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JP7641005B2 - コンジュゲート型ウイルス様粒子および抗腫瘍免疫リダイレクタとしてのその使用 - Google Patents

コンジュゲート型ウイルス様粒子および抗腫瘍免疫リダイレクタとしてのその使用 Download PDF

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Description

優先権
本出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられる、２０１８年１２月２７日出願の米国特許仮出願第６２／７８５，５０２号の優先権および利益を主張する。
ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表の参照
ＥＦＳ－Ｗｅｂの法的枠組みおよび３７ＣＦＲ§§１．８２１－８２５（ＭＰＥＰ§２４４２．０３（ａ）参照）に準じて、ＡＳＣＩＩ対応テキストファイルの形態の配列表（表題「８００２ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」として２０１９年１２月２６日に２８，５７２バイトのサイズで作成）が、本出願と同時に提出されており、この配列表の全内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
発明の分野
本発明は、腫瘍を優先的に結合するコンジュゲート型ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。本発明のＶＬＰは、ＶＬＰが結合された腫瘍を選択的に攻撃する既存のリコールタンパク質特異性Ｔ細胞を利用してＴ細胞応答を誘発できるリコールタンパク質を含む。
背景
米国国立癌研究所によれば、全癌死亡率は、減少し続けており：全癌罹患率は、男性で下降し、女性では変化がない。５年生存率もまた、全てではないがほとんどの一般的癌で改善してきた。とはいうものの２０１７年には米国だけで、さらなる１，６８８，７８０例の新たな癌症例が診断され、６００，９２０例の癌死亡があると推定される。典型的な癌処置としては、化学療法、放射線照射、および手術が挙げられる。しかし手術は、高度に侵襲性であり、多くの場合、特に転移後は奏功しない。化学療法および放射線照射は、効果的であるが、過酷な副作用を生じ、生活の質を劇的に低減する。これらの処置にもかかわらず、多くの癌は依然として難治性であり、原発腫瘍の低減または排除に成功したとしても、転移癌との闘いには無効である可能性がある。標的化デリバリーは、これらの疾患の処置を改善するための最も有望な、しかし最も挑戦的な機会になった。デリバリービヒクルを開発する最初の試みは、抗体－薬物コンジュゲートであった。ほぼ全ての例で、目的は、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を癌細胞の部位に送達して、癌細胞の選択的殺傷を実現することである。より近年になり、そのような免疫療法を利用して免疫系を刺激し、かつ癌細胞表面に優先的に存在するタンパク質を特異的に標的化し、癌細胞の標的排除をもたらす、試みがなされた。そのような治療は、それらが標的特異的であり、潜在的に非特異的自己免疫なしに毒性が低いという点で魅力的である。それらはまた、手術、放射線照射または化学療法に比較して侵襲性および外傷性が低いと見なされる。しかし、癌関連抗原を基にした癌ワクチンは、例えば臨床的免疫原性、免疫寛容およびオフターゲット効果に乏しいため、限定的な成功を有する可能性がある。その上、そのような方法は典型的には、所与の患者の癌に特異的な癌関連抗原を同定して癌の効果的標的化を実現することを必要とする。
こうしてこのアプローチは、ほとんどの癌関連抗原が免疫系により寛容され、乏しい免疫応答をもたらす自己抗原であるため、多くの場合奏功しなかった。重要なことに、ゴールドスタンダードの動物モデルにおけるこれらの特異的な癌抗原特異性免疫療法により実証された成功は、必ずしもヒトに転換可能ではなかった。最後になるが、癌に罹患した患者が全員、腫瘍上で同じ抗原を発現するとは限らず、こうして広範囲の適用可能性については限界がある。近年になりこの分野は、癌特異性ネオエピトープをもたらし得る患者の個々の腫瘍変異に注目するよう切り替わっている。「ネオアンチゲン」と称されるこれらのネオエピトープを抗原として利用することは、癌ワクチンの領域をよみがえらせた。しかしこれは、大変長い開発時間を伴い、経費がかかり、かつ広範囲での実行が困難な、非常に個人向けの治療である。同様の限界が、治癒的であるがコンジュゲート型抗原受容体Ｔ細胞を基にした（ＣＡＲ－Ｔ細胞）方策でも見られる。
支持を得てきた治療薬の一分類は、免疫チェックポイント遮断療法である。この処置方式は、腫瘍の成長および進行が、免疫系による特異的標的化および破壊を予防する能力により駆動される、という前提に基づく。これを考慮して、チェックポイント阻害療法は、そのような「免疫抑制」をよみがえらせ、それにより免疫系の適当かつ効果的な抗腫瘍機能を再始動するように作用する。事実、これらの治療は、過去に非常に予後不良であった種々の癌（黒色腫、大腸癌）で著しい利益を示した。しかし、腫瘍微小環境が癌を根絶する内在性抗腫瘍免疫細胞の能力をくじくことは、よく確立されている。つまり、チェックポイント経路のメンバーであるプログラム細胞死１（ＰＤ－１）またはプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）を標的とする薬物は、免疫抑制経路を遮断するよう働き、癌と戦う体内の免疫系を支援することが示されている。あいにくチェックポイント阻害薬は、患者の大部分で働かず、７０％という残念な非応答率である。これは主として、腫瘍に浸潤し得る既存の抗腫瘍ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答の欠如による。このためチェックポイント阻害薬は一般に、特に腫瘍が出現部位で発達する早期発達期の間に、著しい抗腫瘍免疫浸潤（「冷たい腫瘍」または「非免疫原性」として知られる場合もある）が欠くことの多い癌を処置する際には無効と見なされる。
この結果として、現行の処置は、毒性、限定された応答者集団（非常に多種の癌に適用可能でない）の同様の認識される限界が依然としてあり、最も重要なことに、それらはまた、開発段階で法外に高い経費がかかり、患者にとってより高額の医療費を生じる。それゆえ、免疫寛容および免疫浸潤欠如の問題を巧みに回避し得る代替的な免疫療法方策を考慮することが重要であり、こうして個々の患者の癌タイプの余計な特徴づけを行わずに強力で持続可能な癌特異的Ｔ細胞応答を生成して腫瘍の成長、進行および転移を阻害する組成物および方法が、依然として求められている。
発明の概要
様々な実施形態において、癌細胞を結合できる、またはそれに結合するカプシドタンパク質と；腫瘍の存在下で優先的に切断される少なくとも１種のタンパク質切断配列を含む融合タンパク質と；患者の体内に存在するＴ細胞により結合され得る、またはそれにより結合されるエピトープである配列を有するタンパク質またはその断片である少なくとも１種のリコールタンパク質、を含む、コンジュゲート型ウイルス様粒子（「ＶＬＰ」）が、提供される。
様々な実施形態において、カプシドタンパク質は、パピローマウイルス由来である。様々な実施形態において、パピローマウイルスは、Ｌ１タンパク質を含む。様々な実施形態において、リコールタンパク質は、病原体のエピトープを含む。様々な実施形態において、ＶＬＰは、少なくとも２種のリコールタンパク質を含む融合タンパク質を少なくとも１種含む。様々な実施形態において、ＶＬＰは、少なくとも２種の融合タンパク質を含み、このタンパク質はそれぞれ、別個のリコールタンパク質を含む。様々な実施形態において、リコールタンパク質の少なくとも２種は、同じ病原体の異なるＴ細胞エピトープからの配列を有するタンパク質またはその断片である。様々な実施形態において、リコールタンパク質の少なくとも２種は、異なる病原体のための異なるＴ細胞エピトープからの配列を有するタンパク質またはその断片である。
様々な実施形態において、病原体は、ウイルス、バクテリア、真菌、または寄生虫である。様々な実施形態において、エピトープは、ヒトワクチンのエピトープの配列または配列のサブセットに由来するか、またはそれらで構成される。様々な実施形態において、ワクチンは、早期小児ワクチンまたは成人用に認可されたワクチンである。様々な実施形態において、融合タンパク質は、ジスルフィドリンケージ（ｌｉｎｋａｇｅ）、マレイミドリンケージ（ｌｉｎａｇｅ）、またはアミドリンケージを介して、カプシドタンパク質のシステイン、リシン、またはアルギニンにコンジュゲートされる。様々な実施形態において、カプシドタンパク質および融合タンパク質は、１つの融合タンパク質として隣接して発現される。様々な実施形態において、ワクチンは、病原体に対するワクチンである。様々な実施形態において、病原体は、ウイルス、バクテリア、真菌、または寄生虫である。様々な実施形態において、ワクチンは、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、帯状疱疹ウイルス、風疹、肝炎ウイルス、例えばＡ型肝炎ウイルス、もしくはＢ型肝炎ウイルス、もしくはＣ型肝炎ウイルス、インフルエンザＡ型もしくはＢ型ウイルス、はしかウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、バリオラ（天然痘）ウイルス、狂犬病ウイルス、デングウイルス、エボラウイルス、西ナイルウイルス、黄熱ウイルス、またはジカウイルス、またはサイトメガロウイルス、またはエプスタイン・バーウイルスへの免疫性を誘発する。様々な実施形態において、ワクチンは、バクテリア感染への免疫性を誘発し、バクテリアは、ボルデテラ・パータシス、クロストリジウム・テタニ、クラミジア・トラコマティス、ジフテリア、ヘモフィルス・インフルエンザ、髄膜炎菌、例えばＡＣＷＹ型髄膜炎菌、ニューモコッカス、ビブリオ・コレラ、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、腸チフス、大腸菌、サルモネラ、レジオネラ・ニューモフィラ、リケッチア、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、Ａ群もしくはＢ群ストレプトコッカス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、バシラス・アントラシス、クロストリジウム・ボツリナム、またはエルシニアｓｐである。様々な実施形態において、寄生虫は、エントアメーバ・ヒストリティカ、トキソプラズマ・ゴンディ、トリキネラｓｐ、例えばトリキネラ・スピラリス、トリコモナスｓｐ、例えばトリコモナス・バギナリス、トリパノソーマｓｐ、例えばトリパノソーマ・ブルセイ・ガンビエンセ、トリパノソーマ・ブルセイ・ロデシエンセ、もしくはトリパノソーマ・クルジ、またはプラスモジウム、例えばプラスモジウム・ファルシパルム、プラスモジウム・ビバックス、もしくはプラスモジウム・マラリアである。
様々な実施形態において、ＶＬＰは、総ＣＤ８＋ Ｔ細胞のベースラインの少なくとも２倍の閾値でＴ細胞応答を誘発できる。様々な実施形態において、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＣＤ６９＋でもある。様々な実施形態において、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋でもある。様々な実施形態において、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、非リンパ器官から発生した組織常在型メモリーＴ細胞（ＴＲＭ細胞）である。様々な実施形態において、カプシドタンパク質は、ヘパリン硫酸プロテオグリカン（「ＨＳＰＧ」）を選択的に結合できる。
様々な実施形態において、コンジュゲート型ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を投与することを含む、癌の対象を処置する方法が提供され、ＶＬＰは、（ａ）癌細胞に結合できるカプシドタンパク質と；（ｂ）少なくとも（ｉ）腫瘍の存在下で優先的に切断される切断配列、および（ｉｉ）少なくとも１種のリコールタンパク質、を含む融合タンパク質、を含み、上記リコールタンパク質は、患者の体内に存在するＴ細胞により結合され得るエピトープである配列を有するタンパク質またはその断片であり、切断配列は、リコールタンパク質に結合される。様々な実施形態において、リコールタンパク質の第二の投与は、コンジュゲート型ＶＬＰとして送達される。様々な実施形態において、リコールタンパク質の第二の投与は、ワクチンとして送達される。様々な実施形態において、リコールタンパク質の第二の投与は、アジュバント中の単離されたペプチドとして送達される。
様々な実施形態において、（ｉ）患者の既存の免疫性を測定すること；および（ｉｉ）それを必要とする患者への投与のために適切なコンジュゲート型ＶＬＰを選択すること、を含む、それを必要とする患者にコンジュゲート型ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供するための方法が、提供され、上記ＶＬＰは、（ａ）癌細胞に結合できるカプシドタンパク質と；（ｂ）少なくともｉ）腫瘍の存在下で優先的に切断される切断配列、およびｉｉ）少なくとも１種のリコールタンパク質、を含む融合タンパク質、を含み、上記リコールタンパク質は、患者の体内に存在するＴ細胞により結合され得るエピトープである配列を有するタンパク質またはその断片であり、切断配列は、カプシドタンパク質に結合され、Ｔ細胞エピトープは、総ＣＤ８＋ＣＤ６９＋陽性Ｔ細胞のベースラインのＴ細胞を誘発できる。
様々な実施形態において、ブースティングワクチンが、患者に送達される。様々な実施形態において、ブースティングワクチンは、コンジュゲート型ＶＬＰの投与の少なくとも２週間後に送達される。様々な実施形態において、ブースティングワクチンは、コンジュゲート型ＶＬＰの投与２週間前に送達される。様々な実施形態において、ワクチンは、帯状疱疹ワクチン、ＰＲＥＶＮＡＲ１３（登録商標）ワクチン、ＨＥＰＬＩＳＡＶ－Ｂ（登録商標）ワクチン、ＭＭＲ－ＩＩワクチン、ＺＯＳＴＡＶＡＸＲ（登録商標）、またはＥＮＧＥＲＩＸ－Ｂ（登録商標）である。様々な実施形態において、ワクチンは、帯状疱疹用である。様々な実施形態において、ワクチンは、ＰＲＥＶＮＡＲ１３（登録商標）である。様々な実施形態において、ワクチンは、ＨＥＰＬＩＳＡＶ－Ｂ（登録商標）である。様々な実施形態において、対象は、少なくとも５０歳のヒト患者である。様々な実施形態において、患者は、ＣＡＲ－Ｔ、治療用ワクチン、チェックポイント阻害薬、腫瘍溶解性ウイルス、ネオアンチゲンワクチン、ネオアジュバント、化学療法、放射線照射、手術で過去に処置されたが、抗腫瘍効果を有することが過去に示されなかった。様々な実施形態において、リコールタンパク質は、腫瘍関連抗原でない。様々な実施形態において、方法は、腫瘍の成長、進行または転移を阻害する。
様々な実施形態において、腫瘍は、小細胞肺癌、肝細胞癌、肝臓癌、肝細胞癌、黒色腫、転移性黒色腫、副腎癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳もしくは中枢神経系（ＣＮＳ）癌、乳癌、原発臓器不明の癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、眼癌、胆嚢癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性トロホブラスト疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭および下咽頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、口腔および中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、脾辺縁帯リンパ腫、辺縁帯リンパ腫（節外性または節性）、成人の混合細胞型びまん性アグレッシブリンパ腫、成人の大細胞型びまん性アグレッシブリンパ腫、成人の大細胞型免疫芽球性びまん性アグレッシブリンパ腫、成人の小型非切れ込み核細胞性びまん性アグレッシブリンパ腫、もしくは濾胞性リンパ腫、頭頸部癌、子宮内膜もしくは子宮癌腫、非小細胞肺癌、骨肉腫、膠芽腫、または転移癌である。一実施形態において、癌は、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、膵臓癌または黒色腫である。
開示されるコンジュゲート型ＶＬＰの作用機序を示す。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスについての経時的なマウスＴＣ－１腫瘍成長を示し、ＴＣ－１腫瘍は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびルシフェラーゼの両方を発現する。 ＶＬＰで処置された（明るい方の網掛けピーク）、またはＶＬＰで処置されていない（暗い方の網掛けピーク）のどちらかのＣ５７ＢＬ／６マウスから摘出されたＴＣ－１腫瘍の分析から作成された、蛍光活性化セルソーティングフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）データのグラフ表示を示す。左のパネルは、ＧＦＰでゲートされ、右のパネルは、ＶＬＰに特異的なフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート型抗マウス抗体を用いて検出されたＶＬＰに対しゲートされる。 時間依存的様式でのインビトロのＢ１６ルシフェラーゼおよびＩＤ８ルシフェラーゼ腫瘍細胞モデルにおけるＨＰＶ１６ Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰのＥ７ Ｔ細胞介在性細胞障害効果を示す。特に、図３Ａおよび３Ｂは、それぞれ５．５時間目および８．５時間目の、種々の濃度のＥ７ペプチドのみでまたはＶＬＰにコンジュゲートされたＥ７ペプチドと共にインキュベートされた、Ｂ１６－ＬＵＣ細胞を示す。 時間依存的様式でのインビトロのＢ１６ルシフェラーゼおよびＩＤ８ルシフェラーゼ腫瘍細胞モデルにおけるＨＰＶ１６ Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰのＥ７ Ｔ細胞介在性細胞障害効果を示す。特に、図３Ａおよび３Ｂは、それぞれ５．５時間目および８．５時間目の、種々の濃度のＥ７ペプチドのみでまたはＶＬＰにコンジュゲートされたＥ７ペプチドと共にインキュベートされた、Ｂ１６－ＬＵＣ細胞を示す。 時間依存的様式でのインビトロのＢ１６ルシフェラーゼおよびＩＤ８ルシフェラーゼ腫瘍細胞モデルにおけるＨＰＶ１６ Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰのＥ７ Ｔ細胞介在性細胞障害効果を示す。同様に、図３Ｃおよび３Ｄは、それぞれ５．５時間目および８．５時間目の、Ｅ７ペプチドのみでまたはＶＬＰにコンジュゲートされたＥ７ペプチドと共にインキュベートされた、ＩＤ８細胞を示す。 時間依存的様式でのインビトロのＢ１６ルシフェラーゼおよびＩＤ８ルシフェラーゼ腫瘍細胞モデルにおけるＨＰＶ１６ Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰのＥ７ Ｔ細胞介在性細胞障害効果を示す。同様に、図３Ｃおよび３Ｄは、それぞれ５．５時間目および８．５時間目の、Ｅ７ペプチドのみでまたはＶＬＰにコンジュゲートされたＥ７ペプチドと共にインキュベートされた、ＩＤ８細胞を示す。 時間依存的様式でのインビトロのＢ１６ルシフェラーゼおよびＩＤ８ルシフェラーゼ腫瘍細胞モデルにおけるＨＰＶ１６ Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰのＥ７ Ｔ細胞介在性細胞障害効果を示す。特に、図４Ａおよび４Ｂは、Ｂ１６－ＬＵＣ細胞およびネズミＣＤ８＋ ＨＰＶ１６ Ｅ７特異性Ｔ細胞と共にインキュベートされたＥ７コンジュゲート型ＶＬＰで、細胞障害性がそれぞれ８．５時間と２２．５時間の間で改善されることを示す。 時間依存的様式でのインビトロのＢ１６ルシフェラーゼおよびＩＤ８ルシフェラーゼ腫瘍細胞モデルにおけるＨＰＶ１６ Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰのＥ７ Ｔ細胞介在性細胞障害効果を示す。特に、図４Ａおよび４Ｂは、Ｂ１６－ＬＵＣ細胞およびネズミＣＤ８＋ ＨＰＶ１６ Ｅ７特異性Ｔ細胞と共にインキュベートされたＥ７コンジュゲート型ＶＬＰで、細胞障害性がそれぞれ８．５時間と２２．５時間の間で改善されることを示す。 時間依存的様式でのインビトロのＢ１６ルシフェラーゼおよびＩＤ８ルシフェラーゼ腫瘍細胞モデルにおけるＨＰＶ１６ Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰのＥ７ Ｔ細胞介在性細胞障害効果を示す。同様に、図４Ｃおよび４Ｄは、ＩＤ８細胞およびネズミＣＤ８＋ ＨＰＶ１６ Ｅ７特異性Ｔ細胞と共にインキュベートされたＥ７コンジュゲート型ＶＬＰで、細胞障害性がそれぞれ８．５時間と２２．５時間の間で改善されることを示す。 時間依存的様式でのインビトロのＢ１６ルシフェラーゼおよびＩＤ８ルシフェラーゼ腫瘍細胞モデルにおけるＨＰＶ１６ Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰのＥ７ Ｔ細胞介在性細胞障害効果を示す。同様に、図４Ｃおよび４Ｄは、ＩＤ８細胞およびネズミＣＤ８＋ ＨＰＶ１６ Ｅ７特異性Ｔ細胞と共にインキュベートされたＥ７コンジュゲート型ＶＬＰで、細胞障害性がそれぞれ８．５時間と２２．５時間の間で改善されることを示す。 それぞれ２３時間および２３．５時間のタイムポイントで終了する２つの別の研究の後のＢ１６ルシフェラーゼおよびＩＤ８ルシフェラーゼ細胞に及ぼす、ＨＰＶ１６ Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰ（バッチＦ１～Ｆ３）のＥ７ Ｔ細胞介在性細胞障害効果のバッチ一貫性（ｂａｔｃｈ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）を示す。図５Ａおよび図５Ｂは、Ｂ１６－ＬＵＣ細胞においてＥ７ペプチドにコンジュゲートされたコンジュゲート型ＶＬＰの３つの独立に作製されたバッチのＥ７ Ｔ細胞介在性細胞障害効果の、それぞれ２３時間目および２３．５時間目のタイムポイントで終了する２つの別の研究を示す。図５Ａおよび図５Ｂは、ＩＤ８細胞においてＥ７ペプチドにコンジュゲートされたコンジュゲート型ＶＬＰの３つの独立に作製されたバッチのＥ７ Ｔ細胞介在性細胞障害効果の、それぞれ２３時間目および２３．５時間目のタイムポイントで終了する２つの別の研究を示す。 それぞれ２３または２３．５時間のタイムポイントで終了する２つの別の研究の後のＭＣ３８細胞に及ぼす、ＨＰＶ１６ Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰのＥ７ Ｔ細胞介在性細胞障害効果のバッチ一貫性を示す。コンジュゲートされたＥ７コンジュゲート型ＶＬＰの３つの異なるバッチについて、図６Ａは、２３時間のタイムポイント研究からの結果を表す。 それぞれ２３または２３．５時間のタイムポイントで終了する２つの別の研究の後のＭＣ３８細胞に及ぼす、ＨＰＶ１６ Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰのＥ７ Ｔ細胞介在性細胞障害効果のバッチ一貫性を示す。コンジュゲートされたＥ７コンジュゲート型ＶＬＰの３つの異なるバッチについて、図６Ｂは、２３．５時間のタイムポイント研究からの結果を表す。 ＭＨＣ拘束性Ｈ－２Ｄｂ ＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチド、緩衝液対照、Ｅ７にコンジュゲートされたＶＬＰ、または非コンジュゲート型ＶＬＰのみのどれかを注射されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、バイオルミネッセンスにより測定されたインビボ有効性データを提供する。各例において、マウスはその後、ネズミの特異的Ｈ－２Ｄｂ ＨＰＶ１６ Ｅ７ Ｔ細胞を注射された。図７Ａは、全ての対照および被験マウスについての結果を示す。図７Ａの個々のラインは、それぞれ全ての対照および被験マウスについての平均腫瘍成長を表す。 ＭＨＣ拘束性Ｈ－２Ｄｂ ＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチド、緩衝液対照、Ｅ７にコンジュゲートされたＶＬＰ、または非コンジュゲート型ＶＬＰのみのどれかを注射されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、バイオルミネッセンスにより測定されたインビボ有効性データを提供する。各例において、マウスはその後、ネズミの特異的Ｈ－２Ｄｂ ＨＰＶ１６ Ｅ７ Ｔ細胞を注射された。図７Ｂは、緩衝液対照の結果を提供する。図７Ｂの個々のラインは、各群における別のマウスを表す。 ＭＨＣ拘束性Ｈ－２Ｄｂ ＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチド、緩衝液対照、Ｅ７にコンジュゲートされたＶＬＰ、または非コンジュゲート型ＶＬＰのみのどれかを注射されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、バイオルミネッセンスにより測定されたインビボ有効性データを提供する。各例において、マウスはその後、ネズミの特異的Ｈ－２Ｄｂ ＨＰＶ１６ Ｅ７ Ｔ細胞を注射された。図７Ｃは、非コンジュゲート型ＶＬＰについての結果を提供する。 ＭＨＣ拘束性Ｈ－２Ｄｂ ＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチド、緩衝液対照、Ｅ７にコンジュゲートされたＶＬＰ、または非コンジュゲート型ＶＬＰのみのどれかを注射されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、バイオルミネッセンスにより測定されたインビボ有効性データを提供する。各例において、マウスはその後、ネズミの特異的Ｈ－２Ｄｂ ＨＰＶ１６ Ｅ７ Ｔ細胞を注射された。図７Ｄは、Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰについての結果を提供する。 ＭＨＣ拘束性Ｈ－２Ｄｂ ＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチド、緩衝液対照、Ｅ７にコンジュゲートされたＶＬＰ、または非コンジュゲート型ＶＬＰのみのどれかを注射されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、バイオルミネッセンスにより測定されたインビボ有効性データを提供する。各例において、マウスはその後、ネズミの特異的Ｈ－２Ｄｂ ＨＰＶ１６ Ｅ７ Ｔ細胞を注射された。図７Ｅは、Ｅ７ペプチドのみについての結果を提供する。 腫瘍体積の評定による、ＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対する、急性免疫応答を有するＢ１６．Ｆ１０マウスにおけるＥ７コンジュゲート型ＶＬＰ抗腫瘍免疫リダイレクションのインビボ有効性を示して、即ちマウスは、ペプチドＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）ワクチン接種後に２週間処置された。図８Ａは、対照ＶＬＰ、即ち非コンジュゲート型ＶＬＰ、およびＥ７コンジュゲート型ＶＬＰを含む様々な試料の注射後日数に対比した腫瘍サイズデータのグラフ表示を提供する。 腫瘍体積の評定による、ＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対する、急性免疫応答を有するＢ１６．Ｆ１０マウスにおけるＥ７コンジュゲート型ＶＬＰ抗腫瘍免疫リダイレクションのインビボ有効性を示して、即ちマウスは、ペプチドＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）ワクチン接種後に２週間処置された。図８Ｂは、対照ＶＬＰ、即ち非コンジュゲート型ＶＬＰ、およびＥ７コンジュゲート型ＶＬＰを含む、様々な試料のＢ１６．Ｆ１０腫瘍細胞注射後のマウス生存率のグラフ表示を提供する。 腫瘍体積の評定による、ＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対する、急性免疫応答を有するＢ１６．Ｆ１０マウスにおけるＥ７コンジュゲート型ＶＬＰ抗腫瘍免疫リダイレクションのインビボ有効性を示し、即ちマウスは、ペプチドＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）ワクチン接種後に２週間処置された。図８ＣおよびＤは、ＨＰＶ１６ Ｅ７免疫応答がメモリーフェーズにあったこと、即ち、マウスがペプチドＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）ワクチン接種後に６週間処置されたこと、および処置前の腫瘍体積が５０～１００ｍｍ３の間であったこと以外は、図８Ａおよび８Ｂと同様である。マウスはその後、腫瘍でチャレンジされ、Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰがマウスに注射され、生存率が定量された。 腫瘍体積の評定による、ＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対する、急性免疫応答を有するＢ１６．Ｆ１０マウスにおけるＥ７コンジュゲート型ＶＬＰ抗腫瘍免疫リダイレクションのインビボ有効性を示し、即ちマウスは、ペプチドＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）ワクチン接種後に２週間処置された。図８ＣおよびＤは、ＨＰＶ１６ Ｅ７免疫応答がメモリーフェーズにあったこと、即ち、マウスがペプチドＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）ワクチン接種後に６週間処置されたこと、および処置前の腫瘍体積が５０～１００ｍｍ３の間であったこと以外は、図８Ａおよび８Ｂと同様である。マウスはその後、腫瘍でチャレンジされ、Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰがマウスに注射され、生存率が定量された。 インビトロでＯＶＡコンジュゲート型ＶＬＰとインキュベートされたマウス腫瘍細胞のＳＩＩＮＦＥＫＬ／Ｋｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）ＦＡＣＳ解析を示す。図９Ａは、ＩＤ８－ＬＵＣ（上のパネル）、Ｂ１６－ＬＵＣ （中央のパネル）、およびＭＣ３８（下のパネル）細胞とＯＶＡペプチドのみまたはＯＶＡコンジュゲート型ＶＬＰとのインキュベーションから得られたＦＡＣＳデータを示す。 インビトロでＯＶＡコンジュゲート型ＶＬＰとインキュベートされたマウス腫瘍細胞のＳＩＩＮＦＥＫＬ／Ｋｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）ＦＡＣＳ解析を示す。図９Ｂは、ＯＶＡペプチドと複合体化したＭＨＣ－Ｉに特異的なＨ－２Ｄｂ抗体の結合により染色された、同じ細胞、ＩＤ８－ＬＵＣ（上のパネル）、Ｂ１６－ＬＵＣ （中央のパネル）、およびＭＣ３８（下のパネル）を示す。 ＨＬＡ．Ａ２陽性ＨＣＴ１１６細胞（図１０Ａ）、ＯＶＣＡＲ３細胞（図１０Ｂ）、およびＭＣＦ７細胞（図１０Ｃ）を含む様々な不死化ヒト腫瘍細胞株のＣＭＶコンジュゲート型ＶＬＰで惹起された免疫リダイレクション細胞障害性の棒グラフデータを提供する。各グラフの棒は、左から右に、抗原なし、１μｇ／ｍＬのＣＭＶ ｐｐ６５ ＨＬＡ－Ａ＊０２０１（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）ペプチド（以後、「ＣＭＶペプチド」）のみ、ＶＬＰのみ、即ち、２．５１μｇ／ｍＬの非コンジュゲート型ＶＬＰ、２．５μｇ／ｍＬのＶＬＰにコンジュゲートされたＣＭＶペプチド、および１４ｐｇ／ｍＬのＣＭＶペプチドのみで実施されたテストを表す。 ＨＬＡ．Ａ２陽性ＨＣＴ１１６細胞（図１０Ａ）、ＯＶＣＡＲ３細胞（図１０Ｂ）、およびＭＣＦ７細胞（図１０Ｃ）を含む様々な不死化ヒト腫瘍細胞株のＣＭＶコンジュゲート型ＶＬＰで惹起された免疫リダイレクション細胞障害性の棒グラフデータを提供する。各グラフの棒は、左から右に、抗原なし、１μｇ／ｍＬのＣＭＶ ｐｐ６５ ＨＬＡ－Ａ＊０２０１（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）ペプチド（以後、「ＣＭＶペプチド」）のみ、ＶＬＰのみ、即ち、２．５１μｇ／ｍＬの非コンジュゲート型ＶＬＰ、２．５μｇ／ｍＬのＶＬＰにコンジュゲートされたＣＭＶペプチド、および１４ｐｇ／ｍＬのＣＭＶペプチドのみで実施されたテストを表す。 ＨＬＡ．Ａ２陽性ＨＣＴ１１６細胞（図１０Ａ）、ＯＶＣＡＲ３細胞（図１０Ｂ）、およびＭＣＦ７細胞（図１０Ｃ）を含む様々な不死化ヒト腫瘍細胞株のＣＭＶコンジュゲート型ＶＬＰで惹起された免疫リダイレクション細胞障害性の棒グラフデータを提供する。各グラフの棒は、左から右に、抗原なし、１μｇ／ｍＬのＣＭＶ ｐｐ６５ ＨＬＡ－Ａ＊０２０１（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）ペプチド（以後、「ＣＭＶペプチド」）のみ、ＶＬＰのみ、即ち、２．５１μｇ／ｍＬの非コンジュゲート型ＶＬＰ、２．５μｇ／ｍＬのＶＬＰにコンジュゲートされたＣＭＶペプチド、および１４ｐｇ／ｍＬのＣＭＶペプチドのみで実施されたテストを表す。 ＶＬＰコンジュゲーションについての還元条件のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の写真である。左のレーンは、分子量標準のレーンである。ゲルの次のレーンは、ＲＧ１ ＶＬＰに対する様々な比のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いる様々なコンジュゲーション反応条件である。 ＲＧ１ ＶＬＰに対する様々な比のＴＣＥＰを利用する、コンジュゲーション反応後のコンジュゲート型ＶＬＰの透過型電子顕微鏡測定（ＴＥＭ）により作成された写真である。左上のパネルは、１０：１比でのＴＣＥＰとＲＧ１との反応後のコンジュゲーションの結果を示す。右上のパネルは、３：１比での同じ反応を示し、左下は５：１、右下は１：１での同じ反応を示す。 ゲルに示された通りＶＬＰコンジュゲーション反応の間にＴＣＥＰとの様々な比で還元されたＲＧ１ ＶＬＰでのコンジュゲーションレベルの、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の写真である。 様々なワクチンエピトープにコンジュゲートされたＷＴ ＶＬＰ（図１４Ａ）およびＲＧ１（図１４Ｂ）の、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の写真を提供する。 様々なワクチンエピトープにコンジュゲートされたＷＴ ＶＬＰ（図１４Ａ）およびＲＧ１（図１４Ｂ）の、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の写真を提供する。
詳細な記載
定義
この明細書は、本開示の例示的実施形態および適用を記載する。しかし本発明は、これらの例示的実施形態および適用に、またはこの例示的実施形態および適用が動作する手法もしくは本明細書に記載される手法に、限定されない。本発明の教示の様々な実施形態、特色、目的および利点が、明細書および添付の図面および特許請求の範囲から明白となろう。本明細書で用いられる用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有すること」、「有する」、「有すること」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「包含すること」、ならびにそれらの変形例は、限定であることを意図せず、包括的であるか、または制限がなく、追加の、列挙されていない添加物、成分、整数、要素、または方法ステップを除外しない。例えば特色のリストを含む工程、方法、システム、組成物、キット、または装置は、必ずしもこれらの特色のみに限定されず、そのような工程、方法、システム、組成物、キット、または装置に明確に列挙されていない、またはそれらに本質的に備わらない他の特色を包含してもよい。
「約」は、値を決定するために用いられるデバイスまたは方法の誤差の標準偏差をこの値が包含することを示すために用いられる。
本明細書で用いられる用語「コンジュゲート型ウイルス様粒子」または「コンジュゲート型ＶＬＰ」は、ＶＬＰのカプシドタンパク質に結合された融合タンパク質も含むＶＬＰである。
本明細書で用いられる用語「切断配列」は、部位特異的プロテアーゼがタンパク質を切断または切除する特異的ペプチド配列、またはよりしばしば、ペプチドモチーフを包含してよい。切断部位は、例えばアフィニティタグを切り離し、それにより自然なタンパク質配列を回復させるため、またはタンパク質を不活性化させるため、またはタンパク質を活性化させるために用いられ得る。本発明において、切断は、タンパク質分解切断を指している。様々な実施形態において、タンパク質分解切断は、タンパク質の最終的な成熟の前にペプチダーゼ、プロテアーゼまたはタンパク質分解切断酵素により実行される。タンパク質はまた、例えばミスフォールドタンパク質の、細胞内プロセシングの結果として、切断され得る。タンパク質のタンパク質分解プロセシングの別の例は、分泌タンパク質またはオルガネラに標的化されたタンパク質であり、それらは、細胞外環境または特異的オルガネラへの放出前に特異的シグナルペプチダーゼにより除去されるシグナルペプチドを有する。本発明の一実施形態において、切断配列は、フリンにより特異的に認識され、フリンは、コンジュゲート型ＶＬＰからリコールタンパク質を切断および放出し、リコールタンパク質を腫瘍表面へのローディングに利用可能にする。様々な実施形態において、切断配列は、システイン、リシンおよび／またはアルギニン残基で構成され、それはリコールタンパク質をＶＬＰから切断することを可能にするだけでなく、リコールタンパク質を、腫瘍の部位に選択的に存在するフリンなどの切断タンパク質による放出まで、カプシドタンパク質にコンジュゲートするアンカーとして働く。
「エピトープ」は、固有の免疫グロブリンによる認識を作製する、もしくは認識されるアミノ酸残基のセット、またはＴ細胞の環境下ではＴ細胞受容体タンパク質および／もしくは主要組織適合性（ＭＨＣ）受容体による認識に必須のそれらの残基である。エピトープのアミノ酸残基は、隣接する／連続である必要はない。インビボまたはインビトロの免疫系の環境において、エピトープは、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体および／またはＨＬＡ分子により認識される三次元構造を一緒になって形成する、一次、二次および三次ペプチド構造などの、分子の集合的特色と、電荷の、複合物であってもよい。
本発明の融合タンパク質は、少なくとも（１）腫瘍の表面の部位で優先的に切断される切断配列と、（２）患者の体内に存在するＴ細胞により結合され得るエピトープである配列を有するタンパク質またはその断片である少なくとも１種のリコールタンパク質と、（３）ＶＬＰに共有結合でつなげることができるもの、を含む。コンジュゲート型ＶＬＰは、腫瘍細胞に優先的に結合する（それがコンジュゲートされるだけならば、ＶＬＰについて上記の通り結合、除去、編集するが、さもなければ前述のものを除去する）。
「ＨＰＶ」および「ヒトパピローマウイルス」は、ヒトに感染できるパピローマウイルス科のメンバーを指す。それらのトロピズムにより定義されるＨＰＶの２種の主要な群（生殖器／粘膜および皮膚群）が存在し、そのそれぞれが、複数のウイルス「型」または「系統／遺伝子型」（例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３２など）を含有する。
本明細書で用いられる「ヒトワクチン」は、ヒトにおける固有の疾患への免疫性を改善する生物学的調製物を意味する。ワクチンは典型的には、疾患原因物質（病原体）に似た抗原性物質（複数可）を含有し、多くの場合、疾患原因物質の細菌、その毒素または１つもしくは複数の免疫原性表面タンパク質の弱毒化または殺傷された形態から作製される。抗原性物質は、身体の免疫系を刺激して、疾患の原因を外来物として認識し、それを破壊し、かつそれを「記憶し」、それにより免疫系は、万が一実際の感染／暴露が起こった場合に、これらの病原体のいずれかをより容易に認識および破壊できる。ヒトワクチンとしては、ウイルス疾患およびバクテリア疾患に対するワクチンが挙げられる。様々な実施形態において、ウイルス疾患に対するワクチンとしては、Ａ型、Ｂ型、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、はしかウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、天然痘ウイルスおよび黄熱ウイルスが挙げられる。開発中のウイルス疾患に対するヒトワクチンとしては、デングワクチン、東部馬脳炎ウイルス、ＨＴＬＶ－１ Ｔリンパ球白血病ワクチンおよび呼吸器多核体ウイルスワクチンが挙げられる。そのようなワクチンとしては、幾つかの実施形態において、現在開発中のワクチン、または現在、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）で認可されているワクチン接種が挙げられる。適合性のあるワクチンの例を、表２に列挙する。本発明の実施形態は、列挙されたワクチンに限定されず、ヒト対象において免疫性を提供するために開発された任意のワクチンに適用され得る。
特許請求の範囲および／または本明細書で用いられる場合、「阻害すること」、「低減すること」もしくは「予防」、またはこれらの用語の任意の変形例は、腫瘍の量、進行および／または転移を阻害すること、低減すること、または予防すること、または低減することなどの、所望の結果を実現するための任意の測定可能な減少または完全な阻害／低減もしくは排除を包含する。
「ＭＨＣ」または「主要組織適合性複合体」は、免疫系が外来物質を認識するのを援助する細胞表面に見出されるタンパク質をコードする遺伝子群である。ＭＨＣタンパク質は、高等脊椎動物の全てに見出される。ＭＨＣ分子の２つの主要な型、つまりＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ、が存在する。ヒトにおいては、ＭＨＣクラスＩ分子（ヒトのＭＨＣ分子はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも称される）をコードする３種の異なる遺伝子座：ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃが存在する。ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、およびＨＬＡ－Ａ＊１１は、これらの遺伝子座から発現され得る異なるＭＨＣクラスＩ対立遺伝子の例である。
「パピローマウイルス」は、パピローマウイルス科（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）の全てのメンバーを指す。パピローマウイルスのタイプおよびそれぞれのＶＬＰを作製する能力の詳しいリストが、この発行物：“Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ （ＰＶｓ） ｂａｓｅｄ ｏｎ １８９ ＰＶ ｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｏｓａｌ ｏｆ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ａｍｅｎｄｍｅｎｔｓ，” ｄｅ Ｖｉｌｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ４０１（ｌ）：７０－７９， ２０１０， ＰＭＩＤ： ２０２０６９５７（全ての表）、を利用して参照され得る。
本明細書で用いられる「優先的に切断されるタンパク質」は、融合タンパク質が腫瘍の部位のカプシドタンパク質から優先的に切断されることを意味する。この優先的腫瘍部位切断は、（１）融合タンパク質上の独特の切断配列、および／または（２）独特の腫瘍微小環境、が原因の場合がある。例えば、一実施形態において、融合タンパク質は、腫瘍細胞において高濃度で発現されることが知られている酵素フリンにより優先的に切断される、切断配列を含む。
本明細書で用いられる「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、任意の固有の数のアミノ酸に制限されず、これらの用語は時として、本明細書で互換的に用いられる。本発明のタンパク質およびそれらをコードする核酸の特性およびアミノ酸配列は、周知であり、日常的に決定され得、様々な公知データベースからダウンロードされ得る（例えば、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋデータベース参照）。幾つかの配列が、本明細書で提供される。しかし幾つかの配列の情報は、日常的に更新され（例えば、過去のエントリーの誤りを修正するため）、そのためタンパク質およびそれらをコードする核酸についての更新（修正）された情報は、本出願に包含される。本明細書で議論される配列データベース中に提供される情報は、参照により組み入れられる。
本明細書で用いられる「リコールタンパク質」は、患者または対象が過去に暴露されたワクチンまたは病原体に由来するタンパク質またはその断片を指し、この過去の暴露が、リコールタンパク質を認識しリコールタンパク質に特異的である持続可能なＴ細胞をもたらした。リコールタンパク質は、腫瘍特異性抗原と識別される。
「リコール応答」は、患者の体内に存在するワクチンまたは他の病原体により感作された抗原感作された細胞障害性Ｔ細胞、Ｔｈ１ Ｔ細胞、Ｔｈ２ Ｔ細胞、および／またはＢ細胞がリコールタンパク質を結合する、免疫応答である。
本明細書で用いられる「対象」または「必要とする対象」は、腫瘍／癌を有する、または腫瘍／癌を有したことがある、または前癌状態の病気もしくは細胞を有する任意の動物を包含する。適切な対象（患者）は、マウス、ラット、ウサギ、モルモットまたは豚などの実験動物、ウシなどの畜産動物、イヌまたはウマなどの競技動物、ウマ、イヌまたはネコなどの家畜またはペット、非ヒト霊長類、およびヒトを包含する。
本明細書で用いられる「Ｔ細胞応答」は、Ｔ細胞が抗原に遭遇するとＴ細胞により誘発される免疫応答を指す。ナイーブ成熟Ｔ細胞は、Ｂ細胞、マクロファージ、および樹状細胞により提示される抗原に遭遇すると活性化され、武装したエフェクターＴ細胞を生成する。エフェクターＴ細胞は、細胞障害性Ｔ細胞に分化するＣＤ８＋ Ｔ細胞、または主として液性免疫応答を誘導するＣＤ４＋ Ｔ細胞のどちらかである。Ｔ細胞免疫応答はさらに、病原体による次のチャレンジからの防護を与える免疫記憶を発生する。様々な実施形態において、Ｔ細胞応答は、総ＣＤ８＋ Ｔ細胞のベースラインの少なくとも２倍の閾値である。様々な実施形態において、ＣＤ８＋ Ｔ細胞はまた、ＣＤ６９＋である。
「治療的組成物」は、設計され患者に投与される組成物である。治療的組成物、例えば治療性コンジュゲート型ＶＬＰ含有組成物は、良性のもしくは悪性の腫瘍、またはそのような腫瘍のリスクがある患者／対象を処置するために用いられる。幾つかの実施形態において、コンジュゲート型ＶＬＰは、腫瘍／癌の阻害または再発を増強しようとして、過去に腫瘍を有し現在は明白に腫瘍／癌を有しない対象に投与される。
「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」は、ウイルスに似ているがウイルス遺伝子材料を欠く粒子に自己組織化し得るエンベロープまたはカプシドタンパク質などの、ウイルス構造タンパク質で構成された多タンパク質構造を指す。ＶＬＰは、非感染性かつ非複製性であり、その上、ウイルスと形態学的に類似している。本明細書に開示されるＶＬＰは、腫瘍細胞に結合するか、または腫瘍細胞に本質的に備わるトロピズムを有する。
「ＶＬＰワクチン」は、本明細書に記載されるコンジュゲート型ＶＬＰを１、２、３、４、５個、またはより多く含有する配合剤を指す。一実施形態において、本明細書に記載されるコンジュゲート型ＶＬＰを含む組成物は、対象の体内に既に存在する免疫性をリダイレクトするため、そしてそれにより対象における腫瘍の増殖、成長、および／または転移を阻害するために対象に投与される形態である。典型的には、ＶＬＰワクチンは、例えば吸入による、乾燥粉末、およびアラムなどの追加的アジュバントを含む配合剤の投与もまた企図されるが、本明細書に記載される組成物が懸濁または溶解される従来の生理食塩水または緩衝水性溶液媒体を含む。本発明の組成物は、腫瘍の増殖、成長、および／または転移を阻害するために用いられ得る。宿主への導入の際、本発明のコンジュゲート型ＶＬＰ含有組成物（例えば、ＶＬＰワクチン）は、非限定的に、サイトカインの生成、および／または細胞障害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞の活性化、および／または他の細胞応答を含む免疫応答を誘起できる。
コンジュゲート型ウイルス様粒子
様々な実施形態において、開示されるのは、対象の癌を処置するためのコンジュゲート型ＶＬＰである。様々な実施形態において、本明細書に記載される組成物は、カプシドタンパク質を含み、上記カプシドタンパク質は、癌細胞を結合する。様々な実施形態において、本明細書に記載された組成物は、少なくとも（１）腫瘍の存在下で優先的に切断される切断配列と、（２）少なくとも１種のリコールタンパク質、を含む融合タンパク質をさらに含み、上記リコールタンパク質は、患者の体内に存在するＴ細胞により結合されるエピトープである配列を有するタンパク質またはその断片である。様々な実施形態において、切断配列は、カプシドタンパク質に結合される。
カプシドタンパク質。様々な実施形態において、ＶＬＰが、提供される。ＶＬＰは、ウイルス構造粒子、即ちウイルスに似ているがウイルスのウイルス遺伝子材料を欠く粒子に自己組織化するカプシドタンパク質で構成される。ＶＬＰは、それらが非感染性であり、かつ腫瘍細胞を特異的に標的化してそれに結合するように再操作され得るため、優れた送達分子である。
ＨＰＶカプシド（ＶＬＰおよびシュードビリオン（ＰｓＶ））が腫瘍トロピズムを有し、例えば卵巣および肺癌細胞を含む、腫瘍細胞に直接結合し感染することが、報告された。様々な実施形態において、本明細書に記載されるコンジュゲート型ＶＬＰは、優先的に腫瘍細胞に結合し、例えばそれらは、非腫瘍細胞よりも腫瘍細胞により結合し、コンジュゲート型ＶＬＰの存在が、浸潤したＣＤ８＋ Ｔ細胞を引き付ける積極的な炎症促進性腫瘍微細環境をもたらし得る。同時に、ＶＬＰは、過去のワクチン接種または感染からもたらされかつリコールタンパク質のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを認識する適応性のメモリーＴ細胞による応答を刺激し得る。様々な実施形態において、これらの強力な応答は、免疫寛容を迂回し、腫瘍細胞にこの既存の免疫性を受け易くし、それにより腫瘍の成長、進行および転移を阻害できる。
正常細胞に比べて腫瘍細胞に優先的に結合する任意のＶＬＰが、本発明で用いられてよい。様々な実施形態において、ＶＬＰは、動物ウイルスに基づくＶＬＰである。様々な実施形態において、動物ウイルスに基づくＶＬＰは、ＨＢＶｃまたはＨＰＶに由来する。様々な実施形態において、ＶＬＰは、ＭＳ２、Ｑβ、またはＰ２２などのバクテリオファージに基づくＶＬＰである。様々な実施形態において、ＶＬＰは、カウピークロロティックモットルウイルス（ＣＣＭＶ）またはカウピーモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）などの植物ウイルスに基づくＶＬＰである。様々な実施形態において、ＶＬＰは、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのＥＮＧＥＲＩＸ（登録商標）（Ｂ型肝炎ウイルス）およびＣＥＲＶＡＲＩＸ（登録商標）（ヒトパピローマウイルス）、ならびにＭｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．のＲＥＣＯＭＢＩＶＡＸ ＨＢ（登録商標）（Ｂ型肝炎ウイルス）およびＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標）（ヒトパピローマウイルス）を含む、現在商業化されている防護的なＶＬＰに基づくワクチンである。ＶＬＰの他の実施形態としては、インフルエンザウイルス、パルボウイルスおよびノーウォークウイルスなどの臨床試験または前臨床評価の最中であるＶＬＰに基づくワクチン候補が挙げられる。様々な実施形態において、ＶＬＰは、ハムスターポリオーマウイルス、オニテナガエビノダウイルス、ＨＢｓＡｇ、ＨＣＶ、レトロウイルス、またはＨＢｃである。
一実施形態において、ＶＬＰは、パピローマウイルス由来の構造タンパク質で構成される。パピローマウイルスのビリオンは、Ｌ１タンパク質の７２の五量体（カプソマー）を含有する。Ｌ１タンパク質は、真核細胞中で発現される場合にネイティブビリオンと形態学的に判別不能であるカプシド様構造に自己会合できる。Ｌ１モノマーは、１２のｂ鎖、６のループ（ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ、ＨＩ）、および５のらせん（Ｈ１～Ｈ５）を含有する。ループのほとんどは、カプシドの外表面に向かって高度に露出され、本明細書に記載される通り、例えばジスルヒドリンケージ、マレイミドリンケージによる、「クリック」ケミストリーによる、またはポリイオン性ドッキング部位への結合による、これらのループの１つへの融合タンパク質の付着は、これらのエリアで、ＶＬＰの外表面に提示されるリコールタンパク質をもたらすであろう。
パピローマウイルスＶＬＰ。様々な実施形態において、パピローマ（ＰＶ）Ｌ１タンパク質、またはＰＶＬ１およびＰＶＬ２タンパク質を含むコンジュゲート型ＶＬＰが、提供される。ＶＬＰは、幾つかの実施形態において、パピローマＬ１およびＬ２タンパク質の両方を含む。
一実施形態において、コンジュゲート型パピローマウイルスＶＬＰは、Ｌ１カプシドタンパク質および融合タンパク質を含む。他の実施形態において、コンジュゲート型ＶＬＰは、Ｌ１カプシドタンパク質、Ｌ２カプシドタンパク質、および融合タンパク質を含む。Ｌ１ポリペプチドは、完全長Ｌ１タンパク質またはＬ１ポリペプチド断片であり得る。具体的実施形態において、完全長Ｌ１タンパク質またはＬ１ポリペプチド断片は、会合できるＶＬＰであり、即ちＬ１ポリペプチドは、自己会合して、より高次の組織に自己会合する能力を有するカプソマーを形成し、それによりＶＬＰを形成するであろう。より具体的実施形態において、ＶＬＰは、約５０ｎｍの、７２カプソマーまたは３６０コピーのＬ１タンパク質で構成される構造物である、完全に会合されたパピローマウイルスカプシドを含む。
Ｌ１配列は、今日まで同定された実質的に全てのパピローマウイルス遺伝子型について知られており、これらのＬ１配列または断片のいずれかが、本発明の組成物中で使用されることが企図される。Ｌ１ポリペプチドの例としては、完全長Ｌ１ポリペプチド、例えばＨＰＶ１６ Ｌ１ポリペプチド、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：、ネイティブＣ末端が欠如したＬ１トランケーション、ネイティブＮ末端を欠くＬ１トランケーション、および内部ドメインを欠くＬ１トランケーションが挙げられるが、これらに限定されない。Ｌ１タンパク質は、例えば修飾Ｌ１タンパク質、例えばＨＰＶ１６ Ｌ２アミノ酸１７～３６（ＲＧ１エピトープ）がＨＰＶ１６ Ｌ１のＤＥ表面ループに挿入された修飾ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質であってもよい（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ； １３３（１２）：２７０６－２７１３；Ｓｌｕｐｅｔｚｋｙ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｖａｃｃｉｎｅ． ２５：２００１－２０１０；Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏｌ．， ８０：８４１－６；Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００９，Ｖｉｒｏｌ．， ８３：１００８５－１００９５：およびＣａｌｄｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｖａｃｃｉｎｅ， ２８：４３８４－９３参照）。
Ｌ２ポリペプチドは、完全長Ｌ２タンパク質またはＬ２ポリペプチド断片であり得る。Ｌ２配列は、今日まで同定された実質的に全てのパピローマウイルス遺伝子型について知られており、これらのＬ２配列または断片のいずれかが、本発明中で使用され得る。Ｌ２ポリペプチドの例としては、完全長Ｌ２ポリペプチド、例えばＨＰＶ１６ Ｌ２ポリペプチド、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：、ネイティブＣ末端を欠くＬ２トランケーション、ネイティブＮ末端を欠くＬ２トランケーション、および内部ドメインを欠くＬ２トランケーションが挙げられるが、これらに限定されない。
パピローマウイルスＶＬＰは、任意の動物パピローマウイルスからのＬ１、かつ場合によりＬ２ポリペプチド、またはそれらの誘導体もしくは断片を用いて形成され得る。こうしてヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、シカ、イヌ、ネコ、げっ歯類、ウサギなどのパピローマウイルスの任意の公知の（または本明細書の以後に同定される）Ｌ１の、かつ場合によりＬ２の配列が、本発明のＶＬＰまたはカプソマーを調製するために用いられ得る（パピローマウイルスの遺伝子型およびそれらの関連性のほぼ完全な列挙については、参照により本明細書に組み入れられるｄｅ Ｖｉｌｌｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ３２４：１７－２７，２００４を参照されたい）。
様々な実施形態において、ＶＬＰは、パピローマウイルス（ＰＶ）Ｌ１タンパク質、またはＰＶ Ｌ１およびＰＶ Ｌ２タンパク質で構成される。パピローマウイルスは、小さな二本鎖の環状ＤＮＡ腫瘍ウイルスである。パピローマビリオンのシェルは、大部分のＬ１カプシドタンパク質および少量のＬ２カプシドタンパク質を含有する。真核または原核生物発現系における、単独でのまたはＬ２タンパク質と組み合わせたＬ１タンパク質の発現は、カプソマーおよびＶＬＰの会合をもたらすことが知られている。本明細書で用いられる用語「カプソマー」は、完全長Ｌ１タンパク質またはその断片を含む、パピローマウイルスＬ１ポリペプチドの五量体会合を意味するものとする。ネイティブＬ１カプシドタンパク質は、分子間ジスルフィド結合を介し自己会合して、五量体（カプソマー）を形成し得る。
パピローマウイルスビリオンは、Ｌ１タンパク質の７２の五量体（カプソマー）を含有してよい（Ｔｒｕｓ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ４：４１３－４２０，１９９７参照）。Ｌ１タンパク質は、真核細胞中で発現される場合ネイティブビリオンと形態学的に判別不能であるカプシド様構造に自己会合できる（Ｂｕｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ５１９０－９７， ２００８；およびＲｏｙ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｖａｃｃｉｎ．， ５－１２， ２００８参照。両者とも参照により本明細書に組み入れられる）。Ｌ１モノマーは、１２の鎖、６のループ（ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ、ＨＩ）、および５のらせん（Ｈ１～Ｈ５）を含有する。ループのほとんどは、カプシドの外表面に向かって高度に露出され、本明細書に記載される通り、例えばジスルヒドリンケージ、マレイミドリンケージによる、「クリック」ケミストリーによる、またはポリイオン性ドッキング部位への結合による、これらのループの１つへの融合タンパク質の付着は、これらのエリアで、ＶＬＰの外表面で提示されるリコールタンパク質をもたらすであろう。
特定の実施形態において、ＶＬＰを形成するために用いられるＬ１および場合によりＬ２ポリペプチドは、非ヒトパピローマウイルス、またはＨＰＶ－６、ＨＰＶ－１１、ＨＰＶ－１６、およびＨＰＶ－１８以外のヒトパピローマウイルス遺伝子型由来である。例えばＬ１および／またはＬ２タンパク質は、ＨＰＶ１、２、３、４、５、６、８、９、１５、１７、２３、２７、３１、３３、３５、３８、３９、４５、５１、５２、５８、６６、６８、７０、７６、または９２由来であってよい。
様々な実施形態において、本明細書で提示されるコンジュゲート型ＶＬＰは、１種または複数の癌細胞に結合する。これは一部には、腫瘍細胞に特異的なタンパク質および／または分子への、ＶＬＰの選択性による。様々な実施形態において、ＶＬＰは、腫瘍細胞の表面で優先的に発現される、ヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合する。本明細書で用いられる「癌細胞に結合すること」は、コンジュゲート型ＶＬＰが腫瘍細胞に接近し得るような、および融合タンク質がＶＬＰから切断され得るような、およびリコールタンパク質が腫瘍細胞上に存在するＭＨＣ受容体に結合し得るような、コンジュゲート型ＶＬＰのカプシドタンパク質と腫瘍細胞との非共有結合性相互作用の形成を指す。
動物ウイルスに基づくＶＬＰ。本明細書の他の箇所に記載されるＶＬＰに加えて、ＶＬＰは、Ｂ型肝炎ウイルスに由来してもよい。Ｂ型肝炎ウイルスは、内部タンパク質カプシドと、他のタンパク質を含有する脂質エンベロープとで構成される。２種の異なるＶＬＰが、内部カプシドを形成するコア抗原、または脂質と共に自然にナノ粒子（ＮＰ）を形成する表面抗原のどちらかを用いて、ウイルスから生成され得る。Ｂ型肝炎コア（ＨＢｃ）抗原は、２４０コピーの単一タンパク質から形成される。これらのタンパク質は最初に二量体を形成し、その後、五量体または擬似六量体ジャンクションでＴ５４正十二面体の幾何学的構造に会合する。ＶＬＰは、大腸菌のサイトゾル蓄積および無細胞タンパク質合成を含む複数の技術を利用して生成されてきた。会合したＶＬＰは典型的には、サイズ排除クロマトグラフィーまたは分画遠心法を利用して精製される。個々のコートタンパク質は次に、尿素でＶＬＰを分解することにより得られており、これは積荷およびＶＬＰ再会合を同時に可能にする。
バクテリオファージウイルスに基づくＶＬＰ。様々な実施形態において、ＶＬＰは、バクテリオファージウイルスに基づくＶＬＰに由来する。３種のバクテリオファージＭＳ２、Ｑｂ、およびサルモネラ・ティフィムリウムＰ２２は全て、腸内バクテリア、最も顕著には大腸菌に感染する。３種全てが、核酸が充填されたウイルスカプシドのみで構成されるが、Ｐ２２は、ＭＳ２およびＱｂと大きく異なる。ＭＳ２およびＱｂは、９０のホモダイマーで構成され、コートタンパク質に結合することによりＶＬＰ自己組織化を惹起するためにＲＮＡゲノム中の特異的ステムループヘアピン二次構造を必要とする。その一方でＰ２２は、最大４１５のコートタンパク質、１００～３００の足場タンパク質および１２のポータルタンパク質（ｐｏｒｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）で構成される。しかしＰ２２ ＶＬＰは、４２０のコートタンパク質および１００～３００の足場タンパク質のみからなるように操作されており、それは続いてグアニジン塩酸塩で除去され、コートタンパク質のみを残す。ＨＢＶ ＶＬＰのように、これらのＶＬＰは、十二面体の幾何学的構造で会合する。３種全てが、大腸菌で生成され得るが、Ｑｂは、酵母でも生成され得、ＱｂおよびＭＳ２の両方は、無細胞タンパク質合成を利用して生成され得る。ＭＳ２ ＶＬＰは、サイズ排除クロマトグラフィー、分画遠心法、または固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ヘキサヒスチジンタグを含有するＶＬＰの場合）を利用して精製されてきた。酸または尿素を用いて精製ＭＳ２ ＶＬＰを分解して二量体を得ることができ、その後、二量体は、分解剤の除去およびステムループＲＮＡの添加の後に再会合され得る。Ｑｂ ＶＬＰは、サイズ排除クロマトグラフィーを利用して精製されており、二量体は、酸を用いてＶＬＰを分解することにより得ることができ、その後、ＭＳ２と同様に再会合され得る。Ｐ２２ ＶＬＰは、サイズ排除クロマトグラフィーまたは分画遠心法を利用して精製されており、酸を用いて分解して、コートタンパク質を得ることもできる。足場タンパク質の添加は、Ｐ２２ ＶＬＰを再会合するために必要であるが、これらは次に、除去され得る。これらのバクテリオファージ由来ＶＬＰは、塩濃度を上昇させる代わりに追加的生体分子（ＲＮＡまたはタンパク質）を用いて自己会合を開始する、会合刺激において主に、ＨＢｃ ＶＬＰと異なる。
植物ウイルスを基にしたＶＬＰ。様々な実施形態において、ＶＬＰは、植物ウイルスに基づくＶＬＰである。様々な実施形態において、植物ウイルスに基づくＶＬＰは、カウピーの葉のＣＣＭＶおよびＣＰＭＶに由来する。どちらのウイルスも、脂質エンベロープを有しない。両方のＶＬＰは、正十二面体の幾何学的構造で会合する、ＣＣＭＶ ＶＬＰは、９０のホモダイマーから形成され、大腸菌または酵母で生成され得る。それらは、ヘキサヒスチジン伸長を有するコートタンパク質を用いて、サイズ排除クロマトグラフィーまたは固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを利用して精製されてきた。４６，６２の二量体を、会合したＶＬＰを０．５Ｍ ＣａＣｌ２に対し透析することにより、またはヘキサヒスチジンタグ付きの二量体を直接精製することにより、得ることができる。質量比１：６で二量体をＲＮＡと組み合わせること、およびｐＨを４～５に低下させることは、自己会合を誘導する。その一方でＣＰＭＶは、６０コピーのＶＰ６０タンパク質から形成され、これは最初に、Ｌ型およびＳ型コートタンパク質（それぞれ６０コピー）にタンパク質分解されなければならない。残念ながら、ＶＬＰは、大腸菌または酵母を用いて生成できず、昆虫細胞または植物が、用いられなければならない。ＶＬＰは、分画遠心法を利用して精製されてきたが、コートタンパク質は、利用可能な量で得られていない。ＶＬＰを大腸菌で生成できないこと、または精製コートタンパク質を得られないことは、標的化薬物送達の別の難題を追加するが、ＣＰＭＶは、その表面にリガンドおよび容易に提示し、かつそのゲノムとの関連により積荷する能力により、治療的使用について活発に評価されてきた。他の実施形態において、植物ウイルスに基づくＶＬＰは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）である。
ＶＬＰの腫瘍特異性。様々な実施形態において、ＶＬＰは、腫瘍細胞に優先的に結合する。ＶＬＰの腫瘍優先性は、ＶＬＰの電荷（正または負）、形状およびサイズ（異なるアスペクト比のフィラメントおよび異なる径の球）、シールディング（様々なサイズおよび比重の自己タンパク質／ペプチドおよびポリマー）、および標的化（受容体のリガンド、または様々な比重の異なるリンカー上で提示される環境因子）を含む複数の原因から発生し得る。
電荷に関して、様々な実施形態において、ＶＬＰは、正の表面電荷を含有する。正電荷のＶＬＰは、循環中により長く留まる。負電荷を付与する細胞膜中のプロテオグリカンと、正電荷を付与する腫瘍間質空間内のコラーゲンとの豊富な存在により、正電荷粒子は、哺乳動物細胞への結合を増強する可能性がより高く、凝集を回避し腫瘍組織に透過することがより上手くできる。これらの電荷に基づく効果を実証する幾つかの例として、ヒト子宮頸癌中のネイティブＣＰＭＶよりも効率的に８倍取り込まれることが見出されたポリアルギニン修飾されたＣＰＭＶが挙げられる。
形状に関係して、ＶＬＰの形状および柔軟性は、腫瘍全体に拡散するＶＬＰの能力において追加的役割を担うであろう。例えば、球形粒子と形状粒子の間の拡散プロファイルの比較が、回転楕円体モデルを利用してＣＰＭＶおよびＴＭＶで実施され、ＣＰＭＶ（球形）は一定の拡散プロファイルを受けるが、ＴＭＶ（棒状）は極めて急速な早期ローティングフェーズを伴う２相の核酸挙動を呈し、それが針のように作用する軸上の運動に起因し得ることが示された。細長い粒子により与えられる幾つかの他の有利な特性としては、血管壁へのより良好なマージネーション、および相互作用の表面積がより大きいことによるより強力な接着が挙げられ、それは腫瘍のホーミングへの意味合いだけでなく、心臓血管疾患の標的化の増強も有する。
受動的な腫瘍ホーミング特性の他に、ウイルスと特定細胞の自然な相互作用も、活用され得る。ＣＰＭＶ（カウピーモザイクウイルス）は特に、内皮細胞、癌細胞および炎症細胞上で見出される表面ビメンチンと相互作用する際に独特の特異性を呈する。表面ビメンチンへのＣＰＭＶのネイティブの親和性は、深さ最大５００μｍの微小血管系の高解像度イメージングを可能にし、それは、他のナノ粒子は凝集し血管系を遮断する傾向があるため、他のナノ粒子の使用により実行できない。この相互作用は、子宮頸癌、乳癌および結腸癌細胞株を含む一連の癌細胞への送達、アテローム病変の描写、ならびに腫瘍血管系および血管新生の生体内イメージングなどの様々な適用に用いられ得る。存在する内因性関連の別の例は、細胞内への鉄輸送のための重要な受容体であり、かつ数多くの癌細胞株により高度に上方制御される、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を有するＣＰＶである。色素標識後であっても、ＣＰＶは、ＴｆＲへのその特異性を保持し、ＨｅＬａ子宮頸癌細胞、ＨＴ－２９結腸癌細胞、およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞上に見出される受容体に結合することが示された。
様々な実施形態において、ＶＬＰは、腫瘍細胞表面上で優先的に発現されるタンパク質を標的化できる。そのようなタンパク質は典型的には、腫瘍細胞の表面で過剰発現されるが、全てではないがいくつかは、血中、即ち血清中でも見出され得る。そのような表面マーカの非限定的例としては、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、Ｅ－カドヘリン、ＥＭＡ（上皮膜抗原；ＭＵＣ－１としても知られる）、ビメンチン、フィブロネクチン、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ヒト上皮成長因子受容体２型、Ｅｒｂ Ｂ２とも呼ばれる）、αｖβ３インテグリン、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＦＲ－α（葉酸受容体アルファ）、ＰＡＲ（ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ受容体）、およびトランスフェリン受容体（腫瘍細胞で過剰発現される）が挙げられる。
ペプチドは多くの場合、それらの膜貫通型タンパク質の認識に基づき癌性細胞を標識するために用いられる。ほとんどの通例用いられるペプチドは、Ｌ－アルギニン、グリシンおよびＬ－アスパラギン酸で構成される、アルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）である。ＲＧＤは最初、インテグリンに結合する糖タンパク質であるフィブロネクチンの細胞結合ドメインから単離され、細胞－細胞および細胞－細胞外マトリックス（ＥＣＭ）付着、ならびにコラーゲン、フィブリンおよびプロテオグリカンを結合することによるシグナル伝達に関与する。ＲＧＤペプチドは、細胞表面インテグリンの一タイプであるαｖβに対し最高の親和性を有し、αｖβは、腫瘍内皮細胞で高度に発現されるが、正常な内皮細胞では発現されない。様々な実施形態において、そのようなペプチド配列は、コンジュゲート型ＶＬＰ内に組み込まれる。
融合タンパク質。様々な実施形態において、融合タンパク質は、切断配列を含む。切断配列は、腫瘍細胞により、または腫瘍細胞の付近で優先的に切断され得る任意の配列であり得る。融合タンパク質中へのこの切断配列の挿入は、タンパク質を、それが腫瘍微小環境に入るまで不活性にしておくことを可能にする。癌組織中の固有のプロテアーゼの活性上昇を活用することにより、リコールタンパク質はＶＬＰから放出されず、リコールタンパク質が腫瘍微小環境に入るまでＭＨＣ受容体を能動的にコートできる。複数のプロテアーゼが、腫瘍微小環境中で活性であると当該技術分野で知られている。例えば、複数のメタロ－、システイン－およびセリンプロテアーゼが、知られている。癌治療の観点から、追加的な魅力は、プロドラッグ切断を担うプロテアーゼが癌細胞からではなく腫瘍の間質成分から生じ得るため、腫瘍微小環境中への活性薬物放出の方向は癌細胞のみにより発現される標的に依存しないことである。代わりにそれは、標的を表す全体的な腫瘍エコシステムである。
リコールタンパク質。様々な実施形態において、リコールタンパク質は、エピトープであり、それは、対象の体内に既に存在する、Ｔ細胞またはＴ細胞集団により認識される。様々な実施形態において、この存在するＴ細胞またはＴ細胞集団は、以前の感染またはワクチン接種により存在する。本発明の様々な実施形態において、リコールタンパク質は、Ｔ細胞により結合され得るエピトープである。様々な実施形態において、リコールタンパク質は、対象の体内に既に存在するＴ細胞により結合され得るエピトープである。この文脈において、「結合され得る」は、「エピトープ」が細胞の表面で提示され、そこでそれがＭＨＣ分子に直接結合されることを意味する。ＭＨＣ Ｉにより提示可能なＴ細胞エピトープは、細胞障害性ＣＤ８ Ｔリンパ球（ＣＤＳ Ｔ細胞またはＣＴＬ）のＴ細胞受容体により結合され得る。ＭＨＣ Ｉにより提示可能なＴ細胞エピトープは、典型的には９～１２アミノ酸長のペプチドである。様々な実施形態において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドの放出を可能にし、ＭＨＣクラスＩを介して直接提示できる、コンジュゲート型ＶＬＰが、提供される。放出されたリコールタンパク質は、サイトゾルでの抗原プロセシング機構への送達を必要としないため、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは、短い時間で標的細胞の表面で提示される。こうして、本発明の一実施形態において、標的細胞の投与後８．５時間未満で、Ｔ細胞応答誘発ペプチドが、ＭＨＣクラスＩ分子を介して標的細胞の表面で提示される。本発明の別の実施形態において、標的細胞へのコンジュゲート型ＶＬＰの導入後２３．５時間未満で、Ｔ細胞応答誘発ペプチドが、ＭＨＣクラスＩ分子を介して標的細胞の表面で提示される。本発明の別の実施形態において、コンジュゲート型ＶＬＰは、標的細胞へのコンジュゲート型ＶＬＰの投与後６時間未満内に、標的細胞に対するＴ細胞の細胞障害性を媒介できる。
様々な実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも２種のリコールタンパク質を含む。これらのリコールタンパク質は、異なるタンパク質に由来するエピトープであってもよく、またはそれらは、同じタンパク質のエピトープであってもよい。様々な実施形態において、病原体は、ウイルス、バクテリア、真菌または寄生虫である。
様々な実施形態において、既存のＴ細胞は、ワクチンエピトープに特異的である。様々な実施形態において、エピトープは、早期小児ワクチンに由来する。様々な実施形態において、既存の免疫性は、過去のヒトワクチン投与の結果である。
ウイルスの非限定的例としては、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、帯状疱疹ウイルス、風疹、肝炎ウイルス、例えばＡ型肝炎ウイルスもしくはＢ型肝炎ウイルスもしくはＣ型肝炎ウイルス、インフルエンザ、例えばＡ型もしくはＢ型、はしかウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、バリオラ（天然痘）ウイルス、狂犬病ウイルス、デングウイルス、エボラウイルス、西ナイルウイルス、黄熱ウイルス、またはジカウイルスが挙げられる。
バクテリアの非限定的例としては、ボルデテラ・パータシス、クラミジア・トラコマティス、クロストリジウム・テタニ、ジフテリア、ヘモフィルス・インフルエンザ、髄膜炎菌、ニューモコッカス、ビブリオ・コレラ、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ＢＣＧ、腸チフス、大腸菌、サルモネラ、レジオネラ・ニューモフィラ、リケッチア、トレポネーマ・パリダム、Ａ群もしくはＢ群ストレプトコッカス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、バシラス・アントラシス、クロストリジウム・ボツリナム、またはエルシニアｓｐバクテリアが挙げられる。
寄生虫の非限定的例としては、エントアメーバ・ヒストリティカ、トキソプラズマ・ゴンディ、トリキネラｓｐ、例えばトリキネラ・スピラリス、トリコモナスｓｐ、例えばトリコモナス・バギナリス、トリパノソーマｓｐ、例えばトリパノソーマ・ブルセイ・ガンビエンセ、トリパノソーマ・ブルセイ・ロデシエンセ、もしくはトリパノソーマ・クルジ、またはプラスモジウム、例えばプラスモジウム・ファルシパルム、プラスモジウム・ビバックス、もしくはプラスモジウム・マラリアが挙げられる。
様々な実施形態において、リコールタンパク質は、表１に含まれるリストから選択される：
Figure 0007641005000001
Figure 0007641005000002
様々な実施形態において、エピトープは、ヒトワクチンのエピトープに由来する。様々な実施形態において、ワクチンは、早期小児ワクチンである。適切なワクチンの特定の非限定的例を、以下の表２に列挙する：
Figure 0007641005000003
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Figure 0007641005000013
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Figure 0007641005000024
Figure 0007641005000025
様々な実施形態において、リコールタンパク質エピトープは、タンパク質分解切断に続いて放出され、エピトープは、ＭＨＣクラスＩ分子に結合する。ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、および／またはＣファミリー由来であってよい。ＭＨＣクラスＩ分子に結合する特異的エピトープは、表１または表２に列挙されたもののいずれかであってよい。ＭＨＣクラスＩ分子そのものは、以下の非限定的例の１つまたは複数であってよい：ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２０３、ＨＬＡ－Ａ＊０２０６、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ２．１、またはＨＬＡ－Ａ＊０２。
本発明の一態様において、リコールタンパク質は、約８アミノ酸～約５０アミノ酸長、または約８アミノ酸～約４５アミノ酸長、または約８アミノ酸～約４０アミノ酸長、約８アミノ酸～約３５アミノ酸長、または約８アミノ酸～約３０アミノ酸長、約８アミノ酸～約２５アミノ酸長、約８アミノ酸～約２０アミノ酸長、または約８アミノ酸～約１５アミノ酸長である。本発明の一態様において、融合タンパク質は、約１３アミノ酸～約５０アミノ酸長、または約１３アミノ酸～約４５アミノ酸長、または約１３アミノ酸～約４０アミノ酸長、約１３アミノ酸～約３５アミノ酸長、または約１３アミノ酸～約３０アミノ酸長、約１３アミノ酸～約２５アミノ酸長、約１３アミノ酸～約２０アミノ酸長、または約１３アミノ酸～約１５アミノ酸長である。本発明の一態様において、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープは、例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７アミノ酸長であってよい。
切断配列。様々な実施形態において、リコールタンパク質が腫瘍細胞表面のＭＨＣに結合し得るように、リコールタンパク質をＶＬＰから放出させることができる切断配列が、提供される。様々な実施形態において、ＶＬＰは、エンドソームを回避し、分解し、それらの治療性カーゴを機能性形態でサイトゾルに放出する。様々な実施形態において、コンジュゲート型ＶＬＰおよび／またはコンジュゲート型ＶＬＰの融合タンパク質は、腫瘍細胞内のタンパク質分解酵素による切断を受け易く、ＶＬＰまたは融合タンパク質中の標的切断配列の位置は、標的部位の切断がコンジュゲート型ＶＬＰからのＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含むリコールタンパク質の全てまたは一部を放出し、それが腫瘍細胞のＭＨＣクラスＩ分子と複合体化するようなものである。コンジュゲート型ＶＬＰの充分な量は、熟練の技術者により容易に決定され、その量は、例えば対象の特徴、例えば対象の年齢、性別、および／または病気、ならびに腫瘍の特徴、例えば型、体積、および発達状況に依存することは、察知されよう。
切断配列は、細胞に存在する任意のプロテアーゼにより認識されてよい。少なくとも５６９の公知のプロテアーゼが、記載されている（Ｌｏｐｅｚ－Ｏｔｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ， ７（１０）：８００－８０８, ２００７）。全ての同定されたヒトタンパク質分解酵素は、５種の触媒分類：メタロプロテアーゼ、セリン、トレオニン、システインおよびアスパラギン酸プロテアーゼに分類される。標的化され得る潜在的プロテアーゼの非限定的リストが、５種の大まかな分類（最大数から最小数の順に）：メタロプロテアーゼ、セリン、システイン、トレオニンおよびアスパラギン酸プロテアーゼに分配される最もよく研究されたプロテアーゼを要約した表である、表３で示されている。これらのプロテアーゼの幾つかは、健常細胞に比べて癌細胞で過剰発現されることが見出されている。
様々な実施形態において、切断配列は、プロテアーゼフリン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、例えばＭＭＰ１、２、３、７、８、９、１１、１３、１４、もしくは１９、ＡＤＡＭ（ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ）、例えばＡＤＡＭ８、９、１０、１５、１７、もしくは２８、カテプシン、例えばカテプシンＤ、Ｇ、Ｈ、もしくはＮ、エラスターゼ、プロテイナーゼ－３、アズロシジン、またはＡＤＡＭＴＳ－１により認識される。様々な実施形態において、切断配列は、フリンプロテアーゼにより認識される。様々な実施形態において、切断配列は、少なくとも４つのアミノ酸残基を含み、そのうち少なくとも３つは、アルギニン残基である。様々な実施形態において、切断配列は、少なくとも４つのアミノ酸残基を含み、そのうち少なくとも３つは、アルギニン残基であり、１つは、リシン残基またはアルギニン残基のどちらかである。様々な実施形態において、切断配列は、Ｒ－Ｘ－Ｒ／Ｋ－Ｒである。様々な実施形態において、切断配列は、追加の残基を含む。様々な実施形態において、切断配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、または９の追加的アルギニン残基をさらに含む。アルギニンは正に荷電され、正電荷アルギニン残基のより長い鎖が、より負に荷電されたＶＬＰの表面にこのペプチドをより接近させることは、知られている。
Figure 0007641005000026
Figure 0007641005000027
＊略語：AD：アルツハイマー病；ADAM：ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼドメインプロテアーゼ；COPD：慢性閉塞性肺疾患；ER:小胞体；RA：関節リウマチ
様々な実施形態において、融合タンパク質は、ＶＬＰのカプシドタンパク質に結合されなければならない。融合タンパク質をカプシドタンパク質に結合させる方法が、複数存在する。本発明の様々な実施形態において、切断配列は、マレイミドリンケージまたはアミドリンケージを通してコンジュゲートされる（以下で議論する）。融合タンパク質は、ＶＬＰのカプシドタンパク質上の任意の残基に連結されてよいが、ジスルフィドリンケージ、マレイミドリンケージ、およびアミドリンケージが、リコールタンパク質をシステイン、リシン、またはアルギニン残基にコンジュゲートすることにより形成される。
ＶＬＰの表面機能化
本明細書に記載されたＶＬＰは、リコールタンパク質を送達するように機能化されなければならならず、リコールタンパク質は、コンジュゲート型ＶＬＰの表面で提示されなければならない。様々な実施形態において、リコールタンパク質は、カプシドタンパク質上のシステイン残基を通してＶＬＰにコンジュゲートされてよい。そのようなシステイン分子は、自然に、またはＶＬＰの表面で突然変異により提示され得る。様々な実施形態において、ＶＬＰは、ＶＬＰのカプシド様正十二面体構造を維持しながら、ＶＬＰの表面のシステイン残基のスルフヒドリル基を還元するのに充分な還元条件に供される。その遊離スルフヒドリル基のため、システインは、酸化条件下で他のスルフヒドリル含有リガンドとスルフィド結合を容易に、かつ自然に形成するであろう。あるいはマレイミド上に付加された一連の化合物が、６．５～７．５の間のｐＨでシステイン残基とチオエステルリンケージを容易に、かつ不可逆的に形成する。
様々な実施形態において、融合タンパク質は、ＶＬＰ上のリシン残基にコンジュゲートされてもよい。リシン残基は、その第一級アミンのため、容易に修飾される。ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル反応と称される反応（ＮＨＳが反応の一部として放出されるため）を利用して、アミド結合が、表面露出リシン残基で形成される。この反応は、ｐＨ７．２～ｐＨ９の間で自然に起こる。この付着化学は、ＭＳ２上でトランスフェリンを提示するために用いられており、それはＶＬＰが血液脳関門を経細胞輸送することを可能にし、神経障害の治療薬の新しいライブラリーを開拓することを可能にする。
様々な実施形態において、融合タンパク質はまた、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基にコンジュゲートされてもよい。システインおよびリシンを含む方策と異なり、これらの残基へのカップリングは、複数のステップを必要とする。第一に、カルボン酸は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いて活性化されなければならない。一旦活性化されると、それは、ＮＨＳと反応して、ＮＨＳエステルを形成するであろう。カルボン酸側鎖が本質的にＮＨＳエステルになるので、露出した第一級アミンを有するリガンドを用いて安定なアミド結合を形成できる。
様々な実施形態において、ＶＬＰは、正電荷アミノ酸の領域を含む融合タンパク質に結合できる表面露出エリア上の負電荷アミノ酸の領域を含む。様々な実施形態において、負電荷アミノ酸の領域は、片側または両側が、ポリアニオン：システイン、またはより具体的にはポリグルタミン酸：システイン、またはポリアスパラギン酸;システインと称される１つまたは複数のシステイン残基により隣接されてよい。そのような例では、ＶＬＰおよび融合タンパク質のコンジュゲーションは、ＶＬＰと融合タンパク質の間の相補性アミノ酸電荷の非共有結合と、システイン間のジスルフィド結合とから生じる。様々な実施形態において、システイン（複数可）は、任意の二次／三次構造がシステイン（複数可）に接近して電荷アミノ酸領域をもたらすように、電荷アミノ酸の領域から１つまたは複数のアミノ酸離れている。本発明の様々な実施形態において、融合タンパク質は、末端システインとＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープの間に位置する相補性ポリイオン：システイン配列および酵素切断部位を含むＶＬＰに融合タンパク質を付着させるために少なくとも１つのリコールタンパク質およびポリイオン：システインを含む。様々な実施形態において、融合タンパク質は、末端システインと、少なくとも１つのリコールタンパク質と、末端システインとリコールタンパク質（複数可）の間に位置する酵素切断配列とを含む。
コンジュゲート型ＶＬＰを生成する際に用いられ得る負電荷アミノ酸としては、例えばグルタミン酸およびアスパラギン酸が挙げられる。これらのアミノ酸は、単一で、例えばポリグルタミン酸として、または組み合わせて用いられ得る。具体的実施形態において、領域は、グルタミン酸を含む。負電荷アミノ酸の数は、変化してよく、約４～約２０アミノ酸、約６～約１８アミノ酸、または約８～約１６アミノ酸などを包含し得る。具体的実施形態において、領域は、約８の負電荷アミノ酸を含む。より具体的な実施形態において、領域は、ＥＥＥＥＥＥＥＥＣ（Ｅ８Ｃ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４）を含む。別の実施形態において、領域は、ＣＥＥＥＥＥＥＥＥＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）を含む。ジスルフィド結合を介して融合タンパク質をＶＬＰにコンジュゲートするための方法は、知られている。例えば、融合タンパク質上のポリアルギニンシステイン部分の存在は、Ｌ１粒子の様々なループ中に存在するポリアニオン部位（ＥＥＥＥＥＥＥＥＣ、Ｅ８Ｃ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４）へのペプチドのドッキングを可能にする。２つのシステイン残基の間の共有結合での架橋は、この会合を酸化条件下で不可逆的にするはずである。コンジュゲーション反応では、精製されたＨＰＶ粒子を、コンジュゲーション緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ＝７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２）中で透析し、その後、ペプチドおよび酸化試薬を添加し、その反応を４℃で１６時間進行させる。インキュベーションの終了時に、反応混合物を、サイズ排除カラム（ＳＥＰＨＡＤＥＸ(登録商標） Ｇ－１００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、米国ニュージャージー州、容量２０ｍｌ、流速１ｍｌ／分、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２）にアプライして、非コンジュゲート型ペプチドを除去し、緩衝液を交換する。空隙容積に溶出するコンジュゲート型粒子を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでＬ１タンパク質の存在により同定する。コンジュゲート型粒子を、電子顕微鏡測定により分析する。当業者は、日常的実験を通して、表面露出エリアにポリイオン領域、例えば１つまたは複数のループを含み、かつＶＬＰ会合能力のある、ＶＬＰを作製できる。
様々な実施形態において、融合タンパク質は、コートタンパク質に遺伝的に融合される。様々な実施形態において、融合タンパク質は、ＶＬＰに共有結合または非共有結合のどちらかで連結されてよい。例えば、負電荷および正電荷アミノ酸の結合を介して、またはマレイミドに基づくコンジュゲーションを介して、リコールタンパク質をＶＬＰに付着させるよりむしろ、融合タンパク質をコードする核酸配列が、発現の際に融合タンパク質が生成されるように、カプシドタンパク質をコードする核酸に挿入されてよく、そこでリコールタンパク質はカプシドタンパク質のループに挿入されＶＬＰの表面で提示される。
様々な実施形態において、非天然アミノ酸が、融合タンパク質をＶＬＰにコンジュゲートするために用いられてもよい。２０のアミノ酸の他に、多くの非天然アミノ酸が、部位特異的タンパク質コンジュゲーション反応に用いられてきた。例えば、アジドホモアラニン（ＡＨＡ）またはｐ－アミノ－フェニルアラニン（ｐＡＦ）が、コンジュゲーションのためにＶＬＰコートタンパク質に組み込まれてよい。これらのアミノ酸は、２つの方法：グローバルなメチオニン置換およびアンバー終止コドン抑制、でタンパク質に組み込まれる。ＡＨＡはメチオニンと非常に類似しているため、ＡＨＡは、メチオニン供給が律速的であれば各ＡＵＧコドンで組み込まれ、これはグローバルメチオニン置換と称される。メチオニンまたは無細胞タンパク質合成のための栄養素要求性バクテリアが、メチオニンの利用可能性を限定するために用いられ得る。アンバー終止コドン抑制は、ｐＡＦを組み込むであろう。アンバー終止コドン抑制は、非ネイティブ合成酵素と、天然アミノ酸と反応しないｔＲＮＡとを利用して、非天然アミノ酸をアンバー終止コドンＵＡＧで組み込む。アジドを提示するＡＨＡは、銅（Ｉ）触媒によるアジド－アルキン環化付加（「クリック」反応）に参加し、アルキン含有リガンドと共有結合性のトリアゾール環を形成する。
様々な実施形態において、コンジュゲート型ＶＬＰは、少なくとも１０分の１のウイルスコートタンパク質を含み、リコールタンパク質を提示してよい。様々な実施形態において、ウイルスコートタンパク質の少なくとも５分の１が、リコールタンパク質を提示してよい。様々な実施形態において、ウイルスコートタンパク質の約半分が、リコールタンパク質を提示してよい。様々な実施形態において、ウイルスコートタンパク質の約３分の２が、リコールタンパク質を提示してよい。様々な実施形態において、ウイルスコートタンパク質のほぼ全てが、リコールタンパク質を提示してよい。
処置の方法
本発明の様々な実施形態における、それを必要とする患者にコンジュゲート型ＶＬＰを投与することにより、それを必要とする対象の癌を処置するための方法。本発明の方法は、本発明のコンジュゲート型ＶＬＰを、腫瘍の成長、進行または転移を阻害するのに充分な量で、それを必要とする対象に投与することを含む。本発明の様々な実施形態において、コンジュゲート型ＶＬＰは、マクロファージおよびナチュラルキラー細胞の細胞障害活性を刺激することを含む、サイトカイン生成および／または細胞免疫性、詳細には自然免疫性を刺激するのに充分な量でそれを必要とする対象に投与される。本発明の様々な実施形態において、それを必要とする対象は、過去に腫瘍を処置されたことがあり、現在は医療基準により癌を有しないまたは疾患を有しないと見なされる対象である。
手短に述べると、記載されるコンジュゲート型ＶＬＰの作用機序を、図１に表す。ＶＬＰは、腫瘍細胞に特異的に結合する（図１の左側の腫瘍細胞）。ＶＬＰ上のリコールタンパク質エピトープはその後、フリンによりタンパク質分解切断され、それは腫瘍微小環境で過剰発現される。これは順次、コンジュゲート型ＶＬＰからのエピトープ放出および腫瘍ＭＨＣクラス１分子上へのエピトープのローディング（「エピトープコーティング」）をもたらす。（図１、中央の分解立体図はＶＬＰからのエピトープがロードされたブロック状のＭＨＩ分子を示す）。エピトープでコートされた腫瘍細胞はその後、１つまたは複数の小児ワクチンＴ細胞および既存のＣＤ８ Ｔ細胞により病原体感染細胞として認識され、惹起された免疫リダイレクション応答を生じる。（図１、右端の図解）。即ちこの認識事象は、病原体および小児ワクチンに対する宿主に既存の免疫記憶が、腫瘍微小環境中の腫瘍に対抗して活性化し、腫瘍を攻撃し破壊することをもたらす。腫瘍細胞の破壊は、既存の免疫応答の成分が癌細胞抗原に暴露されることをもたらし得る。したがって、殺傷された腫瘍細胞から放出される抗原は、追加的な腫瘍特異性ＣＤ８ Ｔ細胞を動員する免疫応答、またはその後このエリアで追加の腫瘍細胞を攻撃するために進行するＴ細胞の「第二の波」を開始するであろう。これは、癌細胞抗原に対抗する内在性免疫応答の誘発をもたらすことができ（一般に「エピトープスプレディング」として知られる）、抗腫瘍免疫記憶に導く。
こうして、本明細書に開示される方法は、個体自身の既存の適応記憶免疫系を利用して癌細胞を攻撃することによる、個体において癌を処置する方法である。本明細書に記載される方法は、本来は癌への応答で誘発されなかったが、代わりに日常的なワクチン接種計画により、または自然な環境に存在する微生物および病原体を介して誘発される、既存の免疫応答を個体が有する、という事実を利用する。癌細胞は、通常は既存の免疫応答を誘発する細菌抗原を発現しないため、そのような免疫応答が癌を攻撃することは予期されない。しかし本発明の方法によれば、そのような既存の免疫応答が、動員されて対象の癌を攻撃、殺傷、および浄化する可能性がある。これは、癌の内部または表面に、対象の既存の免疫応答により認識されることが知られた１種または複数の抗原を導入し、免疫応答の細胞が抗原提示癌細胞を攻撃することをもたらすことにより実現される。さらに、癌細胞の破壊は、既存の免疫応答成分が追加の癌細胞抗原に暴露されることをもたらし得る。こうして、本発明の一般的方法は、既存の免疫応答が癌を攻撃するように、癌の部位に個体中の既存の細菌またはワクチン免疫応答を動員することにより実践され得る。こうして一般に、１）ＶＬＰを腫瘍細胞に結合させること、腫瘍細胞表面での提示のためにＶＬＰからエピトープを切断してエピトープのＭＨＣ結合に導くこと、エピトープに対抗する対象の既存のリコールされた免疫性によりロードされたＭＨＣを認識すること、ならびに第二の波およびその後の長期抗腫瘍性免疫性を惹起すること、を含む、この方法に関与する４つのステップが存在する。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータが、ヒトにおける使用のために様々な投与量を配合する際に用いられてよい。そのような組成物の投与量は、好ましくはＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあり、ほとんど、または全く毒性を有しない。投与量は、用いられる投与剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化してよい。本発明の方法で用いられる任意の組成物では、治療的有効用量が、最初に細胞培養アッセイから推定されてよい。用量が、動物モデルにおいて配合されて、細胞培養で決定されたＩＣ５０（症状の最大半量阻害を実現する試験組成物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を実現してよい。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量を正確に決定するために用いられてよい。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより、測定されてよい。
多くの例において、ＶＬＰ含有組成物の複数回投与、通常は多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５回もしくはより多く、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５回もしくはより多く、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５回を超えないもしくはより多くのワクチン接種（それらの間の全範囲を含む）を有することが望ましであろう。ワクチン接種は通常、１、２、３、４、５、６週～５、６、７、８、９、１０、１１週～１２週／月／年の間隔が置かれ（それらの間の全ての値および範囲を含む）、より通常は３～５週間隔であろう。
様々な実施形態において、本発明のコンジュゲート型ＶＬＰの有効量をそれを必要とする対象に投与することによるマクロファージおよびナチュラルキラー細胞の細胞障害活性を刺激するための方法が、提供される。マクロファージおよびナチュラルキラー細胞は、腫瘍微小環境に存在するものであってよい。本発明の一態様において、コンジュゲート型ＶＬＰは、腫瘍微小環境に既に存在するマクロファージおよびナチュラルキラー細胞の細胞障害活性を刺激するのに効果的な量で、対象に投与される。本発明の様々な実施形態において、コンジュゲート型ＶＬＰは、マクロファージおよびナチュラルキラー細胞を腫瘍微小環境に誘引するのに効果的な量で、対象に投与される。
本発明の様々な実施形態において、コンジュゲート型ＶＬＰは、リコールタンパク質に抗体の充分な数を結合させてマクロファージ、好中球およびナチュラルキラー細胞を誘引し刺激するのに効果的な量で、対象に投与される。
本発明の様々な実施形態において、本発明のコンジュゲート型ＶＬＰの有効量をそれを必要とする対象に投与することによる、存在するメモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞の細胞障害活性を腫瘍細胞または腫瘍微小細胞にリダイレクトするための方法が、提供される。好ましくは、コンジュゲート型ＶＬＰのリコールタンパク質のＴ細胞エピトープは、対象が能動的にワクチン接種されたことのある病原体のもの、または過去に対象に感染した病原体のものであり、対象は、腫瘍細胞上のＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成したＴ細胞エピトープを認識するメモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞を有する。本発明の一態様において、コンジュゲート型ＶＬＰの有効量は、メモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞を腫瘍微小環境に誘引するのに充分な量である。本発明の態様において、コンジュゲート型ＶＬＰの有効量は、腫瘍微小環境に存在するメモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞を刺激するのに充分な量である。
様々な実施形態において、腫瘍は、小細胞肺癌、肝細胞癌、肝臓癌、肝細胞癌、黒色腫、転移性黒色腫、副腎癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ癌、乳癌、原発臓器不明の癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、眼癌、胆嚢癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、妊娠性トロホブラスト疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭および下咽頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、口腔および中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、脾辺縁帯リンパ腫、辺縁帯リンパ腫（節外性または節性）、成人の混合細胞型びまん性アグレッシブリンパ腫、成人の大細胞型びまん性アグレッシブリンパ腫、成人の大細胞型免疫芽球性びまん性アグレッシブリンパ腫、成人の小型非切れ込み核細胞性びまん性アグレッシブリンパ腫、もしくは濾胞性リンパ腫、頭頸部癌、子宮内膜もしくは子宮癌腫、非小細胞肺癌、骨肉腫、膠芽腫、または転移癌である。好ましい実施形態において、癌は、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、膵臓癌または黒色腫である。
本明細書で用いられる用語「癌」は、リンパ腫、リンパ性白血病、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、細気管支肺胞細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部の癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸の癌、膣の癌、外陰の癌、ホジキン病、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟部組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、膀胱の癌、腎臓もしくは尿管の癌、腎細胞癌、腎盂の癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍（ｓｐｉｎａｌ ａｘｉｓ ｔｕｍｏｒｓ）、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、およびユーイング肉腫などの、増殖性疾患を指し、上記癌のいずれかの難治性の型、または上記癌の１つもしくは複数の組み合わせも含む。
本発明の一態様は、本発明のコンジュゲート型ＶＬＰを対象に投与することによる、それを必要とする対象において癌を処置するための方法であり、ここでリコールタンパク質のＣＤ８＋エピトープは、ウイルス誘導性癌、例えばＨＰＶ子宮頸癌、ＨＰＶ＋口腔癌、ＥＢＶ鼻咽頭癌に対し奏功しなかった治療性癌ワクチン（「治療性ワクチン」）のものである。方法は、対象がワクチンに対し能動的にワクチン接種したが処置に対し抗腫瘍効果を有して応答しなかったかどうかを決定することを含む。患者はその後、本発明のコンジュゲート型ＶＬＰの有効量を対象に投与し、ここでリコールタンパク質のＣＤ８＋エピトープは、対象に感染した、過去に対象に投与されたワクチン中の抗原決定基のものである。
様々な実施形態において、本発明のコンジュゲート型ＶＬＰを対象に投与することによる、それを必要とする対象の癌を処置するための方法が提供され、ここでリコールタンパク質のＣＤ８＋エピトープは、ウイルス誘導性癌、例えばＨＰＶ子宮頸癌、ＨＰＶ＋口腔癌、ＥＢＶ鼻咽頭癌に対し奏功しなかったＣＡＲ－Ｔ細胞療法（「ＣＡＲ－Ｔ」）のものである。方法は、対象がＣＡＲ－Ｔで能動的に処置されたが処置に対し抗腫瘍効果を有して応答しなかったかどうかを決定することを含む。患者はその後、本発明のコンジュゲート型ＶＬＰの有効量を対象に投与し、ここでリコールタンパク質のＣＤ８＋エピトープは、対象に感染した、過去に対象に投与されたＣＡＲ－Ｔ中の抗原決定基のものである。
様々な実施形態において、本発明のコンジュゲート型ＶＬＰを対象に投与することによる、それを必要とする対象の癌を処置するための方法が提供され、ここでリコールタンパク質のＣＤ８＋エピトープは、癌に対して奏功しなかったワクチンまたはＣＡＲ－Ｔ細胞療法のものである。方法は、対象がＣＡＲ－Ｔで能動的に処置されたが処置に対し抗腫瘍効果を有して応答しなかったかどうかを決定することを含む。患者はその後、本発明のコンジュゲート型ＶＬＰの有効量を投与され、ここでリコールタンパク質のＣＤ８＋エピトープは、対象に感染した、過去に対象に投与されたＣＡＲ－Ｔ中の抗原決定基のものである。
ＶＬＰは、アジュバント特性を有する。幾つかの実施形態において、本発明のコンジュゲート型ＶＬＰ組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる、免疫応答の追加的な非特異的刺激物質の使用により増強され得る。適切なアジュバントとしては、サイトカイン、毒素またはアラムなどの合成組成物などの、全ての許容できる免疫刺激性化合物が挙げられる。
アジュバントとしては、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、無機塩、ポリヌクレオチド、および天然物質が挙げられるが、これらに限定されない。用いられ得る特異的アジュバントとしては、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ｙ－インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、ＢＣＧ、水酸化アルミニウムもしくは他のアルミニウム化合物などのアルミニウム塩、ｔｈｕｒ－ＭＤＰおよびｎｏｒ－ＭＯＰなどの、ＭＤＰ化合物、ＣＧＰ（ＭＴＰ－ＰＥ）、リピドＡ、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、または不活性化細菌剤が挙げられる。２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョン中にバクテリアから抽出された３成分、つまりＭＰＬ、トレハロースジミコール酸（ＴＯＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）を含有する、ＲＩＢＩ。ＭＨＣ抗原がさらに、用いられてよい。
コンジュゲート型ＶＬＰ組成物に対するアジュバントの影響を実現する様々な方法としては、リン酸緩衝生理食塩液中の約０．０５～約０．１％溶液として一般的に用いられる、水酸化またはリン酸アルミニウム塩（アラム）、約０．２５％溶液として用いられる糖の合成ポリマー（例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標））との混合物、それぞれ約７０℃～約１０１℃の範囲の温度での３０秒間～２分間の熱処理による組成物中のタンパク質の凝集物などの薬剤の使用が挙げられる。アルブミンに対するペプシン処理（Ｆａｂ）抗体での再活性化による凝集物；バクテリア細胞、例えばＣ．パルバム、グラム陰性菌の内毒素もしくはリポ多糖成分との混合物；生理学的に許容できる油性ビヒクル、例えばモノオレイン酸マンニド（Ａｒａｃｅｌ Ａ（商標））中のエマルジョン、または保護置換基として用いられる、ペルフルオロカーボン（ＦＬＵＯＳＯＬ－ＤＡ（登録商標））の２０％溶液によるエマルジョンもまた、アジュバント効果を生成するのに用いられてよい。典型的なアジュバントは、完全フロイントアジュバント（死菌のマイコバクテリウム・ツベルクローシスを含有）、不完全フロイントアジュバント、および水酸化アルミニウムである。
ヒトへの投与の場合、種々の適切なアジュバントが、熟練の研究者に明白であろう。これらは、例えば、アジュバントとしてのアラム－ＭＰＬ、または同等の配合剤、認可されたＨＰＶワクチンＣＥＲＶＡＲＩＸ（登録商標）中で用いられるＡＳＯ４、ＡＳ０３、ＡＳ０２、ＭＦ５９、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ、ＧＰＩ－０１００などのサポニンを基剤とするアジュバント、ＣｐＧを基剤とするアジュバント、またはイモキモドを含む。が本発明の実施形態において、アジュバントは、ＶＬＰと単に混合されるよりむしろ、ＶＬＰに生理学的にカップリングされるか、またはＶＬＰにカプセル化される。アジュバントに加えて、免疫応答を増強する生物学的応答調節物質（ＢＲＭ）を同時投与することが、望ましい場合がある。ＢＲＭは、Ｔ細胞免疫性を上方制御すること、またはサプレッサ細胞活性を下方制御することが示されている。そのようなＢＲＭとしては、シメチジン（ＣＩＭ；１２００ｍｇ／ｄ）（Ｓｍｉｔｈ／Ｋｌｉｎｅ、米国ペンシルベニア州）；または低用量シクロホスファミド（ＣＹＰ；３００ｍｇ／ｍｌ）（Ｊｏｈｎｓｏｎ／Ｍｅａｄ、米国ニュージャージー州）およびγ－インターフェロン、ＩＬ－２もしくはＩＬ－１２などのサイトカイン、またはＢ－７などの免疫ヘルパー機能に関与するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の実施形態において、これらの遺伝子は、対象への送達を容易にするためにＶＬＰによりカプセル化される。
有効成分としてポリペプチドまたはペプチド配列（複数可）を含有する組成物の調製は、当該技術分野で一般によく理解されている。典型的には、そのような組成物は、液体溶液もしくは懸濁液のどちらかとして注射液として調製されるが、注射に先立ち液体中の溶液または懸濁液に適した固体の形態が、調製される場合もある。調製物は、乳化されてもよい。免疫原性の有効成分は多くの場合、医薬的に許容でき有効成分と相溶性がある賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールエタノールなど、およびそれらの組み合わせである。加えて、所望なら、組成物は、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはワクチンの有効性を増強するアジュバントなどの補助的物質の量を含有してよい。具体的実施形態において、ワクチンは、物質の組み合わせと配合される。
本発明のコンジュゲート型ＶＬＰを含む組成物は、対象へのインビボ投与に適した生物学的適合性形態である。医薬組成物は、医薬的に許容できる担体をさらに含む。用語「医薬的に許容できる」は、動物、より詳細にはヒトでの使用のために、連邦の規制当局もしくは州政府により認可されていること、または米国薬局方もしくは他の一般に認識された薬局方に列挙されていることを意味する。用語「担体」は、それと共にＶＬＰが投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような医薬担体は、非限定的にピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などを含む、石油、動物起源、植物起源または合成起源のものを含む、水および油などの滅菌液であり得る。医薬組成物が経口投与される場合、水が、担体であってよい。医薬的組成物が静脈内投与される場合、生理食塩水および水性デキストロースが、担体であってよい。生理食塩溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、注射用溶液のための液体担体として用いられてよい。適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク（ｄｒｉｅｄ ｓｌｉｍ ｍｉｌｋ）、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。医薬組成物はまた、微量の湿潤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有してもよい。
本発明のコンジュゲート型ＶＬＰを含む医薬組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放性配合剤などの形態をとり得る。経口配合剤は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムほかの標準的担体を含んでよい。具体的実施形態において、医薬組成物は、患者への妥当な投与のための形態を提供するように、本発明のコンジュゲート型ＶＬＰの有効量を、適切な量の医薬的に許容できる担体と共に含む。配合剤は、投与様式に適するべきである。
本発明の医薬組成物は、非限定的に、静脈内、筋肉内、関節内、気管支内、腹部内、嚢内、軟骨内、窩内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内（ｉｎｔｒａｏｓｔｅａｌ）、骨内（ｉｎｔｒａｏｓｓｅｏｕｓ）、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、経口、非経口、皮下、膣、直腸、口腔、舌下、鼻内、イオン導入手段または経皮の手段を含む、任意の特有の投与経路により投与されてよい。最も適切な経路は、静脈内注射または経口投与である。特有の実施形態において、組成物は、標的エリアに、またはその付近に、例えば腫瘍内注射で投与される。
水性溶液中での非経口投与では、例えば、溶液は、必要に応じて適切に緩衝されるべきであり、液体希釈剤が最初に、充分な生理食塩水またはグルコースで等張にされるべきである。これらの特有の水性溶液は、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮下、および腹腔内投与に特に適する。この関連において、用いられ得る滅菌水性媒体は、本開示に照らせば当業者に理解されるであろう。例えば１つの投与量が、等張ＮａＣｌ溶液に溶解され、皮下点滴療法液に添加され得るか、または提案された輸液部位に注射され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９９０参照）。投与量の若干の変化が、対象の条件に応じて、必ず起こるであろう。投与の担当者は、任意の事象において、個々の対象に適した用量を決定するであろう。
本発明のコンジュゲート型ＶＬＰ含有組成物は、吸入により投与されてよい。特定の実施形態において、組成物は、エアロゾルとして投与され得る。本明細書で用いられる用語「エアロゾル」または「エアロゾル化組成物」は、気体中の固体または液体粒子の懸濁物を指す。この用語は一般に、固体または液体形態から懸濁固体または液体薬物粒子を含む吸入可能な形態に、蒸発、噴霧、または他の方法で変換された組成物を指すために用いられてよい。そのようなエアロゾルは、呼吸器系を介して組成物を送達するために用いられ得る。本明細書で用いられる用語「呼吸器系」は、酸素の吸い込みおよび二酸化炭素の吐き出しを担う体内の臓器系を指す。この系は一般に、鼻から肺胞までの空気通路の全てを含む。哺乳動物において、それは肺、気管支、細気管支、気管、鼻腔、および横隔膜を含むと見なされる。本開示の目的では、呼吸器系への組成物の送達は、薬物が呼吸器系の空気通路の１つまたは複数へ、特に肺へ送達されることを示す。
他の投与様式に適した追加的配合剤としては、坐剤（肛門または膣適用のため）、および幾つかの例では、経口配合剤が挙げられる。坐剤の場合、従来の結合剤および担体は、例えば、ポリアルキレングリコール（ｐｏｌｙａｌｋａｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）またはトリグリセリドを含んでよく、そのような坐剤は、約０．５％～約１０％、好ましくは約１％～約２％の範囲の有効成分を含有する混合物から形成されてよい。経口配合剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常用いられる賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性配合剤、または粉末の形態をとり、約１０％～約９５％の有効成分、好ましくは約２５％～約７０％の有効成分を含有する。
コンジュゲート型ＶＬＰ組成物は、中性のまたは塩の形態としてワクチンに配合されてよい。医薬的に許容できる塩としては、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基で形成される）、ならびに例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来してよい。
本発明の医薬組成物はまた、追加のアジュバントの有効量を含み得る。本明細書で言及される通り、パピローマウイルスＶＬＰは、アジュバント特性を有する。適切な追加的アジュバントとしては、フロイント完全または不完全、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、Ｐｌｕｒｏｎｉｃポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、ジニトロフェノール、ならびにカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、コリネバクテリウム・パルム、および非毒性コレラ毒素などの潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。
貯蔵および使用の通常条件下で、これらの調製物は、微生物の生育を予防する防腐剤を含有する。全ての例で、医薬形態は、滅菌性でなければならず、容易に注射され得る程度に流体でなければならない。それはまた、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、バクテリアおよび真菌などの微生物の混入作用から予防されなければならない。
担体はまた、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。妥当な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用により、分散物の場合は必要とされる粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持され得る。微生物作用の予防は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらされ得る。多くの例で、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸ナトリウムおよびゼラチンの組成物中での使用によりもたらされ得る。
滅菌注射溶液は、適切な溶媒中の必要量のコンジュゲート型ＶＬＰを先に列挙した様々な原材料と共に組み込むことにより調製され、必要に応じて、その後濾過滅菌される。一般的に分散物は、塩基性分散媒および先に列挙したものからの必要な他の原材料を含有する滅菌ビヒクルに種々の滅菌有効成分を組み込むことにより調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それらは、事前に濾過滅菌された溶液から活性成分と任意の追加的な所望の原材料との粉末を生じる。
本発明の異なる態様は、コンジュゲート型ＶＬＰを含む組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。本発明の幾つかの実施形態において、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む標的ペプチドを含むコンジュゲート型ＶＬＰは、腫瘍を処置するため、またはそのような腫瘍の再発を予防するために患者に投与される。そのような組成物は一般に、医薬的に許容できる担体または水性媒体中に溶解または分散されるであろう。
適切なＶＬＰを提供する方法
様々な実施形態において、（１）患者における既存の免疫性を測定すること、および（２）必要とする患者の投与のために適切なコンジュゲート型ＶＬＰを選択すること、を含む、コンジュゲート型ＶＬＰを、それを必要とする患者に提供するための方法が、提供される。患者に投与する適切なコンジュゲート型ＶＬＰは、患者のＴ細胞プロファイルに依存するであろう。適切なコンジュゲート型ＶＬＰは、ベースラインのＣＤ８＋細胞の総数の少なくとも２倍であるＴ細胞応答を誘発できるものであろう。様々な実施形態において、適切なコンジュゲート型ＶＬＰは、ベースラインのＣＤ８＋の総数または総ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ Ｔ細胞の２倍であるＴ細胞応答を誘発できるものであろう。目的は、患者のワクチン接種歴に基づき、または病原体への暴露前に、適切なコンジュゲート型ＶＬＰを選択することである。どのコンジュゲート型ＶＬＰが適切であるかを決定することは、（１）患者の問診；（２）患者の医療記録の再調査；および／または（３）患者のＴ細胞プロファイルを評定すること、を通して実現され得る。
様々な実施形態において、１種より多くのリコールタンパク質が、腫瘍に向けられる免疫応答を誘発するのに適切であってよい。様々な実施形態において、どちらか一方のリコールタンパク質を担うコンジュゲート型ＶＬＰが、適切であろう。様々な実施形態において、１種より多くのリコールタンパク質が、発現され、ＶＬＰに結合される。様々な実施形態において、単一の融合タンパク質が、１種より多くのリコールタンパク質を含む。様々な実施形態において、異なるリコールタンパク質を含む複数の融合タンパク質が、ＶＬＰにコンジュゲートされるであろう。様々な実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるコンジュゲート型ＶＬＰの集団と、医薬的に許容できる賦形剤とを含む。様々な実施形態において、対象に投与されるコンジュゲート型ＶＬＰは、同一である。様々な実施形態において、異なるリコールタンパク質（複数可）を担うコンジュゲート型ＶＬＰが、対象に投与される。
過去のワクチン接種に基づく選択。本発明の様々な実施形態において、適切なコンジュゲート型ＶＬＰを選択する方法が、それを必要とする対象に投与するために提供される。様々な実施形態において、これは、対象が所与の病原体、例えば寄生虫、バクテリア、またはウイルス、例えばはしかまたはポリオに対し能動的にワクチン接種されたことがあるかどうかを確認すること、およびその後、本明細書に開示されるコンジュゲート型ＶＬＰを選択し対象に投与すること、を含み、ここでリコールタンパク質のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープは、それに対し対象が免疫付与された病原体由来である。様々な実施形態において、対象のワクチン接種歴は、対象の医療記録を再調査することにより得られる。様々な実施形態において、対象のワクチン接種歴は、対象に問診することにより得られる。
過去の感染に基づく選択。様々な実施形態において、それを必要とする対象への投与のために適切なコンジュゲート型ＶＬＰを選択する方法は、対象が過去に所与の病原体、例えば寄生虫、バクテリア、またはウイルス、例えばはしかまたはポリオに感染したことがあり、かつ感染が解消されたかどうかを確認することを含む。様々な実施形態において、対象はその後、対象が過去に感染した上記病原体を含むリコールタンパク質を含む、コンジュゲート型ＶＬＰを投与される。
対象の医療記録を再調査すること、または対象に問診することにより、対象が特有の病原体に感染したかどうかを確認してよい。特有のＭＨＣクラスＩ分子に結合するＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープの非限定的例を、表１に表す。方法はまた、どのＭＨＣクラスＩ決定基（複数可）を対象の細胞が発現するかを決定すること、およびその後、本発明のコンジュゲート型ＶＬＰを投与すること、を含んでよく、ここでリコールタンパク質のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープは、対象のＭＨＣクラスＩ決定基（複数可）と複合体を形成する、ワクチン中の病原体または対象に過去に感染した病原体の抗原成分のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープである。
Ｔ細胞応答を測定すること。様々な実施形態において、患者のＴ細胞プロファイルが、当該技術分野で公知の様々な技術を利用して、適切なコンジュゲート型ＶＬＰを選択するために評定される。その後、このプロファイルは、投与する適切なコンジュゲート型ＶＬＰを選択するために用いられる。そのような技術としては、インターフェロンγレベルを測定すること、Ａｇ特異性ＣＤ８＋ Ｔ細胞を単離するフローサイトメトリーを利用すること、および／または細胞障害性アッセイが挙げられる。インターフェロンγ（Ｔ細胞活性化のマーカ）を測定するための、単離されたＴ細胞の細胞内染色。あるいはインターフェロンγのための酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイが、実行されてよい。この技術は、患者のＴ細胞プロファイルのハイスループット評定を可能にする。この方法は、１００，０００～３００，０００細胞の中の１つを検出できる可能性がある。手短に述べると、特異的サイトカインのモノクローナル抗体を、ポリ二フッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）付きマイクロプレート上にプレコートする。ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、樹状細胞および個々のペプチドと共にウェルにピペット注入し、マイクロプレートを、加湿された３７℃のＣＯ２インキュベータ内に２４～４８時間の範囲の期間、配置する。インキュベーションの間、固定された抗体が、細胞から分泌されたサイトカインを結合する。洗浄の後、選択された分析物に特異的な検出抗体を、ウェルに添加する。洗浄に続いて、ストレプトアビジンにコンジュゲートされた酵素を添加し、基質を添加する。用いられる基質に従い有色の沈殿物が形成し、サイトカイン分泌部位にスポットが出現し、個々のスポットは単一の生成細胞を表す。
様々な実施形態において、本明細書に記載される発明は、（１）患者／参加者からＰＢＭＣを収集すること（あらかじめワクチン接種された試料）、（２）抗ＩＦＮ－γ抗体でコートすることによりＥＬＩＳＰＯＴプレートを調製すること（１晩インキュベートする）、（３）ＰＢＭＣを、該当するペプチドのプールの１つ、つまりＴ細胞応答を誘発すると予期されるものと共にインキュベートすること（１～２日間のインキュベーション）、（４）プレートを洗浄し、ビオチン化二次抗体を添加すること（２、３時間インキュベートすること）、（５）プレートを洗浄し、アビジンコンジュゲート型西洋ワサビペルオキシダーゼを添加し、インキュベートすること、（６）プレートを洗浄し、アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）を２、３分間添加すること、（７）反応を停止させること（水）、および（８）ＥＬＩＳＰＯＴリーダで可視化すること、を含む、患者のＴ細胞プロファイルを評定することにより、適切なコンジュゲート型ＶＬＰを決定してそれを必要とする患者に投与する方法を提供する。開示される方法は、最大で１００，０００～３００，０００細胞の中の１つを検出し得る。抗原特異性Ｔ細胞の頻度の２倍増加が、シグナルと見なされるべきである。
様々な実施形態において、Ｔ細胞増殖は、３Ｈ（トリチウム化）－チミジンにより測定され得る。そのような方法は、感受性があり、ハイスループットアッセイに用いられ得る。そのような技術はまた、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）およびＫｉ６４細胞内染色を含む。
トロピズムに基づきリコールタンパク質を選択すること。いくつかのウイルスが特有の組織型へのトロピズムを示すことは、当該技術分野で知られている。例えば脳組織へのトロピズムを示すウイルスとしては、ＪＣウイルス、はしか、ＬＣＭウイルス、アルボウイルスおよび狂犬病が挙げられるが、これらに限定されず；目の組織へのトロピズムを示すウイルスとしては、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびサイトメガロウイルスが挙げられるが、これらに限定されず；鼻の組織へのトロピズムを示すウイルスとしては、ライノウイルス、パラインフルエンザウイルスおよび呼吸器多核体ウイルスが挙げられるが、これらに限定されず；口の組織、例えば口腔粘膜、歯肉、唾液腺、咽頭へのトロピズムを示すウイルスとしては、単純ヘルペスウイルスＩ型およびＩＩ型、ムンプスウイルス、エプスタイン・バーウイルスならびにサイトメガロウイルスが挙げられるが、これらに限定されず；肺組織へのトロピズムを示すウイルスとしては、インフルエンザＡ型およびＢ型ウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、ならびにＳＡＲＳコロナウイルスが挙げられるが、これらに限定されず；神経組織、例えば脊髄へのトロピズムを示すウイルスとしては、ポリオウイルスおよびＨＴＬＶ－１が挙げられるが、これらに限定されず；心臓組織へのトロピズムを示すウイルスとしては、コクサッキーＢウイルスが挙げられるが、これらに限定されず；肝臓組織へのトロピズムを示すウイルスとしては、Ａ、ＢおよびＣ型肝炎ウイルスが挙げられるが、これらに限定されず；胃腸組織、例えば胃および大腸および小腸へのトロピズムを示すウイルスとしては、アデノウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、アストロウイルス、およびコロナウイルスが挙げられるが、これらに限定されず；膵臓組織へのトロピズムを示すウイルスとしては、コクサッキーＢウイルスが挙げられるが、これらに限定されず；皮膚組織へのトロピズムを示すウイルスとしては、水痘帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス６、天然痘、伝染性軟属腫、パピローマウイルス、パルボウイルスＢ１９、風疹、はしかおよびコクサッキーＡウイルスが挙げられるが、これらに限定されず；生殖組織へのトロピズムを示すウイルスとしては、単純ヘルペスウイルス２型、パピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。
様々な実施形態において、それを必要とする対象の癌を処置するための方法は、本発明のコンジュゲート型ＶＬＰを対象に投与することにより提供され、ここでリコールタンパク質は、癌の供給源である組織（「供給組織」）へのトロピズムを有する病原体のＣＤ８＋エピトープである。様々な実施形態において、適切なコンジュゲート型ＶＬＰは、腫瘍細胞の供給組織を最初に決定すること、ならびにその後、（１）それに対し患者が、存在するＣＤ８＋ Ｔ細胞を既に有し、かつ（２）腫瘍の供給組織へのトロピズム有する、リコールタンパク質を選択すること、により選択される。選択されたコンジュゲート型ＶＬＰ（複数可）はその後、それを必要とする対象に投与される。
様々な実施形態において、肺癌を処置するための方法は、対象が、肺細胞に感染する病原体、例えばインフルエンザウイルス、例えばインフルエンザＡ型またはＢ型ウイルスに対し能動的にワクチン接種したことがあるかどうかを決定すること、その後、本発明のコンジュゲート型ＶＬＰの有効量を投与すること、を含み、ここでリコールタンパク質のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープは、ワクチン中に含有される病原体の抗原決定基のものであり、Ｔ細胞エピトープは、対象のＭＨＣ分子クラスＩと複合体を形成する。肺癌を処置するための本発明の方法の一態様において、対象が、肺細胞に感染する病原体、例えばインフルエンザウイルス、例えばインフルエンザＡ型またはＢ型ウイルスに感染したことがあるかどうかを決定すること、その後、本発明のコンジュゲート型ＶＬＰの有効量を投与すること、を含み、ここでリコールタンパク質のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープは、その病原体のものであり、Ｔ細胞エピトープは、対象のＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成する。
本発明の一態様は、本発明のコンジュゲート型ＶＬＰを投与することにより、一般に頭頸部癌と称される癌群の一部である、口腔癌を処置するための方法であって、ここでリコールタンパク質のＣＤ８＋エピトープは、口腔組織へのトロピズムを有する病原体、例えばムンプスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルスまたは単純ヘルペスウイルス１型のものである。方法は、それを必要とする対象が、例えばムンプスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルスもしくは単純ヘルペスウイルス１型に対し能動的にワクチン接種したことがあるかどうか、またはそれらに感染したことがあるかどうかを決定すること、および対象が過去にワクチン接種されたこと、または感染されたことがあるならば、本発明のコンジュゲート型ＶＬＰを対象に投与することを含み、ここでリコールタンパク質のＣＤ８＋エピトープは、ムンプスウイルスもしくははしかウイルスのもの、または対象が受けたワクチンの抗原成分のもの、または過去に対象に感染した病原体、即ちムンプス、はしか、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルスもしくは単純ヘルペスウイルス１型の抗原成分のものである。
併用療法
様々な実施形態において、コンジュゲート型ＶＬＰは、他の癌治療薬と共投与されてよい。さらに、幾つかの実施形態において、本明細書に記載されたコンジュゲート型ＶＬＰは、他の癌処置療法、例えば放射線療法、化学療法、手術、および／または免疫療法と併せて投与される。本発明の幾つかの態様において、本明細書に記載されるコンジュゲート型ＶＬＰは、チェックポイント阻害剤と併せて投与される。様々な実施形態において、キメラＶＬＰは、免疫アゴニストと併せて投与されてよい。様々な実施形態において、コンジュゲート型ＶＬＰは、治療性ワクチンでの処置と併せて投与されてよい。様々な実施形態において、コンジュゲート型ＶＬＰは、Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を発現するコンジュゲート型抗原受容体での処置と併せて投与されてよい。様々な実施形態において、コンジュゲート型ＶＬＰは、別の癌免疫製品での処置と併せて投与されてよい。本発明のコンジュゲート型ＶＬＰおよび他の治療もしくは治療薬は、同じまたは異なる投与経路により同時に、または連続で投与され得る。本発明の方法における使用のための治療薬（複数可）の同一性および量の決定は、当業者に知られる標準的技術を利用して、当業者により容易に行われ得る。
実施例
実施例１
コンジュゲート型ＶＬＰはインビボでマウス腫瘍に結合する
腫瘍に結合する、記載されたコンジュゲート型ＶＬＰの能力は、提案された作用機序の重要な第一ステップである（図１参照）。インビボでのＶＬＰの結合を、ネズミ子宮頸癌モデルＴＣ－１を利用して評定した。手短に述べると、非コンジュゲート型ＶＬＰを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）ヒト細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム所在）において、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて生成する。このプロトコルでは、培地１２０ｍＬ中の３６０×１０６細胞を、２５０ｍＬ振とうフラスコ中で調製する。これに続いて、ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＶＬＰを発現させるために、細胞を、ＨＰＶ１６ Ｌ１遺伝子発現ベクター（Ｃａｔ＃８９９１０、Ａｄｄｇｅｎｅ、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ所在）で、製造業者（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム所在）のプロトコルを介してトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、７２時間保持し、その後、回収した。ＨＰＶ粒子を、洗浄剤溶解によりＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞から放出し、溶解物を、薄い洗浄剤、例えばＢｒｉｊ５８またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００と３７℃で一晩インキュベートした。一晩インキュベートされた溶解物からのＶＬＰをその後、塩化ナトリウムの添加により可溶化した。溶解物をその後、低速遠心分離により透明にした。カプシドを、高塩抽出と、その後の、製造業者の使用説明（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミシガン州セントルイス所在）に従うＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標）（ヨージキサノール）ステップグラジエントを通した超遠心分離により、細胞片および洗浄剤から分離した。ＶＬＰ調製物の純度を、製造業者のプロトコル(Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ所在）に従い染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色ゲル（４～２０％ＣＲＩＴＥＲＩＯＮ（商標）ゲル）により決定し、粒子の形態学を、電子顕微鏡測定（ＥＭ）により評定した。（ＷＯ２０１８／２３７１１５も参照）。
他の場所で報告されたＨＰＶ１６ Ｌ１野生型タンパク質配列は、以下の通りである（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６）：
機能性アッセイのために、生きているＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国マサチューセッツ州バーハーバー所在）に、ルシフェラーゼ／緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現ＴＣ－１腫瘍細胞（２×１０５細胞）を皮下注射した。マウスを、腫瘍の成長の一貫性を確認するため、および触知可能な腫瘍が観察されるまで（約７ｍｍ径）、およそ２週間モニタリングした。（図２Ａ参照）。マウス３匹に、ＶＬＰ５０μｇを静脈内注射した。マウス２匹を、非処置対照とした。ＶＬＰ注射後１６～２４時間後に、マウス全５匹を殺処分し、腫瘍を摘出した。腫瘍をその後、コラゲナーゼで消化した後、第一にＶＬＰに特異的なＨＰＶ１６抗Ｖ５抗マウス抗体（Ａｂｃａｍ、米国カリフォルニア州ベーリンゲーム所在）で、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣｓ）染色緩衝液（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））中にて４℃で１：１００の希釈で処置した。１時間後に、細胞を次いで、ＦＡＣｓ染色緩衝液で２回洗浄して、ＶＬＰに特異的なヤギフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート型抗マウス抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州ミネアポリス所在）により４℃で１：１００の希釈でさらに１時間染色した。細胞をその後、再度ＦＡＣｓ染色緩衝液で２回洗浄した後、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）サイトメトリーにより分析し、（１）第一に、腫瘍細胞のみについて選別するためにＧＦＰでゲーティングし、（２）第二に、選別された腫瘍細胞をＶＬＰの存在について評定した。（図２Ｂ参照。右のパネルおよび左のパネルは、それぞれ異なるマウスから作成されたデータである）。図２Ｂは、左および右の両パネルのヒストグラムプロットでの右側へのシフトにより示された通り、コンジュゲート型ＶＬＰが腫瘍に結合できたことを実証する。
実施例２
コンジュゲート型ＶＬＰはインビトロでヒト腫瘍に結合する
インビトロでヒト腫瘍に結合するコンジュゲート型ＶＬＰの能力をテストするために、５種のヒト腫瘍細胞株：ＯＶＣＡＲ３、ＭＤＡ－ＭＢ２３１、ＨＣＴ１１６、ＰＣ－３、およびＳＫＯＶ３（ＡＴＣＣ、米国バージニア州マナサス所在）を評定する。それぞれの細胞株を最初に、６ウェルプレート内の１つのウェルに播種する。１６～２４時間後に、細胞を、０．０５％トリプシンを用いて溶解する。細胞をその後、カウントして、１×１０６細胞にし、遠心分離し、上清を除去した後、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の１％ＦＢＳ）１００μＬに再懸濁する。次に０．３μｇ／ｍｌのコンジュゲート型ＶＬＰを、インビトロでそれぞれの培養物に添加して、培養物を、最適生育条件下で２４時間インキュベートする。結合がＨＳＰＧ特異性であることを示すために、コンジュゲート型ＶＬＰを、ヘパリン（最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ）を含んでまたは含まずにプレインキュベートし、４℃で（エンドサイトーシスを予防するため）１時間インキュベートする。結合の１時間後に、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液１ｍＬで２回洗浄した後、再度ＦＡＣＳ緩衝液１００μＬに再懸濁する。試料をその後、ＶＬＰに特異的なＰＥコンジュゲート型抗マウス抗体と４℃で１時間インキュベートする。１時間後に、細胞を、洗浄し、フローサイトメトリーによる分析のためＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁する。結合をその後、実施例１ならびに図２Ａおよび２Ｂでのように、ヒストグラムプロットで右側へのシフトにより示される通り、総ＰＥ＋細胞または幾何平均蛍光発光のどちらかに対する陽性率％として評定する。
実施例３
コンジュゲート型ＶＬＰはインビボでヒト腫瘍に結合する
記載されたコンジュゲート型ＶＬＰをさらに、インビボでヒト腫瘍に結合するそれらの能力を評定するためにテストする。最初の実験では、マウスにヒト卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ３腫瘍細胞（３×１０６細胞）を注射する。注射後およそ２週間目に、平均腫瘍体積はおよそ１０ｍｍ３体積であると予期される。注射後３週間目に、腫瘍担持マウスにＣｕ２＋またはＺｎ２＋放射線標識ＶＬＰを投与する。ＶＬＰの生体分布および腫瘍特異性を、４、１２、２４、および４８時間目に評定する。腫瘍をその後、計量、放射能計数、ウイル微小分布および細胞共局在解析のために取り出す。腫瘍に加え、肝臓、脾臓、腎臓などの様々な主要臓器を、イメージング法を利用してＶＬＰの存在について、および腫瘍へのＶＬＰホーミングの有効性を評定するための組織学的検査について評定する。さらなる実験では、マウスにＨＣＴ１１６、ＰＣ－３、またはＳＫＯＶ３などの他の腫瘍細胞株を、同じ実験プロトコルに従って注射する。
実施例４
時間依存的様式でのインビトロでの腫瘍細胞のＶＬＰ誘導Ｔ細胞介在性殺傷
エピトープを腫瘍細胞表面のＭＨＣタンパク質に送達し、次に存在するＴ細胞を対象腫瘍細胞にリダイレクトして腫瘍細胞の細胞障害性殺傷を導く、コンジュゲート型ＶＬＰの能力を、インビトロでテストした。本発明者らは、ネズミ腫瘍モデルがより臨床的に関連性があるので、このモデルにおいてヒトパピローマウイルスＨＰＶ１６ Ｅ７抗原への既存のネズミ記憶応答を利用して概念実証での有効性を実証することを選択した。ＨＰＶ１６ Ｅ７は、オボアルブミン（ＯＶＡ）などの多く用いられる人工抗原に反して、真のヒトウイルス抗原である。複数の異なるＥ７抗原特異性ＣＤ８＋ Ｔ細胞が、異なるＨＬＡ－Ｉ（ＭＨＣ－Ｉ）遺伝子を有する健常ヒトドナーの末梢血中に見出されることは、知られている。それゆえ、Ｅ７の使用は、関連性があり、非ウイルス関連性悪性疾患（腫瘍）を標的とする既存のＣＤ８＋ Ｔ細胞応答のリダイレクションを示す概念実証を提供し、かつこの系を他のヒトウイルス抗原に拡張するための堅実な基盤（ｓｏｌｉｄ ｂａｓｅ）として作用する。
ＶＬＰのコンジュゲーション。コンジュゲート型ＶＬＰを生成するために、リコールタンパク質を、Ｎ末端にマレイミド分子、続いてプロテアーゼ切断部位を含み、ＣＤ８＋リコールエピトープで終結する、即ちＮ末端マレイミド－ＲＲＲＲＲＶＫＲ－エピトープ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、米国ニュージャージー州所在）を含むポリカチオン性１８量体～２０量体ペプチドとして、８５％より大きな純度になるように合成した。試料を、凍結乾燥材料として届け、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で１～２０ｍＭの濃度に希釈した。コンジュゲート型ＶＬＰを、以下のプロトコルを介して、コンジュゲーションのために調製した。最初に、少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度のＶＬＰを、コンジュゲーション反応緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０）で、緩衝液を３回交換しながら（２～８℃で３＋１ｈ、３＋１ｈ、および一晩１６＋３ｈ）透析した。翌日に、ＶＬＰを次いで、１０：１モル比のＴＣＥＰ：Ｌ１（モノマー）比で、Ｌ１モノマー濃度を０．７７ｍｇ／ｍＬとして、室温で振とうせずに１時間、ＴＣＥＰで処置した。続いて、コンジュゲーションを、ペプチド：Ｌ１モノマーモル比５：１で１８～２０量体ペプチドを添加し、Ｌ１モノマーの最終濃度を０．５８ｍｇ／ｍＬにすることにより、実施した。反応物を、２００ｒｐｍで１時間振とうした。コンジュゲーションに続いて、反応の内容物を、透析カセット（ＭＷＣＯ＝１０００ｋＤａ）を用いて冷温（２～８℃）で約３＋１時間、透析に供した（ＰＢＳ、ｐＨ７．０＋０．１、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０）。次に、内容物を、４０，０００ｒｐｍおよび１６℃で１６時間、密度勾配超遠心分離（ＵＣ）ＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標）勾配（ＤＰＢＳ、０．８Ｍ ＮａＣｌ中）に供した。３３～３９％の間のＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標）の界面から開始して画分（１～３）を収集し、その後、低温室で３＋１、３＋１および１６＋３時間、最終的な透析（ＭＷＣＯ＝１０００ｋＤａ）に供した。精製に続いて、試料を、ゲル電気泳動／Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色により分析して、約５５ｋＤａを超えるＬ１バンドのシフトを通してコンジュゲーション率％を決定した。
コンジュゲート型ＶＬＰの定量。生成物の濃度および融合タンパク質のコンジュゲーション率％を、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（４～２０％ ＣＲＩＴＥＲＩＯＮ（商標） ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標） Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌｓ、１８ Ｗｅｌｌ Ｃｏｍｂ、３０μＬ、１．０ｍｍ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ所在）により決定した。加えて、５μｇ～２．５μｇの間の量の非コンジュゲート型ＶＬＰ対照および５種の既知ＢＳＡ標準（Ｓｉｇｍａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、米国ミズーリ州セントルイス所在）を、対照として常に含む。ゲルを、製造業者のプロトコルに従い泳動し、その後、続いて製造業者のプロトコルに従いＣｏｏｍａｓｓｉｅゲル染色（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ－２５０ ｄｙｅ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ所在）に供した。コンジュゲーション量および／または率％を、製造業者のプロトコルに従いＢｉｏＲａｄソフトウエア画像解析を利用してデンシトメトリー解析により決定した。
ペプチドの設計。ペプチドを、上記の通りＮ－末端マレイミドＲＲＲＲＲＶＫＲ－エピトープを含むように設計する。それゆえペプチドは、リコールタンパク質のＮ末端のマレイミド分子を、続いてリコールタンパク質配列の上流にフリン切断配列ＲＸＲ／ＫＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）を含む。例示的なフリン切断配列：ＡＲＧ ＶＡＬ ＬＹＳ ＡＲＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０）。
機能性アッセイでは、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｂ１６－ｌｕｃおよびＩＤ８－ｌｕｃ）を過剰発現するネズミＢ１６（黒色腫／皮膚）およびＩＤ８（卵巣）腫瘍細胞を、培養で生育した。正常環境下では、これらの２種のネズミ腫瘍細胞株Ｂ１６およびＩＤ８は、これらの細胞系がＨＰＶ１６ Ｅ７抗原を発現しないため、ネズミＨＰＶ１６ Ｅ７特異性ＣＤ８＋ Ｔ細胞により殺傷されないであろう。細胞を、培養により生育し、一晩播種した。翌日に、細胞を次いで（１）３種の異なる濃度のＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）（１μｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌ、１ｐｇ/ｍＬ）、（２）ＨＰＶ１６ Ｅ７－コンジュゲート型ＶＬＰ（２．５μｇ／ｍＬ）、（３）非コンジュゲート型（対照）ＶＬＰ（２．５μｇ／ｍＬ）、で処置するか、または（４）非処置のままにした。細胞をその後、洗浄し、様々なＥ：Ｔ比（エフェクタ：標的比）でネズミＣＤ８＋ ＨＰＶ１６ Ｅ７特異性Ｔ細胞と共培養した。共培養後の総最終容量は、２００μＬであった。細胞生存能力を、これらの細胞がルシフェラーゼを過剰発現するため細胞生存能力の代用マーカとして用いられるルシフェラーゼの発現を測定することにより、共培養の特定時間後に測定した。低減したルシフェラーゼ活性は、より多くの細胞死を示し、より大きな免疫リダイレクション、つまりより大きな細胞障害性を示唆した。
ＨＰＶ１６ Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰおよびＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドへの応答は、両方の癌細胞株において時間依存性および濃度依存性であった。共培養の５．５時間後に、Ｅ７ペプチドのみ（１μｇ／ｍＬ）およびコンジュゲート型ＶＬＰ（２．５μｇ／ｍＬ）の両方は、Ｂ１６－ｌｕｃにおける有意なレベルのＴ細胞介在性細胞障害性を実証した。（図３Ａ、Ｂ１６－ＬＵＣおよび図３Ｃ、ＩＤ８を参照）。追加の細胞障害性が、共培養を８．５時間行った場合に観察され、細胞障害のレベルはＥ：Ｔ比１０でＢ１６－ＬＵＣ細胞（図４Ｂ）ではおよそ５０％であり、ＩＤ８－ＬＵＣ細胞（図４Ｄ）ではおよそ３８～５８％であった。同様に、図４は、より長い時間２２．５時間で実現された類似の結果を示す。具体的に、図４Ａおよび４Ｂは、Ｂ１６－ＬＵＣ細胞およびネズミＣＤ８＋ ＨＰＶ１６ Ｅ７特異性Ｔ細胞とインキュベートされたＥ７コンジュゲート型ＶＬＰで、細胞障害性がそれぞれ８．５時間～２２．５時間の間で改善されることを示す。同様に、図４Ｃおよび４Ｄは、ＩＤ８細胞およびネズミＣＤ８＋ ＨＰＶ１６ Ｅ７特異性Ｔ細胞とインキュベートされたＥ７コンジュゲート型ＶＬＰで、細胞障害性が８．５時間～２２．５時間の間で改善されることを示す。
これらの結果は、より高濃度（１μｇ／ｍＬ）でのＥ７ペプチドおよびＥ７コンジュゲート型ＶＬＰが、時間依存性の腫瘍細胞殺傷を呈することを示唆する。これはさらに、Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰが腫瘍細胞殺傷を実現するために腫瘍細胞上のＭＨＣ受容体のフリン切断およびエピトープコーティングを受けることを示唆する。
実施例５
濃度依存的様式での腫瘍細胞のＶＬＰ誘導Ｅ７ Ｔ細胞介在性殺傷
Ｅ７ Ｔ細胞介在性殺傷は、Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰ濃度依存性であることも示された。ルシフェラーゼ遺伝子（Ｂ１６－ｌｕｃおよびＩＤ８－ｌｕｃ）を過剰発現するネズミＢ１６（黒色腫／皮膚）およびＩＤ８（卵巣）腫瘍細胞を、播種した。２４時間後に、細胞を次いで、（１）ＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）（１μｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）、（２）ＨＰＶ１６ Ｅ７－コンジュゲート型ＶＬＰ（２．５μｇ／ｍＬ、０．０２５μｇ／ｍｌ）、（３）非コンジュゲート型（対照、２．５μｇ／ｍＬ）ＶＬＰで処置するか、または（４）非処置のままにした。細胞をその後、洗浄し、様々なＥ：Ｔ比（エフェクタ：標的比）でＣＤ８＋ ＨＰＶ１６ Ｅ７特異性Ｔ細胞と共培養した。共培養後の総最終容量は、２００μＬであった。細胞生存能力を、これらの細胞がルシフェラーゼを過剰発現するため細胞生存能力の代用マーカとして用いられるルシフェラーゼの発現を測定することにより、共培養の特定時間後に測定した。低減したルシフェラーゼ活性は、より大きな免疫リダイレクション、つまりより大きな細胞障害性を示した。
ＨＰＶ１６ Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰおよびＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドへの応答は、両方の癌細胞株において濃度依存性であった。Ｅ７ペプチドのみ（１μｇ／ｍＬ）およびＶＬＰにコンジュゲートされたＥ７（２．５μｇ／ｍＬ）両方は、両方の細胞株における顕著なレベルのＴ細胞介在性細胞障害を実証した。（図３Ａおよび３ＢのＢ１６－ＬＵＣ、ならびに図３Ｃおよび３ＤのＩＤ８参照）。図３は特に、１ｐｇ／ｍＬのＥ７ペプチド単独は、タイムポイントにかかわらず、腫瘍細胞殺傷をたとえあったとしても極わずかしか呈さず、一方で１００ｐｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬのＥ７ペプチドは、タイムポイントにかかわらず、有意な腫瘍細胞障害性を呈したことを示す。同様に、細胞障害性の濃度依存性が、図４のＥ７コンジュゲート型ＶＬＰで観察された。（図４Ａおよび４ＢのＢ１６－ＬＵＣ、ならびに図４Ｃおよび４ＤのＩＤ８参照）。図４では、細胞障害性の顕著な上昇が、タイムポイント（８．５時間または２２．５時間）にかかわらず両方の細胞株で、２．５μｇ／ｍＬのコンジュゲート型ＶＬＰ対０．０２５μｇ／ｍＬコンジュゲート型ＶＬＰの間で観察された。こうして、図３および４は、細胞障害性が、Ｂ１６－ＬＵＣ細胞およびネズミＣＤ８＋ＨＰＶ１６ Ｅ７特異性Ｔ細胞とインキュベートされたＥ７ペプチドおよびＥ７コンジュゲート型ＶＬＰの両方について、濃度が上昇するにつれて改善されることを示す。
実施例６
ＶＬＰ調製物のバッチ一貫性。免疫リダイレクションを実施し得るコンジュゲート型ＶＬＰを作製する記載された工程が確実に一貫するように、「Ｆ１、Ｆ２、およびＦ３」と称するＥ７ペプチドコンジュゲート型ＶＬＰの複数の別個に作製されたバッチを、検査した。ルシフェラーゼ遺伝子（Ｂ１６－ｌｕｃおよびＩＤ８－ｌｕｃ）を過剰発現するネズミＢ１６（黒色腫／皮膚）およびＩＤ８（卵巣）腫瘍細胞を、播種した。２４時間後に、細胞を、（１）ＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）（１μｇ／ｍｌ）、（２）ＨＰＶ１６ Ｅ７－コンジュゲート型ＶＬＰバッチＦ１、Ｆ２、およびＦ３（２．５μｇ／ｍＬ）、（３）非コンジュゲート型（対照、２．５μｇ／ｍＬ）ＶＬＰインキュベートするか、または（４）非処置のままにした。全てのバッチＦ１～Ｆ３は、一貫しており、Ｅ７ Ｔ細胞を活性化でき、かつ２つの別の実験でそれぞれ２３または２３．５時間後にＢ１６－ｌｕｃおよびＩＤ８－ｌｕｃ細胞の殺傷を示した。（Ｂ１６－ｌｕｃ細胞についてはそれぞれ図５Ａおよび５Ｂ、ＩＤ８－ｌｕｃ細胞についてはそれぞれ図５Ｃおよび５Ｄを参照）。
別の腫瘍細胞株ＭＣ３８ネズミ結腸腫瘍株におけるバッチ一貫性をさらに実証するために、細胞を、製造業者に示唆された条件に従い培養で生育させた。通常の環境下では、ＭＣ３８細胞株がネズミＥ７抗原を発現しないため、この細胞株は、ネズミＨＰＶ１６ Ｅ７特異性Ｔ細胞により殺傷されないであろう。ＭＣ３８細胞をその後、（１）Ｅ７ペプチドＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）（１μｇ／ｍｌ）、（２）バッチＦ１、Ｆ２、およびＦ３のＨＰＶ１６ Ｅ７－コンジュゲート型ＶＬＰ（２．５μｇ／ｍＬ）、（３）非コンジュゲート型（対照、２．５μｇ／ｍＬ）ＶＬＰで処置するか、または（４）非処置のままにした。細胞をその後、洗浄し、様々なＥ：Ｔ比（エフェクタ：標的比）でＣＤ８＋ ＨＰＶ１６ Ｅ７特異性Ｔ細胞と共培養した。共培養後の総最終容量は、２００μＬであった。細胞生存能力を、共培養の特定時間の後に測定した。この実施例では、ＭＣ３８はルシフェラーゼを発現しないため、細胞生存能力を、確立された細胞生存能力アッセイ試薬：ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ(登録商標)（ＰＲＯＭＥＧＡ、米国ウィスコンシン州所在）を用いて測定した。このアッセイは、細胞生存能力のマーカであるＡＴＰを検出しそれに結合する、ルシフェラーゼ発現化学プローブを提供する。このため低減されたルシフェラーゼ活性は、より多くのＭＣ３８細胞死を示し、より大きな免疫リダイレクション、つまりより大きな細胞障害性を示唆する。全てのバッチＦ１～Ｆ３は、それらの機能性活性において一貫しており、Ｅ７ Ｔ細胞を活性化でき、２つの別の実験でそれぞれ２３および２３．５時間後にＭＣ３８細胞の殺傷を示した。（それぞれ図６Ａおよび６Ｂ参照）。
実施例７
Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰによるＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるインビボ抗腫瘍免疫リダイレクション
ＨＰＶ１６ Ｅ７－コンジュゲート型ＶＬＰ（ネズミＭＨＣ制限Ｈ－２Ｄｂ ＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドにコンジュゲートされたコンジュゲート型ＶＬＰ）の有効性を、インビボで評定した。合計２０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＩＤ８－ルシフェラーゼ細胞（０．０１５×１０６細胞／マウス）を腹腔内（Ｉ．Ｐ．）注射した。６日目に、マウスを、ルシフェラーゼ発光イメージングを介して腫瘍成長および定着についてチェックした。（ＩＶＩＳ(登録商標) Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、米国マサチューセッツ州ウォルサム所在）。５日目に、マウスを、処置群に分離し、その後、（１）緩衝液のみ、（２）非コンジュゲート型ＶＬＰ（１００μｇ）、（３）ネズミＣＤ８＋ ＨＰＶ１６ Ｅ７特異性Ｔ細胞＋Ｅ７ペプチドコンジュゲート型ＶＬＰ（ｎ＝５、１００μｇ）、および（４）Ｅ７ペプチドのみ（３０μｇ、ｎ＝５）で処置する。１時間後に、全てのマウスにおよそ１×１０６の４日目の刺激後ＣＤ８＋ ＨＰＶ１６ Ｅ７特異性Ｔ細胞（２００μＬ／マウス）を注射した。６日目および７日目に、各マウスで２度目の処置を施したが、追加の刺激後Ｔ細胞は添加されなかった。マウスをその後、モニタリングし、イメージングする。処置の有効性を、腫瘍成長および転移の代用物として作用する発光イメージングによりモニタリングする。
結果は、図7に提供され、Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰ治療が処置６０日目後であってもＥ７特異性Ｔ細胞をＩＤ８ネズミ腫瘍にリダイレクトして腫瘍形成を制御できたことを示す。（図７Ａおよび図７Ｄ）。対照的に、非コンジュゲート型ＶＬＰ（図７Ｃ）または緩衝液のみ（図７Ｂ）などの対照は、なんらかの腫瘍防御または制御を示すことができなかった。若干の防御が、ペプチドのみにより与えられたが（図７Ｅ）、ペプチドのみに対比してＥ７コンジュゲート型ＶＬＰでのペプチドの全死亡率がペプチドのみに比較して低かったことを詳述することが重要である。さらに、ペプチドは、不完全な防御を提供し、ＶＬＰの腫瘍特異性標的化が外因性ペプチドのみの注射に比較して重要であることを示唆する。
実施例８
Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰによるＢ１６．Ｆ１０マウスにおけるインビボ抗腫瘍免疫リダイレクション
ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＶＬＰの有効性を、別のネズミ腫瘍モデル（Ｂ１６．Ｆ１０、ＡＴＣＣ、米国バージニア州オールドタウン・マナサス（Ｏｌｄ Ｔｏｗｎ Ｍａｎａｓｓａｓ）所在）で評定した。腫瘍が腹腔内で生育されるＩＤ８卵巣ネズミモデルとは異なり、Ｂ１６．Ｆ１０マウス腫瘍モデルは、皮下の腫瘍モデルである。この実験では、２０匹のマウスに最初、ＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）をワクチン接種した。２週間後に、マウスがＨＰＶ１６ Ｅ７四量体（Ｈ－２Ｄｂ／ＨＰＶ１６ Ｅ７（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）ＭＨＣ四量体染色）を介するＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドに特異的な免疫応答を有することを検証した。手短に述べると、全血（２～３滴）を、マウスの尾静脈から収集し、抗原特異性ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答についてＥ７四量体（Ｈ－２Ｄｂ／ＨＰＶ１６ Ｅ７（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）ＭＨＣ四量体染色、ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、米国マサチューセッツ州ウーバーン所在）を用いるフローサイトメトリーによりチェックした。その後、マウスの大腿部左脇にＢ１６．Ｆ１０ルシフェラーゼ細胞（０．５×１０６細胞／マウス）を皮下注射した。腫瘍成長体積を、バーニアキャリパーを用いて測定し、体積を、式（Ｗ２×Ｌ）／２（式中、Ｗ（幅）は、２つの直交する尺度の短い方であり、Ｌ（長さ）は、２つのうちの長い方である）を利用して計算した。マウスを、触知可能な腫瘍（約７ｍｍ径）が観察されるまで、２日ごとにモニタリングした。次にマウスを、以下の通り様々な処置群に分割した：（１）緩衝液のみ（ｎ＝５）；（２）非コンジュゲート型ＶＬＰ（「対象」ＶＬＰ）（ｎ＝５）；（３）Ｅ７－コンジュゲート型ＶＬＰ（ｎ＝５）；および（４）ペプチドのみ。全ての処置群は、用量あたり５μｇの指示された成分を受けた。全部で４種の処置を、１日おきに、マウスに投与した。マウスをその後、モニタリングして、腫瘍体積を評定した。処置の有効性を、腫瘍体積の成長および生存率を介してモニタリングし、エンドポイント生存率は、腫瘍成長体積が１５００ｍｍ３に達した時である。結果は、腫瘍成長効果の遅延が、対照ＶＬＰ、Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰおよびＥ７ペプチド群で観察されたことを示す。（図８Ａおよび図８Ｂ参照）。しかし、最終的に全ての腫瘍が、１５００ｍｍ２のエンドポイントサイズに達した。（図８Ａ）。全ての対照マウスは、１７日目までに生存エンドポイントに達した（図８Ｂ）。処置マウスは、１９～２２日目まで生存した。Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰ処置群からのマウス１匹は、全ての腫瘍を完全に退縮させ、８０日より長い間腫瘍のない状態であった（図８Ｂ参照）。
特異的ウイルスメモリーＴ細胞の重要性、およびそれらの存在率上昇が改善された治療転帰をもたらすかどうかをさらにテストするために、マウスをまた、「高」および「低」Ｔ細胞頻度の群に分離し（説明については以下を参照）、即ち、ＰＢＭＣ中により高頻度の末梢ＨＰＶ１６ Ｅ７ Ｔ細胞を有したそれらのマウスを、それを有しないマウスと対比した。マウスを最初に、ＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）でワクチン接種して、抗ウイルス免疫記憶応答を生成させた。ワクチン接種マウスを、およそ６週間、単独で放置して、ＨＰＶ１６ Ｅ７に対する免疫記憶を確立した。免疫原性をチェックするために、マウスを「高」および「低」Ｔ細胞頻度に分離した。手短に述べると、全血（２～３滴）を、マウスの尾静脈から収集し、抗原特異性ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答についてＥ７四量体（Ｈ－２Ｄｂ／ＨＰＶ１６ Ｅ７（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）ＭＨＣ四量体染色、ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、米国マサチューセッツ州ウーバーン所在）を用いるフローサイトメトリーによりチェックした。ＨＰＶ１６ Ｅ７四量体特異性Ｔ細胞応答の頻度は、１～５０％の間であった。１～１４％の間の範囲であるＴ細胞頻度を有したマウスを、「低」と見なし、１５％～５０％の間の範囲であるＴ細胞頻度を有したマウスを、「高」と見なした。その後、全てのマウスの大腿部左脇に、Ｂ１６．Ｆ１０黒色腫細胞（０．５×１０６細胞／マウス）を皮下注射した。腫瘍成長体積を、バーニアキャリパーを用いて測定し、体積を、式（Ｗ２×Ｌ）／２（式中、Ｗ（幅）は、２つの直交する尺度の短い方であり、Ｌ（長さ）は、２つのうちの長い方である）を利用して計算した。腫瘍体積を、Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰまたは対照ＶＬＰ（非コンジュゲート型ＶＬＰ）での処置を開始する前に、５０～１００ｍｍ３に到達させた。
結果は、図８Ｃおよび図８Ｄに表され、腫瘍成長効果の遅延が、Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰで処置されたマウスで観察されたが、ＶＬＰのみで処置された対照群では観察されなかったことを示す。（図８Ｃ参照）。しかし、最終的に全ての腫瘍が、３２日目までに１５００ｍｍ２のエンドポイントに達した。（図８Ｄ）。全ての対照マウスは、１７日目までに生存エンドポイントに達した（図８Ｂ参照）。処置マウスは、「低」Ｔ細胞頻度のマウスでは２４日目まで、または「高」Ｔ細胞頻度のマウスでは３２日目まで生存した。（図８Ｄ）。処置の非存在下では、高頻度のまたは低頻度のＥ７特異性メモリーＴ細胞を有したマウスの間で、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍成長における差異はなかった。（図８Ｃ）。対照的に、処置群の腫瘍成長は、腫瘍成長がより良好に制御されたため、より高いＥ７ Ｔ頻度を有するマウスがＥ７コンジュゲート型ＶＬＰ処置に対しより良好に応答したことを示唆するようであった。（図８Ｄ）。しかし、データのさらなる研究は、個々のマウスが精査された場合明白な傾向を明らかにしなかった。これは、全てのマウスが５０～１００ｍｍ３の間の腫瘍を有したら処置が施されたため、「可変的な」腫瘍サイズによる可能性がある。一般に、より小さな腫瘍を有する（５０ｍｍ３に近い）マウスがコンジュゲート型ＶＬＰ処置により良好に応答することが観察されたが、これはより高い既存のＴ細胞ＰＢＭＣ頻度に必ずしも相関しなかった。これは、免疫リダイレクション効果が、他の潜在的Ｅ７特異性Ｔ細胞、即ち組織常在性メモリーＴ細胞による可能性がある。それにもかかわらず、これらのデータは、免疫リダイレクションが、チェックポイント難治性であることが知られる困難なＢ１６．Ｆ１０マウスモデルであっても可能であることを示唆する。
実施例９
インビトロでのマウス腫瘍細胞上のＭＨＣ－Ｉ受容体へのＶＬＰペプチドローディングの検出
コンジュゲート型ＶＬＰから腫瘍細胞上のＭＨＣ－Ｉ受容体へのペプチドローディングを直接検出するアッセイシステムを、開発した。このアッセイは、ＯＶＡ－コンジュゲート型ＶＬＰ（「ＯＶＡ－ＶＡＬ」）と、ＯＶＡ（ＳＩＮＦＥＫＬ）／Ｋｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）複合体を特異的に認識する抗体（フルオロフォアコンジュゲート型抗ＯＶＡ（ＳＩＮＦＥＫＬ）／Ｋｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）抗体、ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、米国マサチューセッツ州ウーバーン所在）の使用を伴うが、任意の他のペプチド／ＭＨＣ－Ｉ複合体の使用は伴わない。
この目的に向けて、標的細胞（Ｂ１６－ＬＵＣ、ＩＤ８－ＬＵＣ、およびＭＣ３８）を、９６ウェルプレートに０．０２×１０６細胞／ウェルで配置した。翌日に、ＯＶＡコンジュゲート型ＶＬＰ（２．５μｇ／ｍｌ）を、標的腫瘍細胞と３７℃で１時間インキュベートし、続いて大規模洗浄を行って全ての未結合材料を除去した。次に、フルオロフォアコンジュゲート型抗ＯＶＡ（ＳＩＮＦＥＫＬ）／Ｋｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）抗体を、１：１００（総容量１００μＬ、即ち１μＬ）の希釈で４℃で３０分間細胞に直接添加した。このインキュベーションに続いて、過剰の抗体を洗い流し、細胞を、ＦＡＣＳフローサイトメトリーによりＯＶＡ（ＳＩＮＦＥＫＬ）／Ｋｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）複合体の存在について解析した。予測通り、ＯＶＡ（ＳＩＮＦＥＫＬ）／Ｋｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）複合体が、ＯＶＡ－コンジュゲート型ＶＬＰとのインキュベーション後に、３種の異なるマウス腫瘍細胞中で検出された。（図９参照）。
図９Ａは、ＩＤ８－ＬＵＣ（上のパネル）、Ｂ１６－ＬＵＣ（中央のパネル）、およびＭＣ３８(下のパネル）細胞とＯＶＡペプチドのみまたはＯＶＡ－コンジュゲート型ＶＬＰとのインキュベーションから得られたＦＡＣＳデータを示す。これは、ＯＶＡ－コンジュゲート型ＶＬＰがこれらの腫瘍細胞に結合し、それらのペプチドが切断され、次に切断されたペプチドが腫瘍ＭＨＣ－Ｉ分子に結合したことを示す。それゆえ、ＶＬＰの設計は、意図した機能を実施することが検証され、即ちこのエピトープペプチドは、フリンにより切断され、ペプチドは、腫瘍細胞表面のＭＨＣ Ｉ分子により結合される。これらの知見は、ＯＶＡ以外の他のウイルスペプチドに適用可能のはずである。差別的なＯＶＡ（ＳＩＮＦＥＫＬ）／Ｋｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）複合体がネズミ腫瘍全体で検出されたことに言及することも重要であり、さらなる研究は、ローディングが腫瘍表面の表面ＭＨＣクラスＩの利用可能性に依存し得ることを示唆する。（図示しない）。図９Ｂは、ＭＨＣ－Ｉ複合体に特異的なＨ２－Ｄｂ抗体（ＰＥ抗マウスＨ－２Ｄ ｂ抗体、抗Ｈ－２Ｄｂ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、米国カリフォルニア州サンディエゴ所在）の結合により染色された、同じ細胞、ＩＤ８－ＬＵＣ（上のパネル）、Ｂ１６－ＬＵＣ（中央のパネル）、およびＭＣ３８(下のパネル）を示す。
実施例１０
ＨＣＭＶ ｐｐ６５抗原にコンジュゲートされたＶＬＰを用いるヒト不死化腫瘍細胞株に対するヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞ウイルス免疫性のリダイレクション
他の抗原またはエピトープを用いて免疫リダイレクションを惹起する、記載されたコンジュゲート型ＶＬＰ系の能力を、免疫性をリダイレクトするヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｐｐ６５抗原コンジュゲート型ＶＬＰの能力を検討することによりさらに調査した。コンジュゲート型ＶＬＰを、上に記載されるように作製した。ＨＣＭＶを選択する理論的根拠は、ＨＣＭＶが健常個体において高度に優勢であり（ヒト集団の５０～９０％に感染）かつ大部分が無症候性である、という知識に基づいた。（Ｌｏｎｇｍａｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ５２（３－４）： １６５－７３， ２００１； Ｐａｒｄｉｅｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｆ１０００Ｒ．ｅｓ， ７， ２０１８；およびｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２０８（３－４）：３６５－３７３， ２０１９参照）。重要なことに、ＨＣＭＶは、疾患を予防するために長期生存型細胞免疫性を必要とする生涯持続性感染を確立する。このため、高齢者のウイルス感染を強力に制御するために長年にわたり開発された複雑な細胞介在性抗ウイルス適応免疫が癌を処置するために再利用され、役立てられる可能性がある、と仮定するのが合理的である。
インビトロ細胞障害性アッセイ。ヒト標的細胞、ＨＴＣ１１２、ヒト結腸癌、ＭＣＦ７、ヒト乳癌またはＯＶＡＣＡＲ３、ヒト卵巣癌（ＡＴＣＣ、米国バージニア州マナサス所在）を、９６ウェルプレートに０．０１～０．２×１０６／ウェル／１００μＬで一晩播種した。翌日（約２０～２２時間後）、各細胞系列を以下の条件下にて３７℃で１時間インキュベートした：（１）最終濃度１μｇ／ｍＬのＣＭＶペプチド、（２）最終濃度２．５μｇ／ｍＬの対照ＶＬＰ（ペプチドなし）、（３）最終濃度２．５μｇ／ｍＬのＣＭＶ－コンジュゲート型ＶＬＰ、および最終濃度１４ｐｇ／ｍＬのＣＭＶペプチド（２．５μｇ／ｍＬのＣＭＶ－ＶＬＰにコンジュゲートされたペプチドと同等）。１時間後に、細胞を、培地２００μＬで３回、力強く洗浄して、非特異的結合を除去した。ヒト患者ドナーＣＭＶ Ｔ細胞（ＡＳＴＡＲＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ、米国ワシントン州シアトル所在）を、Ｅ：Ｔ（エフェクター細胞：標的細胞）比１０：１で添加し、組織培養インキュベータで２４時間インキュベートした。共培養後の最終的な総容量は、２００μＬであった。細胞生存応力を、共培養の特定時間後に測定した。この実験では、上記ヒト細胞がルシフェラーゼを発現しないため、細胞生存能力を、細胞生存能力アッセイ試薬：ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ(登録商標)（ＰＲＯＭＥＧＡ、米国ウィスコンシン州所在）を用いて測定した。このアッセイは、細胞生存能力のマーカであるＡＴＰを検出しそれに結合するルシフェラーゼ発現化学プローブを提供する。こうしてルシフェラーゼ活性の低減は、より多くのヒト不死化細胞死を示し、より大きな免疫リダイレクション、つまりより大きな細胞障害性を示唆する。
結果を図１０に提供する。ＣＭＶコンジュゲート型ＶＬＰは、ヒト健常ドナーＣＭＶ ｐｐ６５－特異性ＣＤ８＋ Ｔ細胞（Ａｓｔａｒｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．米国ワシントン州ボセル所在）、不死化ＨＬＡ．Ａ２陽性ヒト結腸癌細胞（ＨＣＴ１１６、図１０Ａ）、ヒト卵巣癌細胞（ＯＶＣＡＲ３、図１０Ｂ）およびヒト乳癌細胞（ＭＣＦ７、図１０Ｃ）を殺傷するのに効果的であった。マウスおよびヒト系の両方で、対照ＶＬＰ、即ちペプチドコンジュゲーションなしは、標的細胞の殺傷を誘導せず、または腫瘍細胞単独とのＣＤ８＋ Ｔ細胞の共インキュベーションでも殺傷を誘導しなかった。ヒト細胞株を用いたこれらの一連のインビトロ研究では、１μｇ／ｍＬのＣＭＶペプチドは１０６０ｎＭのペプチドに相当し、一方で２．５μｇ／ｍＬのＣＭＶ－コンジュゲート型ＶＬＰ中のＶＬＰ表面にコンジュゲートされたＣＭＶペプチドと同等のモル数は約０．０２４ｎＭであることが、決定された。こうして、腫瘍細胞を殺傷する同等のＴ細胞リダイレクションが、ＣＭＶペプチドのみのほぼ４４，０００分の１を利用したにもかかわらず、コンジュゲート型ＶＬＰにより惹起された。重要なことに、ＶＬＰにコンジュゲートされたＣＭＶ（ｐｐ６５）ペプチドのみの０．０２４ｎＭと同モルの濃度は１４ｐｇ／ｍＬであることが、決定された。細胞障害性が１４ｐｇ／ｍＬの遊離ペプチドのみでテストされた場合、腫瘍細胞の殺傷は、全ての３種のヒト標的細胞においてほとんど、または全く観察されなかった（図１０Ｃ）。これは、免疫リダイレクションを容易にするために、腫瘍細胞への外因性遊離ペプチドローディングのみに比較してペプチドローディングを増強することにおける、コンジュゲート型ＶＬＰの能力を強調する。
実施例１１
ＶＬＰコンジュゲーション方法
２種のコンジュゲーションアプローチを、融合タンパク質：（１）野生型ＨＰＶワクチン（ＷＴ－ＶＬＰ）；および（２）コンジュゲート型ＨＰＶワクチン（ＷＴ－ＶＬＰに比較して単一Ｌ１モノマーあたり２つの追加的システイン残基を有し、それゆえＲＧ１ ＶＬＰ表面に７２０の余分なシステインを有するＲＧ１ ＶＬＰ）、へのＶＬＰのコンジュゲーションのための候補としてテストした。各テストでは、ＶＬＰを最初に、室温で１時間のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）との反応により還元した。この還元ステップは、次のステップ、つまりＶＬＰへのペプチドのマレイミドコンジュゲーションのためにＶＬＰ上の遊離システインを「放出する」ために必要とされた。還元と、リコールタンパク質の上流で直接合成されたマレイミド分子を利用するマレイミドコンジュゲーションとに利用されたプロトコルは、上記の通りであった。
追加のＲＧ１ペプチド配列挿入を有するＲＧ１ ＶＬＰ Ｌ１タンパク質配列は、以下の通りである（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７）
還元ステップがない場合、検出可能なコンジュゲーションは、ほとんど、または全く起こらない（図１３のレーン３および図１４のレーン５）。コンジュゲーションの効率を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＣＲＩＴＥＲＩＯＮ（商標）ゲル、４～２０％アクリルアミド、ＢｉｏＲａｄ、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ所在）上のＶＬＰのＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色を実施してコンジュゲート型および非コンジュゲート型ＶＬＰの相対量を決定することにより決定する。（図１１参照）。コンジュゲーションが起こらない場合、ＴＣＥＰ：ＲＧ１ ＶＬＰ １：１レーンに見られる通り単一バンドのみが存在するであろう。対照的に、ＴＣＥＰ：ＲＧ１比 ３：１～１０：１での複数のバンドは、コンジュゲーションが起こることを示し、それゆえ還元ステップの重要性も検証する。ＶＬＰがジスルフィド結合により保持され、こうしてＴＣＥＰの付加がＶＬＰを損傷し得ることも知られているが、ＴＣＥＰ：ＲＧ１比 ５：１および３：１は、ＴＥＭ（透過電子顕微鏡測定）の下で無傷のコンジュゲート型ＶＬＰを示し、それにより粒子完全性に影響を及ぼさずにＲＧ１コンジュゲーションに適するＴＣＥＰ量を示す。（図１２参照）。
ＴＣＥＰ濃度がどのようにＶＬＰへの融合タンパク質のカップリング効率を決定するかの関連性を、ＶＬＰに対する還元剤の追加的な比（７４：１まで）でさらに検討した（図１３参照）。ＲＧ１に対するＴＣＥＰの最高比（例えば、７４：１）では、最大５か所のカップリング部位が、単一Ｌ１モノマーに存在する。対照的に、ＷＴ－ＶＬＰは、ＴＣＥＰがどのような比でテストされたとしても、Ｌ１モノマーあたり１か所のみのカップリング部位を生じた。
実施例１２
ヒトコンジュゲート型ＶＬＰはインビトロおよびインビボで腫瘍細胞障害性を惹起する
既存の免疫リコール応答により容易に認識および排出され得る一般的な感染性ウイルス抗原ペプチドで腫瘍細胞を選択的にロードする能力は、様々なネズミモデルを用いてインビトロおよびインビボの両方で評価されるべきである。実施例１～１１に見られる通り、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）１６型 Ｅ７抗原からのネズミＭＨＣ制限Ｈ－２ＤｂＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドを用いて、ＨＰＶ１６ Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰ（Ｅ７－ＶＬＰ）を作製し、腫瘍細胞ＩＤ８（卵巣）、Ｂ１６（黒色腫）、およびＭＣ３８（結腸）に特異的に結合することを示した。Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰからのＥ７ペプチドの切断は、腫瘍細胞上のＭＨＣクラスＩ受容体への特異的Ｅ７ペプチド結合をもたらし、それによりそれらの腫瘍細胞、この場合ネズミＣＤ８＋ ＨＰＶ１６ Ｅ特異性Ｔ細胞を、抗原特異性ＣＴＬ介在性の殺傷を受け易くさせる。実施例１０に見られる通り、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｐｐ６５抗原コンジュゲート型ＶＬＰを用いて、この結果は、ヒト健常ドナーＣＭＶ ｐｐ６５特異性ＣＤ８＋ Ｔ細胞にも拡張された。
ほとんどのヒト個体は、インフルエンザ、ＨＰＶ１６、ＣＭＶ、ＥＢＶおよび他の小児ワクチン（ＭＭＲ、水疱瘡、ＨＥＰＢ）に対する既存の免疫性を有するため、または有する可能性があるため、同じ実験方法が、記載されたＶＬＰを他の免疫原性ＨＬＡ－Ａ２制限ペプチドにコンジュゲートするために採用されてよい。ＨＬＡ－Ａ２制限ペプチドは、それらが米国において最も広く用いられるヒトＭＨＣクラスＩ対立遺伝子であるため、これらの実験に選択されるであろう。上記のＮ２末端にフリン切断部位を有するＨＬＡ－Ａ２制限エピトープに、様々なＶＬＰをコンジュゲートした。特異的エピトープを、表４に提供する。
Figure 0007641005000031
各構造物を、上記の通りＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。（図１４参照）。図１４Ａは、以下のペプチドへのＷＴ ＨＰＶ ＶＬＰのコンジュゲートを表す：ＭＯＶＡ２（ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２））、インフルエンザＶ１、ＨｅｐＢ Ｖ１、はしかＶ１、およびＶＺＶ Ｖ１。（融合タンパク質は、上記の通り米国ニュージャージー州のＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔにより純度８０％で合成される）。同様に、図１４Ｂは、ＭＯＶＡ２（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）、インフルエンザＶ１、ＨｅｐＢ Ｖ１、はしかＶ１、およびＶＺＶ Ｖ１を含むＲＧ１ ＶＬＰのコンジュゲートを表す。
これらの構築物は、実施例と同様に、腫瘍細胞に局在化する、腫瘍細胞に結合する、それらのエピトープをタンパク質分解切断させる、および放出されたエピトープを腫瘍ＭＨＣ Ｉ受容体により結合させてＴ細胞介在性免疫応答を惹起する、それらの能力について、テストされる。ＨＬＡ－Ａ２が陽性である細胞株が、上記の通り用いられる。そのような細胞株としては、例えばＭＤＡ－ＭＢ２３１、ＨＣＴ１１６、およびＰＣ－３などのヒト腫瘍が挙げられる。加えて、ルシフェラーゼ遺伝子を過剰発現しＨＬＡ－Ａ２（それぞれＢ１６－ＡＡＤ、ＴＣ１－ＡＡＤ、およびＩＤ８－ＡＡＤ）を過剰発現するネズミＢ１６（黒色腫／皮膚）、ＴＣ－１（子宮頸）、およびＩＤ８（卵巣）腫瘍細胞サブクローンを、作製した。これらの細胞株の全ては、培養で生育され得る。通常の環境下では、これらの細胞株は、これらが細胞表面でそれぞれの小児ワクチンまたは自然感染抗原を発現または提示しないため、上記の表に列挙されたエピトープに特異的なウイルス特異性ＣＤ８＋ Ｔ細胞により殺傷されないであろう。細胞をその後、（１）１μｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌおよび１ｐｇ／ｍｌの投与量での上記の表４の特異的ウイルス抗原ペプチド；（２）特異的ウイルス抗原コンジュゲート型ＶＬＰ（２．５μｇ／ｍＬ）；（３）非コンジュゲート型（対照）ＶＬＰと共にインキュベートするか；または（４）非処置（緩衝液を用いる）とする。細胞をその後、洗浄し、それぞれの抗原特異性Ｔ細胞と様々なＥ：Ｔ比（エフェクタ：標的比）で共培養する。細胞生存能力を、ヒト腫瘍ではＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ(登録商標)アッセイにより、またはネズミ腫瘍ではルシフェラーゼの発現を測定することにより、測定する。低減されたルシフェラーゼ活性は、より大きな細胞障害性を示し、より大きな免疫リダイレクションを示唆する。
インビボでこれをテストするために、ナイーブトランスフェニックＨＬＡ－Ａ２またはＨＬＡ－ＡＡＤマウスに、ＨｅｐＢ、ＭＭＲおよび水疱瘡などの小児ワクチンを接種して（上記の表２参照）、既存の細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）ウイルス応答を作製する。ＣＴＬ応答を、それぞれのウイルスペプチドへのＨＬＡ－Ａ２特異性四量体を用いて評価する。充分なＣＴＬ応答が確認されたら、マウスにルシフェラーゼ発現ＨＬＡ－Ａ２陽性腫瘍株ＩＤ８－ＡＤＤ（卵巣）、Ｂ１６－ＡＡＤ（黒色腫）、またはＴＣ－１ ＡＡＤ（子宮頸）腫瘍細胞を注射する。腫瘍の生育を、連日モニタリングする。マウスが、平均体積１０ｍｍ３の触知可能な腫瘍を発症したら、ペプチドコンジュゲート型ＶＬＰを１００μｇ／マウス／週で３週間継続して腫瘍担持マウスに投与する。コンジュゲート型ＶＬＰを用いる本明細書に記載の抗腫瘍免疫リダイレクション療法の有効性を、非処置群に対する腫瘍体積および生存率を介して測定する。別の実験で、同じ研究を、小児ワクチンの代わりにペプチドをＨＬＡ－Ａ２またはＨＬＡ－ＡＡＤマウスに直接ワクチン接種すること以外は上記のように、実行する。
実施例１３
コンジュゲート型ＶＬＰへの暴露後にヒト腫瘍で処置されたマウスの生存率
免疫不全マウスに、ＭＨＣクラス１ ＨＬＡ－Ａ２を過剰発現するヒト腫瘍細胞を注射する。例としては、ＰＣ－３、ＨＣＴ１１２、およびＭＤＡ－ＭＢ２３１、が挙げられる。同時に、マウスに、以下のエピトープ（以下の表５）の１つを含む融合タンパク質にコンジュゲートされたコンジュゲート型ＶＬＰで過去に刺激されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（１０６細胞）を注射する：
Figure 0007641005000032
上記の通りリコールタンパク質を含有する融合タンパク質を含むコンジュゲート型ＶＬＰをその後、３週間にわたりマウスに週１回注射する。コンジュゲート型ＶＬＰで刺激されたヒトＰＢＭＣの２回目の注射をその後、１４日目にマウスに注射する。腫瘍の形成は、コンジュゲート型ＶＬＰを提供されなかった対照に比較して、阻害されると予測される。
実施例１４
コンジュゲート型ＶＬＰ免疫リダイレクション特性はフリン切断に依存的である
腫瘍特異性は、一部には、腫瘍細胞上のフリンの存在増加が原因である。フリン切断部位（ｃｉｔｅ）を含有する融合タンパク質にコンジュゲートされたコンジュゲート型ＶＬＰの特異性を確認するために、２種の実験を実行する。最初の実験では、フリン切断部位を有しないＶＬＰを、作製する。細胞障害性アッセイをその後実行して、フリン切断部位なしに、ペプチドは腫瘍細胞にロードされ得ないことを実証する。ルシフェラーゼ遺伝子（Ｂ１６－ｌｕｃおよびＩＤ８－ｌｕｃ）を過剰発現するネズミＢ１６（黒色腫／皮膚）およびＩＤ８（卵巣）腫瘍細胞を、培養で生育させる。細胞をその後、（１）Ｅ７ペプチド（１μｇ／ｍｌ、１ｎｇ/ｍＬ）；（２）ＨＰＶ１６ Ｅ７（フリン切断配列が欠如）コンジュゲート型ＶＬＰ（２．５μｇ／ｍＬ、０．０２５μｇ／ｍＬ）；または（３）非コンジュゲート型（対照、２．５μｇ／ｍＬ）ＶＬＰで処置する。細胞をその後、洗浄し、様々なＥ：Ｔ比（エフェクタ：標的比）でＣＤ８＋ ＨＰＶ１６ Ｅ７特異性Ｔ細胞と共培養する。細胞生存能力をその後、ルシフェラーゼの検出により測定する。低減したルシフェラーゼ活性は、より大きな免疫リダイレクション、つまりより大きな細胞障害性を示す。
２番目の実験では、ＨＬＡ－Ａ２ ＭＨＣクラス１分子を過剰発現するように、フリン欠損細胞株ＦＤ１１を操作する（ＦＤ１１／ＡＡＤ）。細胞障害性アッセイをその後、この細胞株を用いて実行して、フリンを有さない場合にペプチドが腫瘍細胞上にロードし得ないことをさらに実証する。ルシフェラーゼを過剰発現するＦＤ１１／ＡＡＤ腫瘍細胞を、培養で生育させる。細胞をその後、（１）Ｅ７ペプチド（１μｇ／ｍｌ、１ｎｇ/ｍＬ）；（２）ＨＰＶ１６ Ｅ７コンジュゲート型ＶＬＰ（２．５μｇ／ｍｌ、０．０２５μｇ/ｍＬ）；または（３）非コンジュゲート型（対照、２．５μｇ／ｍＬ）ＶＬＰで処置する。細胞をその後、洗浄し、様々なＥ：Ｔ比（エフェクタ：標的比）でＣＤ８＋ ＨＰＶ１６ Ｅ７特異性Ｔ細胞と共培養する。細胞生存能力を、ルシフェラーゼの活性／発現を測定することにより測定する。低減したルシフェラーゼ活性は、より大きな免疫リダイレクション、つまりより大きな細胞障害性を示した。
実施例１５
腫瘍リチャレンジ実験
記載されたコンジュゲート型ＶＬＰにより原発腫瘍を過去に治癒されたマウスの、腫瘍リチャレンジを生き残る能力を評定する。コンジュゲート型ＶＬＰによる腫瘍の処置で生存しているマウス（ｎ＝２０）を、最後の腫瘍の消失後４週間目に同じ腫瘍（１×１０５の生きた細胞）でリチャレンジする。腫瘍またはコンジュゲート型ＶＬＰのどちらかに暴露されていないナイーブマウスの群（ｎ＝２０）に、対照として同じ腫瘍を注射する。処置マウス３匹およびナイーブマウス３匹をその後、ＶＬＰ治療前、ＶＬＰ治療後、およびリチャレンジ後に殺処分する。腫瘍および脾臓をその後、ＩｍｍｕｎｏＳＥＱアッセイ（Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、ワシントン州シアトル所在）によるＴＣＲβハイスループットシーケンシングのために調製する。コンジュゲート型ＶＬＰにより原発腫瘍を過去に治癒されたマウスは、二次的なリチャレンジへの抵抗性を呈すると予測され、コンジュゲート型ＶＬＰ方策が腫瘍再発に対する防御システムの免疫応答を誘導できることを示す。ＶＬＰ治療前、ＶＬＰ治療後、およびリチャレンジ後などの、様々な段階でのマウスの異なるＴＣＲクローンプロファイルを、観察する。

Claims (20)

  1. 少なくとも１種のヒトパピローマウイルスカプシドタンパク質、および
    融合タンパク質であって、少なくとも１種のフリンプロテアーゼ切断ペプチド配列と、少なくとも１種のリコールタンパク質とを含む、融合タンパク質
    を含む、ヒトパピローマウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、
    前記リコールタンパク質が、少なくとも１種のエピトープを含み、
    前記融合タンパク質が、前記パピローマウイルスカプシドタンパク質に付着し、４５アミノ酸以下の長さであり、かつ
    前記フリンプロテアーゼ切断ペプチド配列が、前記パピローマウイルスカプシドタンパク質と前記リコールタンパク質の間に位置し、
    前記ＶＬＰが、癌細胞に結合することができる、または癌細胞に結合し、
    腫瘍微小環境における前記ＶＬＰからの前記少なくとも１種のリコールタンパク質の放出により、前記少なくとも１種のリコールタンパク質と前記癌細胞表面に存在する主要組織適合性（ＭＨＣ）分子との複合体が形成され、その結果、Ｔ細胞が活性化され、それによって前記癌細胞の増殖が阻害される、ヒトパピローマウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
  2. 前記少なくとも１種のエピトープが：
    病原体エピトープであり、
    ＭＨＣ分子と複合体を形成するペプチド配列を含み、および／または
    配列番号１～８３の１つまたは複数から選択される配列を有する、請求項１に記載のＶＬＰ。
  3. 前記ヒトパピローマウイルスカプシドタンパク質が、ヒトパピローマウイルスＬ１および／またはヒトパピローマウイルスＬ２カプシドタンパク質である、請求項１または２に記載のＶＬＰ。
  4. 前記プロテアーゼ切断ペプチド配列が、ジスルフィド結合、チオールエステル結合、アミド結合、または化学架橋の形成に適した条件下で、前記融合タンパク質を架橋剤に曝露することによって作成される共有結合を介してコンジュゲートされることにより、前記少なくとも１種のカプシドタンパク質に付着する、請求項１～３のいずれか１項に記載のＶＬＰ。
  5. 前記融合タンパク質が、少なくとも２種のリコールタンパク質を含むか、または前記ＶＬＰが、それぞれが異なるリコールタンパク質を含む少なくとも２種の融合タンパク質を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のＶＬＰ。
  6. 前記少なくとも１種のヒトパピローマウイルスカプシドタンパク質が、特有の組織型へのトロピズムを示す、請求項１～５のいずれか１項に記載のＶＬＰ。
  7. 前記トロピズムが、ヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）を発現する細胞または組織へのトロピズムである、請求項６に記載のＶＬＰ。
  8. 前記エピトープの配列が、小児ワクチン由来である、請求項１～７のいずれか１項に記載のＶＬＰ。
  9. 前記少なくとも１種のエピトープが、ウイルスエピトープであり、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、帯状疱疹ウイルス、風疹、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、はしかウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、バリオラウイルス、狂犬病ウイルス、デングウイルス、エボラウイルス、西ナイルウイルス、黄熱ウイルス、ジカウイルス、サイトメガロウイルス、またはエプスタイン・バーウイルス由来である、請求項１～８のいずれか１項に記載のＶＬＰ。
  10. 前記少なくとも１種のエピトープが、バクテリアエピトープであり、ボルデテラ・パータシス、クロストリジウム・テタニ、クラミジア・トラコマティス、ジフテリア、インフルエンザ菌、髄膜炎菌、ニューモコッカス、ビブリオ・コレラ、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、腸チフス、大腸菌、サルモネラ菌、レジオネラ・ニューモフィラ、リケッチア、トレポネーマ・パリダム、ストレプトコッカス、バシラス・アントラシス、クロストリジウム・ボツリナム、またはエルシニア菌由来である、請求項１～９のいずれか１項に記載のＶＬＰ。
  11. 前記少なくとも１種のエピトープが、寄生虫エピトープであり、エントアメーバ・ヒストリティカ、トキソプラズマ・ゴンディ、トリキネラ、トリコモナス、トリパノソーマ、またはプラスモジウム由来である、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＶＬＰ。
  12. 前記少なくとも１種のエピトープが、ヒトＴ細胞エピトープである、請求項１～１１のいずれか１項に記載のＶＬＰ。
  13. 前記融合タンパク質が、前記少なくとも１種のヒトパピローマウイルスカプシドタンパク質のシステイン、リジン、またはアルギニン残基を介して前記少なくとも１種のヒトパピローマウイルスカプシドタンパク質にコンジュゲートしている、請求項１～１２のいずれか１項に記載のＶＬＰ。
  14. 請求項１～１３のいずれか１項に記載のヒトパピローマウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）の薬学的に有効な量を含む、癌の治療のための薬学的組成物。
  15. 癌の治療のための薬剤の製造における、請求項１～１３のいずれか１項に記載のヒトパピローマウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物の使用。
  16. 請求項１～１３のいずれか１項に記載のヒトパピローマウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）の薬学的に有効な量を含む、癌の治療に使用するための薬学的組成物。
  17. 前記エピトープが、小児ワクチン由来であり、対象における免疫応答を誘発する、請求項１４または１６に記載の薬学的組成物。
  18. 前記エピトープが、対象における過去の免疫またはワクチン接種に存在するエピトープに対応する、請求項１４または１６に記載の薬学的組成物。
  19. 前記エピトープが、ワクチン由来であり、前記ワクチンが、帯状疱疹ワクチン、肺炎球菌ワクチン、肝炎ワクチン、または、はしか－ムンプス－風疹（ＭＭＲ）ワクチンである、請求項１４または１６に記載の薬学的組成物。
  20. 前記癌が、小細胞肺癌、肝細胞癌、肝臓癌、黒色腫、転移性黒色腫、副腎癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳もしくは中枢神経系癌、乳癌、子宮頸癌、結腸もしくは直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、胆嚢癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍、妊娠性トロホブラスト疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭もしくは下咽頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔もしくは副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、口腔または中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、小リンパ球性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、成人の混合細胞型びまん性アグレッシブリンパ腫、成人の大細胞型びまん性アグレッシブリンパ腫、成人の大細胞型免疫芽球性びまん性アグレッシブリンパ腫、成人の小型非切れ込み核細胞性びまん性アグレッシブリンパ腫、濾胞性リンパ腫、頭頸部癌、子宮内膜もしくは子宮癌腫、非小細胞肺癌、骨肉腫、膠芽腫、または転移癌のうちの１つまたは複数である、請求項１４または１６に記載の薬学的組成物。
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