la reivindicacion 1, en la que la nanoparticula en una nanoparticula autoensamblada.
5. 5. Una composicion para el uso en un metodo para administrar uno o mas compuestos heterologos a un sujeto, comprendiendo el metodo:

   administrar una primera nanoparticula que comprende uno o mas compuestos heterologos al sujeto durante un primer periodo y

   administrar una segunda nanoparticula que comprende el uno o mas compuestos heterologos al sujeto durante un segundo periodo, en donde las nanoparticulas primera y segunda tienen diferentes serotipos, en donde la primera nanoparticula y/o la segunda nanoparticula comprende una proteina L1 de papilomavirus humano (HPV) modificada que tiene inmunogenicidad reducida con relacion a HPV16 silvestre, en donde la secuencia de aminoacidos de la proteina L1 de HPV modificada corresponde a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 que comprende las sustituciones de aminoacidos D273T, N285T y S288N.
6. 6. La composicion para el uso segun la reivindicacion 5, en la que el uno o mas compuestos heterologos comprenden uno o mas agentes terapeuticos y/o medicos.
7. 7. La composicion para el uso segun la reivindicacion 5, en la que la secuencia de aminoacidos de la proteina L1 de HPV modificada comprende ademas las sustituciones de aminoacidos L260F, A264S, A266T y N270S.
8. 8. La composicion para el uso segun la reivindicacion 5, en la que las nanoparticulas primera y segunda son nanoparticulas autoensambladas.
9. 9. Una composicion para el uso en un metodo de aporte de uno o mas compuestos heterologos a un sujeto, comprendiendo la composicion una nanoparticula que comprende uno o mas compuestos heterologos y una proteina L1 de papilomavirus humano (HPV) modificada que tiene una inmunogenicidad reducida con relacion a HPV16 silvestre, en donde la secuencia de aminoacidos de la proteina L1 de HPV modificada corresponde a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 que comprende un bucle FG que tiene sustituciones de aminoacidos que consisten en D273T, N285T y S288N.

   imagen1

   shE6-2

   imagen2

   imagen3

   porcentaje de celulas viables

   imagen4

   Peso del tumor (gramos)

   A Pseudoviriones de HPV de ARNsH de E7-1

   imagen5

   VLPs solas

   imagen6

   Peso del tumor (gramos)

   Tamano medio del tumor(mm)

   imagen7

   Peso medio de los tumores (gramos)

   B

   1.05 0.49

   3
10. 2.5 2

    1.5 1

    0,5 0

    Pv de control Pv de E7-1

    Tratamiento de tumores de celulas TC1

    imagen8

    imagen9

    HPV31L1-HBC

    H31.D24

    H31.F7

    H31.B1

    H31.F16

    H31.H12

    imagen10

    RSGTVGESV(SEQ ID NO: 50) SGTVGESVP (SEQ ID NO: 48) RSGTVG(seq id NO: 4Q)

    cx>

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    o

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    3

    o

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    O

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    imagen15

    imagen16

    L mi

    imagen17

    'nI

    00

    VLPs de HPV

    I6\vt 1649 16431 31 wt 3149 31431

    imagen18

    imagen19

    imagen20

    16 25b-FVkHLFNBa.Ga.VGENVPDDL YIKGSGSTANLASSNYFPT-294 (SEQ ID NO: i)

    x ------------------T-----------T—N-------

    Y ----F S-T S—T-----------T—N-------

    31 257-FVRHFFNRSGTVGESVPTDLYIKGSGSTATLANSTYFPT-295 (SEQ ID NO: 2)

    imagen21

    imagen22

    imagen23

    00

    -p*

    Reactividad relativa

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    CO

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    imagen24

    Reactividad de L2

    Reactividad relativa

    Reactividad relativa

    V)

    CD T3 —I 0) (Q

    imagen25

    Figura 17

    imagen26

    imagen27