ES2419234T3

ES2419234T3 - Composiciones detergentes y uso de combinaciones de enzimas en las mismas

Info

Publication number: ES2419234T3
Application number: ES07821004T
Authority: ES
Inventors: Mikael Mikkelsen; Niels Munk Ryom; Claus Ladefoged; Sandra Friis-Jensen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2006-10-06
Filing date: 2007-10-08
Publication date: 2013-08-20
Anticipated expiration: 2027-10-08
Also published as: CN101522878A; EP2074205B2; US20100311636A1; US20080221008A1; ES2419234T5; EP2074205A1; DK2074205T4; JP5497440B2; EP2272943A1; DK2074205T3; EP2074205B1; CN101522878B; JP2010505988A; WO2008040818A1; US8329632B2; EP2272943B1

Abstract

Composición de detergente en gel o líquida que comprende subtilisina KL o sus variantes en combinación con almenos una lipasa; amilasa; celulasa; o mananasa, donde la proporción en peso entre el contenido de subtilisina KLo sus variantes al contenido de lipasa, amilasa, celulasa o mananasa es de 0,001 a 100, preferiblemente de 0,01 a10, especialmente de 0,5 a 5, especialmente de 1 a 3.

Description

Composiciones detergentes y uso de combinaciones de enzimas en las mismas

[0001] La presente invención se refiere a composiciones detergentes tipo gel o líquidas acuosas que comprenden combinaciones específicas de enzimas. Las composiciones detergentes pueden comprender además una combinación de ácido bórico o un compuesto de boro capaz de formar ácido bórico en la composición, un compuesto polihidroxi, preferiblemente propanodiol, y un nivel relativamente alto de ión calcio para estabilizar una combinación seleccionada de una enzima proteasa y otras enzimas. La invención también se refiere a un proceso para aumentar la estabilidad de las enzimas no proteasas en combinación de una enzima proteasa con otras enzimas en una composición detergente en gel o líquida. La invención además se refiere a enzimas proteasas específicas y su uso en composiciones detergentes

Estado de la técnica

[0002] Proteasas han sido usadas en composiciones detergentes durante aproximadamente 50 años y varias de estas proteasas han sido desarrolladas en los últimos 10 años por ingeniería de proteínas de varias proteasas precursoras.

[0003] La proteasa precursora más exitosa en el mercado es subtilisina 309 - o Savinase®. Ingeniería de proteínas de Savinase fue primero descrita en 1989 en WO 89/06279. Posteriormente un gran número de solicitudes de patente referentes a la ingeniería de proteínas de Savinase ha sido solicitado por el solicitante y otras compañías, tales como Genencor international, Inc., Procter & Gamble, Unilever NV, etc. También, varias variantes de Savinase han sido comercializadas por Novozymes A/S y Genencor international, Inc.

[0004] La variante específica de Savinase comprendiendo las modificaciones Y167A+R170S+A194P fue descrita en WO 98/20115. En la presente solicitud hemos designado esta variante como subtilisina KL.

[0005] Composiciones detergentes en gel y líquidas acuosas que contienen enzimas, incluyendo proteasas, se conocen en la técnica. El mayor problema encontrado con tales composiciones es el de asegurar una estabilidad de almacenamiento suficiente de las enzimas en las composiciones. Es particularmente difícil estabilizar amilasas en presencia de proteasas, que pueden degradar fácilmente amilasas en composiciones detergentes en gel o líquidas acuosas pero también otras enzimas, tales como lipasas, celulasas, etc. son frecuentemente degradadas por las proteasas.

[0006] Amilasas de alto nivel alcalino tales como alfa amilasas son descritas en la especificación británica No. 1,296,839. El uso de un sistema estabilizador de enzimas que comprende una mezcla de ácido bórico o un borato de metal alcalino con ión calcio, y preferiblemente con un poliol, se describe en la patente EEUU 4,537,706, Severson. Ciertas a-amilasas que proporcionan limpieza y eliminación de manchas mejoradas están descritas en W097/32961, Baeck et al., y en W0 96/23873 y patente EEUU 6,093,562.

[0007] US2003/180933 describe composiciones detergentes en gel o líquidas que comprenden una variante de subtilasa comprendiendo las mutaciones A167A + R170S + A194P en combinación con otras enzimas.

Descripción de la invención

[0008] La presente invención se refiere a composiciones detergentes que comprenden subtilisina KL y/o sus variantes en combinación con al menos una lipasa, amilasa, celulasa o, mananasa. Una forma de realización particular de la invención se refiere a composiciones en gel o líquidas que comprenden subtilisina KL o sus variantes en combinación con al menos una lipasa; amilasa; celulasa; o mananasa, donde la proporción en peso entre el contenido de subtilisina KL o sus variantes al contenido de lipasa, amilasa, celulasa o mananasa es de 0,001 a 100, preferiblemente de 0,01 a 10, especialmente de 0,5 a 5, especialmente de 1 a 3. En una forma de realización particular el contenido de subtilisina KL o sus variantes es de 0,001 a 5 % en peso y si están presentes el contenido de cada una de la siguiente lipasa, amilasa, celulasa, o mananasa, es del 0,001 al 5 % en peso.

[0009] Otra forma de realización de la invención se refiere al uso de subtilisina KL o sus variantes en combinación con al menos una, lipasa, amilasa, celulasa o mananasa, para la preparación de composiciones detergentes tipo gel

o líquidas acuosas con estabilidad mejorada de las enzimas no proteasas.

[0010] Otra forma de realización de la invención se refiere a un proceso para aumentar la estabilidad de las enzimas no proteasas en combinación de una enzima proteasa con otras enzimas en una composición detergente en gel o líquida que comprende una proteasa y al menos una enzima no proteasa, donde la composición detergente en gel o líquida es preparada usando la subtilisina KL o una variante de la misma como la enzima proteasa y donde al menos una enzima no proteasa es seleccionada entre lipasa, amilasa, celulasa o mananasa.

[0011] En una forma de realización particular de la invención concierne [0012] Las amilasas para ser usadas en las composiciones detergentes de la invención son la amilasa de B. licheniformis y otras amilasas, tales como aquellas descritas en WO 2001/066712, WO 2006/002643, WO 2000/60060.

[0013] Las celulasas para ser usadas en las composiciones detergentes de la invención son tales como aquellas descritas en WO 1995/024471, WO 91/17244, WO 2002/099091.

[0014] Las lipasas para ser usadas en las composiciones detergentes de la invención son tales como aquellas descritas en WO 2000/060063.

[0015] Las mananasas para ser usadas en las composiciones detergentes de la invención son tales como aquellas descritas en WO 99/64619, por ejemplo SEQ ID nº: 2.

[0016] La endoglucanasa para ser usada en las composiciones detergentes de la invención son tales como aquellas descritas en WO 91/17244

[0017] Las variantes de subtilisina KL de la presente invención son tales como aquellas indicadas en WO 98/20115 y especialmente aquellas indicadas en la Tabla 1:

Tabla 1 Mutaciones en la subtilisina KL

Ninguna *36D P14T N18K N62D V83L A133P E136Q E136R E136K N140R N140K S141E S141N S141Y S141R T143R T143K S153R S156R A160R S162R S162K I165R I165K Y171R Y171K A172R A172K A174R N173R N173K A174K N76D Y176R Y176K A187R A187K S188P S190P Q191R Y192R Y192R Q191P

Y192A Y192P D197N D197R D197E D197K D197G A228V A230V T260R T260K G264R G264K S265T S265R S265K N218S M222S M222A M222G M222T M222V M222S N243R V244R N248R K251R N252R N261R Combinaciones S9R+A15T+T22A+N218S+K251R S9R+A15T+T22A+V841+N218S V30I+V139L+N218S V84I+V139L+N218S N76D+N218S N76D+A228V N76D+A230V N76D+N218S+A230V N76D+A228V+A230V N218S+R247Q N218S+R247H N218S+R247E N218S+R247K D181N+N218S N218S+A230V K251R+S265K P14T+N18K T274H+R275H+*275aH+*275bH+*275cH+*275dH= T274H+R275HHHHH T274H+R275H+*275aH+*275bH+*275cH=T274H+R275HHHH S87N+S101G,V104N *36D+N76D+H120D+G195E+K235L A133P+M222S Inserciones y combinaciones con las mismas *96aA *96aA+A98T *96aA+A133P *96aA+A98T+A133P *96aA+A98T+N218S *97aP+A98T+N218S *98aT, *98aT+S99N+N218S G97D+*98aT+N218S *99aE=S99SE *99aD=S99SD *99aD+M222S=S99SD+M222S

N76D+s99A+*99aE=N76D+S99AE N76D+*99aD+A230V=N76D+S99SD+A230V S99A+*99aD=S99AD S99A+*99aD+M222S=S99AD+M222S S99A+*99aD+N218S=S99AD+N218S S99A+*99aE+A230V=S99AE+A230V A228V+A230V *130aL+P194A

[0018] Se ha descubierto sorprendentemente que la subtilisina KL y sus variantes muestran una compatibilidad destacable para otras enzimas usadas en composiciones detergentes líquidas tales como lipasas, amilasas, celulasas, peroxidasas/oxidasas y hemicelulasas. Esta propiedad produce un aumento sustancial en la actividad residual de estas enzimas en combinación con la subtilisina KL y sus variantes en comparación con la actividad residual en presencia de otras proteasas, incluso después de períodos largos de almacenamiento. Al fin y al cabo el resultado es un rendimiento mejorado de la composición detergente o que se pueden obtener resultados similares con cantidades reducidas de enzima

Nomenclatura y convenciones para designación de variantes

[0019] Al describir las distintas variantes de la enzima subtilisina KL contempladas o producidas según la invención, las siguientes nomeclaturas y convenciones han sido adaptadas para facilidad de referencia: un marco de referencia es primero definido alineando la enzima progenitora con subtilisina BPN' (BASBPN).

[0020] La alineación se puede obtener por la rutina de GAP del paquete GCG versión 9.1 para numerar las variantes que usan los siguientes parámetros: penalización de creación de gap = 8 y penalización de extensión de gap = 8 y todos los demás parámetros mantenidos en sus valores por defecto.

[0021] Otro método es usar alineamientos reconocidos conocidos entre subtilasas, como la alineación indicada en WO 91/00345. En la mayoría de los casos las diferencias no serán de ninguna importancia.

[0022] Así varias deleciones e inserciones serán definidas en relación con BASBPN (SEQ ID NO.1). Para una descripción detallada de la nomenclatura de modificaciones introducidas en un polipéptido por manipulación genética nos referimos a WO 00/71691 página 7-12.

[0023] Numeración de posiciones/residuos de aminoácidos si no se menciona nada más la numeración de aminoácidos usada aquí corresponde a aquella de la secuencia de subtilasa BPN' (BASBPN). Para descripción adicional de la secuencia de BPN', véase Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737.

[0024] "SAVINASE®" Savinase® está comercializada por Novozymes A/S. Es la subtilisina 309 de B. Lentus.

[0025] Modificación(es) de una variante de subtilisina KL. El término "modificación(es)" usado aquí se define para incluir modificación química al igual que la manipulación genética del ADN que codifica la subtilisina KL. La(s) modificación(es) puede(n) ser sustitución(es) de la(s) cadena(s) lateral(es) de aminoácidos, sustitución(es), deleción(es) y/o inserciones en o al aminoácido(s) de interés.

[0026] Variante de subtilasa. En el contexto de esta invención, el término variante de subtilasa o subtilasa mutada significa una subtilasa que ha sido producida por un organismo que está expresando un gen mutante derivado de un microorganismo progenitor que poseía un gen original o progenitor y que produjo una enzima progenitora correspondiente, el gen progenitor habiendo sido mutado para producir el gen mutante donde dicha proteasa de la subtilasa mutada se produce cuando se expresa en un huésped adecuado.

[0027] Secuencias de subtilasa homólogas. La homología entre dos secuencias de aminoácidos está en este contexto descrita por el parámetro "identidad". Para determinar el grado de identidad entre dos subtilasas la rutina GAP del paquete GCG versión 9.1 se puede aplicar (infra) usando los mismos ajustes. La producción a partir de la rutina es además de la alineación de aminoácidos el cálculo del "porcentaje de identidad" entre las dos secuencias. Basado en esta descripción es rutina para un experto en la técnica identificar subtilasas homólogas adecuadas, que se pueden modificar según la invención.

[0028] Polinucleótido aislado. El término "aislado", cuando se aplica a un polinucleótido, denota que el polinucleótido ha sido eliminado de su ambiente genético natural y por tanto está libre de otras secuencias de codificación indeseadas o extrañas, y está en una forma adecuada para el uso dentro de sistemas de producción de proteínas creadas genéticamente. Tales moléculas aisladas son aquellas que son separadas de su entorno natural e incluyen ADNc y clones genómicos. Moléculas de ADN aisladas de la presente invención están libres de otros genes con los cuales éstas están comúnmente asociadas, pero pueden incluir regiones 5' y 3' no traducidas de origen natural tales como promotores y terminadores. La identificación de regiones asociadas será evidente para un experto en la materia (ver por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature 316:774-78,1985). El término "un polinucleótido aislado" puede ser denominado de forma alternativa "un polinucleótido clonado".

[0029] Proteína aislada. Cuando se aplica a una proteína, el término "aislado" indica que la proteína ha sido eliminada de su entorno nativo. En una forma preferida, la proteína aislada está sustancialmente libre de otras proteínas, particularmente otras proteínas homólogas (es decir, "impurezas homólogas (véase más abajo)). Una proteína aislada tiene más del 10% de pureza, preferiblemente más del 20% de pureza, más preferiblemente más del 30% de pureza, según está determinado por SDS-PAGE. Además se prefiere proporcionar la proteína en una forma altamente purificada, es decir, más del 40% pureza, más del 60% de pureza, más del 80% de pureza, más preferiblemente más del 95% de pureza, y de la forma más preferible más del 99% de pureza, según está determinado por SDS-PAGE. El término "proteína aislada" puede ser denominado de forma alternativa "proteína purificada".

[0030] Impurezas homólogas. El término "impurezas homólogas" significa cualquier impureza (p. ej. otro polipéptido distinto de la subtilasa de la invención), que se origina de la célula homóloga de la cual se obtiene originalmente la subtilasa de la invención.

[0031] Obtenido de. El término "obtenido de" como se utiliza en este caso en relación con una fuente microbiana específica, significa que el polinucleótido y/o subtilasa producido por la fuente específica, o por una célula en la que un gen de la fuente ha sido insertado.

[0032] Sustrato. El término "sustrato" usado en conexión con un sustrato para una proteasa debería ser interpretado en su forma más general como que comprende un compuesto que contiene al menos un enlace peptídico (amida) susceptible de hidrólisis por una proteasa de subtilisina.

[0033] Producto. El término "producto" usado en conexión con un producto derivado de una reacción enzimática de proteasa debería, en el contexto de la presente invención, ser interpretado para incluir los productos de una reacción de hidrólisis que implican una proteasa de subtilasa. Un producto puede ser el sustrato en una reacción de hidrólisis posterior.

[0034] Rendimiento de lavado. En el presente contexto el término "rendimiento de lavado" se usa como una capacidad enzimática para eliminar cepas proteináceas u orgánicas presentes en el objeto que debe ser limpiado durante por ejemplo el lavado o limpieza de superficies duras.

[0035] La composición detergente de la invención puede por ejemplo ser formulada como una composición detergente para ropa a mano o a máquina que incluye una composición de aditivo para el lavado de la ropa adecuado para el pretratamiento de tejidos manchados y una composición de suavizante adicionada al enjuague, o ser formulada como una composición detergente para el uso en operaciones de limpieza de superficies duras del hogar en general, o ser formulada para operaciones de lavado de la vajilla a mano o a máquina.

[0036] En general las propiedades de la(s) enzima(s) elegida(s) deberían ser compatibles con el detergente seleccionado, (es decir, pH-óptimo, compatibilidad con otros ingredientes no enzimáticos y enzimáticos, etc.), y la enzima(s) debería estar presente en cantidades eficaces.

[0037] Lipasas: lipasas adecuadas incluyen aquellas de origen fúngico o bacteriano. Mutantes de proteínas creados genéticamente o modificados químicamente están incluidos. Ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola (sinónimo de Thermomyces), por ejemplo de H. insolens como se describe en WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas, por ejemplo de una cepa SD 705 de Pseudomonas sp. (WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), o una lipasa de Bacillus como se describe en WO 2000/060063.

[0038] Otros ejemplos son variantes de lipasa tales como los descritos en WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407225, EP 260105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202. Enzimas lipasas usadas preferidas comercialmente incluyen Lipolase®, Lipolase Ultra® y Lipex® (Novozymes A/S).

[0039] Amilasas: amilasas adecuadas (e y/o 1) incluyen aquellas de origen fúngico o bacteriano. Mutantes de proteínas creados genéticamente o químicamente modificados están incluidos. Amilasas incluyen, por ejemplo, eamilasas obtenidas de Bacillus. Ejemplos de amilasas útiles son las variantes descritas en WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, WO 2000/60060, y WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, y 444. Amilasas comercialmente usadas son Duramyl®, Termamyl®, Stainzym®, Stainzyme Plus®, Stainzyme ultra®, Fungamyl® y BAN® (Novozymes A/S), RapidaseTM, PurastarTM y Purastar OxAmTM (de Genencor International Inc.).

[0040] Celulasas: celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen fúngico o bacteriano. Mutantes creados genéticamente de proteínas o modificados químicamente están incluidos. Celulasas adecuadas incluyen celulasas del género Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo las celulasas fúngicas producidas de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum descritas en US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 y WO 89/09259. Celulasas especialmente adecuadas son las celulasas neutras o alcalinas con beneficios de cuidado del color y de mantenimiento de blancura. Ejemplos de tales celulasas son celulasas descritas en EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasa tales como los descritos en WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y PCT/DK98/00299. Celulasas usadas comercialmente incluyen Renozyme®, Celluzyme®, Celluclean®, Endolase® y Carezyme® (Novozymes A/S), Clazynase™, y Puradax HA™ (Genencor Int. Inc.), y KAC500(B)™ (Kao Corporation).

[0041] Peroxidasas/oxidasas: peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen vegetal, fúngico o bacteriano. Mutantes creados genéticamente de proteínas o químicamente modificados son incluidos. Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, por ejemplo de C. cinereus, y sus variantes como aquellas descritas en WO 93/24618, WO 95/10602, y WO 98/15257. Peroxidasas comercialmente usadas incluyen Guardzyme™ (Novozymes A/S).

[0042] Hemicelulasas: hemicelulasas adecuadas incluyen aquellas de origen fúngico o bacteriano. Mutantes creados genéticamente de proteína o químicamente modificados están incluidos. Hemicelulasas adecuadas incluyen mananasa, liqueninasa, xilanasa, arabinasa, galactanasa, actetil xilano esterasa, glucorunidasa, esterasa de ácido ferúlico, esterasa de ácido cumárico y arabinofuranosidasa como se describe en WO 95/35362. Mananasas adecuadas son descritas en WO 99/64619. Hemicelulasas comercialmente usadas incluyen Mannaway® (Novozymes A/S).

[0043] La(s) enzima(s) detergente(s) se puede(n) incluir en una composición detergente añadiendo aditivos separados que contienen una o más enzimas, o por adición de un aditivo combinado comprendiendo todas estas enzimas. Un aditivo detergente de la invención, es decir un aditivo separado o un aditivo combinado, se puede formular por ejemplo como un gel, un líquido, un lodo, etc. Formulaciones de aditivo de detergente preferidas son líquidos, en particular líquidos estabilizados, o lodos.

[0044] Preparaciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo, ser estabilizadas añadiendo un poliol tal como propilenoglicol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico según métodos establecidos. Enzimas protegidas se pueden preparar según el método descrito en EP 238.216.

[0045] La composición detergente de la invención está en forma de un gel o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, típicamente conteniendo hasta 70 % de agua y 0-30 % de solvente orgánico, o no acuoso.

[0046] La composición detergente comprende uno o más tensioactivos, que pueden ser no iónicos incluyendo semipolares y/o aniónicos y/o zwitteriónicos y/o catiónicos. Los tensioactivos están típicamente presentes a un nivel del 0,1 % al 60% en peso.

[0047] Cuando se incluye en la misma el detergente normalmente contendrá de aproximadamente 1% a aproximadamente 40% de un surfactante aniónico tal como alquilbencenosulfonato lineal, alfa-olefinsulfonato, sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso), etoxisulfato alcohólico, alcanosulfonato secundario, éster metílico de ácido alfasulfo graso, ácido alquil- o alquenilsuccínico o jabón.

[0048] Cuando se incluye en la misma el detergente normalmente contendrá de aproximadamente 0,2% a aproximadamente 40% de un surfactante no iónico tal como alcohol etoxilato, nonilfenol, etoxilato alquilpoliglicósido, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, amida de ácido polihidroxi alquil graso, o derivados de N-acil/N-alquil glucosamina ("glucamidas").

[0049] El detergente puede contener 0-65 % de un constructor de detergente o agente complejante tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilenodiaminatetraacético, ácido dietilenotriaminopentaacético, ácido alquil-o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos estratificados (p. ej. SKS-6 de Hoechst).

[0050] El detergente puede comprender uno o más polímeros. Ejemplos son carboximetilcelulosa, poli(vinilpirrolidona), poli (etilenglicol), poli(vinil alcohol), poli(vinilpiridina-N-óxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos tales como poliacrilatos, copolímeros de ácido maléico/acrílico y copolímeros de lauril metacrilato/ácido acrílico.

[0051] El detergente puede contener un sistema blanqueante que puede comprender una fuente de H2O2 tal como perborato o percarbonato que se puede combinar con un activador blanqueante de formación de perácido tal como tetraacetiletilenodiamina o nonanoiloxibencenosulfonato. Alternativamente, el sistema blanqueante puede comprender peroxiácidos de por ejemplo el tipo amida, imida, o sulfona.

[0052] La(s) enzima(s) de la composición detergente de la invención se puede(n) estabilizar usando agentes estabilizantes convencionales, por ejemplo, un poliol tal como propilenoglicol, dictilenoglicol, metilpropanodiol, o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, por ejemplo, un éster de borato aromático, o un derivado de ácido fenil borónico tal como ácido 4-formilfenil borónico o mono- o trietanolamina, y la composición se puede formular como se describe en por ejemplo WO 92/19709, WO 92/19708, US 5,972,873 o EP 0832174.

5 [0053] El detergente también puede contener otros ingredientes de detergentes convencionales tales como por ejemplo acondicionadores de tejidos incluyendo arcillas, reforzadores de espuma, supresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes supensores de suciedad, agentes antiredeposición de suciedad, tintes, bactericidas, blanqueadores ópticos, hidrótropos, inhibidores de decoloración, o perfumes.

10 [0054] Es actualmente contemplado que en las composiciones detergentes cualquier enzima, en particular la enzima de la invención, se puede adicionar en una cantidad correspondiente a 0,01-100 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado, preferiblemente 0,05-5 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado, en particular 0,1-1 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado.

15 [0055] Variaciones en condiciones regionales y locales, tales como dureza del agua y temperatura de lavado demandan composiciones detergentes regionales. Los Ejemplos 1 de detergente proporcionan gamas para la composición de un detergente líquido.

Materiales y métodos

20 Enzimas

[0056] En los ejemplos a continuación las siguientes enzimas disponibles comerciales son usadas. Alcalase® y Savinase® se usan como estándares para comparación:

Nombre: Tipo de enzima Derivado de o descrito en

Alcalase®: Proteasa, subtilisina Carlsberg B. licheniformis

Savinase®: Proteasa, subtilisina 309 B. lentus

Termamyl®: amilasa B. licheniformis

Novozym 342®: H. Insolens

Amylase A: amilasa La variante de amilasa D183*+G184*+R118K+N195F+R458K. WO 01/66712

Mannan A: Mananasa WO 99/64619

Lipase A: Lipasa variante T231 R+N233R de lipasa T. lanoginosus , WO00/60063

Celulase A: Celulasa H. Insolens, WO 91/17244

También se usa la proteasa designada subtilisina KL y sus variantes. Subtilisina KL es una variante Y167A+R170S+A194P de Savinase (usando numeración de BPN' )

30 Ensayos

Compatibilidad de proteasa:

[0057] La compatibilidad de proteasa de las enzimas se determina por preparación de las composiciones 35 detergentes como se indica en cada Ejemplo y por medición de la actividad residual de las otras actividades enzimáticas después de los períodos indicados en los Ejemplos.

Actividad enzimática:

40 [0058] Actividades enzimáticas son medidas usando los bien conocidos métodos estándares reconocidos .

Composiciones detergentes

[0059] Las composiciones de detergente usadas en los ejemplos son bien un detergente modelo según las

45 composiciones proporcionadas a continuación o detergentes líquidos comerciales para ropa por ejemplo Tide, Era, Gain, Cheer, Wisk, All, Purex, Arm & Hammer, Sun, Great Value, Ariel, Persil, Total, Skip, Dash, Dixan, Ava o cualquier otra extensión de marca o versiones concentradas del detergente líquido. Si el detergente para ropa comercial usado comprende enzimas éstas son inactivadas antes del uso calentando el detergente en un horno de microondas a 85°C durante 5 minutos. Composición A detergente modelo - ejemplo detergente 1

Grupo: Subnombre Contenido

Tensioactivos: 5-60%

Sulfonatos: 0-30%

Sulfatos: 0-15%

Jabones: 0-15%

No iónicos: 0-15%

Catiónicos: 0-15%

Óxidos de amina: 0-10%

FAGA: 0-10%

Solventes: 5-35%

Etanol: 0-10%

MPG - monopropilenoglicol: 0-20%

DEG - Dietilenoglicol: 0-15%

MPD - metilpropanodiol: 0-15%

MEA - monoetanolamina: 0-10%

TEA - trietanolamina Hidrótropos como SXS, SCS, etc Cumeno sulfonato de sodio: 0-10%

Xileno sulfonatos de sodio: 0-10%

Otros solventes: 0-10%

Constructores: Citrato de Na Otros constructores 0-20% 0-15%0-15%

Otros: 0-20%

Polímeros: 0-5%

Enzimas: 0-10%

Ácido bórico y sus derivados: 0-5%

Reguladores de espuma: 0-10%

Otros: 0-10%

Se añade agua hasta el equilibrio del 100%

Ejemplo 1

5 [0060] A un detergente líquido comercial para ropa se le añadieron proteasas comerciales, amilasas, lipasa, y celulasas según están catalogadas a continuación (si el detergente ya contiene enzimas entonces éstas se pueden inactivar calentando el detergente en un horno microondas hasta 85°C durante 5 minutos). Cuando la subtilisina KL fue usada en comparación con proteasa comercial, la misma cantidad de unidades de actividad fue usada.

10 [0061] La estabilidad de las enzimas según se determina por % de actividad enzimática residual después del almacenamiento a 20°C durante 1, 2 y 4 semanas se muestra en tabla 2-5.

[0062] Condiciones de almacenamiento: 20°C durante 1, 2, 4 semanas en los vasos de vidrio cerrados

15 Tabla 2 Actividad de amilasa residual

Semanas: 1 2 3 4

0.5% Alcalase Ultra 2.5 L 0.3% Termamyl 300L: 93 92 89 87

Subtilisina KL 0.3% Termamyl 300 L: 96 98 95 92

0.5% Alcalase Ultra 2.5 L 0.3% Amylase A 12L: 34 16 10 7

Subtilisina KL 0.3% Amylase A 12 L: 90 86 82 78

Tabla 3 Actividad de lipasa residual Tabla 4 Actividad de celulasa residual

Semanas: 1 2 3 4

0.5% Alcalase Ultra 2.5 L 0.3% Lipase A 100 L: 12 11 8 9

Subtilisina KL 0.3% Lipase A 100 L: 72 54 46 38

Semanas: 1 2 3 4

0.5% Alcalase Ultra 2.5 L 0.3% Cellulase A 5000 L: 85 76 68

Subtilisina KL 0.3% Celulase A 5000 L: 99 87 88

Tabla 5 Actividad de proteasa residual

Semanas: 1 2 3 4

0.5% Alcalase Ultra 2.5 L 0.3% Celulase A 5000 L: 86 64 57 50

Subtilisina KL 0.3% Celulase A 5000 L: 84 74 65 56

5 [0063] Como se puede observar arriba la compatibilidad enzimática de la presente invención es claramente mejorada cuando la subtilisina KL se selecciona como la proteasa en vez de Alcalase 2.5L. La estabilidad enzimática de celulase A 5000L, Lipase A 100L, Termamyl 300L y Amilasa A 12L después 1, 2, 3 y 4 semanas a 30°C es claramente mejorada si la subtilisina KL es la proteasa. La proteasa de subtilisina KL es tan estable como la proteasa de referencia, Alcalase 2.5L, usada.

Ejemplo 2

[0064] Al detergente líquido comercial para ropa de Ejemplo 1 se le añadieron proteasas comerciales, amilasas, lipasa, y celulasas como se cataloga a continuación (si el detergente ya contiene enzimas luego éstas son

15 inactivadas calentando el detergente en un microhorno hasta 85°C durante 5 minutos). Cuando la subtilisina KL fue usada en comparación con proteasa comercial, la misma cantidad de unidades de actividad fue usada.

[0065] La estabilidad de las enzimas como determinado por % de actividad enzimática residual después almacenamiento a 30°C durante 1, 2 y 4 semanas se muestra en la tabla 6-9. 20 Tabla 6 Actividad de amilasa residual

Semanas: 1 2 3 4

0.5% Alcalase Ultra 2.5 L 0.3% Termamyl 300L: 85 78 71 66

Subtilisina KL 0.3% Termamyl 300 L: 93 87 83 73

0.5% Alcalase Ultra 2.5 L 0.3% Amylase A 12L: 10 5 4 4

Subtilisina KL 0.3% Amylase A 12 L: 81 74 63 59

Tabla 7 Actividad de lipasa residual

Semanas: 1 2 3 4

0.5% Alcalase Ultra 2.5 L 0.3% Lipase A 100 L: 9 8 5 6

Subtilisina KL 0.3% Lipase A 100 L: 35 17 11 6

Tabla 8 Actividad de celulasa residual

Semanas: 1 2 3 4

0.5% Alcalase Ultra 2.5 L 0.3% Celulase A 5000 L: 47 24 16 13

Subtilisina KL 0.3% Celulase A 5000 L: 67 66 55 55

Tabla 9 Actividad de proteasa residual

Semanas: 1 2 3 4

0.5% Alcalase Ultra 2.5 L: 57 36 29 21

Subtilisina KL: 55 36 24 16

[0066] Como se puede observar arriba la compatibilidad enzimática de la presente invención es claramente

30 mejorada cuando la subtilisina KL se selecciona como la proteasa en vez de Alcalase 2.5L. La estabilidad enzimática de Cellulase A 5000L, Lipase A 100L, Termamyl 300L y Amylase A 12L después de 1, 2, 3 y 4 semanas a 30°C es claramente mejorada si subtilisina KL se selecciona como proteasa. La proteasa subtilisina KL es justo tan estable como la proteasa de referencia, Alcalase 2.5L, usada.

Ejemplo 3

[0067] A un detergente líquido comercial para ropa se le añadieron proteasas comerciales, amilasas, y lipasas según está catalogado a continuación (si el detergente ya contiene enzimas entonces éstas se pueden inactivar calentando 5 el detergente en un microondas hasta 85°C durante 5 minutos). Cuando la subtilisina KL fue usada en comparación con proteasa comercial, la misma cantidad de unidades de actividad fue usada.

[0068] La estabilidad de las enzimas según está determinado por % de actividad enzimática residual después del almacenamiento a 30°C durante 1, 2, 4 y 8 semanas se muestra en tabla 10-11. 10 Tabla 10 Actividad de amilasa residual

Semanas: 1 2 4 8

0.4% Alcalase 2.5 L 0.4% Amylase A 12 L: 42 36 19 9

0.4% Savinase 16 L 0.4% Amylase A 12 L: 48 41 24 9

Subtilisina KL 0.4% Amylase A: 77 73 63 42

0.4% Amylase A 12 L (sin proteasa): 88 89 82 62

Tabla 11 Actividad de lipasa residual

Semanas: 1 2

0.4% Alcalase 2.5 L 0.4% Lipase A 100 L: 9 8

Subtilisina KL 0.4% Lipase A 100 L: 33 22

0.4% Lipase A 100 L (sin proteasa): 86 81

15 [0069] Como se puede observar arriba la compatibilidad enzimática de la presente invención es claramente mejorada cuando la subtilisina KL se selecciona como la proteasa en vez de Savinase 16L y Alcalase 2.5L. La estabilidad enzimática de Lipase A 100L y Amylase A 12L después 2 y 8 semanas se mejora significativamente si se selecciona subtilisina KL como la proteasa preferida.

20 Ejemplo 4

[0070] Un detergente líquido con la siguiente formulación como se muestra en la tabla 13 es preparada.

Tabla 13 Formulación de detergente

Subnombre: Contenido

Cloruro de calcio: 0,1%

LAS-sal de sodio: 11. 81%

Ácido sebácico de soja - sal de sodio: 5,94%

Propilenoglicol: 5,05%

C-13-Oxoalcohol etoxilato, 8EO: 9,45%

Fosfonato: 1,00%

Ácido sebácico de coco - sal de trietanolamina: 6,50%

Citrato sódico: 1,00%

Etanol: 4,63%

Opacificante: 0,12%

Perfume: 0,35%

Color: -

Agua hasta 100%

25: Enzimas usadas

[0071]

Proteasa:: Savinase 16L Alcalase 2.5L Subtilisina KL Subtilisina KL M222S Subtilisina KL *36D Subtilisina KL N76D+S99SE+A230V

Subtilisina KL S162R Subtilisina KL S99SE+N76D Subtilisina KL N76D Subtilisina KL A228V Subtilisina KL A230V Subtilisina KL A228V+A230V

Lipasa: Lipase A 100L Amilasa: Termamyl 300L Manasa: Mannan A 4,0L

Configuración de prueba I

[0072] 5

Adición de enzimas: I) Savinase 16L (0,17mg EP/g) II) Subtilisina KL (0,17mg EP/g) III) Alcalase 2,5L(0,17mg EP/g)

Amilasa: Termamyl 300L (0,4%)

Las cantidades de proteasa se dan en la proteína enzimática (activa) por gramos [EP/g].

[0073] Las formulaciones detergentes se almacenan en 2, y 4 semanas a 30°C en vasos de vidrio cerrados. 10 Después del almacenamiento, las actividades de la proteasa residual y de amilasa son determinadas.

Tabla 14 % de actividad de proteasa residual

Semanas: 2 4

0,17mg Savinase 16L + 0,4% Termamyl 300L: 21 15

0,17mg Alcalase 2,5L + 0,4% Termamyl 300L: 23 16

0,17mg Subtilisina KL + 0,4% Termamyl 300L: 16 10

Tabla 15 % de actividad de amilasa residual

Semanas: 2 4

0,17mg Savinase 16L + 0,4% Termamyl 300L: 90 92

0,17mg Alcalase 2,5L + 0,4% Termamyl 300L: 94 95

0,17mg Subtilisina KL + 0,4% Termamyl 300L: 97 97

15 Configuración de prueba II

[0074]

Adición de enzimas: I) Savinase 16L (0,07mg EP/g) II) Subtilisina KL (0,07mg EP/g) III) Alcalase 2,5L (0,07mg EP/g) IV) Subtilisina 2,5KL M222S (0,07mg EP/g) V) Subtilisina 2,5KL *36D (0,07mg EP/g) VI) Subtilisina KL N76D+S99SE, A230V

Lipasa: Lipase A 100L (0,2%) Amilasa: Termamyl 300L (0,2%) Manasa: Mannan A 4,0L (0,2%)

20 [0075] Las formulaciones detergentes se almacenan en 2, y 4 semanas a 30°C en vasos de vidrio cerrados. Después del almacenamiento las actividades de la proteasa residual, lipasa (Lip.), manasa (Man.) y amilasa (Ter.) son determinadas.

25 Tabla 16 % de actividad de proteasa residual Configuración de prueba III

Semanas: 2 4

0,07mg Savinase 16L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 21 13

0,07mg Alcalase 2,5L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 24 22

0,07mg Subtilisina KL 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 18 13

0,07mg Subtilisina KL M222S 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 50 50

0,07mg Subtilisina KL *36D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 59 19

0,07mg Subtilisina KL N76D+S99SE+A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 84 77

Tabla 17 % de actividad de amilasa residual

Semanas: 2 4

0,07mg Savinase 16L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 97 96

0,07mg Alcalase 2,5L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 87 89

0,07mg Subtilisina KL 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 97 97

0,07mg Subtilisina KL M222S 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 98 101

0,07mg Subtilisina KL *36D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 97 98

0,07mg Subtilisina KL N76D+S99SE+A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 98 98

Tabla 18 % de actividad de lipasa residual

Semanas: 2 4

0,07mg Savinase 16L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 5 5

0,07mg Alcalase 2,5L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 5 5

0,07mg Subtilisina KL 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 4 4

0,07mg Subtilisina KL M222S 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 20 15

0,07mg Subtilisina KL *36D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 6 6

0,07mg Subtilisina KL N76D+S99SE+A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 22 17

Tabla 19 % de actividad de manasa residual

Semanas: 2 4

0,07mg Savinase 16L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 38 25

0,07mg Alcalase 2,5L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 14 13

0,07mg de Subtilisina KL 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 62 48

0,07mg Subtilisina KL M222S 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 89 84

0,07mg Subtilisina KL *36D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 63 54

0,07mg Subtilisina KL N76D+S99SE+A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 99 95

10 [0076]

Adición de enzimas: I) Savinase 16L (0,05mg EP/g det.) II) Subtilisina KL (0,05mg EP/g det.) III) Alcalase 2,5L (0,05mg EP/g det.) VII) Subtilisina 2,5KL S162R (0,05mg EP/g det.) VIII) Subtilisina KL S99SE+N76D (0,05mg EP/g det.) IX) Subtilisina KL N76D (0,05mg EP/g det.) X) Subtilisina KL A228V (0,05mg EP/g det.) XI) Subtilisina KL A230V (0,05mg EP/g det.) XII) Subtilisina KL A228V, A230V (0,05mg EP/g det.)

EP = proteína enzimática det = detergente

[0077] Las formulaciones detergentes se almacenan en 1, 2 y 3 semanas a 30°C en vasos de vidrio cerrados. Después del almacenamiento las actividades de proteasa residual, lipasa (Lip.), manasa (Man.) y amilasa (Ter.) son determinadas.

Tabla 20 % de actividad de proteasa residual

Semanas: 1 2 3

0,05mg Savinase 16L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 89 20 12

0,05mg Alcalase 2,5L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 85 37 37

0,05mg Subtilisina KL 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 70 17 17

0,05mg Subtilisina KL S162R 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 45 12 12

0,05mg Subtilisina KL S99SE+N76D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 100 75 77

0,05mg Subtilisina KL N76D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 94 95 89

0,05mg Subtilisina KL A228V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 85 83 78

0,05mg Subtilisina KL A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 99 87 80

0,05mg Subtilisina KL A228V+A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 100 98 89

Tabla 21 % de actividad de amilasa residual

Semanas: 1 2 3

0,05mg Savinase 16L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 100 98 96

0,05mg Alcalase 2,5L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 100 96 97

0,05mg Subtilisina KL 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 100 98 97

0,05mg Subtilisina KL S162R 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 99 97 97

0,05mg Subtilisina KL S99SE+N76D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 99 98 98

0,05mg Subtilisina KL N76D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 100 100 100

0,05mg Subtilisinaa KL A228V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 100 100 100

0,05mg Subtilisina KL A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 100 100 100

0,05mg Subtilisina KL A228V+A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 100 100 100

Tabla 22 % de actividad de lipasa residual

Semanas: 1 2 3

0,05mg Savinase 16L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 30 5 5

0,05mg Alcalase 2,5L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 10 6 6

0,05mg Subtilisina KL 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 59 8 5

0,05mg Subtilisina KL S162R 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 82 14 6

0,05mg Subtilisina KL S99SE+N76D

0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 81 15 20

0,05mg Subtilisina KL N76D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 49 49 57

0,05mg Subtilisina KL A228V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 53 52 47

0,05mg Subtilisina KL A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 65 59 52

0,05mg Subtilisina KL A228V+A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 61 55 48

Tabla 23 % de actividad residual de Manasa

Semanas: 1 2 3

0,05mg Savinase 16L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 93 44 27

0,05mg Alcalase 2,5L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 81 29 24

0,05mg Subtilisina KL 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 98 71 58

0,05mg Subtilisina KL S162R 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 105 77 73

0,05mg Subtilisina KL S99SE+N76D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 98 98 100

0,05mg Subtilisina KL N76D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 89 96 90

0,05mg Subtilisina KL A228V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 95 96 92

0,05mg Subtilisina KL A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 107 90 89

0,05mg Subtilisina KL A228V+A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 97 88 84

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición de detergente en gel o líquida que comprende subtilisina KL o sus variantes en combinación con al menos una lipasa; amilasa; celulasa; o mananasa, donde la proporción en peso entre el contenido de subtilisina KL

o sus variantes al contenido de lipasa, amilasa, celulasa o mananasa es de 0,001 a 100, preferiblemente de 0,01 a 10, especialmente de 0,5 a 5, especialmente de 1 a 3.
2.

Composición detergente en gel o líquida según la reivindicación 1, donde la lipasa es seleccionada del grupo que comprende lipasas de Humicola (Thermomyces), por ejemplo de H. lanuginosa (T. Lanuginosus) o de H. insolens, lipasas de Pseudomonas, por ejemplo de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes, P. cepacia, P. stutzeri, P. fluorescens, cepa SD 705 de Pseudomonas sp., P. wisconsinensis, lipasas de Bacillus, por ejemplo de B. subtilis, B. stearothermophilus o B. pumilus y sus variantes creadas químicamente o genéticamente.
3.

Composición detergente en gel o líquida según la reivindicación 1 o 2, donde la amilasa es seleccionada del grupo que comprende amilasas de Bacillus, por ejemplo B. licheniformis.
4.

Composición detergente en gel o líquida según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde la celulasa es seleccionada del grupo que comprende celulasas del género Bacillus, Pseudomonas, Myceliophthora, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum.
5.

Composición detergente en gel o líquida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el contenido de subtilisina KL o sus variantes es de 0,001 a 5 % en peso y si están presentes el contenido de cada una de las siguientes lipasa, amilasa, celulasa, o mananasa es de 0,001 a 5 % en peso.
6.

Uso de subtilisina KL o sus variantes en combinación con al menos una lipasa, amilasa, celulasa o mananasa, para la preparación de composiciones detergentes de tipo gel o líquidas acuosas con estabilidad mejorada de las enzimas no proteasas.
7.

Proceso para mejorar la estabilidad de las enzimas no proteasas en combinación de una enzima proteasa con otras enzimas en una composición detergente en gel o líquida que comprende una proteasa y al menos una enzima no proteasa, donde la composición detergente en gel o líquida es preparada usando la subtilisina KL o una variante de la misma como la enzima proteasa, donde al menos una enzima no proteasa es seleccionada entre lipasa, amilasa, celulasa o mananasa.