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DE19927575A1 - Verfahren zur Erhöhung der Widerstandskraft von Kulturpflanzen gegen phytopathogene Pilze und Bakterien mit Hilfe molekulargenetischer Methoden - Google Patents

Verfahren zur Erhöhung der Widerstandskraft von Kulturpflanzen gegen phytopathogene Pilze und Bakterien mit Hilfe molekulargenetischer Methoden

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Publication number
DE19927575A1
DE19927575A1 DE19927575A DE19927575A DE19927575A1 DE 19927575 A1 DE19927575 A1 DE 19927575A1 DE 19927575 A DE19927575 A DE 19927575A DE 19927575 A DE19927575 A DE 19927575A DE 19927575 A1 DE19927575 A1 DE 19927575A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
hydroxylase
activity
plant
resistance
flavanone
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19927575A
Other languages
English (en)
Inventor
Wilhelm Rademacher
John-Bryan Speakman
Eberhard Ammermann
Thorsten Jabs
Karin Herbers
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
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Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
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Priority to EP00945715A priority patent/EP1102856A1/de
Priority to TR2001/00561T priority patent/TR200100561T1/xx
Priority to HU0103259A priority patent/HUP0103259A3/hu
Priority to IL14124900A priority patent/IL141249A0/xx
Priority to PL00346058A priority patent/PL346058A1/xx
Priority to JP2001505721A priority patent/JP2003505016A/ja
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Priority to BR0006873-0A priority patent/BR0006873A/pt
Priority to AU59705/00A priority patent/AU5970500A/en
Priority to ARP000103002A priority patent/AR024382A1/es
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Abstract

Verfahren zur Erhöhung der Widerstandskraft von Kulturpflanzen gegen bakterielle und pilzliche Pathogene, dadurch gekennzeichnet, daß mit molekulargenetischen Methoden eine Pflanze hergestellt wird, in der die Aktivität des Enzyms Chalconsynthese und/oder Plavanon-3-hydroxylase reduziert ist.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Erhö­ hung der Widerstandskraft von Kulturpflanzen gegen bakterielle und pilzliche Pathogene, dadurch gekennzeichnet, daß mit moleku­ largenetischen Methoden eine Pflanze hergestellt wird, in der die Aktivität des Enzyms Flavanon-3-hydroxylase reduziert ist.
Das Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Flavanon-3-hydroxylase durch molekularbiologische Verfahren (z. B. Anti-Sense-Konstrukte, Co-Suppressionen, der Expression spezifi­ scher Antikörper oder der Expression spezifischer Inhibitoren) ganz oder teilweise, andauernd oder vorübergehend, in der ge­ samten Pflanze oder in Teilen der Pflanze in seiner Aktivität ge­ hemmt wird.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Pflanzen mit erhöhter Widerstandskraft gegen bakterielle und pilzliche Pa­ thogene, dadurch gekennzeichnet, daß durch molekulargenetische Methoden die Aktivität des Enzyms Flavanon-3-hydroxylase redu­ ziert ist.
Die Produktivität von Kulturpflanzen kann in vielfältiger Weise durch Streßfaktoren reduziert werden. Zu nennen sind hier unter anderem: Virenerkrankungen, bakterielle und pilzliche Pathogene, schädigende Insekten, Nematoden, Schnecken, Wildverbiß, Hitze, Kühle, Kälte, Wassermangel, zu hoher Wassergehalt des Bodens, Bo­ denversalzung, zu hohe Strahlungsintensität, zu hoher Ozongehalt, Konkurrenz um Licht, Wasser und Nährstoffe durch Begleitflora, unsachgemäße oder nicht optimal auszubringende Herbizidanwendun­ gen (besonders in Obstkulturen), Behandlungen mit Herbiziden, Insektiziden, Fungiziden, Bioregulatoren oder Blattdüngern von zu geringer Selektivität, Blattapplikationen von Pflanzenschutzmit­ teln oder Düngern während intensiver Sonneneinstrahlung.
Eine Reihe dieser durch Stressoren hervorgerufenen Probleme kann durch den Einsatz von Pflanzenschutzmitteln, durch die Verwendung resistenten Pflanzenmaterials oder geeigneter Anbautechniken mi­ nimiert werden. Der Umfang dieser Möglichkeiten ist jedoch be­ grenzt. Insbesondere Bakteriosen sind, wenn überhaupt, nur sehr schwer zu bekämpfen. Dabei werden (z. B. gegen Feuerbrand bei Ap­ fel und Birne) Antibiotika wie Streptomycin oder Tetracycline eingesetzt, was die Gefahr einer Resistenzbildung auch bei Human­ pathogenen in sich birgt. Weiterhin zeigen z. B. pilzliche Patho­ gene häufig eine Anpassung an Fungizide, so daß deren Wirksamkeit nachläßt. Eine ähnliche Anpassung besteht auch bei "pathogenresi­ stenten" Züchtungen, die durch konventionelle Verfahren herge­ stellt werden.
Ein Bedarf an Pflanzen, die gegen Pathogene widerstandsfähig sind, besteht nicht nur bei einjährigen ackerbaulichen oder gärt­ nerischen Kulturen, sondern auch bei wertvollen Dauerkulturen wie Obst und Wein.
Aufgabe der Erfindung war es, ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur dauerhaften Verbesserung der Widerstandsfähigkeit gegen bakterielle und pilzliche Pathogene, insbesondere bei Kul­ turpflanzen, zu finden.
Ausgehend von physiologischen Untersuchungen mit Wachstums­ regulatoren aus der Gruppe der Acylcyclohexandione wurden nun überraschend gentechnologische Verfahren verfügbar, mit deren Hilfe sich Kulturpflanzen erzeugen lassen, die gegen eine Reihe von phytopathogenen Bakterien und Pilzen widerstandsfähig sind.
Acylcyclohexandione wie Prohexadion-Ca und Trinexapacethyl (äl­ tere Bezeichnung: Cimectacarb) werden als Bioregulatoren zur Hem­ mung des pflanzlichen Längenwachstums eingesetzt. Ihre bioregu­ latorische Wirkung kommt dadurch zustande, daß sie die Bio­ synthese von längenwachstumsfördernden Gibberellinen blockieren. Dabei hemmen sie aufgrund ihrer strukturellen Verwandtschaft zu 2-Oxoglutarsäure bestimmte Dioxygenasen, die 2-Oxoglutarsäure als Co-Substrat benötigen (Rademacher, W, Biochemical effects of plant growth retardants, in: Plant Biochemical Regulators, Gaus­ man, HW (ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 169-200 (1991)). Es ist bekannt, daß derartige Verbindungen auch in den Stoffwechsel von Phenolen eingreifen und so bei mehreren Pflan­ zenarten eine Hemmung der Anthocyanbildung bewirken können (Rade­ macher, W et al., The mode of action of acylcyclohexanediones - a new type of growth retardant, in: Progress in Plant Growth Regu­ lation, Karssen, cm, von Loon, LC, Vreugdenhil, D (eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1992)). Derartige Effekte auf den Haushalt phenolischer Inhaltsstoffe werden als ursächlich für die Nebenwirkung von Prohexadion-Ca gegen Feuerbrand angegeben (Rade­ macher, W et al., Prohexadione-Ca - a new plant growth regulator for apple with interesting biochemical features, Poster auf dem 25th Annual Meeting of the Plant Growth Regulation Society of Ame­ rica, 7.-10. Juli 1998, Chicago). A. Lux-Endrich (Dissertation Technische Universität München in Weihenstephan, 1998) findet im Verlauf ihrer Untersuchungen zum Wirkmechanismus von Prohexadion- Ca gegen Feuerbrand, daß es in Zellkulturen von Apfel durch Pro­ hexadion-Ca zu einer mehrfachen Erhöhung des Gehaltes an phenolischen Substanzen kommt und daß dabei eine Reihe von sonst nicht vorhandenen Phenolen auftritt. Im Rahmen dieser Untersu­ chungen wurde weiterhin gefunden, daß unter dem Einfluß von Pro­ hexadion-Ca relativ hohe Mengen von Luteoliflavan und Eriodyctiol in Sproßgewebe von Apfel auftreten. Luteoliflavan kommt in Apfel­ gewebe normalerweise nicht vor und Eriodyctiol tritt als Inter­ mediat des Flavonoidstoffwechsels nur in geringen Mengen auf. Die zu erwartenden Flavonoide Catechin und Cyanidin waren im behan­ delten Gewebe jedoch nicht nachweisbar oder traten nur in deut­ lich reduzierten Mengen auf (S. Römmelt et al. Vortrag 8th Inter­ national Workshop on Fire Blight, Kusadasi, Türkei, 12.-15. Okto­ ber 1998).
Es kann als gesichert gelten, daß Prohexadion-Ca, Trinexapac­ ethyl und andere Acylcyclohexandione 2-Oxoglutarsäure-abhängige Hydroxylasen inhibieren, die im Stoffwechsel phenolischer Sub­ stanzen von Bedeutung sind. Dabei handelt es sich primär um Chal­ consynthetase (CHS) und um Flavanon-3-hydroxylase (F3H) (W. Heller und G. Forkmann, Biosynthesis, in: The Flavonoids, Har­ borne, JB (ed.), Chapman and Hall, New York, 1988). Es kann je­ doch nicht ausgeschlossen werden, daß Acylcyclohexandione auch weitere, bislang unbekannte, 2-Oxoglutarsäure-abhängige Hydroxy­ lasen hemmen. Es dürfte ferner naheliegend sein, daß ein Mangel an Catechin, Cyanidin oder anderen Endprodukten der Flavonoid­ synthese von der Pflanze registriert wird und daß über einen Feedback-Mechanismus die Aktivität des Schlüsselenzyms Phenylala­ ninammoniumlyase (PAL) erhöht wird. Durch die weiterhin existie­ rende Hemmung von CHS und F3H können diese Flavoniod-Endprodukte jedoch nicht gebildet werden, und es kommt zu einer vermehrten Bildung von Luteoliflavan, Eriodyctiol und anderer Phenole (Abb. 1).
Durch die Reduktion der Enzymaktivität des Enzyms Flavanon-3-hy­ droxylase (F3H) werden die Flavonoide Eriodictyol, Proanthocyani­ dine, die am C-Atom 3 mit Wasserstoff substituiert sind, z. B. Lu­ teoforol, Luteoliflavan, Apigeniflavan und Tricetiflavan, sowie homogene und heterogene Oligomere und Polymere aus den genannten und strukturell verwandten Substanzen vermehrt gebildet.
Erhöhte Konzentrationen der Phenole Hydroxyzimtsäuren (p-Cumar­ säure, Ferulasäure, Sinapinsäure), Salicylsäure oder Umbellife­ ron, einschließlich der aus ihnen gebildeten homogenen und hete­ rogenen Oligomere und Polymere werden nach Reduktion der Enzym­ aktivität des Enzyms Flavanon-3-hydroxylase (F3H) in Pflanzen festgestellt. Ebenso erhöht sich die Konzentration der Chalcone, wie z. B. Phloretin, und der Stilbene, wie z. B. Resveratrol.
Durch Reduktion der Enzymaktivität des Enzyms Flavanon-3-hydroxy­ lase wird auch die Konzentration der Glykoside der Flavonoide, der phenolischen Verbindungen, der Chalcone und der Stilbene er­ höht.
Ausgehend von diesen Befunden und Schlußfolgerungen wurden gen­ technisch veränderte Kulturpflanzen erzeugt, in denen F3H durch Anti-Sense-Konstrukte ganz oder teilweise, dauerhaft oder vor­ übergehend, in der gesamten Pflanzen oder in einzelnen Pflanzen­ organen oder -geweben in ihren Aktivitäten reduziert war, mit der Folge, daß der Gehalt an phenolischen Verbindungen in der ganzen Pflanze reduziert ist. Experimentell konnte sodann gezeigt werden, daß diese Pflanzen in ihrer Widerstandsfähigkeit gegen bakterielle und/oder pilzliche Pathogene erhöht sind.
Alternativ zur Herstellung von Pflanzen, die mit Hilfe der Anti­ sense Technologie in ihrer Flavonon-3-hydorxylase Aktivität redu­ ziert sind, lassen sich auch andere literaturbekannte molekular­ genetische Methoden wie Co-Suppression oder die Expression von spezifischen Antikörpern verwenden, um diesen Effekt zu errei­ chen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Erhöhung der Widerstandkraft gegen den Befall mit bakteriellen und pilzlichen Pathogenen durch Reduktion der Flavonon-3-hydroxylase Enzymaktivität kann erfolg­ reich bei folgenden Kulturpflanzen ausgeübt werden: Weizen, Ger­ ste, Roggen, Hafer, Reis, Mais, Hirse, Zuckerrohr, Banane, To­ mate, Tabak, Paprika, Kartoffel, Raps, Zuckerrübe, Soja, Baum­ wolle, Obstgehölze aus der Familie der Rosaceen, wie Apfel und Birne, Pflaume, Zwetschge, Pfirsich, Nektarine und Kirsche sowie Weinreben.
Besonders geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Erhö­ hung der Widerstandskraft gegen Venturia inaequalis in Apfel und Birne sowie gegen Botrytis cinerea bei Weinreben.
Transgene Pflanzen mit reduzierter Aktivität des Enzyms Flava­ non-3-hydroxylase hergestellt nach der in den Beispielen be­ schriebenen Methode zeigen überraschenderweise eine erhöhte Wi­ derstandskraft gegenüber dem Befall mit phytopathogenen Bakte­ rien. Dies konnte am Beispiel des Befalls von transgenen Tomaten­ pflanzen, deren Flavanon-3-hydroxylase Aktivität reduziert ist, mit Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (C mm) gezeigt werden, siehe Beispiel 3.
Pflanzen, dessen Flavanon-3-hydroxylase mit Hilfe von molekular­ genetischen Methoden reduziert wurde, zeigten auch eine erhöhte Widerstandkraft gegen Befall mit Erwinia amylovora und anderen phytopathogenen Bakterien. Die wichtigsten phytopathogenen Bakte­ rien können aus der Publikation "European Handbook of Plant Di­ seases", Eds. Smith, I. M., Dunez, J., Lelliott, R. A. Phillips, D. H. and Archer, S. A. Blackwell Scientific Publications, 1988, entnommen werden.
Insbesondere eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Erhö­ hung der Widerstandskraft gegen folgende pflanzenpathogene Pilze:
Erysiphe graminis (echter Mehltau) an Getreide
Erysiphe cichoracearum und Sphaerotheca fuliginea an Kürbisge­ wächsen
Podosphaera leucotricha an Äpfeln,
Uncinula necator an Reben,
Puccinia-Arten an Getreide,
Rhizoctonia-Arten an Baumwolle, Reis und Rasen,
Ustilago-Arten an Getreide und Zuckerrohr,
Venturia-Arten (Schorf) an Äpfeln und Birnen
Helminthosporium-Arten an Getreide,
Septoria-Arten an Weizen
Botrytis cinerea (Grauschimmel) an Erdbeeren, Gemüse, Zierpflan­ zen und Reben,
Cercospora arachidicola an Erdnüssen,
Pseudocercosporella herpotrichoides an Weizen und Gerste,
Pyricularia oryzae an Reis,
Phytophthora infestans an Kartoffeln und Tomaten,
Plasmopara viticola an Reben,
Pseudoperonospora-Arten in Hopfen und Gurken,
Alternaria-Arten an Gemüse und Obst,
Mycosphaerella-Arten in Bananen und Erdnüssen sowie Fusarium- und Verticillium-Arten in Getreide, Gemüse und Zier­ pflanzen.
Beispiel 1
Klonierung des Gens einer Flavanone-3-Hydroxylase aus Lycopersicon esculentum Mill.cv. Moneymaker.
Reife Tomatenfrüchte von Lycopersicon esculentum Mill.cv. Mo­ neymaker wurden gewaschen, getrocknet und mittels einer sterilen Klinge das Perikarp von Samen, mittlere Kolumnella und Holzteilen befreit. Das Perikarp (ca. 50 g) wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren. Das Material wurde anschliessend in einem Mixer zer­ kleinert. Das zerkleinerte Material wurde in einem vorgekühlten Mörser mit 100 ml Homogenisierungs-Medium versetzt und gemischt. Die Suspension wurde dann in Zentrifugenbecher überführt, indem es durch sterile Mulltücher gepreßt wurde. Anschließend wurde 1/10 Vol 10% SDS hinzugefügt und gut gemischt. Nach 10 Minuten auf Eis, wurde 1 Vol Phenol/Chloroform zugegeben, der Zentrifu­ genbecher verschlossen und gut gemischt. Nach 15 minütiger Zen­ tritugation bei 4000 rpm wurde der Überstand in ein neues Reakti­ onsgefäß überführt. Es schlossen sich drei weitere Phenol/Chloro­ form Extraktionen und eine Chloroform Extraktion an. Im folgenden wurde 1 Vol 3 M NaAC und 2.5 Vol Ethanol zugegeben. Die Fällung der Nukleinsäuren erfolgte über Nacht bei -20°C. Am nächsten Mor­ gen wurden die Nukleinsäuren für 15 Minuten bei 10000 rpm in der Kühlzentrifuge (4°C) pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 5-10 ml kaltem 3 M NaAc resuspendiert. Dieser Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Das Pellet wurde mit 80%igem Ethanol gewaschen. Das vollständig getrocknet Pellet wurde in ca. 0,5 ml sterilem DEPC Wasser aufgenommen und die RNA- Konzentration photometrisch bestimmt.
20 µg gesamt RNA wurden zunächst mit 3,3 µl 3 M Natriumacetat-Lö­ sung, 2 µl 1 M Magnesiumsulfat-Lösung versetzt und auf 100 µl End­ volumen mit DEPC Wasser aufgefüllt. Dazu wurde ein Microliter Rnase freie Dnase (Boehringer Mannheim) gegeben und 45 min bei 37° Grad inkubiert. Nach Entfernen des Enzyms durch ausschütteln mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol wurde die RNA mit Ethanol ge­ fällt und das Pellet in 100 µl DEPC Wasser aufgenommen. 2,5 µg RNA aus dieser Lösung wurden mittels eines cDNA-Kits (Gibco BRL) in cDNA umgeschrieben.
Unter Verwendung von Aminosäuresequenzen die aus für Flava­ none-3-Hydroxylase kodierenden cDNA Klonen abgeleitet wurden, konnten konservierte Bereiche in der Primärsequenz identifiziert werden (Britsch et al., Eur. J. Biochem. 217, 745-754 (1993), die als Grundlage für das Design von degenerierten PCR Oligo­ nukleotiden dienten. Das 5' Oligonukleotid wurde unter Verwendung der Peptidsequenz SRWPDK (Aminosäure 147-152 in der Sequenz FL3H PETHY aus Petunia hybrida) ermittelt und hatte folgende Se­ quenz:
5'-TCI (A/C) G (A/G) TGG CC(A/C/G) GA (C/T) AA (A/G) CC-3.
Die Sequenz des unter Verwendung der Peptidsequenz DHQAW (Amino­ säure 276281 in der Sequenz FL3H PETHY aus Petunia hybrida) abge­ leiteten Oligonukleotides lautete wie folgt: 5'-CTT CAC ACA (C/G/T) GC (C/T) TG (A/G)TG (A/G)TC-3.
Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung der tTth-Polymerase von Perkin-Elmer nach Herstellerangaben durchgeführt. Als Template wurden 1/8 der cDNA eingesetzt (entspricht 0,3 µg RNA). Das PCR- Programm lautete:
AL=L<30 Zyklen
94 Grad 4 sec
40 Grad 30 sec
72 Grad 2 min
72 Grad 10 min
Das Fragment wurde nach Herstellerangaben in den Vektor pGEM-T von Promega kloniert.
Die Richtigkeit des Fragmentes wurde durch Sequenzierung über­ prüft. Das PCR Fragment wurde unter Verwendung der im Polylinker des Vektors pGEM-T vorhandenen Restriktionsschnittstellen Ncol und Pstl isoliert und die überstehenden Enden unter Verwendung der T4-Polymerase und glatte Enden überführt. Dieses Fragment wurde in einen Smal (blunt)geschnittenen Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Sci. 66 : 221-230 (1990)) kloniert (siehe Abb. 2). Dieser enthält den 35S-Promotor des CaMV (Blumen­ kohlmosaikvirus) (Franck et al., Cell 21 : 285-294 (1980)) und das Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens (Gielen et al., EMBO J. 3 : 835-846(1984)). Dieser Vector vermittelt in Pflan­ zen Resistenz gegen das Antibiotikum Kanamycin. Die erhaltenen DNA Konstrukte enthielten das PCR Fragment in Sense und Antisense Orientierung. Das Antisensekonstrukt wurde zur Erzeugung transgener Pflanzen eingesetzt.
Abb. 2: Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S-Promotor des CaMV (Nukleotide 6909 bis 7437 des Blumenkohlmosaikvirus). Frag­ ment B das Fragment des F3H Gens in Antisense-Orientierung. Frag­ ment C (192 Bp) enthält das Terminationssignal des Octopin-Syn­ thase Gens.
Klonierung eines größeren cDNA Fragmentes der Flavanone-3-Hydro­ xylase aus Lycopersicon esculentum Mill.cv. Moneymaker unter Verwendung des 5'RACESystems.
Um auszuschließen, dass die Erzeugung von Pflanzen mit reduzier­ ter mRNA Fließgleichgewichtsmenge der F3H aufgrund der geringen Größe des im Antisensekonstrukt verwendeten F3H PCR Fragmentes nicht erfolgreich ist, sollte ein zweites Antisense-Konstrukt unter Verwendung eines größeren F3H Fragmentes erzeugt werden.
Zum Zweck der Klonierung eines größeren Fragmentes der F3H wurde die 5'RACE Methode (System for Rapid amplification of cDNA ends) angewendet.
Verlängerung des F3H PCR Fragmentes durch die 5'RACE-Methode unter Verwendung des 5'RACE System for rapid amplification of cDNA ends, Version 2 ~ 0 von Life Tecgnologies™.
Aus reifen Tomatenfrüchten von Lycopersicon esculentum Mill.cv.Mo­ neymaker wurde gesamt RNA isoliert (siehe oben).
Die cDNA Erststrang-Synthese wurde nach Herstellerangaben unter Verwendung des GSP-1 (Gen spezifischer Primer) 5'-TTCAC- CACTGCCTGGTGGTCC-3' durchgeführt. Im Anschluß an einen Rnase Ver­ dau, wurde die cDNA unter Anwendung des GlassMAX spin Systems von Life Tecgnologies™ gemäß den Herstellerangaben aufgereinigt.
An das 3'Ende der gereinigten einzelsträngigen F3H cDNA wurde unter Verwendung der terminalen deoxynukleotydil-Transferase ge­ mäß den Herstellerangaben ein Cytosin Homopolymer addiert.
Die Amplifikation der 5' verlängerten F3H cDNA erfolgte unter Verwendung eines zweiten Gen spezifischen Primers (GSP-2) der im Bereich 3' vor der GSP-1 Erkennungssequenz bindet und somit eine "nested" PCR ermöglichte. Als 5'Primer wurde der vom Hersteller gelieferte "5'RACE abrided anchor primer" verwendet, der komple­ mentär zum homopolymeren dC-Schwanz der cDNA ist.
Das so amplifizierte und als F3Hextended bezeichnete cDNA Fragment wurde nach Herstellerangaben in den Vektor pGEM-T von Promega kloniert.
Die Identität der cDNA wurde durch Sequenzierung bestätigt.
Das F3Hextended cDNA Fragment wurde unter Verwendung der im Poly­ linker des Vektors pGEM-T vorhandenen Restriktionsschnittstellen Ncol und Pstl isoliert und die überstehenden Enden unter Verwendung der T4-Polymerase und glatter Enden überführt. Dieses Fragment wurde in einen Smal (blunt) geschnittenen Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990) kloniert (siehe Abbildung . . .). Die­ ser enthält den 35S-Promotor des CaMV (Blumenkohlmosaikvirus) (Franck et al., 1980) und das Terminationssignal des Octopin-Syn­ thase Gens (Gielen et al., 1984). Dieser Vektor vermittelt in Pflanzen Resistenz gegen das Antibiotikum Kanamycin. Die erhaltenen DNA Konstrukte enthielten das PCR Fragment in Sense und Antisense Orientierung. Das Antisensekonstrukt wurde zur Er­ zeugung transgener Pflanzen eingesetzt.
Abb. 3: Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S-Promotor des CaMV (Nukleotide 6909 bis 7437 des Blumenkohlmosaikvirus). Frag­ ment B das Fragment des F3H Gens in Antisense-Orientierung. Frag­ ment C (192 Bp) enthält das Terminationssignal des Octopin-Syn­ thase Gens.
Beispiel 2
Herstellung transgener Lycopersicon esculentum Mill.cv. Moneyma­ ker die ein Teilfragment der Flavanone-3-Hydroxylase in Antisense Orientierung exprimieren.
Es wurde die Methode nach Ling et al., Plant Cell Report 17, 843-847 (1998) genutzt. Die Kultivierung erfolgt bei ca. 22°C unter einem 16 h-Licht/8 h-Dunkel-Regime.
Tomatensamen (Lycopersicon esculentum Mill. cv. Moneymaker) wur­ den durch 10 minütige Inkubation in 4%iger Natriumhypochlorit­ lösung inkubiert, anschließend 3-4 mal mit sterilem destili­ siertem Wasser gewaschen und auf MS Medium mit 3% Saccharose, pH 6,1 zur Keimung ausgelegt. Nach einer Keimdauer von 7-10 d konnten die Kotyledonen für die Transformation eingesetzt werden.
Tag 1: Petrischalen mit dem Medium "MSBN" wurden mit 1,5 ml einer ca. 10 d alten Tabaksuspensionskultur überschichtet. Die Platten wurden mit Folie abgedeckt und bis zum nächsten Tag bei Raumtem­ peratur inkubiert.
Tag 2: Auf die mit der Tabaksuspensionskultur beschichteten Plat­ ten wurde steriles Filterpapier luftblasenfrei aufgelegt. Darauf wurden die quer geschnittenen Keimblätter mit der Oberseite nach unten aufgelegt. Die Petrischalen wurden für 3 Tage im Kulturen­ raum inkubiert.
Tag 5: Die Agrobakterienkultur (LBA4404) wurde durch Zentri­ fugation bei ca. 3000 g für 10 min sedimentiert und in MS-Medium resuspendiert, so daß die OD 0,3 beträgt. In diese Suspension wurden die Keimblattstückchen gegeben, die unter leichtem Schüt­ teln für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurden. An­ schließend wurden die Keimblattstückchen auf sterilem Filterpa­ pier etwas abgetrocknet und wieder zurück auf ihre Ausgangsplat­ ten für die Fortsetzung der Cocultivierung für 3 Tage im Kultu­ renraum gelegt.
Tag 8: Die cocultivierten Keimblattstückchen wurden auf MSZ2K50+β gelegt und für die nächsten 4 Wochen im Kulturenraum inkubiert. Danach erfolgte die Subkultivierung.
Sich bildende Sprosse wurden auf Wurzelinduktionsmedium gebracht.
Nach erfolgreicher Bewurzelung konnten die Pflanzen getestet und ins Gewächshaus überführt werden.
Beispiel 3
Transgene Tomatenpflanzen mit reduzierter Flavanon-3-hydroxylase Aktivität wurden mit Clavibacter michiganensis subsp. michiganen­ sis (Cmm) infiziert.
Cmm wurde auf Hefe-Dextrose-Ca Agar (YDC) bei 28°C 2 Tage kulti­ viert. Die Bakterien wurden mit sterilem Wasser abgeschwemmt und ihre Zelldichte bestimmt. Zur Inokulation wurde die Zelldichte mit sterilem Wasser auf 106 Zellen/ml eingestellt. Die Injektio­ nen wurden mit Injektionsnadeln (Nr. 20), die mit der Bakterien­ suspension gefüllt waren, durchgeführt. Sie erfolgten in die Blattachsel des obersten voll entwickelten Blattes junger Pflan­ zen, die insgesamt 3-4 Blätter besaßen. Die Evaluierung der In­ fektion erfolgte durch Beurteilung des sich entwickelnden Phäno­ typs.
Während in Wildtyp-Pflanzen mehr als 75% der Blätter verwelkt waren, war demgegenüber in den transgenen Tomatenpflanzen ein si­ gnifikant geringerer Verwelkungsgrad zu verzeichnen.
Beispiel 4
Test auf Erhöhung der Widerstandskraft gegen den Befall mit Phytophthora infestans in Tomaten mit Flavanon-3-hydroxylase in Antisens-Orientierung.
Die Blätter von nicht gentechnisch modifizierten bzw. erfindungs­ gemäß gentechnisch modifizierten Tomatenpflanzen der Sorte "Mo­ neymaker" wurden eine Woche nach dem 4-Blattstadium mit einer wäßrigen Zoosporenaufschwemmung von Phytophthora infestans infi­ ziert. Anschließend wurden die Pflanzen in einer wasserdampf­ gesättigten Kammer bei Temperaturen zwischen 16 und 180° aufge­ stellt. Nach 6 Tagen hatte sich die Krautfäule auf den gentech­ nisch nicht modifizierten Kontrollpflanzen so stark entwickelt. Tomatenpflanzen, die ein Antisens-Konstrukt der Flavanon-3-hydro­ xylase exprimierten zeigten einen deutlich geringeren Befall mit Phytophthora infestans als die Kontrolle.

Claims (6)

1. Verfahren zur Erhöhung der Widerstandskraft von Kulturpflan­ zen gegen bakterielle und pilzliche Pathogene, dadurch ge­ kennzeichnet, daß mit molekulargenetischen Methoden eine Pflanze hergestellt wird, in der die Aktivität des Enzyms Flavanon-3-hydroxylase reduziert ist.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Flavanon-3-hydroxylase durch molekularbiologische Ver­ fahren (z. B. Anti-Sense-Konstrukte, Co-Suppressionen, der Ex­ pression spezifischer Antikörper oder der Expression spezifi­ scher Inhibitoren) ganz oder teilweise, andauernd oder vor­ übergehend, in der gesamten Pflanze oder in Teilen der Pflanze in seiner Aktivität gehemmt wird.
3. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeich­ net, daß es sich bei den Kulturpflanzen um Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Reis, Mais, Hirse, Zuckerrohr, Banane, Tomate, Tabak, Paprika, Kartoffel, Raps, Zuckerrübe, Soja, Baumwolle, Obstgehölze aus der Familie der Rosaceen, wie Apfel und Birne, Pflaume, Zwetschge, Pfirsich, Nektarine und Kirsche sowie um Weinreben handelt.
4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Widerstandskraft gegen Venturia inaequalis in Apfel und Birne erhöht wird.
5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Widerstandskraft gegen Botrytis cinerea bei Weinreben erhöht wird.
6. Pflanze mit erhöhter Widerstandskraft gegen bakterielle und pilzliche Pathogene, dadurch gekennzeichnet, daß durch mole­ kulargenetische Methoden die Aktivität des Enzyms Flava­ non-3-hydroxylase reduziert ist.
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