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ES2656396T3 - Plantas resistentes a enfermedad - Google Patents

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ES2656396T3
ES2656396T3 ES12155897.7T ES12155897T ES2656396T3 ES 2656396 T3 ES2656396 T3 ES 2656396T3 ES 12155897 T ES12155897 T ES 12155897T ES 2656396 T3 ES2656396 T3 ES 2656396T3
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ES
Spain
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dmr6
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plant
plants
pcr
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ES12155897.7T
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English (en)
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Mireille Maria Augusta Van Damme
Augustinus Franciscus J.M. Van Den Ackerveken
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Scienza Biotechnologies 4 BV
Original Assignee
Scienza Biotechnologies 4 BV
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Publication date
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Abstract

Planta de uva que es resistente a Plasmopara viticola caracterizada porque la planta tiene un nivel reducido o ausencia completa de proteína DMR6 en comparación con la planta que no es resistente a dicho patógeno en donde dicha planta tiene una mutación en su gen DMR6 que da como resultado una expresión DMR6 reducida en comparación con el gen DMR6 de tipo salvaje en donde no está presente tal mutación.

Description

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3.
usando oligonucleótidos directos e inversos degenerados se lleva a cabo una reacción de PCR,
4.
los fragmentos de PCR se separan mediante electroforesis de gel de agarosa estándar y fragmentos del tamaño esperado se aíslan a partir del gel,
5.
se clonan fragmentos de PCR aislados en un vector de plásmido usando métodos estándar,
6.
los plásmido con tamaños de inserto correcto, tal como se determina por PCR, se analizan mediante secuenciación de ADN,
7.
el análisis de secuencia que usa blastX revela que los fragmentos contienen las secuencias internas de DMR6 correctas,
8.
a continuación, se puede usar la secuencia interna de ADN para diseñar cebadores específicos a género y especie para 5’ y 3’ RACE para obtener la secuencia codificadora de DMR6 completa mediante RLM-RACE (tal como se ha descrito anteriormente).
Como ejemplo se proporciona la secuenciación del ADNc de DMR6 de Cucumis sativus (pepino). Para el pepino diversas combinaciones de cebador entre los siguientes cebadores fueron exitosos en la amplificación de un tramo de secuencia codificadora interna del ADNc; cebadores directos dmr6_deg_fw1B ( ), dmr6_deg_fw2B ( ), dmr6_deg_fw3B ( ) y dmr6_deg_fw4 ( ) y cebadores inversos dmr6_deg_rv3B imagen11( ), dmr6_deg_rv4 ( ) y dmr6_deg_rv5 ( ). Después de la clonación y secuenciación de los fragmentos amplificados se diseñaron cebadores específicos a DMR6 de pepino para 5’RACE (Cuc_dmr6_rv1: y Cuc_dmr6_rv2: ) y 3’RACE (Cuc_dmr6_fw1: y Cuc_dmr6_fw2: ). Finalmente se amplificó y se secuenció la secuencia completa de ADNc de DMR6 de pepino (Figura 5). Un planteamiento similar se usó para espinaca, Spinacia oleracea (Figura 4), Solanum lycopersicum (Figura 12) y Nicotiana benthamiana (Figura 13).
Los ortólogos identificados tal como se han descrito en este ejemplo se pueden modificar usando técnicas bien conocidas para inducir mutaciones que reducen la expresión de DMR6 o la actividad, para obtener plantas no genéticamente modificadas resistentes a Fungi u Oomycota. Alternativamente, la información genética de los ortólogos se puede usar para diseñar vehículos para el silenciamiento del gen, y para transformar las correspondientes plantas de cultivo para obtener plantas que sean resistentes a Oomycota.
Ejemplo 3
Mutación de semillas
Las semillas de la especie vegetal de interés se tratan con un mutágeno para introducir al azar las mutaciones puntuales en el genoma. Se hacen crecer las plantas mutadas para producir semillas y la siguiente generación se sometió a cribado para la ausencia de reducción de los niveles de transcrito de DMR6 o actividad. Esto se alcanza mediante el seguimiento del nivel de la expresión del gen DMR6, o mediante la investigación de los cambios de nucleótido (mutaciones) mediante el método TILLING, mediante secuenciación de ADN, o mediante cualquier otro método para identificar los cambios de nucleótido. Las plantas seleccionadas son homocigóticas o se hacen homocigóticas por autocruzamiento o entrecruzamiento Se ensayó la resistencia aumentada al patógeno de interés para confirmar la resistencia a enfermedad deseada en las plantas homocigóticas seleccionadas con ausencia o actividad de transcrito de DMR6 reducida.
Ejemplo 4
Transferencia de un alelo mutado dentro del ambiente de un cultivo deseado
La introgresión del alelo mutante deseado en un cultivo se alcanza mediante cruzamiento y cribado genotípico del alelo mutante. Esto es un procedimiento estándar en actual reproducción por asistente de marcadores de cultivos.
Ejemplo 5
Uso del promotor DMR6 para la expresión del gen inducido por patógeno y la generación de plantas resistentes a enfermedad
El control preciso de la expresión del transgen es crucial a la producción por ingeniería de plantas con resistencia a enfermedad aumentada. En el pasado, la sobreexpresión constitutiva de los transgenes frecuentemente ha dado como resultado plantas de escasa calidad. Por lo tanto, se ha sugerido usar promotores inducibles a patógeno, por los cuales se expresan los transgenes solamente cuando y donde se necesite, en sitios de infección.
La expresión local e inducible de los genes modificados por ingeniería, por ejemplo genes de cambio maestros, elicitor o genes Avr, genes antimicrobianos, o genes tóxicos, da como resultado la activación de defensa o muerte
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celular que conducirá a resistencia a patógeno, tal como se describe por Gurr and Rushton (Trends in Biotechnology
23: 275-282, 2005). Un buen ejemplo es proporcionado por De wit (Annu. Rev. Phytopathol. 30: 391-418, 1992) quien propone el uso de la combinación Avr9-cf9 para alcanzar muerte celular inducida que conduce a resistencia a enfermedad. La especificidad a tejido y la inducibilidad de la expresión es de importancia principal para tales planteamientos, tal como se describe por Gurr and Rushton (Trends in Biotechnology 23: 283-290, 2005).
Se ha demostrado que el promotor DMR6 demuestra una fuerte expresión inducible y localizada basada en el análisis promotor-GUS. Por tanto, el promotor DMR6 es muy adecuado para la modificación por ingeniería de la resistencia a enfermedad en plantas transgénicas. El promotor DMR6 consiste en una región de 2,5 kb que está en dirección 5’ de la secuencia codificadora de DMR6 de Arabidopsis (ATG codón de inicio) e incluye el 5’UTR (tal como se representa en la Figura 11). A continuación, se usa este promotor inducible a patógeno para modificar por ingeniería construcciones de transgen adecuados, usando técnicas estándar conocidas por los expertos en la técnica.
Usando secuencias de ADN ortólogas de una especie vegetal dada se diseñaron cebadores para PCR. A continuación, estos se usan para el cribado de bibliotecas genómicas de la especie vegetal de interés para identificar los clones genómicos que contienen el ortólogo DMR6 con su promotor y secuencias reguladoras. Alternativamente, se aíslan los clones genómicos mediante cribado de una biblioteca con un fragmento de PCR marcado que corresponde al gen ortólogo DMR6. La secuenciación revela la secuencia de nucleótidos del promotor. A continuación la región de 2-5 kb en dirección 5’ la secuencia codificadora ortóloga DMR6 (ATG codón de inicio), incluyendo por tanto la 5’UTR, se amplifica por PCR para modificar por ingeniería construcciones de transgen para la transformación de la planta.
Ejemplo 6
Este ejemplo demuestra la complementación de dmr6-1 mutante en Arabidopsis thaliana mediante ortólogos DMR6 de 4 especies de cultivo diferentes. Para esto, los ortólogos DMR6 de Cucumis sativa (Cs), Spinacia oleracea (So), Lactuca sativa (Ls) y Solanum lycopersicum (Sl) se clonaron dentro de un vector de expresión vegetal bajo el control del promotor 35S y, posteriormente, este vector se transformó en un mutante dmr6-1 de Arabidopsis thaliana.
En resumen, se aisló ARNm usando métodos estándar y se sintetizó ADNc usando un cebador oligo dT y métodos estándar. Posteriormente, se generaron fragmentos de PCR usando pares de cebador para cada cultivo tal como se representa en la tabla 3 de a continuación. Los productos de PCR generados se clonaron en un vector pENTR/D-TOPO usando el kit de clonación pENTR/D-TOPO de Invitrogen y los plásmidos resultantes con tamaños correctos de inserto, tal como los determinados por PCR, se analizaron por secuenciación de ADN. La recombinación al vector pB7WG2,0 se hizo usando LR clonase II de Invitrogen y se analizaron los plásmidos resultantes por PCR y la digestión con enzimas de restricción. Se transformaron los plásmidos adecuados en Agrobacterium tumefaciens C58C1 PGV2260 y se analizaron los plásmidos de Agrobacterium por PCR y la digestión con enzimas de restricción.
Las plantas dmr6-1 de Arabidopsis thaliana se transformaron con las anteriores construcciones sumergiendo en disolución de Agrobacterium y se verificó la sobreexpresión de cultivos DMR6 en plantas T1 de Arabidopsis mediante RT-PCR usando los cebadores de clonación de cultivos DMR6 (tabla 3). Finalmente, las plantas T2 y T3 de Arabidopsis fueron infectadas con Hyaloperonospora parasitica Cala2 para confirmar la complementación. Los resultados se muestran en la figura 4.
Tal como se muestra en la figura 14, todos los ortólogos DMR6 ensayados eran capaces de la complementación del dmr6-1 de Arabidopsis thaliana indicando que los ortólogos DMR6 identificados codifican proteínas DMR6 con una funcionalidad similar al DMR6 de Arabidopsis thaliana.
Tablas
La Tabla 1 enumera los números GI (del Inglés “GenInfo Identifier”) y el número de entrada de Genbank para las Etiquetas de Secuencia Expresada (ESTs, del Inglés “Expressed Sequence Tags)y las secuencias de ARNm o proteína del ARNm de DMR6 de Arabidopsis y secuencias ortólogas de otras especies vegetales. Un número GI (“genInfo identifier”, algunas veces escrito en minúscula, “gi”) es un número entero único que identifica una secuencia particular. El número GI es una serie de dígitos que se asignan consecutivamente a cada registro de secuencia procesados por NCBI. Por tanto, el número GI cambiará todas las veces que cambie la secuencia. El NCBI asigna los números GI a todas las secuencias procesadas en Entrez, incluyendo secuencias de nucleótidos de DDBJ/EMBL/GenBank, secuencias de proteína de SWISS-PROT, PIR y muchos otros. Por tanto, el número GI proporciona un identificador de secuencia único que es independiente de la fuente de la base de datos que especifica una secuencia exacta. Si se modifica una secuencia en GenBank, incluso por un par de base sencillo, se asigna un nuevo número GI a la secuencia actualizada. El número de entrada sigue el mismo. El número GI es siempre estable y recuperable. Por tanto, la referencia a los números GI en la tabla proporciona una identificación clara e inequívoca de la secuencia correspondiente.
Tabla 1
Especie
Nombre común Detalle Número GI Genbank
Arabidopsis thaliana
Berro de Thale ARNm 42568064 NM_122361
Aquilegia sp
Aquilegia ESTs 75461114 DT768847.1
74538666
DT745001.1
74562677
DT760187.1
75461112
DT768846.1
74562675
DT760186.1
Citrus sinensis
Naranja dulce ESTs 5793134 CX672037.1
57933368
CX673829.1
63078039
CX309185.1
Coffea canephora
Café ESTs 82485203 DV705375.1
82458236
DV684837.1
82461999
DV688600.1
82487627
DV707799.1
Gossypium hirsutum
Algodón ESTs 109842586 DW241146.1
48751103
C0081622.1
Sorghum bicolor
Sorgo ESTs 45992638 CN150358.1
57813436
CX614669.1
45985339
CN145819.1
57821006
CX622219.1
45989371
CN148311.1
57821495
CX622708.1
45959033
CN130459.1
45985193
CN145752.1
18058986
BM322209.1
45958822
CN130381.1
30164583
CB928312.1
Medicago truncatula
Carretón trucado Boceto de Genoma MtrDRAFT_AC119415 g1v1
proteína
92878635 ABE85154
Oryza sativa 1
Arroz Genoma OSJNBb0060105.4
proteína
18057095 AAL58118.1
Oryza sativa 2
ARNm 115450396 NM_001055334
proteína
115450397 NP_001048799
Oryza sativa 3
ARNm 115460101 NM_001060186
Especie
Nombre común Detalle Número GI Genbank
proteína
115460102 NP_001053651
Populus trichocarpa 1
Chopo Genoma: LG_XII: 3095392-3103694
proteína: Popr1_1:569679, eugene3.00120332
Populus trichocarpa 2
Chopo Genoma: LG_XV: 201426-209590
proteína: Poptr_1:732726, estExt_Genewisel_v1.C_LG_XV0083
Solanum lycopersicum 1
Tomate ESTs 62932307 BW689896.1
58229384
BP885913.1
117682646
DB678879.1
5894550
AW035794.1
117708809
DB703617.1
62934028
BW691617.1
15197716
BI422913.1
4381742
AI486371.1
5601946
AI896044.1
4387964
AI484040.1
4383017
AI487646.
5278230
AI780189.1
12633558
BG133370.1
76572794
DV105461.1
117692514
DB718569.1
4385331
AI489960.1
4383253
AI487882.1
4384827
AI489456.1
Solanum lycopersicum 2
Tomate ESTs 47104686 BT013271.1
14685038
BI207314.1
14684816
BI207092.1
Zea mays
Maíz ESTs 110215403 EC897301.1
76291496
DV031064.1
91050479
EB160897.1
91874282
EB404239.1
110540753
EE044673.1
78111856
DV530253.1
94477588
EB706546.1
71441483
DR822533.1
Especie
Nombre común Detalle Número GI Genbank
78111699
DV530096.1
78107139
DV525557.1
76017449
DT944619.1
91048249
EB158667.1
78104908
DV523326.1
78088214
DV516607.1
76291495
DV031063.1
71441482
DR822532.1
78088213
DV516606.1
Vitis vinifera
Uvas ESTs 33396402 CF202029.1
33399765
CF205392.1
45770972
CN006824.1
45770784
CN006636.1
45770528
CN006380.1
45770631
CN006483.1
33400623
CF206250.1
33396335
CF201962.1
30134763
CB920101.1
30305300
CB982094.1
71857419
DT006474.1
30305235
CB982029.1
Zingiber officinale
Jengibre ESTs 87108948 DY375732.1
87095447
DY362231.1
87095448
DY362232.1
87094804
DY361588.1
87095449
DY362233.1
87094803
DY361587.1
Lactuca sativa
Lechuga Secuencia descrita en esta solicitud de patente
Spinacia oleracea
Espinaca Secuencia descrita en esta solicitud de patente
Cucumis sativa
Pepino Secuencia descrita en esta solicitud de patente
Nicotiana benthamiana
Tabaco Secuencia descrita en esta solicitud de patente
Tabla 2
Secuencias cebador de los marcadores de inserción/deleción (diferencia de tamaño entre paréntesis) usados en el mapeo y clonación del gen DMR6.
Nombre cebador
Gen INDEL/enzima Cebador directo Cebador inverso
IND_MOP9
At5G24210
IND_K16H17
At5g24420
IND_T4C12
At5g24820
IND_T11H3
At5g24950-60 cggcttttaacaacatattttcca
IND_F21J6
At5g25270
M450
At5G24450 18
M490
At5g24490 TaqI
M525
At5g24520-30 TaqI tcaagatcttcatattctcattcca
M545
At5G24540/50 41
M555
At5G24550/60 14
M470
At5g24470 HphI
M590
At5g24590 PdmI
Tabla 3 Pares de cebador para clonación de ortólogos dmr6 en un vector de expresión vegetal adecuado.
Arabidopsis thaliana
AtDMR6_fw imagen12
AtDMR6UTR_rv
imagen13
Cucumis sativa
cut_fw imagen14
cucUTR_rv
imagen15
Spinacia oleracea
spy_fw imagen16
spiUTR_rv
imagen17
Lactuca sativa
Leat_fw imagen18
LsatUTR_rv
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Solanum lycopersicum
Slyc1dmr6_fw imagen20
Slyc1dmr6UTR_rv
imagen21

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