ES2536900T3

ES2536900T3 - Antígenos multivariables en complejo con anticuerpo monoclonal humanizado de dirección

Info

Publication number: ES2536900T3
Application number: ES08728767.8T
Authority: ES
Inventors: Gerard Zurawski
Original assignee: Baylor Research Institute
Current assignee: Baylor Research Institute
Priority date: 2007-02-02
Filing date: 2008-01-31
Publication date: 2015-05-29
Anticipated expiration: 2028-01-31
Also published as: BRPI0807344A2; WO2008097817A2; NZ592859A; US20160031988A1; JP2010518020A; EP2114985A4; WO2008097817A3; CA2715042C; ZA200905447B; MX2009008143A; EP2684889A3; CA2715042A1; EP2114985A2; DK2114985T3; US7786267B2; AU2008214077A1; NZ578657A; EP2114985B1; EP2684889A2; AU2008214077B2

Abstract

Una vacuna que comprende un anticuerpo monoclonal recombinante (rAb) que comprende un dominio específico de antígeno unido a uno o más dominios que comprenden una primera mitad de un par de unión de cohesina- dockerina, la primera mitad del par de unión de cohesina-dockerina unida a una segunda mitad del par de unión de cohesina-dockerina, la segunda mitad caracterizada por que es complementaria de la primera mitad y además caracterizada por que la segunda mitad del par de unión de cohesina-dockerina está en una proteína de fusión con un antígeno; y el dominio específico de antígeno caracterizado por que se dirige al MHC de clase I, MHC de clase II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45 , CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de manosa, Langerina, DECTIN-1, B7-1, B7-2, receptor de IFN-γ, receptor de IL-2, ICAM-1, receptor de Fcγ u otro receptor expresado específicamente por células presentadoras de antígenos

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

5

15

25

35

45

55

65

E08728767

13-05-2015

proteínas virales asociadas con tumores que serían de las clases de virus indicadas anteriormente. Ciertos antígenos pueden ser característicos de tumores (siendo un subconjunto proteínas no expresadas habitualmente por una célula precursora tumoral), o puede ser una proteína que se exprese normalmente en una célula precursora tumoral, pero que tenga una mutación característica de un tumor. Otros antígenos incluyen una variante o variantes mutantes de la proteína normal que tiene una actividad o distribución celular alterada, por ejemplo, mutaciones de genes que dan lugar a antígenos tumorales.

Los ejemplos no limitantes específicos de antígenos tumorales incluyen: CEA, antígeno específico de próstata (PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, MAGE 1-4, 6 y 12, MUC (Mucina) (por ejemplo, MUC-1, MUC-2, etc.), GM2 y gangliósidos GD2, ras, myc, tirosinasa, MART (antígeno de melanoma), Pmel 17 (gp100), secuencia del intrón V GnT-V (secuencia del intrón V de N-acetilglucoaminiltransferasa V), Ca psm de próstata, PRAME (antígeno de melanoma), -catenina, MUM-1-B (producto génico mutado ubicuo en melanoma), GAGE (antígeno de melanoma) 1, BAGE (antígeno de melanoma) 2-10, c-ERB2 (Her2/neu), EBNA (antígeno nuclear del Virus de Epstein-Barr Virus) 1-6, gp75, virus del papiloma humano (VPH) E6 y E7, p53, proteína de resistencia del pulmón (LRP), Bcl-2, y Ki-67. Además, la molécula inmunogénica puede ser un autoantígeno implicado en el inicio y/o propagación de una enfermedad autoinmunitaria, cuya patología se debe en gran medida a la actividad de anticuerpos específicos para una molécula expresada por el órgano, tejido o células diana relevantes, por ejemplo, SLE o MG. En dichas enfermedades, puede ser deseable dirigir una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpo continuada, (es decir, un tipo Th2) al autoantígeno relevante para una respuesta inmunitaria celular (es decir, un tipo Th1). Como alternativa, puede ser deseable evitar la aparición de o reducir el nivel de una respuesta de Th2 al autoantígeno en un sujeto que no tenga, pero que se sospeche que sea susceptible de, la enfermedad autoinmunitaria relevante induciendo de forma profiláctica una respuesta Th1 al autoantígeno apropiado. Los autoantígenos de interés incluyen, sin limitación: (a) con respecto a SLE, la proteína Smith, ribonucleoproteína RNP y las proteínas SS-A y SS-B; y (b) con respecto a MG, el receptor de acetilcolina. Los ejemplos de otros antígenos misceláneos implicados en uno o más tipos de respuesta autoinmunitaria incluyen, por ejemplo, hormonas endógenas tales como hormona luteinizante, hormona folículo estimulante, testosterona, hormona del crecimiento, prolactina y otras hormonas.

Los antígenos implicados en enfermedades autoinmunitarias, alergia y rechazo de injertos pueden usarse en las composiciones y métodos de la invención. Por ejemplo, un antígeno implicado en una cualquiera o más de las siguientes enfermedades o trastornos puede usarse en la presente invención: diabetes, diabetes mellitus, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica), esclerosis múltiple, miastenia grave, lupus eritematoso sistémico, tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eccematosa), psoriasis, Síndrome de Sjogren, incluyendo queratoconjuntivitis seca secundaria de Síndrome de Sjogren, alopecia areata, respuestas alérgicas debidas a reacciones a mordedura de artrópodos, enfermedad de Crohn, úlcera aftosa, iritis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis, colitis ulcerosa, asma, asma alérgica, lupus eritematosos cutáneo, esclerodermia, vaginitis, proctitis, erupciones por fármaco, reacciones de inversión de lepra, eritema nodoso leproso, uveítis autoinmunitaria, encefalomielitis alérgica, encefalopatía hemorrágica necrotizante aguda, pérdida de audición sensoneuronal progresiva bilateral idiopática, anemia aplásica, anemia de glóbulos rojos pura, trombocitopenia idiopática, policondritis, granulomatosis de Wegener, hepatitis activa crónica, síndrome de Stevens-Johnson, esprúe idiopático, liquen plano, enfermedad de Crohn, oftalmopatía de Graves, sarcoidosis, cirrosis biliar primaria, uveítis posterior y fibrosis pulmonar intersticial. Los ejemplos de antígenos implicados en enfermedad autoinmunitaria incluyen ácido glutámico descarboxilasa 65 (GAD 65), ADN nativo, proteína básica de mielina, proteína proteolipídica de mielina, componentes de receptor de acetilcolina, tiroglobulina y el receptor de la hormona estimulante de tiroides (TSH). Los ejemplos de antígenos implicados en la alergia incluyen antígenos de polen tales como antígeno de polen de cedro japonés, antígenos de polen de ambrosía, antígenos de polen de ballico, antígenos derivados de animales tales como antígenos de ácaros del polvo y antígenos felinos, antígenos de histocompatibilidad y penicilina y otros fármacos terapéuticos. Los ejemplos de antígenos implicados en el rechazo de injerto incluyen componentes antigénicos del injerto para trasplantar al receptor del injerto tales como componentes del injerto de corazón, pulmón, hígado, páncreas, riñón y neural. El antígeno puede ser un ligando peptídico alterado útil en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria.

Como se usa en el presente documento, la expresión “epítopo o epítopos” se refiere a un antígeno peptídico o proteico que incluye una estructura primaria, secundaria o terciaria similar a un epítopo localizado dentro de cualquiera de varios polipéptidos patógenos codificados por el ADN o ARN patógeno. El nivel de similitud generalmente será hasta tal grado que los anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra dichos polipéptidos también se unirán con, reaccionarán con, o reconocerán de otro modo, el antígeno peptídico o proteico. Pueden emplearse diversos métodos de inmunoensayo junto con dichos anticuerpos, tales como, por ejemplo, transferencia de Western, ELISA, RIA y similares, todos los cuales se conocen por los expertos en la materia. La identificación de epítopos patógenos, adecuados para su uso en vacunas es parte de la presente invención. Por ejemplo, se pueden emplear los métodos de Hopp, como se enseña en la Patente de Estados Unidos Nº 4.554.101, que enseña la identificación y preparación de epítopos de secuencias de aminoácidos basándose en la hidrofilia. Los métodos descritos en varios otros artículos y programas de software basados en los mismos, también pueden usarse para identificar secuencias de núcleo epitópicas (véase, por ejemplo, Jameson y Wolf, 1988; Wolf et al., 1988; Patente de Estados Unidos Nº 4.554.101). La secuencia de aminoácidos de estas “secuencias de núcleo epitópicas” puede incorporarse después fácilmente en péptidos, bien mediante la aplicación de síntesis peptídica o bien mediante tecnología recombinante.

9

imagen8

5

15

25

35

45

55

65

E08728767

13-05-2015

cantidades que varían de 1 g a 1 mg de polinucleótido y 1 g a 100 mg de proteína.

La administración de la partícula viral terapéutica a un paciente seguirá protocolos generales para la administración de productos quimioterapéuticos, teniendo en cuenta la toxicidad, si la hubiera, del vector. Se anticipa que los ciclos de tratamiento se repetirían según fuera necesario. También se contempla que diversas terapias convencionales, así como intervención quirúrgica, pueden aplicarse en combinación con la terapia génica descrita.

Cuando se contempla la aplicación clínica de una terapia génica, será necesario preparar el complejo como una composición farmacéutica apropiada para la aplicación pretendida. En general esto implicará preparar una composición farmacéutica que esté esencialmente sin pirógenos, así como cualquier otra impureza que pudiera ser perjudicial para seres humanos o animales. También se deseará en general emplear sales y tampones apropiados para hacer al complejo estable y permitir la captación compleja por células diana.

Las composiciones acuosas de la presente invención pueden incluir una cantidad eficaz del compuesto, disuelto o disperso en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones también pueden denominarse inóculos. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional es incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse principios activos complementarios a las composiciones. Las composiciones de la presente invención pueden incluir preparaciones farmacéuticas clásicas. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones convencionales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Patologías. Dependiendo de la enfermedad particular para tratar, la administración de composiciones terapéuticas de acuerdo con la presente invención será mediante cualquier vía habitual siempre que el tejido diana esté disponible por esa vía para maximizar el suministro del antígeno a un sitio para respuesta inmunitaria máxima (o en algunos casos mínima). La administración será en general por inyección ortotópica, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa. Otras áreas para suministro incluyen: oral, nasal, bucal, rectal, vaginal o tópica. La administración tópica sería particularmente ventajosa para el tratamiento de cánceres cutáneos. Dichas composiciones normalmente se administrarían como composiciones farmacéuticamente aceptables que incluyen vehículos fisiológicamente aceptables, tampones u otros excipientes.

Las composiciones de vacuna o tratamiento de la invención pueden administrarse por vía parenteral, por inyección, por ejemplo, bien por vía subcutánea o bien por vía intramuscular. Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios, y en algunos casos, formulaciones orales o formulaciones adecuadas para distribución como aerosoles. En el caso de las formulaciones orales, en la manipulación de subconjuntos de linfocitos T que emplean adyuvantes, empaquetamiento de antígenos o la adición de citocinas individuales a diversas formulaciones que dan como resultado vacunas orales mejoradas con respuestas inmunitarias optimizadas. Para supositorios, los aglutinantes y vehículos tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; dichos supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el principio activo en el intervalo del 0,5 % al 10 %, preferentemente 1 %-2 %. Las formulaciones orales incluyen excipientes empleados habitualmente, tales como, por ejemplo, usos farmacéuticos de manitol, lactosa, estearato de magnesio de almidón, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen 10 %-95 % de principio activo, preferentemente 25-70 %.

Los ácidos nucleicos codificantes de antígenos de la invención pueden formularse en la vacuna o composiciones de tratamiento como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formado con grupos amino libres del péptido) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o con ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, maleico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilos libres pueden también derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína y similares.

Se administran composiciones de vacuna o tratamiento de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en cantidad tal que sea profilácticamente y/o terapéuticamente eficaz. La cantidad para administrar depende del sujeto para tratar, incluyendo, por ejemplo, la capacidad del sistema inmunitario del sujeto para sintetizar anticuerpos y el grado de protección o tratamiento deseado. Los intervalos de dosificación adecuados son del orden de varios cientos de microgramos de principio activo por vacunación con un intervalo de aproximadamente 0,1 mg a 1000 mg, tal como en el intervalo de aproximadamente 1 mg a 300 mg, y preferentemente en el intervalo de aproximadamente 10 mg a 50 mg. Los regímenes adecuados para inyecciones de administración inicial y de refuerzo también son variables pero se tipifican por una administración inicial seguida de inoculaciones posteriores u otras administraciones. Las cantidades precisas de principio activo requeridas para administrar dependen del criterio del practicante y pueden ser peculiares para cada sujeto. Resultará evidente para los expertos en la materia que la cantidad terapéuticamente eficaz de molécula de ácido nucleico o polipéptidos de fusión de la presente invención dependerá, entre otros, del programa de administración, la dosis unitaria de antígeno administrado, si la molécula de

11

imagen9

imagen10

5

10

15

20

25

30

E08728767

13-05-2015

imagen11

RAEVVTMINRMLYRGPLKVKVGSFPDVSPKYWAYGDIEEASRNHKYTRDEKDGSEILIE (SEC ID Nº: 1).

Los dominios de cohesina (C) interaccionan con dominios pequeños (por ejemplo, de 56 restos) denominados dockerinas (D). Estos son estructuras que contienen Ca++ con simetría doble y se pueden unir con una cohesina afín con diversas afinidades (por ejemplo, 6E6, M, 2E7M). Las afinidades entre la dockerina y múltiples cohesinas (como se encuentran en armazones) pueden ser mucho mayores (por ejemplo, >E9 M). La interacción no es covalente y está bien definida (por análisis estructural) para al menos un par C-D. Las dockerinas se diseñan para ser dominios unidos con diferentes dominios (de naturaleza enzimática), y las cohesinas se diseñan para actuar en matrices lineales (bien directamente extremo con extremo, o unidas con enlazadores ricos en PT flexibles de diversos tamaños (por ejemplo, 12, 17, 25, 28, 36). Se sabe que una dockerina particular puede tener especificidad por una cohesina particular (por ejemplo, un par C-D de una especie bacteriana puede no ser intercambiable con un par C-D de una especie diferente). Esta característica hace posible asegurar la interacción específica y precisa de diversas proteínas de fusión de antígeno D con un mAb obtenido por ingeniería genética que contiene dominios de cohesina de diversas especificidades.

En la práctica, la presente invención incluye adaptar pares de C-D conocidos de la bibliografía, observados por primera vez en la naturaleza, o desarrollados con nuevas especificidades usando tecnología de presentación de fagos. Esta última tecnología también puede usarse para potenciar (“madurar”) la afinidad de una interacción C-D si se deseara. Además, la introducción por ingeniería genética de restos de cisteína en caras opuestas de la interacción C-D (basándose en los modelos de las estructuras de C-D publicadas) podría usarse para realizar un enlace covalente entre C-D para fortalecer la interacción. Además, la naturaleza dimérica del mAb (y por lo tanto los dominios C unidos) puede usarse positivamente para fines de potenciamiento de la afinidad. En esta realización, por ejemplo, la proteína de fusión con antígeno D se modifica por ingeniería genética con un segundo dominio de dockerina idéntico (D-antígeno-D o D-D-antígeno) o con un dominio de homodimerización. Esta configuración, siempre que los enlazadores entre los dominios sean restrictivos, dará como resultado la unión simultánea preferida de ambos dominios D con el mismo mAb, con estabilidad muy potenciada en comparación con la interacción individual.

Basándose en la estructura cristalina del complejo de cohesina-dockerina (por ejemplo, véase, PNAS 2003,1380913814, Cellulosome assembly revealed by the crystal structure of the cohesin-dockerin complex. Ana L. Carvalho *, Fernando M. V. Dias, José A. M. Prates, Tibor Nagy, Harry J. Gilbert, Gideon J. Davies, Luis M. A. Ferreira, Maria J. Romao y Carlos M. G. A. Fonte), resulta evidente que una realización es una proteína de fusión de antígeno

14 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E08728767

13-05-2015

dockerina (es decir, antígeno fusionado con el extremo N terminal de una dockerina). Sin embargo, tanto a partir de la estructura como a partir de la naturaleza de la organización del dominio de cohesina dentro de los armazones, resulta evidente que las cohesiones pueden fusionarse extremo con extremo, incluso sin secuencias espaciadoras. Además, resulta evidente que están disponibles técnicas bien descritas para obtener por ingeniería genética versiones miniaturizadas de los dominios de cohesina y dockerina (véase por ejemplo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 94, pp. 10080-10085, septiembre de 1997. Structural mimicry of a native protein by a minimized binding domain. Melissa A. Starovasnik, Andrew C. Braisted, y James A. Wells).

Se reconoce en el presente documento que las secuencias enlazadoras tienen una propensión a glucosilación ligada a O resultante de riqueza de ST. Además, los dominios tanto C como D pueden tener sitios unidos a N potenciales. Estas características pueden ser ventajosas en la potenciación de la solubilidad del mAb obtenido por ingeniería genética expresado en células de mamífero mediante decoración con carbohidratos. Por supuesto, es necesario comprobar las consecuencias de la glucosilación de los dominios C por función (unión con el afín D), y si es necesario rectificar por mutagénesis dirigida. Una característica atractiva de la presente invención es que D-A puede expresarse en cualquier sistema que se sepa que es mejor. Por ejemplo, el antígeno tumoral MART1 es una proteína de membrana y se prepara mejor en alto rendimiento mediante cuerpos de inclusión de E. coli. Los esquemas que usan antígenos directamente fusionados con el mAb se limitan a antígenos que son compatibles con expresión en células de mamífero.

Otra realización de la invención es el uso de la interacción D-C para preparar mAb biespecíficos unidos cola con cola. La Figura 2 muestra el uso de la presente invención para formar mAb biespecíficos. mAb1 (negro) se expresa con C1 C terminal y mAb2 (magenta) se expresa con D1 C terminal. La mezcla de mAb1 y mAb2 equimolares dará como resultado un complejo biespecífico 1:1. Obsérvese que, ya que cada molécula de mAb contiene dos equivalentes molares de C o D (el mAb es en sí mismo una estructura dimérica), el mAb biespecífico se estabilizará en gran medida por dos interacciones C-D simultáneas. Especialmente a menor (mAb), esta será la configuración más estable.

EJEMPLO 2. Combinación de dominios y antígenos de Cohesina/Dockerina y Anticuerpo

El Ejemplo 2 muestra que los dominios de cohesina y dockerina particulares pueden secretarse con éxito y eficazmente de células de mamífero como proteínas de fusión manteniendo a la vez la interacción proteína-proteína de cohesina-dockerina específica y de alta afinidad. Aunque la extensiva bibliografía de cohesina-dockerina enseña la expectativa de que dichas proteínas de fusión deberían tener esta funcionalidad, no describe la producción de dichas proteínas de fusión en sistemas de secreción de mamíferos. El estado del conocimiento científico no permite la predicción de descubrimiento ya que las reglas (además de elementos tales como el péptido señal) para la secreción exitosa no están completamente establecidas. Además, se sabe que las regiones enlazadoras de cohesina están glucosiladas en sus bacterias nativas, y los dominios de cohesina y dockerina contienen sitios de glucosilación predichos. Aunque esto puede favorecer de hecho la secreción de células de mamífero, no está claro si la glucosilación “no natural” alterará la interacción cohesina-dockerina.

Aunque la interacción cohesina-dockerina para diversas aplicaciones comerciales se ha publicado, la presente invención se basa en una utilidad previamente no realizada para esta interacción basada en el ensamblaje de complejos proteicos específicos no relacionados con las aplicaciones enzimáticas de ensamblaje controlado previstas.

La invención incluye el uso de todas las secuencias de cohesina-dockerina de diversos microbios degradantes de celulosa, pero describe la aplicación de secuencias de cohesina y dockerina y enlazador específicas del microbio Clostridium thermocellum. Por ejemplo, la secuencia descrita en la Tabla 1 codifica la cadena H de una IgG4 humana unida en el codón C terminal con una secuencia de dockerina de Clostridium thermocellum (denominada rAb.doc). Otras realizaciones de proteínas rAb.doc se describen de forma similar en la Tabla 2 y estas se obtienen por ingeniería genética simplemente transfiriendo la región codificante de dockerina como un fragmento de ADN a vectores que codifican las diferentes entidades de cadena H.

La TABLA 1 muestra las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de rAB-pIRES2(hIgG4H-Dockerina) o C52. La secuencia de ADN (región codificante completa) y aminoácidos (el producto secretado predicho) de la proteína de fusión IgG4H humana.doc se muestra a continuación. El dominio de dockerina (tomado de una célula de Clostridium thermocellum) está destacado en amarillo y la secuencia de cadena H de unión a dockerina está subrayada. El sitio de glucosilación ligada a N altamente predicho dentro del dominio de dockerina está destacado en rojo.

15

imagen12

E08728767

13-05-2015

La Tabla 3 muestra las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de rAB(mAnti-ASGPR_49C11_7H-SLAML-VhIgG4H-C-Dockerina) o C153. Se muestra a continuación la secuencia de ADN (región codificante completa) y aminoácidos (el producto secretado predicho). El dominio de dockerina está destacado en amarillo y la secuencia de unión de cadena H y dockerina está subrayada. La región variable de IgG está destacada en azul. El sitio de glucosilación ligada a N altamente predicho dentro del dominio de dockerina está destacado en rojo.

TABLA 3. rAB-(mAnti-ASGPR_49C11_7H-SLAML-V-hIgG4H-C-Dockerina) o C153.

imagen13

10 La Tabla 4 muestra las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de rAB-pIRES2(mAnti-DC-SIGNL16E7H-LVhIgG4H-C-Dockerina) o C92. Se muestra a continuación la secuencia de ADN (región codificante completa) y aminoácidos (el producto secretado predicho). El dominio de dockerina está destacado en amarillo y la secuencia de unión de cadena H y dockerina está subrayada. La región variable de IgG está destacada en azul. El sitio de glucosilación ligada a N altamente predicho dentro del dominio de dockerina está destacado en rojo.

15

17

imagen14

5

10

15

20

25

30

35

40

E08728767

13-05-2015

La invención incorpora la presencia no anticipada y el uso de este sitio de glucosilación que probablemente confiere a proteínas de fusión de dockerina secretada de células de mamífero solubilidad y propiedades farmacocinéticas deseables que se sabe bien que están asociadas con la glucosilación. La Figura 2 muestra que las proteínas de fusión de rAb.antígeno que emplean secuencias H y L de IgG idénticas pueden diferir drásticamente en su eficacia de secreción. En ambos ejemplos citados, las entidades de rAb.doc se expresan bien en comparación con rAb fusionado con secuencias HA5 de la gripe que típicamente se expresan muy poco. La invención también incorpora la capacidad no anticipada del dominio de dockerina para no impedir significativamente la secreción de la entidad de rAb asociada. Además, la invención incorpora la propiedad del dominio de dockerina de no impedir la funcionalidad de las regiones que se combinan con antígenos específicos de rAb. Esta propiedad se ejemplifica en la Figura 5 que muestra concordancia entre la reactividad de IgFc y reactividad de LOX-1 entre proteínas anti-LOX1_15C4 rAb y anti-LOX1_15C4.doc.

Las figuras 4A y 4B muestran la medición por ELISA anti-IgFc humano de niveles de secreción de diversas proteínas de fusión rAb. Se transfectaron 2,5 g de cada uno de los plásmidos de expresión de cadena H y L en células 293F y se ensayaron diluciones dobles de muestras de sobrenadante después de tres días de cultivo. Los valores del eje Y son actividad de HRP arbitraria.

La Figura 5 muestra la medición por ELISA anti-IgFc humano (actividad de HRP) y unión de LOX-1.fosfatasa alcalina (actividad AP) de anti-LOX1_15C4 rAb secretado (símbolos azules) y anti-LOX1_15C4.doc rAb (símbolos rojos). Se transfectaron diferentes relaciones que sumaban un total de 5 g de los plásmidos de expresión de cadena H y L en células 293F y se ensayaron muestras de sobrenadante después de tres días de cultivo.

La invención incorpora la propiedad del dominio de dockerina para expresar eficaz y funcionalmente en el contexto de proteínas de fusión distintas de hIgG4 y sus derivados cercanos. Por ejemplo, la Tabla 6 muestra la secuencia de una entidad rAb.doc basada en una proteína de fusión de cadena H de IgG2b de ratón.

La Tabla 6 muestra las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos para rAB-pCMV (mIgG2bH-Dockerina) o C19. Se muestra la secuencia de ADN (región codificante completa) y aminoácidos (el producto secretado predicho). El dominio de dockerina está destacado en amarillo y la secuencia de unión de cadena H y dockerina está subrayada. El sitio de glucosilación ligada a N altamente predicho dentro del dominio de dockerina está destacado en rojo.

imagen15

La Figura 6 muestra que cuando se co-transfecta con un plásmido de expresión kappa de mIgG, el plásmido rABpCMV(mIgG2bH-Dockerina) dirige la secreción eficaz de la proteína de fusión rAB-mIgG2b.Dockerina. En la figura 6, una proteína rAb purificada por afinidad por proteína G secretada de células 293 F transfectadas se analizó por SDS.PAGE reductor y tinción con azul brillante de Coomassie. Los carriles 11 y 12 muestran productos de mIgG2b.doc.

19

imagen16

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

imagen22

imagen23

imagen24

Claims

imagen1