ES2560673T3

ES2560673T3 - Derivados de 1-((5-heteroariltiazol-2-il)aminocarbonil)pirrolidin-2-carboxamida como inhibidores de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) útiles en el tratamiento de enfermedades proliferativas

Info

Publication number: ES2560673T3
Application number: ES09782777.8T
Authority: ES
Inventors: Giorgio Caravatti; Robin Alec Fairhurst; Pascal Furet; Vito Guagnano; Patricia Imbach
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2008-09-10
Filing date: 2009-09-08
Publication date: 2016-02-22
Anticipated expiration: 2029-09-08
Also published as: LTC2331537I2; CA2734819A1; CR20110059A; ECSP11010880A; GEP20135991B; DOP2011000070A; FIC20200046I1; LTPA2020534I1; AR073369A1; MX2011002597A; MA32604B1; EA201100447A1; CU24000B1; WO2010029082A1; EP2331537A1; US20140005232A1; US8476268B2; UY32096A; US8710085B2; AU2009290904B2

Abstract

Compuesto 2-amida y 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetiletil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) del ácido (S)- pirrolidin-1,2-dicarboxílico, de estructura:**Fórmula** en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable.

Description

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DESCRIPCION

Derivados de 1-((5-heteroariltiazol-2-il)aminocarbonil)pirrolidin-2-carboxamida como inhibidores de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) utiles en el tratamiento de enfermedades proliferativas.

La presente invencion se refiere a un derivado especlfico de 2-carboxamida-cicloaminourea, como nuevo compuesto inhibidor alfa-selectivo de fosfatidilinositol (PI) 3-cinasas. Esta invencion tambien se refiere a composiciones, o bien solas o bien en combinacion con al menos un agente terapeutico adicional, y opcionalmente en combinacion con un portador farmaceuticamente aceptable. Esta invencion se refiere aun mas al compuesto para su uso, o bien solo o bien en combinacion con al menos un agente terapeutico adicional, en el tratamiento de varias enfermedades, en particular, aquellas mediadas por uno o mas de actividad anomala de factores de crecimiento, tirosina cinasas receptoras, protelna serina/herolna cinasas, receptores acoplados a protelnas G y fosfollpido cinasas y fosfatasas.

Las fosfatidilinositol 3-cinasas (PI3K) comprenden una familia de llpido cinasas que catalizan la transferencia de fosfato a la posicion D-3' de llpidos de inositol para producir fosfoinositol-3-fosfato (PIP), fosfoinositol-3,4-difosfato (PIP2) y fosfoinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3) que, a su vez, actuan como segundos mensajeros en cascadas de serialization mediante el acoplamiento de protelnas que contienen dominios de homologla a pleckstrina, FYVE, Phox y otros de union a fosfollpidos en una variedad de complejos de senalizacion con frecuencia en la membrana plasmatica ((Vanhaesebroeck et al., Annu. Rev. Biochem 70:535 (2001); Katso et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17:615 (2001)). De las dos PI3K de clase 1, las PI3K de clase 1A son heterodlmeros que se componen de una subunidad catalltica p110 (isoformas a, b, 8) asociada de manera constitutiva con una subunidad reguladora que puede ser p85a, p55a, p50a, p85b o p55g. La subclase 1B de la clase tiene un miembro de la familia, un heterodlmero que se compone de una subunidad catalltica p110g asociada con una de dos subunidades reguladoras, p101 o p84 (Fruman et al., Annu Rev. Biochem. 67:481 (1998); Suire et al., Curr. Biol. 15:566 (2005)). Los dominios modulares de las subunidades p85/55/50 incluyen dominios de homologla a Src (SH2) que se unen a residuos de fosfotirosina en un contexto de secuencia especlfico en tirosina cinasas citoplasmaticas y receptoras activadas, dando como resultado la activation y localization de PI3K de clase 1A. La Pl3K de clase 1B se activa directamente por receptores acoplados a protelnas G que se unen a un repertorio diverso de ligandos peptldicos y no peptldicos (Stephens et al., Cell 89:105 (1997)); Katso et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17:615-675 (2001)). Por consiguiente, los productos de fosfollpido resultantes de PI3K de clase I vinculan receptores anteriores con actividades celulares posteriores incluyendo proliferation, supervivencia, quimiotaxia, trafico celular, motilidad, metabolismo, respuestas inflamatorias y alergicas, transcription y traduction (Cantley et al., Cell 64:281 (1991); Escobedo y Williams, Nature 335:85 (1988); Fantl et al., Cell 69:413 (1992)).

En muchos casos, PIP2 y PIP3 reclutan Akt, el producto del homologo humano del oncogen viral v-Akt, en la membrana plasmatica, donde actua como punto nodal para muchas rutas de senalizacion intracelulares importantes para el crecimiento y la supervivencia (Fantl et al., Cell 69:413-423(1992); Bader et al., Nature Rev. Cancer 5:921 (2005); Vivanco y Sawyer, Nature Rev. Cancer 2:489 (2002)). La regulation aberrante de PI3K, que aumenta con frecuencia la supervivencia a traves de la activacion de Akt, es uno de los acontecimientos mas prevalentes en el cancer humano y se ha mostrado que se produce en multiples niveles. El gen supresor de tumores PTEN, que desfosforila fosfoinosltidos en la posicion 3' del anillo de inositol y al hacerlo antagoniza la actividad PI3K, esta delecionado funcionalmente en una variedad de tumores. En otros tumores, los genes para la isoforma p110a, PIK3CA, y para Akt estan amplificados y se ha demostrado una expresion proteica aumentada de sus productos genicos en varios canceres humanos. Ademas, se han descrito mutaciones y la translocation de p85a que sirven para regular por incremento el complejo p85-p110 en canceres humanos. Finalmente, se han descrito mutaciones de cambio de sentido somaticas en PIK3CA que activan rutas de senalizacion posteriores a frecuencias significativas en una amplia diversidad de canceres humanos (Kang at el., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:802 (2005); Samuels et al., Science 304:554 (2004); Samuels et al., Cancer Cell 7:561-573 (2005)). Estas observaciones muestran que la desregulacion de fosfoinositol-3 cinasa y los componentes anteriores y posteriores de esta ruta de senalizacion es una de las desregulaciones mas comunes asociadas con canceres humanos y enfermedades proliferativas (Parsons et al., Nature 436:792 (2005); Hennessey et al., Nature Rev. Drug Disc. 4:988-1004 (2005)).

En vista de lo anterior, los inhibidores de PI3K alfa serlan de valor particular en el tratamiento de enfermedad proliferativa y otros trastornos.

El documento WO2004/096797 da a conocer determinados derivados de tiazol como inhibidores de PI3K gamma y su uso farmaceutico, particularmente para el tratamiento de estados inflamatorios y alergicos.

El documento WO 2005/021519 tambien da a conocer determinados derivados de tiazol como inhibidores de PI3K gamma y su uso farmaceutico, particularmente para el tratamiento de estados inflamatorios y alergicos.

El documento WO 2006/051270 tambien da a conocer determinados derivados de tiazol como inhibidores de PI3K alfa y su uso farmaceutico, particularmente debido a su actividad antitumoral.

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El documento WO 2007/129044 tambien da a conocer determinados derivados de tiazol como inhibidores de PI3K alfa y su uso farmaceutico, particularmente debido a su actividad antitumoral.

En vista de la tecnica anterior, existe la necesidad de proporcionar compuestos adicionales adecuados para el tratamiento de enfermedades proliferativas, particularmente proporcionar compuestos que tengan selectividad mejorada y / o actividad mayor / mejorada.

Se ha encontrado ahora que el derivado de 2-carboxamida-cicloaminourea de la invention facilitado a continuation tiene propiedades farmacologicas ventajosas e inhibe, por ejemplo, PI3K (fosfatidilinositol 3-cinasa). En particular, este compuesto muestra selectividad por PI3K alfa con respecto a los subtipos beta y/o delta y/o gamma. Asl, el compuesto de la invencion es adecuado, por ejemplo, para usarse en el tratamiento de enfermedades que dependen de Pi3 cinasas (en particular PI3K alfa, tal como las que muestran sobreexpresion o amplification de Pl3K alfa, mutation somatica de PIK3CA o mutaciones de llnea germinal o mutation somatica de PTEN o mutaciones y translocation de p85a que sirven para regular por incremento el complejo p85-p110), especialmente enfermedades proliferativas tales como enfermedades tumorales y leucemias.

Ademas, este compuesto muestra preferiblemente estabilidad metabolica mejorada y por tanto aclaramiento reducido, lo que conduce a perfiles farmacocineticos mejorados.

En un primer aspecto, la presente invencion proporciona el compuesto 2-amida y 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1- dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) del acido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxllico, de estructura:

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en forma libre o en forma de sal farmaceuticamente aceptable.

La invencion puede apreciarse de manera mas completa mediante referencia a la siguiente description, incluyendo el siguiente glosario de terminos y los ejemplos finales. Tal como se usa en el presente documento, los terminos “que incluye”, “que contiene” y “que comprende” se usan en el presente documento en su sentido abierto, no limitativo.

Cualquier formula facilitada en el presente documento pretende representar los hidratos, solvatos y polimorfos de tales compuestos, y mezclas de los mismos.

Cualquier formula facilitada en el presente documento tambien pretende representar las formas no marcadas asl como formas marcadas isotopicamente de los compuestos. Los compuestos marcados isotopicamente tienen estructuras representadas por las formulas facilitadas en el presente documento excepto en que uno o mas atomos se reemplazan por un atomo que tiene una masa atomica o numero masico seleccionado. Los ejemplos de isotopos que pueden incorporarse en compuestos de la invencion incluyen isotopos de hidrogeno, carbono, nitrogeno, oxlgeno, fosforo, fluor y cloro, tales como 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 15N, 18F, 31P, 32P, 35S, 36Cl, 125I respectivamente. La invencion incluye diversos compuestos marcados isotopicamente tal como se define en el presente documento, por

ejemplo aquellos en los que estan presentes isotopos radiactivos, tales como H,

13C y 14C. Tales compuestos

marcados isotopicamente son utiles en estudios metabolicos (preferiblemente con C), estudios de cinetica de reaction (con, por ejemplo 2H o 3H), tecnicas de detection u obtencion de imagenes, tales como tomografla de emision de positrones (PET) o tomografla computarizada de emision monofotonica (SPECT) incluyendo ensayos de distribution tisular de farmacos o sustratos, o en el tratamiento radiactivo de pacientes. En particular, un compuesto marcado o con 18F puede preferirse particularmente para estudios con PET o SPECT. En general, pueden prepararse compuestos marcados isotopicamente de esta invencion y profarmacos de los mismos llevando a cabo los procedimientos dados a conocer en los esquemas o los ejemplos y las preparaciones descritos a continuacion sustituyendo un reactivo no marcado isotopicamente por un reactivo marcado isotopicamente disponible facilmente.

Ademas, la sustitucion por isotopos mas pesados, particularmente deuterio (es decir, 2H o D) puede proporcionar determinadas ventajas terapeuticas que resultan de una mayor estabilidad metabolica, por ejemplo aumento de la semivida in vivo o reduction de los requisitos de dosificacion o una mejora del Indice terapeutico. Se entiende que el

deuterio en este contexto se considera un sustituyente de un compuesto de la invencion. La concentracion de un isotopo mas pesado de este tipo, especlficamente deuterio, puede definirse mediante el factor de enriquecimiento isotopico. El termino “factor de enriquecimiento isotopico” tal como se usa en el presente documento significa la razon entre la abundancia isotopica y la abundancia natural de un isotopo especificado. Si un sustituyente en un 5 compuesto de esta invencion se indica como deuterio, tal compuesto tiene un factor de enriquecimiento isotopico para cada atomo de deuterio designado de al menos 3500 (incorporacion de deuterio del 52,5% en cada atomo de deuterio designado), al menos 4000 (incorporacion de deuterio del 60%), al menos 4500 (incorporacion de deuterio del 67,5%), al menos 5000 (incorporacion de deuterio del 75%), al menos 5500 (incorporacion de deuterio del 82,5%), al menos 6000 (incorporacion de deuterio del 90%), al menos 6333,3 (incorporacion de deuterio del 95%), al 10 menos 6466,7 (incorporacion de deuterio del 97%), al menos 6600 (incorporacion de deuterio del 99%), o al menos 6633,3 (incorporacion de deuterio del 99,5%). En los compuestos de esta invencion, cualquier atomo no designado especlficamente como un isotopo particular pretende representar cualquier isotopo estable de ese atomo. A menos que se establezca de otro modo, cuando se designa una posicion especlficamente como “H” o “hidrogeno”, se entiende que la posicion tiene hidrogeno a su composicion isotopica de abundancia natural. Por consiguiente, en los 15 compuestos de esta invencion cualquier atomo designado especlficamente como deuterio (D) pretende representar deuterio, por ejemplo en los intervalos facilitados anteriormente.

Cuando se usa la forma plural (por ejemplo compuestos, sales), esta incluye el singular (por ejemplo un unico compuesto, una unica sal). “Un compuesto” no excluye que este presente (por ejemplo en una formulacion farmaceutica) mas de un compuesto de la invencion (o una sal del mismo).

20 Las siguientes definiciones generales se aplicaran en esta memoria descriptiva, a menos que se especifique de otro modo:

Halogeno (o halo) indica fluor, bromo, cloro o yodo, en particular fluor, cloro. Los grupos y restos sustituidos con halogeno, tales como alquilo sustituido con halogeno (haloalquilo) pueden estar mono, poli o perhalogenados.

“Tratamiento” incluye tratamiento profilactico (preventivo) y terapeutico as! como el retardo de la progresion de una 25 enfermedad o un trastorno.

“Enfermedades mediadas por PI3 cinasas” (especialmente enfermedades mediadas por PI3K alfa o enfermedades mediadas por la sobreexpresion o amplificacion de PI3K alfa, mutacion somatica de PIK3CA o mutaciones de llnea germinal o mutacion somatica de PTEN o mutaciones y translocacion de p85a que sirven para regular por incremento el complejo p85-p110), son especialmente trastornos tales que responden de manera beneficiosa (por 30 ejemplo mejora de uno o mas slntomas, retraso de la aparicion de una enfermedad, hasta la curacion temporal o completa de una enfermedad) a la inhibicion de una PI3 cinasa, especialmente inhibicion de PI3Kalfa o una forma mutante de la misma (donde pueden mencionarse especialmente entre las enfermedades que van a tratarse, enfermedades proliferativas tales como enfermedades tumorales y leucemias).

“Sales” (que, es lo que quiere decirse mediante “o sales de los mismos” u “o una sal de los mismos”), pueden estar 35 presentes solas o en mezcla con compuesto libre de la invencion y son preferiblemente sales farmaceuticamente aceptables. Tales sales se forman, por ejemplo, como sales de adicion de acido, preferiblemente con acidos organicos o inorganicos, a partir de compuestos de la invencion con un atomo de nitrogeno basico, especialmente las sales farmaceuticamente aceptables. Acidos inorganicos adecuados son, por ejemplo, acidos halogenados, tales como acido clorhldrico, acido sulfurico o acido fosforico. Acidos organicos adecuados son, por ejemplo, acidos 40 carboxllicos o acidos sulfonicos, tales como acido fumarico o acido metanosulfonico. Para fines de aislamiento o purificacion, tambien es posible usar sales farmaceuticamente no aceptables, por ejemplo picratos o percloratos. Para uso terapeutico, solo se emplean compuestos libres o sales farmaceuticamente aceptables (cuando sea aplicable en forma de preparaciones farmaceuticas), y por tanto se prefieren estos. En vista de la estrecha relacion entre los compuestos novedosos en forma libre y aquellos en forma de sus sales, incluyendo aquellas sales que 45 pueden usarse como productos intermedios, por ejemplo en la purificacion o identificacion de los compuestos novedosos, cualquier referencia a los compuestos libres anteriormente en el presente documento y a continuacion en el presente documento se entiende que se refiere tambien a las correspondientes sales, segun sea apropiado y conveniente. Las sales de compuestos de la invencion son preferiblemente sales farmaceuticamente aceptables; se conocen en el campo contraiones adecuados que forman sales farmaceuticamente aceptables.

50 “Combination” se refiere o bien a una combination fijada en una forma unitaria de dosificacion, o bien a un kit de partes para la administration combinada en la que un compuesto de la invencion y una pareja de combinacion (por ejemplo otro farmaco tal como se explica a continuacion, tambien denominado “agente terapeutico” o “coagente”) pueden administrarse independientemente al mismo tiempo o por separado en intervalos de tiempo, especialmente cuando estos intervalos de tiempo permiten que las parejas de combinacion muestren un efecto cooperativo, por 55 ejemplo sinergico. Los terminos “coadministracion” o “administracion combinada” o similar tal como se usan en el presente documento pretenden englobar la administracion de la pareja de combinacion seleccionada a un unico sujeto que lo necesita (por ejemplo un paciente), y pretenden incluir reglmenes de tratamiento en los que los agentes no se administran necesariamente por la misma via de administracion o al mismo tiempo. El termino

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“combinacion farmaceutica” tal como se usa en el presente documento significa un producto que resulta del mezclado o la combinacion de mas de un principio activo e incluye combinaciones tanto fijadas como no fijadas de los principios activos. El termino “combinacion fijada” significa que los principios activos, por ejemplo un compuesto de la invention y una pareja de combinacion, se administran ambos a un paciente simultaneamente en forma de una unica entidad o dosificacion. El termino “combinacion no fijada” significa que los principios activos, por ejemplo un compuesto de la invencion y una pareja de combinacion, se administran ambos a un paciente como entidades separadas de manera o bien simultanea, concurrente o bien secuencial sin llmites temporales especlficos, en la que tal administration proporciona niveles terapeuticamente eficaces de los dos compuestos en el cuerpo del paciente. Esta ultima tambien se aplica a la terapia en coctel, por ejemplo la administracion de tres o mas principios activos.

En realizaciones preferidas, que se prefieren independientemente, de manera colectiva o en cualquier combinacion o subcombinacion, la invencion se refiere a un compuesto de la invencion, en forma de base libre o en forma de sal de adicion de acido, en la que los sustituyentes son tal como se definen en el presente documento.

Pueden proporcionarse profarmacos farmaceuticamente aceptables de un compuesto de la invencion.

Pueden proporcionarse metabolitos farmaceuticamente aceptables de un compuesto de la invencion.

La presente invencion tambien se refiere a procedimientos para la production de un compuesto de la invencion. En principio, todos los procedimientos conocidos que convierten dos aminas diferentes en un derivado de urea correspondiente son adecuados y pueden aplicarse usando el material de partida respectivo.

Por tanto, la invencion se refiere en particular a un procedimiento para fabricar un compuesto de la invencion, que comprende hacer reaccionar un compuesto de formula (II)

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o bien con un compuesto de formula (IIIA)

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en la que los sustituyentes y A se definen como corresponden al compuesto de la invencion en el presente documento y R3 puede representar adicionalmente cloro, en presencia de un agente de activation (“metodo A”), o bien con un compuesto de formula (IIIB)

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define como corresponde al compuesto de la invencion en el presente documento y puede representar adicionalmente cloro y RG representa un grupo reactivo, tal como imidazolilcarbonilo, que puede reaccionar

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directamente o mediante la formacion del producto intermedio de isocianato de formula (IIIE) (“metodo B”),

en la que los sustituyentes son tal como se definen en (IIIB),

en cada caso opcionalmente en presencia de un diluyente y opcionalmente en presencia de un adyuvante de reaccion y

recuperar el compuesto de la invencion resultante en forma libre o en forma de una sal y, opcionalmente convertir un compuesto de la invencion, que puede obtenerse segun el metodo A o el metodo B, en un compuesto diferente, y/o convertir una sal que puede obtenerse de un compuesto de la invencion en una sal diferente del mismo, y/o convertir un compuesto libre de la invencion que puede obtenerse en una sal del mismo, y/o separar un isomero que puede obtenerse de un compuesto de la invencion de uno o mas isomeros que pueden obtenerse diferentes del compuesto de la invencion.

Condiciones de reaccion

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El procedimiento puede realizarse segun metodos conocidos en la tecnica, o tal como se da a conocer a continuacion en los ejemplos. Por ejemplo un compuesto de formula II puede hacerse reaccionar con un compuesto de formula III en un disolvente, por ejemplo dimetilformamida, en presencia de una base por ejemplo una amina organica, por ejemplo trietilamina.

Cuando se facilitan temperaturas antes en el presente documento o a continuacion en el presente documento, ha de anadirse “aproximadamente”, ya que son tolerables desviaciones menores con respecto a los valores numericos facilitados, por ejemplo variaciones de ±10%.

Todas las reacciones pueden tener lugar en presencia de uno o mas diluyentes y/o disolventes. Los materiales de partida pueden usarse en cantidades equimolares; alternativamente, un compuesto puede usarse en exceso, por ejemplo para que funcione como disolvente o para desplazar el equilibrio o para acelerar en general las velocidades de reaccion.

Pueden anadirse adyuvantes de reaccion, tales como acidos, bases o catalizadores en cantidades adecuadas, tal como se conoce en el campo, se requiere por una reaccion y en llnea con procedimientos conocidos en general.

Grupos protectores

Si uno o mas de otros grupos funcionales, por ejemplo carboxilo, hidroxilo, amino, sulfhidrilo o similares estan protegidos o es necesario protegerlos en un material de partida tal como se describe en el presente documento o cualquier otro precursor, porque no deben participar en la reaccion o alterar la reaccion, estos son grupos tales como los usados habitualmente en la slntesis de compuestos peptldicos, y tambien de cefalosporinas y penicilinas, as! como derivados de acido nucleico y azucares. Los grupos protectores son grupos tales que ya no estan presentes en los compuestos finales una vez que se eliminan, mientras que los grupos que permanecen como sustituyentes no son grupos protectores en el sentido usado en el presente documento, que son grupos que se anaden en un material de partida o fase intermedia y se eliminan para obtener un compuesto final.

Los grupos protectores pueden estar ya presentes en precursores y deben proteger los grupos funcionales referidos frente a reacciones secundarias no deseadas, tales como acilaciones, eterificaciones, esterificaciones, oxidaciones, solvolisis, y reacciones similares. Es una caracterlstica de los grupos protectores que se prestan facilmente por si mismos, es decir sin reacciones secundarias no deseadas, a la elimination, normalmente mediante acetolisis, protonolisis, solvolisis, reduction, fotolisis o tambien mediante actividad enzimatica, por ejemplo en condiciones analogas a las condiciones fisiologicas, y que no estan presentes en los productos finales. El especialista sabe, o

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puede establecer facilmente, que grupos protectores son adecuados con las reacciones mencionadas anteriormente y a continuacion.

La protection de tales grupos funcionales mediante tales grupos protectores, los propios grupos protectores y sus reacciones de elimination se describen, por ejemplo, en obras de referencia convencionales, tales como J. F. W. McOmie, “Protective Groups in Organic Chemistry”, Plenum Press, Londres y Nueva York 1973, en T. W. Greene, “Protective Groups in Organic Synthesis”, tercera edition, Wiley, Nueva York 1999, en “The Peptides”; Volumen 3 (editores: E. Gross and J. Meienhofer), Academic Press, Londres y Nueva York 1981, en “Methoden der organischen Chemie” (Metodos de quimica organics), Houben Weyl, 4a edicion, Volumen 15/I, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, en H.-D. Jakubke y H. Jescheit, “Aminosauren, Peptide, Proteine” (Aminoacidos, peptidos, protenas), Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach y Basilea 1982, y en Jochen Lehmann, “Chemie der Kohlenhydrate: Monosaccharide und Derivate” (Quimica de hidratos de carbono: monosacaridos y derivados), Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974.

Reacciones y conversiones opcionales

Pueden prepararse sales de un compuesto de la invention con un grupo formador de sal de manera conocida per se. Por tanto, pueden obtenerse sales de adicion de acido de compuestos de la invencion mediante tratamiento con un acido o con un reactivo de intercambio anionico adecuado. Una sal con dos moleculas de acido (por ejemplo un dihalogenuro de un compuesto de la invencion) tambien puede convertirse en una sal con una molecula de acido por compuesto (por ejemplo un monohalogenuro); esto puede realizarse mediante calentamiento hasta obtener una masa fundida, o por ejemplo mediante calentamiento como un solido a alto vaclo a temperatura elevada, por ejemplo de desde 130 hasta 170°C, expulsandose una molecula del acido por molecula de un compuesto de la invencion. Las sales pueden convertirse habitualmente en compuestos libres, por ejemplo mediante tratamiento con compuestos basicos adecuados, por ejemplo con carbonatos de metales alcalinos, hidrogenocarbonatos de metales alcalinos o hidroxidos de metales alcalinos, normalmente carbonato de potasio o hidroxido de sodio.

Pueden separarse mezclas estereoisomericas, por ejemplo mezclas de diastereomeros, en sus isomeros correspondientes de manera conocida per se por medio de metodos de separation adecuados. Pueden separarse mezclas diastereomericas, por ejemplo, en sus diastereomeros individuales por medio de cristalizacion fraccionada, cromatografla, distribution en disolventes, y procedimientos similares. Esta separacion puede tener lugar o bien a nivel de un compuesto de partida o bien en un compuesto de la invencion en si mismo. Pueden separarse enantiomeros a traves de la formation de sales diastereomericas, por ejemplo mediante la formation de sal con un acido quiral enantiomericamente puro, o por medio de cromatografla, por ejemplo mediante HPLC, usando sustratos cromatograficos con ligandos quirales.

Debe hacerse hincapie en que reacciones analogas a las conversiones mencionadas en este capltulo tambien pueden tener lugar a nivel de productos intermedios apropiados (y son por tanto utiles en la preparation de materiales de partida correspondientes).

Materiales de partida:

Los materiales de partida de las formulas II y III, as! como otros materiales de partida mencionados en el presente documento, por ejemplo a continuacion, pueden prepararse segun o de manera analoga a metodos que se conocen en la tecnica, se conocen en la tecnica y/o estan disponibles comercialmente. En la medida en que la production de los materiales de partida no se describe particularmente, los compuestos o bien se conocen o bien pueden prepararse de manera analoga a metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo en los documentos WO 05/021519 o WO04/096797, o tal como se da a conocer a continuacion en el presente documento. Materiales de partida novedosos, as! como procedimientos para la preparacion de los mismos, son asimismo una realization de la presente invencion. En las realizaciones preferidas, tales materiales de partida se usan y la reaction elegida se seleccionan de modo que permitan que se obtengan los compuestos preferidos.

En los materiales de partida (incluyendo productos intermedios), que tambien pueden usarse y/u obtenerse como sales cuando sea apropiado y conveniente, los sustituyentes son preferiblemente tal como se definen para un compuesto de la invencion.

La divulgation en el presente documento tambien se refiere a compuestos de formula (IIIA) o una sal de los mismos

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en la que los sustituyentes son tal como se definen para un compuesto de la invencion.

La presente divulgacion se refiere ademas a procedimientos para la produccion de un compuesto de formula (IIIA). En principio, todos los procedimientos conocidos que acoplan dos componentes de arilo / heteroarilo (tales como reacciones de tipo Heck) para dar un derivado de urea correspondiente son adecuados y pueden aplicarse usando el material de partida respectivo. Por tanto, la invencion tambien se refiere a un procedimiento para preparar un compuesto de formula (IIlA), que comprende

(Etapa 1) hacer reaccionar un compuesto de formula (IV)

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representar adicionalmente halo, PG representa un grupo de proteccion, tal como un grupo acilo, con un compuesto de formula (V)

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representa halo, tal como bromo, en condiciones de Heck; opcionalmente en presencia de un diluyente y opcionalmente en presencia de un adyuvante de reaccion;

(Etapa 2) seguido por la eliminacion del grupo protector, por ejemplo en condiciones acidas; opcionalmente en presencia de un diluyente y opcionalmente en presencia de un adyuvante de reaccion; y

recuperar el compuesto de formula (IIIA) resultante en forma libre o en forma de una sal y,

opcionalmente convertir un compuesto de formula (IIIA) obtenido en un compuesto diferente de formula (IIIA), y/o convertir una sal obtenida de un compuesto de formula (IIIA) en una sal diferente del mismo, y/o convertir un compuesto libre que puede obtenerse de formula (IIIA) en una sal del mismo, y/o separar un isomero que puede obtenerse de un compuesto de formula (IIIA) de uno o mas isomeros obtenidos diferentes de formula (IIIA).

La presente divulgacion se refiere ademas a compuestos de formula (IIIB) o una sal de los mismos

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en la que R1, R2, A se definen como corresponden a un compuesto de la invention, RG representa un grupo reactivo, particularmente imidazolilcarbonilo que puede reaccionar directamente o mediante la formation del producto intermedio de isocianato de formula (IIIE), y R3 se define como corresponde a un compuesto de la invencion en el presente documento y puede representar adicionalmente halo.

La presente divulgation se refiere ademas a procedimientos para la production de un compuesto de formula (IIIB). En principio, todos los procedimientos conocidos que convierten una amina o sal de la misma en un derivado activado correspondiente son adecuados y pueden aplicarse usando el material de partida respectivo. Por tanto, la invencion tambien se refiere a un procedimiento para preparar un compuesto de formula (IIIB), que comprende hacer reaccionar un compuesto de formula (IIIA)

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en la que los sustituyentes son tal como se definen en el presente documento, con un reactivo de activation, tal como 1,1'-carbonildiimidazol, opcionalmente en presencia de un diluyente y opcionalmente en presencia de un adyuvante de reaction; y

recuperar el compuesto de formula (IIIB) resultante en forma libre o en forma de una sal, y

opcionalmente convertir un compuesto de formula (IIIB) obtenido en un compuesto diferente de formula (IIIB), y/o convertir una sal obtenida de un compuesto de formula (IIIB) en una sal diferente del mismo, y/o convertir un compuesto libre que puede obtenerse de formula (IIIB) en una sal del mismo, y/o separar un isomero que puede obtenerse de un compuesto de formula (IIIB) de uno o mas isomeros obtenidos diferentes de formula (IIIB).

La invencion se refiere en una realization a composiciones para uso humano o veterinario cuando esta indicada inhibition de PI3K.

La invencion se refiere al tratamiento de enfermedades proliferativas celulares tales como tumor y/o crecimiento de celulas cancerosas mediadas por PI3K. Las enfermedades pueden incluir las que muestran sobreexpresion o amplification de PI3K alfa, mutation somatica de PIK3CA o mutaciones de llnea germinal o mutation somatica de PTEN o mutaciones y translocation de p85a que sirven para regular por incremento el complejo p85-p110. En particular, los compuestos son utiles en el tratamiento de canceres humanos o de animales (por ejemplo, murinos), incluyendo, por ejemplo, sarcoma; de pulmon; bronquio; prostata; mama (incluyendo canceres de mama esporadicos y pacientes con enfermedad de Cowden); pancreas; cancer gastrointestinal; de colon; recto; carcinoma de colon; adenoma colorrectal; de tiroides; hlgado; vlas biliares intrahepaticas; hepatocelular; de glandula suprarrenal; estomago; gastrico; glioma; glioblastoma; endometrial; melanoma; de rinon; pelvis renal; vejiga urinaria; cuerpo uterino; cuello uterino; vagina; ovario; mieloma multiple; de esofago; una leucemia; leucemia mielogena aguda; leucemia mielogena cronica; leucemia linfocltica; leucemia mieloide; cerebral; un carcinoma del cerebro; cavidad oral y faringe; laringe; intestino delgado; linfoma no Hodgkin; melanoma; adenoma velloso de colon; una neoplasia; una neoplasia de caracter epitelial; linfomas; un carcinoma de mama; carcinoma de celulas basales; carcinoma de celulas escamosas; queratosis actlnica; enfermedades tumorales, incluyendo tumores solidos; un tumor de cabeza o cuello; policitemia vera; trombocitemia esencial; mielofibrosis con metaplasia mieloide; y enfermedad de Walden-Stroem.

El estado o trastorno (por ejemplo mediado por PI3K) tambien puede seleccionarse del grupo que consiste en: policitemia vera, trombocitemia esencial, mielofibrosis con metaplasia mieloide, asma, EPOC, SDRA, slndrome de Loffler, neumonla eosinofllica, infestation parasitaria (en particular metazoaria) (incluyendo eosinofilia tropical), aspergilosis broncopulmonar, poliarteritis nodosa (incluyendo slndrome de Churg-Strauss), granuloma eosinofllico, trastornos relacionados con los eosinofilos que afectan a las vlas respiratorias ocasionados por reaccion farmacologica, psoriasis, dermatitis de contacto, dermatitis atopica, alopecia areata, eritema multiforme, dermatitis herpetiforme, esclerodermia, vitiligo, angeitis por hipersensibilidad, urticaria, penfigoide ampolloso, lupus eritematoso, penfigo, epidermolisis ampollosa adquirida, trastornos hematologicos autoinmunitarios (por ejemplo anemia hemolitica, anemia aplasica, anemia pura de eritrocitos y trombocitopenia idiopatica), lupus eritematoso sistemico, policondritis, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, dermatomiositis, hepatitis activa cronica, miastenia grave, sindrome de Steven-Johnson, esprue idiopatico, enfermedad inflamatoria del intestino autoinmunitaria (por ejemplo colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), oftalmopatia endocrina, enfermedad de

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Graves, sarcoidosis, alveolitis, neumonla por hipersensibilidad cronica, esclerosis multiple, cirrosis biliar primaria, uveitis (anterior y posterior), fibrosis pulmonar intersticial, artritis psoriasica, glomerulonefritis, enfermedades cardiovasculares, aterosclerosis, hipertension, trombosis venosa profunda, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, angina inestable, tromboembolia, embolia pulmonar, enfermedades trombollticas, isquemia arterial aguda, oclusiones tromboticas perifericas y arteriopatla coronaria, lesiones por reperfusion, retinopatla, tal como retinopatla diabetica o retinopatla inducida por oxlgeno hiperbarico, y estados caracterizados por presion ocular elevada o secrecion de humor acuoso ocular, tales como glaucoma.

Para los usos anteriores, la dosificacion requerida variara naturalmente dependiendo del modo de administracion, el estado particular que vaya a tratarse y el efecto deseado. En general, se indica que se obtienen resultados satisfactorios de manera sistemica a dosificaciones diarias de desde aproximadamente 0,03 hasta aproximadamente 100,0 mg/kg de peso corporal, por ejemplo de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 10,0 mg/kg de peso corporal. Una dosificacion diaria indicada en el mamlfero superior, por ejemplo seres humanos, esta en el intervalo de desde aproximadamente 0,5 mg hasta aproximadamente 3 g, por ejemplo de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 1,5 g, administrada de manera conveniente, por ejemplo, en dosis divididas hasta cuatro veces al dla o en forma retardada. Las formas de dosificacion unitarias adecuadas para administracion oral comprenden desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 500 mg, por ejemplo de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 500 mg de principio activo.

El compuesto puede administrarse por cualquier via convencional, en particular por via enteral, por ejemplo por via oral, por ejemplo en forma de comprimidos o capsulas, o por via parenteral, por ejemplo en forma de disoluciones o suspensiones inyectables, de manera topica, por ejemplo en forma de lociones, geles, pomadas o cremas, por inhalacion, por via intranasal, o en forma de supositorio.

El compuesto puede administrarse en forma libre o en forma de sal farmaceuticamente aceptable, por ejemplo tal como se indico anteriormente. Tales sales pueden prepararse de manera convencional y presentan el mismo orden de actividad que los compuestos libres.

Por consiguiente, la invencion tambien proporciona:

■ un compuesto de la invencion, en forma libre o en una forma de sal farmaceuticamente aceptable como producto farmaceutico, por ejemplo en cualquiera de los metodos indicados en el presente documento.

■ un compuesto de la invencion en forma libre o en forma de sal farmaceuticamente aceptable para su uso como producto farmaceutico, por ejemplo en cualquiera de los metodos indicados en el presente documento, en particular para el uso en una o mas enfermedades mediadas por fosfatidilinositol 3-cinasas.

■ el uso de un compuesto de la invencion en forma libre o en forma de sal farmaceuticamente aceptable en cualquiera de los metodos indicados en el presente documento, para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de una o mas enfermedades mediadas por fosfatidilinositol 3-cinasas.

PI3K sirve como nodo de segundo mensajero que integra rutas de senalizacion paralelas, estan surgiendo pruebas de que la combinacion de un inhibidor de PI3K con inhibidores de otras rutas sera util en el tratamiento de cancer y enfermedades proliferativas en seres humanos.

Aproximadamente el 20-30% de los canceres de mama humanos sobreexpresan Her-2/neu-ErbB2, la diana para el farmaco trastuzumab. Aunque trastuzumab ha demostrado respuestas duraderas en algunos pacientes que expresan Her2/neu-ErbB2, solo un subconjunto de estos pacientes responden. Un trabajo reciente ha indicado que esta tasa de respuesta limitada puede mejorarse sustancialmente mediante la combinacion de trastuzumab con inhibidores de P|3k o la ruta PI3K/AKT (Chan et al., Breast Can. Res. Treat. 91:187 (2005), Woods Ignatoski et al., Brit. J. Cancer 82:666 (2000), Nagata et al., Cancer Cell 6:117 (2004)).

Una variedad de tumores malignos humanos expresan mutaciones activantes o niveles aumentados de Her1/EGFR y se han desarrollado varios inhibidores de anticuerpo y molecula pequena frente a esta tirosina cinasa receptora incluyendo tarceva, gefitinib y erbitux. Sin embargo, aunque los inhibidores de EGFR demuestran actividad antitumoral en determinados tumores humanos (por ejemplo, NSCLC), no logran aumentar la supervivencia global del paciente en todos los pacientes con tumores que expresan EGFR. Esto puede racionalizarse mediante el hecho de que muchas dianas posteriores de Her1/EGFR estan mutadas o desreguladas a altas frecuencias en una variedad de tumores malignos, incluyendo la ruta PI3K/Akt. Por ejemplo, gefitinib inhibe el crecimiento de una llnea celular de adenocarcinoma en ensayos in vitro. No obstante, pueden seleccionarse subclones de estas llneas celulares que son resistentes a gefitinib que demuestran un aumento de la activacion de la ruta PI3/Akt. La regulacion por disminucion o inhibicion de esta ruta hace que los subclones resistentes sean sensibles a gefitinib (Kokubo et al., Brit. J. Cancer 92:1711 (2005)). Ademas, en un modelo in vitro de cancer de mama con una llnea celular que alberga una mutacion de PTEN y sobreexpresa EGFR, la inhibicion tanto de la ruta PI3K/Akt como de

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EGFR produjo un efecto sinergico (She et al., Cancer Cell 8:287-297(2005)). Estos resultados indican que la combinacion de gefitinib e inhibidores de la ruta PI3K/Akt seria una estrategia terapeutica atractiva en el cancer.

La combinacion de AEE778 (un inhibidor de Her-2/neu/ErbB2, VEGFR y EGFR) y RAD001 (un inhibidor de mTOR, una diana posterior de Akt) produjo mayor eficacia combinada que cualquier agente solo en un modelo de xenoinjerto de glioblastoma (Goudar et al., Mol. Cancer. Ther. 4:101-112 (2005)).

Los antiestrogenos, tales como tamoxifeno, inhiben el crecimiento de cancer de mama a traves de la induccion de detencion del ciclo celular que requiere la accion del inhibidor del ciclo celular p27Kip. Recientemente, se ha mostrado que la activacion de la ruta de Ras-Raf-MAP cinasa altera el estado de fosforilacion de p27Kip de manera que se atenua su actividad inhibidora en la detencion del ciclo celular, contribuyendo de ese modo a la resistencia antiestrogenos (Donovan, et al, J. Biol. Chem. 276:40888, (2001)). Tal como notificaron Donovan et al., la inhibicion de la senalizacion de MAPK a traves de tratamiento con inhibidor de MEK revertio el estado de fosforilacion aberrante de p27 en lineas celulares de cancer de mama que no responden al tratamiento hormonal y al hacerlo restauro la sensibilidad hormonal. De manera similar, la fosforilacion de p27Kip por Akt tambien suprime su papel para detener el ciclo celular (Viglietto et al., Nat Med. 8:1145 (2002)).

Por consiguiente, el compuesto puede usarse en el tratamiento de canceres hormonodependientes, tales como canceres de mama y prostata. Mediante este uso, se tiene como objetivo revertir la resistencia hormonal observada comunmente en estos canceres con agentes anticancerigenos convencionales.

En canceres hematologicos, tales como leucemia mielogena cronica (CML), la translocacion cromosomica es responsable de la tirosina cinasa BCR-Abl activada de manera constitutiva. Los pacientes afectados responden a imatinib, un inhibidor de tirosina cinasa de molecula pequena, como resultado de la inhibicion de la actividad cinasa Abl. Sin embargo, muchos pacientes con enfermedad en estado avanzado responden a imatinib inicialmente, pero luego presentan recidiva mas tarde debido a mutaciones que confieren resistencia en el dominio cinasa Abl. Estudios in vitro han demostrado que BCR-Ab1 emplea la ruta de Ras-Raf cinasa para provocar sus efectos. Ademas, la inhibicion de mas de una cinasa en la misma ruta proporciona proteccion adicional frente a mutaciones que confieren resistencia.

Por consiguiente, el compuesto pueden usarse en combinacion con al menos un agente adicional seleccionado del grupo de inhibidores de cinasas, tales como Gleevec®, en el tratamiento de canceres hematologicos, tales como leucemia mielogena cronica (CML). Mediante este uso, se tiene como objetivo revertir o prevenir la resistencia a dicho al menos un agente adicional.

Debido a que la activacion de la ruta PI3K/Akt impulsa la supervivencia celular, la inhibicion de la ruta en combinacion con terapias que impulsan la apoptosis en celulas cancerosas, incluyendo radioterapia y quimioterapia, daran como resultado respuestas mejoradas (Ghobrial et al., CA Cancer J. Clin 55:178-194 (2005)). Como ejemplo, la combinacion de inhibidor de PI3 cinasa con carboplatino demostro efectos sinergicos tanto en ensayos de proliferacion y apoptosis in vitro asi como en la eficacia frente a tumor in vivo en un modelo de xenoinjerto de cancer de ovario (Westfall y Skinner, Mol. Cancer Ther. 4:1764-1771 (2005)).

Ademas de cancer y enfermedades proliferativas, existen pruebas acumuladas de que inhibidores de PI3 cinasas de clase 1A y 1B seran terapeuticamente utiles en otras areas de enfermedad. Se ha mostrado que la inhibicion de p110b, el producto de la isoforma PI3K del gen PIK3CB, esta implicada en la activacion de plaquetas inducida por cizallamiento (Jackson et al., Nature Medicine 11:507-514 (2005)). Por tanto, un inhibidor de PI3K que inhiba p110b sera util como agente individual o en combinacion en terapia antitrombotica. La isoforma p1108, el producto del gen PIK3CD, es importante en la funcion y diferenciacion de celulas B (Clayton et al., J. Exp. Med. 196:753-763 (2002)), respuestas antigenicas dependientes e independientes de celulas T (Jou et al., Mol. Cell. Biol. 22:8580-8590 (2002)) y diferenciacion de mastocitos (Ali et al., Nature 431:1007-1011 (2004)). Por tanto, se espera que los inhibidores de p110S seran utiles en el tratamiento de asma y enfermedades autoinmunitarias impulsadas por celulas B. Finalmente, la inhibicion de p110g, el producto de la isoforma del gen PI3KCG, da como resultado una reduccion de la respuesta de celulas T, pero no de celulas B (Reif et al., J. Immunol. 173:2236-2240 (2004)) y su inhibicion demuestra eficacia en modelos con animales de enfermedades autoinmunitarias (Camps et al., Nature Medicine 11:936-943 (2005), Barber et al., Nature Medicine 11:933-935 (2005)).

La invencion proporciona ademas composiciones farmaceuticas que comprenden el compuesto, junto con un excipiente farmaceuticamente aceptable adecuado para la administracion a un sujeto humano o animal, o bien solo o bien junto con otros agentes anticancerigenos.

El compuesto de la invencion puede usarse en metodos de tratamiento de sujetos humanos o animales que padecen una enfermedad proliferativa celular, tal como cancer. Los metodos de tratamiento de un sujeto humano o animal que necesita tal tratamiento, comprenden administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de la invencion o bien solo o bien en combinacion con uno o mas de otros agentes anticancerigenos. En

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particular, las composiciones o bien se formularan conjuntamente como un producto terapeutico de combination o bien se administraran por separado. Los agentes anticancerigenos para su uso con un compuesto de la invention adecuados incluyen, pero no se limitan a, uno o mas compuestos seleccionados del grupo que consiste en inhibidores de cinasas, antiestrogenos, antiandrogenos, otros inhibidores, farmacos quimioterapicos contra el cancer, agentes alquilantes, agentes quelantes, modificadores de la respuesta biologica, vacunas contra el cancer, agentes para terapia antisentido tal como se exponen a continuation:

A. Inhibidores de cinasas: Los inhibidores de cinasas para su uso como agentes anticancerigenos junto con el compuesto de la invencion incluyen inhibidores de cinasas receptoras de factor de crecimiento epidermico (EGFR) tales como quinazolinas de molecula pequena, por ejemplo gefitinib (documentos US 5457105, US 5616582, y US 5770599), ZD-6474 (documento WO 01/32651), erlotinib (Tarceva®, documentos US 5.747.498 y WO 96/30347), y lapatinib (documentos US 6.727.256 y WO 02/02552); inhibidores de cinasas receptoras de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), incluyendo SU-11248 (documento WO 01/60814), SU 5416 (documentos US 5.883.113 y WO 99/61422), SU 6668 (documentos US 5.883.113 y WO 99/61422), CHIR-258 (documentos US 6.605.617 y US 6.774.237), vatalanib o PTK-787 (documento US 6.258.812), VEGF-Trap (documento WO 02/57423), B43-genistema (documento WO-09606116), fenretinida (p-hidroxifenilamina del acido retinoico) (documento US 4.323.581), IM-862 (documento WO 02/62826), bevacizumab o Avastin® (documento WO 94/10202), KRN-951, 3-[5-(metilsulfonilpiperadin-metil)-indolil]-quinolona, AG-13736 y AG-13925, pirrolo[2,1- f][1,2,4]triazinas, ZK-304709, Veglin®, VMDA-3601, EG-004, CEP-701 (documento US 5.621.100), Cand5 (documento WO 04/09769); inhibidores de tirosina cinasa Erb2 tales como pertuzumab (documento WO 01/00245), trastuzumab y rituximab; inhibidores de proteina cinasa Akt, tales como RX-0201; inhibidores de proteina cinasa C (PKC), tales como LY-317615 (documento WO 95/17182) y perifosina (documento US 2003171303); inhibidores de cinasa Raf/Map/MEK/Ras incluyendo sorafenib (BAY 43-9006), ARQ-350RP, LErafAON, BMS-354825, AMG-548, y otros dados a conocer en el documento WO 03/82272; inhibidores de cinasas receptoras de factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR); inhibidores de cinasas dependientes de celulas (CDK), incluyendo CYC-202 o roscovitina (documentos WO 97/20842 y WO 99/02162); inhibidores de cinasas receptoras de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) tales como CHIR-258, AcM 3G3, AG-13736, SU-11248 y SU6668; e inhibidores de cinasas Bcr- Abl y proteinas de fusion tales como STI-571 o Gleevec® (imatinib).

B. Antiestrogenos: Los agentes de selection como diana de estrogenos para su uso en terapia contra el cancer junto con el compuesto de la invencion incluyen moduladores selectivos de los receptores de estrogenos (SERM) incluyendo tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno; inhibidores de aromatasa incluyendo Arimidax® o anastrozol; reguladores por disminucion de los receptores de estrogenos (ERD) incluyendo Faslodex® o fulvestrant.

C. Antiandrogenos: Los agentes de seleccion como diana de androgenos para su uso en terapia contra el cancer junto con el compuesto de la invencion incluyen flutamida, bicalutamida, finasterida, aminoglutetamida, ketoconazol, y corticosteroides.

D. Otros inhibidores: Otros inhibidores para su uso como agentes anticancerigenos junto con el compuesto de la invencion incluyen inhibidores de proteina farnesil transferasa incluyendo tipifarnib o R-115777 (documentos US 2003134846 y WO 97/21701), BMS-214662, AZD-3409 y FTI-277; inhibidores de topoisomerasa incluyendo merbarona y diflomotecan (BN-80915); inhibidores de proteina del huso de kinesina mitotico (KSP) incluyendo SB- 743921 y MKI-833; moduladores del proteasoma tales como bortezomib o Velcade® (documento uS 5.780.454), XL- 784; e inhibidores de ciclooxigenasa 2 (COX-2) incluyendo farmacos antiinflamatorios no esteroideos I (AINE).

E. Farmacos quimioterapicos contra el cancer: agentes quimioterapicos contra el cancer particulares para su uso como agentes anticancerigenos junto con el compuesto de la invencion incluyen anastrozol (Arimidax®), bicalutamida (Casodex®), sulfato de bleomicina (Blenoxane®), busulfano (Myleran®), inyeccion de busulfano (Busulfex®), capecitabina (Xeloda®), N4-pentoxicarbonil-5-desoxi-5-fluorocitidina, carboplatino (Paraplatin®), carmustina (BiCNU®), clorambucilo (Leukeran®), cisplatino (Platinol®), cladribina (Leustatin®), ciclofosfamida (Cytoxan® o Neosar®), citarabina, arabinosido de citosina (Cytosar-U®), inyeccion liposomal de citarabina (DepoCyt®), dacarbazina (DTIC-Dome®), dactinomicina (actinomicina D, Cosmegan), clorhidrato de daunorubicina (Cerubidine®), inyeccion liposomal de citrato de daunorubicina (DaunoXome®), dexametasona, docetaxel (Taxotere®), clorhidrato de doxorubicina (Adriamycin®, Rubex®), etoposido (Vepesid®), fosfato de fludarabina (Fludara®), 5-fluorouracilo (Adrucil®, Efudex®), flutamida (Eulexin®), tezacitibina, gemcitabina (difluorodesoxicitidina), hidroxiurea (Hydrea®), idarubicina (Idamycin®), ifosfamida (IFEX®), irinotecan (Camptosar®), L-asparaginasa (ELSPAr®), leucovorina calcica, melfalan (Alqueran®), 6-mercaptopurina (Purinethol®), metotrexato (Folex®), mitoxantrona (Novantrone®), milotarg, paclitaxel (Taxol®), fenix (itrio90/MX- DTPA), pentostatina, polifeprosan 20 con implante de carmustina (Gliadel®), citrato de tamoxifeno (Nolvadex®), teniposido (Vumon®), 6-tioguanina, tiotepa, tirapazamina (Tirazone®), clorhidrato de topotecan para inyeccion (Hycamptin®), vinblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®) y vinorelbina (Navelbine®).

F. Agentes alquilantes: Los agentes alquilantes para su uso junto con el compuesto de la invencion incluyen VNP- 40101M o cloretizina, oxaliplatino (documentos US 4.169.846, WO 03/24978 y WO 03/04505), glufosfamida, mafosfamida, etopofos (documento US 5.041.424), prednimustina; treosulfano; busulfano; irofluveno (acilfulveno);

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penclomedina; pirazoloacridina (PD-115934); O6-bencilguanina; decitabina (5-aza-2-desoxicitidina); brostalicina; mitomicina C (MitoExtra); TLK-286 (Telcyta®); temozolomida; trabectedina (documento US 5.478.932); AP-5280 (formulacion de platinato de cisplatino); porfiromicina; y clearazida (mecloretamina).

G. Agentes quelantes: Los agentes quelantes para su uso junto con el compuesto de la invencion incluyen tetratiomolibdato (documento WO 01/60814); RP-697; T84.66 quimerico (cT84.66); gadofosveset (Vasovist®); deferoxamina; y bleomicina opcionalmente en combination con electroporation (EPT).

H. Modificadores de la respuesta biologica: Los modificadores de la respuesta biologica, tales como moduladores inmunitarios, para su uso junto con el compuesto de la invencion incluyen estaurosporina y analogos macroclclicos de la misma, incluyendo UcN-01, CEP-701 y midostaurina (veanse los documentos WO 02/30941, WO 97/07081, WO 89/07105, US 5.621.100, WO 93/07153, WO 01/04125, WO 02/30941, WO 93/08809, WO 94/06799, WO 00/27422, WO 96/13506 y WO 88/07045); escualamina (documento WO 01/79255); DA-9601 (documentos WO 98/04541 y US 6.025.387); alemtuzumab; interferones (por ejemplo IFN-a, IFN-b, etc.); interleucinas, especlficamente IL-2 o aldesleucina as! como IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, y variantes biologicas activas de los mismos que tienen secuencias de aminoacidos de mas del 70% de la secuencia humana nativa; altretamina (Hexalen®); SU 101 o leflunomida (documentos WO 04/06834 y US 6.331.555); imidazoquinolinas tales como resiquimod e imiquimod (documentos US 4.689.338, 5.389.640, 5.268.376, 4.929.624, 5.266.575, 5.352.784, 5.494.916, 5.482.936, 5.346.905, 5.395.937, 5.238.944 y 5.525.612); y SMIP, incluyendo benzazoles, antraquinonas, tiosemicarbazonas y triptantrinas (documentos WO 04/87153, WO 04/64759 y WO 04/60308).

I. Vacunas contra el cancer: Las vacunas contra el cancer para su uso junto con el compuesto de la invencion incluyen Avicine® (Tetrahedron Lett. 26:2269-70 (1974)); oregovomab (OvaRex®); Theratope® (STn-KLH); vacunas contra el melanoma; serie GI-4000 (GI-4014, GI-4015, y GI-4016), que se dirigen contra cinco mutaciones en la protelna Ras; GlioVax-1; MelaVax; Advexin® o INGN-201 (documento WO 95/12660); Sig/E7/LAMP-1, que codifica para HPV-16 E7; vacuna contra MAGE-3 o M3TK (documento WO 94/05304); HER-2VAX; ACTIVE, que estimula celulas T especlficas para tumores; vacunas contra el cancer de GM-CSF; y vacunas basadas en monocitogenes de Listeria.

J. Terapia antisentido: Los agentes anticancerlgenos para su uso junto con el compuesto de la invencion tambien incluyen composiciones antisentido, tales como AEG-35156 (GeM-640); AP-12009 y AP-11014 (oligonucleotidos antisentido especlficos para TGF-beta2); AVI-4126; AVI-4557; AVI-4472; oblimerseno (Genasense®); JFS2; aprinocarseno (documento WO 97/29780); GTI-2040 (oligonucleotidos antisentido de ARNm de ribonucleotido reductasa R2) (documento WO 98/05769); GTI-2501 (documento WO 98/05769); oligodesoxinucleotidos antisentido c-Raf encapsulados en liposomas (LErafAON) (documento WO 98/43095); y Sirna-027 (producto terapeutico basado en iARN que selecciona como diana ARNm de VEGFR-1).

El compuesto tambien puede combinarse en una composition farmaceutica con sustancias farmacologicas broncodilatadoras o antihistamlnicas. Tales farmacos broncodilatadores incluyen agentes anticolinergicos o antimuscarlnicos, en particular bromuro de ipratropio, bromuro de oxitropio y bromuro de tiotropio, y agonistas de receptores b-2-adrenergicos tales como salbutamol, terbutalina, salmeterol, carmoterol, milveterol y, especialmente, formoterol o indacaterol. Las sustancias farmacologicas antihistamlnicas coterapeuticas incluyen clorhidrato de cetirizina, fumarato de clemastina, prometazina, loratadina, desloratadina-difenhidramina y clorhidrato de fexofenadina.

Tambien puede proporcionarse una combinacion que comprende el compuesto y uno o mas compuestos que son utiles para el tratamiento de una enfermedad trombolltica, enfermedad cardiaca, accidente cerebrovascular, etc. Tales compuestos incluyen aspirina, una estreptocinasa, un activador del plasminogeno tisular, una urocinasa, un anticoagulante, farmacos antiplaquetarios (por ejemplo, PLAVIX; bisulfato de clopidogrel), una estatina (por ejemplo, LIPITOR o atorvastatina calcica), ZOCOR (simvastatina), CRESTOR (rosuvastatina), etc.), un beta-bloqueante (por ejemplo, atenolol), NORVASC (besilato de amlodipino) y un inhibidor de ACE (por ejemplo, lisinopril).

Tambien puede proporcionarse una combinacion que comprende el compuesto y uno o mas compuestos que son utiles para el tratamiento de antihipertension. Tales compuestos incluyen inhibidores de ACE, agentes hipolipemiantes tales como estatinas, LIPITOR (atorvastatina calcica), bloqueantes de los canales de calcio tales como NORVASC (besilato de amlodipino).

Tambien puede proporcionarse una combinacion que comprende el compuesto y uno o mas compuestos seleccionados del grupo que consiste en fibratos, beta-bloquetantes, inhibidores de NePi, antagonistas del receptor de angiotensina-2 e inhibidores de la agregacion plaquetaria.

Tambien puede proporcionarse una combinacion que comprende el compuesto y un compuesto adecuados para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, incluyendo artritis reumatoide. Tal compuesto puede seleccionarse del

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grupo que consiste en inhibidores de TNF-a tales como anticuerpos monoclonales anti-TNF-a (tales como REMICADE, CDP-870) y D2E7 (HUMIRA) y moleculas de fusion de inmunoglobulina-receptor de TNF (tales como ENBREL), inhibidores de IL-1, antagonistas de receptor o IL-1Ra soluble (por ejemplo inhibidores de ICE o KINERET), agentes antiinflamatorios no esteroideos (AINE), piroxicam, diclofenaco, naproxeno, flurbiprofeno, fenoprofeno, ketoprofeno, ibuprofeno, fenamatos, acido mefenamico, indometacina, sulindaco, apazona, pirazolonas, fenilbutazona, aspirina, inhibidores de COX-2 (tal como CELEBREX (celecoxib), PREXIGE (lumiracoxib)), inhibidores de metaloproteasa (preferiblemente inhibidores selectivos de MMP-13), inhibidores de p2x7, inhibidores de a2a, NEUROTIN, pregabalina, metotrexato a dosis baja, leflunomida, hidroxixcloroquina, d- penicilamina, auranofina u oro parenteral u oral.

Tambien puede proporcionarse una combination que comprende el compuesto y un compuesto adecuados para el tratamiento de osteoartritis. Tal compuesto puede seleccionarse del grupo que consiste en agentes antiinflamatorios no esteroideos convencionales (a continuation en el presente documento AINE) tales como piroxicam, diclofenaco, acidos propionicos tales como naproxeno, flurbiprofeno, fenoprofeno, ketoprofeno e ibuprofeno, fenamatos tales como acido mefenamico, indometacina, sulindaco, apazona, pirazolonas tales como fenilbutazona, salicilatos tales como aspirina, inhibidores de COX-2 tales como celecoxib, valdecoxib, lumiracoxib y etoricoxib, analgesicos y terapias intraarticulares tales como corticosteroides y acidos hialuronicos tales como Hyalgan y Synvisc.

Tambien puede proporcionarse una combinacion que comprende el compuesto y un agente antiviral y/o un compuesto antisepsia. Tal agente antiviral puede seleccionarse del grupo que consiste en Viracept, AZT, aciclovir y famciclovir. Tal compuesto antisepsia puede seleccionarse del grupo que consiste en Valant.

Tambien puede proporcionarse una combinacion que comprende el compuesto y uno o mas agentes seleccionados del grupo que consiste en agentes para el SNC tales como antidepresivos (sertralina), farmacos antiparkinsonianos (tales como deprenilo, Ldopa, Requip, Mirapex; inhibidores de MAOB (tales como selegina y rasagilina); inhibidores de comP (tales como Tasmar); inhibidores de A-2; inhibidores de la recaptacion de dopamina; antagonistas de NMDA; agonistas de nicotina; agonistas de dopamina; e inhibidores de acido nltrico sintasa neuronal).

Tambien puede proporcionarse una combinacion que comprende un compuesto de la invention y uno o mas farmacos contra el Alzheimer. Tal farmaco contra el Alzheimer puede seleccionarse del grupo que consiste en donepezilo, tacrina, inhibidores de a28, NEUROTIN, pregabalina, inhibidores de COX-2, propentofilina o metrifonato.

Tambien puede proporcionarse una combinacion que comprende un compuesto de la invencion y agentes contra la osteoporosis y/o un agente inmunosupresor. Tales agentes contra la osteoporosis pueden seleccionarse del grupo que consiste en EVISTA (clorhidrato de raloxifeno), droloxifeno, lasofoxifeno o fosomax. Tales agentes inmunosupresores pueden seleccionarse del grupo que consiste en FK-506 y rapamicina.

Tambien pueden proporcionarse kits que incluyen el compuesto la invencion y una pareja de combinacion tal como se da a conocer en el presente documento. Los kits representativos incluyen un compuesto inhibidor de PI3K (por ejemplo, el compuesto de la invencion) y un folleto u otro etiquetado que incluye instrucciones para tratar una enfermedad proliferativa celular mediante la administration de una cantidad inhibidora de PI3K del compuesto.

En general, el compuesto de la invencion se administrara en una cantidad terapeuticamente eficaz mediante cualquiera de los modos de administracion aceptados para agentes que sirven para utilidades similares. La cantidad real del compuesto de la invencion, es decir, el principio activo, dependera de numeroso factores tales como la gravedad de la enfermedad que va a tratarse, la edad y la salud relativa del sujeto, la potencia del compuesto usado, la via y forma de administracion, y otros factores. El farmaco puede administrarse mas de una vez al dla, preferiblemente una o dos veces al dla. Todos estos factores estan dentro de los conocimientos del medico encargado. Las cantidades terapeuticamente eficaces de compuestos de formulas I pueden oscilar entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal del receptor al dla; preferiblemente de aproximadamente 0,1-25 mg/kg/dla, mas preferiblemente entre aproximadamente 0,5 y 10 mg/kg/dla. Por tanto, para la administracion a una persona de 70 kg, el intervalo de dosificacion sera lo mas preferiblemente de aproximadamente 35-70 mg al dla.

En general, el compuesto de la invencion se administrara como composiciones farmaceuticas por una cualquiera de las siguientes vlas: administracion oral, sistemica (por ejemplo, transdermica, intranasal o mediante supositorio) o parenteral (por ejemplo, intramuscular, intravenosa o subcutanea). El modo de administracion preferido es el oral usando un regimen de dosificacion diaria conveniente que puede ajustarse segun el grado de afectacion. Las composiciones pueden adoptar la forma de comprimidos, pastillas, capsulas, productos semisolidos, polvos, formulaciones de liberacion sostenida, disoluciones, suspensiones, elixires, aerosoles, o cualquier otra composicion apropiada. Otro modo preferido para administrar el compuesto de la invencion es mediante inhalacion. Esto es un metodo eficaz para administrar un agente terapeutico directamente a las vlas respiratorias.

La election de la formulation depende de diversos factores tales como el modo de administracion del farmaco y la

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biodisponibilidad de la sustancia farmacologica. Para la administracion mediante inhalacion, el compuesto puede formularse como disolucion llquida, suspensiones, propelentes de aerosol o polvo seco y cargarse en un dispensador adecuado para la administracion. Existen varios tipos de dispositivos de inhalacion farmaceutica- inhaladores de nebulizador, inhaladores de dosis medida (MDI) e inhaladores de polvo seco (DPI). Los dispositivos de nebulizador producen una corriente de aire a alta velocidad que provoca que los agentes terapeuticos (que se formulan en forma llquida) se pulvericen como una neblina que se lleva al interior de las vlas respiratorias del paciente. Los MDI normalmente son una formulacion envasada con un gas comprimido. Tras su accionamiento, el dispositivo descarga una cantidad medida de agente terapeutico mediante el gas comprimido, proporcionando por tanto un metodo fiable de administracion de una cantidad establecida de agente. DPI dispensa agentes terapeuticos en forma de un polvo de flujo libre que puede dispersarse en la corriente de aire de inspiracion del paciente durante la respiracion mediante el dispositivo. Para lograr un polvo de flujo libre, el agente terapeutico se formula con un excipiente tal como lactosa. Se almacena una cantidad medida del agente terapeutico en forma de capsula y se dispensa con cada accionamiento.

La invention tambien se refiere a formulaciones en las que el tamano de partlcula de un compuesto de formula (I) es de entre 10 - 1000 nm, preferiblemente 10 - 400 nm. Tales formulaciones farmaceuticas se han desarrollado especialmente para farmacos que presentan escasa biodisponibilidad basandose en el principio de que puede aumentarse la biodisponibilidad mediante el aumento del area superficial, es decir, la disminucion del tamano de partlcula. Por ejemplo, el documento U.S. 4.107.288 describe una formulacion farmaceutica que tiene partlculas en el intervalo de tamano de desde 10 hasta 1.000 nm en la que el material activo esta soportado sobre una matriz reticulada de macromoleculas. El documento U.S. 5.145.684 describe la production de una formulacion farmaceutica en la que se pulveriza la sustancia farmacologica a nanopartlculas (tamano de partlcula promedio de 400 nm) en presencia de un modificador de superficie y luego se dispersan en un medio llquido para dar una formulacion farmaceutica que presenta una biodisponibilidad notablemente alta. Ambos documentos se incluyen como referencia.

En un aspecto adicional, la invencion proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden (una cantidad terapeuticamente eficaz de) un compuesto de la invencion, y al menos un excipiente farmaceuticamente aceptable. Excipientes aceptables son no toxicos, ayudan a la administracion y no afectan adversamente al beneficio terapeutico del compuesto de la invencion. Tal excipiente puede ser cualquier excipiente solido, llquido, semisolido o, en el caso de una composicion de aerosol, gaseoso que esta disponible en general para un experto en la tecnica.

Los excipientes farmaceuticos solidos incluyen almidon, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sllice, estearato de magnesio, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo y similares.

Pueden seleccionarse excipientes llquidos y semisolidos de glicerol, propilenglicol, agua, etanol y diversos aceites, incluyendo los del origen del petroleo, animal, vegetal o sintetico, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo, etc. Los portadores llquidos preferidos, particularmente para disoluciones inyectables, incluyen agua, solution salina, dextrosa acuosa y glicoles.

Pueden usarse gases comprimidos para dispersar un compuesto de la invencion en forma de aerosol. Gases inertes adecuados para este fin son nitrogeno, dioxido de carbono, etc. Otros excipientes farmaceuticos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, editado por E. W. Martin (Mack Publishing Company, 18a ed., 1990). La cantidad del compuesto en una formulacion puede variar dentro del intervalo completo empleado por los expertos en la tecnica. Normalmente, la formulacion contendra, en una base de porcentaje en peso (% en peso), desde aproximadamente el 0,01-99,99% en peso de un compuesto de la invencion basandose en la formulacion total, siendo el resto uno o mas excipientes farmaceuticos adecuados. Preferiblemente, el compuesto esta presente a un nivel de aproximadamente el 1-80% en peso.

La invencion se refiere ademas a composiciones farmaceuticas que comprenden (es decir que contienen o que consisten en) al menos un compuesto de la invencion y al menos un excipiente farmaceuticamente aceptable.

Pueden fabricarse composiciones farmaceuticas que comprenden un compuesto de la invencion en forma libre o en forma de sal farmaceuticamente aceptable en asociacion con al menos un excipiente farmaceutico aceptable (tal como un portador y/o diluyente) de manera convencional mediante el mezclado de los componentes.

Pueden fabricarse composiciones farmaceuticas combinadas que comprenden un compuesto de la invencion en forma libre o en forma de sal farmaceuticamente aceptable y que comprenden ademas una pareja de combination (o bien en una forma unitaria de dosificacion o bien como un kit de partes) en asociacion con al menos un portador y/o diluyente farmaceutico aceptable de manera convencional mediante el mezclado con un portador y/o diluyente farmaceuticamente aceptable con dichos principios activos.

Por consiguiente, la invencion proporciona en aspectos adicionales

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■ una composicion farmaceutica combinada, por ejemplo para su uso en cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, que comprende un compuesto de la invencion en forma libre o forma de sal farmaceuticamente aceptable en asociacion con un diluyente y/o portador farmaceuticamente aceptable.

■ una composicion farmaceutica combinada que comprende un compuesto de la invencion en forma libre o en forma de sal farmaceuticamente aceptable como principio activo; uno o mas materiales portadores y/o diluyentes farmaceuticamente aceptables y opcionalmente una o mas sustancias farmacologicas adicionales. Tal composicion farmaceutica combinada puede estar en forma de una forma unitaria de dosificacion o como kit de partes.

■ una composicion farmaceutica combinada que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de la invencion en forma libre o en forma de sal farmaceuticamente aceptable y una segunda sustancia farmacologica, para administracion simultanea o secuencial.

■ un compuesto de la invencion para su uso en un metodo, segun se definio anteriormente, que comprende coadministrar, por ejemplo de manera concomitante o en secuencia, una cantidad terapeuticamente eficaz, no toxica de un compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y al menos una segunda sustancia farmacologica, por ejemplo tal como se indico anteriormente.

■ una combinacion farmaceutica, por ejemplo un kit, que comprende a) un primer agente que es un compuesto de la invencion tal como se da a conocer en el presente documento, en forma libre o en forma de sal farmaceuticamente aceptable, y b) al menos un coagente, por ejemplo tal como se indico anteriormente; mediante lo cual tal kit puede comprender instrucciones para su administracion.

Los siguientes ejemplos ilustran la invencion. Se proporciona el ejemplo 1 para fines de referencia. A continuation

en el presente documento se describen metodos para preparar tales compuestos.

Ejemplo 1: 2-Amida y 1-{[5-(2-terc-butil-piridin-4-il)-4-metil-tiazol-2-il]-amida} del acido (S)-pirrolidin-1,2-

dicarboxflico

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Se anade Et3N (1,54 ml, 11,1 mmol, 3 eq) a una disolucion de [5-(2-terc-butil-piridin-4-il)-4-metil-tiazol-2-il]-amida del acido imidazol-1-carboxllico (etapa 1.1) (1,26 g, 3,7 mmol) y L-prolinamida (0,548 g, 4,8 mmol, 1,3 eq) en DMF (25 ml), bajo una atmosfera de argon. Se agita la mezcla de reaction durante 14 h a ta, se extingue mediante adicion de una disolucion saturada de NaHCO3, y se extrae con EtOAc. Se lava la fase organica con una disolucion saturada de NaHCO3, se seca (Na2SO4), se filtra y se concentra. Se purifica el residuo mediante cromatografla en columna sobre gel de sllice (DCM/MeOH, 1:0 ^ 94:6), seguido por trituracion en Et2O para proporcionar 1,22 g del compuesto del tltulo como un solido blanquecino: ESI-EM: 388,1 [M+H]+; tR = 2,35 min (sistema 1); CCF: Rf = 0,36 (DCM/MeOH, 9:1). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) S(ppm): 1,32 (s, 9 H) 1,75-1,95 (m, 3 H) 1,97 - 2,13 (m, 1 H) 2,39 (s, 3 H) 3,38-3,50 (m, 1 H) 3,52-3,65 (m, 1 H) 4,10-4,40 (m, 1 H) 6,94 (s. a., 1 H) 7,22 (d, 1 H) 7,30 - 7,48 (m, 2 H) 8,49 (d, 1 H) 10,87 (s. a., 1 H).

Etapa 1.1: r5-(2-terc-Butil-piridin-4-il)-4-metil-tiazol-2-il1-amida del acido imidazol-1-carboxilico

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Se agita una mezcla de 5-(2-terc-butil-piridin-4-il)-4-metil-tiazol-2-ilamina (etapa 1.2) (1 g, 4,05 mmol) y 1,1'- carbonildiimidazol (0,984 g, 6,07 mmol, 1,5 eq) en DCM (50 ml) durante 4 h a reflujo y se deja enfriar. Se recoge el 5 precipitado resultante mediante filtracion para proporcionar 1,26 g del compuesto del tltulo como un solido blanco: ESI-EM: 340,2 [M-H]-; tp= 2,85 min (sistema 1).

Etapa 1.2: 5-(2-terc-Butil-pi ridin-4-il)-4-metil-ti azol-2-ilamina

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Se agita una mezcla de N-[5-(2-terc-butil-piridin-4-il)-4-metil-tiazol-2-il]-acetamida (etapa 1.3) (2 g, 7 mmol), una 10 disolucion acuosa 6 N de HCl (10 ml) y EtOH (50 ml) durante 2 h a 85°C, se deja enfriar, se extingue mediante adicion de una disolucion saturada de NaHCO3 y se extrae con DCM/MeOH (9:1, v/v). Se lava la fase organica con una disolucion saturada de NaHCO3, se seca (Na2SO4), se filtra y se concentra. Se purifica el residuo mediante cromatografla en columna sobre gel de sllice (DCM/MeOH, 1:0 ^ 96:4) para proporcionar 1,21 g del compuesto del tltulo como un solido amarillo: ESI-EM: 248,1 [M+H]+; CCF: Rf = 0,36 (DCM/MeOH, 9:1).

15 Etapa 1.3: N-[5-(2-terc-Butil-piridin-4-il)-4-metil-tiazol-2-il1-acetamida

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Se agita una mezcla de 2-acetamido-4-metiltiazol (1,2 g, 7,7 mmol, 1,1 eq), carbonato de cesio (4,55 g, 14 mmol, 2 eq), tetrafluoroborato de tri-terc-butilfosfinio (0,406 g, 1,4 mmol, 0,2 eq), acetato de paladio (II) (0,15 g, 0,7 mmol, 0,1 eq) y 4-bromo-2-terc-butil-piridina (etapa 1.4) (1,5 g, 7 mmol) en DMF (50 ml) durante 1,5 h a 90°C bajo una 20 atmosfera de argon, se deja enfriar, se extingue mediante adicion de una disolucion saturada de NaHCO3 y se filtra a traves de un lecho de Celite. Se extrae el filtrado con EtOAc. Se lava la fase organica con una disolucion saturada de NaHCO3, se seca (Na2SO4), se filtra y se concentra. Se purifica el residuo mediante cromatografla en columna sobre gel de sllice (DCM/MeOH, 1:0 ^ 97:3) para proporcionar 2,02 g del compuesto del tltulo como un solido amarillo: ESI-EM: 290,1 [M+H]+; CCF: Rf = 0,35 (DCM/MeOH, 9:1).

25 Etapa 1.4: 4-Bromo-2-terc-butil-piridina Br

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Se calienta una mezcla de 2-terc-butil-1 H-piridin-4-ona (etapa 1.5) (4,25 g, 28 mmol) y POBr3 (8,88 g, 31 mmol, 1,1 eq) hasta 120°C, se agita durante 15 min, se deja enfriar, se extingue mediante adicion de una disolucion saturada de NaHCO3 y se extrae con DCM/MeOH (9:1, v/v). Se lava la fase organica con una disolucion saturada de 30 NaHCO3, se seca (Na2SO4), se filtra y se concentra. Se purifica el residuo mediante cromatografla en columna sobre

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gel de sliice (Hex/EtOAc, 95:5) para proporcionar 5,18 g del compuesto del tltulo como un aceite amarillo: ESI-EM: 214,0 / 216,0 [M+H]+; tR = 2,49 min (sistema 1); CCF: Rf = 0,35 (Hex/EtOAc, 1:1).

Etapa 1.5: 2-terc-Butil-1H-piridin-4-ona

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Se agita una mezcla de 2-terc-butil-piran-4-ona (etapa 1.6) (5,74 g, 37,7 mmol) y una disolucion acuosa al 30% de hidroxido de amonio (100 ml) durante 1 h a reflujo, se deja enfriar y se concentra. Se tritura el residuo con MeOH (200 ml) y se filtra. Se concentra el filtrado y se purifica el residuo mediante cromatografla en columna sobre gel de sllice (DCM/MeOH/NH3 ac., 94:5:1 ^ 92:7:1) para proporcionar 4,46 g del compuesto del tltulo como un solido amarillo: ESI-EM: 152,0 [M+H]+; tR = 1,45 min (sistema 1); CCF: Rf = 0,11 (DCM/MeOH, 9:1).

Etapa 1.6: 2-terc-Butil-piran-4-ona

O

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Se agita una mezcla de 5-hidroxi-1-metoxi-6,6-dimetil-hepta-1,4-dien-3-ona (etapa 1.7) (6,8 g, 36,9 mmol) y TFA (5,65 ml, 74 mmol, 2 eq) en benceno (250 ml) durante 14 h a ta y se concentra. La purificacion del residuo mediante cromatografla en columna sobre gel de sllice (Hex/EtOAc, 1:0 ^ 75:25) proporciona 5,74 g del compuesto del tltulo como un aceite amarillo: ESI-EM: 153,1 [M+H]+; tR = 3,21 min (sistema 1); cCf: Rf = 0,22 (Hex/EtOAc, 1:1).

Etapa 1.7: 5-Hidroxi-1-metoxi-6,6-dimetil-hepta-1.4-dien-3-ona

OH O

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Se anade LiHMDS (1 M en THF, 100 ml, 2 eq) gota a gota a una disolucion frla (-78°C) de 4-metoxi-3-buten-2-ona (10 ml, 100 mmol, 2 eq) en THF (400 ml). Tras agitacion durante 30 min a -78°C, se anade una disolucion de cloruro de pivalollo (6,12 ml, 50 mmol) en THF (100 ml). Se deja calentar la mezcla resultante hasta ta a lo largo de 2 h y se extingue mediante adicion de una disolucion saturada de NH4O. Se elimina el THF a vaclo. Se extrae la mezcla concentrada con Et2O. Se lava la fase organica con salmuera, se seca (Na2SO4), se filtra y se concentra. Se purifica el residuo mediante cromatografla en columna sobre gel de sllice (Hex/EtOAc, 1:0 ^ 85:15) para proporcionar 6,83 g del compuesto del tltulo como un aceite amarillo: ESI-EM: 185,1 [M+H]+; CCF: Rf = 0,87 (Hex/EtOAc, 1:1).

Ejemplo 15: 2-Amida y 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) del acido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxflico

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Se prepara el compuesto del tltulo de manera analoga al procedimiento descrito en el ejemplo 1 pero con las siguientes modificaciones. En la etapa 1.1, se agita la mezcla de reaccion durante 14 h a reflujo. En la etapa 1.2, se agita la mezcla de reaccion durante 1 h a 85°C y se extrae con EtOAc tras haberse extinguido. En la etapa 1.3, se agita la mezcla de reaccion durante 2,5 h a 120°C. En la etapa 1.4, se agita la mezcla de reaccion durante 1 h a 83°C y se extrae con EtOAc tras haberse extinguido. En la etapa 1.5, se agita la mezcla de reaccion durante 1 h a

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65°C y no se realiza la trituracion en MeOH. En la etapa 1.6, no se purifica el producto bruto. En la etapa 1.7, se usa cloruro de 3,3,3-trifluoro-2,2-dimetil-propionilo (etapa 12.1).

Compuesto del tltulo: ESI-EM: 442,0 [M+H]+; tR = 3,02 min (sistema 1); CCF: Rf = 0,35 (DCM/MeOH, 9:1). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 (ppm): 1,60 (s, 6 H) 1,70-1,95 (m, 3 H) 1,99 - 2,16 (m, 1 H) 2,40 (s, 3 H) 3,38 - 3,51 (m, 1 H) 3,51 - 3,69 (m, 1 H) 4,10-4,40 (m, 1 H) 6,95 (s. a., 1 H) 7,39 (d, 2 H) 7,53 (s, 1 H) 8,58 (d, 1 H) 10,93 (s. a., 1 H).

En un procedimiento alternativo se prepara el compuesto del tltulo de manera analoga al procedimiento descrito en el ejemplo 1 pero con las siguientes modificaciones: se usa N,N-dimetilacetamida en lugar de DMF y se agita la mezcla a 65°C durante 2 h. En la etapa 1.1, se usa cloroformiato de fenilo (anadido lentamente) en lugar de 1,1'- carbonildiimidazol y se lleva a cabo la reaccion en THF en presencia de N,N-dietil-isopropilamina a temperatura ambiente (1,5 h). En la etapa 1.2, se calienta la mezcla de reaccion con agitacion durante 5 h a reflujo y se extrae con EtOAc tras haberse extinguido. En la etapa 1.3, se agita la mezcla de reaccion durante 2 h a 100°C. En la etapa 1.4, se realiza la reaccion en tolueno usando 1,1 equivalentes de POBr3 y 1,1 equivalentes de tripropilamina y se agita la mezcla durante 2 h a 80°C y se extrae con EtOAc tras haberse extinguido. En la etapa 1.5, se agita la mezcla de reaccion durante 1 h a 65°C y no se realiza la trituracion en MeOH. En la etapa 1.6, se usa tolueno en lugar de benceno y no se purifica el producto bruto. En la etapa 1.7, se usa cloruro de 3,3,3-trifluoro-2,2-dimetil- propionilo (etapa 12.1).

Etapa 12.1: Cloruro de 3,3.3-trifluoro-2.2-dimetil-propionilo

Se prepara el compuesto del tltulo de manera analoga al procedimiento descrito en la etapa 5.1 pero usando acido 3,3,3-trifluoro-2,2-dimetil-propionico.

Etapa 5.1: Cloruro de 1-metil-ciclopropanocarbonilo

COCI

Se agita una mezcla de acido 1-metil-ciclopropanocarboxllico (10 g, 100 mmol) y cloruro de oxalilo (10,49 ml, 120 mmol, 1,2 eq) en CHCl3 (80 ml) durante 4 h a 70°C. Se concentra la mezcla de reaccion para proporcionar 11,8 g del compuesto del tltulo como un aceite amarillo que se usa sin purificacion adicional.

Condiciones de HPLC analitica:

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Gradiente lineal del 20-100% de disolvente A en 5 min + 1,5 min con el 100% de disolvente A; deteccion a 215 nm, velocidad de flujo de 1 ml/min a 30°C. Columna: Nucleosil 100-3 C18 (70 x 4,0 mm). Disolvente A = CH3CN + TFA al 0,1%; disolvente B = H2O + TFA al 0,1%.

Condiciones de EM:

Instrumento: Micromass Platform II, eluyente: metanol al 15% en agua que contiene el 0,2% de una disolucion de hidroxido de amonio al 25%.

Espectros de 1H-RMN: se midieron en un espectrometro Varian Mercury 400 en los disolventes indicados. Abreviaturas: a: ancho; s: singlete; d: doblete; t: triplete; q: cuartete; ppm: parte por millon

Condiciones de HPLC/EM:

Instrumento: Hewlett Packard Agilent serie 1100, columna: XBridge™ C18 2,5 micrometres, 3,0 X 30 mm, temperatura: 50°C, eluyente: sistema de 2 canales: canal A con acetonitrilo al 5% en agua, canal B con acetonitrilo que contiene acido formico al 1,0%.

Tiempo (minutos): % de canal B Flujo (ml/minuto)

0: 5 1,4

3,7: 95 1,4

4,4: 95 2,4

Tiempo (minutos) % de canal B Flujo (ml/minuto)

4,45 95 2,4

Deteccion: Agilent 1100 DAD a 210-350 nm y Waters Micromass ZQ 2000 con ESI+ y ESI-.

HPLC preparativa:

Instrumento: Sistema de HPLC preparativa de Gilson, columna: Sunfire™ Prep C18 OBD™ 5 micrometros, 30 X 100 mm, temperatura: 25°C, eluyente: gradiente de desde el 5 - 100% de acetonitrilo en acido trifluoroacetico acuoso 5 al 0,05% a lo largo de 20 minutos, velocidad de flujo: 30 ml/minuto, deteccion: UV 254 nm.

Abreviaturas y acronimos:

BBr3

tBuP.HBF4

DCM

DIEA

DMAP

DME

DMF

DMP

DMSO

Hex

l

LiHMDS

p.f.

MPLC

NBS

NMP

PdCb(dppf)

Pd(PPh3)4

Rf

ta

TFA

THF

CCF

tR

v

tribromuro de boro

tetrafluoroborato de tri-terc-butilfosfinio

diclorometano

diisopropiletilamina

4-(dimetilamino)piridina

1.2- dimetoxietano dimetilformamida

1.3- dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2-(1H)-pirimidinona dimetilsulfoxido

hexano

litro(s)

bis(trimetilsilil)amiduro de litio punto de fusion

cromatografla de llquidos de media presion

N-bromosuccinimida

1-metil-2-pirrolidona

[1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaladio (II)

tetrakis(trifenilfosfina)paladio (0)

factor de retencion (CCF)

temperatura ambiente

acido trifluoroacetico

tetrahidrofurano

cromatografla en capa fina

tiempo de retencion

volumen

p

peso

Ejemplo A: eficacia como inhibidores de PI3 cinasas

Ensayo de PI3K KinaseGlo: se dispensaron 50 nl de diluciones de compuestos sobre placas negras de 384 pocillos, de pequeno volumen, de estireno antiadherente (NBS) (Costar, n.° de cat. NBS#3676). Se transfirio L-a- 10 fosfatidilinositol (PI), proporcionado como disolucion 10 mg/ml en metanol, al interior de un tubo de vidrio y se seco bajo una corriente de nitrogeno. Despues se resuspendio en octilglucosido (OG) al 3% mediante agitacion con vortex y se almaceno a 4°C. El ensayo de cinasa luminiscente KinaseGlo (Promega, Madison/WI, EE.UU.) es un metodo de HTS homogeneo de medicion de la actividad cinasa mediante cuantificacion de la cantidad de ATP que queda en disolucion tras una reaccion con cinasa.

15 Se anadieron 5 ml de una mezcla de PI/OG con el subtipo PI3K (tabla 1). Se iniciaron reacciones con cinasa mediante adicion de 5 ml de una mezcla de ATP que contenla en un volumen final 10 ml de TRIS-HCl 10 mM pH 7,5, MgCl2 3 mM, NaCl 50 mM, CHAPS al 0,05%, DTT 1 mM y ATP 1 mM, y se produjo a temperatura ambiente. Se detuvieron las reacciones con 10 ml de KinaseGlo y se leyeron las placas 10 min despues en un lector Synergy2 usando un tiempo de integracion de 0,1 segundos por pocillo. Se anadieron 2,5 mM de un pan-inhibidor de PI3 20 cinasa de clase 1 (patron) a las placas de ensayo para generar el 100% de inhibicion de la reaccion con cinasa, y se facilito el 0% de inhibicion mediante el vehlculo de disolvente (DMSO al 90% en agua). Se uso el patron como compuesto de referencia y se incluyo en todas las placas de ensayo en forma de 16 puntos de dilucion por duplicado.

5

10

15

20

25

30

35

Tabla 1 PI3K mediante KinaseGlo: condiciones de ensayo y protocolo de reactivos

Vol (10 ml): Enzima (nM) ATP (mM) PI/OG (mM/mg/ml) NaCl (mM) Mg2+ (mM) CHAPS (%) DTT (mM) tiempo (min)

PI3Ka: 10 1 11/10 50 3 0,05 1 30

PI3Kb: 25 1 11/10 50 3 0,05 1 30

PI3Kg: 150 1 22/20 50 3 0,05 1 90

PI3K8: 10 1 11/10 50 3 0,05 1 30

Clonacion de las PI3K

Los constructos de PI3Ka, PI3KP y PI3K8 son fusiones del dominio iSH2 de p85a y las respectivas isoformas de p110. Se generaron los genes de isoforma de p110 y el fragmento p85a mediante PCR a partir de ADNc de primera hebra generado mediante RT-PCR a partir de ARN comercial de placenta, testlculos y cerebro tal como se describe a continuacion. Se obtuvo el constructo de PI3Kg de Roger Williams lab, MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, R.U. (noviembre de 2003) y se describe (Pacold, Michael E.; Suire, Sabine; Perisic, Olga; Lara- Gonzalez, Samuel; Davis, Colin T.; Walker, Edward H.; Hawkins, Phillip T.; Stephens, Len; Eccleston, John F.; Williams, Roger L. Crystal structure and functional analysis of Ras binding to its effector phosphoinositide 3-kinase gamma. Cell (2000), 103(6), 931-943).

Protelnas y constructos de PI3Ka

PI3Ka de tipo natural

BV1075

p85iSH2(461-568)-GGGGGGGGGGGG-p110a (21-1068)-His

BV1075: Se genero el constructo para baculovirus BV-1075 mediante un ligamiento en tres partes que se compone de un fragmento p85 y un fragmento p110a clonados en un vector pBlueBac4.5. Se derivo el fragmento p85 del plasmido p1661-2 digerido con Nhe/Spe. Se verifico mediante secuenciacion el fragmento p110a derivado de un clon y se uso en un LR410 como fragmento de Spel/Hindlll. Para la generacion del vector de expresion en baculovirus LR410, se uso la reaccion de Gateway LR para transferir el inserto al vector pBlueBac4.5 adaptado para Gateway (Invitrogen). Se digirio el vector de clonacion pBlueBac4.5 (Invitrogen) con Nhe/HindI 11. Esto dio como resultado el constructo PED 153.8. Se genero el componente de p85 (iSH2) mediante PCR usando ORF 318 (descrito anteriormente) como molde y un cebador directo KAC1028 (5'-GCTAGCATGCGAGAATATGATAGAT- TATATGAAG-AATATACC) (SEQ ID NO: 1) y dos cebadores inversos, KAC1029 (5'-GCCTCCACCAC- CTCCGCCTG-GTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC) (SEQ ID NO: 2) y KAC1039 (5'-TACTAGTC-CGCCTCCAC- CACCTCCGCCTCCACCACCTCCGCC) (SEQ ID nO: 3). Los dos cebadores inversos se solapan e incorporan el ligador 12x Gly y la secuencia N-terminal del gen de p110a al sitio Spel. El ligador 12x Gly sustituye al ligador de una unica Gly en el constructo BV1052. Se clono el fragmento de PCR en pCR2.1 TOPO (Invitrogen). De los clones resultantes, se determino que p1661-2 era correcto mediante secuenciacion. Se digirio este plasmido con Nhe y Spel y se aislo en gel el fragmento resultante y se purifico mediante subclonacion.

Se genero el fragmento de clonacion de p110a mediante digestion enzimatica del clon LR410 (vease anteriormente) con SpeI e HindIII. El sitio Spel esta en la region codificante del gen de p110a. Se aislo en gel el fragmento resultante y se purifico para subclonacion. Se preparo el vector de clonacion, pBlueBac4.5 (Invitrogen), mediante digestion enzimatica con Nhe e HindIII. Se purifico el vector de corte con columna Qiagen y despues se desfosforilo con fosfatasa alcalina de intestino de ternera (CIP) (BioLabs). Tras completarse la reaccion con CIP, volvio a purificarse en columna el vector de corte para generar el vector final. Se realizo un ligamiento en tres partes usando ligasa rapida de Roche y las especificaciones del proveedor. Se verifico el plasmido final mediante secuenciacion.

Dominio de cinasa.

Secuencia de protelna de BV 1075:

5

10

15

20

25

1: MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK

61: EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GGGGGGGGGG

121: GLVECLLPNG MIVTLECLRE ATLITIKHEL FKEARKYPLH QLLQDESSYI FVSVTQEAER

181: EEFFDETRRL CDLRLFQPFL KVIEPVGNRE EKILNREIGF AIGMPVCEFD MVKDPEVQDF

241: RRNILNVCKE AVDLRDLNSP HSRAMYVYPP NVES SPELPK HIYNKLDKGQ IIWIWVIVS

301: PNNDKQKYTL KINHDCVPEQ VIAEAIRKKT RSMLLSSEQL KLCVLEYQGK YILKVCGCDE

361: YFLEKYPLSQ YKYIRSCIML GRMPNLMLMA KESLYSQLPM DCFTMPSYSR RISTATPYMN

421: GETSTKSLWV INSALRIKIL CATYVNVNIR DIDKIYVRTG IYHGGEPLCD NVNTQRVPCS

481: NPRWNEWLNY DIYIPDLPRA ARLCLSICSV KGRKGAKEEH CPLAWGNINL FDYTDTLVSG

541: KMALNLWPVP HGLEDLLNPI GVTGSNPNKE TPCLELEFDW FSSWKFPDM SVIEEHANWS

601: VSREAGFSYS HAGLSNRLAR DNELRENDKE QLKAISTRDP LSEITEQEKD FLWSHRHYCV

661: TIPEILPKLL LSVKWNSRDE VAQMYCLVKD WPPIKPEQAM ELLDCNYPDP MVRGFAVRC L

721: EKYLTDDKLS QYLIQLVQVL KYEQYLDNLL VRFLLKKALT NQRIGHFFFW HLKSEMHNKT

781: VSQRFGLLLE SYCRACGMYL KHLNRQVEAM EKLINLTDIL KQEKKDETQK VQMKFLVEQM

841: RRPDFMDALQ GFLSPLNPAH QLGNLRLEEC RIMS SAKRPL WLNWENPDIM SELLFQNNEI

901: IFKNGDDLRQ DMLTLQIIRI MENIWQNQGL DLRMLPYGCL SIGDCVGLIE WRNSHTIMQ

961: IQCKGGLKGA LQFNSHTLHQ WLKDKNKGEI YDAAIDLFTR SCAGYCVATF ILGIGDRHNS

1021: NIMVKDDGQL FHIDFGHFLD HKKKKFGYKR ERVPFVLTQD FLIVISKGAQ ECTKTREFER

1081: FQEMCYKAYL AIRQHANLFI NLFSMMLGSG MPELQSFDDI AYIRKTLALD KTEQEALEYF

1141: MKQMNDAHHG GWTTKMDWIF HTIKQHALNE LGGAHHHHHH (SEQ ID NO: 4)

Protelnas y constructos de PI3Kp

PI3Kb

BV949

p85iSH2(461-N58K-568)-GGGGGG-p110b(2-1070)-His

BV949: Se generaron productos de PCR para el dominio entre SH2 (iSH2) de la subunidad PI3Ka, PI3Kp y PI3K8 de p85 y para la subunidad p110p de longitud completa y se fusionaron mediante PCR solapante. Se obtuvo el producto de PCR de iSH2 a partir de ADNc de primera hebra generado mediante RT-PCR a partir de ARN humano comercial de placenta, testlculos y cerebro (Clontech), usando inicialmente los cebadores gwG130-p01 (5'- CGAGAATATGATAGATTATAT GAAGAAT -3') (SEQ ID NO: 5) y gwG130-p02 (5'-TGGTTT-

AATGCTGTTCATACGTTTGTCAAT-3') (SEQ ID No: 6). Posteriormente, en una reaccion de PCR secundaria, se anadieron sitios AttB1 de recombinacion de Gateway y secuencias de ligador en el extremo 5' y el extremo 3' del fragmento iSH2 de p85 respectivamente, usando los cebadores gwG130-p03 (5'-GGGACAAGTT- TGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGCGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3') (SEQ ID NO: 7) y gwG130-p05 (5'-ACTGAAGCATCCTCCTC-CTCCTCCT-CCTGGTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC-3') (SEQ ID NO: 8). Se obtuvo el fragmento p110p mediante PCR usando como molde un clon de p110p (de fuente desconocida cuya secuencia se verifico) usando los cebadores gwG130-p04 (5'-

ATT AAAC CAGGAGGAGGAGGAGGAGGATGCTT-CAGTTTCAT AAT GCCTCCTGCT-3') (SEQ ID NO: 9) que contiene secuencias de ligador y el extremo 5' de p110p y gwG130-p06 (5'-

AGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCCAGATC-TGTAGTCTTTCCGAA-CTGTGTG-3') (SEQ ID NO: 10) que contiene secuencias del extremo 3' de p110-p fusionadas con una cola de histidina. Se ensamblo la protelna de fusion p85-iSH2/p110p mediante una reaccion de PCR solapante de los ligadores en el extremo 3' del fragmento iSH2 y el extremo 5' del fragmento p110p, usando el cebador gwG130-p03 anteriormente mencionado y un cebador que contenla una cola de histidina solapante y las secuencias de recombinacion de AttB2 (5'- GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAAGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCC-3') (SEQ ID NO: 11). Se recombino este producto final en una reaccion de Gateway (Invitrogen) OR en el vector donador pDONR201 (Invitrogen) para generar el clon de entrada ORF253. Se verifico este clon mediante secuenciacion y se uso en una reaccion de Gateway LR (Invitrogen) para transferir el inserto al vector pBlueBac4.5 adaptado para Gateway (Invitrogen) para la generacion del vector de expresion en baculovirus LR280. Este LR280 tiene una mutacion de aminoacido en la secuencia de p85.

Dominio de cinasa.

Secuencia de protelna de BV949:

1: MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGKEK

61: EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GGGGGCFSFI

121: MPPAMADILD IWAVDSQIAS DGSIPVDFLL PTGIYIQLEV PREATISYIK QMLWKQVHNY

181: PMFNLLMDID SYMFACVNQT AVYEELEDET RRLCDVRPFL PVLKLVTRSC DPGEKLDSKI

241: GVLIGKGLHE FDSLKDPEVN EFRRKMRKFS EEKILSLVGL SWMDWLKQTY PPEHEPSIPE

301: NLEDKLYGGK LIVAVHFENC QDVFSFQVSP NMNPIKVNEL AIQKRLTIHG KEDEVSPYDY

361: VLQVSGRVEY VFGDHPLIQF QYIRNCVMNR ALPHFILVEC CKIKKMYEQE MIAIEAAINR

421: NSSNLPLPLP PKKTRIISHV WENNNPFQIV LVKGNKLNTE E TVKVHVRAG LFHGTELLCK

481: TIVSSEVSGK NDHIWNEPLE FDINICDLPR MARLCFAVYA VLDKVKTKKS TKTINPSKYQ

541: TIRKAGKVHY PVAWVNTMVF DFKGQLRTGD IILHSWSSFP DELEEMLNPM GTVQTNPYTE

601: NATALHVKFP ENKKQPYYYP PFDKIIEKAA EIASSDSANV SSRGGKKFLP VLKEILDRDP

661: LSQLCENEMD LIWTLRQDCR EIFPQSLPKL LLSIKWNKLE DVAQLQALLQ IWPKLPPREA

721: LELLDFNYPD QYVREYAVGC LRQMSDEELS QYLLQLVQVL KYEPFLDCAL SRFLLERALG

781: NRRIGQFLFW HLRSEVHIPA VSVQFGVILE AYCRGSVGHM KVLSKQVEAL NKLKTLNSLI

841: KLNAVKLNRA KGKEAMHTCL KQSAYREALS DLQSPLNPCV ILSELYVEKC KYMDSKMKPL

901: WLVYNNKVFG EDSVGVIFKN GDDLRQDMLT LQMLRLMDLL WKEAGLDLRM LPYGCLATGD

961: RSGLIEWST SETIADIQLN SSNVAAAAAF NKDALLNWLK EYNSGDDLDR AIEEFTLSCA

1021: GYCVASYVLG IGDRHSDNIM VKKTGQLFHI DFGHILGNFK SKFGIKRERV PFILTYDFIH

1081: VIQQGKTGNT EKFGRFRQCC EDAYLILRRH GNLFITLFAL MLTAGLPELT SVKDIQYLKD

1141: SLALGKSEEE ALKQFKQKFD EALRESWTTK VNWMAHTVRK DYRSGAHHHH HHGA

(SEQ ID NO: 12)

Dominio de cinasa.

Protelna y constructo de PI3Kg

PI3Kg

BV950

p110g(A143-[Met144-11021)-His

5 Constructo obtenido de Roger Williams lab, MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, R.U. (noviembre de 2003). Descripcion del constructo en (Pacold, Michael E.; Suire, Sabine; Perisic, Olga; Lara-Gonzalez, Samuel; Davis, Colin T.; Walker, Edward H.; Hawkins, Phillip T.; Stephens, Len; Eccleston, John F.; Williams, Roger L. Crystal structure and functional analysis of Ras binding to its effector phosphoinositide 3-kinase gamma. Cell (2000), 103(6), 931-943). Constructos que carecen de los 144 aa N-terminales.

10 Secuencia de protelna de BV950:

5

10

15

20

25

1: MSEESQAFQR QLTALIGYDV TDVSNVHDDE LEFTRRGLVT PRMAEVASRD PKLYAMHPWV

61: TSKPLPEYLW KKIANNCIFI VIHRSTTSQT IKVSPDDTPG AILQSFFTKM AKKKSLMDIP

121: ESQSEQDFVL RVCGRDEYLV GETPIKNFQW VRHCLKNGEE IHVVLDTPPD PALDEVRKEE

181: WPLVDDCTGV TGYHEQLTIH GKDHESVFTV SLWDCDRKFR VKIRGIDIPV LPRNTDLTVF

241: VEANIQHGQQ VLCQRRTSPK PFTEEVLWNV WLEFSIKIKD LPKGALLNLQ IYCGKAPALS

301: SKASAESPSS ESKGKVRLLY YVNLLLIDHR FLLRRGEYVL HMWQISGKGE DQGSFNADKL

361: TSATNPDKEN SMSISILLDN YCHPIALPKH QPTPDPEGDR VRAEMPNQLR KQLEAIIATD

421: PLNPLTAEDK ELLWHFRYES LKHPKAYPKL FSSVKWGQQE IVAKTYQLLA RREVWDQSAL

481: DVGLTMQLLD CNFSDENVRA IAVQKLESLE DDDVLHYLLQ LVQAVKFEPY HDSALARFLL

541: KRGLRNKRIG HFLFWFLRSE IAQSRHYQQR FAVILEAYLR GCGTAMLHDF TQQVQVIEML

601: QKVTLDIKSL SAEKYDVSSQ VISQLKQKLE NLQNSQLPES FRVPYDPGLK AGALAIEKCK

661: VMASKKKPLW LEFKCADPTA LSNETIGIIF KHGDDLRQDM LILQILRIME SIWETESLDL

721: CLLPYGCIST GDKIGMIEIV KDATTIAKIQ QSTVGNTGAF KDEVLNHWLK EKSPTEEKFQ

781: AAVERFVYSC AGYCVATFVL GIGDRHNDNI MITETGNLFH IDFGHILGNY KSFLGINKER

841: VPFVLTPDFL FVMGTSGKKT SPHFQKFQDI CVKAYLALRH HTNLLIILFS MMLMTGMPQL

901: TSKEDIEYIR DALTVGKNEE DAKKYFLDQI EVCRDKGWTV QFNWFLHLVL GIKQGEKHSA

961: hhhhhh (SEQ ID NO: 13)

Protelna y constructo de PI3K8

PI3K8

BV1060

p85iSH2(461-568)-GGGGGG-p1108(2-1044)-His

BV1060: Se generaron productos de PCR para el dominio entre SH2 (iSH2) de la subunidad p85 y para la subunidad p1108 de longitud completa y se fusionaron mediante PCR solapante. Se genero el producto de PCR de iSH2 usando como molde el ORF318 (vease anteriormente) y los cebadores gwG130-p03 (5'-GGGACAAG- TTT GT ACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGAT AT ACAT AT GC-GAGAAT AT GAT AGATT AT AT GAAGAAT-3') (SEQ ID NO: 7) y gwG154-p04 (5'-TCCTCCTCCT-CCTCCTCCTGGTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC- 3') (SEQ ID NO: 14). Se obtuvo el fragmento p1108 a partir de ADNc de primera hebra generado mediante RT-PCR a partir de ARN humano comercial de placenta, testlculos y cerebro (Clontech), usando inicialmente los cebadores gwG154-p01 (5'- ATGCCCCCTGGGGTGGACTGCCCCAT-3') (SEQ ID NO: 15) y gwG154-p02 (5'-CTACTGCCTGT- TGTCTTTGGACACGT-3') (SEQ ID NO: 16). En una reaccion de PCR posterior se anadieron secuencias de ligador y una cola de histidina en el extremo 5' y el extremo 3' del fragmento p1108 respectivamente, usando los cebadores gw154-p03 (5'-ATTAAACCAGGAGGAGGAGGAGGAGGACCCCCTGGGGTGGAC-TGCCCCATGGA-3') (SEQ ID NO: 17) y gwG154-p06 (5'-AGCTCCGTGATGGTGATGGTGAT-GTGCT-CCCTGCCTGTTGTCTTTGGACACGTTGT- 3') (SEQ ID NO: 18). Se ensamblo la protelna de fusion p85-iSH2/p1108 en una tercera reaccion de PCR mediante los ligadores solapantes en el extremo 3' del fragmento iSH2 y el extremo 5' del fragmento p1108, usando el cebador gwG130-p03 anteriormente mencionado y un cebador que contenla una cola de histidina solapante y las secuencias de recombination de AttB2 de Gateway (Invitrogen) (5'-GGG-ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAA- GCTCCGTGATGGTGATGGTGAGTGCTCC-3') (SEQ ID nO: 19). Se recombino este producto final en una reaccion de Gateway OR en el vector donador pDONR201 (Invitrogen) para generar el clon de entrada ORF319. Se verifico este clon mediante secuenciacion y se uso en una reaccion de Gateway LR (Invitrogen) para transferir el inserto al vector pBlueBac4.5 adaptado para Gateway (Invitrogen) para la generation del vector de expresion en baculovirus LR415.

Secuencia de protelna de BV1060:

1: MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK

61: EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GGGGGPPGVD

121: CPMEFWTKEE NQSWVDFLL PTGVYLNFPV SRNANLSTIK QLLWHRAQYE PLFHMLSGPE

181: AYVFTCINQT AEQQELEDEQ RRLCDVQPFL PVLRLVAREG DRVKKLINSQ ISLLIGKGLH

241: EFDSLCDPEV NDFRAKMCQF CEEAAARRQQ LGWEAWLQYS FPLQLEPSAQ TWGPGTLRLP

301: NRALLVNVKF EGSEESFTFQ VSTKDVPLAL MACALRKKAT VFRQPLVEQP EDYTLQVNGR

361: HEYLYGSYPL CQFQYICSCL HSGLTPHLTM VHSSSILAMR DEQSNPAPQV QKPRAKPPPI

5

10

15

20

25

30

35

40

421: PAKKPSSVSL WSLEQPFRIE

481: SEPVWKQRLE FDINICDLPR

541: DYKDQLKTGE RCLYMWPSVP

601: ALEKILELGR HSECVHVTEE

661: ARLLLVTKWN KHEDVAQMLY

721: ELFQYLLQLV QVLKYESYLD

781: ILEAYCRGST HHMKVLMKQG

841: ALSHLQSPLD P STLLAEVCV

901: DMLTLQMIQL MDVLWKQEGL

961: TAAFNKDALL NWLKSKNPGE

1021: LFHIDFGHFL GNFKTKFGIN

1081: LRRHGLLFLH LFALMRAAGL

1141: WKTKVNWLAH NVSKDNRQEL

LIQGSKVNAD ERMKLVVQAG LFHGNEMLCK TVSSSEVSVC MARLCFALYA VIEKAKKARS TKKKSKKADC PIAWANLMLF DEKGELLNPT GTVRSNPNTD SAAALLICLP EVAPHPVYYP EQLQLREILE RRGSGELYEH EKDLVWKLRH EVQEHFPEAL LLCSWPELPV LSALELLDFS FPDCHVGSFA IKSLRKLTDD CELTKFLLDR ALANRKIGHF LFWHLRSEMH VPSVALRFGL EALSKLKALN DFVKLSSQKT PKPQTKELMH LCMRQEAYLE EQCTFMDSKM KPLWIMYSNE EAGSGGSVGI IFKNGDDLRQ DLRMTPYGCL PTGDRTGLIE VVLRSDTIAN IQLNKSNMAA ALDRAIEEFT LSCAGYCVAT YVLGIGDRHS DNIMIRESGQ RERVPFILTY DFVHVIQQGK TNNSEKFERF RGYCERAYTI PELSCSKDIQ YLKDSLALGK TEEEALKHFR VKFNEALRES GGAHHHHHH (SEQ ID NO: 20)

Purification de constructos de PI3Ka, PI3KP y PI3Kg

Se purificaron PI3Ka, PI3KP y PI3Kg en dos etapas cromatograficas: cromatografla de afinidad con metal inmovilizado (IMAC) sobre una resina de Ni-Sepharose (GE Healthcare) y filtration en gel usando una columna Superdex 200 26/60 (GE Healthcare). Se enfriaron todos los tampones hasta 4°C y se realizo la lisis enfriada con hielo. Se realizo el fraccionamiento de columna a temperatura ambiente. Todos los tampones usados para purificar PI3KP contenlan Triton X100 al 0,05% ademas de lo descrito a continuation.

Se resuspendieron celulas congeladas convencionalmente de 10 l de cultivo celular Tn5 en “tampon de lisis” Tris-Cl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol al 5%, imidazol 5 mM, NaF 1 mM, acido okadaico (oAa) 0,1 ug/ml, BME 5 mM, 1 x coctel inhibidor de proteasa completo - libre de EDTA (20 comprimidos/1 l de tampon, Roche Applied Sciences), Benzonase (25 U/ml de tampon, EMD Biosciences) a una razon de 1:6 v/v de sedimento frente a tampon de lisis, y se sometieron a lisis mecanica mediante 20 carreras en homogeneizador de tipo Dounce usando una mano de almirez de ajuste apretado. Se centrifugo el lisado a 45.000 g durante 30 minutos, y se cargo el sobrenadante sobre una columna de IMAC previamente equilibrada (3 ml de resina/100 ml de lisado). Se lavo la columna con 3-5 volumenes de columna de tampon de lisis, seguido por un segundo lavado de 3-5 volumenes de columna con Tris-Cl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol al 5%, imidazol 45 mM, NaF 1 mM, OAA 0,1 mg/ml, BME 5 mM, 1x coctel inhibidor de proteasa completo - libre de EDTA. Se eluyo la protelna con Tris-Cl 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,5 M, glicerol al 5%, imidazol 250 mM, NaF 1 mM, OAA 0,1 mg/ml, BME 5 mM, 1x coctel inhibidor de proteasa completo - libre de EDTA. Se analizaron las fracciones pertinentes mediante SDS-PAGE y se combinaron en consecuencia. Se purifico adicionalmente la protelna mediante filtracion en gel sobre una columna Superdex 200 26/60 equilibrada en Tris-Cl 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,5 M, glicerol al 5%, NaF 1 mM, DTT 5 mM, 1x coctel inhibidor de proteasa completo - libre de EDTA. Se analizaron las fracciones pertinentes mediante SDS-PAGE y se combinaron en consecuencia. Se anadio un volumen igual de tampon de dialisis (Tris-Cl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol al 50%, NaF 5 mM, DTT 5 mM) a la combination y despues se dializo frente a tampon de dialisis con dos cambios (un cambio durante la noche). Se almaceno la protelna a -20°C.

Purificacion de PI3K8

Se purifico PI3K8 en tres etapas cromatograficas: cromatografla de afinidad con metal inmovilizado sobre una resina de Ni-Sepharose (GE Healthcare), filtracion en gel usando una columna Superdex 200 26/60 (GE Healthcare), y finalmente una etapa de intercambio ionico sobre una columna Q-HP (GE Healthcare). Se enfriaron todos los tampones hasta 4°C y se realizo la lisis enfriada con hielo. Se realizo el fraccionamiento de columna a temperatura ambiente.

Se resuspendieron celulas congeladas convencionalmente de 10 l de cultivo celular Tn5 en “tampon de lisis” Tris-Cl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol al 5%, imidazol 5 mM, NaF 1 mM, acido okadaico (OAA) 0,1 mg/ml, BME 5 mM, 1 x coctel inhibidor de proteasa completo - libre de EDTA (20 comprimidos/1 l de tampon, Roche Applied Sciences), Benzonase (25 U/ml de tampon de lisis, EMD Biosciences) a una razon de 1:10 v/v de sedimento con respecto a tampon de lisis, y se sometieron a lisis mecanica mediante 20 carreras en homogeneizador de tipo Dounce usando una mano de almirez de ajuste apretado. Se centrifugo el lisado a 45.000 g durante 30 minutos, y se cargo el sobrenadante sobre una columna de IMAC previamente equilibrada (5 ml de resina/100 ml de lisado). Se lavo la columna con 3-5 volumenes de columna de tampon de lisis, seguido por un segundo lavado de 3-5 volumenes de columna con Tris-Cl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol al 5%, imidazol 40 mM, NaF 1 mM, OAA

0,1 ug/ml, BME 5 mM, 1 x coctel inhibidor de proteasa completo - libre de EDTA. Se eluyo la protelna con Tris-Cl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol al 5%, imidazol 250 mM, NaF 1 mM, OAA 0,1 mg/ml, BME 5 mM, 1 x coctel inhibidor de proteasa completo - libre de EDTA. Se analizaron las fracciones pertinentes mediante SDS-PAGE y se combinaron en consecuencia. Se purifico adicionalmente la protelna mediante filtracion en gel sobre una columna 5 Superdex 200 equilibrada en Tris-Cl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol al 5%, NaF 1 mM, OAA 0,1 ug/ml, DTT 5 mM, 1 x coctel inhibidor de proteasa completo - libre de EDTA. Se analizaron las fracciones pertinentes mediante SDS-PAGE y se combinaron en consecuencia. Se diluyeron estas fracciones a una razon de 1:10 v/v de volumen de combinacion con respecto a tampon con “tampon A” Tris-Cl 20 mM, pH 8,2, glicerol al 5%, NaF 1 mM, OAA 0,1 mg/ml, DTT 5 mM y se cargaron sobre una columna Q-HP preparada. Tras completarse la carga de la muestra, 10 se lavo con tampon A y el 5% de “tampon B” Tris-Cl 20 mM, pH 8,2, NaCl 1 M, glicerol al 5%, NaF 1 mM, OAA 0,1 ug/ml, DTT 5 mM con 3-5 volumenes de columna. Se eluyo la protelna usando un gradiente del 5%-30% de tampon B. Normalmente la protelna eluye a NaCl ~200 mM. Se analizaron las fracciones pertinentes mediante SDS- PAGe y se combinaron en consecuencia. Se anadio un volumen igual de tampon de dialisis (Tris-Cl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol al 50%, NaF 1 mM, OAA 0,1 mg/ml, DTT 5 mM) a la combinacion y despues se dializo frente a 15 tampon de dialisis con dos cambios (un cambio durante la noche). Se almaceno la protelna a -20°C.

Se obtuvieron los siguientes resultados usando los ensayos descritos anteriormente.

ej.: PI3Ka/CI50 [umol l-1] Pl3Kb/CI50 [umol I-1] PI3K8/CI50 [umol I-1] PI3Kg/CI50 [umol I-1]

15: 0,008 1,212 0,077 1,097

El compuesto de la presente invencion muestra selectividad por PI3K alfa con respecto a los subtipos beta y/o delta y/o gamma, por ejemplo tal como se mide en un ensayo bioqulmico.

Ejemplo B: Determinacion del aclaramiento metabolico in vitro

20 Abreviaturas

ACN ADME ALP % de B BT

[C]t=0

CLh

CLint

CLint,s

Cyno

CYP

DiH2O

ERh

ESI

fub

fum

IS

kmic

KPi

CL-EM/EM

LOD

M

NADPH

NCE

NSB

Qh

RPM

SD

S-D

SF1

SF2

t1/2

TA

UDPGA

UGT

Acetonitrilo

Absorcion, distribucion, metabolismo y excrecion Posicionador automatico de laboratorio % de disolvente B de HPLC

Biotransformacion (o estabilidad metabolica o estabilidad microsomal)

Concentration in vivo de TA inicial (tiempo cero)

Aclaramiento hepatico (ml/min/kg)

Velocidad de aclaramiento intrlnseca (ml de volumen de reaccion/min/mg de protelna microsomal) Velocidad de aclaramiento intrlnseca ajustada a escala para la masa hepatica (ml de volumen de reaccion/min/g de hlgado)

Macaco

Citocromo P450

Agua desionizada

Razon de extraction hepatica

Ionization por electropulverizacion

Fraction libre de farmaco en sangre o plasma

Fraction libre de farmaco en microsomas

Patron interno

Velocidad de eliminacion en microsomas Tampon de fosfato de potasio 0,05 M, pH 7,4

Cromatografla de llquidos acoplada a espectrometrla de masas en tandem Llmite de detection

Contenido de protelna microsomal en la incubation (mg/ml)

b-Nicotinamida adenina dinucleotido fosfato, forma reducida

Nueva entidad qulmica

Union no especlfica

Flujo de sangre portal (ml/min/kg)

Revoluciones por minuto Desviacion estandar Sprague-Dawley

Factor de ajuste a escala: mg de protelna microsomal por gramo de hlgado Factor de ajuste a escala: gramo de hlgado por kg de peso corporal de animal Semivida de aclaramiento in vitro (min)

Artlculo de prueba

Acido uridin-5'-difosfoglucuronico

Uridina 5'-difosfato glucuronosiltransferasas

5

10

15

20

25

30

35

40

V Volumen de incubacion de reaccion (ml)

A continuation (tabla 1) se muestran las concentraciones finales de artlculo de prueba y de protelna, as! como la duration de la incubacion. Se seleccionaron concentraciones de artlculo de prueba bajas para cumplir con la suposicion de que las cineticas de reaccion se evaluan a una concentration inferior (o aproximadamente igual) a Km. Se sabe que DMSO tiene un efecto inhibidor sobre la actividad CYP. Por tanto, se limito la concentracion de DMSO en los medios de incubacion al 0,01% (v/v) de modo que se minimiza la interferencia con el proceso metabolico.

Tabla 1 Componentes de reaccion y concentraciones finales en incubaciones de aclaramiento metabolico

Componente de reaccion

Tampon de fosfato de potasio (KPi), pH 7,4

MgCl2

NADPH

UDPGAa

Alametacina3

Microsomas hepaticos

Artlculo de prueba

CAN

DMSO (disolvente para artlculo de prueba) a Componentes opcionales requeridos unicamente glucuronosiltransferasas).

Concentracion de reaccion final 50 mM

2.0 mM

1.0 mM

25 mg/mg de microsomas hepaticos 0,5 mg/ml

1.0 mM 0,06% (v/v)

0,01% (v/v)

para reconstituir la actividad UGT (uridina 5'-difosfato

Se realiza un experimento tlpico en formato de 96 pocillos con incubacion con agitation a 37°C. Se deriva la velocidad de aclaramiento metabolico in vitro a partir de datos recopilados en cuatro puntos de tiempo (por ejemplo, 0, 5, 15 y 30 minutos) en una reaccion que incluye cofactor(es) (NADPH y/o UDPGA). Tambien se realiza una incubacion con control negativo de 30 minutos (sin cofactor) para evaluar cuestiones de estabilidad no relacionadas con CYP (por ejemplo, inestabilidad qulmica, metabolismo independiente de CYP).

En general, se diluyen TA en DMSO 10 mM 1:1000 en ACN al 0,6% (v/v) en DiH2O hasta 10 mM. Inmediatamente antes del comienzo del experimento, se suspenden 1,25 mg/ml de protelna microsomal en KPi 50 mM. Para la evaluacion del metabolismo mediado por UGT, en primer lugar puede tratarse previamente la suspension mediante incubacion de 5 min sobre hielo con alameticina (25 mg/mg de protelna microsomal). Se anade TA (35 ml) a 140 ml de las suspensiones microsomales para obtener 175 ml de mezcla de enzima-sustrato. Se incuba previamente esta mezcla de enzima-sustrato durante 15 min a 37°C. Se procesa la incubacion con control negativo de 30 min combinando 25 ml de mezcla de enzima-sustrato con un volumen igual de KPi 50 mM que contiene MgCh 4 mM. Tras una incubacion de 30 minutos a 37°C, se extingue la mezcla anadiendo 50 ml de ACN que contiene el patron interno de EM (alprenolol 2 mM). Se procesa el punto de tiempo T=0 min combinando 25 ml de mezcla de enzima- sustrato directamente con 50 ml de ACN que contiene el patron interno de EM (alprenolol 2 mM). Se anaden 25 ml de la disolucion de cofactor (NaDpH 2 mM en KPi 50 mM mas MgCh 4 mM; que incluye opcionalmente UDPGA 2 mM para ensayos con CYP+UGT) para estimular la extincion completa de la mezcla de reaccion.

Se inician las reacciones en masa para los puntos de tiempo restantes mediante adicion de 125 ml de disolucion de cofactor (NADPH 2 mM en KPi 50 mM mas MgCh 4 mM) a los 125 ml restantes de mezcla de enzima-sustrato. Para determinar el metabolismo de UGT, tambien se incluye UDPGA 2 mM en la disolucion de cofactor. En puntos de tiempo de reaccion especlficos (por ejemplo, 5, 15, 30 minutos), se retiran allcuotas de reaccion (50 ml) y se terminan las reacciones mediante adicion de acetonitrilo (50 ml que contiene patron interno de espectrometrla de masas (alprenolol 2 mM). Se centrifugan todas las muestras a ~3400xg a 4°C durante 10 min y se analizan los sobrenadantes mediante CL-EM/EM para la cuantificacion del TA restante. Se usa el porcentaje de TA restante, con respecto a 0 minutos, para estimar la constante de velocidad de elimination in vitro (kmic) que puede usarse para calcular velocidades de aclaramiento metabolico in vitro.

Se realiza el analisis de muestras en un sistema de cromatografla de llquidos de alta resolucion-espectrometrla de masas en tandem (CL/EM) que consiste en un espectrometro de masas Waters Quattro Premiere, una fuente ionica de ESI, un inyector automatico CTC-HTS Pal, y una bomba de CL Agilent. Se separan las muestras en una columna Atlantic C18, 2,1x30 mm, 3,5 micrometros, usando el gradiente de fase movil rapido expuesto en la tabla 2. La fase movil A consiste en agua purificada que contiene formiato de amonio 10 mM. La fase movil B consiste en acetonitrilo que contiene acido formico al 0,01%. La velocidad de flujo es de 1 ml/min. El volumen de inyeccion es de 10 ml. Los primeros 30 segundos de elucion se desvlan al desecho para la limpieza de la muestra. Se detectan los compuestos usando el software MassLinx/QuanLinx que recopila datos de intensidad para todos los fragmentos relacionados con el peso molecular del compuesto de prueba. Tras recopilar los datos sin procesar, el software puede combinar los perfiles de hasta 3 fragmentos de calidad si es necesario. Generalmente, se integra el pico de fragmento de mayor intensidad.

Tabla 2 Gradiente de fase movil para HPLC

Tiempo (min): % de B

0,0: 5

0,2: 5

0,85: 95

1,02: 95

1,05: 5

Cada velocidad de eliminacion microsomal, kmic, se basa en una curva de eliminacion de 4 puntos sometida a prueba de manera individual. Los datos sin procesar de CL-EM/EM para una placa de reaccion se devuelven como areas de pico de analito integradas para TA e IS. Estos valores pueden convertirse en razones de area de pico de 5 analito:IS para normalizar las comparaciones de datos.

El punto de tiempo de reaccion (por ejemplo, 0, 5, 20 o 30 min) se representa graficamente frente al logaritmo natural del porcentaje de TA que queda con respecto a 0 minutos (basandose en la razon de areas de pico relativas). Se usa la pendiente de esta representacion grafica del aclaramiento, kmic, para calcular la semivida in vitro, t1/2, tal como se muestra en la ec. (1). Con el fin de centrarse en la cinetica de reaccion lineal, siempre que 10 sea posible, se excluyen generalmente puntos de datos que representan <10% de TA restante de la definicion de la pendiente de representacion grafica de aclaramiento. La t1/2 de reaccion es el valor experimental central usado para calcular CLint (ec. 2)

Ec. (1): t1/2 = 0,693/-kmic

Ec. (2): Clint = 0,693/-kmic ■ V/M

15 Los siguientes resultados se obtuvieron usando el procedimiento descrito anteriormente:

ejemplo: CYP MetCL-Ra / CL(int) [ul min-1 mg'1! CYP MetCL-Hu / CL(int) [ul min"1 mg"1]

ejemplo comparativo,

WO2004/096797, n.° 133: 56 37

ejemplo segun esta invention

15: 29 33

Ejemplo C: Inhibicion de mutantes de PI3K alfa, E545K y H1047R, determinada en un ensayo de luminiscencia de luciferasa

La luminiscencia es una lectura bien establecida para determinar concentraciones de ATP y por tanto puede usarse para realizar un seguimiento de la actividad de muchas cinasas independientemente de su sustrato. El ensayo de 20 cinasa luminiscente KinaseGlo (Promega, Madison/ WI, EE.UU.) es un metodo de HTS homogeneo de medicion de la actividad cinasa mediante cuantificacion de la cantidad de ATP que queda en disolucion tras una reaccion con cinasa.

Se incubo fosfoinosltido 3-cinasa a temperatura ambiente en 50 ml de medio que contenla ATP 1 pM, MgCh 5 mM, NaCl 50 mM, fosfatidilinositol de soja 5 pg/ml (Avanti Polar lipids, n.° de cat. 840044C), octoglucosido al 0,015% 25 (Sigma, n.° de cat. 09882), CHAPS al 0,01%, DTT 1 mM, DMSO al 2,5% y Tris-HCl 10 mM pH 7,5. Se inicio la reaccion con cinasa mediante la adicion de ATP (incubacion previa de 15 min de enzima con inhibidor) y se detuvo tras 1 h con 50 pl KinaseGlo® (Promega, n.° de cat. V6714) y se midio la luminiscencia mediante un lector Victor II (integration de 0,1 s). Se ajustaron las curvas mediante regresion no lineal usando la ecuacion loglstica (modelo 205 de XLfit®, ID Business Solutions, Guildford, R.U.).

30 Principio del ensayo de luminiscencia (KinaseGlo):

imagen21

Usando el sistema de ensayo anterior y usando protelnas PI3K obtenidas a partir de constructos mostrados en la siguiente tabla

Tipo_________Codigo Constructo__________________________________________________

Tipo natural BV1075 p85iSH2(461-568)-GGGGGGGGGGGG-p110a (21-1068)-His

E545K BV1147 p85iSH2(461-568)-GGISGGGGGI MV-p110a(21-E542K-1068)-His

H1047R BV1097 p85iSH2(461-568)-GGISGGGGGIMV-p110a(21-H1047R-1068)-His

Se evaluo la actividad inhibidora frente a PI3Kalfa de tipo natural y mutante. Los resultados se muestran en la siguiente tabla.

Inhibicion de PI3Kalfa de tipo natural y mutante:

Ejemplo: PI3Kalfa de tipo natural PI3Kalfa E545K PI3Kalfa H1047R

CI50 en nM

15: 4,6 4,0 4,8

BV1147: Se introdujo la mutacion de activacion E545K, que se encuentra en muchos canceres, en ORF318 5 mediante mutagenesis dirigida al sitio con el kit de mutagenesis QuickChange XL (Stratagene). Usando el metodo recomendado por el fabricante y los cebadores mutagenicos gwG152-p15 (5'-

CTCTCTGAAATCACTAAGCAGGAGAAAGATTTT-3') (SEQ ID NO: 21) y gwG152-p16 (5'-AAAATCTTTCT- CCTGCTTAGTGATTTCAGAGAG-3') (SEQ ID NO: 22) se genero ORF544. Se verifico este clon mediante secuenciacion y se uso en una reaccion de Gateway LR (Invitrogen) para transferir el inserto al vector pBlueBac4.5 10 adaptado para Gateway (Invitrogen) para la generacion del vector de expresion en baculovirus LR561.

Dominio de cinasa.

Secuencia de protelna de BV 1147:

1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK 61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GISGGGGGIM 121 VLVECLLPNG MIVTLECLRE ATLITIKHEL FKEARKYPLH QLLQDESSYI FVSVTQEAER 181 EEFFDETRRL CDLRLFQPFL KVIEPVGNRE EKILNREIGF AIGMPVCEFD MVKDPEVQDF 241 RRNILNVCKE AVDLRDLNSP HSRAMYVYPP NVESSPELPK HIYNKLDKGQ IIWIWVIVS 301 PNNDKQKYTL KINHDCVPEQ VIAEAIRKKT RSMLLSSEQL KLCVLEYQGK YILKVCGCDE 361 YFLEKYPLSQ YKYIRSCIML GRMPNLMLMA KESLYSQLPM DCFTMPSYSR RISTATPYMN 421 GETSTKSLWV INSALRIKIL CATYVNVNIR DIDKIYVRTG IYHGGEPLCD NVNTQRVPCS 481 NPRWNEWLNY DIYIPDLPRA ARLCLSICSV KGRKGAKEEH CPLAWGNINL FDYTDTLVSG 541 KMALNLWPVP HGLEDLLNPI GVTGSNPNKE TPCLELEFDW FSSWKFPDM SVIEEHANWS 601 VSREAGFSYS HAGLSNRLAR DNELRENDKE QLKAISTRDP LSEITKQEKD FLWSHRHYCV 661 TIPEILPKLL LSVKWNSRDE VAQMYCLVKD WPPIKPEQAM ELLDCNYPDP MVRGFAVRCL

721 EKYLTDDKLS QYLIQLVQVL KYEQYLDNLL VRFLLKKALT NQRIGHFFFW HLKSEMHNKT 781 VSQRFGLLLE SYCRACGMYL KHLNRQVEAM EKLINLTDIL KQEKKDETQK VQMKFLVEQM 841 RRPDFMDALQ GFLSPLNPAH QLGNLRLEEC RIMSSAKRPL WLNWENPDIM SELLFQNNEI 901 IFKNGDDLRQ DMLTLQIIRI MENIWQNQGL DLRMLPYGCL SIGDCVGLIE WRNSHTIMQ 961 IQCKGGLKGA LQFNSHTLHQ WLKDKNKGEI YDAAIDLFTR SCAGYCVATF ILGIGDRHNS 1021 NIMVKDDGQL FHIDFGHFLD HKKKKFGYKR ERVPFVLTQD FLIVISKGAQ ECTKTREFER 1081 FQEMCYKAYL AIRQHANLFI NLFSMMLGSG MPELQSFDDI AYIRKTLALD KTEQEALEYF 1141 MKQMNDAHHG GWTTKMDWIF HTIKQHALNE LGGAHHHHHH (SEQ ID NO: 23).

15 BV1097: Se introdujo la mutacion de activacion H1047R, que se encuentra en muchos canceres, en ORF318

mediante mutagenesis dirigida al sitio con el kit de mutagenesis QuickChange XL (Stratagene).

Usando el metodo recomendado por el fabricante y los cebadores mutagenicos gwG152-p07 (5'- CAAATGAATGATGCACGTCATGGTGGCTGGACA-3') (SEQ ID NO: 24) y gwG152-p11 (5'-TGTCCAGCCA-

CCATGACGTGCATCATTCATTTG-3') (SEQ ID NO: 25) se genero ORF396. Se verifico este clon mediante secuenciacion y se uso en una reaccion de Gateway LR (Invitrogen) para transferir el inserto al vector pBlueBac4.5 adaptado para Gateway (Invitrogen) para la generacion del vector de expresion en baculovirus LR480.

Dominio de cinasa.

5 Secuencia de protelna de BV 1097:

1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK 61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GISGGGGGIM 121 VLVECLLPNG MIVTLECLRE ATLITIKHEL FKEARKYPLH QLLQDESSYI FVSVTQEAER 181 EEFFDETRRL CDLRLFQPFL KVIEPVGNRE EKILNREIGF AIGMPVCEFD MVKDPEVQDF 241 RRNILNVCKE AVDLRDLNSP HSRAMYVYPP NVESSPELPK HIYNKLDKGQ IIWIWVIVS 301 PNNDKQKYTL KINHDCVPEQ VIAEAIRKKT RSMLLSSEQL KLCVLEYQGK YILKVCGCDE 361 YFLEKYPLSQ YKYIRSCIML GRMPNLMLMA KESLYSQLPM DCFTMPSYSR RISTATPYMN 421 GETSTKSLWV INSALRIKIL CATYVNVNIR DIDKIYVRTG IYHGGEPLCD NVNTQRVPCS 481 NPRWNEWLNY DIYIPDLPRA ARLCLSICSV KGRKGAKEEH CPLAWGNINL FDYTDTLVSG 541 KMALNLWPVP HGLEDLLNPI GVTGSNPNKE TPCLELEFDW FSSWKFPDM SVIEEHANWS 601 VSREAGFSYS HAGLSNRLAR DNELRENDKE QLKAISTRDP LSEITEQEKD FLWSHRHYCV 661 TIPEILPKLL LSVKWNSRDE VAQMYCLVKD WPPIKPEQAM ELLDCNYPDP MVRGFAVRCL 721 EKYLTDDKLS QYLIQLVQVL KYEQYLDNLL VRFLLKKALT NQRIGHFFFW HLKSEMHNKT 781 VSQRFGLLLE SYCRACGMYL KHLNRQVEAM EKLINLTDIL KQEKKDETQK VQMKFLVEQM 841 RRPDFMDALQ GFLSPLNPAH QLGNLRLEEC RIMSSAKRPL WLNWENPDIM SELLFQNNEI 901 IFKNGDDLRQ DMLTLQIIRI MENIWQNQGL DLRMLPYGCL SIGDCVGLIE WRNSHTIMQ 961 IQCKGGLKGA LQFNSHTLHQ WLKDKNKGEI YDAAIDLFTR SCAGYCVATF ILGIGDRHNS

1021 NIMVKDDGQL FHIDFGHFLD HKKKKFGYKR ERVPFVLTQD FLIVISKGAQ ECTKTREFER 1081 FQEMCYKAYL AIRQHANLFI NLFSMMLGSG MPELQSFDDI AYIRKTLALD KTEQEALEYF 1141 MKQMNDARHG GWTTKMDWIF HTIKQHALNE LGGAHHHHHH (SEQ ID NO: 26).

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

REIVINDICACIONES

1. Compuesto 2-amida y 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetiletil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) del acido (S)- pirrolidin-1,2-dicarboxflico, de estructura:

imagen1

en forma libre o en forma de sal farmaceuticamente aceptable.
2. Compuesto segun la reivindicacion 1, en forma libre o en forma de sal farmaceuticamente aceptable, para su uso como producto farmaceutico.
3. Uso del compuesto segun la reivindicacion 1, en forma libre o en forma de sal farmaceuticamente aceptable, para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de cancer.
4. Uso segun la reivindicacion 3, en el que el cancer se selecciona de sarcoma; de pulmon; bronquio; prostata; mama; pancreas; cancer gastrointestinal; de colon; recto; carcinoma de colon; adenoma colorrectal; de tiroides; hlgado; vlas biliares intrahepaticas; hepatocelular; de glandula suprarrenal; estomago; gastrico; glioma; glioblastoma; endometrial; melanoma; de rinon; pelvis renal; vejiga urinaria; cuerpo uterino; cuello uterino; vagina; ovario; mieloma multiple; de esofago; una leucemia; leucemia mielogena aguda; leucemia mielogena cronica; leucemia linfocltica; leucemia mieloide; cerebral; un carcinoma del cerebro; cavidad oral y faringe; laringe; intestino delgado; linfoma no Hodgkin; melanoma; adenoma velloso de colon; una neoplasia; una neoplasia de caracter epitelial; linfomas; un carcinoma de mama; carcinoma de celulas basales; carcinoma de celulas escamosas; queratosis actlnica; enfermedades tumorales, incluyendo tumores solidos; un tumor de cabeza o cuello; policitemia vera; trombocitemia esencial; mielofibrosis con metaplasia mieloide; y enfermedad de Walden-Stroem.
5. Composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto segun la reivindicacion 1, en forma libre o en forma de sal farmaceuticamente aceptable y uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables.
6. Composicion farmaceutica combinada, adaptada para la administracion simultanea o secuencial, que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto segun la reivindicacion 1 en forma libre o en forma de sal farmaceuticamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz de una o mas parejas de combination; y uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables.
7. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 5 o composicion farmaceutica combinada segun la reivindicacion 6 para su uso en el tratamiento de cancer.
8. Compuesto segun la reivindicacion 1 o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de cancer.
9. Compuesto segun la reivindicacion 8 o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de un cancer seleccionado de sarcoma; de pulmon; bronquio; prostata; mama; pancreas; cancer gastrointestinal; de colon; recto; carcinoma de colon; adenoma colorrectal; de tiroides; hlgado; vlas biliares intrahepaticas; hepatocelular; de glandula suprarrenal; estomago; gastrico; glioma; glioblastoma; endometrial; melanoma; de rinon; pelvis renal; vejiga urinaria; cuerpo uterino; cuello uterino; vagina; ovario; mieloma multiple; de esofago; una leucemia; leucemia mielogena aguda; leucemia mielogena cronica; leucemia linfocltica; leucemia mieloide; cerebral; un carcinoma del cerebro; cavidad oral y faringe; laringe; intestino delgado; linfoma no Hodgkin; melanoma; adenoma velloso de colon; una neoplasia; una neoplasia de caracter epitelial; linfomas; un carcinoma de mama; carcinoma de celulas basales; carcinoma de celulas escamosas; queratosis actlnica; enfermedades tumorales, incluyendo tumores solidos; un tumor de cabeza o cuello; policitemia vera; trombocitemia esencial; mielofibrosis con metaplasia mieloide; y enfermedad de Walden-Stroem.