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CN111620955B - 一种多靶位复合抗原及其应用 - Google Patents

一种多靶位复合抗原及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种多靶点复合抗原及其应用，其目的是提供一种多靶点复合抗原，即组合的CTL抗原表位肽。本发明的另一个目的是提供对肿瘤细胞表面多靶位的多价疫苗。本发明的再一个目的是提供一种多靶点复合抗原负载CD8+细胞毒性T淋巴细胞及其制备方法。本发明的再一个目的是提供一种表位诱导的特异性CTL效应细胞。

Description

一种多靶位复合抗原及其应用
技术领域
本发明涉及生物学和医学领域，更具体地涉及多靶点复合抗原及其应用。
背景技术
近年来，免疫系统在肿瘤预防和治疗中的重要作用已经得到广泛认同，基于抗肿瘤特异性免疫重建的免疫治疗是目前国际上公认的继手术、放疗和化疗之后最有希望完全消灭体内肿瘤细胞得以根治肿瘤的重要手段，将成为未来肿瘤治疗的一个主要方向。免疫治疗主要通过体外补充、诱导与活化机体固有的生物应答调节系统来活化调动具有细胞毒活性生物活性细胞及细胞因子，提高病人自身免疫系统的功能，增强特异性肿瘤杀伤细胞的分化能力，在细胞水平上杀伤肿瘤细胞，有效抑制肿瘤细胞的转移、扩散和复发，且副反应轻微，具有良好的临床治疗效果，克服了肿瘤传统治疗方式的“不彻底、易转移、副作用大”等弊端。随着从细胞和分子水平上对肿瘤免疫研究的深入，荷载肿瘤抗原的树突状细胞(DCs)致敏的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)作为免疫治疗的重要部分，可特异性识别肿瘤，呈克隆化扩增并在体内形成免疫记忆，介导持久抗肿瘤特异性免疫效应。而CTL细胞的激活需要肿瘤抗原致敏和抗原递呈细胞(APC)所提供的共刺激信号以及由细胞因子提供的第三类信号分子的共同作用。肿瘤相关和特异性抗原的存在为特异性免疫治疗奠定了理论和物质基础。只有免疫原性强、特异性高的肿瘤抗原才能有效激活肿瘤特异性的T淋巴细胞。近年来，针对肿瘤表达的肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异抗原(TSA)发展起来的肿瘤多肽治疗性疫苗，以其特异性强、安全、廉价、易于保存和应用等特点，有望克服上述疗法的缺点，达到有效治疗肿瘤的目的。
肿瘤抗原必须在抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC)内降解为短肽并形成肽-MHC-TCR复合物才能为T细胞所识别，激发相应的细胞毒性T淋巴细胞反应。而多肽疫苗的目的就在于把高剂量的肿瘤抗原多肽输送给APC表面的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)分子，因此合适而有效的肿瘤抗原多肽对肿瘤疫苗的制备非常重要。且肿瘤抗原多肽是受MHC限制的，只有MHC I类分子相同的患者才能使用同一种肽，并且由于肿瘤的不均一性，某些肿瘤抗原肽可能会诱导免疫耐受而不是激活免疫应答。此外，免疫原性弱是多肽疫苗的另一大弱点，通过对表位多肽进行修饰(单个氨基酸的替换、多肽的PMRI修饰和脂肽等)或采用多价疫苗则可有效提高其免疫原性，诱导更强的CTL活性。
酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)是可以从单细胞水平检测分泌细胞因子的T细胞的一种细胞免疫学检测技术。利用ELISPOT检测分泌IFN-γ的CTL是常用的评价细胞免疫水平的方法，其原理是将IFN-γ的单抗包被在贴有PVDF膜的96孔板上，再将经过免疫原性表位多肽刺激过的T细胞加入微孔内培养，其分泌的IFN-γ与包被抗体结合。将细胞和未结合成分洗去后，加入酶标记IFN-γ检测单抗，与被捕获的IFN-γ结合。加入底物后，可在有IFN-γ的位置产生有色斑点，每个斑点代表一个分泌IFN-γ的细胞。用计算机成像分析系统记数斑点数，就可以确定样品中分泌IFN-γ的CTL的数量。ELISPOT技术敏感性高，由于细胞附近的细胞因子浓度高，分泌100个细胞因子的细胞也能被发现，足以检测到1/105个IFN-γ分泌细胞。并且因为使用了识别细胞因子或抗体的两个不同表位的两种单克隆抗体，ELISPOT技术有着高度的特异性。
本发明是基于申请号为201510270656.X的中国发明专利的后续研究。本发明所引述的文献如下，下述文献通过引用结合到本专利申请中。专利文献1：公开号：CN101302537A；专利文献2：公开号：CN 101854945A；专利文献3：公开号：CN 102625832A。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种多靶点复合抗原，即组合的CTL抗原表位肽。本发明的另一个目的是提供对肿瘤细胞表面多靶位的多价疫苗。本发明的再一个目的是提供一种多靶点复合抗原负载CD8+细胞毒性T淋巴细胞及其制备方法。本发明的再一个目的是提供一种表位诱导的特异性CTL效应细胞。
本发明提供一种多肽，所述多肽由EBV、HPV、HSV和CMV组成，其中：
所述EBV的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13；
所述HPV的氨基酸序列为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ IDNO：22；
所述HSV的氨基酸序列为SEQ ID NO：3；
所述CMV的氨基酸序列为SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：23。
其中，所述多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO：5。
本发明还提供一种编码权利要求2所述多肽的核酸分子。
所述核酸为DNA分子，所述DNA分子为序列表中序列6所示的DNA分子。
含有所述核酸分子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒载体也应在本发明的保护范围之内。
本发明还提供一种疫苗，所述疫苗的活性成分为如下物质中的任一种：
1)所述多肽；
2)所述核酸分子；
3)所述重组表达载体；
4)所述表达盒；
5)所述转基因细胞系；
6)所述重组菌；
7)所述重组病毒载体。
所述疫苗为DC疫苗。
本发明还提供一种多靶点复合抗原负载CD8+细胞毒性T淋巴细胞，所述多靶点复合抗原负载CD8+细胞毒性T淋巴细胞的抗原表位包括所述多肽。
本发明还提供一种表位诱导的特异性CTL效应细胞，其特征在于，抗原表位包括所述多肽。
如下物质中的任一种在制备治疗癌症的药物中的应用也应在本发明的保护范围之内：
1)所述多肽；
2)所述核酸分子；
3)所述重组表达载体；
4)所述表达盒；
5)所述转基因细胞系；
6)所述重组菌；
7)所述重组病毒载体；
8)所述的疫苗；
9)所述的多靶点复合抗原负载CD8+细胞毒性T淋巴细胞。
本发明提供的多靶点复合抗原(Multiple Target complex antigen，MTCA)，即由多个表位组合的方式，该组合方式是根据遗传基因结构和功能差异，从一系列候选多肽中选出至少四种与人类白细胞抗原相匹配的多肽组合，制作成肿瘤疫苗，从而激发患者机体对肿瘤的特异性免疫应答，延长其生存时间，MTCA较其他肿瘤疫苗，具有绕过免疫多样性和肿瘤不均一性的独特优势，可以有效诱导更强的CTL杀伤活性。
在本发明的实施方式中，提供用于多种肿瘤抗原的CTL及其制备方法。本发明可用于任何肿瘤，包括但不限于：肺癌、乳腺癌、肾癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、黑色素瘤和头颈部肿瘤等，还可应用于有关血液和骨髓的癌症。
在本发明优选的具体实施方式中，本发明CTL产物以特异对应所述肿瘤所展现的抗原表达。因此，将组合的多抗原表位多肽联合慢病毒Lenti-hGM-CSF同时感染DC细胞提供了一种生成单CTL产品的途径，所述产品具有特定肿瘤独立抗原特征。
本发明的重要意义体现在：提出了一种全新的细胞免疫治疗理念，即“打破肿瘤免疫耐受基础上的自体免疫细胞治疗”技术，建立了一种在打破肿瘤“免疫耐受”基础上实施高效特异性肿瘤杀伤的新技术、新方法。本技术解决了目前肿瘤免疫治疗中效应细胞在体内存留时间短，肿瘤杀伤效率低，临床疗效差等瓶颈问题，大幅提高了细胞免疫治疗的临床疗效，具有非常广阔的应用前景。
在本发明的实施方案中，用下述方法构建慢病毒载体：针对人外周血hGM-CSF基因(GeneID:NM_000758.3)的CDS区序列提供PCR引物，通过PCR扩增在上述基因的5′端和3′端均添加酶切位点，以质粒pORFhGM-CSF为模板，采用PCR方法扩增出hGM-CSF基因片段；通过PacI限制性内切酶位点，将hGM-CSF基因定向克隆到慢病毒连接载体系统中构建重组载体。将重组载体和包膜质粒以及包装结构质粒混合，形成慢病毒载体系统。本发明所述慢病毒优选是Lenti-hGM-CSF。
在本发明的实施方案中，通过下述方法制备DC疫苗：分离出单核细胞，优选从外周血中分离出单核细胞，经rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α诱导获得DC细胞，将本发明联合的抗原表位多肽(优选SEQ ID NO：5)和本发明上述慢病毒同时感染DC细胞后获得DC疫苗。
在本发明的实施方案中，将本发明联合抗原表位多肽(优选SEQ ID NO：5)和本发明上述慢病毒同时感染DC细胞后获得的DC疫苗然后与T淋巴细胞共同孵育，得到致敏的细胞毒性T淋巴细胞。优选地，MTCA-DC/APC-CTL免疫细胞治疗技术是以表达CD3+CD8+为主的细胞毒性T细胞为主要效应细胞。
在本发明的实施方案中，如下制备抗原特异性CTL：将本发明的如上获得的负载肿瘤相关抗原的DC细胞与T淋巴细胞混合后，在培养基中加入GM-CSF、IL-4、IL-2继续培养后，收集细胞即得本发明表位诱导的特异性CTL效应细胞。
本发明特异性CTL具有明显提高的分泌IFN-γ的能力。在MTCA-多靶点复合抗原诱导抗原特异性CTL对特异性肿瘤细胞的杀伤效应的试验中，本发明MTCA-多靶点复合抗原诱导产生的抗原特异性CTL在效靶细胞共培养过程中可以形成对靶细胞的特异性溶解，即本发明MTCA-多靶点复合抗原诱导的CTL可同时杀伤负载有对照肽的靶细胞，扩大了实验多肽的适用范围。
附图说明
图1是通过pacl限制性内切酶位点，将hGM-CSF基因定向克隆到慢病毒连接载体系统中构建重组载体FattbC31UGW-hGM-CSF的图示。
图2是包膜质粒VSVG。
图3是包装结构质粒CMVΔ8.9-D64N/D116N。
图4是本发明的多靶点复合抗原诱导抗原特异性CTL产生IFN-γ的能力比较条形图。
图5是本发明的多靶点复合抗原诱导抗原特异性CTL对特异性肿瘤细胞的杀伤效应比较条形图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
多肽的合成
以下实施例中的多肽均委托上海强耀生物科技有限公司采用标准Fmoc方案进行合成，并采用高效液相色谱法进行纯化和纯度分析，质谱法进行鉴定和分子量测定。结果显示，所合成的多肽的纯度高于95％，分子量与理论值相符。
本实施例提供了名称为MTCA的多肽，该多肽由EBV、HPV、HSV和CMV组成，其中：
所述EBV的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13；
所述HPV的氨基酸序列为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ IDNO：22；
所述HSV的氨基酸序列为SEQ ID NO：3；
所述CMV的氨基酸序列为SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：23。
其中，当所述EBV的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、所述HPV的氨基酸序列为SEQ IDNO：2、所述HSV的氨基酸序列为SEQ ID NO：3以及所述CMV的氨基酸序列为SEQ ID NO：4时，按照N端到C端的顺序一次连接，得到多肽MTCA。MTCA的氨基酸序列是SEQ ID NO：5，其对应的编码基因的序列为序列6所示的DNA分子。
实施例2慢病毒LentihGM-CSF的构建
1.根据人外周血hGM-CSF基因(GeneID:NM_000758.3)的CDS区序列设计PCR引物F1(F1 5’-GTTAATTAACATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCT-3’)和R1(R1:5’-GTTAATTAACTCACTCCTGGACTGGCTCCCAGCAG-3’)，引物F1和R1能够通过PCR扩增在上述基因的5′端和3′端均添加酶识别位点。上述引物中，下划线部分为酶识别位点。
2.以质粒pORFhGM-CSF(购自Invivogen，货号：porf-hgmcsf)为模板，通过引物F1和R1采用PCR方法扩增，得到hGM-CSF基因片段；再通过PacI限制性内切酶位点，将hGM-CSF基因定向克隆到慢病毒连接载体FattbC31UGW(普如汀生物技术(北京)有限公司，货号BioVector912008，其结构如图1所示)中，得到重组载体FattbC31UGW-hGM-CSF。重组载体FattbC31UGW-hGM-CSF为在慢病毒连接载体FattbC31UGW的PacI限制性内切酶位点处插入hGM-CSF基因并保持慢病毒连接载体FattbC31UGW其他序列不变得到的重组载体。
3.将重组载体FattbC31UGW-hGM-CSF和包膜质粒VSVG(普如汀生物技术(北京)有限公司，货号BioVector912007，其结构如图2所示)以及包装结构质粒pCMVAR8.91-D64N/D116N(普如汀生物技术(北京)有限公司，货号BioVector912006，其结构如图3所示)混合，混合比例为5:5:1形成慢病毒载体系统，利用脂质体LipofectamineTM在293T细胞上转染，24-48h后再荧光显微镜下观察，72h后出现大量荧光后收集病毒上清，获得编码hGM-CSF的慢病毒颗粒Lenti-hGM-CSF，收集的病毒上清液浓缩后分装备用或立即使用。
4.重组慢病毒活性测定时，将浓缩后的病毒储存液作不同比例稀释，感染细胞72h后再荧光显微镜下进行荧光计数，确定滴度。以慢病毒连接载体FattbC31UGW作为对照。结果显示，位点特异整合性慢病毒滴度为7.1×10-7TU/ml。
病毒滴度检测的方法为：取对数生长的HT1080细胞以6×103个/孔的细胞量铺于96孔板，每孔加入含10％FBS的DMEM培养基，第二天在圆底96孔板中用无血清的DMEM培养基对荧光表达病毒做10倍梯度稀释，每个梯度做三个复孔，在铺好HT1080细胞的96孔板里每孔弃去90ul培养基，对应加入圆底96孔板中稀释好的病毒液90ul，24h后换成含10％FBS的DMEM培养基100ul，感染72h后，计数荧光表达量适中的孔数的荧光个数，其与该孔的病毒液体积比即为荧光表达病毒的滴度，荧光表达病毒滴度做一标准曲线再结合QPCR法得出的荧光表达病毒及目的病毒的cq值，即可计算出目的病毒滴度(TU/mL)。
实施例3DC疫苗的制备
从人外周血中分离出单核细胞，经rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α诱导获得DC细胞，通过相差显微镜和流式细胞仪鉴定后，将实施例1合成的多靶点复合抗原肽MTCA(SEQ ID NO：5)和实施例2制备的慢病毒Lenti-hGM-CSF同时感染DC细胞后获得DC疫苗。具体包括如下步骤：
1)采集志愿者外周血，利用淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque，聚蔗糖-泛影葡胺)密度梯度分离法分离自体血浆(56℃30min灭活，4℃保存)和外周血单个核细胞PBMC，将此PBMC用无血清RPMI-1640以(5-7)×107个细胞量铺于T75培养瓶，1h后收集悬浮细胞用于分离T淋巴细胞，贴壁细胞换含rhGM-CSF(1000U/ml)、rhIL-4(1000U/ml)和TNF-α(500U/ml)的1640培养基刺激诱导单核细胞向DC分化。
2)第5天用实施例1中的多肽MTCA和实施例2中的慢病毒颗粒Lenti-hGM-CSF浓缩液感染收集于24孔板中悬浮未成熟的DC，根据预实验最优MOI值计算慢病毒所需体积。转染24小时后更换为新鲜DC诱导培养基并加入rhGM-CSF(1000U/ml)、rhIL-4(1000U/ml)和TNF-α(500U/ml)以促进DC分化成熟，获得DC疫苗。
实施例4抗原特异性CTL的制备
采集志愿者外周血，经淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque)进行密度梯度离心后，收集富含单个核细胞的界面细胞，重悬于RPMI-1640培养基中，置37℃、5％CO2孵箱培养2小时，收集非贴壁的悬浮细胞用含3％血清的RPMI-1640培养基重悬后，调节细胞密度为1×106个/ml，此悬液中富含T淋巴细胞。将实施例3制备的DC疫苗与T淋巴细胞按照1:10的比例混合后，在RPMI-1640培养基中加入GM-CSF(1000U/ml)、IL-4(1000U/ml)、IL-2(500U/ml)继续培养1周，每3天半量换液，维持细胞浓度为1×106个/ml；培养1周后收集细胞即得表位诱导的特异性CTL效应细胞，命名为CTL-MTCA。
实施例5对照样本的制备
按照实施例1-4的方法，分别将实施例1中的多肽MTCA替换为多肽EBV(氨基酸序列为SEQ ID NO：1)、多肽HPV(氨基酸序列为SEQ ID NO：2)、多肽HSV(氨基酸序列为SEQ IDNO：3)和多肽CMV(氨基酸序列为SEQ ID NO：4)；制备得到表位诱导的特异性CTL效应细胞，并将其分别命名为CTL-EBV、CTL-HPV、CTL-HSV和CTL-CMV。
实施例6本发明MTCA-多靶点复合抗原诱导抗原特异性CTL产生IFN-γ的能力测定与比较试验
实验分组为：1、EBV抗原对照组(待测细胞为CTL-EBV)；2、HPV抗原对照组(待测细胞为CTL-HPV)；3、HSV抗原对照组(待测细胞为CTL-HSV)；4、CMV抗原对照组(待测细胞为CTL-CMV)；5、MTCA-多靶点复合抗原组(待测细胞为CTL-CMV)；6、空白对照组(只加入100ulRPMI-1640培养基)。具体实验方法如下：
MTCA-多靶点复合抗原组：采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测CTL-MTCA分泌IFN-γ的能力：采用ELISPOT检测试剂盒，在96孔板中加入用PBS按1:100稀释的IFN-γ捕获抗体100ul，置于4℃孵育过夜，用PBS洗涤后加入待测细胞(实施例4中制备的CTL-MTCA)液(用RPMI-1640培养基调节待测细胞含量)100ul，1×106个/孔，在37℃，5％CO2条件下孵育24h后，用含0.1％吐温20的PBS洗涤后，加入含有1％BSA的PBS按1:100稀释后的生物素标记的抗IFN-γ抗体，在37℃，5％CO2条件下孵育2h，用含1％BSA的PBS按1:5000稀释后的链霉亲和素标记的碱性磷酸酶100ul，孵育1h，洗涤后拍干培养板后，用蒸馏水终止反应，干燥后读点。实验设三次重复。
1、EBV抗原对照组：除将MTCA-多靶点复合抗原组中的待测细胞替换为实施例5中制备的CTL-EBV外，其它操作相同。
2、HPV抗原对照组(待测细胞为CTL-HPV)；
3、HSV抗原对照组(待测细胞为CTL-HSV)；
4、CMV抗原对照组(待测细胞为CTL-CMV)；
5、MTCA-多靶点复合抗原组(待测细胞为CTL-CMV)；
6、空白对照组：除将100ul待测细胞液替换为100ul RPMI-1640培养基外，其它操作相同。
结果如图4所示，结果表明：MTCA-多靶点复合抗原组的特异性CTL分泌IFN-γ的能力明显高于其他5组，其诱导分泌IFN-γ的能力最强，相对于对照组单一抗原肽负载特异性CTL分泌IFN-γ的能力提高了3倍以上。
实施例7本发明MTCA-多靶点复合抗原诱导抗原特异性CTL对特异性肿瘤细胞的杀伤效应
实验分组为：MTCA-多靶点复合抗原组：
MTCA-多靶点复合抗原组：采用时间分辨荧光细胞毒性实验进行分析。以实施例4和5中制备的CTL-MTCA作为效应细胞(E)，分别以T2+EBV、……为靶细胞……为靶细胞(T)，检测CTL的特异性杀伤活性。在37℃，5％CO2条件下将效应细胞与靶细胞按照数量比为50：1共同孵育4h，每个样本设3个复孔，取平均值为检测结果，按照如下公式计算CTL-MTCA的细胞杀伤活性，特异性裂解率＝(待测孔荧光强度-自然释放孔荧光强度)/(最大释放孔荧光强度-自然释放孔荧光强度)*100％。
实验分组为：1、EBV抗原对照组(CTL-EBV)；2、HPV抗原对照组(CTL-HPV)；3、HSV抗原对照组(CTL-HSV)；4、CMV抗原对照组(CTL-CMV)；5、MTCA-多靶点复合抗原组(CTL-MTCA)。
结果如图5所示，MTCA-多靶点复合抗原诱导产生的抗原特异性CTL(CTL-MTCA)在效靶细胞共培养过程中可以形成对靶细胞的特异性溶解，而各对照组多肽所诱导的效应细胞仅能杀伤负载有相应肽的靶细胞，即MTCA-多靶点复合抗原诱导的CTL可同时杀伤负载有上述四种对照肽的靶细胞，扩大了实验多肽的适用范围。MTCA-多靶点复合抗原组对四组靶细胞T2+EBV、T2+HSV、T2+CMV和T2+HPV的特异性裂解率均较高(大于70％)，其它四组中，EBV抗原对照组对靶细胞T2+EBV的特异性裂解率最高，HSV抗原对照组对靶细胞T2+HSV的特异性裂解率最高，CMV抗原对照组对靶细胞T2+CMV的特异性裂解率最高，HPV抗原对照组对靶细胞T2+HPV的特异性裂解率最高，但其最高值也均小于MTCA-多靶点复合抗原组对应的特异性裂解率。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 北京康爱瑞浩细胞技术有限公司
<120> 一种多靶位复合抗原及其应用
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Tyr Leu Leu Glu Met Leu Trp Arg Leu
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Leu Ala His Val Ala Ala Ala Val
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Val Leu Glu Glu Thr Ser Val Met Leu
1 5
<210> 5
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Tyr Leu Leu Glu Met Leu Trp Arg Leu Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu
1 5 10 15
His Leu Gly Leu Ala His Val Ala Ala Ala Val Val Leu Glu Glu Thr
20 25 30
Ser Val Met Leu
35
<210> 6
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tacctcctcg agatgctctg gcggctcacg ctccaagaca ttgtcctcca cctcggtctc 60
gcccacgtcg ccgccgccgt cgtcctcgag gagacgtccg tcatgctc 108
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe Ala Leu
1 5 10
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe Ala Leu
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Val Leu Tyr Ser Phe Ala Leu Met Leu
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Ser Asp Ser Asn Ser Asn Glu Gly
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr
1 5
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu
1 5 10 15
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg
1 5 10
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr
1 5 10
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys
1 5 10 15
Lys Cys Asp
<210> 21
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys
1 5 10
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Ala Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu
1 5 10 15
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5

Claims (7)

1.一种多肽，所述多肽由EBV、HPV、HSV和CMV组成，所述氨基酸序列是SEQ ID NO：5，所述多肽复合抗原诱导的CTL具有同时杀伤负载有EBV、HPV、HSV和CMV中至少一种对照肽的靶细胞的广谱型。
2.编码权利要求1所述多肽的核酸分子，所述核酸为DNA分子，所述 DNA分子为序列表中序列6所示的DNA分子。
3.含权利要求2所述核酸分子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、 重组菌或重组病毒载体。
4.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗的活性成分为如下物质中的任一种：
1)权利要求1所述多肽；
2)权利要求2所述核酸分子；
3)权利要求3所述重组表达载体；
4)权利要求3所述表达盒；
5)权利要求3所述转基因细胞系；
6)权利要求3所述重组菌；
7)权利要求3所述重组病毒载体。
5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为DC疫苗。
6.一种表位诱导的特异性CTL效应细胞，其特征在于，抗原表位包括权利要求1所示的多肽，所述CTL效应细胞能够同时识别如权利要求1所述多肽的EBV、HPV、HSV和CMV。
7.如下物质中的任一种在制备治疗癌症的药物中的应用：
1)权利要求1所述多肽；
2)权利要求2所述核酸分子；
3)权利要求3所述重组表达载体；
4)权利要求3所述表达盒；
5)权利要求3所述转基因细胞系；
6)权利要求3所述重组菌；
7)权利要求3所述重组病毒载体；
8)权利要求4或5所述的疫苗；
9)权利要求6所述的表位诱导的特异性CTL效应细胞。
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