ES2391695T3 - Formas mutantes de estreptolisina O - Google Patents

Abstract

Una proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada según SEC ID Nº: 1, en la que los aminoácidos en lasposiciones P427 y W535 están sustituidos con otro aminoácido, y en la que la actividad hemolítica de la proteínaSLO mutante se reduce al menos el 50 % con respecto a SLO natural.

Description

Formas mutantes de estreptolisina O

Campo de la invención

La invención se refiere a los campos de la inmunología y la vacunología.

5 Antecedentes de la invención

La estreptolisina O (SLO; GAS25) es uno de los factores de virulencia más importantes del patógeno humano Streptococcus pyogenes (GAS). Debido a su capacidad para provocar una respuesta inmunitaria temprana e intensa en seres humanos, se usa rutinariamente como marcador de diagnóstico de infección por GAS.

La SLO pertenece a la familia de las citolisinas activadas con tiol altamente homólogas (TACY), que ejercen su

10 actividad citolítica por la interacción con colesterol sobre la membrana celular, auto-oligomerización y formación de poros. Además, su capacidad para activar directamente la vía del complemento clásica por unión a la región Fc de IgG humana puede producir el ataque directo mediado por complemento sobre células huésped. Las TACY también pueden interferir con la defensa del huésped y la función de células inmunitarias por medio de la inducción de citocinas y mediadores inflamatorios.

15 Algunas TACY pueden proteger pasiva y activamente a los animales de laboratorio. Véase FEMS Lett. 182, 197205, 2000. Sin embargo, el uso de estas toxinas como candidatos a vacuna ha sido dificultado por su complejo patrón de efectos secundarios perjudiciales. Por tanto, hay una necesidad en la materia de proteínas SLO que no sean tóxicas.

El documento WO 2005/108419 describe composiciones de vacuna que comprenden proteínas de citolisina de unión 20 a colesterol mutantes que incluyen proteínas SLO mutantes.

El documento WO 93/05155 describe la expresión y purificación de una proteína SLO mutante y el análisis de su actividad hemolítica.

Pinkey y col. (Infection and Immunity 57:8, 1989) describen el análisis de las actividades hemolíticas de SLO natural y varias proteínas SLO mutantes.

25 El documento GB 2233977 describe proteínas SLO mutantes y describe el análisis de su actividad citolítica.

Breve descripción de las figuras

FIG. 1. Modelo informático tridimensional de SLO. Las prolinas se representan como espacio relleno. Pro427 está coloreada en blanco. FIG. 2. Gráfica que muestra los resultados del ensayo hemolítico usando extractos de E. coli que contienen

30 SLO natural y el mutante de SLO P427L. FIG. 3. Fotomicrografía de gel de SDS-poliacrilamida que muestra el mutante de SLO purificado P427L. FIG. 4. Gráfica que muestra los resultados del ensayo hemolítico usando SLO natural purificada y el mutante

de SLO P427L. FIG. 5. Fotomicrografía de gel de SDS-poliacrilamida de sobrenadantes de lisado de E. coli. Carril A, control

35 negativo de E. coli; carril B, rSLO natural, sin marca; carril C, rSLO P427L, sin marca; y carril D, rSLO natural purificada, sin marca (5 mg). FIG. 6. Gráfica que demuestra que bajo las mismas condiciones el mutante de SLO P427L es 1000 veces

menos hemolítico que SLO natural. FIG. 7. Gráfica que demuestra los efectos del colesterol sobre la hemólisis por SLO natural y el mutante de 40 SLO P427L. FIG. 8. Fotomicrografías del análisis de SDS-PAGE de proteínas sin marca totales en extractos de células.

FIG. 8A, expresión de proteínas sin marca SLO natural y P427L; FIG. 8B, expresión de proteínas sin marca SLO P427L + W535, P427L + C530G, y P427L + C530G + W535F. FIG. 9. Fotomicrografía del análisis de SDS-PAGE de proteínas marcadas con His totales en extractos de

45 células. FIG. 10. Fotomicrografía del análisis de SDS-PAGE de proteínas marcadas con His purificadas. FIG. 11. Fotomicrografías del análisis de SDS-PAGE de proteínas sin marca purificadas. FIG. 11A, Carriles:

A, SLO natural sin marca; B, SLO P427L sin marca; marcadores de peso molecular (116-66,2-45-35-25-18,414,4); la flecha negra indica proteína SLO purificada de mutantes y clones naturales. FIG. 11B, carril A, SLO natural sin marca (3 µg), carril B, SLO P427L-W535F sin marca (3 µg); marcadores de peso molecular (11666,2-45-35-25-18,4-14,4); la flecha negra indica proteína SLO purificada de mutantes y clones naturales.

FIG. 12. Fotomicrografía de análisis de SDS-PAGE de proteína SLO natural sin marca purificada. Muestras de diferentes lotes de purificación de SLO natural se analizaron bajo condiciones reductoras y no reductoras.

FIG. 13. Gráfica que muestra los resultados de las pruebas de hemólisis de mutantes de SLO marcados con His.

FIG. 14. Gráfica que muestra la inhibición de la actividad hemolítica inducida por SLO por antisuero anti-SLO.

FIG. 15. Gráfica que muestra la valoración de la inhibición por antisuero anti-SLO de la hemólisis de SLO.

FIG. 16. Gráfica que muestra la valoración de la actividad hemolítica de SLO.

FIG. 17. Gráfica que muestra la valoración de la actividad hemolítica de SLO natural, SLO natural químicamente desintoxicada y mutantes de SLO (P427L; P427L + W535F).

FIG. 18. Gráfica que muestra la valoración de la actividad hemolítica de SLO natural y mutantes de SLO (P427L; P427L + W535F).

FIG. 19. Gráfica que muestra la valoración de la actividad hemolítica de SLO natural y SLO natural químicamente desintoxicada.

FIG. 20. Gráfica que muestra la dilución de antisuero contra el mutante de SLO P427L + W535F requerida para obtener el 50 % de reducción de la actividad hemolítica de SLO (50 ng/ml de SLO).

FIG. 21. Gráfica que muestra la dilución de antisuero contra el mutante de SLO P427L + W535F requerida para obtener el 50 % de reducción de actividad hemolítica de SLO (100 ng/ml de SLO).

FIG. 22. Curva de valoración que muestra que los ensayos de inhibición de la hemólisis se realizaron con concentraciones de toxina que permitieron el 100 % de hemólisis.

FIG. 23. Alineamiento de proteínas SLO. M1_SF370, SEC ID Nº: 1; M12_2096, SEC ID Nº: 2; M12_9429, SEC ID Nº: 3; M1_5005, SEC ID Nº: 4; M2, SEC ID Nº: 5; M28, SEC ID Nº: 6; M6, SEC ID Nº: 7; M18, SEC ID Nº: 8; M5, SEC ID Nº: 9; M3, SEC ID Nº: 10; M3_SSI, SEC ID Nº: 11; y M4, SEC ID Nº: 12.

FIG. 24. Alineamiento de SLO natural y mutantes de SLO marcados con His. SLO_M1 strainSF370, SEC ID

Nº:

1; SLO WT_histagged, SEC ID Nº: 13; SLOmut.P427L_histagged, SEC ID Nº: 15;

SLOmut.C530G_histagged,

SEC ID Nº: 16; SLOmut.DeltaA248_histagged, SEC ID Nº: 17;

SLOmut.W535F_histagged, SEC ID Nº: 18; y SLOmutW535F&D482N_histagged, SEC ID Nº: 19.

FIG. 25. Gráfica que compara la reducción de la actividad hemolítica de SLO por antisuero contra SLO natural y antisuero contra el mutante de SLO P427L + W535F.

FIG. 26. Gráfica que muestra las propiedades protectoras in vivo del mutante de SLO recombinante P427L + W535F usando tanto alumbre como MF59 como adyuvante.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona mutantes de estreptolisina O (SLO; GAS25) que no son tóxicos, pero que todavía mantienen la capacidad para inducir protección contra S. pyogenes. Formas mutantes de SLO son útiles, entre otras cosas, en composiciones de vacuna, para inducir protección contra S. pyogenes.

La invención proporciona una proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada según SEC ID Nº: 1 en la que los aminoácidos en las posiciones P427 y W535 están sustituidos por otro aminoácido, y en la que la actividad hemolítica de la proteína SLO mutante se reduce al menos el 50 % con respecto a SLO natural.

La invención también proporciona una proteína SLO mutante purificada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 25 y SEC ID Nº: 27.

La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína SLO mutante como se ha descrito anteriormente.

La invención también proporciona una composición de vacuna que comprende:

(a)

un agente activo seleccionado de:

(i)

proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada como se ha descrito anteriormente; y

(ii)

una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada como se ha descrito anteriormente; y

(b)

un vehículo farmacéuticamente aceptable

5 La invención también proporciona un procedimiento de preparación de una vacuna para la prevención o el tratamiento de infección por Streptococcus pyogenes que comprende combinar:

(a) un agente activo seleccionado de:

(i) una proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada como se ha descrito anteriormente; y

(ii) una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de estreptolisina O (SLO) mutante 10 purificada como se ha descrito anteriormente; y

(b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención también proporciona el uso de un agente activo en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir infección por Streptococcus pyogenes, en el que el agente activo está seleccionado del grupo que consiste en:

15 (i) una proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada como se ha descrito anteriormente; y

(ii) una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada como se ha descrito anteriormente.

La invención también proporciona una proteína SLO mutante purificada como se ha descrito anteriormente o una molécula de ácido nucleico como se ha descrito anteriormente para su uso como una vacuna.

20 La invención también proporciona una proteína SLO mutante purificada como se ha descrito anteriormente, una molécula de ácido nucleico como se ha descrito anteriormente, o una composición de vacuna como se ha descrito anteriormente para su uso en terapia, tal como para tratar o prevenir infección por Streptococcus pyogenes.

Proteínas SLO mutantes

Las formas mutantes de SLO según la invención tienen al menos el 50 % menos de actividad hemolítica que SLO

25 natural (por ejemplo, el 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o el 100 %) con respecto a SLO natural como se ha determinado por un ensayo hemolítico, pero son inmunogénicas, por ejemplo, confieren protección contra la exposición mortal a GAS en un modelo de ratón (por ejemplo, véase el Ejemplo 7). Los mutantes de SLO desvelados en el presente documento incluyen los mutantes de SLO P427L (SEC ID Nº: 20), W535F (SEC ID Nº: 21), C530G (SEC ID Nº: 22), MA248 (SEC ID Nº: 23), W535F + D482N (SEC ID Nº: 24), P427L + W535F (SEC ID

30 Nº: 25), P427L + C530G (SEC ID Nº: 26) y P427L + C530G + W535F (SEC ID Nº: 27). La divulgación también incluye versiones marcadas con His de estos mutantes. Ejemplos se muestran en la FIG. 24.

Los mutantes de SLO desvelados en el presente documento incluyen aquellos con una alteración de aminoácidos (es decir, una sustitución, deleción o inserción) en uno o más de los aminoácidos P427, W535, C530, A248 y D482 enumerados según la secuencia de SLO natural mostrada en SEC ID Nº: 1. La FIG. 23 proporciona un alineamiento

35 de secuencias de GAS25 natural de diferentes tipos de M.

Los mutantes de SLO desvelados en el presente documento incluyen alteraciones de un único aminoácido, de dobles o triples aminoácidos (“mutantes únicos”, “mutantes dobles”, “mutantes triples”) en las posiciones P427, W535, C530, A248 y/o D482. Por tanto, los mutantes de SLO pueden comprender los siguientes:

i. P427L (SEC ID Nº: 20), P427R, P427N, P427C, P427Q, P427E, P427G, P427H, P427I, P427L, P427K, 40 P427M, P427F, P427A, P427S, P427T, P427W, P427Y o P427V;

ii. W535F (SEC ID Nº: 21), W535R, W535N, W535D, W535C, W535Q, W535E, W535G, W535I, W535L, W535K, W535M, W535A, W535P, W535S, W535T, W535Y o W535V;

iii. C530G (SEC ID Nº: 22), C530R, C530N, C530D, C530S, C530Q, C530E, C530A, C530H, C530I, C530L, C530K, C530M, C530F, C530P, C530T, C530W, C530Y o C530V;

45 iv. D482L, D482R, D482N, D482C, D482Q, D482E, D482G, D482H, D482I, D482L, D482K, D482M, D482F, D482A, D482S, D482T, D482W, D482Y o D482V;

v. A248L, A248R, A248N, A248C, A248Q, A248E, A248G, A248H, A248I, A248L, A248K, A248M, A248F, A248S, A248T, A248W, A248Y o A248V

vi. MP427; o MW535; o MC530; o MD482; o MA248 (SEC ID Nº: 23); y

50 vii. combinaciones de los mismos, tales como W535F + D482N (SEC ID Nº: 24), P427L + W535F (SEC ID

Nº: 25), P427L + C530G (SEC ID Nº: 26) y P427L + C530G + W535F (SEC ID Nº: 27).

Mutantes dobles desvelados en el presente documento incluyen P427L + W535F (SEC ID Nº: 25), P427L + C530G (SEC ID Nº: 26), P427L + A248L, P427L + D482L, W535F + C530G, W535F + A248L, W535F + D482L, C530G + A248L y A248L + D482L. Mutantes triples incluyen P427L + C530G + A248L, P427L + C530G + D482L, P427L + A248L + D482L, P427L + C530G + W535F (SEC ID Nº: 27), W535F + C530G + A248L, W535F + C530G + D482L, W535F + A248L + D482L y C530G + A248L + D482L.

Proteínas SLO mutantes desveladas en el presente documento también incluyen polipéptidos de fusión que comprenden una proteína SLO mutante como se ha desvelado anteriormente y otro antígeno de GAS. Los antígenos de GAS se desvelan, por ejemplo, en el documento WO 02/34771 e incluyen, pero no se limitan a, GAS39 (spy0266; gi-15674446), GAS40 (spy0269; gi-15674449), GAS42 (spy0287; gi-15674461), GAS45 (M5005_spy0249; gi71910063), GAS57 (spy0416; gi-15674549), GAS58 (spy0430; gi-15674556), GAS84 (spy1274; gi-15675229), GAS95 (spy1733; gi-15675582), GAS117 (spy0448; gi-15674571), GAS130 (spy0591; gi-15674677), GAS137 (spy0652; gi-15674720), GAS159 (spy1105; gi-15675088), GAS193 (spy2025; gi-15675802), GAS202 (spy1309; gi15675258), GAS217 (spy0925; gi-15674945), GAS236 (spy1126; gi-15675106), GAS253 (spy1524; gi-15675423), GAS277 (spy1939; gi-15675742), GAS294 (spy1173; gi-15675145), GAS309 (spy0124; gi-15674341), GAS366 (spy1525; gi-15675424), GAS372 (spy1625; gi-15675501), GAS384 (spy1874; gi-15675693), GAS389 (spy1981; gi15675772), GAS504 (spy1751; gi-15675600), GAS509 (spy1618; gi-15675496), GAS290 (spy1959; gi-15675757), GAS511 (spy1743; gi-15675592), GAS527 (spy1204; gi-15675169), GAS529 (spy1280; gi-15675233) y GAS533 (spy1877; gi-15675696). Otros antígenos de GAS incluyen, pero no se limitan a, GAS68 (Spy0163; gi13621456), GAS84 (Spy1274; gi13622398), GAS88 (Spy1361; gi13622470), GAS89 (Spy1390; gi13622493), GAS98 (Spy1882; gi13622916), GAS99 (Spy1979; gi13622993), GAS102 (Spy2016, gi13623025), GAS146 (Spy0763; gi13621942), GAS195 (Spy2043; gi13623043), GAS561 (Spy1134; gi13622269), GAS 179 (Spy1718, gi13622773) y GAS681 (Spy1152; gi1362228).

Moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas SLO mutantes

La invención incluye moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas SLO mutantes. También se desvelan moléculas de ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que tienen al menos el 50 % de identidad de secuencias con tales moléculas. Dependiendo de la secuencia particular, el grado de identidad de secuencias es preferentemente superior al 50 % (por ejemplo, el 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más). La identidad entre secuencias de nucleótidos se determina preferentemente por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman como se implementa en el programa MPSRCH (Oxford Molecular) usando una búsqueda de huecos afín con los parámetros penalización por apertura de hueco = 12 y penalización por extensión de hueco = 1.

En el presente documento también se desvelan moléculas de ácidos nucleicos que pueden hibridarse con estas moléculas. Las reacciones de hibridación pueden realizarse en condiciones de diferente “rigurosidad”. Las condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación son ampliamente conocidas y publicadas en la materia. Véase, por ejemplo, la página 7.52 de Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989. Ejemplos de condiciones relevantes incluyen (en orden de rigurosidad creciente): temperaturas de incubación de 25 ºC, 37 ºC, 50 ºC, 55 ºC y 68 ºC; concentraciones de tampón de 10X SSC, 6X SSC, 1X SSC y 0,1X SSC (siendo SSC NaCl 0,15 M y tampón citrato 15 mM) y sus equivalentes usando otros sistemas tampón; concentraciones de formamida del 0 %, 25 %, 50 % y 75 %; tiempos de incubación de 5 minutos a 24 horas; 1, 2 o más etapas de lavado; tiempos de lavado-incubación de 1, 2 ó 15 minutos; y disoluciones de lavado de 6X SSC, 1X SSC, 0,1X SSC, o agua desionizada. Las técnicas de hibridación y su optimización son muy conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook, 1989; Ausubel y col., eds., Short Protocols in Molecular Biology, 4ª ed., 1999; patente de EE.UU. 5.707.829; Ausubel y col., eds., Current Protocols in Molecular Biology, suplemento 30, 1987.

En algunos aspectos, las moléculas de ácidos nucleicos desveladas en el presente documento se hibridan con una diana bajo condiciones de baja rigurosidad; en otras realizaciones, las moléculas de ácidos nucleicos desveladas en el presente documento se hibridan bajo condiciones de rigurosidad intermedias; en ciertos aspectos, las moléculas de ácidos nucleicos desveladas en el presente documento se hibridan bajo condiciones de alta rigurosidad. Un ejemplo de una condición de hibridación de baja rigurosidad es 50 ºC y 10X SSC. Un ejemplo de una condición de hibridación de rigurosidad intermedia es 55 ºC y 1X SSC. Un ejemplo de una condición de hibridación de alta rigurosidad es 68 ºC y 0,1X SSC.

Producción de proteínas SLO mutantes

Producción recombinante

La redundancia del código genético es muy conocida. Por tanto, cualquier molécula de ácido nucleico (polinucleótido) que codifique proteína SLO natural o una proteína mutante SLO de la invención puede usarse para producir esa proteína recombinantemente. Ejemplos de secuencias de nucleótidos que codifican SLO natural, el mutante de SLO P427L, W535F, C530G, MA248, W535F + D482N, P427L + W535F, P427L + C530G y P427L + C530G + W535F se proporcionan en la lista de secuencias (véanse también SEC ID NO: 28, 29, 30, 31, 32 y 33).

Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican SLO natural también pueden aislarse de la bacteria S. pyogenes apropiada usando técnicas de purificación de ácidos nucleicos convencionales o pueden sintetizarse usando una técnica de amplificación, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o usando un sintetizador automático. Véase Caruthers y col., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215 223, 1980; Horn y col. Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225 232, 1980; Hunkapiller y col., Nature 310, 105-11, 1984; Grantham y col. Nucleic Acids Res. 9, r43-r74, 1981.

Las moléculas de ADNc pueden prepararse con técnicas de biología molecular convencionales usando ARNm como molde. Las moléculas de ADNc pueden replicarse después usando técnicas de biología molecular muy conocidas en la técnica. Una técnica de amplificación, tal como PCR, puede usarse para obtener copias adicionales de polinucleótidos de la invención, usando tanto ADN genómico como ADNc como molde.

Si se desea, los polinucleótidos pueden manipularse usando procedimientos generalmente conocidos en la técnica para alterar las secuencias codificantes de antígeno por una variedad de motivos que incluyen, pero no se limitan a, alteraciones que modifican la clonación, procesamiento y/o expresión del polipéptido o producto de ARNm. Puede usarse barajado de ADN por fragmentación al azar y reensamblaje por PCR de fragmentos de genes y oligonucleótidos sintéticos para manipular las secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, puede usarse mutagénesis dirigida a sitio para insertar nuevos sitios de restricción, alterar los patrones de glucosilación, cambiar la preferencia de codones, producir variantes de corte y empalme, introducir mutaciones, etc.

Pueden usarse modificaciones de secuencias, tales como la adición de una secuencia de marca de purificación u optimización de codones para facilitar la expresión. Por ejemplo, la secuencia líder del extremo N puede reemplazarse con una secuencia que codifica una proteína de marca tal como polihistidina (“HIS”) o glutatión Stransferasa (“GST”). Tales proteínas de marca pueden usarse para facilitar la purificación, detección y estabilidad de la proteína expresada. Los codones preferidos por un huésped procariota o eucariota particular pueden seleccionarse para aumentar la tasa de expresión de proteínas o para producir un transcrito de ARN que tiene propiedades deseables tales como una semivida que es mayor a la de un transcrito generado a partir de la secuencia que se produce naturalmente. Estos procedimientos son muy conocidos en la técnica y se describen adicionalmente en el documento WO05/0325

Vectores de expresión

Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína SLO mutante puede insertarse en un vector de expresión que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. Pueden usarse procedimientos que son muy conocidos para aquellos expertos en la materia para la construcción de vectores de expresión que contienen secuencias codificantes y elementos de control de la transcripción y traducción apropiados. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas de síntesis y recombinación genética in vivo.

Células huésped

Las células huésped para producir proteínas SLO mutantes pueden ser procariotas o eucariotas. E. coli es una célula huésped preferida, pero otros huéspedes adecuados incluyen Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (por ejemplo, M. tuberculosis), levaduras, baculovirus, células de mamífero, etc.

Una cepa de célula huésped puede elegirse por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar el polipéptido expresado en el modo deseado. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento postraduccional que escinde una forma “prepro” del polipéptido también puede usarse para facilitar la correcta inserción, plegamiento y/o función. Diferentes células huésped que tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para las actividades postraduccional están disponibles de la Colección americana de cultivos tipo (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) y pueden elegirse para garantizar la correcta modificación y procesamiento de una proteína extraña. Véase el documento WO 01/98340.

Las construcciones de expresión pueden introducirse en células huésped usando técnicas bien establecidas que incluyen, pero no se limitan a, transferencia de ADN mediada por policationes de transferrina, transfección con ácidos nucleicos desnudos o encapsulados, fusión celular mediada por liposomas, transporte intracelular de perlas de látex recubiertas por ADN, fusión de protoplastos, infección vírica, electroporación, procedimientos de “pistola de genes” y transfección mediada por DEAE o fosfato de calcio.

Las células huésped transformadas con vectores de expresión pueden cultivarse en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína del cultivo celular. La proteína producida por una célula transformada puede secretarse o estar contenida intracelularmente dependiendo de la secuencia de nucleótidos y/o el vector de expresión usado. Aquellos expertos en la materia entienden que los vectores de expresión pueden diseñarse para contener secuencias señal que dirigen la secreción de antígenos solubles por una membrana celular procariota o eucariota.

Purificación

Pueden incluirse secuencias de exportación de señales en una proteína SLO mutante recombinantemente producida de manera que el antígeno pueda purificarse del medio de cultivo celular usando procedimientos conocidos. Alternativamente, las proteínas SLO mutantes recombinantemente producidas de la invención pueden aislarse de células huésped manipuladas y separarse de otros componentes en la célula tales como proteínas, hidratos de carbono o lípidos usando procedimientos muy conocidos en la técnica. Tales procedimientos incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de exclusión por tamaño, fraccionamiento con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y electroforesis preparativa en gel. Una preparación de proteínas SLO mutantes purificadas es al menos el 80 % pura; preferentemente, las preparaciones son el 90 %, 95 % o el 99 % puras. La pureza de las preparaciones puede evaluarse mediante cualquier medio conocido en la técnica, tal como electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Cuando corresponda, las proteínas SLO mutantes pueden solubilizarse, por ejemplo, con urea.

Síntesis química

Las proteínas SLO mutantes pueden sintetizarse, por ejemplo, usando técnicas en fase sólida. Véase, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 54, 1963; Roberge y col., Science 269, 202 04, 1995. La síntesis de proteínas puede realizarse usando técnicas manuales o por automatización. La síntesis automatizada puede lograrse, por ejemplo, usando el sintetizador de péptidos Applied Biosystems 431 A (Perkin Elmer). Opcionalmente, los fragmentos de una proteína SLO mutante pueden sintetizarse por separado y combinarse usando procedimientos químicos para producir una molécula de longitud completa.

Anticuerpos

En el presente documento también se desvelan anticuerpos que se unen específicamente a una proteína SLO mutante de la invención, pero que no se unen a la proteína SLO natural. El término “anticuerpo” incluye moléculasde inmunoglobulina intactas, además de fragmentos de las mismas, que pueden unirse a un antígeno. Éstos incluyen moléculas de anticuerpos híbridos (quiméricos) (por ejemplo, Winter y col., Nature 349, 293-99, 1991; patente de EE.UU. 4.816.567); fragmentos F(ab')2 y F(ab) y moléculas Fv; heterodímeros no covalentes (por ejemplo, Inbar y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 2659-62, 1972; Ehrlich y col., Biochem 19, 4091-96, 1980); moléculas de Fv monocatenario (sFv) (por ejemplo, Huston y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5897-83, 1988); construcciones de fragmentos de anticuerpos diméricos y triméricos; minicuerpos (por ejemplo, Pack y col., Biochem 31, 1579-84, 1992; Cumber y col., J. Immunology 149B, 120-26, 1992); moléculas de anticuerpos humanizados (por ejemplo, Riechmann y col., Nature 332, 323-27, 1988; Verhoeyan y col., Science 239, 1534-36, 1988; y publicación de patente de RU nº GB 2.276.169 publicada el 21 de septiembre de 1994); y cualquier fragmento funcional obtenido de tales moléculas, además de anticuerpos obtenidos por procedimientos no convencionales tales como expresión en fago. Preferentemente, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. Los procedimientos de obtención de anticuerpos monoclonales son muy conocidos en la técnica.

Normalmente, para formar un epítope se requieren al menos 6, 7, 8, 10 ó 12 aminoácidos contiguo. Sin embargo, los epítopes que implican aminoácidos no contiguos pueden requerir más, por ejemplo, al menos 15, 25 ó 50 aminoácidos. Pueden usarse diversos inmunoensayos (por ejemplo, transferencias Western, ELISA, radioinmunoensayos, ensayos inmunohistoquímicos, inmunoprecipitaciones, u otros ensayos inmunoquímicos conocidos en la técnica) para identificar anticuerpos que tienen la especificidad deseada. Numerosos protocolos para los ensayos de unión competitiva o inmunorradiométricos son muy conocidos en la técnica. Tales inmunoensayos normalmente implican la medición de la formación de complejos entre un inmunogén y un anticuerpo que se une específicamente al inmunogén. Una preparación de anticuerpos que se une específicamente a una proteína SLO mutante normalmente proporciona una señal de detección al menos 5, 10 ó 20 veces superior a una señal de detección proporcionada con otras proteínas cuando se usan en un ensayo inmunoquímico y no proporciona una señal detectable si se pone en contacto con proteína SLO natural. Preferentemente, los anticuerpos no detectan otras proteínas en ensayos inmunoquímicos y pueden inmunoprecipitar del antígeno particular en disolución.

Generación de anticuerpos

Las proteínas SLO mutantes o antígenos polipeptídicos no SLO (descritos más adelante) pueden usarse para inmunizar un mamífero tal como ratón, rata, conejo, cobaya, mono o ser humano para producir anticuerpos policlonales. Si se desea, un antígeno puede conjugarse con una proteína portadora, tal como albúmina de suero bovino, tiroglobulina y hemocianina de lapa californiana. Dependiendo de las especies huésped pueden usarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvante de Freund, geles minerales (por ejemplo, hidróxido de aluminio) y sustancias tensioactivas (por ejemplo, lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa californiana y dinitrofenol). Entre los adyuvantes usados en seres humanos, BCG (bacillus de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum son especialmente útiles.

Los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a un antígeno pueden prepararse usando cualquier

técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a, la técnica de hibridomas, la técnica de hibridomas de linfocitos B humanos y la técnica de hibridomas de EBV (Kohler y col., Nature 256, 495 497, 1985; Kozbor y col., J Immunol. Methods 81, 31 42, 1985; Cote y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026 2030, 1983; Cole y col., Mol. Cell Biol. 62, 109 120, 1984).

Además, pueden usarse técnicas desarrolladas para la producción de “anticuerpos quiméricos,” el corte y empalme de genes de anticuerpos de ratón para genes de anticuerpo humano para obtener una molécula con especificidad por antígeno y actividad biológica apropiadas (Morrison y col., Proc. Natl.. Acad. Sci. 81, 6851 6855, 1984; Neuberger y col., Nature 312, 604 608, 1984; Takeda y col., Nature 314, 452 454, 1985). También pueden “humanizarse” anticuerpos monoclonales y otros para prevenir que un paciente organice una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo cuando se usa terapéuticamente. Tales anticuerpos pueden ser suficientemente similares en secuencia a los anticuerpos humanos que van a usarse directamente en terapia o pueden requerir la alteración de algunos residuos clave. Diferencias de secuencias entre anticuerpos de roedor y secuencias humanas pueden minimizarse sustituyendo residuos que se diferencian de aquellos en las secuencias humanas por mutagénesis dirigida a sitio de residuos individuales o injertando regiones determinantes de la complementariedad enteras.

Alternativamente, los anticuerpos humanizados pueden producirse usando procedimientos recombinantes, como se describe más adelante. Los anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno particular pueden contener sitios de unión a antígeno que son tanto parcialmente como están completamente humanizados, como se desvela en el documento U.S. 5.565.332.

Alternativamente, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios pueden adaptarse usando procedimientos conocidos en la técnica para producir anticuerpos monocatenarios que se unen específicamente a un antígeno particular. Los anticuerpos con especificidad relacionada, pero de composición idiotípica distinta, pueden generarse por barajado de cadenas de bibliotecas de inmunoglobulina combinatorias aleatorias (Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11120 23, 1991).

Los anticuerpos monocatenarios también pueden construirse usando un procedimiento de amplificación de ADN tal como PCR usando ADNc de hibridoma como molde (Thirion y col., 1996, Eur. J Cancer Prev. 5, 507-11). Los anticuerpos monocatenarios pueden ser mono- o biespecíficos, y pueden ser bivalentes o tetravalentes. La construcción de anticuerpos monocatenarios biespecíficos tetravalentes se enseña, por ejemplo, en Coloma & Morrison, Nat. Biotechnol. 15, 159-63, 1997. La construcción de anticuerpos monocatenarios biespecíficos bivalentes se enseña en Mallender & Voss, J. Biol. Chem. 269, 199-206, 1994.

Una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo monocatenario puede construirse usando síntesis de nucleótidos manual o automatizada, clonarse en una construcción de expresión usando procedimientos de ADN recombinante convencionales e introducirse en una célula para expresar la secuencia codificante, como se describe más adelante. Alternativamente, los anticuerpos monocatenarios pueden producirse directamente usando, por ejemplo, tecnología de fago filamentoso (Verhaar y col., Int. J. Cancer 61, 497-501, 1995; Nicholls y col., J. Immunol. Meth. 165, 81-91, 1993).

Los anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno particular también pueden producirse induciendo la producción in vivo en la población de linfocitos o cribando bibliotecas o paneles de inmunoglobulina de reactivos de unión altamente específicos como se desvela en la bibliografía (Orlandi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833 3837, 1989; Winter y col., Nature 349, 293 299, 1991).

Pueden construirse anticuerpos quiméricos como se desvela en el documento WO 93/03151. También pueden prepararse proteínas de unión que se derivan de inmunoglobulinas y que son multivalentes y multiespecíficas, tal como los “diacuerpos” descritos en el documento WO 94/13804.

Los anticuerpos pueden purificarse por procedimientos muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden purificarse por afinidad por paso sobre una columna a la que está unida el antígeno relevante. Los anticuerpos unidos pueden entonces eluirse de la columna usando un tampón con una alta concentración de sales.

Composiciones farmacéuticas

La invención también proporciona composiciones para su uso como medicamentos (por ejemplo, como composiciones inmunogénicas o vacunas). Las composiciones de la invención son útiles para prevenir y/o tratar enfermedad producida como resultado de infección por S. pyogenes y comprenden al menos un agente activo que puede ser un polipéptido, una molécula de ácido nucleico o un anticuerpo. Dicha enfermedad puede ser, por ejemplo, bacteremia, meningitis, fiebre puerperal, fiebre escarlata, erisipelas, faringitis, impétigo, fascitis necrotizante, miositis o síndrome de choque tóxico.

Las composiciones que contienen proteínas SLO mutantes son preferentemente composiciones inmunogénicas y son más preferentemente composiciones de vacuna. El pH de tales composiciones está preferentemente entre 6 y 8, preferentemente aproximadamente 7. El pH puede mantenerse por el uso de un tampón. La composición puede ser estéril y/o libre de pirógenos. La composición puede ser isotónica con respecto a los seres humanos.

Las vacunas según la invención pueden usarse tanto profilácticamente como terapéuticamente, pero normalmente serán profilácticas. Por consiguiente, la invención incluye un procedimiento para el tratamiento terapéutico o profiláctico de una infección por Streptococcus pyogenes. El animal es preferentemente un mamífero, lo más preferentemente un ser humano. Los procedimientos implican administrar al animal una cantidad terapéutica o profiláctica de las composiciones inmunogénicas de la invención.

Algunas composiciones de la invención comprenden una proteína SLO mutante de polipéptido como se describe en el presente documento. Otras composiciones de la invención comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica el (las) proteína(s) SLO mutante(s) y, opcionalmente, otros antígenos que pueden incluirse en la composición (véase más adelante). Véase, por ejemplo, Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunology 9:271283; Donnelly y col. (1997) Ann. Rev Immunol 15:617-648; Scott-Taylor & Dalgleish (2000) Expert Opin Investig Drugs 9:471-480; Apostolopoulos & Plebanski (2000) Curr Opin Mol Ther 2:441-447; Ilan (1999) Curr Opin Mol Ther 1:116-120; Dubensky y col. (2000) Mol Med 6:723-732; Robinson & Pertmer (2000) Adv Virus Res 55:1-74; Donnelly y col. (2000) Am J Respir Crit Care Med 162(4 Pt 2):S90-193; Davis (1999) Mt. Sinai J. Med. 66:84-90. Normalmente, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN, por ejemplo, en forma de un plásmido.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención pueden incluir uno o más agentes activos adicionales. Tales agentes incluyen, pero no se limitan a, (a) otra proteína SLO mutante de la invención, (b) un antígeno polipeptídico que es útil en una vacuna pediátrica, (c) un antígeno polipeptídico que es útil en una vacuna para ancianos o individuos inmunodeprimidos, (d) una molécula de ácido nucleico que codifica (a)-(c), y un anticuerpo que se une específicamente a (a)-(c).

Antígenos adicionales

Las composiciones de la invención pueden administrarse conjuntamente con uno o más antígenos adicionales para su uso en procedimientos terapéuticos o profilácticos de la presente invención. Antígenos adecuados incluyen aquellos enumerados más adelante. Adicionalmente, las composiciones de la presente invención pueden usarse para tratar o prevenir infecciones producidas por cualquiera de los patógenos enumerados más adelante. Además de la combinación con los antígenos descritos más adelante, las composiciones de la invención también pueden combinarse con un adyuvante como se describe en el presente documento.

Antígenos para su uso con la invención incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes antígenos expuestos más adelante, o antígenos derivados de uno o más de los patógenos expuestos más adelante:

A. Antígenos bacterianos

Antígenos bacterianos adecuados para su uso en la invención incluyen proteínas, polisacáridos, lipopolisacáridos y vesículas de la membrana externa que pueden aislarse, purificarse o derivarse de una bacteria. Además, los antígenos bacterianos pueden incluir lisados bacterianos y formulaciones de bacterias inactivadas. Los antígenos bacterianos pueden producirse por expresión recombinante. Los antígenos bacterianos incluyen preferentemente epítopes que se exponen sobre la superficie de la bacteria durante al menos una etapa de su ciclo vital. Los antígenos bacterianos se conservan preferentemente a través de múltiples serotipos. Los antígenos bacterianos incluyen antígenos derivados de una o más de las bacterias expuestas más adelante, además de los ejemplos de antígenos específicos identificados más adelante.

Neisseria meningitidis: los antígenos de Meningitidis pueden incluir proteínas (tales como aquellas identificadas en las referencias 1 - 7), sacáridos (incluyendo un polisacárido, oligosacárido o lipopolisacárido), o vesículas de la membrana externa [Referencias 8, 9, 10, 11] purificadas o derivadas de un serogrupo de N. meningitidis tal como A, C, W135, Y y/o B. Los antígenos de proteína de Meningitidis pueden seleccionarse de adhesinas, autotransportadores, toxinas, proteínas de adquisición de Fe y proteínas asociadas a la membrana (preferentemente proteínas integrales de membrana externa).

Streptococcus pneumoniae: los antígenos de Streptococcus pneumoniae pueden incluir un sacárido (incluyendo un polisacárido o un oligosacárido) y/o proteína de Streptococcus pneumoniae. Los antígenos de sacárido pueden seleccionarse de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F. Los antígenos de proteína pueden seleccionarse, por ejemplo, de una proteína identificada en los documentos WO 98/18931, WO 98/18930, la patente de EE.UU. nº 6.699.703, la patente de EE.UU. nº 6.800.744, los documentos WO 97/43303 y WO 97/37026. Las proteínas de Streptococcus pneumoniae pueden seleccionarse de la familia de la tríada de polihistidina (PhtX), la familia de proteínas de unión a colina (CbpX), truncados de CbpX, familia LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas de truncados de CbpX-truncados de LytX, neumolisina (Ply), PspA, PsaA, Sp128, Sp101, Sp130, Sp125 o Sp133.

Streptococcus pyogenes (Streptococcus del grupo A): los antígenos de Streptococcus del grupo A pueden incluir una proteína identificada en los documentos WO 02/34771 o WO 2005/032582 (incluyendo, pero no se limitan a, GAS39 (spy0266; gi-15674446), GAS40 (spy0269; gi-15674449), GAS42 (spy0287; gi-15674461), GAS45 (M5005_spy0249; gi-71910063), GAS57 (spy0416; gi-15674549), GAS58 (spy0430; gi-15674556), GAS84 (spy1274; gi-15675229), GAS95 (spy1733; gi-15675582), GAS117 (spy0448; gi-15674571), GAS130 (spy0591; gi-15674677), GAS137 (spy0652; gi-15674720), GAS159 (spy1105; gi-15675088), GAS193 (spy2025; gi-15675802), GAS202

(spy1309; gi-15675258), GAS217 (spy0925; gi-15674945), GAS236 (spy1126; gi-15675106), GAS253 (spy1524; gi15675423), GAS277 (spy1939; gi-15675742), GAS294 (spy1173; gi-15675145), GAS309 (spy0124; gi-15674341), GAS366 (spy1525; gi-15675424), GAS372 (spy1625; gi-15675501), GAS384 (spy1874; gi-15675693), GAS389 (spy1981; gi-15675772), GAS504 (spy1751; gi-15675600), GAS509 (spy1618; gi-15675496), GAS290 (spy1959; gi15675757), GAS511 (spy1743; gi-15675592), GAS527 (spy1204; gi-15675169), GAS529 (spy1280; gi-15675233), y GAS533 (spy1877; gi-15675696)), fusiones de fragmentos de proteínas GAS M (incluyendo aquellas descritas en el documento WO 02/094851, y Dale, Vaccine (1999) 17:193-200, y Dale, Vaccine 14(10): 944-948), proteína de unión a fibronectina (Sfb1), proteína asociada a hemo estreptocócico (Shp) y estreptolisina S (SagA). Otros antígenos de GAS incluyen GAS68 (Spy0163; gi13621456), GAS84 (Spy1274; gi13622398), GAS88 (Spy1361; gi13622470), GAS89 (Spy1390; gi13622493), GAS98 (Spy1882; gi13622916), GAS99 (Spy1979; gi13622993), GAS102 (Spy2016, gi13623025), GAS146 (Spy0763; gi13621942), GAS 195 (Spy2043; gi13623043), GAS561 (Spy1134; gi13622269), GAS 179 (Spy1718, gi13622773) y GAS681 (spy1152; gi1362228).

Moraxella catarrhalis: los antígenos de Moraxella incluyen antígenos identificados en los documentos WO 02/18595 y WO 99/58562, antígenos de proteína de membrana externa (HMW-OMP), antígeno C y/o LPS.

Bordetella pertussis: los antígenos de Pertussis incluyen holotoxina de pertussis (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3.

Staphylococcus aureus: los antígenos de Staphylococcus aureus incluyen polisacáridos capsulares de tipo 5 y 8 de

S. aureus opcionalmente conjugados con exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa recombinante no tóxica tal como StaphVAX™, o antígenos derivados de proteínas de superficie, invasinas (leucocidina, cinasas, hialuronidasa), factores de superficie que inhiben la asfixia fagocítica (cápsula, proteína A), carotenoides, producción de catalasa, proteína A, coagulasa, factor de coagulación y/o toxinas que dañan la membrana (opcionalmente desintoxicadas) que lisan membranas de células eucariotas (hemolisinas, leucotoxina, leucocidina).

Staphylococcus epidermidis: los antígenos de S. epidermidis incluyen antígeno asociado a cieno (SAA).

Clostridium tetani (tétanos): los antígenos del tétanos incluyen toxoide tetánico (TT), usado preferentemente como una proteína portadora junto con/conjugada con las composiciones de la presente invención.

Corynebacterium diphtheriae (difteria): los antígenos de la difteria incluyen toxina diftérica, preferentemente desintoxicados, tales como CRM197. Antígenos adicionales que pueden modular, inhibir o asociarse a una ribosilación de ADP se contemplan para la combinación/coadministración/conjugación con las composiciones de la presente invención. Los toxoides de la difteria pueden usarse como proteínas portadoras.

Haemophilus influenzae B (Hib): los antígenos de Hib incluyen un antígeno de sacárido de Hib.

Pseudomonas aeruginosa: los antígenos de Pseudomonas incluyen endotoxina A, proteína Wzz, LPS de P. aeruginosa, más particularmente LPS aislada de PAO1 (serotipo O5) y/o proteínas de membrana externa, que incluyen proteínas F de membrana externa (OprF) (Infect Immun. 2001 May; 69(5):3510-3515).

Legionella pneumophila: los antígenos bacterianos pueden derivarse de Legionella pneumophila.

Streptococcus agalactiae (Streptococcus del grupo B): los antígenos de Streptococcus del grupo B incluyen un antígeno de proteína o de sacárido identificado en los documentos WO 02/34771, WO 03/093306, WO 04/041157 o WO 2005/002619 (que incluye proteínas GBS 80, GBS 104, GBS 276 y GBS 322, y que incluye antígenos de sacárido derivados de los serotipos Ia, Ib, Ia/c, II, III, IV, V, VI, VII y VIII).

Neisseria gonorrhoeae: los antígenos de gonorrhoeae incluyen proteína Por (o porina) tal como PorB (véase Zhu y col., Vaccine (2004) 22:660 - 669), una proteína de unión a transferrina tal como TbpA y TbpB (véase Price y col., Infection and Immunity (2004) 71(1):277 - 283), una proteína de opacidad (tal como Opa), una proteína modificable por reducción (Rmp) y preparaciones de vesículas de la membrana externa (OMV) (véase Plante y col., J Infectious Disease (2000) 182:848 - 855), véanse también, por ejemplo, los documentos WO99/24578, WO99/36544, WO99/57280, WO02/079243).

Chlamydia trachomatis: los antígenos de Chlamydia trachomatis incluyen antígenos derivados de los serotipos A, B, Ba y C (agentes de tracoma, una causa de ceguera), serotipos L1, L2 y L3 (asociados a linfogranuloma venéreo) y serotipos, D-K. Los antígenos de Chlamydia trachomatis también pueden incluir un antígeno identificado en los documentos WO 00/37494, WO 03/049762, WO 03/068811 o WO 05/002619 que incluye PepA (CT045), LcrE (CT089), ArtJ (CT381), ADNK (CT396), CT398, similar a OmpH (CT242), L7/L12 (CT316), OmcA (CT444), AtosS (CT467), CT547, Eno (CT587), HrtA (CT823) y MurG (CT761).

Treponema pallidum (sífilis): los antígenos de la sífilis incluyen el antígeno TmpA.

Haemophilus ducreyi (que produce chancroide): los antígenos de Ducreyi incluyen proteína de membrana externa (DsrA).

Enterococcus faecalis o Enterococcus faecium: los antígenos incluyen una repetición de trisacáridos u otros antígenos derivados de Enterococcus proporcionados en la patente de EE.UU. nº 6.756.361.

Helicobacter pylori: los antígenos de H. pylori incluyen Cag, Vac, Nap, HopX, HopY y/o antígeno de ureasa.

Staphylococcus saprophyticus: los antígenos incluyen la hemaglutinina de 160 kDa del antígeno de S. saprophyticus.

Yersinia enterocolitica: los antígenos incluyen LPS (Infect Immun. 2002 August; 70(8): 4414).

E. coli: los antígenos de E. coli pueden derivarse de cepas de E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteroagregativa (EAggEC), E. coli difusamente adherente (DAEC), E. coli enteropatogénica (EPEC) y/o E. coli enterohemorrágica (EHEC).

Bacillus anthracis (ántrax): los antígenos de B. anthracis están opcionalmente desintoxicados y puede seleccionarse de componentes A (factor letal (LF) y factor de edema (EF)), ambos de los cuales pueden compartir un componente B común conocido como antígeno protector (PA).

Yersinia pestis (plaga): los antígenos de plagas incluyen antígeno capsular F1 (Infect Immun. 2003 Jan; 71(1)): 374383, LPS (Infect Immun. 1999 Oct; 67(10): 5395), antígeno V de Yersinia pestis (Infect Immun. 1997 Nov; 65(11): 4476-4482).

Mycobacterium tuberculosis: los antígenos de Tuberculosis incluyen lipoproteínas, LPS, antígenos BCG, una proteína de fusión de antígeno 85B (Ag85B) y/o ESAT-6 opcionalmente formulado en vesículas de lípido catiónico (Infect Immun. 2004 October; 72(10): 6148), antígenos asociados a isocitrato deshidrogenasa de Mycobacterium tuberculosis (Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Aug 24; 101(34): 12652) y/o antígenos de MPT51 (Infect Immun. 2004 July; 72(7): 3829).

Rickettsia: los antígenos incluyen proteínas de membrana externa que incluyen la proteína de membrana externa A y/o B (OmpB) (Biochim Biophys Acta. 2004 Nov 1; 1702(2):145), LPS y antígeno de proteína de superficie (SPA) (J Autoimmun. 1989 Jun; 2 Suppl:81).

Listeria monocytogenes: los antígenos bacterianos pueden derivarse de Listeria monocytogenes.

Chlamydia pneumoniae: los antígenos incluyen aquellos identificados en el documento WO 02/02606.

Vibrio cholerae: los antígenos incluyen antígenos de proteinasa, LPS, particularmente lipopolisacáridos de Vibrio cholerae II, polisacáridos O-específicos O1 Inaba, V. cholera O139, antígenos de la vacuna IEM108 (Infect Immun. 2003 Oct;71(10):5498-504) y/o toxina de Zonula occludens (Zot).

Salmonella typhi (fiebre tifoidea): los antígenos incluyen polisacáridos capsulares preferentemente conjugados (Vi, por ejemplo, vax-TyVi).

Borrelia burgdorferi (enfermedad de Lyme): los antígenos incluyen lipoproteínas (tales como OspA, OspB, Osp C y Osp D), otras proteínas de superficie tales como proteínas relacionadas con OspE (Erps), proteínas de unión a decorina (tales como DbpA) y proteínas VI antigénicamente variables tales como antígenos asociados a P39 y P13 (una proteína de membrana integral, Infect Immun. 2001 May; 69(5): 3323-3334) y proteína de variación antigénica VIsE J Clin Microbiol. 1999 Dec; 37(12): 3997).

Porphyromonas gingivalis: los antígenos incluyen la proteína de membrana externa (OMP).

Klebsiella: los antígenos incluyen una OMP, que incluye OMP A, o un polisacárido opcionalmente conjugado con toxoide tetánico.

Otros antígenos bacterianos de la invención pueden ser antígenos capsulares, antígenos de polisacárido o antígenos de proteína de cualquiera de los anteriores. Otros antígenos bacterianos también pueden incluir una preparación de vesículas de la membrana externa (OMV). Adicionalmente, los antígenos incluyen versiones vivas, atenuadas y/o purificadas de cualquiera de las bacterias anteriormente mencionadas. Los antígenos de la presente invención pueden derivarse de bacterias Gram-negativas o Gram-positivas. Los antígenos de la presente invención pueden derivarse de bacterias aerobias o anaerobias.

Adicionalmente, cualquiera de los sacáridos derivados de bacterianos anteriores (polisacáridos, LPS, LOS u oligosacáridos) puede conjugarse con otro agente o antígeno tal como una proteína portadora (por ejemplo, CRM197). Tal conjugación puede ser conjugación directa efectuada por la aminación reductora de restos carbonilo sobre los grupos sacárido con respecto a amino sobre la proteína, como se proporciona en la patente de EE.UU. nº

5.360.897 y Can J Biochem Cell Biol. 1984 May;62(5):270-5. Alternativamente, los sacáridos pueden conjugarse mediante un ligador tal como con succinamida u otros enlaces proporcionados en Bioconjugate Techniques, 1996 y CRC, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, 1993.

B. Antígenos víricos

Antígenos víricos adecuados para uso en la invención incluyen virus inactivados (o destruidos), virus atenuados, formulaciones de virus fraccionados, formulaciones de subunidades purificadas, proteínas víricas que pueden aislarse, purificarse o derivarse de un virus, y partículas similares a virus (VLP). Los antígenos víricos pueden derivarse de virus propagados en cultivo celular u otro sustrato. Alternativamente, los antígenos víricos pueden expresarse recombinantemente. Los antígenos víricos incluyen preferentemente epítopes que se exponen sobre la superficie del virus durante al menos una fase de su ciclo vital. Los antígenos víricos se conservan preferentemente a través de múltiples serotipos o cepas aisladas. Los antígenos víricos incluyen antígenos derivados de uno o más de los virus expuestos a continuación, además de los ejemplos de antígenos específicos identificados a continuación.

Ortomixovirus: los antígenos víricos pueden derivarse de un ortomixovirus tal como la gripe A, B y C. Los antígenos de ortomixovirus pueden seleccionarse de una o más de las proteínas víricas que incluyen hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA), nucleoproteína (NP), proteína de matriz (M1), proteína de membrana (M2), uno o más de los componentes de transcriptasa (PB1, PB2 y PA). Los antígenos preferidos incluyen HA y NA.

Los antígenos de la gripe pueden derivarse de cepas de gripe interpandémica (anuales). Alternativamente, los antígenos de la gripe pueden derivarse de cepas con la posibilidad de producir un brote pandémico (es decir, cepas de gripe con nueva hemaglutinina en comparación con la hemaglutinina en cepas actualmente en circulación, o cepas de gripe que son patogénicas en sujetos aviares y tienen la posibilidad de transmitirse horizontalmente en la población humana, o cepas de gripe que son patogénicas para seres humanos).

Virus Paramyxoviridae: los antígenos víricos pueden derivarse de virus Paramyxoviridae tales como pneumovirus (RSV), paramixovirus (PIV) y morbillivirus (sarampión).

Pneumovirus: los antígenos víricos pueden derivarse de un pneumovirus tal como el virus sincicial respiratorio (VSR), virus sincicial respiratorio bovino, virus de la neumonía de ratones y virus de la rinotraqueítis del pavo. Preferentemente, el pneumovirus es VSR. Los antígenos de pneumovirus pueden seleccionarse de una o más de las siguientes proteínas que incluyen las proteínas de superficie fusión (F), glucoproteína (G) y proteína hidrófoba pequeña (SH), proteínas de matriz M y M2, proteínas de nucleocápside N, P y L y proteínas no estructurales NS1 y NS2. Los antígenos de pneumovirus preferidos incluyen F, G y M. Véase, por ejemplo, J Gen Virol. 2004 Nov; 85(Pt 11):3229). Los antígenos de pneumovirus también pueden formularse en o derivarse de virus quiméricos. Por ejemplo, los virus quiméricos VSR/PIV pueden comprender componentes de tanto VSR como PIV.

Paramixovirus: los antígenos víricos pueden derivarse de un paramixovirus tal como los tipos 1-4 del virus paragripal (PIV), paperas, virus de Sendai, virus simio 5, virus paragripal bovino y virus de la enfermedad de Newcastle. Preferentemente, el paramixovirus es PIV o paperas. Los antígenos de paramixovirus pueden seleccionarse de una

o más de las siguientes proteínas: hemaglutinina-neuraminidasa (HN), proteínas de fusión F1 y F2, nucleoproteína (NP), fosfoproteína (P), proteína grande (L) y proteína de matriz (M). Las proteínas de paramixovirus preferidas incluyen HN, F1 y F2. Los antígenos de paramixovirus también pueden formularse en o derivarse de virus quiméricos. Por ejemplo, los virus quiméricos VSR/PIV pueden comprender componentes de tanto VSR como PIV. Las vacunas contra la paperas comercialmente disponibles incluyen virus de las paperas atenuado vivo en tanto una forma monovalente como en combinación con vacunas contra el sarampión y la rubeola (MMR).

Morbillivirus: los antígenos víricos pueden derivarse de un morbillivirus tal como el sarampión. Los antígenos de morbillivirus pueden seleccionarse de una o más de las siguientes proteínas: hemaglutinina (H), glucoproteína (G), factor de fusión (F), proteína grande (L), nucleoproteína (NP), polimerasa fosfoproteína (P) y matriz (M). Las vacunas contra el sarampión comercialmente disponibles incluyen virus del sarampión atenuado vivo, normalmente en combinación con paperas y rubeola (MMR).

Picornavirus: los antígenos víricos pueden derivarse de picornavirus tales como enterovirus, rinovirus, heparnavirus, cardiovirus y aftovirus. Se prefieren antígenos derivados de enterovirus tales como virus de la poliomielitis.

Enterovirus: los antígenos víricos pueden derivarse de un enterovirus tal como los tipos 1, 2 ó 3 del virus de la poliomielitis, tipos 1 a 22 y 24 del virus Coxsackie A, tipos 1 a 6 del virus Coxsackie B, tipos 1 a 9, 11 a 27 y 29 a 34 de ecovirus (virus ECHO) y enterovirus 68 a 71. Preferentemente, el enterovirus es el virus de la poliomielitis. Los antígenos de enterovirus se seleccionan preferentemente de una o más de las siguientes proteínas de cápside VP1, VP2, VP3 y VP4. Las vacunas contra la poliomielitis comercialmente disponibles incluyen vacuna contra la poliomielitis inactivada (IPV) y vacuna oral contra el virus de la poliomielitis (OPV).

Heparnavirus: los antígenos víricos pueden derivarse de un heparnavirus tal como virus de la hepatitis A (VHA). Las vacunas contra el VHA comercialmente disponibles incluyen vacuna contra el VHA inactivado.

Togavirus: los antígenos víricos pueden derivarse de un togavirus tal como un rubivirus, un alfavirus o un arterivirus. Se prefieren antígenos derivados de rubivirus tales como el virus de la rubeola. Los antígenos de togavirus pueden seleccionarse de E1, E2, E3, C, NSP-1, NSPO-2, NSP-3 o NSP-4. Los antígenos de togavirus se seleccionan preferentemente de E1, E2 o E3. Las vacunas contra la rubeola comercialmente disponibles incluyen un virus

adaptado al frío vivo, normalmente en combinación con vacunas contra las paperas y el sarampión (MMR).

Flavivirus: los antígenos víricos pueden derivarse de un flavivirus tal como la encefalitis transmitida por garrapatas (ETG), el dengue (tipos 1, 2, 3 ó 4), fiebre amarilla, encefalitis japonesa, encefalitis del Nilo occidental, encefalitis de San Luis, encefalitis rusa de primavera-verano, encefalitis de Powassan. Los antígenos de flavivirus pueden seleccionarse de PrM, M, C, E, NS-1, NS-2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b y NS5. Los antígenos de flavivirus se seleccionan preferentemente de PrM, M y E. La vacuna contra la ETG comercialmente disponible incluye vacunas de virus inactivados.

Pestivirus: los antígenos víricos pueden derivarse de un pestivirus tal como diarrea viral bovina (DVB), peste porcina clásica (PPC) o enfermedad de Border (BDV).

Hepadnavirus: los antígenos víricos pueden derivarse de un hepadnavirus tal como virus de la hepatitis B. Los antígenos de hepadnavirus pueden seleccionarse de antígenos de superficie (L, M y S), antígenos de núcleo (HBc, HBe). Las vacunas contra el VHB comercialmente disponibles incluyen vacunas de subunidades que comprenden el antígeno de superficie proteína S.

Virus de la hepatitis C: los antígenos víricos pueden derivarse de un virus de la hepatitis C (VHC). Los antígenos del VHC pueden seleccionarse de uno o más de la poliproteína E1, E2, E1/E2, NS345, poliproteína del núcleo NS 345, núcleo y/o péptidos de las regiones no estructurales (Houghton y col., Hepatology (1991) 14:381).

Rabdovirus: los antígenos víricos pueden derivarse de un rabdovirus tal como un lyssavirus (virus de la rabia) y vesiculovirus (VSV). Los antígenos de rabdovirus pueden seleccionarse de glucoproteína (G), nucleoproteína (N), proteína grande (L), proteínas no estructurales (NS). Las vacunas contra el virus de la rabia comercialmente disponibles comprenden virus destruidos cultivados en células diploides humanas o células de pulmón de rhesus fetal.

Caliciviridae: los antígenos víricos pueden derivarse de Calciviridae tales como virus Norwalk y virus similares a Norwalk tales como el virus de Hawai y el virus de las montañas nevadas.

Coronavirus: los antígenos víricos pueden derivarse de un coronavirus, SARS, coronavirus respiratorio humano, bronquitis infecciosa aviar (BIA), virus de la hepatitis del ratón (VHR) y virus de la gastroenteritis porcina transmisible (VGPT). Los antígenos de coronavirus pueden seleccionarse de glicoproteína de la espícula (S), de la envuelta (E), de matriz (M), de nucleocápside (N) y de hemaglutinina-esterasa (HE). Preferentemente, el antígeno de coronavirus se deriva de un virus de SARS. Los antígenos víricos de SARS se describen en el documento WO 04/92360.

Retrovirus: los antígenos víricos pueden derivarse de un retrovirus tal como un oncovirus, un lentivirus o un espumavirus. Los antígenos de oncovirus pueden derivarse de HTLV-1, HTLV-2 o HTLV-5. Los antígenos de lentivirus pueden derivarse de VIH-1 o VIH-2. Los antígenos de retrovirus pueden seleccionarse de gag, pol, env, tax, tat, rex, rev, nef, vif, vpu y vpr. Los antígenos de VIH pueden seleccionarse de gag (p24 gag y p55 gag), env (gp160 y gp41), pol, tat, nef, rev vpu, miniproteínas, (preferentemente p55 gag y gp140v delete). Los antígenos de VIH pueden derivarse de una o más de las siguientes cepas: VIHIIIb, VIHSF2, VIHLAV, VIHLAI, VIHMN, VIH-ICM235, VIH-1US4.

Reovirus: los antígenos víricos pueden derivarse de un reovirus tal como un ortoreovirus, un rotavirus, un orbivirus o un coltivirus. Los antígenos de reovirus pueden seleccionarse de proteínas estructurales A1, A2, A3, µ1, µ2, 01, 02, o 03, o proteínas no estructurales 0NS, µNS o 01s. Los antígenos de reovirus preferidos pueden derivarse de un rotavirus. Los antígenos de rotavirus pueden seleccionarse de VP1, VP2, VP3, VP4 (o el producto escindido VP5 y VP8), NSP 1, VP6, NSP3, NSP2, VP7, NSP4 o NSP5. Los antígenos de rotavirus preferidos incluyen VP4 (o el producto escindido VP5 y VP8) y VP7.

Parvovirus: los antígenos víricos pueden derivarse de un parvovirus tal como el parvovirus B19. Los antígenos de parvovirus pueden seleccionarse de VP-1, VP-2, VP-3, NS-1 y NS-2. Preferentemente, el antígeno de parvovirus es la proteína de la cápside VP-2.

Virus de la hepatitis delta (VHD): los antígenos víricos pueden derivarse de VHD, particularmente el antígeno δ del VHD (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.378.814).

Virus de la hepatitis E (VHE): los antígenos víricos pueden derivarse de VHE.

Virus de la hepatitis G (VHG): los antígenos víricos pueden derivarse de VHG.

Virus del herpes humano: los antígenos víricos pueden derivarse de un virus del herpes humano tal como el virus del herpes simple (VHS), virus de la varicela-zóster (VVZ), virus de Epstein-Barr (VEB), citomegalovirus (CMV), virus del herpes humano 6 (VHH6), virus del herpes humano 7 (VHH7) y virus del herpes humano 8 (VHH8). Los antígenos del virus del herpes humano pueden seleccionarse de proteínas inmediatas tempranas (α), proteínas tempranas (β) y proteínas tardías (γ). Los antígenos del VHS pueden derivarse de cepas de VHS-1 o VHS-2. Los antígenos del VHS pueden seleccionarse de glicoproteínas gB, gC, gD y gH, proteína de fusión (gB) o proteínas de inmunoescape

(gC, gE o gI). Los antígenos del VVZ pueden seleccionarse de proteínas de núcleo, de nucleocápside, del tegumento o de la envuelta. Una vacuna contra el VVZ atenuado vivo está comercialmente disponible. Los antígenos del VEB pueden seleccionarse de proteínas de antígeno temprano (EA), antígeno de la cápside viral (VCA) y glicoproteínas del antígeno de membrana (MA). Los antígenos de CMV pueden seleccionarse de proteínas de la cápside, glicoproteínas de la envuelta (tales como gB y gH) y proteínas del tegumento

Papovavirus: los antígenos pueden derivarse de papovavirus tales como el virus del papiloma y el virus del polioma. Los virus del papiloma incluyen los serotipos de VPH 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 y 65. Preferentemente, los antígenos del VPH se derivan de los serotipos 6, 11, 16 ó 18. Los antígenos del VPH pueden seleccionarse de proteínas de la cápside (L1) y (L2), o E1 - E7, o fusiones de las mismas. Los antígenos del VPH se formulan preferentemente en partículas similares a virus (VLP). Los virus del polioma incluyen virus BK y virus JK. Los antígenos del virus del polioma pueden seleccionarse de VP 1, VP2 o VP3.

Adicionalmente se proporcionan antígenos, composiciones, procedimientos y microbios incluidos en Vaccines, 4ª edición (Plotkin y Orenstein ed. 2004); Medical Microbiology 4ª edición (Murray y col. ed. 2002); Virology, 3ª edición

(W.K.

Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2ª edición (B.N. Fields y D.M. Knipe, eds. 1991), que se contemplan conjuntamente con las composiciones de la presente invención.

C.

Antígenos fúngicos

Los antígenos fúngicos para uso en la invención pueden derivarse de uno o más de los hongos expuestos a continuación.

Los antígenos fúngicos pueden derivarse de dermatofitos, que incluyen: Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum y/o Trichophyton faviforme

Los patógenos fúngicos pueden derivarse de Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp., Alternaria spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp. y Cladosporium spp.

Los procedimientos para producir un antígeno fúngico son muy conocidos en la técnica (véase la patente de EE.UU. nº 6.333.164). En un procedimiento preferido, una fracción solubilizada se extrae y se separa de una fracción insoluble que puede obtenerse a partir de células fúngicas de las cuales se ha eliminado sustancialmente o al menos se ha eliminado parcialmente la pared celular, caracterizado porque el procedimiento comprende las etapas de: obtener células fúngicas vivas; obtener células fúngicas de las cuales se ha eliminado sustancialmente o al menos se ha eliminado parcialmente la pared celular; romper las células fúngicas de las cuales se ha eliminado sustancialmente o al menos se ha eliminado parcialmente la pared celular; obtener una fracción insoluble; y extraer y separar una fracción solubilizada de la fracción insoluble.

D. Antígenos de ETS

Las composiciones de la invención pueden incluir uno o más antígenos derivados de una enfermedad de transmisión sexual (ETS). Tales antígenos pueden proporcionar profilaxis o terapia para ETS tales como clamidia, herpes genital, hepatitis (tal como VHC), condilomas acuminados, gonorrea, sífilis y/o chancroide (véase el documento WO00/15255). Los antígenos pueden derivarse de una o más ETS bacterianas o víricas. Los antígenos de ETS víricas para uso en la invención pueden derivarse de, por ejemplo, VIH, virus del herpes simple (VHS-1 y VHS-2), virus del papiloma humano (VPH) y hepatitis (VHC). Los antígenos de ETS bacterianas para uso en la invención pueden derivarse de, por ejemplo, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Haemophilus ducreyi, E. coli y Streptococcus agalactiae. Ejemplos de antígenos específicos derivados de estos patógenos se han descrito anteriormente.

E. Antígenos respiratorios

Las composiciones de la invención pueden incluir uno o más antígenos derivados de un patógeno que produce enfermedad respiratoria. Por ejemplo, antígenos respiratorios pueden derivarse de un virus respiratorio tal como

ortomixovirus (gripe), pneumovirus (RSV), paramixovirus (PIV), morbillivirus (sarampión), togavirus (rubeola), VVZ y coronavirus (SARS). Los antígenos respiratorios pueden derivarse de una bacteria que produce enfermedad respiratoria tal como Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Bacillus anthracis y Moraxella catarrhalis. Ejemplos de antígenos específicos derivados de estos patógenos se han descrito anteriormente.

F. Antígenos de vacunas pediátricas

Las composiciones de la invención pueden incluir uno o más antígenos adecuados para uso en sujetos pediátricos. Los sujetos pediátricos tienen normalmente menos de aproximadamente 3 años, o menos de aproximadamente 2 años, o menos de aproximadamente 1 año. Los antígenos pediátricos pueden administrarse múltiples veces durante el transcurso de 6 meses, 1, 2 ó 3 años. Los antígenos pediátricos pueden derivarse de un virus que puede elegir como diana poblaciones pediátricas y/o un virus al que las poblaciones pediátricas son susceptibles de ser infectadas. Los antígenos víricos pediátricos incluyen antígenos derivados de uno o más de ortomixovirus (gripe), pneumovirus (RSV), paramixovirus (PIV y paperas), morbillivirus (sarampión), togavirus (rubeola), enterovirus (poliomielitis), VHB, coronavirus (SARS) y virus de la varicela-zóster (VVZ), virus de Epstein Barr (VEB). Los antígenos bacterianos pediátricos incluyen antígenos derivados de uno o más de Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pyogenes (Streptococcus del grupo A), Moraxella catarrhalis, Bordetella pertussis, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani (tétanos), Corynebacterium diphtheriae (difteria), Haemophilus influenzae B (Hib), Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus agalactiae (Streptococcus del grupo B) y E. coli. Ejemplos de antígenos específicos derivados de estos patógenos se han descrito anteriormente.

G. Antígenos adecuados para uso en ancianos o individuos inmunodeprimidos

Las composiciones de la invención pueden incluir uno o más antígenos adecuados para uso en ancianos o individuos inmunodeprimidos. Tales individuos pueden necesitar ser vacunados más frecuentemente, con mayores dosis o con formulaciones complementarias para mejorar su respuesta inmunitaria a los antígenos elegidos como diana. Los antígenos que pueden elegirse como diana para uso en ancianos o individuos inmunodeprimidos incluyen antígenos derivados de uno o más de los siguientes patógenos: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes (Streptococcus del grupo A), Moraxella catarrhalis, Bordetella pertussis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Clostridium tetani (tétanos), Corynebacterium diphtheriae (difteria), Haemophilus influenzae B (Hib), Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Streptococcus agalactiae (Streptococcus del grupo B), Enterococcus faecalis, Helicobacter pilori, Chlamydia pneumoniae, ortomixovirus (gripe), pneumovirus (RSV), paramixovirus (PIV y paperas), morbillivirus (sarampión), togavirus (Rubeola), enterovirus (polio), VHB, coronavirus (SARS), virus de la varicela-zóster (VVZ), virus de Epstein Barr (VEB), citomegalovirus (CMV). Ejemplos de antígenos específicos derivados de estos patógenos se han descrito anteriormente.

H. Antígenos adecuados para uso en vacunas para adolescentes

Las composiciones de la invención pueden incluir uno o más antígenos adecuados para uso en sujetos adolescentes. Los adolescentes pueden estar en necesidad de un refuerzo de un antígeno pediátrico previamente administrado. Los antígenos pediátricos que pueden ser adecuados para uso en adolescentes se han descrito anteriormente. Además, los adolescentes pueden elegirse como diana para recibir antígenos derivados de un patógeno de ETS con el fin de garantizar inmunidad protectora o terapéutica antes del comienzo de la actividad sexual. Los antígenos de ETS que pueden ser adecuados para uso en adolescentes se han descrito anteriormente.

I. Formulaciones de antígeno

En otros aspectos de la invención se proporcionan procedimientos de producción de micropartículas que tienen antígenos adsorbidos. Los procedimientos comprenden: (a) proporcionar una emulsión dispersando una mezcla que comprende (i) agua, (ii) un detergente, (iii) un disolvente orgánico y (iv) un polímero biodegradable seleccionado del grupo que está constituido por un poli(α-hidroxiácido), un ácido polihidroxibutírico, una policaprolactona, un poliortoéster, un polianhídrido y un policianoacrilato. El polímero está normalmente presente en la mezcla a una concentración de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 30 % con respecto al disolvente orgánico, mientras que el detergente está normalmente presente en la mezcla a una relación de detergente con respecto a polímero en peso/peso de aproximadamente 0,00001:1 a aproximadamente 0,1:1 (más normalmente aproximadamente 0,0001:1 a aproximadamente 0,1:1, aproximadamente 0,001:1 a aproximadamente 0,1:1, o aproximadamente 0,005:1 a aproximadamente 0,1:1); (b) eliminar el disolvente orgánico de la emulsión; y (c) adsorber un antígeno sobre la superficie de las micropartículas. En ciertas realizaciones, el polímero biodegradable está presente a una concentración de aproximadamente el 3 % a aproximadamente el 10 % con respecto al disolvente orgánico.

Las micropartículas para uso en este documento se formarán a partir de materiales que son esterilizables, no tóxicos y biodegradables. Tales materiales incluyen, sin limitación, poli(α-hidroxiácido), ácido polihidroxibutírico, policaprolactona, poliortoéster, polianhídrido, PACA y policianoacrilato. Preferentemente, las micropartículas para uso con la presente invención se derivan de un poli(α-hidroxiácido), en particular de una poli(lactida) (“PLA”) o un copolímero de D,L-lactida y glicolida o ácido glicólico, tal como una poli(D,L-lactida-co-glicolida) (“PLG” o “PLGA”), o

un copolímero de D,L-lactida y caprolactona. Las micropartículas pueden derivarse de cualquiera de diversos materiales de partida poliméricos que tienen una variedad de pesos moleculares y, en el caso de los copolímeros tales como PLG, una variedad de relaciones de lactida:glicolida cuya selección será ampliamente un asunto de elección que depende en parte de la macromolécula coadministrada. Estos parámetros se tratan más completamente más adelante.

Otros antígenos también pueden incluir una preparación de vesícula de membrana externa (OMV).

Procedimientos de formulación adicionales y antígenos (especialmente antígenos tumorales) se proporcionan en la patente de EE.UU. nº de serie 09/581772.

J. Referencias de antígenos

Las siguientes referencias incluyen antígenos útiles conjuntamente con las composiciones de la presente invención:

1.

Solicitud de patente internacional WO99/24578

2.

Solicitud de patente internacional WO99/36544.

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Solicitud de patente internacional WO99/57280.

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Kuroda y col. (2001) Lancet 357(9264):1225-1240; véanse también las páginas 1218-1219.

47.

Ramsay y col. (2001) Lancet 357(9251):195-196.

48.

Lindberg (1999) Vacuna 17 Suppl 2:S28-36.

49.

Buttery & Moxon (2000) J R Coil Physicians Long 34:163-168.

50.

Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13:113-133, vii.

51.

Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47:663-567.

52.

Patente europea 0 477 508.

53.

Patente de EE.UU. nº 5.306.492.

54.

Solicitud de patente internacional WO98/42721.

55.

Conjugate Vaccines (eds. Cruse y col.) ISBN 3805549326, particularmente vol. 10:48-114.

56.

Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques ISBN: 012323368 y 012342335X.

57.

Solicitud de patente europea 0372501.

58.

Solicitud de patente europea 0378881.

59.

Solicitud de patente europea 0427347.

60.

Solicitud de patente internacional WO93/17712.

61.

Solicitud de patente internacional WO98/58668.

62.

Solicitud de patente europea 0471177.

63.

Solicitud de patente internacional WO00/56360.

64.

Solicitud de patente internacional WO00/67161.

Si se usa un antígeno de sacárido o de hidrato de carbono, está preferentemente conjugado con una proteína portadora con el fin de potenciar la inmunogenicidad. Véanse Ramsay y col. (2001) Lancet 357(9251):195-196; Lindberg (1999) Vaccine 17 Suppl 2:S28-36; Buttery & Moxon (2000) J R Coll Physicians Lond 34:163-168; Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13:113-133, vii; Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47:563-567; patente europea 0 477 508; patente de EE.UU. 5,306,492; documento WO98/42721; Conjugate Vaccines (eds. Cruse y col.) ISBN 3805549326, particularmente vol. 10:48-114; Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques ISBN: 0123423368 o 012342335X. Proteínas portadoras preferidas son toxinas o toxoides bacterianos tales como toxoide de la difteria o tetánico. El toxoide diftérico CRM197 es particularmente preferido.

Otros polipéptidos portadores incluyen la proteína de la membrana externa de N. meningitidis (documento EP-A0372501), péptidos sintéticos (documentos EP-A-0378881 y EP-A 0427347), proteínas de choque térmico (documentos WO 93/17712 y WO 94/03208), proteínas de pertussis (documentos WO 98/58668 y EP A 0471177), proteína D de H. influenzae (documento WO 00/56360), citocinas (documento WO 91/01146), linfocinas, hormonas, factores de crecimiento, toxina A o B de C. difficile (documento WO 00/61761), proteínas de captación de hierro (documento WO 01/72337), etc. Si una mezcla comprende sacárido capsular de tanto los serogrupos A como C, puede preferirse que la relación (peso/peso) de sacárido MenA:sacárido MenC sea superior a 1 (por ejemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o superior). Pueden conjugarse diferentes sacáridos con el mismo tipo de proteína portadora o tipo de proteína portadora diferente. Puede usarse cualquier reacción de conjugación adecuada, con cualquier ligador adecuado si fuera necesario.

Los antígenos de proteínas tóxicas pueden desintoxicarse si es necesario, por ejemplo, desintoxicación de toxina de pertussis por medios químicos y/o genéticos.

Vehículos farmacéuticamente aceptables

Las composiciones de la invención comprenderán normalmente, además de los componentes anteriormente mencionados, uno o más “vehículos farmacéuticamente aceptables”. Éstos incluyen cualquier vehículo que por sí mismo no induce la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición. Vehículos adecuados son normalmente macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas, tales como proteínas, polisacáridos, ácido polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y agregados de lípidos (tal como gotitas de aceite o liposomas). Vehículos de este tipo son muy conocidos para aquellos expertos en la materia. Una composición también puede contener un diluyente, tal como agua, solución salina, glicerol, etc. Adicionalmente, puede estar presente una sustancia auxiliar, tal como un agente humectante o emulsionante, sustancia de tamponamiento del pH y similares. Una discusión meticulosa de componentes farmacéuticamente aceptables está disponible en Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20ª ed., ISBN: 0683306472.

Agentes inmunorreguladores

Adyuvantes

Las vacunas de la invención pueden administrarse conjuntamente con otros agentes inmunorreguladores. En particular, las composiciones incluirán normalmente un adyuvante. Los adyuvantes para su uso con la invención incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes expuestos más adelante:

A. Composiciones que contienen minerales

Las composiciones que contienen minerales adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales tales como sales de aluminio y sales de calcio. La invención incluye sales minerales tales como hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos, etc. (por ejemplo, véanse los capítulos 8 y 9 de Vaccine Design. (1995) eds. Powell & Newman. ISBN: 030644867X. Plenum.), o mezclas de diferentes compuestos minerales (por ejemplo, una mezcla de un fosfato y un adyuvante de hidróxido, opcionalmente con un exceso de fosfato), tomando los compuestos cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.), y prefiriéndose la adsorción a la(s) sal(es). Las composiciones que contienen

minerales también pueden formularse como una partícula de sal metálica (documento WO00/23105).

Las sales de aluminio pueden incluirse en vacunas de la invención de forma que la dosis de Al3+ esté entre 0,2 y 1,0 mg por dosis.

En una realización, el adyuvante basado en aluminio para su uso en la presente invención es alumbre (sulfato de aluminio y potasio (AlK(SO4)2)), o un derivado del alumbre tal como el formado in situ mezclando un antígeno en tampón fosfato con alumbre, seguido de valoración y precipitación con una base tal como hidróxido de amonio o hidróxido sódico.

Otro adyuvante basado en aluminio para su uso en formulaciones de vacuna de la presente invención es el adyuvante de hidróxido de aluminio (Al(OH)3) u oxihidróxido de aluminio cristalino (AIOOH), que es un excelente adsorbente, que tiene un área superficial de aproximadamente 500 m2/g. Alternativamente se proporciona el adyuvante de fosfato de aluminio (AlPO4) o hidroxifosfato de aluminio que contienen grupos fosfato en lugar de alguno o todos los grupos hidroxilo del adyuvante de hidróxido de aluminio. Los adyuvantes de fosfato de aluminio preferidos proporcionados en este documento son amorfos y solubles en medios ácidos, básicos y neutros.

En otra realización, el adyuvante de la invención comprende tanto fosfato de aluminio como hidróxido de aluminio. En una realización más particular de la misma, el adyuvante tiene una mayor cantidad de fosfato de aluminio que el hidróxido de aluminio, tal como una relación de 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 o superior a 9:1 en peso de fosfato de aluminio con respecto a hidróxido de aluminio. Todavía más particular, las sales de aluminio en la vacuna están presentes a 0,4 a 1,0 mg por dosis de vacuna, o 0,4 a 0,8 mg por dosis de vacuna, o 0,5 a 0,7 mg por dosis de vacuna, o aproximadamente 0,6 mg por dosis de vacuna.

Generalmente, el (los) adyuvante(s) basado(s) en aluminio preferido(s), o relación de múltiples adyuvantes basados en aluminio tales como fosfato de aluminio con respecto a hidróxido de aluminio, se selecciona por la optimización de la atracción electrostática entre moléculas de forma que el antígeno lleve una carga opuesta a la del adyuvante al pH deseado. Por ejemplo, el adyuvante de fosfato de aluminio (punto isoeléctrico = 4) se adsorbe a lisozima, pero no a albúmina a pH 7,4. Si la albúmina debiera ser la diana, se seleccionaría el adyuvante de hidróxido de aluminio (iep 11,4). Alternativamente, el pretratamiento de hidróxido de aluminio con fosfato reduce su punto isoeléctrico, haciendo que sea un adyuvante preferido para antígenos más básicos.

B. Emulsiones de aceite

Las composiciones de emulsión de aceite adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de escualeno-agua tales como MF59 (5 % de escualeno, 0,5 % de TWEENTM 80, y 0,5 % de Span 85, formuladas en emulsiones de partículas submicrométricas usando un microfluidizador). Véase el documento WO90/14837. Véanse también Podda, Vaccine (2001) 19: 2673-2680; Frey y col., Vaccine (2003) 21:4234-4237. MF59 se usa como adyuvante en la vacuna de subunidad trivalente contra el virus de la gripe FLUAD™.

Adyuvantes particularmente preferidos para su uso en las composiciones son emulsiones de aceite en agua submicrométricas. Las emulsiones de aceite en agua submicrométricas preferidas para su uso en este documento son emulsiones de escualeno/agua que opcionalmente contienen cantidades variables de MTP-PE tales como una emulsión de aceite en agua submicrométrica que contiene 4-5 % peso/volumen de escualeno, 0,25-1,0 % peso/volumen de TWEEN™ 80 (poli(monooleato de oxietilensorbitano)) y/o 0,25-1,0 % de SPAN 85™ (trioleato de sorbitano) y opcionalmente N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3hidroxifosfoforiloxi)-etilamina (MTP-PE), por ejemplo, la emulsión de aceite en agua submicrométrica conocida como “MF59” (publicación internacional nº WO90/14837; patentes de EE.UU. nº 6.299.884 y 6.451.325, y Ott y col., en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell, M.F. y Newman, M.J. eds.) Plenum Press, Nueva York, 1995, pág. 277-296). MF59 contiene 4-5 % peso/volumen de escualeno (por ejemplo 4,3 %), 0,25-0,5 % peso/volumen de TWEENTM 80 y 0,5 % peso/volumen de SPAN 85™ y opcionalmente contiene diversas cantidades de MTP-PE, formuladas en partículas submicrométricas usando un microfluidizador tal como el microfluidizador de modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA). Por ejemplo, MTP-PE puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0-500 µg/dosis, más preferentemente de 0-250 µg/dosis y lo más preferentemente de 0-100 µg/dosis. Como se usa en este documento, el término “MF59-0” se refiere a la emulsión aceite en agua submicrométrica anterior que carece de MTP-PE, mientras que el término MF59-MTP denota una formulación que contiene MTP-PE. Por ejemplo, “MF59-100” contiene 100 µg de MTP-PE por dosis, etc. MF69, otra emulsión de aceite en agua submicrométrica para su uso en este documento, contiene 4,3 % peso/volumen de escualeno, 0,25 % peso/volumen de TWEENTM 80 y 0,75 % peso/volumen de SPAN 85™ y opcionalmente MTP-PE. Todavía otra emulsión de aceite en agua submicrométrica es MF75, también conocida como SAF, que contiene 10 % de escualeno, 0,4 % de TWEENTM 80, 5 % de polímero L121 bloqueado con Pluronic y thr-MDP, también microfluidizado en una emulsión submicrométrica. MF75-MTP denota una formulación de MF75 que incluye MTP, tal como de 100-400 µg de MTP-PE por dosis.

Las emulsiones de aceite en agua submicrométricas, los procedimientos de preparación de las mismas y los agentes inmunoestimulantes tales como muramilpéptidos para su uso en las composiciones se describen en detalle en el documento WO90/14837 y en las patentes de EE.UU. 6.299.884 y 6.451.325.

También puede usarse adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA) como adyuvantes en la invención.

C. Formulaciones de saponina

Las formulaciones de saponina también pueden usarse como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un grupo heterólogo de glucósidos de esterol y glucósidos triterpenoides que se encuentran en la corteza, las hojas, los tallos, las raíces e incluso las flores de una amplia variedad de especies de plantas. Las saponinas aisladas de la corteza del árbol Quillaja saponaria Molina se han estudiado exhaustivamente como adyuvantes. La saponina también puede obtenerse comercialmente de Smilax ornata (zarzaparrilla), Gypsophila paniculata (velo de novia) y Saponaria officinalis (raíz de jabón). Las formulaciones de adyuvante de saponina incluyen formulaciones purificadas tales como QS21, además de formulaciones de lípidos tales como ISCOM.

Las composiciones de saponina se han purificado usando cromatografía en capa fina de alta resolución (HP-TLC) y cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC). Se han identificado fracciones purificadas específicas usando estas técnicas que incluyen QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferentemente, la saponina es QS21. Un procedimiento de producción de QS21 se desvela en la patente de EE.UU. 5.057.540. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol tal como colesterol (véase el documento WO96/33739).

Las combinaciones de saponinas y colesteroles pueden usarse para formar partículas únicas llamadas complejos inmunoestimulantes (ISCOM). Los ISCOM normalmente también incluyen un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Puede usarse cualquier saponina conocida en los ISCOM. Preferentemente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOM se describen adicionalmente en los documentos EP0109942, WO96/11711 y WO96/33739. Opcionalmente, los ISCOM pueden carecer de detergente(s) adicional(es). Véase el documento 00/07621.

Una revisión del desarrollo de adyuvantes basados en saponinas puede encontrarse en Barr y col., Advanced Drug Delivery Reviews (1998) 32:247-271. Véase también Sjolander y col., Advanced Drug Delivery Reviews (1998) 32:321-338.

D. Virosomas y partículas similares a virus (VLP)

Los virosomas y las partículas similares a virus (VLP) también pueden usarse como adyuvantes en la invención. Estas estructuras contienen generalmente una o más proteínas de un virus opcionalmente combinado o formulado con un fosfolípido. Son generalmente no patógenas, no replicantes y generalmente no contienen ninguno de los genomas víricos nativos. Las proteínas víricas pueden producirse recombinantemente o aislarse a partir de virus completos. Estas proteínas víricas adecuadas para uso en virosomas o VLP incluyen proteínas derivadas del virus de la gripe (tales como HA o NA), virus de la hepatitis B (tales como proteínas de núcleo o de cápside), virus de la hepatitis E, virus del sarampión, virus Sindbis, rotavirus, virus de la glosopeda, retrovirus, virus de Norwalk, virus del papiloma humano, VIH, fagos de ARN, fago Qβ (tal como proteínas de la cubierta), fago GA, fago fr, fago AP205 y Ty (tal como la proteína p1 del retrotransposón Ty). Los VLP se tratan adicionalmente en los documentos WO03/024480, WO03/024481, y Niikura y col., Virology (2002) 293:273-280; Lenz y col., Journal of Immunology (2001) 5246-5355; Pinto y col., Journal of Infectious Diseases (2003) 188:327-338; y Gerber y col., Journal of Virology (2001) 75(10):4752-4760. Los virosomas se tratan adicionalmente en, por ejemplo, Gluck y col., Vaccine (2002) 20:B10-B16. Los virosomas de la gripe reconstituidos potenciadores de la inmunidad (IRIV) se usan como sistema de administración de antígeno de subunidad en el producto trivalente intranasal INFLEXAL™ {Mischler & Metcalfe (2002) Vaccine 20 Suppl 5:B17-23} y el producto INFLUVAC PLUS™.

E. Derivados bacterianos o microbianos

Adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como:

(1)

Derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS) Tales derivados incluyen monofosforil lípido A (MPL) y MPL 3-O-desacilado (3dMPL). 3dMPL es una mezcla de monofosforil lípido A 3-des-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas. Una forma de “partícula pequeña” preferida de monofosforil lípido A 3-des-O-acilado se desvela en el documento EP 0 689 454. Tales “partículas pequeñas” de 3dMPL son demasiado pequeñas para esterilizarse por filtración a través de una membrana de 0,22 micrómetros (véase el documento EP 0 689 454). Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen miméticos de monofosforil lípido A tales como derivados de fosfato de aminoalquilglucosaminida, por ejemplo, RC-529. Véase Johnson y col. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278.

(2)

Derivados del lípido A Los derivados del lípido A incluyen derivados del lípido A de Escherichia coli tales como OM-174. OM-174 se describe, por ejemplo, en Meraldi y col., Vaccine (2003) 21:2485-2491; y Pajak y col., Vaccine (2003) 21:836

842.

(3) Oligonucleótidos inmunoestimulantes Los oligonucleótidos inmunoestimulantes adecuados para uso como adyuvantes en la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo CpG (una secuencia de dinucleótidos que contiene una

citosina sin metilar seguida de guanosina y ligada por un enlace fosfato a una guanosina). También se ha mostrado que los ARN bicatenarios bacterianos u oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o de poli(dG) son inmunoestimulantes. Los CpG pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser bicatenarios o monocatenarios. Opcionalmente, la guanosina puede sustituirse con un análogo tal como 2'-desoxi-7-deazaguanosina. Véanse Kandimalla y col., Nucleic Acids Research (2003) 31(9): 23932400; documentos WO02/26757 y WO99/62923 para ejemplos de posibles sustituciones de análogos. El efecto del adyuvante de los oligonucleótidos de CpG se trata adicionalmente en Krieg, Nature Medicine (2003) 9(7): 831-835; McCluskie y col., FEMS Immunology and Medical Microbiology (2002) 32:179-185; documento WO98/40100; patente de EE.UU. nº 6.207.646; patente de EE.UU. nº 6.239.116 y patente de EE.UU. nº 6.429.199. La secuencia de CpG puede dirigirse a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT. Véase Kandimalla y col., Biochemical Society Transactions (2003) 31 (parte 3): 654-658. La secuencia de CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmunitaria Th1 tal como un ODN CpG-A, o puede ser más específica para inducir una respuesta de linfocitos B tal como ODN CpG-B. Los ODN CpG-A y CpG-B se tratan en Blackwell y col., J. Immunol. (2003) 170(8):4061-4068; Krieg, TRENDS in Immunology (2002) 23(2): 64-65 y el documento WO01/95935. Preferentemente, CpG es CpG-A ODN. Preferentemente, el oligonucleótido de CpG se construye de manera que el extremo 5' esté accesible para el reconocimiento de receptores. Opcionalmente, dos secuencias de oligonucleótidos de CpG pueden unirse en sus extremos 3' para formar “inmunómeros”. Véanse, por ejemplo, Kandimalla y col., BBRC (2003) 306:948953; Kandimalla y col., Biochemical Society Transactions (2003) 31 (parte 3):664-658; Bhagat y col., BBRC (2003) 300:853-861, y el documento WO03/035836.

(4) Toxinas ribosilantes de ADP y derivados desintoxicados de las mismas

Las toxinas ribosilantes de ADP bacterianas y los derivados desintoxicados de las mismas pueden usarse como adyuvantes en la invención. Preferentemente, la proteína se deriva de E. coli (es decir, enterotoxina lábil al calor de

E. coli “LT”), cólera (“CT”) o pertussis (“PT”). El uso de toxinas ribosilantes de ADP desintoxicadas como adyuvantes de la mucosa se describe en el documento WO95/17211 y como adyuvantes parenterales en el documento WO98/42375. Preferentemente, el adyuvante es un mutante de LT desintoxicado tal como LT-K63, LT-R72 y LT192G. El uso de toxinas ribosilantes de ADP y derivados desintoxicados de las mismas, particularmente LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes puede encontrarse en las siguientes referencias: Beignon y col., Infection and Immunity (2002) 70(6):3012-3019; Pizza y col., Vaccine (2001) 19:2534-2541; Pizza y col., Int. J. Med. Microbiol (2000) 290(45):455-461; Scharton-Kersten y col., Infection and Immunity (2000) 68(9):5306-5313; Ryan y col., Infection and Immunity (1999) 67(12):6270-6280; Partidos y col., Immunol. Lett. (1999) 67(3):209-216; Peppoloni y col., Vaccines (2003) 2(2):285-293; y Pine y col., (2002) J. Control Release (2002) 85(1-3):263-270. La referencia numérica para sustituciones de aminoácidos se basa preferentemente en los alineamientos de las subunidades A y B de toxinas ribosilantes de ADP expuestas en Domenighini y col., Mol. Microbiol (1995) 15(6):1165-1167.

F. Bioadhesivos y mucoadhesivos

También pueden usarse bioadhesivos y mucoadhesivos como adyuvantes en la invención. Bioadhesivos adecuados incluyen microesferas de ácido hialurónico esterificadas (Singh y col. (2001) J. Cont. Rele. 70:267-276) o mucoadhesivos tales como derivados reticulados de poli(ácido acrílico), poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. También pueden usarse quitosano y derivados del mismo como adyuvantes en la invención. Véase el documento WO99/27960.

G. Micropartículas

Las micropartículas también pueden usarse como adyuvantes en la invención. Se prefieren micropartículas (es decir, una partícula de ~100 nm a ~150 µm de diámetro, más preferentemente ~200 nm a ~30 µm de diámetro, y lo más preferentemente ~500 nm a ~10 µm de diámetro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli(α-hidroxiácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), con poli(lactida-co-glicolida), opcionalmente tratadas para tener una superficie negativamente cargada (por ejemplo, con SDS) o una superficie positivamente cargada (por ejemplo, con un detergente catiónico tal como CTAB).

H. Liposomas

Ejemplos de formulaciones de liposomas adecuadas para uso como adyuvantes se describen en la patente de EE.UU. nº 6.090.406, en la patente de EE.UU. nº 5.916.588 y en el documento EP 0 626 169.

I. Formulaciones de polioxietilenéteres y polioxietilenésteres

Adyuvantes adecuados para uso en la invención incluyen polioxietilenéteres y polioxietilenésteres. Documento WO99/52549. Tales formulaciones incluyen adicionalmente tensioactivos de éster de polioxietilensorbitano en combinación con un octoxinol (documento WO01/21207), además de tensioactivos de polioxietilenalquiléter o éster en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional tal como un octoxinol (documento WO01/21152).

Los polioxietilenéteres preferidos se seleccionan del siguiente grupo: polioxietilen-9-lauriléter (laureth 9), polioxietilen-9-esteoriléter, polioxietilen-8-esteoriléter, polioxietilen-4-lauriléter, polioxietilen-35-lauriléter y polioxietilen-23-lauriléter.

J. Polifosfaceno (PCPP)

Las formulaciones de PCPP se describen, por ejemplo, en Andrianov y col., “Preparation of hydrogel microspheres by coacervation of aqueous polyphophazene solutions”, Biomaterials (1998) 19(1-3):109-115 y Payne y col., “Protein Release from Polyphosphazene Matrices”, Adv. Drug. Delivery Review (1998) 31(3):185-196.

K. Muramilpéptidos

Ejemplos de muramilpéptidos adecuados para uso como adyuvantes en la invención incluyen N-acetil-muramil-Ltreonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) y N-acetilmuramil-1-alanil-disoglutaminil-1-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE).

L. Compuestos de imidazoquinolina

Ejemplos de compuestos de imidazoquinolina adecuados para uso como adyuvantes en la invención incluyen imiquimod y sus análogos descritos adicionalmente en Stanley, Clin Exp Dermatol (2002) 27(7):571-577; Jones, Curr Opin Investig Drugs (2003) 4(2):214-218; y las patentes de EE.UU. 4.689.338, 5.389.640, 5.268.376, 4.929.624, 5.266.575, 5.352.784, 5.494.916, 5.482.936, 5.346.905, 5.395.937, 5.238.944, y 5.525.612.

M. Compuestos tiosemicarbazona

Ejemplos de compuestos de tiosemicarbazona, además de procedimientos de formulación, preparación y cribado para los compuestos, todos adecuados para uso como adyuvantes en la invención, incluyen aquellos descritos en el documento WO04/60308. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humana para la producción de citocinas tales como TNF-α.

N. Compuestos de triptantrina

Ejemplos de compuestos de triptantrina, además de procedimientos de formulación, preparación y cribado para los compuestos, todos adecuados para uso como adyuvantes en la invención, incluyen aquellos descritos en el documento WO04/64759. Los compuestos de triptantrina son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humana para la producción de citocinas tales como TNF-α.

La invención también puede comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, las siguientes composiciones de adyuvante pueden usarse en la invención:

(1)

una saponina y una emulsión de aceite en agua (documento WO99/11241);

(2)

una saponina (por ejemplo, QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL) (véase el documento 94/00153);

(3)

una saponina (por ejemplo, QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL) + un colesterol;

(4)

una saponina (por ejemplo, QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) (documento WO98/57659);

(5)

combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua (véanse las solicitudes de patente europea 0835318, 0735898 y 0761231);

(6)

SAF, que contiene el 10 % de escualano, el 0,4 % de Tween 80, el 5 % polímero de bloque de Pluronic L121 y thr-MDP, tanto microfluidizada en una emulsión submicrométrica como agitada con vórtex para generar una emulsión de mayor tamaño de partícula.

(7)

sistema de adyuvante RIBI™ (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene el 2 % de escualeno, el 0,2 % de Tween 80 y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de pared celular (CWS), preferentemente MPL + CWS (DETOX™); y

(8)

una o más sales minerales (tal como una sal de aluminio) + un derivado de LPS no tóxico (tal como 3dPML).

(9)

una o más sales minerales (tal como una sal de aluminio) + un oligonucleótido inmunoestimulante (tal como una secuencia de nucleótidos que incluye un motivo de CpG).

O. Inmunomoduladores humanos

Los inmunomoduladores humanos adecuados para uso como adyuvantes en la invención incluyen citocinas tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones (por ejemplo, interferón-γ), factor estimulante de colonias de macrófagos y factor de necrosis tumoral.

Las sales de aluminio y MF59 son adyuvantes preferidos para su uso con vacunas contra la gripe inyectables. Las toxinas bacterianas y los bioadhesivos son adyuvantes preferidos para su uso con vacunas administradas a la mucosa tales como vacunas nasales.

Procedimientos terapéuticos

La invención proporciona las composiciones descritas anteriormente para su uso en terapia. La invención proporciona las composiciones descritas anteriormente para inducir o aumentar una respuesta inmunitaria a S. pyogenes. La invención proporciona procedimientos para inducir o aumentar una respuesta inmunitaria a S. pyogenes usando las composiciones descritas anteriormente. La respuesta inmunitaria es preferentemente protectora y puede incluir anticuerpos y/o inmunidad mediada por célula (incluyendo inmunidad sistémica y mucosa). Respuestas inmunitarias incluyen respuestas de refuerzo.

Los adolescentes y niños, que incluyen niños pequeños y bebés, pueden recibir una vacuna para uso profiláctico; las vacunas terapéuticas normalmente se administran a adolescentes o adultos. Una vacuna prevista para niños también puede administrarse a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc.

Las enfermedades producidas por Streptococcus pyogenes que pueden prevenirse o tratarse según la invención incluyen, pero no se limitan a, faringitis (tal como dolor de garganta estreptocócico), fiebre escarlata, impétigo, erisipelas, celulitis, septicemia, síndrome de choque tóxico, fascitis necrotizante y secuelas tales como fiebre reumática y glomerulonefritis aguda. Las composiciones también pueden ser eficaces contra otras bacterias estreptocócicas, por ejemplo, GBS.

Pruebas para determinar la eficacia de la respuesta inmunitaria

Una forma de evaluar la eficacia del tratamiento terapéutico implica monitorizar la infección por GAS después de la administración de la composición de la invención. Una forma de evaluar la eficacia del tratamiento profiláctico implica monitorizar respuestas inmunitarias contra las proteínas SLO mutantes en las composiciones de la invención después de la administración de la composición.

Otra forma de evaluar la inmunogenicidad de las proteínas componentes de las composiciones inmunogénicas de la presente invención es expresar proteínas SLO mutantes recombinantemente y cribar sueros de paciente o secreciones mucosas por inmunotransferencia. Una reacción positiva entre la proteína y el suero del paciente indica que el paciente ha organizado previamente una respuesta inmunitaria a la proteína en cuestión; es decir, la proteína es un inmunogén. Este procedimiento también puede usarse para identificar proteínas inmunodominantes y/o epítopes.

Otra forma de comprobar la eficacia del tratamiento terapéutico implica monitorizar infección por GAS después de la administración de las composiciones de la invención. Una forma de comprobar la eficacia del tratamiento profiláctico implica monitorizar respuestas inmunitarias tanto sistémicamente (tal como monitorizar el nivel de la producción de IgG1 y IgG2a) como mucosamente (tal como monitorizar el nivel de producción de IgA) contra SLO después de la administración de la composición. Normalmente, las respuestas de anticuerpos específicos para suero se determinan después de la inmunización, pero antes de la exposición, mientras que las respuestas corporales de anticuerpos específicos para mucosa se determinan después de la inmunización y después de la exposición.

La composiciones de vacuna de la presente invención pueden evaluarse en modelos animales in vitro e in vivo antes de la administración al huésped, por ejemplo, ser humano. Modelos de ratón particularmente útiles incluyen aquellos en los que la inmunización intraperitoneal va seguida de tanto exposición intraperitoneal como exposición intranasal.

La eficacia de las composiciones inmunogénicas de la invención también puede determinarse in vivo inmunizando modelos animales (por ejemplo, cobayas o ratones) con las composiciones inmunogénicas y determinando el nivel de protección obtenida después de la exposición a GAS.

Los modelos de eficacia in vivo incluyen, pero no se limitan a: (i) un modelo de infección murina usando serotipos de GAS humanos; (ii) un modelo de enfermedad murina que es un modelo murino usando una cepa de GAS adaptada a ratón tal como la cepa M23 que es particularmente virulenta en ratones, y (iii) un modelo de primate usando cepas aisladas de GAS humanas.

La respuesta inmunitaria puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria TH1 y una respuesta TH2. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria mejorada o una potenciada o una alterada. La respuesta inmunitaria puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria sistémica y mucosa. Preferentemente, la respuesta inmunitaria es una respuesta al sistema y/o mucosa potenciada.

Una inmunidad sistémica y/o mucosa potenciada se refleja en una respuesta inmunitaria TH1 y/o TH2 potenciada. Preferentemente, la respuesta inmunitaria potenciada incluye un aumento en la producción de IgG1 y/o IgG2a y/o IgA.

Preferentemente, la respuesta inmunitaria a mucosa es una respuesta inmunitaria TH2. Preferentemente, la respuesta inmunitaria a mucosa incluye un aumento en la producción de IgA.

Las células TH2 activadas potencian la producción de anticuerpos y, por tanto, son de valor en responder a infecciones extracelulares. Las células TH2 activadas pueden secretar una o más de IL-4, IL-5, IL-6 y IL-10. Una respuesta inmunitaria TH2 puede producir la producción de IgG1, IgE, IgA y linfocitos B de memoria para la futura protección.

Una respuesta inmunitaria TH2 puede incluir uno o más de un aumento en una o más de las citocinas asociadas a una respuesta inmunitaria TH2 (tal como IL-4, IL-5, IL-6 y IL-10), o un aumento en la producción de IgG1, IgE, IgA y linfocitos B de memoria. Preferentemente, la respuesta inmunitaria TH2 potenciada incluirá un aumento en la producción de IgG1.

Una respuesta inmunitaria TH1 puede incluir uno o más de un aumento en CTL, un aumento en una o más de las citocinas asociadas a una respuesta inmunitaria TH1 (tal como IL-2, IFNγ y TNF-β), un aumento en macrófagos activados, un aumento en la actividad de NK o un aumento en la producción de IgG2a. Preferentemente, la respuesta inmunitaria TH1 potenciada incluirá un aumento en la producción de IgG2a.

Las composiciones inmunogénicas de la invención, en particular las composiciones inmunogénicas que comprenden una o más proteínas SLO mutantes de la presente invención, puede usarse tanto solas como en combinación con otros antígenos de GAS, opcionalmente con un agente inmunorregulador que puede provocar una respuesta Th1 y/o Th2.

La invención también comprende una composición inmunogénica que comprende uno o más agentes inmunorreguladores tales como una sal mineral, tal como una sal de aluminio, y un oligonucleótido que contiene un motivo CpG. Lo más preferentemente, la composición inmunogénica incluye tanto una sal de aluminio como un oligonucleótido que contiene un motivo CpG. Alternativamente, la composición inmunogénica incluye una toxina ribosilante de ADP tal como una toxina ribosilante de ADP desintoxicada y un oligonucleótido que contiene un motivo CpG. Preferentemente, uno o más de los agentes inmunorreguladores incluye un adyuvante. El adyuvante puede seleccionarse de uno o más del grupo que consiste en un adyuvante de TH1 y adyuvante de TH2.

Las composiciones de la invención provocarán preferentemente tanto una respuesta inmunitaria mediada por célula, además de una respuesta inmunitaria humoral, con el fin de tratar eficazmente una infección por GAS. Esta respuesta inmunitaria inducirá preferentemente anticuerpos de acción prolongada (por ejemplo, neutralizantes) y una inmunidad mediada por célula que puede responder rápidamente tras la exposición a uno o más antígenos de GAS.

En una realización particularmente preferida, la composición inmunogénica comprende una o más proteínas SLO mutantes que provocan una respuesta de anticuerpo neutralizante y una o más proteínas SLO mutantes que provocan una respuesta inmunitaria mediada por célula. De esta forma, la respuesta del anticuerpo neutralizante previene o inhibe una infección por GAS inicial mientras que la respuesta inmunitaria mediada por célula que puede provocar una respuesta celular Th1 potenciada previene adicionalmente la propagación de la infección por GAS.

Las composiciones de la invención por lo general se administrarán directamente al paciente. Las composiciones de la presente invención pueden administrarse tanto solas como como parte de una composición, por una variedad de vías diferentes. Ciertas vías pueden ser favorecidas para ciertas composiciones, ya que producen la generación de una respuesta inmunitaria más eficaz, preferentemente una respuesta CMI, o ya que es menos probable que induzcan efectos secundarios, o ya que son más fáciles para administración.

Los procedimientos de administración incluyen inyección parenteral (por ejemplo, inyección subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular o intersticial) y rectal, oral (por ejemplo, comprimido, espray), vaginal, tópica, transdérmica (por ejemplo, véase el documento WO 99/27961), transcutánea (por ejemplo, véanse los documentos WO02/074244 y WO02/064162), intranasal (por ejemplo, véase el documento WO03/028760), ocular, aural y pulmonar, u otra administración a mucosa.

A modo de ejemplo, las composiciones de la presente invención pueden administrarse por una vía sistémica o una vía mucosa o una vía transdérmica o pueden administrarse directamente a un tejido específico. Como se usa en el presente documento, el término “administración sistémica” incluye, pero no se limita a, cualquier vía parenteral de administración. En particular, la administración parenteral incluye, pero no se limita a, inyección subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, intramuscular o intraesternal, técnicas de infusión intravenosa, intraarterial

o dialítica al riñón. Preferentemente, la administración parenteral sistémica es inyección intramuscular. Como se usa en el presente documento, el término “administración a mucosa” incluye, pero no se limita a oral, administración intranasal, intravaginal, intrarrectal, intratraqueal, intestinal y oftálmica.

El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de múltiples dosis. Las múltiples dosis pueden usarse en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. En un programa de múltiples dosis, las diversas dosis pueden administrarse por la misma vía o por vías diferentes, por ejemplo, una sensibilización parenteral y refuerzo a mucosa, una sensibilización de mucosa y refuerzo parenteral, etc.

Las composiciones de la invención pueden prepararse de diversas formas. Por ejemplo, una composición puede prepararse como un inyectable, tanto como una disolución líquida como una suspensión. También pueden prepararse formas sólidas adecuadas para disolución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de inyección (por ejemplo, una composición liofilizada). Una composición puede prepararse para administración por vía oral, tal como un comprimido o cápsula, como un espray, o como un jarabe (opcionalmente aromatizado). Una composición puede prepararse para administración pulmonar, por ejemplo, como un inhalador, usando un polvo fino o un espray. Una composición puede prepararse como un supositorio o pesario. Una composición puede prepararse para administración nasal, aural u ocular, por ejemplo, como gotas. Una composición puede estar en forma de kit, diseñado de forma que una composición combinada se reconstituya justo antes de la administración a un paciente. Tales kits pueden comprender una o más SLO mutantes u otros antígenos en forma líquida y uno o más antígenos liofilizados.

Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de SLO mutante u otros antígenos (o moléculas de ácidos nucleicos que codifican los antígenos), además de cualquier otro componente, según se necesite, tal como antibióticos. Una “cantidad inmunológicamente eficaz” es una cantidad que, cuando se administra a un individuo, tanto en una dosis única como como parte de una serie, aumenta una respuesta inmunitaria medible o previene o reduce un síntoma clínico.

Las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden administrarse en combinación con una pauta de tratamiento con antibióticos. En una realización, el antibiótico se administra antes de la administración del antígeno de la invención o la composición que comprende la una o más proteínas SLO mutantes de la invención.

En otra realización, el antibiótico se administra posterior a la administración de una proteína SLO mutante de la invención. Ejemplos de antibióticos adecuados para su uso en el tratamiento de una infección por GAS incluyen, pero no se limitan a, penicilina o un derivado de la misma o clindamicina, cefalosporinas, glucopéptidos (por ejemplo, vancomicina), y cicloserina.

Sin embargo, la cantidad de agente activo en una composición varía dependiendo de la salud y la condición física del individuo que va a tratarse, de la edad, del grupo taxonómico del individuo que va a tratarse (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), de la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, del grado de protección deseada, de la formulación de la vacuna, de la evaluación del médico práctico de la situación médica y de otros factores relevantes. La cantidad se encontrará en un intervalo relativamente amplio que pueda determinarse por ensayos rutinarios.

Kits

En el presente documento también se desvelan kits que comprenden uno o más recipientes de composiciones de la invención. Las composiciones pueden estar en forma líquida o pueden liofilizarse, como pueden los antígenos individuales. Recipientes adecuados para las composiciones incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringuillas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden formarse a partir de una variedad de materiales, que incluyen vidrio o plástico. Un recipiente puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por un aguja de inyección hipodérmica).

El kit puede comprender adicionalmente un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, disolución de Ringer o disolución de dextrosa. También puede contener otros materiales útiles para el usuario final que incluyen otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas. El kit también puede comprender un segundo o tercer recipiente con otro agente activo, por ejemplo, un antibiótico.

El kit también puede comprender un prospecto que contiene instrucciones escritas para procedimientos de inducir inmunidad contra S. pyogenes o para tratar infecciones por S. pyogenes. El prospecto puede ser un prospecto en borrador sin aprobar o puede ser un prospecto aprobado por la Agencia estadounidense del medicamento (FDA) u otro cuerpo regulador.

La divulgación anterior describe generalmente la presente invención. Puede obtenerse un entendimiento más completo por referencia a los siguientes ejemplos específicos, que sólo se proporcionan para los fines de ilustración y que no pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1

Clonación de proteínas SLO naturales y mutantes

Los genes que codifican proteínas SLO naturales y mutantes se amplificaron por PCR usando los cebadores del genoma SF370 mostrado en la Tabla 1.

Los productos de PCR se digirieron con NheI-XhoI y se ligaron con el vector pet24b+ (Novagen) cortado con las mismas enzimas. Células electrocompetentes de DH5α de E. coli se transformaron con las reacciones de ligación.

5 Se añadió medio LBPTK y, después de incubación durante 1 h a 37 ºC, con agitación a 250 rpm, se sembraron bacterias sobre placas LBPTK que contenían 50 µg/ml de kanamicina. Las colonias positivas se identificaron por PCR de colonias.

Los plásmidos de colonias positivas se prepararon a partir de un cultivo durante la noche en medio LBPTK que contenía 50 µg/ml de kanamicina y se analizaron por secuenciación de ADN, que confirmó el gen inserto esperado

10 bajo el promotor de la T7 polimerasa. Las secuencias de ADN y proteína finales de los genes clonados se muestran en la lista de secuencias. Véase la Tabla 2.

Tabla 1. (continuación) (continuación)

gen

cebadores

SLO natural sin marca

25F NheI, GTGCGTGCTAGCGAATCGAACAAACAAAACACTGC (SEC ID Nº: 34) 25rev = GCATTCGATCCTCGAGCTACTTATAAGTAATCGAACCATATG (SEC ID Nº: 35)

SLO P427L sin marca

Cebadores externos: 25F NheI, GTGCGTGCTAGCGAATCGAACAAACAAAACACTGC (SEC ID Nº: 34) 25rev, GCATTCGATCCTCGAGCTACTTATAAGTAATCGAACCATATG (SEC ID Nº: 35) Cebadores internos: PL427_for, GCTACCTTCAGTAGAAAAAACCTAGCTTATCCTATTTCATACACC (SEC ID Nº: 36) PL427_rev, GGTGTATGAAATAGGATAAGCTAGGTTTTTTCTACTGAAGGTAGC (SEC ID Nº: 37)

SLO natural marcada con His

25F NheI, GTGCGTGCTAGCGAATCGAACAAACAAAACACTGC (SEC ID Nº: 34) 25revhis, GCATTCGATCCTCGAGCTTATAAGTAATCGAACCATATGGG (SEC ID Nº: 38)

SLO W535F

Cebadores externos:

marcada con His

25F NheI, GTGCGTGCTAGCGAATCGAACAAACAAAACACTGC (SEC ID Nº: 34) 25revhis, GCATTCGATCCTCGAGCTTATAAGTAATCGAACCATATGGG (SEC ID Nº: 38) Cebadores internos: WF535_for, GAGTGCACTGGCTTAGCTTTCGAATGGTGGCGAAAAGTGATC(SEC ID Nº: 39) WF535_rev, GATCACTTTTCGCCACCATTCGAAAGCTAAGCCAGTGCACTC (SEC ID Nº: 40)

SLO W535F-D482N marcada con His

Cebadores externos: 25F NheI, GTGCGTGCTAGCGAATCGAACAAACAAAACACTGC (SEC ID Nº: 34) 25revhis, GCATTCGATCCTCGAGCTTATAAGTAATCGAACCATATGGG (SEC ID Nº: 38) Cebadores internos: WF535_for, GAGTGCACTGGCTTAGCTTTCGAATGGTGGCGAAAAGTGATC (SEC ID Nº: 39) WF535_rev, GATCACTTTTCGCCACCATTCGAAAGCTAAGCCAGTGCACTC (SEC ID Nº: 40) y

gen

cebadores

DN482_for, GTTGCTCAATATGAAATCCTTTGGAATGAAATCAATTATGATGACAAAGGAAAAG (SEC ID Nº: 41) DN482_rev, CTTTTCC'PTTGTCATCATAATTGATTTCATTCCAAAGGATTTCATATTGAGCAAC (SEC ID Nº: 42)

SLO C530G

Cebadores externos:

marcada con His

25F NheI, GTGCGTGCTAGCGAATCGAACAAACAAAACACTGC (SEC ID Nº: 34) 25revhis, GCATTCGATCCTCGAGCTTATAAGTAATCGAACCATATGGG (SEC ID Nº: 38) Cebadores internos: CG530_for, CCGTATCATGGCTAGAGAGGGCACTGGCTTAGCTTGGGAATG (SEC ID Nº: 43) CG530_rev, CATTCCCAAGCTAAGCCAGTGCCCTCTCTAGCCATGATACGG (SEC ID Nº: 44)

SLO P427L

Cebadores externos:

marcada con His

25F NheI, GTGCGTGCTAGCGAATCGAACAAACAAAACACTGC (SEC ID Nº: 34) 25 revhis, GCATTCGATCCTCGAGCTTATAAGTAATCGAACCATATGGG (SEC ID Nº: 38) Cebadores internos: PL427_for, GCTACCTTCAGTAGAAAAAACCTAGCTTATCCTATTTCATACACC (SEC ID Nº: 36) PL427_rev, GGTGTATGAAATAGGATAAGCTAGGTTTTTTCTACTGAAGGTAGC (SEC ID Nº: 37)

SLO P427L-W535F-CS35G sin marca

Cebadores externos: 25_F, GTGCGTGCTAGCGAATCGAACAAACAAAAC (SEC ID Nº: 45) 25_stopR, GCGTCTCGAGTCACTTATAAGTAATCGAACCATA (SEC ID Nº: 46) Cebadores internos: W-C_for, CCGTATCATGGCTAGAGAGGGCACTGGCTTAGCTTTCGAATG (SEC ID Nº: 47) W-C_rev, CATTCGAAAGCTAAGCCAGTGCCCTCTCTAGCCATGATACGG (SEC ID Nº: 48)

SLO P427L-

Cebadores externos:

W535F sin marca

25_F, GTGCGTGCTAGCGAATCGAACAAACAAAAC (SEC ID Nº: 45) 25_stopR, GCGTCTCGAGTCACTTATAAGTAATCGAACCATA (SEC ID Nº: 46) Cebadores internos: WF535_for, GAGTGCACTGGCTTAGCTTTCGAATGGTGGCGAAAAGTGATC (SEC ID Nº: 39) WF535_rev, GATCACTTTTCGCCACCATTCGAAAGCTAAGCCAGTGCACTC (SEC ID Nº: 40)

gen

cebadores

SLO P427L-C530G sin marca

Cebadores externos: 25_F, GTGCGTGCTAGCGAATCGAACAAACAAAAC (SEC ID Nº: 45) 25_stopR, GCGTCTCGAGTCACTTATAAGTAATCGAACCATA(SEC ID Nº: 46) Cebadores internos: CG530_for, CCGTATCATGGCTAGAGAGGGCACTGGCTTAGCTTGGGAATG (SEC ID Nº: 43) CG530 rev, CATTCCCAAGCTAAGCCAGTGCCCTCTCTAGCCATGATACGG (SEC ID Nº: 44)

SLO MA248

Cebadores externos:

marcada con His

25F NheI, GTGCGTGCTAGCGAATCGAACAAACAAAACACTGC (SEC ID Nº: 34) 25 revhis, GCATTCGATCCTCGAGCTTATAAGTAATCGAACCATATGGG (SEC ID Nº: 38) Cebadores internos: M248for, CTGGTGGTAATACGCTTCCTAGAACACAATATACTGAATCAATGG (SEC ID Nº: 49) M248rev, CCATTGATTCAGTATATTGTGTTCTAGGAAGCGTATTACCACCAG (SEC ID Nº: 50)

Tabla 2.

identificador de secuencia

Gen SLO

aminoácido nucleótido

sin marca

marcado con His sin marca marcado con His

natural

1-12 13 14

P427L

20 15 28 56

C530G

22 16 57

W535F

21 18 51

M248

23 17 58

W535F + D482N

24 19 52

P427L + C530G

26 53 32

P427L + W535F

25 54 31

P427L + C530G + W535F

27 55 33

Células competentes BL21(DE3) de E. coli (Novagen) se transformaron con la construcción correcta. Se añadió medio LBPTK y, después de la incubación durante 1 h a 37 ºC, con agitación a 250 rpm, se sembraron bacterias sobre placas LBPTK que contenían 50 µg/ml de kanamicina. Células BL21(DE3) pet24b+ SLO natural sin marca se cultivaron a 25 ºC y se indujeron con IPTG 1 mM. La expresión del clon se verificó por SDS-PAGE (sin marca, FIGS. 8A y 8B; marcadas con His, FIG. 9).

Ejemplo 2

Purificación de proteínas marcadas con His

Se suspendieron sedimentos de E. coli en tampón de lisis y se mezclaron durante 30-40 minutos a temperatura ambiente. Los lisados se centrifugaron a 30-40000 x g durante 20-25 minutos y los sobrenadantes se cargaron sobre 5 columnas equilibradas con tampón de lavado A (Poli-Prep con 1 ml de resina Chelating Sepharose Fast Flow activada con Ni). La resina cargada se lavó tres veces con tampón de lavado A y tres veces con tampón de lavado

B. Las proteínas se eluyeron con tampón de elución en tubos Eppendorf que contenían 2 mM final de DTT. Las proteínas de elución totales se cuantifican con reactivo de Bradford y luego se analizaron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (FIGS. 8 y 9).

10 Tampones

Tampón de lisis:

10 ml de B-PER™ (reactivo de extracción de proteínas bacterianas, cat. Pierce 78266) concentración final de MgCl2 de 0,1 mM ADNsa I (cat. Sigma D-4263) 100 unidades

15 lisozima (cat. Sigma L-7651) concentración final de 1 mg/ml tampón de lavado A: NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, pH 8,0 tampón de lavado B: imidazol 20 mM, NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, pH 8,0 tampón de elución: imidazol 250 mM, NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, pH 8,0

Ejemplo 3

20 Purificación de proteínas sin marca

Preparación de lisados

Aproximadamente 80-110 g de sedimento de cultivo de bacteriano se suspendieron en 200-280 ml de reactivo B-PER™ (Pierce) complementado con 6 comprimidos de inhibidor de proteasa COMPLETE®, 10 ml de EDTA 0,2 M a pH 7,5 (concentración final 5 mM), 10 ml de una disolución de 100 mg/ml de lisozima, 8 ml de una disolución de

25 10000 K unidades/ml de ADNsa I y 1 ml de disolución MgCl2 50 mM. La lisis bacteriana se logró agitando la suspensión bacteriana durante 60 minutos hasta que se obtuvo una suspensión homogénea.

Tras la centrifugación durante 60 minutos a 13000 rpm (25400 x g), el sobrenadante se filtró usando un filtro de 0,22 µm y se diluyó con H2O hasta que se obtuvo una conductividad de 1,8-1,9 mS. El pH se ajustó a 8,0. La concentración de proteína se determinó por el método de Bradford.

30 Cromatografía de intercambio aniónico

El sobrenadante derivado del lisado tratado como se ha descrito anteriormente se cargó sobre una columna HP 50/10 Q Sepharose (-200 ml), previamente equilibrada con TRIS 30 mM, pH 8,0. Se recogió el flujo continuo. Las fracciones que contenían una proteína GAS25 se reunieron y se dializaron contra fosfato de Na 10 mM, pH 6,8. La concentración de proteína se determinó por el método de Bradford.

35 Tampón A: TRIS 30 mM, pH 8,0 Tampón B: TRIS 30 mM, NaCl 1 M, pH 8,0 Equilibrio y carga: 0 % de B Gradiente: 0-25 % de B en 5 VC - 25 % de B 2 VC Lavado: 100 % de B 2 VC + 3 VC

40 Flujo: 20 ml/min Volumen de fracción: 14 ml

Cromatografía de hidroxilapatita

El conjunto previamente obtenido se cargó sobre una columna CHT20 previamente equilibrada con fosfato de Na 10 mM, pH 6,8. Se recogió el flujo continuo.

45 Tampón A: fosfato de Na 10 mM, pH 6,8 Tampón B: fosfato de Na 500 mM, pH 6,8 Lavado: 8 VC Lavado: 30 % de B 6 VC Gradiente: 30-100 % de B (10 VC)

50 Lavado: 100 % de B Flujo: 5 ml/min Volumen de fracción: 5 ml

Se cargaron alícuotas de la fracción sobre 12 % de geles Criterion bajo condiciones reductoras y no reductoras. Las fracciones que contenían proteína GAS25 se reunieron y la concentración de proteína se determinó por el método de Bradford.

Cromatografía por filtración en gel

El conjunto recogido se concentró usando un filtro Amicon con el fin de conseguir un volumen < 10 ml. El material concentrado se cargó sobre HiLoad Superdex 200 26/60 equilibrada con al menos 3-4 volúmenes de columna de PBS.

Tampón: PBS

Elución: Isocrática

Flujo: 2,5 ml/min

Volumen de fracción: 5 ml

Las fracciones que contenían proteína GAS25 se reunieron y la concentración de proteína se determinó por Bradford. Una estimación adicional de la concentración de proteína se realizó por medición de UV considerando Abs al 0,1 % (=1 g/l) 1,119. La pureza de la proteína se analiza por electroforesis en gel de poliacrilamida (FIG. 11).

Ejemplo 4

Ensayos hemolíticos

Protocolo para el ensayo hemolítico cuantitativo

Se prepararon diluciones seriadas de toxina en placas de 96 pocillos con fondos con forma de U usando PBS + 0,5 % de BSA. Un ml de sangre de oveja se lavó tres veces en PBS (con centrifugación a 3000 x g) y los glóbulos sanguíneos se suspendieron en 5 ml de PBS. Se añadió un volumen de suspensión igual a 50 µl de cada dilución de toxina y se incubaron a 37 ºC durante 30 min. Se usó Triton (2 %) en agua para dar 100 % de hemólisis, y se usó PBS + 0,5 % de BSA como control negativo. Entonces, las placas se centrifugaron durante 5 min a 1.000 x g, y el sobrenadante se transfirió cuidadosamente a placas de fondo plano de 96 pocillos. La absorbancia se leyó a 540 nm.

Comparación de toxina que contiene SLO natural y mutante de SLO P427L

El gen que codifica SLO P427L se amplificó usando PCR a partir del genoma de SF370 M1 y se clonó en el vector pET21b+, que mostró expresión en BL21DE3 de E. coli de la proteína marcada con His. Se usaron extractos solubles de E. coli que expresaban cantidades similares de las proteínas de estreptolisina O naturales y mutadas (véase la FIG. 5) para realizar un ensayo hemolítico para comparar las propiedades citolíticas de los dos antígenos. El resultado del ensayo se muestra en la FIG. 2, que demuestra que la proteína mutada es al menos 100 veces menos tóxica que la natural.

Comparación de SLO natural purificada y mutante de SLO P427L

El mutante SLO P427L se purificó según procedimientos convencionales de purificación para proteínas recombinantes marcadas con His (FIG. 3). Se usaron diferentes concentraciones de las proteínas naturales purificadas y mutadas para repetir el ensayo hemolítico, que confirmó la disminución de la actividad citolítica (FIG. 4).

Actividad hemolítica de extractos de E. coli que contienen SLO natural marcada con His y sin marca y el mutante de SLO P427L

Los inventores compararon la actividad hemolítica de lisados de E. coli transformados con SLO recombinante natural (rSLO) sin una marca de His (BL21 DE3, Novagen nº 71382- pET24) y rSLO mutante P427L sin una marca de His (BL21 DE3, Novagen nº 71382- pET24). Se usó BL21 DE3 de E. coli (Novagen, nº 71382) transformada con pET24 sin inserto como control negativo. El control positivo fue una disolución hipotónica que contenía Triton al 2 % en agua. El control negativo fue el tampón de dilución de proteína (PBS que contenía 0,5 % de BSA, pH 7,4).

La hemólisis se determinó midiendo la absorbancia a 540 nm (A540nm) de los sobrenadantes. El título se calculó como la dilución con el 50 % de A540nm máxima.

Los resultados se muestran en las Tablas 3 y 4 y en la FIG. 6. Estos datos demuestran que, bajo las mismas condiciones, P427L mutante es 1000 veces menos hemolítica que SLO natural.

Tabla 3.

E. coli

UFC/ml

control negativo

3,9 x 108

rSLO natural (sin marca)

1,2 x 109

rSLO P427L (sin marca)

1,03 x 109

Tabla 4.

rSLO natural sin marca

rSLOP427L sin marca

título (DO=50 % de hemólisis)

50.000 48

título natural/P427L

1042

Comparación de SLO natural y diversos mutantes de SLO

5 La actividad hemolítica de SLO natural se comparó con la actividad hemolítica de varios mutantes de SLO diferentes. Los resultados se muestran en la FIG. 13 y en la Tabla 5, más adelante. Una unidad hemolítica (UH) se define como la cantidad de toxina requerida para obtener el 50 % de lisis máxima obtenida tratando glóbulos sanguíneos con el 2 % de Triton.

Tabla5.

Proteína

UH/mg UH/mg de SLO/mutantes

rSLO natural

22760 1

C530G

620 37

W535F

160 146

W535F-D482N

<< 20 >> 1000

P427L

aproximadamente 20 aproximadamente 1000

.ala248

<< 20 >> 1000

Control neg.

<< 20 >> 1000

10 Debido a diferencias en la pureza de proteínas, las unidades de hemólisis/mg de mutantes indicados en negrita están sobreestimadas; sin embargo, es evidente que (1) W535F mutante es menos hemolítica que el mutante C530G; (2) el mutante P427L es aproximadamente 1000 veces menos hemolítico que la natural y aproximadamente 6-25 veces menos hemolítico que otros dos mutantes W535F y C530G; y (3) el mutante MA248 es ciertamente menos hemolítico que la natural.

15 Efecto del colesterol

Diluciones seriadas de dos-cinco veces en PBS-BSA al 0,5 % de lisados de E. coli o lisado de E. coli con 200 mg/ml de colesterol obtenido después del crecimiento de células a 30 ºC e inducción con IPTG 1 mM a 25 ºC y DO600nm aproximadamente 0,4-0,6 se ensayaron para su actividad hemolítica. Cincuenta microlitros de una disolución de eritrocitos de oveja al 2 % en PBS se trataron con un volumen igual de preparaciones de proteína obtenidas lisando

20 bacterias, 3 horas después de inducción, con tampón de lisis (disolución B-PER-PIERCE- MgCl2 1 mM, 100K unidades/ml de ADNsa (Sigma) y lisozima (Sigma) durante 30-40 minutos. Entonces, la fracción insoluble se centrifugó (15 minutos, 21000 x g, 4 ºC) y el sobrenadante (lisado de E. coli) se transfirió a un nuevo tubo de Eppendorf que contenía DTT a la concentración final de 5 mM.

Bajo esta condición, el colesterol no inhibió ni SLO natural ni mutante hasta que se usó un factor de dilución de 100

25 veces; por tanto, no hubo efecto sobre la lisis inducida por mutante. A diferencia, la lisis inducida por natural se redujo enormemente. La lisis inducida por el control negativo no estuvo influida por el colesterol, que sugiere que la inhibición inducida por colesterol es específica. Véase la Tabla 6 y FIG. 7.

Tabla 6

rSLO natural sin marca

rSLO P427L sin marca

título (DO=50 % de hemólisis)

400 40

título natural/P427L

10

Ejemplo 5

Inhibición de la hemólisis

Protocolo

Diluciones dobles seriadas de sueros de ratones inmunizados con proteínas SLO naturales o mutantes (sin

5 adyuvantes o con alumbre o MF59™ como adyuvantes) se prepararon en placas de 96 pocillos con fondos con forma de U usando PBS + 0,5 % de BSA. Los sueros de ratones inmunizados con PBS o con adyuvante solo, según fuera apropiado, se usaron como controles negativos. Se añadió un volumen igual de una disolución de toxina de 50-100 ng/ml (3,5-7 UH) en PBS + 0,5 % de BSA y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos bajo agitación (800 rpm). Después de la incubación, 50 ml de esta disolución se transfirieron a una nueva placa de 96

10 pocillos, y se añadió un volumen igual de una suspensión de eritrocitos de oveja (lavada 3 x en PBS) y se incubó a 37 ºC durante 30 min. Entonces, las placas se centrifugaron durante 1 min a 1.000 x g, el sobrenadante se transfirió cuidadosamente a placas de fondo plano de 96 pocillos y la absorbancia se leyó a 540 nm. En los resultados descritos más adelante, el título de inhibición se expresa como la dilución de suero que redujo la hemólisis inducida por Triton al 50 %.

15 Inhibición de la hemólisis de SLO por antisueros para SLO natural

La inhibición de la hemólisis de SLO por antisueros anti-SLO natural se muestra en las FIG. 14, FIG. 15, FIG. 16 y las Tablas 7-9. Los títulos de sueros anti-SLO están incluidos entre 1/7.000 y 1/14.000 (media aritmética, 1/12.167 ±

2.714. Los títulos del suero de control negativo (adyuvante de Freund) están incluidos entre 1/375 y 1/4.000 (media aritmética, 1/1.854 ± 1.384).

20 Tabla 7 (mostrada gráficamente en la FIG. 15).

media aritmética de sueros probados - % de hemólisis

factor de dilución/suero

sueros anti-SLO sueros de control negativo

125

9

250

10

500

19

1.000

2 38

2.000

2 69

4.000

2 84

8.000

19 93

16.000

78 97

32.000

99

64.000

97

128.000

100

Tabla 8 Tabla 9 (mostrada gráficamente en la FIG. 16)

sueros anti-SLO (adyuvante de Freund)

sueros de control negativo (adyuvante de Freund)

suero

50 % de inhib. de la hemólisis suero 50 % de inhib. de la hemólisis

A

14.000 1 4.000

B

7.000 2 1.500

C

12.000 3 375

D

12.000 4 3.000

E

14.000 5 1.500

F

14.000 6 750

ng/ml de SLO

% de hemólisis

1,6

4

3,1

3

6,3

6

12,5

30

25

94

50

100

100

100

200

100

Valoración de la actividad hemolítica de SLO natural, SLO natural químicamente desintoxicada y mutantes de SLO

La valoración de la actividad hemolítica de SLO natural, SLO natural químicamente desintoxicada y mutantes de SLO (P427L; P427L + W535F) se muestra en las FIGS. 17-19 y en la Tabla 10.

Tabla 10 (mostrada gráficamente en la FIG. 18).

proteína

UH/mg UH/mg de SLO/mutantes

SLO natural sin marca

728.307 1

SLO P427L sin marca

711 1,024

SLO P427L + W535F sin marca

<22 (estim. 10) >33.000

SLO natural sin marca

45.511

SLO natural sin marca, desintoxicada

<<89 >>511

Inhibición de la hemólisis de SLO por antisuero contra proteínas SLO mutantes

La inhibición de la hemólisis de SLO por antisueros contra proteínas SLO mutantes se muestra en las FIGS. 20-22 y las Tablas 11-13. Usando 50 ng/ml (3,5 UH) de toxina, la dilución del suero requerida para obtener el 50 % de la reducción de la actividad hemolítica de SLO para el mutante de SLO W535-P427L es 1/17.860 usando adyuvante de

10 alumbre y 1/7991 usando el adyuvante MF59™. Los títulos de control negativo (adyuvante solo) son 1/1.000 (alumbre) y 1/125 (MF59™).

Tabla 11 (mostrada gráficamente en la FIG. 20).

50 ng/ml (3,5 UH) de SLO natural

adyuvante

inhibición específica/inhibición no específica

alumbre

18

MF™59

64

Tabla 12 (mostrada gráficamente en la FIG. 21)

100 ng/ml (37 UH) de SLO natural

adyuvante

inhibición específica/inhibición no específica

alumbre

>227

MF™59

>117

Tabla 13 (mostrada gráficamente en la FIG. 22)

ng/ml de SLO

% de hemólisis

1,6

3,5

3,1

5,8

6,3

13

12,5

42

25

86

50

100

100

100

200

100

Una comparación de las diluciones de sueros requeridas para obtener el 50 % de reducción de la actividad hemolítica de SLO para SLO natural y para el mutante W535-P427L, ambos usando el adyuvante de alumbre, se muestra en la FIG. 25. Usando 100 ng/ml (7 UH) de toxina, la dilución del suero requerida para obtener el 50 % de

5 reducción de la actividad hemolítica de SLO para el mutante de SLO W535-P427L es 1/12000, en comparación con una dilución de suero de 1/8750 +/- 1500. La dilución de control negativo (adyuvante solo) es aproximadamente 1/50.

Ejemplo 6

Experimentos de protección in vivo

10 La proteína SLO P427L purificada, junto con adyuvante de Freund, se administró intraperitonealmente a 40 ratones. Entonces, los ratones se expusieron intranasalmente a la cepa 3348 M1 de GAS. La Tabla 14 informa de los datos obtenidos en 3 experimentos separados, que muestran que el 100 % de protección fue coherentemente lograda en todos los experimentos.

Tabla 14. Tasa de supervivencia a la infección de ratones

% de ratones supervivientes

antígeno

Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3

GAS25 Pro247Leu

100 100 100

contaminantes de E. coli (control negativo)

10 10 10

proteína M1 homóloga (control positivo)

100 90 90

15 Grupos de 10-20 ratones se inmunizaron con 20 µg de la proteína recombinante en los días 0, 21 y 35. Los ratones de grupos de control negativos se inmunizaron tanto con GST solo como con contaminantes de E. coli, dependiendo de la versión de la proteína recombinante de GAS usada. Dos semanas después de la tercera inmunización se tomaron muestras de sangre. Algunos días después, los ratones inmunizados se expusieron intranasalmente a 108 ufc (50 µl) de las cepas M1 3348 de GAS. La supervivencia de ratones se monitorizó durante un periodo de 10-14

20 días. Los sueros inmunes obtenidos de los diferentes grupos se probaron para inmunogenicidad sobre la proteína recombinante SLO entera (análisis de transferencia Western). Los resultados se muestran en la Tablas 15 y 16.

Tabla 15 Tabla 16

Proteína

nº de ratones % de supervivencia % de supervivencia de control negativo

GAS25_Pro247Leu His

10 90 30

GAS25_Pro247Leu His

10 100 20

GAS25_Pro247Leu His

10 80 30

GAS25_WT

20 95 15

GAS25_WT

10 100 40

Proteína

nº de ratones % de supervivencia % de supervivencia de control negativo

rSLO natural marcada con His

20 100 45

C530G marcada con His

20 100 45

W535F marcada con His

20 100 45

W535F-D482N marcada con His

20 100 45

P427L marcada con His

20 95 45

Mala248 marcada con His

20 100 45

Protección contra la exposición intranasal a la cepa M1 de GAS por el mutante de SLO P427L-W535F

Treinta ratones se inmunizaron intraperitonealmente con el mutante de SLO P427L-W535F, con tanto alumbre como con MF59 como adyuvantes, y se expusieron intranasalmente a una cepa M1 de GAS. Los resultados se muestran 5 en la FIG. 26. El sesenta y siete por ciento de los ratones inmunizados con el mutante de SLO P427L-W535F y alumbre se protegieron contra la exposición intranasal con una cepa M1 de GAS, como se compara con el 3 % de los ratones de control negativo (inmunizados con adyuvante solo). El noventa por ciento de los ratones inmunizados con el mutante de SLO P427L-W535F y MF59 se protegieron contra la exposición intranasal a una cepa M1 de GAS en comparación con el 10 % de ratones de control negativo (inmunizados con adyuvante solo). Estos niveles de

10 protección son comparables a aquellos obtenidos inmunizando ratones con SLO natural.

Ejemplo 7

Protocolos

Inyección intravenosa de SLO. Una disolución de tanto SLO natural como mutante en PBS se diluye en una disolución de PBS + DTT 2 mM, luego se inyectan 100 µl en la vena de la cola de un ratón. Los ratones se observan

15 durante 2-3 días. La inyección de SLO natural normalmente produce muerte en el plazo de algunos minutos.

Ensayo de inhibición de la letalidad in vivo. Para la inhibición de la letalidad mediada por sueros inmunes, 10 µg/ratón de SLO natural (una disolución de 100 µg/ml en PBS, DTT 2 mM) se incuban durante 20 minutos con rotación de “extremo a extremo” a temperatura ambiente con tanto suero anti-SLO como suero de control (obtenido de ratones inmunizados con adyuvante solo). Después de la incubación, las muestras se inoculan en los ratones

20 mediante inyección intravenosa en la vena de la cola. Los ratones se observan durante 2-3 días.

Los resultados para SLO natural y SLO mutante P427L-W535F se muestran en la Tabla 17.

Tabla 17.

SLO natural

P427L-W535F

µg/ratón

muertos/tratados µg/ratón muertos/tratados

100

0/4

50

4/4 50 0/4

10

8/8 10 0/8

2

0/4

0,4

0/4

0,04

0/4

Se evaluó la toxicidad in vivo aguda usando una dosis de 10 µg/ratón de SLO natural como control positivo e inyección de adyuvante de Freund solo como control negativo. Se incubaron diez µg/ratón de SLO natural con tanto 25 antisuero para SLO natural como con suero de control y se inocularon en ratones como se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la Tabla 18.

Tabla 18.

SLO natural (10 µg/ratón)

sueros

dilución del suero muertos/tratados

ninguno

8/8

SLO natural

1/5 0/4

SLO natural

1/10 0/4

SLO natural

1/20 4/4

SLO natural

1/50 4/4

SLO natural

1/100 4/4

control negativo

1/5 4/4

Los resultados de otro conjunto de experimentos realizados como se ha descrito anteriormente se muestran en las Tablas 19 y 20. Se evaluó la toxicidad in vivo aguda usando tanto 5 como 10 µg/ratón de SLO natural. En particular,

5 10 µg/ratón de SLO natural se incubaron previamente tanto con sueros de ratones inmunizados con GAS25 P427L-W535F como PBS solo (sin suero). Además, 5 µg/ratón de SLO natural se incubaron previamente tanto con sueros de ratones inmunizados con GAS25 P427L-W535F como sueros de ratones inmunizados con PBS más adyuvante (alumbre), como suero de control negativo.

Los resultados demuestran que las dosis mortales de SLO natural las neutralizan sueros anti-SLO P427L-W535F, 10 pero no sueros de control negativo a la misma dilución.

Tabla 19.

SLO natural (10 µg/ratón)

Sueros

dilución del suero muertos/tratados

ninguno

--- 4/4

Anti-SLO P427L-W535F, adyuvante alumbre

1/5 0/4

Tabla 20.

SLO natural (5 µg/ratón)

Suero

dilución del suero muertos/tratados

Anti-SLO P427L-W535F, alum adyuvante

1/5 0/4

control negativo (alumbre solo)

1/5 4/4

Ejemplo 8

15 La inmunización con SLO P427L-W535F protege a los ratones contra inyección intravenosa de SLO natural

Ratones de cinco semanas de edad se inmunizaron intraperitonealmente tres veces (día 0, día 21 y día 35) con tanto SLO natural como con el mutante de SLO P427L-W535F usando alumbre como adyuvante (20 µg de proteína en 2 mg/ml de hidróxido de aluminio). Los ratones inmunizados con adyuvante solo se usaron como control negativo. En el día 55, los ratones se inyectaron intravenosamente con diferentes concentraciones de una disolución

20 de SLO natural en PBS, DTT 2 mM y se monitorizaron durante al menos 72 horas. Los resultados se muestran en la Tabla 21.

Tabla 21

Dosis de SLO sin marca natural inyectada en la vena de la cola del ratón

2,5 µg/ratón

5 µg/ratón 10 µg/ratón 20 µg/ratón

supervivencia (nº de ratones tratados)

supervivencia (nº de ratones tratados)

supervivencia (nº de ratones tratados)

supervivencia (nº de ratones tratados)

adyuvante (alumbre)

100 % (4) 0 % (12) no probado no probado

SLO natural sin marca

no probado 100 % (8) 100 % (4) 100 % (4)

SLO P427L-W535F sin marca

no probado 100 % (8) 100 % (4) 100 % (4)

Cinco µg/ratón de SLO natural es mortal para ratones inmunizados con adyuvante solo; estos ratones murieron en el plazo de algunos minutos después de la inyección de SLO. Sin embargo, incluso 20 µg/ratón de la misma preparación de SLO no mató a los ratones inmunizados con tanto SLO natural como con el mutante de SLO P427L

5 W535F.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Bensi, Giuliano Margarit Y Ros, Immaculada

10 Chiarot, Emiliano Grandi, Guido Scarselli, Maria

<120> Formas mutantes de estreptolisina O

<130> P052158WO

<140> US 12/339.365 20 <141>

<150> US 61/016.193

<151>

25 <150> US 61/088.381

<151>

<160> 59

30 <170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1

<211> 571

<212> PRT 35 <213> S. pyogenes

<400> 1

<210> 2

<211> 571

<212> PRT

<400> 2

<210> 3

<211> 571

<212> PRT

<400> 3 <210> 4

<211> 571

<212> PRT

<400> 4 <210> 5

<211> 571

<212> PRT

<400> 5

<210> 6

<211> 571

<212> PRT

<400> 6 <210> 7

<211> 571

<212> PRT

<400> 7 <210> 8

<211> 571

<212> PRT

<400> 8 <210> 9

<211> 571

<212> PRT

<400> 9

<210> 10

<211> 571

<212> PRT

<400> 10 <210> 11

<211> 571

<212> PRT

<400> 11 <210> 12

<211> 571

<212> PRT

<400> 12

<210> 13

<211> 551

<212> PRT

<400> 13 <210> 14

<211> 1656

<212> ADN

<400> 14 <210> 15

<211> 551

<212> PRT

<400> 15 <210> 16

<211> 551

<212> PRT

<400> 16 <210> 17

<211> 550

<212> PRT

<400> 17 <210> 18

<211> 551

<212> PRT

<400> 18

<210> 19

<211> 551

<212> PRT

<400> 19 <210> 20

<211> 543

<212> PRT

<400> 20 <210> 21

<211> 571

<212> PRT

<400> 21 <210> 22

<211> 571

<212> PRT

<400> 22

<210> 23

<211> 570

<212> PRT

<400> 23 <210> 24

<211> 571

<212> PRT

<400> 24 <210> 25

<211> 543

<212> PRT

<400> 25

<210> 26

<211> 543

<212> PRT

<400> 26

<210> 27

<211> 543

<212> PRT

<400> 27 <210> 28

<211> 1632

<212> ADN

<400> 28 <210> 29

<211> 1632

<212> ADN

<400> 29

<210> 30

<211> 1632

<212> ARN

<213>

S. pyogenes 15

<400> 30

<210> 31

<211> 1632

<212> ADN

<400> 31 <210> 32

<211> 1632

<212> ADN

<400> 32 <210> 33

<211> 1632

<212> ADN

<400> 33

<210> 34

<211> 35

<212> ADN

<400> 34

gtgcgtgcta gcgaatcgaa caaacaaaac actgc

35

<210> 35 <211> 42 <212> ADN <213> S. pyogenes

<400> 35 gcattcgatc ctcgagctac ttataagtaa tcgaaccata tg

42

<210> 36 <211> 45 <212> ADN <213> S. pyogenes

<400> 36 gctaccttca gtagaaaaaa cctagcttat cctatttcat acacc

45

<210> 37 <211> 45 <212> ADN <213> S. pyogenes

<400> 37 ggtgtatgaa ataggataag ctaggttttt tctactgaag gtagc

45

<210> 38 <211> 41 <212> ADN <213> S. pyogenes

<400> 38 gcattcgatc ctcgagctta taagtaatcg aaccatatgg g

41

<210> 39 <211> 42 <212> ADN <213> S. pyogenes

<400> 39 gagtgcactg gcttagcttt cgaatggtgg cgaaaagtga tc

42

<210> 40 <211> 42 <212> ADN <213> S. pyogenes

<400> 40 gatcactttt cgccaccatt cgaaagctaa gccagtgcac tc

42

<210> 41 <211> 55 <212> ADN <213> S. pyogenes

<400> 41 gttgctcaat atgaaatcct ttggaatgaa atcaattatg atgacaaagg aaaag

55

<210> 42 <211> 55 <212> ADN <213> S. pyogenes

<400> 42 cttttccttt gtcatcataa ttgatttcat tccaaaggat ttcatattga gcaac

55

<210> 43 <211> 42 <212> ADN <213> S. pyogenes

<400> 43 ccgtatcatg gctagagagg gcactggctt agcttgggaa tg

42

<210> 44 <211> 42 <212> ADN <213> S. pyogenes

<400> 44 cattcccaag ctaagccagt gccctctcta gccatgatac gg

42

<210> 45 <211> 30 <212> ADN <213> S. pyogenes

<400> 45 gtgcgtgcta gcgaatcgaa caaacaaaac

30

<210> 46 <211> 34 <212> ADN <213> S. pyogenes

<400> 46 gcgtctcgag tcacttataa gtaatcgaac cata

34

<210> 47 <211> 42 <212> ADN <213> S. pyogenes

<400> 47 ccgtatcatg qctagagagg gcactggctt agctttcgaa tg

42

<210> 48 <211> 42 <212> ADN <213> S. pyogenes

<400> 48 cattcgaaag ctaagccagt gccctctcta gccatgatac gg

42

<210> 49 <211> 45 <212> ADN <213> S. pyogenes

<400> 49 ctggtggtaa tacgcttcct agaacacaat atactgaatc aatgg

45

<210> 50 <211> 45 <212> ADN <213> S. pyogenes

<400> 50 ccattgattc agtatattgt gttctaggaa gcgtattacc accag

45

<210> 51 <211> 1656

<212> ADN

<400> 51

<210> 52

<211> 1656

<212> ADN

<213>

S. pyogenes

<400> 52

<210> 53

<211> 551

<212> PRT

<400> 53

<210> 54

<211> 551

<212> PRT

<400> 54 <210> 55

<211> 551

<212> PRT

<400> 55

<210> 56

<211> 1656

<212> ADN

<400> 56

<210> 57

<211> 1656

<212> ADN

<213>

S. pyogenes

<400> 57

<210> 58

<211> 1653

<212> ADN

<400> 58

<210> 59

<211> 1653

<212> ADN

<400> 59

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada según SEC ID Nº: 1, en la que los aminoácidos en las posiciones P427 y W535 están sustituidos con otro aminoácido, y en la que la actividad hemolítica de la proteína SLO mutante se reduce al menos el 50 % con respecto a SLO natural.

2. 2.

   Una proteína SLO mutante purificada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 25 y SEC ID Nº: 27.

3. 3.

   La proteína SLO mutante purificada de la reivindicación 1 que se acopla a una proteína portadora.

4. 4.

   La proteína SLO mutante purificada de la reivindicación 3, en la que la proteína portadora está seleccionada del grupo que consiste en una toxina bacteriana, un toxoide bacteriano, una proteína de la membrana externa de N. meningitidis, una proteína de choque térmico, una proteína de pertussis, proteína D de H. influenzae, una citocina, una linfocina, una hormona, un factor de crecimiento, toxina A de C. difficile, toxina B de C. difficile y una proteína de captación de hierro.

5. 5.

   Una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína SLO mutante de la reivindicación 1 o de la reivindicación

6. 2.

7. 6.

   La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5 que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de secuencias codificantes mostradas en SEC ID Nº: 31 y SEC ID Nº: 33.

8. 7.

   Una composición de vacuna que comprende:

   (a)

   un agente activo seleccionado de:

   (i)

   proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada como se define en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2; y

   (ii)

   una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada como se define en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2; y

   (b)

   un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. 8.

   La composición de vacuna de la reivindicación 7 que comprende además uno o más agentes activos seleccionados del grupo que consiste en:

   (iii) un antígeno de GAS;

   (iv)

   una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno de GAS;

   (v)

   un agente activo que es útil en una vacuna pediátrica tal como un antígeno polipeptídico de un patógeno seleccionado del grupo que consiste en N. meningitidis, S. pneumoniae, Bordetella pertussis, Moraxella catarrhalis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, virus respiratorio sincitial, virus de la poliomielitis, virus del sarampión, virus de las paperas, virus de la rubeola y antígenos polipeptídicos de rotavirus, o una molécula de ácido nucleico que codifica el antígeno polipeptídico; y

   (vi)

   un agente activo que es útil en una vacuna para ancianos o individuos inmunodeprimidos tal como un antígeno polipeptídico de un patógeno seleccionado del grupo que consiste en Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, antígenos polipeptídicos del virus de la gripe y del virus paragripal, o una molécula de ácido nucleico que codifica el antígeno polipeptídico.

10. 9.

    Un procedimiento de preparación de una vacuna para la prevención o el tratamiento de infección por Streptococcus pyogenes que comprende combinar:

    (a)

    un agente activo seleccionado de:

    (i)

    una proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada como se define en la reivindicación 1

    o en la reivindicación 2; y

    (ii)

    una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada como se define en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2; y

    (b)

    un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. 10.

    El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el agente activo es la proteína SLO mutante purificada y la proteína SLO mutante se prepara mediante un procedimiento que comprende:

    (a)

    cultivar una célula huésped que comprende una construcción de expresión que codifica la proteína SLO mutante; y

    (b)

    recuperar la proteína SLO mutante.

12. 11.

    El procedimiento de la reivindicación 9 que comprende además combinar con el vehículo farmacéuticamente aceptable uno o más agentes activos seleccionados del grupo que consiste en:

    (iii) un antígeno de GAS; y

    (iv) una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno de GAS.

    5 12. Uso de un agente activo en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir infección por Streptococcus pyogenes, en el que el agente activo está seleccionado del grupo que consiste en:

    (i) una proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada como se define en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2; y

    (ii)

    una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada 10 como se define en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2.

13. 13.

    Una proteína SLO mutante purificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5 o de la reivindicación 6 para su uso como una vacuna.

14. 14.

    Una proteína SLO mutante purificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, una molécula de ácido

    nucleico de la reivindicación 5 o de la reivindicación 6, o una composición de vacuna de la reivindicación 7 o de la 15 reivindicación 8 para su uso en terapia.
15. 15. Una proteína SLO mutante purificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5 o de la reivindicación 6, o una composición de vacuna de la reivindicación 7 o de la reivindicación 8 para tratar o prevenir infección por Streptococcus pyogenes.