ES2424242T3 - Uso de polipéptidos de aprotinina como portadores en conjugados farmacéuticos - Google Patents

Abstract

Un conjugado, o una sal farmacéuticamente aceptable de este, que comprende: (a) un polipéptido que comprende Angiopep-2 (SEQ ID NO:97), y (b) un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un fármaco, una proteína, un marcador y unpéptido, donde dicho compuesto está conjugado con dicho polipéptido, con la condición de que dichoconjugado no sea un conjugado de: (a) un polipéptido que consiste en la SEQ ID NO:97 o SEQ ID NO:74, y (b) 125yodo.

Description

Uso de polipéptidos de aprotinina como portadores en conjugados farmacéuticos

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a conjugados portadores de Angiopep-2 y composiciones farmacéuticas y su uso para incrementar la potencia de fármacos y modificar la farmacocinética de compuestos. De manera más particular, la presente invención se refiere a conjugados que comprenden el portador descrito en la presente y su uso en el tratamiento del cáncer.

Antecedentes de la Invención

El progreso clínico en el tratamiento de tumores primarios ha sido lento y uno de los problemas asociados con estos tumores es su débil respuesta a los fármacos contra el cáncer. La efectividad de la quimioterapia y la inmunoterapia ha sido afectada por el fenotipo inherente o adquirido de resistencia a fármacos múltiples (MDR, por sus siglas en inglés) de las células cancerosas. Un mecanismo implicado en el fenotipo MDR es ocasionado por la expresión de la P-glicoproteína (P-gp), un transportador de membrana que bombea hacia afuera diversos fármacos anticancerosos de células que expresan MDR1. También se expresa P-gp en un gran número de tejidos secretores normales, tales como riñón, hígado e intestino. Esta bomba de eflujo es expresada fuertemente en capilares del cerebro donde su expresión estuvo localizada principalmente en la membrana luminal de las célula endoteliales que recubren los capilares. En seres humanos, P-gp es codificada por dos genes MDR: MDR1 y MDR3. P-gp codificada por el gen MDR1 humano confiere el fenotipo de resistencia, mientras que P-gp codificada por el gen MDR3 humano no lo hace. De esta manera, P-gp puede considerarse como un guardián que limita la entrada de fármacos expulsándolos fuera del cerebro o fuera de las células cancerosas, impidiendo que alcancen concentraciones citotóxicas.

Las células cancerosas que forman metástasis del cerebro se originan en su mayoría a partir de cánceres de pulmón

o de mama, carcinoma colorrectal, melanoma y tumores de los órganos urinarios. Estas metástasis, que a menudo ocurren después de cirugía, tratamiento de quimioterapia primaria o radioterapia, son quimiorresistentes. La quimioterapia contra metástasis en el cerebro puede ser efectiva únicamente si fuese efectiva para sus tumores originarios correspondientes. Por ejemplo, se demostró que las metástasis en el cerebro originarias de carcinomas de pulmón de células pequeñas y células germinales responden con tasas similares a las metástasis en otros sitios.

La resistencia a fármacos puede ser una propiedad intrínseca de las células tumorales o puede ser adquirida después del tratamiento. La presencia de la bomba de eflujo de P-gp codificada por MDR1 (también denominada en la presente glicoproteína P, P-gp MDR1 o MDR1) ha sido reportada en la mayoría de los tumores de cerebro primarios donde la mayoría de los gliomas y más particularmente células endoteliales de capilares recién formados fueron teñidos positivos para P-gp MDR1. De esta manera, diversos estudios apoyan la idea de que el fenotipo de resistencia a fármacos múltiples puede ser ocasionado no solamente por la expresión de P-gp en células cancerosas, sino también a partir de su expresión en las células endoteliales recién formadas en los tumores. También se descubrió que los niveles de MDR1 eran significativamente inferiores en metástasis de cerebro a partir de melanomas y de adenocarcinomas de pulmón. Además, se demostró que los tratamientos previos a la cirugía no tienen un impacto importante sobre los niveles de MDR1 en metástasis de cerebro a partir de melanomas, pues eran idénticos en pacientes que recibieron radioterapia, quimioterapia, o ambos tratamientos. En metástasis de pulmón, solamente se detectó MDR1 en pacientes que recibieron quimioterapia, indicando que estos tratamientos previos pueden haber inducido su expresión, dando como resultado un fenotipo MDR adquirido. La falta de expresión de MDR1 en tumores de pulmón primarios y en sus metástasis de cerebro correspondientes indica también que estas metástasis no adquieren los mismos niveles de expresión de P-gp durante su crecimiento que las encontradas en tejido normal del cerebro. Estos resultados también indican que los niveles de MDR1 en células endoteliales de capilares en metástasis de cerebro difieren de los de los tumores de cerebro primarios. La falta de expresión de MDR1 en algunas metástasis de cerebro puede explicar en parte porqué algunas de ellas son más sensibles a los fármacos quimioterapéuticos que los tumores de cerebro primarios.

Los métodos para transportar un compuesto a través de la barrera hematoencefálica han sido descritos en la solicitud de patente internacional PCT/CA2004/000011, publicada el 22 de julio de 2004 bajo la publicación WO 2004 060403. Brevemente, en este documento, aprotinina, fragmentos y análogos de aprotinina fueron presentados como un sistema de entrega de fármacos para el sistema nervioso central (CNS, por sus siglas en inglés) y para tratar enfermedades relacionadas con el CNS.

Continúa existiendo una necesidad para incrementar la potencia de los fármacos contra el cáncer.

La presente invención busca satisfacer estas y otras necesidades.

Compendio de la Invención

La presente invención se refiere, en un aspecto de esta, a un conjugado, o sal farmacéuticamente aceptable de este, que comprende:

(a)

un polipéptido que comprende Angiopep-2 (SEQ ID NO:97), y

(b)

un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un fármaco, una proteína, un marcador y un péptido, donde dicho compuesto está conjugado con dicho polipéptido, con la condición de que dicho conjugado no sea un conjugado de: (a) un polipéptido que consiste en la SEQ ID NO:97 o SEQ ID NO:74, y

(b)

125yodo.

El polipéptido puede tener de 19 a 50 aminoácidos de longitud. Los polipéptidos de la presente invención pueden estar amidados, es decir, pueden tener una secuencia de aminoácidos amidada.

La patente de EE. UU. N.o 5,807,980 describe un polipéptido que es identificado en la presente como la SEQ ID NO.:102.

La patente de EE. UU. N.o 5,780,265 describe un polipéptido que es identificado en la presente como la SEQ ID NO.:103.

La secuencia de aminoácidos de aprotinina (SEQ ID NO.:98), la secuencia de aminoácidos de Angiopep-1 (SEQ ID NO.:67), así como algunas secuencias de análogos biológicamente activos pueden encontrarse, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional PCT/CA2004/000011, publicada el 22 de julio de 2004 bajo publicación internacional WO 2004/060403. De manera adicional, la publicación internacional WO 2004/060403 describe un polipéptido que es identificado en la presente como SEQ ID NO.:104.

La patente de EE. UU. N.o 5,118,668 describe un polipéptido que tiene la secuencia ilustrada en la SEQ ID NO.:105.

De acuerdo con la presente invención, el portador puede comprender el péptido 97 (es decir, SEQ ID NO.: 97 (Angiopep-2)).

La presente invención se refiere particularmente a un conjugado o una composición de acuerdo con las reivindicaciones que es útil para modificar y/o mejorar la farmacocinética (in vivo) de un compuesto.

De acuerdo con la presente invención, el compuesto puede ser seleccionado, por ejemplo, del grupo que consiste en un marcador, una proteína, un péptido y un fármaco.

También de acuerdo con la presente invención, el fármaco puede ser, por ejemplo, un fármaco contra el cáncer.

De acuerdo con la presente invención, el fármaco contra el cáncer puede ser conjugado con el portador de Angiopep-2, con ello formando un conjugado. El conjugado puede comprender, por ejemplo, al menos una molécula de fármaco contra el cáncer para cada molécula portadora. El conjugado puede comprender, por ejemplo, al menos dos moléculas de fármaco contra el cáncer por cada molécula portadora. El conjugado puede comprender, por ejemplo, al menos tres moléculas de fármaco contra el cáncer por cada molécula portadora.

El portador puede promover la acumulación del fármaco en un tejido tal como, por ejemplo, un riñón (tejido de riñón), un hígado (tejido de hígado), un ojo (tejido de ojo), y los pulmones (tejido de pulmón), de un individuo.

El portador puede modificar o mejorar la bio-disponibilidad del compuesto.

El portador puede también cambiar la (habitual) distribución en tejido del compuesto.

El portador puede también promover la acumulación del fármaco en el cerebro (tejido de cerebro) de un individuo, el cerebro puede ser un cerebro tumoral.

El cerebro puede comprender una célula cancerosa de pulmón.

El portador puede promover la acumulación del fármaco en una célula cancerosa (p. ej., acumulación intracelular del fármaco en la célula cancerosa).

Como se usa en la presente, el término "cerebro tumoral" se refiere a un cerebro que comprende un tumor, ya sea un tumor primario o una metástasis de un origen de tejido diferente, tal como una metástasis que se origina de un tumor de pulmón, un tumor de mama, de un melanoma, de un tumor colorrectal, de un tumor de un órgano urinario. Ejemplos de células de cerebro tumoral de esta manera incluyen, por ejemplo, glioblastomas, y células metastásicas que se originan, por ejemplo, de pulmones, mama, colon, tracto urinario o de melanoma.

El portador puede de esta manera ser usado, por ejemplo, para reducir la dosis de un fármaco necesaria para lograr el mismo efecto terapéutico (p. ej., para lograr una reducción en el crecimiento de células tumorales).

Se describe el uso de un portador de Angiopep para transportar un compuesto a un sitio objetivo deseado, un tejido objetivo deseado, o una célula objetivo deseada.

Ejemplos de un fármaco que puede ser conjugado con un polipéptido que comprende Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), incluyen, por ejemplo Taxol, vinblastina, vincristina, etopósido, doxorrubicina, ciclofosfamida, Taxotere, melfalán, clorambucil, sales farmacéuticamente aceptables, etc., y sus combinaciones, así como cualquier fármaco que puede ser un sustrato de P-gp.

El fármaco puede tener un grupo que permite su conjugación con el portador de la Angiopep-2.

Ejemplos de derivados de Taxol (o análogos) incluyen, por ejemplo, los derivados divulgados y a los que se hace referencia en la patente de EE. UU. N.o 6,911,549, expedida el 28 de junio de 2005.

Ejemplos de marcadores que pueden ser conjugados con el portador de la presente invención incluyen, por ejemplo un isótopo, un marcador fluorescente (p. ej., rodamina) o una molécula indicadora (p. ej., biotina).

Ejemplos de proteínas que pueden ser conjugadas con el portador de la presente invención incluyen, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un fármaco peptídico o a base de proteína (p. ej., un modulador farmacológico positivo (agonista) o un inhibidor farmacológico (antagonista).

También se describe el uso de un portador de Angiopep para incrementar la potencia de un fármaco. De manera más particular, el portador puede ser usado para incrementar, por ejemplo, la potencia de un fármaco que puede ser un sustrato de P-gp o fármacos que son expulsados (es decir, arrojados, expelidos de una célula, etc.) por una P-gp

o una proteína relacionada con P-gp (p. ej., un variante alélico de P-gp humano o de mamífero, p. ej., una isoforma mdr1a y/o mdr1b de un roedor, etc.).

El portador puede incrementar, por ejemplo, la potencia de un fármaco contra el cáncer, por ejemplo un fármaco contra el cáncer que puede ser un sustrato de P-gp.

En otro aspecto más, el conjugado o la composición farmacéutica descrita en la presente puede ser útil para incrementar (optimizar) un efecto de crecimiento antitumoral de un fármaco contra el cáncer.

Se describe un conjugado que es útil para transportar un fármaco o un marcador en o a un sitio objetivo deseado o para transportar un fármaco o un marcador dentro de una célula objetivo y/o para promover la acumulación de un fármaco o un marcador dentro de una célula, tal como, por ejemplo, una célula que expresa P-gp en su superficie o una célula que es capaz de expresar P-gp (en su superficie).

El portador puede ser usado, por ejemplo, para promover la acumulación, dentro de una célula, de un fármaco que puede comprender la característica de ser expulsado (es decir, expelido, transportado fuera de una célula, arrojado) por P-gp o una proteína relacionada con P-gp.

El sitio deseado puede ser, por ejemplo, el cerebro u otros sitios fuera del cerebro (p. ej., un sitio extracraneal) tal como, por ejemplo, los riñones, el hígado, el páncreas, el colon, los ojos, los pulmones, y sus combinaciones. Por tanto, el sitio objetivo deseado puede ser uno o más sitios seleccionados del grupo que consiste en el cerebro, los riñones, el hígado, el páncreas, el colon, los ojos, los pulmones, y sus combinaciones.

Un sitio objetivo deseado puede ser, por ejemplo, una célula o tejido de cerebro.

Un sitio objetivo deseado puede ser, por ejemplo, una célula o tejido de hígado.

Un sitio objetivo deseado puede ser, por ejemplo, una célula o tejido de riñón.

Un sitio objetivo deseado puede ser, por ejemplo, una célula o tejido de páncreas.

Un sitio objetivo deseado puede ser, por ejemplo, una célula o tejido de colon.

Un sitio objetivo deseado puede ser, por ejemplo, un ojo o célula de ojo.

Un sitio objetivo deseado puede ser, por ejemplo, una célula o tejido de pulmón.

5 El sitio deseado puede ser un sitio que comprende una célula que expresa un receptor o transportador de portador, por ejemplo una célula que expresa un receptor relacionado con lipoproteína de baja densidad (LRP, por sus siglas en inglés). La célula puede también ser una célula que expresa P-gp o una proteína relacionada con P-gp. La célula, por ejemplo, puede ser una célula normal, una célula de tumor, o una célula metastásica. El portador de la presente invención puede de esta manera ser usado para poner en objetivo una célula de cerebro, una célula de

10 hígado, una célula de riñón, una célula de páncreas, una célula de colon, una célula de ojo, una célula de pulmón, y sus combinaciones (ya sea normales o tumorales).

Se describe también el uso de un portador de Angiopep o la composición farmacéutica o el conjugado descritos en la presente para promover la acumulación intracelular de un compuesto (es decir, promover la acumulación del compuesto dentro de una célula).

15 El compuesto puede ser seleccionado, por ejemplo, del grupo que consiste en un marcador, una proteína, un péptido, y un fármaco.

La célula puede ser una célula que es capaz de expresar P-gp o que exprese P-gp. De manera más particular, la célula puede expresar P-gp (MDR1) en la superficie celular.

La célula, por ejemplo, puede ser una célula de tumor. La célula de tumor puede originarse, por ejemplo, y sin 20 limitación, de un tumor de cerebro, un tumor de pulmón, un tumor de mama, un tumor de riñón, un tumor de ojo, un tumor de hígado, un tumor colorrectal o un tumor de un órgano urinario.

La célula puede estar ubicada fuera del cerebro del individuo (mamífero, animal, etc.). Por ejemplo, la célula puede ser una célula de tumor que puede estar ubicada fuera del cerebro de un individuo (mamífero, animal, etc.).

La célula puede estar ubicada dentro del cerebro de un individuo. La célula, por ejemplo, puede ser una célula 25 tumoral que puede estar ubicada dentro del cerebro de un individuo (mamífero, animal, etc.).

La célula de tumor puede ser una célula de tumor de cerebro. Por ejemplo, la célula de tumor de cerebro puede originarse de un glioblastoma o puede ser un glioblastoma.

La célula de tumor puede ser una célula de tumor de pulmón.

Se describe también el uso del conjugado o la composición farmacéutica descritos en la presente, para reducir la 30 eliminación de un fármaco desde el interior de una célula, tal como por ejemplo una célula que puede ser capaz de expresar P-gp (MDR1) o que expresa P-gp. El fármaco puede ser un sustrato de P-gp.

La célula puede ser una célula cancerosa resistente a múltiples fármacos.

Se describe también el uso del conjugado o la composición farmacéutica descritos en la presente, para reducir el crecimiento de una célula. Para ese fin, el portador puede ser conjugado con un fármaco que puede ser capaz de 35 reducir el crecimiento de una célula.

El conjugado formado de esta manera o la composición farmacéutica de este, pueden usarse para reducir el crecimiento de una célula de tumor o una célula endotelial.

La célula de tumor puede ser capaz de expresar o expresa P-gp (MDR1).

La célula de tumor puede ser una célula de tumor de cerebro. De manera más específica, la célula de tumor de 40 cerebro puede originarse de un glioblastoma o puede ser un glioblastoma.

La célula de tumor puede ser una célula de tumor de pulmón.

La célula de tumor puede ser una célula de tumor de mama. La célula de tumor puede ser una célula de tumor de riñón. La célula de tumor puede ser una célula de tumor de ojo. La célula de tumor puede ser de un cáncer colorrectal. La célula de tumor puede ser de un tumor de órgano urinario. El fármaco contra el cáncer puede, de manera más específica, ser Taxol, Taxotere o un derivado de Taxol o

Taxotere. El fármaco contra el cáncer puede ser, por ejemplo, vinblastina. El fármaco contra el cáncer puede ser, por ejemplo, vincristina. El fármaco contra el cáncer puede ser, por ejemplo, etopósido. El fármaco contra el cáncer puede ser, por ejemplo, doxorrubicina. El fármaco contra el cáncer puede ser, por ejemplo, ciclofosfamida. El fármaco contra el cáncer puede ser, por ejemplo, melfalán. El fármaco contra el cáncer puede ser, por ejemplo, clorambucil. Se describe también el uso de un portador de Angiopep-2 descrito en la presente en la elaboración de una

composición farmacéutica o medicamento para modificar la farmacocinética del fármaco. De manera más particular, el portador puede ser usado para reducir el crecimiento de una célula. También de manera más particular, el portador puede ser usado para promover la acumulación del fármaco dentro

de una célula. Además, el portador puede ser usado para reducir la eliminación del fármaco desde el interior de una célula. Asimismo, el portador puede ser usado para incrementar un efecto de crecimiento antitumoral del fármaco. Además, el portador puede ser usado para mejorar la biodisponibilidad del fármaco. Además el portador puede ser usado para cambiar la distribución en tejido (habitual) del fármaco. Además, la presente invención se refiere a un conjugado o una composición de acuerdo con las reivindicaciones

para utilizar en el tratamiento del cáncer, cáncer metastásico, y/o metástasis. De acuerdo con la presente invención,

una metástasis ejemplar puede comprender una metástasis que puede originarse a partir de un tumor de mama, un

tumor de pulmón o un melanoma.

Se describe también un portador de Angiopep-2 que es útil para la detección de una célula objetivo deseada.

El portador de Angiopep-2 descrito en la presente puede ser útil para el diagnóstico de un cáncer, un cáncer metastásico, y/o metástasis. La presente invención se refiere además, en un aspecto adicional, a una composición que comprende el conjugado

de acuerdo con la reivindicaciones y un portador farmacéuticamente aceptable. La presente invención, en un aspecto adicional, se refiere a un conjugado y/o una sal farmacéuticamente aceptable de este. El conjugado puede comprender, por ejemplo, un portador como se describe en la presente y un fármaco, un marcador o una proteína. El portador puede estar unido de manera covalente al fármaco, marcador, proteína o péptido.

De manera más particular, el conjugado puede comprender, por ejemplo, un portador que comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un fármaco, un marcador, una proteína, y sus combinaciones. De acuerdo con la presente invención, el conjugado puede comprender una o más moléculas de fármaco.

El compuesto puede ser liberado o no del portador. El compuesto, por tanto, puede ser liberable del conjugado (o

5 del portador). Se describe también el uso de un conjugado que comprende Angiopep-2 y al menos un fármaco o marcador, para modificar la farmacocinética (in vivo) del fármaco o marcador que está unido al polipéptido de Angiopep-2.

El conjugado puede, de manera más particular, usarse para reducir el crecimiento de una célula. El conjugado puede ser usado para promover la acumulación del fármaco o marcador dentro de una célula.

10 El conjugado puede también ser usado para reducir la eliminación del fármaco o marcador desde el interior de una célula. El conjugado puede ser usado para incrementar un efecto de crecimiento antitumoral del fármaco. El conjugado puede mejorar la biodisponibilidad del compuesto. El conjugado puede también cambiar la distribución en tejido del compuesto.

15 El fármaco puede ser capaz de reducir el crecimiento de una célula. Se describe también el uso de un conjugado que puede comprender a) un portador que comprende Angiopep-2 y b)

al menos un fármaco en la elaboración (elaboración) de una composición farmacéutica o un medicamento para modificar la farmacocinética del fármaco de molécula pequeña. La presente invención también se refiere al uso del conjugado de acuerdo con las reivindicaciones en la elaboración

20 de una composición o un medicamento para el tratamiento de una condición tal como cáncer, cáncer metastásico,

y/o metástasis. Se describe también el uso de un conjugado que puede comprender a) un portador de Angiopep-2 y b) al menos un marcador, para la detección de una célula que puede ser seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste en una célula de ojo, una célula de cerebro, una célula de mama, una célula de hígado, una célula de riñón, una célula de

25 órgano urinario, una célula de colon, una célula del recto, y una célula de pulmón. La célula que puede ser detectada puede ser, por ejemplo, una célula de ojo. La célula que puede ser detectada puede ser, por ejemplo, una célula de cerebro. La célula que puede ser detectada puede ser, por ejemplo, una célula de hígado. La célula que puede ser detectada puede ser, por ejemplo, una célula de mama.

30 La célula que puede ser detectada puede ser, por ejemplo, una célula de riñón. La célula que puede ser detectada puede ser, por ejemplo, una célula de pulmón. La presente invención se refiere adicionalmente a una composición (p. ej., composición farmacéutica) que

comprende un conjugado de acuerdo con las reivindicaciones y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica descrita en la presente puede ser usada, por ejemplo, en el tratamiento o la detección 35 de cáncer, cáncer metastásico, y/o metástasis. La presente invención provee, en un aspecto particular de esta, una composición farmacéutica que puede ser capaz,

por ejemplo, de reducir el crecimiento de una célula o de la detección de una célula, la composición farmacéutica puede comprender: a) un conjugado que puede comprender un portador que no comprende Angiopep-2, y un marcador o un fármaco capaz de reducir el crecimiento de una célula; y

b) un portador farmacéuticamente aceptable. Se describe también una composición farmacéutica que puede comprender:

a) un conjugado que comprende Angiopep-2, y un fármaco o un marcador,

b) un portador farmacéuticamente aceptable, y

c) un solubilizador.

De acuerdo con la presente invención, el solubilizador puede ser, por ejemplo, un éster polioxietilénico de ácido graso. Los solubilizadores englobados por la presente invención incluyen, por ejemplo, Solutol® HS-15.

Un solubilizador adecuado puede comprender un éster polioxietilénico de ácido graso, tal como, por ejemplo, Solutol® HS-15.

La composición farmacéutica puede ser usada, de manera más específica, para modificar la farmacocinética de un compuesto, para reducir el crecimiento de una célula de tumor, o para la detección de una célula de tumor.

La presente invención se refiere además a un conjugado de acuerdo con las reivindicaciones para utilizar en el tratamiento contra el cáncer, cáncer metastásico y/o metástasis. Una metástasis ejemplar que puede ser tratada usando el conjugado de acuerdo con las reivindicaciones es una metástasis que puede originarse, por ejemplo, a partir de un tumor de mama, un tumor de pulmón o un melanoma.

La presente invención también describe, en otro aspecto de esta, un conjugado o composición de acuerdo con las reivindicaciones para utilizar en un método para tratar el cáncer (tal como, por ejemplo, un tumor primario o un cáncer metastásico y/o una metástasis) o para detectar una célula cancerosa, el método puede comprender administrar a un individuo una composición farmacéutica descrita en la presente o un conjugado que comprende Angiopep-2 y b) un fármaco contra el cáncer o un marcador.

De acuerdo con la presente invención, el individuo puede tener, por ejemplo, un tumor extracraneal, un tumor de cerebro primario, o un tumor de cerebro de origen metastásico.

El método puede también comprender un paso de determinar si el tumor del individuo comprende una célula de tumor resistente a fármacos múltiples o, por ejemplo, una célula que expresa P-gp (MDR1), o determinar si el tumor puede tener o tiene un fenotipo de resistencia a fármacos múltiples.

El individuo puede ser el que tiene un tumor. El individuo también puede ser el que ha recibido o recibirá quimioterapia o radioterapia, o ambas. El individuo puede también ser el que tuvo cirugía. Además, el individuo puede ser el que tiene un tumor de cerebro o puede también ser quien tiene un tumor en otro sitio que no sea el cerebro (está libre de un tumor de cerebro). Un individuo que lo necesita puede también ser, por ejemplo, un individuo que presenta o está en riesgo de presentar una resistencia (fenotipo de resistencia a fármacos múltiples (MDR)) a por lo menos un fármaco.

De manera más particular, y de acuerdo con la presente invención, el individuo puede tener, por ejemplo, un tumor extracraneal.

De acuerdo con la presente invención, el tumor extracraneal puede ser, por ejemplo, un tumor de pulmón.

También de acuerdo con la presente invención, el tumor extracraneal puede ser, por ejemplo, una metástasis extracraneal de un tumor de cerebro. En una forma de realización más específica de la presente invención, el tumor de cerebro extracraneal puede ser, por ejemplo, un glioblastoma (metástasis extracraneal de glioblastoma).

El individuo puede tener un tumor de cerebro de origen metastásico. El tumor de cerebro de origen metastásico puede originarse, por ejemplo, de un tumor de pulmón. El tumor de cerebro de origen metastásico puede también originarse, por ejemplo, de un tumor de mama. Adicionalmente, el tumor de cerebro de origen metastásico puede también originarse, por ejemplo, a partir de una melanoma. Además, y como se describe en la presente, el tumor de cerebro de origen metastásico puede también originarse, por ejemplo, de un cáncer colorrectal. Además, el tumor de cerebro de origen metastásico puede también originarse, por ejemplo, de un tumor de un órgano urinario.

De acuerdo con la presente invención, el tumor puede comprender una célula de tumor que puede ser capaz de expresar P-gp o que expresa P-gp.

De acuerdo con la presente invención, el tumor puede comprender una célula de tumor que puede ser capaz de expresar LRP o que expresa LRP.

De acuerdo con la presente invención, la célula de tumor puede comprender una célula de tumor que puede ser capaz de co-expresar P-gp y LRP o que co-expresa P-gp y LRP. Pueden ubicarse P-gp y LRP, por ejemplo, en una superficie celular.

De manera más particular, la presente invención describe un método para promover la acumulación de un fármaco en el cerebro de un individuo que tiene una metástasis. El método puede comprender administrar un portador de Angiopep-2 o conjugado, como se describe en la presente, a un individuo que tiene una metástasis de cerebro. De acuerdo con la presente invención, la metástasis puede originarse de un cáncer de pulmón.

Se describe un método para promover la acumulación intracelular de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un marcador, una proteína, un péptido, y un fármaco.

El método puede comprender el paso de poner en contacto la célula o proveer la célula con un conjugado que comprende Angiopep-2, y b) el compuesto deseado.

La célula, por ejemplo, puede ser una célula que expresa P-gp.

La célula, por ejemplo, puede ser una célula de cerebro, una célula de pulmón, una célula de mama, una célula de riñón, una célula de ojo o una célula de hígado.

La célula, por ejemplo, puede ser una célula de tumor que puede estar localizada fuera de un cerebro de un individuo (mamífero, animal, etc.).

Se describe un método para reducir la eliminación de un fármaco desde el interior de una célula que es capaz de expresar o que expresa P-gp (MDR1).

El método puede comprender conjugar el fármaco con un portador de Angiopep-2 descrito en la presente, con ello formando un conjugado y proveyendo la célula con el conjugado.

La célula puede ser una célula cancerosa resistente a fármacos múltiples.

La célula puede estar comprendida dentro de un tumor extracraneal de un individuo.

La célula puede estar comprendida dentro del cerebro de un individuo. La célula puede ser una célula de tumor, tal como, por ejemplo, una célula de tumor de cerebro (primario) o una célula de tumor de cerebro metastásico.

Los medios para proveer una célula con un conjugado, por ejemplo, son para proveer el conjugado a un individuo que comprende una célula resistente a fármacos múltiples o una célula de tumor resistente a fármacos múltiples (p. ej., o una célula que expresa MDR1).

El método puede ser usado para reducir la eliminación de un fármaco que es un sustrato de P-gp o que puede ser un sustrato de P-gp.

Se describe un método para reducir el crecimiento de una célula. El método puede comprender poner en contacto la célula con un conjugado que comprende Angiopep-2, y b) un fármaco capaz de reducir el crecimiento de una célula,

o con la composición farmacéutica descrita en la presente.

El portador de Angiopep-2 puede ser usado para incrementar la potencia (eficiencia, efectividad) del fármaco.

La conjugación del fármaco con el portador de Angiopep-2 puede ser lograda mediante diversos medios que pueden incluir utilizar un conector (p. ej., un conector capaz de generar un enlace éster), que puede permitir la asociación del fármaco mediante un átomo adecuado, por ejemplo mediante un átomo de oxígeno.

Se describe un método para modificar la farmacocinética de un compuesto que puede ser seleccionado, por ejemplo, del grupo que consiste en un marcador, una proteína, un péptido, y un fármaco, el método pudiendo comprender el paso de conjugar el compuesto con un portador de Angiopep-2 descrito en la presente, con ello formando un conjugado y proveyendo el conjugado a un individuo que lo necesita.

Puede usarse una relación de una molécula del compuesto por cada molécula portadora para el paso de conjugación.

Puede usarse una relación de al menos dos moléculas del compuesto por cada molécula portadora para el paso de conjugación.

Puede usarse una relación de al menos tres moléculas del compuesto por cada molécula portadora para el paso de conjugación. El compuesto, por ejemplo, puede ser un fármaco.

El compuesto puede ser, por ejemplo, un marcador.

El individuo que lo necesita puede ser, de manera más particular, un individuo que tiene un tumor. Por ejemplo, el individuo puede tener un tumor de cerebro. El tumor de cerebro puede ser, por ejemplo, un tumor de cerebro primario. El tumor de cerebro puede ser, por ejemplo, de un origen de tejido diferente al tejido de cerebro.

El tumor de cerebro del individuo puede ser, por ejemplo, un tumor de cerebro extracraneal.

El tumor puede comprender una célula de tumor que expresa o que es capaz de expresar P-gp (MDR1).

El tumor de cerebro puede originarse, por ejemplo, a partir de un tumor de pulmón. El tumor de cerebro puede también originarse, por ejemplo, a partir de un tumor de mama. Asimismo, por ejemplo, el tumor de cerebro puede originarse de un melanoma.

El portador de Angiopep-2, conjugado, o la composición farmacéutica, como se describe en la presente puede usarse para reducir la acumulación de LRP dependiente de RAP y para reducir el evento o efecto (p. ej., intracelular) mediado por RAP.

Para los fines de la presente invención, los siguientes términos se definen a continuación.

El término "Angiopep", como se usa en la presente, se refiere a Angiopep-1 y Angiopep-2.

Los términos "Taxol-Angiogep" y "TxlAn" son usados de manera intercambiable y se refieren a Taxol-Angiopep-1 y Taxol-Angiopep-2, comprendiendo una, dos o tres moléculas de Taxol.

Los términos "Taxol-Angiopep-1" y "TxlAn1" son usados de manera intercambiable y se refieren a Taxol-Angiopep-1, comprendiendo ya sea una, dos o tres moléculas de Taxol.

Los términos "Taxol-Angiopep-2" y "TxlAn2" son usados de manera intercambiable y se refieren a Taxol-Angiopep-2, comprendiendo ya sea una, dos o tres moléculas de Taxol.

El término "TxlAn1 (2:1)" se refiere a la relación de moléculas de Taxol con Angiopep-1 en un conjugado dado. Por ejemplo, el término "TxlAn1 (2:1)" se refiere a un conjugado que tiene dos moléculas de Taxol asociadas con una molécula de Angiopep-1. Además, el término "TxlAn1 (3:1)" se refiere a un conjugado que tiene tres moléculas de Taxol asociadas con una molécula de Angiopep-1.

De manera similar, el término "TxlAn2 (2:1)" se refiere a la relación de moléculas de Taxol con Angiopep-2 en un conjugado dado. Por ejemplo, el término "TxlAn2 (2:1)" se refiere a un conjugado que tiene dos moléculas de Taxol asociadas con una molécula de Angiopep-2. Además, el término "TxlAn2 (3:1)" se refiere a un conjugado que tiene tres moléculas de Taxol asociadas con una molécula de Angiopep-2.

El término "portador" o "vector" significa un compuesto o molécula que es capaz de transportar una molécula a un sitio o célula objetivo deseados. Un portador puede estar unido (de manera covalente o no) o conjugado con otro compuesto o agente y con ello puede ser capaz de transportar el otro compuesto o agente a un sitio objetivo deseado. El portador puede ser una proteína, un péptido o un peptidomimético y puede ser de origen natural o producido mediante síntesis química o tecnología genética recombinante (ingeniería genética).

La expresión "fármaco de molécula pequeña" significa un fármaco que tiene un peso molecular de 1,000 g/mol o menos o entre 300 y 700 g/mol.

Los términos "tratamiento", "tratar" y similares significan obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado, p. ej., inhibir el crecimiento de células cancerosas, muerte de una célula cancerosa o mejora de una condición o enfermedad neurológica. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o parcialmente una enfermedad o síntoma de esta y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa para una enfermedad y/o un efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en la presente, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente un ser humano, e incluye: (a) prevenir la ocurrencia de una enfermedad (p. ej., prevenir el cáncer) o una condición en un individuo que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que todavía no ha sido diagnosticado por tenerla; (b) inhibir una enfermedad (p. ej., detener su desarrollo); o (c) aliviar una enfermedad (p. ej., reducir los síntomas asociados con una enfermedad). "Tratamiento", como se usa en la presente, cubre cualquier administración de un agente farmacéutico o compuesto a un individuo para tratar, curar, aliviar, mejorar, disminuir o inhibir una condición en el individuo, incluyendo administrar un fármaco que comprende un portador descrito en la presente o un conjugado a un individuo que lo necesita.

El término "cáncer" significa cualquier malignidad celular cuyo único rasgo sea la pérdida de los controles normales, lo que da como resultado crecimiento no regulado, falta de diferenciación y capacidad de invadir tejidos locales y crear metástasis. El cáncer puede desarrollarse en cualquier tejido de cualquier órgano. De manera más específica, se pretende que el término "cáncer" incluya cáncer de cerebro.

Los términos "administrar" y "administración" significan un modo de administración incluyendo, sin limitación, vía intraarterial, intranasal, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica o per os. Una dosificación diaria puede dividirse en una, dos o más dosis en una forma adecuada para administrarse una, dos o más veces en un periodo de tiempo.

Los términos "terapéuticamente efectiva" o "cantidad efectiva" significan una cantidad de un compuesto suficiente para mejorar sustancialmente algún síntoma asociado con una enfermedad o una condición médica. Por ejemplo, en el tratamiento del cáncer, sería terapéuticamente efectivo un agente o compuesto que reduce, previene, retrasa, suprime o detiene cualquier síntoma de la enfermedad o condición. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente o compuesto no es requerida para curar una enfermedad o condición, pero proveerá un tratamiento para una enfermedad o condición tal que se retrase, impida o prevenga, o se alivie la enfermedad o condición, o se cambie el término de la enfermedad o condición, o por ejemplo sea menos severa o se acelere la recuperación en un individuo.

El conjugado de la presente invención puede ser usado en combinación con ya sea métodos convencionales de tratamiento y/o terapia o por separado de los métodos convencionales de tratamiento y/o terapia.

Cuando los conjugados de esta invención son administrados en terapias de combinación con otros agentes, pueden administrarse de manera secuencial o simultánea a un individuo. De manera alternativa, composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención pueden comprender una combinación de un conjugado portador-agente de la presente invención en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable o excipiente farmacéuticamente aceptable, como se describe en la presente, y otro agente terapéutico o profiláctico conocido en la materia.

Pueden prepararse sales de ácido (de adición) farmacéuticamente aceptables por los métodos conocidos y usados en la materia.

Como se usa en la presente, "composición farmacéutica" significa cantidades terapéuticamente efectivas del agente junto con diluyentes, conservadores, solubilizadores, emulsificantes, adyuvantes y/o portadores farmacéuticamente aceptables. Una "cantidad terapéuticamente efectiva", como se usa en la presente, se refiere a esa cantidad que provee un efecto terapéutico para una condición y un régimen de administración dados. Tales composiciones son formulaciones líquidas o liofilizadas o secas de otra manera e incluyen diluyentes de diverso contenido de amortiguadores de pH (p. ej., Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y concentración iónica, aditivos tales como albúmina o gelatina para prevenir absorción en superficies, detergentes (p. ej., Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sales de ácido de bilis). Los agentes solubilizadores (p. ej., glicerol, polietilén glicerol), antioxidantes (p. ej., ácido ascórbico, meta-bisulfito de sodio), conservadores (p. ej., timerosal, alcohol bencílico, parabenos), sustancias engrosadoras o modificadores de tonicidad (p. ej., lactosa, manitol), unión covalente de polímeros, tales como polietilén glicol a la proteína, formación de complejos con iones de metales, o incorporación de material en o sobre preparaciones en partículas de compuestos poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, hidrogeles, etc., o en liposomas, microemulsiones, micelios, vesículas unilamelares o multilamelares, eritrocitos acrómicos, o esferoplastos. Tales composiciones influenciarán el estado físico, la solubilidad, la estabilidad, la tasa de liberación in vivo, y la tasa de eliminación in vivo. Composiciones de liberación controlada o sostenida incluye formulación en depósitos lipófilos (p. ej., ácidos grasos, parafinas, aceites). También están comprendidas en la invención las composiciones en partículas revestidas con polímeros (p. ej., poloxámeros o poloxaminas). Las composiciones de la invención pueden incorporar revestimientos protectores de formas en partículas, inhibidores de proteasa o mejoradores de permeación para diversas rutas de administración, incluyendo parenteral, pulmonar, nasal, oral, vaginal, rectal. La composición farmacéutica puede administrarse por vía parenteral, paracanceral, transmucosal, transdérmica, intramuscular, intravenosa, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intraventricular, intracraneal e intratumoral.

Además, como se usan en la presente, los términos "portador farmacéuticamente aceptable" o "portador farmacéutico" son conocidos en la materia e incluyen amortiguador de fosfato 0.01-0.1 M o 0.05 M o solución salina al 0.8%. De manera adicional, tales portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser un amortiguador, soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones, y emulsiones. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medios amortiguados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, aceites de Ringer lactados o aceites fijados. Los vehículos intravenosos incluyen rellenadores de fluidos y nutrientes, rellenadores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer. También pueden estar presentes conservadores y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes de cotejo, gases inertes.

Debe entenderse en la presente como un "fragmento" a un polipéptido que se origina de (engloba) una porción de una secuencia original o parental. Los fragmentos engloban polipéptidos que tienen cortes de uno o más aminoácidos, donde el corte se puede originar del término amino (término N), el término carboxi (término C), o del interior de una proteína. Un fragmento puede comprender la misma secuencia que la porción correspondiente de la secuencia original.

Un "derivado", en el contexto de proteínas o péptidos, debe entenderse en la presente como un polipéptido que se origina de una secuencia original o de una porción de una secuencia original y que puede comprender una o más modificaciones; por ejemplo, una o más modificaciones en la secuencia de aminoácidos (p. ej., una adición, eliminación, inserción, sustitución, etc., de un aminoácido) y una o más modificaciones en la columna vertebral o la cadena lateral de uno o más aminoácidos, o una adición de un grupo u otra molécula a uno o más aminoácidos (cadenas laterales o columna vertebral).

Un "análogo" en el contexto de proteínas o péptido debe entenderse en la presente como una molécula que tienen una actividad biológica y una estructura química similares a las de un polipéptido descrito en la presente. Un análogo comprende un polipéptido que puede tener, por ejemplo, una o más inserciones de aminoácidos, ya sea en uno o ambos extremos del polipéptido y/o dentro de la secuencia de aminoácidos del polipéptido.

Un "análogo" puede tener similitud de secuencia con una secuencia original o una porción de una secuencia original y puede también tener una modificación de su estructura. Por ejemplo, un "análogo" puede tener al menos 90% de similitud de secuencia con una secuencia original o una porción de una secuencia original. Un "análogo" puede también tener, por ejemplo, al menos 70 o incluso 50% de similitud de secuencia con una secuencia original o una porción de una secuencia original. Un "análogo" puede tener, por ejemplo, 50, 70, 80 o 90% de similitud de secuencia con una secuencia original con una combinación de una o más modificaciones en una columna vertebral

o cadena lateral de un aminoácido, o una adición de un grupo u otra molécula, etc. Los aminoácidos que están destinados a ser similares (un aminoácido conservador) a otro son conocidos en la materia e incluyen, por ejemplo, los enumerados en la Tabla 1.

Además, un "análogo" puede tener al menos 50, 70, 80 o 90% de identidad de secuencia con una secuencia original

o una porción de una secuencia original. Asimismo, un "análogo" puede tener, por ejemplo, 50, 70, 80 o 90% de identidad de secuencia con una secuencia original con una combinación de una o más modificaciones en una columna vertebral o cadena lateral de un aminoácido, o una adición de un grupo u otra molécula, etc.

La similitud o la identidad pueden compararse, por ejemplo, en una región de 2, 3, 4, 5, 10, 19, 20 aminoácidos o más (y cualquier número entre éstos). La identidad puede incluir en la presente aminoácidos que son idénticos al péptido original y que pueden ocupar la misma o similar posición cuando se comparan con el polipéptido original. Un análogo que tiene, por ejemplo, 50% de identidad con un polipéptido original puede incluir, por ejemplo, un análogo que comprende 50% del aminoácido del polipéptido original y similarmente con otros porcentajes. Se entenderá en la presente que pueden encontrarse espacios entre los aminoácidos de análogos que son idénticos o similares a los aminoácidos del péptido original. Los espacios pueden no incluir aminoácidos, o incluir uno o más aminoácidos que no son idénticos o similares al péptido original.

Como se discutió antes, la modificación de polipéptidos puede comprender, por ejemplo, inserción (es decir, adición), eliminación y sustitución (es decir, reemplazo) de aminoácidos, ya sea conservadoras o no conservadoras

(p. ej., D-aminoácidos, ácidos desamino) en la secuencia del polipéptido donde tales cambios no alteran sustancialmente la actividad biológica global del polipéptido.

Ejemplos de sustituciones pueden ser aquellas que son conservadoras (es decir, donde un residuo es reemplazado por otro del mismo tipo o grupo general), o cuando se desea, no conservadoras (es decir, donde un residuo es reemplazado por un aminoácido de otro tipo). Además, un aminoácido que no ocurre de manera natural puede sustituirse por un aminoácido que ocurre de manera natural (es decir, sustitución conservadora de aminoácido que

5 no ocurre de manera natural o sustitución de aminoácido no conservadora que no ocurre de manera natural).

Como se entiende, los aminoácidos que ocurren de manera natural pueden subclasificarse como ácidos, básicos, neutros y polares, o neutros y no polares. Además, tres de los aminoácidos codificados son aromáticos. Puede ser útil que los polipéptidos codificados que difieren del polipéptido determinado de la presente invención contengan codones sustituidos por aminoácidos, que sean del mismo tipo o grupo que el aminoácido por reemplazarse. De esta manera, en algunos casos, los aminoácidos básicos Lys, Arg y His pueden ser intercambiables; los aminoácidos ácidos Asp y Glu pueden ser intercambiables; los aminoácidos neutros polares Ser, Thr, Cys, Gln y Asn pueden ser intercambiables; los aminoácidos alifáticos no polares Gly, Ala, Val, Ile y Leu son intercambiables pero debido al tamaño, Gly y Ala están más estrechamente relacionados, y Val, Ile y Leu están más estrechamente relacionados entre sí, y los aminoácidos aromáticos Phe, Trp y Tyr pueden ser intercambiables.

15 Debe observarse además que si los polipéptidos son hechos de manera sintética, pueden también hacerse sustituciones por aminoácidos que no son codificados de manera natural por medio de ADN (aminoácido que no ocurre de manera natural o no natural).

Debe entenderse a un aminoácido que no ocurre de manera natural en la presente como un aminoácido que no se produce o se encuentra de manera natural en un mamífero. Un aminoácido que no ocurre naturalmente comprende un D-aminoácido, un aminoácido que tiene un grupo acetilaminometil unido a un átomo de azufre de una cisteína, un aminoácido pegilado, etc. La inclusión de un aminoácido que no ocurre de manera natural en una secuencia definida de polipéptido por tanto generará un derivado del polipéptido original. Aminoácidos (residuos) que ocurren de manera natural incluyen también los aminoácidos omega de la fórmula NH2(CH2)nCOOH, donde n es 2-6 aminoácidos no polares neutros, tales como sarcosina, t-butil alanina, t-butil glicina, N-metil isoleucina, norleucina,

25 etc. Puede sustituirse fenilglicina por Trp, Tyr o Phe; citrulina y sulfóxido de metionina son no polares, neutros, el ácido cisteico es ácido, y ornitina es básico. La prolina puede ser sustituida con hidroxiprolina y conservar las propiedades que confieren la conformación.

Se conoce en la materia que pueden generarse análogos mediante mutagénesis por sustitución y conservan la actividad biológica de los polipéptidos de la presente invención. Estos análogos tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de proteína removida y un residuo diferente insertado en su lugar. Ejemplos de sustituciones identificadas como "sustituciones conservadoras" son mostrados en la Tabla 1. Si tales sustituciones dan como resultado un cambio no deseado, entonces se introduce otro tipo de sustituciones, denominadas "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o como se describe en la presente adicionalmente con referencia a clases de aminoácidos, y los productos son analizados y seleccionados.

35 En algunos casos, puede ser de interés modificar la actividad biológica de un polipéptido mediante sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos. Por ejemplo, la modificación de un polipéptido puede dar como resultado un incremento en la actividad biológica del polipéptido, puede modular su toxicidad, puede dar como resultado cambios en la biodisponibilidad o en la estabilidad, o puede modular su actividad inmunológica o su identidad inmunológica. Modificaciones sustanciales en la función o la identidad inmunológica son logradas seleccionando sustituciones que difieren de manera significativa en su efecto en cuanto a mantener (a) la estructura de la columna vertebral del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que ocurren de manera natural son divididos en grupos con base en propiedades comunes de la cadena lateral:

(1) hidrófobos: norleucina, metionina (Met), Alanina (Ala), valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (Ile);

45 (2) hidrófilos neutros: cisteína (Cys), serina (Ser), treonina (Thr);

(3)

ácidos: ácido aspártico (asp), ácido glutámico (Glu);

(4)

básicos: asparagina (Asn), glutamina (Gln), histidina (His), lisina (Lys), arginina (Arg);

(5)

residuos que influencian la orientación de cadena: glicina (Gly), prolina (Pro); y aromáticos: triptofano (Trp), tirosina (Tyr), fenilalanina (Phe).

Las sustituciones no conservadoras implican intercambiar un miembro de estas clases por otro.

Tabla 1. Sustitución de aminoácidos

Residuo Original

Sustitución Ejemplar Sustitución Conservadora

Ala (A)

Val, Leu, Ile Val

Arg (R)

Lys, Gln, Asn Lys

Asn (N)

Gln, His, Lys, Arg Gln

Asp (D)

Glu Glu

Cys (C)

Ser Ser

Gln (Q)

Asn Asn

Glu (E)

Asp Asp

Gly (G)

Pro Pro

His (H)

Asn, Gln, Lys, Arg Arg

Ile (I)

Leu, Val, Met, Ala, Phe, norleucina Leu

Leu (L)

Norleucina, Ile, Val, Met, Ala, Phe Ile

Lys (K)

Arg, Gln, Asn Arg

Met (M)

Leu, Phe, Ile Leu

Phe (F)

Leu, Val, Ile, Ala Leu

Pro (P)

Gly Gly

Ser (S)

Thr Thr

Thr (T)

Ser Ser

Trp (W)

Tyr Tyr

Tyr (Y)

Trp, Phe, Thr, Ser Phe

Val (V)

Ile, Leu, Met, Phe, Ala, norleucina Leu

Un análogo de Angiopep-2 puede tener la fórmula II: X1-Angiopep-2-X2; en donde

X1 y X2 pueden ser, de manera independiente, una secuencia de aminoácidos de entre 0 y alrededor de 100 aminoácidos (p. ej., de entre 0 y alrededor de 60 aminoácidos). X1 y X2 pueden ser derivados de aminoácidos

5 consecutivos de aprotinina o análogos de aprotinina (secuencia homóloga de aminoácidos) o pueden ser cualquiera otra secuencia de aminoácidos (secuencia heteróloga de aminoácidos). El análogo, sin embargo, de preferencia sería biológicamente activo, como se determina por medio de uno de los ensayos descritos en la presente o por cualquier ensayo similar o equivalente.

Se pueden encontrar ejemplos de análogos de aprotinina llevando a cabo un blast proteico (Genebank: www.nc

10 bi.nlm.nih.gov/BLAST/) de la secuencia de aprotinina sintética (o porción de esta) descrita en la solicitud de patente internacional n.o PCT/CA2004/000011. Se pueden encontrar análogos de aprotinan ejemplares, por ejemplo, con los n.os de acceso CAA37967 (GI: 58005), 1405218C (GI:3604747) etc.

Un polipéptido biológicamente activo (p. ej., portador) puede ser identificado usando uno de los ensayos o métodos descritos en la presente. Por ejemplo, un portador candidato puede ser producido por medio de síntesis 15 convencional de péptidos, conjugado con Taxol como se describe en la presente, y probado en un modelo in vivo, como se describe en el Ejemplo 5. Un portador biológicamente activo puede ser identificado, por ejemplo, con base en su eficacia para reducir una carga tumoral en comparación con ratones tratados con placebo. Un fármaco candidato que puede ser usado en la conjugación de un portador descrito en la presente puede ser identificado, por ejemplo, determinando o no si el fármaco es expulsado de células que sobreexpresan P-gp, como se describe en la

20 presente, y evaluando si su conjugación con el portador incrementa su acumulación dentro de una célula deseada.

Ejemplos de análogos biológicamente activos pueden encontrarse en la Tabla 2 y en el listado de secuencias.

Deberá entenderse en la presente que si se menciona un "rango" o "grupo de sustancias" con respecto de una característica particular (p. ej., temperatura, concentración, tiempo y similares) de la presente invención, la presente invención se refiere a e incorpora explícitamente en la presente cada uno y todos los miembros específicos y combinaciones de subrangos o subgrupos cualesquiera. De esta manera, cualquier rango o grupo especificado debe ser entendido como una manera abreviada de referirse a cada uno y todos los miembros de un rango o grupo de manera individual así como cada uno y todos los subrangos o subgrupos posibles englobados en ellos; y de manera similar con respecto de cualesquiera subrangos o subgrupos en ellos. De esta manera, por ejemplo

-

con respecto a una longitud de 19 aminoácidos o menos, se entenderá que se incorporan específicamente en la presente cada una y todas las longitudes individuales, p. ej., una longitud de 18, 17, 15, 10, 5, etc. Por tanto, a 5 menos que se mencione de manera específica, cada rango mencionado en la presente deberá entenderse como inclusive. Por ejemplo, en la expresión de 5 a 19 aminoácidos de longitud se incluyen 5 y 19;

-

y de manera similar con respecto a otros parámetros, tales como secuencias, longitud, concentraciones, elementos.

Breve Descripción de los Dibujos

la figura 1 es una secuencia de aminoácidos de péptidos derivados de aprotinina; 10 la figura 2 es una representación esquemática de la bomba de eflujo, glicoproteína P (P-gp o MDR1) en la superficie

celular. La bomba de eflujo, P-gp o MDR1, asociada con resistencia a fármacos múltiples es altamente expresada en la superficie celular de muchas células cancerosas y diversos tejidos, incluyendo la barrera hematoencefálica; la figura 3 es una representación esquemática de la conjugación de un fármaco con el péptido portador; la figura 4 es un cromatograma que ilustra la producción en alta cantidad del conjugado TxlAn2 (3:1);

15 la figura 5 es un análisis de HPLC del pico purificado en una columna hidrófoba usando explorador AKTA;

la figura 6 es un diagrama que ilustra la perfusión en cerebro in situ de Angiopep-2 radiomarbetado y el marcador vascular inulina; la figura 7 es un histograma que ilustra el volumen de distribución aparente de transferrina, aprotinina y Angiopep en

cerebro total, capilares del cerebro y parénquima de cerebro; 20 la figura 8 es un diagrama de proliferación celular en presencia del fármaco parental Taxol. Células de glioblastoma

(U-87) fueron expuestas a diversas concentraciones de Taxol por tres días. La 3H-timidina incorporada en células fue graficada como una función de las concentraciones de Taxol; la figura 9A es un diagrama que representa la acumulación de diversos fármacos en células MDCK transfectadas

con MDR1 en presencia o ausencia (control) de 10 !M CsA, un inhibidor de P-gp. El experimento fue llevado a cabo 25 en presencia de DMSO al 1%; la figura 9B es un diagrama que representa la acumulación del conjugado en células que sobreexpresan P-gp. las figuras 10A y 10B son diagramas que representan distribución en tejidos de Taxol y el conjugado TxlAn1; la figura 11 es un diagrama que representa la distribución en pulmón de Taxol y TxlAn1; la figura 12 es un diagrama que representa los niveles del conjugado TxlAn1 en plasma y pulmón; 30 la figura 13 es un diagrama que representa el efecto del tratamiento con TxlAn2 sobre un crecimiento de tumor de

glioblastoma subcutáneo (U-87); la figura 14 muestra fotografías que ilustran la detección de �-tubulina en NCI-H460 por inmunofluorescencia o luz visible en células cancerosas expuestas a Taxol o el conjugado TxlAn2; como control, las células fueron expuestas a DMSO al 1%;

35 la figura 15 son diagramas que ilustran el efecto de Taxol y el conjugado TxlAn2 sobre el ciclo de células NCI-H460, según se mide por FACS. Las células fueron expuestas por 24 horas con el vehículo (DMSO), Taxol (100 nM) o el conjugado TxlAn2 (30 nM, equivalente a 100 nM de Taxol);

las figuras 16A y 16B son fotografías que representan inmunodetección de LRP en biopsias de tumor de cerebro humano; 40 la figura 17A es un diagrama que ilustra la acumulación de [125I]-RAP en fibroblastos MEF-1 y PEA-13 en presencia

de diversas concentraciones de aprotinina;

la figura 17B es un diagrama que expresa los resultados de la figura 17A, donde la acumulación de [125I]-RAP dependiente de LRP fue calculada restando los resultados de la toma obtenida con células PEA-13 de los resultados con MEF-1 y expresada como una función de las concentraciones de aprotinina;

la figura 18 es un histograma que ilustra el efecto de aprotinina y Angiopep-2 sobre la toma de RAP. La acumulación de [125I]-RAP en fibroblastos MEF-1 y PEA-13 fue medida en presencia de 25 !M aprotinina o Angiopep. La acumulación de [125I]-RAP dependiente de LRP fue calculada restando los resultados para la toma obtenida con células PEA-13 de los resultados obtenidos con MEF-1;

la figura 19A es un diagrama que ilustra la cinética del conjugado TxlAn2 (3:1) en sangre, en DMSO al 80%, después de una inyección de bolo;

la figura 19B es un diagrama que ilustra la cinética del conjugado TxlAn2 (3:1) en sangre, en Solutol® HS15 al 20% después de una inyección de bolo;

la figura 19C es un diagrama que ilustra la cinética de Taxol en sangre, en DMSO al 80%, después de una inyección de bolo;

la figura 20 son diagramas de distribución del conjugado TxlAn2 (3:1) en tejidos, diluido en DMSO (80%) o Solutol® HS15 (20%).

la figura 21A es un histograma que ilustra la distribución de Taxol, TxlAn2 (3:1) y TxlAn2 (2:1) en tejidos, después de inyección intravenosa (i.v.) en diversos tejidos;

la figura 21B es un histograma que ilustra la distribución de Taxol, TxlAn2 (3:1) y TxlAn2 (2:1) en tejidos, después de inyección intravenosa (i.v.) en cerebro normal y tumoral;

la figura 22A es una gráfica que ilustra el volumen de un tumor después de administración i.v. de Taxol (10 mg/kg) o una formulación del conjugado TxlAn2 (3:1) (20 mg/kg) (en Solutol®) en ratones con células NCI-H460 implantadas en su flanco derecho;

la figura 22B es una gráfica que ilustra el volumen de un tumor después de la administración i.p. de una formulación del conjugado TxlAa2 (2:1) o TxlAn2 (3:1) (en Solutol®) en ratones con células NCI-H460 implantadas en su flanco derecho;

la figura 23A es una gráfica que ilustra el volumen de un tumor después de la administración de ya sea el vehículo (control), Taxol (10 mg/kg) o una formulación de TxlAn2 (3:1) (20 mg/kg) por inyección o infusión i.p. con bombas Alzet (30 mg/kg/14 días) en ratones con células NCI-H460 implantadas en su flanco derecho; los tratamientos son indicados mediante flechas; y

la figura 23B es una gráfica que ilustra el volumen de un tumor después de la administración de ya sea el vehículo (control), Taxol (10 mg/kg) o una formulación de TxlAn2 (3:1) (20 mg/kg) por inyección o infusión i.p. con bombas Alzet en ratones con células U87 implantadas en su flanco derecho; los tratamientos son indicados mediante flechas.

Descripción Detallada de la Invención

Angiopep-1 y Angiopep-2 representan dos péptidos derivados de aprotinina que han sido probados en la presente (figura 1). Taxol que representa a) una forma de realización ejemplar de un compuesto conjugado con el portador de la presente invención, fue seleccionado como un fármaco contra el cáncer candidato pues este compuesto natural, aislado de la corteza y agujas del árbol tejo, y es un quimioterapéutico altamente eficiente. Más aún, este compuesto está aprobado por la Food and Drug Administration (FDA) (Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos) para cáncer de ovarios, cáncer de mama, cáncer de pulmón de células no pequeñas y sarcoma de Kaposi, y es un agente anticanceroso bien caracterizado.

Ejemplos

Los conjugados y las composiciones que no están englobados por el contenido de las reivindicaciones no forman parte de la presente invención y se citan como ejemplos de referencia.

Ensayo de Proliferación Celular

Para el ensayo de proliferación celular in vitro, se sembraron entre 2.5 y 5 x 104 células U87 o A549 en una microplaca de cultivo de tejidos de 24 pozos, en un volumen final de 1 ml de medio con 10% de suero y se incubaron por 24 horas a 37°C y 5% de CO2. El medio fue entonces reemplazado con medio libre de suero e incubado durante la noche. La siguiente mañana, el fármaco fue disuelto nuevamente en sulfóxido de dimetilo (DMSO) y el medio fue reemplazado con medio completo conteniendo el fármaco en diferentes concentraciones, en triplicados. La concentración final de DMSO fue de 0.1%. El control usado es un pozo de microplaca con células y sin fármaco. Las células fueron incubadas por 48 a 72 horas, a 37°C y 5% de CO2. Después de la incubación, el medio fue cambiado y reemplazado con 1 ml de medio completo conteniendo [3H]-timidina (1 !Ci/ensayo). La placa fue incubada a 37°C y 5% de CO2 por cuatro horas. El medio fue retirado y las células lavadas con PBS calentado a 37°C. Las células fueron fijadas con una mezcla de etanol:ácido acético (3:1), luego lavadas con agua y precipitadas tres veces con 10% de TCA (ácido tricloroacético) frío en hielo. Finalmente, se añadieron 500 !l de PCA (ácido perclórico) a los pozos y las microplacas fueron calentadas por 30 minutos a 65°C y 30 minutos a 75°C. El contenido de cada pozo fue entonces transferido en un frasco de centelleo con 10 ml de un coctel de centelleo y la actividad fue medida en CPM (cuentas por minuto) en un contador de centelleo en líquido Tri-Carb, de Packard.

Yodación de Péptidos

Los péptidos fueron yodados con procedimientos estándar usando perlas de yodo de Sigma. Tanto Angiopep-1 como Angiopep-2 fueron diluidos en amortiguador de fosfato 0.1 M, pH 6.5 (PB). Dos perlas de yodo fueron usadas para cada proteína. Estas perlas fueron lavadas dos veces con 3 ml de PB en un filtro Whatman y resuspendidas en 60 !l de PB. Se añadió 155I (1 mCi) de Amersham-Pharmacia Biotech a la suspensión de perlas por 5 minutos a temperatura ambiente. Cada yodación fue iniciada por la adición del péptido (100 !g). Después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, el yodo libre fue removido mediante HPLC.

Implante Subcutáneo

A fin de estimar la eficiencia de los conjugados de Taxol y las formulaciones sobre el crecimiento de tumores, se desarrolló un modelo subcutáneo de glioblastomas. En este modelo, 2.5 x 106 células en 100 !l de medio celular sin suero conteniendo 1% de metilcelulosa fueron inyectadas por vía subcutánea en el flanco de los ratones. El tumor fue claramente visible y pudo ser medido usando un calibrador de vernier. El volumen estimado del tumor fue entonces graficado como una función del tiempo.

Perfusión de Cerebro de Ratón In Situ

La toma de los [125I]-péptidos en el lado luminal de los capilares de cerebro de ratón fue medida usando el método de perfusión de cerebro in situ adaptado en el laboratorio para el estudio de la toma del fármaco en el cerebro de ratón. Resumiendo, la carótida derecha común de ratones anestesiados con cetamina/ xilazina (140/8 mg/kg, i.p.) fue expuesta y ligada al nivel de la bifurcación de la carótida común, rostral a la arteria occipital. La carótida común fue entonces cateterizada rostralmente con tubería de polietileno llena de heparina (25 U/ml) y montada en una aguja calibre 26. La jeringa conteniendo fluido de perfusión ([125I]-péptidos o [14C]-inulina en amortiguador Krebs/bicarbonato a un pH de 7.4, gasificado con 95% de O2 y 5% de CO2) fue colocada en una bomba de infusión (bomba Harvard PHD 2000; Harvard Apparatus) y conectada al catéter. Antes de la perfusión, se eliminó la contribución del flujo sanguíneo contralateral cortando los ventrículos del corazón. El cerebro fue sometido a perfusión por los tiempos indicados a una tasa de flujo de 1.15 ml/min. Después de 14.5 min de perfusión, el cerebro fue sometido adicionalmente a perfusión por 60 segundos con amortiguador Krebs, para lavar el exceso de [125I]-proteínas. Los ratones fueron entonces decapitados para terminar la perfusión y se aisló el hemisferio derecho sobre hielo antes de someterse a agotamiento capilar. Alícuotas de los homogenados, sobrenadantes, perlas y productos de perfusión fueron tomadas para medir su contenido en los [125I]-conjugados por precipitación de TCA y para evaluar el volumen aparente de distribución.

Ejemplo 1

Preparación de Conjugados

Ya que la resistencia hacia diversos fármacos tales como vincristina, etopósido y doxorrubicina es mediada mediante sobreexpresión de P-gp (MDR1) (figura 2), cualesquiera métodos de sobrepasar esta bomba de eflujo pueden potenciar la acción de estos fármacos sobre diversos tipos de cáncer. Sobrepasar P-gp puede, por tanto, ser útil para incrementar la potencia de fármacos que están asociados con resistencia mediada por P-gp. Los portadores descritos en la presente fueron por tanto probados respecto de su capacidad para sobrepasar P-gp.

La conjugación de un fármaco al portador descrito en la presente es ilustrada en la figura 3. Brevemente, a fin de conjugar Taxol con el portador de Angiopep-1 o Angiopep-2, primero se activó el Taxol en un derivado de Nsuccinimida (2'-NHS-Txl). Luego las aminas encontradas, por ejemplo, en el residuo lisina o aminoterminales de Angiopep-1 o Angiopep-2 reaccionaron sobre este Taxol activado formando un enlace péptido (enlace amida). En

5 Angiopep-1 o Angiopep-2, el amino terminal (en la posición 1) y las lisinas (en las posiciones 10 y 15) fueron capaces de reaccionar con Taxol activado. Por tanto, se encontró que ocurrían múltiples combinaciones de conjugados por la adición de 1, 2 o 3 Taxoles al péptido, dependiendo de la relación molar usada (figura 3). Toda la conjugación fue analizada por medio de HPLC y la conjugación fue confirmada por espectro de masa (Maldi-Tof). Se encontró que el Taxol era capaz de liberarse del portador mediante el corte del enlace éster por esterasas. Por tanto, los conjugados fueron producidos de manera eficiente combinando el portador con un fármaco contra el cáncer.

La producción del conjugado TxlAn2 (3:1) fue llevada a cabo añadiendo directamente 1 mol equivalente de Angiopep-2 a una solución de 2.5 moles equivalentes de 2'-NHS-Taxol. La reacción fue llevada a cabo en DMSO al 68% en solución de Ringer (pH de 7.3), por una hora a 12°C, y después de retirar el baño frío, por alrededor de 22

15 horas a temperatura ambiente (figura 4). Angiopep-2, 2'-NHS-Taxol y el conjugado TxlAn2 (3:1) son mostrados en el cromatograma mediante flechas. Se muestrearon y analizaron alícuotas de la reacción mediante HPLC después de 25 minutos, 2 horas 15 minutos, 5 horas y 23 horas, como se indica en la figura 4. Los picos de Angiopep-2, 2'NHS-Taxol y el conjugado TxlAn2 (3:1) son mostrados mediante flechas en el cromatograma. Los resultados de la figura 4 ilustran la desaparición de Angiopep-2 y 2'-NHS-Taxol durante la reacción, principalmente en beneficio del conjugado TxlAn2 (3:1).

Esta mezcla de productos fue separada mediante cromatografía hidrófoba en una columna RPC de 300 mm con una tasa de flujo de 4 ml/min usando explorador AKTA (figura 5). Para el pico que corresponde al conjugado TxlAn2 (3:1), se juntan las fracciones, se analizan por medio de HPLC y MS. En la figura 5, el cromatograma superior corresponde a la reacción que está corriendo en t=23 horas, mientras que el inferior corresponde al conjugado

25 TxlAn2 (3:1), que se ha confirmado mediante espectrometría de masa (peso molecular 5107) después de la purificación AKTA.

Ejemplo 2

Perfusión de Cerebro In Situ de Conjugados Taxol-Angiopep-2

Para evaluar la toma en el cerebro de Angiopep in vivo, la tasa inicial de transporte para [125I]-Angiopep en parénquima cerebral de ratón fue medida usando perfusión en cerebro in situ como se describe en la presente. El cerebro de ratón fue sometido a perfusión las veces indicadas con ya sea [125I]-Angiopep-2 o [14C]-inulina. Después de la perfusión, el cerebro fue sometido a perfusión adicional por 60 segundos con solución de Ringer para lavar el exceso de moléculas radiomarbetadas y luego se aisló el hemisferio derecho en hielo antes de someterse a agotamiento capilar. Se tomaron alícuotas de los homogenados, sobrenadantes, perlas y productos de perfusión

35 para medir su contenido de [125I]-Angiopep-2 o [14C]-inulina. Los resultados obtenidos para la acumulación de estas moléculas en parénquima cerebral son ilustrados en la figura 6. La acumulación de [125I]-Angiopep-2 se incrementó como una función del tiempo y es mayor que la del marcador vascular, [14C]-inulina.

Se comparó adicionalmente la toma inicial en cerebro después de 5 minutos de perfusión para [125I]-aprotinina, [125I]transferrina, y [125I]-Angiopep (figura 7) (1:1). Los resultados muestran que Angiopep y aprotinina tienen una tasa inicial de transporte mayor que transferrina.

Ejemplo 3

Efecto de Conjugados sobre el Crecimiento Celular

En un ensayo in vitro, se mostró en la presente que Taxol (sin conjugar) bloquea la proliferación de células de glioblastoma (U-87) con un valor CI50 de alrededor de 10 nM (figura 8). El efecto de Taxol conjugado con el portador

45 descrito en la presente sobre la proliferación de diversas líneas celulares fue entonces evaluado y comparado con Taxol no conjugado (referido como Taxol). Como se muestra en la Tabla 3, los valores CI50 obtenidos para el conjugado Taxol-Angiopep-2 (TxlAn2) fueron sumamente similares a los del Taxol sin conjugar en muchas células cancerosas. Las células endoteliales de cerebro de rata (RBE4) fueron menos sensibles que las líneas de células cancerosas probadas. En conclusión, estos resultados indican que la potencia de los conjugados para bloquear la proliferación celular in vitro es similar a la de Taxol sin conjugar. Para fines de comparación, los resultados obtenidos fueron expresados en términos de la concentración de Taxol.

Tabla 3. Efecto del Conjugado sobre la Proliferación Celular

Líneas Celulares

CI50 (nM)

Taxol

Taxol-Angiopep-2 (3:1)

Glioblastomas

U-87

9.5 9.7

U-118

7.2 8.1

Carcinoma de pulmón

NCI-H460

9.3 12.5

A549

3.6 6.0

Calu-3

17.2 25.0

Células endoteliales

RBE4

137 139

La mayoría de estas células (U-87, U-118, NCI-H460, A549) expresan LRP. Estos datos, sin embargo, no están disponibles para las células RBE4.

Ejemplo 4

Sobrepasar P-gp por medio de Conjugados

5 A fin de determinar si los conjugados de la presente invención eran sustratos de P-gp o no, las células MDCK fueron transfectadas de manera estable con MDR1 (MDCK-MDR1) humana y fueron incubadas de manera subsecuente con fármaco contra el cáncer sin conjugar o con los conjugados de la presente invención. En un primer experimento, células MDCK-MDR1 fueron incubadas con 3H-vinblastina (3H-VBL), rodamina, 3H-Taxol, 125I-Taxol-Angiopep- (125I-TxlAn1), 125I-Taxol-Angiopep-2 (125I-TxlAn2) por una hora a 37°C en presencia o ausencia de 10 !M de ciclosporina A (CsA); un inhibidor competitivo de P-gp (figura 9A). Después de la incubación, las células fueron lavadas y se cuantificó la acumulación de radioactividad dentro de las células o la fluorescencia intracelular. El incremento en la acumulación de estos fármacos es expresado en términos de x-veces en comparación con su respectivo control medido en ausencia de CsA. De esta manera, el valor de control para cada fármaco fue fijado en 1-vez.

15 En otro experimento, la capacidad de los conjugados para acumularse en células que sobreexpresan P-gp fue monitorizada (figura 9B). Células MDCK-MDR1 fueron incubadas con 50 nM de ya sea 3H-Taxol, 125I-TaxolAngiogep-1 (125I-TxlAn1) o 125I-Taxol-Angiopep-2 (125I-TxlAn2) por dos horas a 37°C. Después de la incubación, las células fueron lavadas y se cuantificó la radioactividad acumulada en las células. Los resultados fueron expresados como acumulación de fármaco en pmoles/120 minutos.

Como se muestra en la figura 9A, la acumulación de [3H]-Taxol se incrementó 15 veces en presencia del inhibidor competitivo de P-gp, ciclosporina A (CsA). La acumulación de rodamina y [3H]-vinblastina también se incrementó en

7.5 y 10 veces, respectivamente, en presencia de CsA. Estos resultados demuestran que Taxol, rodamina y vinblastina son sustratos de P-gp. Sin embargo, la ineficacia de CsA sobre la acumulación de los conjugados tanto [125I]-Taxol-Angiogep-1 como [125I]-Taxol-Angiopep-2 indica que no son sustratos de P-gp. La acumulación de

25 ambos conjugados, en ausencia de CsA, fue al menos 11 veces mayor que [3H]-Taxol (figura 9B). Estos últimos resultados confirman fuertemente que ambos conjugados sobrepasan la acción de P-gp pues P-gp no es capaz de expulsarlos de las células. Estos resultados demuestran adicionalmente que la presencia de un portador en conjugación con un fármaco contra el cáncer incrementa la potencia del fármaco. Por tanto, los portadores descritos en la presente son útiles para el transporte y/o la acumulación de fármacos dentro de una célula y son especialmente útiles para fármacos que habitualmente son expulsados por P-gp (es decir, fármacos que son sustratos de P-gp).

Ejemplo 5

Distribución y Farmacocinética de los Conjugados

Se evaluó el impacto de la conjugación del fármaco al portador sobre la distribución del fármaco administrando ya

35 sea 3H-Taxol (5 mg/kg) o 125I-Taxol-Angiogep-1 (TxlAn1) (10 mg/kg, equivalentes a 5 mg de Taxol/kg) a ratones. El fármaco contra el cáncer no conjugado y los conjugados fueron inyectados por vía intravenosa (i.v.) en ratones como un bolo. Se recolectaron tejidos en diferentes tiempos (0.25, 0.5, 1 y 4 horas) y se homogeneizaron. A fin de cuantificar la cantidad de 3H-Taxol, se digirieron homogenados de tejidos con solubilizador de tejidos (soluble) y se añadieron entonces a las muestras 10 ml del centellador de líquidos. La cantidad del conjugado 125I-marbetado, en los diferentes tejidos, fue medida después de precipitación con TCA. La radioactividad asociada con los tejidos fue por tanto cuantificada. El área bajo la curva (AUC0-4) fue estimada usando software Prism y fue graficada para los diferentes tejidos (figura 10). Los resultados de la figura 10A indican que los valores AUC0-4 obtenidos para el conjugado son mayores que para Taxol en diversos tejidos, incluyendo cerebro, riñón, hígado y los ojos, lo que indica una mayor acumulación del conjugado en estos tejidos en comparación con el fármaco no conjugado. De

45 manera más particular, los resultados presentados en la figura 10B indican que la acumulación del conjugado es mucho mayor que el fármaco no conjugado en el pulmón.

Los resultados de un experimento similar conducido con el conjugado Taxol-Angiopep-2 son resumidos en la Tabla 4 a continuación. Aunque hay diferencias con los resultados obtenidos para el conjugado TxlAn1, el conjugado de la Tabla 4 también se acumula en los pulmones, el cerebro y el hígado de manera más eficiente que el Taxol no conjugado.

Tabla 4

AUC0-4 (1g/g de Tejido)

Tejido

TxlAn2 Taxol Relación (TxlAn2/Taxol)

Plasma

170 2.2 77.3

Cerebro

0.32 0.07 4.6

Pulmón

3.4 1.1 3.0

Riñón

11.2 8.0 1.4

Corazón

5.0 2.5 2.0

Hígado

513 22 23

Ojo

0.99 0.57 1.7

Orina

35.7 88 0.4

Tratamientos equivalentes a 5 mg/kg de Taxol

La cinética de la acumulación de Taxol y Taxol-Angiopep-1 en el pulmón es también presentada en la figura 11. Los resultados muestran claramente que la cantidad del conjugado medida en los pulmones en diferentes tiempos es mucho mayor que para el fármaco no conjugado. Más aún, también se observó que la acumulación del conjugado en el pulmón es también mucho mayor que su concentración en el suero (plasma) en diversos tiempos (figura 12). Los resultados presentados en las figuras 10, 11 y 12 indican fuertemente que la conjugación de un fármaco contra el cáncer (p. ej., Taxol) con el portador de la presente invención (p. ej., Angiopep-1 o Angiopep-2) modifica la biodistribución del fármaco contra el cáncer y su farmacocinética.

5 Ejemplo 6

Inhibición del Crecimiento de Tumor In Vivo (U-87)

La capacidad del conjugado para inhibir el crecimiento tumoral fue a continuación evaluada en un modelo in vivo (figura 13). Células U-87 fueron por tanto implantadas por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones y al tercer día luego del implante, los ratones fueron inyectados con el vehículo (DMSO/ Ringer: 80/20; control), Taxol (5 mg/kg)

10 o Taxol-Angiopep-2 (10 mg/kg; equivalentes a 5 mg de Taxol/kg (3 Taxol:1 Angiopep-2)). Se observó que la inhibición del crecimiento tumoral fue más pronunciada en ratones tratados con el conjugado que en ratones tratados con el fármaco contra el cáncer no conjugado.

De hecho, el día diecisiete luego del implante, el crecimiento tumoral fue inhibido en más de 75% por el conjugado, mientras que el crecimiento tumoral fue inhibido únicamente 34% usando el fármaco no conjugado (Tabla 5). Estos

15 resultados muestran que los conjugados descritos en la presente son más eficientes que el Taxol no conjugado para inhibir el crecimiento tumoral in vivo. Finalmente, se midió un nivel de inhibición del crecimiento tumoral 2.2 veces mayor para el conjugado en comparación con el fármaco no conjugado.

Tabla 5. Inhibición del Crecimiento Tumoral con Conjugados

Grupos

Volumen Tumoral (mm3) (media ± sem) Crecimiento Tumoral Inhibición (%) T/C (%)

Días posinyección

f (mm3)

Día 0*

Día 14**

Control

79±7 289±50 203±47 100

Taxol (5 mg/kg)

74±5 219±52 134±55 34 66

TxlAn2 (3:1) (10 mg/kg)

88±9 144±27 56±32 73 27

Tratamiento equivalente a 5 mg/kg de Taxol 20 *corresponde a 3 días posimplante (primer tratamiento)

**corresponde a 17 días posimplante (después de 4 tratamientos)

Ejemplo 7

Mecanismo de Acción de Conjugados

En la figura 14, las células cancerosas de pulmón (NCI-H460) fueron incubadas por 24 horas con ya sea Taxol libre 5 (30 nM) o el conjugado TxlAn2 (10 nM; equivalente a 30 nM de Taxol). Después las células fueron marbetadas para

�-tubulina usando un anticuerpo secundario enlazado a FITC. Se tomaron fotografías en modos visible y fluorescente. Estos resultados indican que tanto Taxol como el conjugado Taxol-Angiopep tienen un efecto similar sobre �-tubulina, llevando a su polimerización. Más aún, como se indica en la figura 15, la adición de Taxol y el conjugado Taxol-Angiopep induce un bloque de las células NCI-H460 en la fase G2/M. Los resultados obtenidos para la polimerización de �-tubulina y el ciclo celular sugieren que el conjugado TxlAn tiene un mecanismo de acción similar sobre células cancerosas que el Taxol.

Ejemplo 8

Efecto de Acumulación de RAP Mediada por LRP

Se mostró previamente en la solicitud de patente internacional PCT/CA2004/00011, que la proteína asociada con el

15 receptor (RAP) inhibía la transcitosis de aprotinina en un modelo in vitro de la barrera hematoencefálica. De acuerdo con estos datos se propuso que el receptor relacionado con lipoproteína de baja densidad (LRP) está implicado en la penetración de aprotinina en el cerebro. La inhibición similar del transporte de Angiopep a través de un modelo in vitro de la barrera hematoencefálica fue también obtenida (datos no mostrados), sugiriendo que la transcitosis de Angiopep a través de las células endoteliales de cerebro también implicaba a LRP. LRP es un receptor de membrana heterodimérico de 600 kDa, compuesto de dos subunidades: la subunidad a (515 kDa) y la subunidad (85 kDa). Se llevó a cabo entonces la inmunodetección de LRP para determinar si este receptor es expresado en tumores de cerebro humanos primarios, tales como glioblastomas, y en metástasis de cerebro humano a partir de cáncer de mama, pulmón y melanoma (figura 16). Resumiendo, se separó una cantidad igual de homogenados de proteína de tumores de cerebro humanos primarios (glioblastomas) o metástasis de cerebro humano mediante

25 electroforesis en gel. Después de la electroforesis, las proteínas fueron transferidas a la membrana PVDF y se inmunodetectó LRP usando un anticuerpo monoclonal dirigido contra la subunidad a obtenido de Cedarlane Laboratories (Hornby, Ontario, Canadá). Se visualizó LRP mediante un anticuerpo secundario dirigido contra IgG de ratón enlazada a peroxidasa de rábano y reactivos quimioluminiscentes.

Bajo las condiciones experimentales usadas, la subunidad a de LRP fue inmunodetectada en 515 kDa en células U87 de glioblastoma. También se detectó LRP en todos los tumores de cerebro humanos primarios y metástasis de cerebro humano (figura 16). En contraste, se detectó megalina (LRP2) en solamente una metástasis en cerebro a partir de pulmón (no mostrada). La expresión de LRP en las diferentes biopsias de pacientes puede explicar en parte porqué se observó previamente una mayor acumulación del conjugado Taxol-aprotinina en tumores de cerebro. Finalmente, como la LRP puede estar implicada en el transporte del portador descrito en la presente, estos

35 resultados indican que los conjugados pueden también poner en objetivo células y tumores que expresan este receptor.

A fin de determinar si la transcitosis de aprotinina y Angiopep puede implicar la LRP, su impacto sobre la toma de la proteína asociada con el receptor (RAP), un ligando endógeno para LRP, fue determinado (figura 17A). La toma de RAP fue medida en fibroblastos que expresan LRP (MEF-1) y en fibroblastos que no expresan LRP (PEA-13) (figuras 17A y 17B). La adición de aprotinina inhibió el transporte de [125I]-RAP en células LRP positivas en una manera dependiente de la dosis. En contraste, la toma de RAP en células LRP negativas casi no fue afectada por las concentraciones de aprotinina. En la figura 17B se calculó la diferencia entre la toma de [125I]-RAP medida en MEF-1 y PEA-13 y se graficó como una función de la concentración de aprotinina. Estos resultados muestran que una porción de la toma de RAP dependiente de LRP puede ser reducida por la aprotinina, indicando que la

45 aprotinina puede interactuar con este receptor. En un experimento diferente (figura 18), la toma de [125I]-RAP también fue medida en presencia de un exceso de aprotinina y Angiopep. Los resultados muestran que tanto aprotinina como Angiopep afectan la acumulación de [125I]-RAP dependiente de LRP.

En resumen, los datos obtenidos para los conjugados descritos en la presente indican que la conjugación de fármacos contra el cáncer con el portador permiten que se escape el fármaco contra el cáncer de la acción de P-gp y por tanto incremente su potencia (cuando se conjuga con el portador). Estos conjugados son activos in vitro para inhibir la proliferación de células cancerosas. Más aún, los resultados obtenidos con relación al crecimiento del tumor in vivo indican que la conjugación del fármaco contra el cáncer con el portador puede incrementar su eficiencia, sobrepasando P-gp, posiblemente poniendo en objetivo al receptor LRP o modificando la farmacocinética

o biodisponibilidad del fármaco no conjugado.

Tomados juntos, los datos descritos en la presente indican que los conjugados pueden ser usados contra tumores primarios incluyendo cánceres de mama, pulmón y piel, así como metástasis que se originan a partir de tumores primarios.

Ejemplo 9

Formulación Mejorada de Conjugados Taxol-Angiopep

Ensayos preliminares llevados a cabo para determinar la solubilidad de los diferentes conjugados TxlAn indicaron que todos los conjugados tenían una baja solubilidad en solución acuosa (p. ej., en solución Ringer/Hepes) debido a la naturaleza altamente hidrófoba del Taxol. Sin embargo, todos los conjugados eran sumamente solubles en sulfóxido de dimetilo (DMSO)/Ringer (80/20%). De esta manera, se determinaron diferentes estrategias para incrementar su solubilidad y reducir la cantidad de DMSO necesaria para su solubilización. De manera interesante, se pudo remover por completo el DMSO de la formulación usando el agente solubilizador Solutol® HS15 (BASF). Por ejemplo, TxlAn2 (3:1), a razón de 5 mg/ml, fue solubilizado de manera eficiente en Solutol® HS15 al 20% y solución Ringer/Hepes, con pH de 5.5. Como este agente ha sido aprobado para diversas aplicaciones relacionadas con fármacos para administración intravenosa (i.v.) e intraperitoneal (i.p)., su uso provee una ventaja comercial a las formulaciones de la presente invención.

Las formulaciones de la presente invención pueden comprender, de esta manera, por ejemplo, a) conjugados TaxolAngiopep-2, b) Solutol® HS15, y c) una solución acuosa o amortiguador (p. ej., solución Ringer/Hepes a un pH de 5 a 7). La concentración de Solutol® HS15 en la formulación puede alcanzar, por ejemplo, 30%. También puede ser útil una concentración mayor de 30%. La concentración de conjugado puede ser determinada con base en la dosis requerida para tratar de manera eficiente a un paciente.

Ejemplo 10

Cinética en Sangre de las Formulaciones Mejoradas

Para estudios de distribución en tejidos y cinética en sangre, se usaron [125I]-conjugados yodados (es decir, conjugados [125I]-TxlAn) y [3H]-Taxol. Resumiendo, los conjugados TxlAn2 (1 mg) fueron radioyodados usando perlas de yodo y Txl-[125I]-An2. El conjugado fue entonces purificado usando una columna conteniendo resina de RPC. El yodo libre fue removido lavando a conciencia la columna con acetonitrilo al 20%. Durante los lavados de la columna, la radioactividad fue contada para determinar la reducción de yodo libre. El conjugado Txl-[125I]-An2 fue entonces bajado mediante un lavado con acetonitrilo al 100%. Luego se evaporó el acetonitrilo y el conjugado yodado fue diluido en DMSO al 100% (100 !l). Luego se inyectó una alícuota del conjugado radioyodado HPLC y se recolectaron fracciones para verificar que la radioactividad estaba asociada con las fracciones correspondientes a los conjugados.

Se determinó la cinética en sangre después de inyecciones intravenosas (i.v.), en la vena de la cola, intraperitoneal (i.p.), y subcutánea (s.c.), llevadas a cabo en ratones despiertos (figura 19). Resumiendo, el conjugado TxlAn2 (3:1) fue diluido en DMSO/Ringer-Hepes (80/20) o el Solutol®/Ringer-Hepes (20/80), Txl-[125I]-An2. Las inyecciones de ratones CD-1 con las formulaciones fueron entonces llevadas a cabo para obtener una concentración de 10 mg/kg. Después de las inyecciones, se recolectaron fracciones de sangre (50 !l) en el extremo de la cola y se determinó directamente la radioactividad. Usando el mismo protocolo, también se determinó la cinética en sangre de Taxol usando [3H]-Taxol. Se disolvió Taxol en DMSO/Ringer-Hepes (80/20), a una concentración que permite una inyección de 5 mg/kg y luego se añadió [3H]-Taxol (2.5 !Ci/inyección). Después de las inyecciones, se recolectaron las fracciones en sangre en el extremo de la cola, se añadió un coctel de centelleo, y se midió la radioactividad en un contador Packard. Los resultados de este experimento son ilustrados en las figuras 19A, 19B y 19C, y son resumidos en la Tabla 6 más adelante.

En resumen, los resultados de la figura 19 y la Tabla 6 muestran que la biodisponibilidad de TxlAn2 es mucho mayor que la biodisponibilidad de Taxol. Por ejemplo, la relación AUC(0-24hrs) TxlAn2/AUC(0-24hrs) Taxol es de 169 (es decir, 203.3/1.2).

En términos del Taxol, la relación AUC(0-24hrs) TxlAn2/ AUC(0-24hrs) Taxol es de 84.7 (es decir, 101.65/1.2). Ya que hay tres moléculas de Taxol en cada molécula de Angiopep-2, la cantidad de Taxol representa alrededor de 0.5 del peso molecular de Angiopep (es decir, 3 x 854/5301). Por tanto, el valor AUC del conjugado (es decir, 203) tiene que ser multiplicado por 0.5 a fin de ser expresado en términos de Taxol.

Además, la biodisponibilidad en sangre de los conjugados TxlAn2 es equivalente después de inyecciones intravenosas e intraperitoneales, mientras que este no es el caso para Taxol. Finalmente, los resultados de la figura 19 y la Tabla 6 indican que la biodisponibilidad en sangre de TxlAn2 es mayor cuando se usa Solutol® como solubilizador en comparación con DMSO.

Tabla 6. El Área Bajo las Curvas de 0 a 24 Horas fue Calculada Usando Software GraphPad

AUC (0-24 h) (1g.h por ml)

Inyección I.V. Inyección I.P. Inyección Subcutánea

TxlAn2 (3:1) (DMSO) (10 mg/kg)

98.1 34.7 15.5

TxlAn2 (3:1) (Solutol®) (10 mg/kg)

203.3 211.3 74.5

Taxol (DMSO) (5 mg/kg)

1.2 0.09 0.14

Ejemplo 11

5 Distribución en Tejidos

Se evaluó la distribución de TxlAn2 en tejidos en ratones CD-1 normales después de inyección intravenosa en la vena de la cola de 10 mg/kg de TxlAn2, solubilizado en Solutol®/ Ringer-Hepes (20/80%) o en DMSO/Ringer-Hepes (80/20). Resumiendo, los ratones CD-1 fueron inyectados por la vena de la cola con una formulación de TxlAn2 solubilizado en Solutol® o DMSO y también conteniendo Txl-[125I]-An2. En puntos predeterminados en el tiempo, se

10 recolectó una muestra de sangre y los ratones anestesiados fueron sometidos a perfusión con PBS fría. Los tejidos fueron entonces cortados y se midió la radioactividad en un contador gamma.

Los resultados de la figura 20 muestran que el uso de Solutol® permite una mayor distribución del conjugado TxlAn2

(3:1) en la mayoría de los tejidos.

Ejemplo 12

15 Distribución en Tumores de Cerebro

En un intento por evaluar la distribución del conjugado Txlan2 (3:1) en un modelo de tumor de cerebro, ratones desnudos fueron implantados intracerebralmente con células de cáncer de pulmón NCI-H460. Diez días después del implante, la pérdida de peso en los ratones fue considerable, indicando que los tumores de cerebro estaban bien establecidos. Se evaluó la distribución en tejidos de Taxol, TxlAn2 (3:1) y TxlAn2 (2:1) (figura 21), como se describió

20 anteriormente.

De esta manera, se dio a los ratones una inyección intravenosa de ya sea Taxol (5 mg/kg) solubilizado en DMSO, o TxlAn2 (3:1) (10 mg/kg) o TxlAn2 (2:1) (12.5 mg/kg), cada uno solubilizado en Solutol®. Después de 10 minutos, los ratones fueron sometidos a perfusión sobre hielo usando PBS fría, los órganos fueron recolectados y se midió la radioactividad. Para evaluar la diferencia de acumulación entre cerebro normal y tumor de cerebro, los cerebros fueron cortados a la mitad, con el hemisferio derecho (sitio de inyección de las células tumorales) correspondiendo al cerebro tumoral y el hemisferio izquierdo al cerebro normal.

Los resultados de las figuras 21A y 21B muestran que los conjugados TxlAn2 (3:1) presentan una distribución

5 superior en tumor de cerebro en comparación con cerebro normal (incremento de dos veces), mientras que no se observa diferencia alguna para la distribución de Taxol entre cerebro normal y tumoral. La distribución del conjugado TxlAn2 (3:1) es mucho mayor que la distribución de Taxol en tumor de cerebro (incremento de diez veces) y fue también superior que la distribución de TxlAn2 (2:1) (4.5 veces).

Ejemplo 13

10 Efecto de la Formulación Mejorada de Conjugados de Taxol-Angiopep sobre el Crecimiento de Tumores S.C.

Se condujeron estudios in vivo para determinar si la formulación mejorada comprendiendo el conjugado de Taxol-Angiopep podía inhibir el crecimiento de células de cáncer de pulmón (NCI-H460) o el crecimiento de células de glioblastoma (U87) en un modelo in vivo de ratones implantados subcutáneamente con estas células cancerosas.

Resumiendo, los ratones recibieron una inyección subcutánea de 2.5 x 106 células de glioma U87 humanas o células

15 NCI-H460. Cuando se observó el crecimiento del tumor, los ratones recibieron tratamiento con Taxol libre, conjugados de Taxol-Angiopep, o vehículo, mediante inyecciones i.v. o i.p. Los tratamientos fueron entonces administrados dos veces por semana hasta que se sacrificaron los animales. Los ratones fueron monitorizados cada día respecto de síntomas clínicos y pérdida de peso. El volumen tumoral fue estimado con un calibrador y la siguiente ecuación (volumen tumoral = n/2 x (longitud (mm) x anchura2 (mm)).

20 En el primer estudio de crecimiento de tumor subcutáneo, las células NCI-H460 fueron implantadas en el flanco derecho de los ratones (figura 22A). Los ratones recibieron el vehículo, Taxol, o la formulación del conjugado TaxolAngiopep-2 (3:1) por medio de inyecciones i.v. en la vena de la cola o inyecciones i.p. Los conjugados fueron administrados a un equivalente de 10 mg/kg de Taxol. Los resultados presentados en la figura 22 muestran que la formulación mejorada del conjugado TxlAn2 (3:1) conteniendo Solutol® HS15 al 20% en solución Ringer/ Hepes (pH

25 de 5.5) ocasionó una inhibición mucho más intensa del crecimiento tumoral de NCI-H460 que el Taxol. Estos resultados también son resumidos en la Tabla 7 a continuación.

Tabla 7

Moléculas

Volumen Tumoral (mm3) Crecimiento Tumoral T/C (%)

Días Posinyección

I (mm3)

Día 0

Día 11

Solutol

118±11 714±71 596±62 100

Taxol i.v.

112±12 483±63 371±58 62

TxlAn2 (3:1) i.v.

112±18 236±32 124±14 21

TxlAn2 (3:1) i.p.

105±14 221±50 116±37 19

TxlAn2 (2:1) i.p.

111±18 215±70 104±53 17

Estos resultados indican que los conjugados TxlAn son más potentes que Taxol en inhibir el crecimiento de tumores en un entorno in vivo. Además, se obtuvieron resultados similares sin importar si el conjugado fue administrado i.v. o

i.p. Finalmente, también se obtuvieron resultados similares con conjugados TxlAn comprendiendo dos o tres moléculas de Taxol.

Ejemplo 14

Efecto de la Formulación Mejorada de Conjugados de Taxol-Angiopep sobre el Crecimiento de Tumores S.C.

En un estudio adicional, se evaluó el efecto de las formulaciones de conjugados TxlAn2 (3:1) sobre el crecimiento

s.c. de NCI-H460 o U87. Los ratones fueron tratados mediante inyecciones i.p. con la formulación mejorada a 20

10 mg/kg/día por cinco días consecutivos o por infusión con el implante de la bomba mini-osmótica Alzet a una dosis de 2 mg/kg/día por 14 días. Como se muestra en las figuras 23A y 23B, la respuesta de los ratones a la formulación de conjugado TxlAn2 (3:1) fue superior cuando los ratones recibieron la formulación mejorada mediante infusión.

Estos experimentos in vivo muestran claramente la eficacia de la formulación mejorada contra el crecimiento tumoral de células de glioblastoma o de cáncer de pulmón. Experimentos similares también indican la eficacia de estas 15 formulaciones mejoradas en prolongar la supervivencia de animales (datos no mostrados).

Listado de Secuencias

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un conjugado, o una sal farmacéuticamente aceptable de este, que comprende:

   (a)

   un polipéptido que comprende Angiopep-2 (SEQ ID NO:97), y

   (b)

   un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un fármaco, una proteína, un marcador y un

   5 péptido, donde dicho compuesto está conjugado con dicho polipéptido, con la condición de que dicho conjugado no sea un conjugado de:

   (a)

   un polipéptido que consiste en la SEQ ID NO:97 o SEQ ID NO:74, y

   (b)

   125yodo.

2. 2. El conjugado de la reivindicación 1, donde dicho polipéptido es de 19 a 50 aminoácidos de longitud.

   10 3. El conjugado de la reivindicación 1 o 2, donde dicho polipéptido consiste en Angiopep-2 (SEQ ID NO:97).
3. 4. Un conjugado, o sal farmacéuticamente aceptable de este, que comprende:

   (a) un polipéptido que comprende Angiopep-2 (SEQ ID NO:97), y

   (b) un fármaco contra el cáncer seleccionado del grupo que consiste en Taxol, vinblastina, vincristina, etopósido, doxorrubicina, ciclofosfamida, Taxotere, melfalán y clorambucil, o un anticuerpo, un fragmento de

   15 anticuerpo, o un fármaco peptídico o a base de proteína, donde dicho fármaco contra el cáncer, dicho anticuerpo, dicho fragmento de anticuerpo, o dicho fármaco peptídico o a base de proteína está conjugado con dicho polipéptido.
4. 5. El conjugado de la reivindicación 4, donde 1, 2 o 3 moléculas de Taxol están conjugadas con dicho polipéptido.
5. 6. El conjugado de la reivindicación 5, donde dichas moléculas de Taxol están conjugadas a través del grupo amino 20 N-terminal y a través de los grupos amino en las lisinas en las posiciones 10 y 15 de la secuencia de Angiopep-2.

6. 7.

   El conjugado de la reivindicación 4, donde dichas molecúlas de Taxol están conjugadas con dicho polipéptido tal como se muestra a continuación:

7. 8.

   El conjugado de la reivindicación 7, donde:

   (a) dicho polipéptido consiste en Angiopep-2 (SEQ ID NO:97), 25 (b) tres (3) moléculas de Taxol están conjugadas con dicho polipéptido, y

   (c) dichas moléculas de Taxol están cada una conjugadas a través del grupo amino N-terminal y a través de los grupos amino en las lisinas en las posiciones 10 y 15 de la secuencia de Angiopep-2.

8. 9.

   Una composición que comprende el conjugado de las reivindicaciones 1-8.

9. 10.

   Una composición que comprende:

   (a).

   (i). un conjugado o sal farmacéuticamente aceptable de este, comprendiendo dicho conjugado:

   (A). un polipéptido que comprende Angiopep-2 (SEQ ID NO:97), y

   (B). un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un fármaco, una proteína, un marcador y un

   péptido, donde dicho compuesto está conjugado con dicho polipéptido, o (ii). Un conjugado de las reivindicaciones 1-8; y (b). un éster polioxietilénico de un ácido graso.

10. 11.

    La composición de la reivindicación 10, donde el éster polioxietilénico es Tween 20 o Tween 80.

11. 12.

    La composición de la reivindicación 10, donde el éster polioxietilénico es Solutol®HS-15.

12. 13.

    La composición de cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 o 12 que comprende además manitol o un tampón.

13. 14.

    Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o la composición de cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 o 12 y un portador farmacéuticamente aceptable.

14. 15.

    Un conjugado que comprende:

    (a)

    un polipéptido que comprende Angiopep-2 (SEQ ID NO:97), y

    (b)

    un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un fármaco, una proteína, un marcador y un péptido, donde dicho compuesto está conjugado con dicho polipéptido; o el conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-8; o

    la composición de cualquiera de las reivindicaciones 9-13 para utilizar en un método para tratar el cáncer o cáncer metastásico.

15. 16.

    El conjugado o la composición para utilizar como se describe en la reivindicación 15, donde dicho cáncer es resistente a fármacos múltiples.

16. 17.

    El conjugado o la composición para utilizar como se describe en la reivindicación 15 o 16, donde dicho cáncer es un cáncer de cerebro, preferentemente un glioblastoma o un glioma.

17. 18.

    El conjugado o la composición para utilizar como se describe en la reivindicación 15 o 16, donde dicho cáncer está ubicado fuera del cerebro.

18. 19.

    El conjugado o la composición para utilizar como se describe en la reivindicación 18, donde dicho cáncer es un tumor de pulmón, un tumor de mama, un tumor de riñón, un tumor de ojo, un tumor de hígado, un tumor colorrectal,

    o un tumor de un órgano urinario.

19. 20.

    El conjugado o la composición para utilizar como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 15-19, donde dicho cáncer es un cáncer metastásico de un tumor de mama, un tumor de pulmón, un melanoma o un tumor de cerebro.

20. 21.

    El conjugado o la composición para utilizar como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 15-20, donde dicho polipéptido promueve la acumulación de la proteína o agente contra el cáncer en dicha célula cancerosa.

21. 22.

    El conjugado o la composición para utilizar como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 15-21, donde dicho cáncer incluye una célula que expresa un receptor relacionado con lipoproteína de baja densidad (LRP), Pglicoproteína (P-gp) o ambos.

22. 23.

    El conjugado o la composición para utilizar como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 15-22, donde dicho método para tratar el cáncer implica la administración intraarterial, intranasal, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica o per os.

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