ES2335213T3 - Deteccion electrocatalitica de la hibridacion de acidos nucleicos. - Google Patents
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Abstract
Un ensayo electrocatalítico de hibridación que comprende: proporcionar una sonda de ácido nucleico inmovilizada sobre un soporte sólido; poner en contacto la sonda de ácido nucleico con una muestra en donde la muestra comprende un ácido nucleico diana, un primer complejo de metal de transición y un segundo complejo de metal de transición; y medir una señal electrocatalítica generada por hibridación de la sonda de ácido nucleico y la diana de ácido nucleico, en donde la presencia del segundo complejo de metal de transición proporciona una señal electrocatalítica intensificada.
Description
Detección electrocatalítica de la hibridación de
ácidos nucleicos.
La aplicación de información genética disponible
recientemente a los avances en medicina preventiva y tratamiento de
enfermedades requiere tecnologías eficientes y exactas de detección
de DNA.^{1,2} Un foco de desarrollos tecnológicos recientes está
representado por los sistemas que aprovechan la hibridación
diferencial del DNA en superficies sólidas.^{3-6}
En teoría, la hibridación de secuencias diana que representan
fragmentos genómicos microbianos o genes relacionados con
enfermedades humanas a secuencias sonda inmovilizadas podría
permitir la detección de DNA con sensibilidad y capacidad altas.
Además, si pudieran discriminarse secuencias estrechamente
relacionadas, podrían detectarse e identificarse patógenos
microbianos.
Una diversidad de técnicas espectroscópicas y
analíticas pueden utilizarse para detectar la hibridación de DNA en
superficies.^{7-22} Pueden utilizarse
nanopartículas de oro modificadas con DNA para detectar secuencias
de DNA utilizando espectroscopia óptica y de
fluorescencia.^{12,18} La resonancia de plasmones superficiales
proporciona también un medio para monitorizar la hibridación de
secuencias diana a sustratos de oro modificados con DNA en tiempo
real.^{3,4,19,20,22} Los resultados obtenidos con estos métodos
indican que puede conseguirse detección de DNA con alta
sensibilidad cuando se utilizan oligonucleótidos inmovilizados para
capturar secuencias de una solución.
Otros métodos de detección de genes
(v.g., Pat. U.S. No. 5.972.692, y Pat. U.S. No. 5.312.527) no
utilizan un ensayo electrocatalítico para detectar la hibridación
del DNA.
La detección de secuencias de DNA utilizando
lectura electroquímica es particularmente atractiva para el
desarrollo de diagnósticos clínicos.^{2,6,23,24} Medidas
electroquímicas cuantitativas de este tipo pueden hacerse
utilizando instrumentación compacta y económica, y siendo
típicamente innecesaria la marcación covalente de las muestras de
DNA con grupos informadores, lo que simplifica el procedimiento de
preparación de la muestra. De hecho, se han publicado varios
métodos para la detección electroquímica de DNA, la mayor parte de
los cuales están basados en la señal producida por un grupo
informador con actividad rédox unido por enlaces no covalentes, que
se incrementa cuando el DNA se hibrida a una superficie modificada
con una secuencia sonda. Adicionalmente, sustituciones de una sola
base que producen desapareamientos de bases en dúplex de DNA
inmovilizados sobre superficies de oro pueden detectarse
electroquímicamente utilizando sondas de intercalación.^{14,16} La
interrupción del apilamiento de bases causada por el
desapareamiento atenúa el flujo de corriente al informador por
interferir con el acoplamiento electrónico mediado por el DNA. Este
efecto podría permitir en potencia la detección electroquímica de
mutaciones puntuales relacionadas con enfermedades.
Los procesos electrocatalíticos que amplifican
las señales obtenidas en las superficies de electrodos modificadas
con DNA proporcionan un medio poderoso para aumentar la sensibilidad
y exactitud de un ensayo de detección.
Ru(bpy)_{3}^{3+} generado electroquímicamente
reacciona con las guaninas contenidas en una diana hibridada en un
proceso catalítico que genera grandes señales que pueden ser
utilizadas para detectar la hibridación de DNA, aunque con
limitaciones debido a dependencia de la secuencia.^{13,15,21,24}
Adicionalmente, una reacción electrocatalítica entre una sonda de
intercalación, azul de metileno, y Fe(CN)_{6}^{3-}
transportado en solución ha sido utilizada para amplificar los
cambios de señal que informan de la presencia de mutaciones
puntuales productoras de desapareamientos^{16}. Se ha utilizado
también ferrocianuro para reciclar una enzima y monitorizar la
reducción química de o-quinona generada
enzimáticamente.^{28} Restos con actividad rédox fotoinducibles o
químicamente inducibles unidos covalentemente a oligómeros de ácido
nucleico han sido utilizados para detección de la hibridación de
ácidos nucleicos^{29}. Sin embargo, ningún sistema es ideal para
detección de secuencias estrechamente relacionadas basada en
hibridación.
La invención se refiere a un nuevo ensayo
electrocatalítico de detección de ácido nucleico que informa de la
hibridación de ácido nucleico entre una sonda de ácido nucleico y un
ácido nucleico, o entre un primer ácido nucleico y un segundo ácido
nucleico, y puede resolver cambios de una sola base en una secuencia
de ácido nucleico diana. El método aprovecha una reacción entre un
par rédox que comprende un compuesto de fijación de ácido nucleico
y una sonda con actividad rédox. El compuesto de fijación de ácido
nucleico comprende un compuesto con actividad rédox que puede
fijarse al ácido nucleico electrostáticamente y puede reducirse a
potencial bajo. Este compuesto se fija al ácido nucleico,
produciendo un complejo combinado electrostáticamente. La señal
generada por la fijación puede amplificarse por el uso de una sonda
con actividad rédox que puede oxidar de nuevo el complejo combinado
electrostáticamente.
El compuesto de fijación de ácido nucleico puede
ser un complejo de un metal de transición. Con preferencia, el
metal de transición es uno seleccionado del grupo constituido por
cobalto, hierro, molibdeno, osmio, rutenio y renio. También
preferiblemente, el complejo de metal de transición es un complejo
de amonio del metal de transición. Más preferiblemente, el complejo
de metal de transición es Ru(NH_{3})_{6}^{3+}.
La sonda con actividad rédox puede ser también un complejo de metal
de transición. Con preferencia, el metal de transición es uno
seleccionado del grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio,
hierro y renio. También preferiblemente, el complejo de metal de
transición es un complejo
de cianato (sic) del metal de transición. Más preferiblemente, el complejo de metal de transición es Fe(CN)_{6}^{3-}.
de cianato (sic) del metal de transición. Más preferiblemente, el complejo de metal de transición es Fe(CN)_{6}^{3-}.
El compuesto de fijación de ácido nucleico se
fija al ácido nucleico principalmente por interacciones
electrostáticas con la cadena principal de fosfato, y por
consiguiente su reducción electroquímica produce una señal que
informa del aumento de grupos cargados negativamente en la
superficie del electrodo como resultado de la hibridación de un
ácido nucleico diana. La señal es amplificada por el oxidante de
metal de transición de la sonda con actividad rédox que permite que
el metal de transición se regenere para ciclos múltiples. La
inmovilización de la sonda de ácido nucleico en superficies
altamente conductoras, v.g., oro, amplifica los efectos cinéticos
de los desapareamientos de bases sobre la hibridación del ácido
nucleico, permitiendo resolver cambios de una sola base.
El ensayo de la presente invención puede
utilizarse para detectar genes de patógenos, tales como bacterias o
virus, o puede utilizarse para detectar la expresión de genes en un
individuo.
Con preferencia, el método se utiliza para
detectar la hibridación entre dos moléculas de ácido nucleico. La
invención incluye también un método para detectar la hibridación
entre dos moléculas de DNA o RNA, o entre moléculas de DNA y
RNA.
La invención presenta un método para detectar la
hibridación de ácido nucleico entre una sonda de ácido nucleico y
un ácido nucleico diana en una muestra, donde el método incluye los
pasos de: (a) proporcionar una sonda de ácido nucleico inmovilizada
sobre un sustrato sólido; (b) poner en contacto, en condiciones de
hibridación, el soporte sólido y la sonda inmovilizada con una
solución que contiene la muestra y un par rédox, en donde el par
rédox comprende un primer complejo de metal de transición y un
segundo complejo de metal de transición; y (c) medir la señal
electrocatalítica generada por hibridación de la sonda de ácido
nucleico y el ácido nucleico diana; donde un aumento de la señal
detectada en el paso (c) con relación a la de una muestra de control
que no contiene ácido nucleico alguno, indica que ha ocurrido
hibridación del ácido nucleico. El método puede incluir también un
paso adicional de testar un control, poniendo en contacto, en
condiciones de hibridación, el soporte sólido y la sonda de ácido
nucleico inmovilizada con una solución que no contiene muestra
alguna, y un par rédox que comprende un primer complejo de metal de
transición y un segundo complejo de metal de transición.
Con preferencia, el metal de transición del
primer complejo de metal de transición es uno seleccionado del
grupo constituido por cobalto, hierro, molibdeno, osmio, rutenio y
renio. Más preferiblemente, el metal de transición del primer
complejo de metal de transición es rutenio. También preferiblemente,
el primer complejo de metal de transición es un complejo de metal
de transición con amonio. Más preferiblemente, el primer complejo
de metal de transición con amonio comprende un metal de transición
seleccionado del grupo constituido por cobalto, hierro, molibdeno,
osmio, rutenio y renio. Muy preferiblemente, el complejo de metal de
transición con amonio es
Ru(NH_{3})_{6}^{3+}.
Con preferencia, el metal de transición del
segundo complejo de metal de transición es uno seleccionado del
grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y renio. Más
preferiblemente, el metal de transición del segundo complejo de
metal de transición es hierro. También preferiblemente, el segundo
complejo de metal de transición es un complejo de cianato del metal
de transición. Más preferiblemente, el segundo complejo de metal de
transición con cianato comprende un metal de transición
seleccionado del grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y
renio. Muy preferiblemente, el segundo complejo de metal de
transición con cianato es Fe(CN)_{6}^{3-}.
La invención presenta también un método para
detectar la hibridación de ácido nucleico entre un primer ácido
nucleico y un segundo ácido nucleico, en donde el método incluye los
pasos de: (a) proporcionar el primer ácido nucleico inmovilizado
sobre un soporte sólido; (b) poner en contacto, en condiciones de
hibridación, el soporte sólido y el primer ácido nucleico
inmovilizado con una solución que se sospecha contiene el segundo
ácido nucleico y un par rédox que comprende un primer complejo de
metal de transición y un segundo complejo de metal de transición; y
(c) medir la señal electrocatalítica generada por hibridación de los
ácidos nucleicos primero y segundo; en donde un aumento de la señal
detectada en el paso (c) con relación a la de un primer ácido
nucleico no hibridado indica que ha ocurrido hibridación del ácido
nucleico. El método puede incluir también un paso adicional de
testar un control poniendo en contacto, en condiciones de
hibridación, el soporte sólido y el primer ácido nucleico
inmovilizado con una solución que no contiene muestra alguna, y un
par rédox que comprende un primer complejo de metal de transición y
un segundo complejo de metal de transición.
Con preferencia, el metal de transición del
primer complejo de metal de transición es uno seleccionado del
grupo constituido por cobalto, hierro, molibdeno, osmio, rutenio y
renio. Más preferiblemente, el metal de transición del primer
complejo de metal de transición es rutenio. Asimismo de modo
preferible, el primer complejo de metal de transición es un
complejo de amonio del metal de transición. Más preferiblemente, el
primer complejo de metal de transición con amonio comprende un
metal de transición seleccionado del grupo constituido por cobalto,
hierro, molib-
deno, osmio, rutenio y renio. Muy preferiblemente, el complejo de metal de transición con amonio es Ru(NH_{3})_{6}^{3+}.
deno, osmio, rutenio y renio. Muy preferiblemente, el complejo de metal de transición con amonio es Ru(NH_{3})_{6}^{3+}.
Con preferencia, el metal de transición del
segundo complejo de metal de transición es uno seleccionado del
grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y renio. Más
preferiblemente, el metal de transición del segundo complejo de
metal de transición es hierro. También de modo preferible, el
segundo complejo de metal de transición es un complejo de metal de
transición con cianato. Más preferiblemente, el segundo complejo de
metal de transición con cianato comprende un metal de transición
seleccionado del grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y
renio. Muy preferiblemente, el segundo complejo de metal de
transición con cianato es Fe(CN)_{6}^{3-}.
\newpage
En otro aspecto, la invención presenta un método
de detección de un desapareamiento entre un primer ácido nucleico y
un segundo ácido nucleico, que comprende: (a) proporcionar una sonda
de ácido nucleico inmovilizada sobre un soporte sólido; (b) poner
en contacto, en condiciones de hibridación, el soporte sólido y la
sonda inmovilizada con una solución que contiene la muestra que
comprende un ácido nucleico diana y un par rédox, en donde el par
rédox comprende un primer complejo de metal de transición y un
segundo complejo de metal de transición; y (c) medir la señal
electrocatalítica generada por hibridación de la sonda de ácido
nucleico y el ácido nucleico diana; en donde una disminución de la
señal detectada en el paso (c) con relación a la de una
complementariedad perfecta entre la sonda de ácido nucleico y el
ácido nucleico diana, indica que existe un desapareamiento entre el
primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico. El método puede
incluir también un paso adicional de testar un control poniendo en
contacto, en condiciones de hibridación, el soporte sólido y la
sonda de ácido nucleico inmovilizada con una solución que no
contiene muestra alguna, y un par rédox que comprende un primer
complejo de metal de transición y un segundo complejo de metal de
transición.
Con preferencia, el metal de transición del
primer complejo de metal de transición es uno seleccionado del
grupo constituido por cobalto, hierro, molibdeno, osmio, rutenio y
renio. Más preferiblemente, el metal de transición del primer
complejo de metal de transición es rutenio. También de modo
preferible, el primer complejo de metal de transición es un
complejo con amonio del metal de transición. Más preferiblemente, el
primer complejo de metal de transición con amonio comprende un
metal de transición seleccionado del grupo constituido por cobalto,
hierro, molib-
deno, osmio, rutenio y renio. Muy preferiblemente, el complejo de metal de transición con amonio es Ru(NH_{3})_{6}^{3+}.
deno, osmio, rutenio y renio. Muy preferiblemente, el complejo de metal de transición con amonio es Ru(NH_{3})_{6}^{3+}.
Con preferencia, el metal de transición del
segundo complejo de metal de transición es uno seleccionado del
grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y renio. Más
preferiblemente, el metal de transición del segundo complejo de
metal de transición es hierro. También de manera preferible, el
segundo complejo de metal de transición es un complejo de metal de
transición con cianato. Más preferiblemente, el segundo complejo de
metal de transición con cianato comprende un metal de transición
seleccionado del grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y
renio. Muy preferiblemente, el segundo complejo de metal de
transición con cianato es Fe(CN)_{6}^{3-}.
La invención presenta adicionalmente un método
de detección de un desapareamiento entre un primer ácido nucleico y
un segundo ácido nucleico, en donde el método incluye los pasos
siguientes: (a) proporcionar el primer ácido nucleico inmovilizado
en un soporte sólido; (b) poner en contacto, en condiciones de
hibridación, el soporte sólido y el primer ácido nucleico
inmovilizado con una solución que contiene la muestra que comprende
el segundo ácido nucleico y un par rédox, en donde el par rédox
comprende un primer complejo de metal de transición y un segundo
complejo de metal de transición; y (c) medir la señal
electrocatalítica generada por hibridación del primer ácido
nucleico y el segundo ácido nucleico; en donde una disminución de la
señal detectada en el paso (c) con relación a la de una
complementariedad perfecta entre el primer ácido nucleico y el
segundo ácido nucleico, indica que existe un desapareamiento entre
el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico. El método
puede incluir también un paso adicional de testar un control,
poniendo en contacto, en condiciones de hibridación, el soporte
sólido y la sonda de ácido nucleico inmovilizada con una solución
que no contiene muestra alguna, y un par rédox que comprende un
primer complejo de metal de transición y un segundo complejo de
metal de transición.
Con preferencia, el metal de transición del
primer complejo de metal de transición es uno seleccionado del
grupo constituido por cobalto, hierro, molibdeno, osmio, rutenio y
renio. Más preferiblemente, el metal de transición del primer
complejo de metal de transición es rutenio. También preferiblemente,
el primer complejo de metal de transición es un complejo de metal
de transición con amonio. Más preferiblemente, el primer complejo
de metal de transición con amonio comprende un metal de transición
seleccionado del grupo constituido por cobalto, hierro, molibdeno,
osmio, rutenio y renio. Muy preferiblemente, el complejo de metal de
transición con amonio es
Ru(NH_{3})_{6}^{3+}.
Con preferencia, el metal de transición del
segundo complejo de metal de transición es uno seleccionado del
grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio, y renio. Más
preferiblemente, el metal de transición del segundo complejo de
metal de transición es hierro. Asimismo de manera preferible, el
segundo complejo de metal de transición es un complejo de metal de
transición con cianato. Más preferiblemente, el segundo complejo de
metal de transición con cianato comprende un metal de transición
seleccionado del grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y
renio. Muy preferiblemente, el segundo complejo de metal de
transición con cianato es Fe(CN)_{6}^{3-}.
La invención presenta también un método de
detección de la hibridación de ácido nucleico entre una sonda de
ácido nucleico y un ácido nucleico diana, en donde el método incluye
los pasos siguientes: (a) proporcionar una sonda de ácido nucleico
inmovilizada en un soporte sólido; (b) poner en contacto la sonda
inmovilizada con una solución que contiene: (i) un complejo de
metal de transición; (c) medir la señal electrocatalítica generada;
(d) poner en contacto la sonda inmovilizada con una solución que
contiene: (i) una muestra que se cree incluye el ácido nucleico
diana, y (ii) un complejo de metal de transición; (e) medir la señal
electrocatalítica generada; en donde un aumento en la señal
detectada en el paso (e) sobre la señal generada en el paso (c)
indica que ha ocurrido hibridación entre la sonda de ácido nucleico
y el ácido nucleico diana. Con preferencia, el metal de transición
del complejo de metal de transición es uno seleccionado del grupo
constituido por cobalto, hierro, molibdeno, osmio, rutenio y renio.
Más preferiblemente, el metal de transición del complejo de metal
de transición es rutenio. También de modo preferible, el complejo de
metal de transición es un complejo de metal de transición con
amonio. Más preferiblemente, el primer complejo de metal de
transición con amonio comprende un metal de transición seleccionado
del grupo constituido por cobalto, hierro, molibdeno,
osmio, rutenio y renio. Muy preferiblemente, el complejo de metal de transición con amonio es Ru(NH_{3})_{6}^{3+}.
osmio, rutenio y renio. Muy preferiblemente, el complejo de metal de transición con amonio es Ru(NH_{3})_{6}^{3+}.
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Las soluciones pueden incluir también un segundo
complejo de metal de transición para mejorar la señal
electrocatalítica generada. Con preferencia, el metal de transición
del segundo complejo de metal de transición es uno seleccionado del
grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y renio. Más
preferiblemente, el metal de transición del segundo complejo de
metal de transición es hierro. También de modo preferible, el
segundo complejo de metal de transición es un complejo de metal de
transición con cianato. Más preferiblemente, el segundo complejo de
metal de transición con cianato comprende un metal de transición
seleccionado del grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y
renio. Muy preferiblemente, el segundo complejo de metal de
transición con cianato es Fe(CN)_{6}^{3-}.
El método puede incluir también pasos de lavado,
v.g., lavado del electrodo entre el contacto con las
diferentes soluciones.
La invención presenta adicionalmente un método
para detectar la presencia de un ácido nucleico diana en una
muestra, en donde el método incluye los pasos siguientes: (a)
proporcionar una sonda de ácido nucleico inmovilizada en un soporte
sólido; (b) poner en contacto la sonda inmovilizada con una solución
que contiene: (i) un complejo de metal de transición; (c) medir la
señal electrocatalítica generada; (d) poner en contacto la sonda
inmovilizada con una solución que contiene: (i) una muestra que se
cree incluye el ácido nucleico diana, y (ii) un complejo de metal
de transición; (e) medir la señal electrocatalítica generada; en
donde un aumento en la señal detectada en el paso (e) sobre la
señal generada en el paso (c) indica que el ácido nucleico está
presente en la muestra. Con preferencia, el metal de transición del
complejo de metal de transición es uno seleccionado del grupo
constituido por cobalto, hierro, molibdeno, osmio, rutenio y renio.
Más preferiblemente, el metal de transición del complejo de metal
de transición es rutenio. También de modo preferible, el complejo de
metal de transición es un complejo de metal de transición con
amonio. Más preferiblemente, el primer complejo de metal de
transición con amonio comprende un metal de transición seleccionado
del grupo constituido por cobalto, hierro, molibdeno, osmio,
rutenio y renio. Muy preferiblemente, el complejo de metal de
transición con amonio es
Ru(NH_{3})_{6}^{3+}.
Las soluciones pueden incluir también un segundo
complejo de metal de transición para mejorar la señal
electrocatalítica generada. Con preferencia, el metal de transición
del segundo complejo de metal de transición es uno seleccionado del
grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y renio. Más
preferiblemente, el metal de transición del segundo complejo de
metal de transición es hierro. También de modo preferible, el
segundo complejo de metal de transición es un complejo de metal de
transición con cianato. Más preferiblemente, el segundo complejo de
metal de transición con cianato comprende un metal de transición
seleccionado del grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y
renio. Muy preferiblemente, el segundo complejo de metal de
transición con cianato es Fe(CN)_{6}^{3-}.
El método puede incluir también pasos de lavado,
v.g., lavado del electrodo entre el contacto con las diferentes
soluciones.
La invención presenta adicionalmente un método
para detectar un desapareamiento entre dos ácidos nucleicos, en
donde el método incluye los pasos siguientes: (a) proporcionar una
sonda de ácido nucleico inmovilizada en un soporte sólido; (b)
poner en contacto la sonda inmovilizada con una solución que
contiene: (i) un complejo de metal de transición; (c) medir la
señal electrocatalítica generada; (d) poner en contacto la sonda
inmovilizada con una solución que contiene: (i) una muestra que se
cree incluye el ácido nucleico diana, y (ii) un complejo de metal
de transición; (e) medir la señal electrocatalítica generada; en
donde una disminución en la señal detectada en el paso (e) sobre la
señal generada en el paso (c) indica que existe un desapareamiento
entre el ácido nucleico sonda y el ácido nucleico diana. Con
preferencia, el metal de transición del complejo de metal de
transición es uno seleccionado del grupo constituido por cobalto,
hierro, molibdeno, osmio, rutenio y renio. Más preferiblemente, el
metal de transición del complejo de metal de transición es rutenio.
También de modo preferible, el complejo de metal de transición es
un complejo de metal de transición con amonio. Más preferiblemente,
el primer complejo de metal de transición con amonio comprende un
metal de transición seleccionado del grupo constituido por cobalto,
hierro, molibdeno, osmio, rutenio y renio. Muy preferiblemente, el
complejo de metal de transición con amonio es
Ru(NH_{3})_{6}^{3+}.
Las soluciones pueden incluir también un segundo
complejo de metal de transición para mejorar la señal
electrocatalítica generada. Con preferencia, el metal de transición
del segundo complejo de metal de transición es uno seleccionado del
grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y renio. Más
preferiblemente, el metal de transición del segundo complejo de
metal de transición es hierro. También de modo preferible, el
segundo complejo de metal de transición es un complejo de metal de
transición con cianato. Más preferiblemente, el segundo complejo de
metal de transición con cianato comprende un metal de transición
seleccionado del grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y
renio. Muy preferiblemente, el segundo complejo de metal de
transición con cianato es Fe(CN)_{6}^{3-}.
El método puede incluir también pasos de lavado,
v.g., lavado del electrodo entre el contacto con las diferentes
soluciones.
En cualquiera de los métodos descritos en esta
memoria, el soporte sólido puede ser un electrodo de oro.
La invención incluye también un estuche para
realizar el método, que incluye una sonda de ácido nucleico
inmovilizada en un electrodo conductor, y reactivos rédox. El
estuche puede incluir muestras positivas de control que incluyen
ácidos nucleicos diana, y muestras negativas de control que no
contienen ácido nucleico diana alguno. El estuche puede incluir
también tipos específicos de controles positivos, v.g.,
ácidos nucleicos diana que son característicos de patógenos y genes
diana específicos. El estuche puede incluir también materiales de
empaquetado e instrucciones para uso.
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La Figura 1 es una ilustración de la detección
electrocatalítica de la hibridación de DNA de una secuencia de
H. pylori.
Figs. 2A y 2B muestran la detección
electrocatalítica de la hibridación de la secuencia Hpn de H.
pylori. Figura 2ª: sin diana. Figura 2B: con diana.
La Figura 3 es un histograma que muestra la
reproducibilidad de la detección electrocatalítica de la
hibridación. Los tests descritos a continuación y representados en
la Figura 2 se realizaron en cuatro días distintos.
La Figura 4 es una ilustración de la detección
electrocatalítica de la hibridación del DNA.
Las Figuras 5A, 5B y 5C muestran un par de
voltamogramas y un gráfico de barras. La Figura 5A es un
voltamograma cíclico que ilustra la intensificación de la señal
electrocatalítica después de la hibridación de la secuencia diana.
La señal inicial se muestra como una línea de puntos, y la señal
obtenida después de la introducción de la diana se muestra como una
línea de trazo continuo. La Figura 5B es un voltamograma obtenido
con los mismos electrodos pero en presencia de Ru(III)
solamente, que exhibe un aumento de señal muy pequeño después de
introducción de la diana. La Figura 5C muestra la detección de
secuencias relacionadas con H. pylori por monitorización de
la carga integrada. Los datos representados corresponden al cambio
de carga después de 30 minutos de hibridación.
La Figura 6 es un gráfico de barras que muestra
la dependencia del tiempo de la hibridación para las secuencias WT
y A2143T correspondientes a un fragmento del rRNA 23S de H.
pylori.
La Figura 7 es un gráfico de barras que muestra
la dependencia del tiempo de la hibridación para la sonda HP2A
(complementaria a la sonda Hpn) y la sonda HP2B (no complementaria a
la sonda Hpn).
La Figura 8 es la electrocatálisis
Ru(III)/Fe(III) como informadora de DNA inmovilizado
en superficie. (A) Dependencia de la electrocatálisis del
recubrimiento de la superficie con DNA. Se prepararon películas de
DNA con densidades variables por variación de la concentración de
MgCl_{2} durante la exposición de sustratos de oro a soluciones
sonda. Se muestran voltamogramas cíclicos obtenidos en electrodos
modificados en presencia de MgCl_{2} 10 (línea de puntos), 30
(línea de trazos), y 100 (línea de trazo continuo) mM. (B)
Voltamogramas cíclicos que ilustran la intensificación de la señal
electrocatalítica después de hibridación de T2a (la línea de puntos
corresponde al CV obtenido antes de la hibridación, y la línea de
trazo continuo corresponde al CV obtenido después de la
hibridación). Se prepararon películas de DNA en presencia de
MgCl_{2} 50 mM. La hibridación con T2a se indujo por introducción
de una solución que contenía DNA 20 \muM, fosfato de sodio 25 mM
(pH 7), NaCl 25 mM, y MgCl_{2} 100 mM durante 30 minutos. La
solución de la diana se calentó a 40ºC, se depositó en un electrodo
invertido, y se incubó durante 30 minutos. No se obtuvo cambio
alguno de señal cuando se introdujo tampón o una secuencia no
complementaria (T-NC). Para comparación, se muestran
voltamogramas de una solución de Ru(NH_{3})_{6}
27 \muM obtenidos antes (línea de puntos) y después de la
hibridación (línea de trazo continuo).
La Figura 9 muestra la detección de secuencias
relacionadas con H. pylori por cambios en la carga integrada
obtenidos utilizando electrocatálisis. Se utilizó voltametría
cíclica para cuantificar la carga en los electrodos expuestos a
pares de secuencias diana/sonda diferentes. Se prepararon películas
de secuencias sonda de DNA (HP2b y HP1a) como se describe en la
Figura 8, con la excepción de que la secuencia sonda de 30
nucleótidos (HP1a) se depositó durante 1,5 horas. La carga
integrada media medida en los electrodos modificados con la sonda
antes de la hibridación se muestra como una línea de puntos. Se dejó
que transcurriera la hibridación de todas las secuencias diana
durante 30 minutos y se realizó por lo demás como se describe en la
Figura 8 con excepción de la inclusión de MgCl_{2} 200 mM en la
solución de hibridación para la diana hpn (T1).
La Figura 10 muestra la dependencia de la
eficiencia de hibridación respecto al recubrimiento de la
superficie. Se utilizaron sondas y secuencias diana tioladas
modificadas con fluoresceína para cuantificar los recubrimientos
absolutos de la superficie, y se empleó voltametría cíclica para
cuantificar los cambios de carga después de la hibridación. Las
secuencias sonda (HP2a) y diana (T2a) y las condiciones
experimentales son idénticas a la Figura 8A.
La Figura 11 muestra la dependencia respecto al
tiempo de la hibridación para las secuencias WT y A2143C
correspondientes a un fragmento del rRNA 23S de H. pylori.
Se depositaron películas de DNA sonda (HP2a) a partir de soluciones
que contenían MCH 1 \muM, ssDNA 5 \muM, y fosfato de sodio 0,8 M
(pH 7) durante 1 hora a la temperatura ambiente. La hibridación se
realizó con diana 1 \muM en fosfato de sodio 25 mM (pH 7), NaCl 25
mM, y MgCl_{2} 100 mM durante el tiempo designado. Los electrodos
se incubaron a 40ºC durante la hibridación.
La Figura 12 muestra la detección
electrocatalítica de dianas extendidas de DNA y RNA. Las soluciones
sonda de DNA (HP1b y HP1c) se depositaron durante 1,5 horas. La
solución diana que contenía 30-mero sintético y
producto PCR comprendía diana 500 nM, MgCl_{2} 100 mM, fosfato de
sodio 25 mM (pH 7), y NaCl 25 mM, y se expusieron a películas de
DNA durante 1 hora a 45ºC. La hibridación de la diana de RNA se
realizó en las mismas condiciones excepto que se utilizó RNA 1
\muM.
"Soporte sólido", como se utiliza en esta
memoria, se refiere al material al que está unida la sonda de ácido
nucleico. Soportes sólidos adecuados están disponibles
comercialmente, y serán evidentes para las personas expertas. Los
soportes pueden fabricarse de materiales tales como vidrio,
cerámica, sílice y silicio, y pueden incorporar material conductor
para servir como electrodo. Pueden utilizarse también soportes
conductores con una superficie de oro. Los soportes comprenden
usualmente una superficie aplastada (planar), o al menos una
estructura en la cual los polinucleótidos a interrogar se encuentren
aproximadamente en el mismo plano. El soporte puede ser un
electrodo, o puede estar unido a un electrodo.
"Desapareamiento", como se utiliza en esta
memoria, se refiere a un dúplex en el cual un número inferior a la
totalidad de los nucleótidos de una cadena están perfectamente
apareados con la otra cadena (v.g., donde ocurre
apareamiento de nucleótidos distinto de
adenosina-timina o guanina-citosina,
v.g., apareamiento de nucleótidos tal como
adenosina-citosina,
adenosina-guanina,
adenosina-adenosina,
timina-citosina, timina-guanina,
timina-timina, guanina-guanina o
citosina-citosina), en donde ocurre una deleción o
inserción de uno o más nucleótidos de DNA en una cadena en
comparación con la otra cadena complementaria (v.g., una
deleción de 1, 2, 5, 10, 15, o más nucleótidos o una inserción de
1, 2, 5, 10, 15, o más nucleótidos), u ocurren otros
desapareamientos entre las dos cadenas del dúplex. Los
desapareamientos de DNA pueden presentarse como consecuencia de
errores de replicación del ácido nucleico, mutagénesis, desaminación
de 5-metil-citosina, formación de
dímeros de timidina, recombinación de ácido nucleico, etc.
Por "sonda" se entiende un oligonucleótido
monocatenario capaz de fijarse a al menos una porción del ácido
nucleico diana que se pretende detectar. La sonda tendrá
generalmente una secuencia parcial o totalmente complementaria a
una secuencia diana de ácido nucleico que se pretende detectar, a
fin de hibridarse de manera estable la misma en condiciones de
hibridación severas. En el caso de una sonda específica de grupo o
especie, la sonda tiene la capacidad para hibridarse de manera
estable a un ácido nucleico diana y no a ácidos nucleicos no diana
tales como los de organismos que quedan fuera del grupo o especie
filogenético(a) en condiciones de hibridación severas. Las
sondas pueden, pero sin carácter necesario, tener regiones que no
son complementarias a una secuencia diana, con tal que dichas
secuencias no alteren sustancialmente la especificidad deseada de
la sonda en condiciones de hibridación severas.
Como se utiliza en esta memoria, el término
"una sonda de ácido nucleico" se refiere también a un ácido
nucleico capaz de fijarse a un ácido nucleico diana de secuencia
complementaria por uno o más tipos de enlaces químicos, usualmente
por apareamiento de bases complementarias, usualmente por formación
de enlaces de hidrógeno. Como se utiliza en esta memoria, una sonda
puede incluir bases naturales (es decir, A, G, C, o T) o modificadas
(7-desazaguanosina, inosina, etc.) o modificaciones
en el resto azúcar. Adicionalmente, las bases de una sonda pueden
estar unidas por un eslabón distinto de un enlace fosfodiéster, con
tal que el mismo no interfiera con la hibridación. Así, por
ejemplo, las sondas pueden ser ácidos nucleicos peptídicos en los
cuales las bases constituyentes están unidas por enlaces peptídicos
en lugar de eslabones fosfodiéster. Será comprendido por un experto
en la técnica que las sondas pueden fijar secuencias diana que
carecen de complementariedad completa, dependiendo la secuencia
sonda de la severidad de las condiciones de hibridación. Por ensayos
en cuanto a la presencia o ausencia de la sonda, puede detectarse
la presencia o ausencia de la secuencia o subsecuencia
seleccionada.
Como se utiliza en esta memoria, el término
"ácido nucleico" hace referencia a polinucleótidos tales como
ácido desoxirribonucleico (DNA), y, en caso apropiado, ácido
ribonucleico (RNA). Debe entenderse que el término incluye también,
como equivalentes, análogos de RNA o DNA constituidos por análogos
de nucleótidos y, en caso de ser aplicable a la realización que se
describe, polinucleótidos mono- (sentido o antisentido) y
bi-catenarios. ESTs, cromosomas, cDNAs, mRNAs, y
rRNAs son ejemplos representativos de moléculas a las que puede
hacerse referencia como ácidos nucleicos.
Como se utiliza en esta memoria, el término
"hibridación" se refiere a cualquier proceso por el cual una
cadena de ácido nucleico se une a una cadena complementaria por
apareamiento de bases.
Como se utiliza en esta memoria, el término
"condiciones de hibridación" hace referencia a condiciones
estándar en las cuales se utilizan moléculas de ácido nucleico para
identificar moléculas de ácido nucleico similares. Tales
condiciones estándar se describen, por ejemplo, en Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Labs Press, 1989. Sambrook et al., ibid., se incorpora
por referencia en esta memoria en su totalidad (véanse
específicamente las páginas 9.31-9.62).
Adicionalmente, fórmulas para calcular las condiciones apropiadas
de hibridación y lavado a fin de conseguir hibridación que permita
grados variables de desapareamiento de nucleótidos se describen,
por ejemplo, en Meinkoth et al., 1984, Anal. Biochem. 138,
267-284; Meinkoth et al., ibid., se
incorpora por referencia en esta memoria en su totalidad. Ejemplos
no limitantes de condiciones de hibridación incluyen condiciones de
hibridación de severidad baja, condiciones de hibridación de
severidad moderada y condiciones de hibridación de severidad
alta.
Como se utiliza en esta memoria, el término
"muestra" tal como se utiliza en sentido más amplio, hace
referencia a cualquier material vegetal, animal o viral que
contiene DNA o RNA, tal como, por ejemplo, tejido o fluido aislado
de un individuo (incluyendo sin limitación plasma, suero, fluido
cerebroespinal, linfa, lágrimas, saliva y secciones de tejidos) o
de constituyentes de cultivo de células in vitro, así como
muestras del medio ambiente. La muestra de ácidos nucleicos puede
extraerse de cualquier fuente y puede ser natural o sintética. La
muestra de ácidos nucleicos puede contener ácidos
desoxirribonucleicos (DNA), ácidos ribonucleicos (RNA), o
copolímeros de ácidos desoxirribonucleicos y ácidos ribonucleicos o
combinaciones de los mismos. Alternativamente, la muestra puede
haber sido sometida a purificación (v.g. extracción) u otro
tratamiento. El término "muestra" puede hacer referencia
también a una "muestra biológica".
Como se utiliza en esta memoria, el término
"una muestra biológica" hace referencia a un organismo entero
o un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes (v.g.,
fluidos corporales, que incluyen pero sin carácter limitante
sangre, mucus, fluido linfático, fluido sinovial, fluido
cerebroespinal, saliva, fluido amniótico, sangre del cordón
umbilical, orina, fluido vaginal y semen). "Una muestra
biológica" se refiere adicionalmente a un homogeneizado, lisado
o extracto preparado a partir de un organismo entero o un
subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes, o una
fracción o porción de aquél, con inclusión pero sin carácter
limitante de, por ejemplo, plasma, suero, fluido espinal, fluido
linfático, las secciones externas de la piel, los tractos
respiratorio, intestinal, y genitourinario, lágrimas, saliva, leche,
células sanguíneas, tumores, y órganos. En muchos casos, la muestra
ha sido extraída de un animal, pero el término "muestra
biológica" puede hacer referencia también a células o tejido
analizados in vivo, es decir, sin ser extraídos del animal.
Típicamente, una "muestra biológica" contendrá células del
animal, pero el término puede hacer referencia también a material
biológico no celular, tal como fracciones no celulares de sangre,
saliva, u orina, que pueden utilizarse para medir los niveles de
polinucleótidos o polipéptidos asociados al cáncer. "Una muestra
biológica" hace referencia adicionalmente a un medio, tal como un
caldo o gel nutriente en el cual se ha propagado un organismo, que
contiene componentes celulares, tales como proteínas o como
moléculas de ácido nucleico.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término
"un aumento de la señal" significa que la señal generada por
la hibridación entre dos ácidos nucleicos es mayor que la generada a
partir de uno de dichos dos ácidos nucleicos sólo en forma no
hibridada. Con preferencia, la hibridación tiene lugar entre una
sonda de ácido nucleico y un ácido nucleico diana. También
preferiblemente, la hibridación existe entre un primer ácido
nucleico y un segundo ácido nucleico. Con preferencia, el aumento
es de al menos aproximadamente 10%, con preferencia al menos
aproximadamente 15%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%,
aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 65%,
aproximadamente 75%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%,
aproximadamente 95%, aproximadamente más
de 100%, aproximadamente dos veces, aproximadamente diez veces, aproximadamente cincuenta veces, o mayor.
de 100%, aproximadamente dos veces, aproximadamente diez veces, aproximadamente cincuenta veces, o mayor.
Como se utiliza en esta memoria, el término
"disminución de la señal" significa que la señal generada por
la hibridación entre dos ácidos nucleicos que son complementarios
excepto por un desapareamiento, es menor que la generada por la
hibridación entre dos ácidos nucleicos totalmente complementarios.
Con preferencia, la disminución es de al menos aproximadamente 10%,
con preferencia al menos aproximadamente 15%, aproximadamente 25%,
aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%,
aproximadamente 65%, aproximadamente 75%, aproximadamente 85%,
aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente más de
100%, aproximadamente dos veces, aproximadamente tres veces,
aproximadamente cincuenta veces, o mayor.
Como se utiliza en esta memoria, el término
"un metal de transición" se refiere a cualquiera de los
elementos encontrados entre los Elementos del Grupo IIA y los
Elementos del Grupo IIB en la Tabla Periódica. Los metales de
transición a utilizar en un complejo de metal de transición de la
presente invención incluyen los de los periodos cuarto, quinto y
sexto de la Tabla Periódica de los Elementos. Con preferencia, los
metales de transición utilizados en la presente invención incluyen
hierro, rutenio, cobalto, molibdeno, osmio y renio.
Como se utiliza en esta memoria, el término
"complejo de metal de transición" hace referencia a una
estructura compuesta de un átomo o ión central de metal de
transición, generalmente un catión, rodeado por cierto número de
ligandos cargados negativamente o neutros que poseen pares de
electrones solitarios que pueden ser cedidos al átomo central. El
metal de transición se define anteriormente en esta memoria. Los
ligandos se fijan al metal de transición central utilizando enlaces
coordinados. Existen cierto número de tipos de ligandos diferentes
que pueden aplicarse a la presente invención. Ejemplos no limitantes
incluyen, pero sin limitación, ligandos monodentados, ligandos
bidentados, ligandos tridentados, ligandos tetradentados y ligandos
hexadentados, etc. Con preferencia, los ligandos puede estar
basados en piridina, basados en fenantrolina, heterocíclicos, aquo,
aromáticos, cloruro (Cl^{-}), amoniaco (NH_{3}), o cianuro
(CN^{-}).
Se describe en esta memoria un ensayo de
detección electrocatalítico que informa de la hibridación entre
ácidos nucleicos, o entre ácidos nucleicos y proteínas. En un
aspecto, el ensayo puede utilizarse para detectar la hibridación
entre una sonda de ácido nucleico y una diana de DNA o RNA. El
ensayo presente es suficientemente sensible para resolver cambios
de una sola base en la secuencia diana. El método aprovecha una
reacción entre un par rédox que comprende un compuesto de fijación
de ácido nucleico y una sonda con actividad rédox. El compuesto de
fijación de ácido nucleico puede ser un complejo de metal de
transición. Con preferencia, el metal de transición es uno
seleccionado del grupo constituido por cobalto, hierro, molibdeno,
osmio, rutenio y renio. También preferiblemente, el complejo de
metal de transición es un complejo con amonio del metal de
transición. Más preferiblemente, el complejo de metal de transición
es Ru(NH_{3})_{6}^{3+}. La sonda con actividad
rédox puede ser también un complejo de metal de transición. Con
preferencia, el metal de transición es uno seleccionado del grupo
constituido por cobalto, molibdeno, osmio, hierro y renio. También
preferiblemente, el complejo de metal de transición es un complejo
con cianato del metal de transición. Más preferiblemente, el
complejo de metal de transición es
Fe(CN)_{6}^{3-}.
El compuesto de fijación de ácido nucleico se
fija al ácido nucleico fundamentalmente por interacciones
electrostáticas con la cadena principal de fosfato, y por
consiguiente su reducción electroquímica produce una señal que
informa acerca del aumento de grupos cargados negativamente en la
superficie del electrodo después de la hibridación de un ácido
nucleico diana. La señal es amplificada por el oxidante de metal de
transición de la sonda con actividad rédox, lo que permite que el
metal de transición se regenere para ciclos múltiples. La
inmovilización de la sonda de ácido nucleico en superficies
altamente conductoras, v.g., oro, amplifica los efectos
cinéticos de los desapareamientos de bases en la hibridación del
ácido nucleico, permitiendo que se resuelvan cambios de una sola
base.
Una ventaja del ensayo es el uso del compuesto
de fijación de ácido nucleico para informar del suceso de
hibridación y el acoplamiento de esta señal a otro proceso
electrocatalítico. El diseño proporciona también sensibilidad
superior, v.g., detección de un solo desapareamiento de
bases.
La invención descrita en esta memoria es útil
para detectar agentes infecciosos bacterianos y virales. La
invención es útil también para detección de genes y proteínas,
v.g., cambios en genes y proteínas, v.g., cambios en
oncogenes. La misma es útil por tanto en un escenario de diagnóstico
clínico, y para la detección de agentes patógenos en escenarios no
clínicos, v.g., detección de agentes de bioterrorismo.
En otro aspecto, el método descrito en esta
memoria puede utilizarse para determinar la presencia de un ácido
nucleico diana de acuerdo con el protocolo siguiente. Una muestra
biológica que se sospecha contiene el ácido nucleico diana puede
tratarse opcionalmente para liberar cualquier ácido nucleico
contenido en la muestra. Por ejemplo, la muestra puede ser suero,
sangre, otros fluidos corporales, tejido, etc. La muestra puede
proceder también de un humano, un animal, una planta, etc. La
muestra puede ser también ácido nucleico lavado procedente de un
frotis o cualquier otro tipo de material utilizado para limpiar
superficies a fin de detectar contaminantes. La muestra puede ser
también ácido nucleico extraído o separado por lavado de un filtro a
través del cual se hace pasar aire, v.g., un filtro
procedente de un sistema de filtración de aire, en el caso de la
detección de agentes de bioterrorismo transportados por el aire. Un
artículo de este tipo puede tratarse para extraer el ácido nucleico
por métodos que son conocidos en la técnica, v.g., métodos de
medicina forense y detección de contaminación. El ácido nucleico
extraído del artículo puede ser testado directamente por los métodos
descritos en esta memoria, o puede amplificarse para mejorar
la
detección.
detección.
En una realización, la invención presenta un
método de detección de la hibridación de ácidos nucleicos entre una
sonda de ácido nucleico y un ácido nucleico diana en una muestra, en
donde el método incluye los pasos de: (a) proporcionar una sonda de
ácido nucleico inmovilizada sobre un sustrato sólido; (b) poner en
contacto, en condiciones de hibridación, el soporte sólido y la
sonda inmovilizada con una solución que contiene la muestra y un
par rédox, en donde el par rédox comprende un primer complejo de
metal de transición y un segundo complejo de metal de transición; y
(c) medir la señal electrocatalítica generada por hibridación de la
sonda de ácido nucleico y el ácido nucleico diana; en donde un
aumento de la señal detectada en el paso (c) con relación a la de
una muestra de control que no contiene ácido nucleico alguno, indica
que ha ocurrido hibridación del ácido nucleico. El método puede
incluir también un paso adicional de testar un control, poniendo en
contacto, en condiciones de hibridación, el soporte sólido y la
sonda de ácido nucleico inmovilizada con una solución que no
contiene muestra alguna, y un par rédox que comprende un primer
complejo de metal de transición y un segundo complejo de metal de
transición.
Con preferencia, el metal de transición del
primer complejo de metal de transición es uno seleccionado del
grupo constituido por cobalto, hierro, molibdeno, osmio, rutenio y
renio. Más preferiblemente, el metal de transición del primer
complejo de metal de transición es rutenio. También preferiblemente,
el primer complejo de metal de transición es un complejo de metal
de transición con amonio. Más preferiblemente, el primer complejo
de metal de transición con amonio comprende un metal de transición
seleccionado del grupo constituido por cobalto, hierro, molibdeno,
osmio, rutenio y renio. Muy preferiblemente, el complejo de metal de
transición con amonio es
Ru(NH_{3})_{6}^{3+}.
Con preferencia, el metal de transición del
segundo complejo de metal de transición es uno seleccionado del
grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio, y renio. Más
preferiblemente, el metal de transición del segundo complejo de
metal de transición es hierro. Asimismo preferentemente, el segundo
complejo de metal de transición es un complejo de metal de
transición con cianato. Más preferiblemente, el segundo complejo de
metal de transición con cianato comprende un metal de transición
seleccionado del grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y
renio. Muy preferiblemente, el segundo complejo de metal de
transición con cianato es Fe(CN)_{6}^{3-}.
En otra realización, la invención presenta
también un método para detectar la hibridación de ácido nucleico
entre un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico, en donde
el método incluye los pasos siguientes: (a) proporcionar el primer
ácido nucleico inmovilizado en un soporte sólido; (b) poner en
contacto, en condiciones de hibridación, el soporte sólido y el
primer ácido nucleico inmovilizado con una solución que se sospecha
contiene el segundo ácido nucleico y un par rédox que comprende un
primer complejo de metal de transición y un segundo complejo de
metal de transición; y (c) medir la señal electrocatalítica generada
por hibridación de los ácidos nucleicos primero y segundo; en donde
un aumento en la señal detectada en el paso (c) con relación a la
de un primer ácido nucleico no hibridado, indica que ha ocurrido
hibridación del ácido nucleico. El método puede incluir también un
paso adicional de testar un control, poniendo en contacto, en
condiciones de hibridación, el soporte sólido y el primer ácido
nucleico inmovilizado con una solución que no contiene muestra
alguna, y un par rédox que comprende un primer complejo de metal de
transición y un segundo complejo de metal de transición.
Con preferencia, el metal de transición del
primer complejo de metal de transición es uno seleccionado del
grupo constituido por cobalto, hierro, molibdeno, osmio, rutenio y
renio. Más preferiblemente, el metal de transición del primer
complejo de metal de transición es rutenio. También preferiblemente,
el primer complejo de metal de transición es un complejo de metal
de transición con amonio. Más preferiblemente, el primer complejo
de metal de transición con amonio comprende un metal de transición
seleccionado del grupo constituido por cobalto, hierro, molibdeno,
osmio, rutenio y renio. Muy preferiblemente, el complejo de metal de
transición con amonio es
Ru(NH_{3})_{6}^{3+}.
Con preferencia, el metal de transición del
segundo complejo de metal de transición es uno seleccionado del
grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio, y renio. Más
preferiblemente, el metal de transición del segundo complejo de
metal de transición es hierro. Asimismo preferentemente, el segundo
complejo de metal de transición es un complejo de metal de
transición con cianato. Más preferiblemente, el segundo complejo de
metal de transición con cianato comprende un metal de transición
seleccionado del grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y
renio. Muy preferiblemente, el segundo complejo de metal de
transición con cianato es Fe(CN)_{6}^{3-}.
En otro aspecto, la invención presenta un método
para detectar un desapareamiento entre un primer ácido nucleico y
un segundo ácido nucleico, que comprende: (a) proporcionar una sonda
de ácido nucleico inmovilizada sobre un soporte sólido; (b) poner
en contacto, en condiciones de hibridación, el soporte sólido y la
sonda inmovilizada con una solución que contiene la muestra que
comprende un ácido nucleico diana y un par rédox, en donde el par
rédox comprende un primer complejo de metal de transición y un
segundo complejo de metal de transición; y (c) medir la señal
electrocatalítica generada por hibridación de la sonda de ácido
nucleico y el ácido nucleico diana; en donde una disminución de la
señal detectada en el paso (c) con relación a la de una
complementariedad perfecta entre la sonda de ácido nucleico y el
ácido nucleico diana, indica que existe un desapareamiento entre el
primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico. El método puede
incluir también un paso adicional de testar un control, por
contacto, en condiciones de hibridación, del soporte sólido y la
sonda de ácido nucleico inmovilizada con una solución que no
contiene muestra alguna, y un par rédox que comprende un primer
complejo de metal de transición y un segundo complejo de metal de
transición.
Con preferencia, el metal de transición del
primer complejo de metal de transición es uno seleccionado del
grupo constituido por cobalto, hierro, molibdeno, osmio, rutenio y
renio. Más preferiblemente, el metal de transición del primer
complejo de metal de transición es rutenio. También preferiblemente,
el primer complejo de metal de transición es un complejo de metal
de transición con amonio. Más preferiblemente, el primer complejo
de metal de transición con amonio comprende un metal de transición
seleccionado del grupo constituido por cobalto, hierro, molibdeno,
osmio, rutenio y renio. Más preferiblemente, el complejo de metal de
transición con amonio es
Ru(NH_{3})_{6}^{3+}.
Con preferencia, el metal de transición del
segundo complejo de metal de transición es uno seleccionado del
grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y renio. Más
preferiblemente, el metal de transición del segundo complejo de
metal de transición es hierro. También preferiblemente, el segundo
complejo de metal de transición es un complejo de metal de
transición con cianato. Más preferiblemente, el segundo complejo de
metal de transición con cianato comprende un metal de transición
seleccionado del grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y
renio. Muy preferiblemente, el segundo complejo de metal de
transición con cianato es Fe(CN)_{6}^{3-}.
La invención presenta adicionalmente un método
de detección de un desapareamiento entre un primer ácido nucleico y
un segundo ácido nucleico, en donde el método incluye los pasos
siguientes: (a) proporcionar el primer ácido nucleico inmovilizado
sobre un soporte sólido; (b) poner en contacto, en condiciones de
hibridación, el soporte sólido y el primer ácido nucleico
inmovilizado con una solución que contiene la muestra que comprende
el segundo ácido nucleico y un par rédox, en donde el par rédox
comprende un primer complejo de metal de transición y un segundo
complejo de metal de transición; y (c) medir la señal
electrocatalítica generada por hibridación del primer ácido
nucleico y el segundo ácido nucleico; en donde una disminución de la
señal detectada en el paso (c) con relación a la de una
complementariedad perfecta entre el primer ácido nucleico y el
segundo ácido nucleico, indica que existe un desapareamiento entre
el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico. El método
puede incluir también un paso adicional de testar un control,
poniendo en contacto, en condiciones de hibridación, el soporte
sólido y la sonda de ácido nucleico inmovilizada con una solución
que no contiene muestra alguna, y un par rédox que comprende un
primer complejo de metal de transición y un segundo complejo de
metal de transición.
Con preferencia, el metal de transición del
primer complejo de metal de transición es uno seleccionado del
grupo constituido por cobalto, hierro, molibdeno, osmio, rutenio y
renio. Más preferiblemente, el metal de transición del primer
complejo de metal de transición es rutenio. También preferiblemente,
el primer complejo de metal de transición es un complejo de metal
de transición con amonio. Más preferiblemente, el primer complejo
de metal de transición con amonio comprende un metal de transición
seleccionado del grupo constituido por cobalto, hierro, molibdeno,
osmio, rutenio y renio. Más preferiblemente, el complejo de metal de
transición con amonio es
Ru(NH_{3})_{6}^{3+}.
Con preferencia, el metal de transición del
segundo complejo de metal de transición es uno seleccionado del
grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y renio. Más
preferiblemente, el metal de transición del segundo complejo de
metal de transición es hierro. También preferiblemente, el segundo
complejo de metal de transición es un complejo de metal de
transición con cianato. Más preferiblemente, el segundo complejo de
metal de transición con cianato comprende un metal de transición
seleccionado del grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y
renio. Muy preferiblemente, el segundo complejo de metal de
transición con cianato es Fe(CN)_{6}^{3-}.
En otra realización, la invención presenta
adicionalmente un método para detectar la hibridación de ácido
nucleico entre una sonda de ácido nucleico y un ácido nucleico
diana, en donde el método incluye los pasos siguientes: (a)
proporcionar una sonda de ácido nucleico inmovilizada sobre un
soporte sólido; (b) poner en contacto la sonda inmovilizada con una
solución que contiene: (i) un complejo de metal de transición; (c)
medir la señal electrocatalítica generada; (d) poner en contacto la
sonda inmovilizada con una solución que contiene: (i) una muestra
que se cree incluye el ácido nucleico diana, y (ii) un complejo de
metal de transición; (e) medir la señal electrocatalítica generada;
en donde un aumento en la señal detectada en el paso (e) sobre la
señal generada en el paso (c) indica que ha ocurrido hibridación
entre la sonda de ácido nucleico y el ácido nucleico diana. Con
preferencia, el metal de transición del complejo de metal de
transición es uno seleccionado del grupo constituido por cobalto,
hierro, molibdeno, osmio, rutenio y renio. Más preferiblemente, el
metal de transición del complejo de metal de transición es rutenio.
También de modo preferible, el complejo de metal de transición es
un complejo de metal de transición con amonio. Más preferiblemente,
el primer complejo de metal de transición con amonio comprende un
metal de transición seleccionado del grupo constituido por cobalto,
hierro, molibdeno, osmio, rutenio y renio. Muy preferiblemente, el
complejo de metal de transición con amonio es
Ru(NH_{3})_{6}^{3+}.
Las soluciones pueden incluir también un segundo
complejo de metal de transición para mejorar la señal
electrocatalítica generada. Con preferencia, el metal de transición
del segundo complejo de metal de transición es uno seleccionado del
grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y renio. Más
preferiblemente, el metal de transición del segundo complejo de
metal de transición es hierro. También de modo preferible, el
segundo complejo de metal de transición es un complejo de metal de
transición con cianato. Más preferiblemente, el segundo complejo de
metal de transición con cianato comprende un metal de transición
seleccionado del grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y
renio. Muy preferiblemente, el segundo complejo de metal de
transición con cianato es Fe(CN)_{6}^{3-}.
El método puede incluir también pasos de lavado,
v.g., lavado del electrodo entre el contacto con las diferentes
soluciones.
En otro aspecto, la invención presenta
adicionalmente un método para detectar la presencia de un ácido
nucleico diana en una muestra, en donde el método incluye los pasos
siguientes: (a) proporcionar una sonda de ácido nucleico
inmovilizada sobre un soporte sólido; (b) poner en contacto la sonda
inmovilizada con una solución que contiene: (i) un complejo de
metal de transición; (c) medir la señal electrocatalítica generada;
(d) poner en contacto la sonda inmovilizada con una solución que
contiene: (i) una muestra que se cree incluye el ácido nucleico
diana, y (ii) un complejo de metal de transición; (e) medir la señal
electrocatalítica generada; en donde un aumento en la señal
detectada en el paso (e) sobre la señal generada en el paso (c)
indica que el ácido nucleico diana está presente en la muestra. Con
preferencia, el metal de transición del complejo de metal de
transición es uno seleccionado del grupo constituido por cobalto,
hierro, molibdeno, osmio, rutenio y renio. Más preferiblemente, el
metal de transición del complejo de metal de transición es rutenio.
También de modo preferible, el complejo de metal de transición es
un complejo de metal de transición con amonio. Más preferiblemente,
el primer complejo de metal de transición con amonio comprende un
metal de transición seleccionado del grupo constituido por cobalto,
hierro, molibdeno, osmio, rutenio y renio. Muy preferiblemente, el
complejo de metal de transición con amonio es
Ru(NH_{3})_{6}^{3+}.
Las soluciones pueden incluir también un segundo
complejo de metal de transición para mejorar la señal
electrocatalítica generada. Con preferencia, el metal de transición
del segundo complejo de metal de transición es uno seleccionado del
grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y renio. Más
preferiblemente, el metal de transición del segundo complejo de
metal de transición es hierro. También de modo preferible, el
segundo complejo de metal de transición es un complejo de metal de
transición con cianato. Más preferiblemente, el segundo complejo de
metal de transición con cianato comprende un metal de transición
seleccionado del grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y
renio. Muy preferiblemente, el segundo complejo de metal de
transición con cianato es Fe(CN)_{6}^{3-}.
El método puede incluir también pasos de lavado,
v.g., lavado del electrodo entre el contacto con las diferentes
soluciones.
La invención presenta adicionalmente un método
para detectar un desapareamiento entre dos ácidos nucleicos, en
donde el método incluye los pasos siguientes: (a) proporcionar una
sonda de ácido nucleico inmovilizada sobre un soporte sólido; (b)
poner en contacto la sonda inmovilizada con una solución que
contiene: (i) un complejo de metal de transición; (c) medir la
señal electrocatalítica generada; (d) poner en contacto la sonda
inmovilizada con una solución que contiene: (i) una muestra que se
cree incluye el ácido nucleico diana, y (ii) un complejo de metal
de transición; (e) medir la señal electrocatalítica generada; en
donde una disminución en la señal detectada en el paso (e) sobre la
señal generada en el paso (c) indica que existe un desapareamiento
entre la son da de ácido nucleico y el ácido nucleico diana. Con
preferencia, el metal de transición del complejo de metal de
transición es uno seleccionado del grupo constituido por cobalto,
hierro, molibdeno, osmio, rutenio y renio. Más preferiblemente, el
metal de transición del complejo de metal de transición es rutenio.
También de modo preferible, el complejo de metal de transición es
un complejo de metal de transición con amonio. Más preferiblemente,
el primer complejo de metal de transición con amonio comprende un
metal de transición seleccionado del grupo constituido por cobalto,
hierro, molibdeno, osmio, rutenio y renio. Muy preferiblemente, el
complejo de metal de transición con amonio es
Ru(NH_{3})_{6}^{3+}.
Las soluciones pueden incluir también un segundo
complejo de metal de transición para mejorar la señal
electrocatalítica generada. Con preferencia, el metal de transición
del segundo complejo de metal de transición es uno seleccionado del
grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y renio. Más
preferiblemente, el metal de transición del segundo complejo de
metal de transición es hierro. También de modo preferible, el
segundo complejo de metal de transición es un complejo de metal de
transición con cianato. Más preferiblemente, el segundo complejo de
metal de transición con cianato comprende un metal de transición
seleccionado del grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio y
renio. Muy preferiblemente, el segundo complejo de metal de
transición con cianato es Fe(CN)_{6}^{3-}.
El método puede incluir también pasos de lavado,
v.g., lavado del electrodo entre el contacto con las diferentes
soluciones.
En cualquiera de los métodos descritos en esta
memoria, el soporte sólido puede ser un electrodo de oro.
El ácido nucleico diana que se detecta por el
método de la presente invención puede ser, por ejemplo, DNA
monocatenario o bicatenario, RNA monocatenario o bicatenario, ácido
nucleico proteínico (PNA) monocatenario o bicatenario, o un híbrido
de DNA, RNA y/o PNA. La diana puede ser también un polinucleótido,
v.g., en una forma purificada o no purificada. La muestra de
ácidos nucleicos puede extraerse de cualquier fuente y puede ser
natural o sintética. La muestra de ácido nucleico puede contener
ácidos desoxirribonucleicos (DNA), ácidos ribonucleicos (RNA), o
copolímeros de ácido desoxirribonucleico y ácido ribonucleico o
combinaciones de los mismos. El polinucleótido diana puede
sintetizarse enzimática o químicamente in vitro, o puede
sintetizarse por medios no enzimáticos. La muestra que contiene el
polinucleótido diana puede comprender también DNA extragenómico de
un organismo, transcritos de RNA del mismo, o cDNA preparado a
partir de transcritos de RNA del mismo. El polinucleótido diana
puede ser sintetizado también por la reacción en cadena de
polimerasa o ligasa.
Con preferencia, la sonda de ácido nucleico es
una secuencia que se sabe es exclusiva del ácido nucleico diana
(v.g., patógeno) que se detecta. Tales secuencias exclusivas
se conocen para cierto número de patógenos, y se conocen también
métodos para la obtención de tales secuencias exclusivas (véase,
v.g., Pat. U.S. No. 4.900.659, "Nucleotide sequence
composition and method for detection of Neisseria gonorrhoeae
and method for screening for a nucleotide sequence that is specific
for a genetically distinct group"). La secuencia sonda es capaz
de fijarse al ácido nucleico diana de secuencia complementaria por
uno o más tipos de enlaces químicos que incluyen apareamiento de
bases.
Entre el ácido nucleico diana que puede
detectarse utilizando la sonda molecular de la invención hay
material genético en la forma de DNA o RNA obtenido de cualesquiera
procariotas existentes naturalmente tales como por ejemplo,
bacterias patógenas o no patógenas que incluyen, pero sin carácter
limitante, especies de Escherichia, Salmonella, Clostridium,
Chlamydia, etc., eucariotas tales como por ejemplo protozoos y
parásitos, hongos, levaduras, plantas superiores, insectos,
animales inferiores y superiores, con inclusión de mamíferos y
humanos y células en cultivo de tejidos, o virus tales como por
ejemplo, Herpesvirus, HIV, virus de la gripe, virus
Epstein-Barr, virus de la hepatitis B, etc.
Los ácidos nucleicos diana de estas fuentes
pueden, por ejemplo, encontrarse en muestras de un fluido corporal
de un animal, con inclusión de un humano, tal como, pero sin
carácter limitante sangre, orina, fluido linfático, fluido
sinovial, bilis, flema, saliva, fluido menstrual y semen.
Adicionalmente, muestras que contienen DNA o RNA pueden, por
ejemplo, encontrarse en fluidos de una planta, tales como, pero sin
carácter limitante, fluido de xilema, fluido de floema y exudados
de plantas. Muestras que contienen DNA o RNA pueden, por ejemplo,
encontrarse también en fuentes no vivas tales como, pero sin
carácter limitante, alimento, aguas residuales, muestras forenses,
lagos, depósitos de agua, ríos y océanos. Polinucleótidos diana
pueden ser también los de organismos desaparecidos o extintos,
v.g. plantas apiñadas en colecciones de herbarios, o de
pieles depiladas, exposiciones de taxidermia, fósiles, o los de
materiales biológicos en colecciones de museos.
La molécula de ácido nucleico diana puede
amplificarse opcionalmente antes de la detección por el método de
la presente invención. El ácido nucleico diana puede encontrarse en
forma bicatenaria o monocatenaria. En el caso en que la molécula de
ácido nucleico diana sea bicatenaria, la misma se trata
preferiblemente en primer lugar con un agente de desnaturalización
para convertir las dos cadenas en una forma monocatenaria, o
parcialmente monocatenaria, al comienzo de la reacción de
amplificación, por métodos conocidos en la técnica tales como
calentamiento, tratamiento con álcali, o por métodos enzimáticos.
Métodos generales para realización de este tratamiento se
proporcionan en Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, N.Y., EE.UU. (1989).
Una vez que la muestra ha sido tratada para
exponer cualquier ácido nucleico diana, la solución puede testarse
como se describe en esta memoria para detectar la hibridación entre
el ácido nucleico unido y el ácido nucleico diana, en caso de estar
presente éste. Alternativamente, algunas muestras pueden testarse
directamente, v.g., la diana puede existir en una muestra de
suero y puede estar directamente accesible, y puede no requerir
tratamiento para liberar el ácido nucleico.
Una molécula de ácido nucleico es
"hibridable" a otra molécula de ácido nucleico, tal como un
cDNA, DNA genómico, o RNA, cuando una forma monocatenaria de la
molécula del ácido nucleico puede reasociarse a la otra molécula de
ácido nucleico en las condiciones apropiadas de temperatura y
concentración iónica de la solución (véase Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press). Las condiciones de temperatura y concentración
iónica determinan la "severidad" de la hibridación. Para
cribado preliminar respecto a ácidos nucleicos homólogos, pueden
utilizarse condiciones de hibridación de severidad baja,
correspondientes a una T_{m} de 55ºC, v.g., 5X SSC, 0,1% SDS,
0,25 leche, y ausencia de formamida; o 30% formamida, 5X SSC, 0,5%
SDS). Las condiciones de hibridación de severidad moderada
corresponden a una T_{m} más alta, v.g., 40% formamida,
con 5X o 6X SSC. Las condiciones de hibridación de alta severidad
corresponden a la T_{m} máxima, v.g., 50% formamida, 5X o
6X SSC. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos
contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la
severidad de la hibridación, son posibles desapareamientos entre
bases. La severidad apropiada para la hibridación de ácidos
nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del
grado de complementariedad, variables bien conocidas en la técnica.
Cuanto mayor es el grado de semejanza u homología entre dos
secuencias de nucleótidos, tanto mayor es el valor T_{m} para que
los híbridos de ácidos nucleicos tengan tales secuencias. La
estabilidad relativa (correspondiente a T_{m} más alta) de las
hibridaciones de ácidos nucleicos decrece en el orden siguiente:
RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos de longitud mayor que 100
nucleótidos, se han deducido ecuaciones para el cálculo de T_{m}
(véase Sambrook et al., supra,
9.50-0.51). Para hibridación con ácidos nucleicos
más cortos, es decir oligonucleótidos, la posición de los
desapareamientos se hace más importante, y la longitud del
oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook et
al., supra, 11.7-11.8). Con preferencia,
una longitud mínima para un ácido nucleico hibridable es al menos
aproximadamente 10 nucleótidos; con preferencia al menos
aproximadamente 15 nucleótidos; y de modo más preferible la longitud
es al menos aproximadamente 20 nucleótidos; y muy preferiblemente
30 nucleótidos.
"Condiciones de hibridación de severidad
alta" pueden emplear hibridación a (1) 1x SSC (10x SSC = 3 M
NaCl, citrato Na_{3}\bullet2H_{2}O 0,3 M (88 g/litro), pH a
7,0 con HCl 1M), 1% SDS (dodecilsulfato de sodio),
0,1-2 mg/ml DNA de esperma de salmón desnaturalizado
a 65ºC, (2) 1x SSC, 50% formamida, 1% SDS, 0,1-2
mg/ml DNA de esperma de salmón desnaturalizado a 42ºC, (3) 1%
seroalbúmina bovina (fracción V), Na_{2}\bulletEDTA 1 mM,
NaHPO_{4} 0,5 M (pH 7,2) (NaHPO_{4} 1M = 134 g
Na_{2}HPO_{4}.7H_{2}O, 4 ml H_{3}PO_{4} de 85% por
litro), 7% SDS, 0,1-2 mg/ml DNA de esperma de salmón
desnaturalizado a 65ºC, (4) 50% formamida, 5x SSC, 0,02 M
Tris-HCl (pH 7,6), 1x solución de Denhardt (100x =
10 g Ficoll 400, 10 g polivinilpirrolidona, 10 g seroalbúmina
bovina (fracción V), agua hasta 500 ml), 10% sulfato de dextrano, 1%
SDS, 0,1-2 mg/ml DNA de esperma de salmón
desnaturalizado a 42ºC, (5) 5x SSC, 5x solución de Denhardt, 1% SDS,
100 \mug/ml DNA de esperma de salmón desnaturalizado a 65ºC, o
(6) 5x SSC, 5x solución de Denhardt, 50% formamida, 1% SDS, 100
\mug/ml DNA de esperma de salmón desnaturalizado a 42ºC, con
lavados de severidad alta de (1) 0,3-0,1 x SSC, 0,1%
SDS a 65ºC, o (2) Na_{2}EDTA 1 mM, NaHPO_{4} 40 mM (pH 7,2), 1%
SDS a 65ºC. Las condiciones anteriores están pensadas para ser
utilizadas para híbridos DNA-DNA de 50 pares de
bases o mayores. En los casos en que se cree que el híbrido tiene
una longitud menor que 18 pares de bases, las temperaturas de
hibridación y lavado deberían ser 5-10ºC inferiores
a la de la T_{m} del híbrido calculada, donde T_{m} en ºC
=
(2 x el número de bases A y T) + (4 x el número de bases G y C). Para híbridos que se cree tienen una longitud de aproximadamente 18 a aproximadamente 49 pares de bases, la T_{m} en ºC = (81,5ºC + 16,6 (log_{10} M) + 0,41 (% G + C) -
0,61 (% formamida) - 500/l), donde "M" es la molaridad de cationes monovalentes (v.g., Na^{+}), y "L" es la longitud del híbrido en pares de bases.
(2 x el número de bases A y T) + (4 x el número de bases G y C). Para híbridos que se cree tienen una longitud de aproximadamente 18 a aproximadamente 49 pares de bases, la T_{m} en ºC = (81,5ºC + 16,6 (log_{10} M) + 0,41 (% G + C) -
0,61 (% formamida) - 500/l), donde "M" es la molaridad de cationes monovalentes (v.g., Na^{+}), y "L" es la longitud del híbrido en pares de bases.
Las "condiciones de hibridación de severidad
moderada" pueden emplear hibridación a (1) 4x SSC (10x SSC = 3 M
NaCl, citrato Na_{3}\bullet2H_{2}O 0,3 M (88 g/litro), pH a
7,0 con HCl 1M), 1% SDS (dodecilsulfato de sodio),
0,1-2 mg/ml DNA de esperma de salmón desnaturalizado
a 65ºC, (2) 4x SSC, 50% formamida, 1% SDS, 0,1-2
mg/ml DNA de esperma de salmón desnaturalizado a 42ºC, (3) 1%
seroalbúmina bovina (fracción V), Na_{2}\bulletEDTA 1 mM,
NaHPO_{4} 0,5 M (pH 7,2) (NaHPO_{4} 1M = 134 g
Na_{2}HPO_{4}.7H_{2}O, 4 ml H_{3}PO_{4} de 85% por
litro), 7% SDS, 0,1-2 mg/ml DNA de esperma de salmón
desnaturalizado a 65ºC, (4) 50% formamida, 5x SSC, 0,02 M
Tris-HCl (pH 7,6), 1x solución de Denhardt (100x =
10 g Ficoll 400, 10 g polivinilpirrolidona, 10 g seroalbúmina
bovina (fracción V), agua hasta 500 ml), 10% sulfato de dextrano, 1%
SDS, 0,1-2 mg/ml DNA de esperma de salmón
desnaturalizado a 42ºC, (5) 5x SSC, 5x solución de Denhardt, 1% SDS,
100 \mug/ml DNA de esperma de salmón desnaturalizado a 65ºC, o
(6) 5x SSC, 5x solución de Denhardt, 50% formamida, 1% SDS, 100
\mug/ml DNA de esperma de salmón desnaturalizado a 42ºC, con
lavados de severidad moderada de 1 x SSC, 0,1% SDS a 65ºC. Las
condiciones anteriores están pensadas para ser utilizadas para
híbridos DNA-DNA de 50 pares de bases o mayores. En
los casos en que se cree que el híbrido tiene una longitud menor que
18 pares de bases, las temperaturas de hibridación y lavado
deberían ser 5-10ºC inferiores a la de la T_{m}
del híbrido calculada, donde T_{m} en ºC = (2 x el número de bases
A y T) + (4 x el número de bases G y C). Para híbridos que se cree
tienen una longitud de aproximadamente 18 a aproximadamente 49 pares
de bases, la T_{m} en ºC =
(81,5ºC + 16,6 (log_{10} M) + 0,41 (% G + C) - 0,61 (% formamida) - 500/l), donde "M" es la molaridad de cationes monovalentes (v.g., Na^{+}), y "L" es la longitud del híbrido en pares de bases.
(81,5ºC + 16,6 (log_{10} M) + 0,41 (% G + C) - 0,61 (% formamida) - 500/l), donde "M" es la molaridad de cationes monovalentes (v.g., Na^{+}), y "L" es la longitud del híbrido en pares de bases.
"Condiciones de hibridación de severidad
baja" pueden emplear hibridación a (1) 4x SSC (10x SSC = 3 M
NaCl, citrato Na_{3}\bullet2H_{2}O 0,3 M (88 g/litro), pH a
7,0 con HCl 1M), 1% SDS (dodecilsulfato de sodio),
0,1-2 mg/ml DNA de esperma de salmón desnaturalizado
a 50ºC, (2) 6x SSC, 50% formamida, 1% SDS, 0,1-2
mg/ml DNA de esperma de salmón desnaturalizado a 40ºC, (3) 1%
seroalbúmina bovina (fracción V), Na_{2}\bulletEDTA 1 mM,
NaHPO_{4} 0,5 M (pH 7,2) (NaHPO_{4} 1M = 134 g
Na_{2}HPO_{4}.7H_{2}O, 4 ml H_{3}PO_{4} de 85% por
litro), 7% SDS, 0,1-2 mg/ml DNA de esperma de salmón
desnaturalizado a 50ºC, (4) 50% formamida, 5x SSC, 0,02 M
Tris-HCl (pH 7,6), 1x solución de Denhardt (100x =
10 g Ficoll 400, 10 g polivinilpirrolidona, 10 g seroalbúmina
bovina (fracción V), agua hasta 500 ml), 10% sulfato de dextrano, 1%
SDS, 0,1-2 mg/ml DNA de esperma de salmón
desnaturalizado a 40ºC, (5) 5x SSC, 5x solución de Denhardt, 1% SDS,
100 \mug/ml DNA de esperma de salmón desnaturalizado a 50ºC, o
(6) 5x SSC, 5x solución de Denhardt, 50% formamida, 1% SDS, 100
\mug/ml DNA de esperma de salmón desnaturalizado a 40ºC, con
lavados de severidad baja de 2 x SSC, 0,1% SDS a 50ºC o (2)
seroalbúmina bovina al 0,5% (fracción V), Na_{2}EDTA 1 mM,
NaHPO_{4} 40 mM (pH 7,2), 5% SDS. Las condiciones anteriores
están pensadas para ser utilizadas para híbridos
DNA-DNA de 50 pares de bases o mayores. En los
casos en que se cree que el híbrido tiene una longitud menor que 18
pares de bases, las temperaturas de hibridación y lavado deberían
ser 5-10ºC inferiores a la de la T_{m} del híbrido
calculada, donde T_{m} en ºC = (2 x el número de bases A y T) +
(4 x el número de bases G y C). Para híbridos que se cree tienen
una longitud de aproximadamente 18 a aproximadamente 49 pares de
bases, la T_{m} en ºC = (81,5ºC + 16,6 (log_{10} M) + 0,41 (% G
+ C) - 0,61 (% formamida) - 500/l), donde "M" es la molaridad
de cationes monovalentes (v.g., Na^{+}), y "L" es la
longitud del híbrido en pares de bases.
Los ensayos descritos en esta memoria pueden
utilizarse para detectar patógenos, tales como bacterias o virus, o
pueden utilizarse para detectar la expresión de genes en un
individuo. Por ejemplo, genes de Helicobacter pylori, un
patógeno implicado en las úlceras gástricas y el cáncer, se
detectaron pos los métodos descritos en esta memoria. Se utilizan
dos secuencias pertenecientes al microbio patógeno Helicobacter
pylori para demostrar la versatilidad y especificidad del
ensayo: una que codifica una proteína exclusiva de H. pylori,
representando la otra una pequeña porción del rRNA 23S de este
organismo. Ambas secuencias pueden detectarse en el intervalo de
concentraciones nanomolares. Además de la información de la
presencia de secuencias relacionadas con patógenos, este ensayo
puede resolver con exactitud cambios de una sola base en las
secuencias diana. Una sustitución A2143C dentro del rRNA de H.
pylori que confiere resistencia a los antibióticos atenúa
significativamente la hibridación a una sonda inmovilizada
correspondiente a la secuencia WT. El desapareamiento de una sola
base introducido por esta mutación ralentiza la cinética de
hibridación y permite la discriminación de las dos secuencias en
tiempos de hibridación breves. El ensayo descrito puede proporcionar
por tanto un medio para detectar y determinar el genotipo de
bacterias infecciosas utilizando métodos electroquímicos.
La Figura 1 muestra un esquema del sistema de
detección electrocatalítica de la hibridación de DNA de la
invención, que utiliza la carga incrementada de
Ru(NH_{3})_{6}^{3+} resultante de la formación
de un dúplex de DNA para informar de la hibridación. La
introducción de Fe(CN)_{6}^{3-} hace que la
reducción electroquímica de este catión sea catalítica y amplifica
espectacularmente la señal. La Figura 2 ilustra datos
representativos obtenidos utilizando este enfoque de detección de
un 30-mero sintético que modeliza el gen Hpn de
Helicobacter pylori, una bacteria infecciosa que está
fuertemente ligada con las úlceras gástricas y el cáncer. Los
electrodos de oro se modificaron con una secuencia sonda
monocatenaria, se trataron los electrodos con mercaptohexanol, y se
incubaron en dos soluciones tampón calentadas (una que contenía la
secuencia diana (Figura 2A), en tanto que la otra no la contenía
(Figura 2B). Las condiciones de hibridación eran 40ºC, fosfato de
sodio 35 mM, NaCl 100 mM, 25 minutos, con o sin secuencia diana Hpn
4 \muM:
El electrodo expuesto a la secuencia diana
exhibía un aumento pronunciado en la respuesta electroquímica,
mientras que el incubado en una solución tampón exhibía una
respuesta reducida (este es el suceso reproducible - parece ser que
el tratamiento térmico desaloja algo del DNA sonda unido
débilmente). La Figura 3 muestra la excelente reproducibilidad del
ensayo.
La invención se ilustra ulteriormente por los
ejemplos que siguen, que no deben interpretarse como limitantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Productos químicos y materiales. Los
reactivos de síntesis de DNA se obtuvieron de Glen Research.
1,6-hexametilenodiamina,
1,4-dioxano anhidro al 99,8%,
6-mercapto-1-hexanol
(97%) (MCH), y ferrocianuro de potasio trihidratado se adquirieron
de Aldrich Chemical Company. Ferricianuro de potasio,
1,1'-carbonildiimidazol, y cloruro de
hexaammin-rutenio se adquirieron de Acros Organics.
3-(2-piridilditio)propionato de
N-succinimidilo (SPDP) se adquirió de Pierce.
Ditiotreitol (DTT) y 2-mercaptoetanol se obtuvieron
de Fisher Scientific. Las pastillas de silicio recu-
biertas de oro se recibieron de Platypus Technologies. La DNA-polimerasa de Pfu clonada se obtuvo de Stratagene.
biertas de oro se recibieron de Platypus Technologies. La DNA-polimerasa de Pfu clonada se obtuvo de Stratagene.
Preparación y purificación de
oligonucleótidos modificados. Los oligonucleótidos se
sintetizaron utilizando un sintetizador de DNA/RNA ABI 394 de
acuerdo con técnicas estándar automáticas en fase sólida. Los
oligonucleótidos modificados en el término 5' con enlazador basado
en hexanodiamina (C6) se prepararon y purificaron como se ha
descrito previamente.^{25} Todos los oligonucleótidos no
modificados se purificaron estrictamente utilizando HPLC de fase
inversa. Se utilizaron las secuencias sonda y diana siguientes en
los experimentos que empleaban oligonucleótidos sintéticos:
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizaron cadenas sonda que presentaban
fluoresceína fijada a la base en el término 3' utilizando
fluorescein-dT CPG (Glen Research) y se modificaron
con un enlazador terminado en tiol como se ha descrito previamente.
La fijación de fluoresceína a las cadenas diana se realizó con un
5'-fluorescein-fosforamidito
siguiendo técnicas estándar automatizadas de fase sólida. Los
oligonucleótidos modificados con fluoresceína se purificaron por
HPLC en fase inversa.
Modificación de las superficies de oro con
DNA sonda. Se inmovilizaron sondas monocatenarias tioladas en
electrodos de oro a granel con A = 0,02 cm^{2} (Bioanalytical
Systems). Antes de la inmovilización de la sonda, los electrodos de
oro se pulimentaron utilizando alúmina de 0,05 \mum, se lavaron en
agua, se trataron por ultrasonidos durante 5 min, y se atacaron
químicamente por escaneo desde 0 a 1,8 V a 200 mV/s en
H_{2}SO_{4} 1M, y se lavaron con agua. Los electrodos de oro
invertidos se expusieron típicamente a sondas de ssDNA tioladas en
soluciones que contenían SH-DNA 5 \muM, MCH 500
nM, fosfato de sodio 25 mM (pH 7), NaCl 25 mM, y MgCl_{2} 50 mM
en una cámara de humedad a la temperatura ambiente durante 1 hora.
(Cualesquiera desviaciones de estas condiciones se describen en las
leyendas individuales de las figuras.) La manipulación de las
densidades de película de las sondas se realizó con soluciones que
contenían cantidades variables de MgCl_{2} que oscilaban entre 10
y 100 mM. Después de la deposición, los electrodos se lavaron en
tampón de fosfato de sodio 25 mM (pH 7), NaCl 25 mM. La adsorción
de DNA en la superficie del electrodo se confirmó por
monitorización del bloqueo del ferrocianuro 2 mM en fosfato de sodio
25 mM (pH 7), NaCl 25 mM.
Hibridación de las secuencias diana.
Electrodos de oro modificados con ssDNA tiolado se expusieron a las
secuencias diana y se detectó la hibridación por intensificación de
la señal electrocatalítica. Antes de la hibridación de la diana, se
registraron las medidas electrocatalíticas iniciales de las sondas
inmovilizadas de ssDNA y después de la hibridación de la diana pudo
calcularse el cambio en la señal.
Medidas electroquímicas. Las medidas
electroquímicas se realizaron con un potenciostato de Bioanalytical
Systems CV-50. Se utilizó una celda de un solo
compartimiento provista de un capilar Luggin. Todas las medidas de
voltametría cíclica se condujeron a temperatura ambiente con un
potenciostato Bioanalytical Systems CV-50W. Se
utilizó una configuración de tres electrodos consistente en un
electrodo de trabajo modificado de oro, un electrodo auxiliar de
alambre de platino, y un electrodo de referencia Ag/AgCl. Se utilizó
una celda de un solo compartimiento provista de un capilar Luggin
para separar el compartimiento de trabajo del compartimiento de
referencia.
Las corrientes electrocatalíticas se midieron en
soluciones de Fe(CN)_{6}^{3-} 2 mM,
Ru(NH_{3})_{6}^{3+} 27 \muM en fosfato de
sodio 25 mM/NaCl 250 mM (pH 7) a una tasa de escaneo de 100 mV/s. La
carga catódica (Q) se cuantificó por integración de los
voltamogramas después de la sustracción del ruido de fondo. Los
cambios de señal correspondientes a la hibridación se calcularon
como sigue: \DeltaQ = (Q_{final} - Q_{inicial})/Q_{inicial}.
Las barras de error que se muestran en las figuras individuales
corresponden a variabilidades entre las pruebas múltiples
independientes de cada experimento.
Se midió la corriente electrocatalítica obtenida
en los electrodos de oro modificados con DNA sonda tiolado, y los
electrodos lavados se expusieron luego a secuencias diana después de
lo cual se detectó la hibridación por intensificación de la señal
electrocatalítica. Las soluciones de hibridación contenían
típicamente DNA diana 500 nM-20 \muM en fosfato
de sodio 25 mM (pH 7), NaCl 25 mM, MgCl_{2} 100 mM. Los electrodos
se incubaron a 37-50ºC en una cámara de humedad
termostatizada y se lavaron a fondo con tampón antes del análisis
electroquímico. Las condiciones utilizadas para los experimentos
individuales variaban dependiendo del tamaño y la fuente del ácido
nucleico diana; detalles de las diferentes pruebas de hibridación se
proporcionan en los textos de las Figuras.
La cuantificación del recubrimiento de la
superficie de los electrodos utilizando DNA marcado con fluoresceína
se realizó basándose en el procedimiento descrito por Demers et
al. Antes de la deposición del DNA marcado con el fluoróforo,
se prepararon electrodos de oro a granel como se ha descrito arriba
con ataque electroquímico. Las superficies planas de oro de mayor
tamaño (0,28 cm^{2}) se limpiaron en solución Piranha (3:1
H_{2}SO_{4}/H_{2}O_{2}) durante 20 minutos seguidos por un
lavado severo en agua. Utilizando una guía que producía un área de
0,28 cm^{2}, se incubó un oligonucleótido modificado con
3'-fluorescein-5'-tiol
sobre la superficie de oro durante 1 hora a la temperatura ambiente
en una cámara de humedad. La inmovilización de la sonda se realizó
utilizando una solución que contenía la sonda
3'-fluorescein-5'-tiol
5 \muM, MCH 500 nM, fosfato de sodio 25 mM (pH 7), NaCl 25 mM y
cantidades variables de MgCl_{2} (10 mM a 100 mM). Se utilizaron
como controles sustratos tratados con sondas no complementarias.
Después de la deposición, se lavaron a fondo las superficies de oro
con fosfato de sodio 25 mM (pH 7), NaCl 25 mM. Se desplazaron luego
con mercaptoetanol 12 mM las sondas modificadas con fluoróforo
durante aproximadamente 3-4 horas a la temperatura
ambiente en una cámara de humedad; se condujo durante una noche una
segunda tanda de desplazamiento. Las intensidades de fluorescencia
para los estándares de calibración y las muestras separadas de la
superficie de oro se midieron en NaOH 50 mM (pH 12) en un lector de
placas de fluorescencia Wallac VictorF. Las cantidades de
oligonucleótido modificado con
3'-fluorescein-5'-tiol
desplazadas de la superficie se determinaron por interpolación a
partir de una curva estándar de calibración lineal preparada con
concentraciones conocidas de la sonda modificada.
Para la medida de las eficiencias de hibridación
utilizando fluorescencia, se introdujeron secuencias diana marcadas
a partir de soluciones que contenían diana 5 \muM
(F1-T2), fosfato de sodio 25 mM (pH 7), NaCl 25 mM,
y MgCl_{2} 100 mM durante 1 hora en una incubadora a 40ºC. Las
superficies se lavaron luego concienzudamente con fosfato de sodio
25 mM (pH 7), NaCl 25 mM para separar la diana no hibridada. El
desplazamiento de los dúplex y las medidas de fluorescencia se
realizaron como se ha descrito arriba. Se trazó una curva estándar
de calibración lineal utilizando concentraciones conocidas de DNA
dúplex (HP2a/F1-T2).
Las medidas de desnaturalización térmica se
realizaron con soluciones que contenían 1 \muM de cadenas
complementarias en fosfato de sodio 25 mM (pH 7), NaCl 25 mM. Las
medidas se obtuvieron por monitorización de la absorbancia a 260 nM
en un espectrofotómetro AVIV.
\vskip1.000000\baselineskip
La adición de un enlazador terminado en tiol a
oligonucleótidos sintéticos permite el autoensamblaje de películas
de DNA sobre electrodos de oro. Superficies de oro modificadas con
oligonucleótidos monocatenarios han sido preparadas por varios
grupos interesados en la monitorización de procesos electroquímicos
en presencia de DNA. Las películas utilizadas en los experimentos
aquí descritos presentan oligonucleótidos que contienen un
enlazador alifático que se une post-sintéticamente
utilizando una combinación de síntesis en fase sólida y en fase de
solución. Un co-adsorbente, mercaptohexanol, se
introduce durante la deposición para reducir la densidad del DNA
adsorbido y minimizar la fijación de DNA inespecífica en la
superficie del oro.
Las condiciones empleadas en este caso para la
deposición producen películas de alta densidad de oligonucleótidos
modificados con tiol en el transcurso de minutos, y tienen
recubrimientos que dependen de la cantidad de catión divalente
utilizada en la solución de deposición. Utilizando oligonucleótidos
modificados con fluoresceína, se determinó que se obtenían
densidades de 12 (\pm 2), 23 (\pm 3), y 27 (\pm 4)
pmol/cm^{2} de oligonucleótidos monocatenarios, con MgCl_{2}
10, 50, ó 100 mM presente en el tampón de deposición,
respectivamente. Se realizaron medidas de densidad de la sonda
tanto sobre electrodos de oro a granel como sobre sustratos de oro
depositados en fase vapor para confirmar que existían densidades
comparables (el trabajo con los sustratos de mayor tamaño era
deseable para cuantificación más exacta de los recubrimientos menos
densos). Recubrimientos comparables a los medidos en este caso con
[Mg^{2+}] baja se observaron en estudios previos en los que la
deposición se efectuó en presencia de fosfato de sodio 10 mM y NaCl
100 mM.
Para los experimentos electroquímicos descritos
a continuación, se utilizaron películas de DNA que estaban formadas
con MgCl_{2} 50 mM presente durante la deposición. Si bien los
recubrimientos de superficie más dispersos promueven una
hibridación más eficiente del DNA (véase más adelante), se consiguió
una mayor reproducibilidad con densidades mayores de DNA que
producían señales voltamétricas más fuertes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ru(NH_{3})_{6}^{3+}, que
carece de cualesquiera ligandos que puedan fijarse de modo
intercalado a DNA, se asocia electrostáticamente con la cadena
principal cargada negativamente. Por consiguiente es un fijador de
secuencias neutro y una sonda ideal para cuantificación del DNA
adsorbido en una superficie de electrodo.^{26} La monitorización
de la hibridación con Ru(NH_{3})_{6}^{3+} podía
proporcionar potencialmente un medio de detección de DNA
electroquímicamente. Sin embargo, las películas con recubrimientos
de superficie más dispersos que permiten hibridación eficiente
producen sólo pequeñas señales para esta especie con actividad
rédox.
Para amplificar las señales obtenidas en los
electrodos modificados con DNA en presencia de
Ru(NH_{3})_{6}^{3+}, se introdujo un oxidante,
Fe(CN)_{6}^{3-}, que podría permitir la reposición
de Ru(NH_{3})_{6}^{3+} por regeneración de la
forma oxidada (Figura 4). Como se muestra en la Figura 5, se
observan ondas reductoras grandes e irreversibles en los electrodos
modificados con DNA sumergidos en soluciones de
Fe(CN)_{6}^{3-} y
Ru(NH_{3})_{6}^{3+} coherentes con el ciclo de
reacción propuesto (Figura 5). Las señales electroquímicas
obtenidas con electrodos modificados con DNA a partir de soluciones
de Ru(III) y Fe(III) están amplificadas
aproximadamente 100 veces con respecto a las obtenidas cuando está
presente solamente Ru(NH_{3})_{6}^{3+} (no se
obtiene señal alguna en esta región cuando está presente sólo
Fe(CN)_{6}^{3-}). La electrocatálisis requiere
que el DNA atraiga el catión a la superficie del oro, dado que no se
observa señal alguna con un electrodo desnudo.
Este ensayo informa sensiblemente de la
presencia de una secuencia de DNA diana. La señal
Ru(III)/Fe(III) monitorizada en un electrodo de oro
modificado con una secuencia sonda complementaria a una porción del
gen de rRNA 23S de H. pylori (secuencia:
5'-GGC AAG ACG GAA AGA CCC-3' (SEQ
ID NO: 2)) aumenta significativamente después de exposición del
electrodo a un oligonucleótido diana sintético (Figura 5). El cambio
en la respuesta electroquímica es apenas detectable en ausencia de
Fe(III). Tiempos de hibridación breves (< 1 hora) en
condiciones moderadas (40ºC) son suficientes para observar un
aumento en la señal electrocatalítica de > 100%. En presencia de
secuencias no complementarias o de tampón que carezca de cualquier
DNA, no se observan diferencias de señal apreciables.
La electrocatálisis
Ru(III)/Fe(III) informa exactamente de la hibridación
de secuencias de diferentes longitudes y composición de bases.
Tanto la secuencia de rRNA 23S de 18 nucleótidos arriba descrita
como una secuencia de 30 nucleótidos correspondiente a un fragmento
del gen Hpn (que codifica una proteína exclusiva de H.
pylori, secuencia: 5'-TGT TGC AGC ACT AGC GAT
AGT CAT CAT CAA-3' (SEQ ID NO: 1)) pueden detectarse
como se muestra en la Figura 5A. El método es además sensible, dado
que las concentraciones diana inferiores a 10 nM producían aumentos
sensibles en la respuesta electroquímica después de la
hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
En experimentos de monitorización de la
hibridación de oligonucleótidos de DNA correspondientes a una región
del rRNA 23S de H. pylori, se observó una sensibilidad
pronunciada a los pares de bases desapareados dentro del complejo
diana/sonda. La intensificación de la señal electroquímica observada
típicamente con la secuencia de rRNA WT disminuía notablemente
cuando se introducía una sustitución de A a C en la posición 2143
dentro del rRNA 23S (secuencia: 5'-GGC AAG ACG Gac
AGA CCC-3' (SEQ ID NO: 3), el nucleótido
correspondiente a C2143 se encuentra en minúsculas). La variante
A2143C es importante debido a que esta sustitución imparte
resistencia a la claritromicina, el antibiótico utilizado
típicamente para combatir H. pylori, y aproximadamente 10%
de las infecciones observadas clínicamente son resistentes a la
claritromicina.
La discriminación del mutante A2143C es
resultado de una cinética de hibridación más lenta para la secuencia
que está desapareada con respecto a la sonda. Un estudio
sistemático de la eficiencia de hibridación en función del tiempo
para el WT frente a la diana A2143C reveló que la extensión de
hibridación para las dos secuencias se hace comparable únicamente
con tiempos de incubación superiores a 12 horas. El efecto
pronunciado causado por el desapareamiento de una sola base en el
complejo diana/sonda es un descubrimiento significativo. Estudios
previos de hibridación de dúplex en solución realizados por otros
grupos han identificado efectos mucho más sutiles, con tasas de
asociación para dos oligonucleótidos de DNA que exhiben poca
sensibilidad a la pérdida de un solo par de
Watson-Crick, y tasas de disociación que aumentan
aproximadamente en un orden de magnitud en los ensamblajes
desapareados. Por consiguiente, parece ser que las reacciones de
hibridación heterogéneas, con un solo oligonucleótido inmovilizado
en una superficie de electrodo, son mucho más sensibles a los
desapareamientos, descubrimiento que proporciona la base para
distinguir secuencias similares con un ensayo de hibridación
electroquímico. La densidad de sonda utilizada por los autores de
la presente invención en los experimentos parece ser que amplifica
también el efecto, dado que estudios en los que se ha utilizado
resonancia de plasmones superficiales para seguir la hibridación en
superficies de oro con recubrimientos de superficie muy bajos han
elucidado efectos similares, pero mucho menos pronunciados.^{22}
Una superficie con un alto recubrimiento de oligonucleótidos
cargados negativamente puede servir para desestabilizar
ulteriormente los dúplex diana/sonda desapareados.
El ensayo de detección de DNA electrocatalítica
descrito proporciona un medio sensible y específico para realizar
la determinación electroquímica del genotipo. El método descrito
será útil para análisis genéticos en un formato multiplexado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se testaron dos secuencias sonda con las
diferentes dianas: HP2a (sonda Hpn complementaria)
5'-TIT TIT TTT TTT GAT GAC TAT CGC TAG
TGG-3' (SEQ ID NO: 4) y HP2b (sonda Hpn no
complementaria) 5'-TTT TTT TTT TTT GGG ATA ATT CTT
CAC CGG-3' (SEQ ID NO: 5). Las bases timina añadidas
permitían que la sonda fuera más accesible a la diana. La sonda
complementaria detecta eficazmente la presencia de los diferentes
ácidos nucleicos diana utilizando el sistema electrocatalítico
Ru(III)/Fe(III).
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias diana eran como sigue:
PCR (generada utilizando PCR asimétrica como DNA
monocatenario, la porción complementaria a la sonda está
subrayada):
\vskip1.000000\baselineskip
RNA (la misma secuencia que el producto PCR,
generado in vitro a partir de DNA molde, la porción
complementaria a la sonda está subrayada):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Soluciones sonda de DNA (HP2a y HP2b) que
contenían ssDNA 5 \muM, MCH 500 nM, MgCl_{2} 50 mM, y tampón
fosfato de sodio 25 mM/NaCl de pH 7 se depositaron durante 1,5 horas
a la temperatura ambiente en una cámara de humedad. La solución
diana que contenía 30-mero sintético y producto PCR
contenía diana 500 nM, MgCl_{2} 100 mM, y tampón fosfato de
sodio/NaCl 25 mM de pH 7, y se expusieron a películas de DNA durante
1 hora a 45ºC. La hibridación del RNA diana se realizó en las
mismas condiciones excepto que se utilizó diana 1 \muM.
Los resultados se muestran en la Figura 7, que
es un gráfico de barras que muestra la dependencia del tiempo de la
hibridación para la sonda HP2a (sonda complementaria de Hpn) y la
sonda HP2b (sonda no complementaria de Hpn). Se aprecia que las
secuencias de DNA diana pueden detectarse como productos PCR o como
transcritos de RNA utilizando los métodos descritos en esta
memoria.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen hpn de H. pylori se
amplificó por PCR de una fuente recombinante (un plásmido de E.
coli proporcionado por el Dr. Andrew Plaut de la Universidad de
Tufts). Se generaron dos productos PCR, uno utilizando el método
asimétrico que produce principalmente DNA monocatenario, y otro
utilizando condiciones PCR convencionales que generarían un
producto bicatenario para la transcripción de RNA de escurrido de
T7. Para la primera reacción, se utilizaron un iniciador PCR
directo (5'-ATC AAA GGA GTC ATC ATG GCA
CAC-3' (SEQ ID NO: 9)) y un iniciador PCR inverso
(5'-AAG TTG CCC CTA GCC ACA-3' (SEQ
ID NO: 10)) en reacciones que contenían 1 \mug/ml de DNA
plasmídico, iniciador directo 500 nM, iniciador inverso 5 nM, 1 x de
tampón de reacción de DNA-polimerasa de Pfu
clonada (Tris-HCl 200 mM (pH 8,8), KCl 100 mM,
(NH_{4})_{2}SO_{4} 100 mM, MgSO_{4} 20 mM, 1% Triton
X-100, 1 mg/ml de seroalbúmina bovina exenta de
nucleasa), dNTPs 1 mM, y 2,5 U de DNA-polimerasa de
Pfu clonada, tampón de polimerasa y enzima adquirida de
Stratagene, en un volumen total de reacción de 100 \mul. Para la
síntesis del producto PCR utilizado para la generación del
transcrito de RNA, se utilizó un iniciador PCR directo que contenía
la secuencia promotora de polimerasa T7 (5'-GCT AGG
TAA TAG GAC TCA CTA TAG GAG TCA TCA TGG CAC AC-3'
(SEQ ID NO: 11)) con las mismas condiciones de reacción a excepción
de la adición de iniciador directo 500 mM e iniciador inverso 500
nM. La PCR se realizó en un Robocycler Stratagene con 30 ciclos a
94ºC durante 2 minutos, 52ºC durante 2 minutos, y 72ºC durante 3
minutos. Los productos PCR se sometieron a extracción con
fenol-cloroformo y precipitación con etanol. El RNA
diana se transcribió a partir de DNA molde amplificado con la
región promotora de T7 utilizando condiciones estándar. Las dianas
de DNA y RNA resultantes tenían las secuencias siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Ru(NH_{3})_{6}^{3+}, que
carece de cualesquiera ligandos que puedan fijarse a DNA de modo
intercalado, se asocia electrostáticamente con la cadena principal
cargada negativamente. Es, por tanto, un fijador de secuencia
neutro y una sonda ideal para la cuantificación de DNA mono o
bicatenario adsorbido en una superficie de electrodo. Sin embargo,
la concentración limitada de Ru(NH_{3})_{6}^{3+}
localizado en electrodos modificados con DNA produce una corriente
débil en condiciones adecuadas para la detección de la hibridación
(es decir concentraciones de Ru(III) suficientemente bajas
para prohibir la adsorción directa de la sonda con actividad
rédox). Para proporcionar sensibilidad máxima de detección de la
hibridación de DNA, los autores de la invención introdujeron un
oxidante, Fe(CN)_{6}^{3-}, que haría posible la
reposición de Ru(NH_{3})_{6}^{3+} por
regeneración de la forma oxidada (Esquema 1), amplificando de este
modo significativamente la respuesta obtenida.
De hecho, como se muestra en la Figura 8, se
observan ondas reductoras grandes e irreversibles utilizando
voltametría cíclica (CV) en electrodos modificados con DNA
sumergidos en soluciones de Fe(CN)_{6}^{3-} y
Ru(NH_{3})_{6}^{3+}, coherentemente con la
reacción propuesta. La cantidad de corriente observada informa de
la cantidad de DNA presente en la superficie del electrodo, dado que
la respuesta obtenida en las superficies que presentaban densidades
diferentes (controladas por variación de [Mg^{2+}] durante la
deposición) era directamente dependiente del número de moléculas de
DNA inmovilizadas.
Las señales electroquímicas obtenidas con
electrodos modificados con DNA a partir de soluciones de
Ru(III) y
Fe(III) se amplifican aproximadamente 100 veces con respecto a las obtenidas cuando está presente solamente
Ru(NH_{3})_{6}^{3+} (inserción en la Figura 8B); no se obtiene señal alguna en esta región cuando únicamente está presente
Fe(CN)_{6}^{3-} (datos no presentados). La electrocatálisis requiere DNA para atraer el complejo catiónico a la superficie del oro, dado que no se observa señal alguna con un electrodo desnudo.
Fe(III) se amplifican aproximadamente 100 veces con respecto a las obtenidas cuando está presente solamente
Ru(NH_{3})_{6}^{3+} (inserción en la Figura 8B); no se obtiene señal alguna en esta región cuando únicamente está presente
Fe(CN)_{6}^{3-} (datos no presentados). La electrocatálisis requiere DNA para atraer el complejo catiónico a la superficie del oro, dado que no se observa señal alguna con un electrodo desnudo.
El ensayo electrocatalítico informa
sensiblemente de la presencia de una secuencia de DNA diana
complementaria. La señal
Ru(NH_{3})_{6}^{3+}/Fe(CN)_{6}^{3-}
monitorizada en un electrodo de oro modificado con una secuencia
sonda complementaria a una porción del gen de rRNA 23S de H.
pylori (nucleótidos 2132-2149) aumenta
significativamente después de exposición del electrodo a un
oligonucleótido diana sintético (Figura 8B). Tiempos de hibridación
breves (< 1 hora) y condiciones moderadas son suficientes para
observar un aumento en la carga integrada de > 100%. En
presencia de secuencias no complementarias o tampón que carezca de
cualquier DNA, no se observan diferencias apreciables de señal.
La electrocatálisis
Ru(III)/Fe(III) informa exactamente de la hibridación
de secuencias de longitudes diferentes. Tanto la secuencia de rRNA
23S de 18 nucleótidos arriba descrita como una secuencia de 30
nucleótidos correspondiente a un fragmento del gen hpn (que
codifica una proteína rica en histidina de función desconocida,
exclusiva de H. pylori) pueden detectarse como se muestra en
la Figura 9. Así pues, el ensayo descrito es versátil y es
compatible con longitudes de secuencia de sonda y composición de
bases diferentes. Es innecesario hacer coincidir la longitud de la
diana y la sonda, dado que experimentos en los que el tamaño de la
diana se aumentaba en 10-15 nucleótidos producían
también detección con éxito de la hibridación (datos no
presentados). El ensayo electrocatalítico es además sensible, dado
que concentraciones diana tan bajas como 10 nM (50 fmol) producían
aumentos medibles en la respuesta electroquímica después de la
hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
La eficiencia de hibridación, investigada
utilizando el ensayo electrocatalítico y la cuantificación basada
en fluorescencia, era sensible a la densidad de la secuencia sonda
inmovilizada (Figura 10). Como se ha descrito arriba, la densidad
de las películas de DNA preparadas con cantidades diferentes de
MgCl_{2} presentes se monitorizó utilizando oligonucleótidos
modificados con fluoresceína. A medida que aumenta la cantidad de
Mg^{2+} en la solución de deposición, aumenta la densidad de la
sonda, obteniéndose películas con 11 pmol de DNA/cm^{2} con
MgCl_{2} 10 mM y obteniéndose películas con 27 pmol de
DNA/cm^{2} con MgCl_{2} 100 mM. Se monitorizó también la
respuesta obtenida en presencia de
Ru(NH_{3})_{6}^{3+} y
Fe(CN)_{6}^{3-}, y aumentaba con el recubrimiento
de la superficie. Con la película preparada con MgCl_{2} 10 mM, la
carga media medida era 0,13(5) \muC, mientras que con
MgCl_{2} 100 mM presente durante la deposición de la sonda, la
carga media medida era 0,59(5) \muC. La correlación entre
estos valores y la densidad del DNA sonda indica que la señal
electroquímica exhibe una dependencia directa de la concentración de
DNA inmovilizado presente en la superficie del electrodo.
Cuando se monitorizaron aumentos de señal
después de la hibridación para los electrodos con recubrimientos de
superficie diferentes, se observó que las películas con menores
densidades de sonda permitían una captura más eficiente de la diana
(Figura 10). Este efecto ha sido observado en varios estudios y se
emite la hipótesis de que se debe al atestamiento estérico cuando
las concentraciones locales de DNA inmovilizado son altas. Si bien
la película de densidad mínima aquí estudiada (formada con
MgCl_{2} 10 mM) permitía 87 (\pm 5)% de hibridación, la
película de densidad máxima (formada con MgCl_{2} 100 mM) exhibía
un nivel de hibridación mucho menor con eficiencia de 6 (\pm 2)%.
Las películas preparadas con MgCl_{2} 50 mM que se utilizaban
rutinariamente en el ensayo de electrocatálisis exhibían también
sólo una hibridación parcial, formando 7 (\pm 2)% de las sondas
un complejo con una secuencia de DNA diana. Es digno de mención sin
embargo, que el ensayo electrocatalítico era capaz de resolver este
bajo nivel de complejación de la diana con un cambio en la carga
integrada de típicamente > 100%.
Sobre la base de las dimensiones del DNA dúplex,
-50 pmol/cm^{2} es el recubrimiento máximo de los dúplex que
puede lograrse. Por esta razón, es evidente que el recubrimiento de
sonda monocatenaria debe ser muy inferior a este nivel para
conseguir una hibridación eficiente.
\vskip1.000000\baselineskip
En experimentos de monitorización de la
hibridación de oligonucleótidos de DNA correspondientes a una región
del rRNA 23S de H. pylori, se observó una sensibilidad
pronunciada a los pares de bases desapareados en el complejo
diana/sonda. La intensificación en la señal electroquímica observada
típicamente con la secuencia de rRNA WT disminuía notablemente
cuando se introducía una secuencia que contenía una sustitución de
A-a-C en la posición 2143 (Figura
9). La secuencia A2143C es importante en términos médicos debido a
que esta sustitución imparte resistencia a la claritromicina, el
antibiótico utilizado típicamente para combatir H. pylori.
Más de 10% de las infecciones observadas clínicamente son
resistentes a la claritromicina.
Basándose en las extremidades térmicas de las
secuencias de rRNA utilizadas para estos experimentos, la
observación de hibridación diferencial es sorprendente. Los dúplex
diana/sonda formados a partir de las secuencias ribosómicas
empleadas para este estudio exhibían valores T_{m} de
58(2)ºC cuando eran totalmente coincidentes, y 52(2)ºC
cuando estaba presente la mutación A2143C que producía un
desapareamiento C-T. Así pues, es razonable esperar
que ambos dúplex debieran formarse en la superficie si la
complejación estuviera regida por estabilidad termodinámica.
Para investigar el origen de la hibridación
diferencial observada en la presencia de la mutación puntual, se
monitorizó la dependencia de la hibridación respecto al tiempo
(Figura 11). Con tiempos de incubación cortos, se observó una
diferencia pronunciada en la señal obtenida para la secuencia WT con
relación a la secuencia A2143C. No obstante, si la hibridación se
dejaba transcurrir durante más de 12 horas, se obtenían resultados
comparables con ambas secuencias. Por consiguiente, la
discriminación de la mutación A2143C es resultado de una cinética
de hibridación más lenta para la secuencia que está desapareada con
respecto a la sonda. La tasa de asociación para ambas secuencias es
probablemente similar, por lo que el cambio observado puede reflejar
una tasa de disociación más rápida para el complejo desapareado que
limita la acumulación de dúplex hibridados.
\vskip1.000000\baselineskip
La aplicabilidad del ensayo electrocatalítico de
detección de grandes dianas de NDA y RNA se testó utilizando una
secuencia de > 200 nucleótidos que contenía el gen hpn de
H. pylori (Figura 12). Para estos experimentos de
hibridación, se emplearon secuencias sonda que contenían un
enlazador de 12 residuos timina que servían para aumentar la
accesibilidad de la porción del oligonucleótido utilizado para
captura de la diana. Utilizando condiciones de hibridación
moderadas (1 hora, 45ºC), se detectó específicamente DNA
monocatenario producido por PCR asimétrica y RNA generado in
vitro por grandes aumentos en las corrientes electrocatalíticas
obtenidas en presencia de una sonda complementaria. Se observaron
niveles bajos de fijación inespecífica con una secuencia sonda no
complementaria, lo que indicaba que los aumentos de señal observados
con la sonda complementaria eran resultado de la hibridación muy
específica de las dianas. No obstante, es digno de mención que la
diana de RNA exhibía reproduciblemente mayores niveles de fijación
inespecífica.
El ensayo electrocatalítico descrito en esta
memoria proporciona un medio sensible de detección de secuencias de
ácido nucleico pertenecientes a patógenos infecciosos con alta
especificidad utilizando lectura electroquímica. El método es muy
sensible, y es adecuado para detectar niveles bajos de hibridación
de DNA a partir de soluciones diluidas de secuencias diana. Una
característica particularmente atractiva del método está constituida
por los grandes aumentos de señal que resultan de la formación de
DNA dúplex en la superficie del electrodo. Típicamente, los cambios
en carga integrada observados son mayores que el 100% incluso cuando
la extensión de hibridación en la superficie del electrodo puede
ser tan baja como 5-10%. Además, el descubrimiento
inesperado de que una sola mutación puntual atenúa drásticamente la
cinética de la formación de dúplex en la superficie del electrodo,
indica que la determinación del genotipo bacteriano basada en
hibridación es factible, y que puede conseguirse una discriminación
de secuencias de alta resolución con sondas de DNA inmovilizadas. El
desarrollo ulterior de herramientas electroquímicas tales como el
ensayo aquí consignado puede adaptarse para análisis de alta
capacidad de DNA permitirá el análisis eficiente de genes
bacterianos y humanos.
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\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Los Directivos del Boston
College
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> DETECCIÓN ELECTROCATALÍTICA DE LA
HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 2846/2138
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/470,242
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-05-13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> T1 (hpn diana)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgttgcagca ctagcgatag tcatcatcaa
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> T2a (WT rRNA diana)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcaagacgg aaagaccc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> T2aMUT (A2143C rRNA diana)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcaagacgg acagaccc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HP1b (sonda hpn complementaria 18 nt
+ 12T)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttttttttt ttgatgacta tcgctagtgc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HP1c (sonda hpn no complementaria 18
nt + 12T)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttttttttt ttgggataat tcttcaccgg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 219
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia diana (producto PCR)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 225
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia diana (transcrito de
RNA)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
30-mero para detección de Hpn diana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgttgcagca ctagcgatag tcatcatcat caa
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador PCR directo para
amplificación del gen hpn de H. pylori
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcaaaggag tcatcatggc acac
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador PCR inverso para
amplificación del gen hpn de H. pylori
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagttgcccc tagccaca
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador PCR directo que contiene
la secuencia promotora de polimerasa T7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctaggtaat acgactcact ataggagtca tcatggcaca c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HP1a (sonda hpn complementaria de 30
nt)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgatgatga ctatcgctag tgctgcaaca
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HP2a (rRNA sonda)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtctttcc gtcttgcc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<213> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HP2b (rRNA
sonda-2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtccacggg gtctttcc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> T2b (WT rRNA diana #2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaaagaccc cgtggacc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> T2bMUT (A2143C RNA diana #2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggacagaccc cgtggacc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> T-NC (diana no
complementaria)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacagttcct gcatg
\hfill15
Claims (20)
1. Un ensayo electrocatalítico de hibridación
que comprende:
- \quad
- proporcionar una sonda de ácido nucleico inmovilizada sobre un soporte sólido;
- \quad
- poner en contacto la sonda de ácido nucleico con una muestra en donde la muestra comprende un ácido nucleico diana, un primer complejo de metal de transición y un segundo complejo de metal de transición; y
- \quad
- medir una señal electrocatalítica generada por hibridación de la sonda de ácido nucleico y la diana de ácido nucleico,
- \quad
- en donde la presencia del segundo complejo de metal de transición proporciona una señal electrocatalítica intensificada.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El ensayo electrocatalítico de hibridación
de la reivindicación 1, en donde el primer complejo de metal de
transición comprende un metal seleccionado del grupo constituido por
cobalto, hierro, molibdeno, osmio, rutenio y renio.
3. El ensayo electrocatalítico de hibridación
de la reivindicación 2, en donde el segundo complejo de metal de
transición comprende un metal seleccionado del grupo constituido por
hierro, cobalto, molibdeno, osmio y renio.
4. El ensayo electrocatalítico de hibridación
de la reivindicación 1, en donde el primer complejo de metal de
transición es un complejo de metal de transición con amonio.
5. El ensayo electrocatalítico de hibridación
de la reivindicación 4, en donde el segundo complejo de metal de
transición es un complejo de metal de transición y ciano.
6. El ensayo electrocatalítico de hibridación de
la reivindicación 1, en donde el soporte sólido comprende oro.
7. El ensayo electrocatalítico de hibridación de
la reivindicación 1, que comprende adicionalmente comparar la señal
electrocatalítica medida con un control.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Un método para detectar la hibridación entre
una sonda de ácido nucleico y un ácido nucleico diana, que
comprende:
- \quad
- proporcionar una sonda de ácido nucleico inmovilizada sobre un soporte sólido;
- \quad
- poner en contacto la sonda de ácido nucleico con una muestra en donde la muestra comprende un ácido nucleico diana, un primer complejo de metal de transición y un segundo complejo de metal de transición; y
- \quad
- medir una señal electrocatalítica generada por hibridación de la sonda de ácido nucleico y la diana de ácido nucleico.
\vskip1.000000\baselineskip
9. El método de la reivindicación 8, que
comprende adicionalmente:
comparar la señal electrocatalítica medida con
un control.
10. El método de la reivindicación 8, en el cual
el primer complejo de metal de transición comprende un metal
seleccionado del grupo constituido por cobalto, hierro, molibdeno,
osmio, rutenio y renio.
11. El método de la reivindicación 10, en el
cual el segundo complejo de metal de transición comprende un metal
seleccionado del grupo constituido por hierro, cobalto, molibdeno,
osmio y renio.
12. El método de la reivindicación 8, en donde
el primer complejo de metal de transición es un complejo de metal
de transición con amonio.
13. El método de la reivindicación 12, en donde
el segundo complejo de metal de transición es un complejo de metal
de transición con ciano.
14. El método de la reivindicación 8 en donde el
sustrato conductor comprende oro.
15. El método de la reivindicación 8, en donde
el ácido nucleico diana es RNA.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Un método para detectar la hibridación entre
una sonda de ácido nucleico y un ácido nucleico diana, que
comprende:
- \quad
- proporcionar una sonda de ácido nucleico inmovilizada sobre un soporte sólido;
- \quad
- poner en contacto la sonda de ácido nucleico con una muestra en donde la muestra comprende un ácido nucleico diana, un primer complejo de metal de transición y un segundo complejo de metal de transición en donde el primer complejo de metal de transición es un complejo de Ru(NH_{3})_{6}^{3-}; y el segundo complejo de metal de transición es un complejo de Fe(CN)_{6}^{3-}; y
- \quad
- medir una señal electrocatalítica generada por hibridación de la sonda de ácido nucleico y la diana de ácido nucleico.
\vskip1.000000\baselineskip
17. El método de la reivindicación 16, que
comprende adicionalmente:
comparar la señal electrocatalítica medida con
un control.
18. El método de la reivindicación 16, en donde
el sustrato conductor comprende oro.
19. El método de la reivindicación 16, en donde
el ácido nucleico diana es RNA.
20. El método de la reivindicación 16, en donde
el ácido nucleico diana es DNA.
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