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ES2562187T5 - Plantas resistentes a enfermedades - Google Patents

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ES2562187T5 ES12155893T ES12155893T ES2562187T5 ES 2562187 T5 ES2562187 T5 ES 2562187T5 ES 12155893 T ES12155893 T ES 12155893T ES 12155893 T ES12155893 T ES 12155893T ES 2562187 T5 ES2562187 T5 ES 2562187T5
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Description

DESCRIPCIÓN
Plantas resistentes a enfermedades
La presente invención se refiere a plantas de col resistentes a enfermedades, en particular a plantas de col resistentes a Hyaloperonospora parasítica. La invención se refiere además a métodos para obtener dichas plantas de col resistentes a enfermedades.
La resistencia de las plantas a agentes patógenos fúngicos y oomicéticos ha sido ampliamente estudiada en cuanto a las resistencias tanto específica como general a agentes patógenos. En muchos casos, la resistencia viene especificada por genes dominantes para la resistencia. Se han identificado muchos de estos genes de resistencia específicos de razas o de "gen por gen" que median en el reconocimiento de agentes patógenos al interaccionar directa o indirectamente con productos de genes de no virulencia u otras moléculas del agente patógeno. Este reconocimiento conduce a la activación de una gran variedad de respuestas de defensa de la planta que detienen el crecimiento del agente patógeno.
En el cultivo de plantas hay una constante lucha para identificar nuevas fuentes de genes de resistencia dominantes sobre todo monogénicos. En variedades cultivadas con genes de resistencia individuales recientemente introducidos, la protección frente a la enfermedad se quiebra a menudo rápidamente porque los agentes patógenos evolucionan y se adaptan con una elevada frecuencia y recuperan la capacidad para infectar exitosamente la planta huésped. Por lo tanto, es muy necesaria la disponibilidad de nuevas fuentes de resistencia a enfermedades.
Por ejemplo, mecanismos de resistencia alternativos actúan a través de la modulación de la respuesta de defensa en las plantas, tal como la resistencia mediada por el gen recesivo mlo de la cebada al agente patógeno Blumeria graminis f.sp. hordei del oídio. Las plantas que portan alelos mutados del gen MLO de tipo silvestre presentan una resistencia casi completa que coincide con el fracaso del intento de penetración fúngica en la pared celular de células epidérmicas atacadas individuales. De este modo, el gen MLO de tipo silvestre actúa como un regulador negativo de la respuesta del agente patógeno. Esto se describe en el Documento WO9804586.
Otros ejemplos son los genes recesivos de resistencia al oídio hallados en una exploración de pérdida de susceptibilidad a Erysiphe cichoracearum. Hasta ahora se han clonado tres genes, denominados PMR6, que codifica una proteína de tipo pectato liasa, PMR4, que codifica una callosa sintasa, y PMR5, que codifica una proteína de función desconocida. Parece que tanto el gen mlo como el gen pmr confieren específicamente resistencia al oídio y no a oomicetos tales como los de los mildiús vellosos.
La resistencia general a agentes patógenos, o formas sistémicas de resistencia tales como SAR, se han obtenido de dos modos principales. El primero es por mutación de reguladores negativos de la defensa de las plantas y la muerte celular, tal como en los mutantes cpr, Isd y acd de Arabidopsis. El segundo es por sobreexpresión transgénica de inductores o reguladores de la defensa de las plantas, tal como en plantas que sobreexpresan NPR1.
La desventaja de estos mecanismos de resistencia conocidos es que, además de resistencia a agentes patógenos, estas plantas muestran a menudo fenotipos adicionales e indeseables detectables, tales como un crecimiento raquítico o la aparición espontánea de muerte celular.
Un objeto de la presente invención es proporcionar una forma de resistencia que sea general y duradera y no esté asociada con fenotipos indeseables.
En la investigación que condujo a la presente invención se llevó a cabo una exploración de mutantes de Arabidopsis thaliana en cuanto a una susceptibilidad reducida al agente patógeno Hyaloperonospora parasítica del mildiú velloso. Se generaron mutantes por EMS en la muy susceptible línea Ler eds1-2 de Arabidopsis. Se analizaron con detalle ocho mutantes resistentes al mildiú velloso (dmr; del inglés, downy mildew resistant), correspondientes a 6 loci diferentes. Un análisis microscópico mostró que en todos los mutantes estaba acusadamente reducido el crecimiento de H. parasitica. La resistencia de dmr3, dmr4 y dmr5 estaba asociada con la activación constitutiva de la defensa de la planta. Además, los mutantes dmr3 y dmr4 pero no dmr5 eran también resistentes a Pseudomonas syringae y Golovinomyces orontii.
Por contraste, no se observó activación potenciada de la defensa de la planta en los mutantes dmr1, dmr2 ni dmr6. Los resultados de esta investigación han sido descritos por Van Damme et al. (2005), Molecular Plant-Microbe Interactions 18 (6), 583-592. En este artículo no se describen la identificación ni la caracterización de los genes DMR. El mutante dmr6 fue identificado en una exploración de "pérdida de susceptibilidad" en el fondo genético Lereds1-2 de Arabidopsis. El gen DMR6 ha sido ahora clonado y caracterizado. De este modo, se halló que DMR6 es el gen At5g24530, que codifica una oxidorreductasa (en la Figura 2 se representan el DNA y la secuencia de aminoácidos). Las oxidorreductasas son enzimas que catalizan la transferencia de electrones de una molécula, el oxidante, a otra, el reductor. De acuerdo con la presente invención, se ha hallado que la falta de una proteína DMR6 funcional da lugar a resistencia al mildiú velloso.
La presente invención proporciona una planta de col que es resistente a Hyaloperonospora parasitica, como se define en las reivindicaciones adjuntas.
La resistencia a Hyaloperonospora parasítica se basa en un nivel alterado, en particular un nivel reducido, o una ausencia completa de la proteína DMR6 en una planta.
La modulación del gen DMR6 para reducir su expresión puede ser llevada a cabo en diferentes niveles. En primer lugar, se puede mutar directamente el gen endógeno. Esto puede ser llevado a cabo por medio de un tratamiento mutagénico. Alternativamente, se puede llevar un gen DMR6 modificado a la planta por medio de técnicas transgénicas o por introgresión, o se puede reducir la expresión de DMR6 a nivel regulador, por ejemplo, modificando las secuencias reguladoras o por silenciamiento génico.
Un nivel reducido de proteína DMR6 es el resultado de una mutación en el gen DMR6 que da lugar a una expresión reducida de DMR6 en comparación con el gen DMR6 de tipo silvestre en el que no está presente tal mutación, o que da lugar a una estabilidad reducida del mRNA o la proteína.
En otra realización de la invención, se puede alcanzar la expresión reducida por infrarregulación de la expresión del gen DMR6 a nivel transcripcional o a nivel traduccional, por ejemplo, mediante silenciamiento génico o mediante mutaciones que afecten a la expresión del gen DMR6.
Para alcanzar un nivel reducido de proteína DMR6, se puede infrarregular la expresión del gen DMR6.
En una realización particular de la invención, la infrarregulación de la expresión del gen DMR6 se lleva a cabo por silenciamiento génico usando RNAi. Para esto, se generan plantas transgénicas que expresan una construcción antisentido de DMR6, una construcción optimizada de micro-RNA, una construcción de repeticiones invertidas o una construcción sentido-antisentido combinados, para generar un dsRNA correspondiente a DMR6 que conduzca a silenciamiento génico.
La infrarregulación del gen DMR6 puede ser llevada también a cabo por mutagénesis de los elementos reguladores en el promotor, la región terminadora, o posibles intrones. En muchos casos, las mutaciones en la secuencia de codificación de DMR6 conducen a sustituciones de aminoácidos o codones de parada prematuros que afectan negativamente a la expresión.
Estas mutaciones se inducen en las plantas utilizando productos químicos mutagénicos tales como metanosulfonato de etilo (EMS; del inglés, ethyl methanesulfonate), por irradiación de material vegetal con rayos gamma o neutrones rápidos, o por otros medios. Los cambios nucleotídicos resultantes son aleatorios pero, en una gran colección de plantas sometidas a mutagénesis, las mutaciones en el gen DMR6 pueden ser fácilmente identificadas utilizando el método de "focalización de lesiones inducidas locales en genomas" (TILLING; del inglés, targeting induced local lesions in genomes) [McCallum et al. (2000), Targeted screening for induced mutations, Nat. Biotechnol. 18, 455­ 457; y Henikoff et al. (2004), TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics, Plant Physiol. 135, 630­ 636]. El principio de este método se basa en la multiplicación, por PCR, del gen de interés a partir de DNA genómico de una gran colección de plantas sometidas a mutagénesis en la generación M2. Secuenciando el DNA o buscando mutaciones puntuales utilizando una nucleasa específica de cadena sencilla, tal como la nucleasa CEL-I [Till et al. (2004), Mismatch cleavage by single-strand specific nucleases, Nucleic Acids Res. 32, 2632-2641], se identifican las plantas individuales que tienen una mutación en el gen de interés.
Explorando muchas plantas se obtiene una gran colección de alelos mutantes, proporcionando cada uno un efecto diferente sobre la expresión génica. Los niveles de expresión génica o de proteína pueden ser examinados, por ejemplo, mediante el análisis de los niveles de transcritos de DMR6 (por ejemplo, por RT-PCR) o mediante la cuantificación de los niveles de proteína DMR6 con anticuerpos.
Las plantas con el nivel de DMR6 o la expresión de DMR6 reducidos deseados son luego retrocruzadas o cruzadas con otras líneas de cultivo para transferir sólo el nuevo alelo deseado al fondo genético del cultivo deseado.
Se describe el uso de un promotor DMR6 para proporcionar resistencia a enfermedades a las plantas. Se ha demostrado la suprarregulación transcripcional de DMR6 en respuesta a una infección por Hyaloperonospora parasítica. Tanto el análisis de transcritos como las líneas de promotor DMR6-gen informador apoyan este hallazgo (véase el Ejemplo 1 más adelante). De esta manera, el promotor DMR6 inducible por agentes patógenos es particularmente útil para controlar la expresión de sistemas inducibles que conducen a resistencia a enfermedades en las plantas.
En, por ejemplo, el Documento WO 99/45125 se ha descrito un ejemplo de dicho sistema inducible que conduce a resistencia a enfermedades en las plantas y en el que el promotor DMR6 puede ser eficaz, en donde una secuencia de nucleótidos antisentido para un gen implicado en la regulación de la ruta metabólica C5 de las porfirinas está operativamente unida a un promotor inducible por agentes patógenos y es utilizada para transformar células vegetales. La expresión de la secuencia de nucleótidos antisentido en respuesta al agente patógeno altera eficazmente el metabolismo de las porfirinas de la célula vegetal transformada, lo que conduce al desarrollo de una lesión localizada en donde queda contenida la propagación del agente patógeno. En el Documento WO 96/36697 también se describen sistemas inducibles que conducen a resistencia a enfermedades en plantas, en donde un promotor inducible controla la expresión de una proteína capaz de provocar la respuesta de hipersensibilidad en una planta. En el Documento EP 0474857 se describe además un método para la inducción de resistencia a agentes patógenos en plantas, que comprende transformar las plantas con secuencias polinucleotídicas que codifican una pareja de gen de no virulencia derivado del agente patógeno/gen de resistencia derivado de la planta, en donde la expresión del péptido provocador o del gen de resistencia, o de ambos, es regulada por un promotor inducible por agentes patógenos. En, por ejemplo, el Documento WO 98/32325 se han descrito otros ejemplos de sistemas inducibles que conducen a resistencia a agentes patógenos en plantas.
Se describe un método para proporcionar resistencia a enfermedades a una planta, que comprende transformar una célula de la planta con una construcción de DNA que comprende al menos un ácido nucleico expresable que está operativamente unido a un promotor inducible por agentes patógenos que es operativo dentro de una célula de la planta, y regenerar plantas transformadas a partir de dichas células de la planta, en donde el promotor inducible por agentes patógenos es un promotor DMR6 y en donde la expresión del ácido nucleico expresable confiere resistencia a enfermedades a la planta transgénica.
Se describen plantas resistentes a enfermedades, obtenibles mediante dicho método, así como tejido vegetal y semillas obtenidos de dichas plantas.
Se describen plantas que son resistentes a un agente patógeno de origen vírico, bacteriano, fúngico u oomicético, en donde la planta comprende en su genoma una construcción de DNA que comprende al menos un ácido nucleico expresable que está operativamente unido a un promotor inducible por agentes patógenos, en donde el promotor inducible por agentes patógenos es un promotor DMR6.
Se describe la construcción de DNA per se, que comprende al menos un ácido nucleico expresable que está operativamente unido a un promotor inducible por agentes patógenos, en donde el promotor inducible por agentes patógenos es un promotor DMR6. La construcción puede ser empleada para transformar células vegetales que pueden ser regeneradas en plantas transformadas. Además, se pueden obtener tejido y semilla de la planta transformada. Los métodos adecuados para introducir la construcción en células vegetales son conocidos por la persona experta.
Por "operativamente unido" se quiere significar que un promotor y un ácido nucleico expresable, por ejemplo, un gen, están conectados de tal modo que permiten la iniciación de la transcripción del ácido nucleico expresable (por ejemplo, un gen) por el promotor.
Por "ácido nucleico expresable" se quiere significar un ácido nucleico (por ejemplo, un gen o parte de un gen) que se puede expresar en la célula, es decir, que se puede transcribir en mRNA y se puede finalmente traducir en una proteína. El ácido nucleico expresable puede ser DNA genómico, cDNA o DNA químicamente sintetizado, o cualquier combinación de los mismos.
Una construcción de DNA comprende todos los elementos de ácido nucleico necesarios que permitan la expresión (es decir, la transcripción) de un ácido nucleico particular en una célula. Típicamente, la construcción incluye un ácido nucleico expresable, es decir, un ácido nucleico que se va a transcribir, y un promotor. La construcción se puede incorporar adecuadamente a, por ejemplo, un plásmido o un vector.
El ácido nucleico expresable puede ser un gen implicado en una respuesta de defensa de la planta, por ejemplo, un gen asociado con la respuesta de hipersensibilidad de una planta. En la respuesta de hipersensibilidad (HR; del inglés, hypersensitivity response) de una planta, el sitio de la planta invadido por el agente patógeno experimenta una muerte celular localizada por la expresión inducida de un mecanismo suicida que desencadena dicha muerte celular localizada en respuesta a agentes patógenos. De este modo, sólo se sacrifican unas pocas células de la planta y se detiene eficazmente la propagación del agente patógeno. Los ejemplos de dichos genes implicados en una respuesta de defensa de la planta son la proteína reguladora NPR1/NIM1 [Friedrich et al., Mol. Plant-Microbe Interact. 14 (9): 1114-1124, 2001] y el factor de transcripción MYB30 [Vailleau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (15): 10179-10184, 2002].
El ácido nucleico expresable puede codificar un polipéptido autólogo o heterólogo capaz de conferir resistencia a enfermedades a una planta. Por "polipéptido autólogo" si quiere significar cualquier polipéptido que se expresa en una célula vegetal transformada a partir de un gen que se encuentra de forma natural en la célula vegetal transformada. Por "polipéptido heterólogo" se quiere significar cualquier polipéptido que se expresa en una célula vegetal transformada a partir de un gen que es parcial o totalmente extraño con respecto a (es decir, que no se encuentra naturalmente en) la célula vegetal transformada. Son ejemplos de dichos polipéptidos la proteína Bax de mamífero, que codifica una proteína pro-apoptótica y da lugar a muerte celular en plantas [Lacomme y Santa Cruz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (14): 7956-61, 1999], y quitinasas fúngicas (María de las Mercedes Dana et al., Plant Physiol. 142 (2): 722-730, 2006].
El promotor DMR6 puede ser el promotor DMR6 de Arabidopsis. El promotor DMR6 comprende una región de 3000 pares de bases que está cadena arriba de la secuencia de codificación de DMR6 de Arabidopsis (codón de inicio: ATG) e incluye la 5'-UTR (región 5' no traducida). El promotor DMR6 puede comprender una secuencia de nucleótidos como la definida en la Figura 11, y/o cualquier fragmento funcional de la misma, es decir, cualquier fragmento (o parte) de dicha secuencia que es aún capaz de iniciar la transcripción del (de los) ácido(s) nucleico(s) expresable(s) al (a los) que está operativamente unido, y/o variantes naturales del mismo, es decir, variantes naturales de este promotor que pueden contener pequeños polimorfismos pero que, en general, tienen una identidad de al menos 90%.
El promotor DMR6 puede ser un promotor DMR6 ortólogo, es decir, un promotor de un gen DMR6 ortólogo. Más adelante, en el Ejemplo 2, se describen métodos para identificar ortólogos DMR6. Una vez que se han identificado los ortólogos DMR6, la persona experta será capaz de aislar el respectivo promotor de dichos ortólogos usando técnicas de biología molecular estándares.
Se ha mostrado que el promotor DMR6 es acusadamente inducido por agentes patógenos, y el promotor DMR6 no se expresa mucho en otros tejidos no infectados. Por lo tanto, es un promotor muy adecuado para uso en sistemas inducibles para proporcionar resistencia a agentes patógenos de origen vírico, bacteriano, fúngico u oomicético a plantas. Anteriormente se han dado ejemplos de agentes patógenos y plantas específicos para los cuales se puede emplear el sistema inducible, utilizando el promotor DMR6.
La presente invención se ilustra mediante los ejemplos siguientes. En los ejemplos se hace referencia a las figuras siguientes.
En la Tabla 1 se muestran los números de acceso de GenBank y los identificadores de GenInfo del mRNA de DMR6 de Arabidopsis y de secuencias ortólogas de otras especies vegetales.
En la Tabla 2 se muestran los cebadores de PCR para los marcadores utilizados para la clonación de DMR6 basada en mapas.
En la Tabla 3 se muestran pares de cebadores para clonar ortólogos dmr6 en un vector de expresión vegetal adecuado.
En la Figura 1 se muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de la proteína DMR6 de Arabidopsis thaliana y ortólogos de Aquilegia sp., Citrus sinensis, Coffea canephora, Cucumis sativus, Gossypium hirsitum, Lactuca sativus, Medicago truncatula, Oryza sativa (3), Populus trichocarpa (2), Solanum lycopersicum (2), Sorghum bicolor, Spinacia oleracea, Vitis vinifera, Zea mays y Zingiber officinale, usando el programa CLUSTAL W (1.83) para alineamiento múltiple de secuencias (EBI). Debajo de las secuencias se indican los aminoácidos conservados mediante los puntos y se indican los aminoácidos idénticos mediante los asteriscos.
En la Figura 2 se muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos, respectivamente, del gen DMR6 (At5g24530, gi 42568064, GenBank NM_122361) y la proteína DMR6 (gi 15238567, GenBank NP_197841) de Arabidopsis thaliana.
En la Figura 3 se muestran la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos derivada, respectivamente, del ortólogo DMR6 de Lactuca sativa.
En la Figura 4 se muestran la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos derivada, respectivamente, del ortólogo DMR6 de Spinacia oleracea.
En la Figura 5 se muestran la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos derivada del ortólogo DMR6 de Cucumis sativus y Cucumis melo.
En la Figura 6 se muestra la resistencia de los mutantes dmr6 de Arabidopsis al mildiú velloso. (a) Cuantificación de esporangióforos del producto de aislamiento Waco9 de H. parasitica, 7 días después de la inoculación, sobre el mutante dmr6-1 (BC2, línea E37) en comparación con su línea parental Ler eds1-2, y sobre el mutante dmr6-2 (línea de T-DNA FLAG_445D09) en comparación con su línea parental Ws-4. (b) Restablecimiento de la susceptibilidad por complementación con el gen At5g24530 en el mutante dmr6-1. Se cuantificaron las esporas de H. parasitica por miligramo de peso de plantón sobre Lereds1-2, dmr6-1 y 5 líneas de complementación (números 121, 122, 211, 231 y 241).
En la Figura 7 se muestra la estructura del gen DMR6 de Arabidopsis y las mutaciones dmr6-1 y dmr6-2. El gen DMR6 contiene cuatro exones y una secuencia de codificación de 1026 bases. Se indican los dos alelos: dmr6-1 con un cambio de base en el exón 2, y dmr6-2 con una inserción de T-DNA en el intrón 2.
En la Figura 8 se muestran los niveles relativos de transcritos de DMR6 en plantas Ler tratadas de forma simulada o sometidas a la inoculación de un producto de aislamiento compatible o incompatible de H. parasitica. Se determinaron los niveles de transcritos en diferentes días después de la inoculación. La diferencia en los valores del ciclo umbral (ACT; del inglés, A cycle threshold) refleja el número de ciclos de multiplicación adicionales por PCR requeridos para alcanzar una concentración de producto umbral arbitraria en comparación con ACTIN2. Un menor valor de ACT indica un mayor nivel de transcritos.
En la Figura 9 se muestra la expresión de la construcción de promotor DMR6-gen informador (pDMR6::GUS) en líneas transgénicas de Arabidopsis, visualizada sólo con X-gluc como sustrato (Figuras d y e ) o Magenta-Xgluc (Figuras a-c) y tinción del crecimiento de H. parasítica con azul de tripano. (a) Ler eds1-2 (pDMR6::GUS) 3 días después de la inoculación con H. parasítica, producto de aislamiento Cala2. (b) Col-0 (pDMR6::GUS) 3 días después de la inoculación con H. parasítica, producto de aislamiento Waco9. (c) Ler eds1-2 (pDMR6::GUS) 3 días después de la inoculación con H. parasitica, producto de aislamiento Emoy2. (d) Col-0 (pDMR6::GUS) 3 días después de la formación de heridas. (e) Col-0 (pDMR6::GUS) 3 días después de la aplicación de BTH.
En la Figura 10 se muestra el análisis por Q-PCR de los niveles de transcritos de los genes: At4g14365, At1g14880, ACD6, PR-1, PR-2 y PR-5, seleccionados como suprarregulados en el análisis con micromatrices de dmr6-1. (a) Niveles de transcripción de los seis genes en dmr6-1 en comparación con Ler eds1-2 y además el transcrito de DMR6. (b) Transcritos génicos elevados de seis genes asociados con la defensa en dmr6-2 frente a Ws-4. ACT refleja el número de ciclos de multiplicación adicionales por PCR necesarios para alcanzar el nivel de transcritos de ACTIN2. Un menor valor de ACT indica un mayor nivel de transcritos.
En la Figura 11 se muestra la secuencia de nucleótidos de la región de 3 kb cadena arriba del codón de inicio del gen DMR6 (at5g24530) de Arabidopsis thaliana, incluyendo el promotor y la 5'-UTR (subrayados).
En la Figura 12 se muestran la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos derivada, respectivamente, del ortólogo DMR6 de Solanum lycopersicum.
En la Figura 13 se muestran la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos derivada, respectivamente, del ortólogo DMR6 de Nicotiana benthamiana.
En la Figura 14 se muestra la complementación de Arabidopsis thaliana dmr6-1 con DMR6 procedente de Cucumis sativus (Cs), Spinacia oleracea (So), Lactuca sativa (Ls) y Solanum lycopersicum (Sl).
Ejemplos
Ejemplo 1
El gen DMR6 (At5g24530) de Arabidopsis es necesario para la susceptibilidad al mildiu velloso
Procedimientos experimentales
Crecimiento e infección de Hyaloperonospora parasitica
El producto de aislamiento Waco9 de H. parasitica fue proporcionado por el Dr. M. Aarts (WUR, Wageningen, Holanda) y el producto de aislamiento Cala2 fue proporcionado por el Dr. E. Holub (Warwick HRI, Wellsbourne, Reino Unido), y fueron mantenidos sobre Arabidopsis Ws-0 y Ler, respectivamente. Se transfirieron semanalmente inóculos (400.000 esporas por mililitro) a plantones sanos de 10 días de edad (E. B. Holub et al., Mol. Plant-Microbe Interact. 7: 223-239, 1994) mediante el uso de una pistola pulverizadora. Los plantones fueron dejados secar al aire durante aproximadamente 45 minutos y fueron incubados bajo una cubierta sellada con una humedad relativa del 100% en una cámara de crecimiento a 16 °C con 9 horas de luz al día (100 mE/m2/s). Se cuantificaron los niveles de esporulación 7 días después de la inoculación (dpi; del inglés, days post inoculation) contando el número de esporangióforos por plantón para al menos 40 plantones por línea examinada (Figura 6a), o aislando esporas en agua 5 dpi y determinando la concentración de esporas para obtener el número por miligramo de tejido foliar (Figura 6b).
Generación de líneas dmr6 retrocruzadas
Los mutantes dmr6 fueron retrocruzados (BC; del inglés, backcrossed) dos veces (BC2) con la línea parental Ler eds1-2 así como con Ler. Las líneas BC2 generadas con Ler fueron seleccionadas en cuanto a la presencia del gen EDS1 de tipo silvestre mediante análisis por PCR.
Clonación de DMR6
Se realizó un mapeo fino del gen dmr6 con marcadores de PCR diseñados utilizando la base de datos Cereon para identificar diferencias de inserción y deleción (IND) entre Col-0 y Ler. Para el mapeo se utilizaron los marcadores (Tabla 2): IND_MOP9 en el gen At5G24210; IND_K16H17 en el gen At5G24420; IND_T4C12 en el gen At5G24820; IND_T11H3 en medio de los genes At5G24950_60, e IND_F21J6 en el gen At5G25270. Se inició una exploración adicional de nuevos recombinantes sobre 300 plantas F2 que dio lugar a ocho plantas recombinantes F2 entre los dos marcadores basados en IND: IND_MOP9 e IND_T4C12, que flanqueaban una región de 61 genes. Siete marcadores adicionales (M450-M590; Tabla 2) redujeron la región a dieciocho candidatos génicos para el locus dmr6, entre At5g24420 y At5g24590. El análisis de la secuencia de At5g24530 indicó una mutación puntual que conducía a un codón de parada en el exón 2 en el mutante dmr6-1.
Identificación de una línea de inserción de T-DNA en dmr6
Se identificó un segundo alelo de dmr6, 445D09, una línea FLAG de inserción de T-DNA generada por INRA Versailles en el fondo genético de acceso Ws-4. La inserción de T-DNA fue confirmada por PCR usando un cebador diseñado en el gen At5g24530, el cebador LP (5'-caggtttatggcatatctcacgtc-3'), en combinación con el cebador del borde derecho del T-DNA, Tag3' (5'-tgataccagacgttgcccgcataa-3') o RB4 (5'-tcacgggttggggtttctacaggac-3'). La inserción exacta del T-DNA en el segundo intrón de At5g24530 fue confirmada por secuenciación de amplicones generados con los cebadores de T-DNA de ambos bordes, el izquierdo y el derecho, en combinación con los cebadores génicamente específicos LP o RP (5'-atgtccaagtccaatagccacaag-3').
Síntesis de cDNA
Se aisló RNA (de aproximadamente 100 mg de tejido foliar de plantones de 10 días de edad) con el kit RNeasy (Qiagen, Venlo, Holanda) y se trató con el sistema RNase-Free DNase (Qiagen). Se cuantificó el RNA total usando un espectrofotómetro UVmini-1240 (Shimadzu, Kyoto, Japón). Se sintetizó cDNA con la transcriptasa inversa Superscript III (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.) y oligo(dT)15 (Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Complementación del mutante dmr6-1
Se generaron líneas de complementación transformando plantas dmr6 por el método de inmersión floral con Agrobacterium tumefaciens (Clough y Bent, 1998) que contenía el gen At5g24530 de Col-0 detrás del promotor 35S. La construcción se generó mediante multiplicación por PCR del gen At5g24530 de longitud completa procedente de cDNA de Col-0 con cebadores que incluían sitios de restricción que se emplearon para clonación direccional. Un cebador directo (5'-ttctgggatccaATGGCGGCAAAGCTGATATC-3') que contenía un sitio de restricción para BamHI cerca del codón de inicio (ATG) multiplicaba el extremo 5' de DMR6 y, en el extremo 3' detrás del codón de parada, se generó un sitio EcoRI con un cebador inverso (5'-gatatatgaattcttagttgtttagaaaattctcgaggc-3'). El 35S-DMR6-Tn fue clonado en el pGreenll0229 [R. P. Heliens, E. A. Edwards, N. R. Leyland, S. Bean y P. M. Mullineaux (2000), "pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol. Biol. 42, 819-832]. Se aislaron plantones resistentes a DL-fosfinotricina (BASTA) 300 pM y se analizaron en cuanto a susceptibilidad a H. parasítica y en cuanto a niveles de expresión de DMR6 por rT-PCR.
Líneas de DMR6 infraexpresado mediante RNAi
Se generaron líneas de RNAi en los fondos genéticos Ler eds1-2 y Col-0. Se generó un amplicón de cDNA de 782 pares de bases de longitud de Col-0 At5g24530. La PCR se realizó con la DNA polimerasa Phusion (2U/pl) y dos diferentes combinaciones de cebadores. El amplicón de la primera combinación de cebadores específicos para el gen DMR6 (RNAiDMR6F: 5'-aaaagcaggctGACCGTCCACGTCTCTCTGAA-3' y RNAiDMR6R: 5'-AGAAAGCTGGGTGAAACGATGCGACCGATAGTC-3') se usó como un molde para la segunda multiplicación por PCR con cebadores generales que permitían la recombinación en el vector pDONR7 del sistema de clonación GateWay. Para la segunda PCR se usaron como molde 10 pl de la primera PCR (desnaturalización durante 30 segundos a 98 °C seguida de 10 ciclos de: 10 segundos a 98 °C; 30 segundos a 58 °C; 30 segundos a 72 °C) en un volumen total de 20 pl. La segunda PCR (desnaturalización durante 30 segundos a 98 °C seguida de 5 ciclos de: 10 segundos a 98 °C; 30 segundos a 45 °C; 30 segundos a 72 °C y 20 ciclos de 10 segundos a 98 °C; 30 segundos a 55 °C; 30 segundos a 72 °C, acabando con una extensión final de 10 minutos a 72 °C) con el attB1 (5'-GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3') y el attB2 (5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggt -3') se llevó a cabo en un volumen de reacción de 50 pl. Se purificó el producto de PCR en gel y se recombinaron 50 ng de inserto en 150 ng de vector pDONR7 con la enzima Clonase b P. Se transformaron células de E. coli DH5a electrocompetentes con el vector y se aislaron plásmidos que contenían el inserto correcto y se emplearon 100 ng del vector pDONR7 con el amplicón de DMR6 en la reacción LR para recombinar el inserto en dos direcciones opuestas en 150 ng del vector pHellsgate8. Después de la transformación de E. coli, se seleccionaron clones resistentes a espectinomicina y se verificaron los plásmidos aislados en cuanto al tamaño de inserto correcto mediante una digestión con NotI y mediante PCR de colonias con un solo cebador interno para At5G24530 (DfragmentF: 5'-gagaagtgggatttaaaatagaggaa-3'); si los insertos estaban insertados dos veces en direcciones opuestas se podía detectar un amplicón de 1420 pares de bases. Se transformó la cepa electrocompetente C58C1 de Agrobacterium con plásmidos pHellsgate8 correctos con el inserto doble en direcciones opuestas. Se aislaron plásmidos de la cepa de Agrobacterium y se volvieron a transformar células de E. coli para confirmar el tamaño correcto del plásmido y el inserto mediante digestión con NotI. Las cepas de Agrobacterium nuevamente confirmadas se utilizaron para la transformación de las plantas Col-0 y Ler eds1-2 por inmersión floral. Se exploraron las semillas desarrolladas en cuanto a resistencia a kanamicina en placas 1^x GM, se transfirieron los plantones T1 y se analizó la siguiente generación de semillas, la T2, en cuanto a expresión de DMR6 y susceptibilidad a H. parasítica.
Perfil de expresión génica del mutante dmr6
Se aisló el RNA total del modo anteriormente descrito. Se multiplicó el mRNA con el kit MessageAmp aRNA (Ambion). Se hibridaron portaobjetos matriciales CATMA (Crowe et al., 2003) que contenían aproximadamente 25.000 etiquetas génicamente específicas de acuerdo con las condiciones normalizadas descritas por de Jong et al.
[M. de Jong, B. van Breukelen, F. R. Wittink, F. L. Menke, P. J. Weisbeek y G. Van den Ackerveken (2006), "Membrane-associated transcripts in Arabidopsis; their isolation and characterization by DNA microarray analysis and bioinformatics", Plant J. 46, 708-721]. Para la PCR cuantitativa se generaron moldes de cDNA del modo previamente descrito. Se determinaron los ciclos umbral por transcrito por triplicado usando el sistema ABI PRISM 7700 para detección de secuencias (Applied Biosystems, Foster City, California, EE.UU.) empleando SYBR Green I (Applied Biosystems, Foster City, California, EE.UU.) como colorante informador. Los grupos de cebadores para los transcritos son DMR6 (QDMR6F: 5'-TGTCATCAACATAGGTGACCAG-3' y QDMR6R: 5'-CGATAGTCACGGATTTTCTGTG-3'), At1g14880 (QAt1g14880F: 5'-CTCAAGGAGAATGGTCCACA-3' y QAt1g14880R: 5'-CGACTTGGCCAAATGTGATA-3'), At4g14365 (QAt4g14365F: 5'-TGGTTTTCTGAGGCATGTAAA-3' y QAt4g14365R: 5'-AGTGCAGGAACATTGGTTGT-3'), ACD6 (QACD6F: 5'-TGGACAGTTCTGGAGCAGAT-3' y QACD6R: 5'-CAACTCCTCCGCTGTGAG-3'), PR-5 (QPR-5F: 5'-GGCAAATATCTCCAGTATTCACA-3' y QPR-5R: 5'-GGTAGGGCAATTGTTCCTTAGA-3'), PR-2 (QPR-2F: 5'-AAGGAGCTT AGCCTCACCAC-3' y QPR-2R: 5'-GAGGGAAGCAAGAATGGAAC-3'), PR-1 (QPR-1F: 5'-GAACACGTGCAATGGAGTTT-3' y QPR-1R: 5'-GGTTCCACCATTGTTACACCT-3') y ACT-2 (QACT2F: 5'- AATCACAGCACTTGCACCA-3' y QACT2R: 5'-GAGGGAAGCAAGAATGGAAC-3'), generándose fragmentos de 100 pares de bases.
Resultados
Caracterización del gen responsable de la resistencia a agentes patógenos en el mutante dmr6
Van Damme et al., 2005, supra, describen un mutante dmr6 que es resistente a H. parasítica. Se puede examinar el nivel de resistencia contando el número de esporangióforos por plantón siete días después de la inoculación con H. parasítica (producto de aislamiento Waco9 o Cala2, obtenibles del Dr. G. Van den Ackerveken, Plant-Microbe Interactions Group, University of Utrecht, Utrecht, Holanda). La línea parental, Lereds1-2 (Parker et al., 1996, Plant Cell 8: 2033-2046), que es muy susceptible, se emplea como un testigo positivo (y se ajusta a 100%).
En la Figura 6a se muestra la reducción de la formación de esporangióforos sobre los mutantes dmr6 infectados en comparación con plantones de las líneas parentales, en donde se muestran los resultados de la cuantificación de la esporulación de Waco9 de Hyaloperonospora parasítica (esporangióforos/plantón) sobre el mutante dmr6-1 resistente al mildiú velloso, dos veces retrocruzado con la línea parental Ler eds1-2, y sobre el mutante dmr6-2 (línea de T-DNA FLAG_445D09) en comparación con las líneas testigo.
De acuerdo con la invención, se ha clonado el gen responsable de la resistencia a H. parasítica en los mutantes dmr6 de van Damme et al., 2005, supra, mediante una combinación de mapeo y secuenciación de candidatos génicos. Previamente se mapeó la mutación dmr6 recesiva cerca del marcador nga139 del cromosoma 5 hasta una región que abarcaba 74 genes. Un mapeo fino vinculó el locus dmr6 a un intervalo de mapeo que contenía los BACs T13K7 y K18P6 entre los marcadores At5g24420 y At5g24590 situados en los genes correspondientes. Esto permitió confinar el intervalo de dmr6 a una región de 18 candidatos génicos. Un análisis comparativo de secuencias de los 18 genes en dmr6 y la línea parental Ler eds1-2 reveló una mutación puntual en el segundo exón del gen At5g24530. Este único cambio de base de G por A, típico de una mutación por EMS, cambia un TGG (codón de trp) por un TGA (codón de parada prematuro) en la posición nucleotídica 691 de la secuencia de codificación (Figura 7). El codón de parada precoz trunca la prevista enzima oxidorreductasa de 342 aminoácidos en la posición 141 antes del dominio catalítico conservado, lo que sugiere que dmr6 es un alelo nulo. Se prevé que la secuencia de codificación de At5g24530 (Figura 2) codifique una proteína con una masa de 39,4 kDa. Hasta la fecha no se ha descrito ningún papel biológico para At5g24530.
At5g24530 es DMR6
Se identificó un segundo alelo, dmr6-2, en una línea de inserción de T-DNA (FLAG_445D09) de la colección de mutantes de INRA, Versailles. Se confirmaron la presencia y la posición del inserto de T-DNA en el segundo intrón de At5g24530 (Figura 7) mediante PCR y análisis de secuencias (datos no mostrados). La progenie de la línea FLAG_445D09 homocigótica para la inserción de T-DNA era resistente al producto de aislamiento Waco9 de H. parasitica, mientras que la línea parental (Ws-4) era susceptible (Figura 6a). El transcrito de At5g24530 pudo ser multiplicado por RT-PCR usando cebadores en los exones 2 y 3 en Ws-4, pero no en la línea dmr6-2 homocigótica (datos no mostrados), lo que indica que dmr6-2 puede ser considerado un segundo alelo nulo.
Para corroborar la idea de que se requiere At5g24530 para la susceptibilidad a H. parasítica, se transformó el mutante dmr6-1 con el cDNA de At5g24530 clonado bajo el control del promotor 35S. En cinco plantones dmr6-1 T2 independientes se confirmó la acusada sobreexpresión de At5g24530 mediante RT-PCR (datos no mostrados). Todas las líneas T3, homocigóticas para el transgén, mostraron restablecimiento de la susceptibilidad al producto de aislamiento Cala2 de H. parasítica (Figura 6b), lo que confirma que At5g24530 es DMR6. La complementación, junto con la identificación de dos mutantes dmr6 independientes, indican claramente que se requiere un gen DMR6 funcional para la susceptibilidad a H. parasitica.
DMR6 es transcripcionalmente activado durante la infección por H. parasitica
Para estudiar la expresión de DMR6 durante la infección con H. parasitica, se midieron los niveles de transcritos relativos por PCR cuantitativa en seis diferentes puntos temporales, desde 0 días (2 horas) después de la inoculación hasta 5 días después de la inoculación (dpi) (Figura 8). Se aisló RNA de plantones Ler de diez días de edad a los que se inoculó agua (simulación), o producto de aislamiento compatible o incompatible de H. parasítica por pulverización. 2 horas después de la inoculación (0 dpi), los niveles de transcritos de d MR6 eran iguales en los diferentes tratamientos. A partir de 1 dpi, el nivel de transcrito de DMR6 resultó significativamente aumentado tanto en la interacción compatible como en la incompatible en comparación con los plantones simuladamente tratados. El nivel de transcritos de DMR6 1 dpi era ligera pero significativamente mayor en la interacción incompatible (ACT de 3,5; factor de inducción de aproximadamente 11) que en la compatible (ACT de 3,0; factor de inducción de aproximadamente 8). El nivel de expresión aumentaba más con el tiempo hasta alcanzar un elevado nivel estable a los 4-5 dpi. En estos puntos temporales el nivel de transcritos de DMR6 era mayor en la interacción compatible que en la incompatible. Los elevados niveles de transcritos de DMR6 durante las interacciones compatibles e incompatibles de H. parasítica sugieren un papel de DMR6 en la defensa de las plantas. La expresión de DMR6 asociada con la defensa pudo ser confirmada en nuestros tres mutantes de defensa potenciada, dmr3, dmr4 y dmr5 (Van den Ackerveken et al., no publicado). Además, un análisis bioinformático de los niveles de DMR6 en el Genevestigator Mutant Surveyor [P. Zimmermann, L. Hennig y W. Gruissem (2005), "Gene-expression analysis and network discovery using Genevestigator", Trends Plant Sci. 10, 407-409] mostró que el gen es intensamente inducido en los mutantes mpk4 y cpr5 resistentes a agentes patógenos. En el doble mutante cpr5/npr1, el nivel de transcritos de DMR6 permanecía elevado, lo que indica que la inducción de la expresión de d MR6 es en su mayor parte independiente de NPR1. Parece que el ácido salicílico es una señal importante en la inducción de la expresión de DMR6 durante la vejez ya que plantas transgénicas nahG (que expresan el gen bacteriano salicilato hidrolasa) sólo mostraban bajos niveles de transcrito de DMR6.
Para investigar con más detalle cómo se activa la expresión de DMR6 durante los estreses biótico y abiótico, se generaron líneas informadoras de DMR6. Se estudió la localización de la expresión de DMR6 en plantas transgénicas Col-0 y Ler eds1-2 que contenían el promotor DMR6 unido al gen informador uidA (p-glucuronidasa, GUS) (pDMR6::GUS). Para visualizar tanto el crecimiento de hifas de H. parasítica, mediante tinción con azul de tripano, como la actividad GUS, se usó magenta-Xgluc como un sustrato de p-glucuronidasa que produce un precipitado magenta. En las plantas no infectadas no se pudo detectar expresión de GUS en los diferentes orgánulos vegetales: raíz, meristemo, flor, polen y semilla. Se indujo la expresión de DMR6 en las interacciones compatibles: Ler eds1-2 infectadas con Cala2 (Figura 9a) y Col-0 infectadas con el producto de aislamiento Waco9 (Figura 9b). También se indujo la expresión de GUS en la interacción incompatible: inoculación del producto de aislamiento Emoy2 en Ler eds1-2 (Figura 9c). Como se muestra en las Figuras 9a y 9b, la expresión de DMR6 estaba confinada a las células en que H. parasítica había formado haustorios. Las células vegetales que contenían los haustorios más recientemente formados no mostraban niveles detectables de actividad GUS (Figura 9a, indicado mediante un asterisco). Durante la interacción incompatible (Figura 9c), sólo se pudo detectar actividad del promotor DMR6 en las células que habían estado en contacto con las hifas invasoras iniciales. En células muertas, como resultado de la respuesta de hipersensibilidad (HR; del inglés, hypersensitivity response) (visualizada mediante tinción con azul de tripano e indicada en la Figura 9c mediante un asterisco), no se pudo detectar actividad GUS, posiblemente debido a una degradación proteica en estas células. Para probar si la expresión de DMR6 en células que contienen haustorios es causada por una respuesta de tipo herida, se hicieron heridas en los plantones mediante una incisión con tijeras y se tiñeron los plantones para actividad GUS 3 días más tarde. No se vio ninguna expresión detectable de promotor DMR6GUS, lo que indica que no se induce la expresión de DMR6 por formación de heridas (Figura 9d). Además, se examinó la inducción local de expresión de DMR6 en respuesta a un tratamiento con benzotiadiazol (BTH), un compuesto funcional análogo al ácido salicílico (SA). 3 días después del tratamiento con BTH, la actividad GUS se localizaba principalmente en las hojas recién formadas pero no en las maduras (Figura 9e). El análisis de las líneas pDMR6::GUS confirma los datos de expresión anteriormente descritos y resalta la inducción estrictamente localizada de DMR6 en respuesta a una infección por H. parasítica.
El mutante dmr6-1 expresa constitutivamente transcritos asociados con la defensa
Para elucidar cómo la falta de DMR6 da lugar a resistencia a H. parasítica, se analizó el transcriptoma del mutante dmr6-1 en comparación con la línea parental Ler eds1-2. Se hibridaron sondas derivadas de mRNA de las partes aéreas de plantones dmr6-1 y Ler eds1-2 de 14 días de edad sobre micromatrices CATMA de genoma completo. Se halló que un total de 58 genes se expresaban significativa y diferencialmente en dmr6-1, de los cuales 51 genes presentaban niveles de transcritos elevados y 7 genes presentaban niveles de transcritos reducidos. Un notable conjunto de los 51 transcritos inducidos han sido identificados como genes asociados con respuestas de defensa activadas de la planta, por ejemplo, ACD6, PR-5, PR-4/HEL y PAD4. Estos datos indican que la pérdida de DMR6 da lugar a la activación de un conjunto específico de transcritos asociados con la defensa. El hallazgo de que DMR6 está entre los genes inducidos en dmr6-1 corrobora la idea de que DMR6 está asociado con la defensa. Para probar si la expresión inducida de los genes asociados con la defensa se debía a la pérdida de DMR6 y no se debía a mutaciones adicionales por metanosulfonato de etilo (EMS) que quedaban en el mutante dmr6-1 retrocruzado, se verificó el nivel de transcritos de una selección de genes (At4g14365, At1g14880, ACD6, PR-1, PR-2 y PR-5) por PCR cuantitativa tanto en el mutante dmr6-1 como en el mutante dmr6-2 (Figura 10). Sólo pudimos probar niveles de transcritos de DMR6 en el mutante dmr6-1 (Figura 10a) ya que el mutante dmr6-2 (Figura 10b) tiene una inserción de T-DNA que altera el transcrito de DMR6. La inducción de DMR6 que se observa en el análisis por micromatrices fue confirmada por Q-PCR en dmr6-1 en comparación con Ler eds1-2 (Figura 10a). En las Figuras 10a y b se muestra que los seis genes seleccionados presentaban expresión elevada en ambos mutantes dmr6 en comparación con las líneas parentales. La observada expresión elevada de los genes asociados con la defensa seleccionados en los mutantes dmr6 indica que la falta de DMR6 activa una respuesta de defensa de la planta. La activación de este conjunto de transcritos asociados con la defensa podría ser la causa primaria de resistencia a H.
parasítica en los mutantes dmr6.
Ejemplo 2
Identificación de ortólogos DMR6 en cultivos
1. Exploración de bancos sobre la base de homología secuencial
En la Figura 2 se muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la secuencia de codificación de DMR6 y la proteína DMR6 de Arabidopsis thaliana. Se compararon bancos públicos de secuencias de nucleótidos y aminoácidos con las secuencias de la Figura 2. Esta comparación dio lugar a la identificación de las secuencias de codificación de DMR6 completas y de las previstas secuencias de aminoácidos en Aquilegia sp., Citrus sinensis, Coffea canephora, Cucumis sativus, Gossypium hirsitum, Lactuca sativa, Medicago truncatula, Oryza sativa (3), Populus trichocarpa (2), Solanum lycopersicum (2), Sorghum bicolor, Spinacia oleracea, Vitis vinifera, Zea mays y Zingiber officinale. La información secuencial de las proteínas ortólogas así identificadas se proporciona en la Tabla 1 y se visualiza en un alineamiento múltiple en la Figura 1. Para muchas otras especies vegetales, se pudieron identificar fragmentos de DNA ortólogos mediante BlastX como mejores éxitos recíprocos con respecto a las secuencias de la proteína DMR6 de Arabidopsis u otras plantas.
2. Identificación de ortólogos por medio de hibridación heteróloga
La secuencia de DNA de DMR6 de Arabidopsis thaliana, como se muestra en la Figura 2, se utiliza como una sonda para buscar secuencias homólogas mediante hibridación con DNA de cualquier especie vegetal usando métodos de biología molecular estándares. Usando este método se detectan genes ortólogos mediante hibridación Southern sobre DNA digerido con enzimas de restricción o mediante hibridación con bancos de DNA genómico o cDNA. Estas técnicas son bien conocidas por la persona experta en este campo técnico. Como una sonda alternativa, se puede emplear como sonda la secuencia de DNA de DMR6 de cualquier otra especie vegetal íntimamente relacionada. 3. Identificación de ortólogos por medio de PCR
Para muchas especies de cultivo, se dispone de secuencias parciales de mRNA de DMR6 o de genes DMR6 que se emplean para diseñar cebadores para multiplicar posteriormente por PCR la secuencia completa de cDNA o DNA genómico. Cuando se dispone de secuencias 5' y 3', la secuencia interna que falta es multiplicada por PCR mediante un cebador directo 5' y un cebador inverso 3' específicos para DMR6. En los casos en que sólo se dispone de secuencias 5', internas o 3', se diseñan cebadores tanto directos como inversos. En combinación con cebadores policonectores plasmídicos disponibles, los insertos son multiplicados a partir de bancos de DNA genómico y de cDNA de la especie vegetal de interés. De un modo similar se multiplican secuencias 5' o 3' que faltan mediante técnicas de PCR avanzadas: 5' RACE, 3' RACE, TAIL-PCR, RLM-RACE o PCR Vectorette.
Se proporciona la secuenciación del cDNA de DMR6 de Lactuca sativa (lechuga) como un ejemplo. A partir de la base de datos de ESTs de GenBank en el NCBI se identificaron varios ESTs de DMR6 de Lactuca utilizando la herramienta tblastn, comenzando con la secuencia de aminoácidos de DMR6 de Arabidopsis. El agrupamiento y el alineamiento de los ESTs dieron lugar a una secuencia de consenso para un fragmento de 5' DMR6. Para obtener el cDNA completo de DMR6 de lechuga se utilizó el kit RLM-RACE (Ambion) sobre mRNA de plantones de lechuga. Se obtuvo la secuencia de 3' RNA usando dos cebadores que se diseñaron en la secuencia de consenso de 5' DMR6 derivada de ESTs (Lsat_dmr6_fw1: CGATCAAGGTCAACACATGG, y Lsat_dmr6_fw2: TCAACCATTACCCAGTGTGC) y los cebadores para 3' RACE del kit. Basándose en la secuencia ensamblada se diseñaron nuevos cebadores para multiplicar la secuencia de codificación completa de DMR6 a partir de cDNA para obtener la secuencia de nucleótidos y la secuencia proteica derivada, como se presentan en la Figura 3.
Se han identificado las secuencias de codificación completas de DMR6 de más de 10 especies vegetales diferentes a partir de bases de datos genómicas y de ESTs. A partir del alineamiento de las secuencias de DNA, se seleccionaron regiones conservadas en la secuencia de codificación para el diseño de cebadores oligonucleotídicos degenerados (para los nucleótidos degenerados, las abreviaturas son de acuerdo con los símbolos de nucleótidos de la IUB que son códigos estándares empleados por todas las compañías que sintetizan oligonucleótidos: G = guanina, A = adenina, T = timina, C = citosina, R = A o G, Y = C o T, M = A o C, K = G o T, S = Co G, W = AoT, B = C o G o T , D = G o A o T , H = A o C o T, V = A o C o G , N = Ao C o G o T).
El procedimiento para obtener secuencias internas de cDNA de DMR6 de una especie vegetal dada es el siguiente: 1. Se aísla mRNA utilizando métodos estándares;
2. Se sintetiza cDNA usando un cebador de oligo-dT y métodos estándares;
3. Se lleva a cabo una reacción PCR usando oligonucleótidos directos e inversos degenerados;
4. Se separan los fragmentos de la PCR mediante electroforesis estándar en gel de agarosa y se aíslan del gel los fragmentos con el tamaño esperado;
5. Se clonan los fragmentos de PCR aislados en un vector plasmídico usando métodos estándares;
6. Se analizan los plásmidos con tamaños de inserto correctos, según se determinan por PCR, mediante secuenciación de DNA;
7. Un análisis de secuencias utilizando blastX revela qué fragmentos contienen las secuencias internas de DMR6 correctas;
8. La secuencia de DNA interna puede ser luego utilizada para diseñar cebadores específicos de genes y especies para 5' y 3' RACE, para obtener la secuencia de codificación completa de DMR6 mediante RLM-rAc E (como se describió anteriormente).
Se proporciona la secuenciación del cDNA de DMR6 de Cucumis sativus (pepino) como un ejemplo. Para el pepino, diversas combinaciones de cebadores entre los cebadores siguientes resultaron exitosas a la hora de multiplicar un tramo de secuencia de codificación interna de cDNA: cebadores directos dmr6_deg_fw1B (TTCCAGGTDATTAAYCAYGG), dmr6_deg_fw2B CATAAYTGGAGRGAYTAYCT), dmr6_deg_fw3B (GARCAAGGRCARCAYATGGC) y dmr6_deg_fw4 (AATCCTCCTTCHTTCAAGGA), y cebadores inversos dmr6_deg_rv3B (AGTGCATTKGGGTCHGTRTG), dmr6_deg_rv4 (AATGTTRATGACAAARGCAT) y dmr6_deg_rv5 (GCCATRTGYTGYCCTTGYTC). Después de la clonación y secuenciación de los fragmentos multiplicados, se diseñaron cebadores específicos para DMR6 de pepino para 5' RACE (Cuc_dmr6_rv1: TCCGGACATTGAAACTTGTG y Cuc_dmr6_rv2: TCAAAGAACTGCTTGCCAAC) y 3' RACE (Cuc_dmr6_fw1: CGCACTCACCATTCTCCTTC y Cuc_dmr6_fw2: GGCCTCCAAGTCCTCAAAG). Finalmente, se multiplicó y secuenció la secuencia completa de cDNA de DMR6 de pepino (Figura 5). Se utilizó un planteamiento similar para espinaca, Spinacia olerácea (Figura 4), Solanum lycopersicum (Figura 12) y Nicotiana benthamiana (Figura 13). Los ortólogos identificados del modo descrito en este ejemplo pueden ser modificados utilizando técnicas bien conocidas para inducir mutaciones que reduzcan la expresión o actividad de DMR6, para obtener plantas resistentes a hongos u oomicetos no genéticamente modificadas. Alternativamente, se puede emplear la información genética de los ortólogos para diseñar vehículos para silenciamiento génico, y para transformar las correspondientes plantas de cultivo para obtener plantas que sean resistentes a oomicetos.
Ejemplo 3
Mutación de semillas
Se tratan semillas de las especies vegetales de interés con un mutágeno con objeto de introducir mutaciones puntuales aleatorias en el genoma. Se cultivan las plantas mutadas para producir semillas y se explora la siguiente generación en cuanto a la ausencia o reducción de los niveles o actividad de transcritos de DMR6. Esto se lleva a cabo determinando el nivel de expresión del gen DMR6 o buscando cambios de nucleótidos (mutaciones) mediante el método TILLING, mediante secuenciación de DNA o mediante cualquier otro método para identificar cambios de nucleótidos. Las plantas seleccionadas son homocigóticas o se hacen homocigóticas mediante autofecundación o fecundación cruzada. Las plantas homocigóticas seleccionadas con actividad ausente o reducida de transcritos de DMR6 son examinadas en cuanto a una resistencia aumentada hacia el agente patógeno de interés para confirmar la resistencia aumentada a la enfermedad.
Ejemplo 4
Transferencia de un alelo mutado al fondo genético de un cultivo deseado
La introgresión del alelo mutante deseado a un cultivo se lleva a cabo mediante cruce y exploración genotípica del alelo mutante. Éste es un procedimiento estándar en la reproducción actual de cultivos con ayuda de marcadores. Ejemplo 5
Uso del promotor DMR6 para una expresión génica inducida por agentes patógenos y la generación de plantas resistentes a enfermedades
Un control preciso de la expresión transgénica es esencial para la modificación genética de plantas con resistencia aumentada a enfermedades. En el pasado, la sobreexpresión constitutiva de transgenes ha dado frecuentemente lugar a plantas de mala calidad. Por lo tanto, se ha sugerido utilizar promotores inducibles por agentes patógenos, mediante los cuales sólo se expresan los transgenes cuando y donde son necesarios - en sitios de infección.
La expresión local e inducible de genes genéticamente modificados, por ejemplo, genes conmutadores maestro, genes provocadores o Avr, genes antimicrobianos o genes tóxicos, da lugar a la activación de defensa o muerte celular que conducirá a resistencia a agentes patógenos, tal como describen Gurr y Rushton (Trends in Biotechnology 23: 275-282, 2005). Un buen ejemplo es proporcionado por de Wit (Annu. Rev. Phytopathol. 30: 391­ 418, 1992), quien propone el uso de la combinación Avr9-Cf9 para conseguir una muerte celular inducida que conduzca a resistencia a enfermedades. La especificidad tisular y la capacidad para inducir expresión son de importancia capital para tales planteamientos, como describen Gurr y Rushton (Trends in Biotechnology 23: 283­ 290, 2005).
De acuerdo con la presente invención, basándose en un análisis de promotor-GUS, se ha demostrado que el promotor DMR6 muestra una expresión intensa, inducible y localizada. De este modo, el promotor DMR6 es muy adecuado para modificar genéticamente la resistencia a enfermedades en plantas transgénicas. El promotor DMR6 consiste en una región de 2,5 kb que está cadena arriba de la secuencia de codificación de DMR6 de Arabidopsis (codón de inicio: ATG) e incluye la 5'-UTR (como se representa en la Figura 11). Este promotor inducible por agentes patógenos es luego utilizado para crear construcciones transgénicas adecuadas utilizando técnicas estándares conocidas por la persona experta en este campo técnico.
Utilizando secuencias de DNA ortólogas de una especie vegetal dada, se diseñan cebadores para PCR. Estos son luego utilizados para explorar bancos genómicos de la especie vegetal de interés para identificar los clones genómicos que contienen el ortólogo DMR6 con sus secuencias promotoras y reguladoras. Alternativamente, los clones genómicos son aislados explorando un banco con un fragmento de PCR etiquetado que corresponde al gen ortólogo DMR6. Una secuenciación revela la secuencia de nucleótidos del promotor. La región de 2-5 kb cadena arriba de la secuencia de codificación del ortólogo DMR6 (codón de inicio: a Tg ), incluyendo así la 5'-UTR, es luego multiplicada por PCR para crear construcciones transgénicas para la transformación de plantas.
Ejemplo 6
En este ejemplo se demuestra la complementación del mutante dmr6-1 en Arabidopsis thaliana por ortólogos DMR6 de 4 especies de cultivo diferentes. Para esto, se clonaron ortólogos DMR6 de Cucumis sativus (Cs), Spinacia oleracea (So), Lactuca sativa (Ls) y Solanum lycopersicum (Sl) en un vector de expresión vegetal bajo el control del promotor 35S y, posteriormente, se utilizó este vector para transformar un mutante dmr6-1 de Arabidopsis thaliana. En resumen, se aisló mRNA usando métodos estándares y se sintetizó cDNA utilizando un cebador de oligo-dT y métodos estándares. Posteriormente se generaron fragmentos de PCR usando pares de cebadores para cada cultivo, como se representan más adelante en la Tabla 3. Se clonaron los productos de PCR generados en un vector pENTR/D-TOPO usando el kit de clonación pENTR/D-TOPO de Invitrogen y se analizaron los plásmidos resultantes con tamaños de inserto correctos, según se determinaron por PCR, mediante secuenciación de DNA. Se realizó la recombinación con el vector pB7WG2.0 usando LR Clonase II de Invitrogen y se analizaron los plásmidos resultantes mediante PCR y digestión con enzimas de restricción. Se transformaron bacterias Agrobacterium tumefaciens C58C1 PGV2260 con plásmidos adecuados y se analizaron los plásmidos de Agrobacterium mediante PCR y digestión con enzimas de restricción.
Se transformaron plantas de Arabidopsis thaliana dmr6-1 con las construcciones anteriores por inmersión en disolución de bacterias Agrobacterium y se verificó la sobreexpresión de DMR6 de cultivos en plantas de Arabidopsis T1 mediante RT-PCR utilizando los cebadores de clonación para DMR6 de cultivos (Tabla 3). Finalmente, se infectaron plantas de Arabidopsis T2 y T3 con Hyaloperonospora parasítica Cala2 para confirmar la complementación. Los resultados se muestran en la Figura 14.
Como se muestra en la Figura 14, todos los ortólogos DMR6 examinados eran capaces de complementar el mutante dmr6-1 de Arabidopsis thaliana, lo que indica que los ortólogos DMR6 identificados codifican proteínas DMR6 con una funcionalidad similar a la de DMR6 de Arabidopsis thaliana.
Tablas
En la Tabla 1 se enumeran los números GI (identificador de GenInfo) y el número de acceso de GenBank para marcadores de secuencia expresada (ESTs; del inglés, expressed sequence tags) y secuencias de mRNA o proteína del mRNA de DMR6 de Arabidopsis y secuencias ortólogas de otras especies vegetales. Un número GI (identificador de GenInfo, a veces escrito en minúsculas, "gi") es un número entero único que permite identificar una secuencia concreta. El número GI es una serie de guarismos que se asignan consecutivamente a cada registro secuencial procesado por el NCBI. De este modo, el número GI cambia cada vez que cambia la secuencia. El NCBI asigna números GI a todas las secuencias procesadas en Entrez, incluyendo secuencias de nucleótidos de DDBJ/EMBL/GenBank, secuencias proteicas de SWISS-PROT, PIR y muchas otras. Por lo tanto, el número GI proporciona un identificador de secuencia único que es independiente de la fuente de la base de datos, que especifica una secuencia exacta. Si una secuencia de GenBank resulta modificada, incluso por un solo par de bases, se asigna un nuevo número GI a la secuencia actualizada. El número de acceso sigue siendo el mismo. El número GI es siempre estable y recuperable. De este modo, la referencia a números GI en la tabla proporciona una identificación clara e inequívoca de la secuencia correspondiente.
Tabla 1
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Tabla 2
Secuencias cebadoras de marcadores de inserción/deleción (diferencia de tamaños entre paréntesis) usados en el mapeo y la clonación del gen DMR6
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Tabla 3
Pares de cebadores para clonar ortólogos dmr6 en un vector de expresión vegetal adecuado
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Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Planta de col que es resistente a Hyaloperonospora parasítica, caracterizada por que la planta presenta un nivel reducido o una ausencia completa de proteína DMR6 en comparación con la planta que no es resistente al citado agente patógeno, en donde dicha planta presenta una mutación en su gen DMR6 que da lugar a una expresión reducida de DMR6 en comparación con el gen DMR6 de tipo silvestre en el que no está presente dicha mutación.
2. Método para obtener una planta de col que sea resistente a Hyaloperonospora parasítica, que comprende reducir el nivel endógeno de proteína DMR6 en la planta por mutación del gen DMR6 de la planta.
3. Método según la reivindicación 2, en donde la mutación se efectúa por tratamiento mutagénico de la planta, en particular con mutágenos o radiación.
4. Método según la reivindicación 2, en donde la reducción del nivel endógeno en la planta se lleva a cabo reduciendo la expresión del gen DMR6 de la planta mediante silenciamiento génico o RNAi.
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