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ES2677850T3 - Composiciones y métodos probióticos - Google Patents

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ES2677850T3
ES2677850T3 ES12803279.4T ES12803279T ES2677850T3 ES 2677850 T3 ES2677850 T3 ES 2677850T3 ES 12803279 T ES12803279 T ES 12803279T ES 2677850 T3 ES2677850 T3 ES 2677850T3
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Andrea Budelli
Francesca Romana FASANO
Miryam TERZANO
Lorenzo BRAMATI
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HJ Heinz Co Brands LLC
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Abstract

Una composición que comprende un producto alimentario fermentado, en donde el producto alimentario se ha fermentado mediante la bacteria probiótica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Número de Acceso del Depósito Internacional LMG P-24778.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones y metodos probioticos Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a organismos probioticos, productos alimentarios preparados con organismos probioticos, y composiciones farmaceuticas que comprenden organismos probioticos. Estas composiciones son utiles en la estimulacion del sistema inmunologico de las mucosas y para el tratamiento de trastornos asociados con la inmadurez del sistema inmunologico de las mucosas.
Antecedentes de la invencion
El epitelio intestinal esta expuesto constantemente a materiales extranos que pueden ser bien daninos o bien beneficiosos para el hospedador. Como consecuencia, el sistema inmunologico debe alcanzar un diffcil equilibrio entre: 1) proteger frente a respuestas inmunologicas que son inducidas por patogenos o toxinas intestinales y 2) eliminar las respuestas inmunologicas frente a tanto a antfgenos alimentarios como frente a los 1014 microorganismos beneficiosos comensales que residen normalmente en el intestino. La interrupcion tanto de las respuestas protectoras como de las respuestas tolerantes pueden dar como resultado una amplia variedad de trastornos que incluyen, por ejemplo, infecciones, inflamacion, alergias alimentarias, hipersensibilidad alimentaria, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, enfermedad celfaca, enfermedad periodontal, artritis reumatoide, ateroesclerosis y cancer de colon.
La red inmuno-reguladora que comprende el sistema inmunologico intestinal cambia con la edad. La red esta poco desarrollada en los recien nacidos y se establece gradualmente a lo largo de los primeros anos de vida. La inmadurez del sistema inmunologico juega un papel importante en la prevalencia de las infecciones y en los trastornos alimentarios en lactantes y en ninos pequenos. En cambio, la capacidad del sistema inmunologico intestinal para responder a nuevos cambios desciende en los ancianos.
Los trastornos gastrointestinales, por ejemplo, infecciones, trastornos inflamatorios y trastornos alimentarios, tales como alergias, intolerancia alimentaria o hipersensibilidad alimentaria, tienen un impacto significativo en la salud y en la calidad de vida tanto en ninos como en adultos.
Los trastornos gastrointestinales, por ejemplo, infecciones, trastornos inflamatorios y trastornos alimentarios, tales como alergias, intolerancia alimentaria o hipersensibilidad alimentaria, tienen un impacto significativo en la salud y en la calidad de vida tanto en ninos como en adultos. La gastroenteritis infecciosa es el trastorno gastrointestinal pediatrico mas comun. Aproximadamente 1 billon de episodios aparecen en el mundo cada ano, mas comunmente en pafses en desarrollo en ninos de menos de 5 anos de edad. Las tasas de mortalidad mundial por gastroenteritis infecciosa tienen un promedio de 3 a 6 millones de ninos por ano. En los Estados Unidos, de 25 a 35 millones de nuevos casos aparecen cada ano, dando como resultado de 300 a 400 muertes. Ademas, la gastroenteritis infecciosa en los EE.UU. dan como resultado 200.000 hospitalizaciones estimadas y 1,5 millones de visitas de pacientes ambulatorios con un coste que excede el billon de dolares. Los trastornos alimentarios, tales como las alergias, tambien tienen un efecto sustancial tanto sobre la salud de ninos como en la de adultos. Los smtomas de las alergias alimentarias pueden variar dependiendo de la gravedad de la alergia y puede oscilar desde una leve sensacion de hormigueo alrededor de la boca y de los labios hasta la anafilaxis mortal. Se estima que las alergias alimentarias afectan a entre 1-10% de la poblacion en los EE.UU. El Centro para el Control de Enfermedades encontro que en el 2007, aproximadamente 3 millones de ninos menores de 18 anos (3,9%) presentaron una alergia alimentaria o una alergia digestiva en los 12 meses anteriores. Para algunos ninos, las alergias alimentarias se vuelven menos graves con la edad, para otros, afectan durante toda la vida. Los ninos que padecen de alergias en los primeros anos de vida pueden desarrollar “marcha alergica”. Por ejemplo, muchos individuos que tienen reacciones alergicas graves a la leche de vaca durante la infancia corren el riego de desarrollar asma despues de la ninez. Hay evidencias de que la prevalencia de las alergias alimentarias esta aumentando mundialmente.
Con independencia de la etiologfa, los trastornos gastrointestinales no solo afectan de negativamente a la salud de los ninos, sino que tienen un grave impacto sobre la econoirna familiar, en las interacciones sociales, y en la asistencia escolar y laboral de los padres. Existe una continua necesidad de estrategias terapeuticas que promuevan la salud gastrointestinal, en particular en individuos que padecen de trastornos gastrointestinales o que corren el riesgo de padecerlos.
CA 2761691 describe composiciones con cepas probioticas que incluyen Lactobacillus paracasei.
EP 1 364 586 se refiere a una formula infantil con cepas Lactobacillus paracasei y/o Bifidobacterium lactis.
WO 99/29833 divulga cepas L. paracasei para el uso como probioticos; tambien hay ejemplos de productos fermentados.
Compendio de la invencion
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La presente invencion proporciona composiciones que comprenden un producto alimentario fermentado, en donde el producto alimentario se ha fermentado mediante la bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778. El producto alimentario puede ser un producto lacteo o un producto de cereales. Se proporcionan tambien composiciones que comprenden la bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778 y un vehmulo aceptable fisiologicamente. El vehmulo aceptable fisiologicamente puede ser un producto alimentario o un vehmulo farmaceutico. Se proporcionan tambien metodos para preparar una composicion nutricional, comprendiendo el metodo: proporcionar un producto alimentario; combinar el producto alimentario con una cantidad eficaz de la bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778 y, opcionalmente, un co-inoculo, para formar una mezcla; e incubar la mezcla a una temperatura y durante un tiempo suficiente para que ocurra la fermentacion. La composicion nutricional se puede secar. La composicion nutricional se puede combinar con uno o mas productos alimentarios adicionales. Para cualquiera de las composiciones y metodos descritos en la presente memoria, las celulas de Lactobacillus paracasei CBA L74 se pueden someter a tratamientos que las vuelvan no replicativas. La concentracion de Lactobacillus paracasei CBA L74 en las composiciones puede variar dependiendo del uso al que se destinen, por ejemplo, como una composicion nutricional o como una composicion farmaceutica. Intervalos utiles incluyen el equivalente de aproximadamente 1 x 102 unidades formadoras de colonias por gramo (“cfu/g”) a aproximadamente 1 x 1012 unidades formadoras de colonias por gramo (“cfu/g”) en peso seco.
Se proporcionan tambien metodos para tratar a un sujeto que corre el riesgo de desarrollar un trastorno gastrointestinal, comprendiendo el metodo: identificar a un sujeto que corre el riesgo de padecer un trastorno gastrointestinal; administrar una cantidad eficaz de una composicion que comprende un producto alimentario en donde el producto alimentario se ha fermentado por la bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778. El trastorno gastrointestinal puede ser un sistema inmunologico de las mucosas deficitario, para estudiar, un sistema inmunologico inmaduro, una alergia alimentaria, un trastorno asociado a diarrea, una infeccion bacteriana o viral, smdrome de intestino irritable, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, enterocolitis necrotizante o por envejecimiento, particularmente envejecimiento del sistema gastrointestinal.
Se proporcionan tambien metodos para tratar a un sujeto que tiene un trastorno gastrointestinal. Los metodos incluyen: identificar a un sujeto que tiene un trastorno gastrointestinal; administrar una cantidad eficaz de una composicion que comprende un producto alimentario en donde el producto alimentario se ha fermentado por la bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778. En algunas realizaciones, los metodos incluyen: identificar a un sujeto que tiene un trastorno gastrointestinal; administrar una cantidad eficaz de una composicion farmaceutica que comprende la bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778. El trastorno gastrointestinal puede ser un sistema inmunologico deficitario, para examinar, un sistema inmunologico inmaduro, una alergia alimentaria, un trastorno asociado a diarrea, una infeccion bacteriana o viral, smdrome del intestino irritable, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn o enterocolitis necrotizante.
Se proporcionan tambien metodos para modular el sistema inmunologico en un sujeto. Los metodos incluyen: identificar un sujeto que necesita la modulacion del sistema inmunologico, y administrar una cantidad eficaz de una composicion que comprende un producto alimentario en donde el producto alimentario se ha fermentado mediante la bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778.
Se proporcionan tambien artmulos de fabricacion. Estos pueden incluir kits que comprenden una cantidad determinada de una composicion nutricional que comprende un producto alimentario fermentado, en donde el producto alimentario se ha fermentado mediante la bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778, y uno o mas elementos seleccionados del grupo que consiste en el material de envasado, un prospecto que comprende las instrucciones de uso, un fluido esteril, y un envase esteril. En algunas realizaciones, el kit puede incluir una cantidad determinada de una composicion farmaceutica que comprende un Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778, y uno o mas elementos seleccionados del grupo que consiste en el material de envasado, un prospecto que comprende las instrucciones de uso, un fluido esteril, y un envase esteril.
En los dibujos adjuntos y en la descripcion de a continuacion se establecen los detalles de una o mas realizaciones de la invencion. Otras caractensticas, objetivos y ventajas de la presente invencion seran evidentes a partir de la descripcion y los dibujos, y a partir de las reivindicaciones.
Breve descripcion de los dibujos
Estas y otras caractensticas y ventajas de la presente invencion se describiran mas a fondo, o seran evidentes, mediante la siguiente descripcion detallada de la realizacion preferida de la invencion, que se considera junto con los dibujos acompanantes en donde los numeros se refieren a las partes y en donde ademas:
La FIG. 1 es una tabla que muestra un analisis del efecto de L. paracasei CBA L74 en el fenotipo de celulas DC.
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La FIG. 2a es una grafica que representa la produccion de IL-10 en celulas DCs (celulas dendnticas, de sus siglas en ingles) co-cultivadas con celulas Caco2 (celulas de adenocarcinoma de colon humano) expuestas a L. paracasei CBA L74. La FIG. 2b es una grafica que representa la produccion de IL-12 en celulas DCs co-cultivadas con celulas Caco2 expuestas a L. paracasei CBA L74.
La FIG. 3 es una grafica que representa la proliferacion de celulas T expuestas a celulas DCs co-cultivadas con celulas CaCo2.
La FIG. 4 es una grafica que representa la produccion de IL-1p en la mucosa intestinal de ratones suplementados con L. paracasei CBA L74.
La FIG. 5 es una grafica que representa la produccion de IL-4 en la mucosa intestinal de ratones suplementados con L. paracasei CBA L74.
La FIG. 6 es una grafica que representa la produccion de IgA en la mucosa intestinal de ratones suplementados con L. paracasei CBA L74.
La FIG. 7 representa un analisis de los niveles de TLR2, TLR4 y TLR9 en la mucosa intestinal de ratones suplementados con L. paracasei CBA L74.
La FIG. 8 representa un analisis de los niveles de PPARy en la mucosa intestinal de ratones suplementados con L. paracasei cBa L74.
La FIG. 9a es una grafica que representa los niveles sericos de IL-1p en ratones suplementados con L. paracasei CBA L74. La FIG. 9b es una grafica que representa los niveles sericosde IL-4 de ratones suplementados con L. paracasei CBA L74.
La FIG. 10 es una tabla que muestra un analisis del efecto L. paracasei CBA L74 sobre el fenotipo de celulas DC en ratones suplementados con L. paracasei CBA L74.
La FIG. 11a es una grafica que representa los fenotipos de linfocitos CD4+ intestinales en ratones suplementados con L. paracasei CBA L74. La FIG. 11b es una grafica que representa los fenotipos de linfocitos CD8+ intestinales en ratones suplementados con L. paracasei CBA L74.
La FIG. 12 es una grafica que representa la produccion de IL-10 en la mucosa intestinal de ratones suplementados con leche fermentada mediante L. paracasei CBA L74.
La FIG. 13 es una grafica que representa la produccion de IL-1p en la mucosa intestinal de ratones suplementados con leche fermentada mediante L. paracasei CBA L74.
La FIG. 14 es una grafica que representa la produccion de IgA en la mucosa intestinal de ratones suplementados con leche fermentada mediante L. paracasei CBA L74.
La FIG. 15 representa un analisis de los niveles de TLR2, TLR4, TLR9 y PPARy en la mucosa intestinal de ratones suplementados con leche fermentada mediante L. paracasei CBA L74.
La FIG. 16 representa un analisis de los niveles de pNF-kB y IKBa en la mucosa intestinal de ratones suplementados con leche fermentada mediante L. paracasei CBA.
La FIG. 17 representa un analisis del efecto de L. paracasei CBA L74 sobre el fenotipo de celulas DC en ratones suplementados con leche fermentada mediante L. paracasei CBA.
La FIG. 18 es un analisis del efecto de L. paracasei CBA L74 sobre el fenotipo de las celulas DC despues de la exposicion a LPS o CpG en ratones suplementados con leche fermentada mediante L. paracasei CBA.
La FIG. 19 es una grafica que representa los fenotipos de linfocitos CD4+ intestinales en ratones suplementados con leche fermentada mediante L. paracasei CBA L74.
La FIG. 20 es una grafica que representa los fenotipos de linfocitos CD8+ intestinales en ratones suplementados con leche fermentada mediante L. paracasei CBA L74.
La FIG. 21 muestra la evaluacion histologica de la mucosa del fleon en ratones suplementados con leche fermentada mediante L. paracasei CBA L74.
La FIG. 22 es una grafica que representa la produccion de IL-1p y IL-4 en la mucosa intestinal de ratones suplementados con arroz fermentado mediante L. paracasei CBA L74.
La FIG. 23 es una grafica que representa la produccion de IL-10 en la mucosa intestinal de ratones suplementados con arroz fermentado mediante L. paracasei CBA L74.
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La FIG. 24 es un analisis de los niveles de TLR2 y TLR4 en la mucosa intestinal de ratones suplementados con arroz fermentado mediante L. paracasei CBA L74.
La FIG. 25a es un analisis de los niveles de PPARy en la mucosa intestinal de ratones suplementados con arroz fermentado mediante L. paracasei CBA L74. La FlG. 25b es un analisis de los niveles de pNF-kB y IKBa en la mucosa intestinal de ratones suplementados con arroz fermentado mediante L. paracasei CBA L74.
La FIG. 26 es una tabla que muestra un analisis del efecto L. paracasei CBA L74 sobre el fenotipo de celulas DC en ratones suplementados con arroz fermentado mediante L. paracasei CBA L74.
La FIG. 27 es una tabla que muestra un analisis del efecto L. paracasei CBA L74 sobre el fenotipo de celulas DC despues de la exposicion a LPS o CpG en ratones suplementados con arroz fermentado mediante L. paracasei CBA L74.
La FIG. 28 es una grafica que representa los fenotipos de linfocitos CD4+ intestinales en ratones suplementados con arroz fermentado mediante L. paracasei CBA L74.
La FIG. 29 es una grafica que representa los fenotipos de linfocitos CD8+ intestinales en ratones suplementados con arroz fermentado mediante L. paracasei CBA L74.
La FIG. 30 es una grafica que representa un analisis del efecto de celulas y del sobrenadante celular de L. paracasei CBA L74 sobre la produccion de IL-10 en MoDCs (celulas dendnticas humanas derivadas de monocitos) en presencia de Salmonella typhimurium.
La FIG. 31 es una grafica que representa un analisis del efecto de celulas y del sobrenadante celular de L. paracasei CBA L74 sobre la produccion de IL-12p70 en MoDCs humanas en presencia de Salmonella typhimurium.
La FIG. 32 es una grafica que representa un analisis del efecto de leche fermentada mediante L. paracasei CBA L74 sobre la produccion de IL-10 en MoDCs humanas en presencia de Salmonella typhimurium y el efecto de inactivacion de L. paracasei CBA L74 sobre la produccion de IL-10 en MoDCs humanas en presencia de Salmonella typhimurium.
La FIG. 33 es una grafica que representa un analisis del efecto de leche fermentada mediante L. paracasei CBA L74 sobre la produccion de IL-12p70 en MoDCs humanas en presencia de Salmonella typhimurium y el efecto de inactivacion de L. paracasei CBA L74 sobre la produccion de IL-12p70 en MoDCs humanas en presencia de Salmonella typhimurium.
La FIG. 34 es una grafica que representa un analisis del efecto de arroz fermentado mediante L. paracasei CBA L74 sobre IL-1p, TNF-a y IL-10 en el tejido intestinal de un explante modelo en presencia de Salmonella typhimurium.
Descripcion detallada
La presente invencion se basa, en parte, en el descubrimiento del inventor de que alimentos fermentados mediante el organismo probiotico Lactobacillus paracasei, cepa CBA L74, puede tener propiedades inmunomoduladoras. Esta cepa se aislo por los inventores y se deposito bajo el Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Deposito de Microorganismos para los propositos del Procedimiento de Patente el 9 de Septiembre, 2008 en las Colecciones Coordinadas Belgas de Micro-organismos (BCCM, de sus siglas en ingles) Laboratorio de Microbiologfa (LMG), Ghent, Belgica. El Numero de Acceso proporcionado por la Autoridad Depositaria Internacional es LMG P24778. Para facilitar la lectura, no repetiremos la frase “Numero de Acceso LMG P-24778” en cada ocasion. Se entiende que cuando nos referimos a L. paracasei, cepa CBA L74, nos referimos a la cepa depositada que tiene el Numero de Acceso LMG P-24778.
Las composiciones de la invencion incluyen el organismo probiotico L. paracasei CBA L74. La Organizacion Mundial de la Salud ha definido a los probioticos como: “Microorganismos vivos que cuando se administran en cantidades adecuadas confieren un beneficio para la salud del hospedador”. En algunas realizaciones, la cepa de L. paracasei CBA L74 se puede someter a la exposicion al calor, desecacion, irradiacion y, o irradiacion uv, para hacerla no replicativa. Una celula de L. paracasei CBA L74 no replicativa puede ser una celula muerta o una celula viva que es incapaz de realizar la division celular. Una celula de L. paracasei CBA L74 no replicativa puede ser una celula intacta o una celula que ha experimentado una lisis parcial o completa. En algunas realizaciones, las celulas no replicativas pueden incluir una mezcla de celulas intactas y celulas lisadas.
Aunque creemos que comprendemos que ciertos acontecimientos ocurren tras la administracion de las composiciones que comprenden o que se producen mediante fermentacion con L. paracasei CBA L74, las composiciones de la presente invencion no se limitan a aquellas que funcionan afectando a cualquier mecanismo celular particular. Nuestra hipotesis de trabajo es que los organismos probioticos o composiciones fermentadas con organismos probioticos pueden proporcionar una mayor barrera para la translocacion de bacterias y productos bacterianos a traves de la mucosa, excluyendo de manera competitiva a los patogenos potenciales, modificando la respuesta del hospedador a los productos microbianos, y mejorando la nutricion enteral de forma que se inhibe el
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crecimiento de patogenos. Los efectos beneficiosos de las composiciones que comprenden organismos probioticos no replicativos pueden derivarse, por ejemplo, de metabolitos producidos durante la fermentacion, por ejemplo, acidos organicos, tales como acido lactico, acido butmco o acido acetico. Alternativamente o de forma adicional, el ADN microbiano, por ejemplo, dinucleotidos CpG sin metilar, fragmentos de la pared celular bacteriana y otros componentes bacterianos sub-celulares, tales como protemas, carbohidratos y lfpidos, pueden ejercer efectos inmunomoduladores en el sistema inmunologico de las mucosas.
Los inventores han encontrado que L. paracasei CBA L74 aislada modula los niveles tanto de marcadores pro- como anti-inflamatorios cuando se ensayo in vitro e in vivo. Por otra parte, tambien se observaron efectos inmunomoduladores despues de la administracion de alimentos que se habfan fermentado mediante L. paracasei CBA L74. Tales efectos inmunomoduladores se notaron incluso cuando los alimentos fermentados se habfan tratado, por ejemplo, por calor, para llevar a cabo L. paracasei CBA L74 no replicativo. Por consiguiente, la invencion caracteriza a composiciones y metodos que se pueden emplear para estimular el sistema inmunologico intestinal. Las composiciones pueden incluir productos alimentarios que se han fermentado mediante L. paracasei CBA L74. Los productos alimentarios pueden ser una amplia gama de alimentos que son susceptibles de la fermentacion mediante L. paracasei CBA L74. En algunas realizaciones, las composiciones pueden incluir L. paracasei CBA L74 aislada y un vehnculo fisiologico. El vehnculo puede ser un producto alimentario, pero la invencion no es tan limitante y en algunas realizaciones el vetnculo puede ser un vetnculo farmacologico. Se proporcionan tambien metodos para preparar y emplear las composiciones. Los metodos de la invencion incluyen metodos para producir composiciones que comprenden L. paracasei CBA L74, metodos de fermentacion de productos alimentarios con L. paracasei CBA L74 y metodos de administracion de las composiciones para generar una respuesta inmunomoduladora en un sujeto. Las composiciones se pueden administrar a un sujeto que tiene un sistema inmunologico inmaduro, a un sujeto que corre riesgo de tener un trastorno gastrointestinal o a un sujeto que tiene un trastorno gastrointestinal. Los metodos se pueden emplear en sujetos humanos, por ejemplo, lactantes y ninos, o en medicina veterinaria. Independientemente del sujeto (si es un ser humano o no), cualquiera de los metodos presentes puede incluir una etapa de identificacion del sujeto. Por ejemplo, los metodos pueden incluir una etapa para determinar si el sujeto necesita de tratamiento.
Composiciones
Alimentos fermentados
Las composiciones de la invencion incluyen composiciones nutricionales, es decir, productos alimentarios fermentados mediante el organismo probiotico, L. paracasei CBA L74. Se puede emplear cualquier producto alimentario susceptible de la fermentacion mediante L. paracasei CBA L74. El producto alimentario puede ser un producto lacteo, por ejemplo, leche o un producto a base de leche. Ejemplos de fuentes lacteas incluyen, sin limitacion, el ganado bovino, ovino, caprino, yaks, bufalo de agua, caballos, burros, renos y camellos. Independientemente de la fuente, la leche o los productos lacteos pueden estar en cualquier forma adecuada para la fermentacion mediante L. paracasei CBA L74. Por ejemplo, la leche puede se leche entera o leche que se ha procesado para eliminar parte o toda la grasa lactea, por ejemplo, leche al 2%, leche al 1% o leche sin grasa. Alternativamente o de forma adicional, la leche se puede pasteurizar y/o homogeneizar, secar y reconstituir, condensar o evaporar previamente. Se pueden emplear tambien partes de los productos lacteos que incluyen casema, protema del suero o lactosa. En algunas realizaciones, el producto lacteo puede ser de aproximadamente 1% a aproximadamente 30% de leche desnatada en polvo reconstituida, por ejemplo, aproximadamente 2%, aproximadamente 5%, aproximadamente 7%, aproximadamente 9%, aproximadamente 10%, aproximadamente 12%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30% de leche desnatada en polvo reconstituida. Antes de la fermentacion, el producto lacteo se puede combinar con uno o mas de lo siguiente: a) un carbohidrato (por ejemplo, un disacarido, tal como dextrosa o un almidon); b) un lfpido; c) una vitamina y d) un mineral. Por ejemplo, la leche desnatada en polvo se puede combinar con dextrosa a aproximadamente el 2%, por ejemplo, aproximadamente 0,25%, aproximadamente 0,50%, aproximadamente 0,75%, aproximadamente 1,0%, aproximadamente 1,5% o aproximadamente 2,0%.
El producto alimentario puede ser un producto de un cereal, por ejemplo, arroz, trigo, avena, cebada, mafz, centeno, sorgo, mijo, o triticale. El producto de cereal puede ser un grano entero o puede molerse para convertirse en harina. El producto de cereal puede ser una unica clase de cereal o una mezcla de dos o mas clases de cereales, por ejemplo, harina de avena mas harina de cebada malteada. Los productos de cereales pueden ser de una calidad y una clase adecuada para el consumo humano o pueden ser productos adecuados para el consumo de animales domesticos. Generalmente, el producto de cereal se hidrata antes de la fermentacion. La concentracion del cereal puede variar, pero intervalos utiles incluyen de aproximadamente 5% a aproximadamente 50% de peso/volumen, por ejemplo, aproximadamente 8% de peso/volumen, aproximadamente 10% de peso/volumen, aproximadamente 12% de peso/volumen, aproximadamente 15% de peso/volumen, aproximadamente 18% de peso/volumen, aproximadamente 20% de peso/volumen, aproximadamente 22% de peso/volumen, aproximadamente 25% de peso/volumen, aproximadamente 30% de peso/volumen, aproximadamente 35% de peso/volumen, aproximadamente 40% de peso/volumen, aproximadamente 45% de peso/volumen o aproximadamente 50% de peso/volumen. Ejemplos de concentraciones incluyen 15% de peso/volumen de arroz o una mezcla de 18,5% de peso/volumen de harina de avena mas 5% de peso/volumen de harina de cebada malteada. El pH de los cereales hidratados se puede ajustar empleando cualquier acido adecuado para el consumo. El acido puede ser, por ejemplo,
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un acido organico. Acidos organicos utiles incluyen acido acetico, acido cftrico, acido lactico, acido ad^pico, acido malico y acido tartarico. Se puede emplear cualquier combinacion de dos o mas acidos. En algunas realizaciones, el pH se puede ajustar a aproximadamente 4,0 empleando acido cftrico.
El producto alimentario puede ser tambien un producto vegetal o una fruta, por ejemplo, un zumo, un pure, un concentrado, una pasta, una crema, una salmuera o una salsa de tomate. Ejemplos de vegetales y de frutas incluyen, sin limitacion, calabazas, por ejemplo, calabacines, calabaza amarilla, calabaza de invierno, calabaza; patatas, esparragos, brocoli, coles de Bruselas, judfas, por ejemplo, judfas verdes, frijoles, frijoles lima, habas, soja, repollo, zanahorias, coliflor, pepinos, colinabo, puerros, cebolletas, cebollas, guisantes mollares, guisantes ingleses, pimientos, nabos, nabos suecos, tomates, manzanas, peras, melocotones, ciruelas, fresas, frambuesas, moras, arandanos azules, arandanos rojos, bayas de Boysen, grosellas espinosas, uvas, grosellas, naranjas, limones, pomelo, bananas, mangos, kiwi, y carambola.
El producto alimentario puede ser tambien una “leche” producida a partir de granos (“leche” de cebada, avena o espelta), frutos secos (“leche” de almendra, anacardo, coco, avellana o nuez), legumbres (“leche” de soja, cacahuete, guisante o altramuces) o semillas (“leche” de semilla de quinoa, sesamo o girasol)
Se contemplan tambien productos alimentarios que comprenden protemas animales, por ejemplo, carne, por ejemplo, salchichas, carnes secas, pescado y productos de pescado seco.
Independientemente del tipo de producto alimentario que se use, el producto se combina con L. paracasei CBA L74 y se incuba a una temperatura y durante un tiempo suficiente para que ocurra la fermentacion. Se puede emplear cualquier metodo de fermentacion estandar conocido en la tecnica. Las condiciones de fermentacion espedficas variaran segun muchos factores que incluyen, por ejemplo, el tipo de producto alimentario, la concentracion del producto alimentario, la instrumentacion que se utilice, el volumen de la muestra, la concentracion inicial del inoculo de L. paracasei CBA L74, la presencia, si es necesaria, de un co-inoculo, las propiedades organolepticas del alimento fermentado, y del uso previsto del alimento fermentado.
Antes de la inoculacion con L. paracasei CBA L74 se esterilizan tanto la instrumentacion como el sustrato (es decir, el producto alimentario a fermentar) para descender, o eliminar, el nivel de bacterias y/o hongos viables y/o virus infecciosos. La instrumentacion se puede esterilizar empleando cualquiera de los metodos estandar o segun las instrucciones del fabricante. La eleccion de un metodo particular para la esterilizacion del sustrato dependera, en parte, de la estabilidad del sustrato al metodo de esterilizacion. Por ejemplo, el sustrato se puede esterilizar mediante vapor y presion, por ejemplo, mediante autoclave, exposicion a ciclos repetidos de calor y fno (por ejemplo, tindalizacion), exposicion a altas presiones (por ejemplo, pascalizacion), ultrafiltracion, o radiacion (por ejemplo, exposicion a rayos gamma, rayos x, haces de radiacion y/o radiacion ultra-violeta (longitud de onda de 10 nm a 320 nm, por ejemplo, de 50 nm a 320 nm, de 100 nm a 320 nm, de 150 nm a 320 nm, de 180 nm a 320 nm, o de 200 nm a 300 nm). Despues del tratamiento se pueden eliminar las aftcuotas del sustrato y colocarlas en un medio adecuado para confirmar la ausencia de bacterias y/o hongos contaminantes. Si el sustrato se ha esterilizado mediante exposicion a altas temperaturas, se debera enfriar a al menos 37°C antes de la inoculacion con L. paracasei CBA L74.
El sustrato se puede inocular con L. paracasei CBA L74 segun los metodos estandar, por ejemplo, a partir del cultivo ftquido fresco o del cultivo liofilizado que se ha resuspendido en medio acuoso durante un tiempo corto antes de la inoculacion. En general, el L. paracasei CBA L74 se anade a concentraciones de aproximadamente 0,5 x 106 a aproximadamente 1 x 106 ufc/ml de sustrato, por ejemplo, aproximadamente 1 x 106 ufc/ml, aproximadamente 2 x 106 ufc/ml, aproximadamente 5 x 106 ufc/ml, 7 x 106 ufc/ml, o 8 x 106 ufc/ml. El cultivo se debe agitar lo suficientemente como para producir una distribucion relativamente uniforme de las bacterias y del sustrato, pero no excesivamente ya que L. paracasei CBA L74 es una bacteria anaerobica. Por ejemplo, un cultivo de cinco litros se puede agitar a aproximadamente 150 rpm. La temperatura de fermentacion generalmente es a 37°C. Durante la fermentacion se pueden monitorear, y por consiguiente, ajustar, varios parametros, por ejemplo, el pH, la presion parcial de O2, la velocidad de agitacion, temperatura, mezcla de gas, nivel de espuma y concentracion de sustrato. Se puede monitorear el crecimiento de L. paracasei CBA L74 empleando metodos microbiologicos estandar. La fermentacion se lleva a cabo hasta que la concentracion de L. paracasei CBA L74 esta entre aproximadamente 108/ml y aproximadamente 109/ml. Dependiendo del sustrato y de otras condiciones, esta concentracion se puede alcanzar en aproximadamente 10 a aproximadamente 30 horas despues de la inoculacion, por ejemplo, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 30 horas.
Las muestras del sustrato se pueden ensayar para el control de calidad antes, durante y despues de la fermentacion empleando metodos microbiologicos estandar. Ejemplos de metodos incluyen, pero no se limitan a, crecimiento en agar Rogosa para L. paracasei CBA L74, crecimiento para recuento en placa agar (PCA, de sus siglas en ingles) para el total de aerobios, crecimiento en agar McConkay para coliformes, crecimiento en agar reforzado para clostridios (RCM, de sus siglas en ingles). Ademas del recuento de colonias, se pueden observar morfologfas de colonias y compararlas con las muestras de referencia.
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En algunas realizaciones, se puede anadir un co-inoculo junto con el L. paracasei CBA L74 para ayudar a iniciar la fermentacion. Co-inoculos utiles para la fermentacion de productos lacteos incluyen, por ejemplo, sin limitacion, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarious, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbrueckii, subsp. Bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, o Leuconostoc mesenteroides. En general, la concentracion del co-inoculo sera menor que la de L. paracasei CBA L74, por ejemplo, aproximadamente 1 x 104/ml x 105/ml. La concentracion final de S. thermophilus puede oscilar de aproximadamente 0,5 x 108/ml a aproximadamente 2,5 x 108/ml.
Productos alimentarios
Una vez que se han conseguido concentraciones adecuadas de L. paracasei CBA L74, el alimento fermentado se puede procesar adicionalmente para su uso. En algunas realizaciones, el pH del alimento fermentado se puede ajustar, por ejemplo, de aproximadamente 3,0 a cerca de la neutralidad, por ejemplo, 6,5, con la adicion de NaOH o KOH. En algunas realizaciones el alimento fermentado se puede secar. El producto alimentario fermentado se puede secar mediante cualquier metodo conocido en la tecnica que den como resultado la retencion de las propiedades inmunomodulatorias del alimento fermentado. Ejemplos de metodos de secado incluyen el secado por pulverizacion, secado por congelacion, por ejemplo, liofilizacion, o en un tambor de secado. El contenido de agua final del producto alimentario fermentado puede variar pero puede estar entre aproximadamente 1% y aproximadamente 10% o mas. En algunas realizaciones, el proceso de secado puede conseguir el L. paracasei CBA L74 no replicativo.
Los alimentos fermentados secos se pueden hidratar antes de su uso. Dependiendo de la cantidad de lfquido que se emplee en la hidratacion, los productos alimentarios fermentados pueden contener el equivalente a aproximadamente 102 y 1012 ufc/ml de L. paracasei CBA L74. El L. paracasei CBA L74 seco no forma colonias, por lo que se entiende que esta cantidad se calcula en base al numero de bacterias vivas que se presentaban en los alimentos fermentados antes de la etapa de secado. En algunas realizaciones, los productos alimentarios fermentados pueden incluir el equivalente de aproximadamente 107 a aproximadamente 1012 ufc/g, por ejemplo, aproximadamente 5 x107 ufc/g, aproximadamente 1 x108 ufc/g, aproximadamente 5 x108 ufc/ml, aproximadamente 1 xlo9 ufc/g, aproximadamente 5 x109 ufc/g, aproximadamente 1 x1010 ufc/g, aproximadamente 5 x1010 ufc/g, aproximadamente 1 x1011 ufc/g, aproximadamente 5 x1011 ufc/g en peso seco.
Antes de la administracion se pueden combinar dos o mas productos alimentarios fermentados preparados mediante los metodos de la invencion. Por ejemplo, se pueden combinar productos lacteos fermentados con productos de cereales fermentados. Alternativamente, el producto alimentario fermentado se puede combinar con otros productos alimentarios, por ejemplo, productos alimentarios no fermentados o productos alimentarios fermentados empleando otras cepas bacterianas. Se puede emplear cualquier combinacion que proporcione que se mantengan las propiedades inmunomoduladoras del alimento fermentado. Ejemplos de productos alimentarios incluyen, sin limitacion, productos lacteos, por ejemplo, leche, yogurt, cuajada, queso y productos a base de queso, leches fermentadas, productos fermentados a base a leche, polvos a base de leche, formulas infantiles, alimentos infantiles colados a base de leche, helado, gelato, pudines, sopas, salsas, pures, o alinos, formulas nutricionales para ancianos; productos de cereales, por ejemplo, pablum, alimentos infantiles colados a base de cereales, avena, harina, semola, polenta, pasta, galletas, crackers, barritas energeticas; productos vegetales, por ejemplo, pures, alimentos infantiles colados a base de vegetales, verduras escabechadas que incluyen pepinos, calabaza, zanahorias, judfas, pimientos, o alinos; productos de frutas, por ejemplo alimentos infantiles colados a base de fruta, productos de tomate, pures, salsas, pastas, salsa de tomate, pures de fruta; o productos a base de protemas, por ejemplo, legumbres, salchichas, carnes curadas, perritos calientes, o carnes trituradas. En algunas realizaciones el alimento fermentado se puede combinar con alimentos para mascotas o comidas para animales.
En algunas realizaciones, las composiciones pueden incluir fermentos de L. paracasei CBA L74, a partir de los cuales se han eliminado todas o sustancialmente todas las celulas de L. paracasei CBA L74. Los metodos para separar las celulas del medio de crecimiento son bien conocidos en la tecnica y pueden depender de metodos ffsicos, por ejemplo, centrifugacion para producir un sedimento celular y un sobrenadante de cultivo, filtracion, ultrafiltracion, filtracion de flujo tangencial, filtracion de flujo normal u osmosis inversa. Alternativamente o de forma adicional, el metodo de separacion se puede basar en el ligando e incluye, por ejemplo, un anticuerpo que se une espedficamente a L. paracasei CBA L74. El anticuerpo se puede unir a un soporte solido, tal como una perla magnetica.
Aislado de L. paracasei CBA L74
En algunas realizaciones, las composiciones de la invencion incluyen L. paracasei CBA L74 que se afsla parcial o sustancialmente del medio en las que crecen. El L. paracasei CBA l74 puede estar vivo o no replicarse, por ejemplo, inactivado, por ejemplo, mediante tratamiento por calor. Las celulas se pueden liofilizar o secarse mediante congelacion bajo condiciones que preservan la viabilidad celular. Los metodos de liofilizacion son bien conocidos en la tecnica.
Vehculos fisiologicos
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En algunas realizaciones, las composiciones de la invencion pueden incluir L. paracasei CBA L74 aislada en combinacion con un vetnculo aceptable fisiologicamente. El L. paracasei CBA L74 puede estar vivo o no replicarse, por ejemplo, inactivado, por ejemplo, mediante tratamiento con calor. La dosis puede variar, pero puede oscilar del equivalente de aproximadamente 102 a aproximadamente 1012 ufc/g, por ejemplo, 1 x102 ufc/g, 5 x102 ufc/g, 1 x103 ufc/g, 5 x103 ufc/g, 1 x104 ufc/g, 5 x104 ufc/g, 1 x105 ufc/g, 5 x105 ufc/g, 1 x106 ufc/g, 5 x106 ufc/g, 1 x107 ufc/g, 5 x107 ufc/g, 1 x108 ufc/g, 5 x108 ufc/g, 1 x109 ufc/g, 5 x109 ufc/g, 1 x1010 ufc/g, 5 x1010 ufc/g, 1 x1011 ufc/g, 5 x1011 ufc/g, 1 x1012 ufc/g en peso seco.
El vetuculo aceptable fisiologicamente puede ser un alimento o un producto alimentario. El L. paracasei CBA L74 se puede anadir a un alimento o producto alimentario antes de su envasado o procesamiento. Alternativamente o de forma adicional, el L. paracasei CBA L74 aislado se puede anadir a un alimento o producto alimentario antes de su consumo. Por ejemplo, el L. paracasei CBA L74 aislado se puede combinar con cualquiera de los alimentos o de los productos alimentarios descritos anteriormente. El producto alimentario puede ser un producto alimentario fermentado o un producto alimentario no fermentado. Por ejemplo, el L. paracasei CBA L74 aislado se puede anadir a un producto lacteo o de cereal no fermentado. En algunas realizaciones, el L. paracasei CBA L74 se puede anadir a un alimento o producto alimentario para incluir el equivalente de aproximadamente 107 a aproximadamente 1012 ufc/g, por ejemplo, aproximadamente 5 x107 ufc/g, aproximadamente 1 x108 ufc/g, aproximadamente 5 x108 ufc/g, aproximadamente 1 x109 ufc/g, aproximadamente 5 x109 ufc/g, aproximadamente 1 x1010 ufc/g, aproximadamente 5 x1010 ufc/g, aproximadamente 1 x1011 ufc/g, aproximadamente 5 x1011 ufc/g en peso seco.
Vehculos farmaceuticos
Las composiciones incluyen tambien un vehfculo aceptable farmaceuticamente. Nosotros empleamos los terminos “aceptable farmaceuticamente” (o “aceptable farmacologicamente”) para referirnos a entidades moleculares y a composiciones que no producen un efecto adverso, alergia u otra reaccion perjudicial cuando se administra a un animal o a un ser humano, segun sea apropiado. El termino “vetuculo aceptable farmaceuticamente”, como se emplea en la presente memoria, incluye a cualquier y todos los disolventes, medio de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos, isotonicos y agentes que retrasan la absorcion, tampones, excipientes, aglutinantes, lubricantes, geles, tensioactivos y similares, que se pueden emplear como medio para una sustancia aceptable farmaceuticamente.
Esta invencion incluye tambien composiciones farmaceuticas que contienen, como el ingrediente activo, el L. paracasei CBA L74 descrito en la presente memoria, en combinacion con uno o mas vehfculos aceptables farmaceuticamente. En algunas realizaciones, el L. paracasei CBA L74 se puede esterilizar empleando tecnicas de esterilizacion convencional antes o despues de que se combine con el vetuculo aceptable farmaceuticamente. En la fabricacion de las composiciones de la invencion, el L. paracasei CBA L74 se mezcla normalmente con un excipiente, diluido mediante un excipiente o encerrado dentro de dicho vetuculo en forma de, por ejemplo, una capsula, comprimido, sobre, papelillo, u otro envase. Cuando el excipiente sirve como diluyente, puede ser un material solido, semisolido, o lfquido (por ejemplo, solucion salina normal), que actua como un vetuculo, transportador o medio para el ingrediente activo. Por tanto, las composiciones pueden estar en forma de comprimidos, pfldoras, polvos, pastillas, sobres, papelillos, elixires, suspensiones, emulsiones, disoluciones, jarabes, aerosoles (como un solido o en un medio lfquido), pomadas, capsulas de gelatina blanda y dura, supositorios, disoluciones inyectables esteriles, y polvos envasados esteriles. Como se conoce en la tecnica, el tipo de diluyente puede variar dependiendo de la ruta de administracion prevista. Las composiciones resultantes pueden incluir agentes adicionales, tales como conservadores. El excipiente o vetuculo se selecciona en base al modo y la via de administracion. Vetuculos farmaceuticos adecuados, asf como las necesidades farmaceuticas para el uso en las formulaciones farmaceuticas, se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin), un texto de referencia bien conocido en este campo, y en la USP/NF (Farmacopea y Formulario Nacional de los Estados Unidos). Algunos ejemplos de excipientes adecuados incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma de acacia, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabe, y metilcelulosa. Las formulaciones pueden incluir adicionalmente: agentes lubricantes tales como talco, estearato de magnesio, y aceite mineral; agentes humectantes; agentes emulsionantes y agentes de suspension; agentes conservadores, tales como metilbenzoatos y propilhidroxibenzoatos; agentes edulcorantes; y agentes saborizantes. Las composiciones farmaceuticas se pueden formular para que proporcionen una liberacion rapida, sostenida o retardada del ingrediente activo despues de la administracion al paciente mediante el empleo de procedimientos conocidos en la tecnica.
Composiciones aceptables farmaceuticamente para emplear en los presentes metodos, incluyendo a aquellas en las que L. paracasei CBA L74 esta atrapado en un coloide para su administracion oral, se pueden preparar segun tecnicas estandar. El L. paracasei CBA L74 se puede secar y compactar mediante trituracion o pulverizacion e insertandolo en una capsula para administracion oral. En algunas realizaciones, el L. paracasei CBA L74 se puede combinar con uno o mas excipientes, por ejemplo, un disgregante, un rellenador, un deslizante, o un conservador. Capsulas adecuadas incluyen tanto capsulas de capa dura como a capsulas de capa blanda. Para formar la capsula se puede emplear cualquier coloide de base lipfdica o de base polimerica. Ejemplos de polfmeros utiles para preparaciones coloidales incluyen gelatina, polisacaridos vegetales o sus derivados, tal como carragenatos y formas modificadas de almidon y celulosa, por ejemplo, hypromelosa. Opcionalmente, se pueden anadir otros ingredientes a la disolucion del agente gelificante, por ejemplo, plastificantes, tales como glicerina y/o sorbitol para disminuir la
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dureza de la capsula, agentes colorantes, conservadores, disgregantes, lubricantes y tratamiento de superficie. En algunas realizaciones, la capsula no incluye gelatina. En otras realizaciones, la capsula no incluye polisacaridos vegetales o sus derivados.
Independientemente de su fuente original o de la manera en la que se obtengan, el L. paracasei CBA L74 de la invencion se puede formular de acuerdo con su uso. Estas composiciones se pueden preparar en una manera bien conocida en la tecnica farmacetica, y se pueden administrar mediante una variedad de vfas, dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistemico en el area a tratar. La administracion puede ser oral o topica (incluyendo la oftalmica y las membranas de mucosas que incluyen la administracion intranasal, vaginal y rectal). En algunas realizaciones, la administracion puede ser pulmonar (por ejemplo, mediante inhalacion o insuflacion de polvos o aerosoles, que incluyen nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidermica y transdermica) u ocular. Metodos para la administracion ocular pueden incluir la administracion topica (gotas oculares), inyeccion subconjuntival, periocular o intravitreal o la introduccion mediante un cateter con globo o insertos oftalmicos colocados quirurgicamente en el saco conjuntival. La administracion parenteral incluye la inyeccion o infusion intravenosa, intraarterial, subcutanea, intraperitoneal o intramuscular; o intracraneal, por ejemplo, la administracion intratecal o intraventricular. La administracion parenteral puede estar en forma de una dosis en bolo unica, o puede ser, por ejemplo, mediante una bomba de perfusion continua. Composiciones farmaceuticas y formulaciones para administracion topica pueden incluir parches transdermicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizadores, lfquidos, polvos, y similares. Pueden ser deseables o necesarios vehfculos farmaceuticos convencionales acuosos, en polvo o bases oleosas, espesantes y similares.
Las composiciones se pueden formular en forma de dosis unitaria, conteniendo cada dosis, por ejemplo, de aproximadamente 0,005 mg a aproximadamente 2000 mg de L. paracasei CBA L74 por dosis diaria. El termino “formas de dosis unitaria” se refiere a unidades discretas ffsicamente adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y otros mairnferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada del material activo calculado para producir el efecto terapeutico deseado, en asociacion con un excipiente farmaceutico adecuado. Para preparar composiciones solidas, tal como comprimidos, el ingrediente activo principal se mezcla con un excipiente farmaceutico para formar una composicion de preformulacion solida que contiene una mezcla homogenea de un compuesto de la presente invencion. Cuando se refiere a estas composiciones de preformulacion como homogeneas, el ingrediente activo normalmente se dispersa uniformemente a traves de la composicion para que la composicion se pueda subdividir facilmente en formas de dosificacion unitarias igualmente eficaces, tal como comprimidos, pfldoras y capsulas. Esta preformulacion solida se subdivide despues en formas de dosificacion unitarias del tipo descrito anteriormente que contienen de, por ejemplo, 0,005 mg a aproximadamente 1000 mg de L. paracasei CBA L74 de la presente invencion.
Las composiciones se pueden formular en una forma de dosificacion unitaria, conteniendo cada dosis, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 40 mg,

de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 10 mg,

de aproximadamente 0,2 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 0,3 mg a aproximadamente 15 mg,
de aproximadamente 0,4 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 1 mg; de

aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 50 mg, de

aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 20 mg, de

aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 5 mg; de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 30 mg, de

aproximadamente 1 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 10 mg, de

aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg; de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 50 mg, de

aproximadamente 5 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 10 mg, de

aproximadamente 10 mg a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 200 mg, de

aproximadamente 30 mg a aproximadamente 150 mg, de aproximadamente 40 mg a aproximadamente 100 mg, de
aproximadamente 50 mg a aproximadamente 100 mg del ingrediente activo.
En algunas realizaciones, los comprimidos o pfldoras de la presente invencion se pueden recubrir o componer de otra manera para proporcionar una forma de dosificacion que permita la ventaja de la accion prolongada. Por ejemplo, el comprimido o pfldora puede comprender una dosis interna y un componente de dosis externa, estando el ultimo en forma de envoltorio sobre el primero. Los dos componentes se pueden separar mediante una capa enterica que sirve para resistir a la disgregacion en el estomago, y que permite al componente interno pasar intacto al duodeno o retrasarse en la liberacion. Se pueden emplear para dichas capas o recubrimientos entericos una variedad de materiales, tales materiales incluyen un numero de acidos polimericos y mezclas de acidos polimericos con tales materiales como goma laca, alcohol cetflico, y acetato de celulosa.
Las formas lfquidas en las que se pueden incorporar las composiciones de la presente invencion para la administracion oral o mediante inyeccion incluyen disoluciones acuosas, jarabes saborizados adecuadamente, suspensiones acuosas y oleosas, y emulsiones saborizadas con aceites comestibles, tal como aceite de algodon, aceite de sesamo, aceite de coco, o aceite de cacahuete, asf como elixires y vefuculos farmaceuticos similares.
La proporcion o concentracion de las composiciones de la invencion en una composicion farmaceutica puede variar dependiendo de un numero de factores que incluyen la dosis, caractensticas qmmicas (por ejemplo, hidrofobicidad),
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y la via de administracion. Por ejemplo, el L. paracasei CBA L74 de la invencion se puede proporcionar en una capsula que contiene de aproximadamente 0,005 mg gramo a aproximadamente 1000 mg para admimstracion oral. Alternativamente o de forma adicional, la dosis se puede expresar como ufc/g en peso seco. La dosis puede variar, pero puede oscilar del equivalente de aproximadamente 102 a aproximadamente 1012 ufc/g, por ejemplo, 1 x102 ufc/g, 5 x102 ufc/g, 1 x103 ufc/g, 5 x103 ufc/g, 1 x104 ufc/g, 5 x104 ufc/g, 1 x105 ufc/g, 5 x105 ufc/g, 1 x106 ufc/g, 5 x106 ufc/g, 1 x107 ufc/g, 5 x107 ufc/g, 1 x108 ufc/g, 5 x108 ufc/g, 1 x109 ufc/g, 5 x109 ufc/g, 1 x1010 ufc/g, 5 x1010 ufc/g, 1 x1011 ufc/g, 5 x1011 ufc/g, 1 x1012 ufc/g en peso seco.
Metodos de uso
Las composiciones descritas en la presente memoria son normalmente utiles de diferentes maneras para la estimulacion de una respuesta inmunomoduladora en el sistema inmunologico de las mucosas. Los sujetos para los que es beneficiosa tal estimulacion incluyen a aquellos que tienen un sistema inmunologico de las mucosas deficitario, por ejemplo, aquellos que tienen un sistema inmunologico inmaduro, tal como lactantes o ninos pequenos, aquellos que tienen un sistema inmunologico deprimido, tal como los ancianos, pacientes que toman farmacos inmunosupresores, radiacion o quimioterapia, aquellos que tienen un sistema inmunologico hiperactivado debido a alergias o trastornos autoinmunes y aquellos que padecen de trastornos gastrointestinales. Los trastornos gastrointestinales pueden incluir infecciones debido a virus, por ejemplo, rotavirus; bacterias patogenicas, por ejemplo, Salmonella, Yersinia, Shigella, Listeria, Clostridium, E. coli, E. sakazaki, H. pylori; o protozoos patogenicos, por ejemplo, Entamoeba histolytica, Cryptosporidium spp, Campylobacter spp. Los trastornos gastrointestinales tambien pueden incluir, por ejemplo, alergias alimentarias, hipersensibilidad alimentaria, smdrome del intestino irritable, enfermedad intestinal inflamatoria, pouchitis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad celfaca, enterocolitis necrotizante, y envejecimiento, en particular el envejecimiento del sistema gastrointestinal.
Un sujeto se trata eficazmente siempre que se genere un resultado beneficioso clmicamente. Esto puede significar, por ejemplo, una resolucion completa de los smtomas asociados con un sistema inmunologico de las mucosas deficitario, un descenso en la gravedad de los smtomas asociados con un sistema inmunologico de las mucosas deficitario, o un enlentecimiento de la progresion de los smtomas asociados con un sistema inmunologico de las mucosas deficitario. Estos metodos pueden incluir ademas las etapas de a) identificar a un sujeto (por ejemplo, un paciente y, mas espedficamente, un paciente humano) que tiene un sistema inmunologico de las mucosas deficitario; y b) proporcionar al sujeto una composicion que comprende L. paracasei CBA L74 descrito en la presente memoria, tal como cualquier producto alimentario fermentado o composicion que comprende L. paracasei CBA L74 en un vehmulo aceptable fisiologicamente. Se considera una cantidad eficaz terapeuticamente a una cantidad de tal composicion proporcionada al sujeto que da como resultado una resolucion completa de los smtomas asociados con un sistema inmunologico de las mucosas deficitario, un descenso en la gravedad de los smtomas asociados con un sistema inmunologico de las mucosas deficitario, o un enlentecimiento de la progresion de los smtomas con el sistema inmunologico de las mucosas deficitario. Los presentes metodos pueden incluir tambien una etapa de monitorizacion para ayudar a optimizar la dosis y la programacion, asf como predecir los resultados.
Los metodos descritos en la presente memoria se pueden aplicar a una amplia variedad de especies, por ejemplo, a seres humanos, a primates no humanos (por ejemplo, monos), caballos, cerdos, vacas u otro ganado, perros, gatos u otros mairnferos utilizados como mascotas, ratas, ratones, u otros animales de laboratorio. Las composiciones descritas en la presente memoria son utiles en composiciones y regfmenes terapeuticos o para la fabricacion de un medicamento para el uso en el tratamiento de condiciones como las que se describen en la presente memoria (por ejemplo, un sistema inmunologico de las mucosas deficitario debido a inmadurez, envejecimiento, infeccion, alergias alimentarias, un trastorno inflamatorio o autoinmune).
Las composiciones nutricionales descritas en la presente memoria se pueden administrar oralmente como parte de la dieta diaria normal de un sujeto. Las composiciones alimentarias se pueden administrar como soporte nutricional tanto a ninos como a adultos. Cuando las composiciones se formulan como composiciones farmaceuticas se pueden administrar a cualquier parte del cuerpo del hospedador para su posterior reparto a una celula diana. Una composicion se puede suministrar a, sin limitacion, el cerebro, el fluido cerebroespinal, articulaciones, mucosa nasal, sangre, pulmones, intestinos, tejidos musculares, piel, o a la cavidad peritoneal de un marnffero. En terminos de vfas de suministro, una composicion se puede administrar por inyeccion intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, intramuscular, subcutanea, intramuscular, intrarrectal, intravaginal, intratecal, intratraqueal, intradermica, o transdermica, por administracion oral o nasal, o por perfusion gradual a lo largo del tiempo. En un ejemplo adicional, se puede proporcionar a un hospedador una preparacion en aerosol mediante inhalacion.
Independientemente de si las composiciones se formulan como productos alimentarios o como productos farmaceuticos, la dosis requerida dependera de la via de administracion, de la naturaleza de la formulacion, de la naturaleza de la condicion del sujeto, por ejemplo, inmadurez del sistema inmunologico o un trastorno gastrointestinal, el tamano del sujeto, peso, area superficial, edad, y sexo, otros farmacos administrados, y el criterio de los medicos que lo atienden. Dosis adecuadas estan en el intervalo de 0,01-1.000 mg/kg. Algunas dosis tfpicas oscilan de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 1 g/kg de peso corporal por dfa. En algunas realizaciones, el intervalo de la dosis es de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por dfa. En algunas realizaciones, la dosis puede ser, por ejemplo, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg o 100 mg/kg. La dosis probablemente dependa de tales variables como del tipo y de la extension de la progresion de
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la enfermedad o trastorno, el estado de salud general del paciente en particular, de la eficacia biologica relativa del compuesto seleccionado, la formulacion del excipiente, y de su via de administracion.
Se pueden extrapolar dosis eficaces a partir de las curvas de dosis-respuesta derivadas de los sistemas de ensayo in vitro o de modelos animales. Por ejemplo, analisis in vitro de produccion de citoquina mediante celulas mononucleares sangumeas perifericas (PBMCs) pueden ser utiles para ensayar respuestas pro- y anti-inflamatorias, por ejemplo, secrecion de IL-1p, IL-12, IL-4, TNF-a, o IL-10 respectivamente. Las composiciones se pueden analizar tambien por los efectos en modelos animales, por ejemplo, la produccion de IgA, la produccion de citoquinas mediante explantes de placas de Peyer, y las respuestas de celulas dendnticas y de celulas T.
En vista de la variedad de dianas celulares y de las diferentes eficacias de las distintas vfas de administracion, cabe esperar variaciones amplias en la dosis necesaria. Las variaciones de estos niveles de dosificacion se pueden ajustar empleando procedimientos empmcos estandar para la optimizacion, asf como es bien conocido en la tecnica. Las administraciones pueden ser unicas o multiples (por ejemplo, 2- o 3-, 4-, 6-, 8-, 10-, 20-, 50-, 100-, 150-, o mas veces). La encapsulacion de los compuestos en un vehfculo de suministro adecuado (por ejemplo, micropartfculas polimericas o dispositivos implantables) pueden aumentar la eficacia del reparto.
La duracion del tratamiento con cualquier composicion proporcionada en la presente memoria puede ser de cualquier magnitud de tiempo desde apenas un dfa hasta durante toda la vida del hospedar (por ejemplo, muchos anos). Por ejemplo, una composicion se puede administrar una vez a la semana (durante, por ejemplo, 4 semanas a muchos meses o anos); una vez al mes (por ejemplo, de tres a doce meses o durante muchos anos); o una vez al ano durante un periodo de 5 anos, diez anos, o mas. Cabe destacar tambien que la frecuencia del tratamiento puede ser variable. Por ejemplo, las presentes composiciones se pueden administrar una vez (o dos veces tres veces, etc) a diario, semanalmente, al mes, o al ano. Cuando las composiciones se formulan como productos alimentarios, por ejemplo, las composiciones se pueden administrar a diario en cada comida.
Para determinar si se induce una respuesta particular se puede emplear cualquiera de los metodos conocidos por los expertos en la tecnica. Se puede emplear metodos clmicos que pueden valorar el grado de un estado de enfermedad en particular para determinar si se induce una respuesta. Por ejemplo, un sujeto se puede monitorear por el alivio sintomatico, por ejemplo, alivio de colico, diarrea, estrenimiento, nauseas, vomitos, dolor abdominal, calambres, acidez, distension abdominal, flatulencia, o incontinencia. Alternativamente o de forma adicional, se pueden emplear marcadores sericos, tecnicas de imagenes, por ejemplo, metodos de ultrasonido, rayos-x, y endoscopicos.
Las composiciones se pueden administrar tambien junto con otras modalidades terapeuticas. Las otras modalidades terapeuticas variaran segun el trastorno en particular, pero pueden incluir, por ejemplo, medicamentos anti- diarreicos, anti-emeticos, agentes anti-colinergicos, agentes anti-inflamatorios, antibioticos, anti-histammicos y otros tratamientos dieteticos, por ejemplo, formulas infantiles hipoalergenicas. La administracion simultanea de dos o mas agentes terapeuticos no requiere que los agentes se administren a la vez o mediante la misma via, siempre y cuando haya un solapamiento en el periodo de tiempo durante el que los agentes estan ejerciendo su efecto terapeutico. Se contempla una administracion simultanea o secuencial, como una administracion en diferentes dfas o semanas.
Fabricacion de articulos
Las composiciones descritas en la presente memoria se pueden ensamblar tambien en kits, junto con las instrucciones de uso. Por consiguiente, estan tambien dentro del alcance de la invencion productos envasados (por ejemplo, envases que contienen uno o mas composiciones de L. paracasei CBA L74 descritas en la presente memoria y envasados para el almacenamiento, transporte o venta en concentrados o concentraciones listas para usar) y kits, que incluyen al menos un compuesto de la invencion y las instrucciones de uso. En cualquiera de los productos envasados o kits, las composiciones de L. paracasei cBa L74 pueden incluir L. paracasei CBA L74 no replicativo. Por ejemplo, los kits pueden incluir determinadas cantidades de una composicion nutricional que incluye uno o mas productos alimentarios fermentados con L. paracasei CBA L74. Las instrucciones de uso se pueden comunicar mediante cualquier medio adecuado. Por ejemplo, se pueden imprimir en un papel impreso en uno o mas lenguajes o facilitarse de forma audible o visual (por ejemplo, en un disco compacto). Los materiales de envasado pueden incluir materiales de envasado, por ejemplo, viales, sobres, envases. En algunas realizaciones, los kits pueden incluir determinadas cantidades de una composicion que comprende L. paracasei CBA L74 en un vetuculo aceptable fisiologicamente junto con materiales de envasado y las instrucciones de uso en cualquiera de los formatos descritos anteriormente. En algunas realizaciones, los kits pueden incluir envases que contienen uno o mas composiciones de L. paracasei CBA L74, por ejemplo L. paracasei CBA L74 y un vetuculo farmaceutico, y uno o mas de un estabilizador adecuado, molecula transportadora, saborizante, y/o similares, segun sea apropiado para el uso previsto. Un producto puede incluir un envase (por ejemplo, un vial, frasco, botella, bolsa, o similar) que contiene uno o mas composiciones de L. paracasei CBA l74. Ademas, la fabricacion de un artfculo puede incluir de forma adicional, por ejemplo, materiales de envasado, instrucciones de uso, jeringas, tampones u otros reactivos control para tratar o monitorear la condicion para la que se requiere la profilaxis o tratamiento. El producto puede incluir tambien una leyenda (por ejemplo, una etiqueta o prospecto impreso u otro medio que describa el uso del producto (por ejemplo, un audio o cinta de video)). La leyenda se puede asociar con el envase (por ejemplo, pegada al
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envase) y puede describir la manera en la que se debera administrar el producto (por ejemplo, la frecuencia y la via de administracion), indicaciones correspondientes, y otros usos. Los componentes del kit pueden ser adecuados para su uso inmediato. Los compuestos pueden ser faciles para la administracion (por ejemplo, presentarse en unidades adecuadas de dosis), y pueden incluir un adyuvante aceptable farmaceuticamente, vehfculo u otro diluyente y/o un agente terapeutico adicional. La invencion comprende kits que, sin embargo, incluyen formulaciones concentradas y/o materiales que pueden requerir dilucion antes de su uso. Alternativamente, los compuestos se pueden proporcionar en una forma concentrada con un diluyente e instrucciones para la dilucion. Los componentes del kit pueden ser adecuados para su uso inmediato. La invencion comprende kits que, sin embargo, incluyen formulaciones concentradas y/o materiales que pueden requerir la dilucion antes de su uso.
La invencion se describira a continuacion por medio de las siguientes clausulas preferidas:
1. Una composicion que comprende un producto alimentario fermentado, en donde el producto alimentario se ha fermentado mediante la bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778.
2. La composicion de la clausula 1, en donde el producto alimentario es un producto lacteo o un producto de cereal.
3. La composicion de la clausula 2, en donde el producto lacteo es leche, yogurt, cuajada, queso o una formula infantil.
4. La composicion de la clausula 2, en donde el producto de cereal es arroz, trigo, avena, cebada, mafz, sorgo, mijo, o triticale.
5. La composicion de cualquiera de las clausulas 1-4, en donde el producto alimentario esta seco.
6. La composicion de cualquiera de las clausulas 1-5, en donde el producto seco esta rehidratado.
7. La composicion de la clausula 6, en donde el producto alimentario seco rehidratado es inmunomodulador.
8. La composicion de cualquiera de las clausulas 1-7, en donde la bacteria probiotica es no replicativa.
9. La composicion de cualquiera de las clausulas 1-8, en donde el producto alimentario comprende de aproximadamente 1x102 ufc/g a aproximadamente 1012 ufc de bacteria probiotica por gramo en peso seco.
10. Una composicion que comprende la bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778 y un vetuculo aceptable fisiologicamente.
11. La composicion de la clausula 10, en donde el vehfculo aceptable fisiologicamente es un producto alimentario.
12. La composicion de la clausula 11, en donde el producto alimentario es un producto lacteo o un producto de cereal.
13. La composicion de la clausula 12, en donde el producto lacteo es leche, yogurt, cuajada, queso o una formula infantil.
14. La composicion de la clausula 12, en donde el producto de cereal es arroz, trigo, avena, cebada, mafz, sorgo, mijo, o triticale.
15. La composicion de cualquiera de las clausulas 10-14, en donde el producto alimentario esta seco.
16. La composicion de cualquiera de las clausulas 10-15, en donde el producto seco esta rehidratado.
17. La composicion de la clausula 16, en donde el producto alimentario rehidratado es inmunomodulador.
18. La composicion de cualquiera de las clausulas 10-17, en donde la bacteria probiotica es no replicativa.
19. La composicion de cualquiera de las clausulas 10-18, en donde el producto alimentario comprende de aproximadamente 1x102 ufc/g a aproximadamente 1012 ufc de bacteria probiotica por gramo en peso seco.
20. La composicion de la clausula 10, en donde el vetuculo aceptable fisiologicamente es un vetuculo aceptable farmaceuticamente.
21. La composicion de la clausula 20, en donde el vehfculo aceptable farmaceuticamente comprende un coloide de base lipfdica o de base polimerica.
22. La composicion de la clausula 21, en donde el coloide es un liposoma, un hidrogel, una micropartfcula, una nanopartfcula o una micela copolfmera en bloque.
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23. La composicion de la clausula 21, en donde el coloide de base polimerica es una capsula.
24. La composicion de cualquiera de las clausulas 20-23, en donde la bacteria probiotica es no replicativa.
25. La composicion de cualquiera de las clausulas 20-24, en donde la bacteria probiotica esta en una forma de dosificacion unitaria de aproximadamente 1x102 ufc/g a aproximadamente 1x1012 ufc/g en peso seco.
26. La composicion de cualquiera de las clausulas 20-25, en donde la composicion se formula para la administracion oral.
27. Un metodo para fabricar una composicion nutricional, comprendiendo el metodo:
a) proporcionar un producto alimentario;
b) combinar el producto alimentario con una cantidad eficaz de la bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778 y, opcionalmente, un co-inoculo, para formar una mezcla;
c) incubar la mezcla a una temperatura y durante un tiempo suficiente para que ocurra la fermentacion.
28. El metodo de la clausula 27, en donde el producto alimentario es un producto lacteo o un producto de cereal.
29. El metodo de la clausula 27 o 28, en donde la cantidad de la bacteria probiotica es de aproximadamente 1 x 106 ufc/ml a aproximadamente 5 x 106 ufc/ml.
30. El metodo de cualquiera de las clausulas 27-29, en donde el co-inoculo es Streptococcus thermophilus.
31. El metodo de la clausula 30 en donde la cantidad del co-inoculo es de aproximadamente 1 x 104 ufc/ml a aproximadamente 1 x 105 ufc/ml.
32. El metodo de cualquiera de las clausulas 27-31, en donde la etapa de incubacion continua hasta que el nivel de bacteria probiotica en la mezcla alcanza de aproximadamente 1 x 108 ufc/ml a aproximadamente 1 x 1010 ufc/ml.
33. El metodo de cualquiera de las clausulas 27-32, que comprende ademas secar la composicion nutricional.
34. El metodo de la clausula 33, en donde la etapa de secado es secado por atomizacion.
35. El metodo de cualquiera de las clausulas 27-34, en donde la composicion nutricional se combina ademas con uno o mas productos alimentarios adicionales.
36. El metodo de la clausula 35, en donde el producto alimentario adicional comprende un producto lacteo, un producto de cereal, un producto basado en un vegetal, un producto basado en una fruta o un producto basado en una protema.
37. El metodo de la clausula 36, en donde el producto basado en una fruta comprende un producto de tomate.
38. Un metodo para modular el sistema inmunologico en un sujeto, comprendiendo el metodo:
a) identificar a un sujeto que necesita de la modulacion del sistema inmunologico;
b) administrar una cantidad eficaz de una composicion que comprende un producto alimentario en donde el producto alimentario se ha fermentado mediante la bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778.
39. El metodo de la clausula 38, en donde el producto alimentario comprende el producto alimentario de cualquiera de las clausulas 1-19.
40. El metodo de la clausula 38 o 39, en donde el sujeto es un nino humano.
41. Un metodo para tratar a un sujeto que corre el riesgo de desarrollar un trastorno gastrointestinal, comprendiendo el metodo:
a) identificar a un sujeto que corre el riesgo de tener un trastorno gastrointestinal;
b) administrar una cantidad eficaz de una composicion que comprende un producto alimentario en donde el producto alimentario se ha fermentado mediante la bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778.
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42. El metodo de la clausula 41, en donde el producto alimentario comprende el producto alimentario de cualquiera de las clausulas 1-19.
43. El metodo de la clausula 41, en donde el trastorno gastrointestinal es un sistema inmunologico de las mucosas deficitario, una alergia alimentaria, un trastorno asociado con diarrea, una infeccion bacteriana o viral, smdrome intestinal irritable, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, enfermedad ceKaca o enterocolitis necrotizante.
44. El metodo de la clausula 43, en donde el sistema inmunologico de las mucosas deficitario es un sistema inmunologico inmaduro.
45. El metodo de cualquiera de las clausulas 41-44, en donde el sujeto es un nino humano.
46. Un metodo para tratar un sujeto que tiene un trastorno gastrointestinal, comprendiendo el metodo:
a) identificar a un sujeto que tienen un trastorno gastrointestinal;
b) administrar una cantidad eficaz de una composicion que comprende un producto alimentario en donde el producto alimentario se ha fermentado mediante la bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778.
47. El metodo de la clausula 46, en donde el producto alimentario comprende el producto alimentario de cualquiera de las clausulas 1-19.
48. El metodo de la clausula 46, en donde el trastorno gastrointestinal es un sistema inmunologico de las mucosas deficitario, una alergia alimentaria, un trastorno asociado con diarrea, una infeccion bacteriana o viral, smdrome intestinal irritable, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, enfermedad celfaca o enterocolitis necrotizante.
49. El metodo de la clausula 48, en donde el sistema inmunologico de las mucosas deficitario es un sistema inmunologico inmaduro.
50. El metodo de cualquiera de las clausulas 46-49, en donde el sujeto es un nino humano.
51. Un metodo para tratar un sujeto que tiene un trastorno gastrointestinal, comprendiendo el metodo:
a) identificar a un sujeto que tienen un trastorno gastrointestinal;
b) administrar una cantidad eficaz de una composicion farmaceutica que comprende la bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778.
52. El metodo de la clausula 51, en donde la composicion farmaceutica comprende la composicion de cualquiera de las clausulas 20-26.
53. El metodo de la clausula 51, en donde el trastorno gastrointestinal es un sistema inmunologico de las mucosas deficitario, una alergia alimentaria, un trastorno asociado con diarrea, una infeccion bacteriana o viral, smdrome intestinal irritable, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, enfermedad celfaca o enterocolitis necrotizante.
54. El metodo de la clausula 53, en donde el sistema inmunologico de las mucosas deficitario es un sistema inmunologico inmaduro.
55. El metodo de cualquiera de las clausulas 51-54, en donde el sujeto es un nino humano.
56. El uso de la bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778 para la preparacion de un producto alimentario para el tratamiento de un trastorno gastrointestinal.
57. El uso de la clausula 56, en donde el producto alimentario comprende el producto alimentario de cualquiera de las clausulas 1-19.
58. El uso de las clausulas 56 o 57, en donde el trastorno gastrointestinal es un sistema inmunologico de las mucosas deficitario, una alergia alimentaria, un trastorno asociado con diarrea, una infeccion bacteriana o viral, smdrome intestinal irritable, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, enfermedad celfaca o enterocolitis necrotizante.
59. El uso de la clausula 58, en donde el sistema inmunologico de las mucosas deficitario es un sistema inmunologico inmaduro.
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60. El uso de cualquiera de las clausulas 56-59, en donde el sujeto es un nino humano.
61. El uso de la bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778 para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de un trastorno gastrointestinal.
62. El uso de la clausula 61, en donde la composicion farmaceutica comprende la composicion de cualquiera de las clausulas 20-26.
63. El uso de la clausula 61, en donde el trastorno gastrointestinal es un sistema inmunologico de las mucosas deficitario, una alergia alimentaria, un trastorno asociado con diarrea, una infeccion bacteriana o viral, smdrome intestinal irritable, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, enfermedad celfaca o enterocolitis necrotizante.
64. El uso de la clausula 63, en donde el sistema inmunologico de las mucosas deficitario es un sistema inmunologico inmaduro.
65. El uso de cualquiera de las clausulas 61-64, en donde el sujeto es un nino humano.
66. La composicion nutricional producida mediante el metodo de cualquiera de las clausulas 27-37.
67. Un kit que comprende una cantidad determinada de una composicion nutricional que comprende un producto alimentario fermentado, en donde el producto alimentario se ha fermentado mediante la bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778 y uno o mas artfculos seleccionados del grupo que consiste en un material de envasado, un prospecto que comprende instrucciones de uso, un fluido esteril, una jeringa y un envase esteril.
68. Un kit que comprende una cantidad determinada de una composicion farmaceutica que comprende Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778 y uno o mas artfculos seleccionados del grupo que consiste en material de envasado, un prospecto que comprende instrucciones de uso, un fluido esteril y un envase esteril.
Ejemplos
Ejemplo 1: Aislamiento y caracterizacion de L. paracasei CBA-174
Analizamos diferentes cepas de Lactobacilli por su capacidad de fermentar suspensiones acuosas que contienen diferentes concentraciones de harina de arroz o harina de trigo. L. paracasei CBA L74 se selecciono para el analisis adicional en base a sus valores de pH bajos y a los altos recuentos de UFC. Esta cepa se deposito bajo el Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Deposito de Microorganismos para los propositos del Procedimiento de Patente el 9 de Septiembre, 2008 en la Colecciones Coordinadas Belgas de Micro-organismos (BCCM) Laboratorio de Microbiologfa (LMG), Ghent, Belgica. El Numero de Acceso proporcionado por la Autoridad Depositaria Internacional es LMG P-24778.
Ejemplo 2: Preparacion de leche fermentada con L. paracasei CBA L74
Condiciones:
• Sustrato: leche en polvo desnatada reconstituida al 9%, dextrosa anadida al 0,25%
• Tratamiento del sustrato por calor: UHT - 135°C durante 3s o Fo equivalente
• Co-inoculo: 5 x 106 para Lactobacillus paracasei CBA-L74
5 x 104 para Streptococcus thermophilus (como iniciador de la fermentacion)
• Temperatura de fermentacion: 37°C
• Tiempo de fermentacion: 15 horas
• pH durante la fermentacion: sin ajustar
• Al final de la fermentacion el pH se ajusta a 6,5 con una disolucion de NaOH
• Secado por atomizacion con una temperatura de entrada de 190°C y una temperatura de salida de 90°C
• Analisis: Recuento de celulas en el fermentado para determinar Streptococcus thermophilus y Lactobacillus paracasei CBA-L74
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Revestimiento: se uso agar selectivo para Lactobacilli (LBS, de sus siglas en ingles) para la deteccion de Lactobacillus paracasei CBA-L74. Se uso agar L-M17 para los recuentos de Streptococcus thermophilus. Ambos se incubaron a 37°C de manera anaerobia. Se empleo el recuento en placa agar (PCA) para la deteccion de los contaminantes y se incubo a 30°C de manera aerobia.
Fermentacion: Se anadieron co-inoculos de L. paracasei CBA L74 y S. thermophilus 1773 como cultivos frescos. La fermentacion se llevo a cabo durante 15 horas, a una concentracion de 108 ufc/ml de L. paracasei CBA-L74. El pH inicial era de 6,6. Al final de la fermentacion el pH era 5,1. El pH se ajusto a 6,5 mediante la adicion de NaOH 2,5 N. La concentracion inicial de L. paracasei CBA-74 era 5 x106 ufc/ml; la concentracion final era de mas de 108 ufc/ml. La concentracion inicial de Streptococcus thermophilus era 5 x 104 ufc/ml; la concentracion final era 1 x 108 ufc/ml. El recuento total de bacterias inicial en PCA era 0 en la leche antes de la inoculacion y a T0 se contaban muy pocas colonias (TFTC, de sus siglas en ingles), despues de un penodo de fermentacion de 15 horas era 5 x 104 ufc/ml; la concentracion final era 1 x 108 ufc/ml.
Secado: El fermento se seco a un temperatura de entrada de 190°C y una temperatura de salida de 90°C. El contenido de humedad del polvo despues del secado por atomizacion era 4,87%.
Ejemplo 3: Preparacion de harina de avena y cebada fermentadas con L. paracasei CBA L74
Preparamos un litro de disolucion de harina de avena 18,5% (p/vol) + harina de cebada malteada 5% (p/p), empleando 185 g de harina de avena y 9,25 g de harina de cebada malteada. La mezcla de harina y agua se ajusto a pH 4,00 con acido cftrico 0,5 M. El fermentador se esterilizo por autoclave, despues se anadio al fermentador la mezcla de harina + agua + acido cftrico.
La mezcla se trato por calor a 80°C durante 30 minutos y despues se enfrio a 37°C. Se ensayaron tres grupos de condiciones de fermentacion diferentes. Todas la fermentaciones terminaron despues de 16 horas, un tiempo que coincidio con el fin de la fase logarftmica de crecimiento.
Ensayo 1: A la disolucion de cereal tratada con calor se anadio con L. paracasei CBA L74 a una concentracion final de 2,3 x 106 ufc/ml y se incubo con agitacion a 37°C. Despues de 16 horas el recuento en placa MRS era 7,6 x 108 ufc/ml (bacterias de acido lactico); los contaminantes medidos en PCA, MC y SB estaban por debajo de 1000 ufc/ml. El pH final era 3,8. Despues de 20 horas el recuento en placa MRS era 1,2 x 108 ufc/ml (bacterias de acido lactico); los contaminantes estaban ausentes. Despues de 24 horas el recuento en placa MRS era 5 x 108 ufc/ml (bacterias de acido lactico); los contaminantes estaban ausentes. Debido a que la fase logarftmica se detiene a las 16 horas, era preferible parar la fermentacion a las 16 horas.
Ensayo 2 (pH estabilizado): Esta fermentacion se llevo a cabo manteniendo el pH a 4 empleando NaOH 2N. Se anadio L. paracasei CBA L74 a la disolucion de cereal tratado por calor hasta una concentracion final de
2.1 x 106 ufc/ml y se incubo con agitacion a 37°C. Despues de 16 horas el recuento en placa MRS era 7,5 x
108 ufc/ml (bacterias de acido lactico); los contaminantes medidos en PCA, MC y SB estaban por debajo de 1000 ufc/ml.
Ensayo 3 (pH estabilizado): Esta fermentacion se llevo a cabo manteniendo el pH a 4 empleando NaOH 2N. Se anadio L. paracasei CBA L74 a la disolucion de cereal tratado por calor hasta una concentracion final de
5.1 x 106 ufc/ml y se incubo con agitacion a 37°C. Despues de 16 horas el recuento en placa MRS era 2,1 x
109 ufc/ml (bacterias de acido lactico); los contaminantes medidos en PCA, MC y SB estaban por debajo de 1000 ufc/ml.
Ejemplo 4: Preparacion de harina de arroz y trigo fermentadas con L. paracasei CBA L74
Preparamos un litro de disolucion de arroz 15% peso/volumen combinando 150 g de arroz y 900 ml de agua. La mezcla se preparo a temperatura ambiente y se mezclo mediante agitacion durante varios minutos a 1000-1300 rpm. La mezcla de arroz se trato mediante tindalizacion calentando la mezcla dentro del instrumento a 70°C, inanicion a 70°C durante 20-30 minutos, enfriando a 30-37°C, inanicion a 30-37°C durante 20-30 minutos, calentando a 70°C, inanicion a 70°C durante 20-30 minutos, enfriando a la temperatura de fermentacion (37°C) mientras se agita a 150-600 rpm.
A la muestra liofilizada se anadio L. paracasei CBA L74 hasta una concentracion final de 1 x 106 ufc/ml. La muestra liofilizada se resuspendio en agua y se incubo brevemente a 37°C para activar las bacterias. Despues de la inoculacion, la mezcla se homogeneizo mediante breve agitacion a 300-600 rpm; durante la fermentacion la disolucion se agito a 150 rpm. La fermentacion se llevo a cabo a 37°C durante 24 horas a una pO2 de < 15%. Se recogieron las aftcuotas en el momento de la inoculacion (T0), a las 16 horas (T16), 18 horas (T18), 21 horas (T21), y a las 24 horas (T24). Despues de la fermentacion, el cereal se calento a 50°C con mezclado continuo. El cereal calentado se seco por atomizacion despues a una Ta del aire de entrada de 80°C, y una Ta del aire de salida de 210°C. El contenido de humedad final era 6%.
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La muestras se analizaron en agar Rogosa (+ vancomicina 12 microgr/ml) (48 horas a 37°C), para la cuantificacion de L. paracasei CBA-174), en PCA para el total de aerobios (24 horas a 37°C), en agar McConkay para coliformes y agar RCM para clostridios.
Los resultados de esta fermentacion fueron como sigue:
Inoculo (L. paracasei CBA-174): 1x106 (± A log) UFC/ml (en el instrumento)
Concentracion de L. paracasei CBA L74 despues de 24 horas de fermentacion: 1 x 108 (± A log) UFC/ml
Contaminantes en PCA antes de la inoculacion: <104 UFC/ml
Contaminantes en agar McConkay antes de la inoculacion: <104 UFC/ml
Contaminantes en RCM antes de la inoculacion: <10 UFC/ml
Contaminantes en PCA despues de la inoculacion: <104 UFC/ml
Contaminantes en PCA 24 horas despues de la fermentacion: <104 UFC/ml
pH antes de la adicion del inoculo: 6 (± 0,20)
pH a las 16-18 horas: 3,70 (± 0,20)
pH a las 24 horas: 3,60 (± 0,20)
Ejemplo 5: Efectos de L. paracasei CBA L74 sobre celulas dendnticas en un sistema de co-cultivo con celulas Caco2
Analizamos el efecto de L. paracasei CBA L74 vivo no replicativo en un co-cultivo de celulas epiteliales intestinales (celulas Caco2) y de celulas dendnticas humanas (DCs). Las celulas Caco2 se sembraron en una membrana Transwell y despues de aproximadamente 3 semanas, cuando la resistencia tras- epitelial era adecuada, se suplementaron con L. paracasei CBA L74 durante 96 horas. Las DCs humanas se diferenciaron de los monocitos sangumeos perifericos y se sembraron en el compartimento basal de la camara de co-cultivo. La resistencia trans-epitelial permanecio constante durante el experimento.
Para caracterizar el fenotipo de DCs, monitoreamos la expresion superficial de celulas DC de moleculas co- estimuladoras (CD80 y CD86), MHC-II y moleculas de adhesion (CD40) mediante analisis citofluorimetrico. Para determinar el perfil de citoquinas producidas por las DCs co-cultivadas con celulas epiteliales intestinales expuestas a L. paracasei CBA L74, recogimos el medio de cultivo y cuantificamos IL-10 y IL- 12p70 mediante ELISA. Para verificar la capacidad de las celulas Caco2 expuestas a L. paracasei CBA L74 para condicionar a las DCs a promover la proliferacion de celulas T, realizamos analisis FACS (celulas activadas por fluorescencia, de sus siglas en ingles) y mezclamos cultivos de linfocitos.
Como se muestra en la Tabla en la Figura 1, la incubacion de celulas Caco2 durante 24 horas con L. paracasei CBA L74 vivo o inactivado (inactivacion termica) modifico el fenotipo de celulas dendnticas co- cultivadas. Ademas, la presencia de L. paracasei CBA L74 modulo los cambios mediados por LPS en el fenotipo de DC.
A continuacion cuantificamos las citoquinas liberadas a partir de celulas DC co-cultivadas con celulas Caco2 acondicionadas con L. paracasei (vivo o inactivado). Como muestra la Figura 2a, las celulas DCs co- cultivadas con Caco2 expuestas a L. paracasei CBA L74 vivo o inactivado, mostraron un incremento significativo estadfsticamente en la produccion de IL-10. No observamos un incremento significativo en la produccion de IL-12 en ausencia de LPS (Figura 2b). Sin embargo, las celulas DCs mantuvieron la capacidad para responder a cambios de LPS mediante la mejora en la produccion de IL-12, sugiriendo que la exposicion a L. paracasei CBA L74 no afectaba a la capacidad global de las celulas DCs para responder a los patogenos.
A continuacion realizamos un ensayo funcional para verificar la capacidad de las celulas DCs expuestas a celulas CaCo2 cultivadas en presencia de un medio o de un medio suplementado con L. paracasei para modular la capacidad de proliferar las celulas T despues de la reaccion de una mezcla de linfocitos. Como se muestra en la Figura 3, no observamos diferencias significativas en la capacidad de las celulas DC co- cultivadas con celulas CaCo2 para modificar la proliferacion de celulas T.
Tomados en conjunto, los datos in vitro indican que L. paracasei CBA L74 vivo o inactivado por calor, puede influir en el entorno generado por las celulas del epitelio intestinal que, a su vez, modula la actividad de otras celulas inmunologicas, tales como las celulas DC. El grafico en conjunto indica que las celulas DCs expuestas a las celulas Caco2 con medio acondicionado, reducen la expresion de marcadores de
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activacion, y producen citoquinas anti-inflamatorias como IL-10, mientras mantienen la capacidad de responder a LPS mediante la produccion mejorada de IL-12.
Ejemplo 6: Efectos de L. paracasei CBA L74 sobre la morfologfa, la expresion de citoquinas y la inmunidad innata de toda la mucosa intestinal
Examinamos los efectos in vivo mediante la administracion de L. paracasei CBA L74 (vivo e inactivado por calor) como un suplemento de la dieta en ratones. Despues de dos semanas de suplementacion, los animales se sacrificaron y se analizo toda la mucosa intestinal.
Morfologfa de la mucosa: Realizamos una tincion de hematoxilina y eosina en secciones del fleon embebidas en parafina. Ningun suplemento tuvo efectos significativos en la estructura intestinal o causo la infiltracion de celulas inflamatorias.
Expresion de citoquinas y de IgA: Determinamos si la administracion de L. paracasei CBA L74 (vivo o inactivado) afecto al nivel de citoquinas anti- y pro-inflamatorias en la mucosa intestinal. Como se muestra en la Figura 4, la administracion de L. paracasei CBA L74 vivo o inactivado, descendio significativamente el nivel de IL-1p, un potente mediador pro-inflamatorio, en la mucosa intestinal de los ratones. Como se muestra en la Figura 5, observamos tambien una reduccion en el nivel de IL-4 de la mucosa basal despues de la administracion de L. paracasei CBA L74 vivo o inactivado. Finalmente, determinamos el efecto de diferentes regfmenes de suplementacion sobre el nivel de IgA de la mucosa. Despues de dos semanas de suplementacion en la dieta con L. paracasei CBA L74, los animales se sacrificaron y se recogio y homogeneizo la mucosa intestinal. Se midio entonces mediante ELISA el total de IgA y los valores normalizados para las protemas de toda la mucosa. Como se muestra en la Figura 6, el L. paracasei CBA L74 inactivado por calor aumento significativamente la IgA de la mucosa.
Inmunidad innata: Analizamos el efecto de la suplementacion en la dieta sobre los niveles de receptores de tipo Toll, TLR, 2, 4, y 9. Estos receptores estan implicados en el reconocimiento de estructuras bacterianas conservadas y, por tanto, juegan un papel clave en la modulacion de la reactividad de celulas inmunologicas y celulas no inmunologicas hacia las estructuras microbianas conservadas. Como se muestra en la Figura 7, la suplementacion de la dieta con L. paracasei CBA L74 vivo o inactivado por calor, incremento los niveles de la expresion proteica de TLR2 y TLR4. Se ensayo tambien el efecto de la suplementacion en la dieta sobre los niveles de PPARy en la mucosa. Como se muestra en la Figura 8, L. paracasei CBA L74 aumento significativamente el nivel de PPARy.
Ejemplo 7: Efectos de L. paracasei CBA L74 en los niveles de citoquinas circulantes
Para analizar si los suplementos en la dieta eran capaces de modificar el nivel de citoquinas circulantes, medimos los efectos de la administracion en la dieta de la cepa (viva o inactivada) sobre el nivel de citoquinas anti- y pro-inflamatorias en el suero. Como se muestra en las Figuras 9a y 9b, L. paracasei CBA L74 vivo indujo un descenso significativo estadfsticamente en IL-1p y un incremento modesto en IL-4, respectivamente.
Ejemplo 8: Efectos de L. paracasei CBA L74 sobre la actividad de celulas dendnticas y de linfocitos T
A continuacion nos centramos en el impacto de la suplementacion de la dieta con L. paracasei CBA L74 sobre las celulas inmunologicas relevantes para la actividad del sistema inmunologico asociados con las mucosas, principalmente de celulas dendnticas y linfocitos. Evaluamos el fenotipo de las DCs dentro de las Placas de Peyer (PP), ya que estas celulas son fundamentales en establecer el destino de un antfgeno y contribuyen en el medio que determinara la naturaleza de la respuesta inmunologica adaptativa.
Como se muestra en la Tabla en la Figura 10, la suplementacion con L. paracasei CBA L74 (vivo o inactivado) descendio la expresion de la molecula co-estimuladora CD80 y la molecula de adhesion CD40 mientras que regulo al alza la expresion de MHCII. Estos datos sugieren que las DCs de los animales suplementados con L. paracasei CBA L74 paredan menos dispuestas a interaccionar con las celulas T y organizar una respuesta inmunologica pero se conservaba su capacidad para procesar y presentar antfgenos.
Despues determinamos la capacidad de la suplementacion en la dieta con L. paracasei CBA L74 para modificar la reactividad de DCs a estfmulos pro-inflamatorios (tal como LPS y CpG bacterianos). La exposicion de DCs de los ratones control a LPS o CpG indujo una potente regulacion al alza de CD80 en las DCs control. La suplementacion de DCs con L. paracasei CBA L74 inactivado por calor no modifico la reactividad a estfmulos inflamatorios. La suplementacion con bacterias vivas redujo significativamente la regulacion al alza de CD80 inducida por LPS y CpG.
Finalmente, investigamos si la suplementacion en la dieta con L. paracasei CBA L74 (vivo o inactivado) afectaba a la polarizacion de los linfocitos T intestinales (tanto CD4+ como CD8+) hacia un fenotipo Th1 o Th2. Para estos estudios, expusimos a las Placas de Peyer a PHA, un potente estfmulo no espedfico, y a
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continuacion se evaluo la polarizacion linfocitaria mediante tincion de intraquina para IL-4 y IFN-y. Como se muestra en la Figura 11a, en ausencia de PHA (la “condicion basal”) en linfocitos CD4+, IL-4 y iFn estaban casi en equilibrio. Aproximadamente 10-12% de las celulas eran positivas para estas citoquinas. Como se muestra en la Figura 11b, para linfocitos CD8+ en la condicion basal, habfa un ligero predominio de celulas que expresan IL-4 sobre las que expresan IFN. La exposicion de linfocitos tanto CD4+ como CD8+ a PHA causo un potente incremento en la tincion intracelular para IL-4 y IFN-y con tendencia hacia la produccion de IFN-y.
En celulas CD4+, la suplementacion en la dieta con L. paracasei CBA L74 vivo incremento los niveles de IFN-y en la condicion basal. Despues de la exposicion a PHA no habfan diferencias significativas en la respuesta entre los grupos suplementados (Figura 11a). En linfocitos CD8+, la suplementacion oral con L. paracasei CBA L74 inactivado favorecio un perfil Th2 con una estimulacion de la produccion de IL-4 sobre la produccion de IFN-y (Figura 11b). El perfil anti-inflamatorio se corrobora ademas por la respuesta suavizada a PHA. Era tambien evidente una tendencia similar aunque menos pronunciada, en linfocitos CD8+ aislados a partir de ratones suplementados con L. paracasei CBA-L74 vivo.
Ejemplo 9: Efecto de leche fermentada por L. paracasei CBA L74 sobre marcadores del sistema inmunologico en la mucosa intestinal
Los ratones se suplementaron dos veces al dfa durante dos semanas bien con: 1) Control (PBS); 2) Leche desnatada (no fermentada); 3) Leche desnatada fermentada con L. paracasei CBA L74 (1x108 ufc/ml); 4) Leche desnatada fermentada con S. thermophilus (6,7x106 ufc/ml); 5) Leche desnatada fermentada con L. paracasei CBA L74 (1x108 ufc/ml) y S. thermophilus (1,18x1o7 ufc/ml); 6) Leche desnatada fermentada con L. paracasei CBA L74 (1,9x109 ufc/ml) y S. thermophilus (2,2x108 ufc/ml). Al finalizar el tratamiento los animales se sacrificaron y se recogio la mucosa intestinal y las Placas de Peyer, y se procesaron para el analisis como se describe a continuacion.
Niveles de citoquinas en la mucosa intestinal. Como se muestra en la Figura 12, la suplementacion con leche desnatada fermentada con L. paracasei CBA L74 causo un incremento significativo en los niveles de IL-10 en la mucosa intestinal. La administracion de leche desnatada fermentada con S. thermophilus indujo una ligera reduccion en comparacion con los controles. La administracion de leche desnatada con ambas cepas a dosis altas indujo un incremento de 2,1 veces en IL-10 en la mucosa. Ninguno de los tratamientos tuvo un efecto significativo en IL-1p de la mucosa aunque la suplementacion con leche desnatada fermentada con L. paracasei CBA L74 causo un ligero incremento en los niveles de la mucosa de esta citoquina.
Actividad mieloperoxidasa en la mucosa intestinal. Se ensayo la actividad de la mieloperoxidasa (MPO) en homogeneizados de la mucosa intestinal. La administracion de leche fermentada o no fermentada con diferentes bacterias no indujo a diferencias significativas estadfsticamente en la actividad de la mieloperoxidasa, aunque habfa un ligero incremento en la actividad MPO observada en la mucosa de animales que recibieron leche no fermentada.
Niveles de IgA en la mucosa intestinal. Como se muestra en la Figura 14, la suplementacion con leche desnatada no fermentada causo un incremento significativo en la IgA de la mucosa intestinal. Este incremento no se observo en animales suplementados con leche desnatada fermentada tanto con L. paracasei CBA L74 como con S. thermophilus en solitario. La administracion de leche fermentada con ambas cepas a dosis mas altas indujo un incremento en la IgA de las mucosas.
Niveles de TLR2, TLR4, TLR9 y PPARy en la mucosa intestinal. A continuacion determinamos mediante WB los niveles clave de receptores del sistema inmunologico innato de la mucosa. Como se muestra en la Figura 15, ninguno de los tratamientos tuvo ningun efecto significativo sobre la expresion del receptor TLR4. La leche no fermentada causo un incremento modesto en TLR2. La administracion de leche desnatada fermentada bien con L. paracasei CBA L74 o S. thermophilus en solitario o en combinacion a dosis bajas previnieron este efecto. Tambien fue evidente un incremento modesto en TLR2 comparable a la de la leche en solitario, en ratones que recibieron leche fermentada con ambas cepas a dosis mas altas. La administracion de leche desnatada en solitario tuvo efectos profundos en los niveles de TLR9, mientras que la administracion de leche fermentada con ambas cepas re- establecieron a niveles de las mucosas comparables con los de los controles. Como se muestra en la Figura 15, la administracion de leche no fermentada causo por sf misma un potente incremento en la PPRAy de la mucosa. Se evidencio un efecto similar en ratones suplementados con leche desnatada fermentada con L. paracasei CBA L74 y dosis mas bajas de leche fermentada con ambas cepas.
Niveles de pNF-kB y IKB en la mucosa intestinal. Determinamos el estado de activacion de NF-kB, un factor de transcripcion clave implicado tanto en la inflamacion intestinal como en la supervivencia de celulas epiteliales. Como se muestra en la Figura 16, NF-kB activado (pNF-kB) era detectable en el control, mucosa normal. Despues de los distintos tratamientos, observamos solo un ligero incremento en los niveles de pNF-kB en la mucosa de los ratones tratados con leche desnatada fermentada bien con L. paracasei CBA L74 o con S. thermophilus en solitario, mientras que en ratones que recibieron leche desnatada fermentada con ambas cepas, pNF-kB era comparable al de los controles. El incremento en pNF-kB era similar a la desaparicion de la subunidad inhibitoria de NF-kB, IKB, que no era detectable en la mucosa de los ratones suplementados con leche desnatada fermentada bien con L.
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paracasei CBA L74 o con S. thermophilus en solitario. Los ratones que recibieron leche desnatada fermentada con ambas cepas mostraron niveles de IkB comparables a los controles.
Ejemplo 10: Efecto de la leche fermentada mediante L. paracasei CBA L74 sobre el fenotipo de celulas dendnticas en la mucosa intestinal
Fenotipo de celulas dendnticas extrafdas a partir de Placas de Peyer. Examinamos el efecto de la suplementacion en la dieta sobre el fenotipo de DCs intestinales. Los resultados de este analisis se muestran en la Figura 17. La administracion de leche fermentada con L. paracasei en solitario asf como con S. thermophilus a dosis mas altas y mas bajas produjeron un descenso significativo estadfsticamente en la expresion de CD80 y CD86 en comparacion con los ratones control (* significa p<0,05 frente al control), mientras que los niveles generales de HLAII y CD40 se mantuvieron estables. Los datos de la Figura 17 se expresan como la media±S.E. de los tres experimentos separados.
Respuestas de las celulas dendnticas expuestas a LPS/CpG. Determinamos la capacidad de la suplementacion en la dieta para modificar la reactividad de celulas DCs a estfmulos pro-inflamatorios (tales como LPS y CpG bacterianas). Como se muestra en la Figura 18, la exposicion de celulas DCs aisladas a partir de animales a LPS y CpG causo un incremento significativo en la expresion de CD80 (* significa p<0,05 frente a las celulas DCs sin estimular de ratones control). Se observo un efecto similar en las celulas DCs purificadas a partir de ratones que recibieron leche no fermentada (° significa p<0,05 frente a las celulas DCs sin estimular de ratones tratados con leche no fermentada). La administracion de leche desnatada fermentada con L. paracasei CBA L74 en solitario previno completamente los efectos mediados por LPS en los ratones tratados con leche no fermentada, aunque era menos efectivo en la regulacion al alza de CD80 inducido por CpG. La leche desnatada fermentada con S. thermophilus en solitario previno los efectos de LPS y CpG y redujo la expresion de CD80. Finalmente, la administracion de leche desnatada fermentada con ambas cepas previno la regulacion al alza de CD80 inducida por LPS y CpG, y mantuvo la expresion de CD80 a niveles basales. Los datos en la Figura 18 se expresan como la media±S.E. de los tres experimentos separados.
Ejemplo 11: Efecto de la leche fermentada mediante L. paracasei CBA L74 sobre el fenotipo de linfocitos T en la mucosa intestinal
Respuestas de los linfocitos intestinales CD4+ y CD8+ expuestos a PHA. Nos planteamos sin la suplementacion en la dieta con leche (bien fermentada o sin fermentar) afectana a la polarizacion de los linfocitos T intestinales (CD4+ y CD8+) hacia un fenotipo Th1 o Th2. Se expusieron los linfocitos derivados de las Placas de Peyer a PHA, y despues se evaluo la polarizacion de los linfocitos mediante tincion para IL-4 y IFN-y intracelular.
Como se muestra en la Figura 19, la exposicion a PHA incremento significativamente la produccion de IL4 y IFN-y en los linfocitos CD4+ de ratones control (* significa p<0,05 frente a los linfocitos sin estimular de ratones control). Esta induccion no se observo en los ratones tratados tanto con leche fermentada como no fermentada. Despues de la suplementacion con leche no fermentada, los linfocitos CD4+ mostraron niveles basales aumentados de IL4 y IFN-y en comparacion con los animales control (° significa p<0,05 frente a los linfocitos sin estimular de ratones control). Estos datos sugenan que la suplementacion con leche fermentada prevema la activacion no espedfica y mantema la produccion de IL4 y IFN-y en niveles basales.
Como se muestra en la Figura 20, la exposicion de linfocitos intestinales CD8+ a PHA en ratones control incremento la produccion de IL4 y IFN-y (* significa p<0,05 frente a los linfocitos sin estimular de ratones control). Esta induccion no se observo en los ratones tratados tanto con leche fermentada como no fermentada. La administracion de leche fermentada con L. paracasei y S. thermophilus a dosis mas altas descendio la produccion basal de IL4 mientras que tras la estimulacion con PHA, los niveles tanto de IL4 como de IFN-y se redujeron en comparacion con los linfocitos estimulados de los ratones control (§ significa p<0,05).
Ejemplo 12: Efecto de leche fermentada mediante L. paracasei CBA L74 sobre la histologfa de la mucosa intestinal
Para determinar la distribucion de las celulas que proliferan en la mucosa intestinal, se realizo un analisis inmunohistoqmmico de la expresion de Ki67, un antfgeno expresado por las celulas en division. En los ratones control habfa una clara inmunorreactividad en las criptas intestinales, mientras que no hubo tincion en las vellosidades. En el tejido de los ratones que recibieron leche no fermentada hubo una potente expresion en las criptas, aunque no habfa expresion ectopica del antfgeno. En ratones que recibieron los diferentes tipos de leche fermentada se observaron patrones de tincion comparables. Se realizo una evaluacion histologica de la mucosa del fleon de los diferentes grupos experimentales. Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 21. La administracion de leche no fermentada redujo el numero y la extension de la vellosidades intestinales, mientras que la morfologfa intestinal se conservo en los animales que recibieron las diferentes formas de leche fermentada.
Ejemplo 13: Efecto del arroz fermentado por L. paracasei CBA L74 sobre marcadores del sistema inmunologico en la mucosa intestinal
Estos experimentos se disenaron para evaluar las propiedades inmuno-moduladoras de cereales fermentados por L. paracasei CBA-L74. Los estudios inclrnan la administracion intragastrica diaria durante dos semanas de: 1)
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Arroz no fermentado; 2) 100 mg al dfa de arroz fermentado (con L. paracasei CBA L74) (correspondiente a 2 x 108 ufc/L de L. paracasei CBA-L74) y 3) 500 mg al dfa de arroz fermentado (con L. paracasei CBA L74) (correspondiente a 109 ufc/L de L. paracasei CBA-L74). Durante el tratamiento los ratones no mostraron ningun signo de enfermedades o diarrea. Al finalizar el tratamiento se mataron los ratones y se recogieron las Placas de Peyer (PP) de manera aseptica. Se eliminaron las celulas epiteliales de las PP mediante la incubacion en HBSS sin Ca2+ mas EDTA y despues los tejidos se sometieron a digestion enzimatica. La suspension celular unica, se lavo, se resuspendio en rMpI fno y se empleo para los ensayos siguientes.
Inicialmente ensayamos el efecto sobre la mucosa intestinal completa de diferentes suplementos en la dieta. Primero, realizamos una tincion de hematoxilina y eosina en secciones del fleon embebidas en parafina. Ninguno de los suplementos en la dieta empleados tuvo efectos significativos en la estructura intestinal o causo la infiltracion de celulas inflamatorias.
Despues determinamos si la administracion de arroz fermentado con L. paracasei CBA L74 afectaba el nivel de citoquinas anti- y pro-inflamatorias en la mucosa intestinal. Como se muestra en la Figura 22, la administracion de arroz o arroz fermentado incrementaron tanto IL-1p como IL-4 en la mucosa. La suplementacion con arroz fermentado a dosis mas altas causo una reduccion en IL-10 como se muestra en la Figura 23.
Despues determinamos el efecto de diferentes regfmenes de suplementacion sobre el nivel de IgA en las mucosas. Tras dos semanas de suplementacion en la dieta, los animales se sacrificaron y se recogio y homogeneizo la mucosa intestinal. Se midio entonces mediante ELISA el total de IgA y los valores normalizados para las protemas de toda la mucosa. Ninguno de los suplementos tuvo efectos significativos sobre la IgA de la mucosa.
Analizamos los efectos del arroz o del arroz fermentado con L. paracasei CBA L74 sobre la inmunidad innata de la mucosa intestinal. Como se muestra en la Figura 24, la suplementacion de la dieta con arroz y arroz fermentado (a dosis bajas) tuvieron solo efectos moderados sobre los TLRs de la mucosa. Como se muestra en la Figura 25a, la suplementacion en la dieta con arroz no fermentado incremento drasticamente los niveles de PPARy de la mucosa. Dosis altas de arroz fermentado incrementaron tambien los niveles de PPARy de la mucosa. Como se muestra en la Figura 25b, dos semanas despues de la suplementacion de la dieta con arroz no fermentado redujo la activacion en la mucosa de NF-kB y descendio la de IKB. La suplementacion con arroz fermentado a dosis bajas no tuvo ningun efecto en comparacion con el control, mientras que dosis mas altas tuvieron efectos comparables a los observados con arroz no fermentado.
Medimos tambien los efectos de la administracion en la dieta sobre el nivel de citoquinas anti- y pro-inflamatorias en el suero. La suplementacion de la dieta bien con arroz o bien con arroz fermentado (a baja dosis) no tuvo influencia sobre los niveles de IL-1p y IL-4 en el suero.
Ejemplo 14: Efecto del arroz fermentado mediante L. paracasei CBA L74 sobre el fenotipo de celulas dendnticas en la mucosa intestinal
A continuacion nos centramos en el impacto de la suplementacion de la dieta con arroz no fermentado o con arroz fermentado con L. paracasei CBA L74 sobre celulas inmunologicas relevantes para la actividad del sistema inmunologico asociado con las mucosas, principalmente de celulas dendnticas y linfocitos. Primero marcamos la suspension de celulas unica con anti-CD1 (para identificar DCs) y bien con anti CD-80 y CD-86, MHC-II y CD-40, para determinar el nivel de actividad y madurez de DCs intestinales en estos organos linfoides. Como se muestra en la tabla de la Figura 26, se observo un efecto significativo del arroz fermentado a altas dosis sobre el fenotipo de DCs. La suplementacion con arroz no fermentado (en estos experimentos usamos dos dosis diferentes) no tuvo efecto, mientras que los efectos del arroz fermentado sobre el nivel de CD80, CD40 y MHC-II eran evidentes a 100 mg/dfa y mas pronunciado a 500 mg/dfa.
A continuacion determinamos la capacidad de la suplementacion en la dieta con arroz o con arroz fermentado con L. paracasei CBA L74 para modificar la reactividad de las DCs por estfmulos pro-inflamatorios (tal como LPS y CpG bacterianos). Como se muestra en la tabla de la Figura 27, la exposicion de DCs a LPS o CpG en ratones control, indujo una regulacion al alza de CD80 en las DCs control. La suplementacion con arroz no fermentado no modifico la reactividad a estfmulos inflamatorios. La suplementacion con las dosis ensayadas de arroz fermentado redujo la regulacion al aza de CD80 inducida por LPS y CpG.
Ejemplo 15: Efecto del arroz fermentado mediante L. paracasei CBA L74 sobre el fenotipo de linfocitos T en la mucosa intestinal
Investigamos si la suplementacion en la dieta con arroz o con arroz fermentado con L. paracasei CBA L74 era capaz de influir en la polarizacion de los linfocitos T intestinales (bien de CD4+ o de CD8+) hacia un fenotipo Th1 o Th2. Los linfocitos derivados de las Placas de Peyer se expusieron a PHA y a continuacion se evaluo la polarizacion de linfocitos mediante tincion de intraquina para IL-4 y IFN-y.
Los resultados de este experimento para linfocitos CD4+ y CD8+ se muestran en las Figuras 28 y 29, respectivamente. Como se muestra en la Figura 28, en la condicion basal, en linfocitos CD4+ IL-4 y IFN-y
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estaban casi en equilibrio ya que aproximadamente el 10-12% de las celulas eran positivas para estas citoquinas. Como se muestra en la Figura 29, en CD8+, en la condicion basal habfa un ligero predominio de las celulas que expresan IL-4 sobre las que expresan IFNy. La exposicion tanto de linfocitos CD4+ como CD8+ a PHA causo un potente incremento en la tincion intracelular para IL-4 y IFNy, con un predominio en la produccion de IFNy.
En ratones que recibieron arroz no fermentado se observo un predominio de la produccion de IL-4 (fenotipo Th2) tanto en la condicion basal como tras la estimulacion de PHA para linfocitos CD4+ y CD8+. Sin embargo, la produccion de IL-4 se asocio a la persistencia de la produccion de IFNy en la condicion basal, tras la estimulacion de PHA se observo un incremento en la expresion de esta citoquina aunque la respuesta se suavizo en comparacion con la respuesta en celulas control. En ratones que recibieron arroz fermentado en la condicion basal observamos un predominio de celulas positivas IFNy sobre las IL-4, aunque en la condicion basal el porcentaje era comparable (para CD4+) o ligeramente menor (para CD8+) comparado con los controles. Tras la estimulacion con PHA, la respuesta de citoquinas en ambas poblaciones celulares era mas suave en comparacion con los ratones control, aunque dirigida hacia un fenotipo Th1 (predominio de celulas positivas IFNy).
Ejemplo 16: Efecto de L. paracasei CBA L74 sobre la produccion de IL-10 en celulas dendnticas humanas derivadas de monocitos (MoDCs) en presencia de Salmonella typhimurium
Se ensayo la capacidad tanto de las celulas L. paracasei CBA L74 como de los sobrenadantes celulares de L. paracasei CBA l74, para inducir la produccion de citoquinas anti-inflamatorias, IL-10, MoDCs humanas en presencia del patogeno bacteriano, Salmonella typhimurium. Las MoDCs humanas se obtuvieron a partir de al menos cuatro, y en algunos casos, siete donantes. Como se muestra en la Figura 30, todas las celulas de Salmonella typhimurium (“FB62”), de la cepa Lactobacillus control, L. paracasei 21060 (“B21060”) y L. paracasei CBA L74 (“CBAL74”), inducen la produccion de IL-10. Por el contrario, aunque el sobrenadante de Salmonella typhimurium (“sn fb62”) induce la produccion de IL-10, los sobrenadantes a partir de Lactobacilli, cepa Lactobacillus, L. paracasei 21060 (“sn b21060”) y L. paracasei CBA L74 (“sn cbal74”) no lo hicieron. La co-incubacion del sobrenadante de L. paracasei CBA L74 con Salmonella typhimurium (“sn cbal74 + FB62”), induce a niveles de IL-10 por encima de los vistos con Salmonella typhimurium en solitario (“sn fb62 + FB62”). Curiosamente, se observo un efecto similar incluso si las MoDCs se precondicionaban con sobrenadante de L. paracasei CBA L74 durante solo una hora y se lavaban despues para eliminar el sobrenadante (“1h sn cbal74 + FB62”).
Ejemplo 17: Efecto de L. paracasei CBA L74 sobre la produccion de IL-12p70 en celulas dendnticas humanas derivadas de monocitos (MoDCs) en presencia de Salmonella typhimurium
Se ensayo la capacidad tanto de las celulas L. paracasei CBA L74 como de los sobrenadantes celulares de L. paracasei CBA L74, para inducir la produccion de citoquinas anpro-inflamatorias, IL-12p70, en MoDCs humanas en presencia del patogeno bacteriano, Salmonella typhimurium. Las MoDCs humanas se obtuvieron a partir de al menos cuatro, y en algunos casos, siete donantes. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 31. Por el contrario, para los resultados obtenidos en el Ejemplo 16 para citoquina anti-inflamatoria, encontramos que Salmonella typhimurium (“FB62”) induce niveles altos de IL-12p70 mientras que la cepa de celulas Lactobacillus control, L. paracasei 21060 (“B21060”) y L. paracasei CBA L74 (“CBAL74”), inducen solo bajos niveles de IL-12p70. Una vez mas, el sobrenadante a partir de Salmonella typhimurium (“sn fb62”) induce la produccion de IL-12p70, pero los sobrenadantes a partir tanto de cepas de Lactobacillus, L. paracasei 21060 (“ sn b21060”) y L. paracasei CBA L74 (“sn cbal74”) no lo hicieron. La co-incubacion del sobrenadante de L. paracasei CBA L74 con Salmonella typhimurium (“sn cbal74 + FB62”) causo una notable reduccion en la produccion de IL-12p70. El efecto se observo incluso si las MoDCs se precondicionaban con sobrenadante de L. paracasei CBA L74 durante solo una hora y se lavaban despues para eliminar el sobrenadante (“1h sn cbal74 + FB62”). Esta reduccion supero a la observada para el Lactobacillus control, L. paracasei 21060 (“1h sn b21060 + FB62”). Estos datos sugenan que tanto L. paracasei CBA L74 como el cultivo del sobrenadante a partir de L. paracasei CBA L74 tienen propiedades anti-inflamatorias que pueden aliviar la inflamacion inducida por el patogeno bacteriano, Salmonella typhimurium.
Ejemplo 18: Efecto de leche fermentada con L. paracasei CBA L74 sobre la produccion de IL-10 en celulas dendnticas humanas derivadas de monocitos (MoDCs) en presencia de Salmonella typhimurium
Se ensayo la capacidad de la leche fermentada con L. paracasei CBA L74 para inducir la produccion de citoquinas anti-inflamatorias, IL-10, en MoDCs humanas en presencia del patogeno bacteriano, Salmonella typhimurium. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 32. Aunque las celulas MoDCs desactivadas normalmente no producen IL-10, encontramos que la incubacion de MoDCs con leche fermentada con L. paracasei CBA L74 induce la produccion de IL-10 de una manera dependiente de la dosis (vease “matriz CBAL74 1,41gr/100ml” y “matriz CBAL74 0,14gr/100ml”). La capacidad se mantiene incluso en presencia de Salmonella typhimurium (vease “matriz CBAL74 1,41gr/100ml + FB62” y “matriz CBAL74 0,14gr/100ml + FB62”).
La Figura 32 muestra tambien que L. paracasei CBA L74 que se ha activado mediante calor (“6,3*106 UFC CBA74 hervido”), se ha tratado con formaldehndo (“6,3*106 UFC CBA74 PFA”), o se ha congelado-descongelado (“6,3*106 UFC CBA74 F&ampT”), retiene la capacidad para inducir IL-10.
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Como se observo para el medio de cultivo de L. paracasei CBA L74, la leche fermentada con L. paracasei CBA L74 causo una reduccion significativa dependiente de la dosis en la produccion de IL-12p70 inducida por Salmonella typhimurium (Figura 33). La leche fermentada por S. thermophilus causo un incremento en la produccion de IL- 12p70 en presencia de Salmonella typhimurium. Sin embargo, la leche fermentada por L. paracasei CBA L74 no estimulo la produccion de IL-12p70, acorde con las propiedades anti-inflamatorias de L. paracasei CBA L74. Estos datos sugieren que L. paracasei CBA L74 retiene sus propiedades anti-inflamatorias incluso en presencia de mas especies pro-inflamatorias.
Ejemplo 19: Efecto de sobrenadantes celulares L. paracasei CBA L74 sobre la produccion de IL-10 y IL12p70 en celulas dendnticas humanas derivadas de monocitos (MoDCs) en presencia de Enterobacter sakazaki
Ensayamos la capacidad de los sobrenadantes celulares L. paracasei CBA L74 para inducir la produccion de citoquinas anti-inflamatorias, IL-10 y citoquinas pro-inflamatorias, IL-12p70, en MoDCs humanas en presencia del patogeno bacteriano, Enterobacter sakazaki. Ensayamos dos cepas de E. sakazaki, N9 y N13. E. sakazaki induce la produccion tanto de IL-10 como de IL-12p70 en MoDCs humanas. La adicion de sobrenadantes celulares L. paracasei CBA L74 dio como resultado un incremento en IL-10 y un descenso significativo en IL-12p70.
Ejemplo 20: Efecto de arroz fermentado con L. paracasei CBA L74 sobre la produccion de citoquinas en modelos de explantes tisulares en presencia de Salmonella typhimurium
Para establecer un sistema de co-cultivo tridimensional, se uso epitelio de intestino de raton como se describe en Abud (Exp. Cell Res. 303: 252-262 (2005)). Los explantes tisulares se cultivaron durante 24 horas en presencia de 100% de O2 con una presion de una atmosfera. La camara inferior contema 1 ml de hEC DMEM mas ITS-X y EGF. La camara superior contema 200 ml de medio mas o bien S. typhimurium, arroz fermentado por L. paracasei CBA L74, o bien una combinacion de S. typhimurium y arroz fermentado por L. paracasei CBA l74. Se recogieron los sobrenadantes y se evaluaron mediante ELISA los niveles de IL-p, TNF-a y IL-10. Como se muestra en la Figura 33, la adicion de arroz fermentado redujo significativamente la produccion de citoquinas pro-inflamatorias, IL-p y TNF-a en presencia de S. typhimurium, con solo un efecto moderado sobre los niveles de citoquina anti-inflamatoria, IL-10.

Claims (20)

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    REIVINDICACIONES
    1. Una composicion que comprende un producto alimentario fermentado, en donde el producto alimentario se ha fermentado mediante la bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778.
  2. 2. Una composicion que comprende la bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778 y un vehfculo aceptable fisiologicamente.
  3. 3. La composicion de la reivindicacion 2, en donde el vetuculo aceptable fisiologicamente es un producto alimentario.
  4. 4. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el producto alimentario es un producto lacteo o un producto de cereal, siendo el producto lacteo seleccionado del grupo que consiste en leche, yogurt, cuajada, queso o una formula infantil y siendo el producto de cereal seleccionado del grupo que consiste en arroz, trigo, avena, cebada, mafz, centeno, sorgo, mijo, o triticale.
  5. 5. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde producto alimentario esta seco.
  6. 6. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la bacteria probiotica es no replicativa.
  7. 7. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el producto alimentario comprende el equivalente de aproximadamente 1x102 ufc/g a aproximadamente 1012 ufc/g de bacteria probiotica por gramo en peso seco.
  8. 8. La composicion de la reivindicacion 2, en donde el vehfculo aceptable fisiologicamente es un vehfculo aceptable farmaceuticamente.
  9. 9. La composicion de la reivindicacion 8, en donde el vehfculo aceptable farmaceuticamente comprende un coloide de base lipfdica o de base polimerica, siendo el coloide seleccionado preferiblemente del grupo que consiste en un liposoma, un hidrogel, una micropartfcula, una nanopartfcula o una micela copolfmera en bloque.
  10. 10. La composicion de la reivindicacion 9, en donde el coloide de base polimerica es una capsula.
  11. 11. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde la bacteria probiotica esta en una forma de dosis unitaria de aproximadamente 1 x 102 ufc/g a aproximadamente 1 x 1012 ufc/g de peso seco y se formula preferiblemente para administracion oral.
  12. 12. Un metodo para preparar una composicion nutricional, comprendiendo el metodo:
    a) proporcionar un producto alimentario;
    b) combinar el producto alimentario con una cantidad eficaz de la bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778 y, opcionalmente, un co-inoculo, para formar una mezcla;
    c) incubar la mezcla a una temperatura y durante un tiempo suficiente para que ocurra la fermentacion.
  13. 13. El metodo de la reivindicacion 12, en donde la cantidad de la bacteria probiotica es de aproximadamente 1 x 106 ufc/ml a aproximadamente 5 x106 ufc/ml.
  14. 14. El metodo de la reivindicacion 12 o 13, en donde el co-inoculo es Streptococcus thermophilus, preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 1 x 104 ufc/ml a aproximadamente 1 x 105 ufc/ml.
  15. 15. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde la etapa de incubacion continua hasta que el nivel de bacteria probiotica en la mezcla alcanza aproximadamente 1 x 108 ufc/ml a aproximadamente 1 x1010 ufc/ml.
  16. 16. La bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778 para el uso en el tratamiento de un trastorno gastrointestinal en un sujeto.
  17. 17. La bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778 para el uso segun la reivindicacion 16, en donde la bacteria probiotica se formula en un producto alimentario o en una composicion farmaceutica, comprendiendo el producto alimentario preferiblemente el producto alimentario de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, comprendiendo la composicion farmaceutica preferiblemente la composicion de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.
  18. 18. La bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778 para el uso segun la reivindicacion 16 o 17, en donde el trastorno gastrointestinal es un
    10
    sistema inmunologico de las mucosas deficitario, una alergia alimentaria, un trastorno asociado a diarrea, una infeccion bacteriana o viral, smdrome de intestino irritable, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, enfermedad celfaca o enterocolitis necrotizante.
  19. 19. La bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778 para el uso segun la reivindicacion 18, en donde el sistema inmunologico de las mucosas deficitario es un sistema inmunologico inmaduro.
  20. 20. La bacteria probiotica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Numero de Acceso del Deposito Internacional LMG P-24778 para el uso segun cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en donde el sujeto es un nino humano.
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Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8518903B2 (en) 2007-04-19 2013-08-27 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Use of toll-like receptor-9 agonists
US9072760B2 (en) 2010-09-24 2015-07-07 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education TLR4 inhibitors for the treatment of human infectious and inflammatory disorders
US10668092B2 (en) 2010-09-24 2020-06-02 The John Hopkins University Compositions and methods for treatment of inflammatory disorders
WO2012088425A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Gap junction-enhancing agents for treatment of necrotizing enterocolitis and inflammatory bowel disease
TR201809987T4 (tr) 2011-06-20 2018-08-27 Heinz Co Brands H J Llc Probiyotik bileşimler ve yöntemler.
RU2654705C2 (ru) * 2012-06-18 2018-05-22 Г.Дж. Хайнц Компани Брэндс ЛЛК Глютенозависимые расстройства
WO2014052453A1 (en) * 2012-09-25 2014-04-03 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Oral therapy of necrotizing enterocolitis
MX2013012618A (es) * 2012-10-26 2016-05-26 María Del Carmen Cadena Garcia Método de manufactura de mezcla de granos fermentados.
EP3470074B1 (en) 2013-05-10 2020-10-14 H.J. Heinz Company Brands LLC Probiotics
ITMI20131467A1 (it) 2013-09-06 2015-03-07 Sofar Spa Uso di una composizione comprendente microrganismi per aumentare la produzione intestinale di acido butirrico, di acido folico o di niacina e/o per diminuire la produzione intestinale di acido succinico
CN104894021B (zh) * 2015-06-03 2018-02-09 宜兰食品工业股份有限公司 一种副干酪乳杆菌及其应用
JP6605319B2 (ja) * 2015-12-17 2019-11-13 株式会社ダイワ 乳酸菌含有加工食品の製造方法
MA45288A (fr) 2016-06-08 2019-04-17 Sofar Spa Nouvelle utilisation médicale de probiotiques
IT201600081929A1 (it) * 2016-08-03 2018-02-03 St Europeo Di Oncologia S R L Uso del surnatante di lactobacillus paracasei nel trattamento della congiuntivite, in particolare della vernal cheratocongiuntivite
IT201600127498A1 (it) 2016-12-16 2018-06-16 Sofar Spa Probiotici per uso nella diverticolosi e malattia diverticolare
CN110741073A (zh) * 2017-06-09 2020-01-31 曾根农场股份公司 新乳酸菌及其用途
WO2019026743A1 (ja) * 2017-07-31 2019-02-07 Ｍｃフードスペシャリティーズ株式会社 嚥下困難者用増粘組成物
CN109662259B (zh) * 2017-10-16 2022-07-29 江苏省农业科学院 一种富益生菌冻干毛豆粒产品及其制备方法
CN109864270B (zh) * 2017-12-01 2022-07-29 江苏省农业科学院 一种富益生菌冻干胡萝卜丁产品及其制备方法
US20210040440A1 (en) * 2018-02-07 2021-02-11 White Dog Labs, Inc. An improved method for selecting microorganisms
JP2019149977A (ja) * 2018-03-05 2019-09-12 今野 由梨 ペット用サプリメント及びその製造方法
CN112534043B (zh) 2018-05-09 2024-04-26 Ko生物技术有限公司 副干酪乳杆菌菌株及其用途
IT201900000801A1 (it) * 2019-01-18 2020-07-18 Proge Farm Srl Composizione comprendente batteri probiotici non vitali e suo uso in terapia
CN113163835A (zh) * 2019-05-15 2021-07-23 N·V·努特里奇亚 促进肠道发育的发酵配方物
CN112869170B (zh) * 2019-11-29 2023-05-23 伊利伊诺科技(上海)有限责任公司 可提高胃肠道免疫能力的益生菌益生元营养组合物及应用
IT202200013882A1 (it) * 2022-07-04 2024-01-04 Alfasigma Spa Prodotto di fermentazione per il trattamento di malattie infiammatorie.

Family Cites Families (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0130228A1 (en) 1983-07-01 1985-01-09 Microlife Technics, Inc. Fermentation method using a selected lactobacillus
US5635199A (en) 1995-10-27 1997-06-03 Nestec Ltd. Support of pediatric patients
RU2134583C1 (ru) 1996-02-29 1999-08-20 Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Способ санации женщин с массивной микробной обсемененностью грудного молока
AU3173497A (en) * 1996-06-21 1998-01-14 Quest International B.V. Fermentation of fruit products
PT862863E (pt) 1997-01-09 2002-04-29 Nestle Sa Produto cerealifero contendo probioticos
NZ501933A (en) 1997-07-05 2001-08-31 Nestle Sa Use of lactobacilli in enteral nutritional compositions for improved mineral absorption
SE510813C2 (sv) 1997-12-08 1999-06-28 Arla Ekonomisk Foerening Bakteriestam av arten Lactobacillus Paracasei subsp. paracasei, sammansättning därav för användning i livsmedel, samt produkt innehållande stammen
US6036985A (en) 1998-04-03 2000-03-14 Nestec S.A. Calcium complex and food fortified therewith
EP1034787A1 (en) 1999-03-11 2000-09-13 Société des Produits Nestlé S.A. Lactobacillus strains preventing diarrhea caused by pathogenic bacteria
EP1034788A1 (en) 1999-03-11 2000-09-13 Société des Produits Nestlé S.A. Lactic acid bacteria strains capable of preventing diarrhea
SE522747C2 (sv) 1999-11-18 2004-03-02 Probi Ab Barnmatsprodukt
MXPA02008016A (es) 2000-02-17 2002-11-29 American Home Prod Formulacion nutricional que contiene substancias prebioticas.
FI110668B (fi) 2000-06-20 2003-03-14 Aboatech Ab Oy Probioottien käyttö atooppisten sairauksien primaariseen ehkäisyyn
SE0003100D0 (sv) * 2000-09-01 2000-09-01 Probi Ab New strains
WO2002028402A1 (en) 2000-10-06 2002-04-11 Société des Produits Nestlé S.A. Use of probiotic lactic acid bacteria for balancing the skin's immune system
GB0027761D0 (en) 2000-11-14 2000-12-27 Nestle Sa Nutritional composition for an immune condition
KR100419132B1 (ko) 2000-12-29 2004-02-18 조성근 위·장 점막 부착성과 증식성, 내산성, 내담즙성 및헬리코박터 파일로리, 대장균 0157:ｈ7에 대한 항균성이우수한 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이ｃｓｋ 01
CA2475972C (en) 2002-02-14 2017-07-11 Felix Hausch Enzyme treatment of foodstuffs for celiac sprue
CN1301708C (zh) 2002-02-21 2007-02-28 雀巢产品有限公司 用于皮肤光保护的人用口服组合物
EP1364586A1 (en) 2002-05-24 2003-11-26 Nestec S.A. Probiotics and oral tolerance
DE60322570D1 (de) 2002-06-28 2008-09-11 Puleva Biotech Sa Probiotische stämme, verfahren zur ihren selektion, diese enthaltende zusammensetzungen und ihre verwendung
PT1638416E (pt) 2003-06-23 2013-07-08 Nestec Sa Utilização de uma fórmula nutricional para função de barreira intestinal óptima
BRPI0415480B1 (pt) 2003-10-16 2019-09-17 Nestec S.A. Composição nutricional contra efeitos colaterais de quimioterapia ou radioterapia
DE602004017885D1 (de) 2003-10-24 2009-01-02 Nutricia Nv Symbiotische zusammensetzung für kleinkinder
US7955834B2 (en) 2004-06-03 2011-06-07 Biogaia Ab Method for improved breast milk feeding to reduce the risk of allergy
EP1723951A1 (en) 2005-04-21 2006-11-22 N.V. Nutricia Nutritional supplement with oligosaccharides for a category of HIV patients
US7862808B2 (en) 2004-07-01 2011-01-04 Mead Johnson Nutrition Company Method for preventing or treating respiratory infections and acute otitis media in infants using Lactobacillus rhamnosus LGG and Bifidobacterium lactis Bb-12
PT1629850E (pt) 2004-08-24 2007-08-14 Nutricia Nv Composição nutricional que compreende a administração de oligossacarídeos indigeríveis
US20060194241A1 (en) 2005-02-28 2006-08-31 Jan Knol Lactobacillus specific probes
RU2428886C2 (ru) 2005-04-13 2011-09-20 Нестек С.А. Смесь для грудных детей, содержащая пробиотики
US20060233772A1 (en) 2005-04-15 2006-10-19 Udo Herz Method for preventing or treating the development of respiratory allergies
EP1714660A1 (en) 2005-04-21 2006-10-25 N.V. Nutricia Uronic acid and probiotics
US8075934B2 (en) 2008-10-24 2011-12-13 Mead Johnson Nutrition Company Nutritional composition with improved digestibility
DE602006016444D1 (de) 2005-07-01 2010-10-07 Nutricia Nv Babynahrung mit hydrolisierten proteinen
AU2006323689B2 (en) 2005-12-08 2012-11-08 Kirin Holdings Kabushiki Kaisha Isohumulone compound clathrate and composition containing the same
ES2381211T3 (es) 2006-02-15 2012-05-24 Nestec S.A. Uso del Bifidobacterium longum para prevenir y tratar inflamaciones
US9005682B2 (en) 2006-03-07 2015-04-14 Nestec S.A. Synbiotic mixture
EP1847180A3 (en) 2006-03-27 2008-04-02 Nestec S.A. Protein-enriched frozen dessert
US20110165127A1 (en) 2006-06-09 2011-07-07 Fabiola Masri Dairy-derived probiotic compositions and uses thereof
DE602007000193D1 (de) * 2006-07-07 2008-12-04 Alpro Nv Verfahren zur herstellung eines milchprodukt-analogs
CA2660764A1 (en) 2006-07-13 2008-01-17 Nestec S.A. Stabiliser system for liquid nutritional compositions
JP2010502572A (ja) 2006-08-08 2010-01-28 ネステク ソシエテ アノニム カロテノイド異性体の安定で生物学的に利用可能な皮膚及び毛髪用組成物
EP1917960A1 (en) 2006-11-06 2008-05-07 Nestec S.A. Improved biological effects of rosmarinic acid
EP1932437A1 (en) 2006-12-15 2008-06-18 Nestec S.A. Infant formula
ES2668552T3 (es) 2007-03-21 2018-05-18 Nestec S.A. Sistema de seguridad para composiciones nutricionales en polvo
EP1974743A1 (en) 2007-03-28 2008-10-01 Nestec S.A. Probiotics to Improve Gut Microbiota
EP1974735A1 (en) 2007-03-28 2008-10-01 Nestec S.A. Reduction of risk of diarrhoea
EP1974734A1 (en) 2007-03-28 2008-10-01 Nestec S.A. Probiotics for reduction of risk of obesity
WO2008153377A1 (en) 2007-06-15 2008-12-18 N.V. Nutricia Nutrition with non-viable bifidobacterium and non-digestible oligosaccharide
PT2036447E (pt) 2007-09-07 2010-03-23 Nestec Sa Processo para a produção de produtos alimentares para bebés
CN101795583B (zh) 2007-09-07 2014-08-13 雀巢产品技术援助有限公司 无菌制备的不期望副产物浓度低的系列婴儿食品及其制备方法
EP2036568A1 (en) 2007-09-12 2009-03-18 Nestec S.A. Wolfberries and inflammation
PL2217246T3 (pl) 2007-11-08 2015-06-30 Nestec Sa Zastosowanie oligosacharydów zawierających n-acetylolaktozaminę do dojrzewania odpowiedzi odpornościowych u noworodków
EP2060257A1 (en) 2007-11-08 2009-05-20 Nestec S.A. Prevention and treatment of secondary infections following viral infection
WO2009067000A1 (en) 2007-11-20 2009-05-28 N.V. Nutricia Composition with synbiotics
ES2715312T3 (es) 2007-11-26 2019-06-03 Nestec Sa Sistema de nutrición infantil ajustado según edad
CN101451158A (zh) 2007-12-04 2009-06-10 黑龙江大学 副干酪乳杆菌产生的抗菌肽的分离纯化方法
EP2072052A1 (en) 2007-12-17 2009-06-24 Nestec S.A. Prevention of opportunistic infections in immune-compromised subjects
MY177280A (en) 2008-01-24 2020-09-10 Nestle Sa Capsule containing nutritional ingredients and method of delivery of a nutritional liquid from the capsule
EP2096115A1 (en) 2008-02-26 2009-09-02 Nestec S.A. Oligosaccharide ingredient
ES2658837T3 (es) 2008-03-14 2018-03-12 Nestec S.A. Mezcla simbiótica
EP2110027A1 (en) 2008-04-01 2009-10-21 Nestec S.A. Long-chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFA) in maternal nutrition during pregnancy and lactation
FR2930406B1 (fr) 2008-04-29 2011-04-15 Groupe Lactalis Aliment infantile a base de matiere grasse d'origine laitiere
EP2143341A1 (en) 2008-07-08 2010-01-13 Nestec S.A. Nutritional Composition Containing Oligosaccharide Mixture
MX2010012905A (es) 2008-05-27 2010-12-21 Nestec Sa Probioticos para mejorar la microbiota intestinal.
WO2009151315A1 (en) 2008-06-13 2009-12-17 N.V. Nutricia Nutritional composition for infants delivered via caesarean section
EP2138187A1 (en) 2008-06-24 2009-12-30 Nestec S.A. Probiotics, secretory IgA and infection
WO2010002241A1 (en) 2008-06-30 2010-01-07 N.V. Nutricia Nutritional composition for infants delivered via caesarean section
EP2143340A1 (en) 2008-07-07 2010-01-13 Nestec S.A. A nutritional composition with free amino acids and structured lipids
US8857317B2 (en) 2008-07-08 2014-10-14 Nestec S.A. Portion-controlled nutrition system and method using capsules
WO2010008272A1 (en) 2008-07-15 2010-01-21 N.V. Nutricia Treatment of gut motility disorders
EP2147678A1 (en) 2008-07-21 2010-01-27 Nestec S.A. Probiotics to increase IgA secretion in infants born by caesarean section
SG194345A1 (en) 2008-09-19 2013-11-29 Nestec Sa Nutritional support to prevent or moderate bone marrow paralysis or neutropenia during anti-cancer treatment
EP2168444A1 (en) 2008-09-24 2010-03-31 Nestec S.A. Acidified nutritional formula
US9034314B2 (en) 2008-11-03 2015-05-19 Nestec S.A. Nutritional composition comprising probiotics and improving sleep patterns
EP2452574A1 (en) 2010-11-15 2012-05-16 Nestec S.A. Age-tailored nutritional formula with particularly adapted caloric density for young infants
CN102223812A (zh) 2008-12-08 2011-10-19 雀巢产品技术援助有限公司 婴儿脂肪量的调节
BRPI0923171A2 (pt) 2008-12-19 2015-08-11 Nestec Sa Prevenção e tratamento da diarréia causada por rotavírus.
WO2010081604A1 (en) 2009-01-19 2010-07-22 Nestec S.A. Nutritional composition for infants
US20100196341A1 (en) 2009-02-05 2010-08-05 Syngen Biotech Co., Ltd. Novel Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SG96, a Bacteriostatic Composition Containing the same and Use Thereof
US8846612B2 (en) 2009-04-03 2014-09-30 Nestec S.A. Promotion of healthy catch-up growth
ES2382263T3 (es) 2009-05-11 2012-06-06 Nestec S.A. Prevención y tratamiento de la diarrea alérgica
CN102802648A (zh) 2009-05-11 2012-11-28 雀巢产品技术援助有限公司 约氏乳杆菌La1 NCC533(CNCM I-1225)和免疫病症
EP2251030A1 (en) 2009-05-12 2010-11-17 Nestec S.A. Lactoferrin and brain health and development in infants
EP2251031A1 (en) 2009-05-12 2010-11-17 Nestec S.A. Lactoferrin and neuronal health and development in the infant gut
WO2010143940A1 (en) 2009-06-12 2010-12-16 N.V. Nutricia Synergistic mixture of beta-galacto-oligosaccharides with beta-1,3 and beta-1,4/1,6 linkages
PT2467032T (pt) 2009-08-18 2018-04-04 Nestec Sa Composição nutricional compreendendo estirpes de bifidobacterium longum e que reduz os sintomas de alergia alimentar, especialmente em lactentes e crianças
US20110070334A1 (en) 2009-09-20 2011-03-24 Nagendra Rangavajla Probiotic Stabilization
EP2308498A1 (en) 2009-09-30 2011-04-13 Nestec S.A. Administration of Bifidobacterium breve during infancy to prevent inflammation later in life
CN104206946A (zh) 2009-11-12 2014-12-17 雀巢产品技术援助有限公司 用于促进肠微生物群平衡和健康的营养组合物
PH12012501184A1 (en) 2009-12-29 2012-11-26 Nestec Sa Nutritional compositions comprising fruit flakes containing docosahexaenoic acid
WO2011110884A1 (en) 2010-03-12 2011-09-15 Compagnie Gervais Danone Lactic acid bacteria for coeliac disease
EP2552464B1 (en) 2010-03-30 2018-02-28 Assistance Publique - Hôpitaux de Paris Use of bifidobacteria for preventing allergy in breastfed infants
WO2011149335A1 (en) 2010-05-25 2011-12-01 N.V. Nutricia Immune imprinting nutritional composition
WO2011148221A1 (en) 2010-05-28 2011-12-01 Compagnie Gervais Danone Lactic acid bacteria for maturation of the enteric nervous system in infants
US20110293784A1 (en) 2010-05-28 2011-12-01 Anja Wittke Milk-based nutritional compositions
ES2614162T3 (es) * 2010-07-15 2017-05-29 Compagnie Gervais Danone Uso de manganeso para mejorar el crecimiento de L. casei en cultivos mixtos
CN102021127B (zh) 2010-07-28 2012-05-30 江南大学 一株副干酪乳杆菌及其应用
EP2436389A1 (en) 2010-10-01 2012-04-04 Nestec S.A. Milk-based protein hydrolysates and infant formulae and nutritional compositions made thereof
EP2449890A1 (en) 2010-11-05 2012-05-09 Nestec S.A. Powdered cereal compositions comprising non-replicating probiotic microorganisms
EP2449891A1 (en) 2010-11-05 2012-05-09 Nestec S.A. Drinking yoghurt preparations containing non-replicating probiotic micro-organisms
EP2455094A1 (en) 2010-11-11 2012-05-23 Nestec S.A. Non-replicating probiotic micro-organisms protect children against gastrointestinal infections
EP2452573A1 (en) 2010-11-15 2012-05-16 Nestec S.A. Age-tailored nutritional composition with animal fats and vegetable fats
EP2452572A1 (en) 2010-11-15 2012-05-16 Nestec S.A. Age-tailored nutritional formula with particularly adapted caloric density for infants and children
EP2465508A1 (en) 2010-11-23 2012-06-20 Nestec S.A. Composition comprising hydrolysed proteins and oligosaccharides for treating skin diseases
EP2455387A1 (en) 2010-11-23 2012-05-23 Nestec S.A. Oligosaccharide mixture and food product comprising this mixture, especially infant formula
EP2465507A1 (en) 2010-11-23 2012-06-20 Nestec S.A. Oligosaccharide composition for treating skin diseases
EP2454948A1 (en) 2010-11-23 2012-05-23 Nestec S.A. Oligosaccharide mixture and food product comprising this mixture, especially infant formula
PL2648551T3 (pl) 2010-12-06 2015-08-31 Nutricia Nv Fermentowany preparat do żywienia niemowląt
MX2013006510A (es) 2010-12-08 2013-06-28 Nestec Sa Producto de cereal infantil que comprende grano entero hidrolizado.
EP2465359A1 (en) 2010-12-15 2012-06-20 Nestec S.A. Improved nutritional composition, especially for infants, with particular fat particles
WO2012107865A2 (en) 2011-02-10 2012-08-16 Wyeth Llc Modulation of growth of bifidobacteria using a combination of oligosaccharides found in human milk
CN103582429B (zh) 2011-03-29 2016-06-15 雀巢产品技术援助有限公司 具有降低的钠含量的营养组合物及其制备方法
EP2510932A1 (en) 2011-04-15 2012-10-17 Nestec S.A. Lactobacillus paracasei NCC2461 (ST11) for use by perinatal maternal administration in the reduction and prevention of allergies in progeny
EP2514435A1 (en) 2011-04-19 2012-10-24 Nestec S.A. Infant formula for use in the prevention of cardiovascular diseases
EP2522232A1 (en) 2011-05-13 2012-11-14 Nestec S.A. Nutritional products comprising human milk oligosaccharides and methods for manufacture thereof
TR201809987T4 (tr) 2011-06-20 2018-08-27 Heinz Co Brands H J Llc Probiyotik bileşimler ve yöntemler.
KR101261156B1 (ko) * 2011-07-21 2013-05-07 에스케이씨앤씨 주식회사 비밀키 생성방법 및 이를 적용한 전자장치
RU2654705C2 (ru) 2012-06-18 2018-05-22 Г.Дж. Хайнц Компани Брэндс ЛЛК Глютенозависимые расстройства
EP3470074B1 (en) 2013-05-10 2020-10-14 H.J. Heinz Company Brands LLC Probiotics

Also Published As

Publication number Publication date
US10039296B2 (en) 2018-08-07
PT2734049T (pt) 2018-07-24
EP3366143B1 (en) 2024-11-13
NZ619099A (en) 2015-08-28
MX352677B (es) 2017-12-04
PT3366143T (pt) 2025-01-07
CA2839524A1 (en) 2012-12-27
EP2734049A4 (en) 2015-04-15
MY187589A (en) 2021-09-30
BR112013032426B1 (pt) 2021-02-09
MY171851A (en) 2019-11-04
CN103997899B (zh) 2016-04-20
PL2734049T3 (pl) 2018-10-31
RU2017129361A3 (es) 2020-11-05
US20140377238A1 (en) 2014-12-25
MX2013015175A (es) 2014-09-04
US11771102B2 (en) 2023-10-03
US20210259264A1 (en) 2021-08-26
BR132020021160F1 (pt) 2021-11-30
RU2014101392A (ru) 2015-07-27
US10251407B2 (en) 2019-04-09
TR201809987T4 (tr) 2018-08-27
US20170202231A1 (en) 2017-07-20
RU2748839C2 (ru) 2021-05-31
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