ES2638112T3 - Nuevas construcciones de expresión en plantas - Google Patents

Abstract

Una secuencia de ADN promotora híbrida que comprende la SEC ID Nº 29.

Description

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genes de tolerancia a herbicidas o genes de tolerancia a insectos.

En una realización, los promotores de la presente invención tienen particular utilidad para regular la expresión de un gen de tolerancia a herbicidas cuando se desee expresión de un gen en múltiples tejidos. Por ejemplo, el gen de tolerancia a herbicidas puede conferir tolerancia al herbicida glifosato. Los ejemplos de genes de tolerancia a glifosato adecuados incluyen, pero sin limitación genes de EPSP sintasa resistente a glifosato o productos génicos que degradan glifosato tales como una glifosato oxidorreductasa y fosfonato N-acetil transferasa. Es importante tener una amplia diversidad de elecciones de elementos reguladores 5’ para cualquier estrategia de biotecnología vegetal para tener elementos reguladores adecuados que sean más eficaces para el perfil de expresión deseado.

En otra realización, los promotores de la presente invención tienen utilidad para determinar la función génica. La función de muchos genes es desconocida y los promotores de la presente invención pueden usarse como elementos genéticos en una construcción para permitir una evaluación fenotípica de uno o más genes expresados en una orientación sentido o antisentido. Los promotores de la presente invención pueden ser componentes en una construcción de expresión en plantas desarrollada para un ensayo de alto rendimiento en el que se deseen altos niveles de expresión génica en tejidos constitutivos y reproductores.

Cualquier planta puede seleccionarse con respecto a la identificación de genes y secuencias reguladoras. Ejemplos de dianas vegetales adecuadas para el aislamiento de genes y secuencias reguladoras incluirían pero sin limitación alfalfa, manzana, albaricoque, Arabidopsis, alcachofa, rúcula, espárrago, aguacate, banana, cebada, judías, remolacha, mora, arándano, brócoli, coles de Bruselas, col, colza, cantalupo, zanahoria, mandioca, ricino, coliflor, apio, cereza, achicoria, cilantro, cítricos, clementinas, trébol, coco, café, maíz, algodón, arándano agrio, pepino, abeto de Douglas, berenjena, endivia, escarola, eucalipto, hinojo, higo, ajo, cucurbitáceas, uva, pomelo, melón verde, jícama, kiwi, lechuga, puerro, limón, lima, pino taeda, lino, mango, melón, champiñón, nectarina, nuez, avena, palma aceitera, colza, ocra, oliva, cebolla, naranja, una planta ornamental, palma, papaya, perejil, chirivía, guisante, melocotón, cacahuete, pera, pimiento, caqui, pino, piña, plátano, ciruela, granada, álamo, patata, calabaza gigante, membrillo, pino insigne, achicoria roja, rábano, colza, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, pino del sur, soja, espinaca, calabaza, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, boniato, liquidámbar, tangerina, té, tabaco, tomate, triticale, césped, nabo, vid, sandía, trigo, ñames y calabacín. Son plantas particularmente preferidas para la identificación de secuencias reguladoras Arabidopsis, maíz, trigo, soja y algodón.

Las secuencias promotoras de la presente invención se aislaron de ADN vegetal de Arabidopsis thaliana. En una realización preferida, una construcción incluye las secuencias promotoras de la presente invención unidas operativamente con una secuencia transcribible junto con secuencias terminadoras y reguladoras adecuadas. Una construcción tal puede transformarse en una planta diana adecuada de interés. Cualquier planta puede usarse como un huésped adecuado para construcciones de ácido nucleico que comprenden las secuencias promotoras de la presente invención. Los ejemplos de plantas diana adecuadas de interés incluirían, pero sin limitación, alfalfa, brócoli, col, colza, coliflor, maíz, algodón, arándano agrio, pepino, lechuga, guisante, álamo, pino, patata, cebolla, arroz, frambuesa, soja, caña de azúcar, remolacha azucarera, girasol, tomate y trigo.

Procedimientos de Aislamiento y Modificación de Promotores

Puede usarse cualquier variedad de procedimientos para aislar fragmentos de las secuencias promotoras desveladas en el presente documento. Puede usarse un enfoque basado en PCR para amplificar regiones flanqueantes de una biblioteca genómica de una planta usando información de secuencia disponible públicamente. Se conocen varios procedimientos por los expertos en la materia para amplificar secuencias de ADN desconocidas adyacentes a una región central de secuencia conocida. Los procedimientos incluyen pero sin limitación PCR inversa (PCRI), PCR vectorette, PCR en forma de Y y enfoques de walking de genoma. Para la presente invención las moléculas de ácido nucleico se aislaron de Arabidopsis diseñando cebadores de PCR basados en información de secuencia disponible.

También pueden obtenerse fragmentos de ácido nucleico por otras técnicas tales como sintetizando directamente el fragmento por medios químicos, como se practica habitualmente usando un sintetizador de oligonucleótidos automático. También pueden obtenerse fragmentos por la aplicación de tecnología de reproducción de ácido nucleico, tal como la tecnología de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) por técnicas de ADN recombinante generalmente conocidas por los expertos en la materia de biología molecular. Con respecto a la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo por PCR) usando un par de cebadores de amplificación particular, las “condiciones de PCR rigurosas” se refieren a condiciones que permiten que el par de cebadores hibriden solamente con la secuencia de ácido nucleico diana con la que se uniría un cebador que tenga la secuencia de tipo silvestre correspondiente (o su complemento) y preferentemente para producir un producto de amplificación único.

Los expertos en la materia conocen procedimientos para preparación de ADN genómico de plantas. En un enfoque, pueden prepararse bibliotecas de ADN genómico de una especie seleccionada por digestión parcial con una enzima de restricción y seleccionando por tamaño los fragmentos de ADN dentro de un intervalo de tamaños particular. El ADN genómico puede clonarse en una construcción adecuada que incluye pero sin limitación un bacteriófago, y prepararse usando una construcción adecuada tal como un bacteriófago usando un kit de clonación adecuado de cualquier variedad de distribuidores (véase por ejemplo Stratagene, La Jolla CA o Gibco BRL, Gaithersburg, MD).

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fragmento también puede comprender al menos una longitud mínima capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico nativo en condiciones de hibridación rigurosas como se han definido anteriormente. La longitud de un fragmento mínimo tal es preferentemente de al menos 8 nucleótidos, más preferentemente 15 nucleótidos, incluso más preferentemente al menos 20 nucleótidos, y más preferentemente al menos 30 nucleótidos de una secuencia de ácido nucleico nativa.

Una “sonda” es un ácido nucleico aislado al que se une un marcador detectable convencional o molécula indiciadora, por ejemplo, un isótopo radiactivo, ligando, agente quimioluminiscente o enzima. Los “cebadores” son ácidos nucleicos aislados que hibridan con una cadena de ADN diana complementaria por hibridación de ácido nucleico para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN diana, después se extiende a lo largo de la cadena de ADN diana por una polimerasa, por ejemplo, una ADN polimerasa. Pueden usarse pares de cebadores para amplificación de una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico convencionales.

Las sondas y los cebadores son generalmente de 11 nucleótidos o más de longitud, preferentemente 18 nucleótidos

o más, más preferentemente 25 nucleótidos y más preferentemente 30 nucleótidos o más. Tales sondas y cebadores hibridan específicamente con una secuencia de ADN o ARN diana en condiciones de hibridación de alta rigurosidad e hibridan específicamente con una secuencia nativa diana de otra especie en condiciones de rigurosidad más baja. Preferentemente, las sondas y los cebadores tienen similitud de secuencia completa con la secuencia nativa, aunque pueden diseñarse sondas que difieran de la secuencia nativa y que conserven la capacidad para hibridar con las secuencias nativas diana por procedimientos convencionales. Se describen procedimientos para preparar y usar sondas y cebadores, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., vol. 1-3, ed. Sambrook y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (en lo sucesivo en el presente documento "Sambrook y col., 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel y col., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York, 1992 (con actualizaciones periódicas) (en lo sucesivo en el presente documento, "Ausubel y col., 1992”); e Innis y col., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Pueden derivarse pares de cebadores de PCR de una secuencia conocida, por ejemplo, mediante el uso de programas informáticos pretendidos para ese fin tales como Primer (Versión 0.5,  1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA). Pueden usarse cebadores y sondas basados en las secuencias promotoras nativas desveladas en el presente documento para confirmar y, si es necesario, modificar las secuencias desveladas por procedimientos convencionales, por ejemplo, volviendo a clonar y volviendo a secuenciar.

Construcciones y Construcciones de Expresión

Pueden incorporarse ácidos nucleicos nativos o sintéticos en construcciones de ácidos nucleicos recombinantes, normalmente construcciones de ADN, capaces de introducción y replicación en una célula huésped. En una realización preferida, las secuencias de nucleótidos como se muestra en SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, y SEQ ID NO:30 o sus fragmentos, variantes o derivados se incorporan en un casete de expresión que incluye las regiones promotoras de la presente invención unidas operativamente con un componente genético tal como gen marcador seleccionable, explorable o puntuable.

En otra realización, las secuencias de ácido nucleico desveladas de la presente invención como se muestran en SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30, se unen operativamente con un componente genético, tal como un ácido nucleico, que confiere una característica deseable asociada con morfología, fisiología, crecimiento y desarrollo de plantas, rendimiento, potenciación nutricional, resistencia a enfermedad o plaga, o tolerancia ambiental o química. Estos componentes genéticos tales como genes marcadores o genes agrónomos de interés pueden actuar en la identificación de una célula vegetal o planta transformada o producir un producto de utilidad agronómica.

En otra realización, un componente genético produce un producto que actúa como un dispositivo de selección y actúa en un tejido vegetal regenerable para producir un compuesto que conferiría al tejido vegetal resistencia a un compuesto de otro modo tóxico. Los genes de interés para su uso como un marcador seleccionable, explorable o puntuable incluirían pero sin limitación GUS (secuencia codificante de beta-glucuronidasa), GFP (secuencia codifican de proteína verde fluorescente), LUX (gen codificante de luciferasa), genes marcadores de resistencia a antibióticos o genes de tolerancia a herbicidas. Los ejemplos de transposones y genes de resistencia a antibióticos asociados incluyen los transposones Tns (bla), Tn5 (nptII), Tn7 (dhfr), penicilinas, kanamicina (y neomicina, G418, bleomicina); metotrexato (y trimetoprim); cloranfenicol; kanamicina y tetraciclina.

Se han perfilado características útiles para marcadores seleccionables en plantas en un informe sobre el uso de microrganismos (Comité Consultivo sobre Nuevos Alimentos y Procedimientos, julio de 1994). Estas incluyen selección rigurosa con número mínimo de tejidos no transformados, grandes números de acontecimientos de transformación independientes sin interferencia significativa con la regeneración, aplicación a un gran número de especies y disponibilidad de un ensayo para puntuar los tejidos con respecto a presencia del marcador.

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Se conocen en la técnica varios genes marcadores seleccionables y varios marcadores de resistencia a antibióticos satisfacen estos criterios, incluyendo los resistentes a kanamicina (nptII), higromicina B (aph IV) y gentamicina (aac3 y aacC4). Los genes marcadores seleccionables dominantes útiles incluyen genes que codifican genes de resistencia a antibióticos (por ejemplo, resistencia a higromicina, kanamicina, bleomicina, G418, estreptomicina o espectinomicina); y genes de resistencia a herbicidas (por ejemplo, fosfinotricin acetiltransferasa). Una estrategia útil para selección de transformantes para resistencia a herbicida se describe, por ejemplo, en Vasil, Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vols. I-III, Laboratory Procedures and Their Applications Academic Press, Nueva York, 1984. Serían genes marcadores seleccionables particularmente preferidos para su uso en la presente invención genes que confieran resistencia a compuestos tales como antibióticos como kanamicina, y herbicidas como glifosato (Della-Cioppa y col., Bio/Technology 5(6), 1987, Patente de Estados Unidos 5.463.175, Patente de Estados Unidos 5.633.435). Pueden implementarse también otros dispositivos de selección y aun quedarían dentro del alcance de la presente invención.

Para la práctica de la presente invención, se emplean composiciones y procedimientos convencionales para preparar y usar construcciones de ADN y células hospedadoras, como se analiza, entre otros, en Sambrook y col., 1989. En una realización preferida, la célula huésped es una célula vegetal. Se han descrito varias construcciones de ADN adecuadas para transfección estable de células vegetales o para el establecimiento de plantas transgénicas en, por ejemplo, Pouwels y col., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, sup. 1987; Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; Gelvin y col., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990 y R.R.D. Croy Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers, 1993. Las construcciones de expresión en plantas pueden incluir, por ejemplo, uno o más genes vegetales clonados bajo el control transcripcional de secuencias reguladoras 5’ y 3’. También pueden incluir un marcador seleccionable como se describe para seleccionar células huésped que contienen la construcción de expresión. Tales construcciones de expresión en plantas también contienen una región reguladora del promotor (por ejemplo, una región reguladora que controla expresión inducible o constitutiva, regulada ambientalmente o por desarrollo o específica de célula o tejido), un sitio de inicio de la transcripción, un sitio de unión al ribosoma, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de la transcripción y una señal de poliadenilación. Otras secuencias de origen bacteriano también se incluyen para permitir que la construcción se clone en un huésped bacteriano. La construcción normalmente también contendrá un origen de replicación procariota de serie de huéspedes amplia. En una realización particularmente preferida, la célula huésped es una célula vegetal y la construcción de expresión en plantas comprende una región promotora como se desvela en SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30; una secuencia transcribible unida operativamente; y una secuencia de terminación de la transcripción. Otras secuencias reguladoras previstas como componentes genéticos en una construcción de expresión incluyen pero sin limitación secuencia líder no traducida que puede acoplarse con el promotor. En una realización particularmente preferida, la célula huésped es una célula vegetal y la construcción de expresión en plantas comprende una región promotora como se desvela en SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30, una secuencia transcribible unida operativamente y una secuencia de terminación de la transcripción. Las construcciones de expresión en plantas también pueden comprender secuencias adicionales que incluyen pero sin limitación secuencias de poliligador que contienen sitios de enzimas de restricción que son útiles para fines de clonación.

Elementos Genéticos en Construcciones de Expresión en Plantas

Las construcciones de expresión en plantas pueden incluir más de una secuencia génica expresable, cada una unida operativamente a un promotor diferente. Varios promotores tienen utilidad para expresión de genes en plantas para cualquier gen de interés incluyendo pero sin limitación marcadores seleccionables, marcadores puntuables, genes para tolerancia a plagas, tolerancia a enfermedad, potenciaciones nutricionales y cualquier otro gen de interés agrónomo. Los ejemplos de promotores constitutivos útiles para expresión de genes en plantas incluyen pero sin limitación, promotor P-35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), que confiere expresión de alto nivel constitutiva en la mayoría de los tejidos vegetales (véase, por ejemplo, Odel y col., Nature 313: 810, 1985), incluyendo monocotiledóneas (véase, por ejemplo, Dekeyser y col., Plant Cell 2: 591, 1990; Terada y Shimamoto, Mol. Gen. Genet. 220: 389, 1990); una versión del promotor de CaMV 35S duplicada en tándem, el promotor potenciado de nopalina sintasa 35S (P-e35S) (An y col., Plant Physiol. 88: 547, 1988); el promotor de octopina sintasa (Fromm y col., Plant Cell 1: 977, 1989); y el promotor del virus del mosaico de la escrofularia (P-FMV) como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº: 5.378.619 y una versión potenciada del promotor del FMV (PeFMV) en la que la secuencia promotora de P-FMV está duplicada en tándem; el promotor 19S del virus del mosaico de la coliflor; un promotor del virus baciliforme de la caña de azúcar; un promotor del virus de manchas amarillas de commelina; y otros promotores de virus de ADN de plantas que se sabe que se expresan en células vegetales.

Puede usarse varios promotores de genes vegetales que se regulan en respuesta a señales ambientales, hormonales, químicas y/o de desarrollo para la expresión de un gen unido operativamente en células vegetales, incluyendo promotores regulados por (1) calor (Callis y col., Plant Physiol. 88: 965, 1988), (2) luz (por ejemplo, promotor rbcS-3A de guisante, Kuhlemeier y col., Plant Cell 1: 471, 1989; promotor rbcS del maíz, Schaffner y Sheen, Plant Cell 3: 997, 1991; o promotor de la proteína de unión a clorofila a/b, Simpson y col., EMBO J. 4: 2723, 1985), (3) hormonas, tales como ácido abscísico (Marcotte y col., Plant Cell 1: 969, 1989), (4) heridas (por ejemplo,

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wunI, Siebertz y col., Plant Cell 1: 961, 1989); o (5) compuestos químicos tales como metil jasmonato, ácido salicílico

o protector. También puede ser ventajoso emplear (6) promotores específicos de órganos (por ejemplo, Roshal y col., EMBO J. 6: 1155, 1987; Schernthaner y col., EMBO J. 7: 1249, 1988; Bustos y col., Plant Cell 1: 839, 1989).

Los promotores de la presente invención son promotores de plantas que son capaces de transcribir secuencias de ADN unidas operativamente en tejido del meristemo que crece rápidamente y en tejidos reproductores y pueden unirse operativamente a cualquier gen de interés en una construcción de expresión.

Las construcciones de expresión de plantas pueden incluir señales de procesamiento de ARN, por ejemplo, intrones, que pueden situarse cadena arriba o cadena abajo de una secuencia codificante de polipéptidos en el transgén. Además, las construcciones de expresión pueden incluir secuencias reguladoras adicionales de la región no traducida 3’ de genes de plantas (Thornburg y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 744 (1987); An y col., Plant Cell 1: 115 (1989), por ejemplo, una región terminadora 3’ para aumentar la estabilidad del ARNm, tal como la región terminadora PI-II de patata o las regiones terminadoras 3’ de octopina o nopalina sintasa. Las regiones no traducidas 5’ de un ARNm pueden desempeñar un papel importante en el inicio de la traducción y también pueden ser un componente genético en una construcción de expresión en plantas. Por ejemplo, las secuencias líder 5’ no traducidas derivadas de genes de proteínas de choque térmico han demostrado potenciar la expresión génica en plantas (véase, por ejemplo Patente de Estados Unidos 5.362.865). Estas secuencias reguladoras cadena arriba y cadena abajo adicionales pueden derivar de una fuente que es nativa o heteróloga con respecto a los otros elementos presente en la construcción de expresión.

Las secuencias promotoras de la presente invención se usan para controlar la expresión génica en células vegetales. Las secuencias promotoras desveladas son componentes genéticos que son parte de construcciones usadas en transformación de plantas. Las secuencias promotoras de la presente invención pueden usarse con cualquier plásmido o construcción de transformación de plantas adecuado que contenga un marcador seleccionable

o explorable y elementos reguladores asociados, como se describe, junto con uno o más ácidos nucleicos expresados de una manera suficiente para conferir un rasgo deseable particular. Los ejemplos de genes estructurales adecuados de interés agrónomo previstos por la presente invención incluirían pero sin limitación uno o más genes de tolerancia a insectos, tales como un gen de Bacillus thuringiensis (B.t.), tolerancia a plagas tales como genes para control de enfermedad fúngica, tolerancia a herbicida tal como genes que confieren tolerancia a glifosato, y genes para mejoras de calidad tales como rendimiento, mejoras nutricionales, tolerancias ambientales o a estrés, o cualquier cambio deseable en la fisiología, crecimiento, desarrollo, morfología vegetal o el producto o productos vegetales. Por ejemplo, los genes estructurales incluirían cualquier gen que confiera tolerancia a insectos incluyendo pero sin limitación un gen de proteína de combate de insectos de Bacillus como se describe en el documento WO 9931248, Patente de Estados Unidos Nº: 5.689.052, Patentes de Estados Unidos Nº: 5.500.365 y

5.880.275. En otra realización, el gen estructural puede conferir tolerancia al herbicida glifosato como se confiere por genes que incluyen, pero sin limitación gen de EPSPS resistente a glifosato de Agrobacterium cepa CP4 (aroA:CP4) como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº: 5.633.435, o gen de glifosato oxidorreductasa (GOX) como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº: 5.463.175.

Como alternativa, las secuencias codificantes de ADN pueden efectuar estos fenotipos codificando una molécula de ARN no traducible que provoca la inhibición dirigida de expresión de un gen endógeno, por ejemplo mediante mecanismos mediados por antisentido o cosupresión (véase, por ejemplo, Bird y col., Biotech. Gen. Engin. Rev. 9: 207,1991). El ARN también podría ser una molécula de ARN catalítica (es decir, una ribozima) modificada por ingeniería genética para escindir un producto de ARNm endógeno deseado (véase por ejemplo, Gibson y Shillitoe, Mol. Biotech. 7: 125,1997). Por lo tanto, cualquier gen que produzca una proteína o ARNm que exprese un fenotipo

o cambio de morfología de interés es útil para la práctica de la presente invención.

Además de elementos reguladores o secuencias localizadas cadena arriba (5’) o dentro de una secuencia de ADN, existen secuencias cadena abajo (3’) que afectan a la expresión génica. Por lo tanto, la expresión secuencia reguladora como se usa en el presente documento se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos localizada cadena arriba, dentro, o cadena abajo de una secuencia de ADN que controla, media en o afecta a la expresión de un producto génico junto con el aparato sintético proteico de la célula.

Los expertos en la materia conocen las construcciones adecuadas para la transformación de plantas. Las secuencias promotoras de la presente invención se incorporan preferentemente en una construcción de expresión usando marcadores explorables o puntuables como se ha descrito y se ensayan en análisis transitorios para proporcionar un indicio de la expresión génica en plantas transformadas. Se conocen procedimientos para ensayar la expresión génica en ensayos transitorios por los expertos en la materia. Se ha indicado expresión transitoria de genes marcadores usando varias plantas, tejidos y sistemas de suministro de ADN. Por ejemplo, los tipos de análisis transitorios pueden incluir pero sin limitación dirigir el suministro génico mediante electroporación o bombardeo de partículas de tejidos en cualquier ensayo de planta transitorio usando cualquier especie vegetal de interés. Tales sistemas transitorios incluirían pero sin limitación protoplastos de cultivos en suspensión en trigo (Zhou y col., Plant Cell Reports 12: 612. 1993), electroporación de protoplastos de hoja de trigo (Sethi y col., J. Crop Sci. 52: 152, 1983); electroporación de protoplasto preparado a partir de tejido de maíz (Sheen, J. The Plant Cell 3: 225, 1991) o bombardeo de partículas de tejidos específicos de interés. La presente invención abarca el uso de cualquier sistema de expresión transitorio para evaluar secuencias reguladoras unidas operativamente a genes indicadores

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seleccionados, genes marcadores o genes agrónomos de interés. Los ejemplos de tejidos vegetales que se ha previsto ensayar en transitorios mediante un sistema de suministro apropiado incluirían pero sin limitación tejidos de base de las hojas, callos, cotiledones, raíces, endospermos, embriones, tejido floral, polen y tejido epidérmico.

Puede usarse cualquier marcador puntuable o explorable en un ensayo transitorio. Los genes marcadores preferidos para análisis transitorios de los promotores de secuencias reguladoras 5’ de la presente invención incluyen un gen de -glucuronidasa (GUS) o un gen de proteína verde fluorescente (GFP). Las construcciones de expresión que contienen las secuencias reguladoras 5’ unidas operativamente a un gen marcador se suministran a los tejidos y los tejidos se analizan por el mecanismo apropiado, dependiendo del marcador. Los análisis cuantitativos o cualitativos se usan como una herramienta para evaluar el perfil de expresión potencial de las secuencias reguladoras 5’ cuando se unen operativamente a genes de interés agrónomo en plantas estables. En última instancia, las secuencias reguladoras 5’ de la presente invención se incorporan directamente en construcciones de expresión de transformación de plantas adecuadas que comprenden las secuencias reguladoras 5’ unidas operativamente a una secuencia de ADN transcribible de interés, se transforman en plantas y las plantas transformadas de forma estable y descendencia de las mismas se analizan con respecto al perfil de expresión deseado conferido por las secuencias reguladoras 5’.

Las construcciones de expresión adecuadas para introducir ADN exógeno en células vegetales incluirían pero sin limitación plásmidos Ti desarmados para procedimientos mediados por Agrobacterium. Estas construcciones pueden contener un marcador de resistencia, límites de ADN T 1-2 y orígenes de replicación para E. coli y Agrobacterium junto con uno o más genes de interés y regiones reguladoras asociadas. Los expertos en la materia saben que están disponibles para enfoques mediados por Agrobacterium varias cepas y procedimientos. Tales cepas incluirían pero sin limitación cepas de Agrobacterium C58, LBA4404, EHA101 y EHA105. Son cepas particularmente preferidas las cepas de Agrobacterium tumefaciens.

Ácidos nucleicos a modo de ejemplo que pueden introducirse por los procedimientos abarcados por la presente invención incluyen, por ejemplo, secuencias de ADN o genes de otras especies, o incluso genes o secuencias que se originan con o están presentes en la misma especie, pero se incorporan en células receptoras por procedimientos de ingeniería genética en vez de técnicas de reproducción o cultivo clásicas. Sin embargo, el término “exógeno” también pretende referirse a genes que normalmente no están presentes en la célula que se transforma, o quizá simplemente no están presentes en la forma, estructura, etc., como se haya en el segmento de ADN transformante o gen o genes que normalmente están presentes y que se desea expresar de una manera que difiere del patrón de expresión natural, por ejemplo, sobreexpresar. Por lo tanto, el término gen “exógeno” o ADN pretende referirse a cualquier gen o segmento de ADN que se introduce en una célula receptora, independientemente de si un gen similar ya está presente en una célula tal. El tipo de ADN incluido en el ADN exógeno puede incluir ADN que ya está presente en la célula vegetal, ADN de otra planta, ADN de un organismo diferente o un ADN generado de forma externa, tal como secuencia de ADN que contiene un mensaje antisentido de un gen, o una secuencia de ADN que codifica una versión sintética o modificada de un gen.

Las construcciones de transformación de plantas que contienen las secuencias promotoras de la presente invención pueden introducirse en plantas por cualquier procedimiento de transformación de plantas. Están disponibles varios procedimientos para introducir secuencias de ADN en células vegetales y se conocen bien en la técnica. Los procedimientos adecuados incluyen pero sin limitación infección bacteriana (por ejemplo, con Agrobacterium como se ha descrito anteriormente), construcciones de cromosoma artificial de bacterias binarios, suministro directo de ADN (por ejemplo, mediante transformación mediada por PEG, captación de ADN mediada por desecación/inhibición, electroporación, agitación con fibras de carburo de silicio), y aceleración de partículas revestidas con ADN (revisado en Potrykus, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 42: 205, 1991).

Los procedimientos para transformar específicamente dicotiledóneas usan principalmente Agrobacterium tumefaciens. Por ejemplo, las plantas transgénicas indicadas incluyen pero sin limitación algodón (Patente de Estados Unidos Nº 5.004.863; Patente de Estados Unidos Nº 5.159.135; Patente de Estados Unidos Nº 5.518.908, documento WO 97/43430), soja (Patente de Estados Unidos Nº 5.569.834; Patente de Estados Unidos Nº 5.416.011; McCabe y col., Bio/Technology, 6:923, 1988; Christou y col., Plant Physiol., 87:671, 1988); Brassica (Patente de Estados Unidos Nº 5.463.174), y cacahuete (Cheng y col., Plant Cell Rep., 15: 653, 1996).

Se han presentado procedimientos similares en la transformación de monocotiledóneas. La retransformación y regeneración de plantas usando estos procedimientos se ha descrito para varios cultivos incluyendo pero sin limitación espárragos (Asparagus officinalis; Bytebier y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84: 5345, 1987); cebada (Hordeum vulgarae; Wan y Lemaux, Plant Physiol., 104: 37, 1994); maíz (Zea mays; Rhodes, C.A., y col., Science,

240: 204, 1988; Gordon-Kamm, y col., Plant Cell, 2: 603, 1990; Fromm, y col., Bio/Technology, 8: 833, 1990; Koziel, y col., Bio/Technology, 11: 194, 1993); avena (Avena sativa; Somers, y col., Bio/Technology, 10: 1589, 1992); Dactylis (Dactylis glomerata; Horn, y col., Plant Cell Rep., 7: 469, 1988); arroz (Oryza sativa, incluyendo variedades índica y japónica, Toriyama, y col., Bio/Technology, 6: 10, 1988; Zhang, y col., Plant Cell Rep., 7: 379, 1988; Luo y Wu, Plant Mol. Biol. Rep., 6: 165, 1988; Zhang y Wu, Theor. Appl. Genet., 76: 835, 1988; Christou, y col., Bio/Technology, 9: 957, 1991); sorgo (Sorghum bicolor; Casas, A.M., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 11212, 1993); caña de azúcar (Saccharum spp. ; Bower y Birch, Plant J., 2: 409, 1992); festuca alta (Festuca arundinacea; Wang, Z.Y. y col., Bio/Technology, 10: 691, 1992); césped (Agrostis palustris; Zhong y col., Plant Cell Rep., 13: 1,

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1993); trigo (Triticum aestivum; Vasil y col., Bio/Technology, 10: 667, 1992; Weeks T., y col., Plant Physiol., 102: 1077, 1993; Becker, y col., Plant, J. 5: 299, 1994) y alfalfa (Masoud, S.A., y col., Transgen. Res., 5: 313, 1996). Resulta evidente para los expertos en la materia que pueden usarse varias metodologías de transformación para producción de plantas transgénicas estables de cualquier variedad de cultivos diana de interés.

Procedimientos de análisis de plantas

Las plantas transformadas se analizan con respecto a la presencia de los genes de interés y el nivel de expresión y/o perfil conferido por las secuencias promotoras de la presente invención. Los expertos en la materia conocen numerosos procedimientos disponibles para análisis de plantas transformadas. Se usan varios procedimientos para evaluar la expresión génica y determinar si el gen o los genes introducidos se integran, actúan de forma apropiada y se heredan como se esperaba. Para la presente invención los promotores pueden evaluarse determinando los niveles de expresión de genes con los que se unen operativamente los promotores. Una evaluación preliminar de la función promotora puede determinarse por un procedimiento de ensayo transitorio usando genes indicadores, pero una evaluación promotora más definitiva puede determinarse a partir del análisis de plantas estables. Los procedimientos para análisis de plantas incluyen pero sin limitación transferencias de Southern o transferencias de Northern, enfoques basados en PCR, análisis bioquímicos, procedimientos de exploración fenotípicos, evaluaciones de campo y ensayos inmunodiagnósticos.

Los procedimientos de la presente invención incluyen pero sin limitación tecnologías de PCR, aislamiento de ADN genómico, construcción de una construcción de expresión, ensayos transitorios y se conocen bien por los expertos en la materia procedimientos de transformación de plantas y se llevan a cabo usando técnicas convencionales o modificaciones de las mismas.

Ensayos de pulverización de glifosato

En una realización se lleva a cabo una evaluación de invernadero o de campo con respecto a la tolerancia de glifosato. El término “glifosato” se usa en el presente documento para referirse colectivamente al herbicida parental N-fosfonometilglicina (conocido de otro modo como ácido de glifosato), a una sal o éster del mismo, o a un compuesto que se convierte a N-fosfonometilglicina en tejidos vegetales o que proporciona de otro modo Nfosfonometilglicina en forma iónica (conocido de otro modo como ión glifosato). De forma ilustrativa, se desvelan sales de glifosato solubles en agua útiles en el presente documento en las Patentes de Estados Unidos Nº 3.799.758 y Nº 4.405.531 de Franz. Las sales de glifosato que pueden usarse de acuerdo con la presente invención incluyen pero sin restricción metales alcalinos, por ejemplo sodio y potasio, sales; sal de amonio; sales de C1-16 alquilamonio, por ejemplo dimetilamonio e isopropilamonio; sal de C1-16 alcanolamonio, por ejemplo monoetanolamonio; sales de C1-16 alquilsulfonio, por ejemplo trimetilsulfonio; mezclas de los mismos y similares. La molécula de ácido de glifosato tiene tres sitios ácidos que tienen diferentes valores de pKa; en consecuencia pueden usarse sales mono, di y tribásicas o cualquier mezcla de las mismas, o sales de cualquier nivel intermedio de neutralización.

Las sales de glifosato son significativas comercialmente en parte debido a que son solubles en agua. Muchas sales de amonio, alquilamonio, alcanolamonio, alquilsulfonio y metales alcalinos son altamente solubles en agua, lo que permite su formulación como soluciones acuosas altamente concentradas que pueden diluirse en agua en el punto de uso.

Dichas soluciones acuosas concentradas pueden contener de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 g por litro de glifosato, expresado como equivalente de ácido (g e.a./l). Se prefieren mayores concentraciones de glifosato, por ejemplo de aproximadamente 300 a aproximadamente 500 g e.a/l.

Las sales de glifosato se formulan de manera alternativa como composiciones solubles en agua o dispersables en agua, por ejemplo, en forma de polvos, gránulos, granza o comprimidos. Tales composiciones se conocen frecuentemente como formulaciones en seco, aunque el término “seco” no debe entenderse en este contexto que implique la ausencia completa de agua. Normalmente, las formulaciones en seco contienen menos de aproximadamente el 5 % en peso de agua, por ejemplo de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 2 % en peso de agua. Tales formulaciones están destinadas para la disolución o dispersión en agua en el momento del uso.

Las formulaciones de glifosato en seco contempladas pueden contener de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 80 % en peso de glifosato, expresado como equivalente de ácido (porcentaje de e.a.). Se prefieren mayores concentraciones de glifosato dentro del intervalo anterior, por ejemplo de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 80 % e.a. Las sales de glifosato especialmente útiles para fabricar formulaciones en seco son las sales de sodio y de amonio.

Las composiciones para el tratamiento de plantas y las composiciones de concentrado líquido y seco pueden contener opcionalmente uno o más principios de excipientes deseados. Los principios excipientes especialmente útiles para las composiciones de glifosato son tensioactivos, que ayudan a retener las soluciones de pulverización acuosas en las superficies relativamente hidrófobas de las hojas de las plantas, así como ayudar al glifosato a penetrar en la capa externa cerosa (cutícula) de la hoja y por lo tanto ponerse en contacto con los tejidos vivos dentro de la hoja. Los tensioactivos también pueden realizar otras funciones útiles.

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Entre los tensioactivos anfotéricos, incluyendo como es habitual en la técnica los tensioactivos más debidamente descritos como zwitteriónicos, clases especialmente preferidas incluye óxidos de polioxietilen alquilamina, alquilbetainas, aminoácidos sustituidos con alquilo y similares. Los ejemplos representativos de tales tensioactivos anfotéricos incluyen óxido de dodecildimetilamina, óxido de polioxietilen (2) cocoamina y estearildimetilbetaína.

Las fuentes de referencia convencionales a partir de las cuales un experto en la materia puede seleccionar tensioactivos adecuados, sin limitación con respecto a las clases mencionadas anteriormente, incluyen los documentos Handbook of Industrial Surfactants, Segunda Edición (1997) publicado por Gower, McCutcheon’s Emulsifiers and Detergents, North American and International Editions (1997) publicado por MC Publishing Company, e International Cosmetic Ingredient Dictionary, Sexta Edición (1995) Volúmenes 1 y 2, publicado por the Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association.

Otros componentes opcionales de las composiciones de la presente invención incluyen agentes para modificar características de color, viscosidad, de gelificación, punto de congelación, higroscopía, comportamiento de apelmazamiento, velocidad de disolución, dispersibilidad u otras características de la formulación.

Ejemplos de formulaciones de glifosato comerciales incluyen, sin limitación, las comercializadas por Monsanto Company como herbicidas ROUNDUP®, ROUNDUP® ULTRA, ROUNDUP® CT, ROUNDUP® EXTRA, ROUNDUP® BIACTIVE, ROUNDUP® BIOFORCE, RODEO®, POLARIS®, SPARK® y ACCORD®, todas ellas conteniendo glifosato como su sal de isopropilamonio; las comercializadas por Monsanto Company como herbicidas ROUNDUP® DRY y RIVAL®, que contienen glifosato como su sal de amonio; las comercializadas por Monsanto Company como ROUNDUP® GEOFORCE, que contienen glifosato como su sal de sodio y la que comercializa Zeneca Limited como herbicida TOUCHDOWN®, que contiene glifosato como su sal trimetilsulfonio.

La selección de las tasas de aplicación para una formulación de glifosato que sea biológicamente eficaz se encuentra dentro de la competencia de la técnica agrícola habitual. Un experto en la materia probablemente reconocerá qué condiciones individuales de la planta, condiciones climatológicas y condiciones de producción pueden influir en los resultados conseguidos en la realización práctica del proceso de la presente invención. Durante dos décadas del uso de glifosato y estudios publicados relacionados con dicho uso han proporcionado información abundante a partir de la cual un buen profesional del control de maleza puede seleccionar las tasas de aplicación de glifosato que sean eficaces desde el punto de vista herbicida sobre especies particulares en fases de crecimiento particulares en condiciones de entorno particulares.

Un proceso de la presente invención puede aplicarse a cualquiera y a todas las especies vegetales en las que el glifosato es biológicamente eficaz como un herbicida o como un regulador del crecimiento de las plantas. Esto incluye una variedad muy amplia de especies vegetales en todo el mundo. Del mismo modo, las composiciones de la invención pueden aplicarse a cualquiera y a todas las especies vegetales en las que el glifosato es biológicamente eficaz.

En una realización, a la planta que comprende las construcciones de ADN de la presente invención se le aplica un herbicida que contiene glifosato y las plantas se evalúan para determinar la tolerancia al herbicida de glifosato. Para someter a ensayo las plantas que comprenden las construcciones de ADN de la presente invención puede usarse cualquier formulación de glifosato. Por ejemplo, puede usarse una composición de glifosato tal como Roundup UltraTM. Los parámetros de ensayo para realizar una evaluación de la planta de la tolerancia a glifosato variarán dependiendo de diversos factores. Los factores incluirían, pero sin limitación, el tipo de formulación de glifosato, la concentración y la cantidad de glifosato usada en la formulación, el tipo de planta, la fase de desarrollo de la planta durante el tiempo de la aplicación, las condiciones ambientales, el procedimiento de aplicación y del número de veces en los que se aplica una formulación particular. Por ejemplo, las plantas pueden someterse a ensayo en un entorno de invernadero usando un procedimiento de aplicación mediante pulverizador. El intervalo de ensayo usando Roundup UltraTM puede incluir, pero sin limitación, de 0,56 a 17,93 kg/ha (8 oz/acre a 256 ozs/acre). El intervalo comercialmente eficaz preferido puede ser de 1,12 a 4.48 kg/ha (16 oz/acre a 64 oz/acre) de Roundup UltraTM, dependiendo del cultivo y de la fase del desarrollo de la planta. Un cultivo puede pulverizarse al menos con una aplicación de una formulación de glifosato. Para ensayar en algodón, una aplicación de 2,24 kg/ha (32 oz/acre) en la fase de 3 hojas puede continuarse por aplicaciones adicionales en las últimas fases en el desarrollo. Para el trigo puede usarse una aplicación de 2,24 kg/ha (32 oz/acre) de Roundup UltraTM en la fase de 3-5 hojas y puede continuarse con una aplicación previa o posterior a la cosecha, dependiendo del tipo de trigo que vaya a ensayarse. Los parámetros de ensayo pueden optimizarse para cada cultivo con objeto de encontrar la planta particular que comprenda las construcciones de la presente invención que confiera el nivel de tolerancia a glifosato eficaz deseado desde el punto de vista comercial.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la técnica podrán apreciar que las técnicas desveladas en los siguientes ejemplos representan técnicas descubiertas por los autores de la invención que funcionan bien en la realización práctica de la presente invención.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Las construcciones de plásmidos usadas son construcciones de clonación de pUC o construcciones de transformación de plantas de doble límite que contiene un origen de replicación de E. coli tal como ori322, un origen de replicación de amplio intervalo de hospedador tal como oriV o oriRi, y una región codificante para un marcador de selección tal como Spc/Str que codifica el aminoglucósido adeniltransferasa (aadA) de Tn7 que confiere resistencia a espectinomicina o a estreptomicina, o un marcador de selección de gentamicina (Gm, Gent). Para la transformación en plantas, la cepa bacteriana hospedadora fue Agrobacterium tumefaciens ABI o LBA4404.

Los elementos genéticos se describen de la siguiente manera: P-e35S es el ARN 35S del CaMV que contiene una duplicación de la región -90-300 como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.424.200; P-FMV es el promotor 34S del Virus del Mosaico de la Escrofularia, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.378.619; P-eFMV es un derivado del promotor de FMV que contiene una región potenciadora duplicada del promotor de FMV; P-FMV; CTP2 es la región del péptido de tránsito de la EPSP sintasa de Arabidopsis, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.633.435; aroA:CP4syn (aroA:CP4) es la región codificante de EPSP (secuencia sintética) de CP4, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.633.435 o además modificada para la expresión en plantas basándose en el uso de codones de especies de plantas particulares; E9 3’ es el extremo 3’ de un aislado del gen RbcS del guisante que actúa como una señal de poliadenilación; nos es el extremo 3’ del gen de la nopalina sintasa que actúa como una señal de poliadenilación; Hsp70 es la secuencia líder no traducida de Petunia hybrida como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.362.865; GUS es la secuencia codificante de la beta-glucuronidasa de E. coli (Jefferson, R. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 83: 8447-8451, 1987); el borde derecho (BD) y el borde izquierdo (BI) son del plásmido Ti de las cepas de octopina y nopalina de Agrobacterium tumefaciens. El P-AtAct2 es el promotor del gen de actina 2 de Arabidopsis thaliana; AtAct2i es el intrón en la región 5’ no traducida (UTR, acrónimo de untranslated region) del gen de actina 2 de Arabidopsis thaliana; P-AtAct8 es el promotor del gen de actina 8 de Arabidopsis thaliana; AtAct2i es el intrón en la UTR 5’ del gen de actina 8 de Arabidopsis thaliana; P-AtAct11 es el promotor del gen actina 11 de Arabidopsis thaliana; AtAct11i es el intrón en la UTR 5’ del gen de actina 11 de Arabidopsis thaliana; P-AtAct1a es el promotor del gen de actina1a de Arabidopsis thaliana, L-AtAct1a es la secuencia líder no traducida e I-AtAct1a es el intrón del ADN genómico del gen de actina 1a; P-AtAct1b es el promotor del gen de actina 1b de Arabidopsis thaliana, L-AtAct1b es la secuencia líder no traducida e I-AtAct 1b es el intrón del ADN genómico del gen de actina 1b; P-AtAct3 es el promotor del gen de actina 3 de Arabidopsis thaliana, L-AtAct3 es la secuencia líder no traducida e I-AtAct3 es el intrón del ADN genómico del gen de actina 3; P-AtAct7 es el promotor del gen de actina 7 de Arabidopsis thaliana, L-AtAct7 es la secuencia líder no traducida e I-AtAct7 es el intrón del ADN genómico del gen de actina 7; P-AtAct12 es el promotor del gen de actina 12 de Arabidopsis thaliana, L-AtAct12 es la secuencia líder no traducida e I-AtAct12 es el intrón del ADN genómico del gen de actina 12; P-AtEF1 (P-AtEF1 o EF1) es el promotor del gen del factor de elongación 1 de Arabidopsis thaliana, AtEF1-i (AtEF1-i) es el intrón de la UTR 5’ del gen del factor de elongación 1 de Arabidopsis thaliana.

Las Figuras 1-18 proporcionan ejemplos de construcciones de transformación en plantas que contienen de uno a tres casetes de expresión de plantas. Los expertos en la técnica de la biología molecular vegetal pueden construir combinaciones múltiples de casetes de expresión en plantas que comprendan el promotor y los elementos genéticos de la presente invención y pueden realizar ensayos en plantas de cultivo sin demasiada experimentación. Las construcciones ilustradas en las figuras no deben considerarse como las únicas construcciones que pueden ensamblarse, si no que únicamente sirven como ejemplos para los expertos en la técnica. La Figura 1 (pCGN8086) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene un casete de expresión que comprende un promotor (P-AtAct8) unido operativamente a un gen de interés (CTP2-aroA:CP4syn). La Figura 2 (pMON45325) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene dos casetes de expresión que comprenden al menos un promotor de la presente invención (P-AtAct11) unido operativamente a al menos un gen de interés (CTP2-aroA:CP4syn). La Figura 3 (pMON45331) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene un casete de expresión que comprende un promotor de la presente invención (P-AtEF 1 más intrón) unido operativamente a al menos un gen de interés (CTP2-aroA:CP4syn). La Figura 4 (pMON45332) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene dos casetes de expresión que comprenden al menos un promotor (P-AtEF más intrón) unido operativamente a al menos un gen de interés (CTP2-aroA:CP4syn). La Figura 5 (pMON9190) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene tres casetes de expresión en el que al menos dos promotores (P-AtEF1 más intrón, AtEF1-i; PAtAct2 más intrón, AtAct2i) están unidos operativamente a al menos un gen de interés (CTP2-aroA:CP4syn) y el promotor P-eFMV está unido operativamente a CTP2-aroA:CP4syn. Los casetes de expresión en plantas de la Figura 6 (pMON9153) son idénticos a los ilustrados en la Figura 4 (pMON45332), este mapa de plásmido se ilustra con el fin de identificar los casetes de expresión para los datos mostrados sobre los fenotipos de plantas en las tablas de datos mostradas en la memoria descriptiva. La Figura 7 (pCGN8099) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene dos casetes de expresión que comprenden promotores híbridos, P-FMV-AtEF1 y P-e35S-AtAct8, que conducen la transcripción del gen de interés (aroA:CP4syn). La Figura 8 (pCGN8088) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene dos casetes de expresión que comprenden un promotor, P-AtAct8 más

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incluyeron pMON48407 (P-AtAct11 + intrón/GUS/nos), pMON26170 (P-AtAct2 + intrón/GUS/nos), pMON26171 (P-AtAct8 + intrón/GUS/nos), pMON11750 (e35S/GUS/nos), pMON26177 (P-EF1α + intrón/GUS/nos), y pMON15737 (P-FMV/GUS/nos). Los promotores de actina y del factor de elongación confirieron altos niveles de expresión GUS en tejidos múltiples incluyendo tejidos reproductores.

Tabla 2. Expresión GUS promedio en V1 de Arabidopsis

Construcción Hoja Brote floral inmaduro Flor Gineceo Androceo pMON48407 6944 7394 8359 ND ND pMON26170 45238 74099 54502 73623 217292 pMON26171 29343 35884 37125 76311 207100 pMON11750 60844 14032 16263 35882 115049 pMON26177 47598 72871 96420 191066 507370 pMON15737 28314 57903 84457 44696 87876

Ejemplo: 10

Las plantas de algodón R0 se sometieron a ensayo para determinar la expresión del gen indicador de GUS en tejidos seleccionados de diversas fases de desarrollo. Los brotes florales se clasificaron por tamaño (pequeño, mediano y grande; grande = flor en vela y abierta). El androceo representa los tejidos reproductores masculinos incluyendo todo el receptáculo (estigma, estilo y ovarios). La muestra de corola estaba compuesta de sépalos y pétalos. El tejido se preparó y los ensayos GUS se realizaron como se describe en el EJEMPLO 8. Los resultados se resumen en la Tabla 3. Las construcciones sometidas a ensayo incluyeron pMON48407 (P-EF1α + intrón/gus/nos), pMON26170 (P-AtAct2 + intrón/gus/nos) y pMON48407 (P-AtAct11 + intrón/gus/nos).

Se sometieron a ensayo seis plantas y se obtuvieron valores GUS promedio para pMON26177. Se sometieron a ensayo veinte plantas y se obtuvieron valores GUS promedio para pMON26170. Se sometieron a ensayo ocho plantas y se obtuvieron valores GUS promedio para pMON48407. Los resultados demuestran que los promotores de actina y del factor de elongación pueden usarse para la expresión eficaz de genes unidos operativamente, particularmente en tejidos reproductores.

TABLA 3. Resultados de Ensayo GUS para Plantas de Algodón

Construcción

Promotor/intrón Tejido sometido a ensayo Resultados GUS

pMON26177

EF1α Hoja 11600

pMON26177

EF1α Corola pequeña 396

pMON26177

EF1α Gineceo pequeño 8670

pMON26177

EF1α Androceo pequeño 13771

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EF1α Corola mediana 362

pMON26177

EF1α Gineceo mediano 3318

pMON26177

EF1α Androceo mediano 8006

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EF1α Corola grande 351

pMON26177

EF1α Gineceo grande 500

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EF1α Androceo grande 15512

pMON26170

Act2 Hoja 12718

pMON26170

Act2 Corola pequeña 1296

pMON26170

Act2 Gineceo pequeño 16684

pMON26170

Act2 Androceo pequeño 7570

pMON26170

Act2 Corola mediana 742

pMON26170

Act2 Gineceo mediano 10041

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cosecha de borra de algodón es un componente clave de la producción. Cuando se determina la eficacia de construcciones transgénicas para conferir tolerancia a herbicida en algodón, la cantidad de conservación de bolas es una medición de eficacia y es un rasgo deseable. Las plantas de algodón transgénicas que contienen promotores (Tabla 7) se sometieron a ensayo en condiciones de invernadero para la conservación de bolas. Los promotores dirigen la expresión de la secuencia codificante aroA:CP4 para el fenotipo tolerante a glifosato. Las plantas se transformaron mediante un procedimiento mediado por Agrobacterium o mediante un procedimiento de bombardeo con partículas. Las construcciones de bombardeo de partículas contenían un GUS adicional que contenía un casete de expresión útil para localización histoquímica de la actividad de la β-glucuronidasa a partir de los promotores. Las plantas transgénicas se degeneraron en medio que contenía glifosato y las plantas se enraizaron en un medio de enraizamiento. Las plántulas enraizadas se sembraron en el suelo y se transfirieron a una cámara de producción durante un período de endurecimiento. Las semillas de estas líneas de planta se recogieron y se plantaron. Quince plantas de cada línea se pulverizaron con glifosato a 48 onzas/acre en la fase de 4 hojas. Al menos 8 plantas supervivientes de cada línea se pulverizaron de nuevo en la fase de 8 hojas con glifosato a 4 onzas/acre. Al llegar a la madurez, se contó el número de bolas de la primera posición para las cinco primeras bolas. Estas líneas que tenían 3 o más de las primeras posiciones de bolas conservadas después de la pulverización con glifosato (mapa de planta ≥ 3) se hicieron progresar para estudio posterior. La Tabla 7 ilustra los datos producidos a partir de este estudio. El número de líneas mapeadas indica el número de líneas que sobrevive a la primera aplicación con pulverización de glifosato. El patrón comercial es la línea 1445(pMON 17136) que contiene el promotor P-FMV que dirige la expresión del gen CTP2-aroA:CP4/E9 3’, esta línea conserva menos de 1 de las 5 primeras bolas. Las construcciones, pCGN8099, pCGN9153, pCGN8088, pCGN8068 proporcionan suficiente tolerancia a glifosato reproductora en el algodón de tal manera que el 14-35 % de las líneas sometidas a ensayo de estas construcciones se hicieron progresar para ensayos agronómicos posteriores.

Tabla 7. Estudio de conservación de bolas de algodón en invernadero

Construcción pCGN8099 pCGN9153 pCGN9165 pCGN9152 pCGN8088 pCGN8086 pCGN8068 pCGN8067 pCGN8084 pCGN8085 pCGN9164 pMON45325 pCGN8096 pCGN9154

Promotores eFMV:EF1a + e35S:Act8 EF1α + FMV EF1α + 35S/GUS EF1a Act8 + FMV Act8 Act2 + FMV Act2 Act2 + FMV + 35S/GUS Act2 + FMV/GUS Act11 + 35S/GUS Act11 + FMV FMV:Act11 + e35S:Act2 FMV:Act11 + e35S:Act2 Nº de líneas mapeadas 104 36 3 7 43 7 37 37 5 1 21 43 14 16 Mapeo de planta ≥3 36 12 1 0 6 0 7 0 0 0 1 0 0 1 %≥ 3 34,6 % 33,3 % 33,3 % 0,0 % 14,0 % 0,0 % 18,9 % 0,0 % 0,0 % 0,0 % 4,8 % 0,0 % 0,0 % 6,3 %

Línea 1445

FMV <1,0

Ejemplo 15

La producción de algodón se correlaciona con el número de cuadrados establecidos durante las primeras cuatro a cinco semanas de la cuadratura. La conservación de estos cuadrados a bolas maduras y su contribución para la cosecha de borra de algodón es un componente de producción clave. Cuando se determina la eficacia de construcciones transgénicas para conferir tolerancia herbicida en algodón, la cantidad de conservación de bolas es una medida de eficacia y es un rasgo deseable. Las plantas de algodón transgénicas que contienen promotores de la presente invención se sometieron a ensayo en condiciones de campo en dos localizaciones para la conservación de bolas. Las líneas de algodón transgénicas 502-254-2 (pCGN8068), 701-178-2 (pCGN8068), 53-2 (pCGN8088), 178-1 (pCGN9153) y 60-1 (pCGN9153) se compararon con 1445 (línea de tolerancia a glifosato) y se incluyó PM1218BR (parental Paymaster 1218) que contenía la construcción pMON17136 (P-FMV/CTP2-aroA:CP4/E93’), una línea no transgénica de tipo silvestre, Coker 130. El diseño de campo es un diseño en bloque completo al azar que consiste en 2 hileras x 20-30 pies x 3 repeticiones. El glifosato se aplica como una formulación de Roundup UltraTM a tasas de producto de 1,12 lb ai/A = 48 oz y producto 1,5 lb ai/A = 64 oz en la fase de 8 hojas del desarrollo de la planta de algodón. Todas las parcelas de algodón se trataron de manera agresiva para el control de maleza y control de insectos, así como otras entradas agronómicas tales como tiempo de siembra, fertilización, irrigación, uso

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