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ES2655535T3 - Una vacuna contra el virus de Epstein-Barr - Google Patents

Una vacuna contra el virus de Epstein-Barr Download PDF

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ES2655535T3
ES2655535T3 ES11751867.0T ES11751867T ES2655535T3 ES 2655535 T3 ES2655535 T3 ES 2655535T3 ES 11751867 T ES11751867 T ES 11751867T ES 2655535 T3 ES2655535 T3 ES 2655535T3
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lymphocytes
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Romana Ruiss
Gilbert Reisbach
Wolfgang Hammerschmidt
Reinhard Zeidler
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Ludwig Maximilians Universitaet Muenchen LMU
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Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Ludwig Maximilians Universitaet Muenchen LMU
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Abstract

Una partícula similar a virus que se puede obtener mediante (a) transfección de una célula humana con un genoma de VEB modificado, en el que dicho genoma de VEB modificado, en comparación con un genoma de VEB de tipo natural, al menos (aa) carece de una o más secuencias que se requieren para el empaquetamiento de dicho genoma de VEB de tipo natural, carece de una o más secuencias que codifican los polipéptidos de VEB requeridos para dicho empaquetamiento y/o comprende una o más secuencias que codifican polipéptidos de VEB cuya capacidad de empaquetamiento está inhabilitada; (ab) carece de una o más secuencias que codifican polipéptidos de VEB que se requieren para la transformación de linfocitos B y/o comprende una o más secuencias que codifican polipéptidos de VEB cuya capacidad de transformación de linfocitos B está inhabilitada; y (ac) carece de una o más secuencias que codifican polipéptidos de VEB que se requieren para inducir la replicación de un VEB y/o comprende una o más secuencias que codifican polipéptidos de VEB cuya capacidad para inducir la replicación de VEB está inhabilitada; (b) cultivo de la célula obtenida en la etapa (a) en condiciones que permitan la expresión de dicho genoma de VEB modificado; (c) inducción de la fase replicativa del VEB; y (d) aislamiento de dicha partícula para su uso en un procedimiento para provocar una respuesta inmunitaria celular CD8+ específica para VEB terapéutica o profiláctica y una respuesta inmunitaria humoral en un individuo humano, comprendiendo dicho procedimiento la administración de dicha partícula a dicho individuo humano.

Description

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de antígenos del VEB de la vacuna que se asemeja mucho al VEB de tipo natural, dando como resultado una modulación del sistema inmunitario que, desde el punto de vista médico, se considera muy eficaz en la lucha contra las infecciones por VEB.
En un modo de realización más preferente de dicho modo de realización alternativo, dicho VEB modificado difiere además del VEB de tipo natural en el hecho de que carece de los polipéptidos de VEB EBNA-2, EBNA-3a, EBNA3b, EBNA-3c. Aún más preferente es que LMP-1 esté inhabilitado y/o que BZLF1 forme parte del VEB modificado.
Las partículas comprendidas en la vacuna de la invención se pueden preparar mediante procedimientos bien conocidos en la técnica que implican clonación estándar y técnicas de cultivo celular y se describen, por ejemplo, en Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y., "Practical Cell Culture Techniques", Boulton et Baker (eds), Humana Press (1992), ISBN 0896032140; "Human Cell Culture Protocols", Gareth E. Jones, Humana Press (1996), ISBN 089603335X. Por ejemplo, los polipéptidos de VEB se pueden generar de manera recombinante mediante expresión a partir de secuencias de ADN dentro de células hospedadoras que permiten la agregación y la salida de las partículas. Preferentemente, la partícula se prepara mediante cualquiera de los procedimientos detallados a continuación.
Aunque el VEB está implicado causalmente en una variedad de afecciones médicas graves como se describe anteriormente y, a pesar de la intensa investigación y de los éxitos en cuanto a la lucha contra diferentes cepas de virus, el desarrollo de una vacuna contra el VEB ha fracasado hasta el momento, si bien en los últimos años se han aprobado vacunas de virus contra, por ejemplo, el virus del papiloma humano, así como la hepatitis B. Los presentes inventores han sido capaces de generar por primera vez una vacuna que es efectiva para preparar una respuesta inmunitaria específica para VEB en individuos sin exposición previa al VEB, así como para reactivar la respuesta inmunitaria específica para VEB en individuos infectados por el VEB y, por lo tanto, proporciona la respuesta a la necesidad persistente de una vacuna contra el VEB.
Lo más sorprendente es que la vacuna de la invención fue capaz de provocar una respuesta inmunitaria CD8+ específica para VEB, es decir, una respuesta inmunitaria celular además de una potente respuesta inmunitaria humoral, en un modelo animal y de reactivar los linfocitos T CD8+ específicos para VEB de donantes humanos seropositivos para VEB aunque los polipéptidos EBNA3 se habían eliminado debido a su capacidad de transformación de linfocitos B. Esto es sorprendente porque es bien sabido que las células CD8+ generadas tras una infección por VEB se dirigen predominantemente hacia polipéptidos EBNA3 y cabría esperar que una vacuna desprovista de dichos polipéptidos EBNA3 no produzca una respuesta celular CD8+ específica para VEB potente. Además, se supone que los linfocitos B humanos, que son las dianas para la vacuna contra VEB de la invención, no son capaces de presentar epítopos con restricción de clase I MHC derivados de partículas víricas (Keller et al., 2009).
Los inventores usaron una línea celular que porta un genoma auxiliar de VEB que se había modificado de modo que no podía empaquetarse en las partículas que forman parte de la vacuna de la invención. Para garantizar adicionalmente la seguridad de la vacuna, la vacuna está preferentemente desprovista de polipéptidos de VEB que pueden transformar linfocitos B como resultado de un genoma de VEB (auxiliar) preferentemente modificado en consecuencia en la línea celular hospedadora. Por lo tanto, incluso en el raro caso de que un genoma auxiliar de VEB se empaquetara de manera ilegítima en una partícula, la transformación de un linfocito B y la reactivación del virus se pueden excluir por completo.
En resumen, los inventores proporcionan partículas que están libres de ADN vírico y que inducen de manera fiable fuertes respuestas inmunitarias neutralizantes polivalentes humorales y celulares en hospedadores sin exposición previa. Por lo tanto, constituyen una vacuna eficaz y segura para individuos que presentan cualquier tipo de estado serológico, en particular, para pacientes sin exposición previa a VEB, por ejemplo, que están esperando un trasplante para reducir el riesgo de enfermedades asociadas al VEB en pacientes inmunodeprimidos.
En un modo de realización preferente de la vacuna de la invención, dicha partícula comprende al menos un polipéptido de VEB seleccionado entre BZLF1 y gp350 y/o comprende además al menos un polipéptido latente de VEB.
El polipéptido de VEB gp350 (glicoproteína 350) es una glicoproteína unida a la membrana. Dicho gp350 es responsable de la especificidad (tropismo) de los linfocitos B al unirse a CD21 en la superficie celular de los linfocitos
B. Los polipéptidos víricos accesorios adicionales pueden contribuir a una infección completamente eficiente (Chesnokova et al., 2009; Omerovic et al., 2005; Silva et al., 2004; Sorem y Longnecker, 2009). Además, también se ha demostrado la infección de baja eficiencia con partículas de VEB recombinantes desprovistas de gp350 (Janz et al., 2000). Las investigaciones recientes también postulan una implicación de gp350 después de la etapa de internalización y, presumiblemente, durante la liberación de la cápside vírica desde el compartimento endosomal (Busse et al., 2010). Aunque no es crucial para la vacuna de acuerdo con la invención, resulta preferente que gp350 esté comprendida en la membrana de la partícula ya que, tras la administración de la vacuna, la respuesta inmunitaria generada se asemeja más a la respuesta inmunitaria provocada por la infección por un VEB de tipo natural.
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El polipéptido temprano inmediato de VEB BZLF1 media en la interrupción de la infección latente por VEB y, en general, se considera el regulador clave en la inducción de la fase lítica del VEB. En el VEB de tipo natural, BZLF1 no se expresa constantemente. Al entrar en el cuerpo del hospedador, BZLF1 no se expresa, solo lo hace después de que se produzca la infección de los linfocitos B, dando como resultado la inducción del ciclo lítico. El ciclo lítico se mantiene hasta que la respuesta inmunitaria del hospedador se adapta al VEB y puede contener la infección, que es el momento en que el VEB entra en la fase latente de la infección. En dicha fase, BZLF1 no se expresa. La infección persistente por VEB se caracteriza por que existe una alternancia de fase lítica y fase latente, en la que la inducción de la fase lítica se debe a la expresión de BZLF1, que en esos momentos se presenta a las células inmunitarias. Por lo tanto, una vacuna que comprende BZLF1 sensibiliza el sistema inmunitario del individuo inmunizado de modo que se moviliza antes de la salida real de nuevas partículas de virus como resultado de la inducción de la fase lítica.
El término "polipéptidos latentes" se refiere a polipéptidos de VEB que están implicados en la inducción y el mantenimiento del ciclo latente del VEB y/o que se expresan como consecuencia de la inducción del ciclo latente. Preferentemente, el al menos un polipéptido latente es LMP-1 (también denominado BNLF1) y/o LMP-2.
La memoria descriptiva también divulga un procedimiento para generar una partícula, que comprende las etapas de:
(a) transfectación de una célula con un genoma de VEB modificado, en el que dicho genoma de VEB modificado, en comparación con un genoma de VEB de tipo natural, al menos (aa) carece de una o más secuencias que se requieren para el empaquetamiento de dicho genoma de VEB de tipo natural, carece de una o más secuencias que codifican polipéptidos de VEB requeridos para dicho empaquetamiento y/o comprende una o más secuencias que codifican polipéptidos de VEB cuya capacidad de empaquetamiento está inhabilitada; (ab) carece de una o más secuencias que codifican polipéptidos de VEB que se requieren para la transformación de linfocitos B y/o comprende una o más secuencias que codifican polipéptidos de VEB cuya capacidad de transformación de linfocitos B está inhabilitada; y (ac) carece de una o más secuencias que codifican polipéptidos de VEB que se requieren para inducir la replicación de un VEB y/o comprende una o más secuencias que codifican polipéptidos de VEB cuya capacidad para inducir la replicación de VEB está inhabilitada; (b) cultivo de la célula obtenida en la etapa (a) en condiciones que permitan la expresión de dicho genoma de VEB modificado; (c) inducción de la fase replicativa del VEB; y (d) aislamiento de dicha partícula.
El término "transfección" se usa en relación con la invención de acuerdo con el significado aceptado en la técnica, a saber, el proceso de introducción de ácidos nucleicos en las células. La transfección se puede lograr mediante una variedad de procedimientos tales como, por ejemplo, procedimientos basadosen productos químicos, como la transfección mediada por fosfato de calcio o la transfección mediada por liposomas. También se conocen en la técnica procedimientos no químicos como la electroporación o la sonoporación o procedimientos basados en partículas tales como transfección mediada por cañón de genes o magnetofección, así como procedimientos mediados por virus.
El "genoma de VEB modificado" se modifica con respecto a un genoma de VEB de tipo natural. Como se describe en las secciones anteriores, existen varias cepas de VEB de tipo natural cuya configuración genética es bien conocida en la técnica (Rickinson y Kieff, 2007). Como se desprende de lo anterior, el genoma de VEB modificado se modifica únicamente con respecto a las secuencias que son comunes para todas las cepas de VEB. El término "empaquetamiento" es bien conocido en la técnica con respecto al ensamblaje del virus y se refiere al proceso de introducción del ADN vírico del VEB lineal en la partícula del virus durante el ensamblaje de la partícula del virus. El empaquetamiento del ADN genómico de VEB se inicia en las secuencias (TR) que se repiten directamente en ambos extremos de dicho ADN genómico. De forma específica, dicho genoma de VEB modificado carece de una o más secuencias que se requieren para el empaquetamiento de un genoma de VEB de tipo natural. El término "requerido para el empaquetamiento" significa, de acuerdo con la invención, que dicha una o más secuencias son esenciales en el empaquetamiento de ADN de VEB en una partícula de VEB de tipo natural. En otras palabras, en ausencia de dicha una o más secuencias, el ADN del VEB no se empaqueta en una partícula de VEB de tipo natural y una partícula generada por el procedimiento de la invención que también puede estar comprendida en la vacuna de la invención. En consecuencia, el genoma de VEB modificado no se empaqueta en una partícula como se describe en el presente documento cuando faltan dichas una o más secuencias requeridas para el empaquetamiento. Por ejemplo, las secuencias de las repeticiones terminales de VEB se pueden eliminar. Dichas repeticiones terminales son reconocidas por una enzima denominada "terminasa". De forma alternativa o adicional, se pueden eliminar una o más secuencias que codifican los polipéptidos de VEB requeridos para dicho empaquetamiento. Dichos polipéptidos de VEB son, por ejemplo, la enzima terminasa. Además, dicho polipéptido o polipéptidos de VEB requeridos para dicho empaquetamiento se pueden inhabilitar de modo que pierdan su capacidad de empaquetamiento. Dicha inhabilitación se puede lograr mediante procedimientos tales como la modificación del dominio del polipéptido que está involucrado funcionalmente en el proceso de empaquetamiento. Dicha modificación se puede lograr mediante procedimientos tales como, por ejemplo, la eliminación de dicho dominio funcional o de partes del mismo, la inhibición estérica de dicho dominio funcional o del polipéptido completo,
o la sustitución de uno o más aminoácidos de dicho dominio funcional.
Aunque puede ser suficiente eliminar una secuencia requerida para el empaquetamiento o una secuencia que codifica un polipéptido de VEB requerido para dicho empaquetamiento y/o inhabilitar la capacidad de empaquetamiento de un polipéptido de VEB esencial para excluir la posibilidad de empaquetamiento, uno puede de forma alternativa inhabilitar la capacidad de empaquetamiento de una combinación de polipéptidos de VEB que
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también dé como resultado la exclusión de la posibilidad de empaquetamiento del ADN de VEB.
Además, el genoma de VEB modificado carece de una o más secuencias que codifican polipéptidos de VEB que se requieren para la transformación de linfocitos B y/o comprende una o más secuencias que codifican polipéptidos de VEB cuya capacidad de transformación de linfocitos B está inhabilitada. Los polipéptidos de VEB específicos y las combinaciones de los mismos se han descrito anteriormente en el presente documento. El experto está en situación de identificar directa e inequívocamente las secuencias genómicas que codifican dicho uno o más polipéptidos. Además, está en situación de llevar a cabo las etapas que conducen a la eliminación de dicha una o más secuencias de un genoma de VEB y/o a modificar dicha una o más secuencias para obtener uno o más polipéptidos de VEB cuya capacidad de transformación se inhabilita tras la expresión.
Además, el genoma de VEB modificado carece de una o más secuencias que codifican polipéptidos de VEB que se requieren para inducir la replicación de un VEB y/o comprende una o más secuencias que codifican polipéptidos de VEB cuya capacidad para inducir la replicación de VEB está inhabilitada. Los polipéptidos de VEB que están involucrados en la replicación del VEB son principalmente polipéptidos denominados polipéptidos líticos que están involucrados en la replicación del genoma vírico, así como en la expresión del genoma del VEB, que finalmente da como resultado la salida de partículas de virus de la célula hospedadora infectada. El término "requerido para" tiene el mismo significado que se ha explicado anteriormente para otros polipéptidos, es decir, uno o más polipéptidos son absolutamente necesarios con respecto a un aspecto específico. En este aspecto de la invención, la presencia de dicha una o más secuencias que codifican polipéptidos de VEB es absolutamente necesaria para la inducción de la replicación de VEB. Los polipéptidos correspondientes se pueden seleccionar entre el siguiente grupo que consiste en BZLF1, BRLF1, BMLF1 y combinaciones de los mismos. También a este respecto, el experto en la técnica está en situación de identificar directa e inequívocamente las secuencias genómicas que codifican dicho uno o más polipéptidos, así como de llevar a cabo las etapas que conducen a la eliminación de dicha una o más secuencias de un genoma de VEB y/o a modificar dicha una o más secuencias para obtener uno o más polipéptidos de VEB cuya capacidad para inducir la replicación de VEB se inhabilita tras la expresión.
El término "cultivo" se usa de acuerdo con su significado aceptado en la técnica. En general, los procedimientos de cultivo celular, tales como, por ejemplo, constituyentes de medios, elección y selección de marcadores, cuantificación celular y aislamiento, son procedimientos bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en "Practical Cell Culture Techniques", Boulton et Baker. (eds), Humana Press (1992), ISBN 0896032140; "Human Cell Culture Protocols", Gareth E. Jones, Humana Press (1996), ISBN 089603335X y ejemplarmente en la sección de ejemplos. Las condiciones de cultivo varían según el tipo celular y, además, pueden dar lugar a la expresión de diferentes fenotipos para un tipo celular particular. En general, las células se cultivan y se mantienen a una temperatura y mezcla de gases apropiadas, es decir, típicamente 37 ° Celsius, 5 % de CO2, en un medio de cultivo
(a) como fluido de irrigación, transporte y dilución mientras se mantiene el equilibrio osmótico intra-y extracelular, (b) que proporciona a las células agua y ciertos iones inorgánicos a granel esenciales para el metabolismo celular normal, (c) que, junto con un carbohidrato como la glucosa, proporciona la principal fuente de energía para el metabolismo celular y (d) que proporciona un sistema tampón para mantener el medio dentro del intervalo de pH fisiológico, es decir, las células se mantienen viables. La receta de los medios de cultivo varía mucho dependiendo del tipo de célula y contiene, por ejemplo y sin limitación, factores de crecimiento, componentes nutrientes, glucosa, tampones para mantener el pH y antifungicidas y antibióticos. Los procedimientos para cultivar y mantener las células en cultivo son bien conocidos en la técnica; los medios de cultivo y otros materiales relacionados con el cultivo celular, así como las instrucciones y procedimientos para un cultivo exitoso de las células se pueden obtener, por ejemplo, en Sigma-Aldrich o Invitrogen. Las condiciones para permitir la expresión del genoma de VEB modificado corresponden esencialmente a las condiciones generales descritas anteriormente en el presente documento. Las modificaciones para potenciar la expresión de polipéptidos del genoma de VEB en la célula hospedadora son conocidas por los expertos en la técnica.
Las células que se usarán en el procedimiento de la invención son células de origen humano. Es preferente el uso de la línea celular HEK293, que se puede obtener, por ejemplo, de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ, Braunschweig) o de la Colección de Cultivos de Tejidos Estadounidense (ATCC).
El término "inducir la fase replicativa" de VEB significa, de acuerdo con la presente invención, el inicio del proceso que finalmente conduce al ensamblaje intracelular de partículas similares a virus (PSV) y a la salida de dichas PSV como partículas definidas en el presente documento. La inducción se puede lograr, por ejemplo, complementando la célula con dicho uno o más polipéptidos de VEB que están ausentes en la célula hospedadora debido a la eliminación de dicha una o más secuencias que codifican polipéptidos de VEB que se requieren para inducir la replicación y/o la modificación de dicha una o más secuencias que codifican polipéptidos de VEB, dando como resultado su incapacidad para inducir la replicación de VEB. Dicha complementación se puede lograr, por ejemplo, proporcionando a la célula dicha una o más secuencias eliminadas, por ejemplo, en un plásmido (transfectado de forma estable o transitoria), a partir del cual se pueden expresar los polipéptidos de VEB que faltan; o proporcionando a la célula una o más secuencias no modificadas que codifican polipéptidos de VEB funcionales que son capaces de inducir la fase replicativa. La provisión de dicha una o más secuencias de ADN se puede efectuar mediante procedimientos como se describen anteriormente en el presente documento y en la sección de ejemplos. De forma alternativa, dicha complementación se puede lograr proporcionando a la célula dicho uno o más polipéptidos de VEB requeridos para inducir la replicación de un VEB. La provisión de dicho uno o más polipéptidos
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horas después de la adición de doxiciclina. (C) Células PBMC de un donante VEB-seropositivo se cargaron con PSV de células 293-VII+-p3989 inducidas con doxiciclina y se usaron como estimuladores para un clon de linfocitos T CD4+ específicos para gp350. La liberación de IFN-indicó que las PSV generadas a partir de células 293-VII+ y 293-VII+-p3989 eran comparables. Las PBMC descargadas (w/o) o las PBMC cargadas con exosomas de células HEK293 (exo) sirvieron como controles negativos, un LCL autólogo fue el control positivo.
Figura 8: Los linfocitos B cargados con PSV reactivan eficientemente un clon de linfocitos T CD4+ y CD8+ específicos para VEB: (A) Los linfocitos B cargados con PSV son potentes estimuladores de un clon de linfocitos T CD4+ específicos para BNRF1. Una línea mini-LCL (Moosmann et al., 2002) se cargó con diluciones sucesivas de las PSV obtenidas de células 293-VII+ inducidas líticamente. Las células cargadas se usaron como estimuladores para un clon de linfocitos T CD4+ autólogo, que reconoce un epítopo específico para BNRF1 (Mautner et al., 2004). La estimulación del clon de linfocitos T con la línea mini-LCL cargada con exosomas (exo) de células HEK293 se usó como control negativo y se utilizó un LCL autólogo que expresa BNRF1 como control positivo. (B) Las células PBMC de un donante HLA-A2+ / B35+ se incubaron con PSV de células 293-VII+ durante la noche o no se trataron y luego se usaron como estimuladores para clones de linfocitos T CD8+ histocompatibles específicos para las proteínas de VEB BZLF1 (EPL, (Green et al., 2004)) y BRLF1 (YVL; (Saulquin et al., 2000)). Un ELISA de IFN- reveló una activación débil pero evidente de los linfocitos T incubados con PBMC tratadas con PSV, pero no con PBMC sin tratar.
Figura 9: La reactivación con PSV de los linfocitos T específicos para VEB depende de los linfocitos B CD19+. Los linfocitos T CD3+ de un donante sano se estimularon tres veces en un período de 14 días con células estimuladoras autólogas irradiadas letalmente como se indicó, que se habían preincubado con exosomas (exo) o con PSV de células HEK293 o células 293-VII+ durante la noche. Las células estimuladoras eran PBMC no fraccionadas, linfocitos B CD19+ clasificadas por MACS o PBMC de las que se habían agotado los linfocitos B (CD19-). Después de tres rondas de estimulación, se evaluó la reactivación de linfocitos T específicas para VEB en un ensayo Elispot de IFN-, utilizando PBMC autólogas cargadas con PSV o exosomas como diana. La reactivación de los linfocitos T dependía estrictamente de la presencia de linfocitos B CD19+ como estimuladores.
Figura 10: Las PSV de células 293-VII+ aumentan selectivamente los linfocitos T CD4+ y CD8+ específicos para VEB. Las PBMC de diferentes donantes positivos para VEB se irradiaron letalmente, se cargaron con PSV de células 293-VII+ inducidas líticamente, con exosomas de células HEK293 o se dejaron sin tratar y se usaron como estimuladores para PBMC autólogas. Después de 28 días y tres rondas de estimulación, las células se analizaron mediante FACS. (A) Las PBMC PSV-, pero no las PBMC irradiadas cargadas con exosomas (exo) o las no tratadas (w/o) aumentaron los linfocitos CD4+ como se describió recientemente (Adhikary et al., 2008). (B) Las PBMC cargadas con PSV reactivaron y aumentaron los linfocitos T CD8+ específicos para VEB, como se revela por la tinción con tetrámeros/pentámeros HLA B03/B08 o A02 restringidos para epítopos seleccionados de las proteínas de VEB. Un tetrámero (KIF) para la proteína celular Her2/neu sirvió como control negativo. (C) Las PBMC irradiadas cargadas con PSV aumentaron de forma fiable los linfocitos CD8+ específicos para VEB de cuatro donantes diferentes hasta 15 veces en 28 días, mientras que el número total de linfocitos T CD8+ disminuyó en aproximadamente la mitad en comparación con el número inicial de linfocitos T CD8+.
Figura 11: Las PSV provocan respuestas inmunitarias humorales y celulares específicas para VEB en ratones inmunizados. Ratones BALB/c fueron inmunizados dos veces con 10 g de PSV de células 293-VII+ (n = 4) o con las mismas cantidades de exosomas de células HEK293 (n = 2). Los sueros y los esplenocitos se analizaron cuatro semanas después de la última inmunización. (A) En ELISA, los sueros de los ratones PSV-(barras negras) pero no los de los ratones inmunizados con exosomas (barras grises) contienen anticuerpos específicos para proteínas de VEB presentes en viriones. (B) Los anticuerpos generados en ratones inmunizados con PSV de células 293-VII+ neutralizan el VEB infeccioso. Las reservas de VEB 2098 positivos para GFP se preincubaron durante 30 minutos con sueros de ratones inmunizados con PSV (PSV) o exosomas (exo) y posteriormente se usaron para infectar linfocitos B primarios humanos a una multiplicidad calculada de infección de 0,1. 48 horas después, se determinó el número de células infectadas que expresaban GFP mediante citometría de flujo. El anticuerpo neutralizante antigp350 72A1 se usó como un control positivo a dos concentraciones diferentes. (C) Las PSV de las células 293-VII+ activan los linfocitos T específicos para VEB. La presencia de linfocitos T específicos para VEB en ratones inmunizados con PSV (barras negras) o exosomas (barras grises) se midió en un ensayo Elispot de IFN- específico para ratones con esplenocitos irradiados como células presentadoras de antígeno cargadas con lisados de células HEK293, que habían sido transfectadas transitoriamente con plásmidos de expresión que codifican las proteínas víricas indicadas.
Los ejemplos ilustran la invención.
Ejemplo 1: Las células 293-VII+ liberan PSV tras la inducción que carecen de ADN vírico pero contienen varias proteínas de VEB
Los inventores describieron recientemente la construcción de dos líneas celulares auxiliares para la encapsidación de vectores derivados de VEB en partículas de virus recombinantes (Delecluse et al., 1999; Hettich et al., 2006). Estas líneas celulares albergan genomas auxiliares de VEB que carecen de las repeticiones terminales (TR), las señales de empaquetamiento de los virus, pero contienen genes para gfp. Consecuentemente, estos genomas
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transitoriamente con plásmidos de expresión para diversas proteínas de VEB.
Como se muestra en la Figura 4, los sueros de ratones inmunizados con PSV VII+, pero no de ratones inmunizados con exosomas de células 293, revelaron una fuerte inmunorreactividad y, por lo tanto, la inducción de anticuerpos específicos para varias proteínas de VEB que se han identificado recientemente como componentes de partículas de VEB (Johannsen et al., 2004). Todos los anticuerpos fueron detectables inequívocamente en sueros de ratones inmunizados con PSV a diluciones 1:200 (Figura 4) y 1:1000 (no mostrado). De interés, los inventores también detectaron anticuerpos contra el factor de transcripción BZLF-1, que, como se mencionó anteriormente, está presente en altos niveles en células VII+ liberadoras de PSV y se incorpora en PSV VII+. Por el contrario, los ratones inmunizados con exosomas de células 293 revelaron niveles no detectables de anticuerpos específicos contra VEB. Como control, los inventores midieron las reactividades de los sueros frente a lisados de células 293 transfectadas con plásmidos de expresión que codifican la proteína de tegumento principal de CMV, pp65 y el transactivador de VEB, EBNA2. Esta proteína se traduce desde el marco de lectura abierto BYRF1, que se ha eliminado del genoma auxiliar VII+ (ver Figura 1). Los inventores no pudieron detectar ninguna reactividad contra estas dos proteínas, indicativo de la especificidad de estos ensayos. De interés, cantidades significativas de títulos de anticuerpos en ratones a los que se les inyectaron PSV ya eran detectables siete días después de la primera inmunización, indicativos de la alta inmunogenicidad de las PSV VII+ (datos no mostrados).
Para evaluar si los anticuerpos específicos contra VEB son neutralizantes, los inventores cuantificaron en qué medida inhiben la infección de linfocitos B primarios por VEB. Para ello, hicieron uso de un VEB recombinante (2089) que porta el gen gfp que se expresa en células infectadas. (Delecluse et al., 1998). Los linfocitos B primarios aislados de adenoides frescas se infectaron con VEB-2089, se preincubaron con sueros de ratón durante 30 minutos, a una MOI de 0,1 y se cuantificó el número de células infectadas 48 horas después mediante análisis FACS. Como se muestra en la Figura 4, los sueros de ratones infectados con PSV inhibieron la infección de linfocitos B humanos primarios por VEB. Como se puede observar, los sueros de ratones inmunizados con células 293 también tienen un efecto inhibidor débil que probablemente se debe a anticuerpos específicos contra 293 que reconocen el VEB-2089 derivado de células 293.
Ejemplo 4: Las PSV VII+ inducen respuestas inmunitarias celulares específicas para VEB
Los inventores se preguntaron a continuación si la inmunización con PSV de ratones no sometidos a experimentación previa también inducía respuestas inmunitarias celulares específicas para VEB, que se sabe que son esenciales para la vigilancia inmunológica del virus y de las células infectadas por VEB (Hislop et al., 2007). Por lo tanto, aislaron los bazos de ratones inmunizados con PSV y generaron una suspensión de células individuales. Se incubaron 2 x 105 esplenocitos durante la noche con lisados de células 293 que habían sido transfectadas transitoriamente con plásmidos de expresión para cualquiera de esas proteínas de VEB que también se han usado para la detección de anticuerpos específicos contra VEB para permitir la absorción, la degradación proteolítica y la presentación de proteínas derivadas de PSV. La activación de los linfocitos T se midió 24 horas después con un ensayo Elispot de interferón-gamma.
Ejemplo 5: Introducción de una línea celular de empaquetado de 3ª generación
Las líneas celulares TR-2 y 293-VII+ son dos líneas celulares de empaquetamiento en las que el ciclo de vida productivo del VEB es inducido por transfección transitoria de un plásmido de expresión que codifica BZLF1, que es suficiente para iniciar el cambio del ciclo latente al ciclo lítico. Sin embargo, la producción a gran escala de PSV de grado clínico depende de una línea celular que se libere permanentemente.
Para superar estas restricciones y dar las primeras pasos hacia una producción estandarizada y más constante de PSV, los inventores diseñaron una nueva línea celular de empaquetamiento, denominada iVII+, que, además del genoma auxiliar VII+, porta de manera estable un segundo plásmido que codifica un BZLF1 inducible y, además, BRLF1, que es otra proteína vírica temprana inmediata que, en cooperación con BZLF1, induce el ciclo lítico en células epiteliales (Zalani et al., 1996). Cuando se cultivan en presencia de doxiciclina, las células iVII mantienen el ciclo lítico y liberan PSV constitutivamente sin ningún cambio detectable en el fenotipo celular.
Ejemplo 6: Reactivación de linfocitos T específicos para VEB
Con el fin de definir si las PSV obtenidas de células 293-VII+ son absorbidas por linfocitos B humanos y si tienen el potencial de reactivar linfocitos T específicos para VEB, una línea de linfocitos B linfoblásticos (LCL) transformada con un mini-VEB (Kempkes et al., 1995) se incubó con PSV de células 293-VII+. A continuación, los LCL cargados se cocultivaron con un clon de linfocitos T CD4+ autólogo específico para la proteína del tegumento del VEB BNRF1 no codificado en los mini-VEB (Kempkes et al., 1995). Los experimentos demostraron que los linfocitos B cargados con PSV reactivaron eficazmente el clon de linfocitos T CD4+, según se midió mediante un ensayo ELISA de GM-CSF (Fig. 8A). Este conjunto de experimentos muestra que las PSV de células 293-VII+ interactúan específicamente con linfocitos B humanos y son absorbidos por ellos, que a su vez son potentes células presentadoras de antígeno y estimuladores de linfocitos T CD4+ específicos para VEB, corroborando los hallazgos de Adhikary et al., 2008.
Ejemplo 7: Las PSV reactivan los linfocitos T CD8+ de hospedadores seropositivos
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La eficacia de las vacunas depende de la generación de una memoria inmunológica de larga duración, que se basa en los linfocitos T CD4+ y CD8+. Se pretendía determinar si las PSV de células 293-VII+ pueden activar los linfocitos T CD8+ específicos para VEB, una población celular que es esencial para la vigilancia de las células infectadas por VEB in vivo. Para someter a ensayo la capacidad de las PSV para reactivar linfocitos T CD8+, las PBMC se incubaron primero con PSV de células 293-VII+ o exosomas de células 293 durante la noche y luego se usaron como dianas para clones de linfocitos T CD8+ específicos para VEB. Un ELISA de IFN- reveló una activación débil pero evidente de los linfocitos T incubados con PBMC que se habían preincubado con PSV (Fig. 8B). En la siguiente serie de experimentos, se estimularon PBMC de donantes seropositivos para VEB con PBMC autólogas e irradiadas previamente incubadas con PSV de células 293-VII+. Después de 28 días y tres rondas de estimulación, un análisis detallado por citometría de flujo reveló que las PBMC cargadas con PSV de células 293-VII+ inducían la proliferación de linfocitos T CD4+ autólogos, en contraste con las PBMC cargadas con exosomas de células HEK293 parentales
o PBMC no tratadas (Fig. 10A). Para determinar si las PSV también reactivaron linfocitos T CD8+ específicos para VEB, se midió su frecuencia inicial en PBMC donantes y se compararon con poblaciones de linfocitos T CD8+ expandidos con PSV in vitro para el reconocimiento específico de epítopos de VEB de clase I HLA conocidos, que provocan fuertes respuestas inmunitarias de los linfocitos T CD8+ en hospedadores infectados. El epítopo peptídico CLG de la proteína latente LMP2 y los epítopos peptídicos EPL/RAK, GLC e YVL de las proteínas líticas tempranas BZLF1, BMLF1 y BRLF1, respectivamente, se eligieron por ser restringidos para HLA B03/B08 o A02. La tinción con pentámeros HLA/péptido reveló una fracción pequeña pero detectable de linfocitos T CD8+ en las PBMC donantes iniciales que reconocían predominantemente los epítopos líticos tempranos (Fig. 10B). La fracción de linfocitos T CD8+ específicos del epítopo se expandió de aproximadamente un 0,15 % a un 0,25 % a un 1,1 % a un 2,4 % en tres rondas de estimulación de PSV (Fig. 10B) y los números absolutos de linfocitos T CD8+ específicos del epítopo aumentaron en hasta 10 veces aproximadamente (Fig. 10C). Este hallazgo está en conflicto con una publicación reciente, ya que los linfocitos B no procesaron eficazmente partículas víricas o PSV para la presentación cruzada asociada a HLA clase I, en contraste con las células presentadoras de antígenos profesionales tales como las células dendríticas o los macrófagos (Keller et al., 2009). Por lo tanto, se esperaba que los monocitos o macrófagos en PBMC pudieran presentar péptidos derivados de PSV a linfocitos T CD8+ para su activación. Para abordar esta controversia, se purificaron células CD19+ y CD19-a partir de PBMC y se incubaron las células mononucleares fraccionadas con PSV de células 293-VII+ o de exosomas de células HEK293. La reactivación de los linfocitos T inmediatamente después de la tercera ronda de estimulación con PBMC cargadas con PSV se cuantificó en ensayos Elispot de IFN- con PBMC CD19+ y CD19-Los resultados indicaron claramente que solo los linfocitos B CD19+ son presentadores potentes de antígenos víricos derivados de PSV (Fig. 9). No se identificó casi ningún linfocito T con PBMC CD19-como células presentadoras de antígeno (Fig. 9), lo que sugiere que solo los linfocitos B activaron los linfocitos T específicos del epítopo del virus, incluidos los linfocitos T CD8+ restringidos a HLA clase I.
Ejemplo 8: Las PSV provocan anticuerpos neutralizantes de alto título específicos para VEB y respuestas inmunitarias celulares en ratones Balb/c no sometidos a experimentación previa
Esta es una repetición del ejemplo 3 (ver también la Fig. 4) que incluye más datos (ver la Fig. 11). En aras de la exhaustividad, se describe nuevamente la metodología, dado que incluye variaciones. Los inventores inmunizaron ratones BALB/c (cuatro animales) dos veces en un período de 14 días con 10 g de PSV, mientras que los ratones de control (dos animales) fueron inmunizados con la misma cantidad de exosomas de células HEK293. Cuatro semanas después de la segunda inmunización, los sueros se analizaron con un ELISA para determinar la presencia de anticuerpos específicos contra VEB y de lisados de proteínas de células HEK293 como antígenos, que se habían transfectado transitoriamente con plásmidos de expresión para proteínas de VEB individuales como se muestra en la Figura 11A. Para evitar señales de fondo causadas por anticuerpos producidos contra proteínas derivadas de HEK293, los sueros se preincubaron durante 2 horas con placas de cultivo celular recubiertas con lisados de HEK293. Como se muestra, los sueros de ratones inmunizados con PSV, pero no los ratones inmunizados con exosomas de células HEK293, revelaron una fuerte inmunorreactividad contra las proteínas víricas seleccionadas, que son componentes de viriones de VEB. Todos los anticuerpos fueron detectables inequívocamente en sueros de ratones inmunizados con PSV a diluciones de 1 a 200 (Fig. 11A). Los ratones inmunizados con PSV también desarrollaron altos niveles de anticuerpos contra el factor de transcripción Zta, codificado por el gen BZLF1. Como controles, se midió la reactividad de los sueros frente a lisados de células HEK293 transfectadas con plásmidos de expresión que codifican la proteína del tegumento CMV pp65 y el transactivador de VEB EBNA2. El EBNA2 se traduce del gen BYRF1, que está eliminado en el genoma auxiliar de VEB en células 293-VII+ (Fig. 1). Como se anticipó, no se detectaron respuestas humorales contra estas dos proteínas en los ratones inmunizados con PSV, lo que indica la especificidad de estos ensayos.
Para saber si los sueros de animales inmunizados con PSV contenían anticuerpos neutralizantes específicos contra VEB, que pueden inhibir la infección celular por VEB, se utilizó la gfp recombinante que codifica VEB 2089, que confiere fluorescencia de GFP a los linfocitos B como una medida cuantitativa de infección (Delecluse et al. 1998). Las reservas de virus de VEB 2089 se preincubaron con sueros de ratón durante 30 minutos y luego se usaron para infectar linfocitos B humanos primarios a una multiplicidad de infección calculada de 0,1. Después de 48 horas, las células infectadas con GFP se cuantificaron mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 11B, los sueros de ratones inmunizados con PSV alteraron la infección por VEB, aunque los sueros de ratones inmunizados con exosomas de células HEK293 también tuvieron un efecto inhibidor pero más débil, probablemente debido a la inducción de anticuerpos contra proteínas derivadas de 293. Las reservas de virus de VEB 2089 se obtienen de
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células productoras HEK293 (Delecluse et al., 1998), lo que sugiere que los sueros de ratones inmunizados con exosomas de células HEK293 también podrían reconocer partículas de VEB 2089 y comprometer su infectividad.
A continuación, se preguntó si la inmunización de ratones conducía a la inducción de respuestas inmunitarias celulares específicas para VEB, que son esenciales para la vigilancia inmunitaria del VEB. Se prepararon células individuales a partir de bazos de ratones inmunizados con PSV y de ratones de control descritos anteriormente. Los esplenocitos irradiados letalmente de ratones individuales se incubaron con lisados obtenidos a partir de células HEK293 transfectadas transitoriamente con plásmidos de expresión únicos que codifican los genes víricos mostrados en la Figura 11C y presentes en viriones. Para permitir la adsorción, la degradación proteolítica y la presentación de los lisadosañadidos exógenamente, los esplenocitos se incubaron durante cinco horas y posteriormente se lavaron para eliminar el lisado libre. La capacidad de las células para presentar antígeno se evaluó con 5 x 105 esplenocitos no irradiados, que se agregaron como indicadores. La activación de las células indicadoras se determinó en un ensayo Elispot de IFN- después de 24 horas. Como se muestra en la Fig. 11C, los esplenocitos de ratones inmunizados con PSV, pero no de ratones de control inmunizados con exosomas de células HEK293, se reactivaron claramente. Tomado en su conjunto, este experimento indicó que las PSV de células 293-VII+ pueden inducir una respuesta inmunitaria celular específica para VEB en ratones que no han sido tratados previamente.
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