CN118063586A - 一种人碱性成纤维细胞生长因子的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人碱性成纤维细胞生长因子的制备方法，所述制备方法包括：培养表达人碱性成纤维细胞生长因子的宿主细胞，诱导所述宿主细胞表达人碱性成纤维细胞生长因子，破碎细胞并收集沉淀，获得粗蛋白，对粗蛋白进行纯化回收所述人碱性成纤维细胞生长因子；所述纯化包括依次进行第一层析和第二层析，所述第一层析的填料包括苯基琼脂糖凝胶等，所述第二层析的填料包括DEAE琼脂糖凝胶等。本发明针对人碱性成纤维细胞生长因子，设计全新的发酵及纯化工艺，有效提高了目标蛋白的纯度，降低了内毒素含量，纯度可达95％以上，内毒素含量低于10EU/mg，适合规模化工业生产。

Description

一种人碱性成纤维细胞生长因子的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种人碱性成纤维细胞生长因子的制备方法。

背景技术

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors，FGFs)家族的一个成员，1986年Abraham获得了bFGF的一级结构以及cDNA序列。人类基因组仅有一个bFGF基因拷贝，定位在染色体4q 26-27。基因大小约40kb，编码序列由3个外显子组成，由两个内含子分隔。上游选择性的起始密码CUG起始翻译分子量从18kD到25kD大小不等的异形体。18kD形式的bFGF分布在细胞质，介导细胞迁移以及整合素α5、α6和β1表达。而22kD～25kD形式定位在细胞核，促进细胞生长。bFGF翻译后的前体由155个氨基酸残基组成，分子量为18kD，其成熟肽含146个氨基酸残基，其中包含大量的碱性氨基酸残基，等电点pI为9.6。bFGF的二级结构为由12个β折叠组成，有4个半光氨酸残基，但没有分子内二硫键形成。bFGF是细胞生长和分化的重要调节因子，具有促血管生成、细胞增殖、细胞趋化和细胞迁移等活性，在细胞分化和机体发育过程中发挥重要作用。

bFGF可在原核表达系统中进行表达，但bFGF在大肠杆菌中的可溶性表达不高，这是由于bFGF容易降解且大多数还以包涵体的形式存在，使得bFGF的大规模制备变得繁琐、昂贵，从一定程度上限制了该蛋白的广泛应用，此外，原核蛋白表达系统以大肠杆菌表达系统为代表，缺点主要是蛋白质翻译后缺乏加工机制，如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠，和表达产物分离纯化复杂，得到具有生物活性的蛋白的几率较小，需要复性，成本高，周期长。在超声破碎后产生内毒素需要特殊工艺去除，去除的同时可能会影响蛋白纯度和活性，纯化工艺要求高。

综上所述，开发有效的碱性成纤维细胞生长因子制备方法对于碱性成纤维细胞生长因子的应用具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种人碱性成纤维细胞生长因子的制备方法，以期实现高效制备高纯度、高活性、低内毒素含量的人碱性成纤维细胞生长因子(野生型或重组)。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种人碱性成纤维细胞生长因子的制备方法，所述制备方法包括：

培养表达人碱性成纤维细胞生长因子的宿主细胞，诱导所述宿主细胞表达人碱性成纤维细胞生长因子，破碎细胞并收集沉淀，获得粗蛋白，对粗蛋白进行纯化回收所述人碱性成纤维细胞生长因子；所述纯化包括依次进行第一层析和第二层析，所述第一层析的填料包括苯基琼脂糖凝胶、丁基琼脂糖凝胶、正丁烷基琼脂糖凝胶或正辛烷基琼脂糖凝胶中任意一种或至少两种的组合，所述第二层析的填料包括DEAE琼脂糖凝胶、Q琼脂糖凝胶或QAE琼脂糖凝胶中任意一种或至少两种的组合。

本发明中，巧妙设计人碱性成纤维细胞生长因子的纯化过程，利用苯基琼脂糖凝胶填料层析和DEAE琼脂糖凝胶填料等层析两步层析协同配合，实现显著提高蛋白纯度的同时，又有效降低内毒素含量，适合实验室工艺至工业生产级别的工艺放大；所用层析填料载量、流速快、填装简单，柱效高，易于清洗、消毒及再生，所以填料寿命长久，适合规模化工业生产。

可以理解，本发明针对人碱性成纤维细胞生长因子设计细胞培养和纯化工艺，可针对任意野生型或重组人碱性成纤维细胞生长因子，本领域能够表达表达人碱性成纤维细胞生长因子的宿主细胞，如大肠杆菌等，均可应用于本发明方法，无需特殊限制。

可以理解，本发明中所述苯基琼脂糖凝胶和DEAE琼脂糖凝胶等是本领域公知的Sepharose(琼脂糖)凝胶类层析填料，如Phenyl Sepharose^TM6FF(HS)(Cytiva，17097303)和DEAE Sepharose^TMFF(Cytiva，17070905)等等，本领域技术人员能够知晓，并选择市售的同类型的层析填料。

优选地，所述纯化后还包括复性的步骤。

优选地，所述复性包括进行第三层析，所述第三层析的填料包括SP琼脂糖凝胶XL。

本发明中，进一步设计针对人碱性成纤维细胞生长因子的复性方法，利用SP琼脂糖凝胶XL填料进行层析，避免了一般复性过程中蛋白质聚体的形成，复性得率更高，同时能够进一步提高目的蛋白的纯度(95％以上)并降低内毒素含量(10EU/mg以下)。

优选地，所述第一层析具体包括：

使用苯基琼脂糖凝胶、丁基琼脂糖凝胶、正丁烷基琼脂糖凝胶或正辛烷基琼脂糖凝胶中任意一种或至少两种的组合装层析柱，利用第一平衡缓冲液冲洗层析柱，上样，利用第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓冲液混合冲洗杂蛋白至基线平稳，再利用第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓冲液混合洗脱目的蛋白。

优选地，所述第一平衡缓冲液含有三羟甲基氨基甲烷(Tris)、尿素(Urea)、EDTA、NaCl和硫酸铵。

优选地，所述第一平衡缓冲液含有终浓度为40～60mM Tris、终浓度为5～7M尿素；终浓度为4～6mM EDTA、400～600mM NaCl和400～600mM硫酸铵。

优选地，所述第一洗脱缓冲液含有精氨酸、Tris、尿素和EDTA。

优选地，所述第一洗脱缓冲液含有终浓度为170～230mM精氨酸、终浓度为40～60mM Tris、终浓度为3～9mM EDTA和终浓度为5～7M尿素。

优选地，所述第二洗脱缓冲液含有精氨酸、Tris、尿素、EDTA和NaCl。

优选地，所述第二洗脱缓冲液含有终浓度为170～230mM精氨酸、终浓度为40～60mM Tris、终浓度为3～9mM EDTA、终浓度为5～7M尿素、终浓度为0.8～1.2M NaCl。

优选地，所述冲洗杂蛋白包括按体积百分比为100％计使用15％～25％第一洗脱缓冲液和75％～85％第二洗脱缓冲液混合。

优选地，所述洗脱包括按体积百分比为100％计使用65％～75％第一洗脱缓冲液和25％～35％第二洗脱缓冲液混合。

优选地，所述第二层析具体包括：

使用DEAE琼脂糖凝胶、Q琼脂糖凝胶或QAE琼脂糖凝胶中任意一种或至少两种的组合装层析柱，利用第二平衡缓冲液冲洗层析柱，上样，利用第三洗脱缓冲液和第四洗脱缓冲液混合冲洗杂蛋白至基线平稳，再利用第三洗脱缓冲液和第四洗脱缓冲液混合洗脱目的蛋白。

优选地，所述第二平衡缓冲液含有Tris和尿素。

优选地，所述第二平衡缓冲液含有终浓度为40～60mM Tris、终浓度为5～7M尿素。

优选地，所述第三洗脱缓冲液含有Tris和尿素。

优选地，所述第三洗脱缓冲液含有终浓度为40～60mM Tris、终浓度为5～7M尿素。

优选地，所述第四洗脱缓冲液含有Tris、尿素和NaCl。

优选地，所述第四洗脱缓冲液含有终浓度为40～60mM Tris、终浓度为5～7M尿素和终浓度为0.8～1.2M NaCl。

优选地，所述冲洗杂蛋白包括按体积百分比为100％计使用80％～90％第三洗脱缓冲液和10％～20％第四洗脱缓冲液混合。

所述洗脱包括按体积百分比为100％计使用60％～70％第三洗脱缓冲液和30％～40％第四洗脱缓冲液混合。

优选地，所述第三层析具体包括：

使用SP琼脂糖凝胶XL装层析柱，利用第三平衡缓冲液冲洗层析柱，上样，利用复性缓冲液进行复性冲洗，利用第五洗脱缓冲液和第六洗脱缓冲液混合冲洗杂蛋白至基线平稳，再利用第五洗脱缓冲液和第六洗脱缓冲液混合洗脱目的蛋白。

优选地，所述第三平衡缓冲液含有乙酸钠、精氨酸和尿素。

优选地，所述第三平衡缓冲液含有终浓度为90～110mM乙酸钠、90～110mM精氨酸和7～9M尿素。

优选地，所述复性缓冲液含有EDTA、乙酸钠、聚乙二醇、精氨酸和2-环己胺基乙磺酸。

优选地，所述复性缓冲液含有终浓度为0.5～2mM EDTA，20～80mM乙酸钠、3～8g/L聚乙二醇2000，100～200mM精氨酸、100～200mM CHES(2-环己胺基乙磺酸)。

优选地，所述第五洗脱缓冲液含有乙酸钠和精氨酸。

优选地，所述第五洗脱缓冲液含有终浓度为20～40mM乙酸钠、100mM精氨酸。

优选地，所述第六洗脱缓冲液含有乙酸钠、精氨酸和NaCl。

优选地，所述第六洗脱缓冲液含有终浓度为20～40mM乙酸钠、90～110mM精氨酸、终浓度为0.8～1.2M NaCl。

优选地，所述冲洗杂蛋白包括按体积百分比为100％计使用80％～90％第五洗脱缓冲液和10％～20％第六洗脱缓冲液混合。

优选地，所述洗脱包括按体积百分比为100％计使用40％～60％第五洗脱缓冲液和40％～60％第六洗脱缓冲液混合。

优选地，所述培养包括菌种复苏和发酵培养。

优选地，所述菌种复苏包括依次进行一级种子培养和二级种子培养。

优选地，所述二级种子培养的培养基含有胰蛋白胨、酵母粉和NaCl。

优选地，所述发酵培养的条件包括：

温度为36～38℃，pH值为6.8～7.2，DO串联转速维持DO≥30％，当OD₆₀₀为7以上、溶氧升速(DO Spike)且pH升高≥0.1单位/min，进行补料，第1h流速95～105mL/h，随后调节流速100～200mL/h，通气量自动调节以维持30-40％的DO。

本发明中设计高密度发酵培养条件，有助于提高蛋白制备量。

优选地，所述发酵培养的条件包括：

培养设定37℃，搅拌速度100～300rpm，通气量30L/min左右自动调节，通过系统自动流加氨水或2M H₂SO₄调节pH，维持培养体系pH值在7.0左右。0-5h温度步控37.00+0.05℃、pH 7.0+0.05、罐压0.05MPa，通气量20～40L/min，DO串联转速(200～600rpm)维持DO≥30％，直至转速达到600rpm后恒定转速直至发酵结束。发酵前5h DO在30％左右，5h后当OD₆₀₀此时在7以上，DO Spike，pH升高≥0.1单位/min，开始补料，此时培养基中的碳源基本耗尽，第1h流速100mL/h，后根据菌体生长状况调节流速100～200mL/h，通气量自动调节以维持30-40％的溶氧。

优选地，所述发酵的基础培养基含有16g/L胰蛋白胨、10g/L酵母粉、6g/L NaCl、40g/L葡萄糖、2g/L KH₂PO₄、4g/L K₂HPO₄、7g/L Na₂HPO₄·12H₂O、1.2g/L(NH₄)₂SO₄、0.2g/LNH₄Cl、1g/L MgSO₄·7H₂O。

优选地，所述补料培养基含有70g/L葡萄糖、83g/L酵母、83g/L胰蛋白胨和6.7g/LMgSO₄·7H₂O。

优选地，所述二级种子培养的培养基中含有10～20g/L胰蛋白胨(进一步优选为13～17)、5～11g/L酵母粉(进一步优选为9～11)和3～7g/L NaCl(进一步优选为4～6)。

本发明设计特定的二级种子培养基，能够显著提高菌株的生产速度，实现快速复苏。

优选地，所述诱导的诱导剂包括异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。

优选地，所述的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的工作浓度为1～25mM，优选为1～3mM，进一步优选为0.8～1.2mM，优选为1mM。

本发明中，对IPTG浓度进行设置实现提高产量的同时又节约成本。

优选地，诱导的开始时间为发酵培养18h。

优选地，所述诱导的温度为36～43℃，优选为37～42℃，进一步优选为41.5～42.5℃，优选为42℃。

本发明中，发明再诱导时控制特定的温度，能够使得菌体生长维持较长时间，有利于生物量的积累。

优选地，所述诱导的时间为2～5h，例如可以是2.5h、3h、3.5h、4h或4.5h等。

优选地，所述收集沉淀后还包括提取包涵体的步骤。

优选地，所述提取包涵体包括将收集到的沉淀与包涵体溶解液混合，收集上清液，得到包涵体溶液。

本发明中，利用包含盐酸胍的包涵体溶解液提取包涵体，再经过高速离心后得到的包涵体溶解液的蛋白表达量约占总蛋白量的50％左右，纯度经过简单离心处理，就有了较大提升，适合规模化生产实际操作。

优选地，所述包涵体溶解液含有Tris、NaCl、EDTA和盐酸胍。

优选地，所述包涵体溶解液中含有50mM Tris、500mM NaCl、5mM EDTA和6M盐酸胍。

作为优选的技术方案，所述人碱性成纤维细胞生长因子的制备方法包括以下步骤：

(1)取表达人碱性成纤维细胞生长因子的宿主细胞进行进行一级种子培养和二级种子培养以及发酵培养，利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导所述宿主细胞表达人碱性成纤维细胞生长因子；

(2)破碎细胞，收集沉淀并与包涵体溶解液混合，收集上清液，获得粗蛋白，对粗蛋白进行第一层析，使用苯基琼脂糖凝胶、丁基琼脂糖凝胶、正丁烷基琼脂糖凝胶或正辛烷基琼脂糖凝胶中任意一种或至少两种的组合装层析柱，利用第一平衡缓冲液冲洗层析柱，上样，利用第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓冲液混合冲洗杂蛋白至基线平稳，再利用第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓冲液混合洗脱目的蛋白；所述包涵体溶解液含有Tris、NaCl、EDTA和盐酸胍，所述第一平衡缓冲液含有Tris、尿素、EDTA、NaCl和硫酸铵，所述第一洗脱缓冲液含有精氨酸、Tris、尿素和EDTA，所述第二洗脱缓冲液含有精氨酸、Tris、尿素、EDTA和NaCl；

(3)对步骤(2)收集产物进行第二层析，使用DEAE琼脂糖凝胶、Q琼脂糖凝胶或QAE琼脂糖凝胶中任意一种或至少两种的组合装层析柱，利用第二平衡缓冲液冲洗层析柱，上样，利用第三洗脱缓冲液和第四洗脱缓冲液混合冲洗杂蛋白至基线平稳，再利用第三洗脱缓冲液和第四洗脱缓冲液混合洗脱目的蛋白，所述第二平衡缓冲液含有Tris和尿素，所述第三洗脱缓冲液含有Tris和尿素，所述第四洗脱缓冲液含有Tris、尿素和NaCl；

(4)对步骤(3)收集产物进行第三层析，使用SP琼脂糖凝胶XL装层析柱，利用第三平衡缓冲液冲洗层析柱，上样，利用复性缓冲液进行复性冲洗，利用第五洗脱缓冲液和第六洗脱缓冲液混合冲洗杂蛋白至基线平稳，再利用第五洗脱缓冲液和第六洗脱缓冲液混合洗脱目的蛋白，所述第三平衡缓冲液含有乙酸钠、精氨酸和尿素，所述复性缓冲液含有EDTA、乙酸钠、聚乙二醇、精氨酸和2-环己胺基乙磺酸，所述第五洗脱缓冲液含有乙酸钠和精氨酸，所述第六洗脱缓冲液含有乙酸钠、精氨酸和NaCl。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明针对人碱性成纤维细胞生长因子，设计全新的发酵及纯化工艺，包括设计高密度发酵条件，实现高密度发酵，控制诱导条件，进一步提高蛋白产量并节约成本，以及设计两步协同的纯化工艺以及特定的复性工艺，有效提高了目标蛋白的纯度，降低了内毒素含量，节约了生产成本，适合实验室工艺至工业生产级别的工艺放大；适合规模化工业生产。

附图说明

图1为菌体发酵生长曲线图；

图2为不同温度下诱导后菌体蛋白SDS-PAGE胶图；

图3为不同浓度诱导剂诱导后菌体蛋白SDS-PAGE胶图；

图4为高密度发酵及纯化操作流程示意图；

图5为诱导前后菌株的菌体蛋白SDS-PAGE胶图；

图6为包涵体溶解液和超声破碎后的菌体的SDS-PAGE胶图；

图7为使用Phenyl Sepharose^TM6FF层析过程图；

图8为使用Phenyl Sepharose^TM6FF层析获得蛋白的SDS-PAGE胶图；

图9为实施例5中使用DEAE Sepharose^TMFF层析过程图；

图10为实施例5中使用DEAE Sepharose^TMFF层析获得蛋白的SDS-PAGE胶图；

图11为实施例5中纯化步骤一、纯化步骤二获得蛋白的纯度以及内毒素含量结果图；

图12为对比例2中使用DEAE Sepharose^TMFF层析获得蛋白的SDS-PAGE胶图；

图13为使用SP Sepharose XL层析过程图；

图14为使用SP Sepharose XL层析获得蛋白的SDS-PAGE胶图；

图15为不同复性方法结果对比图；

图16为最终回收蛋白的SDS-PAGE胶图；

图17为冷冻干燥后蛋白图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

本发明具体实施例中使用的设备如表1所示。

表1

本发明具体实施例中以表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)为例，验证本发明的制备方法。

重组人碱性成纤维细胞生长因子(命名为CBDbFGF，理论等电点是9.69，理论分子量19271.99)的氨基酸和核酸序列如下所示：

M G T K K T L R T G T G S A G S A A G S G G V D A A G S I T T L P A LP E D G G S G A F P P G H F K D P K R L Y C K N G G F F L R I H P D G R V D GV R E K S D P H I K L Q L Q A E E R G V V S I K G V C A N R Y L A M K E D G RL L A S K C V T D E C F F F E R L E S N N Y N T Y R S R K Y T S W Y V A L K RT G Q Y K L G S K T G P G Q K A I L F L P M S A K S；

atgggtactaagaaaaccctgcgtactggtaccggtagcgcgggcagtgctgcgggttctggcggtgtcgacgcagccgggagcatcaccacgctgcccgccttgcccgaggatggcggcagcggcgccttcccgcccggccacttcaaggaccccaagcggctgtactgcaaaaacgggggcttcttcctgcgcatccaccccgacggccgagttgacggggtccgggagaagagcgaccctcacatcaagctacaacttcaagcagaagagagaggagttgtgtctatcaaaggagtgtgtgctaaccgttacctggctatgaaggaagatggaagattactggcttctaaatgtgttacggatgagtgtttcttttttgaacgattggaatctaataactacaatacttaccggtcaaggaaatacaccagttggtatgtggcactgaaacgaactgggcagtataaacttggatccaaaacaggacctgggcagaaagctatactttttcttccaatgtctgctaagagctga。

实施例1

种子菌制备

1.甘油菌种：将存于-80℃表达CBDbFGF的E.coli BL21(DE3)甘油菌种于25℃解冻(种子菌保存于15％甘油中制备甘油保藏菌，冻存-80℃)。

2.平板单克隆：三步划线法接种至LB-卡那霉素平板，37℃培养过夜长单克隆。

3.一级种子：平板单克隆菌转接10mL 2YT(卡那霉素50μg/mL)，37℃，200rpm，培养13h。

4.二级种子：7％一级种子菌转接100mL 2YT培养基(卡那霉素50μg/mL)，37℃，200rpm，培养13h

(试剂1)种子菌培养基配方：配制量1L，称取15g胰蛋白胨、10g酵母粉、5gNaCl；加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解；滴加1N KOH，调节pH值至7.0；加去离子水将培养基定容至1L；高温高压后，常温保存。

种子菌培养基配方的优化：

A型种子菌培养基1L配方组成及用量为：15g胰蛋白胨、10g酵母粉、5gNaCl，水溶灭菌。

B型种子菌培养基1L配方组成及用量为：15g胰蛋白胨、10g酵母粉、15gNaCl，水溶灭菌。

C型种子菌培养基1L配方组成及用量为：10g胰蛋白胨、5g酵母粉、10gNaCl，水溶灭菌。

D型种子菌培养基1L配方组成及用量为：10g胰蛋白胨、5g酵母粉、5gNaCl，水溶灭菌。

检测二级种子在4种种子菌培养基中不同时间点的OD₆₀₀值。注意每个时间点的数据均由3组平行样本的平均值获得，结果如表2所示，A型种子菌培养基可以促进细菌生长得更快，而B、C、D型种子菌培养基相对较慢，所以优选A型种子菌培养基。

表2

	0.5h	3h	6h	9h	12h	15h
							A	0.121	0.234	0.538	0.954	1.641	2.193
B	0.119	0.258	0.465	0.845	1.218	1.657
							C	0.130	0.263	0.499	0.876	1.306	1.792
D	0.127	0.229	0.329	0.624	0.847	1.324

实施例2

发酵罐准备

1.发酵罐灭菌：总体积14L，装液量8L，灭菌前加入1mL消泡剂、校正pH电极，配制前通电极化pH和DO电极≥6h，标定pH 6.86-4.01(斜率为1.0左右)，断电标定DO零点。

2.配制前通电极化pH和DO电极≥6h，标定pH 6.86-4.01(斜率为1.0左右)，断电标定DO零点。

3.校准2M H₂SO₄补料瓶-酸泵和氨水补料瓶-碱泵的流速。

4.将基本培养基各组分溶于7.5L水中，调pH至6.8，定容至8L，转移至发酵罐中，添加1mL消泡剂。

5.安装电极、空气过滤器、供气导管和尾气导管(末端包裹16层纱布和4层报纸)，密封罐盖、补料口、供气导管、取样管，用锡箔纸给电极接头和转轴防水，121℃×20min灭罐。

冷却至25℃后，安装发酵罐时依次供气、供冷凝水、通电(电机、温度探头、pH电极和DO电极)，设定转速200rpm，恒温37℃，连接酸/碱补料瓶并排气。

6.37℃、200rpm、5L/min通气量、罐压0.05MPa时，用酸/碱调节pH 6.80+0.05，标定饱和DO，斜率＜5，且越小偏差越小。

(试剂2)基本培养基(1L)：

称取16g胰蛋白胨、10g酵母粉、6g NaCl、40g葡萄糖、2g KH₂PO₄、4g K₂HPO₄、7gNa₂HPO₄·12H₂O、1.2g(NH4)₂SO₄、0.2g NH₄Cl、1g MgSO₄·7H₂O，加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解；滴加1N KOH，调节pH值至7.0；加水离子水将培养基定容至1L；高温高压后，常温保存。

(试剂3)补料培养基1L配方组成及用量为：70g葡萄糖、83g酵母、83g胰蛋白胨、6.7g MgSO₄·7H₂O。

实施例3

本实施例设计诱导条件。

诱导温度的选择

将二级种子菌按8％接种量接种至发酵罐内，接种前加卡那霉素10mL(终浓度50μg/mL)，全程无菌操作；发酵罐培养设定37℃，搅拌速度100～300rpm，通气量30L/min左右自动调节，通过系统自动流加氨水或2M H₂SO₄调节pH，维持培养体系pH值在7.0左右。0～5h温度步控37.00+0.05℃、pH7.0+0.05、罐压0.05MPa，通气量20～40L/min。DO串联转速(200～600rpm)维持DO≥30％，直至转速达到600rpm后恒定转速直至发酵结束。发酵前5h DO在30％左右，5h后当OD₆₀₀此时在7以上，DO Spike，pH升高≥0.1单位/min，开始补料，此时培养基中的碳源基本耗尽，第1h流速100mL/h，后根据菌体生长状况调节流速100-200mL/h，通气量自动调节以维持30-40％的溶氧，定时补加消泡剂。对数期是大约从6h至第18h结束，期间DO调至40％左右。发酵的第16h后，OD₆₀₀在50以上。根据图1所示菌体发酵生长曲线，18h以后，细菌生长进入延滞期，不再处于对数生长期，细菌活力下降，死菌数目增加，菌体密度开始逐渐下降。由于菌体密度对蛋白表达量有较大影响，需在菌体保持高密度下诱导效率最高，所以优选诱导时间为4h。同时我们发现适当调高培养温度对菌体继续保持高密度同时有助于目的蛋白表达量提高。

方案A：发酵的第17h此时需要调整发酵罐温度升温至42℃，温度步控为42.0℃±0.05℃。DO串联转速(200-600rpm)维持DO≥30％，直至转速达到600rpm后恒定转速。稳定0.5h以上后在18h时加1mM IPTG进行诱导蛋白表达，诱导4h后结束收菌。18h后进入诱导蛋白表达期间的菌体生长速度减慢，相应的降低补料速度。在发酵之后的过程中每小时各取一次样，检测生物量(OD₆₀₀、湿重、残糖含量)，将10倍稀释的发酵液制备电泳样品并在发酵结束后进行电泳检测表达水平。对数中后期OD₆₀₀在60以上，整个发酵过程可在24h内完成，结束时生物量累积至OD₆₀₀在50以上。

方案B：发酵的第17h此时不调整发酵罐温度继续保持37℃，温度步控为37.0℃±0.05℃。DO串联转速(200～600rpm)维持DO≥30％，直至转速达到600rpm后恒定转速。在18h时加1mM IPTG进行诱导蛋白表达，诱导4h后结束收菌。18h后进入诱导蛋白表达期间的菌体生长速度减慢，相应的降低补料速度。在发酵之后的过程中每小时各取一次样，检测生物量(OD₆₀₀、湿重、残糖含量)，将10倍稀释的发酵液制备电泳样品并在发酵结束后进行电泳检测表达水平。对数中后期OD₆₀₀在40以上。

方案A和B，在整个发酵过程中每小时取一次罐体内菌体样本，检测OD₆₀₀，连续取24h对比结果，如图1所示，发现18h菌体生长速度减慢，此时调整发酵罐温度升温至42℃比罐体温度继续保持37℃，菌体生长可以维持较长时间，有利于生物量的积累。图1结果显示培养18h后罐体内样本在42℃时菌体密度高于37℃时菌体密度。诱导后是否意味着42℃时诱导单位体积内蛋白表达量会比37℃时菌体单位体积内蛋白表达量有较大提高，通过SDS-PAGE胶图结果分析证明42℃时诱导蛋白表达量会比37℃时表达量明显提高，如图2所示。

诱导剂浓度的筛选

发酵的第17h此时需要调整发酵罐温度升温至42℃，温度步控为42.0℃±0.05℃。DO串联转速(200-600rpm)维持DO≥30％，直至转速达到600rpm后恒定转速。稳定0.5h以上后在18h时加1mM IPTG进行诱导蛋白表达，诱导4h后结束收菌。18h后进入诱导蛋白表达期：我们设定了0.3mM、1mM、3mM、10mM、25mM四个不同的剂量点。通过取样跑15％SDS-PAGE胶，根据凝胶成像仪拍照结果分析如图3所示0.3mM目的蛋白的表达量略低，而1mM、3mM、10mM、25mM各个剂量点之间差异不明显。综合考虑IPTG价格比较昂贵的，本着保证质量，节约成本，提高产量的原则，我们选择IPTG浓度为1mM是最优性价比参数。

实施例4

本实施例进行高密度发酵及纯化，操作流程如图4所示。

1.接种：将二级种子菌按8％接种量接种于A型种子菌培养基，接种前加卡那霉素10mL(终浓度50μg/mL)，全程无菌操作；

2.发酵：培养设定37℃，搅拌速度100～300rpm，通气量30L/min左右自动调节，通过系统自动流加氨水或2M H₂SO₄调节pH，维持培养体系pH值在7.0左右。0-5h温度步控37.00+0.05℃、pH 7.0+0.05、罐压0.05MPa，通气量20～40L/min，DO串联转速(200～600rpm)维持DO≥30％，直至转速达到600rpm后恒定转速直至发酵结束。发酵前5h DO在30％左右，5h后当OD₆₀₀此时在7以上，DO Spike，pH升高≥0.1单位/min，开始补料，此时培养基中的碳源基本耗尽，第1h流速100mL/h，后根据菌体生长状况调节流速100～200mL/h，通气量自动调节以维持30-40％的溶氧，定时补加消泡剂。对数期是大约从6h至第18h结束，期间DO调至40％左右。发酵的第16h后，OD₆₀₀在50以上。发酵的第17h此时需要调整发酵罐温度升温至42℃，温度步控为42.0℃±0.05℃。DO串联转速(200～600rpm)维持DO≥30％，直至转速达到600rpm后恒定转速。稳定0.5h以上后在18h时加1mM IPTG进行诱导蛋白表达，诱导4h后结束收菌。18h后进入诱导蛋白表达期间的菌体生长速度减慢，相应的降低补料速度。在发酵之后的过程中每小时各取一次样，检测生物量(OD₆₀₀、湿重、残糖含量)，将10倍稀释的发酵液制备电泳样品并在发酵结束后进行电泳检测表达水平。对数中后期OD₆₀₀在60以上，整个发酵过程可在24h内完成，结束时生物量累积至OD₆₀₀在40以上，湿重≥100g/L。发酵产生的尾气经0.22μm膜过滤后外排，整个发酵过程没有环境污染问题。

3.下罐收菌：发酵完成后，无菌操作放出发酵液，经离心(8000rpm4℃，30min)，收集菌体。菌体需用PBS缓冲液洗涤一次，再离心(8000rpm4℃，30min)。

(试剂4)补料培养基1L：70g葡萄糖、83g酵母、83g胰蛋白胨、6.7g MgSO₄·7H₂O、微量元素(1000×)30mL。

(试剂5)500mL无菌补料瓶盛200mL 25％-28％氨水。

(试剂6)稀硫酸50mL浓硫酸缓慢溶于100mL水中，定容至200mL配制成2M H₂SO₄，盛装于500mL无菌补料瓶中。

(试剂7)卡那霉素(浓度为50mg/mL)：过滤除菌，无菌操作分装5mL/15mL离心管，-20℃冻存。

(试剂8)IPTG(浓度为1M)：23.8克溶于100mL水，过滤除菌，无菌操作分装5mL/15mL离心管，-20℃冻存。

验种

1.摇瓶：将二级种子菌按1:1000接种至200mL2YT培养基的1000mL三角瓶，37℃、200rpm培养10h。后再降低培养温度至30℃继续培养10h。

2.制样：将摇瓶菌液取样30μL与2×加样缓冲液(Loading Buffer)等体积混匀，制备诱导前电泳样品；将离心前发酵罐发酵液取样30μL与2×加样缓冲液等体积混匀，制备诱导后电泳样品。

3.电泳：12％分离胶，每泳道点样5μL，电泳至溴酚蓝前沿出胶即可。用去离子水漂洗凝胶后，用快速染色液染色至条带清晰，换去离子水漂洗去除浅蓝色背景后，拍照记录电泳结果。如图5所示，SDS-PAGE检测表明诱导后样品较诱导前样品表达了明显的19kD左右位置的新生条带，则菌种合格。

超声破碎

取一定量发酵菌体按照1:100(m/v)用裂解缓冲液吹打、悬浮，在冰水浴中，使用高压均质机匀浆5min，再在冰水浴中使用超声破碎机破碎菌体，超声破碎参数(5s工作，5s间歇，120min，1000w)，直至菌液不再黏稠；后经染色涂片，镜检，基本无完整菌体后，离心(12000rpm、4℃，30min)收集沉淀。

使用6M盐酸胍的包涵体溶解液200mL溶解沉淀后，再离心(12000rpm 16℃，30min)，得到包涵体溶解液，再经过0.45μm过滤和0.22μm依次过滤后。通过SDS-PAGE电泳分析结果如图6所示，泳道1，2为超声破碎后的菌体，泳道3为包涵体溶解液，可见，目的蛋白表达量约占总蛋白量的20％～30％，并且可以在裂解缓冲液中稳定存在。再经过高速离心后使用6M盐酸胍溶解得到的包涵体溶解液的蛋白表达量约占总蛋白量的50％左右。纯度经过简单离心处理，就有了较大提升，适合规模化生产实际操作。

裂解缓冲液：50mM Tris、200mM精氨酸、5mM EDTA、1mM PMSF；pH 8.3。

包涵体溶解液：50mM Tris，500mM NaCl，5mM EDTA，6M盐酸胍，pH 8.3。

实施例5

本实施例进行纯化。

设备型号：GE公司AKTApilot，层析系统，UNICORN控制系统。

1.纯化步骤一

层析柱1装填规格：柱床体积1L，柱内径100mm。

层析介质1：Phenyl Sepharose^TM6FF(HS)(Cytiva，17097303)。

平衡缓冲液1:终浓度为50mM Tris、终浓度为6M尿素(Urea)；终浓度为5mM EDTA；500mM NaCl；500mM硫酸铵pH 8.3。

Elution buffer(洗脱缓冲液)A1：终浓度为200mM精氨酸、终浓度为50mM Tris、终浓度为5mM EDTA、终浓度为6M尿素；pH 8.3。

洗脱缓冲液B1：终浓度为200mM精氨酸、终浓度为50mM Tris、终浓度为5mM EDTA、终浓度为6M尿素、终浓度为1.0M NaCl；pH 8.3。

Wash Buffer(洗涤缓冲液)A1：终浓度为50mM Tris、终浓度为1.0M NaCl、终浓度为8M尿素；pH 9.0。

洗涤缓冲液B1：50mM乙酸乙酸钠缓冲液、终浓度为1.0M NaCl、终浓度为8M尿素；pH4.0。

洗涤缓冲液C1：终浓度为0.5M NaOH，终浓度为0.5M NaCl。

本发明中设计第一步纯化工艺具有高流速、高载量的优势，且耐受高盐，可以直接将提取物上样至层析柱，目标蛋白结合在层析柱上流穿的纯化模式大大缩短了工艺时间。洗脱缓冲液A1和洗脱缓冲液B1共同线性盐梯度洗脱，使目标蛋白和内毒素初步分离，可以保证去除80％的内毒素。有效降低目标蛋白所含内毒素量。但是仍会有部分内毒素与蛋白一起被洗脱从而不能被去除。并用通过测量在280nm和490nm处的吸光度来监测分离情况。

具体步骤：

1.1将菌体超声破碎后包涵体溶液500mL用平衡缓冲液2000mL稀释至2500mL；

1.2用平衡缓冲液1冲洗柱子3000mL，用于平衡柱子在适当的稳定缓冲体系，流速100mL/min；

1.3对(1.2)处理过的层析拄上样，样品缓冲溶液通过层析柱，流速100mL/min，上样量是2000mLl±100mL。

1.4使用20mL/min的流速80％(体积分数)洗脱缓冲液B1+20％(体积分数)洗脱缓冲液A1冲洗杂蛋白，3个柱体积，直至流出液的基线平稳。

1.5使用20mL/min的流速80％(体积分数)洗脱缓冲液B1+20％(体积分数)洗脱缓冲液A1起始，30％(体积分数)洗脱缓冲液B1+70％(体积分数)洗脱缓冲液A1结束，线性冲洗1个柱体积，洗脱目的蛋白，根据紫外峰图280nm处的吸光度超过50mAU起峰时开始收集，待检测峰回落50mAU至基线附近时停止收集，洗脱时间为15min，手动收集的洗脱液即为目的蛋白，体积约为300mL，层析过程如图7红色箭头所示。通过SDS-PAGE电泳分析结果，如图8所示目的蛋白纯度在70％以上；且通过鲎试剂凝胶法检测收集蛋白的内毒素小于200EU/mg。

1.6层析柱后期保养流程程序：使用100mL/min的流速，用洗涤缓冲液A1和洗涤缓冲液B1交替冲洗层析柱1共3遍，(洗涤缓冲液A1液1.5个柱体积，洗涤缓冲液B1液1.5个柱体积；洗涤缓冲液A1液1.5个柱体积，洗涤缓冲液B1液1.5个柱体积；洗涤缓冲液A1液1.5个柱体积，洗涤缓冲B1液1.5个柱体积)，用洗涤缓冲液C1冲洗亲和层析柱60min以上，洗涤缓冲液C1液1.5个柱体积，停滞30min，再冲洗1.5个柱体积；水洗3个柱体积，20％乙醇液洗1.5个柱体积，流速100mL/min，再生液在柱子中的流动方向与上样、纯化时的样品流向相反，以保证柱效稳定可靠；

1.7最终用50L无菌水，低流速20mL/min冲洗亲和柱及整个系统的各条通路，最终用20％乙醇充盈亲和柱及整个设备管道系统。

2.纯化步骤二

层析介质2：DEAE Sepharose^TMFF(Cytiva，17070905)。

采用的弱阴离子交换层析柱规格：柱床体积1.0L，柱内径100mm

平衡缓冲液2:终浓度为50mM Tris、终浓度为6M尿素；PH8.3。

洗脱缓冲液A2：终浓度为50mM Tris、终浓度为6M尿素；pH 8.3。

洗脱缓冲液B2：终浓度为50mM Tris、终浓度为6M尿素、终浓度为1M NaCl；pH 8.3。

洗涤缓冲液A2：终浓度为1.0M NaOH水溶液。

洗涤缓冲液B2：50mM乙酸乙酸钠缓冲液、终浓度为1.0M NaCl、终浓度为8M尿素；pH4.0。

具体操作：

2.1用平衡缓冲液2，100mL/min的流速冲洗柱子2000mL使其基线洗平。

2.2对1.5步骤收集的样品，使用平衡缓冲液2，1:3(V/V)稀释,也就是说300mL的纯化步骤一的样品，与平衡缓冲液2，900mL进行充分混合，期间使用100mL/min的流速进行上样。

2.3使用20mL/min的流速13％(体积分数)洗脱缓冲液B2+87％(体积分数)洗脱缓冲液A2冲洗杂质，32％(体积分数)洗脱缓冲液B2+68％(体积分数)洗脱缓冲液A2冲洗1个柱体积，洗脱目的蛋白，根据紫外峰图280nm处的吸光度超过50mAU起峰时开始收集，待检测峰回落50mAU至基线附近时停止收集，洗脱时间为20min，手动收集的洗脱液即为目的蛋白，体积约为400mL，层析过程如图9所示。通过SDS-PAGE电泳分析结果，如图10所示目的蛋白纯度在90％以上；且通过鲎试剂凝胶法检测收集蛋白的内毒素小于200EU/mg。

2.4层析柱后期保养流程程序：使用100mL/min的流速，用洗涤缓冲液A2冲洗层析柱2，3个柱体积，水洗3个柱体积，洗涤缓冲液B2液洗3个柱体积)，水洗3个柱体积，20％乙醇液洗1.5个柱体积，流速100mL/min，再生液在柱子中的流动方向与上样、纯化时的样品流向相反，以保证柱效稳定可靠；

2.4最终用50L无菌水，低流速20mL/min冲洗亲和柱及整个系统的各条通路，最终用20％乙醇充盈亲和柱及整个设备管道系统。

本发明设计第二步纯化工艺，与第一步协同配合，仅需将样品过一遍DEAESepharose^TMFF，就能使纯度从70％提高至90％，而且极大的降低了蛋白的内毒素含量，从200EU/mg以上，降低至20EU/mg(图11)。

实施例6

本实施例进行纯化。

与实施例5相比，区别仅在于：

层析介质1：丁基琼脂糖凝胶(Cytiva,17097803)。

平衡缓冲液1:终浓度为40mM Tris、终浓度为7M尿素(Urea)；终浓度为6mM EDTA；400mM NaCl；600mM硫酸铵。

Elution buffer(洗脱缓冲液)A1：终浓度为170mM精氨酸、终浓度为40mM Tris、终浓度为3mM EDTA、终浓度为5M尿素；

洗脱缓冲液B1：终浓度为230mM精氨酸、终浓度为40mM Tris、终浓度为9mM EDTA、终浓度为5M尿素、终浓度为0.8M NaCl；

步骤1.4中使用20mL/min的流速75％(体积分数)洗脱缓冲液B1+25％(体积分数)洗脱缓冲液A1冲洗杂蛋白，3个柱体积，直至流出液的基线平稳。

步骤1.5中使用20mL/min的流速75％(体积分数)洗脱缓冲液B1+25％(体积分数)洗脱缓冲液A1起始，35％(体积分数)洗脱缓冲液B1+65％(体积分数)洗脱缓冲液A1结束，线性冲洗1个柱体积，洗脱目的蛋白。

层析介质2：QAE琼脂糖凝胶(Cytiva,17019003)

平衡缓冲液2:终浓度为40mM Tris、终浓度为7M尿素；

洗脱缓冲液A2：终浓度为40mM Tris、终浓度为5M尿素；

洗脱缓冲液B2：终浓度为60mM Tris、终浓度为7M尿素、终浓度为1.2M NaCl；

步骤2.3中使用20mL/min的流速20％(体积分数)洗脱缓冲液B2+80％(体积分数)洗脱缓冲液A2冲洗杂质，40％(体积分数)洗脱缓冲液B2+60％(体积分数)洗脱缓冲液A2冲洗1个柱体积，洗脱目的蛋白。

层析过程与纯化结果与实施例5接近。

实施例7

本实施例进行纯化。

与实施例5相比，区别仅在于：

层析介质1：正丁烷基琼脂糖凝胶(Cytiva,17098004)。

平衡缓冲液1:终浓度为60mM Tris、终浓度为5M尿素(Urea)；终浓度为4mM EDTA；600mM NaCl；400mM硫酸铵。

Elution buffer(洗脱缓冲液)A1：终浓度为230mM精氨酸、终浓度为40mM Tris、终浓度为9mM EDTA、终浓度为7M尿素；

洗脱缓冲液B1：终浓度为170mM精氨酸、终浓度为60mM Tris、终浓度为3mM EDTA、终浓度为7M尿素、终浓度为1.2M NaCl；

步骤1.4中使用20mL/min的流速85％(体积分数)洗脱缓冲液B1+15％(体积分数)洗脱缓冲液A1冲洗杂蛋白，3个柱体积，直至流出液的基线平稳。

步骤1.5中使用20mL/min的流速85％(体积分数)洗脱缓冲液B1+15％(体积分数)洗脱缓冲液A1起始，25％(体积分数)洗脱缓冲液B1+75％(体积分数)洗脱缓冲液A1结束，线性冲洗1个柱体积，洗脱目的蛋白。

层析介质2：Q琼脂糖凝胶(Cytiva,17051004)

平衡缓冲液2:终浓度为60mM Tris、终浓度为5M尿素；

洗脱缓冲液A2：终浓度为60mM Tris、终浓度为7M尿素；

洗脱缓冲液B2：终浓度为40mM Tris、终浓度为5M尿素、终浓度为0.8M NaCl；

步骤2.3中使用20mL/min的流速10％(体积分数)洗脱缓冲液B2+90％(体积分数)洗脱缓冲液A2冲洗杂质，30％(体积分数)洗脱缓冲液B2+70％(体积分数)洗脱缓冲液A2冲洗1个柱体积，洗脱目的蛋白。

层析过程与纯化结果与实施例5接近。

对比例1

本对比例与实施例5相比，区别仅在于纯化步骤二使用Sephadex^TMG-25替换DEAESepharose^TMFF进行层析。

纯化步骤一

参照实施例5。

纯化步骤二

层析介质：Sephadex^TMG-25(Cytiva,17508702)。

洗脱缓冲液G:含终浓度为0.27g/L的KH₂PO₄、1.42g/L的Na₂HPO₄·12H₂O、0.2g/LKCl和8.8g/L NaCl，磷酸调PH 7.3。

洗涤缓冲液A3：终浓度为1.0M NaOH水溶液。

1.泵A使用200mL/min的流速洗脱缓冲液G洗脱5个柱体积，使其基线洗平。

2.泵B使用200mL/min的流速，样品为上述纯化步骤一中所获得的目的蛋白样品上样量为50mL。

3.泵A使用200mL/min的流速洗脱缓冲液G洗脱目的蛋白，根据紫外峰图，起峰时紫外波长280nm检测高于50mAU开始收集，待检测峰回落至50mAU附近时停止收集，收集的洗脱液即为目的蛋白。

通过SDS-PAGE电泳分析结果，目的蛋白纯度在70％以上；且通过鲎试剂凝胶法检测收集蛋白的内毒素小于200EU/mg。

对比例2

本对比例与实施例5相比，区别仅在于纯化步骤一使用Sephadex^TMG-25替换PhenylSepharose^TM6FF。

纯化步骤一

层析介质：Sephadex^TMG-25(Cytiva,17508702)。

洗脱缓冲液G:含终浓度为0.27g/L的KH₂PO₄、1.42g/L的Na₂HPO₄·12H₂O、0.2g/LKCl和8.8g/L NaCl，磷酸调PH 7.3。

洗涤缓冲液A3：终浓度为1.0M NaOH水溶液。

1.泵A使用200mL/min的流速洗脱缓冲液G洗脱5个柱体积，使其基线洗平。

2.泵B使用200mL/min的流速，样品(包涵体溶液)上样量为50mL。

3.泵A使用200mL/min的流速洗脱缓冲液G洗脱目的蛋白，根据紫外峰图，起峰时紫外波长280nm检测高于50mAU开始收集，待检测峰回落至50mAU附近时停止收集，收集的洗脱液即为目的蛋白。

纯化步骤二

参照实施例5

通过SDS-PAGE电泳分析结果，如图12所示，泳道1为菌体超声裂解液；泳道2为纯化后样品，目的蛋白纯度在75％左右；且通过鲎试剂凝胶法检测收集蛋白的内毒素小于300EU/mg。

通过表3数据对比可知，分别使用层析填料Phenyl和Sephadex^TMG-25，DEAE和Sephadex^TMG-25进行纯化后的样品纯度较低，内毒素残留较高，而发明进行特殊设计，采用层析填料Phenyl和DEAE两步配合进行纯化，不但内毒素含量大幅下降，而且样品的纯度也可以提高至90％以上。

表3

	样品纯度	内毒素含量
			DEAE、G-25两步纯化	75％	小于300EU/mg
Phenyl、G-25两步纯化	70％	小于200EU/mg
			Phenyl、DEAE两步纯化	90％	小于20EU/mg

实施例8

本实施例在实施例5两步纯化的基础上进行纯化步骤三(复性)。

阳离子交换层析介质3：SP Sepharose XL(Cytiva，17507304)

采用的阳离子交换层析柱规格：柱床体积1.0L，柱内径100mm。

平衡缓冲液3：终浓度为100mM乙酸钠缓冲液、100mM精氨酸，8M尿素；pH 5.7。

洗脱缓冲液A3：终浓度为30mM乙酸钠缓冲液、100mM精氨酸；pH 5.7。

洗脱缓冲液B3：终浓度为30mM乙酸钠缓冲液、100mM精氨酸、终浓度为1M NaCl；pH5.7

洗涤缓冲液A3：终浓度为1.0M NaOH水溶液。

洗涤缓冲液B3：50mM乙酸钠缓冲液、终浓度为1.0M NaCl、终浓度为8M尿素；pH4.0。

复性缓冲体系：终浓度为1mM EDTA，50mM乙酸钠缓冲液、5g/L聚乙二醇2000，100mM精氨酸、150mM CHES(2-环己胺基乙磺酸)；pH 5.7。

具体操作：

3.1先用平衡缓冲液3以100mL/min的流速冲洗柱子3000mL使其基线洗平。

3.2用平衡缓冲液3调整实施例5中2.3收集的缓冲液样品，调pH至5.7，总体积大约为1000mL。

3.3对3.2步骤样品，使用100mL/min的流速进行上样。

3.4用平衡缓冲液3冲洗柱子1000mL，用于平衡柱子在适当的稳定缓冲体系，流速100mL/min；

3.5使用平衡缓冲液3和复性缓冲体系以线性梯度从0至100％，对阳离子交换层析介质柱继续进行冲洗，流速10mL/min，1.5个柱体积，再以复性缓冲体系流速10mL/min，继续冲洗1000mL，使其基线洗平，总复性液体积约为2L。

3.6使用100mL/min的流速15％(体积分数)洗脱缓冲液B3+85％(体积分数)洗脱缓冲液A3冲洗杂蛋白，洗脱时间为15min，不做收集；使用100ml/min的流速50％(体积分数)洗脱缓冲液B3+50％(体积分数)洗脱缓冲液A3冲洗目的蛋白，洗脱1000mL，洗脱目的蛋白，根据紫外峰图，起峰时紫外波长280nm检测高于50mAU开始收集，待检测峰回落至50mAU附近时停止收集，洗脱时间为3min，手动收集的洗脱液即为目的蛋白，体积约为200mL；使用100mL/min的流速100％(体积分数)洗脱缓冲液B3冲洗杂蛋白，3个柱体积，洗脱杂蛋白，不做收集，待检测峰回落至基线附近时停止洗脱。整个流程如图13所示；所得样品通过SDS-PAGE电泳分析结果，如图14所示目的蛋白纯度在98％；且通过鲎试剂凝胶法检测收集蛋白的内毒素为5EU/mg。

3.7用无菌纯化水以100mL/min的流速冲洗柱子，3000mL使其基线洗平。使用50％(体积分数)洗涤缓冲液A3+50％(体积分数)无菌纯化水使用100mL/min的流速冲洗60min。再用100％(体积分数)无菌纯化水冲洗5000mL，使其基线洗平。

使用100％(体积分数)洗涤缓冲液B3使用100mL/min的流速冲洗60min。再用100％(体积分数)无菌纯化水冲洗5000mL，使其基线洗平。最后保存至20％乙醇溶液中。

原核表达系统里通常包涵体蛋白往往需溶于6M盐酸胍或8M尿素中，变性后的蛋白需要复性至蛋白的天然构象才会具有生物功能。我们的工艺方法选取了化学稳定性的Sepharose(琼脂糖)凝胶类过滤填料(Phenyl Sepharose^TM6FF、DEAE Sepharose^TMFF和SPSepharose XL)在变性条件下进行纯化和复性。工艺优势：避免了一般复性过程中蛋白质聚体的形成，所以复性得率更高，而且无需大量稀释样品，并将复性和纯化合二为一，大大节省时间及提高回收率高，且该方法适合产业化，首先非常适合实验室工艺至工业生产级别的工艺放大；其次，所用层析填料载量、流速快、填装简单，柱效高，易于清洗、消毒及再生，所以填料寿命非常长久。所以此法纯化获得的蛋白生物分子性价比极高，适合规模化工业生产。

实施例9

本实施例在实施例5两步纯化的基础上进行纯化步骤三(复性)。与实施例8相比，区别仅在于：

平衡缓冲液3：终浓度为90mM乙酸钠缓冲液、110mM精氨酸，7M尿素；

洗脱缓冲液A3：终浓度为20mM乙酸钠缓冲液、90mM精氨酸；

洗脱缓冲液B3：终浓度为40mM乙酸钠缓冲液、110mM精氨酸、终浓度为1.2M NaCl；

复性缓冲体系：终浓度为0.5mM EDTA，20mM乙酸钠缓冲液、8g/L聚乙二醇2000，200mM精氨酸、100mM CHES(2-环己胺基乙磺酸)；

步骤3.6中使用100mL/min的流速20％(体积分数)洗脱缓冲液B3+80％(体积分数)洗脱缓冲液A3冲洗杂蛋白，洗脱时间为15min，不做收集；使用100ml/min的流速40％(体积分数)洗脱缓冲液B3+60％(体积分数)洗脱缓冲液A3冲洗目的蛋白，洗脱1000mL，洗脱目的蛋白。

层析过程与复性结果与实施例8接近。

实施例10

本实施例在实施例5两步纯化的基础上进行纯化步骤三(复性)。与实施例8相比，区别仅在于：

平衡缓冲液3：终浓度为110mM乙酸钠缓冲液、90mM精氨酸，9M尿素；

洗脱缓冲液A3：终浓度为40mM乙酸钠缓冲液、100mM精氨酸；

洗脱缓冲液B3：终浓度为20mM乙酸钠缓冲液、90mM精氨酸、终浓度为0.8M NaCl；

复性缓冲体系：终浓度为2mM EDTA，80mM乙酸钠缓冲液、3g/L聚乙二醇2000，100mM精氨酸、200mM CHES(2-环己胺基乙磺酸)；

步骤3.6中使用100mL/min的流速10％(体积分数)洗脱缓冲液B3+90％(体积分数)洗脱缓冲液A3冲洗杂蛋白，洗脱时间为15min，不做收集；使用100ml/min的流速60％(体积分数)洗脱缓冲液B3+40％(体积分数)洗脱缓冲液A3冲洗目的蛋白，洗脱1000mL，洗脱目的蛋白。

层析过程与复性结果与实施例8接近。

实施例11

本实施例选用稀释复性法和透析复性法进行复性。

一般包涵体蛋白样品的纯度越高，复性效果越好。所以采用复性的样品，选择实施例5中2.3步骤收集的样品，该样品体积大约为400mL，如果再稀释20倍，大约需要8L左右的复性液。仅此一步生产环节的生产成本增加4倍；而且一般稀释法复性的时间大约需要5天。

选用透析复性法，一般包涵体蛋白样品的纯度越高，复性效果越好。所以采用复性的样品，选择实施例5中2.3步骤收集的样品，该样品体积大约为400mL。装入透析袋中，置于放入3600mL的复性液中，每隔24h，更换一次复性液，连续3天，共消耗复性液10.8升。生产成本大概是Sepharose凝胶固相吸附法的5.5倍，所需时间是3天。

根据表3和图15的实验数据结果(泳道1固相吸附复性法样品，泳道2稀释复性法样品，泳道3透析复性法样品)分析：Sepharose凝胶固相吸附法获得的样品纯度90％以上、所需复性液体2L、所需复性时间1天，远优于：稀释复性法获得的样品纯度75％、所需复性液体8L、所需复性时间5天；透析复性法获得的样品纯度80％、所需复性液体10.8L、所需复性时间3天。而且稀释复性法和透析复性法还需要再重新上层析柱纯化，工艺更加复杂。所以Sepharose凝胶固相吸附法工艺针对重组人碱性成纤维细胞生长因子复性特异性强，复性、纯化二合一，采用此方法纯化后复性效率和纯度明显提高，且降低了内毒素含量。所以采用Sepharose的固相吸附复性法是最适选择。

表4

实施例12

本实施例进行目的蛋白收集及冻存。

仪器：切向流系统设备：Centramate^TM(Millbore FS013K05CLVC)

利用切向流系统，将实施例8中3.6收集的样品置换到保存缓冲溶液4中。

保存缓冲溶液4：终浓度为0.27g/L的KH₂PO₄，1.42g/L的Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g/LKCl，8.8g/L NaCl，10g/LArg，10g/L海藻糖，20g/L的蔗糖，1g/L半胱氨酸，磷酸调pH 7.3。

洗涤缓冲液A4：终浓度为100mM乙酸乙酸钠缓冲液、终浓度为1.0M NaCl；pH 5.0。

洗涤缓冲液B4：终浓度为50mM Tris、终浓度为1M NaCl、终浓度为8M尿素；pH 9.0。

洗涤缓冲液C4：终浓度为1.0M NaOH溶液。

4.1蠕动泵管路A4使用50mL/min的流速，用洗涤缓冲液C4，2000mL，清洗所有管路及切向流系统设备，蠕动泵管路B4循环，蠕动泵管路C4流出。

4.2蠕动泵管路A4使用100mL/min的流速，用注射水，2000mL，清洗所有管路及切向流系统设备，蠕动泵管路B4循环，蠕动泵管路C4流出。

4.3蠕动泵管路A4使用100mL/min的流速，用保存缓冲溶液4，500mL，清洗所有管路及切向流系统设备，蠕动泵管路4B循环，蠕动泵管路C4流出。

4.3蠕动泵管路A4使用100mL/min的流速，将3.6收集的样品200mL+保存缓冲溶液4，200mL，蠕动泵管路4B循环，蠕动泵管路C4流出200mL。循环8次后，将切向流系统设备排空收集样品。所得样品通过SDS-PAGE电泳分析结果，如图16所示目的蛋白纯度在95％以上；且通过鲎试剂凝胶法检测收集蛋白的内毒素小于10EU/mg。

4.4蠕动泵管路A4使用100mL/min的流速，用注射水，2000mL，清洗所有管路及切向流系统设备，蠕动泵管路B4循环，蠕动泵管路C4流出。

4.5蠕动泵管路A4使用50mL/min的流速，用洗涤缓冲液C4，2000mL，清洗所有管路及切向流系统设备，蠕动泵管路B4循环，蠕动泵管路C4流出。

4.6蠕动泵管路A4使用100mL/min的流速，用注射水，2000mL，清洗所有管路及切向流系统设备，蠕动泵管路B4循环，蠕动泵管路C4流出。

4.7蠕动泵管路A4使用100mL/min的流速，用20％乙醇溶液，800mL，清洗所有管路及切向流系统设备，蠕动泵管路B4循环，蠕动泵管路C4流出。

冻干保存

5.1将纯化步骤4.3所获得的目的蛋白，lowrry法检测浓度，并适当调整蛋白浓度至1mg/mL。

5.2分装蛋白至3mL西林瓶，-80℃预冻。

5.3冻干机层板-40℃预冻5h

5.4冻干机编程

程序1：设定层板温度-40℃；

程序2：层板温度-40℃，冻干盘置于层板30min

程序3：设定层板温度-40℃，安全压力0.220mbar，真空度0.100mbar，时间10min；

程序4：层板缓慢升温至-25℃，安全压力0.220mbar，真空度0.100mbar，时间5h；

程序5：层板稳定温度在-25℃，安全压力0.220mbar，真空度0.100mbar，时间5h；

程序6：层板缓慢升温至-20℃，安全压力0.220mbar，真空度0.100mbar，时间5h；

程序7：层板稳定温度在-20℃，安全压力0.220mbar，真空度0.100mbar，时间5h；

程序8：层板稳定温度在0℃，安全压力0.220mbar，真空度0.100mbar，时间10h；

程序9：层板稳定温度在0℃，安全压力0.220mbar，真空度0.010mbar，压胶塞。

5.5压盖机，压盖后4℃保存，如图17所示。

综上所述，本发明针对人碱性成纤维细胞生长因子，设计全新的发酵及纯化工艺，包括设计高密度发酵条件，实现高密度发酵，控制诱导条件，进一步提高蛋白产量并节约成本，以及设计两步协同的纯化工艺以及特定的复性工艺，有效提高了目标蛋白的纯度，降低了内毒素含量，纯度可达95％以上，内毒素含量低于10EU/mg，节约了生产成本，适合实验室工艺至工业生产级别的工艺放大；适合规模化工业生产。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种人碱性成纤维细胞生长因子的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

培养表达人碱性成纤维细胞生长因子的宿主细胞，诱导所述宿主细胞表达人碱性成纤维细胞生长因子，破碎细胞并收集沉淀，获得粗蛋白，对粗蛋白进行纯化回收所述人碱性成纤维细胞生长因子；

所述纯化包括依次进行第一层析和第二层析，所述第一层析的填料包括苯基琼脂糖凝胶、丁基琼脂糖凝胶、正丁烷基琼脂糖凝胶或正辛烷基琼脂糖凝胶中任意一种或至少两种的组合，所述第二层析的填料包括DEAE琼脂糖凝胶、Q琼脂糖凝胶或QAE琼脂糖凝胶中任意一种或至少两种的组合。

2.根据权利要求1所述的人碱性成纤维细胞生长因子的制备方法，其特征在于，所述纯化后还包括复性的步骤；

优选地，所述复性包括进行第三层析，所述第三层析的填料包括SP琼脂糖凝胶XL。

3.根据权利要求1所述的人碱性成纤维细胞生长因子的制备方法，其特征在于，所述第一层析具体包括：

使用苯基琼脂糖凝胶、丁基琼脂糖凝胶、正丁烷基琼脂糖凝胶或正辛烷基琼脂糖凝胶中任意一种或至少两种的组合装层析柱，利用第一平衡缓冲液冲洗层析柱，上样，利用第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓冲液混合冲洗杂蛋白至基线平稳，再利用第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓冲液混合洗脱目的蛋白；

优选地，所述第一平衡缓冲液含有三羟甲基氨基甲烷、尿素、EDTA、NaCl和硫酸铵；

优选地，所述第一洗脱缓冲液含有精氨酸、三羟甲基氨基甲烷、尿素和EDTA；

优选地，所述第二洗脱缓冲液含有精氨酸、三羟甲基氨基甲烷、尿素、EDTA和NaCl；

优选地，所述冲洗杂蛋白包括按体积百分比为100％计使用15％～25％第一洗脱缓冲液和75％～85％第二洗脱缓冲液混合；

优选地，所述洗脱包括按体积百分比为100％计使用65％～75％第一洗脱缓冲液和25％～35％第二洗脱缓冲液混合。

4.根据权利要求1所述的人碱性成纤维细胞生长因子的制备方法，其特征在于，所述第二层析具体包括：

使用DEAE琼脂糖凝胶、Q琼脂糖凝胶或QAE琼脂糖凝胶中任意一种或至少两种的组合装层析柱，利用第二平衡缓冲液冲洗层析柱，上样，利用第三洗脱缓冲液和第四洗脱缓冲液混合冲洗杂蛋白至基线平稳，再利用第三洗脱缓冲液和第四洗脱缓冲液混合洗脱目的蛋白；

优选地，所述第二平衡缓冲液含有三羟甲基氨基甲烷和尿素；

优选地，所述第三洗脱缓冲液含有三羟甲基氨基甲烷和尿素；

优选地，所述第四洗脱缓冲液含有三羟甲基氨基甲烷、尿素和NaCl；

优选地，所述冲洗杂蛋白包括按体积百分比为100％计使用80％～90％第三洗脱缓冲液和10％～20％第四洗脱缓冲液混合；

优选地，所述洗脱包括按体积百分比为100％计使用60％～70％第三洗脱缓冲液和30％～40％第四洗脱缓冲液混合。

5.根据权利要求2所述的人碱性成纤维细胞生长因子的制备方法，其特征在于，所述第三层析具体包括：

使用SP琼脂糖凝胶XL装层析柱，利用第三平衡缓冲液冲洗层析柱，上样，利用复性缓冲液进行复性冲洗，利用第五洗脱缓冲液和第六洗脱缓冲液混合冲洗杂蛋白至基线平稳，再利用第五洗脱缓冲液和第六洗脱缓冲液混合洗脱目的蛋白；

优选地，所述第三平衡缓冲液含有乙酸钠、精氨酸和尿素；

优选地，所述复性缓冲液含有EDTA、乙酸钠、聚乙二醇、精氨酸和2-环己胺基乙磺酸；

优选地，所述第五洗脱缓冲液含有乙酸钠和精氨酸；

优选地，所述第六洗脱缓冲液含有乙酸钠、精氨酸和NaCl；

优选地，所述冲洗杂蛋白包括按体积百分比为100％计使用80％～90％第五洗脱缓冲液和10％～20％第六洗脱缓冲液混合；

优选地，所述洗脱包括按体积百分比为100％计使用40％～60％第五洗脱缓冲液和40％～60％第六洗脱缓冲液混合。

6.根据权利要求1所述的人碱性成纤维细胞生长因子的制备方法，其特征在于，所述培养包括菌种复苏和发酵培养；

优选地，所述菌种复苏包括依次进行一级种子培养和二级种子培养；

优选地，所述二级种子培养的培养基含有胰蛋白胨、酵母粉和NaCl；

优选地，所述发酵培养的条件包括：

温度为36～38℃，pH值为6.8～7.2，DO串联转速维持DO≥30％，当OD₆₀₀为7以上、溶氧升速且pH升高≥0.1单位/min，进行补料，第1h流速95～105mL/h，随后调节流速100～200mL/h，通气量自动调节以维持30～40％的DO。

7.根据权利要求6所述的人碱性成纤维细胞生长因子的制备方法，其特征在于，所述二级种子培养的培养基中含有10～20g/L胰蛋白胨、5～11g/L酵母粉和3～7g/LNaCl。

8.根据权利要求1所述的人碱性成纤维细胞生长因子的制备方法，其特征在于，所述诱导的诱导剂包括异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；

优选地，所述的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的工作浓度为1～25mM；

优选地，所述诱导的温度为36～43℃；

优选地，所述诱导的时间为2～5h。

9.根据权利要求1所述的人碱性成纤维细胞生长因子的制备方法，其特征在于，所述收集沉淀后还包括提取包涵体的步骤；

优选地，所述提取包涵体包括将收集到的沉淀与包涵体溶解液混合，收集上清液，得到包涵体溶液；

优选地，所述包涵体溶解液含有三羟甲基氨基甲烷、NaCl、EDTA和盐酸胍。

10.根据权利要求1-9任一项所述的人碱性成纤维细胞生长因子的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)取表达人碱性成纤维细胞生长因子的宿主细胞进行进行一级种子培养和二级种子培养以及发酵培养，利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导所述宿主细胞表达人碱性成纤维细胞生长因子；

(2)破碎细胞，收集沉淀并与包涵体溶解液混合，收集上清液，获得粗蛋白，对粗蛋白进行第一层析，使用苯基琼脂糖凝胶、丁基琼脂糖凝胶、正丁烷基琼脂糖凝胶或正辛烷基琼脂糖凝胶中任意一种或至少两种的组合装层析柱，利用第一平衡缓冲液冲洗层析柱，上样，利用第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓冲液混合冲洗杂蛋白至基线平稳，再利用第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓冲液混合洗脱目的蛋白；所述包涵体溶解液含有三羟甲基氨基甲烷、NaCl、EDTA和盐酸胍，所述第一平衡缓冲液含有三羟甲基氨基甲烷、尿素、EDTA、NaCl和硫酸铵，所述第一洗脱缓冲液含有精氨酸、三羟甲基氨基甲烷、尿素和EDTA，所述第二洗脱缓冲液含有精氨酸、三羟甲基氨基甲烷、尿素、EDTA和NaCl；

(3)对步骤(2)收集产物进行第二层析，使用DEAE琼脂糖凝胶、Q琼脂糖凝胶或QAE琼脂糖凝胶中任意一种或至少两种的组合装层析柱，利用第二平衡缓冲液冲洗层析柱，上样，利用第三洗脱缓冲液和第四洗脱缓冲液混合冲洗杂蛋白至基线平稳，再利用第三洗脱缓冲液和第四洗脱缓冲液混合洗脱目的蛋白，所述第二平衡缓冲液含有三羟甲基氨基甲烷和尿素，所述第三洗脱缓冲液含有三羟甲基氨基甲烷和尿素，所述第四洗脱缓冲液含有三羟甲基氨基甲烷、尿素和NaCl；

(4)对步骤(3)收集产物进行第三层析，使用SP琼脂糖凝胶XL装层析柱，利用第三平衡缓冲液冲洗层析柱，上样，利用复性缓冲液进行复性冲洗，利用第五洗脱缓冲液和第六洗脱缓冲液混合冲洗杂蛋白至基线平稳，再利用第五洗脱缓冲液和第六洗脱缓冲液混合洗脱目的蛋白，所述第三平衡缓冲液含有乙酸钠、精氨酸和尿素，所述复性缓冲液含有EDTA、乙酸钠、聚乙二醇、精氨酸和2-环己胺基乙磺酸，所述第五洗脱缓冲液含有乙酸钠和精氨酸，所述第六洗脱缓冲液含有乙酸钠、精氨酸和NaCl。