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BR0016460B1 - sequência de dna de promotor quimérico, constructos de dna, método de expressar uma sequência de dna estrutural em uma planta e método de controlar ervas daninhas. - Google Patents

sequência de dna de promotor quimérico, constructos de dna, método de expressar uma sequência de dna estrutural em uma planta e método de controlar ervas daninhas. Download PDF

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BR0016460B1
BR0016460B1 BRPI0016460-7A BR0016460A BR0016460B1 BR 0016460 B1 BR0016460 B1 BR 0016460B1 BR 0016460 A BR0016460 A BR 0016460A BR 0016460 B1 BR0016460 B1 BR 0016460B1
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plant
seq
promoter
gene
dna
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BRPI0016460-7A
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Karen L Fincher
Stanislaw Flasinski
Jack Q Wilkinson
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Publication date
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Application filed filed Critical
Priority to BRPI0017613A priority Critical patent/BRPI0017613B1/pt
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Publication of BR0016460B1 publication Critical patent/BR0016460B1/pt

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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SEQÜÊNCIA DE DNA DE PROMOTOR QUIMÉRICO, CONSTRUCTOS DE DNA, MÉ- TODO DE EXPRESSAR UMA SEQÜÊNCIA DE DNA ESTRUTURAL EM UMA PLANTA E MÉTODO DE CONTROLAR ERVAS DANINHAS".
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se ao isolamento e uso de moléculas de ácido nucléico para controle de expressão de gene em plantas, especifi- camente promotores de planta novos.
HISTÓRICO DA INVENÇÃO
Um dos objetivos de engenharia genética de planta é produzir plantas com características ou traços agronomicamente importantes. Avan- ços recentes em engenharia genética têm fornecido as ferramentas neces- sárias para produzirem plantas transgênicas que contém e expressam genes externos (Kahl e outros, World J. of Microbiol. Biotech. 11:449-460, 1995). Traços ou qualidades de interesse particularmente desejáveis para engenha- ria genética de planta incluiriam mas não seriam limitadas a resistência a insetos, doenças de fungos, ou outras pestes e agentes causadores de do- enças, tolerâncias a herbicidas, estabilidade e validade acentuadas, rendi- mento, tolerâncias ambientais, e acentuações nutricionais. Os avanços tec- nológicos em transformação e regeneração de planta têm permitido pesqui- sadores capturarem DNA exógenos, tais como um gene ou genes de uma fonte heteróloga ou uma nativa, e incorporarem o DNA exógeno no genoma da planta. Em uma aproximação, expressão de um agente novo que não é normalmente expresso em uma planta particular ou tecido de planta pode con- ferir um efeito fenótipo desejado. Em outra aproximação, transcrição de um ge- ne ou parte de um gene em uma orientação de anti-sentido pode produzir um efeito desejável prevenindo ou inibindo expressão de um gene endógeno.
A fim de produzir uma planta transgênica, uma construção que inclui uma seqüência de gene heteróloga que confere um fenótipo desejado quando expresso na planta é introduzida em uma célula da planta. A cons- trução também inclui um promotor de planta que é operacionalmente ligado à seqüência de gene heteróloga, freqüentemente um promotor não normal- mente associado com o gene heterólogo. A construção é então introduzida em uma célula da planta para produzir uma célula da planta transformada, e a célula da planta transformada é regenerada em uma planta transgênica. O promotor controla expressão da seqüência de DNA introduzida a qual o promotor é operacionalmente ligado e assim afeta a característica desejada conferida pela seqüência de DNA.
Seria vantajoso ter uma variedade de promotores para talhar expressão de gene tal que um gene ou gene(s) seja transcrito eficiente- mente no tempo certo durante crescimento e desenvolvimento da planta, na localização ótima na planta, e na quantidade necessária para produzir o efeito desejado. Por exemplo, expressão constitutiva de um produto de gene pode ser benéfico em uma localização da planta mas menos benéfica em outra da planta. Em outros casos, pode ser benéfico ter um produto de gene produzido em um certo estágio de desenvolvimento da planta ou em res- posta a certos estímulos ambientais ou químicos. O desenvolvimento co- mercial de germoplasma geneticamente aperfeiçoado tem também avança- do ao estágio de introduzir traços múltiplos em plantas de colheita, freqüen- temente referido como uma aproximação de empilhamento de gene. Nesta aproximação, genes múltiplos conferindo características diferentes de inte- resse podem ser introduzidos em uma planta. É importante quando introduzir genes múltiplos em uma planta que cada gene seja modulado ou controlado para expressão ótima e que os elementos reguladores sejam diversos a fim de reduzir o potencial de silenciar gene. Levando em consideração estas e outras considerações, é aparente que controle ótimo de expressão de gene e diversidade de elemento regulador são importantes em biotecnologia de planta.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a constructos de expressão de planta de DNA que compreendem seqüências de promotores de actina de Arabidopsis (Act), Actla e Actlb e a seqüência de promotor de fator de alongamento 1a (EF1a), e fragmentos e elementos eis derivados destes promotores operacionalmente ligados a seqüências de gene estruturais he- terólogas que funcionam em células de planta de colheita. Assim, de acordo com uma concretização da invenção, um constructo de DNA recombinante é desde que compreenda, em ligação ope- rável, um promotor que é funcional em uma célula de uma planta de colheita, o promotor compreendendo: pelo menos um elemento eis derivado de SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23; uma seqüência de DNA estrutural heteróloga ao promotor; em uma região não traduzida 31 que funciona em plantas para provocar a adição de nucleotídeos poliadenilados à extremida- de 3' da seqüência de RNA. Por exemplo, o promotor pode consistir essen- cialmente em uma região reguladora 5' derivada de qualquer uma dos SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, e SEQ ID NO:26 (incluindo ou excluindo quaisquer seqüências íntron localizadas a esse respeito). O gene estrutural pode compreender qualquer seqüência de nucleotídeo heteróloga onde ex- pressão da seqüência resulta em um traço ou produto agronomicamente útil em uma planta de colheita transgênica.
De acordo com outro aspecto da invenção é um constructo de DNA compreendendo uma seqüência de DNA estrutural operacionalmente ligada às seqüências de promotores da presente invenção que codificam uma proteína empregada para conferir tolerância herbicida a uma planta de colheita. Esta proteína de tolerância herbicida inclui, mas não é limitada a genes de proteína de tolerância de glifosato tal como um gene de EPSP sintase resistente a glifosato sozinho, ou em combinação com um ou mais genes de proteína de degradação de glifosato.
De acordo com outra concretização da invenção, constructos de DNA tais como aqueles descritos acima são fornecidos onde o promotor é um promotor híbrido ou quimérico compreendendo pelo menos um elemento eis derivado de um ou mais de SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID NO:11, SEQ IS NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, e SEQ ID NO:26 operacionalmente ligado a uma seqüência de promotor heteróloga tal como um promotor de calimovírus, por exemplo o promotor de vírus 35S mosaico de Couve-flor ou o promotor de vírus mosai- co de Escrofulária. De acordo com outra concretização da invenção, constructos de DNA, tais como aqueles descrites acima, são fornecidos em série, onde o promotor é um promotor híbrido ou quimérico compreendendo pelo menos um elemento eis derivado de um ou mais de SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, e SEQ ID NO:26 operacionalmente ligado a uma se- qüência de gene heteróloga que expressa em células de planta de colheita transgênica. As seqüências de promotores quiméricos mais especificamente compreendendo as seqüências identificadas em SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, e SEQ ID N0:30.
De acordo com outra concretização da invenção, um constructo de DNA tal como aquele descrito acima é fornecido onde a seqüência de DNA estrutural é uma gene de tolerância de glifosato, tal que quando o constructo de DNA é introduzido em uma célula da planta, ele confere à cé- lula da planta tolerância a uma formulação de glifosato aquosa que inclui pelo menos 50 gramas de equivalente ácido por litro (g a.e./l) de glifosato. Em outras concretizações relacionadas, o constructo de DNA confere à cé- lula de planta tolerância a formulações de glifosato tendo concentrações de gliosato maiores (por exemplo, pelo menos 300 gramas de equivalente de ácido por litro de glifosato. De acordo com uma concretização, o constructo de DNA confere à célula de planta tolerância a pelo menos uma aplicação de Roundup Ultra® em uma taxa de 473 mL por 4000 m2 (16 onças (oz) por acre), por exemplo, em outras concretizações, tolerância a glifosato estende- se a uma, duas ou mais aplicações de 473 mL por 4000 m2 (16 onças (oz) por acre), 496 mL por 4000 m2 (32 onças (oz) por acre), ou 1892 mL por .4000 m2 (64 onças (oz) por acre), por exemplo.
De acordo com outra concretização da invenção, plantas de co- lheitas transgênicas estão desde que sejam transformadas com um cons- tructo de DNA como descrito acima, incluindo espécies monocotiledôneas e espécies dicototiledôneas. Descobriram-se que a actina de Arabidopsis e promotores de EF1a de Arabidopsis são suficientemente ativos em outras espécies de plantas de colheita tais como algodão, tomate e girassol, por exemplo, aquelas quando usadas para controlar expressão de um gene de tolerância de glifosato, tais como aroA:CP4, as plantas toleram taxas de aplicação comerciais de glifosato, exibindo boa tolerância vegetativa e baixo dano a tecidos reprodutivos. Tais promotores podem também ser usados para expressar outros genes de interesse em plantas, incluindo, mas não limitado a, genes que conferem tolerância herbicida, controle de inseto, re- sistência à doença, estabilidade ou validade aumentada, rendimento maior, acentuação nutricional, expressão de um produto farmacêutico ou outro pro- duto de polipeptídeo desejado, ou uma mudança desejável em fisiologia ou morfologia da planta, e assim por diante.
De acordo com outra concretização da invenção, plantas de co- lheita transgênicas estão desde que sejam transformadas com constructos de DNA múltiplos compreendendo actina de Arabidopsis e promotores de EF1a de Arabidopsis sejam suficientemente ativos em outras espécies de plantas tais como algodão, tomate, girassol, por exemplo, as quais quando são usadas para controlar expressão de um gene de tolerância de glifosato tal como aroA:CP4, as plantas toleraram taxas de aplicações comerciais de glifosato, exibindo boa tolerância vegetativa e baixo dano a tecidos reprodu- tivos. Tais promotores podem também ser usados para expressar outros genes de interesse em plantas, incluindo, mas não limitado a, genes que conferem tolerância a herbicida, controle de inseto, resistência a doença, estabilidade ou validade aumentada, rendimento maior, acentuação nutricio- nal, expressão de uma produto farmacêutico ou outro produto de polipeptí- deo desejado, ou uma mudança desejável em fisiologia ou morfologia da planta, e assim por diante.
De acordo com outra concretização da invenção, plantas de co- lheita transgênicas estão desde que sejam transformadas com constructos de DNA múltiplos compreendendo actina de Arabidopsis e promotores de EF1a de Arabidopsis como moléculas de DNA quiméricas em fusão com moléculas de DNA de caulimovírus tendo atividade de promotor em plantas suficientemente ativas em outras espécies de plantas tais como algodão, tomate, canola, soja, e girassol, por exemplo, as quais quando são usadas para controlar expressão de um gene de tolerância de glifosato tal como aroA:CP4, as plantas toleram taxas de aplicações comerciais de glifosato, exibindo boa tolerância vegetativa e baixo dano a tecidos reprodutivos. Tais promotores podem também ser usados para expressar outros genes de inte- resse em plantas, incluindo, mas não limitado a, genes que conferem tole- rância a herbicida, controle de inseto, resistência a doença, estabilidade ou validade aumentada, rendimento maior, acentuação nutricional, expressão de uma produto farmacêutico ou outro produto de polipeptídeo desejado, ou uma mudança desejável em fisiologia ou morfologia da planta, e assim por diante.
De acordo com outra concretização, da invenção os métodos são fornecidos para expressar uma seqüência de DNA estrutural em uma planta. Tais métodos compreendem, fornecendo um constructo de DNA conforme descrito acima, introduzindo o constructo de DNA em uma célula da planta, e regenerando a célula da planta para produzir uma planta tal que o DNA estrutura seja exprimível na planta. De acordo com uma concretiza- ção relacionada, um método de controlar ervas daninhas é fornecido no qual o constructo de DNA compreende um gene de tolerância de glifosato e um aplica-se a uma planta de colheita transformada com o constructo de DNA em uma quantidade de glifosato que é suficiente para controlar ervas dani- nhas sem significantemente prejudicar a planta de colheita. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1 é um mapa de plasmídeo de pCGN8086 Figura 2 é um mapa de plasmídeo de pMON45325 Figura 3 é um mapa de plasmídeo de pMON45331 Figura 4 é um mapa de plasmídeo de pMON45332 Figura 5 é um mapa de plasmídeo de pCGN9190 Figura 6 é um mapa de plasmídeo de pCGN9153 Figura 7 é um mapa de plasmídeo de pCGN8099 Figura 8 é um mapa de plasmídeo de pCGN8088 Figura 9 é um mapa de plasmídeo de pCGN8068 Figura 10 é um mapa de plasmídeo de pCGN8096 Figura 11 é um mapa de plasmídeo de pCGN9151 Figura 12 é um mapa de plasmídeo de pMON1C)156 Figura 13 é um mapa de plasmídeo de pMON52C>59 Figura 14 é um mapa de plasmídeo de pMON54952 Figura 15 é um mapa de plasmídeo de pMON54953 Figura 16 é um mapa de plasmídeo de pMON54954 Figura 17 é um mapa de plasmídeo de pMON54955 Figura 18 é um mapa de plasmídeo de pMON54956 BREVE DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
SEQ ID NO:1 é o iniciador de PCR anterior usado para o isola- mento do promotor Act2
SEQ ID NO:2 é o iniciador de PCR reverso usado para o isola- mento do promotor Act2
SEQ ID NO:3 é o iniciador de PCR anterior usado para o isola- mento do promotor Act8
SEQ ID NO:4 é o iniciador de PCR reverso usado para o isola- mento do promotor Act8
SEQ ID NO:5 é o iniciador de PCR anterior usado para o isola- mento do promotor Actl 1
SEQ ID NO:6 é o iniciador de PCR reverso usado para o isola- mento do promotor Actl 1
SEQ ID NO:7 é o iniciador de PCR anterior usado para o isola- mento do promotor EF1
SEQ ID NO:8 é o iniciador de PCR reverso usado para o isola- mento do promotor EF1
SEQ ID NO:9 é a seqüência do promotor Act2 incluindo a se- qüência íntron do gene Act2. Posições de base 1-764 representam a se- qüência do promotor; posições de base 765-1215 representam o íntron se- guido por 5 bases de região não traduzida 5' (51 UTR) antes do ATG; o sítio de início de transcrição está localizado em posição de base 597.
SEQ ID N0:10 é a seqüência do promotor Act8 incluindo o pri- meiro íntron do gene Act8. Posições de base 1-797 representam a seqüên- cia do promotor; posições de base 798-1259 representam o íntron seguido por 10 bases de 5' UTR antes do ATG; o sítio de início de transcrição está localizado em posição de base 646.
SEQ ID NO:11 é a seqüência do promotor Act11 incluindo o pri- meiro íntron do gene Act11. Posições de base 1-1218 representam a se- qüência do promotor; posições de base 1219-1381 representam o íntron se- guido por 10 bases de 5' UTR antes do ATG; o sítio de início de transcrição está localizado em posição de base 1062.
SEQ ID NO:12 é a seqüência do promotor EF1 incluindo o pri- meiro íntron do gene EF1. Posições de base 1-536 representam a seqüência do promotor; posições de base 537-1137 representam o íntron seguido por .22 bases de 5' UTR antes do ATG; o sítio de início de transcrição está loca- lizado em posição de base 481.
SEQ ID NO: 13 é o iniciador de PCR anterior usado para o iso- lamento do promotor Actl a
SEQ ID NO: 14 é o iniciador de PCR anterior usado para o iso- lamento do promotor Actl b
SEQ ID NO: 15 é o iniciador de PCR reverso usado para o isola- mento dos promotores Actl a e Actl b
SEQ ID NO: 16 é o iniciador de PCR anterior usado para o iso- lamento do promotor Act3
SEQ ID NO: 17 é o iniciador de PCR reverso usado para o isola- mento do promotor Act3
SEQ ID NO:18 é o iniciador de PCR anterior usado para o iso- lamento do promotor Act7
SEQ ID NO: 19 é o iniciador de PCR reverso usado para o isola- mento do promotor Act7
SEQ ID N0:20 é o iniciador de PCR anterior usado para o iso- lamento do promotor Act12
SEQ ID NO:21é o iniciador de PCR reverso usado para o isola- mento do promotor Act12
SEQ ID NO:22 é a seqüência do promotor Actla incluindo o pri- meiro íntron do gene Actla. Posições de base 1-1033 representam a se- qüência do promotor; posições de base 1034-1578 representam o íntron e 5' UTR.
NO de ID de SEQ:23 é a seqüência do promotor Actlb incluindo o primeiro íntron do gene Actlb. Posições de base 1-914 representam a se- qüência do promotor; posições de base 915-1468 representam o íntron e seqüência de 5' UTR.
NO de ID de SEQ:24 é a seqüência do promotor Act3 incluindo o primeiro íntron do gene Act3. Posições de base 1-1023 representam a se- quência do promotor; posições de base 1024-1642 representam o íntron e seqüência de 5' UTR.
NO de ID de SEQ:25 é a seqüência do promotor Act7 incluindo o primeiro íntron do gene Act7. Posições de base 1-600 representam a se- qüência do promotor; posições de base 600-1241 representam o íntron e seqüência de 5' UTR.
NO de ID de SEQ:26 é a seqüência do promotor Act12 incluindo o primeiro íntron do gene Act12. Posições de base 1-1017 representam a seqüência do promotor; posições de base 1018-1313 representam o íntron e seqüência de 5' UTR.
NO de ID de SEQ:27 é a seqüência do promotor FMV-ActH quimérico incluindo o primeiro íntron do gene Act11. Posições de base 1-536 representam a seqüência do promotor FMV duplicada; posições de base .533-1946 representam o promotor de actina 11 de Arabidopsis1 íntron e se- qüência de 5' UTR.
NO de ID de SEQ:28 é a seqüência do promotor FMV-EFIa quimérico incluindo o primeiro íntron do gene EF1a. Posições de base 1-536 apresentam a seqüência do promotor FMV; posições de base 553-1695 re- presentam o promotor EF1a, íntron e seqüência de 5' UTR.
NO de ID de SEQ:29 é a seqüência do promotor CaMV-Act8 in- cluindo o primeiro íntron do gene Act8. Posições de base 1-523 apresentam a seqüência do promotor CaMV; posições de base 534-1800 representam o promotor Act8, íntron e seqüência de 5' UTR. SEQ ID N0:30 é a seqüência do promotor CaMV-Act2 incluindo o primeiro íntron do gene Act2. Posições de base 1-523 representam a se- qüência do promotor CaMV; posições de base 534-1742 representam o promotor Act2, íntron e seqüência de 5' UTR.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Este pedido reivindica o benefício do Nq do Pedido Provisório U.S. 60/171.173, depositado em 16/12/99. As definições e métodos seguin- tes são fornecidos para melhor definir, e para guiar aqueles versados ordiná- ria na técnica na prática da presente invenção. A não ser que de outro modo mencionado, termos são para ser compreendidos de acordo com uso con- vencional por aqueles versados na técnica relevante. A nomenclatura para bases de DNA conforme descritas em 37 CFR § 1.822 é usada. A nomen- clatura de uma e três letras padrão para resíduos de aminoácido é usada.
"Ácido nucléico (seqüência)" ou "polinucleotídeo (seqüência)" refere-se a DNA ou RNA de filamento único ou duplo de origem genômica ou sintética, isto é um polímero de bases de desoxirribonucleotídeo ou ribonu- cleotídeo, respectivamente, lido da extremidade 5' (a montante) à extremi- dade 3' (a jusante). O ácido nucléico pode representar o sentido ou filamento complementar (anti-sentido).
"Nativo" refere-se a uma seqüência de ácido nucléico ocorrendo naturalmente ("tipo selvagem").
Seqüência "heteróloga" refere-se a uma seqüência a qual origina de uma fonte externa ou espécie ou, se da mesma fonte, é modificada de sua forma original.
Uma seqüência de ácido nucléico "isolada" é substancialmente separada ou purificada das outras seqüências de ácido nucléico com a qual o ácido nucléico é normalmente associado na célula do organismo na qual o ácido nucléico normalmente ocorre, isto é, outro DNA cromossômico ou ex- tracromossomal. O termo abrange ácidos nucléicos que são bioquimica- mente purificados a fim de substancialmente remover ácido nucléicos con- taminantes e outros componentes celulares. O termo também abrange áci- dos nucléicos recombinantes e ácidos nucléicos quimicamente sintetizados. O termo "substancialmente purificado", como usado aqui, refere- se a uma molécula separada de outras moléculas normalmente associada com ela em seu estado nativo. Mais preferivelmente, uma molécula substan- cialmente purificada é a espécie predominante presente em uma prepara- ção. Uma molécula substancialmente purificada pode ser maior do que 60% livre, preferivelmente 75% livre, mais preferivelmente 90% livre das outras moléculas (exclusiva de solvente) presente na mistura natural. O termo "substancialmente purificado" não é pretendido a abranger moléculas pre- sentes em seu estado nativo.
Uma primeira seqüência de ácido nucléico exibe "substancial- mente identidade" a uma seqüência de ácido nucléico de referência se, quando optativamente alinhado (com inserções ou anulações de nucleotídeo apropriadas totalizando menos do que 20 porcento da seqüência de referên- cia sobre a janela de comparação) com o outro ácido nucléico (ou seu pa- drão complementar), há pelo menos aproximadamente 75% de identidade de seqüência de nucleotídeo, preferivelmente pelo menos aproximadamente .80% de identidade, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 85% de identidade, e mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 90% de identidade sobre uma janela de comparação de pelo menos 20 posições de nucleotídeo, preferivelmente pelo menos 50 posições de nucleotídeo, mais preferivelmente pelo menos 100 posições de nucleotídeo, e mais preferivel- mente sobre o comprimento inteiro do primeiro ácido nucléico. Alinhamento ótimo de seqüências para alinhar uma janela de comparação pode ser con- duzido pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needle- man e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; pela pesquisa por método similar de Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444, 1988; preferivel- mente por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA) no Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl. O ácido nucléico de referência pode ser uma molécula de comprimento com- pleto ou uma porção de uma molécula maior. Alternativamente, dois ácidos nucléicos são para ter identidade substancial se um hibridiza a outro sob condições severas, como definido acima.
Uma primeira seqüência de ácido nucléico é "operacionalmente ligada" com uma segunda seqüência de ácido nucléico quando as seqüên- cias são assim arranjadas de modo que a primeira seqüência de ácido nu- cléico afete a função da segunda seqüência de ácido nucléico. Preferivel- mente, as duas seqüências são parte de uma molécula de ácido nucléico contígua simples e mais preferivelmente são adjacentes. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado a um gene se o promotor regula ou me- dia transcrição do gene em uma célula.
Um ácido nucléico "recombinante" é feito por uma combinação artificial de dois segmentos separados diferentes, por exemplo, por síntese química ou pela manipulação de segmentos isolados de ácidos nucléicos por técnicas de engenharia genética. Técnicas para manipulação de ácido nu- cléico são bem conhecidas (veja por exemplo Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989; Maliga e outros, Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, 1995; Birren e outros, Genome Analysis: volume 1, Analyzing DNA, (1997), volume .2, Detecting Genes, (1998), volume 3, Cloning Systems, (1999), volume 4, Mapping Genes, (1999), Cold Spring Harbor, New York).
Métodos para síntese química de ácidos nucléicos são discuti- dos, por exemplo, em Beaucage e Carruthers, Tetra. Letts. 22:1859-1862, .1981, e Matteucci e outros, J. Am. Chem. Soe. 103:3185, 1981. Síntese química de ácidos nucléicos pode ser executada, por exemplo, em sintetiza- dores de oligonucleotídeo automatizado comercial.
Uma "seqüência de ácido nucléico sintética" pode ser designada e quimicamente sintetizada por expressão acentuada em particular células hospedeiras e para os propósitos de clonagem em constructos apropriados. Células hospedeiras freqüentemente exibem um modelo preferido de uso de códon (Murray e outros, 1989). DNAs sintéticos designados para acentuar expressão em um hospedeiro particular deveriam portanto refletir o modelo de uso de códon na célula hospedeira. Programas de computadores estão disponíveis para estes propósitos incluindo mas não limitado aos programas "BestFit" ou "Gap" do Pacote de Programa de Análise de Seqüência, Gene- tics Computer Group, Inc., University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wl 53711.
"Ampliação" de ácidos nucléicos ou "reprodução de ácido nucléi- co" refere-se à produção de cópias adicionais de uma seqüência de ácido nucléico e é realizada usando tecnologias de reação de cadeia de polimera- se (PCR). Uma variedade de métodos de ampliação é conhecida na técnica e é descrita, interalia, na Patente U.S. NQs 4.683.195 e 4.683.202 e em PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis e outros, Acade- mic Press, San Diego, 1990. Em PCR, um iniciador refere-se a um oligonu- cleotídeo curto de seqüência definida o qual é anelado a um modelo de DNA para iniciar a reação de cadeia de polimerase.
"Transformado", "transfectado", ou "transgênico" refere-se a uma célula, tecido, órgão, ou organismo no qual tem sido introduzido um ácido nucléico externo, tal como um constructo recombinante. Preferivelmente, o ácido nucléico introduzido é integrado no DNA genômico da célula, tecido, órgão ou organismo recipiente tal que o ácido nucléico introduzido seja her- dado por descendência subseqüente. Uma célula ou organismo "transgêni- co" ou "transformado" também inclui produto da célula ou organismo e pro- duto produzido de um programa de reprodução empregando tal planta "transgênica" como uma origem em um cruzamento e exibindo um fenótipo alterado resultante da presença de um constructo ou constructo recombi- nante.
O termo "gene" refere-se a um DNA cromossômico, DNA de plasmídeo, cDNA, DNA sintético ou outro DNA que codifica um peptídeo, polipeptídeo, proteína, ou molécula de RNA, e regiões flanqueando a se- qüência de codificação envolvida na regulação de expressão. Alguns genes podem ser transcritos em mRNA e traduzidos em polipeptídeos (genes es- truturais); outros genes podem ser transcritos em RNA (por exemplo rRNA, tRNA); e outros tipos de gene funcionam como reguladores de expressão (genes reguladores). "Expressão" de um gene refere-se a transcrição de um gene para produzir o mRNA correspondente e tradução deste mRNA para produ- zir o produto de gene correspondente, isto é, um peptídeo, polipeptídeo, ou proteína. Expressão de gene é controlada ou modulada por elementos re- guladores incluindo elementos reguladores 5' tais como promotores.
"Componente genético" refere-se a qualquer seqüência de ácido nucléico ou elemento genético o qual pode também ser um componente ou parte de um constructo de expressão. Exemplos de componentes genéticos incluem, mas não são limitados a regiões promotoras, líderes não traduzidos de 5', íntrons, genes, regiões não traduzidas de 3', e outras seqüências re- guladoras ou seqüências as quais afetam transcrição ou tradução de uma ou mais seqüências de ácido nucléico.
Os termos "constructo de DNA recombinante", "constructo re- combinante", "constructo de expressão" ou "cassete de expressão" referem- se a qualquer agente tal como um plasmídeo, cosmídeo, vírus, BAC (cro- mossoma artificial bacterial), seqüência autonomamente reprodutora, fago, ou seqüência de nucleotídeo de DNA ou RNA de filamento único ou duplo linear ou circular, derivada de qualquer fonte, capaz de integração genômica ou reprodução autônoma, compreendendo uma molécula de DNA na qual uma ou mais das seqüências de DNA têm sido ligadas em um modo funcio- nalmente operativo usando técnica de DNA recombinante bem conhecida.
"Complementar" refere-se a associação natural de seqüências de ácido nucléico por emparelhamento de base (pares A-G-T com a seqüên- cia complementar T-C-A). Complementaridade entre duas moléculas de fi- lamento simples pode ser parcial, se somente alguns dos pares de ácidos nucléicos são complementares; ou completa, se todos os pares de base são complementares. O grau de complementaridade afeta a eficiência e compri- mento de hibridização e reações de amplificação.
"Homologia" refere-se ao nível de similaridade entre seqüências de ácido nucléico ou de aminoácidos em termos de porcentagem de identi- dade posicionai de nucleotídeo ou aminoácido, respectivamente, isto é, si- milaridade de seqüência ou identidade. Homologia também refere-se ao conceito de propriedades funcionais similares entre ácidos nucléicos ou proteínas diferentes.
"Promotor" refere-se a uma seqüência de ácido nucléico locali- zada a montante ou 5' a um códon de início translacional de uma estrutura de leitura aberta (ou região de codificação de proteína) de um gene e que está envolvido em reconhecimento e aglutinação de polimerase Il de RNA e outras proteínas (fatores de transcrição trans-atuantes) para iniciar transcri- ção. Um "promotor de planta" é um promotor nativo ou não nativo que é fun- cional em células de planta. Promotores constitutivos são funcionais na mai- oria ou todos os tecidos de uma planta durante todo desenvolvimento da planta. Promotores específicos de tecido, órgão ou célula são expressos somente ou predominantemente em um tecido, órgão, ou tipo de célula par- ticular, respectivamente. Em vez de ser expresso "especificamente" em um dado tecido, órgão, ou tipo de célula, um promotor pode exibir expressão "acentuada", isto é, um nível maior de expressão, em uma parte (por exem- plo, tipo de célula, tecido, ou órgão) da planta comparado a outras partes da planta. Promotores temporariamente regulados são funcionais somente ou predominantemente durante certos períodos de desenvolvimento da planta ou em certas horas do dia, como no caso de genes associados com ritmo que ocorre uma vez ao dia, por exemplo. Promotores indutíveis seletiva- mente expressam uma seqüência de DNA operacionalmente ligada em res- posta à presença de um estímulo endógeno ou exógeno, por exemplo por compostos químicos (indutores químicos) ou em resposta a sinais ambien- tais, hormonais, químicos, e/ou de desenvolvimento. Promotores indutíveis ou regulados incluem, por exemplo, promotores regulados por luz, calor, tensão, enchente ou seca, fitohormônios, ferimentos ou produtos químicos tais como etanol, jasmonato, ácido salicílico, ou asseguradores.
Qualquer promotor de planta pode ser usado como uma se- qüência reguladora 5' para modular expressão de um gene particular ou ge- nes. Um promotor preferido seria um promotor de polimerase Il de RNA de planta. Promotores de polimerase Il de RNA de planta, como aqueles de ou- tros eucariotas maiores, têm estruturas complexas e são compreendidos de diversos elementos distintos. Um tal elemento é a caixa TATA ou caixa Gol- dberg-Hogness, a qual é exigida para corrigir expressão de genes eucarióti- cos in vitro e iniciação eficiente de transcrição in vivo precisa. A caixa TATA é tipicamente posicionada em aproximadamente -25 a -35, isto é, 25 a 35 pares de base (pb) a jusante (51) do sítio de iniciação de transcrição, ou sítio de tampa, o qual é definido como posição +1 (Breathnach e Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50:349-383, 1981; Messing e outros, In: Genetic Engineering of Plants, Kosuge e outros, eds., pp. 211-227, 1983). Outro elemento co- mum, a caixa CCAAT, está localizado entre -70 a -100 pb. Em plantas, a caixa CCAAT pode ter uma seqüência de consenso diferente do que a se- qüência funcionalmente análoga de promotores de mamíferos (o análogo da planta foi denominado a "caixa AGGA" para diferenciá-lo de sua contraparte animal; Messing e outros, In: Genetic Engineering of Plants, Kosuge e ou- tros, eds., pp. 211-227, 1983). Além disso, virtualmente todos os promotores incluem seqüências ou realçadores de ativação a jusante adicionais (Benoist e Chambon, Nature 290:304-310, 1981; Gruss e outros, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 78:943-947, 1981; e Khoury e Gruss, Cell 27:313-314, 1983) es- tendendo em torno de -100 pb a -1.000 pb ou mais a jusante do sítio de ini- ciação de transcrição.
Quando fundido a seqüências de DNA heterólogas, tais promo- tores tipicamente produzem a seqüência fundida a ser transcrita em um modo que é similar àquele da seqüência de gene com o qual o promotor é normalmente associado. Promotor de fragmentos que inclui seqüências re- guladoras pode ser adicionado (por exemplo, fundido à extremidade 5' de, ou inserido dentro de, um promotor ativo tendo suas seqüências reguladoras parciais ou completas próprias (Fluhr e outros, Science 232:1106-1112, .1986; Ellis e outros, EMBO J. 6:11-16, 1987; Strittmatter e Chua, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 84:8986-8990, 1987; Poulsen e Chua, Mol. Gen. Genet. .214:16-23, 1988; Comai e outros, Plant Mol. Biol. 15:373-381, 1991). Alter- nativamente, seqüências reguladoras heterólogas podem ser adicionadas à região a jusante 5' de um promotor truncado inativo, por exemplo, um pro- motor incluindo somente o núcleo de TATA e, algumas vezes, os elementos de CCAAT (Fluhr e outros, Science 232:1106-1112, 1986; Strittmatter e Chua, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 84:8986-8990, 1987; Aryan e outros, Mol. Gen. Genet. 225:65-71, 1991).
Promotores são tipicamente compreendidos de "elementos re- guladores transcricional cis-atuantes" distintos múltiplos, ou simplesmente "elementos eis" cada um dos quais confere um aspecto diferente do controle total de expressão de gene (Strittmatter e Chua, Proc. Nat. Acad. Sei. USA .84:8986-8990, 1987; Ellis e outros, EMBO J. 6:11-16, 1987; Benfey e outros, EMBO J. 9:1677-1684, 1990). "Elementos eis" aglutinam a fatores de proteí- na trans-atuantes que regulam transcrição. Alguns dos elementos eis agluti- nam mais do que um fator, e fatores de transcrição trans-atuantes podem interagir com afinidades diferentes com mais do que um elemento eis (Johnson e McKnight, Ann. Rev. Biochem. 58:799-839, 1989). Fatores de transcrição de planta, correspondendo a elementos eis, e análises de suas interações são discutidos, por exemplo, em: Martin, Curr. Opinions Biotech. .7:130-138, 1996; Murai, em: Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology, Dashek, ed., CRC Press, 1997, pp. 397-422; e Methods in Plant Molecular Biology, Maliga e outros, eds., Cold Spring Harbor Press, 1995, pp. 233-300. As seqüências de promotores da presente invenção podem conter "elementos eis" que conferem ou modulam expressão de gene.
Elementos eis podem ser identificados por várias técnicas, in- cluindo análise de anulação, isto é, anulando um ou mais nucleotídeos da extremidade 5' ou interno a um promotor; análise de proteína aglutinante de DNA usando formação de pegada de Dnase I, interferência de metilação, ensaios de mobilidade-mudança de eletroforese, formação de pegada ge- nômica in vivo por PCR mediado por ligação e outros ensaios convencionais; ou por similaridade de seqüência com assuntos de elemento eis conhecidos por métodos de comparação por seqüência convencional. A estrutura fina de um elemento eis pode ser além disso estudos por mutagênese (ou substitui- ção) de um ou mais nucleotídeos de elemento ou por outros métodos con- vencionais (veja por exemplo. Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology, Dashek, ed., CRC Press, 1997, pp. 397-422; e Methods in Plant Molecular Biology1 Maliga e outros, eds., Cold Spring Harbor Press, 1995, pp. 233-300).
Elementos eis podem ser obtidos por síntese química ou por clonagem proveniente de promotores que incluem tais elementos. Elementos eis podem também ser sintetizados com seqüência de flanco adicionais que contenham sítios de enzima de restrição útil para facilitar manipulação sub- seqüente. Em uma concretização, os promotores são compreendidos de "elementos eis" distintos múltiplos. Em uma concretização preferida regiões de seqüência compreendendo "elementos eis" das seqüências de ácido nu- cléico de SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, e SEQ ID NO:26 são identificadas usando programas de computadores incluindo, mas não limitado a MEME ou SIGNALSCAN que são designados especificamente para identificar elementos eis, ou domicílio ou assuntos dentro das seqüên- cias.
A presente invenção inclui fragmentos ou elementos eis de SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, e SEQ ID NO:26 ou homólo- gos de elementos eis conhecidos para efetuar regulação de gene que mos- tram homologia com as seqüências de ácido nucléico da presente invenção. Tais fragmentos de ácido nucléico podem também incluir qualquer região das seqüências descritas. As regiões de promotores ou regiões de promoto- res parciais da presente invenção como mostrado a SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, e SEQ ID NO:26 podem conter pelo menos um elemento regulador incluindo, mas não limitado a "elementos eis" ou domíni- os que são capazes de regular expressão de seqüências de DNA operacio- nalmente ligadas, tais como em tecidos reprodutores de macho.
Promotores de planta podem também incluir promotores produ- zidos através da manipulação de promotores conhecidos a produzirem pro- motores sintéticos, quiméricos, ou híbridos. Tais promotores podem também combinar elementos eis de um ou mais promotores, por exemplo, adicionan- do uma seqüência reguladora heteróloga a um promotor ativo com suas pró- prias seqüências reguladoras parciais ou completas (Ellis e outros, EMBO J. .6:11-16, 1987; Strittmatter e Chua, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 84:8986-8990, .1987;Poulsen e Chua, Mol. Gen. Genet. 214:16-23, 1988; Comai e outros, Plant. Mol. Biol. 15:373-381, 1991). Promotores quiméricos têm também sido desenvolvidos adicionando uma seqüência reguladora heteróloga à região a jusante 5' de um promotor truncado inativo, isto é, um promotor que inclui somente o núcleo TATA e, optativãmente, os elementos de CCAAT (Fluhr e outros, Science 232:1106-1112, 1986; Strittmatter e Chua, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 84:8986-8990, 1987; Aryan e outros, Mol. Gen. Genet. 225:65-71, .1991).
Promotores quiméricos ou híbridos de acordo com a presente invenção podem incluir pelo menos um elemento eis conhecido tal como elementos que são regulados por fatores ambientais numerosos tais como luz, calor, ou tensão; elementos que são regulados ou induzidos por agentes patogênicos ou químicos, e outros mais. Tais elementos podem ou positiva- mente ou negativamente regular expressão de gene, dependendo das con- dições. Exemplos de elementos eis incluem, mas não são limitados a ele- mentos responsivos oxidativos (Cowen e outros, J. Biol. Chem. .268(36):26904, 1993), elementos reguladores de luz (veja por exemplo, Bru- ce e Quail, Plant Cell 2: 1081, 1990, e Bruce e outros, EMBO J. 10:3015, .1991, um elemento eis responsivo a tratamento de metil jasmonato (Beau- doin e Rothstein, Plant Mol. Biol. 33:835, 1997, elementos responsivos a ácido salicílico (Strange e outros, Plant J. 11:1315, 1997, elementos de res- posta a choque de calor (Pelham e outros, Trends Genet. 1:31, 1985, ele- mentos responsivos a ferimentos e tensões abióticas (Loace e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 89:9230, 1992; Mhiri e outros, Plant Mol. Biol. .33:257, 1997), elementos responsivos a frio (Baker e outros, Plant Mol. Biol. .24:701, 1994; Jiang e outros, Plant Mol. Biol. 30:679, 1996; Nordin e outros, Plant Mol. Biol. 21:641, 1993; Zhou e outros, J. Biol. Chem. 267:23515, .1992), e elementos responsivos a seco (Yamaguchi e outros, Plant Cell .6:251-264, 1994; Wang e outros, Plant Mol. Biol. 28:605, 1995; Bray E. A. Trends in Plant Science 2:48, 1997).
Em outra concretização, as seqüências de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, e SEQ ID N0:30 in- clui qualquer comprimento da dita seqüência de nucleotídeo que é capaz de regular uma seqüência de DNA operacionalmente ligada. Por exemplo as seqüências como descritas em SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, e SEQ ID N0:30 podem ser truncadas ou ter porções anuladas e ainda ser capazes de regular transcrição de uma seqüência de DNA opera- cionalmente ligada. Em uma concretização relacionada, um elemento eis das seqüências descritas pode conferir especificidade tal como conferir expres- são acentuada de seqüências de DNA operacionalmente ligadas em certos tecidos. Conseqüentemente, quaisquer fragmentos, porções ou regiões de seqüências das seqüências descritas de SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID ΝΟ.Ί1, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, e SEQ ID N0:30 podem ser usados incluindo mais não limitado a elementos eis ou assuntos das seqüências descritas. Por exemplo, um ou mais pares de base podem ser anulados da extremidade 5' ou 3' de uma seqüência de promotor para produzir um promotor "truncado". Um ou mais pares de base podem também ser inseridos, anulados, ou substituídos inter- namente a uma seqüência de promotor. Promotores podem ser construídos tal que fragmentos ou elementos de promotores sejam operacionalmente ligados, por exemplo, substituindo tal fragmento a jusante de um promotor mínimo. Um promotor mínimo ou basal é um pedaço de DNA o qual é capaz de recrutar e aglutinar a maquinária de transcrição basal. Um exemplo de maquinária de transcrição basal em células eucarióticas é o complexo de polimerase Il de RNA e suas proteínas acessórias. Os componentes enzi- máticos da maquinária de transcrição basal são capazes de iniciar e alongar transcrição de um gene dado, utilizando um promotor mínimo ou basal. Isto é, não existem seqüências cis-atuantes adicionadas na região do promotor que sejam capazes de recrutar e aglutinar fatores de transcrição que modu- lam transcrição, por exemplo, acentuam, reprimem, proporcionam hormônio dependente de transcrição, etc. Substituições, anulações, inserções ou qualquer combinação das mesmas podem ser combinadas para produzir um constructo final.
As seqüências de promotores da presente invenção podem ser modificadas, por exemplo por expressão em outros sistemas de plantas. Em outra aproximação, promotores híbridos novos podem ser designados ou projetados por vários métodos. Muitos promotores contêm seqüências a ju- sante as quais ativam, acentuam ou definem a força e/ou especificidade do promotor (Atchison, Ann. Rev. Cell Biol. 4:127, 1988). Genes T-DNA, por exemplo contêm caixas "TATA" definindo o sítio de iniciação de transcrição e outros elementos a jusante localizados a jusante dos níveis de transcrição modulados de sítio de iniciação de transcrição (Gelvin, em: Transgenic Plants (Kung, S.-D. e Us,R, eds, San Diego: Academic Press, pp. 49-87, .1988). Outro promotor quimérico combinou com um trímero do ativador de octopina sintase (ocs) ao ativador de manopina sintase (mas) mais promotor e descreveu um aumento em expressão de um gene repórter (Min Ni e ou- tros, The Plant Journal 7:661, 1995). As seqüências reguladoras a jusante da presente invenção podem ser usadas para o constructo de tais promoto- res quiméricos ou híbridos. Métodos paro constructo de promotores varian- tes da presente invenção incluem mas não são limitados a combinar ele- mentos de controle de promotores diferentes ou porções ou regiões dupli- cantes de um promotor (veja por exemplo Patente U. S. 5.110.732 e Patente U. S. 5.097.025). Aqueles versados na técnica são familiares com as condi- ções e procedimentos específicos para o constructo, manipulação e isola- mento das macromoléculas (por exemplo, moléculas de DNA, plasmídeos, etc.), geração de organismos recombinantes e o peneiramento e isolamento de genes (veja por exemplo Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989; Mailga e outros, Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, 1995; Birren e outros, Genome Analysis: volume 1, Analyzing DNA, (1997), volume 2, Detecting Genes, (1998), volume 3, Cloning Systems, (1999), volume 4, Mapping Ge- nomes, (1999), Cold Spring Harbor, New York).
O projeto, constructo e uso de promotores quiméricos ou híbri- dos compreendendo um ou mais de elementos eis de SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, e SEQ ID NO:26, para modular ou regular a expressão de seqüências de ácido nucléico operacionalmente ligadas são também abrangidos pela presente invenção.
As seqüências, fragmentos, regiões ou elementos de promotores dos mesmos de SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID NO: .12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, e SEQ ID N0:30 são capazes de transcrever seqüências de DNA operacionalmente ligadas em tecidos múltiplos e portanto podem seletivamente regular expressão de ge- nes em tecidos múltiplos.
Para várias trações agronômicas, transcrição de um gene ou genes de interesse é desejável em tecidos múltiplos para conferir a(s) ca- racterística(s) desejada(s). A disponibilidade de promotores adequados que regulam transcrição de genes operacionalmente ligados em tecidos alvos selecionados de interesse é desejável, já que eles podem não ser desejáveis para expressar um gene em cada tecido, mas somente em certos tecidos. Por exemplo, se um deseja seletivamente expressar um gene alvo para ex- pressão de gene para tolerância herbicida, um pode desejar expressão do gene de tolerância herbicida em tecidos vegetativos e reprodutores. As se- qüências de promotores da presente invenção são úteis para regular ex- pressão de gene em tecidos múltiplos incluindo, mas não limitado a rapida- mente cultivar tecidos meristemáticos, tecidos reprodutivos machos (androe- cium) tais como pólen, anteras, e filamentos, e tecidos reprodutivos da fê- mea (gynoecium) tais como estigma, estilo e ovários, folhas, sépalas e pé- talas. Os promotores da presente invenção portanto têm utilidade para ex- pressão de genes de tolerância herbicida, por exemplo, onde tolerância é desejada em tecidos e estágios múltiplos de desenvolvimento da planta. As seqüências de promotores da presente invenção têm utilidade para regular transcrição de qualquer gene alvo incluindo mas não limitado a genes para controle de fertilidade, rendimento, tolerância a inseto, tolerância fungai, tole- rância a herbicida, ou qualquer traço de interesse desejável. Genes particu- larmente preferidos incluem genes de tolerância herbicida ou genes de tole- rância a inseto.
Em uma concretização, os promotores da presente invenção têm utilidade particular para regular expressão de uma gene de tolerância herbi- cida onde expressão de um gene é desejada em múltiplos tecidos. Por exemplo, o gene de tolerância herbicida pode conferir tolerância ao glifosato de herbicida. Exemplos de genes de tolerância a herbicida adequados inclu- em, mas não são limitados a genes ou produtos de genes de EPSP sintase resistentes a glifosato que degradam glifosato tal como, um glifosato oxidor- redutase e fosfonato N-acetil transferase. É importante ter uma ampla varie- dade de escolhas de elementos reguladores de 5' para qualquer estratégia de biotecnologia de planta a fim de ter elementos reguladores adequados que são mais eficientes para o perfil de expressão desejado.
Em outra concretização, os promotores da presente invenção têm utilidade para determinar função de gene. A função de muitos genes é conhecida e os promotores da presente invenção podem ser usados como elementos genéticos em um constructo para permitir uma avaliação fenotípi- ca de um ou mais genes expressos em uma orientação de sentido ou anti- sentido. Os promotores da presente invenção podem ser componentes em um constructo de expressão de planta desenvolvido para um ensaio de alta conclusão onde níveis altos de expressão de gene em tecidos constitutivos ou reprodutivos é desejado.
Qualquer planta pode ser selecionada para a identificação de genes e seqüências reguladoras. Exemplos de alvos de planta adequados para o isolamento de genes e seqüências reguladoras incluiriam mas não seriam limitados a alfafa, maçã, damasco, Arabidopsis, alcachofra, arugula, aspargo, abacate, banana, cevada, feijões, beterraba, amora-preta, vacínio, brócolis, couve-de-bruxelas, repolho, canola, cantalupo, cenoura, mandioca, ricínio, couve-flor, aipo, cereja, chicória, cilantro, planta cítrica, Clementina, trevo, coco, café, milho, algodão, oxicoco, pepino, conífera norte-americana, berinjela, endiva, escarola, eucalipto, funcho, figos, alho, cabaça, uva, to- ranja, melão, jicama, kiwi, alface, limão-doce, pinheiro teda, linhaça, manga, melão, cogumelo, nectarina, noz, aveia, óleo de dendê, óleo de semente de colza, quiabo, azeitona, cebola, laranja, uma planta ornamental, palma, ma- mão, salsa, pastinaga, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, pimenta, caqui, pinheiro, abacaxi, banana-da-terra, ameixa, romã, álamo, batata, abóbora- moranga, marmelo, pinho radiata, "radiscchio", rabanete, semente de colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, pinho Meridional, soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba sacarina, cana-de-açúcar, girassol, batata-doce, Iiqui- dâmbar, tangerina, chá, tabaco, tomate, "triticale", relva, nabo, uma vinha, melancia, trigo, inhames, e "zucchini".
As seqüências de promotores da presente invenção foram isola- das de DNA da planta de Arabidopsis thaliana. Em uma concretização prefe- rida, um constructo inclui as seqüências de promotores da presente inven- ção operacionalmente ligadas a uma seqüência passível de transcrição junto com finalizador e elementos reguladores adequados. Tal constructo pode ser transformado em uma planta alvo adequada de interesse. Qualquer planta pode ser usada como um hospedeiro adequado paro constructos de ácido nucléico compreendendo as seqüências de promotores da presente inven- ção. Exemplos de plantas alvo adequadas de interesse incluiriam, mas não limitadas a alfafa, brócolis, repolho, canola, couve-flor, milho, algodão, oxi- coco, pepino, alface, ervilhas, álamo, pinho, cebola, batata, arroz, framboe- sa, soja, cana-de-açúcar, beterraba sacarina, girassol, tomate, e trigo. Métodos de Isolamento e Modificação do Promotor
Qualquer número de métodos pode ser usado para isolar frag- mentos das seqüências de promotores descritas aqui contidas. Uma aproxi- mação baseada em PCR pode ser usada para ampliar regiões de flanco de uma biblioteca genômica de uma planta usando informação de seqüência publicamente disponível. Vários métodos são conhecidos àqueles versados na técnica para ampliar seqüências de DNA desconhecidas adjacentes a uma região de núcleo de seqüência conhecida. Métodos incluem mas não são limitados a PCR inverso (IPCR), PCR vetorado, PCR de formato Y e aproximações de conduta de genoma. Para a presente invenção, as molé- culas de ácido nucléico foram isoladas de Arabdopsis designando iniciado- res de PCR baseado em informação de seqüência disponível.
Fragmentos de ácido nucléico podem também ser obtidos por outras técnicas tais como diretamente sintetizando o fragmento por meios químicos, conforme é comumente praticado usando um sintetizador de oli- gonucleotídeo automatizado. Fragmentos podem também ser obtidos por aplicação de tecnologia de reprodução de ácido nucléico, tal como a tecno- logia de PCR (reação de cadeia de polimerase) por técnicas de DNA recom- binantes geralmente conhecidas àqueles versados na técnica de biologia molecular. Com respeito a ampliação de uma seqüência de ácido nucléico alvo (por exemplo, por PCR) usando um par de iniciador de amplificação particular, "condições de PCR severas" referem-se a condições que permi- tem o par de iniciador para hibridizar somente à seqüência de ácido nucléico alvo à qual o iniciador tendo a seqüência do tipo selvagem correspondente (ou seu complemento) aglutinaria e preferivelmente para produzir um pro- duto de amplificação único.
Aqueles verados na técnica estão cientes de métodos para a preparação de DNA genômico da planta. Em uma aproximação, bibliotecas de DNA genômicos podem ser preparadas de uma espécie escolhida por digestão parcial com uma enzima de restrição e selecionando por tamanho os fragmentos de DNA dentro de um limite de tamanho particular. O DNA genômico pode ser clonado em um constructo adequado incluindo mas não limitado a um bacteriófago, e preparado usando um constructo adequado tal como um bacteriófago usando um kit de clonagem adequado de qualquer número de vendedores (veja por exemplo Stratagene, La Jolla CA ou Gibco BRL, Gaithersburg, MD).
Em outra concretização, as seqüências de nucleotídeo dos pro- motores descritas aqui contidos podem ser modificadas. Aqueles versados na técnica podem criar moléculas de DNA que têm variações na seqüência de nucleotídeo. As seqüências de nucleotídeo da presente invenção como mostradas em SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: .12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, e SEQ ID N0:30 po- dem ser modificadas ou alteradas para acentuar suas características de controle. Por exemplo, as seqüências podem ser modificadas por inserção, anulação ou substituição de seqüências modelo em uma aproximação de modificação de DNA baseada em PCR. Moléculas de DNA "variantes" são moléculas de DNA contendo mudanças nas quais um ou mais nucleotídeos de uma seqüência nativa são anulados, adicionados, e/ou substituídos, pre- ferivelmente enquanto mantendo função promotora. No caso de uma frag- mento de promotor, DNA "variante" pode incluir mudanças afetando a trans- crição de um promotor mínimo ao qual ele é operacionalmente ligado. Molé- culas de DNA variantes podem ser produzidas, por exemplo, por técnicas de mutagênese de DNA padrão ou quimicamente sintetizando a molécula de DNA variante ou uma porção da mesma.
Além do seu uso em modular expressão de gene, as seqüências de promotores da presente invenção também têm utilidade como sondas ou iniciadores em experimentos de hibridização de ácido nucléico. As sondas e iniciadores de ácido nucléico da presente invenção podem hibridizar sob condições severas a uma seqüência de DNA alvo. O termo "condições de hibridização severas" é definido como condições sob as quais uma sonda ou iniciador hibridiza especificamente com uma seqüência alvo e não com se- qüências não alvo, conforme pode ser empiricamente determinado. O termo "condições severas" é funcionalmente definido com respeito à hibridização de uma sonda de ácido nucléico a um ácido nucléico alvo (isto é, a uma se- qüência de ácido nucléico particular de interesse) pelo procedimento de hi- bridização específico (veja por exemplo, Sambrook e outros, 1989, em 9,52- .9,55, Sambrook e outros, 1989 em 9,47-9,52; Kanehisa, Nucl. Acids Res. .12:203-213, 1984; e Wetmur e Davidson1 J. Mol. Biol. 31:349-370, 1968). Condições severas apropriadas as quais promovem hibridização de DNA são, por exemplo, 6.0 χ cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) em aproxi- madamente 45°C, seguido por uma lavagem de 2,0 χ SSC a 50°C, são co- nhecidas àqueles versados na técnica ou podem ser encontradas em manu- ais de laboratório incluindo mas não limitado a Current Protocols in Molecu- lar Biology, John Wiley & Sons, N.I., 1989, 6.3.1-6.3.6. Por exemplo, a con- centração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada de uma baixa severidade de aproximadamente 2,0 χ SSC a 50°C a uma alta severidade de aproximadamente 2,0 χ SSC a 50°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada a condições de baixa severidade à temperatu- ra ambiente, aproximadamente 22°C, a condições de alta severidade a aproximadamente 65°C. Ambas temperaturas e sais podem ser variados, ou quer a temperatura ou a concentração de sal pode ser mantida constante enquanto a outra variável é mudada. Por exemplo, hibridização usando son- das ou iniciadores de DNA ou RNA pode ser executada a 65°C em 6x SSC, SDS 0,5%, 5x Denhardt, 100 pg/mL de DNA não específico (por exemplo DNA de esperma de salmão sonicado) com lavagem a 0,5 χ SSC, SDS 0,5% a 65°C, para alta severidade.
Uma molécula de ácido nucléico é dita ser o "complemento" de outra molécula de ácido nucléico se elas exibem complementariedade com- pleta. Como usado aqui, moléculas são ditas a exibirem "complementarieda- de completa" quando cada nucleotídeo de uma das moléculas é comple- mentar a um nucleotídeo do outro. Duas moléculas são ditas ser "minima- mente complementares" se elas podem hibridizar a uma outra com estabili- dade suficiente para permiti-las permanecerem aneladas a outra em pelo menos condições "de baixa severidade" convencionais. Similarmente, as moléculas são ditas ser "complementares" se elas podem hibridizar a uma outra com estabilidade suficiente para permiti-las permanecerem aneladas a uma outra sob condições de "alta severidade" convencional. É contemplado que condições de hibridização de menor severidade tais como temperaturas de hibridização e/ou lavagem menores podem ser usadas para identificar seqüências relacionadas tendo um grau inferior de similaridade de seqüên- cia se especificidade de aglutinação da sonda ou iniciador a seqüência(s) alvo é conservada. Conformemente, as seqüências de nucleotídeos da pre- sente invenção podem ser usadas para sua capacidade para seletivamente formar moléculas dúplex com extensões complementares de fragmentos de DNA. Detecção de segmentos de DNA via hibridização é bem conhecida àqueles versados na técnica, e assim dependendo da aplicação imaginada, um desejará empregar condições de hibridização variantes para alcançar graus de seletividade de sondas voltadas para seqüência alvo e o método de escolha dependerá dos resultados desejados. Condições de severidade convencionais são descritas em Sambrook, e outros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, e por Haymes e outros, Nucleic Acid Hybridization, A Prac- tical Approach, IRL Press, Washington, DC, 1985.
Em uma concretização da presente invenção, as seqüências de ácido nucléico SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID NO: .12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, e SEQ ID NO:26, ou um fragmento, região, elemento eis, ou oligômero destas se- qüências, são usados em ensaios de hibridização de outros tecidos de planta para identificar genes relacionados muito próximos ou homólogos e seqüências reguladoras associadas. Estes incluem mas não são limitados a ensaios de hibridização meridional ou setentrional em qualquer substrato incluindo mas não limitado a um tecido de planta apropriadamente prepara- do, celulose, náilon, ou combinação de filtro, lasca, ou lâmina de vidro. Tais metodologias são bem conhecidas na técnica e estão disponíveis em um kit ou preparação a qual pode ser fornecida por vendedores comerciais.
Um fragmento de ácido nucléico como usado aqui é uma porção do ácido nucléico que é menor do que comprimento completo. Por exemplo, para a presente invenção qualquer comprimento de seqüência de nucleotí- deo que é menor do que as seqüências de nucleotídeo descritas de SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, e SEQ ID NO:26, é considerada ser um fragmento. Um fragmento pode também compreender pelo menos um comprimento mínimo capaz de hibridizar especificamente com um ácido nucléico nativo sob condições de hibridização severas como definido acima. O comprimento de tal fragmento mínimo é preferivelmente pelo menos 8 nu- cleotídeos, mais preferivelmente 15 nucleotídeos, ainda mais preferivel- mente pelo menos 20 nucleotídeos, e mais preferivelmente pelo menos 30 nucleotídeos de uma seqüência de ácido nucléico nativa.
Uma "sonda" é um ácido nucléico isolado ao qual é ligada uma molécula de rótulo ou repórter detectável convencional, por exemplo, um isótopo radioativo, ligando, agente quimioluminescente, ou enzima. "Iniciado- res" são ácidos nucléicos isolados que são anelados a um filamento de DNA alvo complementar por hibridização de ácido nucléico para formar um híbrido entre o iniciador e o filamento de DNA alvo, então estendidos juntos ao fila- mento de DNA alvo por uma polimerase, por exemplo, uma polimerase de DNA. Pares de iniciadores podem ser usados para amplificação de uma se- qüência de ácido nucléico, por exemplo, pela reação de cadeia de polimera- se (PCR) ou outros métodos de amplificação de ácido nucléico convencio- nais.
Sondas e iniciadores são geralmente 11 nucleotídeos ou mais em comprimento, preferivelmente 18 nucleotídeos ou mais, mais preferivel- mente 25 nucleotídeos, e mais preferivelmente 30 nucleotídeos ou mais. Tais sondas e iniciadores hibridizam especificamente a uma seqüência de DNA ou RNA alvo sob condições de hibridização de alta severidade e hibri- dizam especificamente a uma seqüência nativa alvo de outras espécies sob condições de menor severidade. Preferivelmente, sondas e iniciadores de acordo com a presente invenção têm similaridade de seqüência completa com a seqüência nativa, embora sondas diferindo-se da seqüência nativa e que retêm a capacidade para hibridizar a seqüências nativas alvo podem ser designadas por métodos convencionais. Métodos para preparar e usar son- das e iniciadores são descritos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, ed. Sambrook e outros, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (nas partes que se seguem, "Sambrook e outros, 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Au- subel e outros, Greene Publishing e Wiley-lnterscience, New York, 1992 (com atualização periódica) (nas partes que se seguem, "Ausubel e outros, .1992); e Innis e outros, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applicati- ons, Academic Press: San Diego, 1990. Pares de iniciadores de PCR podem ser derivados de uma seqüência conhecida, por exemplo, usando programas de computadores pretendidos para aquele propósito tal como Iniciador (Ver- sion 0,5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA). Iniciadores e sondas baseados nas seqüências de promotores nativos descritas aqui podem ser usados para confirmar e, se necessário, para mo- dificar as seqüências descritas por métodos convencionais, por exemplo, por reclonagem e resseqüenciamento. Constructos e Constructos de Expressão
Ácidos nucléicos nativos ou sintéticos de acordo com a presente invenção podem ser incorporados em constructos de ácido núcléico recom- binantes, tipicamente constructos de DNA, capazes dejntrodução em e re- produção em uma célula hospedeira. Em uma concretização preferida, as seqüências de nucleotídeo da presente invenção como mostrado em SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, e SEQ ID N0:30 ou fragmentos, variantes ou derivados dos mesmos são incorporados em um cassete de expressão o qual inclui as regiões de promotores da presente invenção operacionalmente ligadas a um componente genético tal como um gene marcador selecioná- vel, peneirável, ou contábil.
Em outra concretização, as seqüências de ácido núcléico des- critas da presente invenção como mostrado em SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, e SEQ ID N0:30 são operacionalmente ligadas a um componente genético tal como um ácido núcléico o qual confere uma ca- racterística desejável associada com morfologia, fisiologia, crescimento e desenvolvimento de planta, rendimento, nutricional, acentuação, doença ou resistência a peste, ou tolerância ambiental ou química. Estes componentes genéticos tais como genes marcadores ou genes agronômicos de interesse podem funcionar na identificação de uma célula de planta transformada ou planta, ou uma produção de um produto de utilidade agronômica.
Em outra concretização, um componente genético produz um produto o qual serve como um dispositivo de seleção e funciona em um teci- do de planta regenerável para produzir um composto o qual conferiria no tecido de planta resistência a um composto tóxico diferente. Genes de inte- resse para uso como um marcador selecionável, peneirável, ou contábil in- cluiria mas não limitado a GUS (seqüência de codificação por beta- glucuronidase), GFP (seqüência de codificação para proteína fluorescente verde), LUX (gene de codificação para luciferase), genes marcadores de resistência antibiótica, ou genes de tolerância herbicida. Exemplos de trans- posons e genes de resistência antibiótica associados incluem os transpo- sons Tns (bla), Tn5 (nptll), Tn7 (dhfr), penicilinas, canamicina (e neomicina, G418, bleomicina); metotrexato (e trimetoprima); cloranfenicol; canamicina e tetraciclina.
Características úteis para marcadores selecionáveis em plantas têm sido delineadas em um relatório no uso de microorganismos (Advisory Comittee on Novel Foods and Processes, julho 1994). Estes incluem seleção severa com número mínimo de tecidos não transformados, números grandes de eventos de transformação independentes sem nenhuma interferência si- gnificante com a regeneração, aplicação a um grande número de espécies, e disponibilidade de um ensaio para contar os tecidos para presença do mar- cador.
Vários genes marcadores selecionáveis são conhecidos na téc- nica e marcadores de resistência antibiótica severa satisfazem estes critéri- os, incluindo aqueles resistentes a canamicina (nptll), higromicina B (aph IV) e gentamicina (aac3 e aacC4). Genes marcadores selecionáveis dominante úteis incluem genes codificando genes de resistência antibiótica (por exem- plo, resistência a higromicina, canamicina, bleomicina, G418, estreptomicina ou espectomicina); e genes de resistência a herbicida (por exemplo, fosfino- tricina acetiltransferase). Uma estratégia útil para seleção de transformantes para resistência herbicida é descrita, por exemplo, em Vasil, Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vols. I-III, Laboratory Procedures and Their Applications Academic Press, New York, 1984. Genes marcadores selecio- náveis particularmente preferidos para uso na presente invenção seriam ge- nes os quais conferem resistência a compostos tais como antibióticos tipo canamicina, e herbicidas como glifosato (Della-Cioppa e outros, Bio/Technology 5(6), 1987, Patente U. S. 5.463.175, Patente U. S. .5.633.435). Outros dispositivos de seleção podem também ser implementa- dos e ainda incluiriam-se no objetivo da presente invenção.
Para a prática da presente invenção, composições e métodos convencionais para preparar e usar constructos de DNA e células hospedei- ras são empregados, como discutido, entre outros, em Sambrook e outros, .1989. Em uma concretização preferida, a célula hospedeira é uma célula da planta. Vários constructos de DNA adequados para transfecção estável de células de plantas ou para o estabelecimento de plantas transgênicas foram descritas em, por exemplo, Pouwels e outros, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987); Weissbach e Weissbach, Methods for Plant Mo- lecular Biology, Academic Press, 1989; Gelvin e outros, Plant Molecular Bi- ology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990; e R.R.D. Croy Plant Mole- cular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers, 1993. Constructos de ex- pressão de planta podem incluir, por exemplo, um ou mais genes de planta clonados sob o controle transcricional de seqüências reguladoras 5' e 3'. Eles podem também incluir um marcador selecionável como descrito para selecionar células hospedeiras contendo o constructo de expressão. Tais constructos de expressão de planta também contêm uma região reguladora de promotor (por exemplo, uma região reguladora controlando expressão específica a célula ou tecido, regulada ambiental mente ou desenvolvimen- talmente, indutível ou constitutiva), um sítio de começo de iniciação de transcrição, um sítio de aglutinação de ribossoma, um sinal de processa- mento de RNA, um sítio término de transcrição, e um sinal de poliadenilação. Outras seqüências de origem bacterial são também incluídas para permitir o constructo ser clonado em um hospedeiro bacterial. O constructo também tipicamente conterá uma origem procariótica de amplo limite de hospedeiro de reprodução. Em uma concretização particularmente preferida, a célula hospedeira é uma célula da planta e o constructo de expressão da planta compreende uma região de promotor como descrito em SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, e SEQ ID N0:30; uma seqüência transcritível opera- cionalmente ligada; e uma seqüência de terminação de transcrição. Outras seqüências reguladoras imaginadas como componentes genéticos em um constructo de expressão incluem mas não são limitadas a seqüência líder não traduzida a qual pode ser acoplada com o promotor. Em uma concreti- zação particularmente preferida, a célula hospedeira é uma célula da planta e o constructo de expressão da planta compreende uma região de promotor como descrito em SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, e SEQ ID N0:30; uma seqüência transcritível operacionalmente ligada, e uma seqüên- cia de terminação de transcrição. Constructos de expressão de planta tam- bém podem compreender seqüências adicionais incluindo mas não limitadas a seqüências de poliligantes que contêm sítios de enzima de restrição que são úteis para propósitos de clonagem. Elementos Genéticos em Constructos de Expressão de Planta
Constructos de expressão de planta podem incluir mais do que uma seqüência de gene exprimível, cada uma operavelmente ligada a um promotor diferente. Um número de promotores tem utilidade para expressão de gene de planta para qualquer gene de interesse incluindo mas não limita- do a marcadores selecionáveis, marcadores contábeis, genes para tolerân- cia a peste, tolerância a doença, realçadores nutricionais e qualquer outro gene de interesse agronômico. Exemplos de promotores constitutivos úteis para expressão de gene da planta incluem mas não são limitados a, o pro- motor de vírus mosáico de couve-flor (CaMV) P-35S, o qual confere expres- são de alto nível constitutiva na maioria de tecidos de planta (veja , por exemplo, Odel e outros, Nature 313:810, 1985), incluindo monocotiledôneas (veja, por exemplo, Dekeyser e outros, Plant Cell 2:591, 1990; Terada e Shimamoto, Mol. Gen. Genet. 220:389, 1990); versão em série duplicada do promotor de CaMV 35S, o promotor 35S acentuado (P-e35S) o promotor de nopalina sintase (An e outros, Plant Physiol. 88:547, 1988), o promotor de octipina sintase (Fromm e outros, Plant Cell 1:977, 1989); e o promotor de vírus mosaico de Escrofulária (P-FMV) como descrito na Patente U.S. Ng .5.378.619 e uma versão acentuada do promotor FMV (P-eFMV) onde a se- qüência de promotor de P-FMV é duplicada em série, o promotor de vírus mosaico de couve-flor 19S, um promotor de vírus baciliforme de cana-de- açúcar, um promotor de vírus de mancha amarela de comelina, e outros promotores de vírus de DNA de planta conhecidos a expressar em células da planta.
Uma variedade de promotores de gene de planta que são regu- lados em resposta a sinais ambientais, hormonais, químicos, e/ou desenvol- vimentais podem ser usados para expressão de um gene operacionalmente ligado em células da planta, incluindo promotores regulados (1) por calor (Callis e outros, Plant Physiol. 88:965, 1988), (2) luz (por exemplo, promotor de ervilha rbcS-3A, Kuhlemeier e outros, Plant Cell 1:471, 1989; promotor de milho rbcS, Schaffner e Sheen, Plant Cell 3:997, 1991; ou promotor de pro- teína de aglutinação a/b de clorofila, Simpson e outros, EMBO J. 4:2723, .1985), (3) hormônios, tais como ácido abscísico (Marcotte e outros, Plant Cell 1:969, 1989), (4) ferimento (por exemplo, wunl, Siebertz e outros, Plant Cell 1:961, 1989); ou (5) produtos químicos tais como metil jasmonato, ácido salicílico, ou Asseguradores. Pode também ser vantajoso empregar (6) pro- motores específicos a órgão (por exemplo, Roshal e outros, EMBO J. .6:1155, 1987; Schernthaner e outros, EMBO J. 7:1249, 1988; Bustos e ou- tros, Plant Cell 1:839, 1989).
Os promotores da presente invenção são promotores de plantas que são capazes de transcrever seqüências de DNA operacionalmente liga- das em tecido meristemático rapidamente crescente e tecidos reprodutivos e podem estar operacionalmente ligadas a qualquer gene de interesse em um constructo de expressão.
Constructo de expressão da planta pode incluir sinais de proces- samento de RNA1 por exemplo, íntrons, os quais podem ser posicionados a jusante ou a montante de uma seqüência de codificação de polipeptídeo no transgene. Além disso, os constructos de expressão podem incluir seqüên- cias reguladoras adicionais da região não traduzida 3' de genes de planta (Thornburg e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:744 (1987); An e outros, Plant Cell 1:115 (1989), por exemplo, uma região terminadora 3' para au- mentar estabilidade de mRNA do mRNA, tal como região terminadora Pl-Il de batata ou as regiões terminadoras 3' de octopina ou nopalina sintase. Regiões não traduzidas 5' de um mRNA pode desempenhar um papel im- portante em iniciação de tradução e também pode ser um componente ge- nético em um constructo de expressão de planta. Por exemplo, seqüências líderes 5' não traduzidas de genes de proteína de choque de calor têm sido demonstradas a acentuar expressão de gene em plantas (veja, por exemplo Patente U. S. 5.362.865). Estas seqüências reguladoras a jusante e a mon- tante adicionais podem ser derivadas de uma fonte que é nativa ou heterólo- ga com respeito aos outros elementos presentes no constructo de expres- são.
As seqüências de promotores da presente invenção são usadas para controlar expressão de gene em células de planta. As seqüências de promotores descritas são componentes genéticos que são parte de cons- tructos usados em transformação de planta. As seqüências de promotores da presente invenção podem ser usadas com qualquer plasmídeo ou cons- tructo de transformação de planta adequado contendo um marcador selecio- nável ou peneirável e elementos reguladores associados, como descrito, junto com um ou mais ácidos nucléicos expressos em um modo suficiente para conferir um traço desejável particular. Exemplos de genes estruturais adequados de interesse agronômico imaginado pela presente invenção in- cluiria mas não são limitados a um ou mais genes para tolerância de inseto, tal como um gene BaciHus thuringiensis (B.t.), tolerância a peste tal como genes para controle de doença fungai, tolerância a herbicida tal como genes conferindo tolerância a glifosato, e genes para melhorias de qualidade tais como rendimento, realçadores nutricionais, tolerâncias a ambiente ou ten- são, ou quaisquer mudanças desejáveis em fisiologia da planta, crescimen- to, desenvolvimento, morfologia ou produto(s) da planta. Por exemplo, genes estruturais incluiria qualquer gene que confere tolerância a inseto incluindo mais não limitado a um gene de proteína de controle de inseto de Bacillus como descrito em WO 9931248, incorporado aqui por referência em sua in- tegridade, Patente U.S. N5 5.689.052, incorporada aqui por referência em sua integridade, Patente U.S. NQs 5.500.365 e 5.880.275, incorporadas aqui por referência em sua integridade. Em outra concretização, o gene estrutural pode conferir tolerância a glifosato de herbicida como conferido por genes incluindo, mas não limitado a gene EPSPS resistente a glifosato de cepa CP4 de Agrobacterium (aroA:CP4) como descrito na Patente U.S. Nq .5.633.435, incorporada aqui por referência em sua integridade, ou gene de glifosato oxidorredutase (GOX) como descrito na Patente U.S. Nq 5.463.175, incorporada aqui por referência em sua integridade.
Alternativamente, as seqüências de codificação de DNA podem afetar estes fenótipos codificando uma molécula de RNA não traduzível que causa a inibição marcada de expressão de um gene endógeno, por exemplo via mecanismos mediados por anti-sentido ou co-supressão (veja, por exemplo, Bird e outros, Biotech. Gen. Engin. Rev. 9:207,1991). O RNA pode- ria também ser uma molécula de RNA catalítica (isto é, ribozima) projetada para dividir um produto de mRNA endógeno desejado (veja por exemplo, Gibson e Shillitoe, Mol. Biotech. 7:125, 1997). Assim, qualquer gene que produz uma proteína ou mRNA o qual expressa uma mudança fenotípica ou morfológica de interesse é útil para a prática da invenção presente.
Além disso para elementos ou seqüências reguladoras localiza- das a jusante (5') ou dentro de uma seqüência de DNA, existem seqüências a montante (31) que afetam expressão de gene. Assim, o termo seqüência reguladora como usado aqui contido refere-se a qualquer seqüência de nu- cleotídeo localizada a jusante, dentro de, ou a montante a uma seqüência de DNA a qual controla, media, ou afeta expressão de um produto de gene em conjunção com o aparelho sintético de proteína da célula.
Aqueles versados na técnica estão cientes dos constructos ade- quados para transformação da planta. As seqüências de promotores da pre- sente invenção são preferível mente incorporadas em um constructo de ex- pressão usando marcadores peneiráveis ou contábeis como descrito e tes- tado em análise transiente para fornecer uma indicação de expressão de gene em plantas transformadas. Métodos de testar expressão de gene em ensaios transientes são conhecidos àqueles versados na técnica. Expressão transiente de genes marcadores têm sido descrita usando uma variedade de plantas, tecidos e sistemas de distribuição de DNA. Por exemplo, tipo de análises transientes podem incluir mas não são limitados a distribuição de gene direta via eletroporação ou bombardeamento de partícula em qualquer ensaio de planta transiente usando quaisquer espécies de planta de interes- se. Tais sistemas transientes incluiriam mas não são limitados a protoplastos de culturas de suspensão em trigo (Zhou e outros, Plant Cell Reports .12:612. 1993), eletroporação de protoplastos de folha de trigo (Sethi e ou- tros, J. Crop Sei. 52: 152, 1983); eletroporação de protoplasto preparada de tecido de milho (Sheen, J. The Plant Cell 3: 225, 1991), ou bombardeamento de partícula de tecidos específicos de interesse. A presente invenção abran- ge o uso de qualquer sistema de expressão transiente para avaliar seqüên- cias reguladoras operativamente ligadas a genes repórteres selecionados, genes marcadores ou genes agronômicos de interesse. Exemplos de tecidos de planta imaginados para testar em transientes via um sistema de distribui- ção apropriado incluiria mas não são limitados a tecidos de base de folha, caules, cotiledôneas, raízes, endosperma, embriões, tecido floral, pólen e tecido epidérmico.
Qualquer marcador contábil ou peneirável pode ser usado em um ensaio transiente. Genes marcadores preferidos para análise transiente dos promotores ou seqüências reguladoras 5' da presente invenção incluem um gene β-glucuronidase (GUS) ou um gene de proteína fluorescente verde (GFP). Os constructos da expressão contendo as seqüências reguladoras 5' operacionalmente ligadas a um gene marcado são distribuídos aos tecidos e os tecidos são analisados pelo mecanismo apropriado, dependendo do mar- cador. As análises quantitativas ou qualitativas são usadas como uma ferra- menta para avaliar o perfil de expressão potencial das seqüências regulado- ras 5' quando operacionalmente ligadas a genes de interesse agronômico em plantas estáveis. Recentemente, as seqüências reguladoras 5' da pre- sente invenção são diretamente incorporadas em constructos de expressão de transformação de planta adequados compreendendo as seqüências re- guladoras 5' operacionalmente ligadas a um interesse de seqüência de DNA passível de transcrição, transformadas em plantas e plantas estavelmente transformadas e progênie dos mesmos analisados para o perfil de expressão desejado conferido pelas seqüências reguladoras 5'.
Constructos de expressão adequados para introduzir DNA exó- geno em células de plantas incluiriam mas não são limitados a Ti- plasmídeos desarmados para métodos mediados por Agrobacterium. Estes constructos podem conter um marcador de resistência, 1-2 bordas de T- DNA, e origens de replicação para E. coli e Agrobacterium junto com um ou mais genes de interesse e regiões reguladoras associadas. Aqueles versado na técnica estão cientes que para aproximações mediadas por Agrobacte- rium várias cepas e métodos estão disponíveis. Tais cepas incluiriam mas não são limitadas a cepas de Agrobacterium C58, LBA4404, EHA101 e EHA105. Cepas particularmente preferidas são cepas de Agrobaeterium tu- mefaeiens.
Ácidos nucléicos exemplares os quais podem ser introduzidos pelos métodos abrangidos pela presente invenção incluem, por exemplo, seqüências ou genes de DNA de outras espécies, ou ainda genes ou se- qüências as quais originam-se com ou estão presente nas mesmas espéci- es, mas são incorporados em células recipientes por métodos de engenharia genética ao invés de reprodução clássica ou técnicas de procriação. Entre- tanto, o termo "exógeno" é também pretendido referir a genes que não estão normalmente presentes na célula sendo transformada, ou talvez simples- mente não presente na forma, estrutura, etc., conforme encontrado no seg- mento ou gene de DNA transformante, ou genes os quais estão normal- mente presentes e que um deseja expressar em um modo que difere do mo- delo de expressão natural, por exemplo, para superexpressar. Assim, o ter- mo de gene "exógeno" ou DNA é introduzido para referir a qualquer gene ou segmento de DNA que é pretendido em uma célula de recipiente, indepen- dente de se um gene similar pode já estar presente em tal célula. O tipo de DNA incluído no DNA exógeno pode incluir DNA o qual já está presente na célula da planta, DNA de outra planta, DNA de um organismo diferente, ou um DNA gerado externamente, tal como uma seqüência de DNA contendo uma mensagem de anti-sentido de um gene, ou uma seqüência de DNA co- dificando uma versão sintética ou modificada de um gene.
Os constructos de transformação da planta contendo as seqüên- cias de promotores da presente invenção podem ser introduzidos em plantas por qualquer método de transformação de planta. Diversos métodos estão disponíveis para introduzir seqüências de DNA em células de planta e são bem conhecidos na técnica. Métodos adequados incluem mas são limitados a infecção bacterial (por exemplo, com Agrobacterium como descrito acima), constructos de cromossomo artificial bacterial binário, distribuição direta de DNA (por exemplo via transformação mediada por PEG, apreensão de DNA mediada por dessecação/inibição, eletroporação, agitação com fibras car- beto de silício), e aceleração de partículas revestidas de DNA (revisto em Potrykus, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 42: 205, 1991).
Métodos para especificamente transformar dicotiledôneas pri- meiramente usam Agrobacterium tumefaciens. Por exemplo, plantas trans- gênicas descritas incluíram mas não são limitadas a algodão (Patente U.S. N9 5.004.863; Patente U.S. N9 5.159.135; Patente U.S. N9 5.518.908; WO .97/43430), soja (Patente U.S. N9 5.569.834; Patente U.S. N9 5.416.011; McCabe e outros, Bio/Technology, 6:923, 1988; Christou e outros, Plant Physiol., 87:671, 1988); Brassica (Patente U.S. N9 5.463.174), e amendoim (Cheng e outros, Plant Cell Rep., 15: 653, 1996).
Métodos similares têm sido descritos na transformação de mo- nocotiledôneas. Transformação e regeneração da planta usando estes mé- todos têm sido descritas para várias colheitas incluindo mas não limitadas a aspargo (Asparagus officinalis; Bytebier e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 84: 5345, 1987); cevada (Hordeum vulgarae; Wan e Lemaux, Plant Physiol., 104: 37, 1994); milho (Zea mays; Rhodes, C.A., e outros, Science, .240: 204, 1988; Gordon-Kamm, e outros, Plant Cell, 2: 603, 1990; Fromm, e outros, Bio/Technology, 8: 833, 1990; Koziel, e outros, Bio/Technology, 11: .194, 1993); aveia (Avena saf/Va; Somers, e outros, Bio/Technology, 10: .1589, 1992); grama de pomar (Dactylis glomerata; Horn, e outros, Plant Cell Rep., 7: 469,1988); arroz (Oryza sativa, incluindo variedades de indica e ca- mélia, Toriyama, e outros, Bio/Technology, 6: 10, 1988; Zhang, e outros, Plant Cell Rep., 7: 379, 1988; Luo e Wu, Plant Mol. Biol. Rep., 6: 165, 1988; Zhang e Wu, Theor. Appl. Genet., 76: 835, 1988; Christou, e outros, Bio/Technology, 9: 957, 1991); sorgo (Sorghum bicolor, Casas, A.M., e ou- tros, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 90: 11212, 1993); cana-de-açúcar (Sac- charum spp.; Bower e Birch, Plant J., 2: 409, 1992); festuca comprida (Fes- tuca arundinacea; Wang, Ζ. Y. e outros, Bio/Technology, 10: 691, 1992); grama de relva (Agrostis palustris; Zhong e outros, Plant Cell Rep., 13: 1, .1993); trigo (Triticum aestivum; Vasil e outros, Bio/Technology, 10: 667, .1992; Weeks T., e outros, Plant Physiol., 102: 1077, 1993; Becker, e outros, Plant, J. 5: 299, 1994), e alfafa (Masoud, S.A., e outros, Transgen. Res., 5: .313, 1996). É aparente àqueles versados na técnica que várias metodologi- as de transformação podem ser usadas e modificadas para produção de plantas transgênicas estáveis de várias colheitas alvo de interesse. Métodos de Análise de Planta
As plantas transformadas são analisadas para a presença de genes de interesse e o nível de expressão e/ou perfil conferido pelas se- qüências de promotores da presente invenção. Aqueles versados na técni- cas estão cientes dos métodos numerosos disponíveis para a análise de plantas transformadas. Uma variedade de métodos são usados para taxar expressão de gene e determinar se o(s) gene(s) introduzido(s) é(são) inte- grado^), propriamente funcionando, e herdado(s) como esperado. Para a presente invenção os promotores podem ser avaliados determinando os ní- veis de expressão de genes aos quais os promotores são operativamente ligados. Uma taxação preliminar de função de promotor pode ser determina- da por um método de ensaio transiente usando genes repórteres, mas uma taxação de promotor mais definitiva pode ser determinada da análise de plantas estáveis. Métodos para análise de planta incluem mas não são limi- tados a Southern blots ou Northern blots, aproximações baseadas em PCR, análises bioquímicas, métodos de peneiramento fenotípico, avaliações de campo, e ensaios de imunodiagnósticos.
Os métodos da presente invenção incluindo mas não limitados a tecnologias de PCR, isolamento de DNA genômico, construção de cons- tructo de expressão, ensaios transientes, e métodos de transformação de planta são bem conhecidos àqueles versados na técnica e são realizados usando técnicas ou modificações padrão das mesmas. Testes de Pulverização de Glifosato
Em uma concretização uma avaliação de estufa ou campo para tolerância a glifosato é conduzida. O termo "glifosato" é usado aqui para re- ferir-se coletivamente ao N-fosfonometilglicina de herbicida de origem (dife- rentemente conhecido como ácido glifosato), a um sal ou éster dos mesmos, ou a um composto o qual é convertido a N-fosfonometilglicina em tecidos de plantas ou o qual de outro modo fornece N-fosfonometilglicina em forma iônica (de outro modo conhecida como íon glifosato). Ilustrativamente, sais de glifosato solúveis em água úteis aqui contidos são descritos em Patentes U.S. N9S 3.799.758 e 4.405.531 a Franz, a descrição da qual é incorporada aqui contida por referência. Sais de glifosato que podem ser usados de acordo com a presente invenção incluem mas não os restritos a metais alca- linos, por exemplo sais de sódio e potássio; sal de amônio; alquilamônio Ci- .16, por exemplo sais de dimetilamônio e isopropilamônio; alcanolamônio Ci- .16, por exemplo, sal de monoetanolamônio; alquilsulfônio Cm6, por exemplo sais de trimetilsulfônio; misturas dos mesmos e outros mais. A molécula de ácido glifosato tem três sítios ácidos tendo valores de pKa diferentes; de acordo com sais mono-, di- e tribásicos, ou qualquer mistura dos mesmos, ou sais de qualquer nível intermediário de neutralização, podem ser usados. Sais de glifosato são comercialmente significantes em parte por- que eles são solúveis em água. Muitos sais de amônio, alquilamônio, alca- nolamônio, alquilsulfônio e metais alcalinos são altamente solúveis em água, permitindo formulação como soluções aquosas altamente concentradas as quais podem ser diluídas em água no ponto de uso.
Tais soluções aquosas concentradas podem conter aproxima- damente 50 a cerca 500 gramas por litro de glifosato, expresso como equi- valente ácido (g a.e./l). Concentrações de glifosato maiores, por exemplo aproximadamente 300 a cerca de 500 g a.e./l, são preferidas.
Sais de glifosato são alternativamente formulados como compo- sições solúveis em água e dispersíveis em água na forma por exemplo de pós, grânulos, péletes ou comprimidos. Tais composições são freqüente- mente conhecidas como formulações secas, embora o termo "seco" não de- veria ser compreendido neste contexto para implicar a ausência completa de água. Tipicamente, formulações secas contêm menos do que aproximada- mente 5% em peso de água, por exemplo aproximadamente 0,5% a cerca de 2% em peso de água. Tais formulações são pretendidas para dissolução ou dispersão em água no ponto de uso.
Formulações de glifosato secas contempladas podem conter aproximadamente 5% a cerca de 80% em peso de glifosato, expresso como equivalente ácido (% a.e.). Concentrações maiores de glifosato dentro do limite acima, por exemplo aproximadamente 50% a cerca de 80% a.e., são preferidas. Sais especialmente úteis de glifosato para fazer formulações se- cas são sais de sódio e amônio.
Composições de tratamento de planta e composições de con- centrado líquidas e secas da invenção podem optativamente conter um ou mais ingredientes de excipientes desejados. Ingredientes de excipientes es- pecialmente úteis para composições de glifosato são tensoativos, os quais auxiliam em retenção de soluções de pulverização aquosas nas superfícies relativamente hidrofóbicas de folhas da planta, bem como ajudando o glifo- sato a penetrar a camada externa cerosa (cutícula) da folha e desse modo entrar em contato com tecidos vivos dentro da folha. Tensoativos podem executar outras funções úteis como tais.
Não há restrição no tipo ou classe química de tensoativo que pode ser usada em composições de glifosato da invenção. Tipos não iôni- cos, aniônicos, catiônicos, e anfotéricos, ou combinações de mais do que destes tipos, são todos úteis em situações particulares. Entretanto, é geral- mente preferido que pelo menos um dos tensoativos, se qualquer um, pre- sente deveria ser outro além de aniônico, isto é, pelo menos um dos tensoa- tivos deveria ser não iônico, catiônico ou anfotérico.
Muitos tensoativos úteis aqui contidos têm uma estrutura quími- ca que compreende uma ou mais porções cada uma consistindo em uma única unidade de oxido de alquileno C2-4, ou uma cadeia polimerizada ou copolimerizada de unidades de óxido de alquileno C2-4. Tais tensoativos são referidos como tensoativos de polioxialquileno e incluem tipos não iônicos, aniônicos, catiônicos e anfotéricos. Tensoativos de polioxialquileno úteis em composições presentemente contempladas contêm aproximadamente 2 a cerca de 100 unidades de óxido de alquileno C2-4· Em tensoativos de polio- xialquileno preferidos, as unidades de óxido de alquileno formam uma ou mais cadeias de ou óxido de etileno ou óxido de etileno copolimerizado e óxido de propileno, cada cadeia de unidades de óxido de alquileno tendo um grupo hidrido terminal ou uma tampa de alquila C1-4OU alcanoíla C2-4-
Porções hidrofóbicas de tensoativos úteis em composições da invenção podem ser essencialmente baseado em hidrocarbono, em qual caso as porções hidrofóbicas são tipicamente cadeias Cs-24, preferivelmente C12-18, alquila, alquenila, alquilarila, alcanoíla, ou alquenoíla. Estas cadeias podem ser lineares ou ramificadas. Alternativamente, as porções hidrofóbi- cas podem conter átomos de silício, por exemplo na forma de grupos siloxa- no tais como grupos heptametiltrisiloxano, átomos de flúor, por exemplo como cadeias alquila ou perfluoroalquila parcialmente fluoradas.
Entre tensoativos não iônicos, classes especialmente preferidas incluem alquil, alquenil ou alquilaril éteres de polioxietileno, tais como álcoois ou alquilfenóis primários ou secundários etoxilados, alquil ou alquenil ésteres de polioxietileno, tais como ácidos graxos etoxilados, alquil ésteres de sor- bitano de polioxietileno, gliceril alquil ésteres, ésteres de sacarose, alquil po- liglicosídeos, e outros mais. Exemplos específicos representativos de tais tensoativos não iônicos incluem nonilfenol de polioxietileno (9) Neodol® 25-7 da Shell (um álcool primário linear Ci2-iõde polioxietileno (7)), Tergitol® 15-S- .9 de Union Carbide (um álcool secundário Ci2-isde polioxietileno (9)), Twe- en® 20 de ICI (um monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20)) e Agrimul® PG-2069 de Henkel (um alquil poliglicosídeo Cg-n).
Entre tensoativos catiônicos, classes especialmente preferidas incluem alquilaminas ou alquenilaminas terciárias de polioxietileno, tais como aminas graxas etoxiladas, tensoativos de amônio quaternário, alquileterami- nas de polioxietileno, e outros mais. Exemplos específicos representativos de tais tensoativos catiônicos incluem cocoamina de polioxietileno (5), sebo- amina de polioxietileno (15), cloreto de diestearildimetilamônio, brometo de cetiltrimetilamônio, cloreto de metil bis(2-hidroxietil)cocoamônio, cloreto de N-dodecilpiridina e cloreto de polioxipropileno etoxitrimetilamônio (8). Alqui- Ieteraminas de polioxietileno particularmente preferidos são aqueles descri- tos na Publicação PCT WO N9 96/32839. Muitos tensoativos de amônio quaternário catiônicos de diversas estruturas são conhecidos na técnica a serem úteis em combinação com glifosato e podem ser usados em composi- ções contempladas aqui, tais tensoativos de amônio quaternários têm a fór- mula
(NRaRbRcRd)mAn
onde A é um ânion adequado tal como cloreto, brometo, iodeto, acetato, sulfato ou fosfato, m e η são números inteiros tais que as cargas elétricas positivas em cátions (NRaRbRcRd) equilibram-se a cargas elétricas negativas em ânions A, e opções para Ra, Rb, Rc e Rd incluem, sem limitação: (i) Ra é benzila ou C8-24, preferível mente C12-18. alquila ou alque- nila, e Rb, Rc e Rd são independentemente alquila C1-4, preferivelmente metila;
(ii) RaeRb são independentemente Cs-24, preferivelmente C12-18, alquila ou alquenila, e Rc e Rd são independentemente al- quila C1-4, preferivelmente metila; (iii) Ra é Cs-24. preferivelmente C12-18, alquila ou alquenila, Rb é uma cadeia de polioxialquileno tendo aproximadamente 2 a cerca de 100 unidades de oxido de alquileno C2-4, preferi- velmente unidades de oxido de etileno, e Rc e Rd são inde- pendentemente alquila C1-4, preferivelmente metila;
(iv) Ra é Ca-24, preferivelmente C12-18, alquila ou alquenila, Rb e Rc são cadeias de polioxialquileno tendo em total aproxima- damente 2 a cerca de 100 unidades de oxido de alquileno C2-4, preferivelmente unidades de oxido de etileno, e Rd é alquila C1-4, preferivelmente metila; ou
(v) Ra é uma cadeia de polioxialquileno tendo aproximadamente 2 a cerca de 100 unidades de óxido de alquileno C2-4 nas quais unidades de óxido de alquileno C3-4, preferivelmente unidades de óxido de propileno, predominam e Rb, Rc e Rd são independentemente alquila C1-4, preferivelmente metila ou etila. Tensoativos de amônio quaternários particular- mente preferidos deste tipo são aqueles descritos na Pa- tente U.S. Nq 5.464.807 para Claude e outros.
Em uma concretização, o ânion A associado com tal tensoativo de amônio quaternário pode ser um ânion de glifosato.
Entre tensoativos anfotéricos, conforme incluindo é costumeiro na técnica tensoativos mais corretamente descritos como zwitteriônicos, classes especialmente preferidas incluem óxidos de alquilamina de polioxie- tileno, alquilbetaínas, aminoácidos de alquila substituídos e outros mais. Exemplos representativos de tais tensoativos anfotéricos incluem óxido de dodecildimetilamina, óxido de cocoamina de polioxietileno (2) e estearildime- tilbetaína.
Fontes de referência padrão das quais um versado na técnica pode selecionar tensoativos adequados, sem limitação às classes mencio- nadas acima, incluem Handbook of Industrial Surfactants, Segunda Edição (1997) publicado por Gower, McCutcheon's Emulsifiers and Detergents, Edi- ções Norte-Americanas e Internacionais (1997) publicado por MC Publishing Company, e International Cosmetic Ingredient Dictionary, Sexta Edição (1995) Volumes 1 e 2, publicado pelo Cosmetic, Toiletry and Fragrance As- sociation.
Outros componentes opcionais de composições da invenção incluem agentes para modificar cor, viscosidade, propriedades de formação de gel, ponto de congelamento, higroscopicidade, comportamento de forma- ção de massa, taxa de dissolução, dispersibildiade, ou outras características de formulação.
Exemplos de formulações comerciais de glifosato incluem, sem restrição, aqueles vendidos por Monsanto Company como herbicidas ROUNDUP®, ROUNDUP® ULTRA, ROUNDUP® CT, ROUNDUP® EXTRA, ROUNDUP® BIACTIVE, ROUNDUP® BIOFORCE, RODEO®, POLARIS®, SPARK® e ACCORD®, todos os quais contêm glifosato como seu sal de isopropilamônio; aqueles vendidos por Monsanto Company como herbicidas ROUNDUP® DRY e RIVAL®, os quais contêm glifosato como seu sal de amônio; aquele vendido por Monsanto Company como ROUNDUP® GEO- FORCE, o qual contém glifosato como seu sal de sódio, e aquele vendido por Zeneca Limited como herbicida TOUCHDOWN®, o qual contém glifosato como seu sal de trimetilsulfônio.
A seleção de taxas de aplicação para uma formulação de glifo- sato que são biologicamente eficazes está dentro da perícia do técnico agri- cultural ordinário. Aquele versado na técnica igualmente reconhecerá que condições de plantas individuais, condições de tempo e condições de cres- cimento podem afetar os resultados alcançados em praticando o processo da presente invenção. Durante duas décadas de uso de glifosato e estudos publicados relacionando-se a tal uso foram fornecidos informações abun- dantes das quais um prático em controle de erva daninha pode selecionar taxas de aplicação de glifosato que são eficazes herbicidamente em espéci- es particulares em estágios de crescimento particulares em condições ambi- entais particulares.
Um processo da presente invenção é aplicável a qualquer e to- das as espécies de plantas nas quais glifosato é biologicamente eficaz como um herbicida ou regulador de crescimento de planta. Isto abrange uma vari- edade muito ampla de espécies de plantas mundiais. Igualmente, composi- ções da invenção podem ser aplicadas a qualquer e todas as espécies de plantas nas quais glifosato é biologicamente eficaz.
Em uma concretização, um herbicida contendo glifosato é apli- cado à planta compreendendo os constructos de DNA da presente invenção, e as plantas são avaliadas para tolerância ao herbicida de glifosato. Qual- quer formulação de glifosato pode ser usada para testar plantas compreen- dendo os constructos de DNA da presente invenção. Por exemplo, uma composição de glifosato tal como Roundup Ultra® pode ser usada. Os parâ- metros de teste para uma avaliação da tolerância de glifosato da planta vari- ará dependendo de vários fatores. Fatores incluiriam, mas não são limitados ao tipo de formulação de glifosato, a concentração e quantidade de glifosato usadas na formulação, o tipo de planta, o estágio de desenvolvimento de planta durante o tempo da aplicação, condições ambientais, o método de aplicação, e o número de vezes que uma formulação particular é aplicada. Por exemplo, plantas podem ser testadas em um ambiente de estufa usando um método de aplicação por pulverização. O limite de teste usando Roundup Ultra® pode incluir, mas não é limitado a 0,06 g/m2 (8 oz/acre) a 1,79 g/m2 (256 oz/acre). O limite comercialmente eficaz preferido pode ser de 473 mL por 4000 m2 a 1892 mL por 4000 m2 de Roundup Ultra™, dependendo da colheita e estágio de desenvolvimento da planta. Uma colheita pode ser pul- verizada com pelo menos uma aplicação de uma formulação de glifosato. Para testar em algodão uma aplicação de 32 oz/acre no estágio de 3 folhas pode ser seguida por aplicações adicionais em estágios posteriores em des- envolvimento. Para trigo uma aplicação de 32 oz/acre de Roundup Ultra® no estágio de 3-5 folhas pode ser usada seguida com uma aplicação pré- ou pós-colheita, dependendo do tipo de trigo a ser testado. Os parâmetros de teste podem ser otimizados para cada colheita a fim de encontrar a planta particular compreendendo os constructos da presente invenção que confe- rem o nível de tolerância de glifosato comercialmente eficaz.
Os exemplos seguintes são incluídos para demonstrar concreti- zações preferidas da invenção. Deveria ser apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas descritas nos exemplos os quais seguem repre- sentam técnicas descobertas pelos inventores para funcionarem bem na prática da invenção. Entretanto, àqueles versados na técnica deveriam, Ie- vando em consideração a presente descrição, apreciar que muitas mudan- ças podem ser feitas nas concretizações específicas as quais são descritas e ainda obter um resultado igual ou similar sem desviar-se do espírito e ob- jetivo da invenção, portanto toda matéria descrita ou mostrada nos desenhos acompanhantes é para ser interpretada como ilustrativa e não em um senti- do limitante. EXEMPLOS EXEMPLO 1
Os constructos de plasmídeo usados são ou constructos de clo- nagem pUC ou constructos de transformação de planta de borda dupla con- tendo uma origem E.coli de reprodução tal como or/322,uma origem de limite de hospedeiro amplo de reprodução tal como oriV ou or/Ri, e uma região de codificação para um marcador selecionável tal como Spc/Str que codifica Tn7 aminoglicosídeo adeniltransferase (aadA) confere resistência a especti- nomicina ou estreptomicina, ou um marcador selecionável de gentamicina (Gm, Gent). Para transformação de planta, a cepa bacterial de hospedeiro foi Agrobacterium tumefaciens ABI ou LBA4404.
Os elementos genéticos são descritos como segue: P-e35S é o 35S RNA de CaMV contendo uma duplicação da região -90-300 como des- crita na Patente U.S. Nq 5.424.200 incorporada aqui por referência em sua integridade; P-FMV é o promotor 34S de Vírus Mosaico de Escrofulária como descrito na Patente N9 5.378.619 incorporada aqui por referência em sua integridade; P-eFMV é um derivado do promotor FMV contendo uma um promotor FMV duplicado; CTP2 é a região de peptídeo em trânsito de EPSP sintase de Arabidopsis como descrita na Patente U.S. N9 5.633.435; ara>A:CP4syn (aroA:CP4) é a região de codificação para CP4 EPSP (se- qüência sintética) como descrita na Patente U.S. N9 5.633.435 ou além disso modificada para expressão em plantas baseada em uso de códon de espé- cies de plantas particulares; E9 3' é a extremidade 3' de um isolado do gene RbcS de ervilha que funciona como um sinal de poliadenilação; nos é a ex- tremidade 3' do gene de nopalina sintase que funciona como um sinal de poliadenilação; Hsp70 é a seqüência líder não traduzida de Petunia hybrida como descrita na Patente U.S. N9 5.362.865 incorporada aqui por referência em sua integridade; GUS é a seqüência de codificação de beta- glucurosidade de E. coli (Jefferson, R. A. Proc. NatL Acad. Sei. U.S.A. 83:8447-8451, 1987); as bordas direitas (RB) e as bordas esquerdas (LB) são do plasmídeo Ti de cepas octapina e nopalina de Agrobacterium tume- faciens. O P-AtAct2 é o promotor do gene de actina 2 de Arabidopsis thalia- na ;AtAct2i é o íntron na região não traduzida (UTR) 5' do gene de actina 2 de Arabidopsis thaliana-, P-AtAct8 é o promotor do gene de actina 8 de Ara- bidopsis thaliana; AtAct2i é o íntron no UTR 5' do gene de actina 8 de Arabi- dopsis thaliana; P-AtAct11 é o promotor do gene de actina 11 de Arabidopsis thaliana-, AtAct11 é o íntron no UTR 5' do gene de actina 11 de Arabidopsis thaliana; P-AtActIa é o promotor do gene de actina 1a de Arabidopsis thalia- na, L-AtActIa é o líder não traduzido e I-AtActIa é o íntron do DNA genômi- co do gene de actina 1a; P-AtActIa é o promotor do gene de actina 1b de Arabidopsis thaliana, L-AtActIb é o líder não traduzido e I-AtActIb é o íntron do DNA genômico do gene de actina 1 b; P-AtAct3 é o promotor do gene de actina 3 de Arabidopsis thaliana, L-AtAct3 é o líder não traduzido e l-AtAct3 é o íntron do DNA genômico do gene de actina 3; P-AtAct7 é o promotor do gene de actina 7 de Arabidopsis thaliana, L-AtAct7 é o líder não traduzido e AtAct7 é o íntron do DNA genômico do gene de actina 7; P-AtActI 2 é o pro- motor do gene de actina 12 de Arabidopsis thaliana, L-AtActI2 é o líder não traduzido e I-AtActI 2 é o íntron do DNA genômico do gene de actina 12; P- AtEFIa (P-AtEFI ou EF1a) é o promotor do gene de fator de alongamento 1a de Arabidopsis thaliana, AtEFI a-i (AtEF1-i) é o íntron no UTR51 do gene de fator de alongamento 1 α de Arabidopsis thaliana.
Figuras 1-18 fornecem exemplos de constructos de transforma- ção de planta que contêm um a três cassetes de expressão de planta. Com- binações múltiplas de cassetes de expressão de planta compreendendo o promotor e os elementos genéticos da presente invenção podem ser cons- truídas e testadas em colheitas de plantas por aqueles versados na técnica de biologia molecular de planta sem experimentação indevida. Os construc- tos ilustrados nas Figuras não são para ser construídos como apenas os constructos que podem ser reunidos, mas servem como exemplos para aqueles versados na técnica. Figura 1 (pCGN8086) fornece um exemplo de um constructo de transformação de planta contendo um cassete de expres- são compreendendo um promotor da presente invenção (P-AtAct8) operaci- onalmente ligado a um gene de interesse (CTP2-aro>4:CP4syn). Figura 2 (pMON455325) fornece um exemplo de um constructo de transformação de planta contendo dois cassetes de expressão compreendendo pelo menos um promotor da presente invenção (P-AtActH) operacionalmente ligado a pelo menos um gene de interesse (CTP2-aroy4:CP4syn). Figura 3 (pMON45331) fornece um exemplo de um constructo de transformação de planta contendo um cassete de expressão compreendendo um promotor da presente invenção (P-AtEFI mais íntron) operacionalmente ligado a pelo menos um gene de interesse (CTP2-aro/A:CP4syn). Figura 4 (pMON4555332) fornece um exemplo de um constructo de transformação de planta contendo dois cassetes de expressão compreendendo pelo menos um promotor da presente invenção (P-AtEFI mais íntron) operacionalmente ligado a pelo menos um gene de interesse (CTP2-aro>A:CP4syn). Figura 5 (pMON9190) fornece um exemplo de um constructo de transformação de planta contendo três cassetes de expressão onde pelo menos dois promoto- res da presente invenção (P-AtEFI mais íntron, AtEFIα-i; P-AtAct2 mais íntron,) são operacionalmente ligados a pelo menos um gene de interesse (CTP2-aro/\:CP4syn) e o promotor P-eFMV operacionalmente ligado a CTP2-a/O>4:CP4syn. Figura 6 (pMON9153) cassetes de expressão de planta são idênticos àqueles ilustrados na Figura 4 (pMON45332), este mapa de plasmídeo é ilustrado para os propósitos de identificação dos cassetes de expressão para dados mostrados em fenótipo de planta nas tabelas de da- dos mostrados no relatório descritivo. Figura 7 (pCGN8099) fornece um exemplo de um constructo de transformação de planta contendo dois cas- setes de expressão compreendendo promotores híbridos da presente inven- ção, P-FMV-AtEFIa e P-e35S-AtAct8, dirigindo transcrição do gene de inte- resse (aro>4:CP4syn). Figura 8 (pCGN8088) fornece um exemplo de um construtor de transformação de planta contendo dois cassetes de expressão compreendendo um promotor da presente invenção, P-AtAct8 mais íntron, AtAct8i e o promotor P-eFMV dirigindo expressão de um gene de interesse (aroA:CP4syn). Figura 9 (pCGN8068), fornece um exemplo de um cons- tructo de transformação de planta contendo dois cassetes de expressão compreendendo um promotor da presente invenção, P-AtAct2 mais íntron, AtAct2i, e o promotor P-FMV dirigindo expressão de um gene de interesse (aro>A:CP4syn). Figura 10 (pCGN8096), fornece um exemplo de um cons- tructo de transformação de planta contendo dois cassetes de expressão compreendendo promotores híbridos da presente invenção, P-FMV-/AtAct11 e P-e35S-AtAct2, dirigindo transcrição do gene de interesse (aro/4:CP4syn). Figura 11 (pCGN9151), fornece um exemplo de um constructo de transfor- mação de planta contendo dois cassetes de expressão compreendendo promotores híbridos da presente invenção, P-eFMV-AtEF1a e P-e35S- AtAct2, transcrição propulsora do gene de interesse (aroACP4syn). Figura 12 (pMON10156) fornece um exemplo de um constructo de transformação de planta contendo um cassete de expressão compreendendo o promotor P- eFMV dirigindo expressão do gene de interesse aro>A:CP4syn, este vetor é usado para propósitos comparativos com as seqüências de promotores da presente invenção. Figura 13 (pMON52059) fornece um exemplo de um constructo de transformação de planta contendo um cassete de expressão compreendendo um promotor híbrido (P-FMV-AtEFIa) dirigindo a expressão do gene de interesse {aroA:CP4syn). Figura 14 (pMON54952) fornece um exemplo de um constructo de transformação de planta contendo um cassete de expressão compreendendo um promotor da presente invenção (P- AtActIa mais AtActIa íntron) operacionalmente ligado a pelo menos um ge- ne de interesse (CTP2-aro/\:CP4syn). Figura 15 (pMON54953) fornece um exemplo de um constructo de transformação de planta contendo um cassete de expressão compreendendo um promotor da presente invenção (P- AtActIb mais AtActIb íntron) operacionalmente ligado a pelo menos um ge- ne de interesse (CTP2-aroACP4syn). Figura 16 (pMON54954) fornece um exemplo de um constructo de transformação de planta contendo um cassete de expressão compreendendo um promotor da presente invenção (P-AtAct3 mais AtAct3 íntron) operacionalmente ligado a pelo menos um gene de inte- resse (CTP2-/\ro>A:CP4syn). Figura 17 (pMON54955) fornece um exemplo de um constructo de transformação de planta contendo um cassete de ex- pressão compreendendo um promotor da presente invenção (P-AtAct7 mais AtAct7 íntron) operacionalmente ligado a pelo menos um gene de interesse (CTP2-y4roA'CP4syn). Figura 18 (pMON54956) fornece um exemplo de um constructo de transformação de planta contendo um cassete de expressão compreendendo um promotor da presente invenção (P-AtActI 2 mais AtActI2 íntron) operacionalmente ligado a pelo um gene de interesse (CTP2- /AroACP4syn). EXEMPLO 2
Os constructos de clonagem e constructos de GUS são relacio- nados na Tabela 1. O promotor de actina 2 de Arabidopsis e íntron (número de acesso do Genbank U41998 como descrito em An e outros, Plant J. 10:107-121, 1996) foram isolados usando DNA de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta como um padrão (Rogers e Bendich, Plant Moi Biol. 5:69, 1998) usando SEQ ID NO:1 (inciador anterior ) e SEQ ID NO:2 (iniciador reverso) em uma reação como segue: 0,5 pg de DNA padrão, 25 pmole de cada iniciador, taq polimerase (BMB, Indianópolis, IN) usando bolas de cera para PCR de "início quente". As condições do termociclizador de PCR foram como segue: 94°C para um minuto; 30 ciclos de: 92°C por 40 segundos, 55°C por um minuto, 72°C para um minuto e 30 segundos; e uma extensão de cinco minutos 72°C. A reação de PCR foi purificada usando GeneCIeanII (Bio101 Inc., Vista, CA), digerido com Hindlll e Ncol, e ligado em constructo pMON26149 (Tabela 1) digerido com Hindlll e Ncol. O clone do promotor foi verificado em seqüência e o constructo resultante foi designado pMON26170 (Tabela 1).
Tabela 1. Constructos de Clonagem e Constructos de GUS contende se- qüências de promotores de Actina e EF1 de Arabidopsis
Constructo
pMON26149
pMON26170
pMON26171
pMON8677
pMON48407
pMON26152
pMON26177
pMON 11750
pMON 15737
Promotor*/Gene/3'
Act2/GUS/nos Act8/GUS/nos
Descrição
Constructo de clonagem Constructo de expressão de planta Constructo de expressão de planta Constructo de clonagem
Constructo de expressão de planta Actl 1/GUS/nos Constructo de clonagem Constructo de expressão de planta Constructo de expressão de planta Constructo de expressão de planta
EF1/GUS/nos
e35S/GUS/nos
FMV/GUS/nos
* as seqüências de promotores de actina e fator de alongamento também contêm a seqüência de íntron do 5'UTR do gene correspondente. EXEMPLO 3
O promotor de actina 8 de Arabidopsis e íntron (número de acesso do Genbank U42007 como descrito em An e outros, Plant J. 10:107- 121, 1996) foram isolados usando DNA de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta como umas condições de PCR padrão e métodos de purificação des- critos no Exemplo 2 usando iniciadores de SEQ ID NO:3 (iniciador anterior) e SEQ ID N0:4 (iniciador reverso). O promotor foi clonado usando enzimas de restrição como descrito no Exemplo 2, seqüência verificada, e o constructo resultante foi designado pMON26171 (Tabela 1). EXEMPLO 4
O promotor de actina 11 de Arabidopsis e íntron (número de acesso do Genbank U27981 como descrito em Huang e outros, Plant Moi Biol. 33:125-139, 1997) foram isolados usando DNA de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta como umas condições de PCR padrão e métodos de puri- ficação descritos em Exemplo 2 usando iniciadores de SEQ ID N0:5 (inicia- dor anterior) e SEQ ID N0:6 (iniciador reverso). O promotor foi clonado usando enzimas de restrição EcoRV e Ncol e ligado em PMON8677 (Tabela 1), seqüência verificada, e o constructo resultante foi designado pMON48407 (Tabela 1). EXEMPLO 5
O promotor de fator de alongamento 1 α de Arabidopsis (AtEF1 a) e íntron (número de acesso do Genbank X16430 como descrito em Axelos e outros, Mol. Gen. Genet. 219:106-112, 1989; Curie e outros, NAR 19:1305- 1310; Curie e outros, Plant. Mol. Biol. 18:1083-1089, 1992; Curie e outros, Mol. Gen. Genet. 238:428-436, 1993) foram isolados usando DNA de Arabi- dopsis thaliana Landsberg erecta como umas condições de PCR padrão e métodos de purificação descritos no Exemplo 2 usando iniciadores de SEQ ID NO:7 (iniciador anterior) e SEQ ID NO:8 (iniciador reverso). O promotor foi clonado usando enzimas de restrição HindIII e Ncol e ligado em pMON26152 (Tabela 1) como descrito no Exemplo 2, seqüência verificada, e o constructo resultante foi designado pMON26177(Tabela 1). EXEMPLO 6
Os constructos de transformação de planta descritos foram uni- dos em Agrobacterium. Transformação de algodão foi executada essencial- mente como descrito em W0/0036911, incorporada aqui por referência em sua integridade. A transformação de Arabidopsis foi executada como des- crito em Ye e outros, Plant Journal 19:249-257, 1999. A transformação de tomate foi executada como descrito na Patente U.S. Nq 5.565.347 incorpora- da aqui por referência em sua integridade. EXEMPLO 7
Um constructo de DNA é transformado em uma colheita alvo de interesse via um sistema de distribuição apropriado tal como um método de transformação mediado por Agrobacterium (veja por exemplo Patente U.S. N2 5.569.834 incorporada aqui por referência em sua integridade, Patente U.S. Nq 5.416.011 incorporada aqui por referência em sua integridade, Pa- tente U.S. Ng 5.631.152 incorporada aqui por referência em sua integridade, Patente U.S. N9 5.159.135 incorporada aqui por referência em sua integrida- de, Patente U.S. Nq 5.004.863 incorporada aqui por referência em sua inte- gridade, e Pedido Provisório Nq 60/111795 incorporado aqui por referência em sua integridade. Alternativamente, um método de bombardeamento de partícula pode ser usado (veja por exemplo Pedido de Patente WO .92/15675. WO 97/48814 e Pedido de Patente Européia 586.355, e Patente U.S. NQs 5.120.657, 5.503.998, 5.830.728 e 5.015.580, todas as quais estão incorporadas aqui por referência em sua integridade).
Um amplo número de sistemas e métodos de transformação e de regeneração são disponíveis e bem conhecidos por aqueles versados na técnica. As plantas transformadas estáveis e progênie são subseqüente- mente analisados para expressão do gene em tecidos de interesse por qual- quer número de métodos moleculares, imunodiagnósticos, bioquímicos, e/ou de avaliação de campo conhecidos por aqueles versados na técnica, incluin- do, mas não limitado a um teste de pulverização com uma formulação de glifosato a concentrações eficazes comercialmente executadas em uma câ- mara de crescimento ou ambiente de campo. EXEMPLO 8
Os ensaios de GUS são executados por métodos de rotina co- nhecidos por aqueles versados na técnica (veja por exemplo, Jefferson e outros, EMBO J. 6:3901, 1987).Para algodão, plantas RO foram testadas. O tecido foi selecionado por tamanho em vários estágios em desenvolvimento, amostras e formados poças para análises. O broto floral de algodão foi co- lhido e as amostras de tecido reprodutivo de macho (anteras e filamentos), amostras de tecido reprodutivo de fêmea (estigma inteiro, estile, e ovário), e corola (sépalas e pétalas) foram tomadas. Para a seleção de tamanho, três brotos florais de cada estágio foram selecionados do modo que incluíram vários tamanhos incluindo pequeno (menos do que 0,5 cm), médio (0,5-0,7 cm), e grande (estágio de vela ou flor aberta). Amostras de folha foram sele- cionadas a cerca de 1-2 semanas após as plantas de algodão serem colo- cadas na estufa, e as outras amostras foram coletadas aproximadamente 1-2 semanas depois. As primeiras flores não foram coletadas (as primeiras cinco posições de formação de fruto foram deixadas intactas).
Para Arabidopsis, plantas V1 foram analisadas e segregantes homozigotos e heterozigotos foram testados e analisados oito a dez eventos por constructo (cinco plantas por evento). Os resultados de GUS para Arabi- dopsis representam amostras de poças de 8-10 eventos. Os valores nas ta- belas descritas (Tabela 2 e Tabela 3) representam a expressão de GUS mé- dia para o tecido designado (pmol/MU/min/mg). EXEMPLO 9
Plantas foram analisadas para expressão GUS em tecido de fo- lha e tecidos reprodutivos incluindo brotos florais imaturos e flores. Os re- sultados são mostrados na Tabela 2. Constructos testados incluíram pMON484(D7 (P-AtActH + íntron/GUS/nos), pMON26170 (P-AtAct2 + ín- tron/GUS/nos), pMON26171 (P-AtAct8 + íntron/GUS/nos),pMON1170 (e35S/GUS/nos), pMON26177 (P-EF1a + íntron/GUS/nos) e pMON15737 (P-FMV/GUS/nos). Os promotores de actina e fator de alongamento conferi-
ram altos níveis de expressão de GUS em tecidos múltiplos incluindo tecidos reprodutivos.
Tabela 2. Expressão de GUS V1 de Arabidopsis Média
Constructo Folha Broto Floral Imaturo Flor Gineceu Androceu pMON48407 6944 7394 8359 ND ND pMON26170 45238 74099 54502 73623 217292 pMON26171 29343 35884 37125 76311 207100 pMON 11750 60844 14032 16263 35882 115049 pMON26177 47598 72871 96420 191066 507370 pMON 15737 28314 57903 84457 44696 87876
EXEMPLO 10
As plantas de algodão RO foram testadas para expressão do ge- ne repórter de GUS em tecidos selecionados de vários estágios de desen- volvimento. Os brotos florais foram estagiados por tamanho (pequeno, mé- dio, e grande; grande = vela e flor aberta). A androcéia representou os teci- dos reprodutivos de macho incluindo o receptáculo inteiro (estigma, estilo, e ovários). A amostra de corola foi composta de sépalas e pétalas. O tecido foi preparado e ensaios de GUS executados como descrito em EXEMPLO 8. Os resultados são resumidos em Tabela 3. Os constructos testados incluí- ram pMON48407 (P-EF1a + íntron/gus/nos), pMON26170 (P-AtAct2 + ín- tron/gus/nos), e pMON48407(P-AtAct11 + íntron/gus/nos).
Seis plantas foram testadas e valores de GUS médios obtidos para pMON26177. Vinte plantas foram testadas e valores de GUS médios obtidos para pMC)N26170. Oito plantas foram testadas e valores de GUS médios obtidos para pMON484C)7. Os resultados demonstraram que a actina e promotores de fatores de alongamento podem ser usados para expressão de genes operacionalmente ligados, particularmente em tecidos reproduti- vos.
TABELA 3. Resultados de Ensaio de GUS Dara Plantas de Alqodão Constructo Promotor/íntron Tecido Testado Resultados de GUS pMON26177 EF1a Folha 1160 pMON26177 EF1a Corola Pequena 396 pMON26177 EF1a Gineceu Pequeno 8670 pMON26177 EF1a Androcéia Pequena 13771 pMON26177 EF1a Corola Média 362 pMON26177 EF1a Gineceu Médio 3318 pMON26177 EF1a Androcéia Média 8006 pMON26177 EF1a Corola Grande 351 pMON26177 EF1a Gineceu Grande 500 pMON26177 EF1a Androcéia Grande 15512 pMON26170 Act2 Folha 12718 pMON26170 Act2 Corola Pequena 1296 pMON26170 Act2 Gineceu Pequeno 16684 pMON26170 Act2 Androcéia Pequena 7570 pMON26170 Act2 Corola Média 742 pMON26170 Act2 Gineceu Médio 10041 pMON26170 Act2 Androcéia Média 7893 pMON26170 Act2 Corola Grande 289 pMON2617ü Act2 Gineceu Grande 3218 pMON26170 Act2 Androcéia Grande 42737 pmon48407 Actl 1 Folha 28289 pmon48407 Actl 1 Corola Pequena 10 pmon48407 Actl 1 Gineceu Pequeno 40755 pmon48407 Actl 1 Androcéia Pequena 47834 pmon48407 Actl 1 Corola Média 742 pmon48407 Actl 1 Gineceu Médio 52495 pmon48407 Actl 1 Androcéia Média 35573 pmon48407 Actl 1 Corola Grande 1072 pmon48407 Actl 1 Gineceu Grande 4869 pmon48407 Actl 1 Androcéia Grande 42737 EXEMPLO 11
Plantas transformadas foram também testadas em um teste de pulverização de estufa usando Roundup Ultra® uma formulação de glifosato com um dispositivo Pulverizador de Rastro (Roundup Ultra é uma marca re- gistrada de Monsanto Company). Plantas estavam nos "dois" estágios de folha verdadeira e de maior crescimento e as folhas foram secas antes de aplicar a pulverização por Roundup®. A formulação usada foi Roundup Ul- tra® como uma formulação de 0,36 kg/L (3 Ib/galão a.e.) (equivalente ácido). A calibração usada foi como segue:
Para um volume de pulverização de (20 galões/Acre): Velocidade do bico: 9501 fluxo uniforme Pressão de pulverização: 275,8 kPa (40 psi)
Altura da Pulverização: 25,72 cm (18 polegadas) entre o topo do dossel e extremidade do bico
Velocidade de Rastro 33,52 cm/s (1,1 pé/s), correspondendo a uma lei- tura de 1950-1,0 volt. Formulação: Roundup Ultra® (3 Ib.A.e./galão)
As concentrações de pulverização variarão, dependendo dos limites de testagem desejados. Por exemplo, para uma taxa desejada de 0,06 g/m2 (8 oz/acre) uma solução de trabalho de 3,1 ml/L é usada, e para uma taxa desejada de 1892 mL por 4000 m2 (64 oz/acre) um limite de tra- balho de 24,8 ml/L é usado.
O período de avaliação variará, dependendo da colheita, estádio de desenvolvimento da planta, e nível desejado de tolerância. EXEMPLO 12
Os constructos de expressão de planta usados para transforma- ção de tomate são relacionados em Tabela 4. Plantas de tomate (TO) con- tendo constructos compreendendo pelo menos um promotor de actina ou de fator de alongamento (com íntron) operacionalmente ligado a um gene de tolerância de glifosato aroA:CP4 são peneirados em um teste de pulveriza- ção de glifosato de estufa com formulação de glifosato (Roundup Ultra®) para a eficiência de conferir tolerância a glifosato para plantas de tomate transgênicas. Optativamente1 pelo menos uma seqüência de promotor de actina ou de fator de alongamento operacionalmente ligada a um gene aroA:CP4 e um promotor de caulimovírus eFMV operacionalmente ligado a um aroA:CP4 transformado em plantas de tomate são peneirados por apli- cação de pulverização com glifosato (Roundup Ultra®). Plantas de tomate são pulverizadas com 0,36 g/m2 (48 oz/acre) então avaliadas em dias sema- nas pós aplicação para análise de tolerância vegetativa e até 60 dias pós- aplicação para análise de tolerância reprodutiva. Os resultados são mostra- dos em Tabela 4 e graduados de acordo com eficiência de selecionar linhas de tolerância reprodutivas. A porcentagem de tolerância vegetativa é a por- centagem das linhas peneiradas que demonstraram tolerâncias vegetativa suficiente para dano de glifosato ser considerado a estudos adicionais de traços agronômicos em preparação para candidatura comercialmente. A porcentagem de tolerância reprodutiva é a porcentagem de linhas de tole- rância vegetativa que também demonstraram tolerância reprodutiva sufici- ente para ser considerado a avaliação agronômica adicional. Todos os constructos provaram ser funcionais para fornecer tolerância vegetativa e tolerância reprodutiva às plantas de tomate transgênicas. Várias combina- ções de promotores são aptas a aumentar a eficiência na qual linhas de tole- rância vegetativa e reprodutiva poderiam ser selecionadas por peneiramento neste experimento. Constructos contendo o promotor de EF1a de Arabidop- sis são mais especificamente associados com uma porcentagem alta de li- nhas vegetativamente tolerantes. Promotor P-Act2 em combinação com P- eFMV e P -AtEFIa (pCGN9190) forneceram um aumento na porcentagem de linhas reprodutivamente tolerantes que são peneiradas por este método. TABELA 4 Ensaios de Pulverização de Rastro de Estufa com Taxa de Apli- cação de 0.36 q/m2 (48 oz/Acre)*
Constructo Descrição # de Linhas % de Tolerân- % de Toler.
Testadas cia Vegetativa Reprod.
pCGN9190 eFMV/CP4 + 930
EF1 a/CP4+ Act2/CP4 pCGN9193 EF1a/CP4+ 391
eFMV/CP4 pCGN8086 Act8/CP4 21 pCGN8099 FMV-EFIa/ 71 DP4 + Act8/ CP4
pCGN8088 eFMV/CP4+ 144 Act8/CP4
pMON45325 eFMV/CP4+ 90 Actl 1/CP4
pCGN8096 FMV-ActH/ 201 CP4+ Act2/ CP4
pCGN8067 Act2/CP4 205
83.2
73,9
47.6 84,5
79,9 70,0
62.7
67.3
52,4
38,9
38,1
36.6
34.7 34,4 10,4
8,8
* uma aplicação
.1 Resultados formados poças de 25 peneiras, Contado 14 dias pós-aplicação
.2 Resultados formados poças de 25 peneiras, Contado até 60 dias pós-apli- cação
Rendimento de semente de tomate é usado conforme medido da eficácia das várias seqüências de promotores e combinação de cassetes de expressão usados na presente invenção para conferir tolerância a glifosato a plantas de tomate transgênicas. Em tabela 5, os resultados dos três experi- mentos de campo são mostrados em plantas de tomate transgênicas con- tendo constructos com os promotores da presente invenção dirigindo ex- pressão da seqüência de codificação de aroA:CP4 par tolerância de glifosa- to. Experimento 1 é um teste das plantas produzidas dos constructos que contêm o promotor de vírus mosaico de Escrofulária (P-FMV) na nativa e a versão duplicada (P-eFMV) e elementos genéticos adicionais nos construc- tos que são também encontradas nos constructos usados para testar as se- qüências de promotores da presente invenção. Elementos genéticos adicio- nais tais com a fonte da seqüência não traduzida 5' e o peptídeo de trânsito de cloroplasto são também testados. O constructo pMC>N20998 compreende o P-eFMV, ligado a Hsp70 5 UTR de petúnia, líder ligado ao peptídeo de transito de cloroplasto de EPSPS de Arabidopsis (CTP2) ligada a região de término 3' E9. O constructo difere-se de pMON20999 de pMON2C)998 so- mente em que o CTP é proveniente do peptídeo de transito de cloroplasto de EPSPS de Petunia (CTP4). O constructo pMON45312 difere-se de pMON2ü998 somente em que a seqüência líder é a seqüência líder FMV nativa.
Plantas de tomate são transplantadas no campo em fileiras. As plantas são tratadas por pulverização no campo em uma taxa de 0,36 g/m2 (48 oz/acre) com herbicida Roundup. A semente de tomate é coletada do fruto e pesada. Uma linha de tomate não pulverizada serve como o controle para propósitos de comparação e a eficácia de cado constructo é expressa como uma porcentagem do controle. O resultado de Experimento 1 (coluna 1 de Tabela 5) é que o promotor FMV e P-eFMV somente fornecem 5-11% da produção de semente de uma verificação não pulverizada. Experimento 2, e 3 testam os constructos da presente invenção em localizações diferentes (colunas 2 e 3 de Tabela 5). Experimento 2 é conduzido na mesma localiza- ção como Experimento 1, os constructos pCGN8099 (Figura 7), pCGN9151 (Figura 11) e pCGN9190 (Figura 5) executadas bem fornecendo 25-46% da semente relativa a uma verificação não pulverizada. Em uma localização diferente que tem uma estação de crescimento mais frio, Experimento 3 de- monstrou que pCGN8086 (Figura 9), pCGN8088 (Figura 8), pCGN8099, pCGN9151, pCGN9153 (Figura 6), e pMON45325 (Figura 2) estão aptos a conferir tolerância de glifosato suficiente para os tomates para estabelecer 34-44% de fixação de semente normal relativo a uma verificação não pulve- rizada. Tabela 5. Experimentos de campo de semente de tomate
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EXEMPLO 13
NOS de ID de SEQ: 1-8 e NOS de ID de SEQ:13-21 são inicia- dores de PCR designados de informação de seqüência publicamente dispo- nível para genes de Act1, Act2 (Genbank #U41998), Act3, Act7, Act8, (Genbank #ATU42007), Act11 (Genbank #ATU27981, Act12 e EfMa (Genbank #X16430) de Arabidopsis thaliana. Estas seqüências são usadas para estender seqüência de ácido nucléico usando técnicas de aplicação de reação de cadeia de polimerase (PCR) (veja por exemplo, Mullis e outros, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263, 1986; Erlich e outros, Appln. De Patente Européia 50.424; Appln. De Patente Européia 84.796, Appln. De Patente Européia 258.017, Appln. De Patente Européia 237.362; Mullis, Appln. De Patente Européia 201.184; Mullis e outros, Patente U.S. N9 4.683.202; Erlich, Patente U.S. NQ4.582.788; e Saiki, e outros, Patente U.S. Ng 4.683.194). Vários métodos de aplicação de PCR são conhecidos àque- Ies de perícia na técnica e são usados para identificar seqüências de ácido nucléico adjacentes a uma seqüência conhecida. Por exemplo, métodos de PCR inverso (IPCR), os quais são usados para ampliar seqüências de DNA desconhecidas adjacentes a uma região de núcleo de seqüência conhecida têm sido descritos. Outros métodos estão também disponíveis tais como PCR por captura (Lagerstrom M. e outros, PCR Methods Applic. 1:111, 1991), e PCR de conduta (Parker, e outros, Nucleic Acids Res 19:3055, 1991). Vários fabricantes têm também desenvolvido kits baseados em modi- ficações destes métodos para os propósitos de identificar seqüências de in- teresse. Avanços técnicos incluindo melhorias em iniciador e projeto de adaptador, melhorias na enzima polimerase, e capacidades termocilizadoras têm facilidade mais rápida, métodos eficientes para isolar seqüências de in- teresse.
Tabela 5a. Seqüências de iniciadores para isolamento de seqüências de promotores de Actina e EF1 α Arabidopsis
At. Actina 2 dianteiro: ttttititgatatcaagcttcaactattittatgtatgc At. Actina 2 reverso: gcctcagccatggtgagtctgctgcaaacacacaaaaaga gttcaat At. Actina 8 dianteiro: "nttttttgatatcaagcttccatttttcttttgcataattc At. Actina 8 reverso: gcatcggccatggtgagtcttctgcaatcaaaaacataaa gatctga At. Actina 11 dianteiro: 11 Htititaagcttgatatcacaaccaaatgtcaaatgg At. Actina 11 reverso: ccatctgccatggtctatatcctgtc At. EF1 α dianteiro: tniii"JΊtaagcttgatatcggaagtttctctcttg At. EF1 α reverso: cttttcccatggtagatctctggtcaacaa atc At. Actina 1a dianteiro: cccaagcttaaatgacatcagatacacgc At. Actina 1b dianteiro: cataagcttagaggtccaaattca
At. Actina 1 reverso: ccatcagccatggtcttctacctttatgcaaa At. Actina 3 dianteiro: ccaagcttaccacactcagatgcataaacaaacaca At. Actina 3 reverso: catcagccatggtctactctctgcaaaaaca
At. Actina 7 dianteiro: gcaaagcttactagtcaacaattggcc At. Actina 7 reverso: gatcggccatggttcactaaaaaaaaag
At. Actina 12 dianteiro: GGAAGCTTGCGGCCGCTTTCTACTCTACATGTTTCT
As folhas de plantas jovens de Arabidopsis thaliana (1g) foram homogeneizadas em 9 ml de compensador de CTAB (Saghai-Maroof e ou- tros, 1984, PNAS 81:8014-8018). O compensador de CTAB continha 100 mM de TrisHCI, pH 7,8, 700 mM NaCI, 50 mM de EDTA, CTAB 1% (brometo alquiltrimetilamônio) e 140 mM de 2-mercaptoetanol. Após 90 minutos de incubação em 65C, 4,5 ml de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1) foi adicio- nado e amostras foram misturadas por 10 minutos. Camada aquosa foi se- parada por centrifugação por 10 minutos a 1500 e foi reextraída com cloro- fórmio:isoamil álcool. Após segunda centrifugação, camada aquosa foi transferida a um tubo contendo 50 ml 10 mg/ml de RNaseA (Dnase livre) e incubado à temperatura ambiente por 30 minutos para remover RNA. DNA foi precipitado com 6 ml de isopropanol e ressuspenso em 1 ml de 10 mM de TrisHCI pH 8,5. Solução de DNA foi extraída uma vez com igual volume de fenol e uma vez com um igual volume de cloroforme: álcool isoamílico. Após centrifugação, 1/10 volumes de acetato de sódio (3M, pH 5,2) foi adicionado a camada aquosa, seguida por 2,5 volumes de etanol. O DNA foi aduncado, lavado em etanol 70%, então ar seco e ressuspenso em 0,2 ml de 10 mM TrisHCI.
DNA genômico de Arabidopsis (100 ng) foi usado em 50 ml de reações PCR. Reações contendo os iniciadores mostrados em Tabela 5a. Continham 0,2 mM reverso e soluções iniciadoras 200 nM dNTPs e com- pensador de PCR com magnésio e DNA polimerase de Expand® High Fide- Iity PCR System (Roche Molecular Biochemicals). Após 2 minutos iniciais de desnaturação a reações a 94°C foram ciclizadas 0,5 min a 94°C, 0,5 min a 55°C e 1,5 minuto a 72°C para 35 vezes. Produtos PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1%. Fragmentos DNA isolados em gel representando seqüências de Actina 1a, Actina 1b, Actina 7, e Actina 12 fo- ram fosforilados com T4 DNA quinase e ligados a desfosforilado e construto- res de clonagem pUC19 cortados em Smal. Colônias brancas foram penei- radas para a presença de inserções associadas e seqüenciadas com M13 para confirmar a presença de promotores de actina. Clones selecionados foram designados como pMON54941 (P-AtActIa), pMON54942 (P-AtActIb), pMON54943 (P-AtAct7) e pMON54944 (P-AtActI2). Subseqüentemente, os fragmentos de DNA promotores de Actina foram liberados por Hind Ille Ncol construtores de pUC19 contendo as seqüências de inserção, os fragmentos de DNA foram isolados e ligados a pMON26165 que tem sido digerido com as mesmas enzimas de restrição. Um produto PCR para o promotor de Acti- na 3 (P-AtAct3) foi digerido com Hind Ill e Nco I e clonados diretamente em pMON26165 para formar pMON54951. pMON26165 contem o segmento de gene terminador GUS/nos. Ligação com os segmentos de promotor permite análise de cada promotor para atividade funcional por expressão da enzima β-glucuronidade em células da planta. As células da planta podem ser isola- das, por exemplo, protoplastos de folha de tabaco, ou as células da planta podem estar contidas em um tecido ou organismo da planta, tal como, folha, raiz, cotiledônea, hipocotil, embrião, flor, ou organismo de armazenagem.
O nível de expressão de GUS direcionado pelos promotores é analisado em hipocotil de soja em comparação com GUS direcionado por promotor p-e35S (Tabela 6). DNA de plasmídeo/partículas douradas foi bombardeado para hipocotils então após 48 horas a atividade GUS foi anali- sada histoquimicamente. Todos dos promotores de Actina testados neste ensaio mostram atividade funcional no tecido hipocotil demonstrando sua utilidade para expressão transgene em espécies de planta de colheita hete- róloga. Os construtores contendo aroA:CP4 EPSPS Actina 1a Arabidopsis, promotores de (pMON54952), Actina 1b (pMON54953), Actina 3 (pMON54954), Actina 7 (pMON54955) e Actina 12 (pMON54956) da pre- sente invenção foram preparados em constructos de transformação de planta binária de Agrobacterium para expressão estável do EPSPS resis- tente a glifosato em plantas de colheitas. Estes constructos são transforma- das em células de soja e algodão, as células são selecionadas e regenera- dos em plantas em glifosato contendo meio de cultura de tecido e então analisadas para expressão do proteína AroA:CP4 e para tolerância à aplica- ção de glifosato. Plantas demonstrando tolerância de glifosato aceitável co- mercialmente são além disso por métodos de reprodução convencionais para transferir o traço de tolerância de glifosato em plasma de germe adap- tada por cultivo. Tabela 6. Atividade de promotores de actina de Arabidoosis diferentes em ensaio transiente como compara a P-e34S.
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EXEMPLO 14
Rendimento de algodão é correlacionado com o número de qua- drados estabelecidos durante as primeiras quatro a cinco semanas de qua- driculação. A retenção destes quadrados para cápsulas maduras e sua con- tribuição à colheita da fibra de algodão é um componente chave de rendi- mento. Quando determinando a eficácia de constructos transgene para conferir tolerância herbicida em algodão, a quantidade de retenção de cáp- sulas é uma medida de eficácia e é um traço desejável. Plantas de algodão transgênicas contendo promotores da presente invenção (Tabela 7) foram analisados em condições de estufa para retenção de cápsula. Os promoto- res dirigiram expressão da seqüência de codificação aroA:CP4 para fenótipo tolerante de glifosato. As plantas foram transformadas por um método medi- ado por Agrobacterium ou por um método de disparo de partícula. Os cons- tructos de disparo de partícula continham um GUS adicional contendo cas- sete de expressão útil para localização histoquímica de atividade de β- glucuronidase dos promotores da presente invenção. Plantas transgênicas foram regeneradas em meio contendo glifosato e plantas enraizadas em um meio de formação de raiz. As plantas enraizadas foram plantadas em vaso no solo e transferidas a uma câmara de crescimento para um período de endurecimento. A semente destas linhas de plantas foram coletadas e plan- tadas. Quinze plantas de cada linha foram pulverizadas com glifosato a 0,36 g/m2 (48 oz/acre) no estágio de folha 4. Pelo menos 8 plantas sobreviventes de cada linha foram pulverizadas novamente, no estágio de folha 8 com gli- fosato em 0,36 g/m2 (48 oz/acre). Em maturidade, o número de primeiras cápsulas de posição para as primeiras cinco cápsulas foi contado. Aquelas linhas que tiveram 3 ou mais das primeiras cápsulas da posição retidas após a pulverização de glifosato (mapa de planta > 3) foram avançados para es- tudo adicional. Tabela 7 ilustra os dados produzidos deste estudo. O número de linhas mapeadas indicam o número de linhas sobrevivendo da primeira aplicação de pulverização de glifosato. O padrão comercial é Linha 1445 (pMON17136) que contém o promotor P-FMV dirigindo expressão do gene CTP2-aro/A:CP4/E9 3', esta linha retém menos do que 1 das 5 cápsulas. Os construtores, pCGN8099, pCGN9153, pCGN8088, pCGN8068 forneceram tolerância a glifosato reprodutiva suficiente em algodão tal que 14-35% das linhas testadas destes construtores foram avançadas para experimentos agronômicos.
Tabela 7. Estudo de retenção de cápsula de algodão de estufa
<table>table see original document page 68</column></row><table> Continuação
<table>table see original document page 69</column></row><table>
EXEMPLO 15
Rendimento de algodão é relacionado com o número de quadra- dos estabelecidos durante as primeiras quatro a cinco semanas de quadri- culação. A retenção destes quadrados a cápsulas maduras e sua contribui- ção à colheita da fibra do algodão é um componente chave de rendimento. Quando determinando a eficácia de constructos transgene para conferir tole- rância a herbicida em algodão, a quantidade de retenção de cápsula é uma medida de eficácia e é um traço desejável. Plantas de algodão transgênicas contendo promotores da presente invenção foram analisadas em condições de campo em duas localizações para retenção de cápsulas. As linhas de algodão transgênicas 502-254-2 (pCGN8068), 701-178-2 (pCGN8068), 53-2 (pCGN8088), 178-1 (pCGN9153), e 60-1 (pCGN9153) foram comparados a 1445 (linha de tolerância a glifosato) e PM1218BR (modelo de Paymaster 1218) que contêm o constructo pMON17136 (P-FMV/CTP2-aroA:CP4/E93'), uma linha não transgênica do tipo selvagem, Coker 130 foi incluído. O pro- jeto do campo é um projeto de bloco completo aleatorizado consistindo em 2 filas χ 20-30 pés χ 3 reproduções. Glifosato é aplicado como formulação de Roundup Ultra® em taxas de produto 50,8 kg ia/Ha = 1,42 L (1,12 Ib ai/A = 48 oz) de produto e 68,04 kg ia/HA = 1,89 L (1,5 Ig ai/A = 64 oz) de produto no estágio de folha 8 de desenvolvimento de planta de algodão. Todos os lotes de algodão são coordenados agressivamente para controle de semente e peste de inseto, bem como outras aplicações agronômicas tais como tem- po de plantio, fertilização, irrigação, uso de PCR e desfolhação. A porcenta- gem de retenção cápsula é determinada mapeando a localização de cada uma das cápsulas retidas por seleção aleatória de dez plantas do centro das duas filas centrais (cinco de cada fila) de cada lote do mapa. O primeiro ma- peamento deveria ser feito 4 semanas após primeira flor (mapa de estação média) e segundo mapeamento deveria ser feito na colheita. Os dados co- letados incluem o número de primeiras cápsulas de posição nas cinco protu- berâncias de formação de flor do fundo que são contadas como uma indica- ção da tolerância reprodutiva das linhas de algodão transgênicas a glifosato. Tabela 8 ilustra a vantagem que promotores da presente invenção têm con- ferido a plantas de algodão transgênicas para retenção de cápsulas. Esta tolerância reprodutiva tem resultado em rendimento de fibra de algodão au- mentada (Tabela 9) e rendimento de semente aumentado (Tabela 10) como tal.
Tabela 8. Retenção de cápsula em mapa de planta de estação média de 5 primeiras cápsulas de posição do fundo
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Tabela 9. Rendimentoíde fibra de alqodão (Ibs/Acre) e oercentaaem de ren- dimento (Localização 1) <table>table see original document page 70</column></row><table> Continuação
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Tabela 10. Rendimento de Semente de Algodão (Ibs/Acre) e percentaqem de rendimento (Localização 1)
EXEMPLO 16
5 A eficácia do promotor híbrido P-FMV-AtEFIa dirigindo expres-
são da seqüência de codificação CTP2-aroA:CP4 (Figura 13, pMON52059) e P-FMV/CTP2-aro/\:CP4/E93' (pMON 15737) foi comparada em Arabidopsis thaliana transgênica. As plantas Arabidopsis thaliana transgênicas foram produzidas por infiltração a vácuo (Bechtold e outros, C R Acad Paris Life 10 Sci 316: 1194-1199) sementes foram plantadas em vasos em solo em uma câmara de crescimento ajustada por 24°C, 16 horas de ciclo de luz (120 μΕ rrf2s"1) para permitir crescimento normal e desenvolvimento das plantas. As plantas Arabidopsis transgênicas tolerantes a glifosato de evento de PMON52059 V1 foram selecionadas por aplicação de pulverização de herbi- 15 cida glifosato a uma taxa de 1,8 g/m2 (24 onças/acre), as plantas sobrevi- ventes foram transplantadas em vasos individuais. Oito plantas oMON52059 V1 e oito plantas homozíguas de pMON15737 foram pulverizadas uma Se- gunda vez correspondendo a observação de passar por peneira, aproxima- damente 16 dias após em uma taxa de 5,8 g/m2 (24 onças/acre). As plantas foram observadas para efeitos vegetativos de aplicação de glifosato. Todas as plantas tiveram tolerância vegetativa completa e nenhuma flor anormal foi observada. Entretanto, absorção de síliquas ocorrida indicou que semente não foi fixada nas síliquas abortadas. O número total de síliquas produzidas por cada planta e as síliquas que sementes continham (síliquas férteis) fo- ram contadas e tabuladas. Os resultados são mostrados na Tabela 9 e indi- cam que o constructo de promotor híbrido pMON52059 demonstrou uma melhoria maior do que 10 vezes em síliquas férteis, 89% comparadas a pMON15737 a 8%. O número de estruturas de formação de fruta férteis está relacionado à quantidade de semente que pode ser produzida, isto é especi- almente importante em colheitas, cujo rendimento está associado com nú- meros de semente. Colheitas tais como algodão, soja, canola, trigo e milho são colheitas onde tolerância reprodutiva a glifosato é essencial para bom rendimento.
Tabela 11. Comparação do promotor híbrido P-FMV-EFIa (pMON52Q59) e P-FMV (pMON 15737) em conferir tolerância reprodutiva a glicosato em plantas Arabidopsis.
pMON52059
<table>table see original document page 72</column></row><table> <table>table see original document page 73</column></row><table>
EXEMPLO 17
Girassol (Helianthus annuus L.) é uma colheita de importância agronômica para óleo e alimento. Os constructos pMON45325 (Figura 2), pMON45332 (Figura 4), e pMON45332 (Figura 3) da presente invenção fo- ram transformados em girassol. Transformação mediada por Agrobacterium de girassol tem sido descrita (Schrammeijer e outros, Pfant Cell Reports, 9: 55-60, 1990; EP 0 486 234). Métodos conhecidos por aqueles versados na técnica de transformação de planta com constructos de expressão de trans- gene podem incluir hipocotils, meristemas apicais, protoplasma, e outros tecidos de girassol. Linhas de girassol transgênico SFB250-27 contem pMON20999 (P-FMV/CTP2-aro/4:CP4/E93'); cassete de expressão; SFB288-01, SFB295-09 contém pMON45325 (P-FMV/CTP2-aroA:CP4/E93' ::P-AtAct11 + íntron/CTP2-aroA:CP4/E93'); SFB289-01 contém pMON45332 (P-AtEFIa + íntron/CTP2-aroA:CP4/E93' ::P-eFMV/CTP2-aroA:CP4/E93'); SFB303-08, SFB303-09, SFB303-11, e HA300B contêm pMON45331 (P- AtEFIa + íntron/CTP2-aroA:CP4/E9). Estas linhas são testadas para tole- rância a glifosato e são mostradas em Tabela 12.
Tolerância reprodutiva a glifosato em girassol pode ser medida como uma função da porcentagem de cabeças normais, porcentagem de tamanho de cabeça normal e a produção de pólen. Estas plantas são pulve- rizadas com Glifosato a estágios de folhas V-4 e V-8 em taxa de 2,4 mg/m2 (0,32 oz/acre) ou 0,48 g/m2 (64 oz/acre). As plantas de girassol são taxadas para tolerância vegetativa a glifosato. Tolerância vegetativa é alcançada em níveis 496 e 1892 mL por 4000 m2 (32 e 64 oz/acre) de pulverização de gli- fosato a ambos estágios V4 e V8 de desenvolvimento da planta.
Linhas de girassol transgênicas de tolerância a glifosato vegeta- tivo são contadas por número de cabeças, porcentagem normal de cabeças, porcentagem normal de tamanho de cabeça, e porcentagem de depósito de pólen normal. Estes traços são contados em um teste de campo em uma localização. A tabulação das contagem de cabeça e produção de pólen é mostrada em Tabela 12. Linhas selecionadas dos constructos da presente invenção mostram maior porcentagem de cabeças normal, geralmente por- centagem de tamanho de cabeça normal e depósito de pólen melhor. Tabela 12. Contagens de resistência de glifosato de girassol <table>table see original document page 74</column></row><table>
EXEMPLO 18
Elementos reguladores eis atuantes necessários para regulação de promotor própria podem ser identificados por vários meios. Em um méto- do, análise de anulação é realizada para remover regiões do promotor e os fragmentos do promotor resultantes são analisados para atividade promoto- ra. Fragmentos de DNA são considerados necessários para regulação do promotor se a atividade do promotor truncado é alterado comparado ao fragmento do promotor original. Através desta análise de anulação, regiões pequenas de DNA podem ser identificadas as quais são necessárias para regulação positiva ou negativa de transcrição. Assuntos de seqüência de promotor podem também ser identificadas e promotores novos projetados para conter estes elementos eis para modular expressão de seqüências passíveis de transcrição operacionalmente ligadas. Veja por exemplo Pa- tente U.S. N9 5.233.419, incorporada aqui contida por referência em sua in- tegridade, Patente U.S. Ns 4.990.607 incorporada aqui contida por referência em sua integridade, e Patente U.S. N9 5.097.025 incorporada aqui contida por referência em sua integridade.
Uma aproximação alternativa é procurar seqüências similares entre promotores com perfis de expressão similares. Promotores com mo- delos de sobreposição de atividade podem ter mecanismos reguladores co- muns. Diversos programas de computadores podem ser usados para identi- ficar assuntos de seqüência conservados entre promotores, incluindo mas não limitado a MEME, SIGNAL SCAN, ou GENE SCAN. Estes assuntos po- dem representar sítios de aglutinação para fatores de transcrição os quais atuam para regular os promotores. Uma vez os assuntos de seqüência são identificados, sua função pode ser analisada. Por exemplo, as seqüências de assuntos podem ser anuladas do promotor para determinar se o assunto é necessário para função promotora própria. Alternativamente, o assunto pode ser adicionado a um promotor mínimo para testar se ele é suficiente para ativar transcrição. Elementos reguladores negativos suspeitos podem ser testados para suficiência adicionando a um promotor ativo e testando para uma redução em atividade de promotor. Alguns elementos reguladores eis atuantes podem exigir outros elementos para funcionar. Portanto, elementos múltiplos podem ser testados em várias combinações por qualquer número de métodos conhecidos àqueles versados na técnica.
Outros elementos de promotores funcionais têm sido identifica- dos, elementos promotores podem ser modificados ao nível de nucleotídeo para afetar aglutinação de proteína. As modificações podem causar ou aglu- tinação de afinidade maior ou menor o qual afetaria o nível de transcrição daquele promotor.
Elementos promotores podem atuar aditivamente ou sinergisti- camente para afetar atividade do promotor. A este respeito, elementos pro- motores de regiões reguladoras 51 diferentes podem ser colocados em série para obter um promotor com um espectro diferente de atividade ou perfil de expressão diferentes. Conformemente, combinações para elementos pro- motores de fontes heterólogas ou duplicação de elementos similares ou o mesmo elemento pode conferir um nível maior de expressão de seqüências transcritíveis operacionalmente ligadas. Por exemplo, um elemento promotor pode ser multimerizado para aumentar níveis de expressão especificamente no modelo afetado por aquele elemento promotor.
Os métodos técnicos necessários para construir constructos de expressão contendo os elementos reguladores de 5' projetados novos são conhecidos àqueles versados na técnica. Os promotores projetados são testados em constructos de expressão e testados transientemente operacio- nalmente ligando a promotores novos a um gene repórter adequado tal como GUS e testando em um ensaio de planta transiente. Os promotores novos são operacionalmente ligados a um ou mais genes de interesse e in- corporados em um constructo de transformação de planta junto com um ou mais elementos reguladores adicionais e transformados em uma planta alvo de interesse por um sistema de distribuição de DNA adequado. As plantas estavelmente transformadas e fruto subseqüente são avaliados por qualquer número de métodos molecular, imunodiagnóstico, bioquímico, fenotípico, ou de campo adequado para taxar a(s) característica(s) desejável(is).
Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente invenção, deveria ser aparente a pessoas versadas na técnica que a invenção pode ser modificada em arranjo e detalhes sem desviar-se de tais princípios. Rei- vindicam-se todas as modificações que estão dentro do espírito e objetivo das reivindicações anexas.
Todas as publicações e documentos de patentes publicadas ci- tados neste relatório descritivo são incorporados aqui contidos por referência à mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individual foi especificamente e individualmente indicado a ser incorporado por refe- rência. Listagem de Seqüência
<11O> Fincher, Karen L.
Plasinski, Stanislaw Wilkinson, Jack Q.
<120> Constructos para expressão de planta <130> 11898.0018.OOPCOO MOBSOIBP
<140> US 60/171,173 <141> 1999-12-16
<160> 30
<170> Patentln Versão 3.0 <210> ι
<211> 39 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 1
ttttttttga tatcaagctt caactatttt tatgtatgc 39
<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<400> 2
gcctcagcca tggtgagtct gctgcaaaea cacaaaaaga gttcaat 47
<210> 3 <211> 42 <212> DNA
Artificial <210> 4
<2ll> 47
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<400> 4
gcatcggcca tggtgagtct tctgcaatca aaaacataaa gatctga
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<400> 5
ttttttttta agcttgatat cacaaccaaa tgtcaaatgg
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<400> 6
ccatctgcca tggtctatat cctgtc
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<400> 7
ttttttttta agcttgatat cggaagtttc tctcttg
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<400> 8
cttttcccat ggtagatctc tggtcaacaa ate 33
<2X0> 9
<211> 1219
<212> DNA
<213> Arabidopsis Thaliana
<400> 9
caactatttt tatgtatgca agagtcagca tatgtataat tgattcagaa tcgttttgac 60 gagttcggat gtagtagtag ccattattta atgtacatac taatcgtgaa tagtgatatg 120 atgaaacatt gtatcttatt gtataaatat ccataaacac atcatgaaag acactttctt 180 tcacggtctg aattaattat gatacaattc taatagaaaa cgaattaaat tacgttgaat 240 tgtatgaaat ctaattgaac aagccaacca cgacgacgac taacgttgcc tggattgact 300 cggtttaagt taaccactaa aaaaacggag ctgtcatgta acacgcggat cgagcaggtc 360 acagtcatga agccatcaaa gcaaaagaac taatccaagg gctgagatga ttaattagtt 420 taaaaattag ttaacacgag ggaaaaggct gtctgacagc caggtcacgt tatctttacc 480 tgtggtcgaa atgattcgtg tctgtcgatt ttaattattt ttttgaaagg ccgaaaataa 540 agttgtaaga gataaacccg cctatataaa ttcatatatt ttcctctccg ctttgaattg 600 tctcgttgtc ctcctcactt tcatcagccg ttttgaatct ccggcgactt gacagagaag 660 aacaaggaag aagactaaga gagaaagtaa gagataatcc aggagattca ttctccgttt 720 tgaatcttcc tcaatctcat cttcttccgc tctttctttc caaggtaata ggaactttct 780 ggatctactt tatttgctgg atetegatet tgttttctca atttccttga gatctggaat 840 tcgtttaatt tggatctgtg aacctccact aaatcttttg gttttactag aategateta 900 agttgaccga tcagttagct cgattatagc taccagaatt tggcttgacc ttgatggaga 960 gatccatgtt catgttacct gggaaatgat ttgtatatgt gaattgaaat ctgaactgtt 1020 gaagttagat tgaatctgaa cactgtcaat gttagattga atctgaacac tgtttaagtt 1080 agatgaagtt tgtgtataga ttcttcgaaa ctttaggatt tgtagtgtcg tacgttgaac 1140 agaaagctat ttctgattca atcagggttt atttgactgt attgaactct ttttgtgtgt 1200 ttgcagcaga ctcaccatg 1219 <210> 10
<211> 1271
<212> DNA
<213> Arabidopsis Thaliana <220>
< 2 21 > característica m ista
<222> (535).. (536)
<223> y = COU t/U
<220>
<22ΐ> característica mista
<222> (561).. (561)
<223> y = C0U t/U
<400> ' 10 '
ccatttttct tttgcataat tcatgtttat ttttttattt ttttcatctt gcataattca 60 tgtttaaaag gatatataca tSSTgtctact acattctcct gacattacgt tttatgtgtt 120 tgtcttctga aaataatcat caaaatattt eaggacttgt ttacgttttc aggagaaaaa 180 aaataactgt acccttttca atatagaaat aacatttgta gaaatcgtgg attttcctta 240 ataaacaatc caaaacacga ccaccgttgt ctcctcgact cggtaacacc cgatcgecga 300 cttgaaaatt agaagaaaaa tgaaaagaat aataaaaaaa aaaaaggaat gatgattgaa 360 gctgtcatat atgtcgaccc tatcacagtc aatccaatag cctatattcg ccaactgata 420 tatccaacgg ctcacaaatt ttcacaaact tttcaaaaaa gtataataaa agaggctgtc 480 tgacagccat gtcacgttat actttttccg tatgatcgaa atgattcgtc tttgyygaat 540 ttaattattt ccaaaattga ygactctaaa gaaaaaaaaa tagtttttca gataaacccg 600 cctatataaa tagttcaaca ctcggtttat ttcttctccc ctcaaagaat tgcctcgtcg 660 tcttcagctt catcggccgt tgcatttccc ggcgataaga gagagaaaga ggagaaagag 720 tgagccagtt cttcatcgtc gtggttcttg tttcttcctc gatctctcga tcttctgctt 780 ttgcttttcc gattaaggta attaaaacct ccgatctact tgttcttgtg ttggatctcg 840 attacgattt ctaagttacc ttcaaaagtt gtttccgatt tgattttgat tggaatttag 900 atcggtcaaa ctattggaaa tttttgatcc tggcaccgat tagctcaacg attcatgttt 960 gacttgatct tgcgttgtat ttgaaatcga tccggatcct ttcgcttctt ctgtcaatag 1020 gaatctgaaa tttgaaatgt tagttgaagt ttgacttcag attctgttga tttattgact 1080 gtaacatttt gtcttccgat gagtatggat tcgttgaaat ctgctttcat tatgattcta 1140 ttgatagata catcatacat tgaattgaat ctactcatga atgaaaagcc tggtttgatt 1200 aagaaagtgt tttcggtttt ctcgatcaag attcagatct ttatgttttt gattgcagat 1260 cgtagaccat g 1271
<210> 11 <211> 1393 <212> DNA
<213> Arabidopsis Thaliana <400> 11
acaaccaaat gtcaaatgga atgcatcaga gaccaaacct gtaagagtcc acaaaacaat 60
tcaaagaaag aatatcaaca attcagagat tcaatcctaa aacaaaaaga gaactgaaac 120
caaatcgtac ctacacgacc agtgaagata ccaatagaga gctctgttgt agaatacaac 180
acattaãgcg caattagcag aaacagtctc ttcatctgcc gatttccact tgtcactact 240
ccaaaaacct cccaaaccat ttccaaaaca gacacttttg ccatgtctac atctttccct 300
tccccgaaaa acacatcatt tccatcaacg gagtaaatat ccggcggcat atcgatgctc 360
gagaccgtcc tatcgagaaa aggcttagcc gcttccgtga ccgccggcgt tcgtggaccg 420
tgagattgct gaaacgagcg agaataagca agcctccgat cattagcagc atatccgaca 480
tcgctgctcc gatcatcagg gagctcgtta tcgcctcgag gattaaagga aatggatctc 540
tccattttct tctttgatct taaagttcca acttcggcaa atactaaaat caacagtcag 600
tcgtacaaag aaactctgct tatacagtaa agtcaatggg ccactgttct aagcccatat 660
ataattttag aagcccatag aatacaaaag agtcaagaag cattgaccgc acaagaaaaa 720
aacaattgtt aaaaagggtt ggttagtgtg tatgtatata tgaaatgcaa caaacattat 780
acagcccatt aaatatggtt gttataggta gatgtcccca ttaaggaact ttatccagcc 840
cattaaatta ctttacagag taaaagagag agagaagatt tacagttacg ttaccaaatt 900
ttcgaaatga tttaattagt aataaataaa taattaaatg tcagttactc tctttagaaa 960
gctaaataag acagctgttt ccaccaacaa cgtgactggt cgtggggtcc tccttcgttc 1020
aaagtgatat tcagaaatca acggctgaga tcttctccat caatatttat tacgggccta 1080
ttccttcctt ttttaaactt caattctccg gctcacattc tcttcttcat tcgctccgtt 1140
tctctctcaa aaactacaca cccgtaccac accaccaccc tcctcgtttc ctcagagatc 1200
ccctctctaa cttctaaggt aatcacattt ccataacgtt ccatcgtcat tgattcttca 1260
ttagtatgcg tttatgaagc tttttcaatt taattctctt tggtagatct taagattcct 1320
ctgtttcttg caaaataaag ggttcaatta tgctaatatt ttttatatca attttgacag 1380
gatatagacc atg 1393 <210> 12
<211> 1160
<212> DNA
<213> Arabidopsis Thaliana <220>
<221> característica mista
<222> (565).. (565)
<223> y = c OU t/U
<220>
<22l> característica mista
<222> (571).. (571)
<223> y = cou t/u
<220>
<2~1:> característica mista
<222> (638).. (638)
<223> η = a ou g ou c ou t/u
<220>
<22i> característica mista
<222 > (656).. (656)
<223> η = a ou g ou c ou t/u
<400> 12
ggaagtttct ctcttgaggg aggttgctcg tggaatggga cacatatggt tgtta.ta.ata. 6Q aaccatttcc attgtcatga gattttgagg ttaatatata ctttacttgt tcattatttt 120 atttggtgtt tgaataaatg atataaatgg ctcttgataa tctgcattca ttgagatatc 180 aaatatttac tctagagaag agtgtcatat agattgatgg tccacaatca atgaaatttt 240 tgggagacga acatgtataa ccatttgctt gaataacctt aattaaaagg tgtgattaaa 300 tgatgtttgt aacatgtagt actaaacatt cataaaacac aaccaaccca agaggtattg 360 agtattcacg gctaaacagg ggcataatgg taatttaaag aatgatatta ttttatgtta 420 aaccctaaca ttggtttcgg attcaacgct ataaataaaa ccactctcgt tgctgattcc 480 atttatcgtt cttattgacc ctagccgcta cacacttttc tgcgatatct ctgaggtaag 540 cgttaacgta cccttaratc gttcyttttc yttttcgtct gctgatcgtt gctcatatta 600 tttcgatgat tgttggattc gatgctcttt gttgattnat cgttctgaaa attctnatct 660 gttgtttaga ttttatcgat tgttaatatc aacgtttcac tgcttctaaa cgataattta 720 ttcatgaaac tattttccca ttctgatcga tcttgttttg agattttaat ttgttcgatt 780 gattgttggt tggtggatct atatacgagt gaacttgttg atttgcgtat ttaagatgta 840 tgtcgatttg aattgtgatt gggtaattct ggagtagcat aacaaatcca gtgttccctt 900 tttctaaggg taattctcgg attgtttgct ttatatctct tgaaattgcc gatttgattg 960 aatttagctc gcttagctca gatgatagag caccacaatt tttgtggtag aaatcggttt 1020
gactccgata gcggcttttt actatgattg ttttgtgtta aagatgattt tcataatggt 1080
tatatatgtc tactgttttt attgattcaa tatttgattg ttcttttttt tgcagatttg 1140
ttgaccagag atctaccatg 1160
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 13
cccaagctta aatgacatca gatacacgc 29
<210> 14
<211> 24
<212> DHA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<400> 14
cataagctta gaggtccaaa ttca 24
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 15
ccatcagcca tggtcttcta cctttatgca aa 32
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 16 ccaagcttac cacactcaga tgcataaaca aacaca
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213 > Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<400> 17
catcagccat ggtctactct ctgcaaaaac a
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<400> 18
gcaaagctta ctagtcaaca attggcc
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220:·
<223> Oligonucleotídeo sintético
<400> 19
gatcggccat ggttcactaa aaaaaaag
<210> 20
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<400> 20
ggaagcttgc ggccgctttc tactctacat gtttct
<210> 21 <211> 31 <212> DNA <213> Oligonucleotídeo sintético <400> 21
gactagccgc catggttcaa tctctagctg a 31
<210> 22 <211> 157B <212> DNA
<213> Arabidopsis Thaliana <400> 22
taaatgacat cagatacacg cttgtgaacc atctttaaag tattgatgga ctcttcacta 60
tgaaagctct ctttaaaatt aattttcttt gtacatgtct ctaagcaatg tcaaattaat 120
tagaggtcca aaCtcaaaaa aatgtcgtat tgaatcattc cattactaaa ttggttcaat 180
gtcagattta aacagcctag ggataattta gtgagatatg agattctact ttcaacatat 240
actaatccta aatctctagc aactttttat ataagctata aatatcatga aaatgtattt 300
taatcgtttc ataatttatg cagtcacact aatggaaaaa aggccaatta ttattatttt 360
cttcagacta taaatgaaaa cataaattaa aatgcagatt agtttaaaat tttaataagt 420
aagtaaaatg cttatagcct tatacaaaat catatttgga agtttctaac attgttgcaa 480
tttgttatca caaatcacag taatatttgt atactaatta gtaattacaa ctatacacaa 540
atttaaatgg gtaatcatat atttgtgtcc agtggattga acaaatatgc tcggcccatg 600
cggaagtaat gccaattttg ggtgagtaaa gcccatgcga aattttcaca taagaaatgc 660
atgctttttg ttttcaacga catgagttgc atgcttttta tcattgctta tatagttgca 720
agtttgcaac tccttgatat tttttttatg tagacactac taccaccaaa aacttttggt 780
ctgcttattc ttgtttacta tgtaaaaaaa ataaatgaat tgtttattta ctccgatttg 840
atggagtctg gtttatgagg ttttatagcc tttacagaaa attgatagtt acaaaaatat 900
ttttcaaaaa taaaagggta aaaccgtcat ttcaagttgt tattgttttg ggggactgga 960
tttgaaatga aatatagaac cggaaaacaa ggtgagccga agtcgaagcc tttggaoccg 1020
tttttatatt tactcctccc attcccttct ccttcaatcc ttccttcctc ctcctccctt 1080
cttcttcttc ccctctttca ttttccagcc actacaaact tttctatctc tacttttttt 1140
cctctcgatt tcaggtactt tttgagaccc tttgttgtga ttttcgaaca cacaccccaa 1200
ttacgtttga tttttgatcc cgcatcgatt tcaattcatc cgtttctgag tttcttttgg 1260
atctgggtgt cttgagctaa tcttttcgat ctgttgttta tcgattttac tcatgcgtat 1320
gttcattaca ccatttgtta tttgtttaat caaccaaaag actcatgttt ttcaaatgtc 1380 tttaatataa tttttctgat tgaattttat aatatttaca tgattctgga tccagaatat 1440
ccttcttctt cttccatttt gtcctgtatt gatttgtctt tgaaaaagga ttgttctttg 1500
tatctgtatt ggtgaaaaag gattgttatt tgttgataaa aatttgatct ttaaacaatg 1560
tttggttttg cataaagg 1578
<210> 23
<21Χ> 1468
<212> DNA
<213> Arabidopsis Thaliana
<400> 23
ttagaggtcc aaattcaaaa aaatgtcgta ttgaatcatt ccattactaa attggttcaa 60 tgtcagattt aaacagccta gggataattt agtgagatat gagattctac tttcaacata 120 tactaatcct aaatctctag caacttttta tataagctat aaatatcatg aaaatgtatt 180 ttaatcgttt cataatttat gcagtcacac taatggaaaa aaggccaatt attattattt 240 tcttcagact ataaatgaaa acataaatta aaatgcagat tagtttaaaa ttttaataag 300 taagtaaaat gcttatagcc ttatacaaaa tcatatttgg aagtttctaa cattgttgca 360 atttgttatc acaaatcaca gtaatatttg tatactaatt agtaattaca actatacaca 420 aatttaaatg ggtaatcata tatttgtgtc cagtggattg aacaaatatg ctcggcccat 480 gcggaagtaa tgccaatttt gggtgagtaa agcccatgcg aaattttcac ataagaaatg 540 catgcttttt gttttcaacg acatgagttg catgcttttt atcattgctt atatagttgc 600 aagtttgcaa ctccttgata ttttttttat gtagacacta ctaccaccaa aaacttttgg 660 tctgcttatt cttgtttact atgtaaaaaa aataaatgaa ttgtttattt actccgattt 720 gatggagtct ggtttatgag gttttatagc ctttacagaa aattgatagt tacaaaaata 780 tttttcaaaa ataaaagggt aaaaccgtca tttcaagttg ttattgtttt gggggactgg 840 atttgaaatg aaatatagaa ccggaaaaca aggtgagccg aagtcgaagc ctttggaccc 900 gtttttatat ttactcctcc cattcccttc tccttcaatc CttCCttCCt CCtCCtCCCt 960 tcttcttctt cccctctttc attttccagc cactacaaac ttttctatct ctactttttt 1020 tcctctcgat ttcaggtact ttttgagacc ctttgttgtg attttcgaac acacacccca 1080 attacgtttg atttttgatc ccgcatcgat ttcaattcat ccgtttctga gtttcttttg 1140 gatctgggtg tcttgagcta atcttttcga tctgttgttt atcgatttta ctcatgcgta 1200 tgttcattac accatttgtt atttgtttaa tcaaccaaaa gactcatgtt tttcaaatgt 1260 ctttaatata atttttctga ttgaatttta taatatttac atgattctgg atccagaata 1320 tccttcttct tcttccattt tgtcctgtat tgatttgtct ttgaaaaagg attgttcttt 1380 gtatctgtat tggtgaaaaa ggattgttat ttgttgataa aaatttgatc tttaaacaat 1440 gtttggtttt gcataaaggt agaagacc 1468
<210> 24
<211> 1642
<212> DNA
<213> Arabidopsis Thaliana
<400> 24
tcaagcttac cacactcaga tgcataaaca aacacagcaa gaagattgcc acaaaaatca 60 taacgaaata atcaagagat agctatcaaa tcgccaccgg cgaatcatgt catactcagt 120 atcagaaaca gatatgatag ctcaaaatat ggattaataa tgttactaaa cacatggaca 180 ataatgcatc aatattgaaa gaaagaaaat ggtttagcag aagcaaaatg gtttagaaag 240 taatgaacta cacattcaca aaggtgaaga attcgtcaag cctacaataa caaatgtcta 300 tactttatga gcccacaaag agatacatca cactatctga acgaaactaa agcaacctaa 360 catagtctag aaactactaa aatgaatgtt tcaaaacaat tttaacagaa ggcaaaagtg 420 aaacaacata ctcctttgcg agaacgagga cgaggagcta attcacgtct ggtaacaaca 480 tgtcccttgt tcaacccaac gaacaaaccg gtcttcactt gtggagttgt catcttctgt 540 aaatttcata gacaacaaac aaacaaaact ttctattcaa tacaaaatca aattttacaa 600 gagacggatt cagagataat aaagagatga agagagttaa atcaaaaggg attgatagaa 660 gatacctaat caatggatcg agctcctccg gtggttcaga caaaagaagg acgccgactg 720 aaaattacat ttttgtatat ataccagaga gactcaagaa aaaaccctag tccagtttgg 780 gcttttattg ggccttataa attttgggtc agttttgaca aagtaaatac aaggctatag 840 ctgctttgct aacgtgatta attatttacc atttaccaaa agccttaacc gaggccgagc 900 gagaaaaaaa aacaaaaaaa aggtagaggg caagaacgtc atttccacaa ggaattgaat 960 cggaaaacga ggtgtgccga attcgaagcc tttggacccg tttttatact tttttacttg 1020 ccattcgttt ttttttgttc attggcctca tttgattact tgtttctttg atttctcctt 1080 ccatagaacc gaattgtttt cagtctgaga tttctcctgc cgagagaacg attttaatct 1140 attttcctcg gtaatgttat agcctaattt gtgttttttt ctttttcctg atccggatat 1200 cgttattctg attgacaatt gtcagtttca tcttctattc tgtgaaattt tgattttttt 1260 ccgatctgtg atttcgtcat tgtatcagcg tgcttatatg cgtttgaggc gtaaatgagt 1320 gtgtacctca tttatcattt gctatgtttt tttttttaac agagatcttc agctgtaata 1380
ttataataga ttgaattgat aacgtgattc tggatctgga atatatatat gtcacattct 1440
tcttaggatt tgattttgtc tctctttgga tattaatatt cttcactccc ttgaaaatga 1500
atctgtttat tataatgttt agatatattc cttaccggca tttgttttag cataaatatg 1560
aaacatagca ttgactgatt tgtcttttta ttattcttgt ttttttgcca aattggtctc 1620
atgtttttgc agagagtaga cc 1642
<210> 25
<211> 1241
<212> DNA
<213> Arabidopsis Thaliana <220>
<221> característica mista
<222> (26) ..(26)
<223> η = a ou g ou c ou t/u
<400> 25
actagtcaac aattggccaa tctttngttc taaattgcta ataaacgacc atttccgtca 60 attctccttg gttgcaacag tctacccgtc aaatgtttac taatttataa gtgtgaagtt 120 tgaattatga aaaacgaaat cgtattaaaa attcacaaga ataaacaact ccatagattt 180 tcaaaaaaac agtcacgaga aaaaaaccac agaccgtttg tctgctcttc tagtttttat 240 tatttttcta ttaatagttt tttgttattt cgagaataaa atttgaacga tgtccgaacc 300 acaaaagccg agccgataaa tcctaagccg agcctaactt tagccgtaac catcagtcac 360 ggctcccggg ctaattcatt tgaaccgaat cataatcaac ggtttagatc aaactcaaaa 420 caatctaacg gcaacataga cgcgtcggtg agctaaaaag agtgtgaaag ccaggtcacc 480 atagcattgt ctctcccaga ttttttattt gggaaataat agaagaaata gaaaaaaata 540 aaagagtgag aaaaatcgta gagctatata ttcgcacatg tactcgtttc gctttcctta 600 gtgttagctg ctgccgctgt tgtttctcct ccatttctct atctttctct ctcgctgctt 660 ctcgaatctt ctgtatcatc ttcttcttct tcaaggtgag tctctagatc cgttcgcttg 720 attttgctgc tcgttagtcg ttattgttga ttctctatgc cgatttcgct agatctgttt 780 agcatgcgtt gtggttttat gagaaaatct ttgttttggg ggttgcttgt tatgtgattc 840 gatccgtgct tgttggatcg atctgagcta attcttaagg tttatgtgtt agatctatgg 900 agtttgagga ttcttctcgc ttctgtcgat ctctcgctgt tatttttgtt tttttcagtg 960 aagtgaagtt gtttagttcg aaatgacttc gtgtatgctc gattgatctg gttttaatct 1020 tcgatctgtt aggtgttgat gtttacaagt gaattctagt gttttctctt tgagatctgt 1080
gaagtttgaa cctagttttc tcaataatca acatatgaag cgatgtttga gtttcaataa 1140
acgctgctaa tcttcgaaac taagttgtga tctgattcgt gtttacttca tgagcttatc 1200
caattcattt cggtttcatt ttactttttt tttagtgaac c 1241
<210> 26
<211> 1313
<212> DNA
<213> Arabidopsis Thaliana
<400> 26
tttctactct acatgtttct tgttattagg taaagtatta ggctcttttt ttaaaaaaaa 60 tgcttaatcc tctgggtacc tcgaaaaggg aataatactc tagttagata agtgcagcga 120 tcaacatgac aaaatgaatg aatgtttgct ttaattggtg gctaaaagct aaatacacag 180 aaaagtcaaa attcaatctc aaaatcaacc cctctgtctc caatgtccct aatctatacc 240 aaaatgtcaa tttattttct tgatcatata ttccactaat taaaaataaa tccttctcta 300 atgaaatttg tcaaggcctt ggaagcctag ttttaaatat taaatggaaa ctatttcttc 360 aacaatcaca ctgttattta gtattgttgt atgttgttca ctactttctt catttgtttt 420 gtaagaaact ataataagca aaaacacata ataaagtctc atgtcaaata atgaatctta 480 tgcacatgct tgattatttt acttgcacat atccctatca tcattatcac atttgtcaat 540 taccgttatc atcattactc tcattcttcc cagaactttt tcagcaattt ccatacctca 600 cccactaaga tcttttaccc tttttcttaa ttatagtttg gatagcactc ttttacatag 660 cactgaaatt tcggttgaac acataaatta ctagaaacta gaaggaaatg ttactgaaat 720 ttcactgatt gtctaaaatt gaataatcta aagaaaatgg ccttttaacc tttttcttag 780 gcccaaatgg gctcattacc actcatgctt gttcggtgac ccgattcttc cggtaaaaca 840 gagcctaaac cgtattttca ggttaggctg gtgttttctt aattctccaa cctaaaaata 900 gatggacacg tgtctataga ggctgagata ttggtctcaa tgaagaaaac taacggctca 960 gacccgtgta tgaacgatat taagggccaa agttgcttct gttttccaga aatttttgaa 1020 acccaatttc agggcacgat tccacaacct CtttCttttC ttctagatct acgtaaattc 1080 atcaggtaca tgttattttt tttgtttatt tgatgtcaaa attttgatca caaggaggca 1140 aaaccaatat aaatgtaacg ctaatgcgtt tgattatggt atacgtaacg aattagattt 1200 aatggttaca ttttattgtt ttagatttag ttatgagatt ggcattaatt attggtgttt 1260 cctttgaatt tgctatgttt cttatgttga tgtaatcagc tagagattga acc 1313 <210> 27 <211> 1946 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Sintético <400> 27
aattctcagt ccaaagcctc aacaaggtca gggtacagag tctccaaacc attagccaaa 60
agctacagga gatcaatgaa gaatcttcaa tcaaagtaaa ctactgttcc agcacatgca 120
tcatggtcag taagtttcag aaaaagacat ccaccgaaga cttaaagtta gtgggcatct 180
ttgaaagtaa tcttgtcaac atcgagcagc tggcttgtgg ggaccagaca aaaaaggaat 240
ggtgcagaat tgttaggcgc acctaccaaa agcatctttg cctttattgc aaagataaag 300
cagattcctc tagtacaagt ggggaacaaa ataacgtgga aaagagctgt cctgacagcc 360
cactcactaa tgcgtatgac gaacgcagtg acgaccacaa aagaattagc ttgagctcag 420
gatttagcag cattccagat tgggttcaat caacaaggta cgagccatat cactttattc 480
aaattggtat cgccaaaacc aagaaggaac tcccatcctc aaaggtttgt aaggaagaat 540
tcgatatccc cgcggccgcg ttatcacaac caaatgtcaa atggaatgca tcagagacca 600
aacctgtaag agtccacaaa acaattcaaa gaaagaatat caacaattca gagattcaat 660
cctaaaacaa aaagagaact gaaaccaaat cgtacctaca cgaccagtga agataccaat 720
agagagctct gttgtagaat acaacacatt aagcgcaatt agcagaaaca gtctcttcat 780
ctgccgattt ccacttgtca ctactccaaa aacctcccaa accatttcca aaacagacac 840
ttttgccatg tctacatctt tcccttcccc gaaaaacaca tcatttccat caacggagta 900
aatatccggc ggcatatcga tgctcgagac cgtcctatcg agaaaaggct tagccgcttc 960
cgtgaccgcc ggcgttcgtg gaccgtgaga ttgctgaaac gagcgagaat aagcaagcct 1020
ccgatcatta gcagcatatc cgacatcgct gctccgatca tcagggagct cgttatcgcc 1080
tcgaggatta aaggaaatgg atctctccat tttcttcttt gatcttaaag ttccaacttc 1140
ggcaaatact aaaatcaaca gtcagtcgta caaagaaact ctgcttatac agtaaagtca 1200
atgggccact gttctaagcc catatataat tttagaagcc catagaatac aaaagagtca 1260
agaagcattg accgcacaag aaaaaaacaa ttgttaaaaa gggttggtta gtgtgtatgt 1320
atatatgaaa tgcaacaaac attatacagc ccattaaata tggtfcgttat aggtagatgt 1380 ccccattaag gaactttatc cagcccatta aattacttta cagagtaaaa gagagagaga 144C
agatttacag ttacgttacc aaattttcga aatgatttaa ttagtaataa ataaataatt 1500
aaatgtcagt tactctcttt agaaagctaa ataagacagc tgtttccacc aacaacgtga 1560
ctggtcgtgg ggtcctcctt cgttcaaagt gatattcaga aatcaacggc tgagatcttc 1620
tccatcaata tttattacgg gcctattcct tcctttttta aacttcaatt ctccggctca 1680
cattctcttc ttcattcgct ccgtttctct ctcaaaaact acacacccgt accacaccac 1740
caccctcctc gtttcctcag agatcccctc tctaacttct aaggtaatca catttccata 1800
acgttccátc gtcattgatt cttcattagt atgcgtttat gaagcttttt caatttaatt 1860
ctctttggta gatcttaaga ttcctctgtt tcttgcaaaa taaagggttc aattatgcta 1920
atatttttta tatcaatttt gacagg 1946
<210> 28 <211> 1695 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Sintético <220>
<22i> característica mista
<222 > (1198).. (1198)
<223 > η = a ou g ou c ou t/u
<220>
<221 > característica m ista <222> (1216) .. (1216) <223> η = a ou g ou c ou t/u
<220>
<221 > característica m ista <222> (1216) .. (1216) <223> η = a ou g ou c ou t/u
<220>
<221> característica mista
<222> (1125) .. (1125)
<223> η = a ou g ou c ou t/u
<400> 28
aattctcagt ccaaagcctc aacaaggtca gggtacagag tctccaaacc attagccaaa 60 agctacagga gatcaatgaa gaatcttcaa tcaaagtaaa ctactgttcc agcacatgca 120 tcatggtcag taagtttcag aaaaagacat ccaccgaaga cttaaagtta gtgggcatct 180 ttgaaagtaa tcttgtcaac atcgagcagc tggcttgtgg ggaccagaca aaaaaggaat 240 ggtgcagaat tgttaggcgc acctaccaaa agcatctttg cctttattgc aaagataaag 3Ò0
cagattcctc tagtacaagt ggggaacaaa ataacgtgga aaagagctgt cctgacagcc 360
cactcactaa tgcgtatgac gaacgoagtg acgaccacaa aagaattagc ttgagctcag 420
gatttagcag cattccagat tgggttcaat caacaaggta cgagccatat cactttattc 480
aaattggtat cgccaaaacc aagaaggaac tcccatcctc aaaggtttgt aaggaagaat 540
tcgatatcaa gcttgatatc ggaagtttct ctcttgaggg aggttgctcg tggaatggga 600
cacatatggt tgttataata aaccatttcc attgtcatga gattttgagg ttaatatata 660
ctttacttgt tcattatttt atttggtgtt tgaataaatg atataaatgg ctcttgataa 720
tctgcattca ttgagatatc aaatatttac tctagagaag agtgtcatat agattgatgg 780
tccacaatca atgaaatttt tgggagacga acatgtataa ccatttgctt gaataacctt 840
aattaaaagg tgtgattaaa tgatgtttgt aacatgtagt actaaacatt cataaaacac 900
aaccaaccca agaggtattg agtattcacg gctaaacagg ggcataatgg taatttaaag 960
aatgatatta ttttatgtta aaccctaaca ttggtttcgg attcaacgct ataaataaaa 1020
ccactctcgt tgctgattcc atttatcgtt cttattgacc ctagccgcta cacacttttc 1080
tgcgatatct ctgaggtaag cgttaacgta eccttaratc gttcyttttc yttttcgtct 1140
gctgatcgtt gctcatatta tttcgatgat tgttggattc gatgctcttt gttgattnat 1200
cgttctgaaa attctnatct gttgtttaga ttttatcgat tgttaatatc aacgtttcac 1260
tgcttctaaa cgataattta ttcatgaaac tattttccca ttctgatcga tcttgttttg 1320
agattttaat ttgttcgatt gattgttggt tggtggatct atatacgagt gaacttgttg 1380
atttgcgtat ttaagatgta tgtcgatttg aattgtgatt gggtaattct ggagtagcat 1440
aacaaatcca gtgttccctt tttctaaggg taattctcgg attgtttgct ttatatctct 1500
tgaaattgcc gatttgattg aatttagctc gcttagctca gatgatagag caccacaatt 1560
tttgtggtag aaatcggttt gactccgata gcggcttttt actatgattg ttttgtgtta 1620
aagatgattt tcataatggt tatatatgtc tactgttttt attgattcaa tatttgattg 1680
ttcttttttt tgcag 1695
<210> 29 <211> 1800 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> Sintético <220>
<22ΐ> característica mista
<222> (1068) .. (1069)
<223> y = C0U t/U
<220>
<221> característica mista
<222> (1094) ..(1094)
<223 > y = COU t/u
<400> 29
ggtccgatgt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg 60 cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg 120 ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa 180 agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 240 aaagcaagtg gattgatgtg atggtccgat gtgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg 300 gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa 360 aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg 420 cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag 480 aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatcaag cttccatttt 540 tcttttgcat aattcatgtt tattttttta tttttttcat cttgcataat tcatgtttaa 600 aaggatatat acatgggtct actacattct cctgacatta cgttttatgt gtttgtcttc 660 tgaaaataat catcaaaata tttcaggact tgtttacgtt ttcaggagaa aaaaaataac 720 tgtacccttt tcaatataga aataacattt gtagaaatcg tggattttcc ttaataaaca 780 atccaaaaca cgaccaccgt tgtctcctcg actcggtaac acccgatcgc cgacttgaaa 840 attagaagaa aaatgaaaag aataataaaa aaaaaaaagg aatgatgatt gaagctgtca 900 tatatgtcga ccctatcaca gtcaatccaa tagcctatat tcgccaactg atatatccaa 960 cggctcacaa attttcacaa acttttcaaa aaagtataat aaaagaggct gtctgacagc 1020 catgtcacgt tatacttttt ccgtatgatc gaaatgattc gtctttgyyg aatttaatta 1080 tttccaaaat tgaygactct aaagaaaaaa aaatagtttt tcagataaac ccgcctatat 1140 aaatagttca acactcggtt tatttcttct cccctcaaag aattgcctcg tcgtcttcag 1200 cttcatcggc cgttgcattt cccggcgata agagagagaa agaggagaaa gagtgagcca 1260 gatcttcatc gtcgtggttc ttgtttcttc ctcgatctct cgatcttctg cttttgcttt 1320 tccgattaag gtaattaaaa cctccgatct acttgttctt gtgttggatc tcgattacga 1380 tttctaagtt accttcaaaa gttgtttccg atttgatttt gattggaatt tagatcggtc 1440 aaactattgg aaatttttga tcctggcacc gattagctca acgattcatg tttgacfctga 1500 tcttgcgttg tatttgaaat cgatccggat cctttcgctt cttctgtcaa taggaatctg 1560 aaatttgaaa tgttagttga agtttgactt cagattctgt tgatttattg actgtaacat 1620 tttgtcttcc gatgagtatg gattcgttga aatctgcttt cattatgatt ctattgatag 1680 atacatcata cattgaattg aatctactca tgaatgaaaa gcctggtttg attaagaaag 1740 tgttttcggt tttctcgatc aagattcaga tctttatgtt tttgattgca gatcgtagac 1800
<210> 30
<21Χ> 1742
<2X1> DNA
<2Ι3> Artificial
<220 >
<223 > Sintético
<400> 30
gtccgatgtg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg attccattgc 60 ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc 120 catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa 180 gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca 240 aagcaagtgg attgatgtga tggtccgatg tgagactttt caacaaaggg taatatccgg 300 aaacctcctc ggattccatt gcccagctat ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa 360 ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc 420 ctctgccgac agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga 480 agacgttcca accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gatatcaagc ttcaactatt S40 tttatgtatg caagagtcag catatgtata attgattcag aatcgttttg acgagttcgg 600 atgtagtagt agccattatt taatgtacat actaatcgtg aatagtgata tgatgaaaca 660 ttgtatctta ttgtataaat atccataaac acatcatgaa agacactttc tttcacggtc 720 tgaattaatt atgatacaat tctaatagaa aacgaattaa attacgttga attgtatgaa 780 atctaattga acaagccaac cacgacgacg actaacgttg cctggattga ctcggtttaa 840 gttaaccact aaaaaaacgg agctgtcatg taacacgcgg atcgagcagg tcacagtcat 900 gaagccatca aagcaaaaga actaatccaa gggctgagat gattaattag tttaaaaatt 960 agttaacacg agggaaaagg ctgtctgaca gccaggtcac gttatcttta cctgtggtcg 1020 aaatgattcg tgtctgtcga ttttaattat ttttttgaaa ggccgaaaat aaagttgtaa 1080 gagataaacc cgcctatata aattcatata ttttcctctc cgctttgaat tgtctcgttg 1140 tcctcctcac tttcatcagc cgttttgaat ctccggcgac ttgacagaga agaacaagga 1200 agaagactaa gagagaaagt aagagataat ccaggagatt cattctccgt tttgaatctt 1260 cctcaatctc atcttcttcc gctctttctt tccaaggtaa taggaacttt ctggatctac 1320 tttatttgct ggatctcgat cttgttttct caatttcctt gagatctgga attcgtttaa 1380 tttggatctg tgaacctcca ctaaatcttt tggttttact agaatcgatc taagttgacc 1440 gatcagttag ctcgattata gctaccagaa tttggcttga ccttgatgga gagatccatg 1500 ttcatgttac ctgggaaatg atttgtatat gtgaattgaa atctgaactg ttgaagttag 1560 attgaatctg aacactgtca atgttagatt gaatctgaac actgtttaag ttagatgaag 1620 tttgtgtata gattcttcga aactttagga tttgtagtgt cgtacgttga acagaaagct 1680 atttctgatt caatcagggt ttatttgact gtattgaact ctttttgtgt gtttgcagca 1740 ga 1742 Este anexo apresenta o código de controle da listagem de seqüências biológicas de que trata a Resolução INPl 228 de 11/11/2009:
Código de Controle
Campo 1
C10888C9893DD358
Campo 2 2389A708E6542D6A
Outras Informações:
- Nome do Arquivo: p116565 15106590_1.TXT
- Data de Geração do Código: 29-06-2012
- Hora de Geração do Código: 13:02:45
- Código de Controle:
- Campo 1: C10888C9893DD358
- Campo 2: 2389A708E6542D6A
Gerado pelo Sistema de Listagem de Seqüências Biológicas (SisBioList)

Claims (10)

1. Seqüência de DNA de promotor quimérico, caracterizada pelo fato de compreender a seqüência definida na SEQ ID NO:28.
2. Constructo de DNA, caracterizado pelo fato de que compre- ende: um cassete de expressão compreendendo uma seqüência de DNA de promotor quimérico tal como definida na reivindicação 1, uma seqüência de DNA estrutural e uma região não traduzida 3' que funciona em plantas para causar a adição de nucleotídeos poliadenilados à extremidade 3' da seqüên- cia de RNA; onde o gene estrutural é operacionalmente ligado ao promotor quimérico e à região não traduzida 3'.
3. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 2, caracte- rizado pelo fato de que a seqüência de DNA estrutural é um gene de tole- rância a herbicida.
4. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 3, caracte- rizado pelo fato de que o gene de tolerância a herbicida é um gene de tole- rância a glifosato.
5. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 4, caracte- rizado pelo fato de que o gene de tolerância a glifosato é um gene EPSP sintase ou um gene de glifosato oxidorreductase.
6. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 4, caracte- rizado pelo fato de que o gene de tolerância a glifosato é um gene aroA.CP4.
7. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 2, caracte- rizado pelo fato de que a seqüência de DNA estrutural é um gene de contro- le de inseto.
8. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 7, caracte- rizado pelo fato de que o gene de controle de inseto é derivado de Bacillus thuringienesis.
9. Método de expressar uma seqüência de DNA estrutural em uma planta, caracterizado pelo fato de compreender: (1) fornecer um cons- tructo de DNA tal como definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 8; (2) introduzir o constructo de DNA em uma célula da planta; e (3) regenerar a célula da planta para produzir a planta tal que a seqüência de DNA estrutu- ral possa ser expressada na planta.
10. Método de controlar ervas daninhas, caracterizado pelo fato de que compreende: (1) fornecer uma planta de colheita transformada com um constructo de DNA que compreende um promotor que é funcional em uma célula da planta, o tal como definido em qualquer uma das reivindica- ções 4 a 6; e (2) aplicar à planta de colheita uma quantidade suficiente de glifosato para controlar ervas daninhas sem danificar a planta de colheita.
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