ES2333128T3

ES2333128T3 - Metodo para purificar fsh.

Info

Publication number: ES2333128T3
Application number: ES04803960T
Authority: ES
Inventors: Mara Rossi
Original assignee: Ares Trading SA
Current assignee: Ares Trading SA
Priority date: 2003-12-22
Filing date: 2004-12-16
Publication date: 2010-02-17
Anticipated expiration: 2024-12-16
Also published as: CN100554277C; DE602004023757D1; JP2008500273A; US7754860B2; BRPI0417992A; ATE446314T1; CA2544333A1; CN1890265A; EA200601029A1; EA008924B1; US20070129295A1; IL176328A0; JP4763616B2; WO2005063811A1; AU2004309040B2; NO330774B1; BRPI0417992B1; NO20063304L; KR101160985B1; IL176328A

Abstract

Un método para purificar la FSH humana recombinante o una variante de FSH que comprende las etapas de someter FSH a: (1) cromatografía de intercambio iónico realizada con una resina de intercambio aniónico fuerte; (2) cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados; (2a) cromatografía de intercambio iónico realizada con una resina de intercambio aniónico débil; y (3) cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC).

Description

Método para purificar FSH.

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la purificación de proteínas, particularmente de la hormona estimuladora del folículo (FSH, por sus siglas en inglés "Follicle Stimulating Hormone").

Antecedentes de la invención

La hormona estimuladora del folículo (FSH) es una proteína inyectable que pertenece a la clase de gonadotrofinas. La FSH se usa en el tratamiento de la infertilidad y los trastornos reproductivos tanto en pacientes femeninos como en masculinos.

En la naturaleza, la FSH es producida por la glándula pituitaria. Para su uso farmacéutico, la FSH puede ser producida recombinantemente (rFSH), o puede ser aislada a partir de la orina en mujeres posmenopáusicas (uFSH).

La FSH se usa en pacientes femeninos en la inducción de la ovulación (OI) y en la hiperestimulación ovárica controlada (COH) para tecnologías de reproducción asistida (TRA). En un régimen de tratamiento típico para la inducción de la ovulación, a un paciente se le administra inyecciones diarias de FSH o una variante (aproximadamente de 75 a 300 UI FSH/día) durante un periodo de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 12 días. En un régimen de tratamiento típico para la hiperestimulación ovárica controlada, a un paciente se le administra inyecciones diarias de FSH o una variante (aproximadamente 150-600 UI FSH/día) durante un periodo de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 12 días.

La FSH también se usa para inducir la espermatogénesis en hombres que sufren de oligoespermia. Se ha logrado que un régimen que usa 150 UI de FSH 3 veces semanalmente en combinación con 2.500 UI de hCG dos veces semanalmente mejora el recuento del esperma en hombres que sufren de hipogonadismo hipogonadotrófico [Burgues et al.; "Subcutaneous self-administration of highly purified follicle stimulating hormone and human chorionic gonadotrophin for the treatment of male hypogonadotrophic hypogonadism". Grupo español de colaboración en hipogonadismo hipogonadotrófico en hombres; Hum. Reprod.; 1997, 12, 980-6].

A causa de la importancia de la FSH en el tratamiento de los trastornos de la fertilidad, la provisión de FSH de alta pureza y de alta actividad específica es deseable. El tratamiento con FSH requiere de inyecciones repetidas. Las preparaciones de FSH altamente purificadas pueden ser administradas subcutáneamente, permitiendo la autoadministración por el paciente, aumentándose así la comodidad del paciente y el cumplimiento terapéutico.

Lynch et al. "The extraction and purification of human pituitary follicle-stimulating hormone and luteinising hormone"; Acta Endocrinologica, 1988, 288, 12-19] describen un método para purificar la FSH de la glándula pituitaria humana. El método implica cromatografía de intercambio catiónico y aniónico y cromatografía de exclusión por tamaños. El método, según se piensa, causa que la FSH de la glándula pituitaria tenga una actividad específica de 4.990 UI (inmunoensayo)/mg, con 16 UI/mg de LH. El contenido de proteínas fue determinado por la absorción a 280 nm en peso seco o en solución (asumiendo que A^{280}_{1 \ cm} para 1 g/l es igual a 1).

El documento WO 98/20039 (IBSA Institut Biochimique SA) describe un procedimiento para la purificación de la FSH humana urinaria que comienza con extractos urinarios llamados gonadotrofinas menopáusicas humanas (hMG). El procedimiento usa la cromatografía de intercambio iónico con resinas de intercambio aniónico débilmente básicas del tipo DEAE seguido de la cromatografía de afinidad en resinas que tienen un derivado de antraquinona como ligando. El procedimiento, según se piensa, proporciona FSH urinaria libre de LH y que tiene una actividad específica de 6.870 UI (inmunoensayo)/mg. El contenido de proteínas fue determinado asumiendo que una solución de agua de 1 mg/ml de proteína tiene una densidad óptica de 0,62 a 277 nm, en cubetas de cuarzo con una longitud de paso
de 1 cm.

El documento WO 00/63248 (Instituto Massone SA) describe un procedimiento para la purificación de gonadotrofinas, incluyendo FSH, a partir de orina humana. El procedimiento implica las etapas siguientes: cromatografía de intercambio iónico con una resina fuertemente catiónica del tipo sulfopropilo, cromatografía de intercambio iónico con una resina fuertemente aniónica, y cromatografía de interacción hidrófoba (HIC). Una preparación de FSH que tiene una actividad específica de 8.400 UI/mg (método de Steelman-Pohley: "Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotrophy"; Endocrinology; 1953, 53, 604-616) y menos de 1 UI de LH (método de ganancia de peso de la vesícula seminal en rata: Van Hell H, Matthijsen R & GA Overbeek; Acta Endocrinol, 1964, 47, 409) de actividad biológica por 75 UI de FSH, según se publica, es obtenida. El contenido de proteínas fue realizado por el método de Lowry [O. H. Lowry et al., J. Biol. Chem., 1951, 193, 265].

El documento de EE.UU. Nº. 5.990.288 (Musick et al.) describe un método para purificar FSH a partir de muestras biológicas, tales como glándula pituitaria humanas u orina posmenopáusica humana. El procedimiento usa la cromatografía de afinidad por ligación de tinte. El procedimiento, según se dice, da como resultado FSH de glándula pituitaria humana que tiene una actividad específica de 7.066 UI (inmunoensayo)/mg y menos de 1 UI (inmunoensayo)/mg de LH, y una FSH urinaria que tiene una actividad específica de 6.298 UI (inmunoensayo)/mg y menos de 3 UI (inmunoensayo)/mg de LH. El contenido de proteínas fue determinado por la absorción a 280 nm (asumiendo que una A^{280}_{1 \ cm} para 1 g/l es igual a 1).

Chiba et al. [Isolation and partial characterisation of LH, FSH and TSH from canine pituitary gland; Endocrinol. J., 1997, 44, 205-218] describen una técnica para purificar gonadotrofinas de glándula pituitaria canina, incluyendo FSH, usando cromatografía de afinidad de Concanavalina (Con) A, cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) y cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados con Cu^{++}. La FSH resultante, según se publica, tiene una actividad específica de 2,17 UI/g proteína usando un ensayo radioreceptor para FSH que mide la actividad biológica y el kit de ensayo de proteína BioRad (Laboratorios BioRad CA EE.UU.) para determinar el contenido de proteínas.

El documento WO 88/10270 (Instituto di Ricerca Cesare Serono SPA) describe un método para purificar FSH humana a partir de la orina. El procedimiento implica la inmunocromatografía con anticuerpos monoclonales inmovilizados FSH-específicos unidos a Sepharose 4B por divinil-sulfona, seguido de HPLC de fase inversa. La FSH resultante está libre de LH y otras proteínas urinarias y tiene una actividad específica de 6.200 UI/mg de polvo liofilizado (método de Steelman-Pohley). La preparación era la primera preparación de FSH que era adecuada para la administración subcutánea, debido a su pureza.

El documento EP 0475779 (Vittal Mallya Scientific Research Foundation) describe un procedimiento para la purificación de un polipéptido o una proteína que aprovecha las propiedades quelantes de la fosvitina en una cromatografía de iones metálicos.

Todavía son necesarios nuevos métodos para purificar FSH.

Sumario de la invención

Un objeto de la invención es proporcionar un nuevo método para purificar FSH recombinante o una variante de FSH.

En un primer aspecto, la invención proporciona un método para purificar FSH recombinante humana o una variante de FSH que comprende las etapas de someter FSH a:

(1) cromatografía de intercambio iónico realizada con una resina de intercambio aniónico fuerte;

(2) cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados;

(2a) cromatografía de intercambio iónico realizada usando una resina de intercambio aniónico débil; y

(3) cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC).

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra un organigrama que muestra la purificación de rhFSH.

La figura 2 muestra el perfil de elución para la cromatografía de rhFSH cruda sobre Q Sepharose FF según se detecta por OD a 280 nm.

La figura 3 muestra el perfil de elución para la cromatografía IMAC de rhFSH parcialmente purificada según se detecta por OD a 280 nm.

La figura 4 muestra el perfil de elución para la cromatografía DEAE Sepharose de rhFSH parcialmente purificada según se detecta por OD a 280 nm.

La figura 5 muestra el perfil de elución para la cromatografía fenil Sepharose de rhFSH parcialmente purificada según se detecta por OD a 280 nm.

La figura 6 muestra el perfil de elución para la etapa de RPC usando una columna Source RPC 30.

Abreviaturas

Se usan las siguientes abreviaturas en la descripción de la invención:

FSH: hormona estimulante del folículo

r-FSH: FSH recombinante

hFSH: FSH humana

rhFSH: FSH recombinante humana

BV: Volumen de lecho

DEAE: dietilaminoetilo

IMAC: cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados

OD: densidad óptica

HIC: Cromatografía de interacción hidrófoba

HPLC: cromatografía líquida de alta resolución

IRMA: ensayo inmunoradiométrico

KD o kD: kiloDalton

HCP: proteína de célula huésped, proteínas que provienen de la célula huésped usada para la expresión de FSH

IPC: Controles en procedimiento

RP-HPLC: cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa

Q FF: intercambio aniónico en Q Sepharose FF.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona un método para purificar FSH recombinante humana o una variante de FSH que comprende las etapas de someter FSH a:

(2) cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados;

(3) cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC).

El método de purificación de la invención permite que se obtenga FSH purificada de una pureza comparable a los productos de FSH conocidos, tales como Gonal-F (Serono) y Metrodin-HP (Serono). El material de partida para la purificación es FSH recombinante.

Realizaciones preferidas de la invención

El método de purificación de la invención implica una etapa de cromatografía de intercambio iónico. La etapa de la cromatografía de intercambio iónico se realiza con una resina de intercambio aniónico fuerte, preferiblemente una resina de amonio cuaternario, tal como Q Sepharose FF (Amersham Biosciences), o una resina que tenga características similares, como las siguientes:

Tipo de intercambiador iónico:: Anión fuerte

Capacidad total (mmol/ml):: 0,18-0,25

Límite de exclusión (proteínas globulares):: 4 x 10^{6}

Forma de las perlas:: Esféricas, diámetro 45-165 \mum

Estructura de las perlas:: Agarosa reticulada, 6%

Estabilidad del pH operacional:: 2-12

Estabilidad del pH de limpieza:: 1-14

Caudal lineal a 25ºC 1 bar, lecho de 15 cm altura, columna XK 50/30:: 400-700 cm/h

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En la etapa de la cromatografía de intercambio iónico, la elución se realiza preferiblemente usando un tampón que tenga un pH suavemente alcalino, preferiblemente a 8,5, o a aproximadamente 8,5). El tampón adecuado es un tampón de borato, a un pH de 8,5, o aproximadamente 8,5. La concentración de las especies del tampón de elución está preferiblemente dentro del intervalo de 10, o aproximadamente 10, a 100 mM, o aproximadamente 100 mM, más preferiblemente a 25, o aproximadamente 25, a 75 mM, o aproximadamente 75 mM, lo más preferiblemente a 50 mM, o aproximadamente 50 mM.

Antes de la etapa de la cromatografía de intercambio iónico, puede ser deseable realizar una etapa de ultrafiltración, a fin de concentrar la FSH cruda. La ultrafiltración (o diafiltración) se realiza preferiblemente usando una membrana que tiene un tamaño de poro de 3-10 kD, o aproximadamente 3-10 kD, más preferiblemente 5 kD, o aproximadamente 5 kD.

El método de la invención también implica una etapa de cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados. En una realización preferida, la etapa de la cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados se realiza usando una resina que tenga grupos quelato tridentados, tales como, por ejemplo, ácido iminodiacético (IDA), y un ión metálico divalente, M^{2+}, tal como Cu^{2+}, Zn^{2+}, Ni^{2+}, Ca^{2+}, Mg^{2+} y Co^{2+}, preferiblemente Cu^{2+}. El grupo quelante iónico metálico se une a un soporte sólido adecuado, una resina particularmente preferida es la FF Sepharose Quelante (Amersham Biosciences), u otras resinas que tengan características similares, como las siguientes:

Composición:: agarosa al 6% altamente reticulada

Tamaño de partículas:: 45-165 \mum

Ligando:: grupos de ácido iminodiacético en espaciador

Química de acoplamiento:: Epoxi

Capacidad del ión metálico:: 30-37 \mumol Cu^{2+}/ml

Estabilidad del pH (operacional):: 3-13

Estabilidad del pH (corto plazo de tiempo):: 2-14

Especificaciones de presión/flujo:: matriz base 200-400 cm/h, 1 bar (100 kPa), columna XK 50/60, altura del lecho 25 cm

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La elución en la etapa de la cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados debe ser realizada usando un tampón de acetato, tal como el acetato de amonio. El pH del eluyente debe ser preferiblemente 9, o aproximadamente 9. La concentración de las especies tampón en el eluyente debe estar preferiblemente entre 0,1, o aproximadamente 0,1, y 2 M, o aproximadamente 2 M, más preferiblemente entre 0,5 M, o aproximadamente 0,5 M, y 1 M, o aproximadamente 1 M, lo más preferiblemente a 0,75 M, o aproximadamente 0,75 M.

El método también implica una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba. En una realización preferida, la cromatografía de interacción hidrófoba se realiza con una resina tal como la Fenil Sepharose FF HS (Amersham Biosciences), o una resina que tenga características similares, como las siguientes:

Matriz:: agarosa esférica altamente reticulada al 6%

Tamaño de partículas promedio:: 90 \mum

Ligando hidrofóbico:: Fenilo

Densidad de ligando:: 40

Estabilidad de pH (poco tiempo):: 2-14

Estabilidad del pH (mucho tiempo e intervalo de trabajo): 3-13

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La elución en la etapa de la cromatografía de interacción hidrófoba se realiza preferiblemente usando un tampón que tenga un pH suavemente alcalino (por ejemplo a 7,2, o aproximadamente 7,2, a 9, o aproximadamente 9, más preferiblemente a 7,5, o aproximadamente 7,5, a 8,5, o aproximadamente 8,5, lo más preferiblemente a 8,25, o aproximadamente 8,25). Un eluyente particularmente preferido es el acetato de amonio (50 mM) / sulfato de amonio (0,25 M), preferiblemente a un pH de 8,25, o aproximadamente 8,25.

Después de la etapa de la cromatografía de interacción hidrófoba, también es posible realizar una etapa de cromatografía de fase inversa (RPC). La RPC se realiza preferiblemente usando una resina como la SOURCE 30 RPC (Amersham Biosciences). La elución se realiza preferiblemente usando un tampón tal como el acetato de amonio que tiene un pH a 7,6, o aproximadamente 7,6.

La solución tampón contiene 2-propanol (isopropanol) al 20% (volumen/volumen).

Entre la etapa (2) y la etapa (3), se realiza una etapa de cromatografía de intercambio iónico (2a) con una resina de intercambio aniónico débil, tal como, por ejemplo, una resina de intercambio que lleve DEAE Sepharose FF. Las etapas se realizan en el orden mostrado más abajo:

(1) Cromatografía de intercambio iónico,

(2) Cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados,

(2a) segunda etapa de la cromatografía de intercambio iónico, y

(3) cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC).

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En una realización particularmente preferida, el método de la invención comprende etapas caracterizadas como las que siguen:

(1) cromatografía de intercambio iónico con una resina de intercambio aniónico fuerte, (como Q Sepharose FF);

(2) cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados (preferiblemente con FF Sepharose Quelante, usando Cu^{++} como ión metálico);

(2a) cromatografía de intercambio iónico con una resina de intercambio aniónico débil, (como DEAE Sepharose FF);

(3) cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) (preferiblemente con Fenil Sepharose FF HS).

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La segunda etapa de cromatografía de intercambio iónico (2a) se realiza preferiblemente usando tampón acetato de amonio como eluyente, preferiblemente a un pH de 8,5, o aproximadamente 8,5. Preferiblemente el tampón acetato de amonio está entre 0,05, o aproximadamente 0,05, y 0,5 M, o aproximadamente 0,5 M, más preferiblemente a 0,11 M, o aproximadamente 0,11 M.

Puede ser deseable someter la muestra de FSH a una etapa de nanofiltración, a fin de asegurarse que la preparación de FSH purificada está libre de virus.

En una realización particularmente preferida, el método de la invención comprende las etapas siguientes:

[(0) Ultrafiltración (preferiblemente con una membrana que tiene un tamaño de poro de 5 kD, o aproximadamente 5 kD), (1) cromatografía de intercambio aniónico en Q Sepharose FF con borato a 50 mM, o aproximadamente 50 mM, con NaCl 0,13 M, o aproximadamente 0,13 M, pH a 8,5, o aproximadamente 8,5, como eluyente; (2) cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados en Sepharose FF Quelante y Cu^{++} como ión metálico, y con acetato de amonio a 0,75, o aproximadamente 0,75 M, pH a 9, o aproximadamente 9, como eluyente; (2a) etapa de cromatografía de intercambio aniónico en DEAE Sepharose FF con acetato de amonio 0,11 M, o aproximadamente 0,11 M, pH a 8,5, o aproximadamente 8,5, como eluyente; (3) cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) en Fenil Sepharose FF HS con acetato de amonio 50 mM, o aproximadamente 50 mM, con sulfato de amonio 0,25 M, o aproximadamente 0,25 M, pH a 8,25, o aproximadamente 8,25, como eluyente; (4) cromatografía de fase inversa (RPC) en Source 30 RPC con acetato de amonio 50 mM, o aproximadamente 50 mM, pH a 7,6, o aproximadamente 7,6, con 2-propanol al 20% (v/v), o aproximadamente al 20%, y (5) ultrafiltración (preferiblemente con una membrana que tenga un tamaño de poro de 5 kD), (6) nanofiltration.

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Almacenamiento/Liofilización

La composición líquida que resulta del proceso de purificación descrito antes y que contiene la FSH purificada puede ser congelada para su almacenaje como tal, o después de la purificación, el eluato puede ser sometido a la liofilización ("deshidratación por congelación") para quitar el disolvente. El líquido que resulta o el producto liofilizado se llama "FSH a granel".

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Formulaciones de FSH

La FSH o una variante de FSH de la invención o el purificado según el método de la invención deben ser formulados para una inyección intramuscular o subcutánea, preferiblemente subcutánea.

La formulación de FSH puede ser deshidratada por congelación, en cuyo caso es disuelta en agua para su inyección justo antes de la inyección. La formulación de FSH también puede ser una formulación líquida, en cuyo caso puede ser inyectada directamente, sin disolución previa.

La formulación de FSH puede estar como una dosis individual o como una dosis múltiple. Si está como una dosis múltiple, debe contener preferiblemente un agente bacteriostático, tal como, por ejemplo, alcohol bencílico, meta-cresol, timol o fenol, preferiblemente alcohol bencílico o meta-cresol. Las formulaciones en dosis individuales también pueden comprender un agente bacteriostático.

La FSH de la invención puede ser formulada con excipientes y estabilizadores conocidos, por ejemplo, sacarosa y manitol. También puede comprender un antioxidante, tal como la metionina. Puede comprender además un tensioactivo, tal como TWEEN (preferiblemente TWEEN 20), o Pluronic (preferiblemente Pluronic F68).

En una formulación multidosis particularmente preferida, la FSH producida por el método de la invención se formula disolviéndola en agua para una inyección con sacarosa, tampón fosfato (pH 7), Pluronic F68, metionina y meta-cresol o alcohol bencílico.

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Indicaciones

La FSH de la invención es adecuada para su uso en todos los tratamientos en los que FSH es indicada. Es particularmente adecuada para la administración subcutánea en la inducción de la ovulación, la hiperestimulación ovárica controlada en tecnologías de reproducción asistida y en el tratamiento de la oligospermia. Puede ser usada junto con otras gonadotrofinas, tal como LH y hCG. También puede usarse con compuestos que aumenten la respuesta frente a FSH, tal como el citrato de clomifeno, inhibidores de aromatasa, tales como Anastrozol, Letrozol, Fadrozol e YM-511.

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Secuencias

SEQ ID NO. 1: subunidad \alpha de glicoproteína humana

SEQ ID NO. 2: subunidad \beta de hFSH

SEQ ID NO. 3: variante 1 de subunidad \beta de hFSH

SEQ ID NO. 4: variante 2 de subunidad \beta de hFSH

SEQ ID NO. 5: variante 3 de subunidad \beta de hFSH.

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La hormona estimuladora del folículo, o FSH, como se usa en este documento, se refiere a la FSH humana (hFSH) producida como una proteína madura de cadena entera. La FSH es un dímero formado por la subunidad alfa de la glicoproteína humana y la subunidad beta de la FSH humana. La secuencia de proteínas de la subunidad alfa de la glicoproteína humana se proporciona en la SEQ ID NO. 1, y la secuencia de la proteína de la subunidad beta de la FSH humana se da en SEQ ID NO. 2.

El uso del término "recombinante" se refiere a preparaciones de FSH que se producen mediante el uso de la tecnología del ADN recombinante (véase, por ejemplo el documento WO 85/01958). Un ejemplo de un método para expresar FSH usando la tecnología recombinante es por transfección de células eucarióticas con secuencias de ADN que codifican una subunidad alfa y beta de FSH, tanto si se proporciona en un vector como en dos vectores con cada subunidad que tiene un promotor separado, como se describe en las patentes europeas N^{os}. EP 0 211 894 y
EP 0 487 512. El ADN que codifica la FSH puede ser un cADN o puede contener intrones. Otro ejemplo del uso de la tecnología recombinante para producir FSH es mediante el uso de recombinación homóloga para insertar un segmento regulador heterólogo en unión operativa a secuencias endógenas que codifican una o ambas de las subunidades de FSH, como se describe en la patente europea Nº. EP 0 505 500 (Applied Research Systems ARS Holding NV). También se contemplan métodos como los descritos en el documento WO 99/57263 (Transkaryotic Therapies), en el que una de las subunidades es insertada heterólogamente en una célula, y la otra subunidad es expresada por la activación de secuencias genómicas por la introducción de un segmento regulador heterólogo mediante recombinación homóloga. El método de la invención puede usarse para purificar FSH expresada usando cualquiera de estos métodos.

La expresión "célula recombinante" se refiere a una célula producida insertando el ADN heterólogo, incluyendo cualquiera de los métodos mencionados antes de manipulación genética.

Preferiblemente la FSH es producida recombinantemente en células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas con un vector o vectores que comprenden el ADN que codifica la subunidad alfa de la glicoproteína humana y la subunidad beta de FSH. El ADN que codifica las subunidades alfa y beta puede estar presente en los mismos vectores o diferentes.

La expresión "variante de FSH" se supone que abarca aquellas moléculas que se diferencian de la secuencia de aminoácidos, modelo de glicosilación o en el enlace intersubunidad de FSH humana, pero que exhiben cierta actividad de FSH. Los ejemplos incluyen CTP-FSH, una FSH recombinante modificada de acción lenta, que consiste en una subunidad \alpha tipo silvestre y una subunidad \beta híbrida en la cual el péptido carboxi terminal de hCG ha sido fusionado en el extremo C-terminal de la subunidad \beta de FSH, como se describe en LaPolt et al.; Endocrinology; 1992, 131, 2514-2520; o Klein et al.; "Development and characterization of a long-acting recombinant hFSH agonist"; Human Reprod. 2003, 18, 50-56. También se incluye la CTP-FSH de cadena sencilla, una molécula de cadena sencilla que consiste en las secuencias siguientes (del extremo N-terminal al C-terminal):

1

en el que \betaFSH significa la subunidad \beta de FSH, \betahCG CTP (113-145) significa el péptido carboxi terminal de hCG y \alphaFSH significa una subunidad \alpha de FSH, como se describe en Klein et al. [Pharmacokinetics and pharmacodynamics of single-chain recombinant human follicle-stimulating hormone containing the human chorionic gonadotrophin carboxyterminal peptide in the rhesus monkey; Fertility & Sterility, 2002, 77, 1248-1255]. Otros ejemplos de variantes de FSH incluyen las moléculas de FSH que incorporan otros sitios de glicosilación en la subunidad \alpha y/o \beta, como se describe en el documento WO 01/58493 (Maxygen), y moléculas de FSH con enlaces intersubunidad S-S, como se describe en el documento WO 98/58957. Otros ejemplos de variantes de FSH incluyen moléculas quiméricas que comprenden secuencias de FSH y secuencias de hCG o LH, tales como las descritas en los documentos WO 91/16922 y WO 92/22568.

Las variantes de FSH mencionadas en este documento también incluyen la deleción del extremo carboxi terminal de la subunidad beta que es más corta que la proteína madura de longitud completa de SEQ ID NO. 2. Las deleciones del extremo carboxi terminal de la subunidad beta humana se proporcionan en las SEQ IDS NOS: 3, 4 y 5. Se sobrentiende que las variantes del extremo carboxi terminal de la cadena beta forman dímeros con una subunidad alfa conocida para formar un heterodímero de la variante de FSH.

En una realización preferida, la FSH se produce recombinantemente en células CHO.

En una realización preferida, la FSH purificada producida según el método de la invención es adecuada para una administración subcutánea, permitiendo la autoadministración por el paciente.

La expresión "FSH recombinante cruda" se refiere al sobrenadante del cultivo celular de células recombinantes que expresan FSH, antes de que se haya sometido a alguna etapa cromatográfica. La expresión se limita a la forma cruda del sobrenadante (como aislado de células) así como el sobrenadante concentrado y/o filtrado y/o ultrafiltrado.

La expresión "actividad biológica" con relación a la actividad de FSH, se refiere a la capacidad de una formulación de FSH para obtener respuestas biológicas asociadas a FSH, tal como la ganancia de peso ovárico en el ensayo de Steelman-Pohley [Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotrophin; Endocrinology; 1953, 53, 604-616], o el crecimiento folicular de una paciente femenina. El crecimiento folicular de una paciente femenina puede ser evaluado por ultrasonidos, por ejemplo, en términos de número de folículos que tengan un diámetro promedio de 16 mm, o aproximadamente 16 mm, el día 8 de la estimulación. La actividad biológica se evalúa con respecto a un estándar aceptado para FSH.

El contenido de LH en una preparación de FSH puede ser medido, por ejemplo, usando un inmunoensayo específico de LH, tal como el de Delfia hLH Spec (Wallac Oy, Turku, Finlandia).

La expresión "actividad específica", en referencia a FSH, significa la actividad biológica en UI de la preparación en un ensayo biológico reconocido para FSH, como el bioensayo de Steeelman Pohley, dividido por la cantidad de proteína, como se determina por un ensayo para el contenido de proteína total, tal como el ensayo de Lowry [O. H. Lowry, N. J. Rosebrough, A. L. Farr y R. J. Randall (1951) J. Biol. Chem. 193: 265; Hartree E. E. (1972). Anal. Biochem. 48: 422; J. R. Dulley y P. A. Grieve (1975) Anal. Biochem. 64: 136], el ensayo de Bradford [Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248], o por absorbancia a 280 nm. Preferiblemente, la FSH de la invención tiene una actividad específica mayor que 4000 UI/mg o aproximadamente 4000 UI/mg, más preferiblemente mayor que 6000 UI/mg o aproximadamente 6000 UI/mg, aún más preferiblemente mayor que 7000 UI/mg o aproximadamente 7000 UI/mg, aún más preferiblemente mayor que 8000 UI/mg o aproximadamente 8000 UI/mg en el que la actividad biológica es medida por el bioensayo de Steelman Pohley y el contenido de proteína es medido por la OD a 280 nm.

Ejemplos Purificación

El ejemplo siguiente proporciona r-hFSH purificada empezando por la rhFSH cruda concentrada producida en biorreactores de 15 y 75 L.

Un organigrama del procedimiento de purificación descrito detalladamente en las siguientes secciones es presentado en la Figura 1. La rhFSH purificada resultante se llama "rhFSH a granel".

Para todos los tampones, los valores de pH y conductividad se refieren a +25ºC; es decir la determinación del valor de conductividad fue realizada usando un instrumento equipado con la sonda de temperaturas y el valor obtenido fue automáticamente compensado por la diferencia de temperaturas y se refirió a +25ºC.

En cuanto a las medidas de conductividad, el coeficiente de temperatura de correlación siempre estuvo puesto
en 2.

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Etapa 0

Diafiltración de la rhFSH cruda concentrada Equipo

\bullet: Sistema de ultrafiltración tipo Pellicon Mini (Millipore o equivalente)

\bullet: Membrana de ultrafiltración de tamaño de poro 5KD en polietersulfona tipo BIOMAX (Millipore o equivalente), 0,1 m^{2}

\bullet: Bomba peristáltica tipo Masterflex o equivalente

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Materiales

\bullet: r-hFSH cruda concentrada

\bullet: Cantidad inicial: 200-400 mg de FSH determinados por inmunoensayo DELFIA para FSH (a partir de un bioreactor de 75 L)

\bullet: Peletes de hidróxido de sodio - (Merck)

\bullet: Agua purificada (Modulab o equivalente)

\bullet: Ácido bórico

\bullet: Decahidrato de tetraborato de sodio

\bullet: Hidróxido de sodio (peletes)

\bullet: Tampón borato (borato de sodio 50 mM, pH 8,5 \pm 0,1): 3,06 g de ácido bórico y 10 g de di-hidrato de tetraborato de sodio fueron añadidos a 900 mL de agua purificada con agitación, y se completó hasta 1 L.

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Procedimiento de ultrafiltración

Todas las operaciones fueron realizadas en condiciones refrigeradas (3-8ºC).

La r-hFSH cruda concentrada (1-1,5 L) fue ultrafiltrada en las condiciones siguientes:

\bullet: Tampón: borato de sodio 50 mM, pH 8,5 \pm 0,1, conductividad 1,90 \pm 2 mS/cm

\bullet: Flujo del permeado: 15-25 mL/minuto

\bullet: Presión de admisión: 1,5-2,2 bares (1,5-2,2 x 10^{5} Pa)

\bullet: Presión de transmembrana: 1,5-1,8 bares (1,5-1,8 x 10^{5} Pa)

\newpage

donde:

Presión de Transmembrana (TMP) = (Presión de Admisión + Presión de Salida)/2

La solución de rhFSH fue concentrada hasta un volumen de 1 L.

\bullet: La fracción concentrada fue diluida con 1 volumen de agua purificada y fue concentrada otra vez hasta 1 L (lavado).

\bullet: La etapa de lavado fue repetida dos veces más.

\bullet: La conductividad del impregnado se comprobada, y si era menor de 1,5 mS/cm la muestra se pasaba a la siguiente etapa, si no se repetía la etapa de lavado.

Conductividad del impregnado < 1,5 mS/cm

\bullet: Un volumen de la fracción concentrada fue diluido en 2 volúmenes con tampón de equilibrio y fue concentrada otra vez hasta el volumen original.

\bullet: La operación fue repetida dos veces más.

\bullet: El pH y la conductividad del impregnado fueron comprobados y si el pH y la conductividad de la fracción impregnada eran 8,5 \pm 0,1 y 1,9 \pm 0,2 mS/cm, respectivamente, el impregnado se pasaba a la siguiente etapa, si no se repetía la etapa de lavado.

pH del impregnado = 8,5 \pm 0,1

Conductividad del impregnado: 1,9 \pm 0,2 mS/cm

\bullet: La fracción concentrada fue recuperada y el ultrafiltro fue lavado con tres alícuotas del tampón de equilibrio, recuperando y reuniendo los lavados con la fracción concentrada de tal modo que el volumen recuperado final era aproximadamente 0,6-1,2 L.

Volumen recuperado: 0,6-1,2 L

\bullet: Esta fracción fue marcada como:

Inicio Q

\bullet: Fueron almacenadas muestras de 5 x 0,5 mL a -20ºC para IPC.

\bullet: El volumen de la fracción fue medido (puede ser almacenado a +5 \pm 3ºC durante no más de dos días).

\bullet: Las muestras fueron analizadas como sigue: OD a 280 nm, pH, conductividad y contenido de r-hFSH por inmunoensayo (DELFIA) y RP-HPLC.

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Etapa 1

Intercambio aniónico en Q Sepharose FF Equipo

\bullet: Columna cromatográfica XK 50/20

\bullet: Bomba peristáltica tipo Masterflex o equivalente

\bullet: Cuarto frío

\bullet: Monitor de UV (Longitud de camino óptico 2,5 mm) equipado con registrador de dos canales (Amersham Biosciences o equivalente)

\bullet: Espectrofotómetro UV (Shimadzu o equivalente)

\bullet: pH-metro (Metrohm o equivalente)

\bullet: Conductímetro (Metrohm o equivalente)

\bullet: Balanza (MettlerToledo o equivalente)

\bullet: Bomba peristáltica tipo Masterflex o equivalente

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Materiales

\bullet: r-hFSH cruda concentrada de la etapa de ultrafiltración

\bullet: Cantidad inicial: 200-400 mg de FSH por DELFIA

\bullet: Peletes de hidróxido de sodio - (Merck)

\bullet: Agua purificada (Modulab o equivalente)

\bullet: Ácido bórico

\bullet: Decahidrato de tetraborato de sodio

\bullet: Hidróxido de sodio (peletes)

\bullet: Cloruro de sodio

\bullet: Ácido acético glaciar

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Tampón

\bullet: Tampón de equilibrio: borato de sodio 50 mM, pH 8,5 \pm 0,1, conductividad 1,90 \pm 2 mS/cm

\bullet: Tampón de elución: borato de sodio 50 mM, NaCl 0,13 M, pH 8,5 \pm 0,1, conductividad 16 \pm 1,5 mS/cm

\bullet: Solución de separación: NaCl 1,5 M

\bullet: Solución de esterilización 1: Ácido acético 0,1 M

\bullet: Solución de esterilización 2: NaOH 0,5 M

\bullet: Solución de almacenaje: NaOH 0,01 M

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Empaquetamiento de columna

La columna fue empaquetada con resina Q Sepharose Fast Flow siguiendo las instrucciones del fabricante. La columna empaquetada tenía las dimensiones siguientes:

Diámetro: 5 cm

Altura del lecho: 11 cm \pm 10%

Volumen del lecho: 190-240 mL

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Procedimiento de purificación

Toda la operación fue realizada a:

\bullet: Temperatura: 3-8ºC

\bullet: Caudal lineal: 240-280 cm/horas

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Esterilización de columna

La columna fue aclarada con al menos 1 BV (volumen de lecho por sus siglas en inglés "Bed Volumen") de NaOH 0,5M, luego fue aclarada con 3 BV de agua purificada.

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\global\parskip0.900000\baselineskip

Equilibrado de columna

La columna fue aclarada a través con 6-7 o más BV de tampón de equilibrio, borato de sodio 50 mM, pH 8,5 \pm 0,1, conductividad 1,9 \pm 0,2 mS/cm.

El pH y la conductividad fueron comprobados y el lavado fue seguido hasta que los parámetros de los efluentes de la columna estaban dentro de los valores objetivo siguientes:

pH 8,5 \pm 0,1, conductividad 1,90 \pm 2 mS/cm

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Preparación del material de partida

La r-hFSH concentrada y diafiltrada obtenida de la etapa de ultrafiltración fue descongelada en la cantidad indicada en la sección del material.

El pH y la conductividad fueron comprobados, y las muestras fueron recuperadas para la IPC (5 x 0,5 mL).

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Carga

El material de partida fue cargado en la columna equilibrada.

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Lavado

Cuando la carga de la muestra fue completada, la columna fue aclarada con 2-3 BV del tampón de equilibrio. El volumen recogido fue registrado, y las muestras fueron recuperadas para IPC 5 x 0,5 mL, y la fracción fue desechada.

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Elución

La elución fue comenzada con borato de sodio 50 mM, NaCl 0,13 M, pH 8,5 \pm 0,1, conductividad 16 \pm 1,5 mS/cm. La r-hFSH comenzó a eluirse después de 0,7-1,0 BV desde el principio.

4,5 BV de la fracción de elución fueron recogidos, mostrando dos picos, de acuerdo con el perfil cromatográfico representado en la Figura 2.

El volumen recogido fue registrado, y las muestras para IPC fueron retenidas (5 x 0,5 mL).

La fracción puede ser almacenada a 4ºC durante no más de dos días.

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Esta fracción contiene r-hFSH semipurificada

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Etapa (2)

IMAC en Sepharose ff quelante Equipo

\bullet: Columna cromatográfica C10/40 (Amersham Biosciences)

\bullet: Bomba peristáltica tipo miniplus 2 de Gylson o equivalente

\bullet: Cuarto frío

\bullet: Espectrofotómetro UV (Shimadzu o equivalente)

\bullet: pH-metro (Metrohm o equivalente)

\bullet: Conductímetro (Metrohm o equivalente)

\bullet: Balanza (MettlerToledo o equivalente)

\bullet: Bomba peristáltica tipo Masterflex o equivalente

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Materiales

\bullet: r-hFSH después de Q Sepharose FF

\bullet: Peletes de hidróxido de sodio - (Merck)

\bullet: Agua purificada (Modulab o equivalente)

\bullet: Ácido bórico

\bullet: Decahidrato de tetraborato de sodio

\bullet: Hidróxido de sodio (peletes)

\bullet: Cloruro de sodio

\bullet: EDTA

\bullet: Acetato de amonio

\bullet: Sulfato de cobre

\bullet: Solución de amoniaco al 25%

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Tampones

Solución de carga de metal: sulfato de cobre 0,2 M

Agua acidificada: 1 mL de ácido acético glaciar fue añadido a 1 L de agua purificada con agitación

Tampón de equilibrio: borato de sodio 50 mM, pH 8,25 \pm 0,1, NaCl 0,5 M

Elución: acetato de amonio 0,75 M, pH 9,0 \pm 0,1, conductividad \pm 0,5 mS/cm

Solución de regeneración: NaCl 0,5 M, EDTA 50 mM

Solución esterilizante: NaOH 0,5M

Solución de almacenaje: NaOH 0,01 M

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Empaquetamiento de columna

La columna fue empaquetada con resina Fast Flow de Sepharose quelante siguiendo las instrucciones del fabricante. La columna empaquetada tenía las dimensiones siguientes:

Diámetro: 10 mm

Altura del lecho: 22 \pm10%

Volumen del lecho: 16-20 mL

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Procedimiento de purificación

Todas las operaciones fueron realizadas a:

\bullet: Temperatura: 5 \pm 3ºC

\bullet: Caudal lineal: 240-300 cm/horas

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Esterilización de columna

La columna fue aclarada con al menos 1 BV de NaOH 0,5M, luego fue aclarada con 3 BV de agua purificada.

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Carga de columna

La columna fue aclarada con 5-6 BV de agua acidificada hasta que el pH fue < 4,5 (con el indicador del pH). La columna fue aclarada entonces con 3 BV de sulfato de cobre 0,2 M y otra vez 4-5 BV de agua acidificada hasta que el valor de absorbancia (280 nm) alcanzó la línea de fondo.

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Equilibrado de columna

La columna fue aclarada a través con 6 o más BV de tampón de equilibrio, fosfato de sodio 50 mM, pH 8,25 \pm 0,1, NaCl 0,5 M, conductividad 50 \pm 5 mS/cm. El pH y la conductividad fueron comprobados y se realizó el lavado si los parámetros de los efluentes de la columna estaban fuera de los valores objetivo:

pH 8,25 \pm 0,1, conductividad 50 \pm 5 mS/cm

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Preparación del material de partida

La r-hFSH obtenida de la etapa de Q Sepharose FF fue ajustada a un pH de 8,25 \pm 0,1 añadiendo ácido orto-fosfórico al 35%, y conductividad a 50 \pm 5 mS/cm añadiendo NaCl. Las muestras fueron retiradas para IPC (5 x 0,5 mL).

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Carga

El material de partida fue cargado en la columna equilibrada como antes.

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Lavado

Cuando la carga de muestra fue completada, la columna fue aclarada con 5-10 BV del tampón de equilibrio fosfato de sodio 50 mM, pH 8,25 \pm 0,1, NaCl 0,5 M, conductividad 50 \pm 5 mS/cm. Las muestras fueron retiradas (5 x 0,5 ml) para IPC y la fracción fue desechada.

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Elución

La elución fue comenzada con acetato de amonio 0,075 M, pH 9,0 \pm 0,1, conductividad 7,2 \pm 0,5 mS/cm.

La r-hFSH comenzó a eluirse como un pico principal después de 0,5 BV del principio.

5-7 BV fueron recogidos desde el comienzo del pico principal cuando la OD en línea aumentó abruptamente, aproximadamente después de que el primer 0,5 BV fuera desechado.

Las muestras fueron retiradas para (IPC 5 x 0,5 mL) y la fracción fue almacenada a 3-8ºC durante no más de dos días.

El perfil de elución para el IMAC es mostrado en la Figura 3.

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Esta fracción contenía r-hFSH semipurificada

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Etapa (2a)

Intercambio aniónico en DEAE Sepharose FF Equipo

\bullet: Columna cromatográfica Vantage L 22/40

\bullet: Bomba peristáltica tipo miniplus 2 de Gylson o equivalente

\bullet: Cuarto frío

\bullet: Espectrofotómetro UV (Shimadzu o equivalente)

\bullet: pH-metro (Metrohm o equivalente)

\bullet: Conductímetro (Metrohm o equivalente)

\bullet: Balanza (MettlerToledo o equivalente)

\bullet: Bomba peristáltica tipo Masterflex o equivalente

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Materiales

\bullet: r-hFSH después de IMAC

\bullet: Peletes de hidróxido de sodio - (Merck)

\bullet: Agua purificada (Modulab o equivalente)

\bullet: Hidróxido de sodio (peletes)

\bullet: Cloruro de sodio

\bullet: Acetato de amonio

\bullet: Solución de amoniaco al 25%

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Tampón

Tampón de equilibrio: acetato de amonio 0,11 M, pH 8,5 \pm 0,1, conductividad \pm 0,5 mS/cm

Solución de regeneración: NaCl 1,5 M

Solución esterilizante: NaOH 0,5M

Solución de almacenaje: NaOH 0,01 M

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Empaquetamiento de columna

La columna fue empaquetada con resina Fast Flow de Sepharose DEAE siguiendo las instrucciones de los fabricantes. La columna empaquetada tenía las dimensiones siguientes:

Diámetro: 22 mm

Altura del lecho: 16-17 cm

Volumen del lecho: 65-70 mL

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Procedimiento de purificación

Toda la operación fue realizada a:

\bullet: Temperatura: 5 \pm 3ºC

\bullet: Caudal lineal: 240-300 cm/horas

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Esterilización de columna

La columna fue aclarada con al menos 1 BV de NaOH 0,5M, y luego fue aclarada con 3 BV de agua purificada.

\newpage

Equilibrado de columna

La columna fue aclarada con 6 o más BV de tampón de equilibrio, acetato de amonio 0,11 M, pH 8,5 \pm 0,1, conductividad 10,2 \pm 0,5 mS/cm.

El pH y la conductividad fueron comprobados y se realizó el lavado si los parámetros de los efluentes de la columna estaban fuera de valores objetivo:

pH 8,5 \pm 0,1, conductividad 10,5 \pm 0,5 mS/cm

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Preparación del material de partida

La r-hFSH obtenida de la etapa de IMAC fue llevada a un pH 8,5 \pm 0,1 añadiendo ácido acético glaciar, y la conductividad a 10,5 \pm 0,5 mS/cm añadiendo agua purificada (es necesario al menos un volumen de agua para ajustar la conductividad al valor objetivo).

Las muestras fueron retiradas para IPC (5 x 0,5 mL).

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Carga

El material de partida fue cargado en la columna equilibrada como antes.

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Lavado

Cuando la carga de la muestra fue completada, la columna fue aclarada con 3-6 BV de tampón de equilibrio acetato de amonio 0,11 M pH 8,5 \pm 0,1, conductividad 10,2 \pm 0,5 mS/cm.

Las muestras fueron retiradas para IPC (5 x 0,5 mL) y la fracción fue almacenada a +5 \pm 3ºC durante no más de dos días. El perfil de elución para la cromatografía DEAE Sepharose FF es mostrado en la Figura 4.

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Etapa (3)

Interacción Hidrofóbica en Fenil Sepharose FF HS Equipo

\bullet: Columna cromatográfica XK 26/30

\bullet: Bomba peristáltica tipo miniplus 2 de Gylson o equivalente

\bullet: Cuarto frío

\bullet: Espectrofotómetro UV (Shimadzu o equivalente)

\bullet: pH-metro (Metrohm o equivalente)

\bullet: Conductímetro (Metrohm o equivalente)

\bullet: Balanza (MettlerToledo o equivalente)

\bullet: Bomba peristáltica tipo Masterflex o equivalente

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Materiales

\bullet: r-hFSH después de DEAE

\bullet: Peletes de hidróxido de sodio - (Merck)

\bullet: Agua purificada (Modulab o equivalente)

\bullet: Hidróxido de sodio (peletes)

\bullet: Cloruro de sodio

\bullet: Acetato de amonio

\bullet: Sulfato de amonio

\bullet: Solución de amoniaco del 25%

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Tampón

Tampón de equilibrio: acetato de amonio 50 mM, sulfato de amonio 1 M, pH 8,25 \pm 0,1, conductividad 142 \pm 8 mS/cm

Tampón de lavado: acetato de amonio 50 mM, sulfato de amonio 0,9 M, pH 8,25 \pm 0,1, conductividad 130 \pm 5 mS/cm

Tampón de elución: acetato de amonio 50 mM, sulfato de amonio 0,25M, pH 8,25 \pm 0,1, conductividad 50 \pm 3 mS/cm

Solución de separación: agua purificada

Solución esterilizante: NaOH 0,5M

Solución de almacenaje: NaOH 0,01 M

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Empaquetamiento de columna

La columna fue empaquetada con resina HS Fast Flow de Fenil Sepharose siguiendo las instrucciones de los fabricantes. La columna empaquetada tenía las dimensiones siguientes:

Diámetro: 34 mm

Altura del lecho: 14-15 mm

Volumen del lecho: 125-135 mL

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Procedimiento de purificación

Todas las operaciones fueron realizadas a:

\bullet: Temperatura: 5 \pm 3 C

\bullet: Caudal lineal: 240-300 cm/horas

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Esterilización de columna

La columna fue aclarada con al menos 1 BV de NaOH 0,5M, luego fue aclarada con 3-5 BV de agua purificada.

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Equilibrado de columna

La columna fue aclarada a través con 5-6 o más BV del tampón de equilibrio: acetato de amonio 50 mM, sulfato de amonio 1 M, pH 8,25 \pm 0,1, conductividad 140 \pm 8 mS/cm.

El pH y la conductividad fueron comprobados y se realizó el lavado hasta que los parámetros de los efluentes de la columna estuvieron dentro de los valores objetivo:

pH 8,25 \pm 0,1, conductividad 140 \pm 8mS/cm

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Preparación del material de partida

La r-hFSH obtenida de la etapa de DEAE fue añadida con sulfato de amonio 1 M y fue llevada a pH 8,25 \pm 0,1 añadiendo solución de amoniaco al 25%.

Las muestras fueron retiradas para IPC (5 x 0,5mL) y la fracción fue cargada en la columna de Fenil.

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Carga

El material de partida fue cargado en la columna equilibrada como antes.

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Lavado después de la carga

Cuando la carga de la muestra fue completada, la columna fue aclarada con 3-6 BV del tampón de equilibrio: acetato de amonio 50 mM, sulfato de amonio 1 M, pH 8,25 \pm 0,1, conductividad 140 \pm 5 mS/cm.

Las muestras fueron retiradas para IPC (5 x 0,5 mL) y la fracción fue desechada.

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Lavado

Cuando la carga de la muestra fue completada, la columna fue aclarada con 3-6 BV de tampón de lavado acetato de amonio 50 mM, sulfato de amonio 0,9 M, pH 8,25 \pm 0,1, conductividad 130 \pm 5 mS/cm.

Las muestras fueron retiradas para IPC (5 x 0,5mL) y la fracción fue desechada.

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Elución

La elución fue comenzada con el tampón de elución.

La r-hFSH comenzó a eluirse como un pico principal después de 0,5-0,8 BV del principio. 3-4 BV del pico principal fueron recogidos comenzando cuando los valores de absorbancia (280 nm) aumentaban, según el perfil cromatográfico representado en la Figura 5.

Las muestras fueron retiradas para IPC (5 x 0,5 mL) y fueron almacenadas a +5 \pm 3 C durante no más de un día.

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Etapa (4)

Fase Inversa en Source 30 RPC Equipo

\bullet: Columna cromatográfica: Vantage L 22/40

\bullet: Bomba peristáltica (Minipulso 2 Gillson o equivalente)

\bullet: Espectrofotómetro UV (Shimadzu o equivalente)

\bullet: pH-metro (Metrohm o equivalente)

\bullet: Conductímetro (Metrohm o equivalente)

\bullet: Balanza (Mettler Toledo o equivalente)

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Materiales

\bullet: Intermedio de r-hFSH después de HIC

\bullet: Resina SOURCE 30 RPC (Amersham Biosciences)

\bullet: Acetato de amonio - Merck

\bullet: Ácido acético glaciar - Merck

\bullet: Peletes de hidróxido de sodio - Merck

\bullet: Solución de NaOH al 50% J. T. Baker

\bullet: Solución de amoniaco al 25% - Merck

\bullet: 2-Propanol -Merck

\bullet: Peletes de hidróxido de sodio - Merck

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Tampón

Tampón básico: acetato de amonio 50 mM, pH 7,6 \pm 0,2, conductividad 6,5 \pm 0,5 mS.

Tampón de equilibrio: acetato de amonio 50 mM, pH 7,6 \pm 0,2, conteniendo 2-propanol (VN) al 13%

Tampón de elución: acetato de amonio 50 mM, 7,6 \pm 0,2, conteniendo 2-propanol (VN) al 20%

Solución de regeneración: acetato de amonio 50 mM, 7,6 \pm 0,2, conteniendo 2-propanol (VN) al 35%

Solución esterilizante: NaOH 0,5M

Solución de almacenaje: NaOH 0,01 M

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Empaquetamiento de columna

La columna fue empaquetada con resina SOURCE 30 RPC siguiendo las instrucciones de los fabricantes. La columna empaquetada tenía las dimensiones siguientes:

Diámetro: 22 mm

Altura del lecho: 13-14 cm

Volumen del lecho: 49,4-53,2 mL

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Procedimiento de purificación Preparación del material de partida

El intermedio de después de la HIC fue cargado en la columna en 2-propanol al 13% (V/V).

Toda la operación fue realizada a:

Temperatura: temperatura ambiente (+20 \pm 5ºC)

Caudal lineal: 300-450 cm/horas

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Esterilización de columna

La columna fue aclarada con al menos 1 BV de NaOH 0,5 M y con 6 BV de agua purificada.

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Equilibrado de columna

La columna fue aclarada con 7-10 BV o más del tampón de equilibrio, acetato de amonio 50 mM, pH 7,6 \pm 0,2, conteniendo 2-propanol al 13% (VN).

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Carga

El material de partida r-hFSH después de HIC preparado como antes fue cargado en la columna.

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Lavado después de carga

Cuando la carga de la muestra fue completada, la columna fue aclarada con 7-10 BV del tampón de equilibrio.

Las muestras fueron retiradas para IPC (5 x 0,5 mL), y la fracción fue desechada.

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Elución

La elución fue comenzada con tampón de elución.

La r-hFSH comenzó a eluirse como un pico principal después de 0,5-0,8 BV desde el principio. 5-7 BV del pico principal fueron recogidos comenzando cuando los valores de absorbancia (280 nm) aumentaban, según el perfil cromatográfico representado en la Figura 6. Después de que la colección fue completada, la solución fue diluida 1:2 con agua purificada para reducir el porcentaje de 2-propanol en contacto con r-hFSH.

Las muestras fueron retiradas para IPC (5 x 0,5 mL) y fueron almacenadas a +5 \pm 3ºC durante no más de un día.

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Esta fracción contenía r-hFSH purificada.

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Regeneración de columna

Después de que la elución fue completada la columna fue aclarada con al menos 3 BV del tampón de regeneración.

Las muestras fueron retiradas para la IPC (5 x 0,5 mL), y la fracción fue desechada.

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Esterilización

La columna fue aclarada con al menos 1-2 BV de agua seguido de 3 BV de NaOH 0,5M, el flujo fue parado durante 1 hora, y la columna fue aclarada entonces con 6 BV de agua purificada.

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Almacenaje

La columna fue aclarada con al menos 3 BV de la solución de almacenaje, NaOH 0,01 M y fue almacenada hasta el siguiente ciclo.

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Etapa (5)

Ultrafiltración a granel Equipo

\bullet: 1 Vivaflow 200 PES, RC o Hydrosart de tamaño de poro 5KD (Sartorius)

\bullet: Bomba peristáltica (tipo Masterflex L/S)

\bullet: Espectrofotómetro UV (tipo Shimadzu o equivalente)

\bullet: pH-metro (tipo Toledo Mettler o equivalente)

\bullet: Conductímetro (tipo Metrohm o equivalente)

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Materiales

\bullet: Eluato r-hFSH-HIC

\bullet: Peletes de hidróxido de sodio (NaOH) -Merck.

\bullet: Agua purificada por Modulab o equivalente

\bullet: Nitrógeno (presión de operación: 3 bares; (3 x 10^{5} Pa))- grado UPP.

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Tampones

Solución de diafiltración: la ultrafiltración de la r-hFSH fue realizada usando agua purificada.

Solución esterilizante: NaOH 0,5 M

Solución de almacenaje: NaOH 0,05 M

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Procedimiento

Todas las operaciones fueron realizadas en un cuarto fresco (+5 \pm 3ºC).

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Ultrafiltración

La solución del eluato de r-hFSH-HIC fue recirculada en el sistema Vivaflow y fue concentrada a un volumen menor que 20 mL.

La fracción concentrada fue diluida con 4 volúmenes de agua purificada y fue concentrada hasta < 20 mL.

La etapa de lavado fue repetida como se describe, 5-7 veces más.

El pH y la conductividad del impregnado fueron 7,1 \pm 0,2 y 6,2 \pm 0,5 mS/cm respectivamente. Si estaban fuera de estos valores, la etapa de lavado se repetía.

pH del impregnado = 7,1 \pm 0,2 - Conductividad del impregnado = 6,2 \pm 0,5 mS/cm

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La fracción concentrada fue recuperada en un volumen adecuado para obtener una concentración final de r-hFSH por OD (280 nm) de aproximadamente 0,5-0,7 mg/mL. Las muestras fueron retiradas (10 x 0,5 mL) para su análisis. Ambas muestras y el granel fueron almacenados a -20ºC.

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Etapa (6)

Etapa de nanofiltración para la eliminación de virus Materiales y equipo

\bullet: Solución del intermedio de r-hFSH (después de DEAE o después de RPC ultrafiltrado);

\bullet: Prefiltros de 47 mm de tamaño del tipo Fluorodine II FTKDJL (Pall) o VVLP 0,1 \mu (Millipore);

\bullet: Filtros de 47 mm de tamaño del tipo NFP (Millipore) o DV20 (Pall);

\bullet: Agua purificada;

\bullet: Indicadores de pH de papel;

\bullet: Hidróxido de sodio;

\bullet: Fuente de nitrógeno regulada;

\bullet: Sistema de filtración de acero inoxidable completo (Millipore);

\bullet: Silicios y tubo tygon.

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Tampones

Solución esterilizante: NaOH 0,5 M

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Procedimiento

Todas las operaciones fueron realizadas a temperatura ambiente (+23 \pm 3ºC)

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Nanofiltración

El sistema se rellenó con rFSH después de DEAE o después de RPC ultrafiltrada, prefiltrada en filtros de 0,1 \mu. Al principio de la filtración la entrada de nitrógeno fue abierta hasta una presión inicial de 0,5 bares (5 x 10^{4} Pa) y la válvula del respiradero localizada en el sostenedor del disco fuera abierta a fin de purgar el sistema.

Tan pronto como la primera gota de solución apareció, la válvula del respiradero del sostenedor del disco fue cerrada y la presión de nitrógeno fue aumentada a 2,3-2,8 bares (2,3-2,8 x 10^{5} Pa).

La presión de nitrógeno fue mantenida en 2,3-2,8 bares (2,3-2,8 x 10^{5} Pa) y la solución fue filtrada.

Las condiciones de operación son resumidas a continuación:

2

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Actividad biológica de las muestras

La actividad biológica de rhFSH purificada fue medida usando el método de ganancia de peso ovárico de Steelman-Pohley. La actividad específica fue calculada usando la actividad biológica dividida por el contenido de proteína como se determina por la absorbancia a 280 nm (asumiendo que \varepsilon = 9,95 M^{-1} cm^{-1}), y también usando la actividad biológica dividido por el contenido de proteína como se determina por el método de Lowry. La actividad específica de la rhFSH a granel purificada se muestra en la Tabla 1.

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TABLA 1 Actividad específica de rhFSH a granel purificada de la invención

3

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<110> APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V

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<120> Purificación de FSH

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<130> WO 893

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<160> 5

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 92

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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4

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<210> 2

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<211> 111

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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5

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<210> 3

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<211> 108

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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6

7

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<210> 4

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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8

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<210> 5

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<211> 110

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

9

Claims

1. Un método para purificar la FSH humana recombinante o una variante de FSH que comprende las etapas de someter FSH a:

(2) cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados;

(2a) cromatografía de intercambio iónico realizada con una resina de intercambio aniónico débil; y

(3) cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC).

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2. El método de la reivindicación 1, en el que la resina de intercambio aniónico fuerte es Q Sepharose FF, o una resina que tenga propiedades similares.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la cromatografía de intercambio iónico (i) se realiza usando tampón borato como eluyente.

4. El método de la reivindicación 3, en el que el tampón borato está a un pH de 8,5, o aproximadamente 8,5.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados se realiza con una resina que tiene grupos quelantes tridentados.

6. El método de la reivindicación 5, en el que los grupos quelantes son ácido iminodiacético.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados se realiza con Sepharose FF quelante, o una resina que tenga propiedades similares.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados se realiza con un ión metálico seleccionado de Cu^{2+}, Zn^{2+}, Ni^{2+}, Ca^{2+}, Mg^{2+} y Co^{2+}.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados se realiza con Cu^{2+}.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados se realiza usando acetato de amonio como eluyente.

11. El método de la reivindicación 10, en el que el tampón acetato de amonio tiene un pH de 9, o aproximadamente 9.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la resina de intercambio aniónico débil es la resina DEAE Sepharose FF, o una resina que tenga propiedades similares.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) se realiza usando Fenil Sepharose FF HS, o una resina que tenga características similares.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la cromatografía de interacción hidrófoba se realiza usando acetato de amonio (50 mM)/sulfato de amonio (0,25 M) como eluyente.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende además una etapa de cromatografía de fase inversa (4), realizada después de la etapa de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC).

16. El método de la reivindicación 15, en el que la fase de cromatografía inversa se realiza usando Source 30 RPC como resina, o una resina que tenga características similares.

17. El método de la reivindicación 16, en el que la cromatografía de fase inversa se realiza usando acetato de amonio 50 mM, pH a 7,6, o aproximadamente 7,6, con 2-propanol al 20% (v/v).

18. El método de la reivindicación 15, 16 ó 17, que comprende una etapa de ultrafiltración (5), realizada después de la etapa de cromatografía de fase inversa.

19. Un método para purificar FSH recombinante humana que comprende las etapas de someter FSH a:

(1): ultrafiltración;

(2): cromatografía de intercambio aniónico en Q Sepharose FF con borato a 50 mM, o aproximadamente a 50 mM, con NaCl 0,13 M, o aproximadamente a 0,13 M, pH a 8,5, o aproximadamente a 8,5, como eluyente;

(3): someter el eluato de la etapa (1) a una etapa de cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados en Sepharose ff quelante, con Cu^{2+} como ión metálico, y acetato de amonio 0,75 M o, aproximadamente a 0,75 M, pH a 9, o aproximadamente a 9, como eluyente;

(2a): someter el eluato de la etapa (2) a una etapa de cromatografía de intercambio aniónico en DEAE Sepharose FF, con acetato de amonio 0,11 M, o aproximadamente a 0,11 M, pH a 8,5, o aproximadamente a 8,5, como eluyente;

(3): someter el eluato de la etapa (2a) a una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba en Fenil Sepharose FF HS con acetato de amonio 50 mM, o aproximadamente a 50 mM, sulfato de amonio 0,25 M, o aproximadamente a 0,25 M, pH a 8,25, o aproximadamente a 8,25, como eluyente;

(4): someter el eluato de la etapa (3) a una etapa de cromatografía de fase inversa en Source 30 RFC, con acetato de amonio 50 mM, o aproximadamente a 50 mM, pH a 7,6, o aproximadamente a 7,6, con 2-propanol al 20% (v/v), o aproximadamente al 20%;

(5): someter el eluato de la etapa (4) a una etapa de ultrafiltración; y

(6): someter el concentrado de la etapa (5) a una etapa de nanofiltración.