ES2390082T5

ES2390082T5 - Conjugados de resto de Factor IX y polímeros

Info

Publication number: ES2390082T5
Application number: ES05767845.0T
Authority: ES
Inventors: Mary J. Bossard; Gayle Stephenson
Original assignee: Nektar Therapeutics
Current assignee: Nektar Therapeutics
Priority date: 2004-06-30
Filing date: 2005-06-30
Publication date: 2018-01-19
Anticipated expiration: 2025-06-30
Also published as: US20100120982A1; US9347054B2; IL180115A0; JP6162358B2; AU2005260763B2; KR101100059B1; JP2017105820A; US20100130684A1; NO342927B1; AU2005260763A1; US8586711B2; NO20070552L; US20210023186A1; KR20110030712A; KR101146160B1; US7579444B2; JP2008505119A; EP1765411A2; US20100137511A1; KR20070030308A

Description

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Los restos de aminoácidos en los péptidos se abrevian como sigue: Fenilalanina es Phe o F; Leucina es Leu o L; Isoleucina es Ile o I; Metionina es Met o M; Valina es Val o V; Serina es Ser o S; Prolina es Pro o P; Treonina es Thr

o T; Alanina es Ala o A; Tirosina es Tyr o Y; Histidina es His o H; Glutamina es Gln o Q; Asparagina es Asn o N; Lisina es Lys o K; Ácido Aspártico es Asp o D; Ácido Glutámico es Glu o E; Cisteína es Cys o C; Triptófano es Trp o W; Arginina es Arg o R; y Glicina es Gly o G.

Volviendo a una o más de las realizaciones de la presente invención, se proporciona un conjugado, conjugado que comprende un resto de Factor IX unido covalentemente a través de un enlace amida, bien directamente o bien a través de un resto espaciador que comprende uno o más átomos, a un polímero soluble en agua como se ha definido anteriormente, donde el resto espaciador no incluye azúcares o hidratos de carbono y el conjugado carezca básicamente de cualquier polímero soluble en agua unido directamente, o a través de un resto espaciador, a un azúcar o hidrato de carbono que, a su vez, esté unido a un resto de Factor IX. Los conjugados de la presente invención tendrán una o más de las siguientes características.

El Resto de Factor IX

Como se ha indicado previamente, el término "resto de Factor IX" incluirá el resto de Factor IX anterior a la conjugación así como el resto de Factor IX que sigue a la unión con un polímero soluble en agua. Se entiende, sin embargo, que cuando un resto de Factor IX está unido a un polímero soluble en agua no peptídico, el resto de Factor IX se altera ligeramente debido a la presencia de uno o más enlaces covalentes asociados con el enlace al polímero (o al resto espaciador que está unido al polímero). A menudo, esta forma ligeramente alterada del resto de Factor IX unido a otra molécula se denomina "residuo" del resto de Factor IX.

El resto de Factor IX se puede obtener a partir de métodos no recombinantes o a partir de métodos recombinantes. Además, el resto de Factor IX se puede obtener a partir de fuentes humanas o a partir de fuentes animales.

El resto de Factor IX se puede obtener de manera no recombinante. Por ejemplo, el resto de Factor IX se puede obtener a partir de fuentes derivadas de la sangre. En particular, el Factor IX se puede fraccionar a partir del plasma humano usando técnicas de precipitación y de centrifugación conocidas por los expertos habituales en la materia. Véase, por ejemplo, Wickerhauser (1976) Transfusion 16(4):345-350 y Slichter et al. (1976) Transfusion 16(6):616

626. El Factor IX también se puede aislar a partir de los granulocitos humanos. Véase Szmitkoski et al. (1977) Haematologia (Budap.) 11(1-2):177-187.

El resto de Factor IX se puede obtener a partir de métodos recombinantes. Por ejemplo, se ha aislado, caracterizado, y clonado en vectores de expresión el ADNc que codifican para el Factor IX nativo, que es un resto de Factor IX. Véase, por ejemplo, Choo et al. (1982) "Molecular Cloning of the Gene for Human Anti-hemophilic Factor IX," Nature, Vol. 299: 178-180, and Kurachi et al. (1982) "Isolation and Characterization of a cDNA Coding for Human Factor IX," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 79:6461-65.

Una vez expresado, el Factor IX nativo es una glicoproteína de cadena única de aproximadamente 55000 daltons. Se puede considerar estructuralmente que tiene cuatro dominios: el dominio rico en Gla o gamma carboxiglutamato; las regiones de tipo EGF; el péptido de activación; y el sitio activo. La secuencia de aminoácidos expresada se proporciona como SEC ID Nº 1. A menos que se indique de forma específica, todas las asignaciones de una ubicación numérica de un resto de aminoácido como se ha proporcionado el presente documento son en base a la SEC ID Nº1.

Los métodos recombinantes ejemplares usados para preparar un resto de Factor IX (ya sea Factor IX nativo o una proteína diferente que tiene la actividad de Factor IX) se pueden describir brevemente. Tales métodos implican la construcción del ácido nucleico que codifica el polipéptido o fragmento deseado, la clonación del ácido nucleico en un vector de expresión, la transformación en una célula huésped (por ejemplo, planta, bacterias tales como E. coli, levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae, o células de mamífero tales como células ováricas de hamster Chino o células de riñón de cría de hamster), y la expresión del ácido nucleico para producir el polipéptido o fragmento deseado. La expresión puede ocurrir a través de la expresión exógena (cuando la célula huésped contiene de forma natural la codificación genética deseada) o a través de la expresión endógena. Los métodos para la producción y la expresión de los polipéptidos recombinantes in vitro en células huésped procariotas y eucariotas se conocen por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, el documento de Patente de los Estados Unidos de América Nº 4.868.122.

Para facilitar la identificación y la purificación de un polipéptido recombinante, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para una marca de epítopo u otra secuencia de afinidad de unión se pueden insertar o añadir en el marco con secuencia de codificación, produciendo de ese modo una proteína de fusión que comprende el polipéptido deseado y un polipéptido adecuado para la unión. Las proteínas de fusión se pueden identificar y purificar mediante un primer procesado de una mezcla que contiene la proteína de fusión a través de una columna de afinidad que soporta restos de unión (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra la marca del epítopo u otra secuencia de unión en las proteínas de fusión, uniendo de ese modo la proteína de fusión a la columna. A partir de entonces, se puede recuperar la proteína de fusión lavando la columna con la solución apropiada (por ejemplo,

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dendrítico. Además, la estructura interna del polímero se puede organizar con cualquier número de patrones diferentes y se puede seleccionar del grupo que consiste en homopolímero, copolímero alternante, copolímero aleatorio, copolímero en bloque, tripolímero alternante, tripolímero aleatorio, y tripolímero en bloque.

Típicamente, el PEG activado y otros polímeros solubles en agua activados (es decir, reactivos poliméricos) se activan con un grupo activador adecuado apropiado para el acoplamiento a un sitio deseado en el resto de Factor IX. Por lo tanto, un reactivo polimérico poseerá un grupo reactivo para la reacción con el resto de Factor IX. Los reactivos poliméricos y los métodos representativos para la conjugación de estos polímeros con un resto activo se conocen en la técnica y se describen adicionalmente en Zaiipsky, S., et al., "Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides" en Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992), y en Zaiipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16: 157

182.

Típicamente, el peso molecular promedio en peso del polímero soluble en agua en el conjugado está en el intervalo de 6000 daltons a 90000 daltons, en el intervalo de 10000 daltons a 85000 daltons, en el intervalo de mayor que 10000 daltons a 85000 daltons, en el intervalo de 20000 daltons a 85000 daltons, en el intervalo de 53000 daltons a 85000 daltons. Para cualquier polímero soluble en agua, se prefieren los PEG que tienen un peso molecular dentro de uno o más de estos intervalos.

Los pesos moleculares promedio en peso ejemplares para el polímero soluble en agua incluyen aproximadamente 6000 daltons, aproximadamente 7000 daltons, aproximadamente 7500 daltons, aproximadamente 8000 daltons,

aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente: 9000 12000 15000 25000 daltons, daltons, daltons, daltons, aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente 10000 13000 20000 30000 daltons, daltons, daltons, daltons, aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente 11000 14000 22500 35000 daltons, daltons, daltons, daltons,

aproximadamente aproximadamente: 40000 55000 daltons, daltons, aproximadamente aproximadamente 45000 60000 daltons, daltons, aproximadamente aproximadamente 50000 65000 daltons, daltons,

aproximadamente 70000 daltons, y aproximadamente 75000 daltons. También se pueden usar las versiones ramificadas del polímero soluble en agua (por ejemplo, un polímero ramificado soluble en agua de 40000 daltons compuesto de dos polímeros de 20000 daltons) que tiene un peso molecular total de cualquiera de los anteriores. En una o más realizaciones, el conjugado no tendrá ningún resto de PEG unido, directa o indirectamente, con un PEG que tenga un peso molecular promedio en peso inferior a aproximadamente 6000 daltons.

Cuando se usan como el polímero, los PEG comprenderán típicamente un determinado número de monómeros de (OCH2CH2) [o monómeros de (CH2CH2O), dependiendo de cómo se defina el PEG]. Como se ha usado a lo largo de la descripción, el número de unidades de repetición se identifica a través del subíndice "n" en "(OCH2CH2)n-". De este modo, el valor de (n) entra típicamente dentro de uno o más de los siguientes intervalos: de aproximadamente 100 a aproximadamente 2270, de aproximadamente 136 a aproximadamente 2050, de aproximadamente 225 a aproximadamente 1930, de aproximadamente 450 a aproximadamente 1930, de aproximadamente 1200 a aproximadamente 1930, de aproximadamente 568 a aproximadamente 2727, y de aproximadamente 1200 a aproximadamente 1900. Para cualquier polímero dado dondese conoce el peso molecular, es posible determinar el número de unidades de repetición (es decir, "n") dividiendo el peso molecular promedio en peso del polímero entre el peso molecular del monómero que se repite.

Un polímero particularmente preferente para su uso en la presente invención es un polímero con la parte terminal protegida, es decir, un polímero que tiene al menos un extremo protegido con grupo relativamente inerte, tal como un grupo alcoxi C1-6 inferior, aunque también se puede usar un grupo hidroxilo. Cuando el polímero es PEG, por ejemplo, se prefiere usar un metoxi-PEG (denominado comúnmente mPEG), que es una forma lineal de PEG dondeun extremo del polímero tiene un grupo metoxi (-OCH3), mientras que el otro extremo es un grupo hidroxilo u otro grupo funcional que opcionalmente puede estar químicamente modificado.

Tambien se describe el PEG libre o no unido es un polímero lineal terminado en cada extremo con grupos hidroxilo:

HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH,

en los que (n) oscila típicamente de cero a aproximadamente 4000.

El polímero que se ha mencionado anteriormente, alfa, omega-dihidroxipoli(etilenglicol), se puede representar de una forma breve como HO-PEG-OH dondese entiende que el símbolo -PEG-puede representar la siguiente unidad estructural:

-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-,

en la que (n) es como se ha definido anteriormente.

Otro tipo de PEG útil en la presente invención es metoxi-PEG-OH, o abreviado mPEG, dondeun extremo es el grupo

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grupo terminal isocianato y un alcohol PEG; enlaces peptídicos formados por un grupo una amina, por ejemplo, en el extremo de un polímero tal como PEG, y un grupo carboxilo de un péptido; y enlaces oligonucleótido formados por, por ejemplo, un grupo fosforamidito, por ejemplo, en el extremo de un polímero, y el grupo hidroxilo 5' de un oligonucleótido.

Tales características opcionales del polímero conjugado, es decir, la introducción de uno o más enlaces degradables en la cadena del polímero, pueden proporcionar un control adicional sobre las propiedades farmacológicas finales deseadas del conjugado después de la administración. Por ejemplo, se puede administrar un conjugado grande y relativamente inerte (por ejemplo, que tiene una o más cadenas de PEG de alto peso molecular unidas a un resto de Factor IX, por ejemplo, una o más cadenas de PEG que tienen un peso molecular mayor de aproximadamente 10000, dondeel conjugado básicamente no posee bioactividad), que se hidrolizan para generar un conjugado bioactivo que posee una porción de la cadena de PEG original. De esta manera, las propiedades del conjugado se pueden adaptar de una manera más eficaz para equilibrar la bioactividad del conjugado con el tiempo.

Los expertos habituales en la materia reconocerán que la discusión anterior relativa básicamente a los segmentos de polímero solubles en agua no es de ninguna manera exhaustiva y es meramente ilustrativa, y que se contemplan todos los materiales poliméricos que tienen las cualidades que se han descrito anteriormente. Como se usa en el presente documento, el término "reactivo polimérico" se refiere generalmente a una molécula completa, que puede comprender un segmento de polímero soluble en agua y un grupo funcional.

Conjugados

Como se ha descrito anteriormente, un conjugado de la presente invención comprende un polímero soluble en agua como se ha descrito anteriormente unido covalentemente a través de un enlace amida (directamente o a través de un resto espaciador) a un resto de Factor IX, donde el resto espaciador no incluye azúcares o hidratos de carbono y el conjugado carezca básicamente de cualquier polímero soluble en agua unido directamente, o a través de un resto espaciador, a un azúcar o hidrato de carbono que, a su vez, esté unido a un resto de Factor IX. Típicamente, para cualquier conjugado dado, habrá de uno a cuatro polímeros solubles en agua unidos covalentemente a un resto de Factor IX (dondepara cada polímero soluble en agua, el polímero soluble en agua se puede unir directamente al resto de Factor IX o a través de un resto espaciador). Además, el conjugado puede incluir no más de 6 polímeros solubles en agua unidos individualmente a un resto de Factor IX, no más de 5 polímeros solubles en agua unidos individualmente a un resto de Factor IX, no más de 4 polímeros solubles en agua unidos individualmente a un resto de Factor IX, no más de 3 polímeros solubles en agua unidos individualmente a un resto de Factor IX, y no más de 2 polímeros solubles en agua unidos individualmente a un resto de Factor IX.

El enlace en particular entre el resto de Factor IX y el polímero (o el resto espaciador que está unido al polímero) depende de una diversidad de factores. Tales factores incluyen, por ejemplo, el enlace químico en particular empleado, el resto de Factor IX en particular, los grupos funcionales disponibles dentro del resto de Factor IX (para la unión a un polímero o para la conversión en un sitio de unión adecuado), y la posible presencia de grupos funcionales reactivos adicionales dentro del resto de Factor IX.

En una o más realizaciones de la presente invención, el enlace entre el resto de Factor IX y el polímero (o el resto espaciador que está unido al polímero) es un enlace hidrolíticamente estable, tal como una amida. En una o más realizaciones, el enlace no resulta de la reacción del reactivo polimérico que soporta un grupo funcional triazina, acetilo, hidrazina, diazonio, amino, o éster de succinimidilo con el resto de Factor IX. El enlace no es un enlace carbamato y no es un enlace carbamida, y además, no se forma ningún enlace basado en la reacción de un derivado de polímero que soporta especies de isocianato o de isotiocianato con un resto de Factor IX. Una amida se puede preparar fácilmente por reacción de un grupo carboxilo contenido dentro del resto de Factor IX (por ejemplo, el grupo terminal carboxilo de un resto peptídico que tiene una actividad de Factor IX) con un polímero terminado en amino.

También se describe en el presente documento son conjugados donde el enlace entre el resto de Factor IX y el polímero (o el resto espaciador que está unido al polímero) es un enlace degradable. De este modo, el enlace del polímero soluble en agua (y cualquier resto espaciador) es "escindible." Es decir, el polímero soluble en agua (y cualquier resto espaciador) se escinde (a través de hidrólisis, procesos enzimáticos, o de otra manera), resultando de ese modo el resto de Factor IX nativo o no conjugado. Preferentemente, los enlaces de escisión dan como resultado el polímero (y cualquier resto espaciador) separado del resto de Factor IX in vivo sin dejar ningún fragmento de polímero soluble en agua (ni cualquier resto espaciador). Los enlaces degradables ejemplares incluyen carbonato, éster de carboxilato, éster de fosfato, tioéster, anhídridos, acetales, cetales, aciloxialquil éter, iminas, y ortoésteres. Tales enlaces se pueden preparar fácilmente a través de una modificación apropiada del resto de Factor IX (por ejemplo, el extremo C del grupo carboxilo de la proteína o un grupo hidroxilo de la cadena lateral de un aminoácido tal como serina o treonina contenido dentro de la proteína) y/o el reactivo polimérico usando los métodos de acoplamiento empleados comúnmente en la técnica. Sin embargo, son más preferentes los enlaces hidrolizables que se forman fácilmente por la reacción de un polímero activado adecuadamente con un grupo funcional o modificado contenido dentro del resto que tiene actividad de Factor IX.

Los conjugados (en oposición a un resto de Factor IX no conjugado) puede no poseer un grado medible de actividad

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funcionalizada con un grupo tiol, el enlace resultante será un tioéster y X será S. Cuando se emplean determinados polímeros con brazos múltiples, ramificados o bifurcados, el resto C(O)X, y en particular el resto X, puede ser relativamente más complejo y puede incluir una estructura de enlace más larga.

5 Los reactivos poliméricos que contienen un resto de hidrazida también son útiles para la conjugación con un carbonilo. En la medida en la que el resto de Factor IX no contenga un resto carbonilo, se puede introducir un resto carbonilo mediante la reducción de cualquiera de los ácidos carboxílicos (por ejemplo, el ácido carboxílico Cterminal) y/o proporcionando las versiones glicosiladas o glicadas (en las que los azúcares añadidos tienen un resto carbonilo) del resto de Factor IX. Los ejemplos específicos de reactivos poliméricos que comprenden un resto de

10 hidrazida, junto con los conjugados correspondientes, se proporcionan en la Tabla 2, a continuación. Además, cualquier reactivo polimérico que comprende un éster activado (por ejemplo, un grupo succinimidilo) se puede convertir para contener un resto de hidrazida mediante la reacción del reactivo polimérico que comprende el éster activado con hidrazina (NH2-NH2) o carbazato de terc-butilo [NH2NHCO2C(CH3)3]. En la tabla, la variable (n) representa el número de unidades monoméricas de repetición y "=C-F9" representa el resto de Factor IX que sigue a

15 la conjugación con el reactivo polimérico. Opcionalmente, el enlace hidrazona se puede reducir usando un agente reductor adecuado. Aunque cada porción polimérica [por ejemplo, (OCH2CH2)n o (CH2CH2O)n] presentada en la Tabla 1 termina en un grupo "CH3", otros grupos (tal como H y bencilo) se pueden sustituir por el mismo.

Tabla 2 20

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Los grupos tiol contenidos dentro del resto de Factor IX pueden servir como sitios efectivos de unión para el polímero soluble en agua. En particular, los restos de cisteína proporcionan grupos tiol cuando el resto de Factor IX

5 es una proteína. Los grupos tiol en tales restos de cisteína pueden reaccionar con un PEG activado que es Específico para la reacción con grupos tiol, por ejemplo, un polímero de N-maleimidilo u otro derivado, como se ha descrito en la Patente de los Estados Unidos de América Nº 5.739.208 y en la Publicación de Patente Internacional Nº WO 01/62827.

10 Aunque no se desea estar limitado por la teoría, se cree que todos los restos de cisteína dentro del Factor IX participan en el enlace disulfuro. Como consecuencia, la conjugación con un resto de cisteína que participa en el enlace disulfuro puede alterar la estructura terciaria del Factor IX y potencialmente reducir de manera significativa su actividad global. Por lo tanto, suponiendo que cualquier resto de Factor IX en particular carezca de un grupo tiol o se deba evitar la alteración de los enlaces disulfuro, es posible añadir un resto de cisteína al resto de Factor IX usando

15 técnicas sintéticas convencionales. Véase, por ejemplo, el procedimiento descrito en la Publicación de Patente internacional Nº WO 90/12874 para la adición de restos de cisteína, en la que se puede adaptar tal procedimiento para un resto de Factor IX. Además, también se pueden usar los procesos convencionales de ingeniería genética para introducir un resto de cisteína en el resto de Factor IX.

20 Los ejemplos específicos, junto con los conjugados correspondientes, se proporcionan en la Tabla 3, a continuación. En la tabla, la variable (n) representa el número de unidades monoméricas de repetición y "-S-F9" representa el resto de Factor IX que sigue a la conjugación con el polímero soluble en agua. Aunque cada porción polimérica [por ejemplo, (OCH2CH2)n o (CH2CH2O)n] presentada en la Tabla 3 termina en un grupo "CH3", otros grupos (tal como H y bencilo) se pueden sustituir por el mismo.

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(b)es un número entero que tiene un valor de 2 a 6;

(c)es un número entero que tiene un valor de 2 a 6;

5 R2, en cada aparición, es independientemente H o alquilo inferior; y F9 es un resto de Factor IX,

donde el conjugado carezca básicamente de cualquier polímero soluble en agua unido directamente, o a través de un resto espaciador, a un azúcar o hidrato de carbono que, a su vez, esté unido a un resto de Factor IX.

10 Tambien se describe un conjugado que comprende la siguiente estructura:

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15 donde: cada (n) es independientemente un número entero que tiene un valor de 2 a 3400; y F9 es un resto de Factor IX. 20 Tambien se describe un conjugado que comprende la siguiente estructura:

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25 donde: cada (n) es independientemente un número entero que tiene un valor de 2 a 3400;

(a) es cero o uno;

30 X, cuando está presente, es un resto espaciador que comprende uno o más átomos;

(b') es cero o un número entero que tiene un valor de uno a diez;

(c) es un número entero que tiene un valor de uno a diez;

35 R2, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico; R3, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico; y F9 es un resto de Factor IX

40 donde el conjugado carezca básicamente de cualquier polímero soluble en agua unido directamente, o a través de un resto espaciador, a un azúcar o hidrato de carbono que, a su vez, esté unido a un resto de Factor IX.

Tambien se describen conjugados que comprende la siguiente estructura:

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donde:

cada (n) es independientemente un número entero que tiene un valor de 2 a 3400; y

F9 es un resto de Factor IX.

Composiciones

Típicamente, los conjugados forman parte de una composición. Generalmente, la composición comprende una pluralidad de conjugados, teniendo cada uno de ellos uno, dos, tres o cuatro polímeros solubles en agua como se han definido anteriormente unidos covalentemente de forma separada (bien directamente o bien a través de un resto espaciador) a un resto del Factor IX donde el conjugado carezca básicamente de cualquier polímero soluble en agua unido directamente, o a través de un resto espaciador, a un azúcar o hidrato de carbono que, a su vez, esté unido a un resto de Factor IX. Además, la presente invención incluye ejemplos en los que la composición comprende una pluralidad de conjugados, comprendiendo cada conjugado un polímero soluble en agua como se ha definido anteriormente unido covalentemente a un resto de Factor IX; así como composiciones comprenden dos, tres o cuatro polímeros solubles en agua unidos covalentemente a un resto del Factor IX.

En una o más realizaciones de la presente invención se proporciona una composición, comprendiendo la composición una pluralidad de conjugados, en la que al menos aproximadamente un 80% de todos los conjugados en la composición comprenden cada uno un resto del Factor IX unido covalentemente a uno, dos, tres o cuatro polímeros solubles en agua como se han definido anteriormente y en la que de forma adicional para cada polímero soluble en agua en el conjugado, el resto de Factor IX está unido al polímero soluble en agua a través de un enlace amida, bien directamente o bien a través de un resto espaciador que comprende uno o más átomos donde el conjugado carezca básicamente de cualquier polímero soluble en agua unido directamente, o a través de un resto espaciador, a un azúcar o hidrato de carbono que, a su vez, esté unido a un resto de Factor IX...

Con respecto a los conjugados en la composición, la composición satisfará típicamente una o más de las siguientes características: al menos aproximadamente un 85% de los conjugados en la composición tendrá de uno a tres polímeros unidos al resto de Factor IX; al menos aproximadamente un 85% de los conjugados en la composición tendrá de uno a tres polímeros unidos al resto de Factor IX; al menos aproximadamente un 85% de los conjugados en la composición tendrá de uno a dos polímeros unidos al resto de Factor IX; al menos aproximadamente un 85% de los conjugados en la composición tendrá un polímero unido a resto del Factor IX (es decir, será monoPEGilado); al menos aproximadamente un 95% de los conjugados en la composición tendrá de uno a cinco polímeros unidos al resto de Factor IX; al menos aproximadamente un 95% de los conjugados en la composición tendrá de uno a cuatro polímeros unidos al resto de Factor IX; al menos aproximadamente un 95% de los conjugados en la composición tendrá de uno a tres polímeros unidos al resto de Factor IX; al menos aproximadamente un 95% de los conjugados en la composición tendrá de uno a dos polímeros unidos al resto de Factor IX; al menos un 95% de los conjugados en la composición tendrá un polímero unido al resto de Factor IX (es decir, será monoPEGilado); al menos aproximadamente un 99% de los conjugados en la composición tendrá de uno a cuatro polímeros unidos al resto de Factor IX; al menos aproximadamente un 99% de los conjugados en la composición tendrá de uno a tres polímeros unidos al resto de Factor IX; al menos aproximadamente un 99% de los conjugados en la composición tendrá de uno a dos polímeros unidos al resto de Factor IX; y al menos aproximadamente un 99% de los conjugados en la composición tendrá un polímero unido al resto de Factor IX (es decir, será monoPEGilado).

En una o más realizaciones, es preferente que la composición que contiene el conjugado esté libre o básicamente libre de albúmina. Es también preferente que la composición esté libre o básicamente libre de proteínas que no tengan actividad de Factor IX. De esta manera, es preferente que la composición esté libre en un 85%, más preferentemente en un 95%, y lo más preferentemente en un 99%, de albúmina. Además, es preferente que la composición esté libre en un 85%, más preferentemente en un 95%, y lo más preferentemente en un 99%, de cualquier proteína que no tenga actividad de Factor IX. Suponiendo que la albúmina está presente en la composición, las composiciones ejemplares de la presente invención están básicamente libres de conjugados que comprenden un polímero de polietilenglicol que une un residuo de un resto de Factor IX a la albúmina.

El control del número deseado de polímeros para cualquier resto determinado se puede conseguir mediante la selección del reactivo polimérico apropiado, la proporción de reactivo polimérico con respecto al resto de Factor IX, la temperatura, las condiciones de pH, y otros aspectos de la reacción de conjugación. Además, la reducción o eliminación de los conjugados no deseados (por ejemplo, los conjugados que tienen cuatro o más polímeros unidos) se puede conseguir por medio de purificación.

Por ejemplo, los conjugados polímero-resto de Factor IX se pueden purificar para obtener/aislar diferentes especies conjugadas. De forma específica, la mezcla de productos se puede purificar para obtener un promedio cualquiera entre uno, dos, tres, cuatro, cinco o más PEGs por resto de Factor IX, típicamente uno, dos o tres PEGs por resto de Factor IX. La estrategia para la purificación de la mezcla de reacción del conjugado final dependerá de una diversidad de factores, incluyendo, por ejemplo, el peso molecular del reactivo polimérico empleado, el resto de Factor IX en particular, el régimen de dosificación deseado, y la actividad residual y las propiedades in vivo del

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conjugado o conjugados individuales.

Si se desea, los conjugados que tienen diferentes pesos moleculares se pueden aislar utilizando cromatografía por filtración en gel y/o cromatografía de intercambio iónico. Es decir, la cromatografía por filtración en gel se usa para fraccionar diferentes valores del promedio de polímero con respecto al resto de Factor IX (por ejemplo, 1-mero, 2mero, 3-mero, y demás, en los que "1-mero" indica 1 polímero unido a un resto de Factor IX, "2-mero" 2 polímeros unidos a un resto de Factor IX, y así sucesivamente) basándose en sus diferentes pesos moleculares (cuando la diferencia corresponde esencialmente al peso molecular promedio de la parte de polímero soluble en agua). Por ejemplo, en una reacción ejemplar en la que se conjuga aleatoriamente una proteína de 55000 daltons con un reactivo polimérico que tiene un peso molecular de aproximadamente 20000 daltons, la mezcla de reacción resultante puede contener la proteína no modificada (que tiene un peso molecular de aproximadamente 55000 daltons), la proteína monoPEGilada (o "1-mero") (que tiene un peso molecular de aproximadamente 75000 daltons), la proteína diPEGilada (o "2-mero") (que tiene un peso molecular de aproximadamente 95000 daltons), y demás.

Mientras este enfoque se puede utilizar para separar conjugados de restos de Factor IX con PEG y con otros polímeros que tengan diferentes pesos moleculares, esta aproximación no es generalmente eficaz para separar isómeros posicionales que presentan diferentes sitios de unión del polímero en el resto de Factor IX. Por ejemplo, la cromatografía por filtración en gel se pueden usar para separar unas de otras las mezclas de 1 -meros, 2-meros, 3meros, y demás, aunque cada una de las composiciones de PEG-mero recuperadas puede contener PEGs unidos a diferentes grupos amino reactivos (por ejemplo, restos de lisina) en el resto de Factor IX.

Las columnas para filtración en gel adecuadas para llevar a cabo este tipo de separación incluyen columnas Superdex™ y Sephadex™ disponibles en Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). La selección de una columna en particular dependerá del rango de fraccionamiento deseado. Generalmente, la elución se lleva a cabo utilizando un tampón adecuado, tal como fosfato o acetato. Las fracciones recogidas se pueden analizar mediante una diversidad de métodos diferentes, por ejemplo, (i) absorbancia a 280 nm para el contenido de proteínas, (ii) análisis de proteínas basado en una tinción usando albúmina en suero bovino como estándar, (iii) ensayo de yodo para el contenido de PEG (Sims et al. (1980) Anal. Biochem, 107:60-63), (iv) electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS PAGE), seguido de tinción con cloruro de bario, y cromatografía líquida de alto rendimiento.

La separación de los isómeros posicionales se puede llevar a cabo mediante cromatografía de fase inversa utilizando métodos de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) usando por ejemplo una columna C18 o una columna C3 (Amersham Biosciences o Vydac) o mediante cromatografía de intercambio iónico utilizando una columna de intercambio iónico, por ejemplo, una columna de intercambio iónico Sepharose™ disponible en Amersham Biosciences. Cualquiera de los dos enfoques se puede utilizar para separar isómeros polímero-agente activo tienen el mismo peso molecular (isómeros posicionales).

Preferentemente, las composiciones están básicamente libres de proteínas que no tienen actividad de Factor IX. Además, preferentemente las composiciones están básicamente libres de todos los demás polímeros solubles en agua unidos de forma no covalente. En algunas circunstancias, sin embargo, la composición puede contener una mezcla de conjugados polímero-resto de Factor IX y Factor IX no conjugado.

Opcionalmente, la composición de la presente invención comprende de forma adicional un excipiente farmacéuticamente aceptable. Si se desea, el excipiente farmacéuticamente aceptable se puede añadir a un conjugado para formar una composición.

Los ejemplos de excipientes incluyen los seleccionados entre el grupo que consiste en hidratos de carbono, sales inorgánicas, agentes antimicrobianos, antioxidantes, tensioactivos, tampones, ácidos, bases, y las combinaciones de los mismos.

Un hidrato de carbono tal como un azúcar, un azúcar derivatizado tal como un alditol, ácido aldónico, un azúcar esterificado y/o un polímero de azúcar puede estar presente como excipiente. Los excipientes de hidratos de carbono específicos incluyen, por ejemplo: monosacáridos, tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, Dmanosa, y sorbosa; disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, y celobiosa; polisacáridos, tales como rafinosa, melecitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones, y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol), piranosil sorbitol, y mioinositol.

El excipiente también pueden incluir una sal inorgánica o tampón tal como ácido cítrico, cloruro sódico, cloruro potásico, sulfato sódico, nitrato potásico, fosfato sódico monobásico, fosfato sódico dibásico, y las combinaciones de los mismos.

La composición también pueden incluir un agente antimicrobiano para la prevención o disuasión del crecimiento microbiano. Los ejemplos de agentes antimicrobianos adecuados para la presente invención incluyen cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, cloruro de cetilpiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, timersol, y las combinaciones de los mismos.

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Alcohol etílico, USP, Absolute-200 Proof (AAPER)

NuPAGE® MES [ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico] tampón de migración en SDS (Invitrogen Corporation, Carlsbad CA)5 NuPAGE® 4 x LDS (docecilsulfato de litio) tampón de muestras (Invitrogen Corporation, Carlsbad CA)

SigmaMarker, intervalo bajo (P.M. 6500-66000) (Sigma)

10 SigmaMarker, intervalo medio (P.M. 36000-205000) (Sigma)

NuPAGE® Novex Bis-Tris [Bis(2-hidroxietil)imino-tris(hidroximetil)metano-HCI] gel (Invitrogen Corporation, Carlsbad CA)

15 Análisis por SEC-HPLC

La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se llevó a cabo en un sistema Agilent 1100 HPLC (Agilent). Para las muestras que se analizaron utilizando SEC-HPLC, cada muestra se analizó utilizando una columna KW-804 de proteína SHODEX (Showa Denko KK, Tokio Japón), a pH 7,2. El caudal para la columna se ajustó a 0,5 ml/minuto.

20 Las proteínas y los conjugados PEG-proteína eluidos se detectaron utilizando un enfoque basado en UV que tiene una longitud de onda establecida en 280 nm.

Análisis por SDS-PAGE

25 La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) se llevó a cabo usando un sistema de electroforesis XCELL SURELOCK Mini-Cell (Invitrogen Corporation, Carlsbad CA). Para las muestras que se analizaron utilizando SDS-PAGE, cada mezcla se mezcló con 4 x tampón de muestras LDS (Invitrogen Corporation, Carlsbad CA). A continuación las muestras preparadas se cargaron sobre un gel NuPAGE Novex Bis-Tris al 4-12% y migraron durante aproximadamente 30 minutos a 200 V usando tampón de migración NuPAGE® MES (Invitrogen

30 Corporation, Carlsbad CA).

Análisis por RP-HPLC

La cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa se realizó utilizando una columna inversa C3 (Hamilton,

35 Zorbax). Se utilizó un gradiente del 30-80% de acetonitrilo junto con una temperatura elevada durante 30 minutos a 0,5 ml/ minuto.

El Factor IX recombinante correspondiente a la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. Nº 1 se utilizó en los Ejemplos 1-16. Se obtuvo el Factor IX en un tampón que contiene tanto L-histidina como glicina. A causa de que los

40 grupos amino asociados con la L-histidina y la glicina en el tampón podrían competir con los grupos amino asociados con el Factor IX, fue necesario intercambiar el tampón que contiene amina por un tampón libre de aminas para mejorar el rendimiento de la conjugación del Factor IX cuando se utilizaron reactivos poliméricos dirigidos a aminas para efectuar la conjugación.

45 En resumen, el tampón que contiene amina se intercambió por un tampón libre de aminas en una de las dos aproximaciones, dependiendo del volumen de tampón a intercambiar. Para volúmenes de tampón relativamente pequeños, se utilizó una columna centrífuga de 500 µl Zeba Desalt (Pierce Biotechnology, Rockford IL) de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Para volúmenes de tampón relativamente grandes, se utilizó un dispositivo de filtrado centrífugo de 2 ml CENTRICON® (Millipore Corporation, Billerica MA) con un punto de corte de

50 un peso molecular de 10000 o 30000 dalton de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Todas las muestras utilizadas en los Ejemplos sin etanol se cambiaron a 1 x tampón PBS que tiene un pH de 7,5, mientras que todas las muestras utilizadas en los Ejemplos con etanol se intercambiaron con 1 x tampón PBS que tiene un pH de 7,5 con etanol añadido para formar una mezcla de reacción de Factor IX que contiene etanol al 10%.

55 El tampón libre de aminas que contiene el Factor IX recombinante y que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. Nº 1 (la "solución patrón de Factor IX") se utilizó en los Ejemplos 1-16. La solución patrón de Factor IX contenía aproximadamente de 0,2 mg/ml a 0,55 mg/ml de Factor IX.

Ejemplo 1

60 PEGilación de Factor IX con mPEG-SMB, 30 kDa

(Proporción 1:1 de polímero con respecto al Factor IX; sin etanol)

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Se templó a temperatura ambiente mPEG-SMB, 30 kDa, almacenado a -20 °C en atmósfera de argón. El mPEG

5 SMB (4,1 mg) templado se disolvió en 1 ml de HCl 2 mM para formar una solución de mPEG-SMB. Se añadió la solución de mPEG-SMB a una alícuota de la solución patrón de Factor IX que contiene 0,07 mg de Factor IX hasta que se alcanzó una proporción molar 1:1 de mPEG-SMB con respecto al Factor IX. Después de la adición del mPEG-SMB, se comprobó el pH de la reacción para asegurar un valor de pH de 7,2 a 7,5, y se mezcló bien. Para permitir el acoplamiento del mPEG-SMB al Factor IX a través de un enlace amida, la solución de reacción se agitó

10 durante tres horas a temperatura ambiente, después de lo cual se migró la muestra con SDS PAGE, que confirmó la presencia de material monoconjugado ("1-mero"). Véase la banda marcada como "SMB 30 K 1:1" en el gel proporcionado en la Figura 1. Después de esto, se permitió que continuara el acoplamiento mediante la agitación de la solución de reacción durante 15 horas a 4 °C, obteniéndose de esta manera una solución de conjugado.

15 Se utilizaron RP-HPLC (C3) y una segunda SDS PAGE para la caracterización de la solución de conjugado resultante. Basándose en el resultado de la segunda SDS PAGE, se observó conjugación. Véase la banda marcada como "SMB 30 K 1:1" en el gel proporcionado en la Figura 2. Se utilizó RP-HPLC (C3) para separar los componentes de la solución de conjugado resultante y el cromatograma resultante indicó un rendimiento del 0,54% (que representa el 100% de especies monoPEGiladas o "1-mero"). Véase el cromatograma proporcionado en la Figura 5.

20 Se espera que un aumento en los tiempos de reacción, el aumento de la temperatura y/o las adiciones múltiples de reactivo polimérico podrían incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros conjugados utilizando mPEG-SMB que tenga otro peso molecular promedio en peso.

25 Ejemplo 2

PEGilación de Factor IX con mPEG-SMB, 30 kDa

(Proporción 10:1 de polímero con respecto al Factor IX; sin etanol)30

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35 Se templó a temperatura ambiente mPEG-SMB, 30 kDa, almacenado a -20 °C en atmósfera de argón. El mPEG-SMB (4,1 mg) templado se disolvió en 1 ml de HCl 2 mM para formar una solución de mPEG-SMB. Se añadió la solución de mPEG-SMB a una alícuota de la solución patrón de Factor IX que contiene 0,07 mg de Factor IX hasta que se alcanzó un exceso molar 10 veces superior de mPEG-SMB con respecto al Factor IX. Después de la adición del mPEG-SMB, se comprobó el pH de la reacción para asegurar un valor de pH de 7,2 a 7,5, y se mezcló bien.

40 Para permitir el acoplamiento del mPEG-SMB al Factor IX a través de un enlace amida, la solución de reacción se agitó durante tres horas a temperatura ambiente, después de lo cual se migró la muestra con SDS PAGE, que confirmó la presencia de material monoconjugado ("1-mero"). Véase la banda marcada como "SMB 30 K 10:1" en el gel proporcionado en la Figura 1. Después de esto, se permitió que continuara el acoplamiento mediante la agitación de la solución de reacción durante 15 horas a 4 °C, obteniéndose de esta manera una solución de conjugado.

45 Se utilizaron RP-HPLC (C3) y una segunda SDS PAGE para la caracterización de la solución de conjugado resultante. Basándose en el resultado de la segunda SDS PAGE, se observó conjugación. Véase la banda marcada como "SMB 30 K 10:1" en el gel proporcionado en la Figura 2. Se utilizó RP-HPLC (C3) para separar los componentes de la solución de conjugado resultante y el cromatograma resultante indicó un rendimiento del 6,4%

(que representa el 100% de especies monoPEGiladas o "1-mero"). Véase el cromatograma proporcionado en la Figura 6.

Se espera que un aumento en los tiempos de reacción, el aumento de la temperatura y/o las adiciones múltiples de

5 reactivo polimérico podrían incrementar el rendimiento. De esta manera, cuando se repitió el experimento con tiempos prolongados a temperatura ambiente antes de continuar la reacción durante toda la noche a 4 °C, se consiguió un aumento en el rendimiento de conjugado que se evidenció mediante una banda más oscura como se muestra en el gel de SDS PAGE. Véase la banda marcada como "SMB 30 K 10:1" en la Figura 4. Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros conjugados utilizando mPEG-SMB que tenga otro peso molecular

10 promedio en peso.

Ejemplo 3

PEGilación de Factor IX con mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa 15 (Proporción 1:1 de polímero con respecto al Factor IX; sin etanol)

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mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa

20 Se templó a temperatura ambiente mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa, almacenado a -20 °C en atmósfera de argón. El mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado (2,0 mg) templado se disolvió en 1 ml de HCl 2 mM para formar una solución de mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado. Se añadió la solución de mPEG2-Nhidroxisuccinimida ramificado a una alícuota de la solución patrón de Factor IX que contiene 0,07 mg de Factor IX

25 hasta que se alcanzó una proporción molar 1:1 de mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado con respecto al Factor

IX. Después de la adición del mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, se comprobó el pH de la reacción para asegurar un valor de pH de 7,2 a 7,5, y se mezcló bien. Para permitir el acoplamiento del mPEG2-Nhidroxisuccinimida ramificado al Factor IX a través de un enlace amida, la solución de reacción se agitó durante tres horas a temperatura ambiente, después de lo cual se migró la muestra con SDS PAGE, que no mostró ninguna

30 conjugación detectable. Véase la banda marcada como " NHS 40 K 1:1 " en el gel proporcionado en la Figura 1. Después de esto, se proporciona un tiempo adicional para la conjugación mediante la agitación de la solución de reacción durante 15 horas a 4 °C, obteniéndose de esta manera una solución de conjugado.

Se utilizaron RP-HPLC (C3) y una segunda SDS PAGE para la caracterización de la solución de conjugado

35 resultante. Basándose en el resultado de la segunda SDS PAGE, se observó conjugación. Véase la banda marcada como " NHS 40 K 1:1 " en el gel proporcionado en la Figura 2. Se utilizó RP-HPLC (C3) para separar los componentes de la solución de conjugado resultante y el cromatograma resultante indicó un rendimiento del 0,1% (que representa el 100% de especies monoPEGiladas o "1-mero"). Véase el cromatograma proporcionado en la Figura 7.

40 Se espera que un aumento en los tiempos de reacción, el aumento de la temperatura y/o las adiciones múltiples de reactivo polimérico podrían incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros conjugados utilizando mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado que tenga otro peso molecular promedio en peso.

45 Ejemplo 4

PEGilación de Factor IX con mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa

(Proporción 10:1 de polímero con respecto al Factor IX; sin etanol) 50

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mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa

Se templó a temperatura ambiente mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa, almacenado a -20 °C en atmósfera de argón. El mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado (2,0 mg) templado se disolvió en 1 ml de HCl 2 mM para formar una solución de mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado. Se añadió la solución de mPEG2-Nhidroxisuccinimida ramificado a una alícuota de la solución patrón de Factor IX que contiene 0,07 mg de Factor IX hasta que se alcanzó un exceso molar 10 veces superior de mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado con respecto al Factor IX. Después de la adición del mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, se comprobó el pH de la reacción para asegurar un valor de pH de 7,2 a 7,5, y se mezcló bien. Para permitir el acoplamiento del mPEG2-Nhidroxisuccinimida ramificado al Factor IX a través de un enlace amida, la solución de reacción se agitó durante tres horas a temperatura ambiente, después de lo cual se migró la muestra con SDS PAGE, que no mostró ninguna conjugación detectable. Véase la banda marcada como " NHS 40 K 10:1 " en el gel proporcionado en la Figura 1. Después de esto, se permitió que continuara el acoplamiento mediante la agitación de la solución de reacción durante 15 horas a 4 °C, obteniéndose de esta manera una solución de conjugado.

Se utilizaron RP-HPLC (C3) y una segunda SDS PAGE para la caracterización de la solución de conjugado resultante. Basándose en el resultado de la segunda SDS PAGE, la conjugación aún no era detectable. Véase la banda marcada como " NHS 40 K 10:1 " en el gel proporcionado en la Figura 2. Se utilizó RP-HPLC (C3) para separar los componentes de la solución de conjugado resultante y el cromatograma resultante no indicó ningún rendimiento de conjugado detectable. Véase el cromatograma proporcionado en la Figura 8.

Se espera que un aumento en los tiempos de reacción, el aumento de la temperatura y/o las adiciones múltiples de reactivo polimérico podrían incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros conjugados utilizando mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado que tenga otro peso molecular promedio en peso.

Ejemplo 5

PEGilación de Factor IX con mPEG-SMB, 30 kDa

(Proporción 10:1 de polímero con respecto al Factor IX; con etanol)

imagen33

Dado que se cree que el etanol aumenta la flexibilidad estructural de ciertas proteínas, se introdujo etanol en el tampón y el sistema de reacción. Se templó a temperatura ambiente mPEG-SMB, 30 kDa, almacenado a -20 °C en atmósfera de argón. El mPEG-SMB (10,0 mg) templado se disolvió en 0,5 ml de HCl 2 mM con etanol añadido para formar una solución de mPEG-SMB que contiene etanol al 10%. Se añadió la solución de mPEG-SMB que contiene etanol al 10% a la mezcla de reacción de Factor IX que contiene etanol al 10% hasta que se alcanzó un exceso molar 10 veces superior de mPEG-SMB con respecto al Factor IX. Después de la adición del mPEG-SMB, se comprobó el pH de la reacción para asegurar un valor de pH de 7,2 a 7,5, y se mezcló bien. Para permitir el acoplamiento del mPEG-SMB al Factor IX a través de un enlace amida, la solución de reacción se agitó durante tres horas a temperatura ambiente. Se permitió que continuara el acoplamiento mediante la agitación de la solución de reacción durante toda la noche a 4 °C, obteniéndose de esta manera una solución de conjugado.

Se utilizó SDS PAGE para la caracterización de la solución de conjugado resultante. Basándose en los resultados de SDS PAGE, no se detectó conjugación. Véase la banda marcada como " SMB 30 K 10:1 + EtOH" en el gel proporcionado en la Figura 3. No se cree que la introducción de etanol incremente la flexibilidad estructural del Factor IX que permita un aumento de la conjugación de mPEG-SMB, 30 kDa.

Se espera que un aumento en los tiempos de reacción, el aumento de la temperatura y/o las adiciones múltiples de reactivo polimérico podrían incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros conjugados utilizando mPEG-SMB que tenga otro peso molecular promedio en peso.

Ejemplo 6

PEGilación de Factor IX con mPEG-SMB, 30 kDa

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hidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa.

Se espera que un aumento en los tiempos de reacción, el aumento de la temperatura y/o las adiciones múltiples de reactivo polimérico podrían incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros 5 conjugados utilizando mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado que tenga otro peso molecular promedio en peso.

Ejemplo 8

PEGilación de Factor IX con mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa 10

(Proporción 20:1 de polímero con respecto al Factor IX; con etanol)

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mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa

15 Dado que se cree que el etanol aumenta la flexibilidad estructural de ciertas proteínas, se introdujo etanol en el tampón y el sistema de reacción. Se templó a temperatura ambiente mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa, almacenado a -20 °C en atmósfera de argón. El mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado (2,0 mg) templado se disolvió en 1,0 ml de HCl 2 mM con etanol añadido para formar una solución de mPEG2-N-hidroxisuccinimida

20 ramificado que contiene etanol al 10%. Se añadió la solución de mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado que contiene etanol al 10% a la mezcla de reacción de Factor IX que contiene etanol al 10% hasta que se alcanzó un exceso molar 20 veces superior de mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado con respecto al Factor IX. Después de la adición del mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, se comprobó el pH de la reacción para asegurar un valor de pH de 7,2 a 7,5, y se mezcló bien. Para permitir el acoplamiento del mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado al

25 Factor IX a través de un enlace amida, la solución de reacción se agitó durante tres horas a temperatura ambiente. Se permitió que continuara el acoplamiento mediante la agitación de la solución de reacción toda la noche a 4 °C, obteniéndose de esta manera una solución de conjugado.

Se utilizó SDS PAGE para la caracterización de la solución de conjugado resultante. Basándose en los resultados de

30 SDS PAGE, no se detectó conjugación (resultados no mostrados). No se cree que la introducción de etanol incremente la flexibilidad estructural del Factor IX que permita un aumento de la conjugación de mPEG2-Nhidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa.

35 reactivo polimérico podrían incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros conjugados utilizando mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado que tenga otro peso molecular promedio en peso.

Ejemplo 9

40 PEGilación de Factor IX con mPEG-SMB, 30 kDa

(Proporción 20:1 de polímero con respecto al Factor IX; sin etanol)

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45 mPEG-SMB, 30 kDa

Se templó a temperatura ambiente mPEG-SMB, 30 kDa, almacenado a -20 °C en atmósfera de argón. El mPEG-SMB (8,6 mg) templado se disolvió en 1,0 ml de HCl 2 mM para formar una solución de mPEG-SMB. Se añadió la 50 solución de mPEG-SMB a una alícuota de la solución patrón de Factor IX que contiene 0,07 mg de Factor IX hasta que se alcanzó un exceso molar 20 veces superior de mPEG-SMB con respecto al Factor IX. Después de la adición

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55

del mPEG-SMB, se comprobó el pH de la reacción para asegurar un valor de pH de 7,2 a 7,5, y se mezcló bien. Para permitir el acoplamiento del mPEG-SMB al Factor IX a través de un enlace amida, la solución de reacción se agitó durante dos horas a temperatura ambiente. Se permitió que continuara el acoplamiento mediante la agitación de la solución de reacción toda la noche a 4 °C, obteniéndose de esta manera una solución de conjugado. Después de esto, se permitió que continuara el acoplamiento mediante la agitación de la solución de reacción toda la noche a 4 °C, obteniéndose de esta manera una solución de conjugado.

Se utilizó SDS PAGE para la caracterización de la solución de conjugado resultante. Basándose en los resultados de SDS PAGE, se observó conjugación. Véase la banda marcada como " SMB 30 K 20:1 " en el gel proporcionado en la Figura 4.

Ejemplo 10

PEGilación de Factor IX con mPEG-SPA, 20 kDa

(Proporción 20:1 de polímero con respecto al Factor IX; con etanol)

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Dado que se cree que el etanol aumenta la flexibilidad estructural de ciertas proteínas, se introdujo etanol en el tampón y el sistema de reacción. Se templó a temperatura ambiente mPEG-SPA, 20 kDa, almacenado a -20 °C en atmósfera de argón. El mPEG-SPA (10,0 mg) templado se disolvió en 0,5 ml de HCl 2 mM con etanol añadido para formar una solución de mPEG-SPA que contiene etanol al 10%. Se añadió la solución de mPEG-SPA que contiene etanol al 10% a la mezcla de reacción de Factor IX que contiene etanol al 10% hasta que se alcanzó un exceso molar 20 veces superior de mPEG-SPA con respecto al Factor IX. Después de la adición del mPEG-SPA, se comprobó el pH de la reacción para asegurar un valor de pH de 7,2 a 7,5, y se mezcló bien. Para permitir el acoplamiento del mPEG-SPA al Factor IX a través de un enlace amida, la solución de reacción se agitó durante dos horas a temperatura ambiente. Se permitió que continuara el acoplamiento mediante la agitación de la solución de reacción.

Basándose en los resultados de SDS PAGE, no se detectó conjugación. Véase la banda marcada como " SPA 20 K

20:1 + EtOH" en el gel proporcionado en la Figura 3. No se cree que la introducción de etanol incremente la flexibilidad estructural del Factor IX que permita un aumento de la conjugación de mPEG-SPA, 20 kDa.

Se espera que un aumento en los tiempos de reacción, el aumento de la temperatura y/o las adiciones múltiples de reactivo polimérico podrían incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros conjugados utilizando mPEG-SPA que tenga otro peso molecular promedio en peso.

Ejemplo 11

PEGilación de Factor IX con mPEG-SPA, 20 kDa

(Proporción 40:1 de polímero con respecto al Factor IX; con etanol)

imagen38

Dado que se cree que el etanol aumenta la flexibilidad estructural de ciertas proteínas, se introdujo etanol en el tampón y el sistema de reacción. Se templó a temperatura ambiente mPEG-SPA, 20 kDa, almacenado a -20 °C en atmósfera de argón. El mPEG-SPA (10,0 mg) templado se disolvió en 0,5 ml de HCl 2 mM con etanol añadido para

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Claims

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