ES2607629T3 - Utilización de un activador de beta-glucosidasa para la detección y/o la identificación de C. Difficile - Google Patents

Abstract

Medio de reacción que comprende al menos un sustrato de beta-glucosidasa y un compuesto de fórmula Ar-beta- D-glucósido en la que Ar- designa un compuesto aromático, diferente de dicho sustrato y seleccionado entre la arbutina o hidroquinona-beta-D-glucopiranósido, el 4-metilimbeliferil-beta-glucósido, el 4-amino-beta-glucósido, la salicina o 2-(hidroximetil)fenil-beta-D-glucósido, a una concentración inferior a 5 g/l.

Description

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DESCRIPCION

Utilizacion de un activador de beta-glucosidasa para la deteccion y/o la identificacion de C. Difficile

La presente invencion se refiere a un procedimiento de deteccion y/o de identificacion de los Clostridium difficile. Se refiere tambien a un medio de reaccion espedfico de Clostridium difficile que comprende un activador de beta- glucosidasa.

Clostridium difficile (C. difficile) es un bacilo Gram positivo, anaerobio estricto, y que forma unas esporas. Es el origen de patologfas intestinales de gravedad variable: diarreas medianas o fulminantes, colitis pseudomembranosas o megacolon toxico, que puede por sf mismo ser la causa de una sepsis. El Clostridium difficile se transmite por ingestion oral de esporas que residen en la acidez del estomago y germinan en el intestino. Un desequilibrio de la flora comensal del colon permite la proliferacion de C. difficile, que produce unas toxinas que son la causa de las colitis. En numerosos casos, el desequilibrio de la flora comensal es el resultado de una toma de antibioticos. El C. difficile puede ser considerado como un microorganismo inofensivo del entorno, que se vuelve patogeno oportunista en condiciones particulares. El transito digestivo asintomatico de C. difficile se estima en un 3% en la poblacion adulta, pero puede alcanzar del 15 al 25% de los sujetos despues de un tratamiento con antibioticos o una estancia en una unidad de alta endemicidad. Se observa habitualmente un porcentaje de transito elevado, del 20 al 40% en pacientes hospitalizados, hasta el 50-70% en los ninos. La posibilidad de un diagnostico precoz y rapido es un elemento clave para la prevencion de las complicaciones severas, y para un tratamiento clmico eficaz.

El diagnostico se basa en la busqueda de las toxinas y en el cultivo.

La puesta en evidencia de las toxinas directamente a partir de las heces es un excelente marcador de la presencia de una cepa toxinogena de C. difficile. El metodo de referencia consiste en buscar un efecto citopatogeno (CTA por “Cytotoxic activity” segun la denominacion anglosajona) mediante cultivo celular. Este metodo es muy sensible pero no esta estandarizado y necesita unos tecnicos especializados y un tiempo de respuesta de varios dfas. Tambien se han desarrollado unos ensayos inmunoenzimaticos de tipo ELISA, que detectan o bien la toxina A sola, o bien las toxinas A y B. Se reduce el tiempo de obtencion de un resultado. Sin embargo, se recomienda asociar las tecnicas inmunologicas utilizadas para la deteccion de las toxinas al cultivo bacteriano para aislar las cepas de C. difficile. Este cultivo puede ser realizado sobre una agar C. difficile comercializado por la solicitante, siendo las colonias de C. difficile despues identificadas por unos metodos bioqmmicos tales como la galena API® 20 A o la galeroa rapid ID 32A. Sin embargo, la identificacion por galena necesita tener un cultivo puro de la bacteria a identificar, en un medio de crecimiento adaptado a fin de obtener suficiente biomasa (3 a 4 Mc Farland) lo que toma, en el mejor de los casos, 48h (cultivo de aislamiento de 24 a 72 horas a partir de la extraccion que da unicamente la deteccion presuntiva, y despues cultivo de 24 a 72 horas para generar suficiente biomasa). La lectura de la galena se efectua despues tras 4h de incubacion para el rapid ID 32 A y 24 a 48h para la galena 20A.

Finalmente, el diagnostico se puede realizar mediante tecnicas de biologfa molecular. No obstante, estas tecnicas no son utilizadas de forma rutinaria en la actualidad.

Para sus trabajos con el objetivo de mejorar la identificacion directa de C. difficile, en un cultivo bacteriano, la solicitante ha puesto en evidencia que la utilizacion de sustrato(s) enzimatico(s) de beta-glucosidasa permite una identificacion facil y rapida de C. difficile. Dicha utilizacion de sustrato de beta-glucosidasa se describe en la solicitud WO 2009/092982 como reduciendo el tiempo de obtencion de un resultado de identificacion de C. difficile.

La identificacion precoz y rapida de C. difficile susceptible de estar presente en una muestra sigue siendo un objetivo prioritario, y la solicitante ha proseguido sus investigaciones buscando mas particularmente acelerar la revelacion de la actividad enzimatica. Ha puesto en evidencia asf, de manera inesperada, que un medio de reaccion que comprende un sustrato de beta-glucosidasa y un activador de beta-glucosidasa de formula general Ar-beta-D- glucopiranosido, en la que Ar- corresponde a un nucleo aromatico o a varios nucleos aromaticos adyacentes, permite una identificacion rapida de C. difficile en una muestra, dicho de otra manera, tal medio permite una deteccion mas precoz de la actividad enzimatica de al menos ciertas cepas de C. difficile. La utilizacion de un compuesto Ar-beta-D-glucosido permite una activacion de la beta-glucosidasa y la observacion de una coloracion significativamente mas intensa de las colonias de C. difficile. Ventajosamente, los compuestos Ar-beta-D-glucosido tienen un poder activador de la beta-glucosidasa de C. difficile muy superior al de los otros derivados beta-D- glucosido tales como celobiosa (4-O-beta-D-glucopiranosil-D-glucosa) o la metil-beta-D-glucosa.

Se conoce que los compuestos de formula general Ar-beta-D-glucosido, en la que Ar- representa al menos un nucleo aromatico, homo- o heterodclico, pueden ser utilizados como sustratos de beta-glucosidasa. Esta utilizacion esta detallada en la solicitud WO 2009/092982 (supra). Asimismo, Hidebrand y Schrotch informan que la arbutina, o hidroquinona beta-D-glucopiranosido, se utiliza como fuente de carbono, a una concentracion del 0,5% peso/volumen, dicho de otra manera de 5 g/l, en combinacion con glucosa, en un medio de reaccion. La hidrolisis de la arbutina en hidroquinona, medida mediante metodos cromatograficos, es un marcador de la actividad beta- glucosidasa de Pseudomonas syringae ((Hildebrand y Schroth, Applied Microbiology, 1964; 12 (6): 487-491). Esto disuade al experto en la materia de utilizar un compuesto Ar-beta-D-glucosido como activador de la beta-glucosidasa

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en un medio de reaccion para la deteccion o la identificacion de C. difficile, ya que se encontrana en competencia con el sustrato destinado a revelar la actividad enzimatica del microorganismo diana.

Finalmente, la tecnica anterior informa que la arbutina administrada por v^a oral se excreta y metaboliza en las orinas y puede, para ello, ser utilizada por sus propiedades diureticas y antibacterianas (Schindler et al., 2002; J . Clin. Pharmacol.; 42 (8): 920-927; Siegers et al., 2003, Phytomedicine; 10 (Suppl 4):58-60). Tal utilizacion disuade tambien de la utilizacion de la arbutina en un medio de reaccion para detectar una bacteria.

Antes de una descripcion detallada de la invencion, se dan las definiciones siguientes para permitir comprender mejor la invencion. No son de ninguna manera limitativas.

Por medio de reaccion, se entiende un medio que comprende todos los elementos necesarios para la expresion de un metabolismo y/o el crecimiento de microorganismos. El medio de reaccion puede ser solido, semisolido o ftquido. Por medio solido, se entiende por ejemplo un medio gelificado. El agar es el agente gelificante tradicional en microbiologfa para el cultivo de los microorganismos, pero es posible utilizar gelatina, agarosa u otros gelificantes naturales o artificiales. Un cierto numero de preparaciones estan disponibles en el comercio, como por ejemplo el agar Columbia, la gelosa Trypcase-soja, la gelosa Mac Conkey, la gelosa Sabouraud o mas generalmente las descritas en el Handbook of Microbiological Media (CRC Press). El medio de reaccion segun la invencion debe permitir el crecimiento de las C. difficile.

El medio de reaccion puede comprender uno o varios elementos en combinacion, tales como unos aminoacidos, unas peptonas, unos hidratos de carbono, unos nucleotidos, unos minerales, unas vitaminas, etc. El medio puede comprender tambien un colorante. A tftulo indicativo, se puede citar como colorante el azul de Evans, el rojo neutro, la sangre de oveja, la sangre de caballo, un opacificante tal como el oxido de titanio, la nitroanalina, el verde malaquita, el verde brillante, uno o barios indicadores metabolicos, uno o varios reguladores metabolicos, etc.

El medio de reaccion puede ser un medio de revelacion o un medio de cultivo y de revelacion. En el primer caso, el cultivo de los microorganismos se efectua antes de la inoculacion y, en el segundo caso, el medio de deteccion y/o de identificacion constituye tambien el medio de cultivo.

El experto en la materia puede tambien utilizar una bi-caja, que permite comparar facilmente dos medios, que comprende diferentes sustratos o diferentes mezclas selectivas, en los cuales se ha depositado una misma muestra biologica.

El medio de reaccion puede comprender uno o varios activadores de crecimiento de las cepas de C. difficile. Por activador de crecimiento, se entiende un compuesto o un grupo de compuestos que estimula el crecimiento de microorganismos. Se puede citar en particular la sangre, el suero, las yemas de huevos. Sin ser limitativa, una concentracion comprendida entre 0,1 y 10% es particularmente adecuada para la presente invencion.

El medio de reaccion puede comprender uno o varios agentes reductores. Por agente reductor, se entiende un compuesto o un grupo de compuestos que facilita el crecimiento de los germenes anaerobicos neutralizando el oxfgeno disuelto presente en el medio. Se puede citar en particular la cistema, el piruvato, la oxirasa, el sulfito de sodio, la ditionita, la histidina, el sulfuro ferroso. Sin ser limitativa, una concentracion comprendida entre 0,05 y 50 g/l, preferiblemente entre 0,1 y 2 g/l es particularmente adecuada para la presente invencion.

El medio de reaccion puede comprender uno o varios inductores de la germinacion de las esporas de C. difficile. Por inductor de la germinacion de las esporas, se entiende un compuesto o un grupo de compuestos que favorece el paso del estado de espora al estado vegetativo de las C. difficile. Se puede citar asimismo el taurocolato de sodio.

Sin ser limitativa, una concentracion comprendida entre 0,1 y 10 g/l, preferiblemente entre 1 y 5 g/l es particularmente adecuada para la presente invencion.

El medio de reaccion puede comprender uno o varios agentes selectivos. Por agente selectivo, se entiende cualquier compuesto susceptible de impedir o ralentizar el crecimiento de un microorganismo diferente del microorganismo diana. Sin ser limitativa, una concentracion comprendida entre 5 mg/l y 5 g/l es particularmente adecuada para la presente invencion.

Se puede citar como agente selectivo, los antibioticos, los antifungicos. Por antibiotico, se entiende cualquier compuesto susceptible de impedir o ralentizar el crecimiento de una bacteria. Pertenecen en particular a los grupos de las cefaloesporinas, de los aminosidos, de los polipeptidos, de las sulfamidas, de las quinolonas. A tftulo indicativo, se pueden citar en particular los antibioticos cefotaxima, ceftazidima, cefoxitina, ceftriaxona, cefpodoxima, aztreonam, gentamicina, trimetoprima, tobramicina, moxalactam, fosfomicina, D-cicloserina, polimixina, colistina, las quinolonas tales como el acido nalidfxico.

Por antifungico, se entiende cualquier compuesto susceptible de impedir o ralentizar el crecimiento de una levadura o de un moho. A tftulo indicativo, se puede citar en particular la amfotericina B, el fluconazol, el itraconazol, el

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voriconazol, la cicloheximida.

De manera general, el medio de reaccion puede ademas contener un sustrato que permite la deteccion de una actividad enzimatica o metabolica de los microorganismos diana gracias a una senal detectable directa o indirectamente. Para una deteccion directa, este sustrato puede estar unido a una parte que actua como marcador, fluorescente o cromogeno. Para una deteccion indirecta, el medio de reaccion segun la invencion puede comprender ademas un indicador de pH, sensible a la variacion de pH inducida por el consumo del sustrato y que revela el crecimiento de los microorganismos diana. Dicho indicador de pH puede ser un cromoforo o un fluoroforo. Se citaran como ejemplos de cromoforos el rojo neutro, el azul de anilina, el azul de bromocresol. Los fluoroforos comprenden por ejemplo la 4-metilumbeliferona, los derivados del hidroxicumarina o los derivados de la resorufina.

Por sustrato de beta-glucosidasa, apto para la identificacion de C. difficile, se entiende un sustrato que induce, en condiciones de crecimiento adecuadas, la coloracion de C. difficile. Se entiende en particular el 2-hidroxifenil-beta- glucosido (Catecol-beta-glucosido); Magenta-beta glucosido (5 Bromo-6 cloro-3 indoxil-beta glucosido); DHF-beta glucosido (Dihidroxiflavona-beta glucosido); la Esculina (Esculetin-beta glucosido); CHE-beta glucosido (3,4 Ciclohexenoesculetin-beta glucosido); 8 Hidroxiquinolin-beta glucosido; X-beta glucosido (5 Bromo-4 cloro-3 indoxil- beta glucosido); Rose-beta glucosido (6 Cloro-3 indoxil-beta glucosido); 6 Bromo-3 indoxil-beta glucosido; Blue-beta glucosido (5 Bromo-3 indoxil-b glucosido); 6 Fluoro-3 indoxil-beta glucosido; Alizarin-beta glucosido; (P) Nitrofenil- beta glucosido; 4 Metilumbelliferil-beta glucosido, Naftolbenzein-beta glucosido, Indoxil-N metil-beta glucosido, 5 Bromo-4 cloro-3 indoxil-N metil-beta glucosido, el Naftil-beta glucosido; el Aminofenil-beta glucosido; el Dicloroaminofenil-beta glucosido, Aldol™-beta-glucosido (BIOSYNTH, Lukas M. Wick, Alexander Bayer, Christophe Weymuth, Gunter Schabert, Vanessa Pfister, Aysel Aslan, Urs P. Spitz, « Novel Chromogenic Enzyme Substrates », AsM General Meeting, 2009, Philadelphia, I-091/285).

El medio de reaccion puede comprender ademas un activador enzimatico. Por activador enzimatico, se entiende un compuesto que sirve para activar el proceso de digestion enzimatica, dicho de otra manera, reducir el tiempo de incubacion para revelar la actividad enzimatica y/o incrementar dicha actividad enzimatica.

Los activadores de beta-glucosidasa pueden tener por formula general Ar-beta-D-glucosido, en la que Ar- representa un nucleo aromatico. Por nucleo aromatico, se entiende un compuesto insaturado, es decir que presenta dobles enlaces y que comprende uno o varios anillos adyacentes, homo- o heteroatomicos, teniendo cada anillo de 5 a 7 vertices. De manera no limitativa, se citara la arbutina (hidroquinona-beta-D-glucosido), la 4-metilumbelliferil-beta- glucosido, el 4 aminofenil-beta-glucosido, la salicina (2-(hidroximetil)-fenil-beta-D-glucosido), la esculina (6,7- dihidroxi-cumarin-beta-glucosido). Algunos de estos compuestos son unos sustratos de la beta-glucosidasa. A tttulo de la invencion, son considerados como unos activadores ya que permiten reducir el tiempo de incubacion necesario para la deteccion de la hidrolisis del compuesto utilizado como sustrato, o permiten incrementar esta hidrolisis. Asf, de manera sorprendente, la combinacion de un sustrato enzimatico y de tal activador permite obtener una deteccion mas precoz y/o mas intensa de la actividad enzimatica que cuando estos compuestos se utilizan por separado.

El poder activador de un compuesto puede ser puesto en evidencia en particular para ciertas cepas de C. difficile que tiene una actividad beta-glucosidasa tardfa y/o debl, si la combinacion de dicho compuesto y del sustrato permite una deteccion mas precoz y/o mas intensa que si el sustrato o si el activador se utilizaba solo o con una molaridad al menos equivalente a la suma de las molaridades del sustrato y del activador en combinacion.

Por muestra biologica, se entiende una pequena parte o pequena cantidad aislada de una entidad para el analisis. Puede ser una muestra clmica, procedente de una extraccion de lfquido biologico o una muestra alimenticia, procedente de cualquier alimento. Esta muestra puede asf ser lfquida o solida. Se puede citar de manera no limitativa, una muestra clmica de sangre total, suero, plasma, orinas, heces, extracciones de nariz, gargantas, piel, heridas, lfquido cefalorraqrndeo, una muestra alimenticia de agua, bebidas tales como leche, zumo de frutas, yogur, carne, huevos, verduras, mahonesa, queso, pescado, etc., una muestra alimenticia procedente de una alimentacion destinada a los animales, tales como en particular una muestra procedente de harinas animales. Esta extraccion se puede utilizar tal cual o previamente al analisis, sufrir una preparacion de tipo enriquecimiento, extraccion, concentracion, purificacion, segun unos metodos conocidos por el experto en la materia.

Despues de haberlo puesto en contacto con la muestra, el medio de reaccion se incuba a una temperatura apropiada, generalmente comprendida entre 20 y 50°C, preferiblemente entere 30 y 40°C. De manera preferida, la incubacion se efectua anaerobicamente, dicho de otra manera, en ausencia de oxfgeno, segun las tecnicas conocidas por el experto en la materia.

Por lo tanto, la invencion se refiere a un medio de reaccion que comprende al menos un sustrato de beta- glucosidasa, y un compuesto de formula general Ar-beta-D-glucosidasa, en la que Ar- designa un compuesto aromatico, diferente de dicho sustrato, y se selecciona entre la arbutina o la hidroquinona-beta-D-glucopiranosido, el 4-metilimbelliferil-bta-glucosido, el 4-aminofenil-beta-glucosido, la salicina o 2-(hidroximetil)fenil-beta-D-glucosido, a una concentracion inferior a 5 g/l.

Preferiblemente, el compuesto Ar-beta-D-glucosido esta a una concentracion comprendida entre 0,3 y 1,5 g/l.

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De manera preferida, el compuesto Ar-beta-D-glucosido es la arbutina.

Segun un modo preferido de realizacion de la invencion, el sustrato de beta-glucosidasa se selecciona entre la Alizarina-beta-glucosido, el Magenta-beta-glucosido (5-Bromo-6-cloro-3-indoxil-beta-glucosido), el DHF-beta- glucosido, el 3HF-beta-glucosido, el CHE-beta-glucosido (3,4-Ciclohexenoesculetina-beta-glucosido) y los ALDOL™- beta-glucosido de la comparua BIOSYNTH (Wick et al. 2009. ASM General meeting - Philadelphia (PA, USA)). Dicho sustrato de beta-glucosidasa esta a una concentracion comprendida entre 25 y 1000 mg/l, preferiblemente entre 50 y 400 mg/l.

Segun la invencion, el activador enzimatico es un sustrato enzimatico cuyo producto de hidrolisis es diferente del producto de la hidrolisis del sustrato enzimatico.

Segun un modo preferido de realizacion de la invencion, el activador enzimatico es un sustrato enzimatico cuyo producto no es detectable a simple vista en el medio de reaccion, mientras que el producto de la hidrolisis del sustrato enzimatico sf lo es.

Segun otro modo preferido de realizacion de la invencion, el medio de reaccion comprende ademas un activador de la germinacion de las esporas de C. difficile, siendo dicho activador preferiblemente el taurocolato de sodio, a una concentracion comprendida entre 0,1 y 10,0 g/l, preferiblemente comprendida entre 1,0 y 5,0 g/l.

La invencion se refiere tambien a un procedimiento de deteccion y/o de identificacion de C. difficile que comprende las etapas que consisten en:

a) poner en contacto una muestra susceptible de contener C. difficile con un medio de reaccion que comprende al menos un sustrato de beta-glucosidasa y un compuesto de formula general Ar-beta-D-glucosido, diferente de dicho sustrato, en la que Ar- designa un compuesto aromatico, seleccionado entre la arbutina o hidroquinona-beta-D- glucopiranosido, el 4-metilumbelliferil-beta-glucosido, el 4-aminofenil-beta-glucosido, la salicina o 2- (hidroximetil)fenil-beta-D-glucosido, a una concentracion inferior a 5 g/l;

b) incubar, y

c) detectar la hidrolisis del sustrato de beta-glucosidasa, que indica la presencia de C. difficile.

Segun un modo preferido de realizacion, el procedimiento segun la invencion utiliza en la etapa a) un medio tal como se ha definido anteriormente.

Segun otro modo preferido de realizacion, la incubacion realizada en la etapa b) del procedimiento segun la invencion se realiza en anaerobiosis.

Los ejemplos siguientes son dados a tttulo explicativo y no tienen ningun caracter limitativo. Permitiran comprender mejor la invencion.

Ejemplo 1: puesta en evidencia del efecto activador de la arbutina sobre un sustrato de beta-glucosidasa

1. Medio y microorganismos

Se han ensayado ocho cepas de Clostridium difficile, de la coleccion de la solicitante, sobre unos medios que comprenden arbutina a diferentes concentraciones en presencia o no de CHE-beta-glucosido. La lectura de las cajas se efectua despues a 24h. Los medios se componen de la siguiente manera:

Base CromID® C. difficile comun a todos los medios:

Compuestos

Conc. en g/l

Peptona, extractos tisulares y celulares

12,5

Cloruro de sodio

6

Sulfato de magnesio

0,3

L-arginina

1

Bisulfito de sodio

0,1

agar

13

Citrato de hierro amoniacal

0,3

Glucosa

0,2

TRIS

0,1

Taurocolato de sodio

2,5

5

10

15

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Despues se anade arbutina y/o CHE-beta-glucosido segun los medios:

Concentracion en g/l

Medio T1 medio A1 medio A2 medio A3 medio T2 medio B1 medio B2 medio B3

CHE-b-glucosido

0 0 0 0 0,3 0,3 0,3 0,3

Arbutina g/l

0 0,1 0,3 1 0 0,1 0,3 1

Las referencias y los ribotipos respectivos de las cepas ensayadas se indican en la tabla siguiente:

n° de cepas

Ribotipo

06 03 006

O27

08 01 092

O27

08 01 104

O27

08 01 109

O27

08 01 112

O103

08 01 113

O27

08 01 116

O27

08 01 118

O27

2. Ensayo

Los medios se distribuyen en cajas de Petri.

La inoculacion se efectua a partir de pre-cultivos de 48h a 37°C en anaerobiosis.

Se realiza una suspension en agua fisiologica a 0,5 McF, despues las cepas son inoculadas a lazo calibrado de 10 |il.

Se efectuan unas lecturas despues de 24h de incubacion a 37°C en anaerobiosis.

3. Resultados

Escala de lectura de la actividad enzimatica/coloracion

* 0 = ninguna actividad

* 0,5 = coloracion muy palida

* 1 = coloracion clara de baja intensidad

* 2 = coloracion pura de intensidad media,

* 3 = presencia de una coloracion intensa,

* 4 = presencia de una coloracion muy intensa.

La coloracion obtenida con este sustrato es gris hasta una intensidad de 1 y negra para los otros valores

T1 A1 A2 A3 T2 B1 B2 B3

Clostridium difficile 109

24h 0 0 0 0 1 1 4 4

Clostridium difficile 104

24h 0 0 0 0 0,5 1 4 4

Clostridium difficile 092

24h 0 0 0 0 0 1 4 4

Clostridium difficile 006 (ATCC 027)

24h 0 0 0 0 1 1 4 4

Clostridium difficile 116

24h 0 0 0 0 1 1 4 4

Clostridium difficile 118

24h 0 0 0 0 0,5 1 3 4

Clostridium difficile 113

24h 0 0 0 0 1 1 4 4

Clostridium difficile 112

24h 0 0 0 0 0 4 4 4

Asf, despues de 24h de incubacion, se obtiene: en numero de cepas coloreadas en negro sobre los diferentes medios:

T1 A1 A2 A3 T2 B1 B2 B3

Intensidad de coloracion >= 1

0/8 0/8 0/8 0/8 4/8 8/8 8/8 8/8

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4. Interpretacion

En ausencia de sustrato, no se observa ninguna coloracion.

La arbutina sola no permite tampoco obtener una coloracion de las colonias.

Por el contrario, a partir de la adicion de arbutina en presencia de CHE-beta-glucosido, se observa una activacion de la beta-glucosidasa que se traduce por una intensificacion de la coloracion (gris a negro).

5. Conclusion

La arbutina actua como activador de beta-glucosidasa sobre las cepas de Clostridium difficil.

Ejemplo 2: ensayo de una concentracion optima en arbutina sobre diferentes cepas de C. difficile

1. Medio y microorganismos

Se han ensayado veinte y cuatro cepas de Clostridium difficile, de la coleccion de la solicitante, sobre 5 medios que comprenden cada uno una concentracion diferente en arbutina. La lectura de las cajas se efectua despues a 24h.

Los medios utilizados se preparan a partir del medio CromID® C. difficile indicado anteriormente, para el ejemplo 1, al que se anaden respectivamente cefotaxima a 0,016 g/l, fungizona a 0,005 g/l y D-cicloserina a 0,25 g/l (concentraciones finales), y arbutina segun la tabla siguiente:

medio 1 medio 2 medio 3 medio 4 medio 5

Arbutina g/l

0 0,75 1 1,25 1,5

Las referencias y los ribotipos respectivos de las cepas ensayadas se indican en la tabla siguiente:

n° de cepas

Ribotipo

02 01 042

ND

02 01 043

ND

02 06 146

ND

02 06 148

ND

06 03 006

027

08 01 078

027

08 01 080

O27

08 01 084

O27

08 01 088

010

08 01 092

027

08 01 094

078

08 01 095

027

08 01 096

027

08 01 098

027

08 01 100

027

08 01 102

001

08 01 103

014

08 01 104

027

08 01 109

027

08 01 111

027

08 01 113

027

08 01 114

002

08 01 116

027

08 01 118

027

ND = no determinado

2. Ensayos

Los medios se distribyen en cajas de Petri.

La inoculacion se efectua a partir de pre-cultivos de 48h a 37°C en anaerobiosis.

Se realiza una suspension en agua fisiologica a 0,5 McF, despues se inoculan las cepas con lazo calibrado de 10 |il.

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Se efectuan unas lecturas despues de 24h de incubacion en anaerobiosis.

3. Resultados

Escala de lectura de la actividad enzimatica/coloracion

* 0 = ninguna actividad

* 0,5 = coloracion muy palida

* 1 = coloracion clara de baja intensidad

* 2 = coloracion pura de intensidad media,

* 3 = presencia de una coloracion intensa,

* 4 = presencia de una coloracion muy intensa.

La coloracion obtenida con este sustrato es gris hasta una intensidad de 1 y negra para los otros valores.

Los resultados observados aqrn, en los diferentes medios, se obtuvieron despues de 24h de incubacion a 37°C en anaerobiosis.

M1 M2 M3 M4 M5

Clostridium difficile 42

3 2,5 2,5 2,5 2,5

Clostridium difficile 43

3 3 3 3 3

Clostridium difficile 146

0 2 2 1,5 1,5

Clostridium difficile 148

3 3 3 3 3

Clostridium difficile 6

0,75 3 3 3 3

Clostridium difficile 78

3 3 3 3 3

Clostridium difficile 80

0,75 1,5 3 3 2,5

Clostridium difficile 84

2 2 2 2 2

Clostridium difficile 88

4 4 4 4 4

Clostridium difficile 92

0 3 3 2,75 2,75

Clostridium difficile 94

3 3 3 3 2,75

Clostridium difficile 95

0,5 3 3 2,5 1

Clostridium difficile 96

1 2,5 3 3 3

Clostridium difficile 98

0,75 3 3 3 3

Clostridium difficile 100

0,5 3 3 3 2,75

Clostridium difficile 102

3 3 3 3 3

Clostridium difficile 103

3 4 4 4 4

Clostridium difficile 104

0,1 2,5 3 3 3

Clostridium difficile 109

0,1 3 3 3 3

Clostridium difficile 111

0 2,5 2,5 2,5 3

Clostridium difficile 113

0 2,5 3 3 3

Clostridium difficile 114

3 3 3 2,5 2,5

Clostridium difficile 116

0 2,5 2,5 2,5 2,5

Clostridium difficile 118

0 2,5 2,5 2,5 2,5

Asf, despues de 24h de incubacion, se obtiene, en numero de cepas coloreadas en negro, en los diferentes medios:

Medio 1 Medio 2 Medio 3 Medio 4 Medio 5

Coloracion >= 1

12/24 de los cuales 0/15 O27 24/24 de los cuales 15/15 O27 24/24 de los cuales 15/15 O27 24/24 de los cuales 15/15 O27 24/24 de los cuales 15/15 O27

4. Interpretacion

A partir de la adicion de arbutina en el medio, la coloracion esta claramente mejorada. A 24h, en el medio sin arbutina, solamente 12 cepas de 24 presentan una coloracion superior o igual a 1, mientras que en presencia de 750 mg/l de arbutina, 24 cepas/24 son coloreadas con una intensidad minima de 1.

Las cepas que presentan ya una fuerte coloracion en el control no parecen o estan poco impactadas por la presencia de arbutina si no se supera 1 g/l. Mas alla, se observa para algunas cepas una ligera disminucion de la intensidad de coloracion.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

5. Conclusion:

La arbutina actua aqu como un activador de beta-glucosidasa y su accion parece significativa para la deteccion precoz de los Clostridium difficile y en particular para el ribotipo o27.

Ejemplo 3: ensayo del efecto activador de la arbutina sobre diferentes sustratos de beta-glucosidasa

1. Medio y microorganismos

Las ocho cepas de Clostridium difficile ensayadas en el ejemplo 1 se ensayaron sobre unos medios que comprenden DHF-beta-glucosido (medio A), alizarina-beta-glucosido (medio B) o 3HF-beta-glucosido (medio C) y una concentracion creciente en arbutina.

La lectura de las cajas se efectua despues a 24h y 48h.

Los medios utilizados son preparados en base al medio cromID® C. difficile indicado anteriormente, para el ejemplo 1, al que se anade arbutina segun la tabla siguiente:

Medio T Medio 1 medio 2 medio 3

Arbutina g/l

0 0,250 0,5 1

En funcion de los sustratos, los medios son por lo tanto los siguientes:

* DHF- beta-glucosido a 400 mg/l (medios TA, 1A, 2A y 3A)

* Alizarina-beta-glucosido a 50 mg/l (medios TB, 1 B, 2B y 3B)

* 3HF-beta-glucosido a 300 mg/l (medios TC, 1C, 2C y 3C)

2. Ensayos

Los medios se distribuyen en cajas de Petri.

La inoculacion se efectua a partir de precultivos de 48h a 37°C en anaerobiosis.

Se realiza una suspension en agua fisiologica a 0,5 McF, despues se inoculan las cepas con lazo calibrado de 10 |il. Se efectuan unas lecturas despues de 24h y 48h de incubacion a 37°C y en anaerobiosis.

3. Resultados

Escala de lectura de la actividad enzimatica/coloracion

* 0 = ninguna actividad

* 0,5 = coloracion muy palida

* 1 = coloracion clara de baja intensidad

* 2 = coloracion pura de intensidad media,

* 3 = presencia de una coloracion intensa,

* 4 = presencia de una coloracion muy intensa.

Color de las colonias:

Medio A: Marron Medio B: malva Medio C: Marron

5

10

15

20

25

30

35

40

45

DHF-b-glucosido Alizarina-b-glucosido 3HF-b-glucosido

TA

1A 2A 3A TB 1B 2B 3B TC 1C 2C 3C

Clostridium difficile 6

24h 2 2,5 3 3,5 0,5 1 1 0,75 0 0 0 0

48h

2,5 2,5 3 3,5 0,5 1,5 1,5 1,5 0,5 0,5 1 1,5

Clostridium difficile 92

24h 2 2 3 3,5 0,5 1 1 0,75 0 0 0 0

48h

2,5 2,5 3 3,5 0,5 1,5 1,5 1,5 0,5 1 1,5 1,5

Clostridium difficile 104

24h 2 2,5 3 4 0,5 1 1 0,75 0,5 0,5 0,5 0,5

48h

2,5 2,5 3 4 0,5 1,5 1,5 1,5 1 1 1,5 2

Clostridium difficile 109

24h 2 2,5 3 4 0,5 1 1 1 0 0 0 0

48h

2,5 3 3 4 0,5 1,5 1 1 1 1,5 1,5 1,5

Clostridium difficile 112

24h 2 2 2 2 1 1 1 1 0 0 0 0

48h

3 3 3 2,5 1,5 1,5 1,5 1,5 0 1 1,5 1,5

Clostridium difficile 113

24h 2 2 2 2,5 1 1 1 1 0 0 0 0

48h

2,5 2,5 3 3 1 2 2 1,5 1 1 1,5 2

Clostridium difficile 116

24h 2 2 2 2,5 1 1,25 1,25 1 0,1 0,1 0,1 0,1

48h

2,5 2,5 2,5 3 1 1,5 1 1 0,5 1,5 1,5 1,5

Clostridium difficile 118

24h 2 2 2 3 1 1,5 1,5 1 0 0 0 0

48h

2,5 2,5 3 3 1,5 2 2 1,5 0,5 1 1,5 1,5

4. Interpretacion

En presencia de arbutina, se observa una mejora de la intensidad de coloracion, sea cual sea el sustrato utilizado. Esta mejora es sobretodo visible durante la utilizacion de DHF-p-glucosido, a partir de 24h y esencialmente en presencia de 1 g/l de arbutina. Para la alizarina-beta-glucosido, la mejora es menos clara a 24h, pero se marca mas a 48h sobre todos los medios que contienen arbutina. Finalmente, para el 3HF-beta-glucosido la aportacion de este compuesto es visible solo a 48h, pero se observa una activacion real de la actividad beta-glucosidasa, sea cual sea la concentracion utilizada y sean cuales sean las cepas.

Sin embargo, la concentracion ideal vana segun el sustrato utilizado y sena proxima a 1 g/l con el DHF-beta- glucosido y el 3HF-beta-glucosido y de 500 mg/l con la alizarina-beta-glucosido.

5. Conclusion

Este ensayo demuestra el interes de la arbutina para la activacion de la actividad beta-glucosidasa en las cepas de Clostridium difficile.

Ejemplo 4: ensayo del efecto activador de los compuestos Ar-beta-glucosido sobre la actividad beta-glucosidasa.

1. Medio y microorganismos

Se han ensayado seis cepas de Clostridium difficile sobre unos medios que comprenden un compuesto que podna actuar como activador de la beta-glucosidasa en estas cepas. Los ribotipos de estas cepas se indican en las tablas supra. El de la cepa referenciada 08 01 091 es 056. Los compuestos ensayados como activadores de beta- glucosidasa son los siguientes:

* arbutina;

* O-metil-b-glucosido;

* Celobiosa;

* Salicina;

* 4-aminofenil-b-glucosido;

* 4-metil-umbeliferona-b-glucosido;

* esculina.

Se han ensayado a concentraciones que permiten obtener la misma molaridad para cada uno de los compuestos.

Los medios utilizados se preparan en base al medio chomID® C. difficile indicado anteriormente para el ejemplo 1, al cual se anade el sustrato CHE-beta-glucosido a 0,3 g/l y, respectivamente, uno de los compuestos segun la tabla siguiente:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Arbutina O-metil-b-Glu Celobiosa Salicina 4AminoPhe 4MU-b-glu esculina

T

- - - - -

M1

1 g/l - - - -

M2

- 0,7 g/l - - -

M3

- - 1,25 g/l - -

M4

- - - 1 g/l -

M5

- - - - 1 g/l

M6

1,25 g/l

M7

1,25 g/l

2. Ensayos

Los medios son repartidos en cajas de Petri.

La inoculacion se efectua a partir de precultivos de 48h a 37°C en anaerobiosis.

Se realiza una suspension en agua fisiologica a 0,5 McF, despues se inoculan las cepas con lazo calibrado de 10 |il. Se efectuan unas lecturas despues de 24h de incubacion a 37°C y en anaerobiosis.

3. Resultados

Escala de lectura de la actividad enzimatica/coloracion

* 0 = ninguna actividad

* 0,5 = coloracion muy palida

* 1 = coloracion clara de baja intensidad

* 2 = coloracion pura de intensidad media,

* 3 = presencia de una coloracion intensa,

* 4 = presencia de una coloracion muy intensa.

La coloracion obtenida con este sustrato es gris hasta una intensidad de 1 y negra para los otros valores.

T M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7

Clostridium difficile 91

4 4 0 4 4 4 4 4

Clostridium difficile 94

0.5 3 0 0,5 4 4 3 3

Clostridium difficile* 6

4/1 4 0 4/1 4 4 3 3/1

Clostridium difficile 111

0,5 4 0 0 4 3 3 3

Clostridium difficile 112

0 4 0 0 4 4 4 4

Clostridium difficile 116

0,5 3 0 0,5 4 4 3 3

* = cepa que presenta unas colonias de colores heterogeneas; los resultados indicados en forma de fraccion x/y significan que algunas cepas presentan una intensidad x y otras presentan una intensidad y.

4. Interpretacion

El O-metil-beta-glucosido y la celobiosa no tienen efecto activador sobre la beta-glucosidasa de las Clostridium difficile. Por el contrario, se observa una disminucion de la coloracion sobre las cepas que presentan una cloracion sobre el control.

Por el contrario, como para la arbutina, se observa la activacion de la beta-glucosidasa y por lo tanto un aumento de la coloracion de las colonias en presencia de salicina, de 4-aminofenil-beta-glucosido, de 4-metil-umbeliferona o de esculina. Se observa tambien una homogeneizacion de la coloracion para las cepas heterogeneas, en presencia de uno de estos compuestos. Para el medio que contiene esculina, se observa una fuerte difusion de la coloracion negra en la gelosa, haciendo a veces diffcil la lectura del medio.

5. Conclusion:

Este ensayo demuestra el efecto activador de la beta-glucosidasa de C. difficile por unos compuestos que poseen al menos un anillo aromatico tales como la arbutina, la salicina, el 4-aminofenil-beta-glucosido, la 4-metil-umbeliferona

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

o la esculina.

Ejemplo 5: ensayo de 2 sustratos de beta-glucosidasa a base de ALDOLTM (ALDOLTM 455-beta-glucosido y ALDOLtm 484-beta-glucosido - BIOSYNTH)

1. Medio y microorganismos

Se han ensayado ochos cepas de Clostridium difficile sobre 4 medios diferentes, respectivamente un medio control de crecimiento (T), un medio (1) que contiene 75mg/l de ALDOL™ 455-beta-glucosido, un medio (2) que contiene 75mg/l de ALDOL™ 484-beta-glucosido, y un medio (3) que contiene CHE-b-glucosido a razon de 300mg/l y citrato de hierro amoniacal (300mg/l).

La composicion de la base nutritiva comun a todos los medios se indica a continuacion. Se trata de la base chromlD® C. difficile libre de citrato de hierro amoniacal pero suplementada con 1 g/l de arbutina.

Compuestos

Conc. en g/l

Extractos tisulares y celulares

12,5

Cloruro de sodio

6

Sulfato de magnesio

0,3

L-arginina

1

Bisulfito de sodio

0,1

Agar

13

Arbutina

1

Glucosa

0,2

TRIS

0,1

Taurocolato de sodio

2,5

Despues de la fundicion de los agares, la base se separa en 4*80 ml, repartidos en los frascos T, 1, 2 y 3. En el frasco 3, se habran pesado previamente 300 mg/l de CHE-beta-glucosido y 300 mg/l de citrato de hierro amoniacal. Un ciclo de autoclave permite esterilizar los medios. Despues del retorno de los medios en sobrefusion, los sustratos a base de ALDOL™ se anaden en aditivos, solubilizados en un disolvente de tipo DMSO (dimetilsulfoxido) a partir de una solucion madre concentrada.

2. Ensayos

Los medios se distribuyen en cajas de Petri.

Se efectua la inoculacion a partir de pre-cultivos de 48h a 37°C en anaerobiosis.

Se realiza una suspension en agua fisiologica a 0,5 McF, despues las cepas son inoculadas con lazo calibrado de 10 |il segun el metodo de las 3 esferas.

Se efectuan unas lecturas despues de 24h de incubacion a 37°C y en anaerobiosis. Los resultados se consignan a continuacion.

3. Resultados

Tras la hidrolisis enzimatica de los diversos sustratos por las cepas de C. difficile, las coloraciones de las colonias aisladas obtenidas sobre los medios 1,2 y 3 son respectivamente amarillo, naranja y marron.

Escala de lectura de la expresion de la actividad enzimatica (intensidades de coloracion)

* 0 = ninguna actividad

* 0,5 = coloracion muy palida

* 1 = coloracion clara de baja intensidad

* 2 = coloracion pura de intensidad media,

* 3 = presencia de una coloracion intensa,

* 4 = presencia de una coloracion muy intensa.

T 1 2 3

Clostridium difficile 0801108

24h 0 3 4 2

Clostridium difficile 0801105

24h 0 3 3 4

Clostridium difficile 0801088

24h 0 3 4 4

Clostridium difficile 0801091

24h 0 3 4 3

Clostridium difficile 0801094

24h 0 3 3 3

Clostridium difficile 0603006

24h 0 2 3 2

Clostridium difficile 0801112

24h 0 3 3 4

Clostridium difficile 0801116

24h 0 3 3 4

4. Interpretacion 5

Los sustratos ALDOL™ 455-beta-glucosido y ALDOL™484-beta-glucosido (BIOSYNTH) permiten una excelente deteccion de C. difficile. Las intensidades de coloraciones (amarillo y naranja respectivamente) obtenidas son elevadas a partir de 24h de incubacion. Los rendimientos obtenidos con estos dos sustratos son sustancialmente identicos a los obtenidos con CHE-beta-glucosido.

10

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Medio de reaccion que comprende al menos un sustrato de beta-glucosidasa y un compuesto de formula Ar-beta- D-glucosido en la que Ar- designa un compuesto aromatico, diferente de dicho sustrato y seleccionado entre la arbutina o hidroquinona-beta-D-glucopiranosido, el 4-metilimbeliferil-beta-glucosido, el 4-amino-beta-glucosido, la salicina o 2-(hidroximetil)fenil-beta-D-glucosido, a una concentracion inferior a 5 g/l.
2. 2. Medio de reaccion segun la reivindicacion 1, en el que el compuesto Ar-beta-D-glucosido esta a una concentracion comprendida entre 0,3 y 1,5 g/l.
3. 3. Medio de reaccion segun una de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el compuesto Ar-beta-D-glucosido es la arbutina.
4. 4. Medio de reaccion segun una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el sustrato de beta-glucosidasa se selecciona entre el Alizarina-beta-glucosido, el Magenta-beta-glucosido (5-Bromo-6-cloro-3-indoxil-beta-glucosido), el DHF-beta-glucosido, el 3HF-beta-glucosido y el CHE-beta-glucosido (3,4-Ciclohexenoescuietina-beta-glucosido) y los ALDOL™ beta-glucosido.
5. 5. Medio de reaccion segun una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el sustrato de beta-glucosidasa esta a una concentracion comprendida entre 25 y 1000 mg/l y mas preferiblemente entre 50 y 400 mg/l.
6. 6. Medio de reaccion segun una de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende ademas un activador de la germinacion de las esporas de Clostridium difficile.
7. 7. Medio de reaccion segun la reivindicacion 6, en el que dicho activador de la germinacion de las esporas de Clostridium difficile es el taurocolato de sodio.
8. 8. Medio de reaccion segun la reivindicacion 6 o 7, en el que el taurocolato de sodio esta a una concentracion comprendida entre 0,1 y 10 g/l, preferiblemente comprendida entre 1 y 5 g/l.
9. 9. Procedimiento de deteccion y/o de identificacion de Clostridium difficile que comprende las etapas que consisten en:

   a) poner en contacto una muestra susceptible de contener Clostridium difficile con un medio de reaccion que comprende al menos un sustrato de beta-glucosidasa y un compuesto de formula general Ar-beta-D-glucosido, diferente de dicho sustrato, en la que Ar- designa un compuesto aromatico, seleccionado entre la arbutina o hidroquinona-beta-D-glucopiranosido, el 4-metilumbelliferil-beta-glucosido, el 4-aminofenil-beta-glucosido, la salicina o 2-(hidroximetil)fenil-beta-D-glucosido, a una concentracion inferior a 5 g/l;

   b) incubar en una atmosfera anaerobica; y

   c) detectar la hidrolisis del sustrato de beta-glucosidasa, que indica la presencia de Clostridium difficile.
10. 10. Procedimiento segun la reivindicacion 9, en el que el medio utilizado en la etapa a) es un medio segun una de las reivindicaciones 1 a 8.
11. 11. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 9 o 10, en el que la incubacion realizada en la etapa b) se realiza en anaerobiosis.
12. 12. Utilizacion de la arbutina como activador de beta-glucosidasa en un medio de deteccion y/o de identificacion de Clostridium difficile.